JP2812803B2

JP2812803B2 - 有機保護活性を備えたペプチド

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Publication number: JP2812803B2
Application number: JP6511727A
Authority: JP
Inventors: プレドラグシキリク; マリヤンペテク; スヴェンサイヴェルト; ゼリコグラバレヴィク; イーヴォロツクヴィク; マルコドゥヴニャク; ブランコトゥルコヴィク; ステパンミーセ; エルネストスチャネク; ボリスミルドナー; イヴァンウドヴィチク
Original assignee: プレドラグシキリク; マリヤンペテク; スヴェンサイヴェルト; ゼリコグラバレヴィク; イーヴォロツクヴィク; マルコドゥヴニャク; ブランコトゥルコヴィク; ステパンミーセ; エルネストスチャネク; ボリスミルドナー; イヴァンウドヴィチク
Priority date: 1992-11-16
Filing date: 1993-11-16
Publication date: 1998-10-22
Anticipated expiration: 2013-10-22
Also published as: ES2114170T3; CA2127553A1; DE69316974D1; JPH07507568A; RU94037232A; ATE163131T1; HU9401952D0; RU2116311C1; SK279227B6; HU9303247D0; BG61697B1; SK85794A3; BG98907A; CA2127553C; RO115733B1; SI9300595B; SI9300595A; WO1994011394A3; EP0624164B1; HU211260A9

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、公知の天然化合物BPCと同じタイプの高い
生物学的活性を有しながらより短いアミノ酸連鎖を備え
た新しいペプチドに関するものである。

発明の背景人又は動物の体から分離されたBPC（ボディ・プロテ
クティング・コンパウンド）と名付けられた有機保護活
性を備えた生物学的に活性なタンパク質は、ヨーロッパ
特許第432300号（EP 0432 400）で開示され、公開もさ
れている:P.シキリク他、Exp.Clin.Gastroenterol、
１、15〜26、1991。このタンパク質は、部分的にのみ限
定された構造を備え、約40000±5000ダルトンの高分子
量を有する。この化合物は、潰瘍保護の、肝臓保護の、
抗ウイルス性の、抗浮腫性の、一般的な抗炎症性の活
性、抗悪性腫瘍の活性等のような生物学的活性の非常に
広いスペクトルを有する。これは、列挙された疾患の治
療に、更には神経系の疾患及び障害の治療に、ドーパミ
ン作用性の病因の障害、外科、口腔病学、生殖能力の治
癒に、及び獣医学において使用される。しかしながら、
活性のこの広いスペクトルはおそらく、限定されない構
造の、或いは分離された化合物BPCの不十分な純度乃至
均質性の結果であり得る。

発明の記載本発明の一面に従って、とりわけボディ保護の意味
で、驚くほど高い生物学的活性を呈するクラスの合成ペ
プチドが提供される。いずれにせよ、良好に定義された
構造を備える当該合成化合物は、あいまいな天然源から
の困難な手順によってのみ得られる部分的にのみ定義さ
れた高分子タンパク質BPCに比べて、大きな利点を有す
る。

より詳しくは、この発明は、８〜15個のアミノ酸残基
を含有した新しいクラスの生物学的に高い活性のあるペ
プチドに関するもので、当該残基は３文字のアミノ酸コ
ードを用いた次の基礎的構造式によって表現される。な
お、各アミノ酸残基の下の数字はペプチド連鎖での当該
残基の位置に関連している：ここで、１以上のアミノ酸残基が置換される。使用され
うる置換分Xaa、Yaa及びZaaは次の表Ｉに示される。

好適なペプチドは次のようになる。

本発明の別の面に従って、上に記載された構造式を有
しＣ末端でアミド乃至カルボキシ終端形状での類推ペプ
チドが提供され、１〜15の部位で少なくとも１個、多く
とも７個のアミノ酸残基が省かれ、残りのアミノ酸残基
の少なくとも１個が表Ｉでの置換の概要に従い置換可能
である。

好適なペプチドは次の通りである：別の実施例に従って、上に記載された構造式を有し、
アミノ酸残基の少なくとも１個が省かれ得、残ったアミ
ノ酸残基の少なくとも１個が表Ｉに指摘されたように置
換され得るペプチドは、分子中の最初と最後のアミノ酸
残基の間で新しい結合CO−NHの構成によって環式形状に
変形される。好適なペプチドは次の通りである：出願人は、上に記載したようなペプチドを用いる場
合、そのようなペプチドが親タンパク質BPCのそれと等
しいかそれより大きい生物学的活性を示すことを発見し
た。

