JP2703538B2 - 偽狂犬病ウイルス突然変異体、それを含有するワクチン、その生産法およびその使用法 - Google Patents
偽狂犬病ウイルス突然変異体、それを含有するワクチン、その生産法およびその使用法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、主要な糖蛋白質遺伝子中に欠失および／ま
たは挿入の突然変異体を含有する偽狂犬病ウイルス突然
変異体、例えば、ウイルス遺伝子により暗号化される抗
原ポリペプチドが生産されないものに関する。その結
果、これでワクチン接種した動物は、このウイルスに対
する抗体を発現せず、そして偽狂犬病ウイルスの野外菌
株（field strain）および既知の偽狂犬病ウイルスのワ
クチンの菌株で感染した動物と区別することができる。
本発明は、また、それを含有する偽狂犬病のためのワク
チン、それを生産する方法およびそれを使用する方法に
関する。 Ｉ、偽狂犬病の病気 偽狂犬病、ブタおよび家畜類、例えば、牛、羊および
ヤギの高度に感染性の病気は、ヘルペスウイルス・スイ
ス（Herpesvirus suis）（以後、「偽狂犬病ウイルス」
または「PRV」）により引き起こされる。ブタにおい
て、この病気は呼吸器系の疾患および脳炎を引き起こ
し、これは死に至ることがある。ブタにおける感染の他
の共通の結果は、流産、新生児の死、同産群の大きさの
減少、および生産速度の低下である。他の家畜類、最も
顕著には畜牛において、PRVの感染はほとんど致死の脳
炎に進行することを避けることができない。 偽狂犬病は主要な脅威となってきており、そして世界
を通じてブタ産業に対する経済的損失の原因となった。
また、畜牛および他の飼育場の動物への偽狂犬病の広が
りついてかなりの不安を存在する。過去10年以内に、PR
Vのよりヴィルレントの菌株が出現しかつこの病気の広
く流布したため、経済的損失は増大した。今日、米国の
飼育場の8,000万頭の食用物の8.0％が、10年前の0.8％
に比較して、感染した。 PRV感染の臨床的症候および結果は殺したあるいは変
性した生PRV、すなわち、弱毒したPRVからなるワクチン
の使用により緩和しあるいは防止することできる。しか
しながら、PRVおぼび他のアルファヘルペスウイルス、
例えば、ヘルペス単純疱疹ウイルス１形および２形（以
後、それぞれ、「HSV−１」および「HSV−２」）、水痘
−帯状疱疹、感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス、マーモセ
ットのヘルペスウイルス、およびウマのヘルペスウイル
ス１形の独特の生物学的性質のために、大部分の現存す
るワクチンは偽狂犬病の病気の抑制に失敗してきてい
る。 さらに詳しくは、アルファヘルペスウイルスは神経組
織中に休止状態で入り込むという特別の能力を有する。
すなわち、動物が初期の一般化した感染から回復するに
つれて、アルファヘルペスウイルスは神経系の部分へ後
退し、ここでアルファヘルペスウイルスは非活動的とな
りかつ体の免疫系の防御系に対して不浸透性となる。こ
の休止の感染、すなわち、潜伏は予期されないほどに再
活性化し、病気の再発あるいは保菌状態として知られて
いる伝染状態を生ずることがあり、ここで感染した動物
はこの病気の外面的症候を示さいが、感染性アルファヘ
ルペスウイルスを伝達しあるいは「脱落（shed）」し、
こうして感染を広げかつ流行性爆発を起こす。 II、既知の変性した生きているウイルスPRVワクチン 従来、変性した生きているウイルスPRVワクチンは、
ニワトリおよび／またはサルの組織培養細胞の多数の継
代培養によって生産されてきている［スコダ（Skod
a）、R.、ブラウナー（Brauner）、I.、サデッキー（Sa
decky）、E.およびメイヤー（Mayer）、V.、アクタ・ビ
ロロジカ（Acta Virol）8:1−９（1964）およびバーサ
（Bartha）、A.、Magy. Allatorv. Lapja、16:42-45
（1961）参照］。組織の継代培養の間、ウイルスがその
新しい環境に適合するにつれて、突然変異体は蓄積す
る。これらの不確定の突然変異体は自然宿主中のウイル
スの再生産に悪影響を及ぼし、ウイルスの弱毒を生ず
る。 前述の変性した生きているPRVワクチンを使用すると
きの１つの問題は、動物がしばしば休止のワクチンウイ
ルスの保菌体となるということである。その結果、これ
らのワクチンの使用はそれらの安全性および有効性を妨
害する２つの望ましくない場合が生ずることがある。第
１に、ワクチンウイルスがワクチン接種した保菌体から
脱落するとき、流産、死産、および新生児の胎児感染が
同一ワクチンウイルスにより引き起こされることがあ
る。第２に、群内のワクチンウイルスの反復循環は弱毒
の過程の逆転を生じ、こうしてワクチンウイルスは病原
性親株に戻ることがある。このような環境下に、広がっ
たワクチン接種はこの病気の伝染を促進する。 前述の欠点に加えて、従来知られたPRVワクチンは、
疾患の症候を実質的に最小にするが、動物が病原性野外
菌株により休止の感染を獲得するのを防止しない。こう
して、ワクチン接種にかかわらず、動物はこの病気の保
菌体となり、そしてそれを感受性の動物に伝達すること
がある。この病気のこれらの保菌体は、飼育場と市場と
の間を動くとき、前述のように休止のワクチンウイルス
を脱落するばかりでなく、かつまたこの病気のウイルス
を脱落する。これは地理学的境界線および州の境界を横
切ってこの病気の望ましくない伝達を引き起こす。 前述の欠点を克服するために、チミジンキナーゼ遺伝
子における突然変異原誘発突然変異体または欠失の結
果、機能的チミジンキナーゼ（以後「TK」）酵素を生産
することができない温度抵抗偽狂犬病ウイルスが開発さ
れた（米国特許第4,514,497号、この米国特許の全部を
ここに引用によって加える）。 それにもかかわらず、PRVの休止の特徴は、感染した
群の隔離および感染した動物の屠殺によるこの病気の広
がりを防止することを意図する検疫手段を適用すること
によって、この病気を根絶することを困難とする。すな
わち、現存するワクチンでは、疾患の症候を示さない特
定の動物が休止PRVの保菌体であるかどうかを決定する
ことは、ほとんどの現在のワクチンの使用が感染をマス
クするので困難である。それゆえに、健康に見える動物
が実際に保菌体であり、こうしてPRVの拡散体でありう
るので、検疫手段を適用できるようにするために、感染
した動物および群を同定できることは、ワクチン接種し
た後でさえ、重要である。本発明の実施態様は、この要
求を満たすために開発された。 その上、政府の規制は市場または再販売のため州間の
動きを意図するブタをPRVの保菌体について試験し、そ
してその保菌体（すなわち、PRVについて血清陽性）で
ないことを示さなくてはならないことを要求している。
すべての現在の殺した偽狂犬病ウイルスワクチンおよび
変性した偽狂犬病ウイルスワクチンでは、生産者は彼の
群内のPRVの感染の環境によって感受性の動物にワクチ
ン接種することを強制され、家畜全体のワクチン接種が
PRVについて陽性の血清学的試験を与えるであろうか
ら、生産者は過酷な経済的不利益を受ける。さらに、保
護を増大するための再度のワクチン接種はPRV抗体の力
価をさらに増大するであろう。結局、この家畜を販売す
る農業経営者の能力はきびしく制限される。 安全に投与でき、家畜をPRVの野外菌株により引き起
こされる病気および休止の感染から保護し、そしてしか
も、PRVについての陽性の試験を生成しないワクチン
は、検疫に恐怖によって妨害されないで、ワクチン接種
のプログラムを遂行できるようにするであろう。次い
で、生産者は彼自身の飼育場内での損失を最少にするこ
とができると同時に、動物の健康の当局は、効果的にか
つもはや過度の抑制手段を必要としないで、存続するこ
とができる。本発明の実施態様は、また、これらの要求
を満たすために開発された。 III、PRV菌株のゲノム PRV菌株のゲノムは、大きさがほぼ146キロ塩基対（以
後「Kbp」）の線状、二本鎖の、非環状に並んだDNA分子
から成る。電子顕微鏡ならびに制限酵素によるPRVのヴ
ィルレント菌株のゲノムの分析は、それらのすべてが約
10Kbpの大きさの短い独特（以後「ＵS」）配列と表示す
るDNAの配列を含有することを示した。このＵ配列は逆
向き反復配列おぼび末端配列（以後それぞれ「IRS」お
よび「TRS」）によって限界を確定されており、それら
の各々は約15Kbpの大きさである（第１図参照）。他の
独特配列、すなわち、約111Kbpの大きさの、長い独特
（以後「ＵL」）配列はこの分子の残部からなる。 ヴィルレントPRV菌株のゲノムはクラスDDNA分子とし
て分類される。なぜなら、IRSおよびTRSの区域によって
限界を確定されているゲノムのＵS区域はＵL区域に関し
て２つの向きで発見されるからである。このようなビリ
オンから分離されるPRVのDNAは、こらの異性体を等モル
量で含有する。IRSおよびTRS区域を切断しない制限ヌク
レアーゼ（例えば、Bgl II;第１図参照）でDNAを消化す
ると、このゲノムの独特区域に完全に由来するモル断片
に加えて、２つの1/2モル断片、Bgl II−ＤびBgl II−
Ｅ、および、また、反復配列と独特配列とのまたがる２
つの1/2モル断片（すなわち、Bgl II−Ａ）が生成す
る。第１図において、１つのみBgl II−Ａが示されてい
るが、事実、同時に移動するほとんど同一大きさの２つ
の断片が存在する。 PRVのヴィルレントの実験室菌株の制限酵素の切断地
図は記載された［ベン−ポラト（Ben-Porat）、T.およ
びカプラン（Kaplan）、A.S.、ヘルペスウイルス類（Th
e Herpesviruses）、ロイズマン（Roizman）、B.編、
プレナム・プレス、ニューヨーク、Vol.3、105-173ペー
ジ（1985）参照］。 典型的なPRV（Kaplan）菌株についてKpnI、BamHI、お
よびBgl II断片の制限地図は第１図に示されている［ロ
ムニクジ（Lomniczi）、B.、ブラケンシップ（Blankens
hip）、M.L.およびペン−ポラト（Ben-Porat）、T.、ウ
イルス学雑誌（J. Virol.）49:970-979（1984）参
照］。PRVのヴィルレントのアウジェスズキー（Aujeszk
y）菌株（ATCC No.VR-135）についてのKpnIおよびBamHI
制限パターンは、PRV（Kaplan）菌株のそれに密接に類
似し、米国特許第4,514,497号の第３図、レーン（lan
e）３および８に示されている。米国、ヨーロッパおよ
び台湾の種々の区域から分離された90種より多い追加の
野外菌株の制限パターンは記載された［ギエルキンス
（Gielkins）、A.L.J.、ヴァン・オイルショット（van
Oirschot）,J.T.およびバース（Berns）、A.J.M.、一般
ウイルス学雑誌（J. Gen. Virol.）66:69-82（198
5）；キット（Kit）、S.、キット（Kit）、M.、ラウホ
ーン（Lawhorn）、B.およびマクコンネル（McConne
l）、ウイルスのワクチンへの高い技術の道筋（High-Te
chnology Route to Virus Vaccines）、ドレースマ
ン（Dreesman）、G.R.、ブロンソン（Bronson）、J.G.
およびケネディー（Knnedy）、R.C.（アメリカン・ソサ
イアティー・オブ・マイクロバイオロジー、ワシント
ン、D.C.）、82-99ページ（1985）；ロムニクジ（Lomni
czi）、B.、ブラケンシップ（Blankenship）、M.L.およ
びベン−ポラト（Ben-Porat）、T.、ウイルス学雑誌
（J. Virol.）49:970-979（1984）；パウル（Paul）、
P.S.、メンゲリング（Mengeling）、W.L.およびパート
ル（Pirtle）、E.C.、アーチーブス・オブ・バイロロジ
ー（Arch. Virol.）73:193-198（1982）；パートル（P
irtle）、E.C.、ワーゼン（Wathen）、M.W.、パウル（P
aul）、P.S.、メンゲリング（Mengeling）、W.L.および
サックス（Sacks）、J.M.アメリカン・ジャーナル・オ
ブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）4
5:1906-1912（1984）；およびプリチェット（Pritchet
t）、R.F.、ブシュ（Bush）、C.E.、チャング（Chan
g）、T.J.、ワング（Wang）、J.T.およびジー（Zee）、
Y.C.、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・
リサーチ（Am. J. Vet. Res.）45:2486-2489（198
4）参照］。制限パターンはPRVのアウジェスズキー（Au
jeszky）菌株（米国特許第4,514,497号の第３図、レー
ン３および８参照）について示されているものに一般に
類似するが、切断パターンの変動は立証可能であり、異
なる野外分離物を互いに区別する。変動の１つの形は、
制限エンドヌクレアーゼの切断位置の損失または獲得を
包含する。例えば、3.15Kbpおよび10.7KbpのKpnI切断は
３種類の台湾分離物中に見出されるが、米国およびヨー
ロッパの菌株中に見出されない。その代わり、後者の菌
株は13.8KbpのKpnI断片（KpnI−Ｃ）を有し、台湾の菌
株はKpnI−Ｃ切断中に追加のKPNL1撤回位置を有するこ
とを示す［プリチェット（Pritchett）、R.F.、ブシュ
（Bush）、C.E.、チャング（Chang）、T.J.、ワング（W
ang）、J.T.およびジー（Zee）、Y.C.、アメリカン・ジ
ャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. V
et. Res.）45:2486-2489（1984）参照］。 変動の第２型は、PRVゲノムのIRおよびTR区域におけ
る断片のマッピングについてより高い頻度で起こり、存
在する断片からの配列の追加または欠失を含む。この型
の異質性は、PRVの菌株のBamHI−５またはKpnI−Ｋ断片
はとくに顕著であり、そしてこれらの断片中の配列の繰
り返しから生ずる。 変動の第３の型は騒動断片の大きさの小さい変化を含
む。断片は損失せず、そして新しい断片は発生せず、こ
れらの事実はこれらの分子量のシフトを説明しうるの
で、これらの変動は、制限エンドヌクレアーゼの切断位
置の付加または損失によりはむしろ、先在する断片中の
小さい付加または欠失から生ずると信じられる。 研究した種々のPRV菌株は偽狂犬病の流行的に無関係
の爆発から分離され、そして高度のヴィルレントであ
る。これは制限ヌクレアーゼのパターンにおける前述の
変動がPRVの変動またはヴィルレンスに無関係であるこ
とを立証する。 組織培養における反復継代培養後に分離される、PRV
のいく種類からの弱毒ワクチンの制限ヌクレアーゼのパ
ターンも記載された。これらの例は、次の通りである：
ハンガリーにおいて分離された、バーサ（Bartha）A57
およびＫ菌株、ルーマニアにおいて分離された、SUCHお
よびブカレスト（Bucharest）（BUK）菌株［ズッファ
（Zuffa）、A.およびサラジ（Salij）、J.ベテリナルニ
・メディシナ（Veterinarni Medicina）17:201-210（1
972）］、ブカレスト（Bucharest）菌株の誘導体、例え
ば、ノルデン（Norden）、PRV（BUK−５）およびPRV（B
UK−７）菌株［パウル（Paul）、P.S.、メンゲリング
（Mengeling）、W.L.およびパートル（Pirtle）、E.
C.、アーチーブス・オブ・バイロロジー（Arch・Virol.
73:193-198（1982）；米国特許第4,514,487号；および
キット（Kit）、S.、キット（Kit）、M.およびパートル
（Pirtle）、E.C.、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベ
テリナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）46:1359
-1367（1985）］、およびNIA−４菌株、すなわち、アイ
ルランドにおいて分離されたヴィルレントNIA−３菌株
の誘導体［バスケルヴィレ（Baskerville）、A.、マク
フェラン（McFerran）、J.B.およびダウ（Dow）、C.、
ベテリナリー・ブレチン（Vet. Bull.）43:465-480（1
973）参照］。 PRV（BUK−５）菌株のKpnIおよびBamHIの制限パター
ンは、米国特許第4,514,497号の第３図、レーン２およ
び７に示されている。PRV（BUK−５）およびPRV（BUK−
７）菌株のKpnI、BamHIおよびBgl IIの制限断片の大き
さは下の表１に要約されている（米国特許第4,514,497
号参照）。 米国特許第4,514,497号の第３図は、PRVのヴィルレン
トのアウジェスズキー（Aujeszky）菌株および弱毒PRV
（BUK−５）菌株のDNA制限パターンが次の３つの方法で
異なることを立証している。第１に、弱毒PRV（BUK−
５）DNAはいくつかの制限断片（例えば、BamHI-10G、Ba
mHI−ＯおよびKpnI−Ｘ）を含有し、これらの断片は、P
RVのヴィルレントのアウジェスズキー（Aujeszky）菌株
のDNA中に存在しない。PRVのブカレスト（Bucharest）
ワクチン、例えば、ノルデン（Norden）、PRV（BUK−
５）の中のこれらの変更した断片は、ヴィルレントPRV
菌株のすべてにおけるＵL区域の末端に通常存在する配
列がブカレスト（Bucharest）菌株におけるＵLおよびIR
S区域の接合部に逆位の形態で、また、見出されるとい
う事実から生ずる。結局、ブカレスト（Bucharest）菌
株のＵLおよびＵS区域の両者は、互いに関して逆位にな
って４つのDNA異性体（すなわち、クラスＥ DNA）を生
成することができる［ロムニクジ（Lomniczi）、B.、ブ
ラケンシップ（Blankenship）、M.L.およびベン−ポラ
ト（Ben-Porat）、T.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）4
9:970-979（1984）参照］。 第２に、PRV（BUK−５）のBamHI-11断片は、ゲル電気
泳動の間によりゆっくり移動し、それゆえに、PRVのア
ウジェスズキー（Aujeszky）菌株のBamHI-11断片よりも
大きいが大きい。BamHI-11断片はPRVのtk遺伝子および
他の遺伝子を暗号化する。ヌクレオチドのシークエンシ
ング（sequencing）の研究により、PRV（BUK−５）BamH
I-11断片の大きさの増加は、PRVのtk遺伝子とPRVのtk遺
伝子から下流の次の遺伝子とを架橋する非解読配列中の
約200塩基対（以後「bp」）の反復から生ずることが立
証された。反復配列はポリアデニル化（AATAAA）信号を
含有する［キット（Kit）、S.、キット（Kit）、M.およ
びオーツカ（Otsuka）、H.、ヘルペスウイルス（Herpes
virus）、ラップ（Rapp）、F.編（アラン R. リス、
インコーポレーテッド、ニューヨーク）、311-327ペー
ジ（1984）参照］。この反復配列はPRVのアウジェスズ
キー（Aujeszky）菌株BamHI-11断片中には観察されな
い。 第３の差異はことに重要である。PRVの弱毒したブカ
レスト（Bucharest）、バルサ（Bartha）およびNIA−４
ワクチンの菌株はすべてKpnI−Ｉ断片中にほぼ4Kbpの欠
失を有する。これはBamHI−７からのBamHI-12断片全体
および隣接する配列の損失に相当する（第１図参照）。
この欠失は弱毒菌株の特性であり、そして米国、ヨーロ
ッパおよび台湾において分離された多くのヴィルレント
PRV菌株中に観察されなかった。KpnI−Ｉ断片中にこの
欠失は、少なくとも一部分、弱毒したバルサ（Barth
a）、ブカレスト（Bucharest）およびNIA−４のPRV菌株
のヴィルレンスの減少を説明する。こうして、野外菌株
のKpnI−１配列のすべてを弱毒ワクチン菌株に回復する
（restore）遺伝標識伝達実験はヴィルレンスを回復す
るが、ヴィルレントPRV菌株のこのKpnI−Ｉ断片中の欠
失の遺伝子操作は弱毒PRVを生産することがわかった
［ロムニクジ（Lomniczi）、B.、ワタナベ（Watanab
e）、S.、ベン−ポラト（Ben-Porat）、T.およびカプラ
ン（Kaplan）、A.A.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）5
2:198-205（1984）；ロムニクジ（Lomniczi）、B.、ブ
ラケンシップ（Blankenship）、M.L.およびベン−ポラ
ト（Ben-Porat）、T.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）4
9:970-979（1984）；バーンス（Berns）、A.、バン・デ
ン・オウウェランド（van den Oweland）、A.、クイン
ト（Quint）、W.、バン・オイルショット（van Oirscho
t）、J.およびギールケンス（Gielkens）、A.L.J.、ウ
イルス学雑誌（J. Virol.）53:89-93（1985）；ギール
ケンス（Gielkens）、A.L.J.、バン・オイルショット
（van Oirschot）、J.およびバーンス（Berns）、A.、
一般ウイルス学雑誌（J. Gen. Virol.）66:69-82（19
85）；およびプリチェット（Pritchett）、R.F.、ブシ
ュ（Bush）、C.E.、チャング（Chang）、T.J.、ワング
（Wang）、J.T.およびジー（Zee）、Y.C.、アメリカン
・ジャーナル・オブ・ペテリナリー・リサーチ（Am.
J. Vet. Res.）45:2486-2489（1984）参照］。弱毒ワ
クチン菌株から欠失されたが、ヴィルレントPRV野外菌
株中に存在する配列は、gIまたはgAと表示する、より小
さいPRV糖蛋白質を暗号化する［メッテンレイター（Met
tenleiter）、T.C.、ルーカクス（Lukacs）、N.および
ルジハ（Rziha）、H.J.、ウイルス学雑誌（J. Viro
l.）53:52-57（1985）；およびメッテンレイター（Mett
enleiter）、T.C.、ルーカクス（Lukacs）、N.およびル
ジハ（Rziha）、H.J.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）5
6:307-311（1985）参照］。前述の観察により示される
ように、PRVのKpnI−Ｉ（BamHI-12＋７）配列により暗
号化される遺伝子の生産物はPRVのヴィルレンスの遺伝
標識である。 最近、PRVのバーサ（Bartha）Ｋ菌株は、見掛けの分
子量が約92,000〜98,000ダルトンである糖蛋白質を暗号
化するPRV遺伝子（以後g92）中に「漏出」突然変異体を
含有することが発見された［パウル（Paul）、P.S.、メ
ルゲリング（Mengeling）、W.L.およびパートル（Pirtl
e）、E.C.、アーチーブス・オブ・バイロロジー（Arch.
Virol.）74:193-198（1982）参照］。すなわち、g92
糖蛋白質はその正常レベルの約10％で生産される。この
「漏出」突然変異体は、部分的に、PRVのバーサ（Brth
a）Ｋ菌株のヴィルレンスを説明することができる。PRV
g92遺伝子中のこの「漏出」突然変異体はバーサ（Barth
a）A57菌株中に見出されない［ベン−ポラト（Ben-Pora
t）、T.、デマルチ（DeMarchi）、J.、ベンドリイス（P
endrys）、J.、ベーチ（Veach）、R.A.およびカプラン
（Kaplan）、A.S.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）57:1
91-196（1986）参照］。 しかしながら、従来の弱毒ワクチン菌株のすべて、す
なわち、ブカレスト（Bucharest）およびその誘導体、
バーサ（Bartha）およびその誘導体、およびNIA−４は
それらのtk遺伝子が変更されていない。すなわち、それ
らのすべては感染に機能的な、ウイルス特異的TK酵素を
生産することを強調すべきである。 前述のPRV菌株のそれ以上の弱毒は、自発的または突
然変異原誘発tk−ウイルスの分離によって、あるいはPR
Vのtk−欠失突然変異体の分離によって達成されてきた
［米国特許第4,514,497号；キット（Kit）、S.、キット
（Kit）、M.およびパートル（Pirtle）、E.C.、アメリ
カン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（A
m. J. Vet. Res.）46:1359-1367（1985）；およびロ
ムニクジ（Lomniczi）、B.、ワタナベ（Watanabe）、
S.、ベン−ポラト（Ben-Porat）、T.およびカプラン（K
aplan）、A.A.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）52:198-
205（1984）参照］。こうして、PRVのヴィルレンスはマ
ルチジェニック（multigenic）である。すなわち、PRV
のヴィルレンスは１より多い活性遺伝子の結果である。 tk遺伝子中に欠失をもつPRV突然変異体、すなわち、P
RV（BUK−３）（ATCC No.VR-2074）の制限パターンは、
米国特許第4,514,497号の第３図、レーン１および６中
に示されている。その中の第３図から理解できるよう
に、tk-欠失突然変異体、すなわち、PRV（BUK−３）のB
amHIおよびKpnI制限パターンはtk+親株のそれと同一で
あるが、ただしdl 11と表示するBamHI-11断片および、P
RV tk遺伝子を暗号化するKpnI-JL断片（第２図、プラス
ミドpBK-JL参照）がより速く移動し、それゆえ親PRV（B
UK−５）菌株中におけるよりPRV（BUK−３）菌株の欠失
突然変異体中において約150塩基対だけ小さいことを除
外する（米国特許第4,514,497号の第３図、レーン２お
よび７をレーン１および６と比較せよ）。 IV、偽狂犬病ウイルスの外膜蛋白質 偽狂犬病のウイルス粒子は、直径がほぼ180nmであり
そして、他のヘルペスウイルスと同様に、リポ蛋白質外
膜により取囲まれた162カプソマーから構成された20面
体のカプシド（直径100nm）からなる。非イオン性洗
剤、例えば、トリトンＸ−100でウイルス外膜を除去す
ると、DNAのすべてとウイルス蛋白質の約半分を含有す
る、ウイルスのヌクレオカプシドからの外膜を分離する
ことができる。ヌクレオカプシドは３つの主要蛋白質、
大きさ約142,000、35,000および32,000ダルトン、大き
さ約62,000ダルトンの他の蛋白質、および大きさ約10,0
0〜115,000ダルトンの約12種類の他の小比率の蛋白質か
らなる。外膜はウイルス蛋白質の残部を含有し、これら
の蛋白質は少なくとも７種類の糖蛋白質および非グリコ
シル化蛋白質を含む。他のアルファヘルペスウイルス、
例えば、HSV−１では、外膜蛋白質およびそれらの前駆
体は細胞性および体液性免疫応答を誘発するときある役
割をもち、そしてウイルス−細胞の融合を促進する。 PRV外膜蛋白質の沈降分析およびクロマトグラフィー
の研究により、それらのいくつかは互いに複合化し、あ
るものはジサルファイド架橋を経て共有結合することが
明らかにされた。モノクローナル抗体を使用する免疫沈
澱による外膜蛋白質をさらに分析すると、ジサルファイ
ド架橋により共有結合したウイルス糖蛋白質はgIIa（分
子量約120,000〜125,000ダルトン）、gIIb（分子量約6
8,00〜74,000ダルトン）、gIIc（分子量約52,000〜58,0
00ダルトン）であることが示された［ハンプルHamp
l）、H.、ベン−ポラト（Ben-Plrat）、T.、エールリハ
ー（Ehrliher）、L.、ヘイバーメール（Habermehl）、
K.O.およびカプラー（Kaplan）、A.S.、ウイルス学雑誌
（J. Virol.）52:583-590（1984）；およびルカクス
（Lukacs）、N.、チール（Thiel）、H.J.、メッテンレ
イター（Mettenleiter）、T.C.およびリザ（Rhiza）、
H.J.,ウイルス学雑誌（J. Virol.）53:166-173（198
5）参照］。すべての糖蛋白質は、それらの抗原決定因
子の同一性および部分的ポリペプチドのマッピングによ
り示されるように、広範な配列相同性を共有する。こう
して、それらは多分単一の前駆体蛋白質、すなわち、gI
Iaから由来する。 ３つの小比率の蛋白質、すなわち、gI（分子量約115,
000〜120,000ダルトン）、gV（分子量約98,000ダルト
ン）およびgVI（分子量約62,000ダルトン）は、p115、
すなわち、非グルコシル化蛋白質（分子量約115,000ダ
ルトン）と非共有結合して複合体を形成する。他の主要
糖蛋白質、すなわち、gIII（見掛けの分子量92,000〜9
8,000）はいかなる他の蛋白質とも複合化しない。 前述のすべての糖蛋白質はモノクローナル抗体と反応
し、このことによりそれらはPRV粒子の表面上にさらさ
れることを示す。さらに、gIIIに対するモノクローナル
抗体はウイルスの吸着を阻害し、そして補体の不存在下
にウイルスの感染性を中和する。 クローン化HSV−1 DNAプローブを使用する分子交雑実
験が実施されて、主要なHSV−１糖蛋白質遺伝子、すな
わち、HSV−1 gB、HSV−1 gCおよびHSV−1 gDがPRV頭蛋
白質遺伝子のいずれかとヌクレオチド配列の相同性を共
有するかどうかが研究された。これらの研究により、HS
V−1 gB解読配列を表わすHSV−1 DNA断片はgII複合体を
暗号化するPRV DNAと特異的に交雑するが、HSV− gCお
よびHSV−1 gDを表わすHSV−1 DNA断片はPRV DNAと特異
的に交雑しないことが示された［ロビンス（Robbin
s）、A.K.、ゴールド（Gold）、C.、エンクイスト（Enq
uist）、L.W.、ウィーリー（Whealy）、M.E.およびワト
ソン（Watson）、R.J.、ザ・テント・インターナショナ
ル・ヘルペスウイルス・ワークショップ（the Tenth In
ternational Herpesvirus Workshop）、ミシガン州アン
・アーバー、1985年８月11-26日、において提出された
アブストラクツ、130ページ参照］。モノクローナル抗
体を使用する遺伝子分析および研究により、また、PRV
遺伝子は、gII糖蛋白質複合体地図を、BamHI−１断片に
おいてPRVゲノムのＵの左端において、約0.110〜0.128
地図単位において暗号化することが示された［第１図お
よびウエイゼン（Wathen）、M.、ホランド（Hollan
d）、L.、グロリオソ（Glorioso）、J.およびレビン（L
ebine）、M.、ザ・テンス・インターナショナル・ヘル
ペスウイルス・ワークショップ（the Tenth Internatio
nal Herpesvirus Workshop）、ミシガン州アン・アーバ
ー、1985年８月11-26日、において提出されたアブスト
ラクツ、140ページ参照］。この位置はPRV特異的DNAポ
リメラーゼおよびDNA結合蛋白質を暗号化するPRV遺伝子
のそれに近接する。HSV−1 gB決定は、また、PRV特異的
DNAポリメラーゼおよびDNA結合蛋白質の遺伝子に対して
次に位置する。これは、さらに、PRV-1gII遺伝子とPRV-
1gB遺伝子との間の相同関係を立証する。 PRV-1gB遺伝子は、ウイルスの複製および浸透におい
て必須の役割を有することが知られている、唯一のHSV
−１糖蛋白質遺伝子である。すなわち、温度感受性突然
変異体はPRV-1gB遺伝子中に変更をもって存在する［ス
ピアー、P.G.ヘルペスウイルス類（The Herpesviruse
s）、ロイズマン（Roizman）、B.編（プレナム・プレ
ス、ニューヨーク）、Vo.3、315-356（1985）；ホラン
ド（Holland）、T.C.、ホマ（Homa）、F.L.、マーリン
（Marlin）、S.D.、レビン（Levine）、M.およびグロリ
オソ（Glorioso）、J.ウイルス学雑誌（J. Virol.）5
2:566-574（1984）；およびマーリン（Marlin）、S.
D.、ホランド（Holland）、T.C.、レビン（Levine）、
M.およびグロリオン（Glorioso）、J.C.、ウイルス学雑
誌（J. Virol.）53:128-136（1985）参照］。この発見
はPRVgII遺伝子もPRV複製のための必須でありうること
を示唆している。 PRVg1を暗号化する遺伝子は、BamHI−７およびBamHI-
12断片中のPRVゲノムのＵS区域においてマッピングした
（第１図参照）。この区域から転写されたPRVメッセー
ジャーRNAについての細胞不含翻訳の研究により、分子
量約78,000および83,000ダルトンの２つのポリペプチド
は、BamHI-12およびBamHI−７断片から転写および翻訳
されることが示された。これらの２つのポリペプチドは
PRVのgIに対して特異的のモノクローナル抗体によって
沈殿され、これにより分子量約78,000および83,000ダル
トンのポリペプチドは非グリコシル化gI前駆体であるこ
とが示される［メッテンレイター（Mettenleiter）、T.
C.、ルーカクス（Lukacs）、N.およびルジハ（Rzih
a）、H.J.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）、53:52-57
（1985）参照］。上に示したように、成熟グリコシル化
gIの見掛けの分子量は約115,000〜120,000ダルタトンで
ある。 前述のように、PRV gIの発現はPRVの感染性に対して
絶対（obligatory）ではないが、gIの発現はPRVのヴィ
ルレンスにとって重要であることが示された［メッテン
レイター（Mettenleiter）、T.C.、ルーカクス（Lukac
s）、N.およびルジハ（Rziha）、H.J.、ウイルス学雑誌
（J. Virol.）56:307-311（1985）；バーンス（Bern
s）、A.、バン・デン・オウウェランド（van den Owela
nd）、A.、クイント（Quint）、W.、バン・オイルショ
ット（van Oirschot）、J.およびギールケンス（Gielke
ns）、A.L.J.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）、53:89-
93（1985）；ロムニクジ（Lomniczi）、B.、ブラケンシ
ップ（Blankenship）、M.L.およびベン−ポラト（Ben-P
orat）、T.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）49:970-979
（1984）参照］。すなわち、PRVの３種類のワクチン、
すなわち、ブカレスト（Bucharest）、バーサ（Barth
a）およびNIA−４は、BamHI-12断片を欠き、BamHI−７
断片中に欠失を示し、そしてgI合成することができな
い。tk-欠失突然変異体PRV（BUK−３）は、また、BamHI
-12断片を欠き、そしてBamHI−７断片中に欠失を有す
る。これは期待されることである。なぜなら、これはブ
カレスト（Bucharest）菌株PRV（BUK−５）およびPRV
（BUK−７）から誘導されたからである［米国特許第4,5
14,497号およびキット（Kit）、S.、キット（Kit）、M.
およびパートル（Pirtle）、E.C.、アメリカン・ジャー
ナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Vet.
Res.）46:1359-1367（1985）参照］。さらに、ヴィル
レントPRV菌株の弱毒は、PRV DNAのBamHI−７およびBam
HI-12断片中にDNA配列の欠失をつくることによって操作
された［欧州特許公告第0141458号参照］。他方におい
て、PRVのヴィルレントの実験室菌株および野外菌株の
大部分は完全なBamHI-7＋BamHI-12のDAN配列を含有し、
それゆえPRV gIを発現する［ギエルキンス（Gielkin
s）、A.L.J.、ヴァン・オイルショット（van Oirscho
t）,J.T.およびバース（Berns）、A.J.M.、一般ウイル
ス学雑誌（J. Gen. Virol.）66:69-82（1985）；パー
トル（Pirtle）、E.C.、ワーゼン（Wathen）、M.W.、パ
ウル（Paul）、P.S.、メルゲリング（Mengeling）、W.
L.およびサックス（Sacks）、J.M.、アメリカン・ジャ
ーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Ve
t. Res.）45:1906-1912（1984）；およびプリチェット
（Pritchett）、R.F.、ブシュ（Bush）、C.E.、チャン
グ（Chang）、T,J.、ワング（Wang）、J.T.およびジー
（Zee）、Y.C.、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテ
リナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）45:2485-2
489（1984）参照］。 PRVで感染した細胞は大量の分子量89,000の硫酸化糖
蛋白質を細胞外流体中に分泌する。硫酸化糖蛋白質は非
構造PRV蛋白質である、すなわち、それはPRV粒子の一成
分ではない。その機能は未知である。この硫酸化糖蛋白
質と同一の分子量をもつ主要な細胞内ポリペプチドは、
これまで検出されてきていない。この硫酸化PRV糖蛋白
質はgXと表示され、そしてBamHI-10およびBamHI−７断
片の一部分を含有する2KbpのDAN断片中に、PRVゲノムの
ＵS区域をマッピングする［ペニングトン（Penningto
n）、T.H.およびマククレー（McCrea）、M.A.、一般ウ
イルス学雑誌（J. Gen. Virol.）34:155-165（197
7）；ケル（Kerr）、C.L.およびペニングトン（Penning
ton）、T.H.、一般ウイルス学雑誌（J. Gen. Viro
l.）65:1033-1041（1984）；およびレア（Rea）、T,
J.、チンミンス（Timmins）、J.G.、ロング（Long）、
G.W.およびポスト（Post）、L.E、ウイルス学雑誌（J.
Virol.）54:21-29（1985）参照］。こうして、PRV gX
遺伝子はBamHI-7＋BamHI-10断片中のPRVゲノムのＵS区
域中に暗号化され、そしてPRVゲノムのＵS区域中に同様
に暗号化されるPRV gI遺伝子は、BamHI-7＋BamHI-12断
片中のPRV gX遺伝子の右に暗号化される（第１図参
照）。 gXについて暗号化するPRVゲノムの区域はシークエン
シング（sequencing）され、そして498アミノ酸の遺伝
情報を指定する開いたリーディングフレームを含むこと
が発見され、真核動物のプロモーターおよびポリアデニ
ル化信号に共通の特徴を含有する配列によってフランキ
ングされている。コーデッド（coded）アミノ酸配列の
予測される分子量は53,000ダルトンであり、これはgXメ
ッセンジャーRNAの生体外翻訳後に見られる70,000の分
子量の前駆体の見掛けの質量よりかなり小さい。これは
この配列中のプロリン残基の百分率が高い（8.8％）た
めであると信じられる［レア（Rea）、T.J.、チンミン
ス（Timmins）、J.G.、ロング（Long）、G.W.およびポ
スト（Post）、L.E.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）5
4:21-29（1985）参照］。 gp50と表示する、さらに他のPRV糖蛋白質の遺伝子
は、0.813-0.832地図単位でマッピングされ、これはgX
と同一のBamHI−７ヌクレオチド配列内に少なくとも部
分的に入る（第１図参照）。しかしながら、gXと異な
り、gp50はPRV粒子の表面上に存在する。gp50はPRV特異
型、mar197−１、の分離によって同定され、この変異型
は野外型PRVgp50に対して特異的の中和性モノクローナ
ル抗体（MCA50−１）に対して抵抗性である。mar197−
１変異型は補体の存在下または不存在下にMCA50−１抗
体に対して完全に抵抗性であるが、多価免疫血清によっ
て中和される。mar197−１変異型は状態でgp50を合成し
かつプロセシングするが、突然変異はMCA50−１抗体に
よるgp50の結合および免疫沈殿を防止する。これにより
立証されるように、突然変異はモノクローナル抗体のエ
ピトープに影響を及ぼすgp50遺伝子の構造部分的に存在
する。PRVゲノムの同一の小さい区域内のgXおよびgp50
のための遺伝子の位置は、２つの糖蛋白質遺伝子地図が
互いに非常に密接すること、あるいは前記糖蛋白質が多
少関係があるという可能性を発生させる［ワーゼン（Wa
then）、M.W.およびワーゼン（Wathen）、L.M.K.、ウイ
ルス学雑誌（J. Virol.）51:57-62（1984）参照］。 82,000ダルトンの見掛けの分子量をもつPRV糖蛋白質
（以後「gp82」）は、PRVゲノムのＵ区域中にPRVゲノム
上に0.290-0.309地図単位でマッピングされた。これはB
glII−Ｂ断片内においてBamH−２およびBamH−１断片の
接合部に近接して存在する［第１図およびウエイゼン
（Wathen）、M.、ホランド（Holland）、L.、グロリオ
ソ（Glorioso）、J.およびレビン（Lebine）、M.、ザ・
テンス・インターナショナル・ヘルペスウイルス・ワー
クショップ（the Tenth International Herpesvirus Wo
rkshop）、ミシガン州アン・アーバー、1985年８月11-2
6日、において提出されたアブストラクツ、140ページ参
照］。gp82は細胞培養において複製に必須ではなく、そ
してgp82に不存在に変更したプラークの形態［シンシシ
ャル・フォーメイション（sysncytial formation）］に
関連する。gp82に対してレイズ（raise）されたモノク
ローナル抵抗を使用して、gp82はpg92に多分壮途するこ
とが決定された［ワーゼン（Wathen）、L.M.K.、プラッ
ト（Platt）、V.B.、ワーゼン（Wathen）、M.W.、バン
・デウセン（van Deusen）、R.A.、ウェットストーン
（Whetstone）、C.A.およびパートル（Pirtle）、E.
C.、ウイルスの研究（Virus Research）4:19-29（198
5）およびその中の研究参照］。 最後に、見掛けの分子量が約92,000〜98,000である糖
蛋白質を暗号化するPRV遺伝子、すなわち、g92は、PRV
ゲノム上に0.38〜0.42地図単位でマッピングされた。こ
れはBglII−Ｂ断片内においてBamH−２およびBamH−９
断片の接合部に近接して存在する［第１図およびロビン
ス（Robbins）、A.K.、ワイス（Weis）、J.H.、エンク
イスト（Enquist）、L.W.およびワトソン（Watoson）、
R.J.、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプ
ライド・ジェネチックス（J. Mol. Appl. Genet.）
2:485-496（1984）参照］。この地図位置はワーゼン（W
athen）らによりgp82に指定された地図位置からBamHI−
１の反対側に位置する［ワーゼン（Wathen）、L.M.K.、
プラット（Platt）、V.B.、ワーゼン（Wathen）、M.
W.、バン・デウセン（van Deusen）、R.A.、ウェットス
トーン（Whetstone）、C.A.およびパートル（Pirtl
e）、E.C.、ウイルスの研究（Virus Research）4:19-2
9（1985）参照］。 PRV g92遺伝子についてのヌクレオチドのシークエン
シング（sequencing）のの研究は記載された［ロビンス
（Robbins）、A.K.、ザ・ナインス・インターナショナ
ル・ヘルペスウイルス・ワークショップ（the Ninth In
ternational Herpesvirus Workshop）、ワシントン州シ
アトル、1984年８月24-29日、における提示参照］。こ
れらの研究は、BamHI−２およびBamHI−９断片の接合部
にまたがるDNA断片が479アミノ酸を暗号化するオープン
リーディングフレームを含有することを明らかにした。
推定の翻訳開始暗号は、プラスミドpBUK:Stu12/PstI上
の5.2地図単位におけるNcoI制限位置に存在する（第４
図参照）。TGA停止信号から下流の31ヌクレオチドは、
コンセンサス「AATAAA」ポリアデニル化信号である。 g92配列から予測される非グリコシル化蛋白質の分子
量は51,000ダルトンである。この分子量51,000のポリペ
プチドは、８つの潜在的なグリコシル化位置、すなわ
ち、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン
−Ｘ−セリン配列を含有する。g92は分子量51,000の前
駆体の成熟した、プロセシングされ、かつ完全にグリコ
シル化された形態であると信じられる。見掛けの分子量
が約74,000〜79,000ダルトンである。PRV g92の部分的
にグリコシル化された前駆体（以後「g74」）は、ま
た、糖蛋白質のプロセシングを阻害する薬物モネシンの
使用によって観測された［ルカックス（Lucacs）、N.、
チエール（Thiel）、H.J.、メッテンレイター（Mettnle
iter）、T.C.およびルジハ（Rziha）、H.J.、ウイルス
の研究（Virus Research）53:166-173（1985）参
照］。 g92およびg74の両者の使用する、免疫沈殿およびウエ
スタン・ブロッティングの分析において、特異的に反応
する抗血清は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲルの電気泳動アッセイ（SDS-PAGE）後に切出さ
れた、変性g74ポリペプチドでウサギを免疫化すること
によって得られた［ロビンス（Robbins）、A.K.、ワイ
ス（Weis）、J.H.、エンクイスト（Enquist）、L.W.お
よびワトソン（Watoson）、R.J.、ジャーナル・オブ・
モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネチックス
（J. Mol. Appl. Genet.）2:486-496（1984）参
照］。これと対照的に、SDS-PAGEから分離されたPRV蛋
白質の変性されたg110-g92群に対してウサギ中でレイズ
された抗血清は、免疫沈殿およびウエスタン・ブロッテ
ィング分析において、見掛けの分子量が110,000、92,00
0および55,000ダルトンである蛋白質と主として反応す
る。これらの実験、およびここに後述するスクロース匂
配遠心実験は、g92おびその前駆体、g74、がBamHI−2/B
amHI−９接合部にマッピングされ、そして糖蛋白質gIII
に相当することを示唆する［ハンプル（Hampl）、H.、
ベン−ポラト（Ben−Plrat）、T.、エールリハー（Ehrl
iher）、L.、ヘイバーメール（Habermehl）、K.O.およ
びカプラン（Kaplan）、A.S.、ウイルス学雑誌（J. Vi
rol.）52:583-590（1984）およびルカクス（Lukacs）、
N.、チール（Thiel）、H.J.、メッテンレイター（Mette
nleiter）、T.C.およびリザ（Rhiza）、H.J.、ウイルス
学雑誌（J. Virol.）53:166-173（1985）参照］。 糖蛋白質gIIIの生産は、ヴィルレントPRV菌株、例え
ば、ライス（Rice）菌株、Ind−Ｆ菌株、アイオワ（Iow
a）62-26菌株、カプラン（Kaplan）菌株、ベッカー（Be
cker）菌株およびフィラキシア（Phylaxia）菌株で感染
された細胞、および弱毒PRV菌株、例えば、バーサ（Bar
tha）A57菌株、ブカレスト（Bucharest）（Norden）菌
株およびNIA−４菌株で感染させた細胞において立証さ
れた［レア（Rea）、T.J.、チンミンス（Timmins）、J.
G.、ロング（Long）、G.W.およびポスト（Post）、L.
E.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）54:21-29（1985）；
ワーゼン（Wathen）、M.W.、およびワーゼン（Wathe
n）、L.M.K.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）51:57-62
（1984）；ワーゼン（Wathen）、L.M.K.、プラット（Pl
att）、V.B.、ワーゼン（Wathen）、M.W.、バン・デウ
セン（van Deusen）、R.A.、ウェットストーン（Whetst
one）、C.A.およびパートル（Pirtle）、E.C.、ウイル
スの研究（Virus Research）、4:19-29（1985）；ルカ
クス（Lukacs）、N.、チール（Thiel）、H.J.、メッテ
ンレイター（Mettenleiter）、T.C.およびリザ（Rhiz
a）、H.J.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）53:166-173
（1985）；ロビンス（Robbins）、A.K.、ワイス（Wie
s）、J.H.、エンクイスト（Enquist）、L.W.およびワト
ソン（Watoson）、R.J.、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・アンド・アプライド・ジェネチックス（J. Mol.
