JP2809458B2 - 膜翅目昆虫毒、タンパク様あるいはポリペプチド成分、あるいはタンパク様あるいはポリペプチド成分のアナログを含む薬剤を用いた、哺乳類の感染症の処置に用いる方法および組成物 - Google Patents
膜翅目昆虫毒、タンパク様あるいはポリペプチド成分、あるいはタンパク様あるいはポリペプチド成分のアナログを含む薬剤を用いた、哺乳類の感染症の処置に用いる方法および組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 相互参照 本発明は、1987年９月14日にフアイルされた出願番号
第07/096,628号に一部継続するものである。
第07/096,628号に一部継続するものである。
序文 本発明は、細菌、ウイルスの感染およびガンに対して
有用な他の一次的化学的薬剤の活性および、特に抗生剤
の活性を促進するための、天然に産する特定の二次薬剤
およびその合成アナログ（類似体）の利用に関するもの
である。抗菌、抗ウイルス、抗ガン剤および、特に抗生
剤の実体、ならびにこれらの物質の活性および治療薬と
しての用法は良く知られている。これらの一次的抗感染
剤の活性促進に関する発明で用いられる二次的薬剤も、
本質的にはわかつており、いくつかの例では医薬として
用いられているが、抗菌、抗ウイルス、抗ガン剤およ
び、特に抗生剤の活性促進能に関してはこれまで認識さ
れていない。発明で用いられた二次的薬剤のあるもの
は、これに制限されるわけではないが、単なる例として
挙げると、ミツバチ、マルハナバチ、スズメバチ、大ク
マバチ、アカアリなどを含む、膜翅目の昆虫の毒から主
に取られている。
有用な他の一次的化学的薬剤の活性および、特に抗生剤
の活性を促進するための、天然に産する特定の二次薬剤
およびその合成アナログ（類似体）の利用に関するもの
である。抗菌、抗ウイルス、抗ガン剤および、特に抗生
剤の実体、ならびにこれらの物質の活性および治療薬と
しての用法は良く知られている。これらの一次的抗感染
剤の活性促進に関する発明で用いられる二次的薬剤も、
本質的にはわかつており、いくつかの例では医薬として
用いられているが、抗菌、抗ウイルス、抗ガン剤およ
び、特に抗生剤の活性促進能に関してはこれまで認識さ
れていない。発明で用いられた二次的薬剤のあるもの
は、これに制限されるわけではないが、単なる例として
挙げると、ミツバチ、マルハナバチ、スズメバチ、大ク
マバチ、アカアリなどを含む、膜翅目の昆虫の毒から主
に取られている。
本発明の要約 本発明は、膜翅目昆虫毒および、それらの毒から単離
された活性のあるタンパク様あるいはポリペプチド成分
および、それらのタンパク様あるいはポリペプチド成分
のアナログが、抗菌、抗ウイルス、抗ガン剤および、特
に抗生剤の活性を促進あるいは増強するという発見に帰
するものである。
された活性のあるタンパク様あるいはポリペプチド成分
および、それらのタンパク様あるいはポリペプチド成分
のアナログが、抗菌、抗ウイルス、抗ガン剤および、特
に抗生剤の活性を促進あるいは増強するという発見に帰
するものである。
本発明は、ペンシルバニア州立大学獣医学部大学院に
提出される予定の、「抗生物質とミツバチ毒との相乗的
活性」と題したローレイン・スミス・マルフインガーに
よる獣医学の学位論文で述べられた研究から生じた。こ
の学位論文の全内容は、引用文献によつて開示されるも
のの一部をなしている。全引用文献は、マルフインガー
の文献目録および、本明細書の末尾に示されているた
め、以下の他者による初期の研究についての引用は、こ
こでは省略されている。
提出される予定の、「抗生物質とミツバチ毒との相乗的
活性」と題したローレイン・スミス・マルフインガーに
よる獣医学の学位論文で述べられた研究から生じた。こ
の学位論文の全内容は、引用文献によつて開示されるも
のの一部をなしている。全引用文献は、マルフインガー
の文献目録および、本明細書の末尾に示されているた
め、以下の他者による初期の研究についての引用は、こ
こでは省略されている。
背景とこれまでの技術 抗菌、抗ウイルス性発ガン、抗ガン物質の利用は、当
業者に広く知られているが、それは、朗々と続けられて
いる研究の課題であり、その大部分は、新たな薬剤の発
見に加え、既知の活性をもつ薬剤の活性を促進する方法
の発見に向けられている。
業者に広く知られているが、それは、朗々と続けられて
いる研究の課題であり、その大部分は、新たな薬剤の発
見に加え、既知の活性をもつ薬剤の活性を促進する方法
の発見に向けられている。
実際、ハチ毒由来のある物質については研究がなさ
れ、ある特定の薬理学的適用例において有用であること
がわかつている。例えば、1984年４月24日発布の米国特
許第4,444,753号明細書は、ハチの毒嚢の内容物からの
抽出物を脱タンパクする事により得られた要素を含む組
成物について記述している。この製品は、免疫賦活活
性、抗ガン活性、抗菌物質の抗菌活性を促進する効果、
および、抗ガン物質の抗ガン活性を促進する効果を有し
ている。この特許において開示される発明は、上述の組
成を含む抗ガン性薬剤、免疫賦活および抗菌剤に向けら
れている。この発明は、その目的において、本件の発明
の目的と類似するものであるが、ハチ抽出液が脱タンパ
ク化による修飾を受け、その結果、抽出液がビウレツト
反応およびスルフオサリサイル酸反応に陰性である点に
おいて異なつている。
れ、ある特定の薬理学的適用例において有用であること
がわかつている。例えば、1984年４月24日発布の米国特
許第4,444,753号明細書は、ハチの毒嚢の内容物からの
抽出物を脱タンパクする事により得られた要素を含む組
成物について記述している。この製品は、免疫賦活活
性、抗ガン活性、抗菌物質の抗菌活性を促進する効果、
および、抗ガン物質の抗ガン活性を促進する効果を有し
ている。この特許において開示される発明は、上述の組
成を含む抗ガン性薬剤、免疫賦活および抗菌剤に向けら
れている。この発明は、その目的において、本件の発明
の目的と類似するものであるが、ハチ抽出液が脱タンパ
ク化による修飾を受け、その結果、抽出液がビウレツト
反応およびスルフオサリサイル酸反応に陰性である点に
おいて異なつている。
上述の特許と同一の発明者に対し、1983年１月25日に
発布された米国特許第4,370,316号明細書もまた、免疫
力の減少した宿主動物を、ハチの毒嚢由来の脱タンパク
化した有効量の抽出液の投与により処置する方法を請求
の範囲に含めている。
発布された米国特許第4,370,316号明細書もまた、免疫
力の減少した宿主動物を、ハチの毒嚢由来の脱タンパク
化した有効量の抽出液の投与により処置する方法を請求
の範囲に含めている。
したがつて、抗菌、抗ウイルスおよび抗ガン物質は良
く知られており、またハチ毒嚢由来の脱タンパク化した
抽出液が、抗菌活性、抗菌活性促進活性および免疫賦活
活性を含む、ある有用な活性を有していることも知られ
ているが、タンパク様の膜翅目毒、およびそのタンパク
様あるいはポリペプチド性抽出液ならびにそのようなタ
ンパク様またはポリペプチド性構成成分の類似体が、実
質的に全ての抗菌、抗ウイルス、制ガンおよび抗ガン薬
剤に対し促進効果をもつことは、以前は知られていなか
つた。こうした一次抗感染薬剤の活性促進は、単独でも
効果的であるようなそうした薬剤の投与による効果を高
めるのみならず、もし単独で用いられた場合効果的でな
い少量のそうした薬剤の投与を有効とする事が可能であ
る。
く知られており、またハチ毒嚢由来の脱タンパク化した
抽出液が、抗菌活性、抗菌活性促進活性および免疫賦活
活性を含む、ある有用な活性を有していることも知られ
ているが、タンパク様の膜翅目毒、およびそのタンパク
様あるいはポリペプチド性抽出液ならびにそのようなタ
ンパク様またはポリペプチド性構成成分の類似体が、実
質的に全ての抗菌、抗ウイルス、制ガンおよび抗ガン薬
剤に対し促進効果をもつことは、以前は知られていなか
つた。こうした一次抗感染薬剤の活性促進は、単独でも
効果的であるようなそうした薬剤の投与による効果を高
めるのみならず、もし単独で用いられた場合効果的でな
い少量のそうした薬剤の投与を有効とする事が可能であ
る。
上述のように、本発明は、一般的に用いられる抗感染
治療薬の活性を促進するために、膜翅目昆虫毒、すなわ
ちそのタンパク様成分あるいはポリペプチド性成分およ
び、そうしたタンパク様成分あるいはポリペプチド性成
分の類似体を利用する事に関連するものである。しか
し、この発明に関する説明を簡単にするために、細菌、
ウイルス感染および発ガンの制御における抗成物質の活
性を促進するための、ミツバチ毒あるいはそのタンパク
様抽出液であるメリチン（melittin）の利用に関して、
以下において説明を目的として議論されるだろう。ミツ
バチ毒（HBV）は、容易に入手できることから選ばれ
た。しかし、他の膜翅目毒および、そのタンパク様成分
あるいはポリペプチド性成分、ならびにその類似体も対
象の変化に応じた発明においても有効である。同様に、
抗生物質以外の抗感染薬剤も、以前にも処置を受けたこ
とがあるが、タンパク様膜翅目昆虫薬剤との組み合わせ
によつてさらに効果の促進を伴う、感染に対する処置に
ついて本発明で用いられることが可能だろう。
治療薬の活性を促進するために、膜翅目昆虫毒、すなわ
ちそのタンパク様成分あるいはポリペプチド性成分およ
び、そうしたタンパク様成分あるいはポリペプチド性成
分の類似体を利用する事に関連するものである。しか
し、この発明に関する説明を簡単にするために、細菌、
ウイルス感染および発ガンの制御における抗成物質の活
性を促進するための、ミツバチ毒あるいはそのタンパク
様抽出液であるメリチン（melittin）の利用に関して、
以下において説明を目的として議論されるだろう。ミツ
バチ毒（HBV）は、容易に入手できることから選ばれ
た。しかし、他の膜翅目毒および、そのタンパク様成分
あるいはポリペプチド性成分、ならびにその類似体も対
象の変化に応じた発明においても有効である。同様に、
抗生物質以外の抗感染薬剤も、以前にも処置を受けたこ
とがあるが、タンパク様膜翅目昆虫薬剤との組み合わせ
によつてさらに効果の促進を伴う、感染に対する処置に
ついて本発明で用いられることが可能だろう。
さらに詳しい背景として、ミツバチ毒は、多数の有用
な活性をもつことが示されている。その活性のいくつか
は科学的に報告がなされているが、一方、他のものは経
験的なデータや伝承に基づくものと思われる。ミツバチ
毒のin vitroにおける抗菌活性については詳しい報告が
あるが（シユミツト−ランゲ,1951;オーテルとマークワ
ード,1955;フエンネルら,1968）、しかし、この活性を
実用化する努力はほとんどなされていない。本発明で
は、いくつかの経験的実験から得られたデータが、ミツ
バチ毒の抗菌活性が、抗生物質の共存下では、in vivo
でも有意な効果をもつかも知れないことを示した。これ
らの観察に基づき、ミツバチ毒と抗生物質の相乗作用を
探るために、in vitroのアツセイ系を用いた研究が計画
され、そのアツセイでは、宿主動物の天然の免疫応答に
起因する効果を排除して２つの化合物について評価が可
能である。
な活性をもつことが示されている。その活性のいくつか
は科学的に報告がなされているが、一方、他のものは経
験的なデータや伝承に基づくものと思われる。ミツバチ
毒のin vitroにおける抗菌活性については詳しい報告が
あるが（シユミツト−ランゲ,1951;オーテルとマークワ
ード,1955;フエンネルら,1968）、しかし、この活性を
実用化する努力はほとんどなされていない。本発明で
は、いくつかの経験的実験から得られたデータが、ミツ
バチ毒の抗菌活性が、抗生物質の共存下では、in vivo
でも有意な効果をもつかも知れないことを示した。これ
らの観察に基づき、ミツバチ毒と抗生物質の相乗作用を
探るために、in vitroのアツセイ系を用いた研究が計画
され、そのアツセイでは、宿主動物の天然の免疫応答に
起因する効果を排除して２つの化合物について評価が可
能である。
この研究では、３種の異なる抗生物質に対し、それぞ
れの抗生物質について、ミツバチ毒に関する独立のチエ
ツカーボード希釈列を用いて、３株の細菌がはじめに試
験された。３つの主要な抗生物質群の代表（ペニシリ
ン、アミノグリコシドおよびポリミキシン）が選択さ
れ、ミツバチ毒がこの選択された抗生物質の抗菌効果を
向上させるかについて決定するためにアツセイを行つ
た。第４の主要な抗生物質群は、以下に述べるように後
に研究された。
れの抗生物質について、ミツバチ毒に関する独立のチエ
ツカーボード希釈列を用いて、３株の細菌がはじめに試
験された。３つの主要な抗生物質群の代表（ペニシリ
ン、アミノグリコシドおよびポリミキシン）が選択さ
れ、ミツバチ毒がこの選択された抗生物質の抗菌効果を
向上させるかについて決定するためにアツセイを行つ
た。第４の主要な抗生物質群は、以下に述べるように後
に研究された。
ひとたびチエツカーボードアツセイにおいて共同効果
が示されれば、単純化された方法を用いて、さらに広範
な調査が試みられた。２枚の自動最少阻害濃度（MIC）
アツセイ板は、同時に11種の抗生物質に対する感受性を
希釈することができるが、これに、非阻害濃度のミツバ
チ毒（HBV）存在、非存在下で、細菌の培養と平行して
植菌する。８種のグラム陽性および４種のグラム陰性菌
が、常にHBVとの共同効果を示す抗生物質のクラスを見
つけ、また、これとは異なるグループの細菌の間でこれ
らの組み合わせによる共同効果のスペクトルを決定する
ためにこの系を用いて試験された。
が示されれば、単純化された方法を用いて、さらに広範
な調査が試みられた。２枚の自動最少阻害濃度（MIC）
アツセイ板は、同時に11種の抗生物質に対する感受性を
希釈することができるが、これに、非阻害濃度のミツバ
チ毒（HBV）存在、非存在下で、細菌の培養と平行して
植菌する。８種のグラム陽性および４種のグラム陰性菌
が、常にHBVとの共同効果を示す抗生物質のクラスを見
つけ、また、これとは異なるグループの細菌の間でこれ
らの組み合わせによる共同効果のスペクトルを決定する
ためにこの系を用いて試験された。
全てのミツバチ毒の検定に加え、毒はサイズ排除クロ
マトグラフイーによつて分画された。４つの画分それぞ
れは、特異的な構成成分が抗菌活性を担つているか、な
らびに抗菌アツセイにおいて共同的に作用することがで
きるかについて検定された。ミツバチ毒の抗菌要素とし
てすでに同定されていた（フエンネルら,1968）メリチ
ンを含む画分が、その精製された形状において活性であ
り、全ミツバチ毒がもつ強度に匹敵する共同効果を示す
であろうことが示された。さらに、膜翅目昆虫毒の活性
成分に対する種々の類似体の活性が調べられ、メリチン
と比較された。
マトグラフイーによつて分画された。４つの画分それぞ
れは、特異的な構成成分が抗菌活性を担つているか、な
らびに抗菌アツセイにおいて共同的に作用することがで
きるかについて検定された。ミツバチ毒の抗菌要素とし
てすでに同定されていた（フエンネルら,1968）メリチ
ンを含む画分が、その精製された形状において活性であ
り、全ミツバチ毒がもつ強度に匹敵する共同効果を示す
であろうことが示された。さらに、膜翅目昆虫毒の活性
成分に対する種々の類似体の活性が調べられ、メリチン
と比較された。
図表の簡単な説明 第１図は、メリチンのアミノ酸配列を図解したもので
ある； 第２図は、S.アウレウスに対するミツバチ毒（HBV）
の抗菌活性を示した、接種後の時間に対する光学密度の
グラフである； 第３図は、S.アウレウスにおいて、アンピシリンとHB
Vに対する、接種後の時間と光学密度を示したグラフで
ある； 第４図は、S.アウレウスにおいて、カナマイシンとHB
Vに対する、接種後の時間と光学密度を示したグラフで
ある； 第５図は、S.アウレウスにおいて、ポリミキシンＢと
HBVに対する、接種後の時間と光学密度を示したグラフ
である； 第６図は、大腸菌において、アンピシリンとHBVに対
する、接種後の時間と光学密度を示したグラフである； 第７図は、大腸菌において、カナマイシンとHBVに対
する、接種後の時間と光学密度を示したグラフである； 第８図は、大腸菌において、アンピシリンとHBVに対
する、接種後の時間と光学密度を示したグラフである； 第９図は、大腸菌において、ポリミキシンＢとHBVに
対する、接種後の時間と光学密度を示したグラフであ
る； 第10図は、カナマイシン耐性のS.アウレウスにおい
て、アンピシリンとHBVに対する、接種後の時間と光学
密度を示したグラフである； 第11図は、カナマイシン耐性のS.アウレウスにおい
て、カナマイシンとHBVに対する、接種後の時間と光学
密度を示したグラフである； 第12図は、カナマイシン耐性のS.アウレウスにおい
て、ポリミキシンＢとHBVに対する、接種後の時間と光
学密度を示したグラフである； 第13図は、100μｇのメリチンタンパク質を電気泳動
した結果を示している； 第14図は、S.アウレウスに対する、メリチン/HBVの抗
菌活性を示した、接種後の時間に対する光学密度のグラ
フである； 第15図は、S.アウレウスにおいて、メリチン/HBVおよ
びカナマイシンに対する、接種後の時間と光学密度を示
したグラフである； 第16図は、S.アウレウスにおいて、リフアンピシンと
HBVに対する、接種後の時間と光学密度を示したグラフ
である； 第17図は、Ps.アエルギノーザにおいて、リフアンピ
シンとHBVに対する、接種後の時間と光学密度を示した
グラフである； 第18図は、大腸菌において、ポリミキシンＢとマルハ
ナバチ毒に対する、接種後の時間と光学密度を示したグ
ラフである； 第19図は、大腸菌において、ポリミキシンＢとスズメ
バチ毒に対する、接種後の時間と光学密度を示したグラ
フである； 第20図は、大腸菌において、ポリミキシンＢとオオク
マバチ毒に対する、接種後の時間と光学密度を示したグ
ラフである； 第21図は、敗血症の単独処置モデルにおいて、処置と
血液1mlあたりの細菌数の常用対数を示したグラフであ
る（ポリミキシンＢとメリチンの相乗作用）； 第22図は、敗血症の反復処置モデルにおいて、処置と
血液1mlあたりの細菌数の常用対数を示したグラフであ
る（ポリミキシンＢとメリチンの相乗作用）； 第23図は、大腸菌において、メリチン／類似体および
ポリミキシンＢに対する、接種後の時間と光学密度を示
したグラフである； 第24図は、メリチンと類似体の相対活性を表す、接種
後の時間と光学密度を示したグラフである； 第25図は、メリチンと類似体の相対活性を表す、接種
後の時間と光学密度を示したグラフである； 第26図は、メリチンと類似体の相対活性を表す、接種
後の時間と光学密度を示したグラフである。
ある； 第２図は、S.アウレウスに対するミツバチ毒（HBV）
の抗菌活性を示した、接種後の時間に対する光学密度の
グラフである； 第３図は、S.アウレウスにおいて、アンピシリンとHB
Vに対する、接種後の時間と光学密度を示したグラフで
ある； 第４図は、S.アウレウスにおいて、カナマイシンとHB
Vに対する、接種後の時間と光学密度を示したグラフで
ある； 第５図は、S.アウレウスにおいて、ポリミキシンＢと
HBVに対する、接種後の時間と光学密度を示したグラフ
である； 第６図は、大腸菌において、アンピシリンとHBVに対
する、接種後の時間と光学密度を示したグラフである； 第７図は、大腸菌において、カナマイシンとHBVに対
する、接種後の時間と光学密度を示したグラフである； 第８図は、大腸菌において、アンピシリンとHBVに対
する、接種後の時間と光学密度を示したグラフである； 第９図は、大腸菌において、ポリミキシンＢとHBVに
対する、接種後の時間と光学密度を示したグラフであ
る； 第10図は、カナマイシン耐性のS.アウレウスにおい
て、アンピシリンとHBVに対する、接種後の時間と光学
密度を示したグラフである； 第11図は、カナマイシン耐性のS.アウレウスにおい
て、カナマイシンとHBVに対する、接種後の時間と光学
密度を示したグラフである； 第12図は、カナマイシン耐性のS.アウレウスにおい
て、ポリミキシンＢとHBVに対する、接種後の時間と光
