JP2749042B2 - 転写調節に関与する核内因子 - Google Patents
転写調節に関与する核内因子Info
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は分子生物学分野のものである。
発明の背景
Ｂ細胞特異の免疫グロブリン（Ig）遺伝子の転写を調
節するトランス型因子の存在は、リンパ細胞および非リ
ンパ細胞に導入したIg遺伝子組換え体の発現の解析から
予想されている。二種のＢ細胞特異性シス型転写調節因
子は既に固定されている。一つはＨ鎖およびKL鎖遺伝子
の可変部と恒常部領域の間のイントロンに存在し、転写
のエンハンサーとして作用する。もう一つはＨ鎖および
KL鎖両遺伝子のプロモーターの上流に見られる。この因
子はウイルスのエンハンサー存在下に於いてもリンパ球
特異転写を指示する。 マウスおよびヒトのＬ鎖プロモーターは開始点のおよ
そ70塩基対上流に８塩基配列、ATTTGCATを含んでいる。
Ｈ鎖プロモーターは同じ配列を同じ場所に逆方向に、AT
GCAAATを有している。この成分はＢ細胞中でIgプロモー
ターを有効に利用するために必要らしい。この成分が高
度の配列および位置を保存し、また見かけの機能を維持
していることにより、これが配列特異性転写因子と相互
作用していることが示唆されるが、まだそのような因子
は同定されていない。 発明の詳細な説明 本発明はIg遺伝子の転写調節に関与する遺伝子成分に
結合するヒトリンパ細胞核内因子およびそのような因子
の同定および単離の方法に関するものである。これらの
因子はIg遺伝子の転写調節に関係している。本発明はま
たその調節因子自体をコードする遺伝子およびリンパ細
胞またはハイブリドーマ細胞のようなリンパ球由来の細
胞を外因子をコードする遺伝子でトランスフエクトする
ことによりそれらの細胞に於けるIg遺伝子の転写を改良
する方法に関するものである。 リンパ細胞の核抽出物よりIg遺伝子の転写調節DNA成
分と結合する４種の異なる因子を同定し、単離した。そ
のうち２つの因子（IgNF−ＡおよびＥ）は構成的であ
り、他の２つ（IgNF−ＢおよびKappa−３）はリンパ細
胞特異的である。以下にそれぞれの因子を詳細に説明す
る。 IgNF−Ａ IgNF−ＡはネズミのＨ鎖およびKL鎖遺伝子プロモータ
ーの上流領域のDNA配列およびネズミＨ鎖遺伝子エンハ
ンサーに結合する。結合は配列特異性であり、恐らく三
つの全ての転写成分に存在する保存された配列モチー
フ、ATTTGCATによつて調節されている。IgNF−Ａと類似
の結合特異性を示す因子がヒトHeLa細胞にも存在してお
り、このことからIgNF−Ａが組織特異的でないかも知れ
ないと考えられる。 Ｅ Ｅは構成的因子でＬ鎖およびＨ鎖のエンハンサーに結
合する。 IgNF−Ｂ IgNF−ＢはIgNF−Ａと同じ配列特異性を示す；これも
ネズミＨ鎖およびKL遺伝子プロモーターの上流領域およ
びネズミＨ鎖遺伝子エンハンサーに結合する。しかしこ
の因子はリンパ様細胞特異であり、Ｂ細胞およびＴ細胞
に限定されている。 Kappa−３ Kappa−３はカツパＬ鎖遺伝子のエンハンサーのみに
結合する。これはＢ細胞に特異的であり、Ｂ細胞状態に
特異的と思われる。 これらの因子は改良DNA結合アツセイの方法により同
定し、単離した。アツセイは真核細胞での蛋白質とDNA
相互作用の分析に一般に応用できる。アツセイ実施に際
しては、目的のDNA成分またはその断片を含む。DANプロ
ーブを細胞の核抽出物とインキユベートする。インキユ
ベーシヨンは蛋白−DNA複合体を形成する条件下で行な
う。蛋白−DNA複合体を低イオン強度緩衝液を用いたポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により非結合DNAと分離
する。非特異的な複合体形成を最少限にするために抽出
物とDNAプローブの混合液に拮抗DNA種を添加することも
出来る。真核細胞を用いた本研究では競合DNA種として
二重鎖コポリマー、ポリ（dI−dC）、poly（dI−dC）を
添加することにより核蛋白−DNA複合体の検出感度を高
め、本明細書に記載する調節因子の検出を容易にした。 本発明はまた、転写調節に関与する４種の因子をコー
ドする遺伝子に関する。遺伝子の同定およびクローニン
グは従来より知られる技術により達成できる。例えば、
目的の因子は細胞の粗核抽出物より精製できる。次にそ
の蛋白質の一部を配列決定し、その配列の情報を基にオ
リゴヌクレオチドのプローブを作成し、それを用いてcD
NAライブラリーからその因子をコードする遺伝子を同定
する。 調節因子はコードする遺伝子は細胞に於ける転写を改
良するのに使用できる。例えば、Ig遺伝子の転写に関与
する正に作用するリンパ様細胞特異因子をIg−生産性細
胞に多コピーで挿入することによりIg生産を高めること
が出来る。組織特異性因子をコードする遺伝子を構成的
因子をコードする遺伝子と一緒に利用することも出来、
そのような組合せは必要かつ望ましいことがわかる。 図面の簡単な説明 第1a図はMOPC41 VKappa遺伝子断片の５′領域を図示
したものである；第1b図はMOPC41 VKappa遺伝子のSfaN
I−SfaN Iカツパプロモーター断片を用いたゲル電気泳
動DNA結合アツセイのオートラジオグラフを示す；第1c
図は重複するカツパープロモーター断片を用いたゲル電
気泳動DNA結合アツセイのオートラジオグラフを示す。 第２図はヒト（ａ）EWおよび（ｂ）HeLaの核抽出物の
結合拮抗分析のオートラジオグラフを示す。 第３図は因子−DNA複合体のDNase Iフツトプリント解
析の結果を示す。 第4a図はIgNF−Ａ結合部位の真のおよび推定のヌクレ
オチド配列を示し；第4b図は３種のIg転写調節成分の各
種DNAプローブを用いた結合アツセイのオートラジオグ
ラフである。 第5a図はMODC41のプロモーター領域のDNA配列を示
し、第5b図はヒトＢリンパ腫細胞株RAMOSおよびEW、並
びにHeLa細胞から作成した全細胞抽出物中で記載する鋳
型を用いて得られるRNA転写物のオートラジオグラフを
示す。 第６図は上流域での欠損を含む鋳型からのRNA転写物
のオートラジオグラフを示す。 第７図はＢ細胞核抽出物のMOPC−41Kプロモーター領
域との結合のラジオオートグラフで、IgNF−ＡおよびIg
NF−Ｂ複合体を示している。 第８図はＴ細胞および非リンパ様細胞の核抽出物のMO
PC−41Kプロモーター領域への結合を示す。 第9a図はμ−エンハンサーの制限酵素地図を示し、第
9b図はμエンハンサー断片を用いて行なつたオートラジ
オグラフ結合アツセイを示す。 第10a図はμ300断片の制限酵素地図を示し、第10b図
はμ300の各種小断片により形成する複合体を示し、第1
0c図および10d図は小断片μ70を用いた拮抗結合アツセ
イを示す。 第11a図および第11b図はメチル化阻害法によるμ50お
よびμ70中の結合部位の位置を示し、第11c図はこれら
の結果のまとめを表わす。 第12図はＢ細胞およびＢ細胞以外の抽出物中でμ70を
用いて形成した結合複合体のオートラジオグラフを示
す。 第13a図はカツパーエンハンサーの制限酵素地図を示
し；第13b図はカツパーエンハンサー断片を用いた結合
アツセイのオートラジオグラフを示し；第13c図および1
3d図はカツパーエンハンサー断片での拮抗アツセイのオ
ートラジオグラフを示す。 第14図はメチル化阻害実験によるKappa−３結合の位
置を示す。 第15a図は各種リンパ様および非リンパ様細胞中でのK
appa−３の結合分析を示し；第15b図はＢ細胞分化の種
々の段階に於ける細胞中でKappa−３の結合分析を示
す。 発明を実施する最適な方法 本明細書に記載される転写調節因子は大きく分類して
構成的なものと組織（リンパ）特異的なものとに分けら
れる。全ての因子はIg遺伝子の転写に役割を果すと考え
られる。構成的因子は非リンパ様細胞中にも見られるこ
とから、他の遺伝子の転写にも役割を有するかも知れな
い。 構成的因子が存在することで組織特異性の因子の検出
がより困難となつた。検出を容易にするために以下に記
載する高感度のDNA結合アツセイを全ての実験に用い
た。 転写調節因子IgNF−Ａ、Ｅ、IgNF−ＢおよびKappa−
３の性状を次の表にまとめる。 表に示すようにIgNF−ＡはマウスＨ鎖およびカツパー
Ｌ鎖遺伝子プロモーターの領域のIg調節DNA成分に結合
し、さらにマウスＨ鎖遺伝子エンハンサーにも結合す
る。DNase Iフツトプリント分析の結果、この結合はマ
ウスおよびヒトＬ鎖遺伝子のプローモーター中の開始点
からおよそ70塩基対上流に、またＨ鎖遺伝子プロモータ
ーのほぼ同じ位置（逆向き配列で）に存在する８塩基
（オクタマー）配列（ATTTGCAT）により仲介されること
がわかる。 IgプロモーターのIgNF−Ａ結合部位の欠損または破壊
によりインビボでの正しく開始した転写物の量が有意に
減少する。Y.Bergmanら、PNAS USA 81巻、7041−7045
頁（1984年）、J.O.Masonら、Cell41巻、479−487頁（1
985年）を参照のこと。以下に示すように（例を参照）
これをインビトロの転写系でも起る。IgNF−Ａは正に作
用する因子と考えられる。 IgNF−Ａ結合部位はＢリンパ球特異のIgプロモーター
の機能上の構成部分にあると思われる。例えば、IgNF−
Ａ結合部位を含むこのプロモーターからの配列はＢ細胞
では正確な転写を指定するがHeLa細胞では行なわない。
しかしHeLa細胞抽出物中にも同じような移動度および配
列特異性（拮抗分析により試験）を有する複合体を形成
する因子が検出されたことより、IgNF−ＡはＢ細胞にの
み限定されないかも知れない。興味深いことに、IgNF−
Ａ結合部位のIgオクタマーモチーフが脊椎動物U1および
U2 sn RAN遺伝子の上流（およそ−225bp）領域にも存
在することが最近明かとなつた。さらに重要なことに、
この成分がアフリカツメガエルの卵母細胞に於るU2 sn
RNA遺伝子の転写を劇的に促進する（20から50倍）。
従つてIgNF−Ａは脊椎動物細胞中でのU1およびU2 snRN
A遺伝子の高レベル発現にも作用する構成的活性化蛋白
質かも知れない。 IgNF−Ａ結合部位がマウスＨ鎖エンハンサー中にも存
在することはIgNF−Ａがさらにエンハンサー機能にも関
与することを示唆している。予想される結合部位を含む
エンハンサーの80bp領域を欠失させるとエンハンス活性
をおよそ10倍低下させることが知られている。インビボ
での結合部位の占有は、エンハンサーのオクタマー中の
Ｇ残基がＢ系統の細胞中でのみジメチル硫酸修飾から防
御される事実から示唆される。さらに、IgNF−Ａはやは
りIgオクタマーモチーフを含有するSV40エンハンサーと
も配列特異的に結合する（J.Weinberger、私信）ことか
ら、本因子がエンハンサー機能にも関与している可能性
が益々高い。 Ｅ因子はIgL鎖およびＨ鎖のエンハンサーと結合する
構成的因子である。 IgNF−Ｂ因子はIgNF−Ａと同じ調節成分と結合する。
事実IgNF−Ｂの結合部位はオクタマーモチーフと思われ
る。IgNF−Ａとは反対にIgNF−Ｂはリンパ様細胞特異性
である。この因子はプレＢ、成熟Ｂおよび骨髄腫細胞株
の核抽出物およびＴ細胞リンパ腫のあるものの核抽出物
に検出された。IgNF−Ｂはいくつかの非リンパ様細胞の
核抽出物には検出されなかつた。 Kappa−３はIgL鎖エンハンサーにのみ結合する。この
因子はリンパ様細胞特異である。Kappa−３はまたリン
パ様状態特異的であり、成熟Ｂ細胞のみにより発現され
る。この場合、Ｂ細胞成熟化のマーカーである（本因子
はＢ細胞リンパ腫のタイプ分けに使用できる）。 上述の転写調節因子はゲル電気泳動DNA結合アツセイ
の高感度改良法を用いて細胞の核蛋白抽出物中に同定さ
れた。この改良アツセイはゲル電気泳動の過程で蛋白−
DNA複合体の移動度変化に基づくアツセイ法の改良法で
ある。原法のアツセイは精製した原核細胞遺伝子調節蛋
白質の平衡およびキネテイツクス解析に広く応用されて
きた。M.FriedおよびD.M.Crothers,Nucleic Acid Res.
9巻、6505−6525（1981年）;M.M.GarnerおよびA.Revzi
n,NucleicAcids Res.9巻、3047−3060頁（1981年）など
参照。さらに最近、この方法は真核細胞（サルの細胞）
の核抽出物からサテライトDNAと結合する蛋白質を同定
し、単離するのに使用された。R.StraussおよびA.Varsh
ausky,Cell、37巻、880−901頁（1984年）参照。後者の
研究ではより多く存在して非特異的にDNAと結合する蛋
白質を結合させるために異種の拮抗DNA（E.coli）を過
剰に加えている。 本発明の改良法アツセイでは単純な交互のコポリマ
ー、二重鎖ポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）を拮抗DNA
種として用いた。拮抗剤としてこのコポリマーを使用し
た結果、核蛋白質−DNA複合体の検出感度が高まつた。 アツセイはポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）の添加以
外は本質的にStraussおよびVarshasky（上述）により記
載されるように行なう。核蛋白質抽出物は、例えばJ.D.
Dingnam,Nucleic Acids Research11巻、1475−1489頁
（1983年）の方法により調製される。抽出物を核蛋白質
との結合をテストしようとする放射標識したDNAプロー
ブとインキユベートする。インキユベーシヨンは生理的
緩衝液中でポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）拮抗剤の存
在下で実施する。DNA−蛋白複合体は低イオン強度緩衝
液中でポリアクリルアミドゲルの電気泳動を用いて未結
合DNAプローブと分離し、オートラジオグラフイーによ
り検出する。 好ましい態様では蛋白試料（およそ10μｇ蛋白質）を
およそ10,000cpm（約0.5ng）の末端標識32P−二重鎖DNA
プローブ断片とおよそ0.8−4ngのポリ（dI−dC）−ポリ
（dI−dC）（フアルマシア）の存在下で最終容量およそ
25μにてインキユベートする。インキユベーシヨンは
30℃で30−60分間10mMトリス塩酸（ph7.5）、50mM NaC
l、1mM DTT、1mM EDTA中で行なう。蛋白−DNA複合体は
低イオン強度ポリアクリルアミドゲルにより分離する。
試料を低イオン強度の４％ポリアクリルアミドゲル（0.