Appl. Genet.）2:485-496（1984）；ハンプル（Hamp
l）、H.、ベン−ポラト（Ben-Plrat）、T.、エールリハ
ー（Ehrliher）、L.、ヘイバーメール（Habermehl）、
K.O.およびカプラン（Kaplan）、A.S.、ウイルス学雑誌
（J. Virol.）56:307-311（1985）参照］。 前述のように、バーサ（Bartha）Ｋ菌株は糖蛋白質g9
2の生産能力が低い。すなわち、バーサ（Bartha）Ｋ菌
株はわずかに約10％の正常レベルのg92糖蛋白質を生産
する［ベン−ポラト（Ben-Porat）、T.、デマルチ（De
Marchi）、J.、ペンドリイス（Pendrys）、J.、ベーチ
（Veach）、R.A.およびカプラン（Kaplan）、A.S.、ウ
イルス学雑誌（J. Virol.）57:191-196（1986）参
照］。それにもかかわらず、この量のg092はそれでワク
チン接種した動物において糖蛋白質g92に対する抗体を
誘発させるためには十分であろう。結局、バーサ（Bart
ha）Ｋ菌株でワクチン接種した動物から得られた抗血清
は、他のPRV菌株でワクチン接種したブタからの抗血清
と同一に抗原をなお認識するであろう。それゆえ、バー
サ（Bartha）Ｋ菌株でワクチン接種した動物を、他のPR
V菌株またはPRV野外菌株で感染した動物と区別すること
は不可能である。さらに、バーサ（Bartha）Ｋ菌株が正
常レベルのg92を生産するものへ復帰することは、排除
されない。 本発明においては、それでワクチン接種した動物が、
g92遺伝子中の欠失および／または挿入突然変異のた
め、g92遺伝子で暗号化された、いかなる抗原ポリペプ
チドをも生産せずかつg92抗原の生産に復帰できない。
偽狂犬病ウイルスを、初めて提供することが可能となっ
た。結局、このワクチンを接種した動物は他のPRVワク
チンまたはPRV野外菌株で感染した動物と区別すること
でき、こうして検疫手段により偽狂犬病の病気のエラデ
ィケイション（erradication）を可能である。さらに、
本発明において、前述のように、他のPRVワクチンおよ
び野外菌株の両者と区別することができ、かつ偽狂犬病
の病気の広がりの抑制において有効であるばかりでな
く、かつまた、それを接種した動物が、PRVのtk遺伝子
中の突然変異のため、ワクチンのウイルスの保菌体とな
らず、かつ病原体の野外菌株による休止感染を獲得しな
い、PRVワクチンを、初めて、提供することが可能とな
った。 本発明の目的は、偽狂犬病の病気の広がりを抑制する
のに有効な偽狂犬病ワクチンを提供することである。 本発明の他の目的は、動物をそれでワクチン接種した
ときワクチンのウイルスまたは野外菌株の保菌体になら
ない、偽狂犬病ワクチンを提供することである。 本発明のさらに他の目的は、野外菌株のワクチンおよ
び他のPRVワクチンのウイルスと区別することのできる
偽狂犬病ワクチンを提供することである。 本発明のほかの目的は、それでワクチン接種した動物
は野外菌株ウイルスで感染した動物または他のPRVワク
チンウイルスでワクチン接種した動物と区別することの
できる、偽狂犬病ワクチンを提供することである。 本発明のなお他の目的は、g92遺伝子中の欠失および
／または挿入の両者の結果、抗原g92ポリペプチドを生
産することができない偽狂犬病ウイルスを提供すること
である。 本発明のさらに他の目的は、tk遺伝子の解読配列中の
突然変異の結果機能的チミジンキナーゼ酵素の活性を生
成することができず、かつg92遺伝子中の欠失、挿入、
または欠失および挿入の両者の結果、抗原g92ポリペプ
チドを生産することができない偽狂犬病ウイルスを提供
することである。 本発明の他の目的は、それでワクチン接種した動物が
g92糖蛋白質に対する抗体を発生しない、偽狂犬病ウイ
ルスを提供することである。 本発明のなお他の目的は、tk+に復帰することができ
ず、tk+偽狂犬病ウイルスと容易に区別することがで
き、そしてg92+に復帰することができない偽狂犬病ウイ
ルスを提供することである。 本発明のなおほかの目的は、30℃〜40℃の温度におい
て効率的に複製することができる。すなわち、温度抵抗
性ウイルスを包含する、偽狂犬病ウイルスを提供するこ
とである。 本発明の追加の目的は、g92遺伝子中に欠失および／
または挿入の突然変異を含有する偽狂犬病ウイルスを生
産する方法を提供することである。 本発明の他の目的は、以下の本発明の説明から明らか
となるであろう。 本発明の１つの実施態様において、前述の目的は、g9
2遺伝子中の欠失および／または挿入の両者の結果、抗
原g92ポリペプチドを生産することができないPRV、およ
び（１）製薬学的に有効な量の前記ウイルスおよび
（２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤を含ん
でなる偽狂犬病のためのワクチンによって達成された。 本発明の他の実施態様において、PRVは、また、TK遺
伝子中の突然変異の結果機能的TKを生産することができ
ない。 本発明のほかの実施態様において、PRVは、また、gI
遺伝子中の突然変異の結果糖蛋白質gIを生産することが
できない。 本発明のなお他の実施態様において、PRVは温度抵抗
性ウイルスである。 本発明の追加の実施態様において、前述の目的は、工
程： （１） クローニングベクターと偽狂犬病ウイルスg92
遺伝子の実質的にすべておよびそのフランキング配列を
含有するDNA断片とを含んでなる雑種プラスミドを構成
し、 （２） 機能的選択可能な遺伝子を暗号化するDNA断片
を、工程（１）の得られた雑種プラスミドの偽狂犬病ウ
イルスg92遺伝子の中に挿入し、こうして機能的選択可
能な遺伝子を偽狂犬病ウイルスg92遺伝子のDNA配列によ
ってフランキングし、 （３） 選択可能な遺伝子の生産物を生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスからの感染性DNAをもつ工程
（２）の雑種プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞
の中に同時トラスフェクション（co-transfection）
し、そしてg92遺伝子中の挿入の結果抗原g92ポリペプチ
ドを生産することができない偽狂犬病ウイルス突然変異
体を生産するために、選択可能な遺伝子の生産物を生産
する偽狂犬病ウイルス組換え体について選択する、 を含んでなることを特徴とする、g92遺伝子中の挿入突
然変異の結果抗原g92ポリペプチドを生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスを生産する方法によって達成さ
れた。 本発明の追加の実施態様において、前述の目的は、工
程： （１） クローニングベクターと偽狂犬病ウイルスg92
遺伝子の実質的にすべておよびそのフランキング配列を
含有するDNA断片とを含んでなる雑種プラスミドを構成
し、 （２） 機能的選択可能な遺伝子を暗号化するDNA断片
を、工程（１）の得られた雑種プラスミドの偽狂犬病ウ
イルスg92遺伝子の中に挿入し、こうして機能的選択可
能な遺伝子を偽狂犬病ウイルスg92遺伝子のDNA配列によ
ってフランキングし、 （３） 選択可能な遺伝子の生産物を生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスからの感染性DNAをもつ工程
（２）の雑種プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞
の中に同時トラスフェクションし、そして選択可能な遺
伝子の生産物を生産することができない偽狂犬病ウイル
スについて選択し、 （４） g92遺伝子の実質的にすべてより少なくが存在
し、同時に欠失の各側に隣接して偽狂犬病ウイルスDNA
が保持されるように、工程（１）の雑種プラスミドから
DNA配列を欠失し、 （５） g92遺伝子中の欠失の結果抗原g92ポリペプチド
を生産することができない偽狂犬病ウイルス突然変異体
を生産するために、工程（３）の選択した偽狂犬病ウイ
ルスからの感染性DNAをもつ工程（４）の得られる雑種
プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞の中に同時ト
ラスフェクションし、そして選択可能な遺伝子の生産物
を生産しない偽狂犬病ウイルスについて選択する、 を含んでなることを特徴とする、g92遺伝子の欠失突然
変異の結果抗原g92ポリペプチドを生産することができ
ない偽狂犬病ウイルスを生産する方法によって達成され
た。 ほかの実施態様において、異質DAN配列を工程（４）
における欠失されたg92遺伝子配列の代わりに挿入し、
こうして抗原g92ポリペプチドが生産されないように
し、かつ欠失されたg92配列の各側に隣接してPRV DNA配
列が保持されるようにする。その懸架、工程（５）のPR
V突然変異体は欠失および挿入の突然変異の組合せの結
果抗原g92ポリペプチドを生産することができない。 なお他の実施態様において、工程（４）を工程
（４′）で置換する。この工程（４′）において、異質
DNA配列を工程（１）のプラスミド中に挿入し、こうし
て抗原g92ポリペプチドが生産されずかつ欠失されたg92
配列の各側に隣接してPRV DNA配列が保持されるように
する。その結果、工程（５）のPRV突然変異体は挿入の
突然変異の結果抗原g92ポリペプチドを生産することが
できない。 本発明の好ましい実施態様において、工程（３）の感
染性DNAは機能的チミジンキナーゼを生産することので
きないPRV突然変異体から誘導し、こうして工程（５）
の得られる突然変異体がtk-およびg92-の突然変異体で
あるようにする。 本発明のなおほかの実施態様において、工程（３）の
感染性DNAは温度抵抗性偽狂犬病から誘導し、こうして
工程（５）の得られる突然変異体が温度抵抗性およびg9
2-の突然変異体であるようにする。 本発明のなお他の実施態様において、g92遺伝子中の
欠失および／または挿入の結果、抗原g92ポリペプチド
を生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウイルス
突然変異体を選択しかつ生産するために、工程（５）の
得られる偽狂犬病ウイルスを温度感受性ウイルスに対し
て非許容性温度において増殖する。 前述のように、本発明の一つの実施態様において、前
述の目的は、g92遺伝子中の欠失および／または挿入の
両者の結果、抗原g92ポリペプチドを生産することがで
きないPRV、および（１）製薬学的に有効な量の前記ウ
イルスおよび（２）製薬学的に許容されうる担体または
希釈剤を含んでなる偽狂犬病のためのワクチンによって
達成された。 本発明の他の実施態様において、PRVは、また、tk遺
伝子中の突然変異の結果機能的TKを生産することができ
ない。 本発明ほかの実施態様において、PRVは、また、gI遺
伝子中の突然変異の結果糖蛋白質gIを生産することがで
きない。 本発明のなお他の実施態様において、PRVは温度抵抗
性ウイルスである。 本発明の追加の実施態様において、前述の目的は、工
程： （１） クローニングベクターと偽狂犬病ウイルスg92
遺伝子の実質的にすべておよびそのフランキング配列を
含有するDNA断片とを含んでなる雑種プラスミドを構成
し、 （２） 機能的選択可能な遺伝子を暗号化するDNA断片
を、工程（１）の得られた雑種プラスミドの偽狂犬病ウ
イルスg92遺伝子の中に挿入し、こうして機能的選択可
能な遺伝子を偽狂犬病ウイルスg92遺伝子のDNA配列によ
ってフランキングし、 （３） 選択可能な遺伝子の生産物を生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスからの感染性DNAをもつ工程
（２）の雑種プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞
の中に同時トラスフェクションし、そしてg92遺伝子中
の挿入の結果抗原g92ポリペプチドを生産することがで
きない偽狂犬病ウイルス突然変異体を生産するために、
選択可能な遺伝子の生産物を生産する偽狂犬病ウイルス
組換え体について選択する。 を含んでなることを特徴とする、g92遺伝子中の挿入突
然変異の結果抗原g92ポリペプチドを生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスを生産する方法によって達成さ
れた。 本発明の追加の実施態様において、前述の目的は、工
程： （１） クローニングベクターと偽狂犬病ウイルスg92
遺伝子の実質的にすべておよびそのフランキング配列を
含有するDNA断片とを含んでなる雑種プラスミドを構成
し、 （２） 機能的選択可能な遺伝子を暗号化するDNA断片
を、工程（１）の得られた雑種プラスミドの偽狂犬病ウ
イルスg92遺伝子の中に挿入し、こうして機能的選択可
能な遺伝子を偽狂犬病ウイルスg92遺伝子のDNA配列によ
ってフランキングし、 （３） 選択可能な遺伝子の生産物を生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスからの感染性DNAをもつ工程
（２）の雑種プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞
の中に同時トラスフェクションし、そして選択可能な遺
伝子の生産物を生産することができない偽狂犬病ウイル
スについて選択し、 （４） g92遺伝子の実質的にすべてより少なくが存在
し、同時に欠失の各側に隣接して偽狂犬病ウイルスDNA
が保持されるように、工程（１）の雑種プラスミドから
DNA配列を欠失し、 （５） g92遺伝子中の欠失の結果抗原g92ポリペプチド
を生産することができない偽狂犬病ウイルス突然変異体
を生産するために、工程（３）の選択した偽狂犬病ウイ
ルスからの感染性DNAをもつ工程（４）の得られた雑種
プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞の中に同時ト
ラスフェクションし、そして選択可能な遺伝子の生産物
を生産しない偽狂犬病ウイルスについて選択する、 を含んでなることを特徴とする、g92遺伝子の欠失突然
変異の結果抗原g92ポリペプチドを生産することができ
ない偽狂犬病ウイルスを生産する方法によって達成され
た。 ほかの実施態様において、異質DNA配列を工程（４）
における欠失されたg92遺伝子配列の代わりに挿入し、
こうして抗原g92ポリペプチドが生産されないように
し、かつ欠失されたg92配列の各側に隣接してPRV DNA配
列が保持されるようにする。その結果、工程（５）のPR
V突然変異体は欠失および挿入の突然変異の組合せの結
果抗原g92ポリペプチドを生産することができない。 なお他の実施態様において、工程（４）を工程
（４′）で置換する。この工程（４′）において、異質
DNA配列を工程（１）のプラスミド中に挿入し、こうし
て抗原g92ポリペプチドが生産されずかつ欠失されたg92
配列の各側に隣接してPRV DNA配列が保持されるように
する。その結果、工程（５）のPRV突然変異体は挿入の
突然変異の結果抗原g92ポリペプチドを生産することが
できない。 本発明の好ましい実施態様において、工程（３）の感
染生DNAは機能的チミジンキナーゼを生産することので
きないPRV突然変異体から誘導し、こうして工程（５）
の得られた突然変異体がtk-およびg92-の突然変異体で
あるようにする。 本発明のなおほかの実施態様において、工程（３）の
感染性DNAは温度抵抗性偽狂犬病から誘導し、こうして
工程（５）の得られる突然変異体が温度抵抗性およびg9
2-の突然変異体であるようにする。 本発明のなお他の実施態様において、g92遺伝子中の
欠失および／または挿入の結果、抗原g92ポリペプチド
を生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウイルス
突然変異体を選択しかつ生産するために、工程（５）の
得られる偽狂犬病ウイルスを温度感受性ウイルスに対し
て非許容性温度において増殖する。 g92ポリペプチドは大きさがほぼ1500bpである。欠失
および／または挿入の突然変異体は、例えば、（ｉ）g9
2遺伝子の適当な区域から75〜1500bpのDNA断片を排除す
る：（ii）解読配列の5'末端付近において５、７、８、
10および11bpまたは約50〜200bpのより小さい欠失を生
成し、こうして翻訳リーディングフレームを変更し、そ
してg92ポリペプチド合成を妨げる；（iii）50〜200bp
を欠失させてg92の主要なエピトープを暗号化するヌク
レオチド配列を排除する；（iv）約10〜200bpのPRV DNA
を欠失させると同時に異質DNA配列を挿入し、こうして
プロセシング、移送、あるいは適切にポリリボソーム上
に翻訳されない雑種RNAを生成する；あるいは（ｖ）異
質DNAを挿入し、こうしてプロセシング、移送、あるい
は適切ににポリリボソーム上に翻訳されない雑種RNAを
生成する、ことによって得ることができる。 本発明において、後に詳述する、欠失突然変異体PRV
（dlg92/dltk）は、g92遺伝子の解読配列の80％より多
くを含有する1171bpのRPV StuI断片を排除することによ
って生成された。この試料の大きさは、次のことを保証
した：（ｉ）ワクチン接種した動物中にg92抗体を誘発
することのできる、あるいはPRVの野外菌株で感染した
ブタ中に生産されるg29糖蛋白質に対する抗血清と反応
することのできる、抗原決定基、すなわち、エピトー
プ、をもつポリペプチドはつくられないであろう；およ
び（ii）復帰、すなわち、g92生産性ウイルスへの逆突
然変異は事実上不可能であった。本発明において、PRV
g92欠失突然変異は、復帰の頻度が低いので、好まし
い。 前述のように、他の実施態様において、欠失および／
または挿入の突然変異体は、欠失したPRV g92遺伝子DNA
の代わりに、あるいはPRV g92遺伝子DNA配列に加えて、
異質DNA配列を含有することができる。 ここで使用するとき、「異質DNA配列」は次の意味を
有する：（１）由来に無関係に非解読DNA配列、例え
ば、ウイルス、真核生物または原核生物の非解読配列お
よびオリゴヌクレオチドリンカーを含む；（２）PRV遺
伝子以外の遺伝子を暗号化するDNA配列、すなわち、解
読DNA配列、例えば、前述の選択可能な遺伝子；あるい
は（３）PRVゲノム上の正常位置からPRVゲノム上の他の
位置へ転移した解読PRV DNA配列、例えば、PRV（dlt
k）:PRVTK/STU12中に見出されるPRV g92遺伝子中に転移
したPRV tk遺伝子（第５図参照）。 オリゴヌクレチドリンカーは一般に長さが８〜10ヌク
レオチドでありが、これより長く、例えば、約50ヌクレ
オチドであるか、これより短く、例えば、４、５および
７ヌクレオチドであることができる。オリゴヌクレチド
の好ましい長さは約８〜10ヌクレオチドである。オリゴ
ヌクレチドリンカーのDNA配列は臨界的ではない。同様
に、本発明において使用する他の異質DNA配列の大きさ
および配列は臨界的ではない。一般に、オリゴヌクレチ
ドリンカー以外の異質DNA配列の大きさは約0.5〜5Kbpの
長さである。例えば、HSV−１、HSV−２およびマーモセ
ットのtk遺伝子は約1.3Kbpの長である；ニワトリおよび
ヒトのtk遺伝子は、それぞれ、約2.9および4.2Kbpの長
さである;neoR遺伝子は約1.0Kbpの長さである；そしてl
acZ遺伝子は約3.0Kbpの長さである。 異質DNAをプラスミドDNA中に挿入する方法は、使用す
る異質DNA配列のタイプに依存するであろう。オリゴヌ
クレチド配列中に１またはそれより大きい制限ヌクレア
ーゼ位置を含有するパリンドローム二本鎖リンカー［ニ
ュー・イングランド・バイオラボラトリーズ（New Engl
and Biolabs］を、よく知られた方法で挿入することが
できる［マニアチス（Maniatis）、T.、フリトシュ（Fr
itsch）、E.F.およびサムブルック（Sambrook）、J.、
分子クローニング（Molecular Cloning）、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（1982）参照］。
異質DNA配列は、また、末端トランスフェラーゼを使用
する相補ホモポリマーで末端をテイリング（tailing）
するとによってプラスミドDNA中に挿入することができ
る［マニアチス（Maniatis）、T.、フリトシュ（Fritsc
h）、E.F.およびサムブルック（Sambrook）、J.、分子
クローニング（Molecular Cloning）、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（1982）参照］。異質
DNA配列の長さを賢明に選択することにより、フレーム
シフトの突然変異体をg92遺伝子中に生成し、g92遺伝子
内の欠失の効果を増強することができる。 PRVのg92遺伝子の実質的にすべておよび工程（１）の
そのフランキング配列を含有するPRVのDNA断片を含んで
なる雑種プラスミドを構成するために、本発明において
使用する特定のクローニングベクターは、クローニング
ベクターが選択的特性、例えば、薬物抵抗の遺伝情報を
指定する遺伝子を含有するかぎり、臨界的ではない。こ
のようなクローニングベクターの例は、次のものを包含
する:pBR322およびpBR322に基づくベクター［セキグチ
（Sekiguchi）、T.、ニシモト（Nishimoto）、T.、カイ
（Kai）、R.およびセキグチ（Sekiguchi）、M.遺伝子
（Gene）21:267-272（1983）;pMB9、pBR325、pKH47［ベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Reseach
Laboratories）］、pBR328、pHC79［ベーリンガー・マ
ンハイム・バイオケミカルズ（Boehringer Manneheim B
iochmecals）］、ファージ・シャロン28［ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Reseach Laborator
ies）］、pKB11、pKSV-10［Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（B
iochmecals）］、pMAR420［オーツカ（Otsuka）、H.、
ヘイゼン（Hazen）、M.、キット（Kit）、M.、クアビ
（Quavi）、H.およびキット（Kit）、M.、ウイルス学
（Virol.）113:196-213（1981）およびオリゴ（dG）テ
イルド（tailed）pBR322［ニュー・イングランド・ニュ
ークリアー（New England Nuclear）］。pBR322は、31K
bpのPRVのBilIII−Ｂ断片がPRV g92遺伝子を含有しかつ
pBR322の単一の位置でクローニングすることができるの
で、本発明における好ましいクローニングベクターであ
る（第３図参照）。同様に、プラスミドpBUK:Stu12中に
6.0〜10.0地図単位で示される4KbpのPstI断片は、PRV g
92遺伝子を含有し、そしてpBR322の単一のPstI位置でク
ローニングすることができる。 本発明の雑種プラスミドを生長させるために使用する
特定の宿主は、本発明にとって臨界的ではない。このよ
うな宿主の例は次の通りである：大腸菌（以下E. col
i）K12 RR1［ボリバー（Bolivar）、F.、ロドリグエズ
（Rodriguez）、R.L.、グリーン（Greene）、P.J.、ベ
トラッチ（Betlach）、M.C.、ヘイネカー（Heyneke
r）、H.L.、ボイラー（Boyer）、H.W.、クロサ（Cros
a）、H.W.クロサ（Crosa）、J.H.およびファルコウ（Fa
lkow）、S.、遺伝子（Gene）3:95-113（1977）；E. co
li K12 HB101（ATCC No.33694）；E. coli MM21（ATCC
No.336780）；およびE. coli DH1（ATCC No.3384
9）。下E. coli）K12 RR1は好ましい宿主であり、そし
てＦ-hsd R M遺伝子型を有する。 同様に、別のベクター／クローニング系を使用するこ
とができ、そしてその例は次の通りである：E. coliま
たはサッカロミセス セレビシアエ（Saccharomyces c
erevisiae）の中で、あるいは両者の中で生長するプラ
スミドベクター、あるいはさらに動物細胞、例えば、マ
ウス中で生長するウシ乳頭腫ウイルスのようなベクター
（ATCC No.RL16161）［エルダー（Elder）、J.T.、スプ
リッツ（Spritz9、R.A.およびウェイスマン（Weissma
n）、S.M.、Ann, Rev. Gen. 15:295-340（1981）；お
よびウレ（Ure）、R.、グロスマン（Grossman）、L.お
よびモルデイブ（Moldave）、K.、酵素学における方法
「組換え体DNA」（Methods in Enzymology “Recomb
inant DNA"）、vol.101、部Ｃ、アカデミック・プレ
ス、ニューヨーク（1983）参照］。 ここで使用するとき、「フランキング配列（flanking
sequences）」は、g92遺伝子解読配列から上流、下
流、あるいは上流および下流の両者の配列を意味する。
上流の配列は転写制御信号、すなわち、プロモーターお
よびエンハンサーを含有し、ここで下流の配列はg92遺
伝子の転写停止およびポリアデニル化信号を含有する。 工程（１）および（４）の雑種プラスミド中に存在し
なくてはならない、精確なPRV g92遺伝子配列は、欠失
のために選択した配列および欠失突然変異の操作に使用
すべき制限ヌクレアーゼに依存するであろう。 工程（１）および（４）において必要なプラスミド中
の欠失に隣接する特定のPRV DNA配列は、雑種プラスミ
ド中の欠失に特異性に依存するであろう。一般に、欠失
および／または挿入の３′および５′の両者の側に隣接
するPRV DNA配列の大きさは、少なくとも約400bpであろ
う。プラスミドpBUK:gCdlStuI（第４図参照）におい
て、欠失の両側の３′および５′配列は長さが1.3Kbお
よび1.6Kbpであった。 工程（１）のg92糖蛋白質遺伝子を含有するPRV DNA断
片を得る、本発明における出発物質として使用する特定
のPRV菌株は、臨界的ではない。このような菌株の例
は、次のものを包含する:tk+PRV菌株、例えば、よく知
られた弱毒菌株、例えば、ブカレスト（Bucharest）菌
株、SUCH−１［スコダ（Skoda）、R.、ブラウナー（Bra
uner）、I.、サデッキー（Sadecky）、E.およびメイヤ
ー（Mayer）、V.、アクタ・ビロロジカ（Acta Viro
l.）8:1−９（1964）参照］、およびノルデン（Norde
n）菌株［パウル（Paul）、P.S.、メンゲリング（Menge
ling）、W.L.およびパートル（Pirtle）、E.C.、アーチ
ーブス・オブ・バイロロジー（Arch. Virol.）73:193-
198（1982）参照］；および病気の動物から直接分離し
たヴィルレント菌株または実験室において頻繁に継代培
養したヴィルレント菌株、例えば、アウジェスズキー
（Aujeszky）菌株（ATCC No.VR-135）、Ｐ−2208菌株、
KC-152D（菌株［マエス（Maes）、R.K.、カニツ（Kanit
z）、C.L.およびグスタフソン（Gustafson）、D.R.、ア
メリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ
（Am. J. Vet. Res.）44:2083〜2086（1983）、S52/
25アイオワ（Iowa）菌株、Ind−Ｆ菌株、Ind−Ｓ菌株、
Ind−Ｒ菌株およびショープ（Shope）菌株［パウル（Pa
ul）、P.S.、メンゲリング（Mengeling）、W.L.および
パートル（Pirtle）、E.C.、アーチーブス・オブ・バイ
ロロジー（Arch. Virol.（73:193-198（1982）参
照］；およびtk-PRV菌株、例えば、PRV（BUK-5A）（ATC
C No.VR-2028）およびPRV（BUK-dl 3）（ATCC No.VR-20
74）、これらのすべてはg92を生産する。 ここで使用するとき、「選択可能な遺伝子」は、存在
または不存在を容易に検出できる遺伝子生産物を暗号化
するDNA配列を意味する。工程（２）において使用する
選択可能な遺伝子は、本発明にとって臨界的ではない。
このような選択可能な遺伝子の例は、tk遺伝子、トラン
スポゾンTn遺伝子（neoR決定E. coli lacZ遺伝子を包
含することができる。 選択可能な遺伝子として使用する特定のtk遺伝子は、
本発明にとって臨界的ではない。すなわち、tk遺伝子は
前述の任意のtk+PRV菌株から、あるいはウイルス特異的
tk遺伝子を含有する他のウイルス、例えば、HSV−１、H
SV−２、およびマーモセットヘルペスウイルスから誘導
することができる［キット（Kit）、S.、キット（Ki
t）、M.、クアビ（Qavi）、H.、トルクラ（Trukula）、
D.およびオーツカ（Otsuka）、H.、バイオヒミカ・エト
・バイオフィジカ・アクタ（Biohim. Biophys. Act
a）741:158-170（1983）；オーツカ（Otsuka）、H.およ
びキット（Kit）、S.ウイルス学（Virol.）135:316-330
（1983）およびワグナー（Wagner）、M.J.、シャープ
（Sharp）、J.A.およびサンマー（Summer）、W.C.、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Proc. Natl. Acad. Sci.）USA
78:1441-1445（1981）参照］。あるいは、tk遺伝子は細
胞、例えば、ニワトリおよびヒトのtk遺伝子、由来であ
ることができる［メリル（Merill）、G.F.、ハーランド
（Harland）、R.N.、グラウジン（Graudine）、M.およ
びマクナイト（McKnight）、S.L.、モレキュラー・アン
ド・セルラー・バイオロジー（Mol. Cell. Biol.）4:
1769-1776（1984）およびブラッドシャウ（Bradsha
w）、H.D.Lジュニアーおよびディニンガー（Deininge
r）、P.L.、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ
ロジー（Mol. Cell. Biol.）4:2316-2320（1984）参
照］。PRVのブカレスト（Bucharest）菌株、例えば、PR
V（BUK−５）のtk遺伝子は、工程（３）において使用す
る感染性tk-PRV DNAがPRVのブカレスト（Bucharest）菌
株から誘導されるとき、選択可能な遺伝子として本発明
におて使用するのに好ましいtk遺伝子である。工程
（３）の得られる組換え体ウイルスは、ただちの速いPR
V制御信号に応答して、高い効率で、tk+遺伝子を発現す
べきである。異型のウイルスおよび細胞のtk+遺伝子
は、雑種PRV組換え体中の発現の効率に劣ることがあ
る。あるいは、工程（２）の雑種プラスミドは、PRV tk
+遺伝子の上流の転写制御配列に連結した異型のウイル
スまたは細胞のtk+遺伝子を含有することができる。 機能的TKの存在または不存在、すなわち、tk+またはt
k-のウイルスについて選択するための特定の選択手段は
臨界的ではない。tk+ウイルスのための選択手段の例
は、次の通りである:10-4モルのハイポキサンチン、10
-6モルのアミノプテリン、４×10-5モルのチミジンおよ
び10-5モルのグリシンを補充した生長培地（以後「HAT
G」）［ダッブス（Dubbs）、D.R.、オーツカ（Otsuk
a）、H.、クアビ（Quavi）、H.およびキット（Kit）、
S.、ウイルス学（Virol.）126:408-411（1983）参照］
および６×10-7モルのメトトレキセート、1.6×10-5モ
ルのチミジン、５×10-5モルのアデノシン、５×10-5モ
ルのグアノシンおよび10-4モルのグリシンを補充した生
長培地（以後「MTAGG」［ムンゴン（Mungon）、W.、ク
ライセルバード（Kraiselburd）、E.、デイビス（Davi
s）、D.およびマン（Mann）、J.、ウイルス学雑誌（J.
Virol.）7:813-820（1971）参照］。tk-ウイルスのた
めの選択手段の例は、次の通りである:25μg/mlの５−
ブロモデオキシウリジンを含有する生長培地（以後「Br
dUrd」）、100μg/mlの５−ヨードデオキシウリジンを
含有する生長培地（以後「IdUrd」または100μg/mlのア
ラビノシルチンを含有する生長培地。tk-ウイルスのた
めのヌクレオチド類似体の選択技術の多くの変法を使用
することもできる。例えば、ウイルスで感染した細胞は
約2.5〜25μg/mlのBrdUrdを含む培地中で生長させるこ
とができる。BrdUrdをtk+ウイルスのNDA中に組込まれか
つBrdUrd含有DNAは高度の刊行性であるので、ウイルス
の収穫物は約0.5μモルのヘヒスト（Hoechst）33258で
処理してDNAさらに光増感することができる。次いで、D
NAを「冷白色の」蛍光［ゼネラル・エレクトリック（Ge
neral Electric）］に４分間暴露して約50エルグ/mm2／
秒を供給する［ヒラリー（Hillary）、A.M.、ルゴ（Lug
o）、T.G.およびフォルニーア（Fournier）、R.E.K.、
バイオケルミカル・ジェネチックス（Biochem. Gene
t.）22:201-213（1984）参照］。この手順後、tk+ウイ
ルスの感染性は選択的に破壊されが、tk-ウイルスはこ
の処理に対して抵抗性である。 前述のように、そのtk遺伝子以外の選択可能な遺伝子
を工程（２）において使用することができ、こうして工
程（２）の得られる雑種プラスミドがPRV g92遺伝子のD
NA配列によりフランキングされた機能的選択可能な遺伝
子を含有するようにすることができる。例えば、ネオマ
イシンおよび約物に対する抵抗を付与することのできる
アミノグリコシド3'−ホスホトランスフェラーゼを暗号
化するトランスポゾンTn5遺伝子（neoR）［pNeo;ファー
マシア（Pharmacia）Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Biochme
cals）参照］。トランスポゾンTn5遺伝子を発現させる
ために、PRVプロモーターはトランスポゾンTn5遺伝子の
解読区域の対して5'に位置することが必要である。次い
で、このようにして生成されたキメラのプラスミドを工
程（３）におけるG418と一緒に使用して、g92糖蛋白質
を発現することのできない組換え体のPRV g92突然変異
体について選択することができる［フランケ（Frank
e）、C.A.、ライス（Rice）、C.M.およびフルビー（Hru
by）、D.E.、モレキュラー・アンド・セルラー・・バイ
オロジー（Mol. Cell. Biol.）5:1918-1924（1985）
参照］。 あるいは、前述のように、E. coli lacZ遺伝子を工
程（２）においてtk遺伝子の代わりに使用し、こうして
E. coli lacZ遺伝子がPRVプロモーターに融合され、そ
して得られるキメラ遺伝子が5'および3'の各側において
PRV g92ヌクレオチド配列によってフランキングされる
ようにすることができる。次いで、この雑種プラスミド
を工程（３）において使用して、β−ガラクトシダーゼ
を発現する組換え体PRVプラークについて選択すること
ができ、このプラークはＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドおよびXGal［ベーリンガー・マンハ
イム・バイオケミカルズ（Boehringer Manneheim Bioch
mecals）］で生成される青色光によって検出される［チ
ャクラバルチ（Chakrabarti）、S.、ブレチリング（Bre
chling）、K.およびモス（Moss）、B.、モレキュラー・
アンド・セルラー・・バイオロジー（Mol. Cell. Bio
l.）5:3403-3409（1985）参照］。 選択可能な遺伝子の生産物を生産することのできない
特定のPRV菌株は、臨界的でなく、そして使用する選択
可能な遺伝子に依存するであろう。こうして、選択可能
な遺伝子がtk遺伝子であるとき、使用するPRV菌株はtk-
PRV菌株でなくてはならない。tk-PRV菌株は自然突然変
異体、突然変異原誘発突然変異体、または欠失および／
または挿入の突然変異体であることができ、ただしそれ
らは検出可能な頻度で、例えば、HATGを補充した生長培
地中で、tk+に復帰してはならない。自然突然変異体の
冷は、araT抵抗性菌株、例えば、tk-PRV（Ka）、tk-PRV
（Bartha）およびtk-PRV（Norden）を包含する［ロムニ
クジ（Lomniczi）、B.、ワタナベ（Watanabe）、S.、ベ
ン−ポラト（Ben-Porat）、T.およびカプラン（Kapla
n）、A.A.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）52:198-205
（1984）参照］。突然変異原誘発突然変異体の例は、PR
V（BUK-5A）（ATCC No.VR-2028）を含む、米国特許第4,
514,497号中に記載される突然変異体を包含する。欠失
突然変異体の例は、米国特許第4,514,497号中に記載さ
れいるものを包含し、PRV（BUK-dl 3）（ATCC N.VR-207
4）を含む。PRV（BUKE-dl 3）は、PRV gIを同様に生産
しない、突然変異原誘発tk-PRV、すなわち、高度に弱毒
した温度抵抗性PRVであるPRV（BUK-5A）（ATCC No.VR-2
028）から誘導されるので、好ましい欠失突然変異体で
ある。PRVはウイルス特異的トランスポゾンTn5遺伝子ま
たはE. coli lacZ遺伝子について暗号化しないので、
これらの選択可能な遺伝子を使用するとき、tk-PRVを含
む、前述の任意のPRV菌株を使用することができる。 本発明において使用する特定のPRV宿主細胞は、使用
する選択可能な遺伝子に依存するであろう。すなわち、
tk+遺伝子について選択するためには、tk-宿主細胞を使
用すべきである。しかしながら、機能的neoR遺伝子また
はlacZ遺伝子について選択するためには、tk+またはtk-
の宿主細胞は、いずれもneoR遺伝子またはlacZ遺伝子を
自然に生産しないので、使用可能である。 本発明において使用する特定のtk+宿主細胞は、PRVの
許容生長を許すかぎり、臨界的ではない。このようなtk
+宿主細胞の例は、次のものを包含する:RAB−９（ウサ
ギ皮膚細胞）ATCC No.1414を有する；一次ウサギ腎細
胞；二次ウサギ腎細胞；サル細胞、例えば、CV−１およ
びOMK;ヒト細胞、例えば、HeLa（S3）およびヒト胚腎細
胞；およびニワトリ胚線維芽細胞。しかしながら、野外
における動物のワクチン接種に使用すべきワクチンを生
産するためには、ユナイテッド・ステイツ・ディパート
メント・オブ・アグリカルチャー（Unite States Depar
tmento of Agriculture）が承認した、好ましくはワク
チン接種すべき動物と同一腫であり、かつ他の感染因子
を含有しない、PRVについて許容される細胞系を使用す
べきである。例えば、適当なブタの細胞系は、骨髄腫お
よび他のウイルスを含まない、承認された倍数の非腫瘍
発生ブタこうがん（diploid non-tumorgenic swine tes
ticle）（ST）細胞系である。 本発明において使用する特定のtk-宿主細胞は、PRVに
ついて許容生長を許すかぎり、臨界的ではない。このよ
うなtk-宿主細胞の例は、次のものを包含する：ウサギR
ab（BU）、マツキLM（TK-）、ヒトHeLa（BU25）［キッ
ト（Kit）、S.、ダッブス（Dubbs）、D.R.およびフリー
アソン（Frearson）、インターナショナル・ジャーナル
・オブ・キャンサー（Int. J. Cancer）1:19-30（196
6）；キット（Kit）、S.、ダッブス（Dubbs）、D.R.、
プレカルスキー（Prekarski）、L.J.およびフス（Hs
u）、T.C.、実験的細胞の研究（Exptl. Cell不Res.）3
1:297-312（1963）；キット（Kit）、S.およびクアビア
（Quavi）、H.、ウイルス学（Virol.）130:381-389（19
83）；キット（Kit）、S.、クアビ（Qavi）、H.、ダッ
ブス（Dubbs）、D.R.およびオーツカ（Otsuka）、H.、
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.
Mol. Biol.）12:25-36（1983）参照］、シリアンンハ
ムスターBHK 21（TK-）［サンダス（Sandus）、P.G.、
ウィルキー（Wilkie）、N.M.およびデイビドソン（Davi
dson）、A.J.、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロ
ロジー（J. Gen. Virol.）63:277-295（1982）参照］
およびヒト系統143［キャンピオン−ピカルド（Campion
e-Picardo）、ラウルス（Rawls）、W.E.およびバッチェ
ッチ（Barcchetti）、S.、ウイルス学誌（J. Virol.）
31:281-287（1979）参照］。Rab（BU）は本発明におい
て使用する好ましいtk-宿主細胞である。 本発明に関して、温度抵抗性ウイルスは温度不感受性
であるウイルスである。温度抵抗性ウイルスは、親ウイ
ルスまたはPRVの野外分離物が許容温度において複製す
るのとほぼ同様によく、非許容温度、すなわち、約38.5
℃〜40℃、好ましくは39.1℃において複製することがで
きる。これと対照的に、温度感受性PRV菌株は複製に必
須のウイルス遺伝子中に突然変異体を含有し、これによ
り機能的遺伝子生産物は許容温度、すなわち、約32℃〜
37.5℃、好ましくは34.5℃において生産されるが、非許
容温度においては生産されない。したがって、温度感受
性ウイルスにおいて、感染性ウイルス粒子の生産は、許
容温度における生産に比較して、非許容温度において４
〜７対数（logs）だけ低い。温度抵抗性ウイルス菌株で
は、感染性ウイルス粒子の生産は非許容温度において、
許容温度におけるとのほぼ同一である。 温度抵抗性ウイルスは変更生ワクチンとして温度感受
性ウイルスよりすぐれる。その理由は次の通りである：
（１）弱毒は、複製のために要求されるウイルス遺伝子
の弱化からよりはむしろ、病原性ウイルス遺伝子の変更
から生ずる；そして（２）温度抵抗性ウイルスは筋肉内
に、鼻内にあるいは静脈内に安全に投与することがで
き、そして体の深い組織中で複製して、より安全な延長
した免疫学的応答を誘発することができる。 g92-PRV突然変異体は、PRVを弱毒化する追加の突然変
異体を含有するとき、偽狂犬病の病気に対して変更生ウ
イルスワクチンとして使用することができる。このよう
な追加の突然変異体は、tk-突然変異体およびgI-突然変
異体を包含する。 あるいは、本発明のg92-PRV突然変異体は偽狂犬病の
病気に対して殺したウイルスワクチンとして使用するこ
とができる。すなわち、g92-PRV突然変異体の感染性を
紫外線またはホルムアルデヒド処理により不活性化する
と、腹腔内糖予後、細胞毒性Ｔ細胞、および糖蛋白質gI
Ia、gIIb、gIVおよびgVの対する保護抗体を誘発するこ
とができる。このワクチン接種で免疫化された動物は、
こうして、ヴィルレントウイルスの感染に対して保護さ
れるであろう。 さらに、非イオン性洗剤抽出物［ノニデット（Nonide
t）P40またはトリトン（Triton）X100］をPRVg92-感染
ブタ細胞からつくって、サブユニットのPRVワクチンを
生産することができる。これらの抽出物は、糖蛋白質g9
2を除外して、使用したPRV菌株により暗号化された糖蛋
白質および非糖蛋白質のすべてを含有する。糖蛋白質の
精製後、それらをサブユニットのワクチンとして使用す
ることができる［ヒレマン（Hilleman）、M.T.ラーソン
（Larson）、V.M.、レーマン（Lehman）、E.D.、サレル
ノ（Salerno）、R.A.、コナード（Conard）、P.G.、マ
クリーン（McLean）、A.A.、ヒトヘルペスウイルス：ア
ン・インターディシプリナリー・パースペクチブ（The
Human Herpesvirus：An Interdiciplinary Perspe
ctive）、ナーミアス（Nahmias）、A.J.、ドウドル（Do
wdle）、W.R.およびシナジ（Schinazi）、R.F.編（エル
セビーア、ニューヨーク）、503ページ（1981）；アイ
ゼンバーグ（Eisenberg）、R.J.、ポンス・デ・レオン
（Ponce de Leon）、M.、ペレビア（Perbvia）、L.、ロ
ング（Long）、D.およびコーヘン（Cohen）、G.H.、ジ
ャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）41:1099-
1104（1982）；ロング（Long）、D.、マダラ（Madar
a）、T.J.、ポンス・デ・レオン（Ponce de Leon）、
M.、コーヘン（Cohen）、G.H.、モントゴメリー（Montg
omery）、P.C.、アイゼンバーグ（Eisenberg）、R.J.、
感染および免疫（Inf. Immun.）37:761-764（1984）；
およびディクス（Dix）、R.D.およびミルス（Mills）、
J.、ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー（J.
Med. Virol.）71:9−18（1985）参照］。 他の変法として、本発明のg92-PRV突然変異体は出発
物質としてtk+PRV菌株を使用して、米国特許第4,514,49
7号中に記載されるtk-PRV突然変異体を得ることができ
る。 本発明の前述のウイルスの製薬学的に有効な量を、製
薬学的に許容されうる担体または希釈剤と一緒に、動
物、例えば、ブタ、ウシ、ヒツジおよびヤギにおける偽
狂犬病の病気に対するワクチンとして使用することがで
きる。 本発明において有用な製薬学的に許容されうる担体ま
たは希釈剤の例は、PRVに対する抗体を含有しない、す
なわち、PRVについて血清陰性である、約2.5〜15％の血
清を含有する、生理学的に緩衝化した、すなわち、pH7.
0〜7.4の、任意の媒質を包含する。無ガンマグロブリン
血清は、ガンマグロブリンを含有する血清よりも好まし
い。本発明において使用する血清の例は、次のものを包
含する：ブタ血清、子牛血清、胎児子牛血清、ウマ血清
および子羊血清。PRVについて血清陰性のブタからの無
ガンマグロブリン血清はブタのワクチン接種にために好
ましく、そして胎児子牛血清または無ガンマグロブリン
血清は子牛のワクチン接種に好ましいであろう。血清蛋
白質、例えば、ブタルブミンまたはウシ血清アルブミン
を約0.5〜3.0％の量で血清の代わりに使用できる。しか
しながら、ワクチン接種される動物中にアレルギー生応
答を誘発するであろう。異質調製を担体または希釈剤中
に使用することを避けることが望ましい。凍結乾燥前
に、、リン酸塩緩衝化生理的食塩水、グルタミン酸塩、
カシトーン（casitone）またはラクトースの加水分解
物、スクロース、ソルボース、ラクトース、ゼラチンま
たは防腐剤、例えば、ゲンタマイシン、フンガゾーン
（fungazone）およびアンホテリシンＢを含有する任意
の可溶化溶液を使用してウイルスを希釈することができ
る。 本発明のウイルスは少なくとも105.5〜106.5p.f.u./m
lの力価で凍結乾燥した状態で４℃〜−20℃において貯
蔵することが好ましい。凍結乾燥したウイルスは、1.0
％（v/v）のグリセロールを含有する無菌の蒸留水で再
構成することができる。 投与に有効な量は、ワクチン接種する動物の年令、体
重および種および投与方法に依存して変化する。生変更
ウイルスワクチンとして、適当な投与量は、例えば、約
104.5〜106.5p.f.u.、好ましくは約105.0〜106.5p.f.u.
であることができる。殺したウイルスワクチンとして、
適当な投与量は、例えば、変更生ウイルスワクチンにつ
いて用いるそれの約10倍多くすることができる。 本発明のワクチンは筋肉内におよび皮下に投与するこ
とができる。筋肉内は好ましい投与法である。本発明の
変更生ワクチンは、また、鼻内に投与することができ
る。 次の実施例により本発明をさらに説明する。これらの
実施例は本発明の範囲を限定することを意図するもので
はない。 以下の実施例において、すべての媒質および緩衝溶液
は、特記しないかぎり、ガラス蒸留水で調製した。 実施例１ PRVのg92-突然変異体の精製 Ａ、PRV DNAの精製 PRV DNAは、本質的にHSV DNAの調製についてピグナッ
チ（Pignatti）らが記載するようにして調製した［ピグ
ナッチ（Pignatti）、P.F.、カッサイ（Cassai）、E.、
メネグジ（Meneguzzi）、G.、ケムシナー（Chemcine
r）、N.およびミラネシ（Milanesi）、G.、ウイルス学
（Virol.）93:260-264（1979）参照］。 20mlのイーグル（Eagle）の最少必須培地［AutoPow、
APMEM、フロー・ラボラトリーズ・インコーポレーテッ
ド（Flow Laboratories,Inc.）］＋10％（v/v）胎児子
牛血清、50μg/mlのネオマイシンおよび2.0ミリモルの
グルタミンおよび10ミリモルのHEPES、pH7.3、（以後
「生長培地」）を含有する、RAB−９（約５×106細胞／
培養物）の８オンスの規格ガラス便の単層培養物にPRV
（BUK−７）を5.0PFU/細胞のm.o.i.において感染させ
た。PRV（BUK−７）はPRV菌株のよく知られかつ入手可
能なブカレスト（Bucharest）菌株のプラーク精製した
クローンである（米国特許第4,514,497号参照）。次い
で、感染した細胞を34.5℃で３時間インキュベーション
し、その時細胞DNAの合成はウイルスの感染により阻害
された。次いで、1.0μCi/mlおよび0.25μg/mlの3Ｈ−
チミジンを添加してウイルスを放射線標識し、そして3
4.5℃でさらに17時間インキュベーションした。細胞を
ゴムのポリスマンで生長培地中にこすり入れることによ
ってガラスから分離し、0.14モルのNaCl、0.003モルのK
Cl,0.001モルのCaCl2、0.0005モルのMgCl2および0.01モ
ルのリン酸塩、pH7.5、からなり（以後「PBS」）、10μ
g/mlの非放射性チミジンを含有する、氷冷リン酸塩緩衝
化生理的食塩水で洗浄した。次に、細胞を600×ｇで遠
心し、次いでエタノール−ドライアイス浴中で凍結し
た。 融解後、細胞の沈殿物（約0.7ml）を0.25％（v/v）の
トリトンＸ−100、10ミリモルのEDTA、10ミリモルのト
リス−HCl、pH7.9、からなる溶菌溶液の９体積中に懸濁
させた。次に、細胞懸濁液をダウンス（Dounce）ホモジ
ナイザーに移し、そしておだやかに混合しながら室温に
おいて20〜30分間インキュベーションした。 次いで、細胞懸濁液をガラスの遠心管に移し、そして
NaClを0.2モルの最終濃度に添加した。次に、管を数回
倒立させ、そしてこの溶液を直ちに1000Xgで４℃におい
て10分間遠心した。 得られる上澄みをガラス管中にデカンテーションし、
そして10ミリモルのトリスHCl、pH7.5、1.0ミリモルのE
DTAからなる緩衝液（以後「TE緩衝液」）中において100
μg/mlのプロテアーゼＫ（E.M.サイエンス）とともに37
℃で１時間インキュベーションすることによって脱蛋白
質した。次いで、１体積の90％（v/v）の再蒸留フェノ
ールを添加し、この溶液を倒立により混合し、20,000Xg
で遠心し、そして水相、すなわち、上相をポリアロマー
遠心管に移した。次いで、酢酸ナトリウムを4.0％（w/
v）の濃度に添加し、核酸を２体積の氷冷〃エタノール
で沈殿させ、そして−20℃で一夜インキュベーションし
た。その後、沈殿を16,000rpmで４℃でスピンコ（Spinc
o）SW25ローター内で遠心し、2.0mlのTE緩衝液中に溶解
し、そして４℃でTE緩衝液に対して透析した。 次いで、得られたDNA溶液をポリアロマー遠心管に移
し、そしてTE緩衝液中のCs細胞を57％（w/w）（ρ＝1.7
15g/cm2）に添加した。次に、DNAを44,000rpmで22.5℃
において46時間スピンコ（Spinco）No、50Tiローター内
で遠心した。次いで、12滴の分画をポリアロマー管の底
から集め、そして4.0μｌのアリコートを液体シンチレ
ーション・スペクトロメーター中で計数して、PRV DNA
含有分画を捜した（ρ＝約1.727g/cm ）。合計25の分画
が集められた時、一般に分画13〜15はPRV DNAを含有し
た。 次いで、PRV DNA含有分画をプールし、そしてTE緩衝
液を数回交換してTE緩衝液に対して４℃において約24時
間透析した。DNAの濃度は蛍光測定により決定した。PRV
（BUK−７）のNDAの収量は108細胞から約50μｇであっ
た。 PRV（BUK−７）のDNAの同一性は、後述するように、
サブマリン・ゲル装置［ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ・インコーポレーテッド（Bethesda Reseach Lab
oratiories,Inc.）］中で４℃において電気泳動した後
得られた制限ヌクレアーゼ消化PRV（BUK−７）のDNA断
片のパターンによって確認した。 得られたPRV（BUK−７）のDNAを、製造業者［ニュー
・イングランド・バイオラボラトリーズ・インコーポレ
ーテッド（New England Biolabs,Inc.）］により推奨さ
れる反応条件下に、BamHI、BglIIおよびKpnI制限ヌクレ
アーゼで切断した。次に、次に、0.4％（w/v）のブロモ
フェノール・ブルー、125ミリモルのEDTAおよび50％（v
/v）のグリセロールからなる溶液の1/10体積を添加し
て、反応を停止させ、次いで65℃で10分間加熱した。各
試料の12μｌのアリコーTPをアガロースゲルの試料のウ
ェル（well）に適用し、そして電気泳動を後述するよう
にして実施した。 制限ヌクレアーゼの断片の電気泳動は0.6％（w/v）ア
ガロースのスラブゲル上で30ミリモルのNaH2PO4、1.0ミ
リモルのEDTA、40ミリモルのトリス−HCl、pH8.1、から
なる電気泳動緩衝液（以後「電気泳動緩衝液」）中で45
ボルトおよび４℃において約16時間実施した［キット
（Kit）、S.、クアビ（Qavi）、H.、ダッブス（Dubb
s）、D.R.およびオーツカ（Otsuka）、H.,ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Bio
l.）12:25-36（1983）参照］。電気泳動後、DNA断片を
0.5μg/mlの臭化エチジウムを含有する電気泳動緩衝液
中でゲルをソーキングすることによって着色し、長い波
長のUV照射機の上で可視化し、そして光等級づけた。制
限ヌクレアーゼのパターンはPRV DNAについて前に記載
したものに類似した［キット（Kit）、S.、キット（Ki
t）、M.およびパートル（Pirtle）、E.C.、アメリカン
・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am.
J. Vet. Res.）46:1359-1367（1985）；ロムニクジ
（Lomniczi）、B.、ブラケンシップ（Blankenship）、
M.L.およびベン−ポラト（Ben-Porat）、T.、ウイルス
学雑誌（J. Virol.）49:970-979（1984）参照］。PRV
（BUK−５）およびPRV（BUK−７）のゲノムのBglII、Ba
mHIおよびKpnIの断片の位置を示す制限ヌクレアーゼ地
図は、米国特許第4,514,497号の第２図に示されてい
る。これらの断片は、第１図中に示されるPRV［カプラ
ン（Kaplan）］の対応するDNA断片と本質的に同一の位
置にマッピングされる。PRV（BUK−５）またはPRV（BUK
−７）は本発明において互換滴に使用することできるで
あろう。BglII、BamHIおよびKpnIの断片の大きを下表１
に示す。 この方法で調製されたPRV（BUK−７）DNAは標準のト
ランスフェクションのアッセイにおいて約100PFU/μｇ
のDNAを感染性を有した［グラハム（Graham）、F.L.お
よびファ・デル・エブ（Van der Eb）、A.J.、ウイルス
学（Virol.）52:456-467（1973）参照］。 Ｂ、プラスミドpBK-JLの構成 PRV（BUK−７）から分離したDNAのKpnI断片を、次の
手順によりpMAR-KpnのKpnI位置中にクローニングした
（第２図参照）。 pMAR-Kpnは、単一のKpnIクローニング位置をもつpMAR
420から誘導された6.0Kbpのプラスミドである［オーツ
カ（Otsuka）、H.、ヘイゼン（Hazen）、M.、キット（K
it）、M.、クアビ（Quavi）、H.およびキット（Kit）、
M.、ウイルス学（Virol.）113:196-213（1981）参
照］。pMAR-KpnはpMAR-420から4.3KbpのXhoI-SalI断片
を欠失させることによって得た。この工程において、pA
MR-Kpn以外のクローニングベクターを本発明の精神およ
び範囲から逸脱しないで使用することができるであろ
う。例えば、pKB111、pKSC-10［ファーマシア（Pharmac
ia）Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Biochmecals）］およびp
MAR420は、ただ１つのKpnIクローニング位置を有するの
で、使用できるであろう。同様に、オリゴ（dG）テイル
ドpBR322をPRVのオリゴ（dG）テイルドKpnI断片と一緒
に使用できるであろう。 6.0ミリモルのNaCl、6.0ミリモルのトリスHCl（pH7.
5）、6.0ミリモルのMgCl2、1.0ミリモルのジチオスレイ
トールおよび100μg/mlのウシ血清アルブミン（以後「B
SA」）からなる100μｌの緩衝液（以後「KpnI切断緩衝
液」）中に溶解した。次いで、DNAを40単位のKpnI［ニ
ュー・イングランド・バイオラボラトリーズ・インコー
ポレーテッド（New England Biolabs,Inc.）］で１時間
消化した。この反応をシクロヘキシルアミン四酢酸塩
（以後「CDTA」）を20ミリモルのに添加し、そして65℃
に30分間加熱することによって停止させた。酢酸ナトリ
ウムを0.1モルに添加した後、DNAを２体積のエタノール
で沈殿させ、−20℃で一夜貯蔵し、そして遠心により集
めた。 クローニングベクター、pMAR-Kpn、を50μｌのKpnI切
断緩衝液中で0.5μｇのpMAR-KpnのDNAをインキュベーシ
ョンし、次いで５単位のKpnIで37℃において１時間消化
することによって直線化した。反応を前述のように停止
させ、そしてDNAをエタノール沈殿後遠心により集め
た。 4.0μｇのKpnI切断PRV（BUK−７）および0.1μｇのKp
nI切断pMAR-Kpnを、50ミリモルのトリス‐HCl（pH7.
8）、10ミリモルのMgCl2、20ミリモルのジチオスレイト
ール、1.0ミリモルのATP、50μg/mlのBSAからなり（以
後「結合緩衝液」）そして100単位のT4 DNAリガーゼ
［ニュー・イングランド・バイオラボラトリーズ・イン
コーポレーテッド（New England Biolabs,Inc.）］を含
有する緩衝液の50μｌ中に溶解し、そして４℃で一夜イ
ンキュベーションした。この反応をEDTAを20ミリモルの
に添加し、そして65℃に30分間加熱することによって停
止させた。 組換え体プラスミドをTE緩衝液中に希釈し、そして後
述のようにE. col. K12 RR1バクテリアを形質転換した
［ボリバー（Bolivar）、F.、ロドリグエズ（Rodrigue
z）、R.L.、グリーン（Greene）、P.J.、ベトラッチ（B
etlach）、M.C.、ヘイネカー（Heyneker）、H.L.、ボイ
ヤー（Boyer）、H.W.、クロサ（Crosa）、H.W.クロサ
（Crosa）、J.H.およびファルコウ（Falkow）、S.、遺
伝子（Gene）3:95-113（1977）参照］。 バクテリアはCaCl2を使用して準備した［マンデル（M
andel）、M.およびヒガ（Higa）、A.、ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）5
3:159-162（1970）参照］。詳しくは、E. col. K12 RR
1の2.0（Ａ600）の密度の一夜の培養物を使用して、1.0
％（w/v）のバクトトリプトン、0.5％（w/v）の酵母エ
キスおよび0.5％（w/v）のNaClからなるブイヨン（以後
「NLブイヨン）」の200mlを0.02（Ａ600）のバクテリア
密度で接種した。バクテリアは、約0.5（Ａ600）が達成
されるで、約２時間インキュベーションした。次いで、
バクテリアを遠心により沈殿させ、そして1/4体積の冷5
0ミリモルのCaCl2中に懸濁させた・氷上で５分間インキ
ュベーションした後、バクテリアを再び1/4体積の冷50
ミリモルのCaCl2中に懸濁させた。 次に、1/10mlのTE緩衝液中の組換え体プラスミドDA
N、約10〜100ng、を2.0mlのCaCl2処理バクテリアに添加
した。この混合物を４℃に30分間保持した。次いで、形
質を37℃に５分間上昇させ、そして0.3mlのNLブイヨン
を添加した。その後、インキュベーションを37℃で振盪
しながら45分間続けた。試料を30μg/mlのアンピシリン
を補充したトリプチカーゼ他意図寒天平板［BBLマイク
ロバイオロジー・システムス（Bicrobiology System
s）］上で平板培養した。 得られるクローンを所望の組換え体プラスミドDNAに
ついて、次のようにして、急速スクリーニングした。 組換え体プラスミドDNAを含有するバクテリアの一夜
培養物を、30μg/mlのアンピシリンを含有するMLブイヨ
ンの5.0ml中に接種し、そして37℃において約1.5（Ａ
600）の密度にインキュベーションした。次いで、1mlの
このバクテリア培養物を1.5mlのエッペンドルフ（Eppen
dorf）ポリプロピレン管に移し、そしてエッペンドルフ
（Eppendorf）遠心機内で室温において１分間遠心して
バクテリアを沈殿させた。次に、このバクテリアを、2.