学密度を示したグラフである； 第13図は、100μｇのメリチンタンパク質を電気泳動
した結果を示している； 第14図は、S.アウレウスに対する、メリチン/HBVの抗
菌活性を示した、接種後の時間に対する光学密度のグラ
フである； 第15図は、S.アウレウスにおいて、メリチン/HBVおよ
びカナマイシンに対する、接種後の時間と光学密度を示
したグラフである； 第16図は、S.アウレウスにおいて、リフアンピシンと
HBVに対する、接種後の時間と光学密度を示したグラフ
である； 第17図は、Ps.アエルギノーザにおいて、リフアンピ
シンとHBVに対する、接種後の時間と光学密度を示した
グラフである； 第18図は、大腸菌において、ポリミキシンＢとマルハ
ナバチ毒に対する、接種後の時間と光学密度を示したグ
ラフである； 第19図は、大腸菌において、ポリミキシンＢとスズメ
バチ毒に対する、接種後の時間と光学密度を示したグラ
フである； 第20図は、大腸菌において、ポリミキシンＢとオオク
マバチ毒に対する、接種後の時間と光学密度を示したグ
ラフである； 第21図は、敗血症の単独処置モデルにおいて、処置と
血液1mlあたりの細菌数の常用対数を示したグラフであ
る（ポリミキシンＢとメリチンの相乗作用）； 第22図は、敗血症の反復処置モデルにおいて、処置と
血液1mlあたりの細菌数の常用対数を示したグラフであ
る（ポリミキシンＢとメリチンの相乗作用）； 第23図は、大腸菌において、メリチン／類似体および
ポリミキシンＢに対する、接種後の時間と光学密度を示
したグラフである； 第24図は、メリチンと類似体の相対活性を表す、接種
後の時間と光学密度を示したグラフである； 第25図は、メリチンと類似体の相対活性を表す、接種
後の時間と光学密度を示したグラフである； 第26図は、メリチンと類似体の相対活性を表す、接種
後の時間と光学密度を示したグラフである。
毒の組成 毒は生化学的な化合物の不均質な混合物である。大部
分の毒は90％以上がタンパク質である。毒素と酵素とが
このタンパク質の部分を占め、直接の細胞障害の原因と
なつている。ホスホリパーゼA2、酸性ホスフアターゼお
よびヒアルロニダーゼなどの多くの酵素が大部分の毒に
共通するものであるが、毒に含まれる毒素およびその他
の生物学的に活性なペプチドは、極めて種特異的であ
る。
分の毒は90％以上がタンパク質である。毒素と酵素とが
このタンパク質の部分を占め、直接の細胞障害の原因と
なつている。ホスホリパーゼA2、酸性ホスフアターゼお
よびヒアルロニダーゼなどの多くの酵素が大部分の毒に
共通するものであるが、毒に含まれる毒素およびその他
の生物学的に活性なペプチドは、極めて種特異的であ
る。
毒を産生する昆虫は全て、膜翅目昆虫に属している。
蛇毒と同様に、ホスホリパーゼA2、ヒアルロニダーゼお
よび酸性ホスフアターゼなどの酵素活性は全ての昆虫毒
に共通である。しかし、毒素およびペプチド成分は、種
間で異なつている（トウ,1977b）。
蛇毒と同様に、ホスホリパーゼA2、ヒアルロニダーゼお
よび酸性ホスフアターゼなどの酵素活性は全ての昆虫毒
に共通である。しかし、毒素およびペプチド成分は、種
間で異なつている（トウ,1977b）。
イタリア・ミツバチ（アピス メリフエラ）の毒は、
最も広く研究された昆虫毒である。ミツバチ毒の主要成
分はメリチンである。このペプチドは2,847ドルトンの
分子量をもち、毒の乾燥重量の約50％を占めている。２
番目のペプチドであるアパミンは、毒の約５パーセント
存在しており、他にいくつかのペプチドが微量存在して
いる（ハバーマン,1972）。
最も広く研究された昆虫毒である。ミツバチ毒の主要成
分はメリチンである。このペプチドは2,847ドルトンの
分子量をもち、毒の乾燥重量の約50％を占めている。２
番目のペプチドであるアパミンは、毒の約５パーセント
存在しており、他にいくつかのペプチドが微量存在して
いる（ハバーマン,1972）。
他の膜翅目昆虫毒は、メリチンと似た生物学的性質を
もつペプチドを含んでいる。それらのペプチドは、例え
ば、マルハナバチ メガボンブス ペンシルバニカス由
来のボンボリチンＩ−Ｖ、ジガバチ、オオクマバチおよ
びスズメバチ由来のマストパランならびに、ヨーロツパ
オオクマバチ由来のクラボリンなどがある。これらのペ
プチドの共通した性質は、その両親媒性である。これら
のペプチドは、配列分析がなされ、その構造もよく知ら
れている（A.アルジオラスとJ.J.ピサノ,1985）。
もつペプチドを含んでいる。それらのペプチドは、例え
ば、マルハナバチ メガボンブス ペンシルバニカス由
来のボンボリチンＩ−Ｖ、ジガバチ、オオクマバチおよ
びスズメバチ由来のマストパランならびに、ヨーロツパ
オオクマバチ由来のクラボリンなどがある。これらのペ
プチドの共通した性質は、その両親媒性である。これら
のペプチドは、配列分析がなされ、その構造もよく知ら
れている（A.アルジオラスとJ.J.ピサノ,1985）。
ミツバチ毒の抗菌活性 ミツバチ毒の殺菌活性は、1941年にW.シユミツト−ラ
ンゲ（1941）によつてはじめて報告された。彼は、大腸
菌とブドウ球菌について調べ、どちらもミツバチ毒の抗
菌活性に感受性であることを見いだした。
ンゲ（1941）によつてはじめて報告された。彼は、大腸
菌とブドウ球菌について調べ、どちらもミツバチ毒の抗
菌活性に感受性であることを見いだした。
それから10年もたたずに、ブランギとパーバン（195
1）はミツバチ毒素の抗菌活性を単離する種々の抽出法
を評価してきた。彼らは、その活性が毒の水抽出物にも
アセトン抽出物にも存在することを見いだした。彼らは
また、その活性が100℃の加熱に対し15分間まで安定で
あることを示した。
1）はミツバチ毒素の抗菌活性を単離する種々の抽出法
を評価してきた。彼らは、その活性が毒の水抽出物にも
アセトン抽出物にも存在することを見いだした。彼らは
また、その活性が100℃の加熱に対し15分間まで安定で
あることを示した。
1955年には、オーテルとマークワード（1955）が、ミ
ツバチ毒の抗菌活性に対し、様々な細菌の間で感受性に
差異があるという研究結果を発表した。296種の細菌が
試験された。その結果、ミツバチ毒に対する寛容性はグ
ラム陽性殺菌よりもグラム陰性細菌出より高くなつてい
ることが示された。殺菌濃度の範囲は、グラム陽性細菌
に対しては12.5μg/mlから25μg/mlで、グラム陰性細菌
に対しては、1mg/mlから10mg/mlと報告された。殺菌活
性は赤血球細胞「直接溶血画分」と共に精製された。
「メリチン」という名称は、まだこの画分の活性成分に
対してつけられているものではなかつた。
ツバチ毒の抗菌活性に対し、様々な細菌の間で感受性に
差異があるという研究結果を発表した。296種の細菌が
試験された。その結果、ミツバチ毒に対する寛容性はグ
ラム陽性殺菌よりもグラム陰性細菌出より高くなつてい
ることが示された。殺菌濃度の範囲は、グラム陽性細菌
に対しては12.5μg/mlから25μg/mlで、グラム陰性細菌
に対しては、1mg/mlから10mg/mlと報告された。殺菌活
性は赤血球細胞「直接溶血画分」と共に精製された。
「メリチン」という名称は、まだこの画分の活性成分に
対してつけられているものではなかつた。
1963年に、ベントンらは、ミツバチ毒のバイオアツセ
イについて発表している。毒の抗菌活性は放射状拡散ア
ツセイ法によつて定量されるが、この方法は、細菌の増
殖層上に、一連の毒希釈法によつて生ずる増殖阻害領域
を測定するものである。このアツセイは、in vivoで使
用するためにミツバチ毒の生物学的活性を規格化する目
的で提出された。（現在、アレルギーの脱感作のみが、
米国食品・薬品局によつて承認されたin vivoにおける
ミツバチ毒療法である。）この論文では、ミツバチ毒活
性の熱感受性についても試験しており、これが滅菌処理
にも耐えることが明らかとなつた（121℃で15分間）
（ベントンら,1963）。
イについて発表している。毒の抗菌活性は放射状拡散ア
ツセイ法によつて定量されるが、この方法は、細菌の増
殖層上に、一連の毒希釈法によつて生ずる増殖阻害領域
を測定するものである。このアツセイは、in vivoで使
用するためにミツバチ毒の生物学的活性を規格化する目
的で提出された。（現在、アレルギーの脱感作のみが、
米国食品・薬品局によつて承認されたin vivoにおける
ミツバチ毒療法である。）この論文では、ミツバチ毒活
性の熱感受性についても試験しており、これが滅菌処理
にも耐えることが明らかとなつた（121℃で15分間）
（ベントンら,1963）。
メリチンの単離と活性 ミツバチ毒は薬理的に活性な化合物を有している。毒
中に最も多く含まれる化合物はメリチンであり、これは
2,847ドルトンの分子量をもつポリペプチドで、赤血球
の直接的溶血素として働く。他の活性化合物には、ホス
フオリパーゼA2、ヒスタミン、ドーパミン、ノルアドレ
ナリン、アパアミンおよびヒアルロニダーゼが含まれて
いる（ハーバーマン,1972）。
中に最も多く含まれる化合物はメリチンであり、これは
2,847ドルトンの分子量をもつポリペプチドで、赤血球
の直接的溶血素として働く。他の活性化合物には、ホス
フオリパーゼA2、ヒスタミン、ドーパミン、ノルアドレ
ナリン、アパアミンおよびヒアルロニダーゼが含まれて
いる（ハーバーマン,1972）。
メリチンの抗菌活性 フエンネル、シツプマンとコール（1968）は、メリチ
ンをセフアデツクスＧ−50クロマトグラフイーで精製
し、メリチン画分が「強力な抗菌活性」をもつことを示
した。彼らは、任意の30種の細菌を試験し（数種の連鎖
球菌、ブドウ球菌および腸内細菌株を含む）、全ミツバ
チ毒に対して、精製したメリチンの活性を比較した。彼
らは、S.アウレウス株のひとつである、ペニシリン耐性
株がメリチンに対して全く感受性の低下を示さないこと
に注目した。
ンをセフアデツクスＧ−50クロマトグラフイーで精製
し、メリチン画分が「強力な抗菌活性」をもつことを示
した。彼らは、任意の30種の細菌を試験し（数種の連鎖
球菌、ブドウ球菌および腸内細菌株を含む）、全ミツバ
チ毒に対して、精製したメリチンの活性を比較した。彼
らは、S.アウレウス株のひとつである、ペニシリン耐性
株がメリチンに対して全く感受性の低下を示さないこと
に注目した。
メリチンはミツバチ毒の抗菌因子であることが報告さ
れていたにもかかわらず、in vivoにおけるその利用の
報告は全く見られなかつた。メリチンとレシチンの間の
相乗作用が、レシチン上のホスフオリパーゼA2とミツバ
チ毒の活性を促進することが、モレーととクレイル（19
74）によつて言及された。しかし、以前は、メリチンが
抗生物質の活性を促進することは認識されていなかつ
た。
れていたにもかかわらず、in vivoにおけるその利用の
報告は全く見られなかつた。メリチンとレシチンの間の
相乗作用が、レシチン上のホスフオリパーゼA2とミツバ
チ毒の活性を促進することが、モレーととクレイル（19
74）によつて言及された。しかし、以前は、メリチンが
抗生物質の活性を促進することは認識されていなかつ
た。
ハーバーマンとジエンシユ（1967）は、メリチンを精
製し、アミノ酸配列を報告した。彼らは、メリチンが天
然には２つの形で存在し、それらはＮ−末端のホルミル
置換においてのみ異なつていることを見いだした（第１
図）。
製し、アミノ酸配列を報告した。彼らは、メリチンが天
然には２つの形で存在し、それらはＮ−末端のホルミル
置換においてのみ異なつていることを見いだした（第１
図）。
膜翅目昆虫毒のタンパク様成分およびポリペプチド性成
分の類似体 以下のメリチン類似体が調製されている。
分の類似体 以下のメリチン類似体が調製されている。
この類似体は、例えばM.ボダンスキー：「ペプチド合
成の原理」、シユプリンガー・フエアラーク,1984によ
つて述べられている従来のペプチド合成法によつて調製
された。
成の原理」、シユプリンガー・フエアラーク,1984によ
つて述べられている従来のペプチド合成法によつて調製
された。
例えば、類似体No.4、いわゆるメリチン（１−20）−
Lys−Arg−Lys−Arg−Gly−Gly−NH2のペプチド合成を
ここでさらに詳細に述べる。
Lys−Arg−Lys−Arg−Gly−Gly−NH2のペプチド合成を
ここでさらに詳細に述べる。
PEPSYN KAという商標で市販されている、ポリジメチ
ルアクリルアミドゲルなどの修飾した樹脂を、（Fmoc−
Gly）2Oと反応させるが、ここで、Fmocは一時的な保護
基として働く９−フルオレニルメトキシカルボニルを示
している。
ルアクリルアミドゲルなどの修飾した樹脂を、（Fmoc−
Gly）2Oと反応させるが、ここで、Fmocは一時的な保護
基として働く９−フルオレニルメトキシカルボニルを示
している。
触媒として４−ジメチルアミノピリジン共存下で行わ
れるこの反応により、エステル化されたFmoc−Gly−Ｏ
−樹脂が形成される。
れるこの反応により、エステル化されたFmoc−Gly−Ｏ
−樹脂が形成される。
このエステルは、DMF中、20％ピペリジン存在下で脱
保護され、その結果Ｈ−Gly−Ｏ−樹脂ができる。
保護され、その結果Ｈ−Gly−Ｏ−樹脂ができる。
脱保護された産物を、次に Fmoc−Gly−OPfp という式をもつ活性型エステルと反応させるが、ここで
Pfpとはペンタフルオロフエニルを表し、この反応の結
果、 Fmoc−Gly−Gly−Ｏ−樹脂 が形成される。
Pfpとはペンタフルオロフエニルを表し、この反応の結
果、 Fmoc−Gly−Gly−Ｏ−樹脂 が形成される。
残りの24アミノ酸は、脱保護と活性型エステルとのカ
ツプリングからなる、同様な20回のサイクルによつてで
きた反応産物と結合する。
ツプリングからなる、同様な20回のサイクルによつてで
きた反応産物と結合する。
このようにして作られた産物は、DMF中、20％ピペリ
ジンによつて脱保護され、形成されたメリチン類似体は
TFA（トリフルオロ酢酸）および、水などの捕捉剤の存
在下で樹脂から切断される。
ジンによつて脱保護され、形成されたメリチン類似体は
TFA（トリフルオロ酢酸）および、水などの捕捉剤の存
在下で樹脂から切断される。
抗生物質 抗生物質は、その抗生物質の活性部位に基づいて機能
的に４つのグループに分けることができる（フオルク,1
978a）。４つのグループの標的構造は細胞壁、細胞膜、
タンパク合成装置および核酸複製装置である。共同作用
アツセイが複雑なため、前述のグループよりそれぞれ１
つ、しめて４つの抗生物質が試験を行うために選択され
た。選択された抗生物質は、アンピシリン、カナマイシ
ン、ポリミキシンＢおよびリフアンピシンである。それ
ぞれは、原核細胞に対し、異なる作用様式を有してい
る。
的に４つのグループに分けることができる（フオルク,1
978a）。４つのグループの標的構造は細胞壁、細胞膜、
タンパク合成装置および核酸複製装置である。共同作用
アツセイが複雑なため、前述のグループよりそれぞれ１
つ、しめて４つの抗生物質が試験を行うために選択され
た。選択された抗生物質は、アンピシリン、カナマイシ
ン、ポリミキシンＢおよびリフアンピシンである。それ
ぞれは、原核細胞に対し、異なる作用様式を有してい
る。
アンピシリン アンピシリンは細胞壁構造に影響を与える抗生物質の
グループに属している。これらの抗生物質は全てアンピ
シリン誘導体であり、それぞれは機能的ベーターラクタ
ム環を含んでいる。全体を通じて、ベーターラクタムグ
ループとして知られるこられの抗生物質は、ペプチドグ
リカンのペンタグリシン架橋を連結するトランスペプチ
ド酵素を阻害することにより、細胞壁の合成を妨害する
ため、活発に生育している細胞のみが、その存在によつ
て影響を受ける。
グループに属している。これらの抗生物質は全てアンピ
シリン誘導体であり、それぞれは機能的ベーターラクタ
ム環を含んでいる。全体を通じて、ベーターラクタムグ
ループとして知られるこられの抗生物質は、ペプチドグ
リカンのペンタグリシン架橋を連結するトランスペプチ
ド酵素を阻害することにより、細胞壁の合成を妨害する
ため、活発に生育している細胞のみが、その存在によつ
て影響を受ける。
アンピシリンは、ペニシリンの半合成誘導体である。
アンピシリン合成の合成段階で、ペニシリンＧのアルフ
ア炭素にアミンが付加される。これにより、（細菌の主
なペニシリン耐性因子である）ペーターラクタマーゼに
対する耐性が賦与され、その結果、アンピシリンが細菌
に対してペニシリンよりも広い作用スペクトルをもつこ
ととなる（フオルク,1978b）。
アンピシリン合成の合成段階で、ペニシリンＧのアルフ
ア炭素にアミンが付加される。これにより、（細菌の主
なペニシリン耐性因子である）ペーターラクタマーゼに
対する耐性が賦与され、その結果、アンピシリンが細菌
に対してペニシリンよりも広い作用スペクトルをもつこ
ととなる（フオルク,1978b）。
カナマイシン カナマイシンは、アミノグリコシドである。この抗生
物質グループは、タンパク合成を妨害する。このグルー
プの抗生物質は細菌の30sリボソームに結合し、アミノ
アシル−tRNAの結合を立体的に阻害するか、あるいはリ
ボソームの活性部位で伸長しているペプチド鎖の転移を
阻害する（フオルク,1979c）。タンパク合成は多くの細
胞機能の調節に必要とされるため、アミノグリコシドは
活発な増殖相あるいは定常期においても、細菌に対して
有効である。
物質グループは、タンパク合成を妨害する。このグルー
プの抗生物質は細菌の30sリボソームに結合し、アミノ
アシル−tRNAの結合を立体的に阻害するか、あるいはリ
ボソームの活性部位で伸長しているペプチド鎖の転移を
阻害する（フオルク,1979c）。タンパク合成は多くの細
胞機能の調節に必要とされるため、アミノグリコシドは
活発な増殖相あるいは定常期においても、細菌に対して
有効である。
ポリミキシンＢ ポリミキシンＢは、環状の両親媒性ペプチドである。
親水性と疎水性の両方の性質を併せもつため、ポリミキ
シンＢは、その作用のために細胞の増殖を必要としない
界面活性剤様の作用をもつている。メリチンと同様に、
ポリミキシンＢは、細胞膜と相互作用をし、細胞膜の疎
水性領域に小さな親水性の孔を形成する。選択的透過性
バリアとして機能する厚いリポポリサツカライド層をも
つグラム陰性細菌では、ポリミキシンＢは浸透圧勾配の
破壊に効果的である。したがつて、ポリミキシンＢはグ
ラム陰性細菌に対して極めて効果的であるが、一方、グ
ラム陽性細菌に対してはほんのわずかな効果しかもたな
い（セベツク,1979）。メリチンは、ポリミキシンＢと
同様な孔を膜に形成させるが、メリチンはグラム陽性細
菌に対してより効果的であり、そのため、メリチンの作
用はポリミキシンＢの作用とは完全に類似したものでは
ない。
親水性と疎水性の両方の性質を併せもつため、ポリミキ
シンＢは、その作用のために細胞の増殖を必要としない
界面活性剤様の作用をもつている。メリチンと同様に、
ポリミキシンＢは、細胞膜と相互作用をし、細胞膜の疎
水性領域に小さな親水性の孔を形成する。選択的透過性
バリアとして機能する厚いリポポリサツカライド層をも
つグラム陰性細菌では、ポリミキシンＢは浸透圧勾配の
破壊に効果的である。したがつて、ポリミキシンＢはグ
ラム陰性細菌に対して極めて効果的であるが、一方、グ
ラム陽性細菌に対してはほんのわずかな効果しかもたな
い（セベツク,1979）。メリチンは、ポリミキシンＢと
同様な孔を膜に形成させるが、メリチンはグラム陽性細
菌に対してより効果的であり、そのため、メリチンの作
用はポリミキシンＢの作用とは完全に類似したものでは
ない。
リフアンピシン リフアンピシンは、核酸合成の段階で作用するグルー
プの抗生物質であり、これまでに言及した４つの主なカ
テゴリーからの抗生物質の最後の例である。
プの抗生物質であり、これまでに言及した４つの主なカ
テゴリーからの抗生物質の最後の例である。
共同作用に関する研究 細菌の系における抗生物質と他の化合物との共同作用
に関する研究論文の総論は、全ての研究者が同一の基本
的研究法を用いていることを示している。細菌の増殖は
培養液中で、それぞれの化合物を別々に加えるか、加え
ない条件で、つぎにそれぞれを一緒に加えて観察され
