JP2792091B2

JP2792091B2 - １―アシル―リゾホスファチジルコリンの製造方法

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Publication number: JP2792091B2
Application number: JP1090868A
Authority: JP
Inventors: 英彦日比野; 信雄福田; 理仲地; 敏夫村松
Original assignee: NIPPON YUSHI KK
Current assignee: NIPPON YUSHI KK
Priority date: 1989-04-12
Filing date: 1989-04-12
Publication date: 1998-08-27
Anticipated expiration: 2013-08-27
Also published as: JPH02270890A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、化学合成して得た単酸基ジアシルホスファ
チジルコリンを原料として、位置特異的脱アシル化によ
り１−アシル−リゾホスファチジルコリンを製造する方
法に関する。

（従来の技術）１−アシル−リゾホスファチジルコリンのSn−２位に
アラキドン酸やエイコサペンタエン酸が結合したホスフ
ァチジルコリンは、生体内のエイコサノイド前駆体の貯
蔵庫となる事から、この１−アシル−リゾホスファチジ
ルコリンは医薬品分野で重要な物質である。

この１−アシル−リゾホスファチジルコリンは天然に
も少量存在するが、従来、次のような方法により調製さ
れている。

エム・ケイツ：脂質研究法、生化学実験法５、255
頁、東京化学同人社、1975、東京奥山治美、村瀬茂雄：蛋白質核酸酵素、32,267,1987 ジー・エイチ・デハスら:Biochim.Biophys.Acta,159,
105,1968 リン脂質の酵素分解方法（特開昭63−44893号）リゾレシチンの製造法（特開昭63−225388号）しかるに上記の従来の調整法のうち、の方法は、処
理量が5mgと少量であり、しかも非常に高価な蛇毒を用
いて加水分解している。さらに未反応のホスファチジル
コリンが認められている。この方法を改良し、卵黄ホス
ファチジルコリン数百mgを10mgのハブ毒で処理する方法
も提案されているが、反応生成物中の未反応のホスファ
チジルコリンを除去する問題は解決されていない。の
方法は、処理量が1mg以下と少量であり、しかもより高
価である蛇毒起源のホスホリパーゼA₂を使用しても１−
アシル−リゾホスファチジルコリンの収集率は85％が限
界である。の方法は、卵黄を基質として1mg程度の少
量を処理し、前述と同様、高価な豚膵臓を起源とするホ
スホリパーゼA₂を使用している。の方法は、リン脂質
又はリン脂質と油脂の混合物を基質として、高価な豚膵
臓を起源とするホスホリパーゼA₂を使用してリゾリン脂
質へ80〜90％変換させているが、ホスファチジルコリン
自身の変換率や生成されるリゾホスファチジルコリンの
立体特異性は不明である。の方法は、リゾホスファチ
ジルコリンの化学合成による製造法であるが、反応生成
物中から除去し難い触媒や高沸点溶媒が併存する問題が
ある。

（発明が解決しようとする課題）前記のような方法では処理できる量が少なく、入手の
難しい高価な加水分解酵素を使用しなければならず、反
応生成物も純粋なものが得難く大量生産できないという
難点があった。

従って現在、入手が容易で安価な天然起源の酵素を利
用し、工業的に大量生産が可能で、しかも反応生成物の
分取が容易な１−アシル−リゾホスファチジルコリンの
製造法が求められている。

本発明は、位置特異性を有する天然起源の安価な酵素
を用いることにより、化学合成して得た単酸基ジアシル
ホスファチジルコリンを加水分解して、純粋な１−アシ
ル−リゾホスファチジルコリンを工業的に大量生産する
新規な方法を提供しようとするものである。

（課題を解決するための手段）本発明は、エステル化触媒（ピリジン誘導体または第
三アミン）の存在下に化学合成して得た単酸基ジアシル
ホスファチジルコリンを中性アルミナカラム処理した
後、パンクレアチンを用いて加水分解することを特徴と
する１−アシル−リゾホスファチジルコリンの製造方法
である。