0mg/mlの卵リソチーム、50ミリモルのグルコース、10ミ
リモルのCDTA、および15ミリモルのトリス−HCl緩衝液
（pH8.0）からなるリソチーム溶液No.1（以後「リソチ
ーム溶液No.1」）の0.1ml中に再懸濁させ、次いで４℃
で30分間インキュベーションした。次に、0.2mlのNaOH
＋1.0％（w/v）のドデシル硫酸ナトリウムをバクテリア
の懸濁液に添加し、管を渦形成し、そして４℃に５分間
保持した。その後、0.15mlの3.0モルの酢酸ナトリウ
ム、pH4.8、を添加し、そして管をおだやかに倒立さ
せ、その間にDNAの「凝塊（clot）」が形成した。このD
NAを４℃に１時間保持して染色体のDNA、調製および高
分子量のRNAを沈殿させた。次に、沈殿をエッペンドル
フ（Eppendorf）遠心機ちゅで室温において５分間遠心
し、そして組換え体プラスミドDNAを含有するほぼ0.4ml
の透明な上澄みを第２エッペンドルフ（Eppendorf）遠
心機の管に移した。次いで、2.5体積のエタノール（ほ
ぼ1.0ml）を第２管に添加し、そしてこの管を−20℃に
おいて30分間配置した。沈殿した組換え体プラスミドDN
Aを、エッペンドルフ（Eppendorf）遠心機内で室温にお
ちえ２分間遠心することによって集めた。次いで、組換
え体プラスミドDNAを0.1mlの0.1モルの酢酸ナトリウ
ム、0.05モルのトリス−HCl（pH8.0）中に溶解し、エタ
ノールで再沈殿させ、再び遠心により集め、そして最後
に50μｌの水中に溶解した。 次いで、10μｌのプラスミドDNAをKpnI切断緩衝液中
に希釈し、そして2.0単位のKpnIを添加した。37℃で60
分の消化期間後、試料を0.4％（w/v）のブロモフェノー
ル・ブルー、125ミリモルのEDTAおよび50％（v/v）のグ
リセロールからなる溶液の1/10体積と混合し、そして約
20μｌを前述のように電気泳動分析のため0.6％（w/v）
のアガローススラブのゲルへ適用した。この分析によ
り、組換え体プラスミドがKpnI挿入を含有するかどうか
が明らかにされ、そして、含有する場合、挿入の大きさ
（Kbp）が明らかにされた［バーンボイム（Birnboi
m）、H.C.およびドリイ（Doly）、J.、核酸の研究（Nuc
l. Acids Res.）7:1513-1523（1973）参照］。 前述の急速スクリーニング手順のための組換え体プラ
スミドDNAの生産物に使用したバクテリアに比較して、
組換え体プラスミドDNAの大規模調製のため、200倍の量
のプラスミド温度転換バクテリアをプロセシングした
が、ただし最初のエタノール沈殿後、試料を37℃におい
て、5.0ミリモルのトリス−HCl（pH8.0）中の1.0mg/ml
のＲラーゼ（Nase）からなる、100℃で10分間加熱され
てある、原溶液からの0.5mgの膵Ｒナーゼ（Nase）［ウ
ォーシントン・バイオケミカルス（Worthington Bioche
micals）］で30分間処理した。この処理に引続いて、TE
緩衝液中の500μｇのプロイテナーゼＫ（E.M.サイエン
ス）を37℃で30分間添加した。次いで、等体積のエタノ
ールを添加し、試料を渦形成し、そして前述のように遠
心して相を分離した。次いで、水相を取り出し、エタノ
ールで沈殿させ、そして前述のように遠心により集め
た。次いで、沈殿物を0.2mlのTE緩衝液中に溶解し、そ
して50ミリモルのNaCl、10ミリモルのトリス−HCl（pH
7.5）、1.0ミリモルのEDTA中の10.4mlの直線の10〜40％
（w/v）のスクロース勾配で層状にし、次いでスピンコ
（Spinco）SW41ローター中で24,000rpmで４℃において2
0時間遠心した。15滴の分画をポリアロマー遠心管の底
から集めて、プラスチックトレーのウェル中に入れた。
合計35の分画が得られた。次いで、５μｌのアルコート
を、前述のように、アガロースゲルの電気泳動によりス
クリーニングした。組換え体プラスミドDNAを含有する
分画をプールし、0.1×TE緩衝液に対して透析し、そし
てさらに研究するために４℃で貯蔵した。これらの手順
を使用して、pMAR-KpnのKpnI位置中にクローニングした
断片6.3KbpのKpnI-JLを含有する12.3Kbpの組換え体プラ
スミドが得られた、。このKpnI−ＪはPRVのtk遺伝子を
含有する（米国特許第4,514,497号参照）。得られるプ
ラスミドをpBK-JLと表示する（第２図参照）。 Ｃ、pBK-JL（Stu/BglII）の構成 tk遺伝子を含有するpBK-JLからDNA断片を効率よくか
つ選択的に移動化させるために、プラスミドpBK-JLのSt
uI位置を次のようにBglII位置に転化した（第２図参
照）。 1.0μｇのpBK-JLを、100ミリモルのNaCl、10ミリモル
のトリス−HCl（pH8.0）、10ミリモルのMgCl2、6.0ミリ
モルの２−メルカプトエタノール、100μg/mlのBSAから
なる100μｌの緩衝液（以後「StuI切断緩衝液］）中に
溶解し、そして５単位のStuI［ニュー・イングランド・
バイオラボラトリーズ・インコーポレーテッド（New En
gland Biolabs,Inc.）］で37℃において２時間消化し
た。この反応をCDTAを20ミリモルに添加し、そして65℃
に30分間加熱することによって停止させた。次いで、酢
酸ナトリウムを0.1モルに添加し、そしてDNAをエタノー
ルで沈殿させ、そして遠心により集めた。StuI切断pBK-
JLを、1.0μｇのホスホリル化BglIIリンカー［ニュー・
イングランド・バイオラボラトリーズ・インコーポレー
テッド（New England Biolabs,Inc.）］および1000単位
のT4 DNAリガーゼを含有する結合緩衝液中に溶解した。
４℃で一夜インキュベーションした後、この反応をEDTA
を20ミリモルに添加し、そして65℃に10分間加熱するこ
とによって停止させた。ここで鎖状化したBglIIリンカ
ーを含有するStuI切断pBK-JLプラスミドを、50ミリモル
のNaCl、10ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）、1.0ミリ
モルのEDTA中の10〜40％（w/v）スクロース勾配で40,00
0rpmで８時間スピンコ（Spinco）SW41ローター内でDNA
を遠心することによって、未反応のリンカーから分離し
た。次いで、分画を集め、そして前述のようにDNAをア
リコートのアガロースゲルの電気泳動の分析により局在
化した。次いで、プラスミドDNAを0.1モルの酢酸ナトリ
ウムに移し、2.0μｇの担体酵母DNAを添加し、そしてDN
Aをエタノールで沈殿させ、そして遠心により集めた。
プラスミド上にBglII付着末端をつくるために、末端に
鎖状化BglIIリンカーをもつStuI切断pBK-JLを、10ミリ
モルのNaCl,10ミリモルのトリス−HCl（pH7.4）、10ミ
リモルのMgCl2、10ミリモルの２−メルカプトエタノー
ル、100μg/mlのBSAからなる緩衝液（以後「BglII切断
緩衝液」）の50μｌ中に溶解し、そして８単位のBglII
［ニュー・イングランド・バイオラボラトリーズ・イン
コーポレーテッド（New England Biolabs,Inc.）］で37
℃において１時間消化した。DNAをエタノールで沈殿さ
せ、遠心により集め、次いで50μｌの結合緩衝液中に溶
解し、そして前述のように再び結合してプラスミドを環
化した。前述のようにして得られたプラスミドでE. co
l. K12 RR1を形式転換した後、StuI位置を欠くが、前者
のStuI位置にBglII位置を含有するプラスミドについて
コロニーをスクリーニングした。代表的プラスミドを分
離し、そしてpBK-JL（Stu/BglII）と表示した（第２図
参照）。 Ｄ、pBUK:BglII−Ｂのクローニング PRV（BUK−７）の31.6KbpのBglII−Ｂ断片を、次のよ
うにしてpBR322のBamHI位置中にクローニングした（第
１図および第４図参照）。 4.0μｇのPRV（BUK−７）DNAを100μｌのBglII切断緩
衝液中に溶解し、そして32単位のBglII［ニュー・イン
グランド・バイオラボラトリーズ・インコーポレーテッ
ド（New England Biolabs、Inc.）］で37℃において１
時間消化した。この反応を等体積の90％（v/v）の再蒸
留したフェノールを添加し、混合し、そして相分離のた
めに遠心した。0.1×TE緩衝液に対して水相を透析した
後、酢酸ナトリウムを0.1Nに添加し、次いでで２体積の
エタノールを添加し、そしてDNA沈殿物を−20℃で一夜
貯蔵した。DNA沈殿物を遠心により集め、そして0.1×TE
緩衝液に再溶解した。 次いで、制限ヌクレアーゼ断片をBamHI消化、脱ホス
ホリル化pBR322と次の方法で一緒にした。 4.0μｇのBglII紹介PRV（BUK−７）DNAを、0.2μｇの
BamHI消化、脱ホスホリル化pBR322と、100お単位のT4 D
NAリガーゼを［ニュー・イングランド・バイオラボラト
リーズ・インコーポレーテッド（New England Biolabs,
Inc.）］を含有する0.05mlの結合緩衝液中で混合し、そ
して４℃でインキュベーションした。この反応をEDTAを
20ミリモルに添加し、そして65℃に10分間加熱すること
によって停止させて。組換え体DNAプラスミドを、前述
のように、使用してE. col. K12 RR1を形質転換し、そ
して生ずるコロニーを前述の急速プラスミドスクリーニ
ング手順によりスクリーニングした。pBR322のBamHI位
置の中にクローニングしたほぼ31.6KbpのPRV（BUK−
７）のBilII−Ｂ断片を含む、大きさ約35Kbpの、プラス
ミドを分離し、そしてpBUK:BglII−Ｂと表示した。 Ｅ、pBUK:BglII−ＢのサブクローニングおよびpBUK:Stu
12の構成 約11〜21地図単位にマッピングされる（第４図参照）
pBUK:BglII−ＢからのStuI断片を、次の手順によりpBR3
22のBamHI位置に移した。 1.0μｇのBUK:BglII−Ｂを100μｌのStuI切断緩衝液
中に溶解した。DNAを10単位のStuI［ニュー・イングラ
ンド・バイオラボラトリーズ・インコーポレーテッド
（New England Biolabs,Inc.）］の添加により消化し、
そして37℃で１時間インキュベーションした。この反応
をCDTAを20ミリモルに加津酢酸ナトリウムを0.2モルに
添加し、次いで65℃に30分間加熱することによって停止
させた。DNAをエタノールで沈殿させ、そして前述のよ
うに、遠心により集めた。 StuI消化pBUK:BglII−Ｂを、1.0μｇのホスホリル化B
glIIリンカー［ニュー・イングランド・バイオラボラト
リーズ・インコーポレーテッド（New England Biolabs,
Inc.）］および1000単位のT4 DNAリガーゼを含有する25
μｌの結合緩衝液中に溶解した。４℃で一夜インキュベ
ーションした後、この反応をEDTAを20ミリモルに添加
し、そして65℃に10分間加熱することによって停止させ
た。StuI消化pBUK:BilII−Ｂ（ここでStuI末端に鎖状化
BglIIリンカーを有する）を、次のようにして、結合し
ないBglIIリンカーから分離した。反応混合物を、50ミ
リモルのNaCl、10ミリモルのトリスーHCl（pH7.5）、1.
0ミリモルのEDTA中で10〜40％（w/v）のスクロース勾配
上に層状にし、そしてスピンコ（Spinco）SW41ローター
内で40,000rpmで４℃において８時間遠心した。分画を
集め、そして前述のように、アリコートをアガロースゲ
ルの電気泳動によりDANを捜し出した。リンカーは勾配
の上部に残ったが、プラスミドDNAは勾配の中央にセグ
メント化した。各分画に酢酸ナトリウムを0.1モルにか
つ2.0μｇの担体酵母tRNAを添加した後、プラスミドDNA
をエタノールで沈殿させ、遠心により集め、50μｌのBg
lII切断緩衝液中に溶解し、次いで８単位のBglII［ニュ
ー・イングランド・バイオラボラトリーズ・インコーポ
レーテッド（New England Biolabs,Inc.）］で37℃にお
いて１時間消化して、BglIIの付着末端をつくった。反
応を停止させ、前述のように、DNAをエタノールで沈殿
させ、そして遠心により集めた。 StuI消化pBUK:BglII−Ｂ（ここでStuI断片上にBglII
付着末端を有する）を、まずDNAを50μｌの結合緩衝液
中に溶解することによって、pBR322のBamHI位置中にク
ローニングした。次いで、BamHI消化、脱ホスホリル化p
BR322を添加し、そして、前述のように、この混合物を1
000単位のT4 DNAリガーゼで結合した。結合反応を停止
させた後、E. col. K12 RR1を雑種プラスミドで形質転
換し、そして、前述のように、生ずるコロニーを組換え
体についてスクリーニングした。pBR322のBamHI位置に
挿入されたpBUK:BglII−Ｂから誘導された12KbpのStuI
断片を分離し、そしてpBUK:Stu12と表示した。 Ｆ、pPRVTK/STU12の構成 PRV g92遺伝中に挿入された子選択可能な遺伝子、す
なわち、PRV tk遺伝子を含む雑種プラスミドを、pBK-JL
（StuI/BglII）からの3.1KbpのBglII-KpnI断片を、次の
ように、pBUK:Stu12のBamHIおよびKpnI位置の中に移す
ことによって、構成した（第３図参照）。 4.0μｇのpBUK:Stu12を、150ミリモルのNaCl、6.0ミ
リモルのトリス−HCl（pH7.9）、6.0ミリモルのMgCl2,1
00μg/mlのBSAからなる緩衝液（以後「BamHI切断緩衝
液」）の200μｌ中に溶解し、そして10単位のBamHI［ニ
ュー・イングランド・バイオラボラトリーズ・インコー
ポレーテッド（New England Biolabs,Inc.）］で37℃に
おいて２時間消化した。この反応をCDTAを20ミリモルに
かつ酢酸ナトリウムを0.1モルに添加し、次いで65℃に3
0分間加熱することによって停止させた。DNAをエタノー
ルで沈殿させ、そして遠心により集めた。引続いて、DN
Aを200μｌのKpnI切断緩衝液中に溶解し、そして20単位
のKpnIで37℃において２時間消化し、次いでこの反応を
CDTAを20ミリモルに添加し、そして65℃に30分間加熱す
ることによって停止させた。次いで、酢酸ナトリウムを
0.3モルに添加し、DNAをエタノールで沈殿させ、そして
遠心により集めた。 組み合わせたKpnIおよびBamHIの切断は、約0.4および
15.6Kbpの２つの断片を生じた。引続く工程の間小さい
断片のそのもとの位置への再結合を最少にするために、
次のように、これらの２つの断片をスクロース勾配上の
遠心により分離した。 KpnIおよびBamHIで消化したpBUK:Stu12断片を100μｌ
のTE緩衝液中に溶解し、そして、前述のように、10〜40
％（w/v）のスクロース勾配の上部に層状化し、そして
スピンコ（Spinco）SW41ローター内で40,000rpmで４℃
において８時間遠心することによって沈降させた。分画
を集め、そして前述のように、各分画の一部のアガロー
スゲルの電気泳動分析によりDNA断片の位置を捜した。
大きいDNA断片を含有する分画に、酢酸ナトリウムを0.3
モルにかつまた2.0μｇの酵母tRNAを添加し、次いでDNA
をエタノールで沈殿させ、そして遠心により集めた。 次いで、2.0μｇのpBK-JL（StuI/BglII）を100μｌの
KpnI切断緩衝液中に溶解し、そして10単位のKpnIで37℃
において１時間消化した。この反応を停止し、そして前
述のように、DNAをエタノールで沈殿させ、そして遠心
により集めた。次いで、KpnI消化pBK-JL（StuI/BglII）
を100μｌのBglII切断緩衝液中に再溶解し、そして10単
位のBglII［ニュー・イングランド・バイオラボラトリ
ーズ・インコーポレーテッド（New England Biolabs,In
c.）］で37℃において２時間消化した。この反応を停止
させた後、DNAをエタノールで沈殿させ、そして遠心に
より集めた。引続く工程におけるこれらの断片の再結合
を最少とするため、KpnI＋BglIIで消化したpBK-JL（Stu
I/BglII）を、50ミリモルのトリス−HCl（pH8.0）,50ミ
リモルのNaClからなる緩衝液（以後「アルカリ性ホスフ
ァターゼ緩衝液」）の100μｌ中に溶解し、そして0.2単
位のバクテリアのアルカリ性ホスファターゼ［インター
ナショナル・バイオテキノロジーズ（International Bi
otechnologies）］で65℃において１時間消化した。こ
の反応をプロテイナーゼＫを100μg/mlに添加して停止
させ、そして37℃で１時間インキュベーションし、次い
で等体積の再溶解した90％（v/v）のフェノールを添加
した。振盪後、水相を集め、そしてエーテルで抽出して
残留フェノールを除去した。DNAをエタノールで沈殿さ
せ、そして遠心により集めた。 最後に、50μｌの結合緩衝液および1000単位のT4 DNA
リガーゼ中において、KpnI＋BamHIpBUK:Stu12を脱ホス
ホリル化およびKpnI＋BglIIpBK-JL（StuI/BglII）と４
℃において一夜結合することによって、をPRV tk遺伝子
をPRV g92遺伝子中に移した。反応を前述のように停止
させ、そして前述のように、プラスミドDNAをE. col.
K12 RR1中にトランスフェクションした。候補の組換え
体プラスミドを前述の急速プラスミドスクリーニング手
順によりスクリーニングし、そしてpBUK:Stu12の0.4Kbp
のKpnI-BamHI断片を欠くが、pBK-JL（StuI/BglII）の3.
1KbpのKpnI-BglII断片の挿入を含有する19Kbpのプラス
ミドが得られた。このプラスミドをpPRVTK/STU12と表示
した。 Ｇ、pBUK:Stu12/PstIの構成 PRV g92遺伝子中に欠失をもつプラスミドを構成する
ため、PRV g92遺伝子を含有する4.0KbpのPstI断片を、
次のように、16KbpのpBUK:Stu12プラスミドからpBR322
のPstI位置中にサブクローニングした（第４図）。 2.0μｇのpBUK:Stu12を、100ミリモルのNaCL、10ミリ
モルのトリス−HCl（pH7.5）、10ミリモルのMgCl2、100
μg/mlのBSAからなる緩衝液（以後「PstI結合緩衝
液」）の100μｌ中に溶解し、そして10単位のPstI［ニ
ュー・イングランド・バイオラボラトリーズ・インコー
ポレーテッド（New England Biolabs,Inc.）］で37℃に
おいて１時間消化した。この反応をCDTAを20ミリモルに
添加し、そして65℃に30分間加熱することによって停止
させた。次いで、酢酸ナトリウムを0.1モルに添加し、
そしてDNAをエタノールで沈殿させ、そして遠心により
集めた。pBUK:Stu12の4KbpのPstI断片を、次のようにし
て、pBR322のPstI位置中にクローニングした。プラスミ
ドDNAを、0.2μｇのPstI消化および脱ホスホリル化pBR3
22［ニュー・イングランド・バイオラボラトリーズ・イ
ンコーポレーテッド（New England Biolabs,Inc.）］お
よび1000単位のT4 DNAリガーゼを含有する50μｌの結合
緩衝液中に溶解し、そして４℃で一夜インキュベーショ
ンした。この反応をEDTAを20ミリモルに添加し、そして
65℃に10分間加熱することによって停止させた。組換え
体DNAをE. col. K12 RR1中に形質転換により導入し、
そして前述のように、大きさが約8.4Kbpであり、かつpB
R322のPstI位置中に挿入されたpBUK:Stu12からの4.0Kbp
のPstI断片を含有するプラスミドについて、コロニーを
前述の急速プラスミドスクリーニング手順によりスクリ
ーニングした（第４図）。このようにして、代表的組換
え体プラスミドを分離し、そしてpBUK:Stu12/PstIと表
示した。 Ｈ、pBU:gCdlSalの構成 pBUK:Stu12/PstIの5.2〜6.3地図単位からのPRV g92遺
伝子中に1.1SalI欠失をもつプラスミドを、次のように
して構成した（第４図）。 0.25μｇのpBUK:Stu12/PstIを、150ミリモルのNaCl、
6.0ミリモルのトリス−HCl（pH7.9）、6.0ミリモルのMg
Cl2、6.0ミリモルの２−メルカプトエタノール、100μg
/mlのBSAからなる緩衝液（以後「SalI結合緩衝液」）中
に溶解し、そして1.5単位のSalI［ニュー・イングラン
ド・バイオラボラトリーズ・インコーポレーテッド（Ne
w England Biolabs,Inc.）］で37℃において１時間消化
した。次いで、この反応をCDTAを20ミリモルに添加し、
そして65℃に加熱することによって停止させた。酢酸ナ
トリウムを0.1モルに添加し、次いでDNAをエタノールで
沈殿させ、そして遠心により集めた。この手順はプラス
ミドpBUK:Stu12/PstI中に１系列の部分的SalI切断を導
入した。 次いで、部分的に消化したpBUK:Stu12/PstIを50μｌ
の結合緩衝液中に再溶解し、そして1000単位のT4 DNAリ
ガーゼの存在下に４℃で一夜インキュベーションした。
この反応をEDTAを20ミリモルに添加し、そして65℃に10
分間加熱することによって停止させた。プラスミドDAN
を、前述のように、E. col. K12 RR1の形質転換により
バクテリア中に導入し、そして前述のように、地図単位
5.2〜6.3に及ぶpBUK:Stu12/PstIの1.1Kbpの欠失を有す
るプラスミドが得られるまで、得られるコロニーを急速
プラスミドスクリーニング手順により分析した。所望の
プラスミドをpBU:gCdlSalと表示した（第４図参照）。 I.PRV（dltk）:PRVTK/STU12の構成 PRV g92遺伝子中に挿入された選択可能な遺伝子、す
なわち、機能的PRV tk遺伝子をもつ組換え体PRVを相同
組換えにより得るために、tk-PRV菌株の完全な感染性DN
Aと、PRV g92遺伝子の解読配列内の欠失中に挿入された
機能的PRV tk遺伝子を含有する雑種プラスミドと使用し
て出発することが必要であった（第５図参照）。この型
の交雑（cross）に従い得られた後代ウイルスは、tk遺
伝子の遺伝子座における相同組換えにより救出（rescu
e）された親のtk-PRVおよびtk+PRVを主として含む。g92
遺伝子中に挿入された機能的PRV tk遺伝子を含有するtk
+組換え体を得るために、次のように所望組換え体を濃
縮しかつそれについてスクリーニングすることが必要で
あった。 tk+PRVはtk-ウサギ細胞（すなわち、RAB（BU）［キッ
ト（Kit）、S.およびクアビア（Quavi）、H.ウイルス学
（Virol.）130:381-389（1983）参照］中で、生長培地
を含有するHATGの存在下に、上の交雑の後代を生長させ
ることにより濃縮した。なぜなら、HATGはtk-PRVの複製
を阻害しかつtk+PRVのアウトグロウス（outgrowth）に
好適であるからである。次いで、濃縮されたtk+PRVの集
団を分子ハイブリダイゼーションによりスクリーニング
して、PRV g92遺伝子内の欠失中に挿入された機能的PRV
tk遺伝子を有するウイルスのクローンを同定した。 前述のPRV組換えの構成のために選択した雑種プラス
ミドはpPRVK/STU12であった（第３図参照）。しかしな
がら、機能的PRV tk遺伝子またはg92遺伝子の解読配列
に隣接して、大きいまたは小さいフランキング配列を含
有するか、あるいはg92遺伝子の他の部分中に大きいま
たは小さい欠失を含有する、他の雑種プラスミドを使用
して、g92遺伝子内の欠失中に挿入された、あるいはg92
遺伝子中に直接挿入された、機能的PRV tk遺伝子をもつ
tk+組換え体をつくることができるであろう。g92遺伝子
中に欠失および／または挿入の突然変異体を構成するた
めの便利な制限ヌクレアーゼ市は、プラスミドpBUK:Stu
12/PstIのg92DNA断片の制限地図の検査から（第４図参
照）、および制限ヌクレアーゼ切断位置（下表２参照）
（g92遺伝子の解読配列を含有する2.4KbpのNcoI-Mlu DN
A断片のヌクレオチド配列から予測される）［ロビンス
（Robbins）、A.K.、ザ・ナインス・インターナショナ
ル・ヘルペスウイルス・ワークショップ（the Tenth In
ternational Herpesvirus Workshop）、ワシントン州ア
シアトル、1984年８月24-29日、における提示参照］か
ら、確認することができる。 組換え工程のために選択したtk-PRV DNAはPRV（BUK-d
l 3）（ATCC No.VR-2074）（米国特許第4,514,497号参
照）であった。PRV（BUK-dl 3）はtk遺伝子中に欠失を
含有し、そしてワクチンとして既知の優秀性をもつ菌株
であるので、前述の組換え体の構成のために他のtk PRV
ワクチン菌株よりも好ましいウイルスであった。しかし
ながら、他のtk-PRV菌株、例えば、自然tk-突然変異体
または突然変異原誘発tk-突然変異体、例えば、PRV（BU
K-5A）（ATCC No.VR-2078）（米国特許第4,514,497号参
照）を、また、本発明の精神および生長を逸脱しないで
使用することができるであろう。 PRV（BUK-dl 3）のg92遺伝子内の欠失中に挿入された
機能的PRV tk遺伝子を含有する組換え体tk+PRVの構成
は、次のように実施した。 RAB−９細胞を60mmのペトリ皿（0.2×106細胞／皿）
中に接種し、そして37℃において48時間インキュベーシ
ョンした。次いで、次の無菌溶液を順番に試験管中に添
加した： （１） 0.02mlの50μg/mlのTE緩衝液中のPRV（BUK-dl
33）DNA溶液； （２） 0.2mlの10μg/mlの雑種プラスミドpPRVK/STU12
の溶液； （３） 0.65mlの水； （４） 8.0g/lのNaCl、0.37g/lのKCl、0.125g/lのNa2H
PO4・２H2O、1.0g/lのグルコース、5.0g/lのHEPES、pH
7.05、からなる２×HEPES緩衝溶液中のサケ精子DNAの20
μg/ml溶液の1.0ml;および （５） 0.13mlの2.0モルのCaCl2。 得られる溶液を倒立により混合し、そして室温に30分
間保持し、その間DNA−リン酸カルシウムの沈殿物が形
成した。次いで、0.5mlのDNAのリン酸カルシウム沈殿物
含有懸濁液を5.0mlの生長培地に直接添加し、そして60m
mのペトリ皿中に48時間前に接種したRAB−９細胞上で平
板培養した。次いで、この培地をアスピレーションし、
そして単層を5.0mlの新しい生長培地で洗浄し、次いで
１×HEPES緩衝溶液＋15％（v/v）のグリセロールの溶液
の1.0mlを添加した。室温で３分間インキュベーション
した後、単層を培地で再び洗浄し、そして新しい生長培
地を添加した。培養物を34.5℃で、広範な細胞変性作用
は発生するまで、２日間インキュベーションした。次い
で、ウイルスを前述のように収穫し、そして−80℃で貯
蔵した。次いで、ウイルス収穫物を寒天のオーバーレイ
の下でRAB−９中で滴定した。 同時トランスフェクション（cotransfection）のウイ
ルス収穫物を融解し、超音波処理し、そしてHATGを含有
する生長培地中に希釈した。tk+PRV組換え体を濃縮する
ため、収穫したウイルスを0.01PFU/細胞のインプット
（input）多重度に希釈し、そしてHATGを補充した生長
培地中の８オンスの規格びん内のRAB（BU）細胞の全面
単層培養物中で継代培養した。37℃で１時間吸収させた
後、感染した単層培養物を、水１リットルあたり8.0gの
NaCl、0.4gの水KCl、0.1gのグルコースおよび0.02gのフ
ェノール・レッドからなる溶液（以後「CKN」）で３回
洗浄した。次いで、HATGを含有する生長培地を添加し、
インキュベーションを34.5℃で48時間続け、そしてウイ
ルスを収穫した。選択工程の風格物をRAB−９細胞で滴
定し、候補の組換え体tk+2PRVをプラークから不規則に
取り上げ、そしてウイルスのプールを調製した。この方
法で、96のtk+PRV候補組換え体が得られた。 Ｊ、分子ハイブリダイゼーションのためのプローブの調
製 PRV tk遺伝子の欠失およびPRV g92遺伝子中に欠失お
よび／または挿入をもつ候補の組換え体PRV突然変異体
を同定するために、32Ｐ標識プローブを使用する分子ハ
イブリダイゼーションの実験を実施した。これらのプロ
ーブは次の通りであった。 （１） M13mp19/BB2（KpnI-BamHI） このプローブはフファージM13mp19/BB2（KpnI-BamH
I）のRF形態のニット−トランスレーションにより調製
した。このファージのRF形態は、プラスミドpBB2の0.38
KbpのKpnI-BamHIヌクレオチド配列をファージM13mp19の
ポリクローニング部位に挿入することによって調製した
［ヤニシ−ペロン（Yanisch-Perron）、C.、ビエイラ
（Vieira）、J.およびメッシング（Messing）、J.遺伝
子（Gene）33:103-119（1985）参照］。プラスミドBB2
は、pBR322のBamHI制限位置でクローニングされたPRV
（BUK−５）BamHI−２断片を含む。0.38KbpのKpnI-BamH
I断片は、遺伝子の3'末端においてPRV g92構造遺伝子の
約1/4にまたがる。さらに詳しくは、フファージM13mp19
/BB2（KpnI-BamHI）は次のようにして調製した。 １μｇのpBB2および0.1μｇのRF DNAのM13mp19を、6.
0ミリモルのNaCl、6.0ミリモルのトリス−HCl（pH7.
5）、6.0ミリモルのMgCl2、6.0ミリモルの２−メルカプ
トエタノール、100μg/mlのBSAおよび10単位のKpnIから
なる反応混合物中で37℃においてインキュベーションし
た。１時間インキュベーションした後、1.5モルのNaC
l、60ミリモルのトリス−HCl（pH7.9）、60ミリモルのM
gCl2、1.0mg/mlのBSA、10単位のBamHIおよび100μｌと
する量の水からなる10×BamHI緩衝液の10μｌを添加し
た。次いで、この反応混合物を37℃でさらに１時間イン
キュベーションした。反応を10μｌの0.25モルのEDTA
（pH7.6）を添加し、そして65℃に10分間加熱すること
によって停止させた。この混合物をフェノール：クロロ
ホルム（１容量:1容量）で１回抽出し、そしてDNAを0.1
体積の3.0モルの酢酸ナトリウム（pH7.6）および2.2体
積のエタノールの添加により水相から沈殿させた。この
DNA沈殿物をエタノールで１回洗浄し、そして真空乾燥
した。 消化したDNAを、50ミリモルのトリス−HCl（pH7.
8）、10ミリモルのMgCl2、20ミリモルのジチオスレイト
ール、1.0ミリモルのATP、50μg/mlのBSAおよび400単位
のT4リガーゼからなる40μｌの反応混合物中で結合し
た。この反応を４℃で18時間実施し、そして160μｌのT
E緩衝液を添加し、そして65℃に10分間加熱することに
よって停止させた。得られる組換え体ファージを、前述
のように、使用してCaCl2活性化E. col. JM105バクテ
リアを形質転換し、そして挿入された0.38KbpのKpnI-Ba
mHIを含有する形質転換体についてスクリーニングし
た。次いで。ニック−トランスレイションしたプローブ
を所望のファージ、すなわち、M13mp19/BB2（KpnI-BamH
I）を次のようにして調製した。 6.0μモルのPBS、pH7.4、1.8nモルのdGTP、0.1mCiの
（α−32Ｐ）dTTP（400Ci/ミリモル）、0.1mCiの（α−
32Ｐ）dCTP（400Ci/ミリモル）［アマーシャム・コーポ
レーション（Amersham Corporation）］からなる反応混
合物の25μｌに、約1.0μｇの雑種ファージDNAを添加し
た。次いで、10ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）、5.0
ミリモルのMgCl2および100μg/mlのBSAからなる溶液の
1.0μｌ中の1.33ngのＤナーゼ（Nase）Ｉ［ウォーシン
トン・バイオケミカルズ（Worthington Biochemical
s）］を添加し、そしてこの反応混合物を室温で１分間
放置した。次に、反応混合物を5.0単位のE. col. DNA
ポリメラーゼＩ［ベーリンガー・マンハイム・バイオケ
ミカルズ（Boehringer Manneheim Biochmecals）］とと
もに、50ミリモルのリン酸カリウム緩衝液、pH7.0、2.5
ミリモルのジチオスレイトールおよび50％（v/v）のグ
リセロールからなる溶液の1.0μｌ中で14℃においてイ
ンキュベーションした。比活性が２×108cpm/μgDNAよ
り高くなったとき、すなわち、ほぼ３時間経過したと
き、この反応を0.25モルのEDTA（pH7.4）の10μｌを添
加し、そして65℃に10分間加熱することによって停止さ
せた。次いで、TE緩衝液中の5.0mg/mlの超音波処理した
サケ精子DNAを含む溶液の50μｌをこの混合物に添加
し、そしてニック−トラスレイションしたDNAをセファ
デックス（Sephdex）G50（微細）のカラムクロマトグラ
フィーにかけ、そして10ミリモルのNaCl、10ミリモルの
トリス−HCl（pH6.5）、2.0ミリモルのEDTAの溶離緩衝
液で溶離することによって精製した。 得られる32Ｐニック−トランスレイションDNAを、水
浴中で20分間沸騰させ、そして氷上で急冷した後、DNA-
DNA交雑実験におけるプローブとして使用して一本鎖DNA
を形成した［リグビイ（Rigby）、P.W.J.、ディエクマ
Ｎ（Dieckman）、M.、ロウデス（Rhodes）、G.およびベ
ルグ（Berg）、P.、ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（J. Mol. Biol.）113:237-251（1977）
参照］。 （２） pBTKプローブ このプローブを、前述のように、プラスミドpBTKのニ
ック−トラスレイションにより調製した。プラスミドpB
TKを、後述するように、EcRI-StuI断片（０〜4.8地図単
位）を欠失することによりpBK JLから誘導した。 0.25μｇのpBK JLを50μｌのStuI切断緩衝液中に溶解
し、そして２単位のStuI［ニュー・イングランド・バイ
オラボラトリーズ・インコーポレーテッド（New Englan
d Biolabs,Inc.）］で37℃において２時間消化した。次
いで、トリス−HCl（pH7.5）を100ミリモルのにあぢ
し、そしてStuI消化プラスミドを５単位のEcoRI［ニュ
ー・イングランド・バイオラボラトリーズ・インコーポ
レーテッド（New England Biolabs,Inc.）］でさらに37
℃において１時間消化した。この反応を等体積の再蒸留
した90％（v/v）のフェノールで脱蛋白質し、そして水
相を遠心により分離した。次いで、消化したプラスミド
DNAを含有する水相をエーテルで抽出し、そして0.1×TE
に対して透析し、次いで0.3モルの酢酸ナトリウム中に
移し、そしてエアノールで沈殿させた。プラスミドDNA
を遠心により集め、6.0ミリモルのトリス−HCl（pH7.
5）、1.0ミリモルのジチオスレイトール、6.0ミリモル
のMgCl2,50ミリモルのNaClからなり（以後「Hin緩衝
液」）かつ各々0.1ミリモルのdATP、dCTP、dGTPおよびd
TTPを含有する緩衝液の25μｌ中に再溶解した。次い
で、２単位のE. col. DNAポリメラーゼＩのクレノー断
片を添加し、そしてこの反応混合物を22℃で30分間イン
キュベーションした。この反応は付着EcoRI末端を満た
し、それを平滑末端に転化し、この反応を70℃に５分間
加熱することによって停止させた。等体積の２×結合緩
衝液を添加し、そして1000単位のT4DNAリガーゼを添加
し、そして４℃で一夜インキュベーションすることによ
って、複製を達成した。この反応をEDTAを20ミリモルに
添加し、そして65℃に10分間加熱することによって停止
させた。E. col. K12 RR1を複製したDNAを形質転換
し、そしてEcoRI-StuI欠失を含有する7.5Kbpのプラスミ
ドが得られるまで、前述のように、コロニーを急速プラ
スミドスクリーニング手順によりスクリーニングした。
このプラスミドをpBTKと表示した。 （３） pSalプローブ このプローブを、前述のように、プラスミドpSalのニ
ック−トラスレイションより調製した。プラスミドpSal
は、後述するように、pBUK:Stu12/PstIの1.1KbpのStuI
断片（5.2-6.3地図単位、第４図参照）をpBR322のStuI
位置にサブクローニングすることによって、pBUK:Stu12
/PstIから誘導した。 1.0μｇのpBUK:Stu12/PstIを50μｌのStuI切断緩衝液
中に溶解し、そして20単位のStuI［ニュー・イングラン
ド・バイオラボラトリーズ・インコーポレーテッド（Ne
w England Biolabs,Inc.）］で37℃において１時間消化
した。また、1.0μｇのpBR322を同一方法で処理した。
これらの反応をCDTAを20ミリモルに添加し、そして65℃
に30分間加熱することによって別々に停止させた。次い
で、StuI消化プラスミドをプールした。次に、酢酸ナト
リウムを0.1モルに添加し、そしてDNAを２体積のエタノ
ールの添加により沈殿させた。DNA遠心により集め、そ
して1000単位のT4DNAリガーゼを含む50μｌの結合緩衝
液中に再溶解した。４℃で一夜インキュベーションした
後、この反応をEDTAを20ミリモルに添加し、そして65℃
に10分間加熱することによって停止させた。E. col. K
12 RR1を結合したDNAで形質転換し、そしてAmp Tet表現
型を前述の急速プラスミドスクリーニング手順により分
析いた。pBR322のStuI−に挿入されたpBUK:Stu12/PstI
の1.1KbpのStuI断片を含有するコロニーを分離し、そし
てpSalと表示した。 （４） pBUK:Stu12/PstIプローブ このプローブは、前述のように、プラスミドpBUK:Stu
12/PstIのニック−トラスレイションにより調製した。 （５） オリゴ−006プローブ このプローブは、後述するように、オリゴヌクレオチ
ド−006の末端ヌクレオチドのポリヌクレオチドキナー
ゼでホスホリル化することによって調製した。オリゴヌ
クレオチド−006は、製造業者の支持に従って自動化DNA
合成装置［システク・インコーポレーテッド（Systec,I
nc.）］ホスホルアミダイト化学により合成し、そして
次のヌクレオチド配列を有した： ５′−GCGCCGCGCTTCGACCAGACC−３′ この配列はPRV（BUK−５）のBamHI-11断片から誘導され
た小さいSalI断片の一部であり、そしてPRV（BUK−３）
のtk遺伝子から欠失されたほぼ150bpの配列の一部であ
る（米国特許第4,514,497号参照）。 50ポコモルのオリゴヌクレオチド−006を、150Ci（γ
32Ｐ）ATP、70ミリモルのトリス−HCl（pH7.6）、10ミ
リモルのMgCl2、5.0ミリモルのジチオスレイトールおよ
び５単位not4ポリヌクレオチドキナーゼ［ニュー・イン
グランド・バイオラボラトリーズ・インコーポレーテッ
ド［New England Biolabs,Inc.）］からなる反応混合物
に添加した。この混合物を37℃で１時間インキュベーシ
ョンし、そしてこの反応をEDTAを20ミリモルに添加して
停止させ、ゲルP4［バイオーラド・インコーポレーテッ
ド（Bio-Rad,Inc,）］を使用するゲル濾過により標識オ
リゴヌクレチド−006を精製して未反応の（γ−32Ｐ）A
TPを除去した。この溶離緩衝液は、前述のセファデック
ス（Sephadex）Ｇ−50について使用したものと同一であ
った。このプローブは、すでに一本鎖であったので、使
用前に熱処理しなかＴった。 Ｋ、PRV g92遺伝子中の欠失中に挿入された機能的PRV t
k遺伝子を含有する組換え体tk+PRVの同定 前述の候補の組換え体から調製したPRV DNAを、ドッ
ト−ブロット（（dot-blot）法［ブランドスマ（Brands
ma）、J.およびミラー（Miller）、G.、プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ（Proc. Natl. Acad. Sci.）USA 77:6851-6855
（1980）参照］により分析して、BamHI−２の0.4KbpのK
pnI-BamHI断片を欠くウイルスを同定した。この断片はP
RV g92遺伝子の解読配列の一部であり、そして、前述の
ように、ファージM13mp19中でクローニングして、ファ
ージM13mp19/BB2（KpnI-BamHI）を生成した。次いで、M
13mp19/BB2（KpnI-BamHI）の二本鎖（RF）のニック−ト
ラスレイションした32−Ｐ標識プローブを、これらのド
ット−ブロット（dot-blot）、および引続くサザン・ブ
ロット、分子ハイブリダイゼーション実験においてプロ
ーブとして使用した。 詳しくは、RAB−９細胞の全面生長した単層を含有す
る、24ウェルの多ウェル組織培養トレーを、0.05mlの未
希釈の候補のウイルスで感染させ、そして34.5℃で８時
間インキュベーションした。このウイルスの接種物をア
スピレーションし、ウェルを1.0mlのGKNで洗浄し、そし
て0.2mlのNaOHを各ウェルに添加して細胞を溶解し、そ
してDNAを開放させた。室温で一夜貯蔵した後、0.3mlの
1.0モルのトリス−HCl（pH7.5）を添加し、そして0.15
モルのNaCl、0.015ミリモルのクエン酸ナトリウム、pH
7.0、からなる20×緩衝液（以後「SSC」）の0.5mlを各
ウェルに添加した。ドット−ブロット（dot-blot）分析
のため、96ウェルのシュレイヘル−シュネル（Schleich
er-Schnell）濾過装置内のニトロセルロースフィルター
を使用した。フィルターを水で洗浄し、そして１×SSC
で洗浄した後、DNA試料を添加した。DNA試料をフェルタ
ーにベーキングするために、ニトロセルロースフィルタ
ーを乾燥し、真空デシケーター内で60℃で一夜加熱し、
次いで80℃で２時間加熱した。フィルターを、50mlの３
×SSC、0.02％（w/v）のフィコール（Ficoll）、0.02％
（w/v）のBSA、0.02％（w/v）のポリビニルピロリド
ン、50μg/mlの沸騰させかつアルカリ変性したサケ精子
DNA（以後「変性デンハルト（Dehardt）溶液」、10μg/
mlのポリ（Ａ）を含有するプラスチックの密閉可能なパ
ウチに入れ、そして60℃で振盪しながら一夜インキュベ
ーションした。アルカリ性サケ精子DNAは約5.0mg/mlの
原溶液から添加した。前記原溶液は、50mgのサケ精子DN
Aを10mlの0.2NのNaOH中に溶解し、100℃で20分間加熱し
て変性し、そしてDNAを約0.4Kbpのセグメントの剪断
し、次いで0.2mlの10NのHClで中和することによって調
製した。 次いで、変性デンハルト（Dehart）溶液を、50％（v/
v）のホルムアミド、0.6モルのNaCl、0.2モルのトリス
−HCl（pH8.0）、0.02モルのEDTA、0.1％（w/v）のドデ
シル硫酸ナトリウム、50μg/mlのアルカリ変性サケ精子
DNAおよび10μg/mlのポリ（Ａ）からなるハイブリダイ
ゼーション緩衝液（以後「ハイブリダイゼーション緩衝
液」）の50mlと置換した。次に、気泡を袋から絞り出
し、次いでこれをオスター・タッチ−アーマチック・バ
ッグ・シーラー（Oster Touch-a-Mtic Bag Sealer）で
密閉し、そして振盪器上で37℃において１時間インキュ
ベーションした。 その後、約107cpmそして50ngの（32Ｐ）ニック−トラ
スレイションしてM13mp19/BB2（KpnI-BamHI）プローブ
（後述するようにして得られた）を含有する1.0mlを、
3.0mlの注射器で袋の側面のかどを通して添加した。次
に、袋を再び密閉し、そして振盪器上で48時間まで37℃
でインキュベーションしてハイブリダイゼーションさせ
た。 ハイブリダイゼーションが完結した後、袋を切断し、
そして溶液をデカンテーションした。次いで、フィルタ
ーを注意して取り出し、そして約100mlのハイブリダイ
ゼーション緩衝液＋50μg/mlの変性サケ精子DNAを含有
するトレー内に最初の洗浄のためにのみ入れたが、洗浄
液中にポリ（Ａ）は存在しなかった。フィルターを30分
間37℃でおだやかな振盪の下に５回洗浄した。次に、フ
ィルターを37℃で0.3×SSCで30分間洗浄し、次いで濾紙
上に配置して室温で一夜乾燥した。 オートラジオグラフィーのため、フィルターをサラン
ラップで覆われた１枚の薄い板紙の上に再配置し、そし
て増強スクリーを使用してフジＸフィルムに−70℃で２
時間ないし５日間露出した。96の候補のうつ１つは32Ｐ
標識M13mp19/BB2（KpnI-BamHI）プローブにハイブリダ
イゼーションせず、これによりこのハイブリダイゼーシ
ョンしないプローブはPRV g92遺伝子のKpnI-BamHI配列
中に欠失を有したことが示された。このクローンをPRV
（dltk）:PRVTK/STU12と表示する（第５図参照）。 高い純度のウイルスのDNAを、前述のように、tk+PRV
（dltk）:PRVTK/STU12から調製した。次いで、この候補
の欠失突然変異体からの0.5μｇのウイルスDNAを制限ヌ
クレアーゼ、KpnIおよびBamHI、でニュー・イングラン
ド・バイオラボトリーズ・インコーポレーテッド（New
England Biolabs,Inc.）が特定する条件下に消化し、そ
して断片を0.6％（w/v）アガロースゲルの電気泳動によ
り35ボルトの一定電圧のもとに４℃で分離した。電気泳
動緩衝液は0.04モルのトリズマ（Trizma）塩基、pH8.