15×16cm;アクリルアミド：ビスアクリルアミド重量比3
0:1）上に層でチヤージする。ゲルは先ず6.7mMトリス塩
酸（pH7.5）、3.3mM NaOAcおよび1mM EDTAより成る緩衝
液中11v/cmで30分間予備泳動する。緩衝液は槽内を還流
させる。ゲルを同じ電圧で室温にて電気泳動にかけ、ウ
アツトマン3MM紙に移し、乾燥してオートラジオグラ
フイーを行なう。 アツセイの感度が高まつたことは最初の実験で示さ
れ、IgNF−Ａ因子の同定が出来た。MOPC41カツパーＬ鎖
遺伝子の上流領域（第1a図）に由来する放射標識したSf
aN I−SfaN I DNA断片をヒトＢ細胞株の核抽出物とE.c
oli染色体DNAまたはポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）の
存在下、非存在下でインキユベートした。生成した複合
体を低イオン強度で失活させない状態でポリアクリルア
ミドゲルの電気泳動により遊離断片と分離し、オートラ
ジオグラフイー（第1b図）により検出した。拮抗DNAの
非存在下では全ての標識断片はゲルの上端に集まつてお
り（１列目）、これは恐らく過剰な非配列特異性蛋白質
との結合によるものと思われる。ポリ（dI−dC）−ポリ
（dI−dC）（２列から６列）或いはE.coli染色体DNA
（７−11列）の量を増加して添加すると遊離断片より遅
く移動する予想蛋白−DNA複合体が検出された。複合体
の主要種（Ｂ）および少量種の相対存在比は交互コポリ
マー拮抗DNAの存在下の方が有意に高い。 コポリマー拮抗ポリ（dI−dC）、ポリ（dI−dC）と併
せた高感度ゲル電気泳動DNA結合アツセイの使用により
本明細書に記載する調節因子の同定が容易となつた。単
純な交互コポリマーは異種配列DNAよりも配列特異因子
の結合に対して低程度に拮抗するためにアツセイの感度
を有意に増加している。本アツセイは哺乳動物遺伝子調
節蛋白質の解明に一般に応用される。 本アツセイの感度をさらに増すために粗抽出物中で非
特異結合の関与を最少とするように小さいDNAプローブ
（およそ100bpまたはそれ以下）を使用する。 本アツセイを用いて蛋白−DNA相互作用の配列特異性
を調べるため結合拮抗テストを実施できる。そのために
は、蛋白因子への拮抗結合を試験しようとする無標識DN
A断片を蛋白抽出物と標識DNAプローブ（ポリ（dI−dC）
−ポリ（dI−dC）と一緒に）のインキユベーシヨン混合
液に添加する。蛋白−DNAプローブ複合体の消失または
低下はその無標識断片が蛋白因子の結合に拮抗すること
を示す。さらに、プローブ配列に対する蛋白の相対的な
結合親和性は種々の濃度で拮抗物の蛋白を置きかえる能
力を調べることによりアツセイできる。 拮抗アツセイと共に、DNase Iフツトプリント分析
（D.GalasおよびA.Schmitz,Nucl.Acids Res.5巻、3157
−3170頁（1978年）および後述の例を参照）およびメチ
ル化阻害実験（例えばA.Ephrussiら、Sciencu227巻:134
−140頁（1985年）参照）を用いて蛋白因子の結合領域
の詳細な解析が出来る。 これらの因子の転写調節に於ける機能的役割はいくつ
かの方法で確認できる。リンパ様細胞因子に関しての好
ましい技術はリンパ様細胞系統の細胞から開発したイン
ビトロの転写系を使用する。本系については後に示す例
の中で詳細に記載する。因子の機能はこの系で因子の結
合部位を欠失する鋳型を転写に用いることにより直接確
認できる。既に述べたとおり、MOPC41カツパー遺伝子の
cap部位から上流−44と−79bpの間に位置する配列の欠
失は本系での転写を阻害する（これはインビボ系でも観
察されている）。欠失領域中にIgNF−Ａの結合部位が存
在する。このことは鋳型の転写は因子−結合部位に、恐
らく因子自体に依存していることを示す。 因子の機能を確認する直接的な方法は適当な鋳型を用
いたインビトロの転写系で転写が因子の除去および置換
によつて調節されることを示すことである。例えば、天
然のMOPC41Kプロモーター遺伝子をインビトロの系で鋳
型として用い、この鋳型の転写を因子（例えばリンパ特
異因子のIgNF−Ｂ）の存在下および非存在下で確認でき
る。因子はリンパ様細胞抽出物よりクロマトグラフイー
分画により除去してから置き変える。もし非存在下で転
写の程度が低下し、因子を添加することにより回復する
のであれば転写に於ける因子の関与が直接示されること
になる。 同定される調節因子をコードする遺伝子を単離し、ク
ローニングすることが出来る。これは二つの一般的な方
法のいずれかにより達成できる。第一の方法では因子を
クロマトグラフイーで精製する。例えばイオン交換、ゲ
ル過およびアフイニテイクロマトグラフイー、或いは
これらの組合せを用いる。因子が十分に精製されればそ
の一部の配列を決定し、配列のデータからオリゴデオキ
シヌクレオチドプローブを作成してそれを用いてcDNAラ
イブラリーより因子をコードする遺伝子を同定する。 もう一つの方法は、精製した因子または濃縮した因子
に対する抗血清を形成させる。抗体を用いてその因子を
発現することがわかつている細胞のcDNAライブラリーで
因子の発現を同定する。 正の調節因子をコードする遺伝子は遺伝子発現を高め
る手段を提供する。Ig遺伝子転写の正の調節に関与する
リンパ特異因子はリンパ様細胞での免疫グロブリン生産
を増加させる方法を提供するかも知れない。モノクロー
ナル抗体を生産するハイブリドーマのようなリンパ様細
胞は調節因子をコードする遺伝子の多コピーでトランス
インフエクシヨンしてIg生産を高めることができる。こ
のためには調節因子をコードする遺伝子に強いプロモー
ターを連結する。（構築には選択マーカーも組込むよう
に設計する）。構築物の多コピーをエレクトロポレーシ
ヨンのようなトランスフエクシヨン手法により細胞に挿
入する。一個の細胞を構成的因子を含む複数個の因子で
トランスフエクシヨン出来、その場合に因子は協調して
作用することがわかつた。このようにして因子の遺伝子
を増幅することにより、トランスフエクトされた細胞で
調節因子の過剰生産が誘導され、その結果免疫グロブリ
ンの生産が増加する。 本発明はさらに以下の例により説明される。 例 I.核内因子IgNF−Ａの同定 A.方法 1.SfaN I−SfaN I Ｋプロモーター断片とのゲル電気泳
動DNA結合アツセイ SfaN I断片をpS64（pSPIgVk、N.Speckにより供与）の
Sma I部位にサブクローニングした。結合分析にはpSPIg
VkをHind IIIおよびEcoR Iで消化してこの断片を切り出
した。後の二つの部位はpSP64のポリリンカー中のSma I
部位をはさんでいる。［-32P）dATPおよびE.coli DNA
ポリメラーゼＩの大断片で末端標識した後、放射標識断
片をポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離した。
結合反応を行ない、反応液を電気泳動で分離した（第1b
図）。32P−標識断片（およそ0.5ng、10,000cpm）をヒ
トＢリンパ腫細胞株（EW）（J.D.Dignamら、Nucl.Acids
Res.11巻、1475−1489頁（1983年）の方法により調
製）の核抽出物と二つの非特異拮抗DNAの存在下（２−1
1列）または非存在下（１列）でインキユベートした。
結合反応液は（25μ）は10mMトリス塩酸（pH7.5）、5
0nM NaCl、1nM DTT、1mM EDTA、５％グリセロールお
よび８μgEW核抽出蛋白を含有した。２−６の反応はそ
れぞれ800、1600、2400、3200および4000ngのポリ（dI
−dC）−ポリ（dI−dC）をさらに添加した。７−11の反
応はそれぞれ300、600、900、1200および1500ngのHinf
I消化E.coli染色体DNAを含有した。室温で30分間インキ
ユベートした後、生成した複合体を低イオン強度の４％
ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリ
ルアミド重量比30:1）で6.7mMトリス塩酸（pH7.5）、3.
3mM酢酸ナトリウムおよび1mM Na−EDTA中分離した。F.S
traussおよびA.Varshavsky,Cell、37巻、889−901頁（1
984年）参照。ゲルを11V/cmで30分間予備泳動した。電
気泳動は同じ電圧勾配で室温にて90分間、緩衝液を循環
して行なつた。泳動後ゲルを乾燥し、−70℃でスクリー
ンを用いてオートラジオグラフイーにかけた。第1b図で
ＦおよびＢはそれぞれ遊離および結合断片の位置を示
す。 結合アツセイは2400ngのポリ（dI−dC）−ポリ（dI−
dC）および次のDNA断片を用いて上に説明したように実
施した:K SfaN I−SfaN I（0.5ng、10,000cpm、１
列）、Ｋ Pvu II−Kpn I（0.5ng、10,000cpm、２
列）、Ｋ Pvu II−SfaN I（0.1ng、5000cpm、３列）お
よびpSP64 Pvu II−EcoR I（0.2ng、5000cpm、４
列）。KPvu II−SfaN I断片はプラスミドpSPIgVkをPvu
IIおよびEcoR Iで消化して得られた。EcoR I部位はポリ
リンカー内に存在し、従つて本断片は16bpのポリリンカ
ー配列を含有する。 2.ヒトEWおよびHeLa細胞の核抽出物での結合拮抗分析 EW核抽出物、第2a図。結合アツセイは放射標識のKPvu
II−SfaN I断片（0.1ng、5000cpm）および2400ngのポ
リ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）を用いて上述のとおり行
なつた。２−４の反応はさらにそれぞれ50、100および2
00ngのバクテリア性プラスミドpSP64を、５−７はそれ
ぞれ50、100および200ngの組換えプラスミドpSPIgVKを
含有した。pSPIgVKの一分子が高親和性の部位１個を有
し、pSP64（3000bp）の一分子が3000個の非特異部位を
持つと仮定すると、これら二つの部位に対する因子の見
かけ上の親和性の比は3000×200/50＝1.2×104以上であ
る。 HeLa核抽出物、第2b図。結合アツセイは放射標識のＫ
Pvu II−SfaN I断片（およそ0.1ng、5000cpm）、2400
ngのポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）および６μｇのHe
La核抽出蛋白（P.Grabowskiより供与）を用いて上述の
とおり実施した。反応１および２はさらにそれぞれ100n
gのpSP64およびpSPIgVKを含有した。 3.因子−DNA複合体のDNaseフツトプリント（第３図） Ｂ細胞の核抽出物を10nM Hepes、pH7.9、20％グリセ
ロール、1mM DTT、1mM EDTA、5mM MgCl2および0.1M
KClで平衡化したヘパリン−セフアロースカラムにかけ
る。Ｋ−プロモーター結合因子は0.25M KClの段階で溶
出した。この分画（30μ）との結合反応は2.5mM MgCl
2、KPvu II−SfaN I（1ng、100,000cpm）および4800ng
ポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）を添加した前述の反応
液成分中で行なつた。Ｋプロモータープローブのコード
鎖はE.coli DNAポリメラーゼの大断片を用いて
［-32P］dATPで３′末端（EcoR I部位）標識した。反応
１はＢ細胞核蛋白の非存在下でDNase I（５μg/ml）で
室温2.5分間消化した。反応２は先ずEW核内因子のヘパ
リンセフアロース画分（14μｇ蛋白質）と室温で15分間
インキユベートし、次にDNase Iで上記と同様に消化し
た。核反応はEDTA（5mM）で終結させ、生成物を既に述
べたようにそのままのポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分離した。オートラジオグラフイーにより種々の
生成物を検出してからDNAを遊離（反応１）および結合
（反応２のB1およびB2）断片のバンドからゲル片を0.5M
酢酸アンモニウム（pH7.5）、0.1％SDSおよび1mM EDTA
中37℃で一晩振とう下でインキユベートして溶出した。
上澄液を順番にフエノール−クロロホルム−イソアミル
アルコール（25:24:1、v/v）およびクロロホルム−イソ
アミルアルコール（24:1、v/v）で抽出し、担体RNAの存
在下で２倍容量のエタノールで沈でんさせた。再沈でん
の後、生成物を8M尿素存在下で10％ポリアクリルアミド
ゲル（20:1）で分離して分析し、−70℃でスクリーンを
用いてオートラジオグラフイーを行なつた。１列は反応
１からの遊離断片消化の生成物を示す。２列と３列は反
応１からのそれぞれ結合バンドB1およびB2から溶出した
消化生成物である。１′、２′および３′列はそれぞれ
１、２、および３列に対応し、ただ前のセツトはDNase
Iで５分間消化されている。Ｋプロモータープローブの
Ａ−Ｇ化学切断ハシゴを同時に電気泳動にかけて結合領
域をマツピングした。A.MaxamおよびW.Gilbert.Meth.En
zymol.65巻、499−525頁（1980年）参照。 4.共通の核内因子の三つのIg転写制御成分への結合 真の並びに予想される結合部位のヌクレオチド配列、
第4a図。VL結合部位をDNase I阻害アツセイにより決定
する（＊印は保護領域の境界を示す）。VHおよびJM−CU
配列はそれぞれＶ17,2,25プロモーターおよびマウスＨ
鎖エンハンサー中の予想される結合部位である。カツコ
内の数はオクタマーモチーフの開始位置を示す。結合拮
抗、結アツセイ（10μ）は上記記載のとおりに、1600
ngのポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）およびEW核内因子
のヘパリンセフアロース画分（1.5μｇ蛋白）を用いて
行なつた。VLプローブ（およそ0.1ng、5000cpm）１−
３、10、11列。VHプローブ（0.2ng、5000cpm）４−６、
12−12列。JH−CHプローブ（0.2ng、5000cpm）、７−
９、14、15列。２、５および８列はさらに5ngのVLプロ
モーターオリゴマー（36bp、MOPC−41 VK遺伝子断片の
−81から−44の位置）を含み、３、６および９列は50ng
の同じオリゴマーを含有した。11、13および15列はさら
に50ngのJH−CHオリゴマー（41bp、Ｈ鎖エンハンサーの
−１から40の位置）を含有した。相補一本鎖合成オリゴ
ヌクレオチドはRonald Mertz博士、Genzentrum der Uni
versitat MunchenおよびE.L.Winnacker博士、Institut
fur Biochemie der Universitat Munchenにより作成さ
れた。それらは使用前にアニーリングして結合アツセイ
の拮抗基質とした。 B.結 果 MOPC41カツパーＬ鎖遺伝子の上流域（第1a図）由来の
放射標識SfaN I−SfaN I DNA断片をヒトＢ細胞の核抽
出物と２種の拮抗DNAの存在および非存在下でインキユ
ベートした。生成した複合体を低イオン強度、無変性ポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動により遊離断片と分離
し、オートラジオグラフイーにより検出した（第1b
図）。拮抗DNA非存在下では標識断片の全てがゲルの上
端に留まり（１列目）、これは恐らく過剰な非配列特異
性蛋白との結合のためであると思われる。拮抗物として
ポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）（２−６列目）または
E.coli染色体DNA（７−11列目）を量を変化して添加す
ると、遊離断片よりゆつくり移動する蛋白−DNA複合体
と予想されるものが検出された。主要複合体（Ｂ）およ
び少量の複合体種の存在比は交互コポリマー拮抗DNAの
存在時に有意に増加した。この単純コポリマーの添加が
アツセイの感度をかなり高めたので、以後の結合分析で
は全てこれを使用した。 結合アツセイで検出された主要複合体の配列特異性を
試験するため、互いに重複するカツパープロモーター断
片（第1a図のSfaN I−SfaN I、Pvu II−Kpn IおよびPvu
II−SfaN I参照）およびバクテリア性プラスミドSP64
由来の同じ位の長さの断片（EcoR I−Pvu II）を個々に
アツセイした（第1c図）。バクテリアのDNA断片は全く
結合が認められないのに対し（４列目）、カツパープロ
モーターの全ての断片が同じ移動度の重要複合体種を生
成した（１−３列）、異なる長さの断片プローブ（75−
300bp）で形成した一連の複合体の移動度はおよそ同じ
であつた（データーは示していない）。従つてこれらデ
ーターは特異核内因子がカツパープロモーター断片の重
複領域に結合することを示唆している。この領域内には
保存されたオクタマー配列が含まれるがTATA成分はな
い。最も短かい75bpのカツパープロモーター断片では
（３列目）ゲルの上端に標識は見られない事が注目され
る。従つて、最近明かにされたように、短かいプローブ
断片を使用することで特異的蛋白−DNA複合体の検出感
度が高まる。 コポリマーおよび小断片プローブの使用により感度が
増加したことから二つの複合体、B1およびB2（第2a図の
１列目）が検出された。主要種B1が前の図のＢに相当す
る。因子のカツパープロモーターDNAに対する相対親和
性を拮抗アツセイにより測定した（第2a図）。上述のイ
ンキユベーシヨンに対照のプラスミド（pSP64）を添加
しても試験した濃度範囲で結合を拮抗しなかつた（２−
４列）のに対し、組換えプラスミド（pSPIgVK）は同じ
濃度範囲でB1およびB2の両種の複合体形成を低下させた
（５−７列）。後者のプラスミドはカツパープロモータ
ーの上流域をpSP64に挿入して作成した。pSPIgVKプラス
ミドが一個の高親和性結合部位を含有すると仮定すれ
ば、B1およびB2に関与する核内因子は異種プラスミドDN
Aよりも同系配列に対して104倍の高い親和性を有すると
考えられる（上述の方法の部の２を参照）。 B1およびB2形成に必要な因子がＢリンパ球に特異的か
どうかを調べるために、ヒトHeLa細胞由来の核抽出物を
カツパープロモーターとの結合につきアツセイした（第
2b図）。HeLa抽出物でも（１列目）Ｂ細胞抽出物で見ら
れたと同じ程度のB1およびB2両種が生成した。さらに、
両者共pSPIgVKプラスミド（２列）により特異的に拮抗
した。従つてHeLa細胞もカツパープロモーター上流域に
特異的に結合する因子を含有する。 複合体B1およびB2に存在する因子の結合部位をより高
分解能で観察するためにDNase Iフツトプリント分析を
使用した。この実験を容易にするためにＢ細胞からの因
子を核抽出蛋白のヘパリンセフアロースカラムクロマト
グラフイーにより部分精製した。大部分の結合活性は0.