た。相加作用ではなく、相乗作用であることを証明する
ために、それぞれの場合において、少なくとも１つの化
合物は、それ単独では最少の増殖阻害しか示さないレベ
ルで用いられた。したがつて、比較的不活性な１つの化
合物と用いた場合、その第１の化合物の存在下で第２の
化合物がいかなる活性の上昇を示しても、それは相乗効
果によるものであろう（メレルリングら,1971;カリゾー
サとレビソン,1981;シナモンとパルマー,1983）。本発
明の実験は、このタイプの計画に基づいて行われた。
に関する研究論文の総論は、全ての研究者が同一の基本
的研究法を用いていることを示している。細菌の増殖は
培養液中で、それぞれの化合物を別々に加えるか、加え
ない条件で、つぎにそれぞれを一緒に加えて観察され
た。相加作用ではなく、相乗作用であることを証明する
ために、それぞれの場合において、少なくとも１つの化
合物は、それ単独では最少の増殖阻害しか示さないレベ
ルで用いられた。したがつて、比較的不活性な１つの化
合物と用いた場合、その第１の化合物の存在下で第２の
化合物がいかなる活性の上昇を示しても、それは相乗効
果によるものであろう（メレルリングら,1971;カリゾー
サとレビソン,1981;シナモンとパルマー,1983）。本発
明の実験は、このタイプの計画に基づいて行われた。
材料と方法 材料 ミツバチ（アピス メリフエラ）毒は、ヴエスパ・ラ
ボラトリーズ、スプリング・ミルズ、ペンシルヴアニア
州から入手した。
ボラトリーズ、スプリング・ミルズ、ペンシルヴアニア
州から入手した。
細菌株は、ペンシルヴアニア州立大学の獣医科学部に
よつて供給された。S.アウレウス＃140は、乳腺炎にか
かつた牛の患畜から単離された。大腸菌＃G1880Eは、大
腸菌リフアレンス・センターの体系的なコレクシヨンか
ら選ばれたものである。S.アウレウスのカナマイシン耐
性株は、以下の自然選択法によつて単離した。
よつて供給された。S.アウレウス＃140は、乳腺炎にか
かつた牛の患畜から単離された。大腸菌＃G1880Eは、大
腸菌リフアレンス・センターの体系的なコレクシヨンか
ら選ばれたものである。S.アウレウスのカナマイシン耐
性株は、以下の自然選択法によつて単離した。
抗生物質は、シグマ・ケミカル・カンパニー（セント
ルイス、ミズーリ州）から購入し、活性単位はシグマ社
の分析に基づいたものを用いた。
ルイス、ミズーリ州）から購入し、活性単位はシグマ社
の分析に基づいたものを用いた。
トリプチカーゼ・ソイ・ベース（BBLミクロバイオロ
ジー・システム社、コツキースヴイル、メリーランド
州）は、液体あるいは寒天での全ての細菌の培養を補助
するために用いられた。
ジー・システム社、コツキースヴイル、メリーランド
州）は、液体あるいは寒天での全ての細菌の培養を補助
するために用いられた。
セフアデツクスＧ−50は、フアルマシア・フアイン・
ケミカルズ、ウプサラ、スウエーデンから購入した。
ケミカルズ、ウプサラ、スウエーデンから購入した。
ミツバチ毒存在、非存在下での抗生物質の最少阻害濃
度（MIC）アツセイは、ギブコ・ラボラトリーズ、ロー
レンス、マサチユーセツツ州によつて供給されているSe
nsititreTMを用い、アレジエニー・ゼネラル・ホスピタ
ル、ピツツバーグ・ペンシルヴアニア州の微生物学部門
において行われた。
度（MIC）アツセイは、ギブコ・ラボラトリーズ、ロー
レンス、マサチユーセツツ州によつて供給されているSe
nsititreTMを用い、アレジエニー・ゼネラル・ホスピタ
ル、ピツツバーグ・ペンシルヴアニア州の微生物学部門
において行われた。
方法 カナマイシン耐性変異株の単離 S.アウレウスを5mlのトリプチカーゼ・ソイ・ブロー
ス（TSB）において一夜、ほぼ109コロニー形成単位/ml
の濃度となるまで培養した。この一夜培養液0.1mlを39
μg/mlのカナマイシンを含むトリプチカーゼ・ソイ・ア
ガー（TSA）プレートにまき、37℃で48時間インキユベ
ーシヨンした。48時間以内に出現したコロニーは、39μ
g/mlのカナマイシンを含む第２のTSAプレートに移植し
た。
ス（TSB）において一夜、ほぼ109コロニー形成単位/ml
の濃度となるまで培養した。この一夜培養液0.1mlを39
μg/mlのカナマイシンを含むトリプチカーゼ・ソイ・ア
ガー（TSA）プレートにまき、37℃で48時間インキユベ
ーシヨンした。48時間以内に出現したコロニーは、39μ
g/mlのカナマイシンを含む第２のTSAプレートに移植し
た。
共同効果に関するチエツカーボード希釈アツセイ このアツセイのために、TSB中で対数増殖期にあるそ
れぞれの株を凍結することにより、細菌の培養を調製し
た。この目的には、5mlの一夜培養液が、500mlアーレン
メイヤー・フラスコに作成した200mlのTBSに接種するた
めに用いられた。培養は、37℃で連続的に撹拌すること
により行われ、660mmにおける光学密度（OD）を毎時間
測定した。培養が対数増殖期中期に達したところで（約
0.500OD単位）、5mlを16×100mmのネジ口試験管に移し
た。全ての培養を凍結し、−20℃で保存した。大腸菌
は、凍結下での生存のために、培地に対して終濃度20％
となるようにグリセロールを添加することが必要とされ
た。これは、凍結直前に、4mlの対数増殖期の培養液に1
mlの滅菌したグリセロールを混合することで可能であ
る。
れぞれの株を凍結することにより、細菌の培養を調製し
た。この目的には、5mlの一夜培養液が、500mlアーレン
メイヤー・フラスコに作成した200mlのTBSに接種するた
めに用いられた。培養は、37℃で連続的に撹拌すること
により行われ、660mmにおける光学密度（OD）を毎時間
測定した。培養が対数増殖期中期に達したところで（約
0.500OD単位）、5mlを16×100mmのネジ口試験管に移し
た。全ての培養を凍結し、−20℃で保存した。大腸菌
は、凍結下での生存のために、培地に対して終濃度20％
となるようにグリセロールを添加することが必要とされ
た。これは、凍結直前に、4mlの対数増殖期の培養液に1
mlの滅菌したグリセロールを混合することで可能であ
る。
アツセイを始めるために、１本の凍結培養を室温の水
をいれたビーカー中で解凍した。この解凍した培養を、
500mlのアーレンメイヤー・フラスコにいれた175mlのTS
Bに加え、撹拌し、即座にOD660を測定し、これを「時間
０」における測定値として記録した。次にフラスコを常
に撹拌しながら37℃で２時間インキユベーシヨンし、そ
の時点でOD660を再び測定し、あらかじめ上述の規定量
のミツバチ毒（HBV）と抗生物質を添加しておいた16×1
00mmのネジ口試験管にこの培養液を分注した。
をいれたビーカー中で解凍した。この解凍した培養を、
500mlのアーレンメイヤー・フラスコにいれた175mlのTS
Bに加え、撹拌し、即座にOD660を測定し、これを「時間
０」における測定値として記録した。次にフラスコを常
に撹拌しながら37℃で２時間インキユベーシヨンし、そ
の時点でOD660を再び測定し、あらかじめ上述の規定量
のミツバチ毒（HBV）と抗生物質を添加しておいた16×1
00mmのネジ口試験管にこの培養液を分注した。
HBVと抗生物質の保存溶液は、蒸留水で作成し、過
滅菌し、チエツカーボード希釈系で必要とされる２倍濃
度で、5mlに分けて−20℃で保存した。それぞれの細菌
種に必要とされる凍結保存液の濃度は、第１表に示され
ている。それぞれの細菌に用いられた濃度は、それぞれ
の微生物に対する、それぞれの抗生物質の最少阻害領域
を決定するために抗生物質を単独で用いた、予備的な実
験に基づいている。
滅菌し、チエツカーボード希釈系で必要とされる２倍濃
度で、5mlに分けて−20℃で保存した。それぞれの細菌
種に必要とされる凍結保存液の濃度は、第１表に示され
ている。それぞれの細菌に用いられた濃度は、それぞれ
の微生物に対する、それぞれの抗生物質の最少阻害領域
を決定するために抗生物質を単独で用いた、予備的な実
験に基づいている。
それぞれのアツセイに対し、１バイアルの抗生物質と
１バイアルのHBVが室温で解凍され、等量の２×TSBで希
釈され、ついで通常濃度のTSBで順次２倍に希釈され
て、４種類の濃度の毒と４種類の濃度の抗生物質が得ら
れる。75本のネジ口試験管に番号をつけ、第２表に示し
たチエツカーボードのパターンに合わせて配列した。TS
B、抗生物質およびHBVを次に、第３表に示したデザイン
にしたがつて分注した。00と０と印をした試験管は、2.
5mlのTSBを含み、OD対照および無菌状態の対照として用
いた。試験管１−75はそれぞれ500μの総容量を含
み、上述の２時間培養液2mlを接種した。（註：各々の
試験管におけるHBVおよび抗生物質の終濃度は、分注さ
れた250μに添加した濃度の1/10である（第３表参
照）。）それぞれの試験管を直ちに密封し、反転した。
全ての試験管に接種した後、37℃の保温槽中の水平型試
験管立てに置いた。おのおのの試験管の増殖は、４、
６、８、12、24時間後に、660nmにおけるそれぞれの試
験管の光学密度を測定することにより、個々に観察され
た。
１バイアルのHBVが室温で解凍され、等量の２×TSBで希
釈され、ついで通常濃度のTSBで順次２倍に希釈され
て、４種類の濃度の毒と４種類の濃度の抗生物質が得ら
れる。75本のネジ口試験管に番号をつけ、第２表に示し
たチエツカーボードのパターンに合わせて配列した。TS
B、抗生物質およびHBVを次に、第３表に示したデザイン
にしたがつて分注した。00と０と印をした試験管は、2.
5mlのTSBを含み、OD対照および無菌状態の対照として用
いた。試験管１−75はそれぞれ500μの総容量を含
み、上述の２時間培養液2mlを接種した。（註：各々の
試験管におけるHBVおよび抗生物質の終濃度は、分注さ
れた250μに添加した濃度の1/10である（第３表参
照）。）それぞれの試験管を直ちに密封し、反転した。
全ての試験管に接種した後、37℃の保温槽中の水平型試
験管立てに置いた。おのおのの試験管の増殖は、４、
６、８、12、24時間後に、660nmにおけるそれぞれの試
験管の光学密度を測定することにより、個々に観察され
た。
HBVを用いた最少阻害濃度アツセイ アレジエニー・ゼネラル・ホスピタルの微生物学研究
室は、自動化MICアツセイを行うことが可能で、12種の
臨床的に単離された細菌株について試験的な検査を行う
契約を結んだ。自動化MICアツセイの応用には、次の制
約があつた：（１）それぞれのアツセイは、１種類の投
与量のHBVについてのみ試験できる、（２）HBVのみの効
果は、完全な阻害あるいは非阻害的としか評価できな
い。この系における11種の抗生物質とHBVとの共同作用
は、HBVの存在・非存在下で同時に行つた２つのアツセ
イを比較することによつて評価された。各種に用いられ
たHBVの投与量は、チエツカーボード希釈アツセイに基
づき、非阻害投与量であると算定されたものである。
室は、自動化MICアツセイを行うことが可能で、12種の
臨床的に単離された細菌株について試験的な検査を行う
契約を結んだ。自動化MICアツセイの応用には、次の制
約があつた：（１）それぞれのアツセイは、１種類の投
与量のHBVについてのみ試験できる、（２）HBVのみの効
果は、完全な阻害あるいは非阻害的としか評価できな
い。この系における11種の抗生物質とHBVとの共同作用
は、HBVの存在・非存在下で同時に行つた２つのアツセ
イを比較することによつて評価された。各種に用いられ
たHBVの投与量は、チエツカーボード希釈アツセイに基
づき、非阻害投与量であると算定されたものである。
メリチンの精製 セフアデツクス Ｇ−50ゲル過のベツドは、ベータ
・アラニン−酢酸緩衝液（BAAB）、pH4.3（グラルニツ
クら,1986）中で、室温、24時間膨潤させ、その後一夜
５℃で平衡化した。2.5×6cmカラムにゲルを注入し、1.
0ml/時間の流速で平衡化した。100mgのHBVを、20％のシ
ヨ糖を含む5mlのBAAB緩衝液に再構成した。HBVをカラム
に重層し、1ml/時間の流速で溶出した。溶出液は、280n
mの吸収でモニターした。主ピークを含む画分を分取
し、一部をローリー・タンパク・アツセイ法（ローリ
ー,1951）によりアツセイし、残りを凍結乾燥した。
・アラニン−酢酸緩衝液（BAAB）、pH4.3（グラルニツ
クら,1986）中で、室温、24時間膨潤させ、その後一夜
５℃で平衡化した。2.5×6cmカラムにゲルを注入し、1.
0ml/時間の流速で平衡化した。100mgのHBVを、20％のシ
ヨ糖を含む5mlのBAAB緩衝液に再構成した。HBVをカラム
に重層し、1ml/時間の流速で溶出した。溶出液は、280n
mの吸収でモニターした。主ピークを含む画分を分取
し、一部をローリー・タンパク・アツセイ法（ローリ
ー,1951）によりアツセイし、残りを凍結乾燥した。
メリチン画分の同定は、相対移動度と各画分のポリア
クリルアミド・ゲル電気泳動による分離で見られるバン
ドの定量に基づいて行つた（ベントン,1965）。メリチ
ンの純度についてもポリアクリルアミド・ゲル電気泳動
で調べた。電気泳動は、グラルニツクら，（1986）によ
つて述べられている通りに行つた。凍結乾燥した画分
は、泳動試料緩衝液で2mg/mlとなるように再懸濁し、50
μの試料をゲルの試料用ウエルに注入した。
クリルアミド・ゲル電気泳動による分離で見られるバン
ドの定量に基づいて行つた（ベントン,1965）。メリチ
ンの純度についてもポリアクリルアミド・ゲル電気泳動
で調べた。電気泳動は、グラルニツクら，（1986）によ
つて述べられている通りに行つた。凍結乾燥した画分
は、泳動試料緩衝液で2mg/mlとなるように再懸濁し、50
μの試料をゲルの試料用ウエルに注入した。
メリチンに対する全毒の等価性 全ミツバチ毒におけるその割合に当たるメリチン画分
の量は、全毒とメリチン画分の電気泳動試料中の個々の
バンドの定量によつて決定された。全ミツバチ毒の20、
40、60、80、100μｇの試料が電気泳動によつて分離さ
れ、これをクマシーＲブリリアント・ブルー−過塩素酸
染色法によつて染色し、デンシトメーターでスキヤンを
行つた。試料がアプライされたきの試料中のタンパク量
に対して、全毒試料のメリチンバンドのピーク領域に関
連した標準曲線が作成された。６種類の精製されたメリ
チン試料40μｇが同時にアツセイされ、ミツバチ毒にお
けるそれらの等価量を標準曲線から決定した。この方法
は、マルフインガーら（1986）によつて詳細に記述され
ている。
の量は、全毒とメリチン画分の電気泳動試料中の個々の
バンドの定量によつて決定された。全ミツバチ毒の20、
40、60、80、100μｇの試料が電気泳動によつて分離さ
れ、これをクマシーＲブリリアント・ブルー−過塩素酸
染色法によつて染色し、デンシトメーターでスキヤンを
行つた。試料がアプライされたきの試料中のタンパク量
に対して、全毒試料のメリチンバンドのピーク領域に関
連した標準曲線が作成された。６種類の精製されたメリ
チン試料40μｇが同時にアツセイされ、ミツバチ毒にお
けるそれらの等価量を標準曲線から決定した。この方法
は、マルフインガーら（1986）によつて詳細に記述され
ている。
共同効果活性についてのメリチン画分に対する試験 全ミツバチ毒とメリチン画分の抗菌活性を比較するた
めに、初期のチエツカーボード希釈実験の結果を総括
し、HBVの投与効果が単独、または抗生物質との組み合
わせで容易に見ることができる試験系を選択した。ブド
ウ球菌は、前出のチエツカーボード・アツセイにおいて
用いられる濃度でHBVのみに対しても感受性であり、カ
ナマイシンがHBVとの良い共同効果を示すため、この系
を全HBVとメリチンの抗菌活性を比較するために選ばれ
た。この分析で用いられたそれぞれの成分の投与量は、
２μg/ml HBVと2.5μg/mlカナマイシンである。これら
の投与量は、少量の投与量変化の効果が再現性を有し、
容易に測定できるような細菌の反応性の範囲にあつた。
2.0μg/mlのHBVと等価なメリチン画分の投与量は、1.6
μg/mlであつた。等価な活性を調べるために、それぞれ
の実験は平行して、カナマイシン存在・非存在下でのメ
チリン画分および全ミツバチ毒について、３連の試料を
比較して行つた。
めに、初期のチエツカーボード希釈実験の結果を総括
し、HBVの投与効果が単独、または抗生物質との組み合
わせで容易に見ることができる試験系を選択した。ブド
ウ球菌は、前出のチエツカーボード・アツセイにおいて
用いられる濃度でHBVのみに対しても感受性であり、カ
ナマイシンがHBVとの良い共同効果を示すため、この系
を全HBVとメリチンの抗菌活性を比較するために選ばれ
た。この分析で用いられたそれぞれの成分の投与量は、
２μg/ml HBVと2.5μg/mlカナマイシンである。これら
の投与量は、少量の投与量変化の効果が再現性を有し、
容易に測定できるような細菌の反応性の範囲にあつた。
2.0μg/mlのHBVと等価なメリチン画分の投与量は、1.6
μg/mlであつた。等価な活性を調べるために、それぞれ
の実験は平行して、カナマイシン存在・非存在下でのメ
チリン画分および全ミツバチ毒について、３連の試料を
比較して行つた。
統計的分析 それぞれのチエツカーボード実験は、５回反復して行
われた。それぞれの細菌−抗生物質の組み合わせに対す
る、５回の繰り返し行つた結果の平均値について、ウオ
ーラー−ダンカン Ｋ−比Ｔテストを用いてそれぞれの
時間における有意な相違について試験を行ない、そして
一群の曲線群が共同効果を調べるために選択された。ひ
とつの曲線群は、実験対照曲線（抗生物質あるいはHBV
の非存在下での細菌の増殖）、抗生物質対照曲線（HBV
非存在、抗生物質存在下での細菌の増殖）、毒対照曲線
（抗生物質非存在、HBV存在下での細菌の増殖）、およ
び相関曲線（抗生物質、HBV共存下での増殖）から構成
された。抗生物質対照曲線と毒対照曲線が実験対照曲線
に比べ、少しの平均OD減少しか示さない曲線群および、
同時に実験対照曲線に比べ相関曲線において大きなODの
減少を示す曲線群について、共同効果を調べた。
われた。それぞれの細菌−抗生物質の組み合わせに対す
る、５回の繰り返し行つた結果の平均値について、ウオ
ーラー−ダンカン Ｋ−比Ｔテストを用いてそれぞれの
時間における有意な相違について試験を行ない、そして
一群の曲線群が共同効果を調べるために選択された。ひ
とつの曲線群は、実験対照曲線（抗生物質あるいはHBV
の非存在下での細菌の増殖）、抗生物質対照曲線（HBV
非存在、抗生物質存在下での細菌の増殖）、毒対照曲線
（抗生物質非存在、HBV存在下での細菌の増殖）、およ
び相関曲線（抗生物質、HBV共存下での増殖）から構成
された。抗生物質対照曲線と毒対照曲線が実験対照曲線
に比べ、少しの平均OD減少しか示さない曲線群および、
同時に実験対照曲線に比べ相関曲線において大きなODの
減少を示す曲線群について、共同効果を調べた。
化合物間の共同効果は、相加的効果が予想されるた
め、化合物の相加的効果から区別することができる。相
加的効果は、２つの化合物それぞれの効果を合計するこ
とにより予想できるため、それ以上のどのような効果も
相乗的な関係を示すことになる。HBVと抗生物質の相加
的関係を示すODの読みを予測する公式が導き出された。
上述に対する引用として、マルフインガーの学位論文
（1971）、23−25ページを参照のこと。
め、化合物の相加的効果から区別することができる。相
加的効果は、２つの化合物それぞれの効果を合計するこ
とにより予想できるため、それ以上のどのような効果も
相乗的な関係を示すことになる。HBVと抗生物質の相加
的関係を示すODの読みを予測する公式が導き出された。
上述に対する引用として、マルフインガーの学位論文
（1971）、23−25ページを参照のこと。
結果 チニツカーボード力価検定 ３種のバクテリア菌株を、ミツバチ毒とくみあわせた
３種の抗生物質それぞれについて検査した。これら、バ
クテリア、抗生物質、HBVの９種の組み合わせを、各々
のバクテリア−抗生物質のくみあわせにつき25種の処理
（抗生物質とHBVの組み合わせ）を含むチエツカーボー
ド検定を用いて分析した。各々のチエツカーボード実験
