JP2837240B2 - イヌ免疫グロブリンγ鎖の定常領域をコードする遺伝子断片およびマウス×イヌキメラ抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、イヌの失病、特に伝染病の診断、治療及び
予防に期待できる新規なイヌモノクローナル抗体に関す
る。さらに詳細にはイヌモノクローナル抗体を構成する
イヌ免疫グロブリンγ鎖の定常領域をコードする遺伝子
断片およびこれを利用したマウス×イヌキメラ抗体に関
する。

発明の背景 イヌはペットとして昔から人間に愛着のある動物であ
るが、近年の欧米では、「伴侶、仲間、相棒としての動
物」（Companion species）と称され、人間社会の一員
としての地位を獲得しつつある。もう一方では、医学、
薬学、畜産学、獣医学から心理学にいたる実験動物とし
ての貢献度は従来から大きなものであったが、近年では
医薬品の効果検定や安全性試験にSPFイヌなどの呼称の
もとで更に貢献度が高まっている。いずれの場合にも当
然の事として、これらのイヌの疾病、特に伝染病に関す
るより確実な知識がますます必要となり、その診断、治
療、予防のための方法が確立される事が要求されてい
る。

イヌのウイルス性疾患は多く、なかでもイヌジステン
パーウイルス、イヌパルボウイルス、イヌ伝染性肝炎ウ
イルス等の疾患は急性で致死率が高い。予防としてのワ
クチンは開発されているものの、感染・発症したイヌの
治療法としては、抗生物質、サルファ剤等の二次細菌感
染予防の対症療法しかないこと等、現在の治療法には問
題を残している。従来より治療法として高度免疫血清や
血清由来の免疫グロブリンが使用され有効な実績を残し
てきた。しかし、現在では、動物愛護思想の高まりと共
に、イヌ血清原料の入手が困難になりこの治療法は使い
たくとも使用できない状況になっている。従って、従来
の高度免疫血清に代わって感染ウイルスを中和できるモ
ノクローナル抗体が出来れば、これらウイルス性疾患の
治療に大きく貢献することが可能である。

従来技術 上記のような高度免疫血清の代替品として、ウイルス
中和活性を有するモノクローナル抗体の使用が考えられ
る。モノクローナル抗体作製に関する基本的な技術は、
これまでに主としてマウス型モノクローナル抗体におい
て確立されている。ハイブリドーマ等の細胞が産生する
モノクローナル抗体は大量にしかも半永久に得られ、原
料不足の問題を解消できうる。しかし、ここにおけるモ
ノクローナル抗体は、副作用（マウスモノクローナル抗
体をイヌに使用した場合、異種タンパクとしてアナフィ
ラキシーショックや血清病などの副作用を起こすことが
考えられる）をなくす意味から、従来のマウスモノクロ
ーナル抗体ではなくイヌモノクローナル抗体でなければ
ならない。

これらのイヌウイルス性疾患の治療薬としてのイヌモ
ノクローナル抗体の作製法には次のようなものが考えら
れる。（１）イヌ×イヌハイブリドーマを用いる方法、
（２）ある種のウイルス及び化学薬剤等でトランスフォ
ームさせたイヌリンバ球を用いる方法、（３）イヌ×マ
ウスヘテロハイブリドーマを用いる方法、（４）イヌ×
マウスヘテロハイブリドーマを親株としたイヌ×（イヌ
×マウス）ハイブリドーマを用いる方法、（５）キメラ
モノクローナル抗体（抗原と結合する可変（Ｖ）領域は
ウイルス中和活性を有するマウスモノクローナル抗体か
ら、抗原性あるいは免疫原性及び生理活性に関与する定
常（Ｃ）領域はイヌモノクローナル抗体からなる、マウ
ス（Ｖ）−イヌ（Ｃ）キメラモノクローナル抗体）を遺
伝子組換えで作製する方法、等であるが、これらの方法
による成功例は一切報告されていない。