1、0.03モルのNaH2PO4および0.001モルのEDTAであっ
た。親tk-PRV（BUK-dl 3）（第6A図、レーン８および16
参照）、PRV（BUK-dl 3）の誘導に使用した親tk+菌株、
すなわち、PRV（BUK-5A-R1）の制限ヌクレアーゼ断片
（第6A図、レーン７および15、、および米国特許第4,51
4,497号参照）、およびファージ・ラムダDNAのHindIII
の書家およびファージφX174RF DNAのHaeIII消化により
得られた遺伝子標識断片（第6A図、レーン１、９、17お
よび18参照）を、また、電気泳動させた。アガロースゲ
ルを電気泳動緩衝液中に溶解した0.5μg/mlの臭化エチ
ジウムで着色し、そして短い波長の紫外線照明の下に写
真撮影した。臭化エチジウムで着色したゲルは、PRV（B
UK-dl 3）の6.1KbpのKpnILＪが組換え体tk+PRV（dlt
k）:PRVTK/STU12中において消失し、そしてKpnI−G/H断
片と同時に移動する8.6Kbpのハイパーモルの（hypermol
ar）の帯と置換したことを明らかにした（第6A図、レー
ン14および16参照）。また、PRV（BUK−dl 3）の17.8Kb
pのBamHI−２断片は組換え体tk+PRV（dltk）:PRVTK/SUT
12中において消失し、そして約19.2Kbpの新規なゆっく
り移動するBamHI断片により置換された（第6A図、レー
ン６および８参照）。これらの結果はPRV g92遺伝子か
らの0.4Kbpの欠失と一感染し、そしてpBK JL（Stu/BglI
I）の3.1Kbp-KpnI断片（PRV tk遺伝子を含有する）との
置換と一致する。 アガロースゲル中で分離したDNA制限断片を、次に、
サザン・ブロッティング手順によりニトロセルロースフ
ィルター［シュレイヘル−シュネル（Schleicher-Schne
ll）］に、次の方法で、移した［サザン（Southern）,
E.M.,ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J. Mol. Biol.98:503-513（1975）参照］。 アガロースゲルを1.0モルのKOHを含有するガラスの裏
張りのトレー内に入れ、次いで、1.0モルのトリス−HCl
（pH7.0）および0.6モルのNaClを含有するガラスの裏張
りのトレー内に室温で60分間入れた。次いで、処理した
ゲルをブロット装置［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ・インコーポレーテッド（Bethesda Reseach Labor
atories,Inc.）］に移した。 ニトロセルロースフィルターを水中で10分間、次いで
20×SSC中で５分間予備湿潤させた。次に、フィルター
をゲル上に配置した。移送流体として20×SSCを使用し
て、ブロッティングを約24時間進行させた。付着性ゲル
をニトロセルロースフィルターから除去し、そしてフィ
ルターを６×SSCにすすぎ、室温で数時間乾燥し、次い
で60℃において真空デシケーター内で乾燥した。次い
で、80℃で２時間ベーキングした。ニトロセルロースフ
ィルターをデシケーターから取り出し、そしてデイゼイ
・シール−ア−ミール（Dazey Seal-a-Meal）料理用バ
ッグ内に入れた。 フィルターを、まず、前述のように、60℃において50
mlの変性デンハルト（Dehardt）溶液およびハイブリダ
イゼーション緩衝液で37℃において一夜予備処理した。 ２つの別々のゲルからのニトロセルロースフィルター
を、次に、２つの異なる32Ｐ標識ニック−トラスレイシ
ョンプローブ、すなわち、（ｉ）pBTKおよび（ii）M13m
p19/BB2（KpnI-BamHI）にハイブリダイゼーションさせ
た。プローブのニトロセルロースフィルターへの分子ハ
イブリダイゼーションの手順および洗浄工程は、前述し
たものと同一であった。 pBTKプローブはtk遺伝子全体を含有したが、PRV g92
遺伝子配列をまったく含有しなかった。pBTKプローブ
は、候補の組換え体ウイルスの特定の断片ならびに親PR
V（BUK-dl 3）のそれに対してハイブリダイゼーション
した。期待されるように、ハイブリダイゼーションはPR
V（BUK-dl 3）の6.1KbpnoKpnI-JL断片および組換え体中
の新しい8.6Kbpの断片に対して起こった。また、ハイブ
リダイゼーションはPRV（BUK-dl 3）のBamHI-11断片お
よびVBamHI−９断片の両者に対して起こった。組換え体
tk+PRV（dltk）:PRVTK/STU12に関すると、pBTKプローブ
はBamHI-11断片および新しいBamHI断片、大きさ約19.2K
bp、に対してハイブリダイゼーションした。これが立証
するように、PRV tk遺伝子は組換え体中のg92遺伝子中
に挿入された。 M13mp19/BB2（KpnI-BamHI）プローブは、PRV（BUK-dl
3）のKpnI-JLおよびBamHI−２断片に対してハイブリダ
イゼーションしたが、組換え体のいかなる断片へのハイ
ブリダイゼーションは存在せず、このことにより0.4Kbp
のKpnI-BamHI断片がPRV g92遺伝子から欠失されたこと
が示される。これらの実験から結論的に立証されるよう
に、tk+PRV（dltk）:PRVTK/STU12ウイルスは、PRV g92
遺伝子の欠失中に挿入された選択可能なg92遺伝子、す
なわち、機能的PRV tk遺伝子を有した。 Ｌ、PRV（dlg92/dltk） 相同組換えにより、PRV g92遺伝子中に欠失を、ま
た、含有するPRV（BUK-dl 3）の組換え体を得るため
に、機能的PRV tk遺伝子がPRV g92遺伝子中に挿入され
ているtk+PRV菌株の完全なDNA、およびg92遺伝子中に欠
失を含有する雑種プラスミドを使用して出発することが
必要であった（第５図参照）。この型の交雑後に得られ
た後代ウイルスは主として親tk+PRVからなる。収穫物中
のtk PRV組換え体を濃縮するために、IdUrdを含有する
選択的培地を使用した。IdUrdはtk+PRVの複製を阻害
し、そしてtk-PRVのアウトグロウスを促進する。他の選
択的培地、例えば、BdUrdおよび１−β−Ｄアラビノシ
ルチミジンを、本発明の精神および範囲を逸脱しないで
使用することができるであろう。 前述の組換え体の構成に選択した雑種プラスミドは、
pBUk:gCdlSalであった。しかしながら、PRV g92遺伝子
の解読配列に隣接して大きいまたは小さいフランキング
配列、あるいはg92遺伝子の他の部分中に大きいまたは
小さい欠失を含有する他の雑種プラスミドを、本発明の
精神および範囲を逸脱しないで使用して追加の欠失突然
変異体をつくることできるであろう。上の表２は、この
ような欠失突然変異体の構成に選択できる制限ヌクレア
ーゼ切断位置のいくつかを示す。 組換え工程のために選択したtk+PRV DNAはPRV（dlt
k）:PRVTK/STU12であった。前述のように、この菌株は
正常のtk遺伝子の遺伝子座にPRV g92遺伝子中の欠失、
および、PRV g92遺伝子中の欠失中に挿入された第２
の、完全に機能的なPRV tk遺伝子を含有する（第５図参
照）。tk+PRV（dltk）:PRVTK/STU12をpBUk:gCdlSalと交
雑することによる相同組換えは、機能的PRV tk遺伝子の
除去およびg92遺伝子中のみの欠失とのその置換を生ず
る。 g92遺伝子中の欠失をもつ組換え体tk-PRVの構成は、
次のようにして実施した。 RAB−９細胞を60mmのペトリ皿（0.2×106細胞／皿）
に接種し、そして37℃において48時間インキュベーショ
ンした。次いで、次の無菌溶液を試験管に順番に添加し
た： （１） TE緩衝液中のtk+PRV（dltk）:PRVTK/STU12の50
μg/mlの溶液の0.02ml; （２） PstI消化プラスミドpBUk:gCdlSalの10μg/mlの
溶液の0.2ml。PstI消化プラスミドは次のようにして得
た。10μｇのpBUk:gCdlSalを500μｌのPstI切断緩衝液
中に溶解し、次いでこのプラスミド20単位のPstIで37℃
において１時間消化し、次いでこの反応混合物をプロテ
イナーゼＩ（EMサイエンス）とともに100μg/mlで37℃
において１時間インキュベーションした。この反応混合
物を等体積のフェノールとともに渦形成し、相分離のた
めに遠心し、そして0.1×TE緩衝液に対して透析した。 （３） 0.65mlの水； （４） 8.0g/lのNaCl、0.37g/lのKCl、0.125g/lのNa2H
PO4、1.0g/lのグルコース、5.0g/lのHEPES、pH7.05から
なる２×HEPES緩衝溶液中のサケ精子DNAの20μg/ml溶液
の1.0ml;および （５） 0.13mlの2.0モルのCaCl2。 得られる溶液を倒立により混合し、そして室温に30分
間保持し、その間DNA−カルシウム沈殿物が形成した。
次いで、DNAのカルシウム沈殿物を含有する懸濁液の0.5
mlを5.0mlの生長培地に直接添加し、そして60mmのペト
リ皿中に48時間前に接種したRAB−９細胞上で平板培養
した。細胞を37℃において５時間インキュベーションし
た。次いで、培地をアスピレーションし、そして単層を
5.0mlの新しい生長培地ですすぎ、次いで１×HEPES緩衝
液＋15％（v/v）のグリセロールの溶液の1.0mlを添加し
た。室温で３分間インキュベーションした後、この溶液
をアスピレーションし、単層を再び培地ですすぎ、次い
で新しい生長培地を添加した。広範な細胞変性作用が起
こるまで、培養物を34.5℃において２日間インキュベー
ションした。ウイルスの収穫物を前述のようにつくり、
そして−80℃で貯蔵した。次いで、ウイルスの収穫物を
寒天のオーバーレイの下にRAB−９細胞で滴定した。 同時トランスフェクションからのウイルスの収穫物を
融解し、超音波処理し、そして100μg/mlのIdUrdを補充
した生長培地中で希釈した。tk-PRV組換え体を濃縮する
ために、ウイルスの収穫物を0.1PFU/細胞のインプット
多重度に希釈し、そして100μg/mlのIdUrdを補充した生
長培地中で８オンスの規格びんないでRAB（BU）／細胞
のサブコンフルエント（suconfluent）単層培養におい
て継代培養した。37℃において１時間インキュベーショ
ンした後、感染した単層培養物をGKNで３回洗浄した。
次いで、100μg/mlのIdUrdを含有する生長培地を添加
し、インキュベーションを34.5℃において48時間続け、
そしてウイルスの収穫物をつくった。この選択工程の収
穫物をRAB−９細胞中で滴定し、候補の組換え体tk-PRV
をプラークから不規則にピックアップし、そしてウイル
スのプールを調製した。このようにして、96のtk-g92-P
RV候補の組換え体が得られた。 Ｍ、tk遺伝子およびg92遺伝子の両者中の欠失をもつ組
換え体tk-g92-PRV突然変異体の同定 前述の候補の組換え体から調製したウイルスのDNA
を、前述のように、ドット−ブロット（dot-blot）法に
より分析して、PRV g92遺伝子の1.1KbpのSalI配列およ
びPRVg92遺伝子のほぼ150bpのSacI−Ｃ配列の両者を欠
失する組換え体を同定した（米国特許第4,514,497号参
照）。96の候補の組換え体からのウイルスDNAの組成抽
出物を溶解した細胞から調製し、そしてニトロセルロー
スシートを使用する濾過により吸収した。乾燥後、加熱
によりDNAをフィルターに固定し、そして前述のよう
に、変性デンハルト（Dehardt）溶液で予備処理し、フ
ィルターを前述の32Ｐ標識pSalプローブを含有するハイ
ブリダイゼーション緩衝液中に配置した。ハイブリダイ
ゼーションおよびフィルターの洗浄音痴、ニトロセルロ
ースフィルターを乾燥し、そしてＸフィルムに対して露
出した。候補の組換え体のほぼ1/3はプローブにハイブ
リダイゼーションすることができず、これによりg92遺
伝子の大部分を含有するpSalの1.1KbpのSalI断片中に存
在する配列はこれらの組換え体ウイルス中に存在しない
ことが示される。クローン２を不規則に選択し、そして
PRV（dlg92/dltk）と表示した。このウイルスはアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（American T
ype Culture Collection）に受託番号VR-2116で受託さ
れた。 高い純度のウイルスDNAを、前述のように、調製し、K
pnIおよびBamHIで消化し、次いで断片をアガロースゲル
の電気泳動により分離した。臭化エチジウムで着色した
ゲルは、KpnI−Ａ断片が約5KP結合だけより大きい断片
と置換されたこと（第6A図、レーン10〜13参照）および
8.6KbpのKpnI-G/Hと一緒に移動するtk+PRV（dltk）:PRV
TK/STU12のハイパーモルの帯（第6A図、レーン14参照）
がもはや存在しないことを明らかにした。tk+PRV（dlt
k）:PRVTK/STU12の19.2KbpのBamHI−２断片（第6A図、
レーン６参照）は組換え体中にそんざせず、そしてBamH
I−３断片の一緒に移動するハイパーモルの帯（16.7Kb
p）と置換された（第6A図、レーン２〜５参照）。ま
た、tk+PRV（dltk）:PRVTK/STU12において消失したBamH
I−９断片は再び出現した。これらの結果は、tk+PRV（d
ltk）:PRVTK/STU12のPRV g92遺伝子の試料した断片中に
挿入された機能的PRV tk遺伝子を置換したPRV g92遺伝
子からの1.1KbpのSalI断片の欠失と一致する（第５図参
照）。 電気泳動後、上のゲルのサザン・ブロットを、前述の
ように、（ｉ）32Ｐ標識オリゴー006、（ii）32Ｐ標識p
BUK:Stu12/PstI、そして（iii）前述の32Ｐ標識pSalIに
対してハイブリダイゼーションしたが、ただしオリゴー
006のためのハイブリダイゼーション緩衝液は35％（v/
v）のホルムアルデヒド、0.6モルのNaCl、0.2モルのト
リス−HCl（pH8.0）、0.02モルのEDTA、0.1％（w/v）の
ドデシル硫酸ナトリウム、50μg/lのアルカリ変性サケ
精子DNAおよび10μg/mlのポリ（Ａ）であり、そして最
後の洗浄は６×SSC中で実施した。 次の結果が、これらのオートラジオグラフィーの実験
から得られた： （１） オリゴー006プローブは、PRV（BUK-5A-R1）のK
pnI-JLおよびBamHI断片（米国特許第4,514,497号参照）
に対してハイブリダイゼーションし、そしてPRV（dlt
k）:PRVTK/STU12の8.6KbpのKpnIおよび19.2KbpのBamHI
断片（これらの両者は完全な機能的PRV tk遺伝子を含有
する）に対してハイブリダイゼーションするが、tk-欠
失突然変異体、PRV（BUK-dl 3）およびPRV（dlg92/dlt
k）に対してハイブリダイゼーションしなかった。この
ことから立証されるように、候補の組換え体、PRV（dlg
92/dltk）と表示する（クローン２、３、８および10）
はPRV（BUK-dl 3）から前に欠失されたPRV tk遺伝子の
同一のほぼ150bpの配列を欠いた。 （２） 32P-pBUK:Stu12/PstIプローブは、期待するよ
うに、PRV（BUK-5A-R1）およびPRV（BUK-dl 3）のBamHI
−２、BamHI−９、KpnI-JLおよびKpnI−Ａの断片に対し
てハイブリダイゼーションした（第6B図参照）。このプ
ローブは組換え体PRV（dlg92/dltk）ウイルスのもとのK
pnI-JLまたはKpnI−Ａ断片に対してハイブリダイゼーシ
ョンしなかったが、その代わり、KpnI−ＡおよびKpnI-J
L（欠失）断片の融合から生ずる、新しい34.2Kbpの断片
にハイブリダイゼーションした（第５図および第6B図参
照）。同様に、pBUK:Stu12/PstIプローブは、親BamHI−
２からの1.1KbpのSalI配列の欠失から生ずる、新しい1
6.7KbpのBamHI−２断片に対してハイブリダイゼーショ
ンした。 （３） 32P-pSalIプローブは、PRV（BUK-5A-R1）、PRV
（BUK-dl 3）のBamHI−２、KpnI−ＪLおよびKpnI−Ａ断
片、およびPRV（dltk）:PRVTK/STU12の新しい34.2Kbpの
KpnIおよび19.2KbpのBamHI断片に対してのみハイブリダ
イゼーションした（第５図および第6C図参照）。しかし
ながら、このプローブは候補のPRV（dlg92/dltk）ウイ
ルスの断片にまったくハイブリダイゼーションしなかっ
た（第6C図参照）。 上の結果が照明するように、PRV（dlg92/dltk）組換
え体は、PRV tk遺伝子中にほぼ150bpの欠失およびPRV g
92遺伝子中にほぼ1.1Kbpの欠失をもつ、二重の突然変異
体である。 実施例２ PRV菌株のTK活性 PRV g92の欠失および／または挿入の突然変異体の表
現型、すなわち、PRV（dlg92/dltk）およびPRV（dlt
k）:PRVTK/STU12（第５図参照）を分析するため、感染
した細胞のオートラジオグラフィーを次のようにして実
施した。 RAB（BU）細胞を８ウェルのLab-Tek反応（マイルス・
ラボラトリーズ・インコポーレーテッド）のスライド中
に接種（50,000/ウェル）し、そして37℃で全面生長ま
で１〜２日間インキュベーションした。細胞を約10PFU/
細胞において、親ウイルス菌株PRV（BUK−５）およびPR
V（BUK-dl 3）で、あるいは組換え体ウイルス、PRV（dl
tk）:PRVTK/STU12およびPRV（dlg92/dltk）で感染させ
た。37℃において１時間吸収させた後、新しい生長培地
を添加した。感染後３時間に、生長培地を5.0μCiの3H-
dThd/ml、0.1μg/mlのdThdを含む新しい生長培地と交換
した。感染後20時間に、培地を分離し、そして細胞１×
GKN、メタノールですすぎ、次いで室温においてメタノ
ール中で固定した。ウェルおよびガスケットをスライド
から除去し、そして細胞を４℃において、5.0％（w/v）
のトリクロロ酢酸（２回）、70％（v/v）のエタノール
（３回）、および100％のエタノール（２回）の各々で
５分間洗浄した。空気中で乾燥した後、スライドを2.0
％（w/v）の酢酸−オルセイン中で２分間着色し、次い
でエタノール中で変性した。スライドをオートラジオグ
ラフィー写真乳剤（コダック−NTB2）中に40℃で浸漬
し、そして水平位置で１時間乾燥した。次いで、スライ
ドをドリエライト（drierite）を含む暗箱内に入れ、そ
して室温において20時間放置した。スライドをコダック
・デクトールで16℃において２分間現像し、水中で10秒
間すすぎ、コダック・フィクサー中で５分間定着し、そ
して各回2.5分間水中ですすいだ。 PRV（BUK−５）、すなわち、tk+PRV、で感染させたす
べての細胞において、核はPRV TK酵素による3H-dThdの
ホスホリル化、および引続く3H-dTTPの酸不溶性核のDNA
中の組込みのために強く標識された。同様に、PRV（dlt
k）:PRVTK/STU12で感染させたすべての細胞において、
核は3H-dThdで強く標識された。このことにより機能的P
RV tk遺伝子はPRV g92遺伝子中に挿入されたことが立証
される。この結果は、この組換え体ウイルスがHATG培地
で選択されたので、期待されたものである。期待される
ように、PRV（BUK-dl 3）およびPRV（dlg92/dltk）は、
ウイルスの生長のために、感染された細胞において顕著
な細胞変性作用を生成せず、これらのウイルスで感染さ
れた細胞の核は、3H-dThdをホスホリル化する機能的TK
酵素が存在しないので、標識されなかった。こうして、
これらの実験が立証するように、PRV（dlg92/dltk）はt
k-PRVであり、そしてPRV（dltk）:PRVTK/STU12はtk+PRV
であった。 前述のオートラジオグラフィー実験に加えて、PRV委
した細胞からの細胞質ゾル抽出物ヲ3H-dThd−ホスホリ
ル化活性についてアッセイして、TK誘発活性を欠くPRV
（dlg92/dltk）を評価した。これらの実験は前述のよう
にして実施した［米国特許第4,514,497号、およびキッ
ト（Kit）、S.、キット（Kit）、M.およびパートル（Pi
rtle）、E.C.、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリ
ナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）46:1359-136
7（1985）参照］。結果を下表３に示す。 上の表３が示すように、（ｉ）モック感染したRAB（B
U）細胞、すなわち、tk-細胞、は無視できるTK活性を有
する；（ii）TK活性はtk+ウイルス、RPV（BUK−５）で
感染後にRAB（BU）細胞によって獲得される；しかし、
（iii）はTK活性は突然変異体ウイルス、PRV（dlg92/dl
tk）によっては獲得されない。こうして、PRV（BUK-dl
3）と同様に、PRV（dlg92/dltk）ウイルスはtk-PRVであ
る。 実施例３ PRV菌株の温度抵抗性 RAB−９細胞の複製、サブコンフルエンス（subconflu
ent）単層培養物を、約0.1PFU/細胞のインプット多重度
において、PRV（BUK-dl 3）またはPRV（dlg92/dltk）で
感染し、そしてCO2インキュベーター内で30℃、34.5℃
および39.1℃においてインキュベーションした。34.5℃
で感染後５時間において、ウイルスの収穫物をつくっ
て、ウイルス菌株の吸収および浸透直後に存在する感染
性ウイルスの量を決定した。ウイルスの収穫物を、ま
た、34.5℃および39.1℃においてウイルスの感染後43〜
54時間に、および30℃においてウイルスの感染後91〜11
5時間につくった（表４参照）。広範な細胞変性作用は
収穫時間において観測された。次いで、ウイルスの収穫
物を、米国特許第4,514,497号に記載されるようにし
て、RAB−９細胞中で34.5℃および39.1℃において滴定
した。結果を下表４に示す。 上の表４が立証するように、PRV（BUK-dl 3）は39.1
℃において34.5℃におけるのとほぼ同じ力価に複製した
（それぞれ、約３×108および６×108PFH/ml）。30℃の
インキュベーションから感染後91時間で調製した収穫物
は約８×107PFU/mlの力価を有し、これにより効率よい
ウイルスの複製が、また、30℃において起こったことが
示される。有意には、これらの力価はウイルスの収量に
ついてアッセイするためのプラールの滴定を34.5℃ある
いは39.1℃において実施するかどうかを無関係に観察さ
れた。 表４が示すように、PRV（dlg92/dltk）はPRV（BUK-dl
3）よりゆっくり複製し）、そしてPRV（dlg92/dltk）
による細胞の感染後に得られる力価は、PRV（BUK-dl
3）による細胞の感染後に得られる力価よりも多少低か
った。しかしながら、PRV（dlg92/dltk）による効率よ
い複製は30℃、34.5℃および39.1℃において観測され
た。同様に、ウイルスの収穫物のプラーク滴定アッセイ
が立証するように、プラーク滴定を34.5℃または39.1℃
において実施するかどうかに無関係に、ほぼ同一の力価
が測定された。これらの結果から明瞭に示されるよう
に、PRV（BUK-dl 3）およびPRV（dlg92/dltk）の両者は
温度抵抗性であり、そして広い範囲の温度、特定的には
30℃〜39.1℃またはそれより高い温度にわたって効率的
に複製することができる。 実施例４ PRV（dlg92/dltk）でワクチン接種したブタにおける特
異的抗体の生産および保護の研究 PRV（dlg92/dltk）で感染した細胞中でつくられるPRV
特異的糖蛋白質を分析するために、およびこれらの糖蛋
白質を他のウイルス菌株で感染させた細胞中でつくられ
る糖蛋白質と比較するために、PRV（dlg92/dltk）−特
異的抗血清（以後「Ｃ型抗血清」）を得ることが必要で
あった。これはブタ、WP2およびBP2を、下の詳述するよ
うに、PRV（dlg92/dltk）で免疫化することによって達
成した。引続いて、これらの２種類の免疫化ブタをヴィ
ルレントPRV（Ind−Ｆ）に対して対抗暴露し、そして対
抗後の抗血清（以後「Ｄ型抗血清」）を下に詳述するよ
うに集めた。このようにして、PRV（dlg92/dltk）蛋白
質のみによって誘発された抗体および，また、ヴィルレ
ントPRVによって誘発されるが、PRV（dlg92/dltk）によ
って誘発されない、追加の抗体、すなわち、抗g92抗体
を得ることが可能であった。さらに、このパイロット研
究はPRV（dlg92/dltk）のワクチンウイルスの安全性お
よび効能の評価を可能とした。 Ｃ型抗血清はブタWP2、すなわち、生後６週間の去勢
した雄、およびブタBP2、すなわち、雌ブタから生産し
た。２種類のブタはヨークシャイヤーＸヅロク（Duro
c）Ｘランドレイス（Landrace）Ｘハンプシャイヤーの
交雑（cross）であり、各々は11.4kgの体重であり、そ
して別々の室内で機構制御した環境において収容した。
ニップル（Nipple）水供給装置により水を自由に与え、
そして16％の商用豚飼料を自己供給装置により毎日与え
た。ブタWP2およびBP2のワクチン接種前の抗血清は、抗
PRV中和性抗体に対して陰性であった。 第１日に、両者のブタに2.0ml（４×108PFU/ml）のPR
V（dlg92/dltk）を首の筋肉中において接種した。ワク
チン接種後の期間において、ブタの食欲は低下せず、そ
して悪い反応は観察されなかった。 12日後に、両者のブタに同一投与量のPRV（dlg92/dlt
k）を首の筋肉中においてワクチン接種し、そして第２
の血清試料を採取した。この時PRV中和力価は1:4であっ
た。第２回目のワクチン接種後の期間において、ブタの
食欲は低下せず、そして悪い反応は観察されなかった。
14日後、血清試料を再び採取し、そしてこの後者の血清
をＣ型抗血清と表示した。 Ｃ型抗血清の収集と同時に、両者のブタを約３×108P
FUのPRVのヴィルレントInd−Ｆ菌株に対して首の筋肉に
おいて筋肉内対抗暴露した。16日後に、血清試料を採取
し、そしてＤ型抗血清と表示した。この実験の51日の期
間において、悪い反応は認められかった。雌ブタおよび
去勢した雄ブタは、実験の終りにおいて、それぞれ、4
1.4kgおよび34.6kgの体重であった。体重の増加を通常
の速度で起こり、そして両者のブタは精力さかんであり
かつ健康であった。 こうして、PRV（dlg92/dltk）は、PRV g92遺伝子中の
欠失にかかわらず、PRV（BUK-dl 3）の前に照明した保
護的性質を保持した［キット（Kit）、S.、キット（Ki
t）、M.およびパーソル（Pirtle）、E.C.、アメリカン
・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am.
J. Vet. Res.）46:1359-1367（1985）；キット（Ki
t）、S.、キット（Kit）、M.、ラウホーン（Lawhor
n）、B.およびマクコンネル（McConnel）、ウイルスの
ワクチンへの高い技術の道筋（High-Technology Route
to Virus Vaccines）、ドレースマン（Dreesma
n）、G.R.、ブロンソン（Bronson）、J.G.およびケネデ
ィー（Knnedy）、R.C.（アメリカン・ソサイアティー・
オブ・マイクロバイオロジー、ワシントン、D.C.）、82
-99ページ（1985）参照］。 実施例５ PRV−感染細胞中で合成されたマンノース標識糖蛋白質 （Ａ） 細胞抽出物らのマンノース標識糖蛋白質の免疫
沈殿 PRV案のいくつかの型をこれらの実験において使用し
た：（ｉ）PRV（BUK-dl 3）でワクチン接種したブタか
らのＡ型抗血清；（ii）PRV（BUK-dl 3）でワクチン接
種し、そして引続いてPRVの高度にヴィルレントのInd−
Ｆ菌株に対して対抗暴露させたブタからのＢ型抗血清；
（III）PRV（dlg92/dltk）でワクチン接種したブタから
のＣ型抗血清；（iv）PRV（dlg92/dltk）でワクチン接
種し、そして引続いてPRVの高度にヴィルレントのInd−
Ｆ菌株に対して対抗暴露させたブタからのＤ型抗血清；
（ｖ）PRVで自然に感染した家畜のブタからのＥ型抗血
清；（vi）PRVで自然に感染した野性のブタからのＦ型
抗血清：および（vii）PRV gp82にと反応する、マウス
ハイブリドーマ細胞から誘導された、PRVモノクローナ
ル抗体からなるＧ型抗血清。 Ｂ型、Ｄ型、Ｅ型およびＦ型の抗血清は、tk+PRV野外
菌株の主要な糖蛋白質のすべてと反応する。Ａ型の抗血
清は、gIを除外したtk+PRV野外菌株の主要な糖蛋白質の
すべてと反応する［メッテンレイター（Mettenleite
r）、T.C.、ルーカクス（Lukacs）、N.およびルジハ（R
ziha）、H.J.ウイルス学雑誌（J. Virol.）53:52-57
（1985）参照］。この理由は、前述のように、PRV（BUK
-dl 3）はgIを生産しないブカレスト（Bucharest）菌株
から誘導されることにある。Ｃ型の抗血清は、gIおよび
g92を除外したtk+PRV野外菌株の主要な糖蛋白質のすべ
てと反応する。この理由は、前述のように、PRV（dlg92
/dltk）はgIを生産しないPRV（BUK-dl 3）から誘導さ
れ、そしてPRV（dlg92/dltk）は、PRV g92遺伝子中の操
作された欠失のため、g92を生産しないことにある。そ
れゆえ、Ｃ型抗血清は、後述するように、PRV（dlg92/d
ltk）でワクチン接種したブタを、他のブカレスト（Buc
harest）菌株、例えば、PRV（BUK−５）、PRV（BUK-dl
3）またはPRV（Norden）DEワクチン接種されたブタと区
別するために有用である。 Ａ型およびＢ型の抗血清を、それぞれ、ブタNo.103お
よびNo.106、すなわち、生後６週のブタ、から生産し
た。ブタはランドレイス（Landrace）Ｘハンプシャイヤ
ーの交雑（cross）であり、そして別々の室内で機構制
御した環境において収容した。ブタNo.103およびNo.106
からのワクチン接種前の血清は、抗PRV中和性抗体に対
して陰性であった。 第１日に、ブタNo.103に1.25ml（４×108PFU/ml）のP
RV（BUK-dl 3）を首の筋肉中において接種した。13日後
に、No.103に同一ウイルス調製物を投与し、そしてブタ
No.106を最初に1.5mlの同一ウイルス調製でワクチン接
種した。ブタNo.103についてのPRV中和力価はこの時1:4
であった。14日後、すなわち、最初のワクチン接種後27
日に、ブタNo.103を放血させたＡ型抗血清を採取した。
この時、PRV中和力価は1:64であった。同一の日に、ブ
タNo.106を約７×108PFU/mlのPRVのヴィルレントInd−
Ｆ菌株に対して鼻内に対抗暴露した。ブタNo.106の対抗
暴露後10日に、ブタNo.106から血清試料を採取し、そし
てＢ型抗血清と表示した。PRVの中和力価は1:256であっ
た［キット（Kit）、S.、キット（Kit）、M.およびパー
トル（Pirtle）、E.C.、アメリカン・ジャーナル・オブ
・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）46:
1359-1367（1985）参照］。 Ｃ型およびＤ型の抗血清を前述のようにして誘導され
た。 Ｅ型抗血清はE.C.パートル（Pirtle）、ウイルス学研
究所（Virological Reseach Laboratiory）、ナショナ
ル・アニマル・ディシーズ・センター（National Anima
l Disease Center）、アイオワ州エイムス、から入手し
た。 抗血清No.6−１、３−36決定５−29は、アイオワ州に
おけるパッキング・プラント（Packing plant）におい
て個々のブタから得た。これらの抗血清は、ミクロ免疫
拡散テスト（MIDT）により決定したとき、PRV抗体に対
して陽性であった［MIDT手順について、グーテクンスト
（Gutekunst）、D.E.、パートル（Pirtle）、E.C.およ
びメンゲリング（Mengeling）、W.L.、アメリカン・ジ
ャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. V
et. Res.）39:207-210（1978）参照］。パッキング・
プラント（Packing plant）において屠殺したブタのほ
ぼ10％はPRVについて血清陽性であり、それゆえ、前にP
RVで自然に感染していた。これらの血清のウイルス中和
性抗体の力価は決定しなかった。 Ｆ型抗血清はロバート（Robert）A.クランデル（Cran
dell）博士、テキサス・ベテリナリー・メディカル・ダ
イアグノスチック・ラボラトリー（Texas Veterinary M
edical Diagnostic Laboratory）、テキサス州カレッジ
・ステーション、によって提供された。この抗血清は、
イースト・テキストのオークションマーケットで販売さ
れたパイニー・ウッド・ルーター（Piney Wood roote
r）ブタを放血することによって採取した。放血を実施
したPRV抗体の発生を決定され、それゆえ、この区域の
野生ブタはPRVで自然に感染されていた［キット（Ki
t）、S.、キット（Kit）、M.、ラウホーン（Lawhor
n）、B.およびマクコンネル（McConnel）、ウイルスの
ワクチンへの高い技術の道筋（High-Technology Route
to Virus Vaccines）、ドレースマン（Dreesma
n）、G.R.、ブロンソン（Bronson）、J.G.およびケネデ
ィー（Knnedy）、R.C.（アメリカン・ソサイアティー・
オブ・マイクロバイオロジー、ワシントン、D.C.）、82
-99ページ（1985）参照］。1:4〜1:64の範囲のウイルス
中和力価をもつ６種類の異なる野生ブタからの抗血清を
分析された。 Ｇ型抗血清はR.A.ファン・デウセン（van Deusen）、
生物ウイルス学研究所（Bilogic Virology Laborator
y）、ナショナル・ベテリナリー・サービス研究所（Nat
ional Veterinary Service Laboratory）米国農務省、
アイオワ州エイエム、から入手した。このは抗血清はPR
V（IND−Ｆ）に対して生産された抗gp82−２モノクロー
ナル抗体のクローン3G9-F2（マウスIgM）であった［ワ
ーゼン（Wathen）、L.M.K.、プラット（Platt）、V.
B.、ワーゼン（Wathen）、M.W.、バン・デウセン（van
Deusen）、R.A.、ウェットストーン（Whetstone）、C.
A.およびパートル（Pirtle）、E.C.、ウイルスの研究
（Virus Research）4:19-29（1985）参照］。 弱毒ワクチンまたはヴィルレントPRV菌株で感染した
細胞中につくられるPRV特異的糖蛋白質を得るために、
４オンスの規格びん内のRAB−９細胞の全面生長培養物
を、種々のPRV菌株で約20PFU/細胞のインプット多重度
で感染させた。ウイルスを37℃において15分毎におだや
かに攪拌しながら１時間吸収させた。次いで、2.0％（w
/v）の透析した（PBS緩衝液に対して）胎児子牛血清を
補充した5.0mlの生長培地を添加した。10％（w/v）より
はむしろ2.0％（w/v）の低下した濃度で透析した胎児子
牛血清を使用すると、標識前駆体、例えば、35Ｓ−チミ
ジンおよび3Ｈ−マンノースまたは3−グルコサミンのウ
イルス−特異的蛋白質および糖蛋白質への組込みが促進
され、かつ内因性非標識代謝物による放射性代謝物の希
釈が減少する。PRV免疫細胞を、感染後５時間まで、34.
5℃においてインキュベーションした。この細胞を標識
するために、培地を除去し、細胞の単層をグルコース不
含培地で洗浄し、そして100μCiの3Ｈ−マンノース
（［アマシャム・コーポレーション（Amersham Corpora
tion）］を含有する生長培地を添加した。Ｃ。を感染後
24時間まで34.5℃においてインキュベーションし、その
時培地をアスピレーションにより除去し、細胞をGKNで
洗浄し、次いで1.0％（w/v）のNP40（非イオン性洗
剤）、0.9％（w/v）のNaCl、0.0625モルのトリス−HCl
（pH7.0）からなるノニデト（Nonidet）P40−抽出緩衝
液の０、4mlを、おだやかにかきまぜながら、５分間添
加した。次いで、細胞を−80℃で凍結し、融解し、そし
て超音波により崩壊させた。蛋白質抽出物を−80℃で貯
蔵した。 免疫沈殿のため、70μｌの各抽出物を30μｌのＡ型、
Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型またはＦ型の抗血清に添加し、
次いでこの混合物を４℃で16〜20時間インキュベーショ
ンした。次いで、150μｌのパンソービン（Pansorbin）
［プロテインA;カルビオケム（Calbiochem）］を添加し
て抗原−抗体複合体を吸収し、そしてこの混合物を４℃
で45分間インキュベーションした。ソーバル（Sorval
l）遠心機のSS34ローター中で9,000rpmで遠心した後、
上澄みを除去し、そいてPBS＋0.05％（v/v）のツイーン
20からなる沈殿物を洗浄緩衝液中に再懸濁させた。沈殿
物の遠心および洗浄を３回反復し、そして、最後に、沈
殿を60μｌの蒸留水中に再懸濁させた。0.0625モルのト
リス−HCl（pH6.8）、0.3％（w/v）のドデシル硫酸ナト
リウム、0.5％（v/v）の２−メルカプトエタノール、10
％（v/v）のグリセロールおよび0.001％（w/v）のブロ
モフェノール・ブルーからなる緩衝液Ｄの30μｌを添加
し、そしてこの混合物を２分間沸騰させ、そして使用す
るまで−80℃で貯蔵した。 モノクローナル抗体をgp82−２を使用する免疫沈殿の
場合において、90μｌの各抽出物を10μｌのＧ型抗血清
（IgM）に添加し、そしてこの混合物を４℃で20時間イ
ンキュベーションした。次いで、50％（v/v）のグリセ
ロール中の抗マウスポリクローナルＹ血清の1.0mg/mlの
溶液［カーケガード・アンド・ラボラトリーズ・インコ
ーポレーテッド（Kirkegaard and Perry Laboratories
Inc.）］の30μｌを添加し、そしてインキュベーション
を４℃において20時間続けた。次いで、165μｌのパン
ソービン（Pansorbin）（プロテインＡ）を添加した。
この手順の残部は前述したものと同一であった。 次に、試料を、後述するように、変性条件下にSDS−
ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により分析した。 （１） 次の成分からなる５×電気泳動緩衝液： （ａ） 144gのグリSN（カルビオケム）； （ｂ） 30gのトリズマ（Trizma）［シグマ・ケミカル
・カンパニー（Sigma Chemical Co.）］； （ｃ） 5.0gのドデシル硫酸ナトリウム。 （２） 次の成分からなる3.0％（w/v）のポリアクリル
アミドスタッキングゲル： （ａ） 3.17mlのＨ2O; （ｂ） 1.25mlの上のトリス緩衝液（４×0.5モルのト
リス−HCl（pH6.8）、0.4％（w/v）のドデシル硫酸ナト
リウム）； （ｃ） 0.5mlのアクリルアミド：ビスアクリルアミド
（30:0.8w/w）； （ｄ） 75μｌの2.0％（w/v）の過硫酸アンモニウム
（バイオラド・ラブ）；および （ｅ） 5.0μｌのTEMED（シグマ・ケミカル・カンパニ
ー）。 （３） 次の成分からなる10％（w/v）のポリアクリル
アミドの展開ゲル： （ａ） 12mlのＨ2O; （ｂ） 7.5mlの下のトリス緩衝液（４×1.5モルのトリ
ス−HCl（pH8.8）＋0.4％（w/v）のドデシル硫酸ナトリ
ウム）； （ｃ） 10mlの0.5mlのアクリルアミド：ビスアクリル
アミド（30:0.8w/w; （ｄ） 0.6mlの２％（w/v）の過硫酸アンモニウム； （ｅ） 15μｌのTEMED;および （ｆ） 0.5mlの50％（v/v）のグリセロール。 100μｌの緩衝液Ｄ中の3Ｈ−マンノース−標識試料
を、1.5mmの厚さのラエムリ（Laemmli）ゲルに適用し、
そして一定電圧において16時間室温で電気泳動させた
［ラエムリ（Laemmli）、U.K.、ネイチャー（Nature）2
27:680-685（1970）参照］。ゲルを固定し、そして50％
（v/v）のメタノール、10％（w/v）の酢酸および0.015
％（w/v）のクマッシー・ブルーからなる決定で室温に
おいて30分間着色させ、次いで10％（v/v）の酢酸およ
び10％（v/v）のメタノールからなる溶液室温において
２時間で脱色した。次いで、ゲルをEn3Hance ｛ニュー
・イングランド・ニュークリアー・プロダクツ（New En
gland Nuclear Products）］で室温において１時間処理
し、そして蒸留水で30分間洗浄した。次いで、ゲルを乾
燥し、そして直接オートラジオグラフィーに−70℃にお
いて１〜５日間かけ、ここでフジＸ線フィルムおよびラ
イティング＋増強スクリーン［クロネクス・スクリーン
（Cronex screen）；イー・アイ・デュポン・デ・ネモ
アス・アンド・カンパニー・インコーポレーテッド（E.
I.de Nemours and Co.,Inc.）］を使用した。 次の結果が得られた： （１） 正常の（放血前）ブタの血清（NS）はPRV免疫
細胞の抽出物から3Ｈ−マンノース−レク糖蛋白質を沈
殿させなかった（第7A図および第7B図参照）。 （２） Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型およびＦ型の、
抗血清はモック−免疫細胞から3Ｈ−マンノース−レク
糖蛋白質を沈殿させなかった（データは示されていな
い）。 （３） Ｂ型（第7A図、レーン１参照）、Ｄ型、Ｅ型お
よびＦ型の抗血清は、ヴィルレントtk+PRV（I11）−感
染細胞から、見掛け分子量が約116,000〜130,000ダルト
ン（PRV gIIaおよびgI）、約92,000〜98,000ダルトン
（PRV gIIIおよびgIV）、74,000（PRV gIIb）、62,000
（PRV gV）および58,000ダルトン（PRV gIIc）の高度に
3Ｈ−マンノース−標識された糖蛋白質、および分子量
が約40,000ダルトンの軽度に3Ｈ−マンノース−標識さ
れた糖蛋白質を免疫沈殿させた。これらの結果は他の研
究者により得られた結果に類似する［ハンプル（Hamp
l）、H.、ベン−ポラト（Ben-Plrat）、T.、エールリハ
ー（Ehrliher）、L.、ヘイバーメール（Habermehl）、
K.O.およびカプラン（Kaplan）、A.S.、ウイルス学雑誌
（J. Virol.）52:583-590（1984）；ルカクス（Lukac
s）、N.、チール（Thiel）、H.J.、メッテンレイター
（Mettenleiter）、T.C.およびリザ（Rhiza）、H.J.、
ウイルス学雑誌（J. Virol.）53:166-173（1985）；お
よびロビンス（Robbins）、A.K.、ワイス（Weis）、J.
H.、エンクイスト（Enquist）、L.W.およびワトソン（W
atoson）、R.J.、ジャーナル・オブ・モレキュラー・ア
ンド・アプライド・ジェネチックス（J. Mol. Appl.
Genet.）2:485-496（1984）参照］。 （４） PRV（BUK−５）およびPRV（BUK-dl 3）感染細
胞の場合において、Ｂ型（第7A図、レーン５および第7B
図、レー９参照）およびＤ型、Ｅ型およびＦ型の抗血清
は同様な3Ｈ−マンノース−標識糖蛋白質を沈殿させた
が、ただし分子量が同様な約116,000〜130,000ダルトン
である帯は、KpnI−Ｉ欠失のためPRVのブカレスト（Buc
harest）誘導菌株で感染した細胞にgIが存在しないの
で、gIを多分含有しない。 （５） PRV（dlg92/dltk）感染細胞の抽出物から、Ｂ
型の抗血清により（第7B図参照）、Ｄ型、Ｅ型およびＦ
型の抗血清により沈殿した糖蛋白質は、PRV（BUK−５）
およびPRV（BUK-dl 3）感染細胞から沈殿したものに類
似するが、ただしこれらの抗血清は92,000〜98,000ダル
トンの糖蛋白質、すなわち、gIIIを沈殿させることがで
きなかった。さらに、Ｂ型抗血清はPRV（dltk）:PRVTK/
STU12感染細胞のマンノース標識抽出物から92,000〜98,
000ダルトンの糖蛋白質を沈殿させなかった。 （６） tk-PRV（BUK-dl 3）のワクチン接種したブタか
ら得られた、Ａ型抗血清により沈殿した3Ｈ−マンノー
ス標識蛋白質のパターンは、Ｂ型、Ｄ型、Ｅ型およびＦ
型の抗血清で観察されるものに一般に類似したが、ただ
し分子量が約116,000〜130,000ダルトンである帯の標識
はtk+PRV（I11）免疫細胞からの免疫沈殿物中において
減少した。これは期待された結果である。なぜなら、PR
V（BUK-dl 3）でワクチン接種したブタはgIに対する抗
体の誘発に欠けるからである。また、gIを含有するPRV
（I11）からの抽出物を免疫沈殿に使用したとき、gV（6
2,000）帯対gIIc（58,000）帯の標識の比が抗血清のす
べてについて増加した（第7A図、レーン１〜３とレーン
13〜15との比較）は注目するに値する。これは、gIおよ
びgVが非共有結合の糖蛋白質の複合体の一部であるとい
う観察と一致する。 （７） 有意には、tk-PRV（dlg92/dltk）でワクチン接
種したブタから得られたＣ型抗血清は主要な分子量92,0
00〜98,000の糖蛋白質の本質的にいずれをも沈殿させな
かった（第7A図、レーン３および７および第7B図、レー
ン11および15参照）。しかしながら、tk+PRV（Ind−
Ｆ）で前もってワクチン接種したブタの対抗暴露後に得
られたＤ型抗血清は、期待されるように、主要な分子量
92,000〜98,000の糖蛋白質を沈殿させなかった。 （８） これらの結果が明瞭に示すように、tk-PRV（dl
g92/dltk）は、下において照明するように、gIIIに相当
する主要な分子量92,000〜98,000の糖蛋白質を合成する
とき欠けた。同様に、PRV（dltk）:PRVTK/STU12は主要
な分子量92,000〜98,000の糖蛋白質を合成するとき欠け
た。これらの２種類の蛋白質はPRVのブカレスト（Bucha
rest）菌株から誘導されたので、また、gIの合成におい
て欠けた。それゆえ、tk-PRV（dlg92/dltk）でワクチン
接種したブタはgIIIおよびgIに対する抗体をつくること
ができなかった。こうして、tk-PRV（dlg92/dltk）でワ
クチン接種したブタからの抗血清は、ヴィルレントtk+P
RV菌株で感染したブタの抗血清から、してgIIIを発現す
るブカレスト（Bucharest）、バーサ（Birtha）およびN
IA−４ワクチンでワクチン接種したブタから、区別され
うる。 （Ｂ） 分画したマンノース標識糖蛋白質の免疫沈殿 PRV感染細胞中につくられた個々の糖蛋白質（または
糖蛋白質複合体）を分離しかつ研究するために、9.6×1
06のRAB−９細胞を約30PRFU/細胞のtk+PRV（I11）菌株
で感染させ、そして前述のように、感染後3Ｈ−マンノ
ースで５〜24時間標識した。次に、ノニデット（Nonide
d）P40抽出物を、前述のように、調製した（合計の体積
1.6ml）。次いで、1.0mlの抽出物をPBS中の連続の５％
〜15％（w/v）スルロース勾配の10.2mlの上の層状に
し、そしてスピンコ（Spinco）遠心装置のベックマン
（Beckman）SW41ローター中で32,000rpmにおいて４℃で
20時間遠心した。各々約0.4mlの29の分画を遠心機の管
の底から集めた。20μｋのアリコートを直径24mmのワッ
トマン（Whatman）GF/Aディスク・フィルター上にスポ
ッティングし、５％（w/v）のトリクロロ酢酸で各10分
間２回洗浄し、エタノールで１回洗浄し、80℃で30分間
乾燥し、次いで液体シンチレーション・スペクトロメー
ターで計数して、3Ｈ−マンノース標識細胞およびウイ
ルスの糖蛋白質を捜した。スルロース勾配の重い側に対
して斜めになる放射性帯が、分画14〜27において見出さ
れた。放射性帯のピークは分画23中に発見された。この
ことから予測されるように、gI、gIV、gVおよびp115を
含む非共有結合の糖蛋白質複合体、ならびにgIIa、gIIb
およびgIIcを含む供給結合した複合体は放射性帯の重い
スクロース分画中に見出され、そして、共有結合および
非共有結合の複合体、すなわち、gI＋gIV＋gV＋p115お
よびgIIa＋gIIb＋gIIcはgIIIよりも大きい凝集体である
ので、gIIIは標識ピークの軽いスクロース分画中に見出
されるであろう［ハンプル（Hampl）、H.、ベン−ポラ
ト（Ben-Plrat）、T.、エールリハー（Ehrliher）、
L.、ヘイバーメール（Habermehl）、K.O.およびカプラ
ン（Kapln）、A.S.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）52:
583-590）1984）参照］。多くの大きさの細胞の蛋白質
は、また、ピークの種々の部分中に存在することがあ
る。それゆえ、免疫沈殿の分析およびSDS−ポリアクリ
ルアミドゲルの電気泳動の分析を実施して、異なるPRV
糖蛋白質の位置を研究し、かつそれらを細胞の糖蛋白質
と区別した。 スクロース勾配の分画14〜27からのPRV（I11）抗体の
120μｌから成るアリコートを60μｌのＢ型抗血清に添
加し、そしてこの混合物を４℃で16〜20時間インキュベ
ーションした。アリコートを、また、60μｌのＣ型抗血
清に添加し、そしてこの混合物を４℃で16〜20時間イン
キュベーションした。次いで、270μｌのパンソービン
（Pansorbin）を添加して抗原−抗体複合体を吸収し、
そしてこの懸濁液を４化合物で45分間インキュベーショ
ンした。得られた混合物を、前述のように、遠心し、洗
浄し、そして緩衝液Ｄで抽出した。次いで、SDS-PAGE分
析を、前述のように、実施した。Ｂ型抗血清で沈殿した
抗原の場合において、SDS−ポリアクリルアミドゲルの
分析により、スクロース勾配の分画14〜19は116,000〜1
30,000、98,000、74,000、62,000および58,000ダルトン
の3Ｈ−スクロース標識帯を含有することが明らかにさ
れ、このことにより非共有結合および共有結合の糖蛋白
質複合体がこれらの分画中に存在すしたことが示され、
分画21〜27は分子量約92,000〜98,000ダルトンをもつ放
射性の単一の主要な帯を示した。低分子量のいくつかの
淡い帯も認められた。こうして、分画21〜27は非複合糖
蛋白質、gIIIから主としてなっていた。 スクロース分画中の抗原をＣ型抗血清で沈殿させると
き、むしろ異なる結果が得られた。分画14〜19は使用Ｈ
−マンノース標識蛋白質の帯を示し、これにより、期待
されるように、gIIa、gIIb、gIIc、gIVおよびgVの存在
が示された。しかしながら、分画20〜27は、gIIIを表わ
す、3Ｈ−マンノース標識92,000〜98,000ダルトンの分
子量の基をまったく示さなかった。これらの結果から明
らかなように、g92糖蛋白質はtk-PRV（dlg92/dltk）感
染細胞中に存在せず、そしてg92糖蛋白質は前にgIIIま
たはgBと表示された糖蛋白質に外使用する［ハンプル
（Hampl）、H.、ベン−ポラト（Ben-Plrat）、T.、エー
ルリハー（Ehrliher）、L.、ヘイバーメール（Habermeh
l）、K.O.およびカプラン（Kaplan）、A.S.、ウイルス
学雑誌（J. Virol.）52:583-590）1984）；ルカクス
（Lukacs）、N.、チール（Thiel）、H.J.、メッテンレ
イター（Mettenleiter）、T.C.およびリザ（Rhiza）、
H.J.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）53:166-173）198
5）参照］。 感染をその特定の実施態様を参照して詳述してきた
が、明らかなように、本発明の精神および範囲を逸脱し
ないで種々の変更および変化が可能である。
たは挿入の突然変異体を含有する偽狂犬病ウイルス突然
変異体、例えば、ウイルス遺伝子により暗号化される抗
原ポリペプチドが生産されないものに関する。その結
果、これでワクチン接種した動物は、このウイルスに対
する抗体を発現せず、そして偽狂犬病ウイルスの野外菌
株（field strain）および既知の偽狂犬病ウイルスのワ
クチンの菌株で感染した動物と区別することができる。
本発明は、また、それを含有する偽狂犬病のためのワク
チン、それを生産する方法およびそれを使用する方法に
関する。 Ｉ、偽狂犬病の病気 偽狂犬病、ブタおよび家畜類、例えば、牛、羊および
ヤギの高度に感染性の病気は、ヘルペスウイルス・スイ
ス（Herpesvirus suis）（以後、「偽狂犬病ウイルス」
または「PRV」）により引き起こされる。ブタにおい
て、この病気は呼吸器系の疾患および脳炎を引き起こ
し、これは死に至ることがある。ブタにおける感染の他
の共通の結果は、流産、新生児の死、同産群の大きさの
減少、および生産速度の低下である。他の家畜類、最も
顕著には畜牛において、PRVの感染はほとんど致死の脳
炎に進行することを避けることができない。 偽狂犬病は主要な脅威となってきており、そして世界
を通じてブタ産業に対する経済的損失の原因となった。
また、畜牛および他の飼育場の動物への偽狂犬病の広が
りついてかなりの不安を存在する。過去10年以内に、PR
Vのよりヴィルレントの菌株が出現しかつこの病気の広
く流布したため、経済的損失は増大した。今日、米国の
飼育場の8,000万頭の食用物の8.0％が、10年前の0.8％
に比較して、感染した。 PRV感染の臨床的症候および結果は殺したあるいは変
性した生PRV、すなわち、弱毒したPRVからなるワクチン
の使用により緩和しあるいは防止することできる。しか
しながら、PRVおぼび他のアルファヘルペスウイルス、
例えば、ヘルペス単純疱疹ウイルス１形および２形（以
後、それぞれ、「HSV−１」および「HSV−２」）、水痘
−帯状疱疹、感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス、マーモセ
ットのヘルペスウイルス、およびウマのヘルペスウイル
ス１形の独特の生物学的性質のために、大部分の現存す
るワクチンは偽狂犬病の病気の抑制に失敗してきてい
る。 さらに詳しくは、アルファヘルペスウイルスは神経組
織中に休止状態で入り込むという特別の能力を有する。
すなわち、動物が初期の一般化した感染から回復するに
つれて、アルファヘルペスウイルスは神経系の部分へ後
退し、ここでアルファヘルペスウイルスは非活動的とな
りかつ体の免疫系の防御系に対して不浸透性となる。こ
の休止の感染、すなわち、潜伏は予期されないほどに再
活性化し、病気の再発あるいは保菌状態として知られて
いる伝染状態を生ずることがあり、ここで感染した動物
はこの病気の外面的症候を示さいが、感染性アルファヘ
ルペスウイルスを伝達しあるいは「脱落（shed）」し、
こうして感染を広げかつ流行性爆発を起こす。 II、既知の変性した生きているウイルスPRVワクチン 従来、変性した生きているウイルスPRVワクチンは、
ニワトリおよび／またはサルの組織培養細胞の多数の継
代培養によって生産されてきている［スコダ（Skod
a）、R.、ブラウナー（Brauner）、I.、サデッキー（Sa
decky）、E.およびメイヤー（Mayer）、V.、アクタ・ビ
ロロジカ（Acta Virol）8:1−９（1964）およびバーサ
（Bartha）、A.、Magy. Allatorv. Lapja、16:42-45
（1961）参照］。組織の継代培養の間、ウイルスがその
新しい環境に適合するにつれて、突然変異体は蓄積す
る。これらの不確定の突然変異体は自然宿主中のウイル
スの再生産に悪影響を及ぼし、ウイルスの弱毒を生ず
る。 前述の変性した生きているPRVワクチンを使用すると
きの１つの問題は、動物がしばしば休止のワクチンウイ
ルスの保菌体となるということである。その結果、これ
らのワクチンの使用はそれらの安全性および有効性を妨
害する２つの望ましくない場合が生ずることがある。第
１に、ワクチンウイルスがワクチン接種した保菌体から
脱落するとき、流産、死産、および新生児の胎児感染が
同一ワクチンウイルスにより引き起こされることがあ
る。第２に、群内のワクチンウイルスの反復循環は弱毒
の過程の逆転を生じ、こうしてワクチンウイルスは病原
性親株に戻ることがある。このような環境下に、広がっ
たワクチン接種はこの病気の伝染を促進する。 前述の欠点に加えて、従来知られたPRVワクチンは、
疾患の症候を実質的に最小にするが、動物が病原性野外
菌株により休止の感染を獲得するのを防止しない。こう
して、ワクチン接種にかかわらず、動物はこの病気の保
菌体となり、そしてそれを感受性の動物に伝達すること
がある。この病気のこれらの保菌体は、飼育場と市場と
の間を動くとき、前述のように休止のワクチンウイルス
を脱落するばかりでなく、かつまたこの病気のウイルス
を脱落する。これは地理学的境界線および州の境界を横
切ってこの病気の望ましくない伝達を引き起こす。 前述の欠点を克服するために、チミジンキナーゼ遺伝
子における突然変異原誘発突然変異体または欠失の結
果、機能的チミジンキナーゼ（以後「TK」）酵素を生産
することができない温度抵抗偽狂犬病ウイルスが開発さ
れた（米国特許第4,514,497号、この米国特許の全部を
ここに引用によって加える）。 それにもかかわらず、PRVの休止の特徴は、感染した
群の隔離および感染した動物の屠殺によるこの病気の広
がりを防止することを意図する検疫手段を適用すること
によって、この病気を根絶することを困難とする。すな
わち、現存するワクチンでは、疾患の症候を示さない特
定の動物が休止PRVの保菌体であるかどうかを決定する
ことは、ほとんどの現在のワクチンの使用が感染をマス
クするので困難である。それゆえに、健康に見える動物
が実際に保菌体であり、こうしてPRVの拡散体でありう
るので、検疫手段を適用できるようにするために、感染
した動物および群を同定できることは、ワクチン接種し
た後でさえ、重要である。本発明の実施態様は、この要
求を満たすために開発された。 その上、政府の規制は市場または再販売のため州間の
動きを意図するブタをPRVの保菌体について試験し、そ
してその保菌体（すなわち、PRVについて血清陽性）で
ないことを示さなくてはならないことを要求している。
すべての現在の殺した偽狂犬病ウイルスワクチンおよび
変性した偽狂犬病ウイルスワクチンでは、生産者は彼の
群内のPRVの感染の環境によって感受性の動物にワクチ
ン接種することを強制され、家畜全体のワクチン接種が
PRVについて陽性の血清学的試験を与えるであろうか
ら、生産者は過酷な経済的不利益を受ける。さらに、保
護を増大するための再度のワクチン接種はPRV抗体の力
価をさらに増大するであろう。結局、この家畜を販売す
る農業経営者の能力はきびしく制限される。 安全に投与でき、家畜をPRVの野外菌株により引き起
こされる病気および休止の感染から保護し、そしてしか
も、PRVについての陽性の試験を生成しないワクチン
は、検疫に恐怖によって妨害されないで、ワクチン接種
のプログラムを遂行できるようにするであろう。次い
で、生産者は彼自身の飼育場内での損失を最少にするこ
とができると同時に、動物の健康の当局は、効果的にか
つもはや過度の抑制手段を必要としないで、存続するこ
とができる。本発明の実施態様は、また、これらの要求
を満たすために開発された。 III、PRV菌株のゲノム PRV菌株のゲノムは、大きさがほぼ146キロ塩基対（以
後「Kbp」）の線状、二本鎖の、非環状に並んだDNA分子
から成る。電子顕微鏡ならびに制限酵素によるPRVのヴ
ィルレント菌株のゲノムの分析は、それらのすべてが約
10Kbpの大きさの短い独特（以後「ＵS」）配列と表示す
るDNAの配列を含有することを示した。このＵ配列は逆
向き反復配列おぼび末端配列（以後それぞれ「IRS」お
よび「TRS」）によって限界を確定されており、それら
の各々は約15Kbpの大きさである（第１図参照）。他の
独特配列、すなわち、約111Kbpの大きさの、長い独特
（以後「ＵL」）配列はこの分子の残部からなる。 ヴィルレントPRV菌株のゲノムはクラスDDNA分子とし
て分類される。なぜなら、IRSおよびTRSの区域によって
限界を確定されているゲノムのＵS区域はＵL区域に関し
て２つの向きで発見されるからである。このようなビリ
オンから分離されるPRVのDNAは、こらの異性体を等モル
量で含有する。IRSおよびTRS区域を切断しない制限ヌク
レアーゼ（例えば、Bgl II;第１図参照）でDNAを消化す
ると、このゲノムの独特区域に完全に由来するモル断片
に加えて、２つの1/2モル断片、Bgl II−ＤびBgl II−
Ｅ、および、また、反復配列と独特配列とのまたがる２
つの1/2モル断片（すなわち、Bgl II−Ａ）が生成す
る。第１図において、１つのみBgl II−Ａが示されてい
るが、事実、同時に移動するほとんど同一大きさの２つ
の断片が存在する。 PRVのヴィルレントの実験室菌株の制限酵素の切断地
図は記載された［ベン−ポラト（Ben-Porat）、T.およ
びカプラン（Kaplan）、A.S.、ヘルペスウイルス類（Th
e Herpesviruses）、ロイズマン（Roizman）、B.編、
プレナム・プレス、ニューヨーク、Vol.3、105-173ペー
ジ（1985）参照］。 典型的なPRV（Kaplan）菌株についてKpnI、BamHI、お
よびBgl II断片の制限地図は第１図に示されている［ロ
ムニクジ（Lomniczi）、B.、ブラケンシップ（Blankens
hip）、M.L.およびペン−ポラト（Ben-Porat）、T.、ウ
イルス学雑誌（J. Virol.）49:970-979（1984）参
照］。PRVのヴィルレントのアウジェスズキー（Aujeszk
y）菌株（ATCC No.VR-135）についてのKpnIおよびBamHI
制限パターンは、PRV（Kaplan）菌株のそれに密接に類
似し、米国特許第4,514,497号の第３図、レーン（lan
e）３および８に示されている。米国、ヨーロッパおよ
び台湾の種々の区域から分離された90種より多い追加の
野外菌株の制限パターンは記載された［ギエルキンス
（Gielkins）、A.L.J.、ヴァン・オイルショット（van
Oirschot）,J.T.およびバース（Berns）、A.J.M.、一般
ウイルス学雑誌（J. Gen. Virol.）66:69-82（198
5）；キット（Kit）、S.、キット（Kit）、M.、ラウホ
ーン（Lawhorn）、B.およびマクコンネル（McConne
l）、ウイルスのワクチンへの高い技術の道筋（High-Te
chnology Route to Virus Vaccines）、ドレースマ
ン（Dreesman）、G.R.、ブロンソン（Bronson）、J.G.