は、各処理につき３個１組のサンプルを含み、５回くり
返された。５回の実験でくり返された３つ組のサンプル
から得たデータを平均し、各処理の各時間での平均及び
標準偏差は に示してある。各バクテリア−抗生物質の組み合わせに
ついて、各時間点での各抗生物質/HBV処理のOD平均値を
高い方から順に並べ、ウオーラー−ダンカン（Waller−
Dunkan）Ｋ−比Ｔテストを用いた有効な差異に従いグル
ープ分けした。ウオーラー−ダンカン分析表から、“統
計分析”の中に記述されているように、４つの曲線の集
合を相乗作用の証拠を示すため比較した。相互作用曲線
と、最低の実測曲線、抗生物質コントロール曲線と毒コ
ントロール曲線間で最も大きいODの差を示している曲線
の集合をプロツトし、各時間点で“統計分析”の節より
引用した等式を用いて相乗作用について調べた。各曲線
の集合である時間点について（−Ｘ＋Ａ＋Ｖ−AV）の値
が95％の信頼性で０よりきわだつて大きい場合（すなわ
ち、相乗作用が示されている場合）、相互作用曲線上で
その時間点をあらわしている四角に上付き文字“S"をう
つて、その時間点を表示している。（第２図−11） S.aureus S.aureusは、低濃度の単独のミツバチ毒に感受性があ
る。したがつて影響を及ぼさない最大限度のミツバチ毒
の量を知ることが重要であつた。この濃度は約２μg/ml
であつた。その結果、S.aureusに対するすべての抗生物
質/HBVの組み合わせにおいて、チエツカーボード力価方
式の毒の投与量は０、２、４、８、16μg/mlにした。
（表Ａ−１からＡ−３）。第２図に抗菌化合物としてミ
ツバチ毒単独で用いた場合の、これらのミツバチ毒投与
量による影響を示してある。
３種の抗生物質それぞれについて検査した。これら、バ
クテリア、抗生物質、HBVの９種の組み合わせを、各々
のバクテリア−抗生物質のくみあわせにつき25種の処理
（抗生物質とHBVの組み合わせ）を含むチエツカーボー
ド検定を用いて分析した。各々のチエツカーボード実験
は、各処理につき３個１組のサンプルを含み、５回くり
返された。５回の実験でくり返された３つ組のサンプル
から得たデータを平均し、各処理の各時間での平均及び
標準偏差は に示してある。各バクテリア−抗生物質の組み合わせに
ついて、各時間点での各抗生物質/HBV処理のOD平均値を
高い方から順に並べ、ウオーラー−ダンカン（Waller−
Dunkan）Ｋ−比Ｔテストを用いた有効な差異に従いグル
ープ分けした。ウオーラー−ダンカン分析表から、“統
計分析”の中に記述されているように、４つの曲線の集
合を相乗作用の証拠を示すため比較した。相互作用曲線
と、最低の実測曲線、抗生物質コントロール曲線と毒コ
ントロール曲線間で最も大きいODの差を示している曲線
の集合をプロツトし、各時間点で“統計分析”の節より
引用した等式を用いて相乗作用について調べた。各曲線
の集合である時間点について（−Ｘ＋Ａ＋Ｖ−AV）の値
が95％の信頼性で０よりきわだつて大きい場合（すなわ
ち、相乗作用が示されている場合）、相互作用曲線上で
その時間点をあらわしている四角に上付き文字“S"をう
つて、その時間点を表示している。（第２図−11） S.aureus S.aureusは、低濃度の単独のミツバチ毒に感受性があ
る。したがつて影響を及ぼさない最大限度のミツバチ毒
の量を知ることが重要であつた。この濃度は約２μg/ml
であつた。その結果、S.aureusに対するすべての抗生物
質/HBVの組み合わせにおいて、チエツカーボード力価方
式の毒の投与量は０、２、４、８、16μg/mlにした。
（表Ａ−１からＡ−３）。第２図に抗菌化合物としてミ
ツバチ毒単独で用いた場合の、これらのミツバチ毒投与
量による影響を示してある。
S.aureus対アンピシリン/HBV チエツカーボード方式でのチユーブ中のアンピシリン
の最終濃度は、０、0.05、0.1、0.2、0.4μg/mlであつ
た。第３図にHBV2μg/mlとアンピシリン0.05μg/ml使用
したアンピシリン/HBVの組み合わせの結果を示してあ
る。４あるいは６時間の時点では何も相乗作用は認めら
れないが、しかし、８及び12時間の両時点では相互作用
曲線は、アンピシリン、HBV単独で引き起こす の和から予想されるものより大幅に低い。統計分析を行
うとこの時間点では、合計値（−Ｘ＋Ａ＋Ｖ−AV）は、
０よりきわだつて大きい。
の最終濃度は、０、0.05、0.1、0.2、0.4μg/mlであつ
た。第３図にHBV2μg/mlとアンピシリン0.05μg/ml使用
したアンピシリン/HBVの組み合わせの結果を示してあ
る。４あるいは６時間の時点では何も相乗作用は認めら
れないが、しかし、８及び12時間の両時点では相互作用
曲線は、アンピシリン、HBV単独で引き起こす の和から予想されるものより大幅に低い。統計分析を行
うとこの時間点では、合計値（−Ｘ＋Ａ＋Ｖ−AV）は、
０よりきわだつて大きい。
S.aureus対カナマイシン/HBV チエツカーボード方式でS.aureusをテストするのに選
んだカナマイシンの最終濃度は０、1.25、2.50、5.0、1
0.0μg/mlであつた（表Ａ−２）。第４図はコントロー
ルと相互作用曲線間で強い対照を示している曲線の集合
が描いてある。この実験では、相乗作用は６時間の点の
近くで最初に実証できるようになり、培養８時間までに
明らかに認められる。12時間で、培養菌は併用投与の影
響からのがれるようであり、相乗作用効果は、培地中の
他の（栄養）要素により増殖が制限されるようになるの
で失われる。（この増殖制限はコントロール曲線により
明らかに示される、）12時間の増殖制限にもかかわら
ず、この検定で６、８、12時間でのデータの統計分析
は、カナマイシンとHBVの相乗的相互作用を示唆してい
る。
んだカナマイシンの最終濃度は０、1.25、2.50、5.0、1
0.0μg/mlであつた（表Ａ−２）。第４図はコントロー
ルと相互作用曲線間で強い対照を示している曲線の集合
が描いてある。この実験では、相乗作用は６時間の点の
近くで最初に実証できるようになり、培養８時間までに
明らかに認められる。12時間で、培養菌は併用投与の影
響からのがれるようであり、相乗作用効果は、培地中の
他の（栄養）要素により増殖が制限されるようになるの
で失われる。（この増殖制限はコントロール曲線により
明らかに示される、）12時間の増殖制限にもかかわら
ず、この検定で６、８、12時間でのデータの統計分析
は、カナマイシンとHBVの相乗的相互作用を示唆してい
る。
S.aureus対ポリマイキシンB/HBV これらの実験でのポリマイキシンＢの最終濃度は、
０、312、624、1250、2500U/mlである。（表Ａ−３）．
相乗作用はHBV4μg/mlとポリマイキシンB625U/mlのとこ
ろで観察された。（第５図）。培養８及び12時間の両点
で相乗作用が相互作用曲線ではつきり示されている。
０、312、624、1250、2500U/mlである。（表Ａ−３）．
相乗作用はHBV4μg/mlとポリマイキシンB625U/mlのとこ
ろで観察された。（第５図）。培養８及び12時間の両点
で相乗作用が相互作用曲線ではつきり示されている。
大腸菌（E.coli） ハチミツ毒は相乗作用を示すのに必要な程度でも、単
独では大腸菌に対して阻害的ではなかつた。（表Ａ−４
からＡ−６）、すなわち、大腸菌とのチエツカーボード
検定では、毒性は、HBVの限定的な要素ではなかつた。
しかしながら約40μg/mlよりHBVを高濃度にすると、培
地成分の沈殿がおこつたので、実験条件にはそれ以上の
HBV濃度には制限が設けられた。したがつて、大腸菌と
のチエツカーボード検定に用いられたHBVの最終濃度は
０、５、10、20、40μg/mlであつた。
独では大腸菌に対して阻害的ではなかつた。（表Ａ−４
からＡ−６）、すなわち、大腸菌とのチエツカーボード
検定では、毒性は、HBVの限定的な要素ではなかつた。
しかしながら約40μg/mlよりHBVを高濃度にすると、培
地成分の沈殿がおこつたので、実験条件にはそれ以上の
HBV濃度には制限が設けられた。したがつて、大腸菌と
のチエツカーボード検定に用いられたHBVの最終濃度は
０、５、10、20、40μg/mlであつた。
大腸菌対アンピシリン/HBV 大腸菌チエツカーボード力価で用いるよう選ばれたア
ンピシリンの最終濃度は0.5、１、２、４μg/mlであつ
た（表Ａ−４）。相乗作用は上記の実験のいずれで求め
られたどの曲線の集合よりも劇的性質が乏しかつた。相
乗作用の証拠は40μg/ml HBV−１μg/mlアンピシリンの
くみ合わせ、６時間の点にのみあつた。（第６図） 大腸菌対カナマイシン/HBV チエツカーボード検定に選ばれたカナマイシンの最終
濃度は、０、５、10、20、40μg/mlであつた。（表Ａ−
５）．第７図に作用をおこせる最小限の投与量のカナマ
イシンと併用したハチミツ毒の作用を示してある。この
条件では、８時間の点でのみ相乗作用が観られた。HBV
量によらず、カナマイシン量を低くしたHBVとの他のど
の組みあわせでも相乗作用は認められなかつた。第８図
はHBVと併用した大腸菌へのカナマイシンの量をより多
くした投与を示している。ここでは、相乗作用性は統計
的に、２時間後以降どの点でも見いだされている。
ンピシリンの最終濃度は0.5、１、２、４μg/mlであつ
た（表Ａ−４）。相乗作用は上記の実験のいずれで求め
られたどの曲線の集合よりも劇的性質が乏しかつた。相
乗作用の証拠は40μg/ml HBV−１μg/mlアンピシリンの
くみ合わせ、６時間の点にのみあつた。（第６図） 大腸菌対カナマイシン/HBV チエツカーボード検定に選ばれたカナマイシンの最終
濃度は、０、５、10、20、40μg/mlであつた。（表Ａ−
５）．第７図に作用をおこせる最小限の投与量のカナマ
イシンと併用したハチミツ毒の作用を示してある。この
条件では、８時間の点でのみ相乗作用が観られた。HBV
量によらず、カナマイシン量を低くしたHBVとの他のど
の組みあわせでも相乗作用は認められなかつた。第８図
はHBVと併用した大腸菌へのカナマイシンの量をより多
くした投与を示している。ここでは、相乗作用性は統計
的に、２時間後以降どの点でも見いだされている。
大腸菌対ポリマイキシンB/HBV チエツカーボード力価でのポリマイキシンＢの最終濃
度は、０、1.5、３、６、12U/mlだつた。（表Ａ−６）
ポリマイキシンＢ 3U/mlとHBV ５μg/mlの組みあわせ
で、相乗作用性の最も劇的な実例が与えられた。相乗作
用は処理のすべての時間点であきらかであり、実測及び
計算値の間の差異が大きい。
度は、０、1.5、３、６、12U/mlだつた。（表Ａ−６）
ポリマイキシンＢ 3U/mlとHBV ５μg/mlの組みあわせ
で、相乗作用性の最も劇的な実例が与えられた。相乗作
用は処理のすべての時間点であきらかであり、実測及び
計算値の間の差異が大きい。
カナマイシン耐性 S.aureus 自然突然変異体を選択して得られたカナマイシン耐性
S.aureusについて、薬剤耐性バクテリアに対するHBVの
影響力を決めるために試検した。。カナマイシン耐性S.
aureusは、望ましいものであつた。なぜならこの生物で
はすべての抗生物質について何らかの相乗作用が認めら
れまた、相乗作用効果はカナマイシンの場合に最も確か
に認められたからである。耐性株のHBVに対する感受性
に違いは見られなかつたのでチエツカーボード検定での
毒の濃度は親株に対するものと同様に０、２、４、８、
16μg/mlであつた。（表Ａ−７からＡ−９）同一の条件
下では、耐性株は親株に比して増殖速度が遅いことに気
づいた。したがつて２種の異なる株についての実験間
で、吸光度の を比較することは無意味である。
S.aureusについて、薬剤耐性バクテリアに対するHBVの
影響力を決めるために試検した。。カナマイシン耐性S.
aureusは、望ましいものであつた。なぜならこの生物で
はすべての抗生物質について何らかの相乗作用が認めら
れまた、相乗作用効果はカナマイシンの場合に最も確か
に認められたからである。耐性株のHBVに対する感受性
に違いは見られなかつたのでチエツカーボード検定での
毒の濃度は親株に対するものと同様に０、２、４、８、
16μg/mlであつた。（表Ａ−７からＡ−９）同一の条件
下では、耐性株は親株に比して増殖速度が遅いことに気
づいた。したがつて２種の異なる株についての実験間
で、吸光度の を比較することは無意味である。
カナマイシン耐性S.aureus対アンピシリン/HBV このチエツカーボード検定で用いられたアンピシリン
の最終濃度はs.aureus親株に対するものと同様で、０、
0.05、0.1、0.2、0.4μg/mlであつた。（表Ａ−７）。
遅い増殖速度もしくは耐性要素によつて、この株で観察
された効果は、完全に親株に類似していなかつた。相乗
作用の最もよい証拠は、親株より高いアンピシリン濃度
のときに認められた。増殖速度が遅いので、増殖周期は
より長いとみなした。第10図にHBV 2μg/mlとアンピシ
リン0.4μg/mlの相互作用を示す。データーの統計評価
では、相乗作用は８、12、24時間にみられた。カナマイ
シン耐性S.aureus対カナマイシン/HBV S.aureusカナマ
イシン耐性株の増殖速度を減少させるのに必要なカナマ
イシン投与量は親株に必要な量の約４倍高かつた。カナ
マイシン耐性S.aureusに対するチエツカーボード検定範
囲は、カナマイシン０、５、10、20、40μg/mlであつ
た。（表Ａ−８）．またここでも、増殖速度が低いこと
から増殖周期の長期化を考慮に入れることが必要であつ
た。ミツバチ毒８μg/mlとカナマイシン10μg/mlの組み
合わせを第11図に示してある。S.aureus親株に必要とす
る投与量の２倍量のカナマイシンの使用しても、ハチミ
ツ毒存在下で２倍長く効果が持続する。相乗作用は12時
間以降でのみ観察され、24時間の時点でのみ意味がある
ことが判明した。
の最終濃度はs.aureus親株に対するものと同様で、０、
0.05、0.1、0.2、0.4μg/mlであつた。（表Ａ−７）。
遅い増殖速度もしくは耐性要素によつて、この株で観察
された効果は、完全に親株に類似していなかつた。相乗
作用の最もよい証拠は、親株より高いアンピシリン濃度
のときに認められた。増殖速度が遅いので、増殖周期は
より長いとみなした。第10図にHBV 2μg/mlとアンピシ
リン0.4μg/mlの相互作用を示す。データーの統計評価
では、相乗作用は８、12、24時間にみられた。カナマイ
シン耐性S.aureus対カナマイシン/HBV S.aureusカナマ
イシン耐性株の増殖速度を減少させるのに必要なカナマ
イシン投与量は親株に必要な量の約４倍高かつた。カナ
マイシン耐性S.aureusに対するチエツカーボード検定範
囲は、カナマイシン０、５、10、20、40μg/mlであつ
た。（表Ａ−８）．またここでも、増殖速度が低いこと
から増殖周期の長期化を考慮に入れることが必要であつ
た。ミツバチ毒８μg/mlとカナマイシン10μg/mlの組み
合わせを第11図に示してある。S.aureus親株に必要とす
る投与量の２倍量のカナマイシンの使用しても、ハチミ
ツ毒存在下で２倍長く効果が持続する。相乗作用は12時
間以降でのみ観察され、24時間の時点でのみ意味がある
ことが判明した。
カナマイシン耐性S.aureus対ポリミキシンB/HBV この突然変異体はカナマイシンに対する抵抗性が増大し
ているという基準で選択されたのだが、それが親株より
ポリミキシンＢに対して感受性が上昇した点に注目する
ことは興味深かつた。チエツカーボード検定に用いられ
たポリミキシンＢ投与量は０、12.5、25、50及び100U/m
lであつた。（表Ａ−９）一方親株の検定に使用したポ
リミキシンＤの投与範囲は312から2500U/mlの間であつ
た。第12図にカナマイシン耐性S.aureus対50U/mlポリミ
キシンＢ及び４μg/mlHBを示してある。相乗作用は12時
間の点で認められた。
ているという基準で選択されたのだが、それが親株より
ポリミキシンＢに対して感受性が上昇した点に注目する
ことは興味深かつた。チエツカーボード検定に用いられ
たポリミキシンＢ投与量は０、12.5、25、50及び100U/m
lであつた。（表Ａ−９）一方親株の検定に使用したポ
リミキシンＤの投与範囲は312から2500U/mlの間であつ
た。第12図にカナマイシン耐性S.aureus対50U/mlポリミ
キシンＢ及び４μg/mlHBを示してある。相乗作用は12時
間の点で認められた。
HBV存在及び非存在下での抗生物質のMIC検定 （最少阻止濃度） ８つのグラム陽性菌及び４つのグラム陰性菌に対する
抗生物質のMICへのHBVの影響の予備調査結果を第４表及
び第５表にそれぞれ示した。この検定法は明らかに不適
当であるにもかかわらず、明確な傾向が調査結果に表わ
れた。同一のHBV投与量がある抗生物質のMICには影響を
及ぼし一方他の抗生物質に対しては及ぼさない、ことが
１つのMIC検定中で観察されるような場合に、相乗作用
は強く示唆された。第４表及び５表中でHBV存在下で抗
生物質のMICが２箇所以上で２倍希釈以上低下している
ことを表示するのに（＋）を用いた。（−）はHBV存在
下でMICが変化しないあるいは単にただ１つの希釈段階
での （検定の誤差と判断される）しか示さないことを示して
いる。
抗生物質のMICへのHBVの影響の予備調査結果を第４表及
び第５表にそれぞれ示した。この検定法は明らかに不適
当であるにもかかわらず、明確な傾向が調査結果に表わ
れた。同一のHBV投与量がある抗生物質のMICには影響を
及ぼし一方他の抗生物質に対しては及ぼさない、ことが
１つのMIC検定中で観察されるような場合に、相乗作用
は強く示唆された。第４表及び５表中でHBV存在下で抗
生物質のMICが２箇所以上で２倍希釈以上低下している
ことを表示するのに（＋）を用いた。（−）はHBV存在
下でMICが変化しないあるいは単にただ１つの希釈段階
での （検定の誤差と判断される）しか示さないことを示して
いる。
第４表はいくつかのグラム陽性生物の結果を示してい
る。結果は、テストした種の間に傾向が存在することを
指し示している。例えば、S.aureusは抗生物質/HBVの組
みあわせすべてにおいて相乗作用を示しているようであ
るが、S.epidermidisはセフアロチン/HBVの組みあわせ
においてのみ首尾一貫して相乗作用性の結果を示すが、
他の抗生物質/HBVの組み合わせに対しては偶発的結果を
示した。テストしたストレプトコツカス フアエカリス
（streptococcus faecalis）の一株は、２種のスタフイ
ロコツカス（staphylococcus）種の生物が示すのと同様
の相乗作用傾向を示していない。
る。結果は、テストした種の間に傾向が存在することを
指し示している。例えば、S.aureusは抗生物質/HBVの組
みあわせすべてにおいて相乗作用を示しているようであ
るが、S.epidermidisはセフアロチン/HBVの組みあわせ
においてのみ首尾一貫して相乗作用性の結果を示すが、
他の抗生物質/HBVの組み合わせに対しては偶発的結果を
示した。テストしたストレプトコツカス フアエカリス
（streptococcus faecalis）の一株は、２種のスタフイ
ロコツカス（staphylococcus）種の生物が示すのと同様
の相乗作用傾向を示していない。
第５表のデータはMIC検定法での４種の大腸株の結果
を表に記入したものである。相乗作用の明確な傾向が、
MIC検定方式に含まれる各々のベーターラクタム抗生物
質（アンピシリン、カルベニシリン及びピペラシリン）
を用いた場合に認められる。また、一例をのぞいたすべ
ての例においてアミノ糖ゲンチミシン及びアミカシンの
MICは低下した。セフオキチンのMICもまたすべての大腸
菌の検定で低下した。
を表に記入したものである。相乗作用の明確な傾向が、
MIC検定方式に含まれる各々のベーターラクタム抗生物
質（アンピシリン、カルベニシリン及びピペラシリン）
を用いた場合に認められる。また、一例をのぞいたすべ
ての例においてアミノ糖ゲンチミシン及びアミカシンの
MICは低下した。セフオキチンのMICもまたすべての大腸