ここで、（１）については融合効率が低いことや適当
なミエローマ親株がないこと、（２）についてはヒトの
場合のEBウイルスに相当する適当なウイルスや適当な化
学薬剤がないこと、さらに、（３）（４）の方法ではヒ
ト型モノクローナル抗体作製例から考えて、目的のイヌ
型モノクローナル抗体を高効率に得るまでには多くの困
難が予想される（例えば、安定性の問題等）。従って、
（５）のキメラモノクローナル抗体法がより実現性の高
い方法であると考えられる。

このキメラモノクローナル抗体は、可変（Ｖ）領域の
原料となるマウスモノクローナル抗体を産生するマウス
×マウスハイブリドーマからクローニングしたそのＶ遺
伝子と、定常（Ｃ）領域の原料となるイヌモノクローナ
ル抗体を産生するイヌ抗体産生細胞からクローニングし
たＣ遺伝子とを結合させたマウス（Ｖ）−イヌ（Ｃ）キ
メラ抗体遺伝子を含むプラスミドベクターを、動物細胞
（例えば、マウスミエローマ）宿主中で発現させ、その
培養上清中に得られるものである。ヒトにおいてはすで
にキメラ抗体に関するいくつかの報告が見受けられる
（特開昭60−155132号、特開昭61−47500号）。

このようにイヌキメラ抗体の作製には、目的の抗原と
結合能を持つ抗体分子の可変（Ｖ）領域のアミノ酸配列
をコードする遺伝子とイヌ免疫グロブリンの定常（Ｃ）
領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子が必要となる。
キメラ抗体の可変（Ｖ）領域遺伝子は、前述した種々の
イヌウイルス等に対して中和活性を有するマウスモノク
ローナル抗体を産生する細胞から得られるもので、この
細胞は従来のマウス×マウスハイブリドーマ法で比較的
容易に作製することが出来る。しかしながら、キメラ抗
体の定常領域遺伝子となるイヌ免疫グロブリンＣ領域遺
伝子については現在のところ全くその構造が知られてお
らず、遺伝子もクローニングされていない。従って、イ
ヌキメラ抗体を作製するためには、イヌ免疫グロブリン
の定常（Ｃ）領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子を
見いだすことが非常に重要な要素となっている。

発明の目的 このような状況にあって、本発明者らは、イヌ免疫グ
ロブリンの定常領域のアミノ酸配列をコードしている遺
伝子を単離すべく研究を重ねた結果、これを単離するこ
とに成功した。すなわち、本発明は、これまでに一切報
告されていないイヌ免疫グロブリンγ鎖の定常領域をコ
ードする遺伝子を提供するものであり、これによりイヌ
キメラ抗体の作製を可能にするものである。本発明のイ
ヌ免疫グロブリンγ鎖をコードする遺伝子を用いて作ら
れたイヌキメラ抗体は、イヌの疾病、特に伝染病に対し
て副作用のない診断薬、治療薬・予防薬への応用を可能
にするものである。

発明の構成及び効果 免疫グロブリンのγ鎖としては、すでにヒト及びマウ
ス［例えば、A.Shimizuら、Cell,29,p121（1982）;N,Ta
kahashiら、Cell,29,p671（1982）］で発見され、さら
に、他の動物種のγ鎖では、ウサギ［C.L.Martensら、P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,79,p6018（1982）］、ウシ［K.
L.Knightら、J.Immunol,140,p3654（1988）］等が報告
されているが、イヌ免疫グロブリンγ鎖に関する報告は
まだない。

本発明者らは、イヌ肝臓細胞の染色体DNAから、ヒト
免疫グロブリン遺伝子をプローブとして用い、イヌ免疫
グロブリン定常領域をコードすると思われる遺伝子断片
を得ることに成功した。クローニングされた遺伝子断片
の塩基配列から予測されるアミノ酸配列と、他の動物種
の免疫グロブリンのＣ領域遺伝子の配列とを比較し遺伝
子解析を行った結果、本発明により得られた遺伝子断片
は、γ鎖に属する免疫グロブリン定常領域をコードする
遺伝子断片であることが判明した。