既述されたペプチドの薬理学的調査は、「試験管内」
及び「生体内」の異なる一般的モデルに基づき行われ、
次の薬理学的特性が発見された： 1.）肝臓と膵臓に関する保護効果 Seq.Id.No.:2、３、４、６で指定された新しい合成ペ
プチドの保護効果が、ラットの肝臓と膵臓のキズの異な
った実験モデル、即ち、24時間の胆管結紮、24時間の胆
管＋肝動脈結紮、48時間の拘束ストレス、CCl₄施与にお
いて、参照基準（ブロモクリプチン（bromocriptin）、
アマンタジン（amantadine）、ソマトスタチン（somato
statin））と比較された。10μｇ−10ng/kg体重の範囲
で、胃内にか又は腹膜を通してのいずれかで適用された
使用ペプチドは、24時間の胆管結紮、24時間の胆管＋肝
動脈結紮、48時間の拘束ストレス、CCl₄施与を受けた動
物での肝臓と膵臓の壊死、並びに脂肪変化を著しく阻止
する。ビリルビン、SGOT、SGPTの生化学的値は、巨視的
／微視的に言及されたデータに完全に則る。

2.）腎臓障害に関する効果ａ）一方だけの腎摘出実験において、190〜250gの両性のアルビノウィスタ
ー種のラットが用いられた。一方だけの腎摘出が行わ
れ、結果として、残った腎臓の重量の増加が、対照標準
においても、並びに手術の１時間前に10μg/kg体重で腹
膜を通して与えられたペプチドSeq.Id.No.2、３、４、
６で処理されたグループにおいても認められた。ペプチ
ドで処理されたグループにおいては、残った腎臓の隆起
（raise）の低下が一貫して認められた。

両方のグループでの生化学的パラメータが比較され
た。用いられた全てで、残った肝臓の機能が改善したよ
うである。

ｂ）ゲンタマイシンの適用実験において、雌のアルビノウィスター種のラットが
用いられた。30日の期間の間、毎日１度40mg/kgの適用
量で、ゲンタマイシンが適用されて、気管内の損傷が誘
発された。動物の全てが最後の薬の適用から５日で犠牲
となった。著しい気管系の病変が対照標準のグループで
認められ、一方で上記ペプチドで処理された全てのグル
ープにおいて著しく低い微視的病変が一貫して見出され
た。

ｃ）塩化水銀実験において、アルビノウィスター種のラットが用い
られた。塩化水銀（mercury chloride）が2mg/kg体重の
適用量で静脈内に適用され、ペプチドSeq.Id.No.:2、
３、４、６が塩化水銀の適用の１時間前に20μg/kgの適
用量で適用された。対照標準のデータと異なり、生化学
的で微視的な結果が、上記ペプチドで処理されたグルー
プにおいて保護効果を示した。

3.）睾丸病変に関する影響睾丸病変に関するペプチドSeq.Id.No.:2、３、４、６
の影響が、ケトコナゾール（ketoconasol）の適用（胃
内へ24mg/kg）、テストステロン（腹膜を通して30mg/k
g）又は６グレイの照射によって調べられた。ペプチドS
eq.Id.No.:2、３、４、６は１時間前に与えられた。ペ
プチドSeq.Id.No.:2、３、４、６は保護効果を実証し
た。

4.）生殖能力／商業的繁殖ａ）ペプチドSeq.Id.No.2、３、４、６と生殖能力。精
子障害（oligoasthenospermia、精液中の精子数不足と
精子の存続力の減少）に関する影響。調査はあ30〜40才
の10人の男性について、精子障害の診断によって行われ
た。これらの患者から、精液が３〜４に日の禁欲後にと
られた。液化の後（30分）、0.5mlの精液が0.5mlの媒体
の層に加えられた。対照標準の媒体は、10％の不活性化
された弦状の漿液（chordal serum）を有するHAM−F10
からなっている。実験の媒体は、追加的に２μg/ml乃至
４μg/mlのBPCを含有している。ハーウェル型生殖室（H
orwell Fertility Chamber）中で、５％のCO₂を含有す
る大気中で37℃で90分間のトラベリグタイム（travelin
g time）の後、1mlの精液中の進行する可動の、同じ場
所で可動の及び静止した精子の数が測定された。予備的
な結果は低濃度の既述のペプチドの精子の運動性に関す
る影響を示していない。しかしながら、より高い濃度
（４μg/ml）においては、対照標準に関して運動性のか
なりの％が測定された。

ペプチドSeq.Id.No.2、３、４、６と再生プロセス既述のペプチドが３回の妊娠の前歴をもつマウスにお
いて調べられた。最後の乳汁分泌の中止後20日で、動物
は交尾を受けた。使用されたペプチドは、妊娠（19〜21
日）と乳汁分泌（次の３週）の全期間中、日に一度、10
μg/kg体重の適用量で腹膜を通して与えられた。対照標
準のグループは同時に等量の塩水を受けた。雌１匹当た
りの子の数と子の体重とが記録された。

慎重な統計学的分析は、雌１匹当たりの子の著しく増
加した数と、驚くべきことに、調べられた時間間隔のお
のおのでの体重の間に違いがないこととを一貫して示し
た。全ての雌は、乳汁分泌の中止後の次の25日間で回復
することができた。その後、５度目の妊娠に関する影響
の調査のために再び交尾を受けた。