本発明に用いる酵素は、入手が容易で非常に安価なパ
ンクレアチンであり、この酵素を用いて加水分解反応す
ることにより、単酸基ジアシルホスファチジルコリンの
Sn−２位の脱アシル化を選択的に進行させると共に、高
い変換率で１−アシル−リゾホスファチジルコリンに変
換させることができる。

以下、本発明の１−アシル−リゾホスファチジルコリ
ンの製造方法について、詳述する。

本発明における加水分解方法は、化学合成した単酸基
ジアシルホスファチジルコリンにアルミナカラム処理を
施した後、その１部を50〜500部の有機溶媒に溶解し、
これに例えば塩化カルシウム溶液10〜30部とホウ酸ナト
リウム溶液10〜30部、及びパンクレアチン0.5〜2.0部を
添加して反応させる。このパンクレアチンとしては、リ
パーゼ含量の高い豚膵臓起源のものが望ましい。

また、反応時のpHは５〜９が好ましく、さらには、６
〜８が適しており、添加されるホウ酸ナトリウム溶液は
0.01〜1M、塩化カルシウム溶液は0.1Mトリス／塩酸緩衝
液に塩化カルシウムを２〜200mMの濃度の範囲になるよ
う調整したものを添加することが好ましい。反応は10〜
80℃、好ましくは20〜50℃で行うのが良く、反応中は高
速撹拌を行い、３〜24時間反応させるのがよい。

本発明において用いる化学合成した単酸基ジアルホス
ファチジルコリンは、例えばグリセロホスホコリン１モ
ルに対して、特定脂肪酸の無水物またはハロゲン化物3.
5〜６モルを、ピリジン誘導体または第三アミン、例え
ばジメシルアミノピリジンやトリイソプロピルアミン等
から選ばれるエステル化触媒の存在下に、非プロトン性
高極性溶媒、例えばジメチルスルホキシド、ヘキサメト
キシホスホロアミド等の中で反応させることによって得
られる。これらのホスファチジルコリンから得られる１
−アシル−リゾホスファチジルコリンの脂肪酸種は、こ
の反応時に使用する脂肪酸の無水物やハロゲン化物の分
子種の選択により任意に選択出来る。脂肪酸としては炭
素数12〜24の脂肪酸が好ましく、飽和のものでも不飽和
のものでもよい。

本発明においては、原料である化学合成した単酸基ジ
アシルホスファチジルコリンのパンクレアチンによる分
解率を向上するために、アルミナカラム処理を行うもの
である。市販のアルミナには、乾燥用、薄層クロマトグ
ラフィー用、カラムクロマトグラフィー用、酵母細胞や
微生物の分解用及び高い吸着容量を持つ特別活性化ゲル
等があるが、本発明にはカラムクロマトグラフィー用の
ものが好ましい。カラムクロマトグラフィー用のアルミ
ナには酸性、塩基性及び中性のタイプの活性ゲルがある
が、リン脂質が一般に塩基に弱い結合を示す点と酸性処
理したものは溶質の化学変化を起こす点から中性アルミ
ナが好ましい。アルミナの活性度は水の含有量によって
変化し、その保持容量が低下するので、使用前には充分
乾燥し、アルミナの水の含量を３％未満にまで減少さ
せ、ブロックマン活性度Ｉに調整してから使用するのが
より好ましい。

カラムクロマトグラフィー用のアルミナとして使用出
来る市販品は、シグマ・ケミカル社製のアルミナ、活性
度Ｉ（pfs）WN−３型、中性;ICNバイオメディカルス社
製の酸化アルミニウム90、活性型、中性、活性度I;イー
・メルク・エイ・ジー製の酸化アルミニウム90、活性
型、中性、活性度I;アルドリッヒ・ケミカル・カンパニ
ー製の酸化アルミニウム、活性型、中性、活性度I;ジャ
ンセン・シミカ製の酸化アルミニウム、活性型、中性；
等が挙げられる。