得られたイヌ免疫グロブリンγ鎖定常領域をコードす
るDNA断片の塩基配列を解析し、該定常領域のアミノ酸
配列を見いだし、これをこれまでに報告されているヒ
ト、マスウ、ウサギ等の免疫グロブリンγ鎖定常領域の
アミノ酸配列と比較検討したところ、イヌ免疫グロブリ
ンγ鎖定常領域に特異的なアミノ酸配列として、該γ鎖
定常領域のCH3ドメインのＣ末端側から最初のシステイ
ンの近傍のアミノ酸配列が下記（Ａ）のアミノ酸配列で
あることが見いだされた。

本発明者らは、本発明により解析されたイヌの免疫グ
ロブリンγ鎖定常領域のアミノ酸配列、およびこれまで
に解析されている種々の動物の免疫グロブリンγ鎖定常
領域のアミノ酸配列を比較することにより、上記のシス
テインの近傍に存在する−Ile−Cys−Ala−の領域は、
イヌ、マウス、ヒト等の種の違いによっていずれも異な
るアミノ酸配列となっている領域であることを見いだし
た。また、同時にこの領域は、例えばヒトのγ鎖定常領
域のアミノ酸配列としては、サブクラス間で極めてよく
保存されていることも見いだし、今回本発明により明ら
かにされた上記の配列は、イヌ免疫グロブリンγ鎖定常
領域特有の配列であると推測された。

また、CH3ドメインのＮ末端側から３番目のアミノ酸
から始まる配列にも、同様なイヌ免疫グロブリンγ鎖定
常領域特有の下記（Ｂ）の配列を見いだした。

尚、本発明においてクローニングされたこの領域のア
ミノ酸配列は下記の通りであり、このアミノ酸配列
（Ｂ）′がイヌ免疫グロブリンγ鎖定常領域に存在する
特有のアミノ酸配列の好ましい一例として挙げられる。

本発明のイヌ免疫グロブリンγ鎖定常領域をコードす
る遺伝子断片においても、上記（Ａ）および（Ｂ）のア
ミノ酸配列をコードするDNA配列をその一部に有するこ
とを特徴とする。このような上記のγ鎖に含まれるアミ
ノ酸配列は、イヌ免疫グロブリンγ鎖のＣ領域を決定す
る重要なアミノ酸配列と考えられ、本発明により初めて
明らかにされた。

これらのアミノ酸配列を含んだイヌ免疫グロブリンγ
鎖定常の好ましい一例を示すと、下記に示すアミノ酸配
列が挙げられる。

このようなアミノ酸配列もしくはこれをコードする核
酸塩基配列については一切その報告例はなく、本発明に
より初めて開示されるものである。

また、本発明のイヌ免疫グロブリンγ鎖のＣ領域をコ
ードする遺伝子の具体的核酸塩基配列の一例としては、
第５図に示された塩基配列が挙げられる。

また、本発明のγ鎖遺伝子を用いてイヌ染色体DNAと
サザンハイブリダイゼーションを行った結果、本発明の
γ鎖以外に、同じイヌγ鎖に属している他のサブクラス
のＣ領域遺伝子がいつくか存在していることが示され
た。ヒトとマウスの例［例えば、清水ら、Cell,29,p121
（1982）；高橋ら、Cell,29,p671（1982）］からも、イ
ヌγ鎖にもいくつかのサブクラスが存在すると思われ
る。また、イヌγ鎖には血清学的に少なくとも４つのサ
ブクラスがあることが知られており［John S.Johnson
ら、J.Immunol,98,p923（1966）］、本発明の遺伝子は
これら４つのサブクラスの内のいずれかをコードしてい
ると思われる。従って、本発明の遺伝子を用いて残りの
サブクラスのＣ領域遺伝子をクローニングすることが可
能であると思われる。

尚、同一のサブクラス内においても１ヶ所から数カ所
のアミノ酸が置換されているアロタイプの異なる遺伝子
が存在することがヒト、ウサギ等の免疫グロブリンγ鎖
の遺伝子解析の結果からも予想される。本発明のイヌ免
疫グロブリンγ鎖定常領域をコードする遺伝子断片は、
上記のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片のみに限ら
れず、このような部分的にアミノ酸が置換されているア
ロタイプの異なる遺伝子もを包含する。