およびケネディー（Knnedy）、R.C.（アメリカン・ソサ
イアティー・オブ・マイクロバイオロジー、ワシント
ン、D.C.）、82-99ページ（1985）；ロムニクジ（Lomni
czi）、B.、ブラケンシップ（Blankenship）、M.L.およ
びベン−ポラト（Ben-Porat）、T.、ウイルス学雑誌
（J. Virol.）49:970-979（1984）；パウル（Paul）、
P.S.、メンゲリング（Mengeling）、W.L.およびパート
ル（Pirtle）、E.C.、アーチーブス・オブ・バイロロジ
ー（Arch. Virol.）73:193-198（1982）；パートル（P
irtle）、E.C.、ワーゼン（Wathen）、M.W.、パウル（P
aul）、P.S.、メンゲリング（Mengeling）、W.L.および
サックス（Sacks）、J.M.アメリカン・ジャーナル・オ
ブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）4
5:1906-1912（1984）；およびプリチェット（Pritchet
t）、R.F.、ブシュ（Bush）、C.E.、チャング（Chan
g）、T.J.、ワング（Wang）、J.T.およびジー（Zee）、
Y.C.、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・
リサーチ（Am. J. Vet. Res.）45:2486-2489（198
4）参照］。制限パターンはPRVのアウジェスズキー（Au
jeszky）菌株（米国特許第4,514,497号の第３図、レー
ン３および８参照）について示されているものに一般に
類似するが、切断パターンの変動は立証可能であり、異
なる野外分離物を互いに区別する。変動の１つの形は、
制限エンドヌクレアーゼの切断位置の損失または獲得を
包含する。例えば、3.15Kbpおよび10.7KbpのKpnI切断は
３種類の台湾分離物中に見出されるが、米国およびヨー
ロッパの菌株中に見出されない。その代わり、後者の菌
株は13.8KbpのKpnI断片（KpnI−Ｃ）を有し、台湾の菌
株はKpnI−Ｃ切断中に追加のKPNL1撤回位置を有するこ
とを示す［プリチェット（Pritchett）、R.F.、ブシュ
（Bush）、C.E.、チャング（Chang）、T.J.、ワング（W
ang）、J.T.およびジー（Zee）、Y.C.、アメリカン・ジ
ャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. V
et. Res.）45:2486-2489（1984）参照］。 変動の第２型は、PRVゲノムのIRおよびTR区域におけ
る断片のマッピングについてより高い頻度で起こり、存
在する断片からの配列の追加または欠失を含む。この型
の異質性は、PRVの菌株のBamHI−５またはKpnI−Ｋ断片
はとくに顕著であり、そしてこれらの断片中の配列の繰
り返しから生ずる。 変動の第３の型は騒動断片の大きさの小さい変化を含
む。断片は損失せず、そして新しい断片は発生せず、こ
れらの事実はこれらの分子量のシフトを説明しうるの
で、これらの変動は、制限エンドヌクレアーゼの切断位
置の付加または損失によりはむしろ、先在する断片中の
小さい付加または欠失から生ずると信じられる。 研究した種々のPRV菌株は偽狂犬病の流行的に無関係
の爆発から分離され、そして高度のヴィルレントであ
る。これは制限ヌクレアーゼのパターンにおける前述の
変動がPRVの変動またはヴィルレンスに無関係であるこ
とを立証する。 組織培養における反復継代培養後に分離される、PRV
のいく種類からの弱毒ワクチンの制限ヌクレアーゼのパ
ターンも記載された。これらの例は、次の通りである：
ハンガリーにおいて分離された、バーサ（Bartha）A57
およびＫ菌株、ルーマニアにおいて分離された、SUCHお
よびブカレスト（Bucharest）（BUK）菌株［ズッファ
（Zuffa）、A.およびサラジ（Salij）、J.ベテリナルニ
・メディシナ（Veterinarni Medicina）17:201-210（1
972）］、ブカレスト（Bucharest）菌株の誘導体、例え
ば、ノルデン（Norden）、PRV（BUK−５）およびPRV（B
UK−７）菌株［パウル（Paul）、P.S.、メンゲリング
（Mengeling）、W.L.およびパートル（Pirtle）、E.
C.、アーチーブス・オブ・バイロロジー（Arch・Virol.
73:193-198（1982）；米国特許第4,514,487号；および
キット（Kit）、S.、キット（Kit）、M.およびパートル
（Pirtle）、E.C.、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベ
テリナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）46:1359
-1367（1985）］、およびNIA−４菌株、すなわち、アイ
ルランドにおいて分離されたヴィルレントNIA−３菌株
の誘導体［バスケルヴィレ（Baskerville）、A.、マク
フェラン（McFerran）、J.B.およびダウ（Dow）、C.、
ベテリナリー・ブレチン（Vet. Bull.）43:465-480（1
973）参照］。 PRV（BUK−５）菌株のKpnIおよびBamHIの制限パター
ンは、米国特許第4,514,497号の第３図、レーン２およ
び７に示されている。PRV（BUK−５）およびPRV（BUK−
７）菌株のKpnI、BamHIおよびBgl IIの制限断片の大き
さは下の表１に要約されている（米国特許第4,514,497
号参照）。 米国特許第4,514,497号の第３図は、PRVのヴィルレン
トのアウジェスズキー（Aujeszky）菌株および弱毒PRV
（BUK−５）菌株のDNA制限パターンが次の３つの方法で
異なることを立証している。第１に、弱毒PRV（BUK−
５）DNAはいくつかの制限断片（例えば、BamHI-10G、Ba
mHI−ＯおよびKpnI−Ｘ）を含有し、これらの断片は、P
RVのヴィルレントのアウジェスズキー（Aujeszky）菌株
のDNA中に存在しない。PRVのブカレスト（Bucharest）
ワクチン、例えば、ノルデン（Norden）、PRV（BUK−
５）の中のこれらの変更した断片は、ヴィルレントPRV
菌株のすべてにおけるＵL区域の末端に通常存在する配
列がブカレスト（Bucharest）菌株におけるＵLおよびIR
S区域の接合部に逆位の形態で、また、見出されるとい
う事実から生ずる。結局、ブカレスト（Bucharest）菌
株のＵLおよびＵS区域の両者は、互いに関して逆位にな
って４つのDNA異性体（すなわち、クラスＥ DNA）を生
成することができる［ロムニクジ（Lomniczi）、B.、ブ
ラケンシップ（Blankenship）、M.L.およびベン−ポラ
ト（Ben-Porat）、T.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）4
9:970-979（1984）参照］。 第２に、PRV（BUK−５）のBamHI-11断片は、ゲル電気
泳動の間によりゆっくり移動し、それゆえに、PRVのア
ウジェスズキー（Aujeszky）菌株のBamHI-11断片よりも
大きいが大きい。BamHI-11断片はPRVのtk遺伝子および
他の遺伝子を暗号化する。ヌクレオチドのシークエンシ
ング（sequencing）の研究により、PRV（BUK−５）BamH
I-11断片の大きさの増加は、PRVのtk遺伝子とPRVのtk遺
伝子から下流の次の遺伝子とを架橋する非解読配列中の
約200塩基対（以後「bp」）の反復から生ずることが立
証された。反復配列はポリアデニル化（AATAAA）信号を
含有する［キット（Kit）、S.、キット（Kit）、M.およ
びオーツカ（Otsuka）、H.、ヘルペスウイルス（Herpes
virus）、ラップ（Rapp）、F.編（アラン R. リス、
インコーポレーテッド、ニューヨーク）、311-327ペー
ジ（1984）参照］。この反復配列はPRVのアウジェスズ
キー（Aujeszky）菌株BamHI-11断片中には観察されな
い。 第３の差異はことに重要である。PRVの弱毒したブカ
レスト（Bucharest）、バルサ（Bartha）およびNIA−４
ワクチンの菌株はすべてKpnI−Ｉ断片中にほぼ4Kbpの欠
失を有する。これはBamHI−７からのBamHI-12断片全体
および隣接する配列の損失に相当する（第１図参照）。
この欠失は弱毒菌株の特性であり、そして米国、ヨーロ
ッパおよび台湾において分離された多くのヴィルレント
PRV菌株中に観察されなかった。KpnI−Ｉ断片中にこの
欠失は、少なくとも一部分、弱毒したバルサ（Barth
a）、ブカレスト（Bucharest）およびNIA−４のPRV菌株
のヴィルレンスの減少を説明する。こうして、野外菌株
のKpnI−１配列のすべてを弱毒ワクチン菌株に回復する
（restore）遺伝標識伝達実験はヴィルレンスを回復す
るが、ヴィルレントPRV菌株のこのKpnI−Ｉ断片中の欠
失の遺伝子操作は弱毒PRVを生産することがわかった
［ロムニクジ（Lomniczi）、B.、ワタナベ（Watanab
e）、S.、ベン−ポラト（Ben-Porat）、T.およびカプラ
ン（Kaplan）、A.A.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）5
2:198-205（1984）；ロムニクジ（Lomniczi）、B.、ブ
ラケンシップ（Blankenship）、M.L.およびベン−ポラ
ト（Ben-Porat）、T.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）4
9:970-979（1984）；バーンス（Berns）、A.、バン・デ
ン・オウウェランド（van den Oweland）、A.、クイン
ト（Quint）、W.、バン・オイルショット（van Oirscho
t）、J.およびギールケンス（Gielkens）、A.L.J.、ウ
イルス学雑誌（J. Virol.）53:89-93（1985）；ギール
ケンス（Gielkens）、A.L.J.、バン・オイルショット
（van Oirschot）、J.およびバーンス（Berns）、A.、
一般ウイルス学雑誌（J. Gen. Virol.）66:69-82（19
85）；およびプリチェット（Pritchett）、R.F.、ブシ
ュ（Bush）、C.E.、チャング（Chang）、T.J.、ワング
（Wang）、J.T.およびジー（Zee）、Y.C.、アメリカン
・ジャーナル・オブ・ペテリナリー・リサーチ（Am.
J. Vet. Res.）45:2486-2489（1984）参照］。弱毒ワ
クチン菌株から欠失されたが、ヴィルレントPRV野外菌
株中に存在する配列は、gIまたはgAと表示する、より小
さいPRV糖蛋白質を暗号化する［メッテンレイター（Met
tenleiter）、T.C.、ルーカクス（Lukacs）、N.および
ルジハ（Rziha）、H.J.、ウイルス学雑誌（J. Viro
l.）53:52-57（1985）；およびメッテンレイター（Mett
enleiter）、T.C.、ルーカクス（Lukacs）、N.およびル
ジハ（Rziha）、H.J.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）5
6:307-311（1985）参照］。前述の観察により示される
ように、PRVのKpnI−Ｉ（BamHI-12＋７）配列により暗
号化される遺伝子の生産物はPRVのヴィルレンスの遺伝
標識である。 最近、PRVのバーサ（Bartha）Ｋ菌株は、見掛けの分
子量が約92,000〜98,000ダルトンである糖蛋白質を暗号
化するPRV遺伝子（以後g92）中に「漏出」突然変異体を
含有することが発見された［パウル（Paul）、P.S.、メ
ルゲリング（Mengeling）、W.L.およびパートル（Pirtl
e）、E.C.、アーチーブス・オブ・バイロロジー（Arch.
Virol.）74:193-198（1982）参照］。すなわち、g92
糖蛋白質はその正常レベルの約10％で生産される。この
「漏出」突然変異体は、部分的に、PRVのバーサ（Brth
a）Ｋ菌株のヴィルレンスを説明することができる。PRV
g92遺伝子中のこの「漏出」突然変異体はバーサ（Barth
a）A57菌株中に見出されない［ベン−ポラト（Ben-Pora
t）、T.、デマルチ（DeMarchi）、J.、ベンドリイス（P
endrys）、J.、ベーチ（Veach）、R.A.およびカプラン
（Kaplan）、A.S.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）57:1
91-196（1986）参照］。 しかしながら、従来の弱毒ワクチン菌株のすべて、す
なわち、ブカレスト（Bucharest）およびその誘導体、
バーサ（Bartha）およびその誘導体、およびNIA−４は
それらのtk遺伝子が変更されていない。すなわち、それ
らのすべては感染に機能的な、ウイルス特異的TK酵素を
生産することを強調すべきである。 前述のPRV菌株のそれ以上の弱毒は、自発的または突
然変異原誘発tk−ウイルスの分離によって、あるいはPR
Vのtk−欠失突然変異体の分離によって達成されてきた
［米国特許第4,514,497号；キット（Kit）、S.、キット
（Kit）、M.およびパートル（Pirtle）、E.C.、アメリ
カン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（A
m. J. Vet. Res.）46:1359-1367（1985）；およびロ
ムニクジ（Lomniczi）、B.、ワタナベ（Watanabe）、
S.、ベン−ポラト（Ben-Porat）、T.およびカプラン（K
aplan）、A.A.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）52:198-
205（1984）参照］。こうして、PRVのヴィルレンスはマ
ルチジェニック（multigenic）である。すなわち、PRV
のヴィルレンスは１より多い活性遺伝子の結果である。 tk遺伝子中に欠失をもつPRV突然変異体、すなわち、P
RV（BUK−３）（ATCC No.VR-2074）の制限パターンは、
米国特許第4,514,497号の第３図、レーン１および６中
に示されている。その中の第３図から理解できるよう
に、tk-欠失突然変異体、すなわち、PRV（BUK−３）のB
amHIおよびKpnI制限パターンはtk+親株のそれと同一で
あるが、ただしdl 11と表示するBamHI-11断片および、P
RV tk遺伝子を暗号化するKpnI-JL断片（第２図、プラス
ミドpBK-JL参照）がより速く移動し、それゆえ親PRV（B
UK−５）菌株中におけるよりPRV（BUK−３）菌株の欠失
突然変異体中において約150塩基対だけ小さいことを除
外する（米国特許第4,514,497号の第３図、レーン２お
よび７をレーン１および６と比較せよ）。 IV、偽狂犬病ウイルスの外膜蛋白質 偽狂犬病のウイルス粒子は、直径がほぼ180nmであり
そして、他のヘルペスウイルスと同様に、リポ蛋白質外
膜により取囲まれた162カプソマーから構成された20面
体のカプシド（直径100nm）からなる。非イオン性洗
剤、例えば、トリトンＸ−100でウイルス外膜を除去す
ると、DNAのすべてとウイルス蛋白質の約半分を含有す
る、ウイルスのヌクレオカプシドからの外膜を分離する
ことができる。ヌクレオカプシドは３つの主要蛋白質、
大きさ約142,000、35,000および32,000ダルトン、大き
さ約62,000ダルトンの他の蛋白質、および大きさ約10,0
0〜115,000ダルトンの約12種類の他の小比率の蛋白質か
らなる。外膜はウイルス蛋白質の残部を含有し、これら
の蛋白質は少なくとも７種類の糖蛋白質および非グリコ
シル化蛋白質を含む。他のアルファヘルペスウイルス、
例えば、HSV−１では、外膜蛋白質およびそれらの前駆
体は細胞性および体液性免疫応答を誘発するときある役
割をもち、そしてウイルス−細胞の融合を促進する。 PRV外膜蛋白質の沈降分析およびクロマトグラフィー
の研究により、それらのいくつかは互いに複合化し、あ
るものはジサルファイド架橋を経て共有結合することが
明らかにされた。モノクローナル抗体を使用する免疫沈
澱による外膜蛋白質をさらに分析すると、ジサルファイ
ド架橋により共有結合したウイルス糖蛋白質はgIIa（分
子量約120,000〜125,000ダルトン）、gIIb（分子量約6
8,00〜74,000ダルトン）、gIIc（分子量約52,000〜58,0
00ダルトン）であることが示された［ハンプルHamp
l）、H.、ベン−ポラト（Ben-Plrat）、T.、エールリハ
ー（Ehrliher）、L.、ヘイバーメール（Habermehl）、
K.O.およびカプラー（Kaplan）、A.S.、ウイルス学雑誌
（J. Virol.）52:583-590（1984）；およびルカクス
（Lukacs）、N.、チール（Thiel）、H.J.、メッテンレ
イター（Mettenleiter）、T.C.およびリザ（Rhiza）、
H.J.,ウイルス学雑誌（J. Virol.）53:166-173（198
5）参照］。すべての糖蛋白質は、それらの抗原決定因
子の同一性および部分的ポリペプチドのマッピングによ
り示されるように、広範な配列相同性を共有する。こう
して、それらは多分単一の前駆体蛋白質、すなわち、gI
Iaから由来する。 ３つの小比率の蛋白質、すなわち、gI（分子量約115,
000〜120,000ダルトン）、gV（分子量約98,000ダルト
ン）およびgVI（分子量約62,000ダルトン）は、p115、
すなわち、非グルコシル化蛋白質（分子量約115,000ダ
ルトン）と非共有結合して複合体を形成する。他の主要
糖蛋白質、すなわち、gIII（見掛けの分子量92,000〜9
8,000）はいかなる他の蛋白質とも複合化しない。 前述のすべての糖蛋白質はモノクローナル抗体と反応
し、このことによりそれらはPRV粒子の表面上にさらさ
れることを示す。さらに、gIIIに対するモノクローナル
抗体はウイルスの吸着を阻害し、そして補体の不存在下
にウイルスの感染性を中和する。 クローン化HSV−1 DNAプローブを使用する分子交雑実
験が実施されて、主要なHSV−１糖蛋白質遺伝子、すな
わち、HSV−1 gB、HSV−1 gCおよびHSV−1 gDがPRV頭蛋
白質遺伝子のいずれかとヌクレオチド配列の相同性を共
有するかどうかが研究された。これらの研究により、HS
V−1 gB解読配列を表わすHSV−1 DNA断片はgII複合体を
暗号化するPRV DNAと特異的に交雑するが、HSV− gCお
よびHSV−1 gDを表わすHSV−1 DNA断片はPRV DNAと特異
的に交雑しないことが示された［ロビンス（Robbin
s）、A.K.、ゴールド（Gold）、C.、エンクイスト（Enq
uist）、L.W.、ウィーリー（Whealy）、M.E.およびワト
ソン（Watson）、R.J.、ザ・テント・インターナショナ
ル・ヘルペスウイルス・ワークショップ（the Tenth In
ternational Herpesvirus Workshop）、ミシガン州アン
・アーバー、1985年８月11-26日、において提出された
アブストラクツ、130ページ参照］。モノクローナル抗
体を使用する遺伝子分析および研究により、また、PRV
遺伝子は、gII糖蛋白質複合体地図を、BamHI−１断片に
おいてPRVゲノムのＵの左端において、約0.110〜0.128
地図単位において暗号化することが示された［第１図お
よびウエイゼン（Wathen）、M.、ホランド（Hollan
d）、L.、グロリオソ（Glorioso）、J.およびレビン（L
ebine）、M.、ザ・テンス・インターナショナル・ヘル
ペスウイルス・ワークショップ（the Tenth Internatio
nal Herpesvirus Workshop）、ミシガン州アン・アーバ
ー、1985年８月11-26日、において提出されたアブスト
ラクツ、140ページ参照］。この位置はPRV特異的DNAポ
リメラーゼおよびDNA結合蛋白質を暗号化するPRV遺伝子
のそれに近接する。HSV−1 gB決定は、また、PRV特異的
DNAポリメラーゼおよびDNA結合蛋白質の遺伝子に対して
次に位置する。これは、さらに、PRV-1gII遺伝子とPRV-
1gB遺伝子との間の相同関係を立証する。 PRV-1gB遺伝子は、ウイルスの複製および浸透におい
て必須の役割を有することが知られている、唯一のHSV
−１糖蛋白質遺伝子である。すなわち、温度感受性突然
変異体はPRV-1gB遺伝子中に変更をもって存在する［ス
ピアー、P.G.ヘルペスウイルス類（The Herpesviruse
s）、ロイズマン（Roizman）、B.編（プレナム・プレ
ス、ニューヨーク）、Vo.3、315-356（1985）；ホラン
ド（Holland）、T.C.、ホマ（Homa）、F.L.、マーリン
（Marlin）、S.D.、レビン（Levine）、M.およびグロリ
オソ（Glorioso）、J.ウイルス学雑誌（J. Virol.）5
2:566-574（1984）；およびマーリン（Marlin）、S.
D.、ホランド（Holland）、T.C.、レビン（Levine）、
M.およびグロリオン（Glorioso）、J.C.、ウイルス学雑
誌（J. Virol.）53:128-136（1985）参照］。この発見
はPRVgII遺伝子もPRV複製のための必須でありうること
を示唆している。 PRVg1を暗号化する遺伝子は、BamHI−７およびBamHI-
12断片中のPRVゲノムのＵS区域においてマッピングした
（第１図参照）。この区域から転写されたPRVメッセー
ジャーRNAについての細胞不含翻訳の研究により、分子
量約78,000および83,000ダルトンの２つのポリペプチド
は、BamHI-12およびBamHI−７断片から転写および翻訳
されることが示された。これらの２つのポリペプチドは
PRVのgIに対して特異的のモノクローナル抗体によって
沈殿され、これにより分子量約78,000および83,000ダル
トンのポリペプチドは非グリコシル化gI前駆体であるこ
とが示される［メッテンレイター（Mettenleiter）、T.
C.、ルーカクス（Lukacs）、N.およびルジハ（Rzih
a）、H.J.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）、53:52-57
（1985）参照］。上に示したように、成熟グリコシル化
gIの見掛けの分子量は約115,000〜120,000ダルタトンで
ある。 前述のように、PRV gIの発現はPRVの感染性に対して
絶対（obligatory）ではないが、gIの発現はPRVのヴィ
ルレンスにとって重要であることが示された［メッテン
レイター（Mettenleiter）、T.C.、ルーカクス（Lukac
s）、N.およびルジハ（Rziha）、H.J.、ウイルス学雑誌
（J. Virol.）56:307-311（1985）；バーンス（Bern
s）、A.、バン・デン・オウウェランド（van den Owela
nd）、A.、クイント（Quint）、W.、バン・オイルショ
ット（van Oirschot）、J.およびギールケンス（Gielke
ns）、A.L.J.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）、53:89-
93（1985）；ロムニクジ（Lomniczi）、B.、ブラケンシ
ップ（Blankenship）、M.L.およびベン−ポラト（Ben-P
orat）、T.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）49:970-979
（1984）参照］。すなわち、PRVの３種類のワクチン、
すなわち、ブカレスト（Bucharest）、バーサ（Barth
a）およびNIA−４は、BamHI-12断片を欠き、BamHI−７
断片中に欠失を示し、そしてgI合成することができな
い。tk-欠失突然変異体PRV（BUK−３）は、また、BamHI
-12断片を欠き、そしてBamHI−７断片中に欠失を有す
る。これは期待されることである。なぜなら、これはブ
カレスト（Bucharest）菌株PRV（BUK−５）およびPRV
（BUK−７）から誘導されたからである［米国特許第4,5
14,497号およびキット（Kit）、S.、キット（Kit）、M.
およびパートル（Pirtle）、E.C.、アメリカン・ジャー
ナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Vet.
Res.）46:1359-1367（1985）参照］。さらに、ヴィル
レントPRV菌株の弱毒は、PRV DNAのBamHI−７およびBam
HI-12断片中にDNA配列の欠失をつくることによって操作
された［欧州特許公告第0141458号参照］。他方におい
て、PRVのヴィルレントの実験室菌株および野外菌株の
大部分は完全なBamHI-7＋BamHI-12のDAN配列を含有し、
それゆえPRV gIを発現する［ギエルキンス（Gielkin
s）、A.L.J.、ヴァン・オイルショット（van Oirscho
t）,J.T.およびバース（Berns）、A.J.M.、一般ウイル
ス学雑誌（J. Gen. Virol.）66:69-82（1985）；パー
トル（Pirtle）、E.C.、ワーゼン（Wathen）、M.W.、パ
ウル（Paul）、P.S.、メルゲリング（Mengeling）、W.
L.およびサックス（Sacks）、J.M.、アメリカン・ジャ
ーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Ve
t. Res.）45:1906-1912（1984）；およびプリチェット
（Pritchett）、R.F.、ブシュ（Bush）、C.E.、チャン
グ（Chang）、T,J.、ワング（Wang）、J.T.およびジー
（Zee）、Y.C.、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテ
リナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）45:2485-2
489（1984）参照］。 PRVで感染した細胞は大量の分子量89,000の硫酸化糖
蛋白質を細胞外流体中に分泌する。硫酸化糖蛋白質は非
構造PRV蛋白質である、すなわち、それはPRV粒子の一成
分ではない。その機能は未知である。この硫酸化糖蛋白
質と同一の分子量をもつ主要な細胞内ポリペプチドは、
これまで検出されてきていない。この硫酸化PRV糖蛋白
質はgXと表示され、そしてBamHI-10およびBamHI−７断
片の一部分を含有する2KbpのDAN断片中に、PRVゲノムの
ＵS区域をマッピングする［ペニングトン（Penningto
n）、T.H.およびマククレー（McCrea）、M.A.、一般ウ
イルス学雑誌（J. Gen. Virol.）34:155-165（197
7）；ケル（Kerr）、C.L.およびペニングトン（Penning
ton）、T.H.、一般ウイルス学雑誌（J. Gen. Viro
l.）65:1033-1041（1984）；およびレア（Rea）、T,
J.、チンミンス（Timmins）、J.G.、ロング（Long）、
G.W.およびポスト（Post）、L.E、ウイルス学雑誌（J.
Virol.）54:21-29（1985）参照］。こうして、PRV gX
遺伝子はBamHI-7＋BamHI-10断片中のPRVゲノムのＵS区
域中に暗号化され、そしてPRVゲノムのＵS区域中に同様
に暗号化されるPRV gI遺伝子は、BamHI-7＋BamHI-12断
片中のPRV gX遺伝子の右に暗号化される（第１図参
照）。 gXについて暗号化するPRVゲノムの区域はシークエン
シング（sequencing）され、そして498アミノ酸の遺伝
情報を指定する開いたリーディングフレームを含むこと
が発見され、真核動物のプロモーターおよびポリアデニ
ル化信号に共通の特徴を含有する配列によってフランキ
ングされている。コーデッド（coded）アミノ酸配列の
予測される分子量は53,000ダルトンであり、これはgXメ
ッセンジャーRNAの生体外翻訳後に見られる70,000の分
子量の前駆体の見掛けの質量よりかなり小さい。これは
この配列中のプロリン残基の百分率が高い（8.8％）た
めであると信じられる［レア（Rea）、T.J.、チンミン
ス（Timmins）、J.G.、ロング（Long）、G.W.およびポ
スト（Post）、L.E.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）5
4:21-29（1985）参照］。 gp50と表示する、さらに他のPRV糖蛋白質の遺伝子
は、0.813-0.832地図単位でマッピングされ、これはgX
と同一のBamHI−７ヌクレオチド配列内に少なくとも部
分的に入る（第１図参照）。しかしながら、gXと異な
り、gp50はPRV粒子の表面上に存在する。gp50はPRV特異
型、mar197−１、の分離によって同定され、この変異型
は野外型PRVgp50に対して特異的の中和性モノクローナ
ル抗体（MCA50−１）に対して抵抗性である。mar197−
１変異型は補体の存在下または不存在下にMCA50−１抗
体に対して完全に抵抗性であるが、多価免疫血清によっ
て中和される。mar197−１変異型は状態でgp50を合成し
かつプロセシングするが、突然変異はMCA50−１抗体に
よるgp50の結合および免疫沈殿を防止する。これにより
立証されるように、突然変異はモノクローナル抗体のエ
ピトープに影響を及ぼすgp50遺伝子の構造部分的に存在
する。PRVゲノムの同一の小さい区域内のgXおよびgp50
のための遺伝子の位置は、２つの糖蛋白質遺伝子地図が
互いに非常に密接すること、あるいは前記糖蛋白質が多
少関係があるという可能性を発生させる［ワーゼン（Wa
then）、M.W.およびワーゼン（Wathen）、L.M.K.、ウイ
ルス学雑誌（J. Virol.）51:57-62（1984）参照］。 82,000ダルトンの見掛けの分子量をもつPRV糖蛋白質
（以後「gp82」）は、PRVゲノムのＵ区域中にPRVゲノム
上に0.290-0.309地図単位でマッピングされた。これはB
glII−Ｂ断片内においてBamH−２およびBamH−１断片の
接合部に近接して存在する［第１図およびウエイゼン
（Wathen）、M.、ホランド（Holland）、L.、グロリオ
ソ（Glorioso）、J.およびレビン（Lebine）、M.、ザ・
テンス・インターナショナル・ヘルペスウイルス・ワー
クショップ（the Tenth International Herpesvirus Wo
rkshop）、ミシガン州アン・アーバー、1985年８月11-2
6日、において提出されたアブストラクツ、140ページ参
照］。gp82は細胞培養において複製に必須ではなく、そ
してgp82に不存在に変更したプラークの形態［シンシシ
ャル・フォーメイション（sysncytial formation）］に
関連する。gp82に対してレイズ（raise）されたモノク
ローナル抵抗を使用して、gp82はpg92に多分壮途するこ
とが決定された［ワーゼン（Wathen）、L.M.K.、プラッ
ト（Platt）、V.B.、ワーゼン（Wathen）、M.W.、バン
・デウセン（van Deusen）、R.A.、ウェットストーン
（Whetstone）、C.A.およびパートル（Pirtle）、E.
C.、ウイルスの研究（Virus Research）4:19-29（198
5）およびその中の研究参照］。 最後に、見掛けの分子量が約92,000〜98,000である糖
蛋白質を暗号化するPRV遺伝子、すなわち、g92は、PRV
ゲノム上に0.38〜0.42地図単位でマッピングされた。こ
れはBglII−Ｂ断片内においてBamH−２およびBamH−９
断片の接合部に近接して存在する［第１図およびロビン
ス（Robbins）、A.K.、ワイス（Weis）、J.H.、エンク
イスト（Enquist）、L.W.およびワトソン（Watoson）、
R.J.、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプ
ライド・ジェネチックス（J. Mol. Appl. Genet.）
2:485-496（1984）参照］。この地図位置はワーゼン（W
athen）らによりgp82に指定された地図位置からBamHI−
１の反対側に位置する［ワーゼン（Wathen）、L.M.K.、
プラット（Platt）、V.B.、ワーゼン（Wathen）、M.
W.、バン・デウセン（van Deusen）、R.A.、ウェットス
トーン（Whetstone）、C.A.およびパートル（Pirtl
e）、E.C.、ウイルスの研究（Virus Research）4:19-2
9（1985）参照］。 PRV g92遺伝子についてのヌクレオチドのシークエン
シング（sequencing）のの研究は記載された［ロビンス
（Robbins）、A.K.、ザ・ナインス・インターナショナ
ル・ヘルペスウイルス・ワークショップ（the Ninth In
ternational Herpesvirus Workshop）、ワシントン州シ
アトル、1984年８月24-29日、における提示参照］。こ
れらの研究は、BamHI−２およびBamHI−９断片の接合部
にまたがるDNA断片が479アミノ酸を暗号化するオープン
リーディングフレームを含有することを明らかにした。
推定の翻訳開始暗号は、プラスミドpBUK:Stu12/PstI上
の5.2地図単位におけるNcoI制限位置に存在する（第４
図参照）。TGA停止信号から下流の31ヌクレオチドは、
コンセンサス「AATAAA」ポリアデニル化信号である。 g92配列から予測される非グリコシル化蛋白質の分子
量は51,000ダルトンである。この分子量51,000のポリペ
プチドは、８つの潜在的なグリコシル化位置、すなわ
ち、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン
−Ｘ−セリン配列を含有する。g92は分子量51,000の前
駆体の成熟した、プロセシングされ、かつ完全にグリコ
シル化された形態であると信じられる。見掛けの分子量
が約74,000〜79,000ダルトンである。PRV g92の部分的
にグリコシル化された前駆体（以後「g74」）は、ま
た、糖蛋白質のプロセシングを阻害する薬物モネシンの
使用によって観測された［ルカックス（Lucacs）、N.、
チエール（Thiel）、H.J.、メッテンレイター（Mettnle
iter）、T.C.およびルジハ（Rziha）、H.J.、ウイルス
の研究（Virus Research）53:166-173（1985）参
照］。 g92およびg74の両者の使用する、免疫沈殿およびウエ
スタン・ブロッティングの分析において、特異的に反応
する抗血清は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲルの電気泳動アッセイ（SDS-PAGE）後に切出さ
れた、変性g74ポリペプチドでウサギを免疫化すること
によって得られた［ロビンス（Robbins）、A.K.、ワイ
ス（Weis）、J.H.、エンクイスト（Enquist）、L.W.お
よびワトソン（Watoson）、R.J.、ジャーナル・オブ・
モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネチックス
（J. Mol. Appl. Genet.）2:486-496（1984）参
照］。これと対照的に、SDS-PAGEから分離されたPRV蛋
白質の変性されたg110-g92群に対してウサギ中でレイズ
された抗血清は、免疫沈殿およびウエスタン・ブロッテ
ィング分析において、見掛けの分子量が110,000、92,00
0および55,000ダルトンである蛋白質と主として反応す
る。これらの実験、およびここに後述するスクロース匂
配遠心実験は、g92おびその前駆体、g74、がBamHI−2/B
amHI−９接合部にマッピングされ、そして糖蛋白質gIII
に相当することを示唆する［ハンプル（Hampl）、H.、
ベン−ポラト（Ben−Plrat）、T.、エールリハー（Ehrl
iher）、L.、ヘイバーメール（Habermehl）、K.O.およ
びカプラン（Kaplan）、A.S.、ウイルス学雑誌（J. Vi
rol.）52:583-590（1984）およびルカクス（Lukacs）、
N.、チール（Thiel）、H.J.、メッテンレイター（Mette
nleiter）、T.C.およびリザ（Rhiza）、H.J.、ウイルス
学雑誌（J. Virol.）53:166-173（1985）参照］。 糖蛋白質gIIIの生産は、ヴィルレントPRV菌株、例え
ば、ライス（Rice）菌株、Ind−Ｆ菌株、アイオワ（Iow
a）62-26菌株、カプラン（Kaplan）菌株、ベッカー（Be
cker）菌株およびフィラキシア（Phylaxia）菌株で感染
された細胞、および弱毒PRV菌株、例えば、バーサ（Bar
tha）A57菌株、ブカレスト（Bucharest）（Norden）菌
株およびNIA−４菌株で感染させた細胞において立証さ
れた［レア（Rea）、T.J.、チンミンス（Timmins）、J.
G.、ロング（Long）、G.W.およびポスト（Post）、L.
E.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）54:21-29（1985）；
ワーゼン（Wathen）、M.W.、およびワーゼン（Wathe
n）、L.M.K.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）51:57-62
（1984）；ワーゼン（Wathen）、L.M.K.、プラット（Pl
att）、V.B.、ワーゼン（Wathen）、M.W.、バン・デウ
セン（van Deusen）、R.A.、ウェットストーン（Whetst
one）、C.A.およびパートル（Pirtle）、E.C.、ウイル
スの研究（Virus Research）、4:19-29（1985）；ルカ
クス（Lukacs）、N.、チール（Thiel）、H.J.、メッテ
ンレイター（Mettenleiter）、T.C.およびリザ（Rhiz
a）、H.J.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）53:166-173
（1985）；ロビンス（Robbins）、A.K.、ワイス（Wie
s）、J.H.、エンクイスト（Enquist）、L.W.およびワト
ソン（Watoson）、R.J.、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・アンド・アプライド・ジェネチックス（J. Mol.
Appl. Genet.）2:485-496（1984）；ハンプル（Hamp
l）、H.、ベン−ポラト（Ben-Plrat）、T.、エールリハ
ー（Ehrliher）、L.、ヘイバーメール（Habermehl）、
K.O.およびカプラン（Kaplan）、A.S.、ウイルス学雑誌
（J. Virol.）56:307-311（1985）参照］。 前述のように、バーサ（Bartha）Ｋ菌株は糖蛋白質g9
2の生産能力が低い。すなわち、バーサ（Bartha）Ｋ菌
株はわずかに約10％の正常レベルのg92糖蛋白質を生産
する［ベン−ポラト（Ben-Porat）、T.、デマルチ（De
Marchi）、J.、ペンドリイス（Pendrys）、J.、ベーチ
（Veach）、R.A.およびカプラン（Kaplan）、A.S.、ウ
イルス学雑誌（J. Virol.）57:191-196（1986）参
照］。それにもかかわらず、この量のg092はそれでワク
チン接種した動物において糖蛋白質g92に対する抗体を
誘発させるためには十分であろう。結局、バーサ（Bart
ha）Ｋ菌株でワクチン接種した動物から得られた抗血清
は、他のPRV菌株でワクチン接種したブタからの抗血清
と同一に抗原をなお認識するであろう。それゆえ、バー
サ（Bartha）Ｋ菌株でワクチン接種した動物を、他のPR
V菌株またはPRV野外菌株で感染した動物と区別すること
は不可能である。さらに、バーサ（Bartha）Ｋ菌株が正
常レベルのg92を生産するものへ復帰することは、排除
されない。 本発明においては、それでワクチン接種した動物が、
g92遺伝子中の欠失および／または挿入突然変異のた
め、g92遺伝子で暗号化された、いかなる抗原ポリペプ
チドをも生産せずかつg92抗原の生産に復帰できない。
偽狂犬病ウイルスを、初めて提供することが可能となっ
た。結局、このワクチンを接種した動物は他のPRVワク
チンまたはPRV野外菌株で感染した動物と区別すること
でき、こうして検疫手段により偽狂犬病の病気のエラデ
ィケイション（erradication）を可能である。さらに、
本発明において、前述のように、他のPRVワクチンおよ
び野外菌株の両者と区別することができ、かつ偽狂犬病
の病気の広がりの抑制において有効であるばかりでな
く、かつまた、それを接種した動物が、PRVのtk遺伝子
中の突然変異のため、ワクチンのウイルスの保菌体とな
らず、かつ病原体の野外菌株による休止感染を獲得しな
い、PRVワクチンを、初めて、提供することが可能とな
った。 本発明の目的は、偽狂犬病の病気の広がりを抑制する
のに有効な偽狂犬病ワクチンを提供することである。 本発明の他の目的は、動物をそれでワクチン接種した
ときワクチンのウイルスまたは野外菌株の保菌体になら
ない、偽狂犬病ワクチンを提供することである。 本発明のさらに他の目的は、野外菌株のワクチンおよ
び他のPRVワクチンのウイルスと区別することのできる
偽狂犬病ワクチンを提供することである。 本発明のほかの目的は、それでワクチン接種した動物
は野外菌株ウイルスで感染した動物または他のPRVワク
チンウイルスでワクチン接種した動物と区別することの
できる、偽狂犬病ワクチンを提供することである。 本発明のなお他の目的は、g92遺伝子中の欠失および
／または挿入の両者の結果、抗原g92ポリペプチドを生
産することができない偽狂犬病ウイルスを提供すること
である。 本発明のさらに他の目的は、tk遺伝子の解読配列中の
突然変異の結果機能的チミジンキナーゼ酵素の活性を生
成することができず、かつg92遺伝子中の欠失、挿入、
または欠失および挿入の両者の結果、抗原g92ポリペプ
チドを生産することができない偽狂犬病ウイルスを提供
することである。 本発明の他の目的は、それでワクチン接種した動物が
g92糖蛋白質に対する抗体を発生しない、偽狂犬病ウイ
ルスを提供することである。 本発明のなお他の目的は、tk+に復帰することができ
ず、tk+偽狂犬病ウイルスと容易に区別することがで
き、そしてg92+に復帰することができない偽狂犬病ウイ
ルスを提供することである。 本発明のなおほかの目的は、30℃〜40℃の温度におい
て効率的に複製することができる。すなわち、温度抵抗
性ウイルスを包含する、偽狂犬病ウイルスを提供するこ
とである。 本発明の追加の目的は、g92遺伝子中に欠失および／
または挿入の突然変異を含有する偽狂犬病ウイルスを生
産する方法を提供することである。 本発明の他の目的は、以下の本発明の説明から明らか
となるであろう。 本発明の１つの実施態様において、前述の目的は、g9
2遺伝子中の欠失および／または挿入の両者の結果、抗
原g92ポリペプチドを生産することができないPRV、およ
び（１）製薬学的に有効な量の前記ウイルスおよび
（２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤を含ん
でなる偽狂犬病のためのワクチンによって達成された。 本発明の他の実施態様において、PRVは、また、TK遺
伝子中の突然変異の結果機能的TKを生産することができ
ない。 本発明のほかの実施態様において、PRVは、また、gI
遺伝子中の突然変異の結果糖蛋白質gIを生産することが
できない。 本発明のなお他の実施態様において、PRVは温度抵抗
性ウイルスである。 本発明の追加の実施態様において、前述の目的は、工
程： （１） クローニングベクターと偽狂犬病ウイルスg92
遺伝子の実質的にすべておよびそのフランキング配列を
含有するDNA断片とを含んでなる雑種プラスミドを構成
し、 （２） 機能的選択可能な遺伝子を暗号化するDNA断片
を、工程（１）の得られた雑種プラスミドの偽狂犬病ウ
イルスg92遺伝子の中に挿入し、こうして機能的選択可
能な遺伝子を偽狂犬病ウイルスg92遺伝子のDNA配列によ
ってフランキングし、 （３） 選択可能な遺伝子の生産物を生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスからの感染性DNAをもつ工程
（２）の雑種プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞
の中に同時トラスフェクション（co-transfection）
し、そしてg92遺伝子中の挿入の結果抗原g92ポリペプチ
ドを生産することができない偽狂犬病ウイルス突然変異
体を生産するために、選択可能な遺伝子の生産物を生産
する偽狂犬病ウイルス組換え体について選択する、 を含んでなることを特徴とする、g92遺伝子中の挿入突
然変異の結果抗原g92ポリペプチドを生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスを生産する方法によって達成さ
れた。 本発明の追加の実施態様において、前述の目的は、工
程： （１） クローニングベクターと偽狂犬病ウイルスg92
遺伝子の実質的にすべておよびそのフランキング配列を
含有するDNA断片とを含んでなる雑種プラスミドを構成
し、 （２） 機能的選択可能な遺伝子を暗号化するDNA断片
を、工程（１）の得られた雑種プラスミドの偽狂犬病ウ
イルスg92遺伝子の中に挿入し、こうして機能的選択可
能な遺伝子を偽狂犬病ウイルスg92遺伝子のDNA配列によ
ってフランキングし、 （３） 選択可能な遺伝子の生産物を生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスからの感染性DNAをもつ工程
（２）の雑種プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞
の中に同時トラスフェクションし、そして選択可能な遺
伝子の生産物を生産することができない偽狂犬病ウイル
スについて選択し、 （４） g92遺伝子の実質的にすべてより少なくが存在
し、同時に欠失の各側に隣接して偽狂犬病ウイルスDNA
が保持されるように、工程（１）の雑種プラスミドから
DNA配列を欠失し、 （５） g92遺伝子中の欠失の結果抗原g92ポリペプチド
を生産することができない偽狂犬病ウイルス突然変異体
を生産するために、工程（３）の選択した偽狂犬病ウイ
ルスからの感染性DNAをもつ工程（４）の得られる雑種
プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞の中に同時ト
ラスフェクションし、そして選択可能な遺伝子の生産物
を生産しない偽狂犬病ウイルスについて選択する、 を含んでなることを特徴とする、g92遺伝子の欠失突然
変異の結果抗原g92ポリペプチドを生産することができ
ない偽狂犬病ウイルスを生産する方法によって達成され
た。 ほかの実施態様において、異質DAN配列を工程（４）
における欠失されたg92遺伝子配列の代わりに挿入し、
こうして抗原g92ポリペプチドが生産されないように
し、かつ欠失されたg92配列の各側に隣接してPRV DNA配
列が保持されるようにする。その懸架、工程（５）のPR
V突然変異体は欠失および挿入の突然変異の組合せの結
果抗原g92ポリペプチドを生産することができない。 なお他の実施態様において、工程（４）を工程
（４′）で置換する。この工程（４′）において、異質
DNA配列を工程（１）のプラスミド中に挿入し、こうし
て抗原g92ポリペプチドが生産されずかつ欠失されたg92
配列の各側に隣接してPRV DNA配列が保持されるように
する。その結果、工程（５）のPRV突然変異体は挿入の
突然変異の結果抗原g92ポリペプチドを生産することが
できない。 本発明の好ましい実施態様において、工程（３）の感
染性DNAは機能的チミジンキナーゼを生産することので
きないPRV突然変異体から誘導し、こうして工程（５）
の得られる突然変異体がtk-およびg92-の突然変異体で
あるようにする。 本発明のなおほかの実施態様において、工程（３）の
感染性DNAは温度抵抗性偽狂犬病から誘導し、こうして
工程（５）の得られる突然変異体が温度抵抗性およびg9
2-の突然変異体であるようにする。 本発明のなお他の実施態様において、g92遺伝子中の
欠失および／または挿入の結果、抗原g92ポリペプチド
を生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウイルス
突然変異体を選択しかつ生産するために、工程（５）の
得られる偽狂犬病ウイルスを温度感受性ウイルスに対し
て非許容性温度において増殖する。 前述のように、本発明の一つの実施態様において、前
述の目的は、g92遺伝子中の欠失および／または挿入の
両者の結果、抗原g92ポリペプチドを生産することがで
きないPRV、および（１）製薬学的に有効な量の前記ウ
イルスおよび（２）製薬学的に許容されうる担体または
希釈剤を含んでなる偽狂犬病のためのワクチンによって
達成された。 本発明の他の実施態様において、PRVは、また、tk遺
伝子中の突然変異の結果機能的TKを生産することができ
ない。 本発明ほかの実施態様において、PRVは、また、gI遺
伝子中の突然変異の結果糖蛋白質gIを生産することがで
きない。 本発明のなお他の実施態様において、PRVは温度抵抗
性ウイルスである。 本発明の追加の実施態様において、前述の目的は、工
程： （１） クローニングベクターと偽狂犬病ウイルスg92
遺伝子の実質的にすべておよびそのフランキング配列を
含有するDNA断片とを含んでなる雑種プラスミドを構成
し、 （２） 機能的選択可能な遺伝子を暗号化するDNA断片
を、工程（１）の得られた雑種プラスミドの偽狂犬病ウ
イルスg92遺伝子の中に挿入し、こうして機能的選択可
能な遺伝子を偽狂犬病ウイルスg92遺伝子のDNA配列によ
ってフランキングし、 （３） 選択可能な遺伝子の生産物を生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスからの感染性DNAをもつ工程
（２）の雑種プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞
の中に同時トラスフェクションし、そしてg92遺伝子中
の挿入の結果抗原g92ポリペプチドを生産することがで
きない偽狂犬病ウイルス突然変異体を生産するために、
選択可能な遺伝子の生産物を生産する偽狂犬病ウイルス
組換え体について選択する。 を含んでなることを特徴とする、g92遺伝子中の挿入突
然変異の結果抗原g92ポリペプチドを生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスを生産する方法によって達成さ
れた。 本発明の追加の実施態様において、前述の目的は、工
程： （１） クローニングベクターと偽狂犬病ウイルスg92
遺伝子の実質的にすべておよびそのフランキング配列を
含有するDNA断片とを含んでなる雑種プラスミドを構成
し、 （２） 機能的選択可能な遺伝子を暗号化するDNA断片
を、工程（１）の得られた雑種プラスミドの偽狂犬病ウ
イルスg92遺伝子の中に挿入し、こうして機能的選択可
能な遺伝子を偽狂犬病ウイルスg92遺伝子のDNA配列によ
ってフランキングし、 （３） 選択可能な遺伝子の生産物を生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスからの感染性DNAをもつ工程
（２）の雑種プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞
の中に同時トラスフェクションし、そして選択可能な遺
伝子の生産物を生産することができない偽狂犬病ウイル
スについて選択し、 （４） g92遺伝子の実質的にすべてより少なくが存在
し、同時に欠失の各側に隣接して偽狂犬病ウイルスDNA
が保持されるように、工程（１）の雑種プラスミドから
DNA配列を欠失し、 （５） g92遺伝子中の欠失の結果抗原g92ポリペプチド
を生産することができない偽狂犬病ウイルス突然変異体
を生産するために、工程（３）の選択した偽狂犬病ウイ
ルスからの感染性DNAをもつ工程（４）の得られた雑種
プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞の中に同時ト
ラスフェクションし、そして選択可能な遺伝子の生産物
を生産しない偽狂犬病ウイルスについて選択する、 を含んでなることを特徴とする、g92遺伝子の欠失突然
変異の結果抗原g92ポリペプチドを生産することができ
ない偽狂犬病ウイルスを生産する方法によって達成され
た。 ほかの実施態様において、異質DNA配列を工程（４）
における欠失されたg92遺伝子配列の代わりに挿入し、
こうして抗原g92ポリペプチドが生産されないように
し、かつ欠失されたg92配列の各側に隣接してPRV DNA配
列が保持されるようにする。その結果、工程（５）のPR
V突然変異体は欠失および挿入の突然変異の組合せの結
果抗原g92ポリペプチドを生産することができない。 なお他の実施態様において、工程（４）を工程
（４′）で置換する。この工程（４′）において、異質
DNA配列を工程（１）のプラスミド中に挿入し、こうし
て抗原g92ポリペプチドが生産されずかつ欠失されたg92
配列の各側に隣接してPRV DNA配列が保持されるように
する。その結果、工程（５）のPRV突然変異体は挿入の
突然変異の結果抗原g92ポリペプチドを生産することが
できない。 本発明の好ましい実施態様において、工程（３）の感
染生DNAは機能的チミジンキナーゼを生産することので
きないPRV突然変異体から誘導し、こうして工程（５）
の得られた突然変異体がtk-およびg92-の突然変異体で
あるようにする。 本発明のなおほかの実施態様において、工程（３）の
感染性DNAは温度抵抗性偽狂犬病から誘導し、こうして
工程（５）の得られる突然変異体が温度抵抗性およびg9
2-の突然変異体であるようにする。 本発明のなお他の実施態様において、g92遺伝子中の
欠失および／または挿入の結果、抗原g92ポリペプチド
を生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウイルス
突然変異体を選択しかつ生産するために、工程（５）の
得られる偽狂犬病ウイルスを温度感受性ウイルスに対し
て非許容性温度において増殖する。 g92ポリペプチドは大きさがほぼ1500bpである。欠失
および／または挿入の突然変異体は、例えば、（ｉ）g9
2遺伝子の適当な区域から75〜1500bpのDNA断片を排除す
る：（ii）解読配列の5'末端付近において５、７、８、
10および11bpまたは約50〜200bpのより小さい欠失を生
成し、こうして翻訳リーディングフレームを変更し、そ
してg92ポリペプチド合成を妨げる；（iii）50〜200bp
を欠失させてg92の主要なエピトープを暗号化するヌク
レオチド配列を排除する；（iv）約10〜200bpのPRV DNA
を欠失させると同時に異質DNA配列を挿入し、こうして
プロセシング、移送、あるいは適切にポリリボソーム上
に翻訳されない雑種RNAを生成する；あるいは（ｖ）異
質DNAを挿入し、こうしてプロセシング、移送、あるい
は適切ににポリリボソーム上に翻訳されない雑種RNAを
生成する、ことによって得ることができる。 本発明において、後に詳述する、欠失突然変異体PRV
（dlg92/dltk）は、g92遺伝子の解読配列の80％より多
くを含有する1171bpのRPV StuI断片を排除することによ
って生成された。この試料の大きさは、次のことを保証
した：（ｉ）ワクチン接種した動物中にg92抗体を誘発
することのできる、あるいはPRVの野外菌株で感染した
ブタ中に生産されるg29糖蛋白質に対する抗血清と反応
することのできる、抗原決定基、すなわち、エピトー
プ、をもつポリペプチドはつくられないであろう；およ
び（ii）復帰、すなわち、g92生産性ウイルスへの逆突
然変異は事実上不可能であった。本発明において、PRV
g92欠失突然変異は、復帰の頻度が低いので、好まし
い。 前述のように、他の実施態様において、欠失および／
または挿入の突然変異体は、欠失したPRV g92遺伝子DNA
の代わりに、あるいはPRV g92遺伝子DNA配列に加えて、
異質DNA配列を含有することができる。 ここで使用するとき、「異質DNA配列」は次の意味を
有する：（１）由来に無関係に非解読DNA配列、例え
ば、ウイルス、真核生物または原核生物の非解読配列お
よびオリゴヌクレオチドリンカーを含む；（２）PRV遺
伝子以外の遺伝子を暗号化するDNA配列、すなわち、解
読DNA配列、例えば、前述の選択可能な遺伝子；あるい
は（３）PRVゲノム上の正常位置からPRVゲノム上の他の
位置へ転移した解読PRV DNA配列、例えば、PRV（dlt
k）:PRVTK/STU12中に見出されるPRV g92遺伝子中に転移
したPRV tk遺伝子（第５図参照）。 オリゴヌクレチドリンカーは一般に長さが８〜10ヌク
レオチドでありが、これより長く、例えば、約50ヌクレ
オチドであるか、これより短く、例えば、４、５および
７ヌクレオチドであることができる。オリゴヌクレチド
の好ましい長さは約８〜10ヌクレオチドである。オリゴ
ヌクレチドリンカーのDNA配列は臨界的ではない。同様
に、本発明において使用する他の異質DNA配列の大きさ
および配列は臨界的ではない。一般に、オリゴヌクレチ
ドリンカー以外の異質DNA配列の大きさは約0.5〜5Kbpの
長さである。例えば、HSV−１、HSV−２およびマーモセ
ットのtk遺伝子は約1.3Kbpの長である；ニワトリおよび
ヒトのtk遺伝子は、それぞれ、約2.9および4.2Kbpの長
さである;neoR遺伝子は約1.0Kbpの長さである；そしてl
acZ遺伝子は約3.0Kbpの長さである。 異質DNAをプラスミドDNA中に挿入する方法は、使用す
る異質DNA配列のタイプに依存するであろう。オリゴヌ
クレチド配列中に１またはそれより大きい制限ヌクレア
ーゼ位置を含有するパリンドローム二本鎖リンカー［ニ
ュー・イングランド・バイオラボラトリーズ（New Engl
and Biolabs］を、よく知られた方法で挿入することが
できる［マニアチス（Maniatis）、T.、フリトシュ（Fr
itsch）、E.F.およびサムブルック（Sambrook）、J.、
分子クローニング（Molecular Cloning）、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（1982）参照］。
異質DNA配列は、また、末端トランスフェラーゼを使用
する相補ホモポリマーで末端をテイリング（tailing）
するとによってプラスミドDNA中に挿入することができ
る［マニアチス（Maniatis）、T.、フリトシュ（Fritsc
h）、E.F.およびサムブルック（Sambrook）、J.、分子
クローニング（Molecular Cloning）、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（1982）参照］。異質
DNA配列の長さを賢明に選択することにより、フレーム
シフトの突然変異体をg92遺伝子中に生成し、g92遺伝子
内の欠失の効果を増強することができる。 PRVのg92遺伝子の実質的にすべておよび工程（１）の
そのフランキング配列を含有するPRVのDNA断片を含んで
なる雑種プラスミドを構成するために、本発明において
使用する特定のクローニングベクターは、クローニング
ベクターが選択的特性、例えば、薬物抵抗の遺伝情報を
指定する遺伝子を含有するかぎり、臨界的ではない。こ
のようなクローニングベクターの例は、次のものを包含
する:pBR322およびpBR322に基づくベクター［セキグチ
（Sekiguchi）、T.、ニシモト（Nishimoto）、T.、カイ
（Kai）、R.およびセキグチ（Sekiguchi）、M.遺伝子
（Gene）21:267-272（1983）;pMB9、pBR325、pKH47［ベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Reseach
Laboratories）］、pBR328、pHC79［ベーリンガー・マ
ンハイム・バイオケミカルズ（Boehringer Manneheim B
iochmecals）］、ファージ・シャロン28［ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Reseach Laborator
ies）］、pKB11、pKSV-10［Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（B
iochmecals）］、pMAR420［オーツカ（Otsuka）、H.、
ヘイゼン（Hazen）、M.、キット（Kit）、M.、クアビ
（Quavi）、H.およびキット（Kit）、M.、ウイルス学
（Virol.）113:196-213（1981）およびオリゴ（dG）テ
イルド（tailed）pBR322［ニュー・イングランド・ニュ
ークリアー（New England Nuclear）］。pBR322は、31K
bpのPRVのBilIII−Ｂ断片がPRV g92遺伝子を含有しかつ
pBR322の単一の位置でクローニングすることができるの
で、本発明における好ましいクローニングベクターであ
る（第３図参照）。同様に、プラスミドpBUK:Stu12中に
6.0〜10.0地図単位で示される4KbpのPstI断片は、PRV g
92遺伝子を含有し、そしてpBR322の単一のPstI位置でク
ローニングすることができる。 本発明の雑種プラスミドを生長させるために使用する
特定の宿主は、本発明にとって臨界的ではない。このよ
うな宿主の例は次の通りである：大腸菌（以下E. col
i）K12 RR1［ボリバー（Bolivar）、F.、ロドリグエズ
（Rodriguez）、R.L.、グリーン（Greene）、P.J.、ベ
トラッチ（Betlach）、M.C.、ヘイネカー（Heyneke
r）、H.L.、ボイラー（Boyer）、H.W.、クロサ（Cros
a）、H.W.クロサ（Crosa）、J.H.およびファルコウ（Fa
lkow）、S.、遺伝子（Gene）3:95-113（1977）；E. co
li K12 HB101（ATCC No.33694）；E. coli MM21（ATCC
No.336780）；およびE. coli DH1（ATCC No.3384
9）。下E. coli）K12 RR1は好ましい宿主であり、そし
てＦ-hsd R M遺伝子型を有する。 同様に、別のベクター／クローニング系を使用するこ
とができ、そしてその例は次の通りである：E. coliま
たはサッカロミセス セレビシアエ（Saccharomyces c
erevisiae）の中で、あるいは両者の中で生長するプラ
スミドベクター、あるいはさらに動物細胞、例えば、マ
ウス中で生長するウシ乳頭腫ウイルスのようなベクター
（ATCC No.RL16161）［エルダー（Elder）、J.T.、スプ
リッツ（Spritz9、R.A.およびウェイスマン（Weissma
n）、S.M.、Ann, Rev. Gen. 15:295-340（1981）；お
よびウレ（Ure）、R.、グロスマン（Grossman）、L.お
よびモルデイブ（Moldave）、K.、酵素学における方法
「組換え体DNA」（Methods in Enzymology “Recomb
inant DNA"）、vol.101、部Ｃ、アカデミック・プレ
ス、ニューヨーク（1983）参照］。 ここで使用するとき、「フランキング配列（flanking
sequences）」は、g92遺伝子解読配列から上流、下
流、あるいは上流および下流の両者の配列を意味する。
上流の配列は転写制御信号、すなわち、プロモーターお
よびエンハンサーを含有し、ここで下流の配列はg92遺
伝子の転写停止およびポリアデニル化信号を含有する。 工程（１）および（４）の雑種プラスミド中に存在し
なくてはならない、精確なPRV g92遺伝子配列は、欠失
のために選択した配列および欠失突然変異の操作に使用
すべき制限ヌクレアーゼに依存するであろう。 工程（１）および（４）において必要なプラスミド中
の欠失に隣接する特定のPRV DNA配列は、雑種プラスミ
ド中の欠失に特異性に依存するであろう。一般に、欠失
および／または挿入の３′および５′の両者の側に隣接
するPRV DNA配列の大きさは、少なくとも約400bpであろ
う。プラスミドpBUK:gCdlStuI（第４図参照）におい
て、欠失の両側の３′および５′配列は長さが1.3Kbお
よび1.6Kbpであった。 工程（１）のg92糖蛋白質遺伝子を含有するPRV DNA断
片を得る、本発明における出発物質として使用する特定
のPRV菌株は、臨界的ではない。このような菌株の例
は、次のものを包含する:tk+PRV菌株、例えば、よく知
られた弱毒菌株、例えば、ブカレスト（Bucharest）菌
株、SUCH−１［スコダ（Skoda）、R.、ブラウナー（Bra
uner）、I.、サデッキー（Sadecky）、E.およびメイヤ
ー（Mayer）、V.、アクタ・ビロロジカ（Acta Viro
l.）8:1−９（1964）参照］、およびノルデン（Norde
n）菌株［パウル（Paul）、P.S.、メンゲリング（Menge
ling）、W.L.およびパートル（Pirtle）、E.C.、アーチ
ーブス・オブ・バイロロジー（Arch. Virol.）73:193-
198（1982）参照］；および病気の動物から直接分離し
たヴィルレント菌株または実験室において頻繁に継代培
養したヴィルレント菌株、例えば、アウジェスズキー
（Aujeszky）菌株（ATCC No.VR-135）、Ｐ−2208菌株、
KC-152D（菌株［マエス（Maes）、R.K.、カニツ（Kanit
z）、C.L.およびグスタフソン（Gustafson）、D.R.、ア
メリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ
（Am. J. Vet. Res.）44:2083〜2086（1983）、S52/
25アイオワ（Iowa）菌株、Ind−Ｆ菌株、Ind−Ｓ菌株、
Ind−Ｒ菌株およびショープ（Shope）菌株［パウル（Pa
ul）、P.S.、メンゲリング（Mengeling）、W.L.および
パートル（Pirtle）、E.C.、アーチーブス・オブ・バイ
ロロジー（Arch. Virol.（73:193-198（1982）参
照］；およびtk-PRV菌株、例えば、PRV（BUK-5A）（ATC
C No.VR-2028）およびPRV（BUK-dl 3）（ATCC No.VR-20
74）、これらのすべてはg92を生産する。 ここで使用するとき、「選択可能な遺伝子」は、存在
または不存在を容易に検出できる遺伝子生産物を暗号化
するDNA配列を意味する。工程（２）において使用する
選択可能な遺伝子は、本発明にとって臨界的ではない。
このような選択可能な遺伝子の例は、tk遺伝子、トラン
スポゾンTn遺伝子（neoR決定E. coli lacZ遺伝子を包
含することができる。 選択可能な遺伝子として使用する特定のtk遺伝子は、
本発明にとって臨界的ではない。すなわち、tk遺伝子は
前述の任意のtk+PRV菌株から、あるいはウイルス特異的
tk遺伝子を含有する他のウイルス、例えば、HSV−１、H
SV−２、およびマーモセットヘルペスウイルスから誘導
することができる［キット（Kit）、S.、キット（Ki
t）、M.、クアビ（Qavi）、H.、トルクラ（Trukula）、
D.およびオーツカ（Otsuka）、H.、バイオヒミカ・エト
・バイオフィジカ・アクタ（Biohim. Biophys. Act
a）741:158-170（1983）；オーツカ（Otsuka）、H.およ
びキット（Kit）、S.ウイルス学（Virol.）135:316-330
（1983）およびワグナー（Wagner）、M.J.、シャープ
（Sharp）、J.A.およびサンマー（Summer）、W.C.、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Proc. Natl. Acad. Sci.）USA
78:1441-1445（1981）参照］。あるいは、tk遺伝子は細
胞、例えば、ニワトリおよびヒトのtk遺伝子、由来であ
ることができる［メリル（Merill）、G.F.、ハーランド
（Harland）、R.N.、グラウジン（Graudine）、M.およ
びマクナイト（McKnight）、S.L.、モレキュラー・アン
ド・セルラー・バイオロジー（Mol. Cell. Biol.）4:
1769-1776（1984）およびブラッドシャウ（Bradsha
w）、H.D.Lジュニアーおよびディニンガー（Deininge
r）、P.L.、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ
ロジー（Mol. Cell. Biol.）4:2316-2320（1984）参
照］。PRVのブカレスト（Bucharest）菌株、例えば、PR
V（BUK−５）のtk遺伝子は、工程（３）において使用す
る感染性tk-PRV DNAがPRVのブカレスト（Bucharest）菌
株から誘導されるとき、選択可能な遺伝子として本発明
におて使用するのに好ましいtk遺伝子である。工程
（３）の得られる組換え体ウイルスは、ただちの速いPR
V制御信号に応答して、高い効率で、tk+遺伝子を発現す
べきである。異型のウイルスおよび細胞のtk+遺伝子
は、雑種PRV組換え体中の発現の効率に劣ることがあ
る。あるいは、工程（２）の雑種プラスミドは、PRV tk
+遺伝子の上流の転写制御配列に連結した異型のウイル
スまたは細胞のtk+遺伝子を含有することができる。 機能的TKの存在または不存在、すなわち、tk+またはt
k-のウイルスについて選択するための特定の選択手段は
臨界的ではない。tk+ウイルスのための選択手段の例
は、次の通りである:10-4モルのハイポキサンチン、10
-6モルのアミノプテリン、４×10-5モルのチミジンおよ
び10-5モルのグリシンを補充した生長培地（以後「HAT
G」）［ダッブス（Dubbs）、D.R.、オーツカ（Otsuk
a）、H.、クアビ（Quavi）、H.およびキット（Kit）、
S.、ウイルス学（Virol.）126:408-411（1983）参照］
および６×10-7モルのメトトレキセート、1.6×10-5モ
ルのチミジン、５×10-5モルのアデノシン、５×10-5モ
ルのグアノシンおよび10-4モルのグリシンを補充した生
長培地（以後「MTAGG」［ムンゴン（Mungon）、W.、ク
ライセルバード（Kraiselburd）、E.、デイビス（Davi
s）、D.およびマン（Mann）、J.、ウイルス学雑誌（J.