アルミナカラム処理は次のように行うのが好ましい。
まず、合成ホスファチジルコリン１重量当り20〜50重量
部の中性アルミナをクロロホルムに懸濁してカラムに充
填し、クロロホルムで充分にコンディショニングを行っ
て、微細なアルミナ断片を除去してアルミナカラムを調
製する。次いで合成ホスファチジルコリンをクロロホル
ム溶液としてカラムに対し、クロロホルム、次いでクロ
ロホルム／メタノール混液で流出させる。この方式によ
り、非常に短時間に収率80〜95％でホスファチジルコリ
ンを回収することができる。この様にして得られたアル
ミナカラム処理した合成ホスファチジルコリンと、アル
ミナ未処理の合成ホスファチジルコリンを、一定量のパ
ンクレアチンで加水分解すると、未処理品に比べて処理
品の１−アシル−リゾホスファチジルコリンの収率は約
２割向上した。

本発明に使用されるパンクレアチンは、例えば豚膵臓
起源のものを用いることができ、アミラーゼ、トリプシ
ン、リパーゼ、リボヌクレアーゼ及びプロテアーゼ等の
多くの酵素を含んでいる。市販のパンクレアチンは、そ
の構成酵素のアミラーゼ、プロテアーゼ及びリパーゼの
活性をアメリカ薬剤処方一覧やアメリカ薬局方に従って
測定しクラス別されている。本発明に使われるパンクレ
アチンは、特にアミラーゼの活性をアメリカ薬局方で測
定した結果により、力価等量×１、力価等量×３、力価
等量×４、力価等量×８とクラス別されているものが好
ましい。尚、医薬用の消化酵素剤のパンクレアチンは希
釈剤にデキストリン、ラクトース及び砂糖等が添加され
て力価が低下しているため不適である。

パンクレアチンとして使用出来る市販品は、シグマ・
ケミカル・カンパニー製の豚膵臓由来パンクレアチン
（Activity 1×U.S.P.specification,Activity 3×U.S.
P.specification,Activity 4×U.S.P.specification,Ac
tivity 8×U.S.P.specification）、東京化成製の豚膵
臓由来パンクレアチン（Activity 4×JP）、関東化学製
のパンクレアチン、石津製薬製の化学用パンクレアチ
ン、純正化学製のパンクレアチン等が挙げられる。

本発明により、合成単酸基ジアシルホスファチジルシ
ルコリンをパンクレアッチンで加水分解して得られる反
応生成物は、デカンテーションやアセトン分別などの操
作によって容易に１−アシル−リゾホスファチジルコリ
ンと脂肪酸とに分離することが出来る。

（発明の効果）本発明により、非常に高価なホスホリパーゼA₂を使わ
ず、工業的に入手可能で非常に安価なパンクレアチンを
用いて、合成ホスファチジルコリンから純粋な１−アシ
ル−リゾホスファチジルコリンを大量に製造することが
出来る。従って、生体内で様々な生物活性を示す１−ア
シル−リゾホスファチジルコリンを容易に入手すること
が出来る。本発明により得られる１−アシル−リゾホス
ファチジルコリンは、そのSn−２位に多価不飽和脂肪酸
を組み込んだ混酸基ジアシルホスファチジルコリンの原
料などとして医薬品や化粧分野などにおいて広く利用さ
れうるものである。