キメラ抗体の作製方法はすでにマウス−ヒトキメラ抗
体で示された方法［渡辺ら、Cancer Reserch,47,p999−
1005（1987）］に準じて行うことが出来る。すなわち、
キメラ抗体遺伝子は、基本的にＶ領域遺伝子とＣ領域遺
伝子の２種類の遺伝子断片を結合させることにより構築
される。さらに、遺伝子の単離法に応じて、主として２
つの結合の組合せがある。すなわち、染色体DNAから単
離したＶとＣ領域遺伝子、cDNAから単離したＶとＣ領域
遺伝子の組合せである。

例えば、マウス染色体DNAから単離したＶ領域遺伝子
を、イヌ染色体DNAから単離したＣ領域遺伝子と結合さ
せた場合、マウスＶ領域遺伝子には発現に必要なプロモ
ーターやエンハンサー等の発現調節領域を含んでいるこ
とが好ましい。ただし、プロモーターやエンハンサー等
はマウス由来である必要はなく、イヌ由来でもヒト由来
でもウイルス由来でも差しつかえない。また、プロモー
ターはＶ領域の５′上流域に位置し、エンハンサーはＶ
領域遺伝子とＣ領域遺伝子の間に位置するのが好ましい
が、エンハンサーについては必ずしもこの位置に限定さ
れるものではない。一方、マウスcDNAから単離したＶ領
域遺伝子を、イヌcDNAから単離したＣ領域遺伝子と結合
させる場合、その結合部分は適当な制限酵素サイトや、
必要であれば適当な合成リンカーを用いて、Ｖ領域遺伝
子のコードしているアミノ酸配列とＣ領域遺伝子のコー
ドしているアミノ酸配列がずれないよう、またＶ領域ア
ミノ酸配列とＣ領域アミノ酸配列が変化しないよう結合
しなければならない。さらに、動物細胞中で発現を可能
にするための適当なプロモーターやエンハンサー等の発
現調節領域を遺伝子の５′上流域に付加してやる必要が
ある。このようにして作製したキメラ抗体遺伝子を、例
えば、pSV2−gpt［R.C.Mulliganら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,78,p2027（1981）］、pSV2−neo［P.J.Southern
ら、J.Mol.Appl.Genet.,1,p327（1982）］等の選択マー
カーの付いた適当なベクタープラスミドに、あるいは、
宿主細胞内でプラスミド状態で増殖できるウイルス遺伝
子の一部（パピローマウイルスなど）を持ったベクター
プラスミドに、Ｈ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子を別々に、ある
いは同時に組み込み、キメラ抗体遺伝子プラスミドを構
築することが望ましい。マウス−イヌキメラ抗体を得る
ためには、このように調製されたキメラ抗体遺伝子を含
むプラスミドを用いて宿主動物細胞を形質転換すること
が必要である。宿主動物細胞としては、不死化されたマ
ウス及び他の動物細胞、好ましくはＢリンパ系細胞株
［例えば、P3X63Ag8・653（ATCC CRL 1580）、P3X63Ag8
U・１（ATCC CRL 1597）、P3/NS1/1 Ag4−１（ATCC CRL
18）、Sp2/0−Ag12（ATCC CRL 1581）等の形質細胞腫、
ハイブリドーマ］である。DNAによる細胞の形質転換方
法としては、DEAE−デキストラン法、燐酸カルシウム共
沈降法、プロトプロスト融合法、エレクトロポレーショ
ン法等の方法［例えば、B.D.Hanesら編集“Transcripti
on and Translation"IRL Press（1984）参照］があり、
いずれの方法でもよい。Ｈ鎖とＬ鎖のキメラ抗体遺伝子
を同時に持つプラスミドで形質転換を行う場合には選択
マーカーは１種類でよいが、Ｈ鎖Ｌ鎖別々の場合には２
種類のマーカーが必要である。この場合には、１つのプ
ラスミドで形質転換を行った後に、さらにもう一方のプ
ラスミドで形質転換を行う二重形質転換法を用いるのが
好ましい。このようにして形質転換された細胞を通常の
ハイブリドーマと同じ適当な条件下（例えば、10％牛胎
児血清を含むRPMI1640培地中）で培養すれば、この細胞
から通常のハイブリドーマの産生する抗体と同様にマウ
ス−イヌキメラ抗体が分泌産生される。このキメラ抗体
は通常の抗体と同様な方法により精製することが出来
る。