25M KClの分画に溶出され、およそ５倍精製された（デ
ーターは示していない。第３図の説明参照）。フツトプ
リント分析には部分精製した因子をカツパープロモータ
ープローブとインキユベートした後にDNase Iを添加
し、B1およびB2種は遊離断片とポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分離した。B1およびB2バンドより結合DN
Aを溶出し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調
べた（第３図、２、３および２′、３′列）。Ｂ細胞蛋
白非存在下のカツパープロモータープローブのDNase I
消化（１および１′列）およびATC化学分解ラダーも同
時に泳動して結合部位のマツピングを行なつた。B1複合
体の因子（２および２′列）はコード鎖上の19ヌクレオ
チド領域を保護するようである。保護された部分の５′
および３′境界位置は転写開始部位からそれぞれ−72お
よび−52とマツプされる。C.QueenおよびD.Baltimore,C
ell32巻、741−740（1983年）。DNase I保護領域は保存
オクタヌクレオチド配列、ATTTGCATの辺りを中心として
おり、この配列が核内因子によるIgプロモーターの認識
に重要であることを示唆している。B2複合体も本質的に
B1と同じDNase I保護パターンを示し、従つてさらに加
えてのDNA関連が伴なわないと考えられる（３および
３′列）。この結果の単純な解釈はB2複合体がB1複合体
に関与する蛋白質の蛋白−蛋白相互反応による二量体形
成により生成されるというものである。もう一つの解釈
としては、B2複合体がB1複合体に関与する因子にもう一
つ違う蛋白が結合して生成するか、或いは異なるDNA結
合蛋白質が同じ配列を認識することにより生成するかで
ある。 オクタマー配列モチーフはＬおよびＨの両鎖遺伝子プ
ロモーターおよびマウスおよびヒトＨ鎖遺伝子のエンハ
ンサー成分に存在するので、マウスＨ鎖プロモーター
（VH）およびマウスＨ鎖エンハンサーからの断片に対す
る因子の結合アツセイを実施した。VHプロモーター断片
はＶ17,2,25遺伝子の５′領域に由来し、転写開始部位
を基準に−154から＋57の間のヌクレオチドを含んでい
る。R.GrosschealおよびD.Baltimore,Cell41巻885−897
頁（1985年）。このプロモーター内で保存オクタヌクレ
オチドは−57から−50の位置を占める（第4a図）。Ｈ鎖
エンハンサー断片は胚細胞株JHCU領域に由来し、エンハ
ンサー機能領域と考えられている313bp中の81から251を
含んでいる。T.Banergiら、Cell33巻、729−740頁（198
3年）。上記断片中で保存オクタヌクレオチドは166から
173に位置する（第4a図）。Ｂ細胞ヘパリンセフアロー
ス画分（カツパープロモーター配列との結合を基に精製
した。第4b図１列）はVHプロモーター断片（４列）およ
びエンハンサー断片（７列）の両方に結合することがわ
かった。三つの断片と形成した複合体の移動度は非常に
類似し、共通の因子との結合と一致する。さらに、これ
らの断片との結合はMOPC41カツパーＬ鎖遺伝子プロモー
ターのオクタヌクレオチドモチーフを含む合成二重鎖40
マーにより特異的に拮抗された（１−９列）。オクタヌ
クレオチドモチーフを欠失するマウスＨ鎖エンハンサー
領域からの配列を含有する同じ長さのオリゴマー（第4b
図）は同じ濃度範囲で結合を拮抗しなかつた（10−15
列）。この拮抗分析の結果はさらに、共通の核内因子
（IgNF−Ａ）が三つ全てのIg転写成分と結合することの
示唆を強める。前に述べたように、これらの三つの転写
成分は同一の配列モチーフであるATTTGCATを共通に有す
る（第4a図）。従つて共通の核内因子の結合がこのモチ
ーフにより仲介されていることはほぼ確実である。 II.Ig遺伝子のインビトロ転写の上流配列への依存性 A.方 法 第5a図：鋳型 欠失５′５および５′７については既に
記載した。Y.Bergmanら、PNAS USA81巻、7041頁（1981
年）参照。配列決定されたＨ鎖およびＬ鎖の可変部領域
遺伝子の上流に見られる高度に保存されるオクタヌクレ
オチド配列を四角に囲つた（“OCTA"と表示）。これは
“TATA"ボツクスよりおよそ30塩基対上流に位置してい
る。プラスミドpKおよびｐΔＫを５′Δ５および５′Δ
７の５′末端を合成リンカーを用いてHind III部位に変
え、JK−CK主要イントロン中のBgl IIまでの断片をHind
IIIおよびBamH Iで消化したpUC−13にクローニングし
て構築した。pKEKおよびpKEKはＨ鎖エンハンサーのカツ
パーエンハンサーのいずれかをpKの特有なHind III部位
にクローン化されて含有している。エンハンサーとして
使用した断片JK−CKイントロン（E.E.Maxら（1981
年）、J.Biol.Chem.256巻、5116頁）からの800bp Hind
III−Mb0 II断片およびJH−CKイントロンからの700bp X
ba I−EcoR I断片である。S.D.Gilliesら、Cell33巻;71
7頁（1983年）;J.Banjerjiら、Cell33巻、729頁（1983
年）。第5b図；ヒトＢリンパ腫細胞株RAMOS（１、２
列）およびEW（３、４列）から作成した全細胞抽出物で
の転写;HeLa全細胞抽出物（５、６列）。予想される2.3
kbの流出転写物を表示した。 細胞株RAMOSおよびEWを10％の不活化仔ウシ胎児血清
含有のRPMI培地中で細胞濃度が５−８×105/mlとなるま
で増殖させる。全細胞抽出物をManlyらの方法、PNAS U
SA 77巻、3855頁（1980年）、に従つて作成し、最終蛋
白濃度がおよそ18mg/mlであつた。流出転写反応は反応
液20μ中30℃で60分間行なつた。典型的な反応液は９
μ（160μｇ）の全細胞抽出物、50μＭの各ATP、CTP
およびGTP、0.5μM UTP、10uCiのａ−32PUTP（NEG 007
X、7600Ci/mM）5mMのクレアチンりん酸、0.3mg/mlのク
レアチンホスホキナーゼ（シグマ）、12mM Hepes7.9、1
2％グリセロール、60mM KCl、5mM MG++1mM EDTA、0.
6mMのDTT、鎖状鋳型（およそ50ng）および非特異担体と
してのポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）（およそ400n
g）を含有する。反応は20μの停止緩衝液（7M尿素、1
00mM LiCl、0.5％SDS、10mM EDTA、250μg/ml tRNA、
10mMトリス（pH7.9））を添加して停止し、フエノー
ル；クロロホルム；イソアミルアルコール（1:1:0.05）
で２回、クロロホルムで一回抽出し、エタノールで沈で
んする。RNAをグリオキサールで処理し、10mMりん酸ナ
トリウム（pH6.8）、1mM EDTA中で1.4％アガロースゲ
ルの電気泳動で分析した。Manleyら、上述、を参照。次
にゲルを乾燥し、増幅スクリーンを用いて−70℃でオー
トラジオグラフイーを行なつた。 第６図：予備インキユベーシヨンパルスチエース手法
を用いたＢ細胞抽出物中のインビトロ転写に対する上流
欠失５′７の影響。野生型プロモーター（１列）または
不完全なカツパープロモーター（２、３列）を含む鋳型
を用いて得られる転写物。４−６列：野生型プロモータ
ー（４列）または不完全なカツパープロモーター（５−
６列）を含む閉環環状鋳型を用いたインビトロ転写。こ
れらの反応ではアデノウイルス主要後期プロモーター
（MLP）を含む閉環環状鋳型50ngを内部標準として入れ
た。カツパー鋳型またはアデノウイルム鋳型に特異な転
写物をそれぞれKappaおよびMLPと表示してある。主要後
期プロモーターを含む鋳型にはプラスミドpFLBHを用い
た。プラスミドはpBR322のBamH IおよびHind III部位の
間に挿入してアデノウイルスの14.7から17.0マツプ単位
の配列を含有し、A.FireおよびM.Samuelsの好意による
提供物である。 線状またはスーパーコイル状の鋳型（50ng）を９μ
（およそ150μgm）のEW抽出物、６％（重量／容量）ポ
リエチレングリコール20,000および第5b図に記載される
ヌクレオチド以外の全ての成分を含む20μの容量中で
30℃60分間インキユベートした。転写はヌクレオチドお
よび放射活性UTPを以下の最終濃度で添加することによ
り開始した:ATP、CTPおよびGTPを各60uMおよび1uMのUTP
および10nCiの-32P UTP（NEG007X、600Ci/mM）。開始
パルスは30℃10分間維持した後、大過剰の無標識ヌクレ
オチドで10分間チエースした。チエース中の最終濃度は
以下のとおりである:ATP、CTP、GTPが330μＭでUTPが1m
M。反応を停止し、処理して連続転写物を前述のように
分析した。転写物の開始点のマツピングは以下の通りに
行なつた：閉環環状鋳型から生成した転写物を20μの
HE（50mM Hepes、pH0.7、1mM EDTA）にとり、10μを
用いてハイブリダイゼーシヨン選択を行なつた。カツパ
ーRNAに相補的なハイブリダイゼーシヨン用鋳型をMOPC4
1遺伝子のCAP部位を含むPva II−Sau3A断片（Queenおよ
びBaltimore,Cell33巻、741頁（1983年））をM13フアー
ジMP9にクローニングして構築した。一本鎖フアージDNA
を調製し、塩化セシユウムの密度勾配遠心分離により精
製した。MLP特異の転写物はA.FireおよびM.Samuelsによ
り提供されたM13クローンXH11を用いて検出した。ハイ
ブリダイゼーシヨンは750mM NaClおよび100−200μｇ
の一本鎖相補DNAの存在下で最終容量15μ中50℃で２
時間行なつた。次に反応を200μの冷クエンチ溶液
（0.2M NaCl、10mM Hepes pH7.5、1mM EDTA）で希釈
し、2UのリボヌクレアーゼT1を添加した。一本鎖RNAの
消化を30℃で30分間行なつた後反応液をフエノール・ク
ロロホルム・イソアミルアルコール（1:1:0.05）で一回
抽出し、担体tRNAで沈でんさせた。ペレツトを冷70％Et
OHで一回洗浄し、乾燥して80％v/vホルムアミド、50mM
トリスホウ酸、pH8.3および1mM EDTAに再けん濁した。R
NAを95℃３分間変性させた後６％ポリアクリルアミド8.
3M尿素のシークエンス用ゲルで電気泳動にかけた。免疫
グロブリンのプロモーターに由来する２本のバンドの上
（Kappa）はカツパー転写の正しい開始を表わす。下の
バンドはいろいろな強度で見られ、下に説明するように
恐らく異なるCOP部位を表わさないだろう。 B.結 果 ２種のヒトバーキツトリンパ腫細胞株、EWおよびRAMO
Sから細胞全抽出物をManleyらの方法、上述、により作
成した。インビトロ転写反応に用いた鋳型は第5a図に示
した。野生型遺伝子（pK）を代表する鋳型はMOPC41カツ
パー遺伝子に由来し、主要イントロンJK−CK中の転写開
始点（第5a図、５′Δ５の末端）から上流Bgl II部位ま
でのおよそ100bpの配列を含んでいる。E.E.Max、J.Bio
l.Chem.256巻、5116頁。この断片はJK1に再編成した完
全な可変部領域を保持するがBgl II部位よりさらに下流
にあるカツパーエンハンサーは含まない。例えばQueen
およびStafford,Mol Cell Biol.4巻、1042頁（1984年）
参照。この短かい５′フランクで一時的トランスフエク
シヨンアツセイでの転写の正確な開始と高レベルの転写
に十分であることがわかつた。Y.Bergmanら、PNAS USA
81巻:7041頁（1984年）。カツパープロモーターの欠失
実験で欠失５′Δ７は遺伝子の転写能を完全に失なつて
いるのに対し、欠失５′Δ５は影響がないことから、重
要な調節配列はヌクレオチド−79から−44の間に存在す
ることが既にわかつている。Bergmanら、上述、参照。
不活性なプロモーター変異（ｐΔＫ）をHind III部位を
５′Δ７の５′末端に操作してBgl II部位までの遺伝子
断片をHind IIIおよびBamH Iで切断したpUC13にクロー
ニングして構築した。 Ｂ細胞抽出物中の転写活性を調べるためにポリリンカ
ー中のSac I部位で切断した線状鋳型を用い、この部位
で終結している転写物（ラン・オフ転写物）を電気泳動
分離により調べた。RAMOS、EWまたはHeLa細胞の抽出物
を用いた時2.3kbのラン・オフ転写物が検出された（第5
b図、２、４および６列）。カツパー鎖エンハンサー配
列を添加しても影響は見られず、これらの抽出物中の転
写はエンハンサー非依存性と考えられる（第5b図、１、
３および５列）。（EWおよびHeLaでエンハンサーの添加
により放射活性バツクグラウンドにやや増加が見られる
が2.3kbバンドでは変化ない。）2.3kbのバンドは鋳型を
添加しない場合または0.5ugm/mlのアマニチンの存在下
による転写で消失した。従つてこれが鋳型特異性のRNA
ポリメラーゼII転写生成物であることを示す。2.3kbの
すぐ下のバンドはアマニチンにより減少せず、恐らす内
部18sRNAの末端標識を反映している。 転写の開始が天然のcap部位からのものかどうか確認
するために二つ目のアツセイを用いた。U.Hansenおよび
P.A.Sharp（1983年）EMBOJ2巻;2293頁参照。このアツセ
イではユニフオーム標識のRNAを転写開始部位を含む一
本鎖DNAプローブ（カツパー遺伝子のPvu II−Sau3A断片
をフアージM13にクローニングして生成）とハイブリダ
イズした。得られる複合体をリボヌクレアーゼT1で消化
し、リボヌクレアーゼ耐性のRNA断片を8.3M尿素を添加
した６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。
この方法でインビトロに合成したRNAの分析を第６図
（４列）に示す。上のバンド（Kappaと表示）は正しいc
ap位置を表わす。そのすぐ下のバンドは種々の濃度で観
察され、多分異なるcap位置を示すのではなく保護され
た領域の３′末端から次のＧ残基でのリボヌクレアーゼ
T1による切断により生じたと思われる。（Sau3A1部位付
近の配列分析の結果RNA上の二つ目のＧ残基のセツトは
一本鎖DNAプローブとのホモロジー領域の末端から上流1
9bpに存在することがわかる）。従つてＢ細胞からの抽
出物はインビトロでHeLa細胞抽出物と同じ効率で免疫グ
ロブリンプロモーターを正しく開始し、転写することが
出来た。 ５′に連なる配列のインビトロ効果を解析するために
欠失遺伝子ｐΔＫの転写を調べた。多くの調節効果が転
写の開始速度に作用するので、開始速度を測定する前イ
ンキユベーシヨン、パルス−チエースプロトコールを用
いた。A.Fireら、J.Biol.Chem.259巻:2509頁（1984年）
参照。鋳型DNAを先ず抽出物と前インキユベートして前
開始複合体を形成させた。次にヌクレオチドおよび放射
活性UTPを添加して転写を開始した。開始した転写物は
非放射標識のヌクレオチドでチエースしている間に完了
し、電気泳動分離により分析した。このアツセイで取り
込まれた放射活性はパルス期間中に起つた正しい開始の
数に比例する。 第６図で２列と３列を１列と比較すると、開始点の上
流およそ100bpを含有する鋳型pKは欠失変異ｐΔＫより
もおよそ10倍の効率で開始した。ここでも、不完全なプ
ロモーターの−44bpの位置に連結したＨ鎖エンハンサー
の存在は転写の程度を改善しなかつた。閉環環状鋳型を
使用しても同様なプロモーター欠損の効果が観察された
（第６図、４−６列）。この反応ではアデノウイルスの
主要後期プロモーターを含む鋳型を内部対照としていれ
た；予想される180bpの保護RNA断片はMLPと表示した。
５列と６列を４列と比較すると変異プロモーターからの
転写効率は10倍低下し、一方主要後期プロモーターの転
写物は変わらなかつた。Ｈ鎖エンハンサーを含むスーパ
ーコイル鋳型からの転写量が見かけ上減少している理由
はそれ以上検討していない。しかし、転写が−44から−
79の間の上流配列に依存していることが観察され、この
効果がＢ細胞抽出物に特異としても同じ鋳型が異種のHe
La全細胞抽出物中で転写された事は明かである。野生型
の鋳型と比較して欠失鋳型では４から５倍の転写の低下
が見られた（データは示していない）。従つて、欠損の
影響はせいぜいやや組織特異と言える。 本明細書に記載したように、発明者らは２種の別々の
ヒトＢ細胞リンパ種より転写能を有する全細胞および核
抽出物を開発した。これらの抽出物中でMOPC41カツパー
遺伝子のプロモーターからの転写は正確に開始し、プロ
モーターの欠失は転写開始RNA量を有意に低下させた。
インビトロでここで用いた欠失の影響は一時的トランス
フエクシヨンアツセイによる分析で数百倍であるが、発
明者らがインビトロで観察した影響はおよそ10から15倍
程度でしかなかつた。現在インビトロの転写に必要ない
くつかの上流配列があるが、R.GroschedlおよびM.L.Bir
steil（1982年）PNAS USA79巻:297頁;R,Henら、（1982
年）PNAS USA79巻;7132頁など参照、その効果は対応す
るインビトロのものより小さい。これはインビトロ転写
の程度を測定する際にTATAボツクスが関連因子の優性な
ためであろう、N.G.Miyamotら、Nucl.Acids Res.12巻:8
779頁（1984年）。 III IgNF−Ｂの発見とその性状 各種細胞株の核抽出物についてオクタマー結合性蛋白
質の検索を行なうために移動度シフトゲル電気泳動を用
いた。IgNF−Ａに対応するバンドは全ての抽出物に見ら
れたが、IgNF−Ａと異なる移動度のIgNF−Ｂと命名する
二つ目のバンドはリンパ様細胞の核抽出物にのみ見られ
た。このリンパ特異オクタマー結合蛋白質は、試験した
プレＢ、成熟Ｂおよび骨髄腫細胞株全ての核抽出物およ
びあるＴ細胞リンパ腫の核抽出物に見られた（第７およ
び８図）。IgNF−Ｂは非リンパ細胞株、HeLa、２、Cos
およびMelの核抽出物中には検出されなかつた（第８図
参照）、IgNF−ＢはIgNF−Ａと同様に拮抗実験で同じオ
クタマーに特異的であることがわかり、IgNF−Ｂバンド
はオクタマー配列を持つ非標識DNA断片と選択的に拮抗
したが、オクタマー配列を持たないDNA断片とはしなか
つた。 オクタマー配列は全ての免疫グロブリン（Ig）可変部
遺伝子の転写開始部位からおよそ−70上流の位置に見ら
れ、この領域はIgプロモーターのリンパ特異性を制御す
ることがわかつている。従つてIgNF−Ｂはリンパ様細胞
の上流オクタマー配列に結合して転写を活性化している
のかも知れない。 IV.μ−エンハンサーと結合する因子:E因子 完全な機能を持つμエンハンサーはJHとＣμの間の主
要イントロンからの700bp Xba I−EcoR I断片に存在す
る。この断片はPst I部位での切断によりさらに分割さ
れて400bpのXba I−Pst I断片（μ400）および300bpのP
st I−EcoR I断片（μ300）を生成する。一時トランス
フエクシヨンにより組織特異エンハンサー活性の30−50
％はμ300に保持され、μ400には活性は全く検出されな
かつた。μエンハンサーとどんな蛋白因子が相互反応す
るのか調べるためにゲル結合アツセイを用いた。簡単に
は、末端標識したDNA断片を組織培養から調製した核抽
出物とインキユベートした。室温20分後に低イオン強度
ポリアクリルアミドゲルにのせ、120Vで２時間電気泳動