（実施例）以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。
尚、各例中、％は重量基準である。

参考例１アルミナカラム処理 ICNバイオメディカルス社製のカラムクロマトグラフ
ィー用中性活性型酸化アルミニウム（活性度Ｉ、70〜29
0メッシュASTM、粒径0.05〜0.02mm、pH7.5、流動密度0.
9g/ml、密度3.97、ポアー径58Å、表面積155m²/g）20g
を２φ×7cmのガラスカラムにクロロホルムに懸濁して
充填し（充填容積22cm³、充填高さ7cm）クロロホルム10
0mlとクロロホルム／メタノール（3/1）混液300mlを通
した合成ホスファチジルコリン1gを3mlのクロロホルム
溶液として、アルミナカラムに付し、クロロホルム50m
l、次いでクロロホルム／メタノール（3/1〜5/1、v/v）
混液200mlを通液してホスファチジルコリンを溶出し、
溶出液を留去してアルミナカラム処理ホスファチジルコ
リンを得た。

参考例２パンクレアチンの位置特異性の確認アルミナカラム処理した化学合成品のSn−１−オレオ
イル−２−ドコサヘキサエノイルホスファチジルコリン
1.2gを150mlのエーテル／エタノール（95/5）混液に溶
解し、これに豚膵臓起源のパンクレアチン（アメリカ薬
局方、力価等量×１、シグマ社製）1gを懸濁させた0.1
モルトリス／塩酸・ミリモル塩化カルシウム溶液（pH7.
4）15mlと0.1モルホウ酸ナトリウム溶液浮15mlを加え、
混合物を高速撹拌しながら、室温に数時間おいた。経時
後、反応液の一部を連結乾燥し、このもののクロロホル
ム／メタノール（2/1、v/v）抽出液を薄層クロマトグラ
フィー（TLC）上にスポットして、クロロホルム／メタ
ノール／水（65/25/4、v/v/v）混液を展開溶媒として展
開させた。展開後、遊離脂肪酸区分およびリゾホスファ
チジルコリン区分をそれぞれ掻き取り、硫酸メタノール
法で脂肪酸メチルを調製してガスクロマトグラフィー分
析を行った。その結果、遊離脂肪酸区分からは、ドコサ
ヘキサエン酸が85％検出され、リゾホスファチジルコリ
ン区分からはオレイン酸が80％検出された。

経時後、反応液の大部分である残部のエーテルをデカ
ンテーションで除去し、新しいエーテル150mlを加えて
撹拌し、デカンテーションでエーテルを除去した後アセ
トン100mlを加えて撹拌し、新しいアセトン100mlをさら
に加えてデカンテーションした後、粗生成物を乾燥濃縮
した。このの濃縮物をクロロホルム／メタノール（1/
1、v/v）混液100mlに溶解し、この溶液中に濾過助剤
（ダイカライト・パーライト、ダイカライト・オリエン
ト社製）1gを添加し撹拌後、濾過して、その母液を蒸発
乾燥して840mgの黄色油状物を得た。

黄色油状物の分析値は下記の通りであった。

TLC 展開液クロロホルム／メタノール／水 65/25/4（v/v/v） Rf値:0.12 発色剤２′,7′−ジクロロフルオレッセン試薬：橙色ジットマー・レスター試薬：青色 TLC−FID（イヤトロスキャン法）展開液 TLCと同じリゾホスファチジルコリン 97％、不明３％ FAB−MS （Pos.）TEA〔Ｍ＋Ｈ〕⁺:522 〔オレオイルリゾホスファチジルコリン＋Ｈ〕⁺522 （Neg.）TEA〔Ｍ−Ｈ〕:281 〔C₁₇H₃₃COO^-〕、即ちオレイン酸_-281。

以上の結果より、豚膵臓起源のパンクレアチンは効率
よく合成ホスファチジルコリンのSn−２位の脂肪酸を加
水分解し、１−アシル−リゾホスファチジルコリンを生
成することが判明した。

実施例１化学合成したジパルミトイルホスファチジルコリンの
アルミナカラム処理品1.0gを用意した。次いで参考例２
と同様の条件で加水分解反応を行った。経時反応液をク
ロロホルム／メタノール／水（1/2/0.8、v/v/v）混液10
0mlで抽出し、この抽出液にクロロホルム100mlと蒸留水
100mlを加え、分離してくるクロロホルム層を分取し
た。クロロホルム層を乾固した後、冷アセトン50mlで４
回沈澱を洗浄し、アセトン洗浄液に遊離脂肪酸のないこ
とを確認した。収量は0.62gで性状は白色粉末であっ
た。