本発明により提供されるイヌ免疫グロブリンをコード
する遺伝子断片は、イヌ免疫グロブリンγ鎖のＣ領域の
特異的アミノ酸配列もしくはDNA配列を開示するもので
あり、この遺伝子を用いて、上述のようにして得られる
マウス−イヌキメラ抗体は、イヌの疾病に対して、これ
までになかった実質的に有効な診断、予防及び治療剤と
なりうるものである。

次に、その実施例を示すが本発明はこれに限定される
ものではない。

実施例 （１）γ鎖遺伝子の単離 イヌγ鎖遺伝子をクロスハイブリダイゼーション法に
よりクローニングするために、まずヒトγ鎖［工藤ら、
Gene,33,p181（1985），西村ら,Cancer Res.,47,p999
（1987）］とのクロスハイブリダイゼーションの条件を
検討した。コンピュータを用いてマウス、ヒト、ウサギ
γ鎖間でホモロジー解析をした結果、特にCH2−CH3エク
ソンを含む領域が非常にホモロジーが高いことが示され
た。従って、このヒトＣγ遺伝子よりCH2−CH3エクソン
を含むPst I−Sph I断片を切り出し、プローブとして使
用した。

イヌ肝臓の染色体DNA100μｇをNbo Iで部分消化（30u
nits,37℃,30分）した後、この18〜20kbpに相当するDNA
断片をしょ糖密度勾配遠心［しょ糖10〜40（wt/vol）、
26000rpm、18時間、15℃］により調製した。次にこのDN
A断片とλEMBL3ベクターDNA（ストラタジーン社製）のB
amH I切断DNAとをT4DNAリガーゼにより連結させ、スト
ラタジーン社のキットを用いてin vitroパッケージング
を行い、p2392大腸菌（ストラタジーン）に感染させ、
イヌ肝臓細胞のγ鎖遺伝子ライブラリィを得た。このラ
イブラリィから、ヒトＣγプローブを用いてプラークハ
イブリダイゼーション［W.D.Benton,R.W.Davis,Scienc
e,196,p180（1977）］を行い、イヌＣγ鎖エクソンを含
むクローンDMoDE9aを選択した。このクローンのサイズ
は約20kbで、その制限酵素切断点地図を第１図に示す。
このクローンから、イヌＣγエクソンを含むBamH I−Ba
mH I断片DE94γ（2kbp）を分取し後の実験に用いた （２）DE94γを用いたサザン及びノーザンブロット分析 初めにこのDE94γを用いたサザンブロット分析を行っ
た。イヌ肝臓細胞の染色体DNA10μｇを制限酵素BamH I
で切断し、このDNAを電気泳動で0.7％アガロースゲルに
展開し、ナイロンメンブレンフィルター（ハイボンド−
Ｎプラス、アマシャム社製）に転写後、イヌＣγ鎖領域
を含んだ［³²P］標識DE94γプローブとサザンハイブリ
ダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーショ
ンの方法はハイボンド−Ｎ−プラスに付属していたマニ
ュアルのプロトコールに従った。検出されたバンドのパ
ターンを、ヒトCr鎖プローブを用いたクロスハイブリダ
イゼーションのパターンと比較した結果、全く同じ位置
（2kb）にバンドがみとめられた（第２図）。分子サイ
ズはλファージDNAをHind IIIで切断したマーカーDNAに
よって算出した。また、2kp以外に1.9,1.2,1.05kbpにも
DE94γとハイブリダイズするバンドを検出した。この結
果より、このDE94γ以外に同じイヌγ鎖に属している他
のサブクラスのＣγ領域遺伝子がいくつか存在している
ことが示された。イヌγ鎖には血清学的に少なくとも４
つのサブクラスがあることが知られており［John S.Joh
nsonら、J.Immunol,98,p923（1966）］、DE94γ遺伝子
はこれら４つのサブクラスの内のいずれかをコードして
いると思われる。