をかけた。次にゲルを乾燥し、オートラジオクラフイー
にかけた。このアツセイで活性のある300bp（μ300）エ
ンハンサー断片を用いると、ヒトＢリンパ腫細胞株EWか
らの抽出物にDNA−蛋白複合体が観察された（第9b図、
２列）。この新しいバンドが特異複合体であることを示
すため、種々の量の非放射活性拮抗断片の存在下で結合
反応を行なつた（第9b図、３−11列）。拮抗断片として
μ300を添加すると複合体バンドは完全に消失した。一
方、燐りのμ400断片（６、７、８列）或いはKL鎖エン
ハンサーを含む450bp断片（９、10、11列）では多量に
添加してもわずかな影響しかなかつた。興味深いことに
Ｋエンハンサーの存在下では特異複合体の量が少し増加
していた（９列と２列を比較）。以下に示すように、μ
およびＫエンハンサーの両方共少なくとも一つの共通蛋
白質と相互反応し、これはμ300断片が結合して検出さ
れるものではない。Ｋエンハンサー存在下での特異複合
体の増加は恐らく両エンハンサーに共通の因子が反応液
から除かれ、より多くの標識断片がμ特異因子と結合し
て検出されたためであろう。 少量しか存在しない蛋白質の結合部位を検出し、μ30
0で検出される複合体をより詳細に解明できるようにす
るため、この断片をさらに切断した。生成した小断片の
それぞれについて核蛋白質との結合部位となり得るかど
うか分析した。第10a図はμエンハンサーの該領域の部
分制限地図である。μ300をAlu I、Hinf IおよびDde I
で消化して多数の50−70bp断片、μ50、μ（60）２（Al
u I−Dde IおよびHinf I−Alu Iの混合）およびμ70を
得た。これらの断片のそれぞれについて非特異拮抗物ポ
リ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）の種々の量の存在下でEW
リンパ腫細胞の核抽出物との結合反応を行なつた。結果
を第10b図に示す。 断片μ50は4ugのポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）の
存在下でもほとんど減少しない主要複合体バンド（２、
３、４列）を形成する。２つの60bp断片混合物は明確な
複合体バンドを形成しない（６、７、８列）。μ70断片
は２本の薄い、しかしはつきりした核蛋白複合体バンド
を形成し（10、11、12列）、その下の方のバンドは3ugm
の非特異担体ポリ（dI・Ｃ）・（dI・Ｃ）によつてほと
んど影響しない（12列）。 観察された複合体の特異性を各種DNA断片を用いた拮
抗実験で調べた、第10c図。その結果、μ50で形成する
複合体はμ300（μ50はその一部）またはＫプロモータ
ー断片の存在下で拮抗されるが、同じ量のμ400または
Ｋエンハンサー断片では拮抗されず、複合体が前に述べ
たIgNF−Ａがその同類配列との相互反応により生成する
のと一致する。（この因子は全ての配列決定された免疫
グロブリン遺伝子のプロモーター中およびＨ鎖エンハン
サーの小断片内の保存オクタヌクレオチド、ATTTGCAT、
を認識する。 μ70で観察される複合体はそれ自体で特異的に拮抗さ
れ（９列）、またＫエンハンサーである程度拮抗される
（第10図ｃ図の５、６列）が、モロニーネズミ白血病ウ
イルスエンハンサー（３、４列）またはμ400（第10d図
の７、８列）では全く拮抗されなかつた。さらに拮抗分
析でこの複合体は（μ60）２（第10D図、７、８列）、
μ50（第10D図、５、６列）、或いはμ70（Alu I−Alu
Iの中央断片）（第10d図、11、12列）のいずれでも拮抗
されなかつた。従つてここで観察された結合はこの小さ
い断片に特異的であり、μ300をさらに切断してIgNF−
Ａの主要相互作用をエンハンサー配列と分離してもう一
つの断片（μ50）とした時のみ検出された。 EphrussiらおよびChurchらはメチレーシヨン保護実験
を用いてＢ細胞中のDMSによるメチル化に特異的に耐性
なＨ鎖エンハンサー内のＧ残基セツトを決定した。この
結果から組織特異DNA結合蛋白質はこの試薬のDNAへの相
互作用を低下させるという仮定が得られる。保護は４つ
のクラスターで見られ、それらのDNA配列の相同性から
予想される因子の結合部位の一致配列を誘導できた。全
ての４つの予想結合部位（E1−E4）は700bp断片内に見
られるがμ300はこの因子の２つの完全結合領域（E3お
よびE4）およびオクタマー（０）配列を保持している。
上述の特異核蛋白複合体を示すAlu I−Alu I断片は完全
なE3領域を含み、インビトロで検出する因子は恐らくイ
ンビボで検出されているものと同じであろう。従つて、
E4および０を含んでいるHinf I−Dde I断片（μ50）が
μ70への結合を拮抗しないことは予想できなかつた（第
10d図、５、６列）。 これがIgNF−Ａがオクタマー部位と優先的に結合して
μ70への拮抗剤として作用できないためであつたのかも
知れないので、結合反応および拮抗実験を粗抽出をヘパ
リン−セフアロースカラムのクロマトグラフイーにかけ
てμ70結合活性は有するがIgNF−Ａは有意に除いた画分
を用いて行なつた。μ50またはμ70を末端標識し、カラ
ム画分とインキユベートしても電気泳動分析で特異核蛋
白複合体は観察されなかつた。この画分を用いてもμ50
もμ170もμ70とその結合蛋白との相互作用を拮抗でき
なかつた。（データーは示してない）。従つて、E4と命
名する結合部位はE3に結合する因子と同じ因子とは結合
しない事を示している。同様に、E1領域（Hinf I−Pst
I断片として単離）はその因子のμ70への結合に対して
μ70自体のように有効に拮抗しない。 個々の断片（μ70およびμ50）内の結合部位の位置を
決定するため、メチル化阻害法を用いた。末端標識した
DNA断片をジメチル硫酸（DMS）を用いてグアニンおよび
アデニンに部分メチル化を行なつた。メチル化したDNA
を次に粗抽出物との結合反応に使用し、複合体を電気泳
動を用いて遊離断片と分離した。複合体および遊離断片
の両バンドをゲルから切り出し、DNA電気溶出により回
収した。回収DNAをピペリジン切断した後12％のポリア
クリルアミド尿素シークエンシング用ゲルにかけた。原
理は、もしDMSとの反応により導入したメチル基が特異
蛋白の結合を阻害するなら、DNAのその分子は形成した
複合体および続く対応するラダーから選択的に消失する
ということである。従つて本法により蛋白と深い作用の
あるＧ残基を同定できる。［ゲル結合アツセイを用いた
DNase Iフツトプリントは複合体の半減期が短かいため
に存在量の少ないこれらの因子の場合には複雑であるこ
とがわかつた。もし結合インキユベーシヨンの後でDNas
e I部位消化を行なえば試料をのせて複合体をゲルにか
ける間に複合体のDNA断片が結合反応液中に存在する多
量の遊離断片と交換する可能性がある。従つて複合体或
いは遊離DNAで見られるDNaseパターンに区別がなくなる
（μ70での核蛋白複合体の半減期は１分以下である。Se
nおよびBaltimore、未発表データー）。］ 核抽出値物とμ50DNA断片を用いてこのような阻害実
験を行なつた結果、観察される複合体はIgNF−Ａ蛋白質
の保存されたオクタマー配列との相互作用により生成す
ることを示す（第11a図）。遊離断片は特徴的なＧラダ
ーを形成し（第11a図、２、３列）、複合体の形（１
列）は保存オクタマーの中央に存在する＊印で示すＧ残
基にメチル基を有するDNA分子では特異的に消失してい
る。恐らくこの残基の修飾が蛋白とその同系配列の間の
安定な複合体形成をひどく妨げる。この残基はインビボ
でDMSのメチル化に対しても保護されている。しかし興
味深いことに、μエンハンサーのこの領域中保護される
と観察された他のＧ残基は全てこのインビトロの阻害実
験で影響されなかつた。従つて、これらのインビボでの
阻害が蛋白の結合によるものであるなら、この因子はIg
NF−１とは異なり、インビトロでは断片に結合しない。 μ70断片ではいくつかのＧ残基が結合蛋白（Ｅ）と親
密な接触に重要であることがわかつた（第11b図）。コ
ード鎖ハンドで３つのＧが遊離DNA断片と比較して複合
体で強度が有意に低下しており（第11b図、１列と２列
を比較）、非コード鎖では２つのＧが有意に影響を受け
ている（第11b図、２列と４列を比較）。 インビボでのDMS阻害実験および発明者らのインビト
ロメチル化阻害実験の結果を第11c図に示す。配列上の
白丸および黒丸はEphrussiらによりインビボのメチル化
で保護されるとわかつている残基であり、丸で囲つたＧ
は発明者らがインビトロで同定したものである。μ70断
片での一致配列に亘る保護および阻害パターンはインビ
ボとインビトロで驚くほど類似しており、ゲル結合アツ
セイによりここで同定した蛋白質はインビドで本配列と
相互作用するものである事を示す。しかしμ50と同様、
この領域にインビボで見られる第二番目の保護はインビ
トロでは観察されなかつた。検出された因子の組織特異
性：同定された蛋白質がＢ細胞でのみ発現が限定されて
いるのかどうか決定するため、Ｂ細胞および非Ｂ細胞か
ら作成した種々の抽出物を検索した（第12図）。Ｂ細胞
株EWで生成し、特徴づけした（拮抗およびメチル化阻害
実験により）複合体と一緒に移動する複合体はμ50およ
びμ70断片（第12図、μ70）で調べた全ての細胞株で観
察された。各抽出で生成した複合体をそれ以上解体しな
かつたが、このデーターからこれらの因子がいずれも組
織非特異性であることを示していると解釈している。二
番目の複合体（IgNF−Ｂ）はＢおよびＴ細胞のみに限つ
てμ50で観察された。 各列での蛋白量は９から11μｇと一定にしてあつたが
生成する複合体の程度は抽出物によりかなり差があつた
ことは注意すべき点である。この段階では本アツセイを
用いて異なる細胞株での蛋白の量を推定するのは意味あ
るとは考えられない。（これは多分、細胞の状態の差お
よび細胞株による抽出条件の差によるのであろう。 要約すると、μエンハンサーの300bpのPst I−EcoR I
断片の機能分析の結果； （ｉ） このDNA配列内に少なくとも２つの異なる蛋白
が結合する。一つの蛋白（IgNF−Ａ）は全てのＨ鎖およ
びＬ鎖の可変領域遺伝子の上流に高度に保存され、また
μエンハンサーにも見られるオクタマー配列（ATTTGCA
T）と相互作用する。二つ目の蛋白はEphrussiおよびChu
rchにより全細胞中のDMSによるメチル化に対して組織特
異的に保護されると示された配列と相互作用すする； （ii） 両因子とも各種細胞株からの核抽出物中に検出
され、Ｂ細胞特異的ではない； （iii） E1およびE4の両配列とも因子のμ70（E3に対
応）への結合に殆ど拮抗せず、これらの配列は、部位間
の配列相同性からそう予想されるのだか、同じ因子とは
相互作用しないことを示す。 v.カツパーＬ鎖エンハンサーと結合する因子の同定 カツパーＬ鎖遺伝子の主要イントロン中にエンハンサ
ー成分が同定された。PicaidおよびSchaffnerはエンハ
ンサー活性は500bp Alu I−Alu I断片に位置すること
を示し、QueenおよびSlaffordは５′および３′境界を
限定してエンハンサーが大断片内の275bpに限定される
と考えられる。発明者らはこの領域をより小さい断片に
切断して蛋白結合部位の位置をゲル結合アツセイの方法
により各断片につきアツセイした。 Ｋエンハンサーの対応領域の制限地図を第13a図に示
す。黒い四角はChurchらによつてインビボでμエンハン
サー内の予想蛋白結合領域と同定された配列を表わす。 Dde IおよびHae IIIで切断して生成した断片（第13a
図のK1、K2、K3、K4およびK5）をいろいろな量のポリ
（dI、dC）、（dI、dC）を非特異的担体として添加して
結合をアツセイしたところ、K4およびK5は明かに陰性
（第13b図、１−８列）であり、K3およびK2は陽性（第1
3b図、10−12列、14−16列）であつた。予備的な結果、
内部断片はいずれも特異的な結合部位を含んでいない。
0.5−1ngの放射標識プローブで形成する核蛋白質複合体
バンドは３μｇの担体存在下でも検出できた（第13b
図、12、16列）。 検出されたバンドが蛋白とDNAの特異相互作用を表わ
していることを示すために拮抗実験を行なつた（第13c
図および13d図）。K2の拮抗パターンは以前にμ70で観
察したものと驚くほど類似していた：このK2に対して相
対的に多量のμ400、モロニー白血病ウイルスエンハン
サー、SV40エンハンサーまたはＫプロモーター（保存オ
クタを含有）は結合に拮抗せず、μ300およびＫエンハ
ンサーは拮抗した（データーは示していない）。K2は配
列比較により予想されるＥボツクスを含有する（μ70と
同様に）ことが同定されたのでその結合をμ300からの
小断片で拮抗した（第13c図）。複合体は非標識のμ70
をインキユベーシヨンに添加することにより特異的に拮
抗して消失し（３列および４列を２列と比較）たが、μ
60（５、６列）、μ170（７、８列）或いはSV40エンハ
ンサー（９、10列）とはしなかつた。さらに、この配列
と結合する蛋白は二つの連続したクロマトグラフイース
テツプ（ヘパリンアガロースおよびDEAEセフアロース）
でμ70結合活性と一緒に分画される。従つて同じ配列特
異的蛋白質がμ70およびK2に結合し、μおよびＫエンハ
ンサーの両者に相互作用する少なくとも一つの共通蛋白
質があると結論される。 K3複合体（第13d図で矢印の先で示す）はμ30（３お
よび４列を２列と比較）、μ400（５および６列を２列
と比較）によつてＫプロモーター含有断片（７および８
列を２列と比較）と同様拮抗されなかつた。しかしこの
複合体は完全なＫエンハンサー（９、10列）およびSV40
エンハンサー（11、12列）により特異的に拮抗された。
主要K3複合体の下のバンドは実験の違いにより種々の強
度で見られ、この実験で完全なＫエンハンサーによつて
も拮抗されなかつたのでこれ以上調べられていない。SV
40エンハンサーがこの因子の結合で特異的に拮抗するこ
とは、本断片とSV40エンハンサーが11ヌクレオチドの長
さで同一の配列を共有していることから驚くことではな
い。 本因子のK3断片上の結合部位をメチル化阻害実験によ
り位置決定した。二つの別の抽出物でこの配列内の４残
基中の３残基のメチル化により結合は完全に結合を阻止
した（第14図、１列［複合体］および２列［遊離］を比
較；および３列［複合体］と４列［遊離］を比較）。こ
の連続したＧのつながりはSV40エンハンサーとK3の間の
保存領域（GGGGACTTTCC）の一部を成している。従つて
結合部位はK3断片の片端の方向に位置している。この結
果は前にSV40エンハンサーで観察された特異拮抗を説明
する。興味深いことに、Ｋエンハンサーの欠失マツピン
グによりK3断片中の配列はエンハンサー機能に非常に重
要であることがわかつた。 本因子の組織範囲を各種細胞株からの抽出物でのK3と
の結合分析により調べた。K3との核蛋白複合体形成はマ
ウスＢ細胞株（第15a図、２列）でのみ検出され、他の
５株の非Ｂ細胞（第15a図、５−11列の奇数列）では検
出されなかつた。偶数列はμ50で検出される普遍的因子
はこれら全ての細胞株に存在することを示し、実験の陽
性対照となる。従つてKappa3因子はＢリンパ腫細胞での
発現に限定されているらしい。 次にＢ細胞の分化に於ける各段階での細胞から作成し
た抽出物を調べた（第15b図）。面白いことに、K3結合
蛋白はアベルソン（Abelson）ネズミ白血病ウイルスで
トランスフオームされたプレーＢ細胞株PD、二種のマウ
スＢ細胞株（WEH1231およびAJ9、第15b図、12、14
列）、一つのヒトＢ細胞株（EW、第15b図、16列）、マ
ウス骨髄腫株（MPC22、第15b図、18列）および二種ヒト
骨髄腫（KR12および8226、第15b図、20および22列）で
検出された。しかし、本因子はプレープレＢ細胞株（C
5、第15b図、４列）およびマウスプレＢ細胞株（HATF
L、38B9、70Z、第15b図、６、８、10列）には存在しな
いようである。従つて本因子は組織特異、即ち、Ｂリン
パ様系統細胞に限定されるだけでなく、その系統内で分
化段階特異である。調べた一連の抽出物で、この因子の
存在はＫ発現と驚くほど相関性がある。 Kappaエンハンサーでの結果は以下のように要約でき
る:Kエンハンサーの切断によりこのDNAと結合する二つ
の蛋白が検出された。そのうちの一つの蛋白は広く存在
してＨ鎖のμエンハンサーとも結合する。二番目の蛋白
はＢ細胞系統内で高度にステージ特異的に発現され、内
在Ｋ遺伝子が活性な細胞株でのみ検出できる。Ｈ鎖エン
ハンサー内にはその因子の結合部位が存在しないよう
で、SV40エンハンサーにはある。 等価 本技術に熟練した者は本明細書に記載する発明の特別
な態様の多くの等価を認識し、或いは単にきまつた手順
の実験により確認できる。そのような等価は添付の請求
の範囲に包含されるものである。
節するトランス型因子の存在は、リンパ細胞および非リ
ンパ細胞に導入したIg遺伝子組換え体の発現の解析から
予想されている。二種のＢ細胞特異性シス型転写調節因
子は既に固定されている。一つはＨ鎖およびKL鎖遺伝子
の可変部と恒常部領域の間のイントロンに存在し、転写
のエンハンサーとして作用する。もう一つはＨ鎖および
KL鎖両遺伝子のプロモーターの上流に見られる。この因
子はウイルスのエンハンサー存在下に於いてもリンパ球
特異転写を指示する。 マウスおよびヒトのＬ鎖プロモーターは開始点のおよ
そ70塩基対上流に８塩基配列、ATTTGCATを含んでいる。
Ｈ鎖プロモーターは同じ配列を同じ場所に逆方向に、AT
GCAAATを有している。この成分はＢ細胞中でIgプロモー
ターを有効に利用するために必要らしい。この成分が高
度の配列および位置を保存し、また見かけの機能を維持
していることにより、これが配列特異性転写因子と相互
作用していることが示唆されるが、まだそのような因子
は同定されていない。 発明の詳細な説明 本発明はIg遺伝子の転写調節に関与する遺伝子成分に
結合するヒトリンパ細胞核内因子およびそのような因子
の同定および単離の方法に関するものである。これらの
因子はIg遺伝子の転写調節に関係している。本発明はま
たその調節因子自体をコードする遺伝子およびリンパ細
胞またはハイブリドーマ細胞のようなリンパ球由来の細
胞を外因子をコードする遺伝子でトランスフエクトする
ことによりそれらの細胞に於けるIg遺伝子の転写を改良
する方法に関するものである。 リンパ細胞の核抽出物よりIg遺伝子の転写調節DNA成
分と結合する４種の異なる因子を同定し、単離した。そ
のうち２つの因子（IgNF−ＡおよびＥ）は構成的であ
り、他の２つ（IgNF−ＢおよびKappa−３）はリンパ細
胞特異的である。以下にそれぞれの因子を詳細に説明す
る。 IgNF−Ａ IgNF−ＡはネズミのＨ鎖およびKL鎖遺伝子プロモータ
ーの上流領域のDNA配列およびネズミＨ鎖遺伝子エンハ
ンサーに結合する。結合は配列特異性であり、恐らく三
つの全ての転写成分に存在する保存された配列モチー
フ、ATTTGCATによつて調節されている。IgNF−Ａと類似
の結合特異性を示す因子がヒトHeLa細胞にも存在してお
り、このことからIgNF−Ａが組織特異的でないかも知れ
ないと考えられる。 Ｅ Ｅは構成的因子でＬ鎖およびＨ鎖のエンハンサーに結
合する。 IgNF−Ｂ IgNF−ＢはIgNF−Ａと同じ配列特異性を示す；これも
ネズミＨ鎖およびKL遺伝子プロモーターの上流領域およ
びネズミＨ鎖遺伝子エンハンサーに結合する。しかしこ
の因子はリンパ様細胞特異であり、Ｂ細胞およびＴ細胞