対照標準のグループに関して、乳汁分泌に対し増加し
た能力とともに増加した受精率が、既述のペプチドで処
理された全ての処理グループにおいて記録された。

既述のペプチドがかなり古いマウスにおける生殖能力
を改善できたことに言及されなければならない。結論と
して、それらの結果は、総合的で有益なペプチド能力、
並びに人の精子を用いて得られた試験管でのデータに合
致する。

ｃ）商業的繁殖（全数4306匹のうち）1419匹の健康な豚が生後直ちに
10μｇのペプチドSeq.Id.No.2、３、４、６を受け、別
の1140匹は生後13日目、去勢の１時間前に同じペプチド
を受け、残りの1477匹が在来のFe治療のみを受けた。打
撲傷、えり分け、死亡率、体重及び食物消費が４週間後
に査定された。用いられたペプチドは、一旦適用され、
（生後直ちにペプチドで処理されたグループにおいて）
えり分け率と（ペプチドで処理された全てのグループに
おいて）打撲傷率とを著しく減少する。同じ体重が、ペ
プチド処理され、食物消費も際立って低い動物において
得られた。感染症に関する影響：生後28日の大腸菌によ
る全腸炎（E.colli enterocolitis）にかかっている40
匹の離乳した豚が調べられた。用いられたペプチドは20
匹の動物（10μg/kg体重で筋肉内に）適用された。１ケ
月後、死亡率の著しい低下がペプチド処理された動物に
認められた。

別の試験において、最初の１週間後の死亡率が全数12
00匹の健康な豚において調べられた。400匹の動物が在
来のfe治療に加えて、生後直ちに既述のペプチドを受け
た。著しく低い死亡率が、既述のペプチドで（10μg/kg
体重で筋肉内に）処理されたグループにおいて認められ
た。

5.）アンフェタミン作用に関する影響ペプチドSeq.Id.No.2、３、４、６の影響が、アンフ
ェタミンを適用する５分前か同時に腹膜を通して10μg/
kg乃至10ng/kg体重の適用量において調べられた。既述
のペプチドで処理されたグループにおいて、アンフェタ
ミンで誘発された作用的障害が著しく減少することが認
められた。

6.）出血時間ペプチドSeq.Id.No.2、３、４、６の影響が、（出血
の３時間前に1000UI/kgで皮下に）ヘパリンを適用する
ものとしないものとでマウスとラットにおいて通常の出
血検査（尻尾の切断又は切開）によって調べられた。調
べられたペプチド（腹膜を通して10μg/kg乃至10ng/k
g）は出血誘発と同時に適用された。調べられたペプチ
ドで処理された全ての動物において、出血時間の著しい
減少が認められた。

7.）去勢の重大性に関する影響 Allen−Doisy法に従う修正された手順が行われた。種
々の適用量が、前処理又は後処理として、１回の適用又
は日に１度の摂生において、適用された（腹膜を通して
10μg/kg乃至10ng/kg）。調べられたペプチドで処理さ
れたグループにおいて、異なる去勢の重大性（例えば、
膣の上皮の萎縮、骨粗しょく症（osteoporosis）の予防
又は転換が認められた。

8.）高血圧高血圧は、片側の腎動脈の閉塞によって誘発された。
10日後、動物は、各種の実験計画案（単独又は連続適
用）を用いて、ペプチドSeq.Id.No.2、３、４、６（腹
膜を通して10μg/kg乃至10ng/kg体重）か塩水で処理さ
れた。調べられたペプチドで処理されたグループにおい
て、上昇した血圧値の著しい減少が観察された。

9.）実験に基づく真性糖尿病に関する影響 175〜230g体重のウィスターの雄のアルビノラット
が、ストレプトゾトシン又はアロキサンで誘発される真
性糖尿病に用いられた。10又は100μg/kgの適用量で適
用されたペプチドSeq.Id.No.2、３、４、６は、ストレ
プトゾトシンで処理された動物において、糖尿病の兆候
をかなり遅らせる。更に、生存時間をかなり引き延ばし
た。

10.甲状腺上皮小体切除に関する影響ウィスターラットにおける甲状腺上皮小体の総切除が
行われた。その後、異なる実験計画案（単独又は繰り返
し処理）を用いて、ペプチドSeq.Id.No.2、３、４、６
（腹膜を通して10ng/kg体重）か塩水（腹膜を通して5ml
/kg体重）で処理された。調べられたペプチドで処理さ
れたグループにおいて、腺切除の重大性がかなり減少し
た。

11.）頚動脈の動脈結紮動物は両方の頚動脈の動脈結紮の後、３時間で犠牲に
なった。１時間前に全ての動物はペプチドSeq.Id.No.
2、３、４、６（腹膜を通して10ng/kg体重）か塩水（腹
膜を通して5ml/kg体重）で処理された。調べられたペプ
チドで処理されたグループにおいて、脳浮腫が著しく低
くなることが見出された。