次にノーザンブロット分析を行った。イヌ脾臓ポリＡ
＋RNA（クローンテック社製）２μｇを電気泳動により
３％ホルムアルデヒドを含む0.75％アガロースゲルに展
開し、ナイロンメンブレンフィルター（ハイボンド−Ｎ
プラス）に転写後、［³²P］標識DE94γプローブとノー
ザンハイブリダイゼーションを行った。ノーザンハイブ
リダイゼーションの方法はハイボンド−Ｎプラスに付属
のマニュアルのプロトコールに従った。このプローブに
より約1.8kbの位置にバンドが検出された（第３図）。
このサイズはマウス及びヒトで知られている免疫グロブ
リンγ鎖遺伝子のサイズとほぼ同じである。

これら２つの結果より、DE94γは機能的なイヌＣγ領
域を含む活性な遺伝子であることが推定された。尚、こ
のDE94γが組み込まれたプラスミドを有する大腸菌は、
Escherichia coli DCG−DE94G［微工研菌寄第11466号］
として出願人により寄託されている。

（３）DE94γの核酸塩基配列とアミノ酸配列 イヌＣγ領域の核酸塩基配列を調べるために、クロー
ンDE94γから、BamH I−EcoR I,EcoR I−Hinf I,Hinf I
−Hinf I,Hinf I,Hinf I−BamH Iの各小DNA断片を調製
した。これらの各小断片をT4−DNAポリメレースを用い
て切断面を平滑末端に変えた後、M13mp19ベクターのSma
Iサイトに宝ライゲーションキットを用いて挿入した。
東洋紡インストラクトマニュアルの方法に従い、JM109
のコンピテント細胞を調製し、Ｃγ領域遺伝子を挿入し
たM13mp19DNAで形質転換させ、一本鎖DNAを抽出精製し
た。さらにこの一本鎖DNAの各酸塩基配列決定は、Seque
nase vre.2.0 DNAシークエンスキット（Lnited states
Biochemical Corporation）を用いて行った。核酸塩基
配列行った方向は第４図に示す。核酸塩基配列決定の結
果、CH1−ヒンジ−CH2−CH3からなるイヌγ遺伝子が確
認された。第５図にその結果を示す。さらに、この核酸
塩基配列を基に予想されるアミノ酸に変換した（第６
図）。

このDE94γの核酸配列を基に遺伝子解析ソフト（Gene
tyx:ソフトウエア開発社製）を用いて、LASLデータベー
スをホモロジー検索したところ、ヒト及びマウスの免疫
グロブリンγ鎖と高いホモロジーを示し、免疫グロブリ
ンγ鎖遺伝子以外の遺伝子とはホモロジーは示さなかっ
た。DE94γ遺伝子のＣγ領域とマウス及びヒトのＣγ領
域をホモロジー比較すると、アミノ酸レベルでマウスγ
１とは61.0％、ヒトG1とは70.4％であった。

以上の結果より、DE94γ遺伝子は間違いなくイヌγ鎖
に属する遺伝子であり、マウス−イヌキメラ抗体の作製
を可能にする遺伝子であると思われた。

（４）マウス免疫グロブリンγ鎖可変（Ｖγ）領域遺伝
子の単離 抗CPV抗体産生ハイブリドーマJP2（γ1,κ）より染色
体DNAを単離し、染色体DNA100μｇを制限酵素Hind III
で切断する。次にDNA断片とλL47ベクターDNA（ストラ
タジーン）をT4DNAリガーゼにより連結させ、JP2細胞の
染色体DNAライブラリィを得た。このライブラリィか
ら、プラークハイブリダイゼーション法［W.D.Benton、
R.W.Davis,Science,196,（p180（1977）参照］によりマ
ウスJHプローブを用いて抗CPV抗体のVH領域遺伝子を含
むクローンJP2gH211を選択した。第７図はその制限酵素
切断点地図である。この遺伝子断片よりVHエクソン部分
を含んだEcoR I−Sac I断片を調製し、以下のイヌ−マ
ウスキメラ抗体Ｈ鎖遺伝子の材料とした。尚、この抗イ
ヌパルボウイルス活性を有するマウス免疫グロブリンＨ
鎖のＶ領域遺伝子が組み込まれたプラスミドを有する大
腸菌が、Escherichia coli MVH−JP2［微工研菌寄第111
67号］として出願人により寄託されている。尚、同じJP
2細胞から、マウスＪκプローブを用いてクローニング
した抗イヌパルボウイルスマウス免疫グロブリンＬ鎖の
Ｖ領域遺伝子は、Escherichia coli MVK−JP2［微工研
菌寄第11165号］として出願人により寄託されている。