Virol.）7:813-820（1971）参照］。tk-ウイルスのた
めの選択手段の例は、次の通りである:25μg/mlの５−
ブロモデオキシウリジンを含有する生長培地（以後「Br
dUrd」）、100μg/mlの５−ヨードデオキシウリジンを
含有する生長培地（以後「IdUrd」または100μg/mlのア
ラビノシルチンを含有する生長培地。tk-ウイルスのた
めのヌクレオチド類似体の選択技術の多くの変法を使用
することもできる。例えば、ウイルスで感染した細胞は
約2.5〜25μg/mlのBrdUrdを含む培地中で生長させるこ
とができる。BrdUrdをtk+ウイルスのNDA中に組込まれか
つBrdUrd含有DNAは高度の刊行性であるので、ウイルス
の収穫物は約0.5μモルのヘヒスト（Hoechst）33258で
処理してDNAさらに光増感することができる。次いで、D
NAを「冷白色の」蛍光［ゼネラル・エレクトリック（Ge
neral Electric）］に４分間暴露して約50エルグ/mm2／
秒を供給する［ヒラリー（Hillary）、A.M.、ルゴ（Lug
o）、T.G.およびフォルニーア（Fournier）、R.E.K.、
バイオケルミカル・ジェネチックス（Biochem. Gene
t.）22:201-213（1984）参照］。この手順後、tk+ウイ
ルスの感染性は選択的に破壊されが、tk-ウイルスはこ
の処理に対して抵抗性である。 前述のように、そのtk遺伝子以外の選択可能な遺伝子
を工程（２）において使用することができ、こうして工
程（２）の得られる雑種プラスミドがPRV g92遺伝子のD
NA配列によりフランキングされた機能的選択可能な遺伝
子を含有するようにすることができる。例えば、ネオマ
イシンおよび約物に対する抵抗を付与することのできる
アミノグリコシド3'−ホスホトランスフェラーゼを暗号
化するトランスポゾンTn5遺伝子（neoR）［pNeo;ファー
マシア（Pharmacia）Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Biochme
cals）参照］。トランスポゾンTn5遺伝子を発現させる
ために、PRVプロモーターはトランスポゾンTn5遺伝子の
解読区域の対して5'に位置することが必要である。次い
で、このようにして生成されたキメラのプラスミドを工
程（３）におけるG418と一緒に使用して、g92糖蛋白質
を発現することのできない組換え体のPRV g92突然変異
体について選択することができる［フランケ（Frank
e）、C.A.、ライス（Rice）、C.M.およびフルビー（Hru
by）、D.E.、モレキュラー・アンド・セルラー・・バイ
オロジー（Mol. Cell. Biol.）5:1918-1924（1985）
参照］。 あるいは、前述のように、E. coli lacZ遺伝子を工
程（２）においてtk遺伝子の代わりに使用し、こうして
E. coli lacZ遺伝子がPRVプロモーターに融合され、そ
して得られるキメラ遺伝子が5'および3'の各側において
PRV g92ヌクレオチド配列によってフランキングされる
ようにすることができる。次いで、この雑種プラスミド
を工程（３）において使用して、β−ガラクトシダーゼ
を発現する組換え体PRVプラークについて選択すること
ができ、このプラークはＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドおよびXGal［ベーリンガー・マンハ
イム・バイオケミカルズ（Boehringer Manneheim Bioch
mecals）］で生成される青色光によって検出される［チ
ャクラバルチ（Chakrabarti）、S.、ブレチリング（Bre
chling）、K.およびモス（Moss）、B.、モレキュラー・
アンド・セルラー・・バイオロジー（Mol. Cell. Bio
l.）5:3403-3409（1985）参照］。 選択可能な遺伝子の生産物を生産することのできない
特定のPRV菌株は、臨界的でなく、そして使用する選択
可能な遺伝子に依存するであろう。こうして、選択可能
な遺伝子がtk遺伝子であるとき、使用するPRV菌株はtk-
PRV菌株でなくてはならない。tk-PRV菌株は自然突然変
異体、突然変異原誘発突然変異体、または欠失および／
または挿入の突然変異体であることができ、ただしそれ
らは検出可能な頻度で、例えば、HATGを補充した生長培
地中で、tk+に復帰してはならない。自然突然変異体の
冷は、araT抵抗性菌株、例えば、tk-PRV（Ka）、tk-PRV
（Bartha）およびtk-PRV（Norden）を包含する［ロムニ
クジ（Lomniczi）、B.、ワタナベ（Watanabe）、S.、ベ
ン−ポラト（Ben-Porat）、T.およびカプラン（Kapla
n）、A.A.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）52:198-205
（1984）参照］。突然変異原誘発突然変異体の例は、PR
V（BUK-5A）（ATCC No.VR-2028）を含む、米国特許第4,
514,497号中に記載される突然変異体を包含する。欠失
突然変異体の例は、米国特許第4,514,497号中に記載さ
れいるものを包含し、PRV（BUK-dl 3）（ATCC N.VR-207
4）を含む。PRV（BUKE-dl 3）は、PRV gIを同様に生産
しない、突然変異原誘発tk-PRV、すなわち、高度に弱毒
した温度抵抗性PRVであるPRV（BUK-5A）（ATCC No.VR-2
028）から誘導されるので、好ましい欠失突然変異体で
ある。PRVはウイルス特異的トランスポゾンTn5遺伝子ま
たはE. coli lacZ遺伝子について暗号化しないので、
これらの選択可能な遺伝子を使用するとき、tk-PRVを含
む、前述の任意のPRV菌株を使用することができる。 本発明において使用する特定のPRV宿主細胞は、使用
する選択可能な遺伝子に依存するであろう。すなわち、
tk+遺伝子について選択するためには、tk-宿主細胞を使
用すべきである。しかしながら、機能的neoR遺伝子また
はlacZ遺伝子について選択するためには、tk+またはtk-
の宿主細胞は、いずれもneoR遺伝子またはlacZ遺伝子を
自然に生産しないので、使用可能である。 本発明において使用する特定のtk+宿主細胞は、PRVの
許容生長を許すかぎり、臨界的ではない。このようなtk
+宿主細胞の例は、次のものを包含する:RAB−９（ウサ
ギ皮膚細胞）ATCC No.1414を有する；一次ウサギ腎細
胞；二次ウサギ腎細胞；サル細胞、例えば、CV−１およ
びOMK;ヒト細胞、例えば、HeLa（S3）およびヒト胚腎細
胞；およびニワトリ胚線維芽細胞。しかしながら、野外
における動物のワクチン接種に使用すべきワクチンを生
産するためには、ユナイテッド・ステイツ・ディパート
メント・オブ・アグリカルチャー（Unite States Depar
tmento of Agriculture）が承認した、好ましくはワク
チン接種すべき動物と同一腫であり、かつ他の感染因子
を含有しない、PRVについて許容される細胞系を使用す
べきである。例えば、適当なブタの細胞系は、骨髄腫お
よび他のウイルスを含まない、承認された倍数の非腫瘍
発生ブタこうがん（diploid non-tumorgenic swine tes
ticle）（ST）細胞系である。 本発明において使用する特定のtk-宿主細胞は、PRVに
ついて許容生長を許すかぎり、臨界的ではない。このよ
うなtk-宿主細胞の例は、次のものを包含する：ウサギR
ab（BU）、マツキLM（TK-）、ヒトHeLa（BU25）［キッ
ト（Kit）、S.、ダッブス（Dubbs）、D.R.およびフリー
アソン（Frearson）、インターナショナル・ジャーナル
・オブ・キャンサー（Int. J. Cancer）1:19-30（196
6）；キット（Kit）、S.、ダッブス（Dubbs）、D.R.、
プレカルスキー（Prekarski）、L.J.およびフス（Hs
u）、T.C.、実験的細胞の研究（Exptl. Cell不Res.）3
1:297-312（1963）；キット（Kit）、S.およびクアビア
（Quavi）、H.、ウイルス学（Virol.）130:381-389（19
83）；キット（Kit）、S.、クアビ（Qavi）、H.、ダッ
ブス（Dubbs）、D.R.およびオーツカ（Otsuka）、H.、
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.
Mol. Biol.）12:25-36（1983）参照］、シリアンンハ
ムスターBHK 21（TK-）［サンダス（Sandus）、P.G.、
ウィルキー（Wilkie）、N.M.およびデイビドソン（Davi
dson）、A.J.、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロ
ロジー（J. Gen. Virol.）63:277-295（1982）参照］
およびヒト系統143［キャンピオン−ピカルド（Campion
e-Picardo）、ラウルス（Rawls）、W.E.およびバッチェ
ッチ（Barcchetti）、S.、ウイルス学誌（J. Virol.）
31:281-287（1979）参照］。Rab（BU）は本発明におい
て使用する好ましいtk-宿主細胞である。 本発明に関して、温度抵抗性ウイルスは温度不感受性
であるウイルスである。温度抵抗性ウイルスは、親ウイ
ルスまたはPRVの野外分離物が許容温度において複製す
るのとほぼ同様によく、非許容温度、すなわち、約38.5
℃〜40℃、好ましくは39.1℃において複製することがで
きる。これと対照的に、温度感受性PRV菌株は複製に必
須のウイルス遺伝子中に突然変異体を含有し、これによ
り機能的遺伝子生産物は許容温度、すなわち、約32℃〜
37.5℃、好ましくは34.5℃において生産されるが、非許
容温度においては生産されない。したがって、温度感受
性ウイルスにおいて、感染性ウイルス粒子の生産は、許
容温度における生産に比較して、非許容温度において４
〜７対数（logs）だけ低い。温度抵抗性ウイルス菌株で
は、感染性ウイルス粒子の生産は非許容温度において、
許容温度におけるとのほぼ同一である。 温度抵抗性ウイルスは変更生ワクチンとして温度感受
性ウイルスよりすぐれる。その理由は次の通りである：
（１）弱毒は、複製のために要求されるウイルス遺伝子
の弱化からよりはむしろ、病原性ウイルス遺伝子の変更
から生ずる；そして（２）温度抵抗性ウイルスは筋肉内
に、鼻内にあるいは静脈内に安全に投与することがで
き、そして体の深い組織中で複製して、より安全な延長
した免疫学的応答を誘発することができる。 g92-PRV突然変異体は、PRVを弱毒化する追加の突然変
異体を含有するとき、偽狂犬病の病気に対して変更生ウ
イルスワクチンとして使用することができる。このよう
な追加の突然変異体は、tk-突然変異体およびgI-突然変
異体を包含する。 あるいは、本発明のg92-PRV突然変異体は偽狂犬病の
病気に対して殺したウイルスワクチンとして使用するこ
とができる。すなわち、g92-PRV突然変異体の感染性を
紫外線またはホルムアルデヒド処理により不活性化する
と、腹腔内糖予後、細胞毒性Ｔ細胞、および糖蛋白質gI
Ia、gIIb、gIVおよびgVの対する保護抗体を誘発するこ
とができる。このワクチン接種で免疫化された動物は、
こうして、ヴィルレントウイルスの感染に対して保護さ
れるであろう。 さらに、非イオン性洗剤抽出物［ノニデット（Nonide
t）P40またはトリトン（Triton）X100］をPRVg92-感染
ブタ細胞からつくって、サブユニットのPRVワクチンを
生産することができる。これらの抽出物は、糖蛋白質g9
2を除外して、使用したPRV菌株により暗号化された糖蛋
白質および非糖蛋白質のすべてを含有する。糖蛋白質の
精製後、それらをサブユニットのワクチンとして使用す
ることができる［ヒレマン（Hilleman）、M.T.ラーソン
（Larson）、V.M.、レーマン（Lehman）、E.D.、サレル
ノ（Salerno）、R.A.、コナード（Conard）、P.G.、マ
クリーン（McLean）、A.A.、ヒトヘルペスウイルス：ア
ン・インターディシプリナリー・パースペクチブ（The
Human Herpesvirus：An Interdiciplinary Perspe
ctive）、ナーミアス（Nahmias）、A.J.、ドウドル（Do
wdle）、W.R.およびシナジ（Schinazi）、R.F.編（エル
セビーア、ニューヨーク）、503ページ（1981）；アイ
ゼンバーグ（Eisenberg）、R.J.、ポンス・デ・レオン
（Ponce de Leon）、M.、ペレビア（Perbvia）、L.、ロ
ング（Long）、D.およびコーヘン（Cohen）、G.H.、ジ
ャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）41:1099-
1104（1982）；ロング（Long）、D.、マダラ（Madar
a）、T.J.、ポンス・デ・レオン（Ponce de Leon）、
M.、コーヘン（Cohen）、G.H.、モントゴメリー（Montg
omery）、P.C.、アイゼンバーグ（Eisenberg）、R.J.、
感染および免疫（Inf. Immun.）37:761-764（1984）；
およびディクス（Dix）、R.D.およびミルス（Mills）、
J.、ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー（J.
Med. Virol.）71:9−18（1985）参照］。 他の変法として、本発明のg92-PRV突然変異体は出発
物質としてtk+PRV菌株を使用して、米国特許第4,514,49
7号中に記載されるtk-PRV突然変異体を得ることができ
る。 本発明の前述のウイルスの製薬学的に有効な量を、製
薬学的に許容されうる担体または希釈剤と一緒に、動
物、例えば、ブタ、ウシ、ヒツジおよびヤギにおける偽
狂犬病の病気に対するワクチンとして使用することがで
きる。 本発明において有用な製薬学的に許容されうる担体ま
たは希釈剤の例は、PRVに対する抗体を含有しない、す
なわち、PRVについて血清陰性である、約2.5〜15％の血
清を含有する、生理学的に緩衝化した、すなわち、pH7.
0〜7.4の、任意の媒質を包含する。無ガンマグロブリン
血清は、ガンマグロブリンを含有する血清よりも好まし
い。本発明において使用する血清の例は、次のものを包
含する：ブタ血清、子牛血清、胎児子牛血清、ウマ血清
および子羊血清。PRVについて血清陰性のブタからの無
ガンマグロブリン血清はブタのワクチン接種にために好
ましく、そして胎児子牛血清または無ガンマグロブリン
血清は子牛のワクチン接種に好ましいであろう。血清蛋
白質、例えば、ブタルブミンまたはウシ血清アルブミン
を約0.5〜3.0％の量で血清の代わりに使用できる。しか
しながら、ワクチン接種される動物中にアレルギー生応
答を誘発するであろう。異質調製を担体または希釈剤中
に使用することを避けることが望ましい。凍結乾燥前
に、、リン酸塩緩衝化生理的食塩水、グルタミン酸塩、
カシトーン（casitone）またはラクトースの加水分解
物、スクロース、ソルボース、ラクトース、ゼラチンま
たは防腐剤、例えば、ゲンタマイシン、フンガゾーン
（fungazone）およびアンホテリシンＢを含有する任意
の可溶化溶液を使用してウイルスを希釈することができ
る。 本発明のウイルスは少なくとも105.5〜106.5p.f.u./m
lの力価で凍結乾燥した状態で４℃〜−20℃において貯
蔵することが好ましい。凍結乾燥したウイルスは、1.0
％（v/v）のグリセロールを含有する無菌の蒸留水で再
構成することができる。 投与に有効な量は、ワクチン接種する動物の年令、体
重および種および投与方法に依存して変化する。生変更
ウイルスワクチンとして、適当な投与量は、例えば、約
104.5〜106.5p.f.u.、好ましくは約105.0〜106.5p.f.u.
であることができる。殺したウイルスワクチンとして、
適当な投与量は、例えば、変更生ウイルスワクチンにつ
いて用いるそれの約10倍多くすることができる。 本発明のワクチンは筋肉内におよび皮下に投与するこ
とができる。筋肉内は好ましい投与法である。本発明の
変更生ワクチンは、また、鼻内に投与することができ
る。 次の実施例により本発明をさらに説明する。これらの
実施例は本発明の範囲を限定することを意図するもので
はない。 以下の実施例において、すべての媒質および緩衝溶液
は、特記しないかぎり、ガラス蒸留水で調製した。 実施例１ PRVのg92-突然変異体の精製 Ａ、PRV DNAの精製 PRV DNAは、本質的にHSV DNAの調製についてピグナッ
チ（Pignatti）らが記載するようにして調製した［ピグ
ナッチ（Pignatti）、P.F.、カッサイ（Cassai）、E.、
メネグジ（Meneguzzi）、G.、ケムシナー（Chemcine
r）、N.およびミラネシ（Milanesi）、G.、ウイルス学
（Virol.）93:260-264（1979）参照］。 20mlのイーグル（Eagle）の最少必須培地［AutoPow、
APMEM、フロー・ラボラトリーズ・インコーポレーテッ
ド（Flow Laboratories,Inc.）］＋10％（v/v）胎児子
牛血清、50μg/mlのネオマイシンおよび2.0ミリモルの
グルタミンおよび10ミリモルのHEPES、pH7.3、（以後
「生長培地」）を含有する、RAB−９（約５×106細胞／
培養物）の８オンスの規格ガラス便の単層培養物にPRV
（BUK−７）を5.0PFU/細胞のm.o.i.において感染させ
た。PRV（BUK−７）はPRV菌株のよく知られかつ入手可
能なブカレスト（Bucharest）菌株のプラーク精製した
クローンである（米国特許第4,514,497号参照）。次い
で、感染した細胞を34.5℃で３時間インキュベーション
し、その時細胞DNAの合成はウイルスの感染により阻害
された。次いで、1.0μCi/mlおよび0.25μg/mlの3Ｈ−
チミジンを添加してウイルスを放射線標識し、そして3
4.5℃でさらに17時間インキュベーションした。細胞を
ゴムのポリスマンで生長培地中にこすり入れることによ
ってガラスから分離し、0.14モルのNaCl、0.003モルのK
Cl,0.001モルのCaCl2、0.0005モルのMgCl2および0.01モ
ルのリン酸塩、pH7.5、からなり（以後「PBS」）、10μ
g/mlの非放射性チミジンを含有する、氷冷リン酸塩緩衝
化生理的食塩水で洗浄した。次に、細胞を600×ｇで遠
心し、次いでエタノール−ドライアイス浴中で凍結し
た。 融解後、細胞の沈殿物（約0.7ml）を0.25％（v/v）の
トリトンＸ−100、10ミリモルのEDTA、10ミリモルのト
リス−HCl、pH7.9、からなる溶菌溶液の９体積中に懸濁
させた。次に、細胞懸濁液をダウンス（Dounce）ホモジ
ナイザーに移し、そしておだやかに混合しながら室温に
おいて20〜30分間インキュベーションした。 次いで、細胞懸濁液をガラスの遠心管に移し、そして
NaClを0.2モルの最終濃度に添加した。次に、管を数回
倒立させ、そしてこの溶液を直ちに1000Xgで４℃におい
て10分間遠心した。 得られる上澄みをガラス管中にデカンテーションし、
そして10ミリモルのトリスHCl、pH7.5、1.0ミリモルのE
DTAからなる緩衝液（以後「TE緩衝液」）中において100
μg/mlのプロテアーゼＫ（E.M.サイエンス）とともに37
℃で１時間インキュベーションすることによって脱蛋白
質した。次いで、１体積の90％（v/v）の再蒸留フェノ
ールを添加し、この溶液を倒立により混合し、20,000Xg
で遠心し、そして水相、すなわち、上相をポリアロマー
遠心管に移した。次いで、酢酸ナトリウムを4.0％（w/
v）の濃度に添加し、核酸を２体積の氷冷〃エタノール
で沈殿させ、そして−20℃で一夜インキュベーションし
た。その後、沈殿を16,000rpmで４℃でスピンコ（Spinc
o）SW25ローター内で遠心し、2.0mlのTE緩衝液中に溶解
し、そして４℃でTE緩衝液に対して透析した。 次いで、得られたDNA溶液をポリアロマー遠心管に移
し、そしてTE緩衝液中のCs細胞を57％（w/w）（ρ＝1.7
15g/cm2）に添加した。次に、DNAを44,000rpmで22.5℃
において46時間スピンコ（Spinco）No、50Tiローター内
で遠心した。次いで、12滴の分画をポリアロマー管の底
から集め、そして4.0μｌのアリコートを液体シンチレ
ーション・スペクトロメーター中で計数して、PRV DNA
含有分画を捜した（ρ＝約1.727g/cm ）。合計25の分画
が集められた時、一般に分画13〜15はPRV DNAを含有し
た。 次いで、PRV DNA含有分画をプールし、そしてTE緩衝
液を数回交換してTE緩衝液に対して４℃において約24時
間透析した。DNAの濃度は蛍光測定により決定した。PRV
（BUK−７）のNDAの収量は108細胞から約50μｇであっ
た。 PRV（BUK−７）のDNAの同一性は、後述するように、
サブマリン・ゲル装置［ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ・インコーポレーテッド（Bethesda Reseach Lab
oratiories,Inc.）］中で４℃において電気泳動した後
得られた制限ヌクレアーゼ消化PRV（BUK−７）のDNA断
片のパターンによって確認した。 得られたPRV（BUK−７）のDNAを、製造業者［ニュー
・イングランド・バイオラボラトリーズ・インコーポレ
ーテッド（New England Biolabs,Inc.）］により推奨さ
れる反応条件下に、BamHI、BglIIおよびKpnI制限ヌクレ
アーゼで切断した。次に、次に、0.4％（w/v）のブロモ
フェノール・ブルー、125ミリモルのEDTAおよび50％（v
/v）のグリセロールからなる溶液の1/10体積を添加し
て、反応を停止させ、次いで65℃で10分間加熱した。各
試料の12μｌのアリコーTPをアガロースゲルの試料のウ
ェル（well）に適用し、そして電気泳動を後述するよう
にして実施した。 制限ヌクレアーゼの断片の電気泳動は0.6％（w/v）ア
ガロースのスラブゲル上で30ミリモルのNaH2PO4、1.0ミ
リモルのEDTA、40ミリモルのトリス−HCl、pH8.1、から
なる電気泳動緩衝液（以後「電気泳動緩衝液」）中で45
ボルトおよび４℃において約16時間実施した［キット
（Kit）、S.、クアビ（Qavi）、H.、ダッブス（Dubb
s）、D.R.およびオーツカ（Otsuka）、H.,ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Bio
l.）12:25-36（1983）参照］。電気泳動後、DNA断片を
0.5μg/mlの臭化エチジウムを含有する電気泳動緩衝液
中でゲルをソーキングすることによって着色し、長い波
長のUV照射機の上で可視化し、そして光等級づけた。制
限ヌクレアーゼのパターンはPRV DNAについて前に記載
したものに類似した［キット（Kit）、S.、キット（Ki
t）、M.およびパートル（Pirtle）、E.C.、アメリカン
・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am.
J. Vet. Res.）46:1359-1367（1985）；ロムニクジ
（Lomniczi）、B.、ブラケンシップ（Blankenship）、
M.L.およびベン−ポラト（Ben-Porat）、T.、ウイルス
学雑誌（J. Virol.）49:970-979（1984）参照］。PRV
（BUK−５）およびPRV（BUK−７）のゲノムのBglII、Ba
mHIおよびKpnIの断片の位置を示す制限ヌクレアーゼ地
図は、米国特許第4,514,497号の第２図に示されてい
る。これらの断片は、第１図中に示されるPRV［カプラ
ン（Kaplan）］の対応するDNA断片と本質的に同一の位
置にマッピングされる。PRV（BUK−５）またはPRV（BUK
−７）は本発明において互換滴に使用することできるで
あろう。BglII、BamHIおよびKpnIの断片の大きを下表１
に示す。 この方法で調製されたPRV（BUK−７）DNAは標準のト
ランスフェクションのアッセイにおいて約100PFU/μｇ
のDNAを感染性を有した［グラハム（Graham）、F.L.お
よびファ・デル・エブ（Van der Eb）、A.J.、ウイルス
学（Virol.）52:456-467（1973）参照］。 Ｂ、プラスミドpBK-JLの構成 PRV（BUK−７）から分離したDNAのKpnI断片を、次の
手順によりpMAR-KpnのKpnI位置中にクローニングした
（第２図参照）。 pMAR-Kpnは、単一のKpnIクローニング位置をもつpMAR
420から誘導された6.0Kbpのプラスミドである［オーツ
カ（Otsuka）、H.、ヘイゼン（Hazen）、M.、キット（K
it）、M.、クアビ（Quavi）、H.およびキット（Kit）、
M.、ウイルス学（Virol.）113:196-213（1981）参
照］。pMAR-KpnはpMAR-420から4.3KbpのXhoI-SalI断片
を欠失させることによって得た。この工程において、pA
MR-Kpn以外のクローニングベクターを本発明の精神およ
び範囲から逸脱しないで使用することができるであろ
う。例えば、pKB111、pKSC-10［ファーマシア（Pharmac
ia）Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Biochmecals）］およびp
MAR420は、ただ１つのKpnIクローニング位置を有するの
で、使用できるであろう。同様に、オリゴ（dG）テイル
ドpBR322をPRVのオリゴ（dG）テイルドKpnI断片と一緒
に使用できるであろう。 6.0ミリモルのNaCl、6.0ミリモルのトリスHCl（pH7.
5）、6.0ミリモルのMgCl2、1.0ミリモルのジチオスレイ
トールおよび100μg/mlのウシ血清アルブミン（以後「B
SA」）からなる100μｌの緩衝液（以後「KpnI切断緩衝
液」）中に溶解した。次いで、DNAを40単位のKpnI［ニ
ュー・イングランド・バイオラボラトリーズ・インコー
ポレーテッド（New England Biolabs,Inc.）］で１時間
消化した。この反応をシクロヘキシルアミン四酢酸塩
（以後「CDTA」）を20ミリモルのに添加し、そして65℃
に30分間加熱することによって停止させた。酢酸ナトリ
ウムを0.1モルに添加した後、DNAを２体積のエタノール
で沈殿させ、−20℃で一夜貯蔵し、そして遠心により集
めた。 クローニングベクター、pMAR-Kpn、を50μｌのKpnI切
断緩衝液中で0.5μｇのpMAR-KpnのDNAをインキュベーシ
ョンし、次いで５単位のKpnIで37℃において１時間消化
することによって直線化した。反応を前述のように停止
させ、そしてDNAをエタノール沈殿後遠心により集め
た。 4.0μｇのKpnI切断PRV（BUK−７）および0.1μｇのKp
nI切断pMAR-Kpnを、50ミリモルのトリス‐HCl（pH7.
8）、10ミリモルのMgCl2、20ミリモルのジチオスレイト
ール、1.0ミリモルのATP、50μg/mlのBSAからなり（以
後「結合緩衝液」）そして100単位のT4 DNAリガーゼ
［ニュー・イングランド・バイオラボラトリーズ・イン
コーポレーテッド（New England Biolabs,Inc.）］を含
有する緩衝液の50μｌ中に溶解し、そして４℃で一夜イ
ンキュベーションした。この反応をEDTAを20ミリモルの
に添加し、そして65℃に30分間加熱することによって停
止させた。 組換え体プラスミドをTE緩衝液中に希釈し、そして後
述のようにE. col. K12 RR1バクテリアを形質転換した
［ボリバー（Bolivar）、F.、ロドリグエズ（Rodrigue
z）、R.L.、グリーン（Greene）、P.J.、ベトラッチ（B
etlach）、M.C.、ヘイネカー（Heyneker）、H.L.、ボイ
ヤー（Boyer）、H.W.、クロサ（Crosa）、H.W.クロサ
（Crosa）、J.H.およびファルコウ（Falkow）、S.、遺
伝子（Gene）3:95-113（1977）参照］。 バクテリアはCaCl2を使用して準備した［マンデル（M
andel）、M.およびヒガ（Higa）、A.、ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）5
3:159-162（1970）参照］。詳しくは、E. col. K12 RR
1の2.0（Ａ600）の密度の一夜の培養物を使用して、1.0
％（w/v）のバクトトリプトン、0.5％（w/v）の酵母エ
キスおよび0.5％（w/v）のNaClからなるブイヨン（以後
「NLブイヨン）」の200mlを0.02（Ａ600）のバクテリア
密度で接種した。バクテリアは、約0.5（Ａ600）が達成
されるで、約２時間インキュベーションした。次いで、
バクテリアを遠心により沈殿させ、そして1/4体積の冷5
0ミリモルのCaCl2中に懸濁させた・氷上で５分間インキ
ュベーションした後、バクテリアを再び1/4体積の冷50
ミリモルのCaCl2中に懸濁させた。 次に、1/10mlのTE緩衝液中の組換え体プラスミドDA
N、約10〜100ng、を2.0mlのCaCl2処理バクテリアに添加
した。この混合物を４℃に30分間保持した。次いで、形
質を37℃に５分間上昇させ、そして0.3mlのNLブイヨン
を添加した。その後、インキュベーションを37℃で振盪
しながら45分間続けた。試料を30μg/mlのアンピシリン
を補充したトリプチカーゼ他意図寒天平板［BBLマイク
ロバイオロジー・システムス（Bicrobiology System
s）］上で平板培養した。 得られるクローンを所望の組換え体プラスミドDNAに
ついて、次のようにして、急速スクリーニングした。 組換え体プラスミドDNAを含有するバクテリアの一夜
培養物を、30μg/mlのアンピシリンを含有するMLブイヨ
ンの5.0ml中に接種し、そして37℃において約1.5（Ａ
600）の密度にインキュベーションした。次いで、1mlの
このバクテリア培養物を1.5mlのエッペンドルフ（Eppen
dorf）ポリプロピレン管に移し、そしてエッペンドルフ
（Eppendorf）遠心機内で室温において１分間遠心して
バクテリアを沈殿させた。次に、このバクテリアを、2.
0mg/mlの卵リソチーム、50ミリモルのグルコース、10ミ
リモルのCDTA、および15ミリモルのトリス−HCl緩衝液
（pH8.0）からなるリソチーム溶液No.1（以後「リソチ
ーム溶液No.1」）の0.1ml中に再懸濁させ、次いで４℃
で30分間インキュベーションした。次に、0.2mlのNaOH
＋1.0％（w/v）のドデシル硫酸ナトリウムをバクテリア
の懸濁液に添加し、管を渦形成し、そして４℃に５分間
保持した。その後、0.15mlの3.0モルの酢酸ナトリウ
ム、pH4.8、を添加し、そして管をおだやかに倒立さ
せ、その間にDNAの「凝塊（clot）」が形成した。このD
NAを４℃に１時間保持して染色体のDNA、調製および高
分子量のRNAを沈殿させた。次に、沈殿をエッペンドル
フ（Eppendorf）遠心機ちゅで室温において５分間遠心
し、そして組換え体プラスミドDNAを含有するほぼ0.4ml
の透明な上澄みを第２エッペンドルフ（Eppendorf）遠
心機の管に移した。次いで、2.5体積のエタノール（ほ
ぼ1.0ml）を第２管に添加し、そしてこの管を−20℃に
おいて30分間配置した。沈殿した組換え体プラスミドDN
Aを、エッペンドルフ（Eppendorf）遠心機内で室温にお
ちえ２分間遠心することによって集めた。次いで、組換
え体プラスミドDNAを0.1mlの0.1モルの酢酸ナトリウ
ム、0.05モルのトリス−HCl（pH8.0）中に溶解し、エタ
ノールで再沈殿させ、再び遠心により集め、そして最後
に50μｌの水中に溶解した。 次いで、10μｌのプラスミドDNAをKpnI切断緩衝液中
に希釈し、そして2.0単位のKpnIを添加した。37℃で60
分の消化期間後、試料を0.4％（w/v）のブロモフェノー
ル・ブルー、125ミリモルのEDTAおよび50％（v/v）のグ
リセロールからなる溶液の1/10体積と混合し、そして約
20μｌを前述のように電気泳動分析のため0.6％（w/v）
のアガローススラブのゲルへ適用した。この分析によ
り、組換え体プラスミドがKpnI挿入を含有するかどうか
が明らかにされ、そして、含有する場合、挿入の大きさ
（Kbp）が明らかにされた［バーンボイム（Birnboi
m）、H.C.およびドリイ（Doly）、J.、核酸の研究（Nuc
l. Acids Res.）7:1513-1523（1973）参照］。 前述の急速スクリーニング手順のための組換え体プラ
スミドDNAの生産物に使用したバクテリアに比較して、
組換え体プラスミドDNAの大規模調製のため、200倍の量
のプラスミド温度転換バクテリアをプロセシングした
が、ただし最初のエタノール沈殿後、試料を37℃におい
て、5.0ミリモルのトリス−HCl（pH8.0）中の1.0mg/ml
のＲラーゼ（Nase）からなる、100℃で10分間加熱され
てある、原溶液からの0.5mgの膵Ｒナーゼ（Nase）［ウ
ォーシントン・バイオケミカルス（Worthington Bioche
micals）］で30分間処理した。この処理に引続いて、TE
緩衝液中の500μｇのプロイテナーゼＫ（E.M.サイエン
ス）を37℃で30分間添加した。次いで、等体積のエタノ
ールを添加し、試料を渦形成し、そして前述のように遠
心して相を分離した。次いで、水相を取り出し、エタノ
ールで沈殿させ、そして前述のように遠心により集め
た。次いで、沈殿物を0.2mlのTE緩衝液中に溶解し、そ
して50ミリモルのNaCl、10ミリモルのトリス−HCl（pH
7.5）、1.0ミリモルのEDTA中の10.4mlの直線の10〜40％
（w/v）のスクロース勾配で層状にし、次いでスピンコ
（Spinco）SW41ローター中で24,000rpmで４℃において2
0時間遠心した。15滴の分画をポリアロマー遠心管の底
から集めて、プラスチックトレーのウェル中に入れた。
合計35の分画が得られた。次いで、５μｌのアルコート
を、前述のように、アガロースゲルの電気泳動によりス
クリーニングした。組換え体プラスミドDNAを含有する
分画をプールし、0.1×TE緩衝液に対して透析し、そし
てさらに研究するために４℃で貯蔵した。これらの手順
を使用して、pMAR-KpnのKpnI位置中にクローニングした
断片6.3KbpのKpnI-JLを含有する12.3Kbpの組換え体プラ
スミドが得られた、。このKpnI−ＪはPRVのtk遺伝子を
含有する（米国特許第4,514,497号参照）。得られるプ
ラスミドをpBK-JLと表示する（第２図参照）。 Ｃ、pBK-JL（Stu/BglII）の構成 tk遺伝子を含有するpBK-JLからDNA断片を効率よくか
つ選択的に移動化させるために、プラスミドpBK-JLのSt
uI位置を次のようにBglII位置に転化した（第２図参
照）。 1.0μｇのpBK-JLを、100ミリモルのNaCl、10ミリモル
のトリス−HCl（pH8.0）、10ミリモルのMgCl2、6.0ミリ
モルの２−メルカプトエタノール、100μg/mlのBSAから
なる100μｌの緩衝液（以後「StuI切断緩衝液］）中に
溶解し、そして５単位のStuI［ニュー・イングランド・
バイオラボラトリーズ・インコーポレーテッド（New En
gland Biolabs,Inc.）］で37℃において２時間消化し
た。この反応をCDTAを20ミリモルに添加し、そして65℃
に30分間加熱することによって停止させた。次いで、酢
酸ナトリウムを0.1モルに添加し、そしてDNAをエタノー
ルで沈殿させ、そして遠心により集めた。StuI切断pBK-
JLを、1.0μｇのホスホリル化BglIIリンカー［ニュー・
イングランド・バイオラボラトリーズ・インコーポレー
テッド（New England Biolabs,Inc.）］および1000単位
のT4 DNAリガーゼを含有する結合緩衝液中に溶解した。
４℃で一夜インキュベーションした後、この反応をEDTA
を20ミリモルに添加し、そして65℃に10分間加熱するこ
とによって停止させた。ここで鎖状化したBglIIリンカ
ーを含有するStuI切断pBK-JLプラスミドを、50ミリモル
のNaCl、10ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）、1.0ミリ
モルのEDTA中の10〜40％（w/v）スクロース勾配で40,00
0rpmで８時間スピンコ（Spinco）SW41ローター内でDNA
を遠心することによって、未反応のリンカーから分離し
た。次いで、分画を集め、そして前述のようにDNAをア
リコートのアガロースゲルの電気泳動の分析により局在
化した。次いで、プラスミドDNAを0.1モルの酢酸ナトリ
ウムに移し、2.0μｇの担体酵母DNAを添加し、そしてDN
Aをエタノールで沈殿させ、そして遠心により集めた。
プラスミド上にBglII付着末端をつくるために、末端に
鎖状化BglIIリンカーをもつStuI切断pBK-JLを、10ミリ
モルのNaCl,10ミリモルのトリス−HCl（pH7.4）、10ミ
リモルのMgCl2、10ミリモルの２−メルカプトエタノー
ル、100μg/mlのBSAからなる緩衝液（以後「BglII切断
緩衝液」）の50μｌ中に溶解し、そして８単位のBglII
［ニュー・イングランド・バイオラボラトリーズ・イン
コーポレーテッド（New England Biolabs,Inc.）］で37
℃において１時間消化した。DNAをエタノールで沈殿さ
せ、遠心により集め、次いで50μｌの結合緩衝液中に溶
解し、そして前述のように再び結合してプラスミドを環
化した。前述のようにして得られたプラスミドでE. co
l. K12 RR1を形式転換した後、StuI位置を欠くが、前者
のStuI位置にBglII位置を含有するプラスミドについて
コロニーをスクリーニングした。代表的プラスミドを分
離し、そしてpBK-JL（Stu/BglII）と表示した（第２図
参照）。 Ｄ、pBUK:BglII−Ｂのクローニング PRV（BUK−７）の31.6KbpのBglII−Ｂ断片を、次のよ
うにしてpBR322のBamHI位置中にクローニングした（第
１図および第４図参照）。 4.0μｇのPRV（BUK−７）DNAを100μｌのBglII切断緩
衝液中に溶解し、そして32単位のBglII［ニュー・イン
グランド・バイオラボラトリーズ・インコーポレーテッ
ド（New England Biolabs、Inc.）］で37℃において１
時間消化した。この反応を等体積の90％（v/v）の再蒸
留したフェノールを添加し、混合し、そして相分離のた
めに遠心した。0.1×TE緩衝液に対して水相を透析した
後、酢酸ナトリウムを0.1Nに添加し、次いでで２体積の
エタノールを添加し、そしてDNA沈殿物を−20℃で一夜
貯蔵した。DNA沈殿物を遠心により集め、そして0.1×TE
緩衝液に再溶解した。 次いで、制限ヌクレアーゼ断片をBamHI消化、脱ホス
ホリル化pBR322と次の方法で一緒にした。 4.0μｇのBglII紹介PRV（BUK−７）DNAを、0.2μｇの
BamHI消化、脱ホスホリル化pBR322と、100お単位のT4 D
NAリガーゼを［ニュー・イングランド・バイオラボラト
リーズ・インコーポレーテッド（New England Biolabs,
Inc.）］を含有する0.05mlの結合緩衝液中で混合し、そ
して４℃でインキュベーションした。この反応をEDTAを
20ミリモルに添加し、そして65℃に10分間加熱すること
によって停止させて。組換え体DNAプラスミドを、前述
のように、使用してE. col. K12 RR1を形質転換し、そ
して生ずるコロニーを前述の急速プラスミドスクリーニ
ング手順によりスクリーニングした。pBR322のBamHI位
置の中にクローニングしたほぼ31.6KbpのPRV（BUK−
７）のBilII−Ｂ断片を含む、大きさ約35Kbpの、プラス
ミドを分離し、そしてpBUK:BglII−Ｂと表示した。 Ｅ、pBUK:BglII−ＢのサブクローニングおよびpBUK:Stu
12の構成 約11〜21地図単位にマッピングされる（第４図参照）
pBUK:BglII−ＢからのStuI断片を、次の手順によりpBR3
22のBamHI位置に移した。 1.0μｇのBUK:BglII−Ｂを100μｌのStuI切断緩衝液
中に溶解した。DNAを10単位のStuI［ニュー・イングラ
ンド・バイオラボラトリーズ・インコーポレーテッド
（New England Biolabs,Inc.）］の添加により消化し、
そして37℃で１時間インキュベーションした。この反応
をCDTAを20ミリモルに加津酢酸ナトリウムを0.2モルに
添加し、次いで65℃に30分間加熱することによって停止
させた。DNAをエタノールで沈殿させ、そして前述のよ
うに、遠心により集めた。 StuI消化pBUK:BglII−Ｂを、1.0μｇのホスホリル化B
glIIリンカー［ニュー・イングランド・バイオラボラト
リーズ・インコーポレーテッド（New England Biolabs,
Inc.）］および1000単位のT4 DNAリガーゼを含有する25
μｌの結合緩衝液中に溶解した。４℃で一夜インキュベ
ーションした後、この反応をEDTAを20ミリモルに添加
し、そして65℃に10分間加熱することによって停止させ
た。StuI消化pBUK:BilII−Ｂ（ここでStuI末端に鎖状化
BglIIリンカーを有する）を、次のようにして、結合し
ないBglIIリンカーから分離した。反応混合物を、50ミ
リモルのNaCl、10ミリモルのトリスーHCl（pH7.5）、1.