に限定されている。 Kappa−３ Kappa−３はカツパＬ鎖遺伝子のエンハンサーのみに
結合する。これはＢ細胞に特異的であり、Ｂ細胞状態に
特異的と思われる。 これらの因子は改良DNA結合アツセイの方法により同
定し、単離した。アツセイは真核細胞での蛋白質とDNA
相互作用の分析に一般に応用できる。アツセイ実施に際
しては、目的のDNA成分またはその断片を含む。DANプロ
ーブを細胞の核抽出物とインキユベートする。インキユ
ベーシヨンは蛋白−DNA複合体を形成する条件下で行な
う。蛋白−DNA複合体を低イオン強度緩衝液を用いたポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により非結合DNAと分離
する。非特異的な複合体形成を最少限にするために抽出
物とDNAプローブの混合液に拮抗DNA種を添加することも
出来る。真核細胞を用いた本研究では競合DNA種として
二重鎖コポリマー、ポリ（dI−dC）、poly（dI−dC）を
添加することにより核蛋白−DNA複合体の検出感度を高
め、本明細書に記載する調節因子の検出を容易にした。 本発明はまた、転写調節に関与する４種の因子をコー
ドする遺伝子に関する。遺伝子の同定およびクローニン
グは従来より知られる技術により達成できる。例えば、
目的の因子は細胞の粗核抽出物より精製できる。次にそ
の蛋白質の一部を配列決定し、その配列の情報を基にオ
リゴヌクレオチドのプローブを作成し、それを用いてcD
NAライブラリーからその因子をコードする遺伝子を同定
する。 調節因子はコードする遺伝子は細胞に於ける転写を改
良するのに使用できる。例えば、Ig遺伝子の転写に関与
する正に作用するリンパ様細胞特異因子をIg−生産性細
胞に多コピーで挿入することによりIg生産を高めること
が出来る。組織特異性因子をコードする遺伝子を構成的
因子をコードする遺伝子と一緒に利用することも出来、
そのような組合せは必要かつ望ましいことがわかる。 図面の簡単な説明 第1a図はMOPC41 VKappa遺伝子断片の５′領域を図示
したものである；第1b図はMOPC41 VKappa遺伝子のSfaN
I−SfaN Iカツパプロモーター断片を用いたゲル電気泳
動DNA結合アツセイのオートラジオグラフを示す；第1c
図は重複するカツパープロモーター断片を用いたゲル電
気泳動DNA結合アツセイのオートラジオグラフを示す。 第２図はヒト（ａ）EWおよび（ｂ）HeLaの核抽出物の
結合拮抗分析のオートラジオグラフを示す。 第３図は因子−DNA複合体のDNase Iフツトプリント解
析の結果を示す。 第4a図はIgNF−Ａ結合部位の真のおよび推定のヌクレ
オチド配列を示し；第4b図は３種のIg転写調節成分の各
種DNAプローブを用いた結合アツセイのオートラジオグ
ラフである。 第5a図はMODC41のプロモーター領域のDNA配列を示
し、第5b図はヒトＢリンパ腫細胞株RAMOSおよびEW、並
びにHeLa細胞から作成した全細胞抽出物中で記載する鋳
型を用いて得られるRNA転写物のオートラジオグラフを
示す。 第６図は上流域での欠損を含む鋳型からのRNA転写物
のオートラジオグラフを示す。 第７図はＢ細胞核抽出物のMOPC−41Kプロモーター領
域との結合のラジオオートグラフで、IgNF−ＡおよびIg
NF−Ｂ複合体を示している。 第８図はＴ細胞および非リンパ様細胞の核抽出物のMO
PC−41Kプロモーター領域への結合を示す。 第9a図はμ−エンハンサーの制限酵素地図を示し、第
9b図はμエンハンサー断片を用いて行なつたオートラジ
オグラフ結合アツセイを示す。 第10a図はμ300断片の制限酵素地図を示し、第10b図
はμ300の各種小断片により形成する複合体を示し、第1
0c図および10d図は小断片μ70を用いた拮抗結合アツセ
イを示す。 第11a図および第11b図はメチル化阻害法によるμ50お
よびμ70中の結合部位の位置を示し、第11c図はこれら
の結果のまとめを表わす。 第12図はＢ細胞およびＢ細胞以外の抽出物中でμ70を
用いて形成した結合複合体のオートラジオグラフを示
す。 第13a図はカツパーエンハンサーの制限酵素地図を示
し；第13b図はカツパーエンハンサー断片を用いた結合
アツセイのオートラジオグラフを示し；第13c図および1
3d図はカツパーエンハンサー断片での拮抗アツセイのオ
ートラジオグラフを示す。 第14図はメチル化阻害実験によるKappa−３結合の位
置を示す。 第15a図は各種リンパ様および非リンパ様細胞中でのK
appa−３の結合分析を示し；第15b図はＢ細胞分化の種
々の段階に於ける細胞中でKappa−３の結合分析を示
す。 発明を実施する最適な方法 本明細書に記載される転写調節因子は大きく分類して
構成的なものと組織（リンパ）特異的なものとに分けら
れる。全ての因子はIg遺伝子の転写に役割を果すと考え
られる。構成的因子は非リンパ様細胞中にも見られるこ
とから、他の遺伝子の転写にも役割を有するかも知れな
い。 構成的因子が存在することで組織特異性の因子の検出
がより困難となつた。検出を容易にするために以下に記
載する高感度のDNA結合アツセイを全ての実験に用い
た。 転写調節因子IgNF−Ａ、Ｅ、IgNF−ＢおよびKappa−
３の性状を次の表にまとめる。 表に示すようにIgNF−ＡはマウスＨ鎖およびカツパー
Ｌ鎖遺伝子プロモーターの領域のIg調節DNA成分に結合
し、さらにマウスＨ鎖遺伝子エンハンサーにも結合す
る。DNase Iフツトプリント分析の結果、この結合はマ
ウスおよびヒトＬ鎖遺伝子のプローモーター中の開始点
からおよそ70塩基対上流に、またＨ鎖遺伝子プロモータ
ーのほぼ同じ位置（逆向き配列で）に存在する８塩基
（オクタマー）配列（ATTTGCAT）により仲介されること
がわかる。 IgプロモーターのIgNF−Ａ結合部位の欠損または破壊
によりインビボでの正しく開始した転写物の量が有意に
減少する。Y.Bergmanら、PNAS USA 81巻、7041−7045
頁（1984年）、J.O.Masonら、Cell41巻、479−487頁（1
985年）を参照のこと。以下に示すように（例を参照）
これをインビトロの転写系でも起る。IgNF−Ａは正に作
用する因子と考えられる。 IgNF−Ａ結合部位はＢリンパ球特異のIgプロモーター
の機能上の構成部分にあると思われる。例えば、IgNF−
Ａ結合部位を含むこのプロモーターからの配列はＢ細胞
では正確な転写を指定するがHeLa細胞では行なわない。
しかしHeLa細胞抽出物中にも同じような移動度および配
列特異性（拮抗分析により試験）を有する複合体を形成
する因子が検出されたことより、IgNF−ＡはＢ細胞にの
み限定されないかも知れない。興味深いことに、IgNF−
Ａ結合部位のIgオクタマーモチーフが脊椎動物U1および
U2 sn RAN遺伝子の上流（およそ−225bp）領域にも存
在することが最近明かとなつた。さらに重要なことに、
この成分がアフリカツメガエルの卵母細胞に於るU2 sn
RNA遺伝子の転写を劇的に促進する（20から50倍）。
従つてIgNF−Ａは脊椎動物細胞中でのU1およびU2 snRN
A遺伝子の高レベル発現にも作用する構成的活性化蛋白
質かも知れない。 IgNF−Ａ結合部位がマウスＨ鎖エンハンサー中にも存
在することはIgNF−Ａがさらにエンハンサー機能にも関
与することを示唆している。予想される結合部位を含む
エンハンサーの80bp領域を欠失させるとエンハンス活性
をおよそ10倍低下させることが知られている。インビボ
での結合部位の占有は、エンハンサーのオクタマー中の
Ｇ残基がＢ系統の細胞中でのみジメチル硫酸修飾から防
御される事実から示唆される。さらに、IgNF−Ａはやは
りIgオクタマーモチーフを含有するSV40エンハンサーと
も配列特異的に結合する（J.Weinberger、私信）ことか
ら、本因子がエンハンサー機能にも関与している可能性
が益々高い。 Ｅ因子はIgL鎖およびＨ鎖のエンハンサーと結合する
構成的因子である。 IgNF−Ｂ因子はIgNF−Ａと同じ調節成分と結合する。
事実IgNF−Ｂの結合部位はオクタマーモチーフと思われ
る。IgNF−Ａとは反対にIgNF−Ｂはリンパ様細胞特異性
である。この因子はプレＢ、成熟Ｂおよび骨髄腫細胞株
の核抽出物およびＴ細胞リンパ腫のあるものの核抽出物
に検出された。IgNF−Ｂはいくつかの非リンパ様細胞の
核抽出物には検出されなかつた。 Kappa−３はIgL鎖エンハンサーにのみ結合する。この
因子はリンパ様細胞特異である。Kappa−３はまたリン
パ様状態特異的であり、成熟Ｂ細胞のみにより発現され
る。この場合、Ｂ細胞成熟化のマーカーである（本因子
はＢ細胞リンパ腫のタイプ分けに使用できる）。 上述の転写調節因子はゲル電気泳動DNA結合アツセイ
の高感度改良法を用いて細胞の核蛋白抽出物中に同定さ
れた。この改良アツセイはゲル電気泳動の過程で蛋白−
DNA複合体の移動度変化に基づくアツセイ法の改良法で
ある。原法のアツセイは精製した原核細胞遺伝子調節蛋
白質の平衡およびキネテイツクス解析に広く応用されて
きた。M.FriedおよびD.M.Crothers,Nucleic Acid Res.
9巻、6505−6525（1981年）;M.M.GarnerおよびA.Revzi
n,NucleicAcids Res.9巻、3047−3060頁（1981年）など
参照。さらに最近、この方法は真核細胞（サルの細胞）
の核抽出物からサテライトDNAと結合する蛋白質を同定
し、単離するのに使用された。R.StraussおよびA.Varsh
ausky,Cell、37巻、880−901頁（1984年）参照。後者の
研究ではより多く存在して非特異的にDNAと結合する蛋
白質を結合させるために異種の拮抗DNA（E.coli）を過
剰に加えている。 本発明の改良法アツセイでは単純な交互のコポリマ
ー、二重鎖ポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）を拮抗DNA
種として用いた。拮抗剤としてこのコポリマーを使用し
た結果、核蛋白質−DNA複合体の検出感度が高まつた。 アツセイはポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）の添加以
外は本質的にStraussおよびVarshasky（上述）により記
載されるように行なう。核蛋白質抽出物は、例えばJ.D.
Dingnam,Nucleic Acids Research11巻、1475−1489頁
（1983年）の方法により調製される。抽出物を核蛋白質
との結合をテストしようとする放射標識したDNAプロー
ブとインキユベートする。インキユベーシヨンは生理的
緩衝液中でポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）拮抗剤の存
在下で実施する。DNA−蛋白複合体は低イオン強度緩衝
液中でポリアクリルアミドゲルの電気泳動を用いて未結
合DNAプローブと分離し、オートラジオグラフイーによ
り検出する。 好ましい態様では蛋白試料（およそ10μｇ蛋白質）を
およそ10,000cpm（約0.5ng）の末端標識32P−二重鎖DNA
プローブ断片とおよそ0.8−4ngのポリ（dI−dC）−ポリ
（dI−dC）（フアルマシア）の存在下で最終容量およそ
25μにてインキユベートする。インキユベーシヨンは
30℃で30−60分間10mMトリス塩酸（ph7.5）、50mM NaC
l、1mM DTT、1mM EDTA中で行なう。蛋白−DNA複合体は
低イオン強度ポリアクリルアミドゲルにより分離する。
試料を低イオン強度の４％ポリアクリルアミドゲル（0.
15×16cm;アクリルアミド：ビスアクリルアミド重量比3
0:1）上に層でチヤージする。ゲルは先ず6.7mMトリス塩
酸（pH7.5）、3.3mM NaOAcおよび1mM EDTAより成る緩衝
液中11v/cmで30分間予備泳動する。緩衝液は槽内を還流
させる。ゲルを同じ電圧で室温にて電気泳動にかけ、ウ
アツトマン3MM紙に移し、乾燥してオートラジオグラ
フイーを行なう。 アツセイの感度が高まつたことは最初の実験で示さ
れ、IgNF−Ａ因子の同定が出来た。MOPC41カツパーＬ鎖
遺伝子の上流領域（第1a図）に由来する放射標識したSf
aN I−SfaN I DNA断片をヒトＢ細胞株の核抽出物とE.c
oli染色体DNAまたはポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）の
存在下、非存在下でインキユベートした。生成した複合
体を低イオン強度で失活させない状態でポリアクリルア
ミドゲルの電気泳動により遊離断片と分離し、オートラ
ジオグラフイー（第1b図）により検出した。拮抗DNAの
非存在下では全ての標識断片はゲルの上端に集まつてお
り（１列目）、これは恐らく過剰な非配列特異性蛋白質
との結合によるものと思われる。ポリ（dI−dC）−ポリ
（dI−dC）（２列から６列）或いはE.coli染色体DNA
（７−11列）の量を増加して添加すると遊離断片より遅
く移動する予想蛋白−DNA複合体が検出された。複合体
の主要種（Ｂ）および少量種の相対存在比は交互コポリ
マー拮抗DNAの存在下の方が有意に高い。 コポリマー拮抗ポリ（dI−dC）、ポリ（dI−dC）と併
せた高感度ゲル電気泳動DNA結合アツセイの使用により
本明細書に記載する調節因子の同定が容易となつた。単
純な交互コポリマーは異種配列DNAよりも配列特異因子
の結合に対して低程度に拮抗するためにアツセイの感度
を有意に増加している。本アツセイは哺乳動物遺伝子調
節蛋白質の解明に一般に応用される。 本アツセイの感度をさらに増すために粗抽出物中で非
特異結合の関与を最少とするように小さいDNAプローブ
（およそ100bpまたはそれ以下）を使用する。 本アツセイを用いて蛋白−DNA相互作用の配列特異性
を調べるため結合拮抗テストを実施できる。そのために
は、蛋白因子への拮抗結合を試験しようとする無標識DN
A断片を蛋白抽出物と標識DNAプローブ（ポリ（dI−dC）
−ポリ（dI−dC）と一緒に）のインキユベーシヨン混合
液に添加する。蛋白−DNAプローブ複合体の消失または
低下はその無標識断片が蛋白因子の結合に拮抗すること
を示す。さらに、プローブ配列に対する蛋白の相対的な
結合親和性は種々の濃度で拮抗物の蛋白を置きかえる能
力を調べることによりアツセイできる。 拮抗アツセイと共に、DNase Iフツトプリント分析
（D.GalasおよびA.Schmitz,Nucl.Acids Res.5巻、3157
−3170頁（1978年）および後述の例を参照）およびメチ
ル化阻害実験（例えばA.Ephrussiら、Sciencu227巻:134
−140頁（1985年）参照）を用いて蛋白因子の結合領域
の詳細な解析が出来る。 これらの因子の転写調節に於ける機能的役割はいくつ
かの方法で確認できる。リンパ様細胞因子に関しての好
ましい技術はリンパ様細胞系統の細胞から開発したイン
ビトロの転写系を使用する。本系については後に示す例
の中で詳細に記載する。因子の機能はこの系で因子の結
合部位を欠失する鋳型を転写に用いることにより直接確
認できる。既に述べたとおり、MOPC41カツパー遺伝子の
cap部位から上流−44と−79bpの間に位置する配列の欠
失は本系での転写を阻害する（これはインビボ系でも観
察されている）。欠失領域中にIgNF−Ａの結合部位が存
在する。このことは鋳型の転写は因子−結合部位に、恐
らく因子自体に依存していることを示す。 因子の機能を確認する直接的な方法は適当な鋳型を用
いたインビトロの転写系で転写が因子の除去および置換
によつて調節されることを示すことである。例えば、天
然のMOPC41Kプロモーター遺伝子をインビトロの系で鋳
型として用い、この鋳型の転写を因子（例えばリンパ特
異因子のIgNF−Ｂ）の存在下および非存在下で確認でき
る。因子はリンパ様細胞抽出物よりクロマトグラフイー
分画により除去してから置き変える。もし非存在下で転
写の程度が低下し、因子を添加することにより回復する
のであれば転写に於ける因子の関与が直接示されること
になる。 同定される調節因子をコードする遺伝子を単離し、ク
ローニングすることが出来る。これは二つの一般的な方
法のいずれかにより達成できる。第一の方法では因子を
クロマトグラフイーで精製する。例えばイオン交換、ゲ
ル過およびアフイニテイクロマトグラフイー、或いは
これらの組合せを用いる。因子が十分に精製されればそ
の一部の配列を決定し、配列のデータからオリゴデオキ
シヌクレオチドプローブを作成してそれを用いてcDNAラ
イブラリーより因子をコードする遺伝子を同定する。 もう一つの方法は、精製した因子または濃縮した因子
に対する抗血清を形成させる。抗体を用いてその因子を
発現することがわかつている細胞のcDNAライブラリーで
因子の発現を同定する。 正の調節因子をコードする遺伝子は遺伝子発現を高め
る手段を提供する。Ig遺伝子転写の正の調節に関与する
リンパ特異因子はリンパ様細胞での免疫グロブリン生産
を増加させる方法を提供するかも知れない。モノクロー
ナル抗体を生産するハイブリドーマのようなリンパ様細
胞は調節因子をコードする遺伝子の多コピーでトランス
インフエクシヨンしてIg生産を高めることができる。こ
のためには調節因子をコードする遺伝子に強いプロモー
ターを連結する。（構築には選択マーカーも組込むよう
に設計する）。構築物の多コピーをエレクトロポレーシ
ヨンのようなトランスフエクシヨン手法により細胞に挿
入する。一個の細胞を構成的因子を含む複数個の因子で
トランスフエクシヨン出来、その場合に因子は協調して
作用することがわかつた。このようにして因子の遺伝子
を増幅することにより、トランスフエクトされた細胞で
調節因子の過剰生産が誘導され、その結果免疫グロブリ
ンの生産が増加する。 本発明はさらに以下の例により説明される。 例 I.核内因子IgNF−Ａの同定 A.方法 1.SfaN I−SfaN I Ｋプロモーター断片とのゲル電気泳
動DNA結合アツセイ SfaN I断片をpS64（pSPIgVk、N.Speckにより供与）の
Sma I部位にサブクローニングした。結合分析にはpSPIg
VkをHind IIIおよびEcoR Iで消化してこの断片を切り出
した。後の二つの部位はpSP64のポリリンカー中のSma I
部位をはさんでいる。［-32P）dATPおよびE.coli DNA
ポリメラーゼＩの大断片で末端標識した後、放射標識断
片をポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離した。
結合反応を行ない、反応液を電気泳動で分離した（第1b
図）。32P−標識断片（およそ0.5ng、10,000cpm）をヒ
トＢリンパ腫細胞株（EW）（J.D.Dignamら、Nucl.Acids
Res.11巻、1475−1489頁（1983年）の方法により調
製）の核抽出物と二つの非特異拮抗DNAの存在下（２−1
1列）または非存在下（１列）でインキユベートした。
結合反応液は（25μ）は10mMトリス塩酸（pH7.5）、5
0nM NaCl、1nM DTT、1mM EDTA、５％グリセロールお
よび８μgEW核抽出蛋白を含有した。２−６の反応はそ
れぞれ800、1600、2400、3200および4000ngのポリ（dI
−dC）−ポリ（dI−dC）をさらに添加した。７−11の反
応はそれぞれ300、600、900、1200および1500ngのHinf
I消化E.coli染色体DNAを含有した。室温で30分間インキ
ユベートした後、生成した複合体を低イオン強度の４％
ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリ
ルアミド重量比30:1）で6.7mMトリス塩酸（pH7.5）、3.