（５）マウス−イヌキメラ抗体Ｈ鎖遺伝子（pSV2−PHDC
γ）の作製 （１）で得られたプラスミドpDE94γをBamH Iで切断
し、イヌ免疫グロブリンＣγ鎖遺伝子を含む2kbのBamH
I断片を調製した。この遺伝子をBamH Iで切断したpSV2
−gptベクターともに宝ライゲーションキットを用いて
連結し、プラスミドpSV2−DCγを得た。次に、（４）で
得られたpJP2gH211のEcoR I−Sac I断片の両端をT4−DN
Aポリメラーゼを用いて平滑末端に変え、宝ライゲーシ
ョンキットを用いて前述のプラスミドpSV2−DCγのHpa
Iサイトに挿入しプラスミドpSV2−PHDCγを作製した。
（第８図）

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明においてクローニングされたイヌ免疫
グロブリンγ鎖定常領域をコードする染色体DNA断片（D
MoDE9a及びDE94γ）の制限酵素切断地図を示す。 第２図は、イヌ肝臓細胞の染色体DNAを制限酵素BamH I
で切断し、これをイヌＣγ鎖領域を含んだ［³²P］標識D
E94γ（１）及び［³²P］標識ヒトＣγ１鎖（２）プロー
ブとサザンハイブリダイゼーションを行った結果の模式
図である。 第３図は、イヌ脾臓ポリＡ＋RNAと［³²P］標識DE94γプ
ローブとのノーザンハイブリダイゼーションの模式図で
ある。 第４図は、本発明でクローニングされたDNA断片DE94γ
の制限酵素切断地図および塩基配列解析を行った領域
（→）を示す。 第５図は、本発明でクローニングされたDNA断片DE94γ
に存在するイヌ免疫グロブリンγ鎖定常領域をコードす
るDNA塩基配列を示す。 第６図は、本発明でクローニングされたDNA断片DE94γ
中にコードされるイヌ免疫グロブリンγ鎖定常領域の全
アミノ酸配列を示す。 第７図は、実施例（５）で調製した抗CPV抗体のVH領域
遺伝子を含むクローンJP2gH211の制限酵素切断点地図を
示す。 第８図は、実施例（６）で構築した抗CPVマウス×イヌ
キメラ抗体Ｈ鎖を発現する遺伝子（pSV2−PHDCγ）の構
築図を示す。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを
   コードするDNA配列を含有する遺伝子断片。 （ａ）下記のアミノ酸配列からなるイヌ免疫グロブリン
   γ鎖の定常領域ポリペプチド （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
   ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列か
   らなり、かつイヌ免疫グロブリンγ鎖定常領域の機能を
   有するポリペプチド。
2. 【請求項２】前記第（１）項に記載のイヌ免疫グロブリ
   ンγ鎖の定常領域をコードする遺伝子断片をマウス免疫
   グロブリンＨ鎖の可変領域をコードする遺伝子断片の
   ３′側に接続したことを特徴とするマウス×イヌキメラ
   抗体Ｈ鎖をコードする組換えDNA分子。
3. 【請求項３】前記第（２）項記載の組換えDNA分子を発
   現ベクターに組み込み、この組換えベクターによって形
   質転換された細胞を培養し、発現されたマウス×イヌキ
   メラ抗体Ｈ鎖を回収することを特徴とするマウス×イヌ
   キメラ抗体Ｈ鎖の製法。
4. 【請求項４】前記第（３）項記載のマウス×イヌキメラ
   抗体Ｈ鎖の製法により得られるマウス×イヌキメラ抗体
   Ｈ鎖。