12.）副腎副腎の損傷誘発のために動物はアニリンを受けた（７
日間に皮下に300mg/kg）。全ての動物は、同時にペプチ
ドSeq.Id.No.:2、３、４、６（腹膜を通して10μg/kg体
重、10ng/kg体重）か塩水（腹膜を通して5ml/kg体重）
で処理された。副腎の重さ及び微視的な変化が査定され
た。アニリン対照標準のグループに関して、調べられた
ペプチドは両適用量において副腎の重量のアニリン誘発
された増加を著しく減少した。微視的な保護が投与量に
依存した。アニリンで誘発された障害がACTH分泌過多に
関連があることが一般に受け入れられているので、調べ
られたペプチドとACTHとの間で因果関係を確立すること
が可能であった。これは、既述のペプチドで処理された
グループと実験を受けていない健康な対照標準のグルー
プとで同じ重量であることが見出されたことによって支
持されたようにも思われる。

加えて、動物は、調べられたペプチドで前処理された
（腹膜を通して／胃内に10μｇ又は10ng/kg体重）後
に、48時間抑制ストレス手続きを受けた。調べられたペ
プチドで処理された動物における副腎の増加した重量の
減少が、対応する微視的な観察と一致した。

13.）温度障害体温の上昇が、酵母溶液の適用（皮下に4000mg/kg）
によって引き起こされ、温度低下が、温度４℃の冷水で
の浸漬を用いて又はレセルピン適用（腹膜を通して5mg/
kg）で誘発された。温度上昇と低下の両方で調べられた
ペプチドSeq.Id.No.2、３、４、６（腹膜を通して10ng/
kg体重）の異なる摂生が、両方の温度障害を正常化する
ように一貫して実証された。

14.）血液生成に関する影響アルビノ種のマウスに、LD₅₀の投与量で細胞成長抑制
剤（エンドキサン、ビンクリスチン、アドリアブラスチ
ン、サイトシンアラビシド（Cytosinarabinosid））が
注射された。細胞成長抑止剤を適用される１時間前に、
動物は10μｇの投与量でペプチドSeq.Id.No.2、３、
４、６が処理され、一方、対照標準が等量の塩水を受け
た。動物は実験から３日、５日、７日及び11日目に犠牲
になった。血液中のパラメータ（Ｅ、Hb、Htc、Ｌ、Tb
abs.好中球数）、骨髄、肝臓と脾臓の細胞構造と組織構
造が査定された。

実験から３日目に、Ｌ、Ｅ、Tb及び好中球値において
グループ間に違いは観察されなかったが、ペプチドで処
理された動物の骨髄中の無傷の造血細胞とは異なって、
対照標準では形成不全の差異が強く認められた。

好中球と白血球の数が、11日目前まで正常化が観察さ
れなかった対照標準とは異なって、ペプチドで処理され
た動物において５日目までに著しく増加し、７日目まで
に通常値に達した。

15.）苦痛の減少苦痛は２％MgSO₄又は0.6％酢酸の腹膜を通した適用
（0.2ml/マウス）によって誘発された。適用の時間又は
適用量に関するペプチドSeq.Id.No.2、３、４、６の
（腹膜を通して10μｇ又は10ng/kg、同時に又は30分前
に）各種摂生が、対照標準のグループに比べて悶え苦し
む時間をかなり減少する。

16.）各種リケッチア属により誘発された感染症 10^-9に溶解されたＱ熱病原体（Coxielle Burnetti）
の懸濁液0.2mlが適当な卵に注射された。当該卵に、ペ
プチドSeq.Id.No.2、３、４、６（1pg、10pg、100pg及
び1ng）も注射された。生存時間は、対照標準に比べ
て、処理されたグループで著しく長くなった。

17.）腫瘍細胞に関する影響ａ）２列の細胞系Ｌ−924と黒色腫Ｂ−16が標準条件に
おいて試験管内で培養された。試験管内で、既述の細胞
培養の成育に関するペプチドSeq.Id.No.2、３、４、６
の影響が調べられた。細胞培養の開始から２日で、既述
のペプチドが３％濃度（0.1ml）で加えられた。３日
後、培養当たり細胞数が細胞計数器によって測定され
た。その結果は、Ｂ−16黒色腫細胞での既述のペプチド
の抑制効果を示した。

ｂ）エールリッヒ腹水腫瘍（Erlich's ascites tumor,E
AT）は、腫瘍細胞の施与の方法に依って、腹水腫瘍か充
実性腫瘍のいずれかとしてマウスの全ての血統において
成長しうる腫瘍である。マウスの生存時間に関して皮下
に又は腹膜を通して注射されたペプチドSeq.Id.No.2、
３、４、６でのEAT細胞の培養の影響が調べられた。動
物が45日の間、観察された。NMRI血統の15匹の雄のマウ
スの対照標準が0.4×10⁶EAT細胞を受けた。注射に先立
ち、腫瘍細胞が塩水中において４℃で１時間培養され
た。注射量は0.2mlであった。このグループでの中央生
存時間は36日で、3/15だけが45日生存した。