3mM酢酸ナトリウムおよび1mM Na−EDTA中分離した。F.S
traussおよびA.Varshavsky,Cell、37巻、889−901頁（1
984年）参照。ゲルを11V/cmで30分間予備泳動した。電
気泳動は同じ電圧勾配で室温にて90分間、緩衝液を循環
して行なつた。泳動後ゲルを乾燥し、−70℃でスクリー
ンを用いてオートラジオグラフイーにかけた。第1b図で
ＦおよびＢはそれぞれ遊離および結合断片の位置を示
す。 結合アツセイは2400ngのポリ（dI−dC）−ポリ（dI−
dC）および次のDNA断片を用いて上に説明したように実
施した:K SfaN I−SfaN I（0.5ng、10,000cpm、１
列）、Ｋ Pvu II−Kpn I（0.5ng、10,000cpm、２
列）、Ｋ Pvu II−SfaN I（0.1ng、5000cpm、３列）お
よびpSP64 Pvu II−EcoR I（0.2ng、5000cpm、４
列）。KPvu II−SfaN I断片はプラスミドpSPIgVkをPvu
IIおよびEcoR Iで消化して得られた。EcoR I部位はポリ
リンカー内に存在し、従つて本断片は16bpのポリリンカ
ー配列を含有する。 2.ヒトEWおよびHeLa細胞の核抽出物での結合拮抗分析 EW核抽出物、第2a図。結合アツセイは放射標識のKPvu
II−SfaN I断片（0.1ng、5000cpm）および2400ngのポ
リ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）を用いて上述のとおり行
なつた。２−４の反応はさらにそれぞれ50、100および2
00ngのバクテリア性プラスミドpSP64を、５−７はそれ
ぞれ50、100および200ngの組換えプラスミドpSPIgVKを
含有した。pSPIgVKの一分子が高親和性の部位１個を有
し、pSP64（3000bp）の一分子が3000個の非特異部位を
持つと仮定すると、これら二つの部位に対する因子の見
かけ上の親和性の比は3000×200/50＝1.2×104以上であ
る。 HeLa核抽出物、第2b図。結合アツセイは放射標識のＫ
Pvu II−SfaN I断片（およそ0.1ng、5000cpm）、2400
ngのポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）および６μｇのHe
La核抽出蛋白（P.Grabowskiより供与）を用いて上述の
とおり実施した。反応１および２はさらにそれぞれ100n
gのpSP64およびpSPIgVKを含有した。 3.因子−DNA複合体のDNaseフツトプリント（第３図） Ｂ細胞の核抽出物を10nM Hepes、pH7.9、20％グリセ
ロール、1mM DTT、1mM EDTA、5mM MgCl2および0.1M
KClで平衡化したヘパリン−セフアロースカラムにかけ
る。Ｋ−プロモーター結合因子は0.25M KClの段階で溶
出した。この分画（30μ）との結合反応は2.5mM MgCl
2、KPvu II−SfaN I（1ng、100,000cpm）および4800ng
ポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）を添加した前述の反応
液成分中で行なつた。Ｋプロモータープローブのコード
鎖はE.coli DNAポリメラーゼの大断片を用いて
［-32P］dATPで３′末端（EcoR I部位）標識した。反応
１はＢ細胞核蛋白の非存在下でDNase I（５μg/ml）で
室温2.5分間消化した。反応２は先ずEW核内因子のヘパ
リンセフアロース画分（14μｇ蛋白質）と室温で15分間
インキユベートし、次にDNase Iで上記と同様に消化し
た。核反応はEDTA（5mM）で終結させ、生成物を既に述
べたようにそのままのポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分離した。オートラジオグラフイーにより種々の
生成物を検出してからDNAを遊離（反応１）および結合
（反応２のB1およびB2）断片のバンドからゲル片を0.5M
酢酸アンモニウム（pH7.5）、0.1％SDSおよび1mM EDTA
中37℃で一晩振とう下でインキユベートして溶出した。
上澄液を順番にフエノール−クロロホルム−イソアミル
アルコール（25:24:1、v/v）およびクロロホルム−イソ
アミルアルコール（24:1、v/v）で抽出し、担体RNAの存
在下で２倍容量のエタノールで沈でんさせた。再沈でん
の後、生成物を8M尿素存在下で10％ポリアクリルアミド
ゲル（20:1）で分離して分析し、−70℃でスクリーンを
用いてオートラジオグラフイーを行なつた。１列は反応
１からの遊離断片消化の生成物を示す。２列と３列は反
応１からのそれぞれ結合バンドB1およびB2から溶出した
消化生成物である。１′、２′および３′列はそれぞれ
１、２、および３列に対応し、ただ前のセツトはDNase
Iで５分間消化されている。Ｋプロモータープローブの
Ａ−Ｇ化学切断ハシゴを同時に電気泳動にかけて結合領
域をマツピングした。A.MaxamおよびW.Gilbert.Meth.En
zymol.65巻、499−525頁（1980年）参照。 4.共通の核内因子の三つのIg転写制御成分への結合 真の並びに予想される結合部位のヌクレオチド配列、
第4a図。VL結合部位をDNase I阻害アツセイにより決定
する（＊印は保護領域の境界を示す）。VHおよびJM−CU
配列はそれぞれＶ17,2,25プロモーターおよびマウスＨ
鎖エンハンサー中の予想される結合部位である。カツコ
内の数はオクタマーモチーフの開始位置を示す。結合拮
抗、結アツセイ（10μ）は上記記載のとおりに、1600
ngのポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）およびEW核内因子
のヘパリンセフアロース画分（1.5μｇ蛋白）を用いて
行なつた。VLプローブ（およそ0.1ng、5000cpm）１−
３、10、11列。VHプローブ（0.2ng、5000cpm）４−６、
12−12列。JH−CHプローブ（0.2ng、5000cpm）、７−
９、14、15列。２、５および８列はさらに5ngのVLプロ
モーターオリゴマー（36bp、MOPC−41 VK遺伝子断片の
−81から−44の位置）を含み、３、６および９列は50ng
の同じオリゴマーを含有した。11、13および15列はさら
に50ngのJH−CHオリゴマー（41bp、Ｈ鎖エンハンサーの
−１から40の位置）を含有した。相補一本鎖合成オリゴ
ヌクレオチドはRonald Mertz博士、Genzentrum der Uni
versitat MunchenおよびE.L.Winnacker博士、Institut
fur Biochemie der Universitat Munchenにより作成さ
れた。それらは使用前にアニーリングして結合アツセイ
の拮抗基質とした。 B.結 果 MOPC41カツパーＬ鎖遺伝子の上流域（第1a図）由来の
放射標識SfaN I−SfaN I DNA断片をヒトＢ細胞の核抽
出物と２種の拮抗DNAの存在および非存在下でインキユ
ベートした。生成した複合体を低イオン強度、無変性ポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動により遊離断片と分離
し、オートラジオグラフイーにより検出した（第1b
図）。拮抗DNA非存在下では標識断片の全てがゲルの上
端に留まり（１列目）、これは恐らく過剰な非配列特異
性蛋白との結合のためであると思われる。拮抗物として
ポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）（２−６列目）または
E.coli染色体DNA（７−11列目）を量を変化して添加す
ると、遊離断片よりゆつくり移動する蛋白−DNA複合体
と予想されるものが検出された。主要複合体（Ｂ）およ
び少量の複合体種の存在比は交互コポリマー拮抗DNAの
存在時に有意に増加した。この単純コポリマーの添加が
アツセイの感度をかなり高めたので、以後の結合分析で
は全てこれを使用した。 結合アツセイで検出された主要複合体の配列特異性を
試験するため、互いに重複するカツパープロモーター断
片（第1a図のSfaN I−SfaN I、Pvu II−Kpn IおよびPvu
II−SfaN I参照）およびバクテリア性プラスミドSP64
由来の同じ位の長さの断片（EcoR I−Pvu II）を個々に
アツセイした（第1c図）。バクテリアのDNA断片は全く
結合が認められないのに対し（４列目）、カツパープロ
モーターの全ての断片が同じ移動度の重要複合体種を生
成した（１−３列）、異なる長さの断片プローブ（75−
300bp）で形成した一連の複合体の移動度はおよそ同じ
であつた（データーは示していない）。従つてこれらデ
ーターは特異核内因子がカツパープロモーター断片の重
複領域に結合することを示唆している。この領域内には
保存されたオクタマー配列が含まれるがTATA成分はな
い。最も短かい75bpのカツパープロモーター断片では
（３列目）ゲルの上端に標識は見られない事が注目され
る。従つて、最近明かにされたように、短かいプローブ
断片を使用することで特異的蛋白−DNA複合体の検出感
度が高まる。 コポリマーおよび小断片プローブの使用により感度が
増加したことから二つの複合体、B1およびB2（第2a図の
１列目）が検出された。主要種B1が前の図のＢに相当す
る。因子のカツパープロモーターDNAに対する相対親和
性を拮抗アツセイにより測定した（第2a図）。上述のイ
ンキユベーシヨンに対照のプラスミド（pSP64）を添加
しても試験した濃度範囲で結合を拮抗しなかつた（２−
４列）のに対し、組換えプラスミド（pSPIgVK）は同じ
濃度範囲でB1およびB2の両種の複合体形成を低下させた
（５−７列）。後者のプラスミドはカツパープロモータ
ーの上流域をpSP64に挿入して作成した。pSPIgVKプラス
ミドが一個の高親和性結合部位を含有すると仮定すれ
ば、B1およびB2に関与する核内因子は異種プラスミドDN
Aよりも同系配列に対して104倍の高い親和性を有すると
考えられる（上述の方法の部の２を参照）。 B1およびB2形成に必要な因子がＢリンパ球に特異的か
どうかを調べるために、ヒトHeLa細胞由来の核抽出物を
カツパープロモーターとの結合につきアツセイした（第
2b図）。HeLa抽出物でも（１列目）Ｂ細胞抽出物で見ら
れたと同じ程度のB1およびB2両種が生成した。さらに、
両者共pSPIgVKプラスミド（２列）により特異的に拮抗
した。従つてHeLa細胞もカツパープロモーター上流域に
特異的に結合する因子を含有する。 複合体B1およびB2に存在する因子の結合部位をより高
分解能で観察するためにDNase Iフツトプリント分析を
使用した。この実験を容易にするためにＢ細胞からの因
子を核抽出蛋白のヘパリンセフアロースカラムクロマト
グラフイーにより部分精製した。大部分の結合活性は0.
25M KClの分画に溶出され、およそ５倍精製された（デ
ーターは示していない。第３図の説明参照）。フツトプ
リント分析には部分精製した因子をカツパープロモータ
ープローブとインキユベートした後にDNase Iを添加
し、B1およびB2種は遊離断片とポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分離した。B1およびB2バンドより結合DN
Aを溶出し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調
べた（第３図、２、３および２′、３′列）。Ｂ細胞蛋
白非存在下のカツパープロモータープローブのDNase I
消化（１および１′列）およびATC化学分解ラダーも同
時に泳動して結合部位のマツピングを行なつた。B1複合
体の因子（２および２′列）はコード鎖上の19ヌクレオ
チド領域を保護するようである。保護された部分の５′
および３′境界位置は転写開始部位からそれぞれ−72お
よび−52とマツプされる。C.QueenおよびD.Baltimore,C
ell32巻、741−740（1983年）。DNase I保護領域は保存
オクタヌクレオチド配列、ATTTGCATの辺りを中心として
おり、この配列が核内因子によるIgプロモーターの認識
に重要であることを示唆している。B2複合体も本質的に
B1と同じDNase I保護パターンを示し、従つてさらに加
えてのDNA関連が伴なわないと考えられる（３および
３′列）。この結果の単純な解釈はB2複合体がB1複合体
に関与する蛋白質の蛋白−蛋白相互反応による二量体形
成により生成されるというものである。もう一つの解釈
としては、B2複合体がB1複合体に関与する因子にもう一
つ違う蛋白が結合して生成するか、或いは異なるDNA結
合蛋白質が同じ配列を認識することにより生成するかで
ある。 オクタマー配列モチーフはＬおよびＨの両鎖遺伝子プ
ロモーターおよびマウスおよびヒトＨ鎖遺伝子のエンハ
ンサー成分に存在するので、マウスＨ鎖プロモーター
（VH）およびマウスＨ鎖エンハンサーからの断片に対す
る因子の結合アツセイを実施した。VHプロモーター断片
はＶ17,2,25遺伝子の５′領域に由来し、転写開始部位
を基準に−154から＋57の間のヌクレオチドを含んでい
る。R.GrosschealおよびD.Baltimore,Cell41巻885−897
頁（1985年）。このプロモーター内で保存オクタヌクレ
オチドは−57から−50の位置を占める（第4a図）。Ｈ鎖
エンハンサー断片は胚細胞株JHCU領域に由来し、エンハ
ンサー機能領域と考えられている313bp中の81から251を
含んでいる。T.Banergiら、Cell33巻、729−740頁（198
3年）。上記断片中で保存オクタヌクレオチドは166から
173に位置する（第4a図）。Ｂ細胞ヘパリンセフアロー
ス画分（カツパープロモーター配列との結合を基に精製
した。第4b図１列）はVHプロモーター断片（４列）およ
びエンハンサー断片（７列）の両方に結合することがわ
かった。三つの断片と形成した複合体の移動度は非常に
類似し、共通の因子との結合と一致する。さらに、これ
らの断片との結合はMOPC41カツパーＬ鎖遺伝子プロモー
ターのオクタヌクレオチドモチーフを含む合成二重鎖40
マーにより特異的に拮抗された（１−９列）。オクタヌ
クレオチドモチーフを欠失するマウスＨ鎖エンハンサー
領域からの配列を含有する同じ長さのオリゴマー（第4b
図）は同じ濃度範囲で結合を拮抗しなかつた（10−15
列）。この拮抗分析の結果はさらに、共通の核内因子
（IgNF−Ａ）が三つ全てのIg転写成分と結合することの
示唆を強める。前に述べたように、これらの三つの転写
成分は同一の配列モチーフであるATTTGCATを共通に有す
る（第4a図）。従つて共通の核内因子の結合がこのモチ
ーフにより仲介されていることはほぼ確実である。 II.Ig遺伝子のインビトロ転写の上流配列への依存性 A.方 法 第5a図：鋳型 欠失５′５および５′７については既に
記載した。Y.Bergmanら、PNAS USA81巻、7041頁（1981
年）参照。配列決定されたＨ鎖およびＬ鎖の可変部領域
遺伝子の上流に見られる高度に保存されるオクタヌクレ
オチド配列を四角に囲つた（“OCTA"と表示）。これは
“TATA"ボツクスよりおよそ30塩基対上流に位置してい
る。プラスミドpKおよびｐΔＫを５′Δ５および５′Δ
７の５′末端を合成リンカーを用いてHind III部位に変
え、JK−CK主要イントロン中のBgl IIまでの断片をHind
IIIおよびBamH Iで消化したpUC−13にクローニングし
て構築した。pKEKおよびpKEKはＨ鎖エンハンサーのカツ
パーエンハンサーのいずれかをpKの特有なHind III部位
にクローン化されて含有している。エンハンサーとして
使用した断片JK−CKイントロン（E.E.Maxら（1981
年）、J.Biol.Chem.256巻、5116頁）からの800bp Hind
III−Mb0 II断片およびJH−CKイントロンからの700bp X
ba I−EcoR I断片である。S.D.Gilliesら、Cell33巻;71
7頁（1983年）;J.Banjerjiら、Cell33巻、729頁（1983
年）。第5b図；ヒトＢリンパ腫細胞株RAMOS（１、２
列）およびEW（３、４列）から作成した全細胞抽出物で
の転写;HeLa全細胞抽出物（５、６列）。予想される2.3
kbの流出転写物を表示した。 細胞株RAMOSおよびEWを10％の不活化仔ウシ胎児血清
含有のRPMI培地中で細胞濃度が５−８×105/mlとなるま
で増殖させる。全細胞抽出物をManlyらの方法、PNAS U
SA 77巻、3855頁（1980年）、に従つて作成し、最終蛋
白濃度がおよそ18mg/mlであつた。流出転写反応は反応
液20μ中30℃で60分間行なつた。典型的な反応液は９
μ（160μｇ）の全細胞抽出物、50μＭの各ATP、CTP
およびGTP、0.5μM UTP、10uCiのａ−32PUTP（NEG 007
X、7600Ci/mM）5mMのクレアチンりん酸、0.3mg/mlのク
レアチンホスホキナーゼ（シグマ）、12mM Hepes7.9、1
2％グリセロール、60mM KCl、5mM MG++1mM EDTA、0.