菌の検定で低下した。
メリツチン精製及び検査 ミツバチ毒のクロマトグラフイー セフアデツクスＧ−50でメリツチンを精製したところ
明確な、ベースラインから分離したピークが得られた。
無効（容）量は100mlでありメリツチン画分は無効容量
後200から230mlの間に溶出した。最初の100μｇの試料
から約65μｇが200から230の画分で回収した。これらの
画分を集め、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によつて
精製度をチエツクした。第13図に集められた画分200−2
30のタンパク質100μｇの電気泳動の結果を示してい
る。このバンドの相対移動度を電気泳動で分離したHBV
構成成分の相対移動度と比較した結果、メリツチンがこ
の分離方法で検出可能な画分200−230の唯一の構成成分
として同定された。
明確な、ベースラインから分離したピークが得られた。
無効（容）量は100mlでありメリツチン画分は無効容量
後200から230mlの間に溶出した。最初の100μｇの試料
から約65μｇが200から230の画分で回収した。これらの
画分を集め、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によつて
精製度をチエツクした。第13図に集められた画分200−2
30のタンパク質100μｇの電気泳動の結果を示してい
る。このバンドの相対移動度を電気泳動で分離したHBV
構成成分の相対移動度と比較した結果、メリツチンがこ
の分離方法で検出可能な画分200−230の唯一の構成成分
として同定された。
メリツチンの抗菌能検査 等価な投与量のメリツチンとミツバチ毒全体を、抗生
物質存在、非存在下のくみあわせで抗菌能力を比較し
た。（表Ａ−10）．上記の検定に用いた程度のHBVに、
S.aureusは感受性であつたので、この生物をメリツチン
画分活性をテストするのに選ばれた。カナマイシンが画
分の相乗作用活性を評価するために選ばれたが、それ
は、S.aureus対HBVと併用したこの抗生物質での上記の
検査で得た相互作用曲線がすべての時間的で相乗作用を
示したからである。
物質存在、非存在下のくみあわせで抗菌能力を比較し
た。（表Ａ−10）．上記の検定に用いた程度のHBVに、
S.aureusは感受性であつたので、この生物をメリツチン
画分活性をテストするのに選ばれた。カナマイシンが画
分の相乗作用活性を評価するために選ばれたが、それ
は、S.aureus対HBVと併用したこの抗生物質での上記の
検査で得た相互作用曲線がすべての時間的で相乗作用を
示したからである。
メリツチンの抗菌能 メリツチン対HBV全体の結果を第14図に示してある。H
BV全体とメリツチン画分の抗菌能について、有意な差は
観察されなかつた。第14図に表されている各々の時間点
において、HBV曲線とメリツチン曲線の吸光度は統計学
的に等しい。
BV全体とメリツチン画分の抗菌能について、有意な差は
観察されなかつた。第14図に表されている各々の時間点
において、HBV曲線とメリツチン曲線の吸光度は統計学
的に等しい。
カナマイシンとのメリツチンの相乗作用活性 第15図で同投与量のカナマイシンと組み合わせた場合
の同等量に相当する等価なメリツチン画分とHBV毒全体
の抗菌能を比較している、２曲線のどの時間点の吸光度
も有意な差はない。さらに、統計評価を考慮しなけれ
ば、メリツチン画分をあらわす相互作用曲線は実際のと
ころすべての時間点でHBV全体をあらわす相互作用曲線
よりわずかに低い。すなわち、両曲線上の時間点を実の
平均と見なせば、メリツチン画分は実際HBV全体より活
性が高いと最終結論しうる。
の同等量に相当する等価なメリツチン画分とHBV毒全体
の抗菌能を比較している、２曲線のどの時間点の吸光度
も有意な差はない。さらに、統計評価を考慮しなけれ
ば、メリツチン画分をあらわす相互作用曲線は実際のと
ころすべての時間点でHBV全体をあらわす相互作用曲線
よりわずかに低い。すなわち、両曲線上の時間点を実の
平均と見なせば、メリツチン画分は実際HBV全体より活
性が高いと最終結論しうる。
検定結果のチエツカーボードの説明 チエツカーボード検定の結果は抗生物質とミツバチ毒
間の相乗作用性を明らかに表示している。第２図では抗
生物質非存在下での様々な投与量にミツバチ毒のS.aure
usに対する作用を示した。この図中で、毒を８あるいは
16μg/mlというように大量に増殖中の培養液に加える
と、実際培養液の吸光度の低下を認めることができる。
この細胞溶解の徴候は、ミツバチ毒が実際殺菌的である
証拠である。この殺菌活性及び抗生物質との併用に見ら
れる相乗作用へのその寄与の機構は理解されていない。
チエツカーボード力価検定で様々な結果があつたこと
で、いくつかの異なる相乗作用機構がこれらの実験で機
能しうる可能性が示唆される。
間の相乗作用性を明らかに表示している。第２図では抗
生物質非存在下での様々な投与量にミツバチ毒のS.aure
usに対する作用を示した。この図中で、毒を８あるいは
16μg/mlというように大量に増殖中の培養液に加える
と、実際培養液の吸光度の低下を認めることができる。
この細胞溶解の徴候は、ミツバチ毒が実際殺菌的である
証拠である。この殺菌活性及び抗生物質との併用に見ら
れる相乗作用へのその寄与の機構は理解されていない。
チエツカーボード力価検定で様々な結果があつたこと
で、いくつかの異なる相乗作用機構がこれらの実験で機
能しうる可能性が示唆される。
データ表中のいくつかの時間点で標準偏差が大きいこ
とに対して疑問が生ずると予想される。この変動性は通
常、対数増殖期にバクテリアがある場合増殖速度が急な
勾配であることによる。対数増殖中期にとられた時間点
は、もつと遅く増殖する期間にとられた時間点にくら
べ、時間による吸光度の差が非常に大きくなるであろ
う。したがつて、サンプリング間隔の制御不可能な小さ
な変動が、対数的に増殖している間の時間点の吸光度示
度ではより大きな変動の原因となりうる。培養液は対数
期中に様々な処理グループに分けられるので、変動は実
験間においてはむしろさらに目を引くようになつてい
る。この種の誤差は、しかしながら統計評価方法で考慮
に入れられている。大きなサンプル数（15）を用いる
と、時間点の平均に対する見積もり範囲はこれらの平均
間の差を統計的に評価するに十分なほど、せばまつた。
メリツチンは当初１種の菌株、１種の抗生物質とのくみ
あわせで、HBVの相乗作用的構成成分としてしかテスト
されなかつたが、可能性のある機構を論じる目的で、メ
リツチンはテストされた各々のバクテリア−抗生物質−
HBVの組み合わせで相乗作用性ミツバチ毒構成成分であ
ると推定していた。
とに対して疑問が生ずると予想される。この変動性は通
常、対数増殖期にバクテリアがある場合増殖速度が急な
勾配であることによる。対数増殖中期にとられた時間点
は、もつと遅く増殖する期間にとられた時間点にくら
べ、時間による吸光度の差が非常に大きくなるであろ
う。したがつて、サンプリング間隔の制御不可能な小さ
な変動が、対数的に増殖している間の時間点の吸光度示
度ではより大きな変動の原因となりうる。培養液は対数
期中に様々な処理グループに分けられるので、変動は実
験間においてはむしろさらに目を引くようになつてい
る。この種の誤差は、しかしながら統計評価方法で考慮
に入れられている。大きなサンプル数（15）を用いる
と、時間点の平均に対する見積もり範囲はこれらの平均
間の差を統計的に評価するに十分なほど、せばまつた。
メリツチンは当初１種の菌株、１種の抗生物質とのくみ
あわせで、HBVの相乗作用的構成成分としてしかテスト
されなかつたが、可能性のある機構を論じる目的で、メ
リツチンはテストされた各々のバクテリア−抗生物質−
HBVの組み合わせで相乗作用性ミツバチ毒構成成分であ
ると推定していた。
見かけ上増加する投与量 大抵の場合、ミツバチ毒は抗生物質の初期有効性を増
大させるようだが、そのことは、２つの化合物を付加す
ると直ちに菌の増殖速度を低下させる能力が増加するこ
とにより示される。この種類の協同性は大腸菌対HBV及
びポリミキシンＢで最も顕著に示された。（第９図）。
２種の化合物を付加した後の最初の時間的で、相乗作用
性は明らかであり、それは培養液が対数期にある間持続
する。これらの結果は低い、効果のない投与量の抗生物
質でもHBVの付加により効果的になりうることを示唆し
ている。上記に示した増大した投与効果はテストしたほ
とんどの実験のくみあわせにおいて認められたタイプの
相乗作用である。このタイプの作用はいくつかの異なる
機構を通したメリツチンの働きによつて説明可能であ
り、その機構とは （１） 抗生物質分子の溶解性を変化させる。（２）
菌の膜透過性を増大させる。及び（３） 抗生物質分子
の作用点での有効性を増大させるなどである。
大させるようだが、そのことは、２つの化合物を付加す
ると直ちに菌の増殖速度を低下させる能力が増加するこ
とにより示される。この種類の協同性は大腸菌対HBV及
びポリミキシンＢで最も顕著に示された。（第９図）。
２種の化合物を付加した後の最初の時間的で、相乗作用
性は明らかであり、それは培養液が対数期にある間持続
する。これらの結果は低い、効果のない投与量の抗生物
質でもHBVの付加により効果的になりうることを示唆し
ている。上記に示した増大した投与効果はテストしたほ
とんどの実験のくみあわせにおいて認められたタイプの
相乗作用である。このタイプの作用はいくつかの異なる
機構を通したメリツチンの働きによつて説明可能であ
り、その機構とは （１） 抗生物質分子の溶解性を変化させる。（２）
菌の膜透過性を増大させる。及び（３） 抗生物質分子
の作用点での有効性を増大させるなどである。
抗生物質の変化する溶解性質 メリツチンは、抗生物質の有効性を、抗生物質を菌細
胞へもつと容易に輸送されるようにすることで増大させ
る可能性がある。抗生物質分子とのメリチンの直接の相
互作用は、分子の極性を減少させ、より疎水的にさせ
て、菌の膜を通過する受動輸送を可能にしていると推測
しうる。メリツチンの両親媒的性質及び塩基性によつて
メリツチンはこのような機能をはたすのにあり得そうな
候補にあげられ、この機構にもつともらしさが加えられ
ている。このタイプの機構はバリノマイシンによつて容
易となるカリウムイオンの拡散に類似しているであろ
う。
胞へもつと容易に輸送されるようにすることで増大させ
る可能性がある。抗生物質分子とのメリチンの直接の相
互作用は、分子の極性を減少させ、より疎水的にさせ
て、菌の膜を通過する受動輸送を可能にしていると推測
しうる。メリツチンの両親媒的性質及び塩基性によつて
メリツチンはこのような機能をはたすのにあり得そうな
候補にあげられ、この機構にもつともらしさが加えられ
ている。このタイプの機構はバリノマイシンによつて容
易となるカリウムイオンの拡散に類似しているであろ
う。
増大する膜透過性 バクテリアの透過障壁が減少することでもまた見かけ
上の抗生物質の投与量は増大しうるであろう。チヤンネ
ルを型づくるペプチドとしてこの役割は容易に支持され
るが、抗菌相乗作用に含まれるメリチンの機能がこれし
かないはずはない。膜障壁のより小さいグラム陽性生物
においてメリチンが単独でより効果的であることは、膜
を介した輸送が増大することでは説明不可能である。
上の抗生物質の投与量は増大しうるであろう。チヤンネ
ルを型づくるペプチドとしてこの役割は容易に支持され
るが、抗菌相乗作用に含まれるメリチンの機能がこれし
かないはずはない。膜障壁のより小さいグラム陽性生物
においてメリチンが単独でより効果的であることは、膜
を介した輸送が増大することでは説明不可能である。
抗生物質固有活性の増大 ３番目の協同的相互作用のためのあり得る機構では、
メリツチンと抗生物質の直接の相互作用が、抗生物質が
いつたんその作用部位に到達すると、抗生物質をより効
果的にしていると提案している。より特定な例はカナマ
イシンとの予想されうる相互作用である。
メリツチンと抗生物質の直接の相互作用が、抗生物質が
いつたんその作用部位に到達すると、抗生物質をより効
果的にしていると提案している。より特定な例はカナマ
イシンとの予想されうる相互作用である。
いつたんカナマイシンが30Sリボソームに到達する
と、メリツチン−カナマイシン複合体が、結合していな
いカナマイシンに比して作用部位により大きな親和性を
持つ（やはり、核酸と同様、メリチンは塩基性分子であ
る）、あるいはメリチン−カナマイシン複合体は単にそ
の複合体の大きさによつてリボソームからトランスフア
ー−RNAを立体的にへだてるのにより有効であると予測
される。
と、メリツチン−カナマイシン複合体が、結合していな
いカナマイシンに比して作用部位により大きな親和性を
持つ（やはり、核酸と同様、メリチンは塩基性分子であ
る）、あるいはメリチン−カナマイシン複合体は単にそ
の複合体の大きさによつてリボソームからトランスフア
ー−RNAを立体的にへだてるのにより有効であると予測
される。
抗生物質の活性寿命の増大 いくつかのケースで、増殖期の後期までミツバチ毒
（メリチン）付加による抗生物質の有効性の増大を検出
することが困難であつた。これらのケースではメリチン
は抗生物質作用の持続の増加を引き起こしているようで
あつた。この作用はカナマイシン耐性S.aureusをカナマ
イシン/HBVで処理したときに認められた。第９図に相対
的に高い投与量のHBVが示されているが、その理由はよ
り低い投与量では相乗作用は認められないからである。
つまり、HBV単独での有効性による早い時間点での相乗
作用を認めないことは第９図では困難であるが、これら
早い時間点で、より低い投与量のHBVではカナマイシン
との相乗作用を示さなかつた。しかしながら協同的効果
が24時間の点で認められた。このタイプの遅延した作用
に対して２つの説明が示唆されている、それは （１） 耐性突然変異体の排除あるいは（２） 抗生物
質の半減期の延長である。
（メリチン）付加による抗生物質の有効性の増大を検出
することが困難であつた。これらのケースではメリチン
は抗生物質作用の持続の増加を引き起こしているようで
あつた。この作用はカナマイシン耐性S.aureusをカナマ
イシン/HBVで処理したときに認められた。第９図に相対
的に高い投与量のHBVが示されているが、その理由はよ
り低い投与量では相乗作用は認められないからである。
つまり、HBV単独での有効性による早い時間点での相乗
作用を認めないことは第９図では困難であるが、これら
早い時間点で、より低い投与量のHBVではカナマイシン
との相乗作用を示さなかつた。しかしながら協同的効果
が24時間の点で認められた。このタイプの遅延した作用
に対して２つの説明が示唆されている、それは （１） 耐性突然変異体の排除あるいは（２） 抗生物
質の半減期の延長である。
耐性株の選択における確率の低下 ミツバチ毒と抗生物質相方が菌が生育停止するほどの
投与量菌培養液中に存在すると、耐性菌が併用処理に対
して生き残るであろう確率はそれが相方の処理後存在し
生き残る確率の積に等しい。これが遅延する相乗作用効
果としてあらわれているようであり、なぜなら上昇した
OD示度の検出可能なレベルに達するまで突然変異体が複
製するのに多くの世代が必要なためであろう。突然変異
体の選択は、処理の標準偏差を示す複数同一組のサンプ
ル中に激しく高いOD示度が偶発的にあらわれることが特
色とされている。例えば、カナマイシン耐性S.aureusを
カナマイシン存在下でHBV処理のみの効果を評価毒コン
トロール曲線での12時間の点での平均ODは0.65で標準偏
差は0.51であり（表Ａ−８）、この時点で高い示度の変
動を示した。つまり、ここで24時間の点で認められる相
乗作用効果はHBV毒耐性突然変異体による抑制の結果で
ある可能性は非常にある。
投与量菌培養液中に存在すると、耐性菌が併用処理に対
して生き残るであろう確率はそれが相方の処理後存在し
生き残る確率の積に等しい。これが遅延する相乗作用効
果としてあらわれているようであり、なぜなら上昇した
OD示度の検出可能なレベルに達するまで突然変異体が複
製するのに多くの世代が必要なためであろう。突然変異
体の選択は、処理の標準偏差を示す複数同一組のサンプ
ル中に激しく高いOD示度が偶発的にあらわれることが特
色とされている。例えば、カナマイシン耐性S.aureusを
カナマイシン存在下でHBV処理のみの効果を評価毒コン
トロール曲線での12時間の点での平均ODは0.65で標準偏
差は0.51であり（表Ａ−８）、この時点で高い示度の変
動を示した。つまり、ここで24時間の点で認められる相
乗作用効果はHBV毒耐性突然変異体による抑制の結果で
ある可能性は非常にある。
抗生物質安定性の増大 抗生物質の分解からの保護を可能性のある機構からは
ずすことはできない。抗生物質の効能を増加させる一般
的手法は、溶液中でより安定性をあるいは酵素の攻撃に
対して抵抗性を得るように抗生物質を構造的に変化させ
ることである。これらのタイプの修飾で抗生物質のペニ
シリン類の多くの誘導体を説明できる。例えば、ペニシ
リンＶは立体的障害を供えるフエノキシメチル置換基を
もつ、酵素の攻撃から抗生物質のベーターラクタム環を
保護している（ヴオルク（Volk）,1978c）。このような
置換によつてまた分子のこの部位はベーターラクタム環
による環化が妨げられて分子は酸加水分解に対してより
抵抗性を示すようになる。抗生物質は初期にはそれほど
効果的ということはなく、菌培養液がそのときの栄養源
による限界ODに達しない場合にかぎり抗生物質の持続期
間が延長したことが明らかであるので、このタイプの修
飾はまた、菌の生育を停止する投与量のときのみにあら
われる相乗作用効果を生みだすと思われる。しかしなが
らもしもHBVがこのような修飾をひきおこせるとすれ
ば、複数同一組のサンプル間でより首尾一貫した結果が
要求される。
ずすことはできない。抗生物質の効能を増加させる一般
的手法は、溶液中でより安定性をあるいは酵素の攻撃に
対して抵抗性を得るように抗生物質を構造的に変化させ
ることである。これらのタイプの修飾で抗生物質のペニ
シリン類の多くの誘導体を説明できる。例えば、ペニシ
リンＶは立体的障害を供えるフエノキシメチル置換基を
もつ、酵素の攻撃から抗生物質のベーターラクタム環を
保護している（ヴオルク（Volk）,1978c）。このような
置換によつてまた分子のこの部位はベーターラクタム環
による環化が妨げられて分子は酸加水分解に対してより
抵抗性を示すようになる。抗生物質は初期にはそれほど
効果的ということはなく、菌培養液がそのときの栄養源
による限界ODに達しない場合にかぎり抗生物質の持続期
間が延長したことが明らかであるので、このタイプの修
飾はまた、菌の生育を停止する投与量のときのみにあら
われる相乗作用効果を生みだすと思われる。しかしなが
らもしもHBVがこのような修飾をひきおこせるとすれ
ば、複数同一組のサンプル間でより首尾一貫した結果が
要求される。
MIC試験の評価 HBV/抗生物質相乗作用試験のために開発されたチエツ
カー盤力価測定アツセイは、異なる抗生物質および異な
る細菌に対するHBVの効果を広範囲に調査する場合に
は、時間がかかり過ぎた。しかしながら、HBVとの相乗
作用に対する抗生物質のクラスの中での傾向を位置付け
るため、および、抗生物質とHBVの特異的な相乗的組み
合わせに対する細菌種の中での感受性のスペクトルを決
定するために、このような調査は必要であつた。自動化
MICアツセイの修飾法が、この型の調査を容易にするた
めに考案された。
カー盤力価測定アツセイは、異なる抗生物質および異な
る細菌に対するHBVの効果を広範囲に調査する場合に
は、時間がかかり過ぎた。しかしながら、HBVとの相乗
作用に対する抗生物質のクラスの中での傾向を位置付け
るため、および、抗生物質とHBVの特異的な相乗的組み
合わせに対する細菌種の中での感受性のスペクトルを決
定するために、このような調査は必要であつた。自動化
MICアツセイの修飾法が、この型の調査を容易にするた
めに考案された。
自動化MICアツセイの限界により、結果の評価は幾分
経験的である。HBVのみの効果は阻害的または非阻害的
としか記録されなかつたので、結果は相加的効果に対し