実験グループの15匹のNMRIの雄のマウスが、同じ量で
同じ投与量の腫瘍細胞を受けたが、これら細胞は予め既
述のペプチド溶液（２μg/ml）中で培養された。僅かに
2/15のマウスがが観察期間（45日）の間に死亡し、残り
の全ては45日以上生存した。対照標準と実験のグループ
の間での差異は著しく異なった（Ｐ＜0.01）。同じ手順
を用いEATを（皮下への代わりに）腹膜を通して注射し
た場合にも同じ結果が観察された。

ｃ）黒色腫又は悪性乳癌（aplastic mamas cercimoma）
細胞の注射により誘発された肺転移（metastases）に関
する（腹膜を通して10μg/kg体重の投与量で与えられ
た）ペプチドSeq.Id.No.2、３、４、６の影響の調査の
ためにマウスが用いられた。ペプチドで処理されたグル
ープにおいて、肺転移数の著しいの減少が測定された。

上記データに基づき、既述のペプチドが腫瘍を持つ動
物の生存時間を引き延ばし、抗腫瘍活動を示したことを
述べることができた。

18.）抗抑鬱活性抗抑鬱活性の発現のために、ポーゾルト等、Eur.J.Ph
armacol.、47,379〜391頁（1978）に従う強制遊泳試験
が用いられた。

雄のウィスターのラット（180〜240g体重）が、この
実験に用いられた。調べられたペプチドSeq.Id.No:4
が、既述の実験計画案に従って適用された。簡単に、対
照標準の動物は食塩水を受け、走査は５分間で、動けな
い時間が計算された。対照標準での動けない時間は150
秒であり、一方、ペプチドで処理された動物では僅かに
60〜70秒の値が観察された。投与量レスポンスの曲線が
次のようにして計算された。即ち、10μｇ〜10ng/kgで
充分が効果が、10pg/kg体重で活性がなお存在し、1pg/k
gで効果が存在しない。

これらペプチドの薬理学的調査の以下の結果は、スト
レスと疾患に対して有機体を保護するための意味、一般
的に有機機能を正常化するための意味において活性を示
す。

それらペプチドの使用は、幾つかの人間又は動物の疾
患と障害の予防と治療に効果的でもある。より詳しく
は、これら化合物は次の処理に用いられよう。

−ストレスで誘発された障害と病気 −肝臓と膵臓の障害と病変 −睾丸萎縮と精子移動性 −生殖能力の障害 −商業的繁殖の改善 −各種リケッチア属の病気 −甲状腺上皮小体切除 −真性糖尿病 −副腎の障害 −血液生成系の障害 −凝固作用の障害 −出血の障害 −去勢後の／閉経の障害 −虚血及び毒性障害 −精神医学的障害 −高血圧 −体温障害 −苦痛 −腫瘍 −抑鬱症一般に、既述のペプチドは、充填剤、非毒性の緩衝剤
又は生理的食塩水のような非毒性の薬剤キャリア又は媒
介物と組み合わせて、かなり広範囲の薬剤構成物におい
て用いることもできる。そのような薬剤構成物は局所的
に又は全身的に用いることができ、液体、固体、半固
体、注射可能な溶液、錠剤、軟膏、ローション、カプセ
ル、舌下錠のようにどのような適当な形態でもよい。

これらペプチドは、一般に、全身的に適用される際
に、体重の10^-5〜10^-2mg/kgの適用量で投与される。局
所的に投与される際、それらはより高い濃度、例えば0.
1％〜0.5％で用いられる。

非常に好ましいことに、50mg/kg体重の投与量まで何
ら毒性の兆候がなく、経口投与（胃内へ）によって化合
物の良好な活性もある。

ここに記載されたペプチドは、均質な液体系中での保
護アミノ酸の段階的濃縮を用いること、また望ましくは
固相法（solid phase method）を用いることで合成する
ことができる。環状ペプチドの調製のために、所望の長
さの部分的に保護された線形ペプチドが、Ｃ末端でのア
ルキルエステル群とともに、そしてアジ化物に転化さ
れ、次いで結合され、保護されて調製される。選択的
に、自由末端群を有した部分的に保護された線形ペプチ
ドが、非常に薄い溶液中でジフェニルホスリルアジ化物
によって環式化されうる。