6mMのDTT、鎖状鋳型（およそ50ng）および非特異担体と
してのポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）（およそ400n
g）を含有する。反応は20μの停止緩衝液（7M尿素、1
00mM LiCl、0.5％SDS、10mM EDTA、250μg/ml tRNA、
10mMトリス（pH7.9））を添加して停止し、フエノー
ル；クロロホルム；イソアミルアルコール（1:1:0.05）
で２回、クロロホルムで一回抽出し、エタノールで沈で
んする。RNAをグリオキサールで処理し、10mMりん酸ナ
トリウム（pH6.8）、1mM EDTA中で1.4％アガロースゲ
ルの電気泳動で分析した。Manleyら、上述、を参照。次
にゲルを乾燥し、増幅スクリーンを用いて−70℃でオー
トラジオグラフイーを行なつた。 第６図：予備インキユベーシヨンパルスチエース手法
を用いたＢ細胞抽出物中のインビトロ転写に対する上流
欠失５′７の影響。野生型プロモーター（１列）または
不完全なカツパープロモーター（２、３列）を含む鋳型
を用いて得られる転写物。４−６列：野生型プロモータ
ー（４列）または不完全なカツパープロモーター（５−
６列）を含む閉環環状鋳型を用いたインビトロ転写。こ
れらの反応ではアデノウイルス主要後期プロモーター
（MLP）を含む閉環環状鋳型50ngを内部標準として入れ
た。カツパー鋳型またはアデノウイルム鋳型に特異な転
写物をそれぞれKappaおよびMLPと表示してある。主要後
期プロモーターを含む鋳型にはプラスミドpFLBHを用い
た。プラスミドはpBR322のBamH IおよびHind III部位の
間に挿入してアデノウイルスの14.7から17.0マツプ単位
の配列を含有し、A.FireおよびM.Samuelsの好意による
提供物である。 線状またはスーパーコイル状の鋳型（50ng）を９μ
（およそ150μgm）のEW抽出物、６％（重量／容量）ポ
リエチレングリコール20,000および第5b図に記載される
ヌクレオチド以外の全ての成分を含む20μの容量中で
30℃60分間インキユベートした。転写はヌクレオチドお
よび放射活性UTPを以下の最終濃度で添加することによ
り開始した:ATP、CTPおよびGTPを各60uMおよび1uMのUTP
および10nCiの-32P UTP（NEG007X、600Ci/mM）。開始
パルスは30℃10分間維持した後、大過剰の無標識ヌクレ
オチドで10分間チエースした。チエース中の最終濃度は
以下のとおりである:ATP、CTP、GTPが330μＭでUTPが1m
M。反応を停止し、処理して連続転写物を前述のように
分析した。転写物の開始点のマツピングは以下の通りに
行なつた：閉環環状鋳型から生成した転写物を20μの
HE（50mM Hepes、pH0.7、1mM EDTA）にとり、10μを
用いてハイブリダイゼーシヨン選択を行なつた。カツパ
ーRNAに相補的なハイブリダイゼーシヨン用鋳型をMOPC4
1遺伝子のCAP部位を含むPva II−Sau3A断片（Queenおよ
びBaltimore,Cell33巻、741頁（1983年））をM13フアー
ジMP9にクローニングして構築した。一本鎖フアージDNA
を調製し、塩化セシユウムの密度勾配遠心分離により精
製した。MLP特異の転写物はA.FireおよびM.Samuelsによ
り提供されたM13クローンXH11を用いて検出した。ハイ
ブリダイゼーシヨンは750mM NaClおよび100−200μｇ
の一本鎖相補DNAの存在下で最終容量15μ中50℃で２
時間行なつた。次に反応を200μの冷クエンチ溶液
（0.2M NaCl、10mM Hepes pH7.5、1mM EDTA）で希釈
し、2UのリボヌクレアーゼT1を添加した。一本鎖RNAの
消化を30℃で30分間行なつた後反応液をフエノール・ク
ロロホルム・イソアミルアルコール（1:1:0.05）で一回
抽出し、担体tRNAで沈でんさせた。ペレツトを冷70％Et
OHで一回洗浄し、乾燥して80％v/vホルムアミド、50mM
トリスホウ酸、pH8.3および1mM EDTAに再けん濁した。R
NAを95℃３分間変性させた後６％ポリアクリルアミド8.
3M尿素のシークエンス用ゲルで電気泳動にかけた。免疫
グロブリンのプロモーターに由来する２本のバンドの上
（Kappa）はカツパー転写の正しい開始を表わす。下の
バンドはいろいろな強度で見られ、下に説明するように
恐らく異なるCOP部位を表わさないだろう。 B.結 果 ２種のヒトバーキツトリンパ腫細胞株、EWおよびRAMO
Sから細胞全抽出物をManleyらの方法、上述、により作
成した。インビトロ転写反応に用いた鋳型は第5a図に示
した。野生型遺伝子（pK）を代表する鋳型はMOPC41カツ
パー遺伝子に由来し、主要イントロンJK−CK中の転写開
始点（第5a図、５′Δ５の末端）から上流Bgl II部位ま
でのおよそ100bpの配列を含んでいる。E.E.Max、J.Bio
l.Chem.256巻、5116頁。この断片はJK1に再編成した完
全な可変部領域を保持するがBgl II部位よりさらに下流
にあるカツパーエンハンサーは含まない。例えばQueen
およびStafford,Mol Cell Biol.4巻、1042頁（1984年）
参照。この短かい５′フランクで一時的トランスフエク
シヨンアツセイでの転写の正確な開始と高レベルの転写
に十分であることがわかつた。Y.Bergmanら、PNAS USA
81巻:7041頁（1984年）。カツパープロモーターの欠失
実験で欠失５′Δ７は遺伝子の転写能を完全に失なつて
いるのに対し、欠失５′Δ５は影響がないことから、重
要な調節配列はヌクレオチド−79から−44の間に存在す
ることが既にわかつている。Bergmanら、上述、参照。
不活性なプロモーター変異（ｐΔＫ）をHind III部位を
５′Δ７の５′末端に操作してBgl II部位までの遺伝子
断片をHind IIIおよびBamH Iで切断したpUC13にクロー
ニングして構築した。 Ｂ細胞抽出物中の転写活性を調べるためにポリリンカ
ー中のSac I部位で切断した線状鋳型を用い、この部位
で終結している転写物（ラン・オフ転写物）を電気泳動
分離により調べた。RAMOS、EWまたはHeLa細胞の抽出物
を用いた時2.3kbのラン・オフ転写物が検出された（第5
b図、２、４および６列）。カツパー鎖エンハンサー配
列を添加しても影響は見られず、これらの抽出物中の転
写はエンハンサー非依存性と考えられる（第5b図、１、
３および５列）。（EWおよびHeLaでエンハンサーの添加
により放射活性バツクグラウンドにやや増加が見られる
が2.3kbバンドでは変化ない。）2.3kbのバンドは鋳型を
添加しない場合または0.5ugm/mlのアマニチンの存在下
による転写で消失した。従つてこれが鋳型特異性のRNA
ポリメラーゼII転写生成物であることを示す。2.3kbの
すぐ下のバンドはアマニチンにより減少せず、恐らす内
部18sRNAの末端標識を反映している。 転写の開始が天然のcap部位からのものかどうか確認
するために二つ目のアツセイを用いた。U.Hansenおよび
P.A.Sharp（1983年）EMBOJ2巻;2293頁参照。このアツセ
イではユニフオーム標識のRNAを転写開始部位を含む一
本鎖DNAプローブ（カツパー遺伝子のPvu II−Sau3A断片
をフアージM13にクローニングして生成）とハイブリダ
イズした。得られる複合体をリボヌクレアーゼT1で消化
し、リボヌクレアーゼ耐性のRNA断片を8.3M尿素を添加
した６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。
この方法でインビトロに合成したRNAの分析を第６図
（４列）に示す。上のバンド（Kappaと表示）は正しいc
ap位置を表わす。そのすぐ下のバンドは種々の濃度で観
察され、多分異なるcap位置を示すのではなく保護され
た領域の３′末端から次のＧ残基でのリボヌクレアーゼ
T1による切断により生じたと思われる。（Sau3A1部位付
近の配列分析の結果RNA上の二つ目のＧ残基のセツトは
一本鎖DNAプローブとのホモロジー領域の末端から上流1
9bpに存在することがわかる）。従つてＢ細胞からの抽
出物はインビトロでHeLa細胞抽出物と同じ効率で免疫グ
ロブリンプロモーターを正しく開始し、転写することが
出来た。 ５′に連なる配列のインビトロ効果を解析するために
欠失遺伝子ｐΔＫの転写を調べた。多くの調節効果が転
写の開始速度に作用するので、開始速度を測定する前イ
ンキユベーシヨン、パルス−チエースプロトコールを用
いた。A.Fireら、J.Biol.Chem.259巻:2509頁（1984年）
参照。鋳型DNAを先ず抽出物と前インキユベートして前
開始複合体を形成させた。次にヌクレオチドおよび放射
活性UTPを添加して転写を開始した。開始した転写物は
非放射標識のヌクレオチドでチエースしている間に完了
し、電気泳動分離により分析した。このアツセイで取り
込まれた放射活性はパルス期間中に起つた正しい開始の
数に比例する。 第６図で２列と３列を１列と比較すると、開始点の上
流およそ100bpを含有する鋳型pKは欠失変異ｐΔＫより
もおよそ10倍の効率で開始した。ここでも、不完全なプ
ロモーターの−44bpの位置に連結したＨ鎖エンハンサー
の存在は転写の程度を改善しなかつた。閉環環状鋳型を
使用しても同様なプロモーター欠損の効果が観察された
（第６図、４−６列）。この反応ではアデノウイルスの
主要後期プロモーターを含む鋳型を内部対照としていれ
た；予想される180bpの保護RNA断片はMLPと表示した。
５列と６列を４列と比較すると変異プロモーターからの
転写効率は10倍低下し、一方主要後期プロモーターの転
写物は変わらなかつた。Ｈ鎖エンハンサーを含むスーパ
ーコイル鋳型からの転写量が見かけ上減少している理由
はそれ以上検討していない。しかし、転写が−44から−
79の間の上流配列に依存していることが観察され、この
効果がＢ細胞抽出物に特異としても同じ鋳型が異種のHe
La全細胞抽出物中で転写された事は明かである。野生型
の鋳型と比較して欠失鋳型では４から５倍の転写の低下
が見られた（データは示していない）。従つて、欠損の
影響はせいぜいやや組織特異と言える。 本明細書に記載したように、発明者らは２種の別々の
ヒトＢ細胞リンパ種より転写能を有する全細胞および核
抽出物を開発した。これらの抽出物中でMOPC41カツパー
遺伝子のプロモーターからの転写は正確に開始し、プロ
モーターの欠失は転写開始RNA量を有意に低下させた。
インビトロでここで用いた欠失の影響は一時的トランス
フエクシヨンアツセイによる分析で数百倍であるが、発
明者らがインビトロで観察した影響はおよそ10から15倍
程度でしかなかつた。現在インビトロの転写に必要ない
くつかの上流配列があるが、R.GroschedlおよびM.L.Bir
steil（1982年）PNAS USA79巻:297頁;R,Henら、（1982
年）PNAS USA79巻;7132頁など参照、その効果は対応す
るインビトロのものより小さい。これはインビトロ転写
の程度を測定する際にTATAボツクスが関連因子の優性な
ためであろう、N.G.Miyamotら、Nucl.Acids Res.12巻:8
779頁（1984年）。 III IgNF−Ｂの発見とその性状 各種細胞株の核抽出物についてオクタマー結合性蛋白
質の検索を行なうために移動度シフトゲル電気泳動を用
いた。IgNF−Ａに対応するバンドは全ての抽出物に見ら
れたが、IgNF−Ａと異なる移動度のIgNF−Ｂと命名する
二つ目のバンドはリンパ様細胞の核抽出物にのみ見られ
た。このリンパ特異オクタマー結合蛋白質は、試験した
プレＢ、成熟Ｂおよび骨髄腫細胞株全ての核抽出物およ
びあるＴ細胞リンパ腫の核抽出物に見られた（第７およ
び８図）。IgNF−Ｂは非リンパ細胞株、HeLa、２、Cos
およびMelの核抽出物中には検出されなかつた（第８図
参照）、IgNF−ＢはIgNF−Ａと同様に拮抗実験で同じオ
クタマーに特異的であることがわかり、IgNF−Ｂバンド
はオクタマー配列を持つ非標識DNA断片と選択的に拮抗
したが、オクタマー配列を持たないDNA断片とはしなか
つた。 オクタマー配列は全ての免疫グロブリン（Ig）可変部
遺伝子の転写開始部位からおよそ−70上流の位置に見ら
れ、この領域はIgプロモーターのリンパ特異性を制御す
ることがわかつている。従つてIgNF−Ｂはリンパ様細胞
の上流オクタマー配列に結合して転写を活性化している
のかも知れない。 IV.μ−エンハンサーと結合する因子:E因子 完全な機能を持つμエンハンサーはJHとＣμの間の主
要イントロンからの700bp Xba I−EcoR I断片に存在す
る。この断片はPst I部位での切断によりさらに分割さ
れて400bpのXba I−Pst I断片（μ400）および300bpのP
st I−EcoR I断片（μ300）を生成する。一時トランス
フエクシヨンにより組織特異エンハンサー活性の30−50
％はμ300に保持され、μ400には活性は全く検出されな
かつた。μエンハンサーとどんな蛋白因子が相互反応す
るのか調べるためにゲル結合アツセイを用いた。簡単に
は、末端標識したDNA断片を組織培養から調製した核抽
出物とインキユベートした。室温20分後に低イオン強度
ポリアクリルアミドゲルにのせ、120Vで２時間電気泳動
をかけた。次にゲルを乾燥し、オートラジオクラフイー
にかけた。このアツセイで活性のある300bp（μ300）エ
ンハンサー断片を用いると、ヒトＢリンパ腫細胞株EWか
らの抽出物にDNA−蛋白複合体が観察された（第9b図、
２列）。この新しいバンドが特異複合体であることを示
すため、種々の量の非放射活性拮抗断片の存在下で結合
反応を行なつた（第9b図、３−11列）。拮抗断片として
μ300を添加すると複合体バンドは完全に消失した。一
方、燐りのμ400断片（６、７、８列）或いはKL鎖エン
ハンサーを含む450bp断片（９、10、11列）では多量に
添加してもわずかな影響しかなかつた。興味深いことに
Ｋエンハンサーの存在下では特異複合体の量が少し増加
していた（９列と２列を比較）。以下に示すように、μ
およびＫエンハンサーの両方共少なくとも一つの共通蛋
白質と相互反応し、これはμ300断片が結合して検出さ
れるものではない。Ｋエンハンサー存在下での特異複合
体の増加は恐らく両エンハンサーに共通の因子が反応液
から除かれ、より多くの標識断片がμ特異因子と結合し
て検出されたためであろう。 少量しか存在しない蛋白質の結合部位を検出し、μ30
0で検出される複合体をより詳細に解明できるようにす
るため、この断片をさらに切断した。生成した小断片の
それぞれについて核蛋白質との結合部位となり得るかど
うか分析した。第10a図はμエンハンサーの該領域の部
分制限地図である。μ300をAlu I、Hinf IおよびDde I
で消化して多数の50−70bp断片、μ50、μ（60）２（Al
u I−Dde IおよびHinf I−Alu Iの混合）およびμ70を
得た。これらの断片のそれぞれについて非特異拮抗物ポ
リ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）の種々の量の存在下でEW
リンパ腫細胞の核抽出物との結合反応を行なつた。結果
を第10b図に示す。 断片μ50は4ugのポリ（dI−dC）−ポリ（dI−dC）の
存在下でもほとんど減少しない主要複合体バンド（２、
３、４列）を形成する。２つの60bp断片混合物は明確な
複合体バンドを形成しない（６、７、８列）。μ70断片
は２本の薄い、しかしはつきりした核蛋白複合体バンド
を形成し（10、11、12列）、その下の方のバンドは3ugm
の非特異担体ポリ（dI・Ｃ）・（dI・Ｃ）によつてほと
んど影響しない（12列）。 観察された複合体の特異性を各種DNA断片を用いた拮
抗実験で調べた、第10c図。その結果、μ50で形成する
複合体はμ300（μ50はその一部）またはＫプロモータ
ー断片の存在下で拮抗されるが、同じ量のμ400または
Ｋエンハンサー断片では拮抗されず、複合体が前に述べ
たIgNF−Ａがその同類配列との相互反応により生成する
のと一致する。（この因子は全ての配列決定された免疫
グロブリン遺伝子のプロモーター中およびＨ鎖エンハン
サーの小断片内の保存オクタヌクレオチド、ATTTGCAT、
を認識する。 μ70で観察される複合体はそれ自体で特異的に拮抗さ
れ（９列）、またＫエンハンサーである程度拮抗される
（第10図ｃ図の５、６列）が、モロニーネズミ白血病ウ
イルスエンハンサー（３、４列）またはμ400（第10d図
の７、８列）では全く拮抗されなかつた。さらに拮抗分
析でこの複合体は（μ60）２（第10D図、７、８列）、
μ50（第10D図、５、６列）、或いはμ70（Alu I−Alu
Iの中央断片）（第10d図、11、12列）のいずれでも拮抗
されなかつた。従つてここで観察された結合はこの小さ
い断片に特異的であり、μ300をさらに切断してIgNF−
Ａの主要相互作用をエンハンサー配列と分離してもう一
つの断片（μ50）とした時のみ検出された。 EphrussiらおよびChurchらはメチレーシヨン保護実験
を用いてＢ細胞中のDMSによるメチル化に特異的に耐性
なＨ鎖エンハンサー内のＧ残基セツトを決定した。この
結果から組織特異DNA結合蛋白質はこの試薬のDNAへの相
互作用を低下させるという仮定が得られる。保護は４つ
のクラスターで見られ、それらのDNA配列の相同性から
予想される因子の結合部位の一致配列を誘導できた。全