て、相乗的効果であることは証明されない。（HBVのわ
ずかに阻害的な量は非阻害的であると記録され、したが
つていくつかのMIC減少は実際には相加的効果の結果で
ある可能性がある。）しかしながら、ほとんどのアツセ
イでは、一部の抗生物質しかMICの減少を示さなかつた
ので、HBV添加量は相加的ではないことが示唆された。
したがつて、チエツカー盤力価測定システムの結果によ
つて支持される場合、これらのMICアツセイの使用は特
異的な細菌群の最大の可能性をもつ抗生物質/HBVの組み
合わせを指摘するのに信頼性があるべきである。この観
点からMICは将来の研究に向けて使用されるであろう。
経験的である。HBVのみの効果は阻害的または非阻害的
としか記録されなかつたので、結果は相加的効果に対し
て、相乗的効果であることは証明されない。（HBVのわ
ずかに阻害的な量は非阻害的であると記録され、したが
つていくつかのMIC減少は実際には相加的効果の結果で
ある可能性がある。）しかしながら、ほとんどのアツセ
イでは、一部の抗生物質しかMICの減少を示さなかつた
ので、HBV添加量は相加的ではないことが示唆された。
したがつて、チエツカー盤力価測定システムの結果によ
つて支持される場合、これらのMICアツセイの使用は特
異的な細菌群の最大の可能性をもつ抗生物質/HBVの組み
合わせを指摘するのに信頼性があるべきである。この観
点からMICは将来の研究に向けて使用されるであろう。
活性のあるミツバチ毒液成分の同定 これらの研究の結果はミツバチ毒液の相乗的活性が完
全にメリチン画分に含まれることを示唆しているが、こ
れらの結果の注意深い解釈が行われるべきである。小さ
なペプチドや非染色（クマシーブルー）成分が、メリチ
ン分子とイオン力または疎水結合力によつてクロマトグ
ラフイーの際にメリチンと同じ挙動を示す可能性があ
る。メリチンは非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
およびセフアデツクスゲルクロマトグラフイー（ハーバ
ーマン（Haberman）,1972）において、通常の分子量の
５倍の重合体として移動する。これらの小さなミセル
は、クロマトグラフイーにおいてより小さな疎水性化合
物を運ぶことができる。メリチン画分におけるこのよう
な型の混入を検出するための分析が含まれており、第６
章で論じられている。
全にメリチン画分に含まれることを示唆しているが、こ
れらの結果の注意深い解釈が行われるべきである。小さ
なペプチドや非染色（クマシーブルー）成分が、メリチ
ン分子とイオン力または疎水結合力によつてクロマトグ
ラフイーの際にメリチンと同じ挙動を示す可能性があ
る。メリチンは非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
およびセフアデツクスゲルクロマトグラフイー（ハーバ
ーマン（Haberman）,1972）において、通常の分子量の
５倍の重合体として移動する。これらの小さなミセル
は、クロマトグラフイーにおいてより小さな疎水性化合
物を運ぶことができる。メリチン画分におけるこのよう
な型の混入を検出するための分析が含まれており、第６
章で論じられている。
上述のように、HBVがリフアンピシンに代表される上
述の第４の抗生物質群の活性を増強するのにも効果的で
あることを示すためにさらなる試験が行われた。データ
を以下の表６、７、および図16、17に示す。
述の第４の抗生物質群の活性を増強するのにも効果的で
あることを示すためにさらなる試験が行われた。データ
を以下の表６、７、および図16、17に示す。
HBV以外の膜翅目毒液の活性も、以下の表８、９およ
び図18−20に示される様に、マルハナバチ毒液、スズメ
バチ毒液、およびオオクマバチ毒液に関して決定され
た。
び図18−20に示される様に、マルハナバチ毒液、スズメ
バチ毒液、およびオオクマバチ毒液に関して決定され
た。
いくつかの上述と類似の物質に関しても、天然のメリ
チンに関連してその相対的活性を決定するために試験が
行われた。相対的活性は以下のように算出した： 得られた結果は表10に示した。
チンに関連してその相対的活性を決定するために試験が
行われた。相対的活性は以下のように算出した： 得られた結果は表10に示した。
NH2末端が主に塩基性アミノ酸から構成されている類
似物質は、主にNH2末端が中性および／または酸性アミ
ノ酸からなる類似物質よりも活性をもつていることが示
された。
似物質は、主にNH2末端が中性および／または酸性アミ
ノ酸からなる類似物質よりも活性をもつていることが示
された。
in vivo実験 序 in vivo実験は、蜜蜂毒液の主要なペプチドであるメ
リチン（melittin）が、証明済の抗生物質である。ポリ
ミキシンＢ（polymyxin B）の有効性を高めることを実
証する。細菌性敗血症という疾病モデルは、マウスにお
いて展開された。本実験のために、大腸菌（E.coli）敗
血症に対するポリミキシンＢとメリチンの活性が、別々
に或いは組み合わされた形で、２つの基本的なセツトの
実験において比較される。両実験のプロトコールに関し
て、メリチンとポリミキシンＢの間の共同的相互作用は
明らかであり、各分散分析での処理平均値の比較によ
り、統計学的に立証されている。このことから、ポリミ
キシンＢの有効性を高めたり、in vivoで、優れた抗菌
活性を示したりするというメリチンの能力が明白に実証
される。
リチン（melittin）が、証明済の抗生物質である。ポリ
ミキシンＢ（polymyxin B）の有効性を高めることを実
証する。細菌性敗血症という疾病モデルは、マウスにお
いて展開された。本実験のために、大腸菌（E.coli）敗
血症に対するポリミキシンＢとメリチンの活性が、別々
に或いは組み合わされた形で、２つの基本的なセツトの
実験において比較される。両実験のプロトコールに関し
て、メリチンとポリミキシンＢの間の共同的相互作用は
明らかであり、各分散分析での処理平均値の比較によ
り、統計学的に立証されている。このことから、ポリミ
キシンＢの有効性を高めたり、in vivoで、優れた抗菌
活性を示したりするというメリチンの能力が明白に実証
される。
背景と先行技術と題されたセクシヨンで前述した多く
の参照文献は、蜜蜂毒液、より特異的に言えばメリチン
の抗微生物試薬としての利用法を発表している。しかし
ながら、こうした参照文献は、蜜蜂毒液もしくはメリチ
ンのin vitroでの有効性しか実証していない。
の参照文献は、蜜蜂毒液、より特異的に言えばメリチン
の抗微生物試薬としての利用法を発表している。しかし
ながら、こうした参照文献は、蜜蜂毒液もしくはメリチ
ンのin vitroでの有効性しか実証していない。
他の幾つかの系はメリチンを孤立したin vitro系での
様々な免疫反応を乱す人為的手段として用いてきた。グ
ツドマン（Goodman）ら（1984）はin vitroにおけるメ
リチンによるＢ細胞の活性化を報告した。２つの別々の
報告は、１つはコンドウ（Kondo）とカナイ（Kanai）に
よるもの（1986）１つはコンドウによるもの（1986）だ
が、マウスとモルモツトの両方の食細胞から単離された
膜の殺菌活性を刺激するというin vitroでのメリチンの
利用法を述べている。最後になるが、蜜蜂毒液の免疫シ
ステムへの効果に関連した出版物（ソマーフイールド
（Somer field）ら、1986）は、メリチンによる好中球
の０産生の阻害を述べている。ソマーフイールドらは、
抗炎症動因としてのメリチンに対する役割を示唆してい
る。この活性は、in vivoでの抗細菌防御を弱める可能
性が多分にあるのではないだろうか。
様々な免疫反応を乱す人為的手段として用いてきた。グ
ツドマン（Goodman）ら（1984）はin vitroにおけるメ
リチンによるＢ細胞の活性化を報告した。２つの別々の
報告は、１つはコンドウ（Kondo）とカナイ（Kanai）に
よるもの（1986）１つはコンドウによるもの（1986）だ
が、マウスとモルモツトの両方の食細胞から単離された
膜の殺菌活性を刺激するというin vitroでのメリチンの
利用法を述べている。最後になるが、蜜蜂毒液の免疫シ
ステムへの効果に関連した出版物（ソマーフイールド
（Somer field）ら、1986）は、メリチンによる好中球
の０産生の阻害を述べている。ソマーフイールドらは、
抗炎症動因としてのメリチンに対する役割を示唆してい
る。この活性は、in vivoでの抗細菌防御を弱める可能
性が多分にあるのではないだろうか。
メリチンに関して相当量の研究があるにも拘らず、メ
リチンが、伝染性生物に対してin vivoで有効であるこ
とは未だ実証されないでいる。更に重要なことに、メリ
チンの抗生物質との相互作用を要求したり、それで利益
を得たりするような場面が、提案されないでいる。ここ
で報告している結果は、大腸菌による細菌性敗血症に苦
しむマウスの治療にin vivoで用いられた時のメリチン
とポリミキシンＢとの間の有益な相互作用を実証してい
る。
リチンが、伝染性生物に対してin vivoで有効であるこ
とは未だ実証されないでいる。更に重要なことに、メリ
チンの抗生物質との相互作用を要求したり、それで利益
を得たりするような場面が、提案されないでいる。ここ
で報告している結果は、大腸菌による細菌性敗血症に苦
しむマウスの治療にin vivoで用いられた時のメリチン
とポリミキシンＢとの間の有益な相互作用を実証してい
る。
材料と手法 メスのスイスCD−１マウス（Swiss CD−1 mice）（チ
ヤールズリバー（Charlos River）が18−20グラムの体
重で得られた。マウスは77±１゜F、33−45％の相対湿
度で毎日12時間の明期を与えながら収容された。配達さ
れるとすぐに、各積荷のマウスは実験に用いる前に、２
週間の環境順応期間、維持しておいた。
ヤールズリバー（Charlos River）が18−20グラムの体
重で得られた。マウスは77±１゜F、33−45％の相対湿
度で毎日12時間の明期を与えながら収容された。配達さ
れるとすぐに、各積荷のマウスは実験に用いる前に、２
週間の環境順応期間、維持しておいた。
ポリミキシンＢ（シグマ化学会社（Sigma Chemical C
ompany））は、粉末の形で、7900ユニツト/mgのものが
調達された。保存溶液は0.85％ NaCl中で0.1mg/mlで調
製され、使用まで5mlずつ分注して−20℃で凍らせた。
ompany））は、粉末の形で、7900ユニツト/mgのものが
調達された。保存溶液は0.85％ NaCl中で0.1mg/mlで調
製され、使用まで5mlずつ分注して−20℃で凍らせた。
蜜蜂毒液（HBV）は、ヴエスパ有限責任研究所（Vespa
Laboratories,Inc.）スプリング ミルズ ペンシルバ
ニア州（Spring Mills,PA）により供給された。HBVは、
in vitro実験のために以前記述されたようにゲル過を
用いて単離されたメリチンのソースであつた。メリチン
は、ローリーのタンパク質分析法（Lowry protein assa
y）（ローリーら,1951）により定量され、それから凍結
乾燥にした。凍結乾燥したメリチンを0.85％ NaCl中で
0.1mg/mlの濃度に再構成し、次の使用まで1.5mlずつ分
注して−20℃で凍らせた。
Laboratories,Inc.）スプリング ミルズ ペンシルバ
ニア州（Spring Mills,PA）により供給された。HBVは、
in vitro実験のために以前記述されたようにゲル過を
用いて単離されたメリチンのソースであつた。メリチン
は、ローリーのタンパク質分析法（Lowry protein assa
y）（ローリーら,1951）により定量され、それから凍結
乾燥にした。凍結乾燥したメリチンを0.85％ NaCl中で
0.1mg/mlの濃度に再構成し、次の使用まで1.5mlずつ分
注して−20℃で凍らせた。
大腸菌株＃G1108Eを、ペンシルバニア州立大学大腸菌
リフアレンスセンター、ユニヴアーシテイ パーク，ペ
ンシルバニア州（Pennsylvania State University E.co
li Refarence Center,University Park,PA）より得た。
5mlのトリプテイカーゼ ソイ ブロース（trypticase
soy broth）一晩培養液を、新しいトリプテイカーゼ
ソイ ブロース800mlに植え付けた。培養液は穏やかに
震盪して一晩、増殖させた。滅菌済グリセロール200ml
を培養液に加え、それから、撹拌しながら5.0mlずつ無
菌で分注する。この分注液を凍らして−20℃で保存し
た。解凍した時、各分注液は、±３×108生菌/mlであつ
た。それから接種前に、培養液を2.5％胃ムチン（シグ
マ化学会社）を含んだトリプテイカーゼ ソイ ブロー
スで1:400に希釈した。
リフアレンスセンター、ユニヴアーシテイ パーク，ペ
ンシルバニア州（Pennsylvania State University E.co
li Refarence Center,University Park,PA）より得た。
5mlのトリプテイカーゼ ソイ ブロース（trypticase
soy broth）一晩培養液を、新しいトリプテイカーゼ
ソイ ブロース800mlに植え付けた。培養液は穏やかに
震盪して一晩、増殖させた。滅菌済グリセロール200ml
を培養液に加え、それから、撹拌しながら5.0mlずつ無
菌で分注する。この分注液を凍らして−20℃で保存し
た。解凍した時、各分注液は、±３×108生菌/mlであつ
た。それから接種前に、培養液を2.5％胃ムチン（シグ
マ化学会社）を含んだトリプテイカーゼ ソイ ブロー
スで1:400に希釈した。
2.5％ムチンを含んだトリプテイカーゼ ソイ ブロ
ースに懸濁した細菌の1:400の希釈液0.25ml（およそ50
0,000生菌）の腹膜組織内注射によりマウスを感染させ
た。
ースに懸濁した細菌の1:400の希釈液0.25ml（およそ50
0,000生菌）の腹膜組織内注射によりマウスを感染させ
た。
注射に先立ち、ポリミキシンＢとメリチンを解凍し、
過滅菌してから、滅菌済0.85％ NaClで溶液0.2ml中
に必要投与量が含まれているように適当に希釈した。感
染後30分してから、この量をマウスに皮下注射で首の根
本の皮膚のひだに投与した。皮膚のひだを基本的に控え
めにつまむことで親指と人差し指の間に作られる。
過滅菌してから、滅菌済0.85％ NaClで溶液0.2ml中
に必要投与量が含まれているように適当に希釈した。感
染後30分してから、この量をマウスに皮下注射で首の根
本の皮膚のひだに投与した。皮膚のひだを基本的に控え
めにつまむことで親指と人差し指の間に作られる。
血中細菌レベルは、無菌的に心臓に針を刺して得た血
液サンプルから決定された。心臓に刺した後針をヘパリ
ン（heparin）でコートしたシリンジから取り除き、血
液0.2mlを0.85％ NaCl 0.2mlを含むチユーブに移し、
よく混ぜた。全てのサンプルは、プレートにまくまで、
氷上でとつておいた。全てのサンプルの複製スプレツト
プレートを、適当な希釈でトリプテイカーゼ ソイ寒天
上で調製し、37℃で一晩培養した。400未満のコロニー
を含む全てのプレートを計数し、記録した。
液サンプルから決定された。心臓に刺した後針をヘパリ
ン（heparin）でコートしたシリンジから取り除き、血
液0.2mlを0.85％ NaCl 0.2mlを含むチユーブに移し、
よく混ぜた。全てのサンプルは、プレートにまくまで、
氷上でとつておいた。全てのサンプルの複製スプレツト
プレートを、適当な希釈でトリプテイカーゼ ソイ寒天
上で調製し、37℃で一晩培養した。400未満のコロニー
を含む全てのプレートを計数し、記録した。
結果 第１の実験構想では、各々４匹のマウスから成る４つ
のランダムなグループに前述の通りに大腸菌を接種し
た。30分後、各グループの４匹のマウスをそれぞれ、
１）0.25％ NaClのみ（「無処理」；“no treatmen
t"）２）2.0μポリミキシンＢ、３）50mgメリチン、
４）2.0μｇポリミキシンＢ＋50ngメリチンのいづれか
を含む0.85％ NaCl溶液0.2mlで処理した。最初の接種
後21時間してから血液サンプルを採取し、血液1ml中の
細菌の数を、適当な希釈血液の複数プレート計数の結果
を平均することで計算した（表Ａ−11）。この実験を３
通り行ない４匹の処理マウスの各々の血液1ml中の細菌
の平均数を比較した（図21）、２つの方法による分散分
析における処理結果に対する.0015というｐ値（一様で
ないサンプルサイズを調整して）は、処理手段の少なく
とも１つで有意な差を示した。ツキーの多重平均値比較
法（Tukey′s multiple mean comparison）により、有
意な差が出た唯一の平均値が２μｇポリミキシンＢと50
ngメリチンを組み合わせて受けたグループの平均値であ
ることが示された。個々に用いられたメリチンとポリミ
キシンＢにより供される活性の合計を組み合わせて用い
られた時の活性と比較することにより、分散分析内での
対照は、相互作用が、実際共同的であることを確かなも
のとした（ｐ値＝.0493）。
のランダムなグループに前述の通りに大腸菌を接種し
た。30分後、各グループの４匹のマウスをそれぞれ、
１）0.25％ NaClのみ（「無処理」；“no treatmen
t"）２）2.0μポリミキシンＢ、３）50mgメリチン、
４）2.0μｇポリミキシンＢ＋50ngメリチンのいづれか
を含む0.85％ NaCl溶液0.2mlで処理した。最初の接種
後21時間してから血液サンプルを採取し、血液1ml中の
細菌の数を、適当な希釈血液の複数プレート計数の結果
を平均することで計算した（表Ａ−11）。この実験を３
通り行ない４匹の処理マウスの各々の血液1ml中の細菌
の平均数を比較した（図21）、２つの方法による分散分
析における処理結果に対する.0015というｐ値（一様で
ないサンプルサイズを調整して）は、処理手段の少なく
とも１つで有意な差を示した。ツキーの多重平均値比較
法（Tukey′s multiple mean comparison）により、有
意な差が出た唯一の平均値が２μｇポリミキシンＢと50
ngメリチンを組み合わせて受けたグループの平均値であ
ることが示された。個々に用いられたメリチンとポリミ
キシンＢにより供される活性の合計を組み合わせて用い
られた時の活性と比較することにより、分散分析内での
対照は、相互作用が、実際共同的であることを確かなも
のとした（ｐ値＝.0493）。
第２の実験構想は、反復処理の効果を試験した。再び
各々４匹のマウスから成る４つのグループに大腸菌を接
種し、30分後に同じく４つの処理剤:1）0.85％ NaClの
み（「無処理」）;2）2.0μｇポリミキシンB;3）50ngメ
リチン;4）2.0μｇポリミキシンＢ＋50ngメリチン：を
用いて処理した。最初の感染後18時間してから、各マウ
スを再度、同じ大腸菌接種に挑戦させ、30分後同じ抗生
物質／メリチン養生法で治療した。５時間後（最初の感
染から23時間）各マウスからの血液サンプルをプレート
にまいて血中の細菌数を定量した。この実験を５回くり
返し、結果（表Ａ−12）を分散分析により見積もつた。
こうした分析で、少なくとも１つの治療において有意な
差（ｐ値＝.0001）が見られた。ツキーの多重平均値比
較法により、ポリミキシンの反復処理は血液1ml中の細
菌数を有意に減少させるということが示された。ツキー
の比較法により、ポリミキシンＢ＋メリチンで治療した
動物の血中細菌数が、ポリミキシンＢやメリチンのみで
治療した動物の血中の数より有意に低いことが示された
のは更に重要である（図22参照）。分散分析内での対照
は、この２つの化合物の共同性に対して高い信頼度を与
えた（ｐ値＝0.0007） 結論 上の実験は、抗生物質ポリミキシンＢとメリチン間の
共同的相互作用を明確に実証している。メリチンが他の
医薬の治療効果をその抗微生物性質と膜透過性を高める
能力とにより、高めるということは多いにありえる。
各々４匹のマウスから成る４つのグループに大腸菌を接