本発明は次の例に関して記載されるが、本発明の範囲
はそれによって限定されるものではない。

例１ Boc計画を用いるペプチド合成ペプチド合成は、Ｃ−末端カルボキシペプチドを作る
ために、Boc−Val−PAM樹脂100mgで始められて行われた
（応用バイオ系から購入されたPAM、置換物0.56meq/gは
アミノポリスチレンのアミノ−アシル−４−（オキシメ
チル）−フェニル酢酸誘導体である。）。Bocアミノ酸
（Boc＝第三級ブトキシカルボニル基−）は、濃縮試薬
としてジイソプロピルカルボジイミド（DIPC）を用いて
重合体キャリアにおいて次々の濃縮された。各段階にお
いて、Bco群はジクロロメタン中でトリフルオロ酢酸（T
FA）の50％溶液で除去された。その後アミノ酸はジイソ
プロピルエチルアミンで陽子を取り除かれた。

各段階での転化は99.5％よりも高くなければならな
い。そうでない場合、濃縮は繰り返された。完全な合成
後、開裂が低いHF手続き（０℃で２時間）で行われた。
カルボニウムイオン除去剤としてアニソールが用いられ
た。HFは窒素の流れによって蒸発された。未処理の生ペ
プチドがその後、油性残基をドライエーテルに注ぐこと
によって得られた。

そして生ペプチドが、シリカゲルRP−18を充填した５
×150mmのコラム、溶媒系での傾斜溶出：水／アセトニ
トリルでの0.1％TFAを用いて逆相HPLCで浄化された。検
出:225nmでの紫外線吸収。Seq.Id.No:4でのペプチドの
合成は図１に示される。

例２ Fmoc計画を用いるペプチド合成標準的なFmoc保護アミノ酸が合成に用いられた（Fmoc
＝９−フルオレニルメチルオキ−カルボニル基−）。側
鎖機能はＯ−第三級ブチルエステル（Asp、Apm、Glu、A
ad）として、及びBoc誘導体（Lys）として保護された。
第一アミノ酸（Val）は、カップリング試薬としてジイ
ソプロピルカルボジイミド用いて、重合体キャリア−BH
A樹脂（BHA＝ベンゾヒドリルアミノ樹脂）に結合され
た。各段階で、Fmoc保護群はピペリジンと共に除去され
た。その後、第二等、以降のすべてのアミノ酸は、合成
が完了するまで、同じようにして導かれた。開裂はTFA/
TFMSA/アニソール＝2:17:52（vol/vol）の混合物によっ
て行われた。

その後ペプチドは例１に記載されたHPLC法を用いて浄
化された。Seq.Id.No:2でのペプチドの合成は図２に示
される。

例３ Ddz計画を用いるペプチド合成すべてのアミノ酸が、Ddz（＝α、αジメチル−３、
５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基−）によっ
てそのαアミノ機能で保護され用いられた。副機能はＺ
群（＝ベンジルオキシカルボニル基−）によってリジン
が、Ｏ−ｔ−Bu群（ｔ−ブチルエステル）によってアス
パラギン酸及びグルタミン酸が保護された。

1.4mmol/gのキャパシティーを備えた（クロロメチル
化されたポリスチレンゲルを架橋された）メリフィール
ド支体（Merrifield support:ポリマー樹脂）が、その
セシウム塩を介して第一Ddz−アミノ酸の結合に用いら
れた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）の濃縮
後、Ddz保護群は、ジクロロメタン中で５％TFAを用いた
各段階で除去され、次いで洗浄され、ジクロロメタン中
で10％トリエチルアミンで陽子を取り除かれた。陽子除
去後、次のカップリング段階が、同じ方法を用いて引き
継がれた。当該カップリング段階は、ペプチドシーケン
スが完了するまで繰り返された。

最後にペプチドは、HBr/TFA/アニソール混合物を用い
て重合体キャリアから開裂された。揮発性部分の蒸発
後、丁度開裂されたペプチドはドライエーテルから沈澱
され、乾燥された。その後、生ペプチドは例１に記載さ
れたようにHPLC法によって浄化された。

Seq.Id.No:6でのペプチドの合成は図３に示される。

例４環式ペプチドの合成部分的に保護された形態でのペプチド：は予め例１又は２に記載された方法に従って調製され
た。

ジメチルホルムアミド中のこのペプチドの0.0005モル
溶液は、ジフェニルホスホリルアジ化物及びトリエチル
アミンを添加した後に20℃、12時間で環化された。

そしてこの混合物が、水素／パラジウム木炭触媒で25
℃、８時間水素化された。

溶媒は注意深く蒸発され、未処理の生成物は、例１に
記載されたHPLCを用いて浄化された。

Seq.Id.No:10での環式ペプチドが10％収率で得られた。

Ddz計画を用いる線形及び環式ペプチドの合成群を保護するDdzでの同じ計画が、線形及び環式ペプ
チドを得るのに用いられた。副機能はＺ群（リジン）
で、及びＯ−ベンジルエステル群−OBzl−（グルタミン
酸及びアスパラギン酸）で保護された。重合体キャリア
はHYCRAM^R樹脂（ORPEGEN社、ドイツ、ハイデルベルクの
商標）で、これは４−ブロモクロトニル−β−アラニル
アミドメチル−ポリスチレンである。第一アミノ酸（Dd
z−バリン）はそのセシウム塩を介して重合体キャリア
に結合した。