白色粉末の分析値は下記の通りであった。

TLC 参考例２と同じ条件 Rf値:0.12と0.52にスポットを認め、発色剤に対
する呈色も同じである。

TLC−FID（イヤトロスキャン法）展開液 TLCと同じリゾホスファチジルコリン 92％、ホスファチジルコリン８％以上の結果より、豚膵臓起源のパンクレアチンによる
合成ホスファチジルコリンの加水分解に関し、アルミナ
カラム処理品は90％以上分解されることがわかった。

上記組成物をクロロホルム3mlに溶解し、この溶液を
ケイ酸カラムクロマトグラフィー（２φ×7cm）に付
し、クロロホルム単独系からメタノール含量を高めなが
ら通液し、クロロホルム／メタノール（4/1〜1/1、v/
v）混液で溶出してくるリゾホスファチジルコリンを分
画した。収量は520mgであった。

このリゾホスファチジルコリンのFAB−MS分析値は次
の通りであった。

（Pos.）TEA〔Ｍ＋Ｈ〕⁺:496 〔パルミトイルリゾホスファチジルコリン＋Ｈ〕⁺196 （Neg.）TEA〔Ｍ−Ｈ〕:255 〔C₁₅H₃₁COO^-〕、即ちパルミチン酸^-255 実施例２アルミナカラム処理した化学合成品のジリノレイルホ
スファチジルコリン1.0gを用意した。次いで参考例２と
同様の条件で加水分解反応を行った。経時反応液を参考
例２に従って、エーテルとアセトンによる溶剤分別と濾
過助剤処理により黄色油状物を801mgを得た。

黄色油状物の分析値は下記の通りであった。

TLC 実施例と同じ条件 Rf値:0.13と0.54のスポットに発色が認められ、
0.85のスポットは発色が著しく弱かった。

TLC−FID（イヤトロスキャン法）展開液 TLCと同じリゾホスファチジルコリン 74％、ホスファチジルコリン３％脂肪酸 24％反応組成物を実施例２と同様のケイ酸カラムクロマト
グラフィー処理によりリゾホスファチジルコリンを分画
し、収量は576mgであった。

（Pos.）TEA〔Ｍ＋Ｈ〕⁺:520 〔リノレイルリゾホスファチジルコリン＋Ｈ〕⁺520 （Neg.）TEA〔Ｍ−Ｈ〕:279 〔C₁₇H₃₁COO^-〕、即ちリノール酸^-279 比較例化学合成したジパルミトイルホスファチジルコリンの
アルミナ未処理品1.0gを用意した。次いで実施例１に従
って同一の操作を行った。収量は、0.75gで性状は白色
粉末であった。

白色粉末の分析値は下記の通りであった。

TLC 参考例２と同じ条件 Rf値:0.10と0.48にスポットを認め、発色剤に対
する呈色も同じである。

TLC−FID（イヤトロスキャン法）展開液 TLCと同じリゾホスファチジルコリン 45％、ホスファチジルコリン 55％以上の結果より、豚膵臓起源のパンクレアチンによる
合成ホスファチジルコリンの加水分解に関し、アルミナ
カラム処理を施さない条件では分解率が低下することが
判明した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07F 9/10 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】エステル化触媒（ピリジン誘導体または第
三アミン）の存在下に化学合成して得た単酸基ジアシル
ホスファチジルコリンを中性アルミナカラム処理した
後、パンクレアチンを用いて加水分解することを特徴と
する１−アシル−リゾホスファチジルコリンの製造方
法。
【請求項２】中性アルミナカラムの中性アルミナがブロ
ックマン活性度Ｉに調整された請求項１記載の製造方
法。