種し、30分後に同じく４つの処理剤:1）0.85％ NaClの
み（「無処理」）;2）2.0μｇポリミキシンB;3）50ngメ
リチン;4）2.0μｇポリミキシンＢ＋50ngメリチン：を
用いて処理した。最初の感染後18時間してから、各マウ
スを再度、同じ大腸菌接種に挑戦させ、30分後同じ抗生
物質／メリチン養生法で治療した。５時間後（最初の感
染から23時間）各マウスからの血液サンプルをプレート
にまいて血中の細菌数を定量した。この実験を５回くり
返し、結果（表Ａ−12）を分散分析により見積もつた。
こうした分析で、少なくとも１つの治療において有意な
差（ｐ値＝.0001）が見られた。ツキーの多重平均値比
較法により、ポリミキシンの反復処理は血液1ml中の細
菌数を有意に減少させるということが示された。ツキー
の比較法により、ポリミキシンＢ＋メリチンで治療した
動物の血中細菌数が、ポリミキシンＢやメリチンのみで
治療した動物の血中の数より有意に低いことが示された
のは更に重要である（図22参照）。分散分析内での対照
は、この２つの化合物の共同性に対して高い信頼度を与
えた（ｐ値＝0.0007） 結論 上の実験は、抗生物質ポリミキシンＢとメリチン間の
共同的相互作用を明確に実証している。メリチンが他の
医薬の治療効果をその抗微生物性質と膜透過性を高める
能力とにより、高めるということは多いにありえる。
第１のセツトの実験の結果（図21）は、メリチンだけ
の効果に対して統計的有意性に欠けていたが、絶対平均
値の比較により、メリチン治療だけでの、ポジテイブな
効果が示唆された。第２のセツトの実験の結果（図22）
は、再び、メリチンだけの治療に対する有意な差に欠け
ていた。絶対治療平均値の比較によりメリチンのみのネ
ガテイブな効果が示唆された。第２セツトの実験のマウ
スが、２倍のメリチンを受けていたことを考えると、こ
のことは、メリチンの高い投与が、抗生物質なしで用い
られた時、感染過程を悪化させる可能性があることを示
唆している。かなり高いメリチン投与を伴つていた以前
の実験法はこの仮定を立証している。メリチンがそれだ
けで使用された場合、有害な活性が起きるのは十分考え
られる。感染治療に対するメリチンの有効な利用法が、
文献検索では見つからなかつたことは重要である。抗生
物質は、メリチンのネガテイブな効果を明らかに押しと
どめるので、組みあわせた治療法は重要な発展となるで
あろう。
の効果に対して統計的有意性に欠けていたが、絶対平均
値の比較により、メリチン治療だけでの、ポジテイブな
効果が示唆された。第２のセツトの実験の結果（図22）
は、再び、メリチンだけの治療に対する有意な差に欠け
ていた。絶対治療平均値の比較によりメリチンのみのネ
ガテイブな効果が示唆された。第２セツトの実験のマウ
スが、２倍のメリチンを受けていたことを考えると、こ
のことは、メリチンの高い投与が、抗生物質なしで用い
られた時、感染過程を悪化させる可能性があることを示
唆している。かなり高いメリチン投与を伴つていた以前
の実験法はこの仮定を立証している。メリチンがそれだ
けで使用された場合、有害な活性が起きるのは十分考え
られる。感染治療に対するメリチンの有効な利用法が、
文献検索では見つからなかつたことは重要である。抗生
物質は、メリチンのネガテイブな効果を明らかに押しと
どめるので、組みあわせた治療法は重要な発展となるで
あろう。
合成メリチンアナログで実証される抗生物質の共同性 抗生物質とメリチンの間で見られた共同性は、メリチ
ンを合成ペプチドアナログで置きかえても達成させるか
もしれない。この目的のため、そのようなアナログが、
考案され、合成された。天然のメリチンと並行して試験
すると、同等の抗生物質高揚性が与えられた。
ンを合成ペプチドアナログで置きかえても達成させるか
もしれない。この目的のため、そのようなアナログが、
考案され、合成された。天然のメリチンと並行して試験
すると、同等の抗生物質高揚性が与えられた。
序 下に示すような構造をもつアナログNo.6を、E.coliに
対するポリミキシンＢとの共同性について以前に記述 されたようなin vitro試験にかけた。このペプチドは2
2、24番目のアミノ酸（下線部）で、アルギニンが、リ
ジンに置きかわつているところで、メリチンとは異な
る。以前記述された分析法で用いると、天然のメリチン
と同等の活性が実証された。
対するポリミキシンＢとの共同性について以前に記述 されたようなin vitro試験にかけた。このペプチドは2
2、24番目のアミノ酸（下線部）で、アルギニンが、リ
ジンに置きかわつているところで、メリチンとは異な
る。以前記述された分析法で用いると、天然のメリチン
と同等の活性が実証された。
材料と手法 メリチンを、蜜蜂毒液全体（ヴエスパ有限責任研究所
（Vespa Laboratories,Inc.））から、ゲル過クロマ
トグラフイーにより単離し、ローリーのタンパク質分析
法で定量し、凍結乾燥して保存した。分析にあたつて、
凍結乾燥したメリチンを、蒸留水で0.4mg/mlになるよう
に再構成し、過滅菌して使用まで4.0mlずつ分注して
−20℃で保存した。
（Vespa Laboratories,Inc.））から、ゲル過クロマ
トグラフイーにより単離し、ローリーのタンパク質分析
法で定量し、凍結乾燥して保存した。分析にあたつて、
凍結乾燥したメリチンを、蒸留水で0.4mg/mlになるよう
に再構成し、過滅菌して使用まで4.0mlずつ分注して
−20℃で保存した。
アナログNo.6はベン セルマーク博士（タンパク質研
究所、コペンハーゲン大学、シガーズゲード34,DK−220
0 コペンハーゲン N,デンマーク;The Protein Labora
tory,Copenhagen University,Sigurdsgade 34,DK−2200
Copenhagen N,Denmark）により合成された。0.1％トリ
フルオロ酢酸（trifluoro autate）中で０−80％アセト
ニトリル（acetonitrile）勾配を用いたC18カラムから
の高圧液体クロマトグラフイー（high pressure liquid
chromatography）の溶出プロフイールに基づいて98％
以上純清なものと評価された。凍結乾燥の形で、ペプチ
ドを受け取り、0.85％ NaCl中におよそ0.2mg/mlで再構
成して過滅菌して0.5mlずつ分注して使用まで−20℃
で保存した。
究所、コペンハーゲン大学、シガーズゲード34,DK−220
0 コペンハーゲン N,デンマーク;The Protein Labora
tory,Copenhagen University,Sigurdsgade 34,DK−2200
Copenhagen N,Denmark）により合成された。0.1％トリ
フルオロ酢酸（trifluoro autate）中で０−80％アセト
ニトリル（acetonitrile）勾配を用いたC18カラムから
の高圧液体クロマトグラフイー（high pressure liquid
chromatography）の溶出プロフイールに基づいて98％
以上純清なものと評価された。凍結乾燥の形で、ペプチ
ドを受け取り、0.85％ NaCl中におよそ0.2mg/mlで再構
成して過滅菌して0.5mlずつ分注して使用まで−20℃
で保存した。
7900ユニツト/mgの特異活性をもつポリミキシンＢ
（シグマ化学会社）を蒸留水で、240ユニツト/mlに再構
成し、過滅菌して、4.0mlずつ分注して使用まで−20
℃で保存した。
（シグマ化学会社）を蒸留水で、240ユニツト/mlに再構
成し、過滅菌して、4.0mlずつ分注して使用まで−20
℃で保存した。
E.coli株No.G1108Eは、ペンシルバニア州立大学E.col
i リフアレンスセンター（105 Henning Building,Uni
versity Park,pennsylvania,16802）から得られた。接
種原を、トリプテイカーゼ ソイ ブロースで中間対数
相（mid−log phase）になつている培養液から調製し
た。滅菌済グリセロール最終濃度20％となるよう加え、
培養液を5.0mlずつ分注して使用まで−20℃で保存し
た。
i リフアレンスセンター（105 Henning Building,Uni
versity Park,pennsylvania,16802）から得られた。接
種原を、トリプテイカーゼ ソイ ブロースで中間対数
相（mid−log phase）になつている培養液から調製し
た。滅菌済グリセロール最終濃度20％となるよう加え、
培養液を5.0mlずつ分注して使用まで−20℃で保存し
た。
チエツカー版力価測定共同性分析法を行なつて、大腸
菌に対してポリミキシンＢと並行して天然メリチンとア
ナログ＃６とを試験した。天然メリチンとアナログ＃６
の同等の投与量は最後の過後ごとの分注液について同
時に行なわれたローリーのタンパク質分析法に基づい
た。両ペプチドは培地中最終濃度５μg/mlと10μg/mlで
共同性分析法で試験された。ポリミキシンＢは、両ペプ
チドの両方のレベルに対して、３ユニツト/mlと６ユニ
ツト/mlの最終培地濃度で試験された。
菌に対してポリミキシンＢと並行して天然メリチンとア
ナログ＃６とを試験した。天然メリチンとアナログ＃６
の同等の投与量は最後の過後ごとの分注液について同
時に行なわれたローリーのタンパク質分析法に基づい
た。両ペプチドは培地中最終濃度５μg/mlと10μg/mlで
共同性分析法で試験された。ポリミキシンＢは、両ペプ
チドの両方のレベルに対して、３ユニツト/mlと６ユニ
ツト/mlの最終培地濃度で試験された。
結果 ポリミキシンＢ ６ユニツト/mlに対し、10μg/mlで
試験した時、天然メリチンとアナログ＃６の両方につい
て、共同性が最も良く実証された（表11）。こうした条
件（図23参照）のもとで、各ペプチドに関するデータ
を、各時点での共同性活性に対し、統計的に分析した。
統計的対比を用いて、各ペプチドだけとポリミキシンＢ
だけの平均活性を各ペプチドとポリミキシンＢとの組み
あわせの活性と比較した。メリチンとアナログ＃６共
に、４、６、８時間の時点で共同性が検出された（ｐ値
＝.0001）。
試験した時、天然メリチンとアナログ＃６の両方につい
て、共同性が最も良く実証された（表11）。こうした条
件（図23参照）のもとで、各ペプチドに関するデータ
を、各時点での共同性活性に対し、統計的に分析した。
統計的対比を用いて、各ペプチドだけとポリミキシンＢ
だけの平均活性を各ペプチドとポリミキシンＢとの組み
あわせの活性と比較した。メリチンとアナログ＃６共
に、４、６、８時間の時点で共同性が検出された（ｐ値
＝.0001）。
加えて、メリチン（10μｇメリチン＋６ユニツトポリ
ミキシンＢ）とアナログ＃６（10μｇアナログ＃６＋６
ユニツトポリミキシンＢ）に対する共同性曲線を異なる
活性レベルに対して各時点で比較した。この２つの曲線
の間ではどの時点においても有意な差異は検出できなか
つた。
ミキシンＢ）とアナログ＃６（10μｇアナログ＃６＋６
ユニツトポリミキシンＢ）に対する共同性曲線を異なる
活性レベルに対して各時点で比較した。この２つの曲線
の間ではどの時点においても有意な差異は検出できなか
つた。
結論 合成メリチンアナログであるアナログ＃６が、ポリミ
キシンＢの活性を高める能力に関してはメリチンとほぼ
同様の活性をもつことが結果で示されている。12時間の
時点はアナログ＃６が、ポリミキシンＢに関してメリチ
ンよりもわずかに良い活性を持つことを示唆している
が、活性におけるこの差異は、それを反映するだろうペ
プチドでの実際の定量的差異に関しては極微なものであ
る。10μｇアナログ＃６に対して10μｇメリチンにより
生じる共同性の差異を、５μｇメリチンに対して10μｇ
メリチンにより生じる共同性の差異と比較する（表11）
ことにより、アナログ＃６に対して、メリチンの特異活
性の差異は10％より小さいと見なせる。
キシンＢの活性を高める能力に関してはメリチンとほぼ
同様の活性をもつことが結果で示されている。12時間の
時点はアナログ＃６が、ポリミキシンＢに関してメリチ
ンよりもわずかに良い活性を持つことを示唆している
が、活性におけるこの差異は、それを反映するだろうペ
プチドでの実際の定量的差異に関しては極微なものであ
る。10μｇアナログ＃６に対して10μｇメリチンにより
生じる共同性の差異を、５μｇメリチンに対して10μｇ
メリチンにより生じる共同性の差異と比較する（表11）
ことにより、アナログ＃６に対して、メリチンの特異活
性の差異は10％より小さいと見なせる。
この研究により、メリチンと同等あるいはそれ以上の
共同性能力をもつメリチンアナログを合成することがで
きることが示された。
共同性能力をもつメリチンアナログを合成することがで
きることが示された。
メリチンとポリミキシンＢの共同的抗細菌活性：メリチ
ンアナログの相対活性 抗生物質とメリチンとの間に見られる共同性は、メリ
チンを、合成アナログや、天然ペプチドを化学的に修飾
した誘導物に置きかえることでも達成されるかもしれな
い。合成メリチン、５つの合成ペプチドアナログ、そし
て天然メリチンの化学的修飾物を、大腸菌の増殖阻害に
関してポリミキシンＢとの共同的相互作用に対して試験
した。その相対活性を、天然の蜜蜂毒液からのメリチン
のそれと比較した。各ペプチドはポリミキシンＢと共同
的相互作用を示したものの、特異活性が有意に異なつて
いた。幾つかのアナログは天然メリチンより優れた共同
性活性を示した。
ンアナログの相対活性 抗生物質とメリチンとの間に見られる共同性は、メリ
チンを、合成アナログや、天然ペプチドを化学的に修飾
した誘導物に置きかえることでも達成されるかもしれな
い。合成メリチン、５つの合成ペプチドアナログ、そし
て天然メリチンの化学的修飾物を、大腸菌の増殖阻害に
関してポリミキシンＢとの共同的相互作用に対して試験
した。その相対活性を、天然の蜜蜂毒液からのメリチン
のそれと比較した。各ペプチドはポリミキシンＢと共同
的相互作用を示したものの、特異活性が有意に異なつて
いた。幾つかのアナログは天然メリチンより優れた共同
性活性を示した。
序 合成ペプチドと天然メリチンの化学的修飾物というメ
リチンアナログの２つのタイプを、抗細菌活性分析にお
いてポリミキシンＢとの共同性についてin vitroで分析
した。合成アナログは、合成ペプチドのグループを含
み、その全てがメリチンの26アミノ酸配列とは２もしく
はそれ以上の残基において異なる。メリチンの化学的修
飾物であるNPS−メリチン（NPS−melittin）は、天然メ
リチンの19番目のトリプトフアン残基にｏ−ニトロフエ
ニルスルフエニル基を付けてある。こうしたアナログの
各々の活性を、天然及び合成メリチン両方の活性と比較
した。こうしたアナログの各々が、in vitroでポリミキ
シンＢと共同的相互作用を示した一方で、ペプチドの活
性とは有意な差が明らかになつた。こうした相違は、ポ
リミキシンＢの活性の増強剤としての役割において、メ
リチン分子の鍵となる属性を明確に表している。
リチンアナログの２つのタイプを、抗細菌活性分析にお
いてポリミキシンＢとの共同性についてin vitroで分析
した。合成アナログは、合成ペプチドのグループを含
み、その全てがメリチンの26アミノ酸配列とは２もしく
はそれ以上の残基において異なる。メリチンの化学的修
飾物であるNPS−メリチン（NPS−melittin）は、天然メ
リチンの19番目のトリプトフアン残基にｏ−ニトロフエ
ニルスルフエニル基を付けてある。こうしたアナログの
各々の活性を、天然及び合成メリチン両方の活性と比較
した。こうしたアナログの各々が、in vitroでポリミキ
シンＢと共同的相互作用を示した一方で、ペプチドの活
性とは有意な差が明らかになつた。こうした相違は、ポ
リミキシンＢの活性の増強剤としての役割において、メ
リチン分子の鍵となる属性を明確に表している。
材料と手法 蜜蜂毒液全体（ヴエスパ有限責任研究所）から、ゲル
過クロマトグラフイーにより、天然メリチンを単離
し、ローリーのタンパク質分析法により定量して凍結乾
燥して保存した。分析にあたつて、凍結乾燥したメリチ
ンを、蒸留水で0.34mg/mlとなるように再構成して、
過滅菌して、使用まで4.0mlずつ分注して−20℃で保存
した。
過クロマトグラフイーにより、天然メリチンを単離
し、ローリーのタンパク質分析法により定量して凍結乾
燥して保存した。分析にあたつて、凍結乾燥したメリチ
ンを、蒸留水で0.34mg/mlとなるように再構成して、
過滅菌して、使用まで4.0mlずつ分注して−20℃で保存
した。
副腎皮質刺激ホルモンに対してラマチヤンドラン（Ra
machandran）らによつて記述された様にして、ペプチド
をｏ−ニトロフエニルスルフエニルクロライド（NPS−C
l）と反応させることで、天然メリチンから、NPS−メリ
チンを合成した。ペプチドを溶液から、エチル酢酸で沈
殿させ、0.1N酢酸に再び懸濁し、それから、セフアデツ
クスＧ−10（Sephadex G−10）（LKB−Pharmacia,Pisca
taway,N.J.）カラムに通して、残つているNPS−Cl塩を
除いた。365nmでの誘導物のモル吸光度を決定すると、
メリチンが95％以上修飾されていることがわかつた。
machandran）らによつて記述された様にして、ペプチド
をｏ−ニトロフエニルスルフエニルクロライド（NPS−C
l）と反応させることで、天然メリチンから、NPS−メリ
チンを合成した。ペプチドを溶液から、エチル酢酸で沈
殿させ、0.1N酢酸に再び懸濁し、それから、セフアデツ
クスＧ−10（Sephadex G−10）（LKB−Pharmacia,Pisca
taway,N.J.）カラムに通して、残つているNPS−Cl塩を
除いた。365nmでの誘導物のモル吸光度を決定すると、
メリチンが95％以上修飾されていることがわかつた。
合成メリチンを、Peninsula Laboratories,Belmont,C
a.から調達した。0.5mgサンプルを、0.85％塩水に、ロ
ーリーのタンパク質分析法に基づいて0.3mg/mlになるよ
うに再構成した。サンプルは、使用まで−20℃で保存し
た。
a.から調達した。0.5mgサンプルを、0.85％塩水に、ロ
ーリーのタンパク質分析法に基づいて0.3mg/mlになるよ
うに再構成した。サンプルは、使用まで−20℃で保存し
た。
合成アナログは、トルベン セルマーク博士（タンパ
ク質研究所、コペンハーゲン大学、シガーズゲード34,D
K−2200 コペンハーゲンN,デンマーク）により合成さ
れた。各アナログは、純度を分析して、０−100％アセ
トニトリル勾配を用いたＣ−18カラムからのクロマトグ
ラフイー溶出プロフイールに基づき98％以上純粋なもの
と評価された。各ペプチドを、凍結乾燥した形で受けと
り、0.85％ NaClにおよそ1.0mg/mlになるように再構成
して過滅菌し、1.0mlずつ分注して使用まで−20℃で
保存した。各ペプチド溶液を、使用前に、ローリーのタ
ンパク質分析法により定量した。ローリー法の結果は、
ペプチドの乾燥重量に基づく濃度見積もりと、よく一致
していた。
ク質研究所、コペンハーゲン大学、シガーズゲード34,D
K−2200 コペンハーゲンN,デンマーク）により合成さ
れた。各アナログは、純度を分析して、０−100％アセ
トニトリル勾配を用いたＣ−18カラムからのクロマトグ
ラフイー溶出プロフイールに基づき98％以上純粋なもの
と評価された。各ペプチドを、凍結乾燥した形で受けと
り、0.85％ NaClにおよそ1.0mg/mlになるように再構成
して過滅菌し、1.0mlずつ分注して使用まで−20℃で
保存した。各ペプチド溶液を、使用前に、ローリーのタ
ンパク質分析法により定量した。ローリー法の結果は、
ペプチドの乾燥重量に基づく濃度見積もりと、よく一致
していた。
7900ユニツト/mgの特異活性をもつポリミキシンＢ
（シグマ化学会社、St,Louis,Mo.）を、0.85％塩水に24
0ユニツト/mlになるように再構成して、過滅菌して4.
0mlずつ分注して使用まで−20℃で保存した。
（シグマ化学会社、St,Louis,Mo.）を、0.85％塩水に24
0ユニツト/mlになるように再構成して、過滅菌して4.