その後Ddz群はジクロロメタン中でトリフルオロ酢酸
（５％）を用いて除去され、アミノ群はジイソプロピル
エチルアミンで陽子を取り除かれた。次の段階におい
て、Ddz−グリシンは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ールの存在でジイソプロピルカルボジイミド（DIPC）を
用いて、ポリマーマトリックスのバリン残基に結合し
た。

これらの段階は、ペプチド連鎖が完了するまで繰り返
された。合成された保護形態でのペプチドは、その後酸
素のない無水テトラヒドロ−フランに溶けたテトラキス
（トリフェニル−ホスフィノ）−パラジウム（Ｏ）でHY
CRAM^Rキャリアから注意深く開裂された。モルホリンの
ような添加剤がアリル群の受体分子として用いられた。

重合体キャリアが濾過され、テトラヒドロフランで洗
浄された。ペプチドの溶液がその後シリカゲルの短いコ
ラムを通して濾過され、パラジウム触媒が除去された。

部分的に保護されたペプチド4aを含有する溶出液が、
真空での溶媒の蒸気後、乾燥された。

Seq.Id.No:4での線形ペプチドの合成部分的に保護されたペプチド4aが２、２、２トリフル
オロエタノールに溶解され、木炭でのパラジウムの存在
（10％）において30℃で水素ガスによって水素化され
た。触媒が濾過され、溶媒が真空で蒸発された。その
後、未処理の残基は例１に記載されたようないHPLC法を
用いて浄化された。浄化後、Seq.Id.No:4でのペプチド
が得られた。当該生成物は例１で得られた化合物と同じ
であった。

Seq.Id.No:9での環式ペプチドの合成部分的に保護されたペプチド4aは、ジメチルホルムア
ミド／ジクロロメタン（1:1）に溶かされ、0.001モル溶
液が形成された。環化のために、DIPCとHOBtが加えら
れ、20℃で10時間おかれた。その後当該溶液は、濃縮さ
れた小さな要量となり、２、２、２トリフルオロエタノ
ールで希釈され、Sephadex LH−20で充填されたコラム
を通すことで浄化された。部分的に保護された環式ペプ
チド9aを含有する留分が集められ、８時間の水素バブリ
ングと激しい撹拌によって30℃で木炭でのパラジウム
（10％）触媒で水素化された。

その後、触媒が濾過によって除去され、溶液は真空で
の溶媒蒸発によって乾燥された。未処理の生ペプチド
は、例１で記載された方法を用いてHPLCによって追加的
に浄化された。得られた純環式ペプチドはSeq.Id.No:9
でのペプチドと同じである。

Ddz計画と環化を用いたHYCRAM^R重合体キャリアでの合
成は、図４及び５に示された。合成されたペプチドの全
ては、シリカゲルRP−18（オクタデシルシラン化され
た）のコラムを用いてHPLC法によってその純度をチェッ
クされ、通常の様式において水／アセトニトリル／トリ
フルオロ酢酸からなる溶媒の混合物で傾斜して溶出され
た。全ての場合において、純度は95％以上であった。

ペプチドはアミノ酸分析（値は理論の±10％以内であ
った）、連続分析、マス−FAB分光測定法で決定された
分子量、紫外線及び赤外線スペクトルで特徴づけられた
（図６及び７）。