ての４つの予想結合部位（E1−E4）は700bp断片内に見
られるがμ300はこの因子の２つの完全結合領域（E3お
よびE4）およびオクタマー（０）配列を保持している。
上述の特異核蛋白複合体を示すAlu I−Alu I断片は完全
なE3領域を含み、インビトロで検出する因子は恐らくイ
ンビボで検出されているものと同じであろう。従つて、
E4および０を含んでいるHinf I−Dde I断片（μ50）が
μ70への結合を拮抗しないことは予想できなかつた（第
10d図、５、６列）。 これがIgNF−Ａがオクタマー部位と優先的に結合して
μ70への拮抗剤として作用できないためであつたのかも
知れないので、結合反応および拮抗実験を粗抽出をヘパ
リン−セフアロースカラムのクロマトグラフイーにかけ
てμ70結合活性は有するがIgNF−Ａは有意に除いた画分
を用いて行なつた。μ50またはμ70を末端標識し、カラ
ム画分とインキユベートしても電気泳動分析で特異核蛋
白複合体は観察されなかつた。この画分を用いてもμ50
もμ170もμ70とその結合蛋白との相互作用を拮抗でき
なかつた。（データーは示してない）。従つて、E4と命
名する結合部位はE3に結合する因子と同じ因子とは結合
しない事を示している。同様に、E1領域（Hinf I−Pst
I断片として単離）はその因子のμ70への結合に対して
μ70自体のように有効に拮抗しない。 個々の断片（μ70およびμ50）内の結合部位の位置を
決定するため、メチル化阻害法を用いた。末端標識した
DNA断片をジメチル硫酸（DMS）を用いてグアニンおよび
アデニンに部分メチル化を行なつた。メチル化したDNA
を次に粗抽出物との結合反応に使用し、複合体を電気泳
動を用いて遊離断片と分離した。複合体および遊離断片
の両バンドをゲルから切り出し、DNA電気溶出により回
収した。回収DNAをピペリジン切断した後12％のポリア
クリルアミド尿素シークエンシング用ゲルにかけた。原
理は、もしDMSとの反応により導入したメチル基が特異
蛋白の結合を阻害するなら、DNAのその分子は形成した
複合体および続く対応するラダーから選択的に消失する
ということである。従つて本法により蛋白と深い作用の
あるＧ残基を同定できる。［ゲル結合アツセイを用いた
DNase Iフツトプリントは複合体の半減期が短かいため
に存在量の少ないこれらの因子の場合には複雑であるこ
とがわかつた。もし結合インキユベーシヨンの後でDNas
e I部位消化を行なえば試料をのせて複合体をゲルにか
ける間に複合体のDNA断片が結合反応液中に存在する多
量の遊離断片と交換する可能性がある。従つて複合体或
いは遊離DNAで見られるDNaseパターンに区別がなくなる
（μ70での核蛋白複合体の半減期は１分以下である。Se
nおよびBaltimore、未発表データー）。］ 核抽出値物とμ50DNA断片を用いてこのような阻害実
験を行なつた結果、観察される複合体はIgNF−Ａ蛋白質
の保存されたオクタマー配列との相互作用により生成す
ることを示す（第11a図）。遊離断片は特徴的なＧラダ
ーを形成し（第11a図、２、３列）、複合体の形（１
列）は保存オクタマーの中央に存在する＊印で示すＧ残
基にメチル基を有するDNA分子では特異的に消失してい
る。恐らくこの残基の修飾が蛋白とその同系配列の間の
安定な複合体形成をひどく妨げる。この残基はインビボ
でDMSのメチル化に対しても保護されている。しかし興
味深いことに、μエンハンサーのこの領域中保護される
と観察された他のＧ残基は全てこのインビトロの阻害実
験で影響されなかつた。従つて、これらのインビボでの
阻害が蛋白の結合によるものであるなら、この因子はIg
NF−１とは異なり、インビトロでは断片に結合しない。 μ70断片ではいくつかのＧ残基が結合蛋白（Ｅ）と親
密な接触に重要であることがわかつた（第11b図）。コ
ード鎖ハンドで３つのＧが遊離DNA断片と比較して複合
体で強度が有意に低下しており（第11b図、１列と２列
を比較）、非コード鎖では２つのＧが有意に影響を受け
ている（第11b図、２列と４列を比較）。 インビボでのDMS阻害実験および発明者らのインビト
ロメチル化阻害実験の結果を第11c図に示す。配列上の
白丸および黒丸はEphrussiらによりインビボのメチル化
で保護されるとわかつている残基であり、丸で囲つたＧ
は発明者らがインビトロで同定したものである。μ70断
片での一致配列に亘る保護および阻害パターンはインビ
ボとインビトロで驚くほど類似しており、ゲル結合アツ
セイによりここで同定した蛋白質はインビドで本配列と
相互作用するものである事を示す。しかしμ50と同様、
この領域にインビボで見られる第二番目の保護はインビ
トロでは観察されなかつた。検出された因子の組織特異
性：同定された蛋白質がＢ細胞でのみ発現が限定されて
いるのかどうか決定するため、Ｂ細胞および非Ｂ細胞か
ら作成した種々の抽出物を検索した（第12図）。Ｂ細胞
株EWで生成し、特徴づけした（拮抗およびメチル化阻害
実験により）複合体と一緒に移動する複合体はμ50およ
びμ70断片（第12図、μ70）で調べた全ての細胞株で観
察された。各抽出で生成した複合体をそれ以上解体しな
かつたが、このデーターからこれらの因子がいずれも組
織非特異性であることを示していると解釈している。二
番目の複合体（IgNF−Ｂ）はＢおよびＴ細胞のみに限つ
てμ50で観察された。 各列での蛋白量は９から11μｇと一定にしてあつたが
生成する複合体の程度は抽出物によりかなり差があつた
ことは注意すべき点である。この段階では本アツセイを
用いて異なる細胞株での蛋白の量を推定するのは意味あ
るとは考えられない。（これは多分、細胞の状態の差お
よび細胞株による抽出条件の差によるのであろう。 要約すると、μエンハンサーの300bpのPst I−EcoR I
断片の機能分析の結果； （ｉ） このDNA配列内に少なくとも２つの異なる蛋白
が結合する。一つの蛋白（IgNF−Ａ）は全てのＨ鎖およ
びＬ鎖の可変領域遺伝子の上流に高度に保存され、また
μエンハンサーにも見られるオクタマー配列（ATTTGCA
T）と相互作用する。二つ目の蛋白はEphrussiおよびChu
rchにより全細胞中のDMSによるメチル化に対して組織特
異的に保護されると示された配列と相互作用すする； （ii） 両因子とも各種細胞株からの核抽出物中に検出
され、Ｂ細胞特異的ではない； （iii） E1およびE4の両配列とも因子のμ70（E3に対
応）への結合に殆ど拮抗せず、これらの配列は、部位間
の配列相同性からそう予想されるのだか、同じ因子とは
相互作用しないことを示す。 v.カツパーＬ鎖エンハンサーと結合する因子の同定 カツパーＬ鎖遺伝子の主要イントロン中にエンハンサ
ー成分が同定された。PicaidおよびSchaffnerはエンハ
ンサー活性は500bp Alu I−Alu I断片に位置すること
を示し、QueenおよびSlaffordは５′および３′境界を
限定してエンハンサーが大断片内の275bpに限定される
と考えられる。発明者らはこの領域をより小さい断片に
切断して蛋白結合部位の位置をゲル結合アツセイの方法
により各断片につきアツセイした。 Ｋエンハンサーの対応領域の制限地図を第13a図に示
す。黒い四角はChurchらによつてインビボでμエンハン
サー内の予想蛋白結合領域と同定された配列を表わす。 Dde IおよびHae IIIで切断して生成した断片（第13a
図のK1、K2、K3、K4およびK5）をいろいろな量のポリ
（dI、dC）、（dI、dC）を非特異的担体として添加して
結合をアツセイしたところ、K4およびK5は明かに陰性
（第13b図、１−８列）であり、K3およびK2は陽性（第1
3b図、10−12列、14−16列）であつた。予備的な結果、
内部断片はいずれも特異的な結合部位を含んでいない。
0.5−1ngの放射標識プローブで形成する核蛋白質複合体
バンドは３μｇの担体存在下でも検出できた（第13b
図、12、16列）。 検出されたバンドが蛋白とDNAの特異相互作用を表わ
していることを示すために拮抗実験を行なつた（第13c
図および13d図）。K2の拮抗パターンは以前にμ70で観
察したものと驚くほど類似していた：このK2に対して相
対的に多量のμ400、モロニー白血病ウイルスエンハン
サー、SV40エンハンサーまたはＫプロモーター（保存オ
クタを含有）は結合に拮抗せず、μ300およびＫエンハ
ンサーは拮抗した（データーは示していない）。K2は配
列比較により予想されるＥボツクスを含有する（μ70と
同様に）ことが同定されたのでその結合をμ300からの
小断片で拮抗した（第13c図）。複合体は非標識のμ70
をインキユベーシヨンに添加することにより特異的に拮
抗して消失し（３列および４列を２列と比較）たが、μ
60（５、６列）、μ170（７、８列）或いはSV40エンハ
ンサー（９、10列）とはしなかつた。さらに、この配列
と結合する蛋白は二つの連続したクロマトグラフイース
テツプ（ヘパリンアガロースおよびDEAEセフアロース）
でμ70結合活性と一緒に分画される。従つて同じ配列特
異的蛋白質がμ70およびK2に結合し、μおよびＫエンハ
ンサーの両者に相互作用する少なくとも一つの共通蛋白
質があると結論される。 K3複合体（第13d図で矢印の先で示す）はμ30（３お
よび４列を２列と比較）、μ400（５および６列を２列
と比較）によつてＫプロモーター含有断片（７および８
列を２列と比較）と同様拮抗されなかつた。しかしこの
複合体は完全なＫエンハンサー（９、10列）およびSV40
エンハンサー（11、12列）により特異的に拮抗された。
主要K3複合体の下のバンドは実験の違いにより種々の強
度で見られ、この実験で完全なＫエンハンサーによつて
も拮抗されなかつたのでこれ以上調べられていない。SV
40エンハンサーがこの因子の結合で特異的に拮抗するこ
とは、本断片とSV40エンハンサーが11ヌクレオチドの長
さで同一の配列を共有していることから驚くことではな
い。 本因子のK3断片上の結合部位をメチル化阻害実験によ
り位置決定した。二つの別の抽出物でこの配列内の４残
基中の３残基のメチル化により結合は完全に結合を阻止
した（第14図、１列［複合体］および２列［遊離］を比
較；および３列［複合体］と４列［遊離］を比較）。こ
の連続したＧのつながりはSV40エンハンサーとK3の間の
保存領域（GGGGACTTTCC）の一部を成している。従つて
結合部位はK3断片の片端の方向に位置している。この結
果は前にSV40エンハンサーで観察された特異拮抗を説明
する。興味深いことに、Ｋエンハンサーの欠失マツピン
グによりK3断片中の配列はエンハンサー機能に非常に重
要であることがわかつた。 本因子の組織範囲を各種細胞株からの抽出物でのK3と
の結合分析により調べた。K3との核蛋白複合体形成はマ
ウスＢ細胞株（第15a図、２列）でのみ検出され、他の
５株の非Ｂ細胞（第15a図、５−11列の奇数列）では検
出されなかつた。偶数列はμ50で検出される普遍的因子
はこれら全ての細胞株に存在することを示し、実験の陽
性対照となる。従つてKappa3因子はＢリンパ腫細胞での
発現に限定されているらしい。 次にＢ細胞の分化に於ける各段階での細胞から作成し
た抽出物を調べた（第15b図）。面白いことに、K3結合
蛋白はアベルソン（Abelson）ネズミ白血病ウイルスで
トランスフオームされたプレーＢ細胞株PD、二種のマウ
スＢ細胞株（WEH1231およびAJ9、第15b図、12、14
列）、一つのヒトＢ細胞株（EW、第15b図、16列）、マ
ウス骨髄腫株（MPC22、第15b図、18列）および二種ヒト
骨髄腫（KR12および8226、第15b図、20および22列）で
検出された。しかし、本因子はプレープレＢ細胞株（C
5、第15b図、４列）およびマウスプレＢ細胞株（HATF
L、38B9、70Z、第15b図、６、８、10列）には存在しな
いようである。従つて本因子は組織特異、即ち、Ｂリン
パ様系統細胞に限定されるだけでなく、その系統内で分
化段階特異である。調べた一連の抽出物で、この因子の
存在はＫ発現と驚くほど相関性がある。 Kappaエンハンサーでの結果は以下のように要約でき
る:Kエンハンサーの切断によりこのDNAと結合する二つ
の蛋白が検出された。そのうちの一つの蛋白は広く存在
してＨ鎖のμエンハンサーとも結合する。二番目の蛋白
はＢ細胞系統内で高度にステージ特異的に発現され、内
在Ｋ遺伝子が活性な細胞株でのみ検出できる。Ｈ鎖エン
ハンサー内にはその因子の結合部位が存在しないよう
で、SV40エンハンサーにはある。 等価 本技術に熟練した者は本明細書に記載する発明の特別
な態様の多くの等価を認識し、或いは単にきまつた手順
の実験により確認できる。そのような等価は添付の請求
の範囲に包含されるものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 バルティモアー，デビッド
アメリカ合衆国 02138 マサチュ−セ
ッツ州，ケンブリッジ，リザーバー ス
トリート 26
(72)発明者 セン，ランジャン
アメリカ合衆国 02144 マサチュ−セ
ッツ州，ソマービル，ウインスロウ ア
ベニュー 32
(72)発明者 シャープ，フィリップ，エイ
アメリカ合衆国 02158 マサチュ−セ
ッツ州，ニュートン，グラスミアー ス
トリート 119
(72)発明者 シング，ハリンダー
アメリカ合衆国 02139 マサチュ−セ
ッツ州，ケンブリッジ，アパートメント
３アール，オールストン ストリート
198
(72)発明者 スタウト，ルイス，エイ
アメリカ合衆国 02142 マサチュ−セ
ッツ州，ウォータータウン，ダートモス
ストリート 20
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．マウスKappa Ｌ鎖遺伝子のエンハンサーDNA配列に
おけるDNA配列GGGGACTTTCCに結合するリンパ細胞特異的
核蛋白質、IgNF−κ３、または、（ａ）マウスＨ鎖およ
びKappa Ｌ鎖両遺伝子プロモーターの上流領域にあるD
NA配列GGGGACTTTCCと結合し、そして （ｂ）マウスＨ鎖遺伝子エンハンサーにおけるDNA配列G
GGGACTTTCCと結合するリンパ細胞特異的核蛋白質、IgNF
−Ｂであり、免疫グロブリンＬ鎖またはＨ鎖遺伝子の転
写調節DNA成分におけるDNA配列GGGGACTTTCCと配列に特
異的な仕方で結合するリンパ細胞特異的核蛋白質であっ
て、リンパ細胞核抽出物から免疫グロブリンＬ鎖または
Ｈ鎖遺伝子の転写調節DNA成分に結合することにより得
ることができるリンパ細胞特異的核蛋白質。 ２．IgNF−κ３である請求項１に記載の蛋白質。 ３．IgNF−Ｂである請求項１に記載の蛋白質。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81744186A | 1986-01-09 | 1986-01-09 | |
| US817,441 | 1986-01-09 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8003422A Division JPH08275782A (ja) | 1986-01-09 | 1996-01-11 | 転写調節に関与する核内蛋白質をコードするｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63502480A JPS63502480A (ja) | 1988-09-22 |
| JP2749042B2 true JP2749042B2 (ja) | 1998-05-13 |
Family
ID=25223096
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62500935A Expired - Lifetime JP2749042B2 (ja) | 1986-01-09 | 1987-01-09 | 転写調節に関与する核内因子 |
| JP8003422A Pending JPH08275782A (ja) | 1986-01-09 | 1996-01-11 | 転写調節に関与する核内蛋白質をコードするｄｎａ |
| JP9128566A Pending JPH1084974A (ja) | 1986-01-09 | 1997-05-19 | 遺伝子の転写を高める方法 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8003422A Pending JPH08275782A (ja) | 1986-01-09 | 1996-01-11 | 転写調節に関与する核内蛋白質をコードするｄｎａ |
| JP9128566A Pending JPH1084974A (ja) | 1986-01-09 | 1997-05-19 | 遺伝子の転写を高める方法 |
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1997
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| DE3789883T2 (de) | 1994-10-06 |
| JPS63502480A (ja) | 1988-09-22 |
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| WO1987004170A1 (en) | 1987-07-16 |
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