0mlずつ分注して使用まで−20℃で保存した。
大腸菌G1108Eは、ペンシルバニア州立大学大腸菌リフ
アレンスセンター（105 ヘニングビル，ユニバーシテ
イパーク，ペンシルバニア州,16802）より得られた。中
間対数相のトリプテイカーゼ ソイ ブロースで増殖し
た培養液より、接種原を調製した。滅菌済グリセロール
を最終濃度20％になるように培養液に加え、5.0mlずつ
分注して、使用まで−20℃で保存した。
アレンスセンター（105 ヘニングビル，ユニバーシテ
イパーク，ペンシルバニア州,16802）より得られた。中
間対数相のトリプテイカーゼ ソイ ブロースで増殖し
た培養液より、接種原を調製した。滅菌済グリセロール
を最終濃度20％になるように培養液に加え、5.0mlずつ
分注して、使用まで−20℃で保存した。
チエツカー版力価測定共同性分析法を行なつて、メリ
チンと並行して大腸菌に対してポリミキシンＢと共に、
各ペプチドを試験した。天然メリチンと各アナログの同
等の投与量は、保存溶液の最終過後の各ペプチドの分
注液に対して行なわれたローリーのタンパク質分析法に
基づいた。全てのペプチドを、培地中最終濃度５μg/ml
で共同性分析法で試験した。全分析の培地中のポリミキ
シンＢの濃度は６ユニツト/mlであつた。
チンと並行して大腸菌に対してポリミキシンＢと共に、
各ペプチドを試験した。天然メリチンと各アナログの同
等の投与量は、保存溶液の最終過後の各ペプチドの分
注液に対して行なわれたローリーのタンパク質分析法に
基づいた。全てのペプチドを、培地中最終濃度５μg/ml
で共同性分析法で試験した。全分析の培地中のポリミキ
シンＢの濃度は６ユニツト/mlであつた。
結果 表12に、合成メリチンアナログのアミノ酸配列が示し
てある。各合成アナログに対し、初めのＮ端の20アミノ
酸は、天然メリチンと同じである。変更は、6C端アミノ
酸にあり、太字印刷で示されている。
てある。各合成アナログに対し、初めのＮ端の20アミノ
酸は、天然メリチンと同じである。変更は、6C端アミノ
酸にあり、太字印刷で示されている。
表13は、ポリミキシンＢとの共同的相互作用に対して
試験された化合物の各々のための増殖曲線表示を含んで
いる。各時点の値は、平均値と、６サンプルからの平均
値の標準誤差を表している。「コントロール」曲線はポ
リミキシンＢもペプチドも加えられていない培養液の増
殖を表している。培養液への各ペプチドのみの効果はそ
の表には含まれていないが、しかしながら、メリチンの
ように、こうしたペプチドは、それだけで10μg/mlある
いはそれ以下で用いられた時、大腸菌の増殖には何の効
果もなかつた。このようにして、「コントロール」は、
各ペプチドだけで処理した時の培養液の表示でもある。
試験された化合物の各々のための増殖曲線表示を含んで
いる。各時点の値は、平均値と、６サンプルからの平均
値の標準誤差を表している。「コントロール」曲線はポ
リミキシンＢもペプチドも加えられていない培養液の増
殖を表している。培養液への各ペプチドのみの効果はそ
の表には含まれていないが、しかしながら、メリチンの
ように、こうしたペプチドは、それだけで10μg/mlある
いはそれ以下で用いられた時、大腸菌の増殖には何の効
果もなかつた。このようにして、「コントロール」は、
各ペプチドだけで処理した時の培養液の表示でもある。
ポリミキシンＢでのみ処理した（６ユニツト/ml）細
菌培養液の増殖曲線を、ポリミキシンＢ＋メリチン（５
μg/ml）で処理した培養液の曲線と比較した時、増大し
た抗細菌活性が、処理を克服して対数相増殖に至るのに
要する時間の増加として実証される（図24）。５μg/ml
のメリチンのみでの培養液処理が、本質的に「コントロ
ール」曲線と重なつた増殖曲線を生じるので、ポリミキ
シンＢ阻害を脱し、ペプチド存在下で中間対数相に至る
のに培養液が要する時間の増加はペプチドの共同性活性
の証拠である。このようにしてポリミキシンＢをペプチ
ドと共に表している増殖曲線が、ポリミキシンＢのみの
処理を表している曲線の右にシフトすることは共同性の
証拠である。
菌培養液の増殖曲線を、ポリミキシンＢ＋メリチン（５
μg/ml）で処理した培養液の曲線と比較した時、増大し
た抗細菌活性が、処理を克服して対数相増殖に至るのに
要する時間の増加として実証される（図24）。５μg/ml
のメリチンのみでの培養液処理が、本質的に「コントロ
ール」曲線と重なつた増殖曲線を生じるので、ポリミキ
シンＢ阻害を脱し、ペプチド存在下で中間対数相に至る
のに培養液が要する時間の増加はペプチドの共同性活性
の証拠である。このようにしてポリミキシンＢをペプチ
ドと共に表している増殖曲線が、ポリミキシンＢのみの
処理を表している曲線の右にシフトすることは共同性の
証拠である。
こうした実験での細菌へのメリチンに対するポリミキ
シンＢの比率は、最小の共同性を生じるように考えら
れ、ペプチドアナログの増加した活性が、明白になるよ
うにした。そうした増加は、合成メリチンとNPS−メリ
チン両方に対して、図24にて見られる。ローリー法で決
定したところ、全てのペプチドは等しい濃度であつた。
シンＢの比率は、最小の共同性を生じるように考えら
れ、ペプチドアナログの増加した活性が、明白になるよ
うにした。そうした増加は、合成メリチンとNPS−メリ
チン両方に対して、図24にて見られる。ローリー法で決
定したところ、全てのペプチドは等しい濃度であつた。
合成メリチンアナログのポリミキシンＢとの共同的活
性を比較した同様の増殖曲線が図25に示されている。
性を比較した同様の増殖曲線が図25に示されている。
ポリミキシンＢとのメリチン／アナログ共同性におけ
る差異をより明確に視覚化するため、ポリミキシンＢの
みでの処理と比較した時、メリチンまたはアナログ添加
に従つて、各増殖曲線が、中間対数相に至るまでの付加
的な時間延期を図24、25を用いて計算した。こうした値
は、図26に棒グラフで示してある。様々な処理の間で、
各時点で得られた記録を比較するため、表13のデータに
対し、ツキーのスチユーデンタイズド レンジ テスト
（Tukey′s studentized renge test）を行なつた。そ
れから、増殖曲線時刻の少なくとも１つに対し、有意な
差のある増殖阻害のレベル（α＝0.05）を示すことので
きる能力に依存して、ペプチドをグループ分けした。こ
のグループ分けは、図26に異なる棒のマークで表してあ
る。
る差異をより明確に視覚化するため、ポリミキシンＢの
みでの処理と比較した時、メリチンまたはアナログ添加
に従つて、各増殖曲線が、中間対数相に至るまでの付加
的な時間延期を図24、25を用いて計算した。こうした値
は、図26に棒グラフで示してある。様々な処理の間で、
各時点で得られた記録を比較するため、表13のデータに
対し、ツキーのスチユーデンタイズド レンジ テスト
（Tukey′s studentized renge test）を行なつた。そ
れから、増殖曲線時刻の少なくとも１つに対し、有意な
差のある増殖阻害のレベル（α＝0.05）を示すことので
きる能力に依存して、ペプチドをグループ分けした。こ
のグループ分けは、図26に異なる棒のマークで表してあ
る。
結論 こうした結果は、様々なメリチンアナログが、アミノ
酸置換と化学的修飾の両方によつて作られているという
ことを示している。こうしたタイプの修飾は、ペプチド
の相対的共同性活性を高めることも低下させることもで
きる。図26に基づくと、in vitroでのメリチンとそのア
ナログの相対活性は以下のように、上昇的順番で示すこ
とができる： 1.アナログ＃７ Ａ 2.天然メリチン Ｂ 3.NPS−メリチン Ｃ 4.アナログ＃６ Ｃ 5.合成メリチン Ｃ 6.アナログ＃２ Ｃ 7.アナログ＃４ Ｄ 8.アナログ＃５ Ｄ ５μg/mlレベルで、有意に差のある（α＝0.05）共同性
活性をもつペプチドを、文字のグループで記してある。
注目すべきは、効能の順番を確立するのに用いられたパ
ラメーターである培養液の中間対数相までの延長時間
が、ペプチドの量が狭いメリチン濃度の範囲を少し超え
ても、化学量論的に増加することである。各アナログで
の線型範囲の境界は同等ではないようなので、ここで提
供されたデータは、与えられた濃度でのペプチドの効能
についての相対的順番を決めることにしか用いることは
できないし、定量的差異を評価するのには用いることが
できない。しかしながら、効能の順位は、ペプチドの共
同性活性が、Ｃ端領域のアミノ酸での正電荷側鎖の数と
それが表に出ているかどうかに依つていることを示唆す
るものなのである。
酸置換と化学的修飾の両方によつて作られているという
ことを示している。こうしたタイプの修飾は、ペプチド
の相対的共同性活性を高めることも低下させることもで
きる。図26に基づくと、in vitroでのメリチンとそのア
ナログの相対活性は以下のように、上昇的順番で示すこ
とができる： 1.アナログ＃７ Ａ 2.天然メリチン Ｂ 3.NPS−メリチン Ｃ 4.アナログ＃６ Ｃ 5.合成メリチン Ｃ 6.アナログ＃２ Ｃ 7.アナログ＃４ Ｄ 8.アナログ＃５ Ｄ ５μg/mlレベルで、有意に差のある（α＝0.05）共同性
活性をもつペプチドを、文字のグループで記してある。
注目すべきは、効能の順番を確立するのに用いられたパ
ラメーターである培養液の中間対数相までの延長時間
が、ペプチドの量が狭いメリチン濃度の範囲を少し超え
ても、化学量論的に増加することである。各アナログで
の線型範囲の境界は同等ではないようなので、ここで提
供されたデータは、与えられた濃度でのペプチドの効能
についての相対的順番を決めることにしか用いることは
できないし、定量的差異を評価するのには用いることが
できない。しかしながら、効能の順位は、ペプチドの共
同性活性が、Ｃ端領域のアミノ酸での正電荷側鎖の数と
それが表に出ているかどうかに依つていることを示唆す
るものなのである。
こうしたメリチンアナログの相対効能はin vitroで確
立されたものであるが、実質的な相違は、in vivoでも
起こりうるだろう。ホストへの取り込みや、ホストから
の除去といつたin vivoのパラメーターは実際の扱い方
における効能のこの順位を有意に変えることもあるだろ
う。メリチンの副腎皮質刺激活性が、よく文書で証明さ
れている一方で、NPS−メリチンは、副腎皮質刺激ホル
モン（ACTH）のNPS誘導物が、未修飾のACTHの1/100しか
脂質分解活性を誘導しないように、天然メリチンより低
い副腎活性しか有していないだろう。こうした理由か
ら、この研究に含まれるアナログの各々は、in vivoの
評価に対して考察されるべきだろう。
立されたものであるが、実質的な相違は、in vivoでも
起こりうるだろう。ホストへの取り込みや、ホストから
の除去といつたin vivoのパラメーターは実際の扱い方
における効能のこの順位を有意に変えることもあるだろ
う。メリチンの副腎皮質刺激活性が、よく文書で証明さ
れている一方で、NPS−メリチンは、副腎皮質刺激ホル
モン（ACTH）のNPS誘導物が、未修飾のACTHの1/100しか
脂質分解活性を誘導しないように、天然メリチンより低
い副腎活性しか有していないだろう。こうした理由か
ら、この研究に含まれるアナログの各々は、in vivoの
評価に対して考察されるべきだろう。
参考文献 Benton,A.W.1965.Bec venom,its collection.toxicity
and proteins.Thesis,Dept.Entomology,Cornell Univer
sity,Ithaca,New York. Benton,A.W.,R.A.Morse and F.V.Kosikowski.1963.Bioa
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Nature 198:295−296. Brangi,G.P.and M.P4avan.1954.Bactericidal properti
es of bee venom（Translated title,in Italian）.Ise
ctes sociaux 1:209−217. Brown,L.R.,J.Lauterwein,and K.Wuthrich.1980.High−
resolution 1H−NMR studies of selt−aggregation of
melittin in aqueous solution.Biochim.Biophys.Add
622:231−244. Carrizosa,J.and M.E.Levison.1981.Minimal concentra
tion of aminoglycoside that can synergize with pen
icillin in entrococcal endocarditis.Antimicrob.Age
nta Chemother.20:405−409. Coulson,C.C.and R.L.Kincaid.1985.Gram−preparative
purification of calmodulin and S−100 protein usi
ng melittin−sepharose chromatography.69th Annual
Meeting of the Federation of American Society for
Experimental Biology.Federation Procedings 44:177
7. Cynamon,M.H.and G.S.Palmer.1983.In vitro actizity
of amoxicillin in combination with clavulanlc acid
against Mycobacterium tuberculosis.Antimicrob.Age
nta Chemother.24:429−431. Fennel,J.F.,W.H.Shipman and L.J.Cole.1968.Antibact
erial action of melittin,a polypeptide from bee ve
nom.Proc Soc.Exp.Biol.Med.127:707−710. Franklin,T.J.and G.A.Snow.1981a.Biochemistry of an
timicrobial action.Chapman and Hall,New York,New Y
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timicrobial action.Chapman and Hall,New York,New Y
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Collection and standardization of hymenoptera veno
m.Folia Allergol.Immunol.Clin.33:9−18. Haberman,E.1972.Bee and wasp venoms:The biochmistr
y and pharmacology of their peptides and enzymes a
re reviewed.Science 177:314−322. Haberman,E.and J.Jentsch.1967.Scquenzanalyse des m
ejittins aus den tryptischen und peptischen spalts
tucken.Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.348:37−５ Hanke,W.,C.Methfessel.H.U.Wilmsen,E.katz.B.Jung,an
d G.Boheim.1983.Melittin and a chemically modified
trichotoxin from alamethicin−type multi−state p
ores.Biochim.Biophys.Acta 727:100−114. Lauterwein,L.,C.Bosch,L.R.Brown and K.Wuthrich.197
9.Physiochmemical studies of the protein lipid int
eractions in melittin−containing micelles.Biochi
m.Biophys.Acta 556:244−264. Lauterwein,J.,L.R.Brown and K.Wuthrich.1980.Highre
solution 1H−MNR studies of monomeric melittin in
aqueous solution.Biochim.Biophys.Acta 622:219−23
0. Lowry,O.H.,N.J.Rosendrough,A.L.Farr and R.J.Randal
l.1951.Protein measurement with the folin phenol r
eagent.J.Biol.Chem.193:265−275. Moellering.R.C.,C.Wennersten and A.N.Weinberg.197
1.Studies of antibiotic synergism against enteroco
cci.J.Lab.Clin.Med.77:821−827. Mollay,C.and G.Kreil.1973.Fluorometric measurement
s on the interaction of melittin with Lecithin,Bio
chim.Biophys。Acta 316:196−203。
and proteins.Thesis,Dept.Entomology,Cornell Univer
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9.Physiochmemical studies of the protein lipid int
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bactericidal properties of bee venom（Translated
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ee venom（Translated title,in German）.Munchemer M
odi zinische Wochenschrift 88:935−936. Sebek,O.K.1980.Antibiotics:volume 1:mechanism of a
ction.D.Gottlieb and P.D.Shaw（eds.）.Springer−Ve
rlag,New York.pp.142−149. Tu,A.T.1977a.Venoms:chemistry and molecular biolog
y.John Wiley and Sons,Inc.,New York,London,Sydney,
and Toronto.pp.1−16. Tu,A.T.1977b.Venoms:chemistry and molecular biolog
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C.May and J.Frazier（eds.）.J.P.Lippincott Compan
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2. Volk,W.A.1978b.Essentials of medical microbiology.
C.May and J.Frazier（eds.）.J.P.Lippincott Compan
y,Phila.,New York,SanJose and Toronto.pp.122−126. Volk,W.A.1978c.Essentials of medical microbiology.
C.May and J.Frazier（eds.）.J.P.Lippincott Compan
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C.May and J.Frazier（eds.）.J.P.Lippincott Compan
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5. Yuns,R.A.1982.A circular dichroism study of the st
ructure of Apis melifera melittin.Arch.Biochem.Bio
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cyte proliferative responses by arachidonate metab
olites:Effects on membrane−directed versus intrac
ellular activators.J.Allergy Clin.Immunol.74:418−
425,1984. Kondo,E.and K Kanai.Bactericidal activity of the m
embrane fraction isolated from phagocytes of mice
and its stimulation by melittin.Japan.J.Med.Sci。B
iol.39:9−20,1986. Kondo,E.Melittin−stimulated antimycobacterial act
ivity of the membrane fraction isolated from phago
cytes of guinea pigs.Japan.J.Med.Sci.Biol。39:21−
24,1986. Somerfield,S.D.,J.Stach,C.Mraz,F.gervais,and E.Ska
mene.Bee venom melittin blocks neutrophil Oz produ
ction.Inflammation 10:175−182,1986・ Mulfinger,L.M.The synergistic activities of honey
bee venom with antibiotics.Unpublished M.S.thesis,
Pennsylvania State University,1986（contained in
U.S.Patent Appln.S.N.096,628）． Lowry,O.H.,N.J.Rosenbrough,A.L.Farr,and R.J.Randal
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nt.J.Biol.Chem.193:265−275.1951. Ramachandran,J.and Virginia Lee.Preparation and pr
operties of ｏ−nitrophenyl sulfenyr derivative of
ACTH:an inhibitor of the lipolytic action of the
hormone.Biochem.Biophys.Res.Com.38（３）:507−512.
1970. Scoffone,E.,A.Fontana,and R.Rocchi.Sulfenyl halide
s as modifying reagents for polypeptides and prote
ins.I.Modification of tryptophan residues.Biochemi
stry７（３）:971−979.1968. Couch,T.and A.Benton.The effect of the venom of th
e honey bee,Apis mellifera L.,on the adrenocortica
l response of the adult male rat.Taxicon 10:55−6
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2.1972.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ローウェンステイン，ヘニング デンマーク王国デーカー―3480 フレデ ンスボーグ，ノデボ，ウィンセルスヴィ グ ８ (56)参考文献 特開 昭55−149214（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 38/16 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】哺乳動物の感染治療のための組成物で、当
該組成物は、 感染に対しての活性を有する第１の抗生物質試薬、及
び、 少なくとも１つの膜翅類毒液、 膜翅類毒液の少なくとも１つの活性タンパク質成分、 膜翅類毒液の少なくとも１つのポリペプチド成分、 膜翅類毒液の１つの活性タンパク質成分の少なくとも１
つのアナログまたは化学的に装飾された誘導物、 膜翅類毒液の１つのポリペプチド構成要素の少なくとも
１つのアナログまたは化学的に装飾された誘導物、およ
び それらの混合物から成るグループから選択される第２の
試薬から成り、該第２試薬はビューレット反応陽性であ
り、 該第１の抗生物質試薬と該第２の試薬の比率は、該第２
試薬が該第１の抗生物質試薬の活性を高めるようになさ
れている、前記組成物。 - 【請求項２】前記第１の抗生物質試薬が、下記天然、半
合成および合成抗生物質からなる群から選択される抗生
物質からなるものである、請求項１の組成物： β−ラクタムタイプの抗生物質； アミノグリコシドタイプの抗生物質；および 両親媒性ペプチドタイプの抗生物質。 - 【請求項３】β−ラクタムタイプの抗生物質がアンピシ
リンであり； アミノグリコシドタイプの抗生物質がカナマイシンであ
り；および 両親媒性ペプチドタイプの抗生物質がポリミキシンＢま
たはリフアンピシンである請求項２の組成物。 - 【請求項４】前記第２の試薬が、 蜜蜂毒液、 マルハナバチ毒液、 ホホナガスズメバチ毒液、 ボルドフエイスホーネット毒液 前記毒液の少なくとも１つの活性タンパク質成分、 前記毒液の少なくとも１つの活性ポリペプチド成分、 メリチン、ボンビリチン、マストポラン、およびクラボ
リンのアナログまたは化学的に装飾された誘導物、およ
び それらの混合物 から成るグループから選択されるものである、請求項
１、２または３の組成物。 - 【請求項５】抗生物質試薬がアンピシリン、カナマイシ
ン、ポリミキシンＢまたはリフアンピシンであり、第２
の試薬が蜜蜂毒液、メリチン、メリチンのアナログまた
は化学的に装飾された誘導物、マストポラン、マストポ
ランのアナログまたは化学的に装飾された誘導物、ある
いはこれらの混合物である請求項１または２の組成物。 - 【請求項６】前記第１の抗生物質試薬が、アンピシリ
ン、カナマイシン、ポリミキシンＢ、またはリフアンピ
シンから成り、前記第２の試薬が蜜蜂毒液またはメリチ
ンであるところの請求項１または２の組成物。 - 【請求項７】請求項１ないし６のいずれかの組成物から
なる医薬の有効量を含む、哺乳動物の感染治療用キッ
ト。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US33609689A | 1989-04-13 | 1989-04-13 | |
| US336,096 | 1989-04-13 | ||
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|---|---|
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| JP2809458B2 true JP2809458B2 (ja) | 1998-10-08 |
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|---|---|---|---|
| JP1505858A Expired - Fee Related JP2809458B2 (ja) | 1989-04-13 | 1989-04-17 | 膜翅目昆虫毒、タンパク様あるいはポリペプチド成分、あるいはタンパク様あるいはポリペプチド成分のアナログを含む薬剤を用いた、哺乳類の感染症の処置に用いる方法および組成物 |
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| KR101018352B1 (ko) * | 2009-07-28 | 2011-03-04 | 동성제약주식회사 | 봉독을 유효성분으로 하는 여드름 예방 및 치료용 조성물 |
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| US4822608A (en) * | 1987-09-14 | 1989-04-18 | Vespa Laboratories, Inc. | Methods and compositions for the treatment of mammalian infections employing medicaments comprising hymenoptera venom or proteinaceous or polypeptide components thereof |
-
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- 1989-04-17 CA CA000596851A patent/CA1337330C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-17 JP JP1505858A patent/JP2809458B2/ja not_active Expired - Fee Related
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