我々の発明の或る実施例のみが特別詳細に記載された
が、所謂当業者にとって、多くの他の特有の実施例の実
施でき、多くの変更もすべて、本発明の精神と書き添え
られたクレームの範囲のうちで行いうることも明らかで
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＢＵＡ６１Ｋ 37/02 ＡＣＪＡＢＹＡＤＰＡＣＢＡＢＹＡＣＪＡＣＢＡＣＶＡＢＮＡＤＰＡＡＢＡＤＵＡＢＵ // Ｃ０７Ｋ 7/06 ＡＤＵ 7/08 ＡＡＫ 14/435 ＺＮＡＡＡＨ (73)特許権者 999999999 グラバレヴィクゼリコクロアチアハーエル・41000 ザグレブレルマノーヴァ 12アー (73)特許権者 999999999 ロツクヴィクイーヴォクロアチアハーエル・41000 ザグレブクヴェツノナセリエ１／21 (73)特許権者 999999999 ドゥヴニャクマルコクロアチアハーエル・41000 ザグレブローザルクセンブルグ４ (73)特許権者 999999999 トゥルコヴィクブランコクロアチアハーエル・41000 ザグレブバウエロヴァ 19 (73)特許権者 999999999 ミーセステパンクロアチアハーエル・58000 スプリトルズヴェルトーヴァ 37 (73)特許権者 999999999 スチャネクエルネストクロアチアハーエル・41000 ザグレブアレヤファウポポヴィカ 125 (73)特許権者 999999999 ミルドナーボリスクロアチアハーエル・41000 ザグレブコペルニコヴァ 34 (73)特許権者 999999999 ウドヴィチクイヴァンスイスツェーハー・6370 シュタンスエンネトモーザーシュトラーセ 16 (72)発明者シキリクプレドラグクロアチアハーエル・41000 ザグレブユリシェヴァ５ (72)発明者ペテクマリヤンクロアチアハーエル・41000 ザグレブヴィスニカ 29 (72)発明者サイヴェルトスヴェンクロアチアハーエル・41000 ザグレブパルモティチェヴァ 17 (72)発明者グラバレヴィクゼリコクロアチアハーエル・41000 ザグレブレルマノーヴァ 12アー (72)発明者ロツクヴィクイーヴォクロアチアハーエル・41000 ザグレブクヴェツノナセリエ１／21 (72)発明者ドゥヴニャクマルコクロアチアハーエル・41000 ザグレブローザルクセンブルグ４ (72)発明者トゥルコヴィクブランコクロアチアハーエル・41000 ザグレブバウエロヴァ 19 (72)発明者ミーセステパンクロアチアハーエル・58000 スプリトルズヴェルトーヴァ 37 (72)発明者スチャネクエルネストクロアチアハーエル・41000 ザグレブアレヤファウポポヴィカ 125 (72)発明者ミルドナーボリスクロアチアハーエル・41000 ザグレブコペルニコヴァ 34 (72)発明者ウドヴィチクイヴァンスイスツェーハー・6370 シュタンスエンネトモーザーシュトラーセ 16 (56)参考文献特開平２−225497（ＪＰ，Ａ) 特開平２−223594（ＪＰ，Ａ) 特開平４−149198（ＪＰ，Ａ) 特表平６−509588（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／17195（ＷＯ，Ａ１) 欧州公開432400（ＥＰ，Ａ１) Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｕｔｅｒｏｌ．２（４）ｐ234−236 （1992) Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｕｔｅｒｏｌ．１（１）ｐ87−90 （1991) ＡｃｔａＰｈｙｓｉｏｌ．Ｈｕｎｇ 80（１−４）ｐ89−98（1992) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 37/02 C07K 14/435,7/06,7/08 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】８〜15個のアミノ酸残基からなり、次の一
般式によって表され、XaaがAla、bAla、Leu、Ile、Gly、Va
l、NleおよびNvaから選ばれる中性の脂肪族アミノ酸残
基を表し、YaaがLys、Arg、OrnおよびHisから選ばれる
塩基性のアミノ酸残基を表し、ZaaがGlu、Asp、Aadおよ
びApmから選ばれる酸性のアミノ酸残基を表し、位置２
でのZaaから位置９でのAlaからなるアミノ酸残基鎖が必
須であり、少なくとも１個で最大７個のアミノ酸残基が
省略され得、更に位置10でのAspがAsnで代替可能であ
る、新しい種類のペプチドを含有する、肝臓及び膵臓の
障害と病変の治療用医薬組成物。
【請求項２】睾丸の萎縮と精子易動性の処置に用いられ
る請求項１記載のペプチドを含有する組成物。
【請求項３】請求項１記載のペプチドを含有する、受胎
能力障害の治療用医薬組成物。
【請求項４】商業的繁殖の改善に使用される請求項１記
載のペプチドを含有する組成物。
【請求項５】請求項１記載のペプチドを含有する、リケ
ッチア属の病気の治療用医薬組成部物。
【請求項６】甲状腺上皮小体切除の処置に用いられる、
請求項１記載のペプチドを含有する医薬組成物。
【請求項７】請求項１記載のペプチドを含有する、真性
糖尿病治療用医薬組成物。
【請求項８】請求項１記載のペプチドを含有する、副腎
の障害の治療用医薬組成物。
【請求項９】請求項１記載のペプチドを含有する、造血
系の障害の治療用医薬組成物。
【請求項１０】請求項１記載のペプチドを含有する、凝
固作用の障害の治療用医薬組成物。
【請求項１１】請求項１記載のペプチドを含有する、出
血の障害の治療用医薬組成物。
【請求項１２】請求項１記載のペプチドを含有する、去
勢後／閉経後の障害の治療用医薬組成物。
【請求項１３】請求項１記載のペプチドを含有する、虚
血及び毒性病変の治療用医薬組成物。
【請求項１４】請求項１記載のペプチドを含有する、精
神医学的障害の治療用医薬組成物。
【請求項１５】請求項１記載のペプチドを含有する、高
血圧症の治療用医薬組成物。
【請求項１６】請求項１記載のペプチドを含有する、体
温障害の治療用医薬組成物。
【請求項１７】請求項１記載のペプチドを含有する、苦
痛の処置に用いられる医薬組成物。
【請求項１８】請求項１記載のペプチドを含有する、腫
瘍の処置に用いられる医薬組成物。