0ミリモルのEDTA中で10〜40％（w/v）のスクロース勾配
上に層状にし、そしてスピンコ（Spinco）SW41ローター
内で40,000rpmで４℃において８時間遠心した。分画を
集め、そして前述のように、アリコートをアガロースゲ
ルの電気泳動によりDANを捜し出した。リンカーは勾配
の上部に残ったが、プラスミドDNAは勾配の中央にセグ
メント化した。各分画に酢酸ナトリウムを0.1モルにか
つ2.0μｇの担体酵母tRNAを添加した後、プラスミドDNA
をエタノールで沈殿させ、遠心により集め、50μｌのBg
lII切断緩衝液中に溶解し、次いで８単位のBglII［ニュ
ー・イングランド・バイオラボラトリーズ・インコーポ
レーテッド（New England Biolabs,Inc.）］で37℃にお
いて１時間消化して、BglIIの付着末端をつくった。反
応を停止させ、前述のように、DNAをエタノールで沈殿
させ、そして遠心により集めた。 StuI消化pBUK:BglII−Ｂ（ここでStuI断片上にBglII
付着末端を有する）を、まずDNAを50μｌの結合緩衝液
中に溶解することによって、pBR322のBamHI位置中にク
ローニングした。次いで、BamHI消化、脱ホスホリル化p
BR322を添加し、そして、前述のように、この混合物を1
000単位のT4 DNAリガーゼで結合した。結合反応を停止
させた後、E. col. K12 RR1を雑種プラスミドで形質転
換し、そして、前述のように、生ずるコロニーを組換え
体についてスクリーニングした。pBR322のBamHI位置に
挿入されたpBUK:BglII−Ｂから誘導された12KbpのStuI
断片を分離し、そしてpBUK:Stu12と表示した。 Ｆ、pPRVTK/STU12の構成 PRV g92遺伝中に挿入された子選択可能な遺伝子、す
なわち、PRV tk遺伝子を含む雑種プラスミドを、pBK-JL
（StuI/BglII）からの3.1KbpのBglII-KpnI断片を、次の
ように、pBUK:Stu12のBamHIおよびKpnI位置の中に移す
ことによって、構成した（第３図参照）。 4.0μｇのpBUK:Stu12を、150ミリモルのNaCl、6.0ミ
リモルのトリス−HCl（pH7.9）、6.0ミリモルのMgCl2,1
00μg/mlのBSAからなる緩衝液（以後「BamHI切断緩衝
液」）の200μｌ中に溶解し、そして10単位のBamHI［ニ
ュー・イングランド・バイオラボラトリーズ・インコー
ポレーテッド（New England Biolabs,Inc.）］で37℃に
おいて２時間消化した。この反応をCDTAを20ミリモルに
かつ酢酸ナトリウムを0.1モルに添加し、次いで65℃に3
0分間加熱することによって停止させた。DNAをエタノー
ルで沈殿させ、そして遠心により集めた。引続いて、DN
Aを200μｌのKpnI切断緩衝液中に溶解し、そして20単位
のKpnIで37℃において２時間消化し、次いでこの反応を
CDTAを20ミリモルに添加し、そして65℃に30分間加熱す
ることによって停止させた。次いで、酢酸ナトリウムを
0.3モルに添加し、DNAをエタノールで沈殿させ、そして
遠心により集めた。 組み合わせたKpnIおよびBamHIの切断は、約0.4および
15.6Kbpの２つの断片を生じた。引続く工程の間小さい
断片のそのもとの位置への再結合を最少にするために、
次のように、これらの２つの断片をスクロース勾配上の
遠心により分離した。 KpnIおよびBamHIで消化したpBUK:Stu12断片を100μｌ
のTE緩衝液中に溶解し、そして、前述のように、10〜40
％（w/v）のスクロース勾配の上部に層状化し、そして
スピンコ（Spinco）SW41ローター内で40,000rpmで４℃
において８時間遠心することによって沈降させた。分画
を集め、そして前述のように、各分画の一部のアガロー
スゲルの電気泳動分析によりDNA断片の位置を捜した。
大きいDNA断片を含有する分画に、酢酸ナトリウムを0.3
モルにかつまた2.0μｇの酵母tRNAを添加し、次いでDNA
をエタノールで沈殿させ、そして遠心により集めた。 次いで、2.0μｇのpBK-JL（StuI/BglII）を100μｌの
KpnI切断緩衝液中に溶解し、そして10単位のKpnIで37℃
において１時間消化した。この反応を停止し、そして前
述のように、DNAをエタノールで沈殿させ、そして遠心
により集めた。次いで、KpnI消化pBK-JL（StuI/BglII）
を100μｌのBglII切断緩衝液中に再溶解し、そして10単
位のBglII［ニュー・イングランド・バイオラボラトリ
ーズ・インコーポレーテッド（New England Biolabs,In
c.）］で37℃において２時間消化した。この反応を停止
させた後、DNAをエタノールで沈殿させ、そして遠心に
より集めた。引続く工程におけるこれらの断片の再結合
を最少とするため、KpnI＋BglIIで消化したpBK-JL（Stu
I/BglII）を、50ミリモルのトリス−HCl（pH8.0）,50ミ
リモルのNaClからなる緩衝液（以後「アルカリ性ホスフ
ァターゼ緩衝液」）の100μｌ中に溶解し、そして0.2単
位のバクテリアのアルカリ性ホスファターゼ［インター
ナショナル・バイオテキノロジーズ（International Bi
otechnologies）］で65℃において１時間消化した。こ
の反応をプロテイナーゼＫを100μg/mlに添加して停止
させ、そして37℃で１時間インキュベーションし、次い
で等体積の再溶解した90％（v/v）のフェノールを添加
した。振盪後、水相を集め、そしてエーテルで抽出して
残留フェノールを除去した。DNAをエタノールで沈殿さ
せ、そして遠心により集めた。 最後に、50μｌの結合緩衝液および1000単位のT4 DNA
リガーゼ中において、KpnI＋BamHIpBUK:Stu12を脱ホス
ホリル化およびKpnI＋BglIIpBK-JL（StuI/BglII）と４
℃において一夜結合することによって、をPRV tk遺伝子
をPRV g92遺伝子中に移した。反応を前述のように停止
させ、そして前述のように、プラスミドDNAをE. col.
K12 RR1中にトランスフェクションした。候補の組換え
体プラスミドを前述の急速プラスミドスクリーニング手
順によりスクリーニングし、そしてpBUK:Stu12の0.4Kbp
のKpnI-BamHI断片を欠くが、pBK-JL（StuI/BglII）の3.
1KbpのKpnI-BglII断片の挿入を含有する19Kbpのプラス
ミドが得られた。このプラスミドをpPRVTK/STU12と表示
した。 Ｇ、pBUK:Stu12/PstIの構成 PRV g92遺伝子中に欠失をもつプラスミドを構成する
ため、PRV g92遺伝子を含有する4.0KbpのPstI断片を、
次のように、16KbpのpBUK:Stu12プラスミドからpBR322
のPstI位置中にサブクローニングした（第４図）。 2.0μｇのpBUK:Stu12を、100ミリモルのNaCL、10ミリ
モルのトリス−HCl（pH7.5）、10ミリモルのMgCl2、100
μg/mlのBSAからなる緩衝液（以後「PstI結合緩衝
液」）の100μｌ中に溶解し、そして10単位のPstI［ニ
ュー・イングランド・バイオラボラトリーズ・インコー
ポレーテッド（New England Biolabs,Inc.）］で37℃に
おいて１時間消化した。この反応をCDTAを20ミリモルに
添加し、そして65℃に30分間加熱することによって停止
させた。次いで、酢酸ナトリウムを0.1モルに添加し、
そしてDNAをエタノールで沈殿させ、そして遠心により
集めた。pBUK:Stu12の4KbpのPstI断片を、次のようにし
て、pBR322のPstI位置中にクローニングした。プラスミ
ドDNAを、0.2μｇのPstI消化および脱ホスホリル化pBR3
22［ニュー・イングランド・バイオラボラトリーズ・イ
ンコーポレーテッド（New England Biolabs,Inc.）］お
よび1000単位のT4 DNAリガーゼを含有する50μｌの結合
緩衝液中に溶解し、そして４℃で一夜インキュベーショ
ンした。この反応をEDTAを20ミリモルに添加し、そして
65℃に10分間加熱することによって停止させた。組換え
体DNAをE. col. K12 RR1中に形質転換により導入し、
そして前述のように、大きさが約8.4Kbpであり、かつpB
R322のPstI位置中に挿入されたpBUK:Stu12からの4.0Kbp
のPstI断片を含有するプラスミドについて、コロニーを
前述の急速プラスミドスクリーニング手順によりスクリ
ーニングした（第４図）。このようにして、代表的組換
え体プラスミドを分離し、そしてpBUK:Stu12/PstIと表
示した。 Ｈ、pBU:gCdlSalの構成 pBUK:Stu12/PstIの5.2〜6.3地図単位からのPRV g92遺
伝子中に1.1SalI欠失をもつプラスミドを、次のように
して構成した（第４図）。 0.25μｇのpBUK:Stu12/PstIを、150ミリモルのNaCl、
6.0ミリモルのトリス−HCl（pH7.9）、6.0ミリモルのMg
Cl2、6.0ミリモルの２−メルカプトエタノール、100μg
/mlのBSAからなる緩衝液（以後「SalI結合緩衝液」）中
に溶解し、そして1.5単位のSalI［ニュー・イングラン
ド・バイオラボラトリーズ・インコーポレーテッド（Ne
w England Biolabs,Inc.）］で37℃において１時間消化
した。次いで、この反応をCDTAを20ミリモルに添加し、
そして65℃に加熱することによって停止させた。酢酸ナ
トリウムを0.1モルに添加し、次いでDNAをエタノールで
沈殿させ、そして遠心により集めた。この手順はプラス
ミドpBUK:Stu12/PstI中に１系列の部分的SalI切断を導
入した。 次いで、部分的に消化したpBUK:Stu12/PstIを50μｌ
の結合緩衝液中に再溶解し、そして1000単位のT4 DNAリ
ガーゼの存在下に４℃で一夜インキュベーションした。
この反応をEDTAを20ミリモルに添加し、そして65℃に10
分間加熱することによって停止させた。プラスミドDAN
を、前述のように、E. col. K12 RR1の形質転換により
バクテリア中に導入し、そして前述のように、地図単位
5.2〜6.3に及ぶpBUK:Stu12/PstIの1.1Kbpの欠失を有す
るプラスミドが得られるまで、得られるコロニーを急速
プラスミドスクリーニング手順により分析した。所望の
プラスミドをpBU:gCdlSalと表示した（第４図参照）。 I.PRV（dltk）:PRVTK/STU12の構成 PRV g92遺伝子中に挿入された選択可能な遺伝子、す
なわち、機能的PRV tk遺伝子をもつ組換え体PRVを相同
組換えにより得るために、tk-PRV菌株の完全な感染性DN
Aと、PRV g92遺伝子の解読配列内の欠失中に挿入された
機能的PRV tk遺伝子を含有する雑種プラスミドと使用し
て出発することが必要であった（第５図参照）。この型
の交雑（cross）に従い得られた後代ウイルスは、tk遺
伝子の遺伝子座における相同組換えにより救出（rescu
e）された親のtk-PRVおよびtk+PRVを主として含む。g92
遺伝子中に挿入された機能的PRV tk遺伝子を含有するtk
+組換え体を得るために、次のように所望組換え体を濃
縮しかつそれについてスクリーニングすることが必要で
あった。 tk+PRVはtk-ウサギ細胞（すなわち、RAB（BU）［キッ
ト（Kit）、S.およびクアビア（Quavi）、H.ウイルス学
（Virol.）130:381-389（1983）参照］中で、生長培地
を含有するHATGの存在下に、上の交雑の後代を生長させ
ることにより濃縮した。なぜなら、HATGはtk-PRVの複製
を阻害しかつtk+PRVのアウトグロウス（outgrowth）に
好適であるからである。次いで、濃縮されたtk+PRVの集
団を分子ハイブリダイゼーションによりスクリーニング
して、PRV g92遺伝子内の欠失中に挿入された機能的PRV
tk遺伝子を有するウイルスのクローンを同定した。 前述のPRV組換えの構成のために選択した雑種プラス
ミドはpPRVK/STU12であった（第３図参照）。しかしな
がら、機能的PRV tk遺伝子またはg92遺伝子の解読配列
に隣接して、大きいまたは小さいフランキング配列を含
有するか、あるいはg92遺伝子の他の部分中に大きいま
たは小さい欠失を含有する、他の雑種プラスミドを使用
して、g92遺伝子内の欠失中に挿入された、あるいはg92
遺伝子中に直接挿入された、機能的PRV tk遺伝子をもつ
tk+組換え体をつくることができるであろう。g92遺伝子
中に欠失および／または挿入の突然変異体を構成するた
めの便利な制限ヌクレアーゼ市は、プラスミドpBUK:Stu
12/PstIのg92DNA断片の制限地図の検査から（第４図参
照）、および制限ヌクレアーゼ切断位置（下表２参照）
（g92遺伝子の解読配列を含有する2.4KbpのNcoI-Mlu DN
A断片のヌクレオチド配列から予測される）［ロビンス
（Robbins）、A.K.、ザ・ナインス・インターナショナ
ル・ヘルペスウイルス・ワークショップ（the Tenth In
ternational Herpesvirus Workshop）、ワシントン州ア
シアトル、1984年８月24-29日、における提示参照］か
ら、確認することができる。 組換え工程のために選択したtk-PRV DNAはPRV（BUK-d
l 3）（ATCC No.VR-2074）（米国特許第4,514,497号参
照）であった。PRV（BUK-dl 3）はtk遺伝子中に欠失を
含有し、そしてワクチンとして既知の優秀性をもつ菌株
であるので、前述の組換え体の構成のために他のtk PRV
ワクチン菌株よりも好ましいウイルスであった。しかし
ながら、他のtk-PRV菌株、例えば、自然tk-突然変異体
または突然変異原誘発tk-突然変異体、例えば、PRV（BU
K-5A）（ATCC No.VR-2078）（米国特許第4,514,497号参
照）を、また、本発明の精神および生長を逸脱しないで
使用することができるであろう。 PRV（BUK-dl 3）のg92遺伝子内の欠失中に挿入された
機能的PRV tk遺伝子を含有する組換え体tk+PRVの構成
は、次のように実施した。 RAB−９細胞を60mmのペトリ皿（0.2×106細胞／皿）
中に接種し、そして37℃において48時間インキュベーシ
ョンした。次いで、次の無菌溶液を順番に試験管中に添
加した： （１） 0.02mlの50μg/mlのTE緩衝液中のPRV（BUK-dl
33）DNA溶液； （２） 0.2mlの10μg/mlの雑種プラスミドpPRVK/STU12
の溶液； （３） 0.65mlの水； （４） 8.0g/lのNaCl、0.37g/lのKCl、0.125g/lのNa2H
PO4・２H2O、1.0g/lのグルコース、5.0g/lのHEPES、pH
7.05、からなる２×HEPES緩衝溶液中のサケ精子DNAの20
μg/ml溶液の1.0ml;および （５） 0.13mlの2.0モルのCaCl2。 得られる溶液を倒立により混合し、そして室温に30分
間保持し、その間DNA−リン酸カルシウムの沈殿物が形
成した。次いで、0.5mlのDNAのリン酸カルシウム沈殿物
含有懸濁液を5.0mlの生長培地に直接添加し、そして60m
mのペトリ皿中に48時間前に接種したRAB−９細胞上で平
板培養した。次いで、この培地をアスピレーションし、
そして単層を5.0mlの新しい生長培地で洗浄し、次いで
１×HEPES緩衝溶液＋15％（v/v）のグリセロールの溶液
の1.0mlを添加した。室温で３分間インキュベーション
した後、単層を培地で再び洗浄し、そして新しい生長培
地を添加した。培養物を34.5℃で、広範な細胞変性作用
は発生するまで、２日間インキュベーションした。次い
で、ウイルスを前述のように収穫し、そして−80℃で貯
蔵した。次いで、ウイルス収穫物を寒天のオーバーレイ
の下でRAB−９中で滴定した。 同時トランスフェクション（cotransfection）のウイ
ルス収穫物を融解し、超音波処理し、そしてHATGを含有
する生長培地中に希釈した。tk+PRV組換え体を濃縮する
ため、収穫したウイルスを0.01PFU/細胞のインプット
（input）多重度に希釈し、そしてHATGを補充した生長
培地中の８オンスの規格びん内のRAB（BU）細胞の全面
単層培養物中で継代培養した。37℃で１時間吸収させた
後、感染した単層培養物を、水１リットルあたり8.0gの
NaCl、0.4gの水KCl、0.1gのグルコースおよび0.02gのフ
ェノール・レッドからなる溶液（以後「CKN」）で３回
洗浄した。次いで、HATGを含有する生長培地を添加し、
インキュベーションを34.5℃で48時間続け、そしてウイ
ルスを収穫した。選択工程の風格物をRAB−９細胞で滴
定し、候補の組換え体tk+2PRVをプラークから不規則に
取り上げ、そしてウイルスのプールを調製した。この方
法で、96のtk+PRV候補組換え体が得られた。 Ｊ、分子ハイブリダイゼーションのためのプローブの調
製 PRV tk遺伝子の欠失およびPRV g92遺伝子中に欠失お
よび／または挿入をもつ候補の組換え体PRV突然変異体
を同定するために、32Ｐ標識プローブを使用する分子ハ
イブリダイゼーションの実験を実施した。これらのプロ
ーブは次の通りであった。 （１） M13mp19/BB2（KpnI-BamHI） このプローブはフファージM13mp19/BB2（KpnI-BamH
I）のRF形態のニット−トランスレーションにより調製
した。このファージのRF形態は、プラスミドpBB2の0.38
KbpのKpnI-BamHIヌクレオチド配列をファージM13mp19の
ポリクローニング部位に挿入することによって調製した
［ヤニシ−ペロン（Yanisch-Perron）、C.、ビエイラ
（Vieira）、J.およびメッシング（Messing）、J.遺伝
子（Gene）33:103-119（1985）参照］。プラスミドBB2
は、pBR322のBamHI制限位置でクローニングされたPRV
（BUK−５）BamHI−２断片を含む。0.38KbpのKpnI-BamH
I断片は、遺伝子の3'末端においてPRV g92構造遺伝子の
約1/4にまたがる。さらに詳しくは、フファージM13mp19
/BB2（KpnI-BamHI）は次のようにして調製した。 １μｇのpBB2および0.1μｇのRF DNAのM13mp19を、6.
0ミリモルのNaCl、6.0ミリモルのトリス−HCl（pH7.
5）、6.0ミリモルのMgCl2、6.0ミリモルの２−メルカプ
トエタノール、100μg/mlのBSAおよび10単位のKpnIから
なる反応混合物中で37℃においてインキュベーションし
た。１時間インキュベーションした後、1.5モルのNaC
l、60ミリモルのトリス−HCl（pH7.9）、60ミリモルのM
gCl2、1.0mg/mlのBSA、10単位のBamHIおよび100μｌと
する量の水からなる10×BamHI緩衝液の10μｌを添加し
た。次いで、この反応混合物を37℃でさらに１時間イン
キュベーションした。反応を10μｌの0.25モルのEDTA
（pH7.6）を添加し、そして65℃に10分間加熱すること
によって停止させた。この混合物をフェノール：クロロ
ホルム（１容量:1容量）で１回抽出し、そしてDNAを0.1
体積の3.0モルの酢酸ナトリウム（pH7.6）および2.2体
積のエタノールの添加により水相から沈殿させた。この
DNA沈殿物をエタノールで１回洗浄し、そして真空乾燥
した。 消化したDNAを、50ミリモルのトリス−HCl（pH7.
8）、10ミリモルのMgCl2、20ミリモルのジチオスレイト
ール、1.0ミリモルのATP、50μg/mlのBSAおよび400単位
のT4リガーゼからなる40μｌの反応混合物中で結合し
た。この反応を４℃で18時間実施し、そして160μｌのT
E緩衝液を添加し、そして65℃に10分間加熱することに
よって停止させた。得られる組換え体ファージを、前述
のように、使用してCaCl2活性化E. col. JM105バクテ
リアを形質転換し、そして挿入された0.38KbpのKpnI-Ba
mHIを含有する形質転換体についてスクリーニングし
た。次いで。ニック−トランスレイションしたプローブ
を所望のファージ、すなわち、M13mp19/BB2（KpnI-BamH
I）を次のようにして調製した。 6.0μモルのPBS、pH7.4、1.8nモルのdGTP、0.1mCiの
（α−32Ｐ）dTTP（400Ci/ミリモル）、0.1mCiの（α−
32Ｐ）dCTP（400Ci/ミリモル）［アマーシャム・コーポ
レーション（Amersham Corporation）］からなる反応混
合物の25μｌに、約1.0μｇの雑種ファージDNAを添加し
た。次いで、10ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）、5.0
ミリモルのMgCl2および100μg/mlのBSAからなる溶液の
1.0μｌ中の1.33ngのＤナーゼ（Nase）Ｉ［ウォーシン
トン・バイオケミカルズ（Worthington Biochemical
s）］を添加し、そしてこの反応混合物を室温で１分間
放置した。次に、反応混合物を5.0単位のE. col. DNA
ポリメラーゼＩ［ベーリンガー・マンハイム・バイオケ
ミカルズ（Boehringer Manneheim Biochmecals）］とと
もに、50ミリモルのリン酸カリウム緩衝液、pH7.0、2.5
ミリモルのジチオスレイトールおよび50％（v/v）のグ
リセロールからなる溶液の1.0μｌ中で14℃においてイ
ンキュベーションした。比活性が２×108cpm/μgDNAよ
り高くなったとき、すなわち、ほぼ３時間経過したと
き、この反応を0.25モルのEDTA（pH7.4）の10μｌを添
加し、そして65℃に10分間加熱することによって停止さ
せた。次いで、TE緩衝液中の5.0mg/mlの超音波処理した
サケ精子DNAを含む溶液の50μｌをこの混合物に添加
し、そしてニック−トラスレイションしたDNAをセファ
デックス（Sephdex）G50（微細）のカラムクロマトグラ
フィーにかけ、そして10ミリモルのNaCl、10ミリモルの
トリス−HCl（pH6.5）、2.0ミリモルのEDTAの溶離緩衝
液で溶離することによって精製した。 得られる32Ｐニック−トランスレイションDNAを、水
浴中で20分間沸騰させ、そして氷上で急冷した後、DNA-
DNA交雑実験におけるプローブとして使用して一本鎖DNA
を形成した［リグビイ（Rigby）、P.W.J.、ディエクマ
Ｎ（Dieckman）、M.、ロウデス（Rhodes）、G.およびベ
ルグ（Berg）、P.、ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（J. Mol. Biol.）113:237-251（1977）
参照］。 （２） pBTKプローブ このプローブを、前述のように、プラスミドpBTKのニ
ック−トラスレイションにより調製した。プラスミドpB
TKを、後述するように、EcRI-StuI断片（０〜4.8地図単
位）を欠失することによりpBK JLから誘導した。 0.25μｇのpBK JLを50μｌのStuI切断緩衝液中に溶解
し、そして２単位のStuI［ニュー・イングランド・バイ
オラボラトリーズ・インコーポレーテッド（New Englan
d Biolabs,Inc.）］で37℃において２時間消化した。次
いで、トリス−HCl（pH7.5）を100ミリモルのにあぢ
し、そしてStuI消化プラスミドを５単位のEcoRI［ニュ
ー・イングランド・バイオラボラトリーズ・インコーポ
レーテッド（New England Biolabs,Inc.）］でさらに37
℃において１時間消化した。この反応を等体積の再蒸留
した90％（v/v）のフェノールで脱蛋白質し、そして水
相を遠心により分離した。次いで、消化したプラスミド
DNAを含有する水相をエーテルで抽出し、そして0.1×TE
に対して透析し、次いで0.3モルの酢酸ナトリウム中に
移し、そしてエアノールで沈殿させた。プラスミドDNA
を遠心により集め、6.0ミリモルのトリス−HCl（pH7.
5）、1.0ミリモルのジチオスレイトール、6.0ミリモル
のMgCl2,50ミリモルのNaClからなり（以後「Hin緩衝
液」）かつ各々0.1ミリモルのdATP、dCTP、dGTPおよびd
TTPを含有する緩衝液の25μｌ中に再溶解した。次い
で、２単位のE. col. DNAポリメラーゼＩのクレノー断
片を添加し、そしてこの反応混合物を22℃で30分間イン
キュベーションした。この反応は付着EcoRI末端を満た
し、それを平滑末端に転化し、この反応を70℃に５分間
加熱することによって停止させた。等体積の２×結合緩
衝液を添加し、そして1000単位のT4DNAリガーゼを添加
し、そして４℃で一夜インキュベーションすることによ
って、複製を達成した。この反応をEDTAを20ミリモルに
添加し、そして65℃に10分間加熱することによって停止
させた。E. col. K12 RR1を複製したDNAを形質転換
し、そしてEcoRI-StuI欠失を含有する7.5Kbpのプラスミ
ドが得られるまで、前述のように、コロニーを急速プラ
スミドスクリーニング手順によりスクリーニングした。
このプラスミドをpBTKと表示した。 （３） pSalプローブ このプローブを、前述のように、プラスミドpSalのニ
ック−トラスレイションより調製した。プラスミドpSal
は、後述するように、pBUK:Stu12/PstIの1.1KbpのStuI
断片（5.2-6.3地図単位、第４図参照）をpBR322のStuI
位置にサブクローニングすることによって、pBUK:Stu12
/PstIから誘導した。 1.0μｇのpBUK:Stu12/PstIを50μｌのStuI切断緩衝液
中に溶解し、そして20単位のStuI［ニュー・イングラン
ド・バイオラボラトリーズ・インコーポレーテッド（Ne
w England Biolabs,Inc.）］で37℃において１時間消化
した。また、1.0μｇのpBR322を同一方法で処理した。
これらの反応をCDTAを20ミリモルに添加し、そして65℃
に30分間加熱することによって別々に停止させた。次い
で、StuI消化プラスミドをプールした。次に、酢酸ナト
リウムを0.1モルに添加し、そしてDNAを２体積のエタノ
ールの添加により沈殿させた。DNA遠心により集め、そ
して1000単位のT4DNAリガーゼを含む50μｌの結合緩衝
液中に再溶解した。４℃で一夜インキュベーションした
後、この反応をEDTAを20ミリモルに添加し、そして65℃
に10分間加熱することによって停止させた。E. col. K
12 RR1を結合したDNAで形質転換し、そしてAmp Tet表現
型を前述の急速プラスミドスクリーニング手順により分
析いた。pBR322のStuI−に挿入されたpBUK:Stu12/PstI
の1.1KbpのStuI断片を含有するコロニーを分離し、そし
てpSalと表示した。 （４） pBUK:Stu12/PstIプローブ このプローブは、前述のように、プラスミドpBUK:Stu
12/PstIのニック−トラスレイションにより調製した。 （５） オリゴ−006プローブ このプローブは、後述するように、オリゴヌクレオチ
ド−006の末端ヌクレオチドのポリヌクレオチドキナー
ゼでホスホリル化することによって調製した。オリゴヌ
クレオチド−006は、製造業者の支持に従って自動化DNA
合成装置［システク・インコーポレーテッド（Systec,I
nc.）］ホスホルアミダイト化学により合成し、そして
次のヌクレオチド配列を有した： ５′−GCGCCGCGCTTCGACCAGACC−３′ この配列はPRV（BUK−５）のBamHI-11断片から誘導され
た小さいSalI断片の一部であり、そしてPRV（BUK−３）
のtk遺伝子から欠失されたほぼ150bpの配列の一部であ
る（米国特許第4,514,497号参照）。 50ポコモルのオリゴヌクレオチド−006を、150Ci（γ
32Ｐ）ATP、70ミリモルのトリス−HCl（pH7.6）、10ミ
リモルのMgCl2、5.0ミリモルのジチオスレイトールおよ
び５単位not4ポリヌクレオチドキナーゼ［ニュー・イン
グランド・バイオラボラトリーズ・インコーポレーテッ
ド［New England Biolabs,Inc.）］からなる反応混合物
に添加した。この混合物を37℃で１時間インキュベーシ
ョンし、そしてこの反応をEDTAを20ミリモルに添加して
停止させ、ゲルP4［バイオーラド・インコーポレーテッ
ド（Bio-Rad,Inc,）］を使用するゲル濾過により標識オ
リゴヌクレチド−006を精製して未反応の（γ−32Ｐ）A
TPを除去した。この溶離緩衝液は、前述のセファデック
ス（Sephadex）Ｇ−50について使用したものと同一であ
った。このプローブは、すでに一本鎖であったので、使
用前に熱処理しなかＴった。 Ｋ、PRV g92遺伝子中の欠失中に挿入された機能的PRV t
k遺伝子を含有する組換え体tk+PRVの同定 前述の候補の組換え体から調製したPRV DNAを、ドッ
ト−ブロット（（dot-blot）法［ブランドスマ（Brands
ma）、J.およびミラー（Miller）、G.、プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ（Proc. Natl. Acad. Sci.）USA 77:6851-6855
（1980）参照］により分析して、BamHI−２の0.4KbpのK
pnI-BamHI断片を欠くウイルスを同定した。この断片はP
RV g92遺伝子の解読配列の一部であり、そして、前述の
ように、ファージM13mp19中でクローニングして、ファ
ージM13mp19/BB2（KpnI-BamHI）を生成した。次いで、M
13mp19/BB2（KpnI-BamHI）の二本鎖（RF）のニック−ト
ラスレイションした32−Ｐ標識プローブを、これらのド
ット−ブロット（dot-blot）、および引続くサザン・ブ
ロット、分子ハイブリダイゼーション実験においてプロ
ーブとして使用した。 詳しくは、RAB−９細胞の全面生長した単層を含有す
る、24ウェルの多ウェル組織培養トレーを、0.05mlの未
希釈の候補のウイルスで感染させ、そして34.5℃で８時
間インキュベーションした。このウイルスの接種物をア
スピレーションし、ウェルを1.0mlのGKNで洗浄し、そし
て0.2mlのNaOHを各ウェルに添加して細胞を溶解し、そ
してDNAを開放させた。室温で一夜貯蔵した後、0.3mlの
1.0モルのトリス−HCl（pH7.5）を添加し、そして0.15
モルのNaCl、0.015ミリモルのクエン酸ナトリウム、pH
7.0、からなる20×緩衝液（以後「SSC」）の0.5mlを各
ウェルに添加した。ドット−ブロット（dot-blot）分析
のため、96ウェルのシュレイヘル−シュネル（Schleich
er-Schnell）濾過装置内のニトロセルロースフィルター
を使用した。フィルターを水で洗浄し、そして１×SSC
で洗浄した後、DNA試料を添加した。DNA試料をフェルタ
ーにベーキングするために、ニトロセルロースフィルタ
ーを乾燥し、真空デシケーター内で60℃で一夜加熱し、
次いで80℃で２時間加熱した。フィルターを、50mlの３
×SSC、0.02％（w/v）のフィコール（Ficoll）、0.02％
（w/v）のBSA、0.02％（w/v）のポリビニルピロリド
ン、50μg/mlの沸騰させかつアルカリ変性したサケ精子
DNA（以後「変性デンハルト（Dehardt）溶液」、10μg/
mlのポリ（Ａ）を含有するプラスチックの密閉可能なパ
ウチに入れ、そして60℃で振盪しながら一夜インキュベ
ーションした。アルカリ性サケ精子DNAは約5.0mg/mlの
原溶液から添加した。前記原溶液は、50mgのサケ精子DN
Aを10mlの0.2NのNaOH中に溶解し、100℃で20分間加熱し
て変性し、そしてDNAを約0.4Kbpのセグメントの剪断
し、次いで0.2mlの10NのHClで中和することによって調
製した。 次いで、変性デンハルト（Dehart）溶液を、50％（v/
v）のホルムアミド、0.6モルのNaCl、0.2モルのトリス
−HCl（pH8.0）、0.02モルのEDTA、0.1％（w/v）のドデ
シル硫酸ナトリウム、50μg/mlのアルカリ変性サケ精子
DNAおよび10μg/mlのポリ（Ａ）からなるハイブリダイ
ゼーション緩衝液（以後「ハイブリダイゼーション緩衝
液」）の50mlと置換した。次に、気泡を袋から絞り出
し、次いでこれをオスター・タッチ−アーマチック・バ
ッグ・シーラー（Oster Touch-a-Mtic Bag Sealer）で
密閉し、そして振盪器上で37℃において１時間インキュ
ベーションした。 その後、約107cpmそして50ngの（32Ｐ）ニック−トラ
スレイションしてM13mp19/BB2（KpnI-BamHI）プローブ
（後述するようにして得られた）を含有する1.0mlを、
3.0mlの注射器で袋の側面のかどを通して添加した。次
に、袋を再び密閉し、そして振盪器上で48時間まで37℃
でインキュベーションしてハイブリダイゼーションさせ
た。 ハイブリダイゼーションが完結した後、袋を切断し、
そして溶液をデカンテーションした。次いで、フィルタ
ーを注意して取り出し、そして約100mlのハイブリダイ
ゼーション緩衝液＋50μg/mlの変性サケ精子DNAを含有
するトレー内に最初の洗浄のためにのみ入れたが、洗浄
液中にポリ（Ａ）は存在しなかった。フィルターを30分
間37℃でおだやかな振盪の下に５回洗浄した。次に、フ
ィルターを37℃で0.3×SSCで30分間洗浄し、次いで濾紙
上に配置して室温で一夜乾燥した。 オートラジオグラフィーのため、フィルターをサラン
ラップで覆われた１枚の薄い板紙の上に再配置し、そし
て増強スクリーを使用してフジＸフィルムに−70℃で２
時間ないし５日間露出した。96の候補のうつ１つは32Ｐ
標識M13mp19/BB2（KpnI-BamHI）プローブにハイブリダ
イゼーションせず、これによりこのハイブリダイゼーシ
ョンしないプローブはPRV g92遺伝子のKpnI-BamHI配列
中に欠失を有したことが示された。このクローンをPRV
（dltk）:PRVTK/STU12と表示する（第５図参照）。 高い純度のウイルスのDNAを、前述のように、tk+PRV
（dltk）:PRVTK/STU12から調製した。次いで、この候補
の欠失突然変異体からの0.5μｇのウイルスDNAを制限ヌ
クレアーゼ、KpnIおよびBamHI、でニュー・イングラン
ド・バイオラボトリーズ・インコーポレーテッド（New
England Biolabs,Inc.）が特定する条件下に消化し、そ
して断片を0.6％（w/v）アガロースゲルの電気泳動によ
り35ボルトの一定電圧のもとに４℃で分離した。電気泳
動緩衝液は0.04モルのトリズマ（Trizma）塩基、pH8.
1、0.03モルのNaH2PO4および0.001モルのEDTAであっ
た。親tk-PRV（BUK-dl 3）（第6A図、レーン８および16
参照）、PRV（BUK-dl 3）の誘導に使用した親tk+菌株、
すなわち、PRV（BUK-5A-R1）の制限ヌクレアーゼ断片
（第6A図、レーン７および15、、および米国特許第4,51
4,497号参照）、およびファージ・ラムダDNAのHindIII
の書家およびファージφX174RF DNAのHaeIII消化により
得られた遺伝子標識断片（第6A図、レーン１、９、17お
よび18参照）を、また、電気泳動させた。アガロースゲ
ルを電気泳動緩衝液中に溶解した0.5μg/mlの臭化エチ
ジウムで着色し、そして短い波長の紫外線照明の下に写
真撮影した。臭化エチジウムで着色したゲルは、PRV（B
UK-dl 3）の6.1KbpのKpnILＪが組換え体tk+PRV（dlt
k）:PRVTK/STU12中において消失し、そしてKpnI−G/H断
片と同時に移動する8.6Kbpのハイパーモルの（hypermol
ar）の帯と置換したことを明らかにした（第6A図、レー
ン14および16参照）。また、PRV（BUK−dl 3）の17.8Kb
pのBamHI−２断片は組換え体tk+PRV（dltk）:PRVTK/SUT
12中において消失し、そして約19.2Kbpの新規なゆっく
り移動するBamHI断片により置換された（第6A図、レー
ン６および８参照）。これらの結果はPRV g92遺伝子か
らの0.4Kbpの欠失と一感染し、そしてpBK JL（Stu/BglI
I）の3.1Kbp-KpnI断片（PRV tk遺伝子を含有する）との
置換と一致する。 アガロースゲル中で分離したDNA制限断片を、次に、
サザン・ブロッティング手順によりニトロセルロースフ
ィルター［シュレイヘル−シュネル（Schleicher-Schne
ll）］に、次の方法で、移した［サザン（Southern）,
E.M.,ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J. Mol. Biol.98:503-513（1975）参照］。 アガロースゲルを1.0モルのKOHを含有するガラスの裏
張りのトレー内に入れ、次いで、1.0モルのトリス−HCl
（pH7.0）および0.6モルのNaClを含有するガラスの裏張
りのトレー内に室温で60分間入れた。次いで、処理した
ゲルをブロット装置［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ・インコーポレーテッド（Bethesda Reseach Labor
atories,Inc.）］に移した。 ニトロセルロースフィルターを水中で10分間、次いで
20×SSC中で５分間予備湿潤させた。次に、フィルター
をゲル上に配置した。移送流体として20×SSCを使用し
て、ブロッティングを約24時間進行させた。付着性ゲル
をニトロセルロースフィルターから除去し、そしてフィ
ルターを６×SSCにすすぎ、室温で数時間乾燥し、次い
で60℃において真空デシケーター内で乾燥した。次い
で、80℃で２時間ベーキングした。ニトロセルロースフ
ィルターをデシケーターから取り出し、そしてデイゼイ
・シール−ア−ミール（Dazey Seal-a-Meal）料理用バ
ッグ内に入れた。 フィルターを、まず、前述のように、60℃において50
mlの変性デンハルト（Dehardt）溶液およびハイブリダ
イゼーション緩衝液で37℃において一夜予備処理した。 ２つの別々のゲルからのニトロセルロースフィルター
を、次に、２つの異なる32Ｐ標識ニック−トラスレイシ
ョンプローブ、すなわち、（ｉ）pBTKおよび（ii）M13m
p19/BB2（KpnI-BamHI）にハイブリダイゼーションさせ
た。プローブのニトロセルロースフィルターへの分子ハ
イブリダイゼーションの手順および洗浄工程は、前述し
たものと同一であった。 pBTKプローブはtk遺伝子全体を含有したが、PRV g92
遺伝子配列をまったく含有しなかった。pBTKプローブ
は、候補の組換え体ウイルスの特定の断片ならびに親PR
V（BUK-dl 3）のそれに対してハイブリダイゼーション
した。期待されるように、ハイブリダイゼーションはPR
V（BUK-dl 3）の6.1KbpnoKpnI-JL断片および組換え体中
の新しい8.6Kbpの断片に対して起こった。また、ハイブ
リダイゼーションはPRV（BUK-dl 3）のBamHI-11断片お
よびVBamHI−９断片の両者に対して起こった。組換え体
tk+PRV（dltk）:PRVTK/STU12に関すると、pBTKプローブ
はBamHI-11断片および新しいBamHI断片、大きさ約19.2K
bp、に対してハイブリダイゼーションした。これが立証
するように、PRV tk遺伝子は組換え体中のg92遺伝子中
に挿入された。 M13mp19/BB2（KpnI-BamHI）プローブは、PRV（BUK-dl
3）のKpnI-JLおよびBamHI−２断片に対してハイブリダ
イゼーションしたが、組換え体のいかなる断片へのハイ
ブリダイゼーションは存在せず、このことにより0.4Kbp
のKpnI-BamHI断片がPRV g92遺伝子から欠失されたこと
が示される。これらの実験から結論的に立証されるよう
に、tk+PRV（dltk）:PRVTK/STU12ウイルスは、PRV g92
遺伝子の欠失中に挿入された選択可能なg92遺伝子、す
なわち、機能的PRV tk遺伝子を有した。 Ｌ、PRV（dlg92/dltk） 相同組換えにより、PRV g92遺伝子中に欠失を、ま
た、含有するPRV（BUK-dl 3）の組換え体を得るため
に、機能的PRV tk遺伝子がPRV g92遺伝子中に挿入され
ているtk+PRV菌株の完全なDNA、およびg92遺伝子中に欠
失を含有する雑種プラスミドを使用して出発することが
必要であった（第５図参照）。この型の交雑後に得られ
た後代ウイルスは主として親tk+PRVからなる。収穫物中
のtk PRV組換え体を濃縮するために、IdUrdを含有する
選択的培地を使用した。IdUrdはtk+PRVの複製を阻害
し、そしてtk-PRVのアウトグロウスを促進する。他の選
択的培地、例えば、BdUrdおよび１−β−Ｄアラビノシ
ルチミジンを、本発明の精神および範囲を逸脱しないで
使用することができるであろう。 前述の組換え体の構成に選択した雑種プラスミドは、
pBUk:gCdlSalであった。しかしながら、PRV g92遺伝子
の解読配列に隣接して大きいまたは小さいフランキング
配列、あるいはg92遺伝子の他の部分中に大きいまたは
小さい欠失を含有する他の雑種プラスミドを、本発明の
精神および範囲を逸脱しないで使用して追加の欠失突然
変異体をつくることできるであろう。上の表２は、この
ような欠失突然変異体の構成に選択できる制限ヌクレア
ーゼ切断位置のいくつかを示す。 組換え工程のために選択したtk+PRV DNAはPRV（dlt
k）:PRVTK/STU12であった。前述のように、この菌株は
正常のtk遺伝子の遺伝子座にPRV g92遺伝子中の欠失、
および、PRV g92遺伝子中の欠失中に挿入された第２
の、完全に機能的なPRV tk遺伝子を含有する（第５図参
照）。tk+PRV（dltk）:PRVTK/STU12をpBUk:gCdlSalと交
雑することによる相同組換えは、機能的PRV tk遺伝子の
除去およびg92遺伝子中のみの欠失とのその置換を生ず
る。 g92遺伝子中の欠失をもつ組換え体tk-PRVの構成は、
次のようにして実施した。 RAB−９細胞を60mmのペトリ皿（0.2×106細胞／皿）
に接種し、そして37℃において48時間インキュベーショ
ンした。次いで、次の無菌溶液を試験管に順番に添加し
た： （１） TE緩衝液中のtk+PRV（dltk）:PRVTK/STU12の50
μg/mlの溶液の0.02ml; （２） PstI消化プラスミドpBUk:gCdlSalの10μg/mlの
溶液の0.2ml。PstI消化プラスミドは次のようにして得
た。10μｇのpBUk:gCdlSalを500μｌのPstI切断緩衝液
中に溶解し、次いでこのプラスミド20単位のPstIで37℃
において１時間消化し、次いでこの反応混合物をプロテ
イナーゼＩ（EMサイエンス）とともに100μg/mlで37℃
において１時間インキュベーションした。この反応混合
物を等体積のフェノールとともに渦形成し、相分離のた
めに遠心し、そして0.1×TE緩衝液に対して透析した。 （３） 0.65mlの水； （４） 8.0g/lのNaCl、0.37g/lのKCl、0.125g/lのNa2H
PO4、1.0g/lのグルコース、5.0g/lのHEPES、pH7.05から
なる２×HEPES緩衝溶液中のサケ精子DNAの20μg/ml溶液
の1.0ml;および （５） 0.13mlの2.0モルのCaCl2。 得られる溶液を倒立により混合し、そして室温に30分
間保持し、その間DNA−カルシウム沈殿物が形成した。
次いで、DNAのカルシウム沈殿物を含有する懸濁液の0.5
mlを5.0mlの生長培地に直接添加し、そして60mmのペト
リ皿中に48時間前に接種したRAB−９細胞上で平板培養
した。細胞を37℃において５時間インキュベーションし
た。次いで、培地をアスピレーションし、そして単層を
5.0mlの新しい生長培地ですすぎ、次いで１×HEPES緩衝
液＋15％（v/v）のグリセロールの溶液の1.0mlを添加し
た。室温で３分間インキュベーションした後、この溶液
をアスピレーションし、単層を再び培地ですすぎ、次い
で新しい生長培地を添加した。広範な細胞変性作用が起
こるまで、培養物を34.5℃において２日間インキュベー
ションした。ウイルスの収穫物を前述のようにつくり、
そして−80℃で貯蔵した。次いで、ウイルスの収穫物を
寒天のオーバーレイの下にRAB−９細胞で滴定した。 同時トランスフェクションからのウイルスの収穫物を
融解し、超音波処理し、そして100μg/mlのIdUrdを補充
した生長培地中で希釈した。tk-PRV組換え体を濃縮する
ために、ウイルスの収穫物を0.1PFU/細胞のインプット
多重度に希釈し、そして100μg/mlのIdUrdを補充した生
長培地中で８オンスの規格びんないでRAB（BU）／細胞
のサブコンフルエント（suconfluent）単層培養におい
て継代培養した。37℃において１時間インキュベーショ
ンした後、感染した単層培養物をGKNで３回洗浄した。
次いで、100μg/mlのIdUrdを含有する生長培地を添加
し、インキュベーションを34.5℃において48時間続け、
そしてウイルスの収穫物をつくった。この選択工程の収
穫物をRAB−９細胞中で滴定し、候補の組換え体tk-PRV
をプラークから不規則にピックアップし、そしてウイル
スのプールを調製した。このようにして、96のtk-g92-P
RV候補の組換え体が得られた。 Ｍ、tk遺伝子およびg92遺伝子の両者中の欠失をもつ組
換え体tk-g92-PRV突然変異体の同定 前述の候補の組換え体から調製したウイルスのDNA
を、前述のように、ドット−ブロット（dot-blot）法に
より分析して、PRV g92遺伝子の1.1KbpのSalI配列およ
びPRVg92遺伝子のほぼ150bpのSacI−Ｃ配列の両者を欠
失する組換え体を同定した（米国特許第4,514,497号参
照）。96の候補の組換え体からのウイルスDNAの組成抽
出物を溶解した細胞から調製し、そしてニトロセルロー
スシートを使用する濾過により吸収した。乾燥後、加熱
によりDNAをフィルターに固定し、そして前述のよう
に、変性デンハルト（Dehardt）溶液で予備処理し、フ
ィルターを前述の32Ｐ標識pSalプローブを含有するハイ
ブリダイゼーション緩衝液中に配置した。ハイブリダイ
ゼーションおよびフィルターの洗浄音痴、ニトロセルロ
ースフィルターを乾燥し、そしてＸフィルムに対して露
出した。候補の組換え体のほぼ1/3はプローブにハイブ
リダイゼーションすることができず、これによりg92遺
伝子の大部分を含有するpSalの1.1KbpのSalI断片中に存
在する配列はこれらの組換え体ウイルス中に存在しない
ことが示される。クローン２を不規則に選択し、そして
PRV（dlg92/dltk）と表示した。このウイルスはアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（American T
ype Culture Collection）に受託番号VR-2116で受託さ
れた。 高い純度のウイルスDNAを、前述のように、調製し、K
pnIおよびBamHIで消化し、次いで断片をアガロースゲル
の電気泳動により分離した。臭化エチジウムで着色した
ゲルは、KpnI−Ａ断片が約5KP結合だけより大きい断片
と置換されたこと（第6A図、レーン10〜13参照）および
8.6KbpのKpnI-G/Hと一緒に移動するtk+PRV（dltk）:PRV
TK/STU12のハイパーモルの帯（第6A図、レーン14参照）
がもはや存在しないことを明らかにした。tk+PRV（dlt
k）:PRVTK/STU12の19.2KbpのBamHI−２断片（第6A図、
レーン６参照）は組換え体中にそんざせず、そしてBamH
I−３断片の一緒に移動するハイパーモルの帯（16.7Kb
p）と置換された（第6A図、レーン２〜５参照）。ま
た、tk+PRV（dltk）:PRVTK/STU12において消失したBamH
I−９断片は再び出現した。これらの結果は、tk+PRV（d
ltk）:PRVTK/STU12のPRV g92遺伝子の試料した断片中に
挿入された機能的PRV tk遺伝子を置換したPRV g92遺伝
子からの1.1KbpのSalI断片の欠失と一致する（第５図参
照）。 電気泳動後、上のゲルのサザン・ブロットを、前述の
ように、（ｉ）32Ｐ標識オリゴー006、（ii）32Ｐ標識p
BUK:Stu12/PstI、そして（iii）前述の32Ｐ標識pSalIに
対してハイブリダイゼーションしたが、ただしオリゴー
006のためのハイブリダイゼーション緩衝液は35％（v/
v）のホルムアルデヒド、0.6モルのNaCl、0.2モルのト
リス−HCl（pH8.0）、0.02モルのEDTA、0.1％（w/v）の
ドデシル硫酸ナトリウム、50μg/lのアルカリ変性サケ
精子DNAおよび10μg/mlのポリ（Ａ）であり、そして最
後の洗浄は６×SSC中で実施した。 次の結果が、これらのオートラジオグラフィーの実験
から得られた： （１） オリゴー006プローブは、PRV（BUK-5A-R1）のK
pnI-JLおよびBamHI断片（米国特許第4,514,497号参照）
に対してハイブリダイゼーションし、そしてPRV（dlt
k）:PRVTK/STU12の8.6KbpのKpnIおよび19.2KbpのBamHI
断片（これらの両者は完全な機能的PRV tk遺伝子を含有
する）に対してハイブリダイゼーションするが、tk-欠
失突然変異体、PRV（BUK-dl 3）およびPRV（dlg92/dlt
k）に対してハイブリダイゼーションしなかった。この
ことから立証されるように、候補の組換え体、PRV（dlg
92/dltk）と表示する（クローン２、３、８および10）
はPRV（BUK-dl 3）から前に欠失されたPRV tk遺伝子の
同一のほぼ150bpの配列を欠いた。 （２） 32P-pBUK:Stu12/PstIプローブは、期待するよ
うに、PRV（BUK-5A-R1）およびPRV（BUK-dl 3）のBamHI
−２、BamHI−９、KpnI-JLおよびKpnI−Ａの断片に対し
てハイブリダイゼーションした（第6B図参照）。このプ
ローブは組換え体PRV（dlg92/dltk）ウイルスのもとのK
pnI-JLまたはKpnI−Ａ断片に対してハイブリダイゼーシ
ョンしなかったが、その代わり、KpnI−ＡおよびKpnI-J
L（欠失）断片の融合から生ずる、新しい34.2Kbpの断片
にハイブリダイゼーションした（第５図および第6B図参
照）。同様に、pBUK:Stu12/PstIプローブは、親BamHI−
２からの1.1KbpのSalI配列の欠失から生ずる、新しい1
6.7KbpのBamHI−２断片に対してハイブリダイゼーショ
ンした。 （３） 32P-pSalIプローブは、PRV（BUK-5A-R1）、PRV
（BUK-dl 3）のBamHI−２、KpnI−ＪLおよびKpnI−Ａ断
片、およびPRV（dltk）:PRVTK/STU12の新しい34.2Kbpの
KpnIおよび19.2KbpのBamHI断片に対してのみハイブリダ
イゼーションした（第５図および第6C図参照）。しかし
ながら、このプローブは候補のPRV（dlg92/dltk）ウイ
ルスの断片にまったくハイブリダイゼーションしなかっ
た（第6C図参照）。 上の結果が照明するように、PRV（dlg92/dltk）組換
え体は、PRV tk遺伝子中にほぼ150bpの欠失およびPRV g
92遺伝子中にほぼ1.1Kbpの欠失をもつ、二重の突然変異
体である。 実施例２ PRV菌株のTK活性 PRV g92の欠失および／または挿入の突然変異体の表
現型、すなわち、PRV（dlg92/dltk）およびPRV（dlt
k）:PRVTK/STU12（第５図参照）を分析するため、感染
した細胞のオートラジオグラフィーを次のようにして実
施した。 RAB（BU）細胞を８ウェルのLab-Tek反応（マイルス・
ラボラトリーズ・インコポーレーテッド）のスライド中
に接種（50,000/ウェル）し、そして37℃で全面生長ま
で１〜２日間インキュベーションした。細胞を約10PFU/
細胞において、親ウイルス菌株PRV（BUK−５）およびPR
V（BUK-dl 3）で、あるいは組換え体ウイルス、PRV（dl
tk）:PRVTK/STU12およびPRV（dlg92/dltk）で感染させ
た。37℃において１時間吸収させた後、新しい生長培地
を添加した。感染後３時間に、生長培地を5.0μCiの3H-
dThd/ml、0.1μg/mlのdThdを含む新しい生長培地と交換
した。感染後20時間に、培地を分離し、そして細胞１×
GKN、メタノールですすぎ、次いで室温においてメタノ
ール中で固定した。ウェルおよびガスケットをスライド
から除去し、そして細胞を４℃において、5.0％（w/v）
のトリクロロ酢酸（２回）、70％（v/v）のエタノール
（３回）、および100％のエタノール（２回）の各々で
５分間洗浄した。空気中で乾燥した後、スライドを2.0
％（w/v）の酢酸−オルセイン中で２分間着色し、次い
でエタノール中で変性した。スライドをオートラジオグ
ラフィー写真乳剤（コダック−NTB2）中に40℃で浸漬
し、そして水平位置で１時間乾燥した。次いで、スライ
ドをドリエライト（drierite）を含む暗箱内に入れ、そ
して室温において20時間放置した。スライドをコダック
・デクトールで16℃において２分間現像し、水中で10秒
間すすぎ、コダック・フィクサー中で５分間定着し、そ
して各回2.5分間水中ですすいだ。 PRV（BUK−５）、すなわち、tk+PRV、で感染させたす
べての細胞において、核はPRV TK酵素による3H-dThdの
ホスホリル化、および引続く3H-dTTPの酸不溶性核のDNA
中の組込みのために強く標識された。同様に、PRV（dlt
k）:PRVTK/STU12で感染させたすべての細胞において、
核は3H-dThdで強く標識された。このことにより機能的P
RV tk遺伝子はPRV g92遺伝子中に挿入されたことが立証
される。この結果は、この組換え体ウイルスがHATG培地
で選択されたので、期待されたものである。期待される
ように、PRV（BUK-dl 3）およびPRV（dlg92/dltk）は、
ウイルスの生長のために、感染された細胞において顕著
な細胞変性作用を生成せず、これらのウイルスで感染さ
れた細胞の核は、3H-dThdをホスホリル化する機能的TK
酵素が存在しないので、標識されなかった。こうして、
これらの実験が立証するように、PRV（dlg92/dltk）はt
k-PRVであり、そしてPRV（dltk）:PRVTK/STU12はtk+PRV
であった。 前述のオートラジオグラフィー実験に加えて、PRV委
した細胞からの細胞質ゾル抽出物ヲ3H-dThd−ホスホリ
ル化活性についてアッセイして、TK誘発活性を欠くPRV
（dlg92/dltk）を評価した。これらの実験は前述のよう
にして実施した［米国特許第4,514,497号、およびキッ
ト（Kit）、S.、キット（Kit）、M.およびパートル（Pi
rtle）、E.C.、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリ
ナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）46:1359-136
7（1985）参照］。結果を下表３に示す。 上の表３が示すように、（ｉ）モック感染したRAB（B
U）細胞、すなわち、tk-細胞、は無視できるTK活性を有
する；（ii）TK活性はtk+ウイルス、RPV（BUK−５）で
感染後にRAB（BU）細胞によって獲得される；しかし、
（iii）はTK活性は突然変異体ウイルス、PRV（dlg92/dl
tk）によっては獲得されない。こうして、PRV（BUK-dl
3）と同様に、PRV（dlg92/dltk）ウイルスはtk-PRVであ
る。 実施例３ PRV菌株の温度抵抗性 RAB−９細胞の複製、サブコンフルエンス（subconflu
ent）単層培養物を、約0.1PFU/細胞のインプット多重度
において、PRV（BUK-dl 3）またはPRV（dlg92/dltk）で
感染し、そしてCO2インキュベーター内で30℃、34.5℃
および39.1℃においてインキュベーションした。34.5℃
で感染後５時間において、ウイルスの収穫物をつくっ
て、ウイルス菌株の吸収および浸透直後に存在する感染
性ウイルスの量を決定した。ウイルスの収穫物を、ま
た、34.5℃および39.1℃においてウイルスの感染後43〜
54時間に、および30℃においてウイルスの感染後91〜11
5時間につくった（表４参照）。広範な細胞変性作用は
収穫時間において観測された。次いで、ウイルスの収穫
物を、米国特許第4,514,497号に記載されるようにし
て、RAB−９細胞中で34.5℃および39.1℃において滴定
した。結果を下表４に示す。 上の表４が立証するように、PRV（BUK-dl 3）は39.1
℃において34.5℃におけるのとほぼ同じ力価に複製した
（それぞれ、約３×108および６×108PFH/ml）。30℃の
インキュベーションから感染後91時間で調製した収穫物
は約８×107PFU/mlの力価を有し、これにより効率よい
ウイルスの複製が、また、30℃において起こったことが
示される。有意には、これらの力価はウイルスの収量に
ついてアッセイするためのプラールの滴定を34.5℃ある
いは39.1℃において実施するかどうかを無関係に観察さ
れた。 表４が示すように、PRV（dlg92/dltk）はPRV（BUK-dl
3）よりゆっくり複製し）、そしてPRV（dlg92/dltk）
による細胞の感染後に得られる力価は、PRV（BUK-dl
3）による細胞の感染後に得られる力価よりも多少低か
った。しかしながら、PRV（dlg92/dltk）による効率よ
い複製は30℃、34.5℃および39.1℃において観測され
た。同様に、ウイルスの収穫物のプラーク滴定アッセイ
が立証するように、プラーク滴定を34.5℃または39.1℃
において実施するかどうかに無関係に、ほぼ同一の力価
が測定された。これらの結果から明瞭に示されるよう
に、PRV（BUK-dl 3）およびPRV（dlg92/dltk）の両者は
温度抵抗性であり、そして広い範囲の温度、特定的には
30℃〜39.1℃またはそれより高い温度にわたって効率的
に複製することができる。 実施例４ PRV（dlg92/dltk）でワクチン接種したブタにおける特
異的抗体の生産および保護の研究 PRV（dlg92/dltk）で感染した細胞中でつくられるPRV
特異的糖蛋白質を分析するために、およびこれらの糖蛋
白質を他のウイルス菌株で感染させた細胞中でつくられ
る糖蛋白質と比較するために、PRV（dlg92/dltk）−特
異的抗血清（以後「Ｃ型抗血清」）を得ることが必要で
あった。これはブタ、WP2およびBP2を、下の詳述するよ
うに、PRV（dlg92/dltk）で免疫化することによって達
成した。引続いて、これらの２種類の免疫化ブタをヴィ
ルレントPRV（Ind−Ｆ）に対して対抗暴露し、そして対
抗後の抗血清（以後「Ｄ型抗血清」）を下に詳述するよ
うに集めた。このようにして、PRV（dlg92/dltk）蛋白
質のみによって誘発された抗体および，また、ヴィルレ
ントPRVによって誘発されるが、PRV（dlg92/dltk）によ
って誘発されない、追加の抗体、すなわち、抗g92抗体
を得ることが可能であった。さらに、このパイロット研
究はPRV（dlg92/dltk）のワクチンウイルスの安全性お
よび効能の評価を可能とした。 Ｃ型抗血清はブタWP2、すなわち、生後６週間の去勢
した雄、およびブタBP2、すなわち、雌ブタから生産し
た。２種類のブタはヨークシャイヤーＸヅロク（Duro
c）Ｘランドレイス（Landrace）Ｘハンプシャイヤーの
交雑（cross）であり、各々は11.4kgの体重であり、そ
して別々の室内で機構制御した環境において収容した。
ニップル（Nipple）水供給装置により水を自由に与え、
そして16％の商用豚飼料を自己供給装置により毎日与え
た。ブタWP2およびBP2のワクチン接種前の抗血清は、抗
PRV中和性抗体に対して陰性であった。 第１日に、両者のブタに2.0ml（４×108PFU/ml）のPR
V（dlg92/dltk）を首の筋肉中において接種した。ワク
チン接種後の期間において、ブタの食欲は低下せず、そ
して悪い反応は観察されなかった。 12日後に、両者のブタに同一投与量のPRV（dlg92/dlt
k）を首の筋肉中においてワクチン接種し、そして第２
の血清試料を採取した。この時PRV中和力価は1:4であっ
た。第２回目のワクチン接種後の期間において、ブタの
食欲は低下せず、そして悪い反応は観察されなかった。
14日後、血清試料を再び採取し、そしてこの後者の血清
をＣ型抗血清と表示した。 Ｃ型抗血清の収集と同時に、両者のブタを約３×108P
FUのPRVのヴィルレントInd−Ｆ菌株に対して首の筋肉に
おいて筋肉内対抗暴露した。16日後に、血清試料を採取
し、そしてＤ型抗血清と表示した。この実験の51日の期
間において、悪い反応は認められかった。雌ブタおよび
去勢した雄ブタは、実験の終りにおいて、それぞれ、4
1.4kgおよび34.6kgの体重であった。体重の増加を通常
の速度で起こり、そして両者のブタは精力さかんであり
かつ健康であった。 こうして、PRV（dlg92/dltk）は、PRV g92遺伝子中の
欠失にかかわらず、PRV（BUK-dl 3）の前に照明した保
護的性質を保持した［キット（Kit）、S.、キット（Ki
t）、M.およびパーソル（Pirtle）、E.C.、アメリカン
・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am.
J. Vet. Res.）46:1359-1367（1985）；キット（Ki
t）、S.、キット（Kit）、M.、ラウホーン（Lawhor
n）、B.およびマクコンネル（McConnel）、ウイルスの
ワクチンへの高い技術の道筋（High-Technology Route
to Virus Vaccines）、ドレースマン（Dreesma
n）、G.R.、ブロンソン（Bronson）、J.G.およびケネデ
ィー（Knnedy）、R.C.（アメリカン・ソサイアティー・
オブ・マイクロバイオロジー、ワシントン、D.C.）、82
-99ページ（1985）参照］。 実施例５ PRV−感染細胞中で合成されたマンノース標識糖蛋白質 （Ａ） 細胞抽出物らのマンノース標識糖蛋白質の免疫
沈殿 PRV案のいくつかの型をこれらの実験において使用し
た：（ｉ）PRV（BUK-dl 3）でワクチン接種したブタか
らのＡ型抗血清；（ii）PRV（BUK-dl 3）でワクチン接
種し、そして引続いてPRVの高度にヴィルレントのInd−
Ｆ菌株に対して対抗暴露させたブタからのＢ型抗血清；
（III）PRV（dlg92/dltk）でワクチン接種したブタから
のＣ型抗血清；（iv）PRV（dlg92/dltk）でワクチン接
種し、そして引続いてPRVの高度にヴィルレントのInd−
Ｆ菌株に対して対抗暴露させたブタからのＤ型抗血清；
（ｖ）PRVで自然に感染した家畜のブタからのＥ型抗血
清；（vi）PRVで自然に感染した野性のブタからのＦ型
抗血清：および（vii）PRV gp82にと反応する、マウス
ハイブリドーマ細胞から誘導された、PRVモノクローナ
ル抗体からなるＧ型抗血清。 Ｂ型、Ｄ型、Ｅ型およびＦ型の抗血清は、tk+PRV野外
菌株の主要な糖蛋白質のすべてと反応する。Ａ型の抗血
清は、gIを除外したtk+PRV野外菌株の主要な糖蛋白質の
すべてと反応する［メッテンレイター（Mettenleite
r）、T.C.、ルーカクス（Lukacs）、N.およびルジハ（R
ziha）、H.J.ウイルス学雑誌（J. Virol.）53:52-57
（1985）参照］。この理由は、前述のように、PRV（BUK
-dl 3）はgIを生産しないブカレスト（Bucharest）菌株
から誘導されることにある。Ｃ型の抗血清は、gIおよび
g92を除外したtk+PRV野外菌株の主要な糖蛋白質のすべ
てと反応する。この理由は、前述のように、PRV（dlg92
/dltk）はgIを生産しないPRV（BUK-dl 3）から誘導さ
れ、そしてPRV（dlg92/dltk）は、PRV g92遺伝子中の操
作された欠失のため、g92を生産しないことにある。そ
れゆえ、Ｃ型抗血清は、後述するように、PRV（dlg92/d
ltk）でワクチン接種したブタを、他のブカレスト（Buc
harest）菌株、例えば、PRV（BUK−５）、PRV（BUK-dl
3）またはPRV（Norden）DEワクチン接種されたブタと区
別するために有用である。 Ａ型およびＢ型の抗血清を、それぞれ、ブタNo.103お
よびNo.106、すなわち、生後６週のブタ、から生産し
た。ブタはランドレイス（Landrace）Ｘハンプシャイヤ
ーの交雑（cross）であり、そして別々の室内で機構制
御した環境において収容した。ブタNo.103およびNo.106
からのワクチン接種前の血清は、抗PRV中和性抗体に対
して陰性であった。 第１日に、ブタNo.103に1.25ml（４×108PFU/ml）のP
RV（BUK-dl 3）を首の筋肉中において接種した。13日後
に、No.103に同一ウイルス調製物を投与し、そしてブタ
No.106を最初に1.5mlの同一ウイルス調製でワクチン接
種した。ブタNo.103についてのPRV中和力価はこの時1:4
であった。14日後、すなわち、最初のワクチン接種後27
日に、ブタNo.103を放血させたＡ型抗血清を採取した。
この時、PRV中和力価は1:64であった。同一の日に、ブ
タNo.106を約７×108PFU/mlのPRVのヴィルレントInd−
Ｆ菌株に対して鼻内に対抗暴露した。ブタNo.106の対抗
暴露後10日に、ブタNo.106から血清試料を採取し、そし
てＢ型抗血清と表示した。PRVの中和力価は1:256であっ
た［キット（Kit）、S.、キット（Kit）、M.およびパー
トル（Pirtle）、E.C.、アメリカン・ジャーナル・オブ
・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）46:
1359-1367（1985）参照］。 Ｃ型およびＤ型の抗血清を前述のようにして誘導され
た。 Ｅ型抗血清はE.C.パートル（Pirtle）、ウイルス学研
究所（Virological Reseach Laboratiory）、ナショナ
ル・アニマル・ディシーズ・センター（National Anima
l Disease Center）、アイオワ州エイムス、から入手し
た。 抗血清No.6−１、３−36決定５−29は、アイオワ州に
おけるパッキング・プラント（Packing plant）におい
て個々のブタから得た。これらの抗血清は、ミクロ免疫
拡散テスト（MIDT）により決定したとき、PRV抗体に対
して陽性であった［MIDT手順について、グーテクンスト
（Gutekunst）、D.E.、パートル（Pirtle）、E.C.およ
びメンゲリング（Mengeling）、W.L.、アメリカン・ジ
ャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. V
et. Res.）39:207-210（1978）参照］。パッキング・
プラント（Packing plant）において屠殺したブタのほ
ぼ10％はPRVについて血清陽性であり、それゆえ、前にP
RVで自然に感染していた。これらの血清のウイルス中和
性抗体の力価は決定しなかった。 Ｆ型抗血清はロバート（Robert）A.クランデル（Cran
dell）博士、テキサス・ベテリナリー・メディカル・ダ
イアグノスチック・ラボラトリー（Texas Veterinary M
edical Diagnostic Laboratory）、テキサス州カレッジ
・ステーション、によって提供された。この抗血清は、
イースト・テキストのオークションマーケットで販売さ
れたパイニー・ウッド・ルーター（Piney Wood roote
r）ブタを放血することによって採取した。放血を実施
したPRV抗体の発生を決定され、それゆえ、この区域の
野生ブタはPRVで自然に感染されていた［キット（Ki
t）、S.、キット（Kit）、M.、ラウホーン（Lawhor
n）、B.およびマクコンネル（McConnel）、ウイルスの
ワクチンへの高い技術の道筋（High-Technology Route
to Virus Vaccines）、ドレースマン（Dreesma
n）、G.R.、ブロンソン（Bronson）、J.G.およびケネデ
ィー（Knnedy）、R.C.（アメリカン・ソサイアティー・
オブ・マイクロバイオロジー、ワシントン、D.C.）、82
-99ページ（1985）参照］。1:4〜1:64の範囲のウイルス
中和力価をもつ６種類の異なる野生ブタからの抗血清を
分析された。 Ｇ型抗血清はR.A.ファン・デウセン（van Deusen）、
生物ウイルス学研究所（Bilogic Virology Laborator
y）、ナショナル・ベテリナリー・サービス研究所（Nat
ional Veterinary Service Laboratory）米国農務省、
アイオワ州エイエム、から入手した。このは抗血清はPR
V（IND−Ｆ）に対して生産された抗gp82−２モノクロー
ナル抗体のクローン3G9-F2（マウスIgM）であった［ワ
ーゼン（Wathen）、L.M.K.、プラット（Platt）、V.
B.、ワーゼン（Wathen）、M.W.、バン・デウセン（van
Deusen）、R.A.、ウェットストーン（Whetstone）、C.
A.およびパートル（Pirtle）、E.C.、ウイルスの研究
（Virus Research）4:19-29（1985）参照］。 弱毒ワクチンまたはヴィルレントPRV菌株で感染した
細胞中につくられるPRV特異的糖蛋白質を得るために、
４オンスの規格びん内のRAB−９細胞の全面生長培養物
を、種々のPRV菌株で約20PFU/細胞のインプット多重度
で感染させた。ウイルスを37℃において15分毎におだや
かに攪拌しながら１時間吸収させた。次いで、2.0％（w
/v）の透析した（PBS緩衝液に対して）胎児子牛血清を
補充した5.0mlの生長培地を添加した。10％（w/v）より
はむしろ2.0％（w/v）の低下した濃度で透析した胎児子
牛血清を使用すると、標識前駆体、例えば、35Ｓ−チミ
ジンおよび3Ｈ−マンノースまたは3−グルコサミンのウ
イルス−特異的蛋白質および糖蛋白質への組込みが促進
され、かつ内因性非標識代謝物による放射性代謝物の希
釈が減少する。PRV免疫細胞を、感染後５時間まで、34.
5℃においてインキュベーションした。この細胞を標識
するために、培地を除去し、細胞の単層をグルコース不
含培地で洗浄し、そして100μCiの3Ｈ−マンノース
（［アマシャム・コーポレーション（Amersham Corpora
tion）］を含有する生長培地を添加した。Ｃ。を感染後
24時間まで34.5℃においてインキュベーションし、その
時培地をアスピレーションにより除去し、細胞をGKNで
洗浄し、次いで1.0％（w/v）のNP40（非イオン性洗
剤）、0.9％（w/v）のNaCl、0.0625モルのトリス−HCl
（pH7.0）からなるノニデト（Nonidet）P40−抽出緩衝
液の０、4mlを、おだやかにかきまぜながら、５分間添
加した。次いで、細胞を−80℃で凍結し、融解し、そし
て超音波により崩壊させた。蛋白質抽出物を−80℃で貯
蔵した。 免疫沈殿のため、70μｌの各抽出物を30μｌのＡ型、
Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型またはＦ型の抗血清に添加し、
次いでこの混合物を４℃で16〜20時間インキュベーショ
ンした。次いで、150μｌのパンソービン（Pansorbin）
［プロテインA;カルビオケム（Calbiochem）］を添加し
て抗原−抗体複合体を吸収し、そしてこの混合物を４℃
で45分間インキュベーションした。ソーバル（Sorval
l）遠心機のSS34ローター中で9,000rpmで遠心した後、
上澄みを除去し、そいてPBS＋0.05％（v/v）のツイーン
20からなる沈殿物を洗浄緩衝液中に再懸濁させた。沈殿
物の遠心および洗浄を３回反復し、そして、最後に、沈
殿を60μｌの蒸留水中に再懸濁させた。0.0625モルのト
リス−HCl（pH6.8）、0.3％（w/v）のドデシル硫酸ナト
リウム、0.5％（v/v）の２−メルカプトエタノール、10
％（v/v）のグリセロールおよび0.001％（w/v）のブロ
モフェノール・ブルーからなる緩衝液Ｄの30μｌを添加
し、そしてこの混合物を２分間沸騰させ、そして使用す
るまで−80℃で貯蔵した。 モノクローナル抗体をgp82−２を使用する免疫沈殿の
場合において、90μｌの各抽出物を10μｌのＧ型抗血清
（IgM）に添加し、そしてこの混合物を４℃で20時間イ
ンキュベーションした。次いで、50％（v/v）のグリセ
ロール中の抗マウスポリクローナルＹ血清の1.0mg/mlの
溶液［カーケガード・アンド・ラボラトリーズ・インコ
ーポレーテッド（Kirkegaard and Perry Laboratories
Inc.）］の30μｌを添加し、そしてインキュベーション
を４℃において20時間続けた。次いで、165μｌのパン
ソービン（Pansorbin）（プロテインＡ）を添加した。
この手順の残部は前述したものと同一であった。 次に、試料を、後述するように、変性条件下にSDS−
ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により分析した。 （１） 次の成分からなる５×電気泳動緩衝液： （ａ） 144gのグリSN（カルビオケム）； （ｂ） 30gのトリズマ（Trizma）［シグマ・ケミカル
・カンパニー（Sigma Chemical Co.）］； （ｃ） 5.0gのドデシル硫酸ナトリウム。 （２） 次の成分からなる3.0％（w/v）のポリアクリル
アミドスタッキングゲル： （ａ） 3.17mlのＨ2O; （ｂ） 1.25mlの上のトリス緩衝液（４×0.5モルのト
リス−HCl（pH6.8）、0.4％（w/v）のドデシル硫酸ナト
リウム）； （ｃ） 0.5mlのアクリルアミド：ビスアクリルアミド
（30:0.8w/w）； （ｄ） 75μｌの2.0％（w/v）の過硫酸アンモニウム
（バイオラド・ラブ）；および （ｅ） 5.0μｌのTEMED（シグマ・ケミカル・カンパニ
ー）。 （３） 次の成分からなる10％（w/v）のポリアクリル
アミドの展開ゲル： （ａ） 12mlのＨ2O; （ｂ） 7.5mlの下のトリス緩衝液（４×1.5モルのトリ
ス−HCl（pH8.8）＋0.4％（w/v）のドデシル硫酸ナトリ
ウム）； （ｃ） 10mlの0.5mlのアクリルアミド：ビスアクリル
アミド（30:0.8w/w; （ｄ） 0.6mlの２％（w/v）の過硫酸アンモニウム； （ｅ） 15μｌのTEMED;および （ｆ） 0.5mlの50％（v/v）のグリセロール。 100μｌの緩衝液Ｄ中の3Ｈ−マンノース−標識試料
を、1.5mmの厚さのラエムリ（Laemmli）ゲルに適用し、
そして一定電圧において16時間室温で電気泳動させた
［ラエムリ（Laemmli）、U.K.、ネイチャー（Nature）2
27:680-685（1970）参照］。ゲルを固定し、そして50％
（v/v）のメタノール、10％（w/v）の酢酸および0.015
％（w/v）のクマッシー・ブルーからなる決定で室温に
おいて30分間着色させ、次いで10％（v/v）の酢酸およ
び10％（v/v）のメタノールからなる溶液室温において
２時間で脱色した。次いで、ゲルをEn3Hance ｛ニュー
・イングランド・ニュークリアー・プロダクツ（New En
gland Nuclear Products）］で室温において１時間処理
し、そして蒸留水で30分間洗浄した。次いで、ゲルを乾
燥し、そして直接オートラジオグラフィーに−70℃にお
いて１〜５日間かけ、ここでフジＸ線フィルムおよびラ
イティング＋増強スクリーン［クロネクス・スクリーン
（Cronex screen）；イー・アイ・デュポン・デ・ネモ
アス・アンド・カンパニー・インコーポレーテッド（E.
I.de Nemours and Co.,Inc.）］を使用した。 次の結果が得られた： （１） 正常の（放血前）ブタの血清（NS）はPRV免疫
細胞の抽出物から3Ｈ−マンノース−レク糖蛋白質を沈
殿させなかった（第7A図および第7B図参照）。 （２） Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型およびＦ型の、
抗血清はモック−免疫細胞から3Ｈ−マンノース−レク
糖蛋白質を沈殿させなかった（データは示されていな
い）。 （３） Ｂ型（第7A図、レーン１参照）、Ｄ型、Ｅ型お
よびＦ型の抗血清は、ヴィルレントtk+PRV（I11）−感
染細胞から、見掛け分子量が約116,000〜130,000ダルト
ン（PRV gIIaおよびgI）、約92,000〜98,000ダルトン
（PRV gIIIおよびgIV）、74,000（PRV gIIb）、62,000
（PRV gV）および58,000ダルトン（PRV gIIc）の高度に
3Ｈ−マンノース−標識された糖蛋白質、および分子量
が約40,000ダルトンの軽度に3Ｈ−マンノース−標識さ
れた糖蛋白質を免疫沈殿させた。これらの結果は他の研
究者により得られた結果に類似する［ハンプル（Hamp
l）、H.、ベン−ポラト（Ben-Plrat）、T.、エールリハ
ー（Ehrliher）、L.、ヘイバーメール（Habermehl）、
K.O.およびカプラン（Kaplan）、A.S.、ウイルス学雑誌
（J. Virol.）52:583-590（1984）；ルカクス（Lukac
s）、N.、チール（Thiel）、H.J.、メッテンレイター
（Mettenleiter）、T.C.およびリザ（Rhiza）、H.J.、
ウイルス学雑誌（J. Virol.）53:166-173（1985）；お
よびロビンス（Robbins）、A.K.、ワイス（Weis）、J.
H.、エンクイスト（Enquist）、L.W.およびワトソン（W
atoson）、R.J.、ジャーナル・オブ・モレキュラー・ア
ンド・アプライド・ジェネチックス（J. Mol. Appl.
Genet.）2:485-496（1984）参照］。 （４） PRV（BUK−５）およびPRV（BUK-dl 3）感染細
胞の場合において、Ｂ型（第7A図、レーン５および第7B
図、レー９参照）およびＤ型、Ｅ型およびＦ型の抗血清
は同様な3Ｈ−マンノース−標識糖蛋白質を沈殿させた
が、ただし分子量が同様な約116,000〜130,000ダルトン
である帯は、KpnI−Ｉ欠失のためPRVのブカレスト（Buc
harest）誘導菌株で感染した細胞にgIが存在しないの
で、gIを多分含有しない。 （５） PRV（dlg92/dltk）感染細胞の抽出物から、Ｂ
型の抗血清により（第7B図参照）、Ｄ型、Ｅ型およびＦ
型の抗血清により沈殿した糖蛋白質は、PRV（BUK−５）
およびPRV（BUK-dl 3）感染細胞から沈殿したものに類
似するが、ただしこれらの抗血清は92,000〜98,000ダル
トンの糖蛋白質、すなわち、gIIIを沈殿させることがで
きなかった。さらに、Ｂ型抗血清はPRV（dltk）:PRVTK/
STU12感染細胞のマンノース標識抽出物から92,000〜98,
000ダルトンの糖蛋白質を沈殿させなかった。 （６） tk-PRV（BUK-dl 3）のワクチン接種したブタか
ら得られた、Ａ型抗血清により沈殿した3Ｈ−マンノー
ス標識蛋白質のパターンは、Ｂ型、Ｄ型、Ｅ型およびＦ
型の抗血清で観察されるものに一般に類似したが、ただ
し分子量が約116,000〜130,000ダルトンである帯の標識
はtk+PRV（I11）免疫細胞からの免疫沈殿物中において
減少した。これは期待された結果である。なぜなら、PR
V（BUK-dl 3）でワクチン接種したブタはgIに対する抗
体の誘発に欠けるからである。また、gIを含有するPRV
（I11）からの抽出物を免疫沈殿に使用したとき、gV（6
2,000）帯対gIIc（58,000）帯の標識の比が抗血清のす
べてについて増加した（第7A図、レーン１〜３とレーン
13〜15との比較）は注目するに値する。これは、gIおよ
びgVが非共有結合の糖蛋白質の複合体の一部であるとい
う観察と一致する。 （７） 有意には、tk-PRV（dlg92/dltk）でワクチン接
種したブタから得られたＣ型抗血清は主要な分子量92,0
00〜98,000の糖蛋白質の本質的にいずれをも沈殿させな
かった（第7A図、レーン３および７および第7B図、レー
ン11および15参照）。しかしながら、tk+PRV（Ind−
Ｆ）で前もってワクチン接種したブタの対抗暴露後に得
られたＤ型抗血清は、期待されるように、主要な分子量
92,000〜98,000の糖蛋白質を沈殿させなかった。 （８） これらの結果が明瞭に示すように、tk-PRV（dl
g92/dltk）は、下において照明するように、gIIIに相当
する主要な分子量92,000〜98,000の糖蛋白質を合成する
とき欠けた。同様に、PRV（dltk）:PRVTK/STU12は主要
な分子量92,000〜98,000の糖蛋白質を合成するとき欠け
た。これらの２種類の蛋白質はPRVのブカレスト（Bucha
rest）菌株から誘導されたので、また、gIの合成におい
て欠けた。それゆえ、tk-PRV（dlg92/dltk）でワクチン
接種したブタはgIIIおよびgIに対する抗体をつくること
ができなかった。こうして、tk-PRV（dlg92/dltk）でワ
クチン接種したブタからの抗血清は、ヴィルレントtk+P
RV菌株で感染したブタの抗血清から、してgIIIを発現す
るブカレスト（Bucharest）、バーサ（Birtha）およびN
IA−４ワクチンでワクチン接種したブタから、区別され
うる。 （Ｂ） 分画したマンノース標識糖蛋白質の免疫沈殿 PRV感染細胞中につくられた個々の糖蛋白質（または
糖蛋白質複合体）を分離しかつ研究するために、9.6×1
06のRAB−９細胞を約30PRFU/細胞のtk+PRV（I11）菌株
で感染させ、そして前述のように、感染後3Ｈ−マンノ
ースで５〜24時間標識した。次に、ノニデット（Nonide
d）P40抽出物を、前述のように、調製した（合計の体積
1.6ml）。次いで、1.0mlの抽出物をPBS中の連続の５％
〜15％（w/v）スルロース勾配の10.2mlの上の層状に
し、そしてスピンコ（Spinco）遠心装置のベックマン
（Beckman）SW41ローター中で32,000rpmにおいて４℃で
20時間遠心した。各々約0.4mlの29の分画を遠心機の管
の底から集めた。20μｋのアリコートを直径24mmのワッ
トマン（Whatman）GF/Aディスク・フィルター上にスポ
ッティングし、５％（w/v）のトリクロロ酢酸で各10分
間２回洗浄し、エタノールで１回洗浄し、80℃で30分間
乾燥し、次いで液体シンチレーション・スペクトロメー
ターで計数して、3Ｈ−マンノース標識細胞およびウイ
ルスの糖蛋白質を捜した。スルロース勾配の重い側に対
して斜めになる放射性帯が、分画14〜27において見出さ
れた。放射性帯のピークは分画23中に発見された。この
ことから予測されるように、gI、gIV、gVおよびp115を
含む非共有結合の糖蛋白質複合体、ならびにgIIa、gIIb
およびgIIcを含む供給結合した複合体は放射性帯の重い
スクロース分画中に見出され、そして、共有結合および
非共有結合の複合体、すなわち、gI＋gIV＋gV＋p115お
よびgIIa＋gIIb＋gIIcはgIIIよりも大きい凝集体である
ので、gIIIは標識ピークの軽いスクロース分画中に見出
されるであろう［ハンプル（Hampl）、H.、ベン−ポラ
ト（Ben-Plrat）、T.、エールリハー（Ehrliher）、
L.、ヘイバーメール（Habermehl）、K.O.およびカプラ
ン（Kapln）、A.S.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）52:
583-590）1984）参照］。多くの大きさの細胞の蛋白質
は、また、ピークの種々の部分中に存在することがあ
る。それゆえ、免疫沈殿の分析およびSDS−ポリアクリ
ルアミドゲルの電気泳動の分析を実施して、異なるPRV
糖蛋白質の位置を研究し、かつそれらを細胞の糖蛋白質
と区別した。 スクロース勾配の分画14〜27からのPRV（I11）抗体の
120μｌから成るアリコートを60μｌのＢ型抗血清に添
加し、そしてこの混合物を４℃で16〜20時間インキュベ
ーションした。アリコートを、また、60μｌのＣ型抗血
清に添加し、そしてこの混合物を４℃で16〜20時間イン
キュベーションした。次いで、270μｌのパンソービン
（Pansorbin）を添加して抗原−抗体複合体を吸収し、
そしてこの懸濁液を４化合物で45分間インキュベーショ
ンした。得られた混合物を、前述のように、遠心し、洗
浄し、そして緩衝液Ｄで抽出した。次いで、SDS-PAGE分
析を、前述のように、実施した。Ｂ型抗血清で沈殿した
抗原の場合において、SDS−ポリアクリルアミドゲルの
分析により、スクロース勾配の分画14〜19は116,000〜1
30,000、98,000、74,000、62,000および58,000ダルトン
の3Ｈ−スクロース標識帯を含有することが明らかにさ
れ、このことにより非共有結合および共有結合の糖蛋白
質複合体がこれらの分画中に存在すしたことが示され、
分画21〜27は分子量約92,000〜98,000ダルトンをもつ放
射性の単一の主要な帯を示した。低分子量のいくつかの
淡い帯も認められた。こうして、分画21〜27は非複合糖
蛋白質、gIIIから主としてなっていた。 スクロース分画中の抗原をＣ型抗血清で沈殿させると
き、むしろ異なる結果が得られた。分画14〜19は使用Ｈ
−マンノース標識蛋白質の帯を示し、これにより、期待
されるように、gIIa、gIIb、gIIc、gIVおよびgVの存在
が示された。しかしながら、分画20〜27は、gIIIを表わ
す、3Ｈ−マンノース標識92,000〜98,000ダルトンの分
子量の基をまったく示さなかった。これらの結果から明
らかなように、g92糖蛋白質はtk-PRV（dlg92/dltk）感
染細胞中に存在せず、そしてg92糖蛋白質は前にgIIIま
たはgBと表示された糖蛋白質に外使用する［ハンプル
（Hampl）、H.、ベン−ポラト（Ben-Plrat）、T.、エー
ルリハー（Ehrliher）、L.、ヘイバーメール（Habermeh
l）、K.O.およびカプラン（Kaplan）、A.S.、ウイルス
学雑誌（J. Virol.）52:583-590）1984）；ルカクス
（Lukacs）、N.、チール（Thiel）、H.J.、メッテンレ
イター（Mettenleiter）、T.C.およびリザ（Rhiza）、
H.J.、ウイルス学雑誌（J. Virol.）53:166-173）198
5）参照］。 感染をその特定の実施態様を参照して詳述してきた
が、明らかなように、本発明の精神および範囲を逸脱し
ないで種々の変更および変化が可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヴィルレント偽狂犬病ウイルス菌株のDNAに
ついてのBglII、BamHIおよびKpnI制限ヌクレアーゼ地図
を示す。ゲノムの独特の短い（ＵS）区域に境界を確定
された逆位反復（IRS）および末端反復（TRS）区域が示
されている。さらに、ゲノムの独特の長い（ＵL）区域
が示されている。 第２図は、例えば、本発明において使用するプラスミド
pBK-JLおよびpBK-JL（StuI/BglII）の誘導を概略的に示
す。すなわち、PRV（BUK−７）KpnI-JL断片（第１図参
照）はプラスミドpMAR-Kpnの独特KpnI位置（1.6地図単
位９でクローン化してプラスミドpBK-JLを生産した。プ
ラスミドpMAR-KpnプラスミドpMAR420の誘導体である
［オーツカ（Otsuka）、H.、ヘイゼン（Hazen）、M.、
キット（Kit）、M.、クアビ（Quavi）、H.およびキット
（Kit）、M.、ウイルス学（Virol.）113:196-213（198
1）参照］。黒色の棒および実線は、それぞれ、pBR322
およびヘルペスウイルス・タマリヌス（Herpesvirus t
amarinus）ヌクレオチド配列を表わす。次いで、pBK-JL
プラスミドをStuI制限位置で切断し、そしてBglIIリン
カーをこの位置に結合してpBK-JL（Stu/BglII）を生成
する。 第３図は、例えば、プラスミドpRRVTK/STU12の誘導化を
概略的に示す。すなわち、pBK-JL（StuI/BglII）プラス
ミド（第２図参照）をBglIおよびKpnIで切断して3.1Kbp
のKpnI-BglII（StuI）断片（4.8-7.9地図単位）を切出
し、次いでこれをプラスミドpBUK:Stu12中に挿入して
（第４図参照）プラスミドpRRVTK/Stu12を生成した。pR
RVTK/STU12プラスミドは、PRVg92遺伝子の解読配列中に
挿入されたpBK-JLからのPRV tk遺伝子を含有する。pBU
K:Stu12の誘導化は第４図に記載されている。 第４図は、例えば、プラスミドpBUK/BglII−Ｂ、pBUK:S
tu12、pBUK:Stu12/PstIおよびpBUK/gCdlSalの誘導化を
概略的に示す。プラスミドpBUK/BglII−Ｂは、PRV（BUK
−７）の31.6KbpのBglII断片（第１図参照）をpBR322の
BamHI位置でクローニングすることによって構成した。
次に、BglIIリンカーをプラスミドpBUK/BglII−ＢのStu
I位置（約11および21地図単位）に付加し、次いで得ら
れるBglII/StuI断片を他のpBR322のBamHI位置に移して
プラスミドpBUK:Stu12を生成した。プラスミドpBUK:Stu
12をPstIで切断し、そしてPRV g92遺伝子を含有する4.0
KbpのPstI断片をpBR322のPstI位置に移してプラスミドp
BUK:Stu12/PstIを生成した。最後に、1.1KbpのStuI断片
（5.2-6.3の地図単位）をプラスミドpBUK:Stu12/PstIの
g92遺伝子から欠失してプラスミドpBUK:gCdlSalを生成
した。 第５図は、tk-PRV（BUK-dl 3）およびtk+PRV（dltk）:P
RVTK/STU12、すなわち、プラスミドPRVTK/STU12およびt
k-PRV（BUK-dl 3）の組換え体から分離されたウイル
ス、の感染性DNAのPRV g92およびtk遺伝子の区域中のBa
mHIおよびKpnI制限断片を示す。また、プラスミドpBUK:
Stu12/PstIおよびtk+PRV（dltk）:PRVTK/STU12の間の組
換えによって形成された、tk-PRV（slg92/dltk）のBamH
IおよびKpnI制限断片が示されている。PRV g92遺伝子か
ら欠失された1.1KbpのStuI断片は、PRV（BUK-dl 3）のB
amHI−２断片より上に示されている。tk-delおよび11
（dl）は、ほぼ150bpの配列がtk+PRV（BUK−５）のBamH
I-11断片から欠失されてtk-PRV（BUK-dl 3）が形成した
ことを示す。tk+PRV（dltk）:PRVTK/STU12を形成するた
めに、PRVTK/STU12の3.1KbpのKpnI-StuI/BglII断片を組
換えによりtk-PRV（BUK-dl 3）のBamHI−２断片中に挿
入すると同時に、BamHI−２の0.4KbpのKpnI−BamHI断片
を欠失させた。この組換えは、図示するように、tk+PRV
（dltk）:PRVTK/STU12中に新しいKpnIおよびBamHI制限
位置を発生した。本発明のtk-PRV（dlg92/dltk）ワクチ
ンは、BamHI-11断片中のtk遺伝子中のほぼ150bpの欠失
およびBamHI−２中の1.1KbpのStuIの欠失を有し、これ
は、また、KpnI位置を排除しかつKpnI−ＡおよびKpnI-J
L断片を融合する。 第6A図は、親および組換え体PRV（Bucharest）菌株から
のBamHI−およびKpnI−消化DNAの臭化エチジウム着色ア
ガロースゲル断片を示す。レーン２および10、３および
11、４および13および５および13は、それぞれ、クロー
ン10、８、３および２を示す。これらのクローンは、g9
2およびtk遺伝子中に欠失をもつ、候補の組換え体tk-PR
V（dlg92/dltk）ワクチンである。レーン７および15に
おけるtk+PRV（BUK-SA-R1）、レーン８および16に示すt
k-欠失突然変異体PRV（BUK-dl 3）の構成において使用
した親ウイルスである［キット（Kit）、S.、キット（K
it）、M.およびパートル（Pirtle）、E.C.、アメリカン
・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am.
J. Vet. Res.）46:1359-1367（1985）および米国特許
第4,514,497号参照］。レーン６および14は、tk+組換え
体PRV（dltk）:PRVTK/STU12を示す（第５図参照）。レ
ーン１および18は、内部遺伝標識として使用した、Cla
切断プラスミドpMAR4（13.4Kbp）、pAGO（6.4Kbp）およ
びPMH110（4.4Kbp）を示す［キット（Kit）、S.、クア
ビ（Qavi）、H.、ダッブス（Dubbs）、D.R.およびオー
ツカ（Otsuka）、H.J.,Med. Virol.、12:25-36（198
3）参照］。レーン９および17は、HindIIIラムダファー
ジおよびHaeIIIφX174ファージ遺伝標識断片を示す。 第6B図は、第6A図中に示すPRV菌株のDNA断片に対する32
Ｐ標識のpBUK:Stu12/PstIプローブの分子交雑を示すオ
ートラジオグラフを示す。 第6C図は、第6A図中に示すPRV菌株の特異的DNA断片に対
する32Ｐ標識pSAIプローブの分子交雑を示すオートラジ
オグラフを示す。 第7A図および第7B図は、異なるPRV特異的抗血清を使用
する免疫沈殿、SDS−ポリアクリルアミド（7.5％）上の
電気泳動およびオートラジオグラフィー後の、PRV感染R
AB−９細胞からの3Ｈ−マンノース標識蛋白質を示す。
培養物を約20PFU/細胞の入力多重度で感染させ、そして
感染後５〜24時間からのグルコース不含培地中で34.5℃
において3Ｈ−マンノースで標識した。感染に利用したP
RV菌株は、次の通りであった：ヴィルレントのイリノイ
ス（Illinois）菌株、tk+PRV（I11）（第7A図、レーン
１〜４）、親tk+PRV（BUK−５）（第7A図、レーン５〜
８）、tk-欠失突然変異体、PRV（BUK-dl 3）（第7B図、
レーン９〜12）、および組換え体tk-g92-欠失突然変異
体、PRV（dlg92/dltk）（第7B図、レーン13〜16）。Ａ
型抗血清はPRV（BUK-dl 3）で２回ワクチン接種した
が、ヴィルレントウイルスに対抗暴露しなかったブタN
o.103からものであった。Ｂ型抗血清はtk-PRV（BUK-dl
3）でワクチン接種し、次いでワクチン接種後14日にヴ
ィルレントtk+PRV（Ind−Ｅ）に対して対抗暴露し、最
後に、ヴィルレントウイルスに対抗暴露後２週に放血さ
せて、放血後血清を得たブタNo.106からのものであった
［キット（Kit）、S.、キット（Kit）、M.およびパート
ル（Pirtle）、E.C.、アメリカン・ジャーナル・オブ・
ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）46:13
59-1367（1985）参照］。Ｃ型血清はtk-PRV（dlg92/dlt
k）でワクチン接種したブタWP2から得た。第7A図および
第7B図において、レーン４、８、12および16は、抽出物
と正常（予備放血）ブタ血清（NS）との反応を示す。分
子量を表面呈するために使用したマーカー蛋白質は、ミ
オシン（205,000）、ベーターガラクトシダーゼ（116,0
00）、ホスホリラーゼ（97,000）、ウシ血清アルブミン
（66,000）、オバルブミン（45,000）および炭酸脱水酵
素（29,000）［シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma
Chemical Co.）］であった。
ついてのBglII、BamHIおよびKpnI制限ヌクレアーゼ地図
を示す。ゲノムの独特の短い（ＵS）区域に境界を確定
された逆位反復（IRS）および末端反復（TRS）区域が示
されている。さらに、ゲノムの独特の長い（ＵL）区域
が示されている。 第２図は、例えば、本発明において使用するプラスミド
pBK-JLおよびpBK-JL（StuI/BglII）の誘導を概略的に示
す。すなわち、PRV（BUK−７）KpnI-JL断片（第１図参
照）はプラスミドpMAR-Kpnの独特KpnI位置（1.6地図単
位９でクローン化してプラスミドpBK-JLを生産した。プ
ラスミドpMAR-KpnプラスミドpMAR420の誘導体である
［オーツカ（Otsuka）、H.、ヘイゼン（Hazen）、M.、
キット（Kit）、M.、クアビ（Quavi）、H.およびキット
（Kit）、M.、ウイルス学（Virol.）113:196-213（198
1）参照］。黒色の棒および実線は、それぞれ、pBR322
およびヘルペスウイルス・タマリヌス（Herpesvirus t
amarinus）ヌクレオチド配列を表わす。次いで、pBK-JL
プラスミドをStuI制限位置で切断し、そしてBglIIリン
カーをこの位置に結合してpBK-JL（Stu/BglII）を生成
する。 第３図は、例えば、プラスミドpRRVTK/STU12の誘導化を
概略的に示す。すなわち、pBK-JL（StuI/BglII）プラス
ミド（第２図参照）をBglIおよびKpnIで切断して3.1Kbp
のKpnI-BglII（StuI）断片（4.8-7.9地図単位）を切出
し、次いでこれをプラスミドpBUK:Stu12中に挿入して
（第４図参照）プラスミドpRRVTK/Stu12を生成した。pR
RVTK/STU12プラスミドは、PRVg92遺伝子の解読配列中に
挿入されたpBK-JLからのPRV tk遺伝子を含有する。pBU
K:Stu12の誘導化は第４図に記載されている。 第４図は、例えば、プラスミドpBUK/BglII−Ｂ、pBUK:S
tu12、pBUK:Stu12/PstIおよびpBUK/gCdlSalの誘導化を
概略的に示す。プラスミドpBUK/BglII−Ｂは、PRV（BUK
−７）の31.6KbpのBglII断片（第１図参照）をpBR322の
BamHI位置でクローニングすることによって構成した。
次に、BglIIリンカーをプラスミドpBUK/BglII−ＢのStu
I位置（約11および21地図単位）に付加し、次いで得ら
れるBglII/StuI断片を他のpBR322のBamHI位置に移して
プラスミドpBUK:Stu12を生成した。プラスミドpBUK:Stu
12をPstIで切断し、そしてPRV g92遺伝子を含有する4.0
KbpのPstI断片をpBR322のPstI位置に移してプラスミドp
BUK:Stu12/PstIを生成した。最後に、1.1KbpのStuI断片
（5.2-6.3の地図単位）をプラスミドpBUK:Stu12/PstIの
g92遺伝子から欠失してプラスミドpBUK:gCdlSalを生成
した。 第５図は、tk-PRV（BUK-dl 3）およびtk+PRV（dltk）:P
RVTK/STU12、すなわち、プラスミドPRVTK/STU12およびt
k-PRV（BUK-dl 3）の組換え体から分離されたウイル
ス、の感染性DNAのPRV g92およびtk遺伝子の区域中のBa
mHIおよびKpnI制限断片を示す。また、プラスミドpBUK:
Stu12/PstIおよびtk+PRV（dltk）:PRVTK/STU12の間の組
換えによって形成された、tk-PRV（slg92/dltk）のBamH
IおよびKpnI制限断片が示されている。PRV g92遺伝子か
ら欠失された1.1KbpのStuI断片は、PRV（BUK-dl 3）のB
amHI−２断片より上に示されている。tk-delおよび11
（dl）は、ほぼ150bpの配列がtk+PRV（BUK−５）のBamH
I-11断片から欠失されてtk-PRV（BUK-dl 3）が形成した
ことを示す。tk+PRV（dltk）:PRVTK/STU12を形成するた
めに、PRVTK/STU12の3.1KbpのKpnI-StuI/BglII断片を組
換えによりtk-PRV（BUK-dl 3）のBamHI−２断片中に挿
入すると同時に、BamHI−２の0.4KbpのKpnI−BamHI断片
を欠失させた。この組換えは、図示するように、tk+PRV
（dltk）:PRVTK/STU12中に新しいKpnIおよびBamHI制限
位置を発生した。本発明のtk-PRV（dlg92/dltk）ワクチ
ンは、BamHI-11断片中のtk遺伝子中のほぼ150bpの欠失
およびBamHI−２中の1.1KbpのStuIの欠失を有し、これ
は、また、KpnI位置を排除しかつKpnI−ＡおよびKpnI-J
L断片を融合する。 第6A図は、親および組換え体PRV（Bucharest）菌株から
のBamHI−およびKpnI−消化DNAの臭化エチジウム着色ア
ガロースゲル断片を示す。レーン２および10、３および
11、４および13および５および13は、それぞれ、クロー
ン10、８、３および２を示す。これらのクローンは、g9
2およびtk遺伝子中に欠失をもつ、候補の組換え体tk-PR
V（dlg92/dltk）ワクチンである。レーン７および15に
おけるtk+PRV（BUK-SA-R1）、レーン８および16に示すt
k-欠失突然変異体PRV（BUK-dl 3）の構成において使用
した親ウイルスである［キット（Kit）、S.、キット（K
it）、M.およびパートル（Pirtle）、E.C.、アメリカン
・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am.
J. Vet. Res.）46:1359-1367（1985）および米国特許
第4,514,497号参照］。レーン６および14は、tk+組換え
体PRV（dltk）:PRVTK/STU12を示す（第５図参照）。レ
ーン１および18は、内部遺伝標識として使用した、Cla
切断プラスミドpMAR4（13.4Kbp）、pAGO（6.4Kbp）およ
びPMH110（4.4Kbp）を示す［キット（Kit）、S.、クア
ビ（Qavi）、H.、ダッブス（Dubbs）、D.R.およびオー
ツカ（Otsuka）、H.J.,Med. Virol.、12:25-36（198
3）参照］。レーン９および17は、HindIIIラムダファー
ジおよびHaeIIIφX174ファージ遺伝標識断片を示す。 第6B図は、第6A図中に示すPRV菌株のDNA断片に対する32
Ｐ標識のpBUK:Stu12/PstIプローブの分子交雑を示すオ
ートラジオグラフを示す。 第6C図は、第6A図中に示すPRV菌株の特異的DNA断片に対
する32Ｐ標識pSAIプローブの分子交雑を示すオートラジ
オグラフを示す。 第7A図および第7B図は、異なるPRV特異的抗血清を使用
する免疫沈殿、SDS−ポリアクリルアミド（7.5％）上の
電気泳動およびオートラジオグラフィー後の、PRV感染R
AB−９細胞からの3Ｈ−マンノース標識蛋白質を示す。
培養物を約20PFU/細胞の入力多重度で感染させ、そして
感染後５〜24時間からのグルコース不含培地中で34.5℃
において3Ｈ−マンノースで標識した。感染に利用したP
RV菌株は、次の通りであった：ヴィルレントのイリノイ
ス（Illinois）菌株、tk+PRV（I11）（第7A図、レーン
１〜４）、親tk+PRV（BUK−５）（第7A図、レーン５〜
８）、tk-欠失突然変異体、PRV（BUK-dl 3）（第7B図、
レーン９〜12）、および組換え体tk-g92-欠失突然変異
体、PRV（dlg92/dltk）（第7B図、レーン13〜16）。Ａ
型抗血清はPRV（BUK-dl 3）で２回ワクチン接種した
が、ヴィルレントウイルスに対抗暴露しなかったブタN
o.103からものであった。Ｂ型抗血清はtk-PRV（BUK-dl
3）でワクチン接種し、次いでワクチン接種後14日にヴ
ィルレントtk+PRV（Ind−Ｅ）に対して対抗暴露し、最
後に、ヴィルレントウイルスに対抗暴露後２週に放血さ
せて、放血後血清を得たブタNo.106からのものであった
［キット（Kit）、S.、キット（Kit）、M.およびパート
ル（Pirtle）、E.C.、アメリカン・ジャーナル・オブ・
ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）46:13
59-1367（1985）参照］。Ｃ型血清はtk-PRV（dlg92/dlt
k）でワクチン接種したブタWP2から得た。第7A図および
第7B図において、レーン４、８、12および16は、抽出物
と正常（予備放血）ブタ血清（NS）との反応を示す。分
子量を表面呈するために使用したマーカー蛋白質は、ミ
オシン（205,000）、ベーターガラクトシダーゼ（116,0
00）、ホスホリラーゼ（97,000）、ウシ血清アルブミン
（66,000）、オバルブミン（45,000）および炭酸脱水酵
素（29,000）［シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma
Chemical Co.）］であった。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ.
73，（1982），Ｐ．193−198
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．g92遺伝子中の欠失、挿入、または欠失および挿入
の両者の結果、抗原g92ポリペプチドを生産することが
できない偽狂犬病ウイルス。 ２．前記偽狂犬病ウイルスはg92遺伝子中の欠失の結果
抗原g92ポリペプチドを生産することができない特許請
求の範囲第１項記載の偽狂犬病ウイルス。 ３．前記欠失は約10〜1500bpの大きさである特許請求の
範囲第１項記載の偽狂犬病ウイルス。 ４．前記欠失は約75〜200bpの大きさである特許請求の
範囲第３項記載の偽狂犬病ウイルス。 ５．前記挿入は約８〜5000bpである特許請求の範囲第１
項記載の偽狂犬病ウイルス。 ６．前記偽狂犬病ウイルスは、また、tk遺伝子中の突然
変異の結果、機能的TKを生産することができない特許請
求の範囲第１項記載の偽狂犬病ウイルス。 ７．tk遺伝子中の前記突然変異は欠失突然変異である特
許請求の範囲第６項記載の偽狂犬病ウイルス。 ８．前記偽狂犬病ウイルスは、また、gI遺伝子中の突然
変異の結果、機能的gIを生産することができない特許請
求の範囲第１項記載の偽狂犬病ウイルス。 ９．前記偽狂犬病ウイルスは、また、温度抵抗性である
特許請求の範囲第１項記載の偽狂犬病ウイルス。 １０．前記ウイルスはPRV（dlg92/dltk）（ATCC No.VR-
2116）の同定特性を有する特許請求の範囲第１項記載の
偽狂犬病ウイルス。 １１．前記偽狂犬病ウイルスは凍結乾燥されている特許
請求の範囲第１項記載の偽狂犬病ウイルス。 １２．工程： （１） クローニングベクターと偽狂犬病ウイルスg92
遺伝子の実質的にすべておよびそのフランキング配列を
含有するDNA断片とを含んでなる雑種プラスミドを構成
し、 （２） 機能的選択可能な遺伝子を暗号化するDNA断片
を、工程（１）の得られた雑種プラスミドの偽狂犬病ウ
イルスg92遺伝子の中に挿入し、こうして機能的選択可
能な遺伝子を偽狂犬病ウイルスg92遺伝子のDNA配列によ
ってフランキングし、 （３） 選択可能な遺伝子の生産物を生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスからの感染性DNAをもつ工程
（２）の雑種プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞
の中に同時トラスフェクションし、そしてg92遺伝子中
の挿入の結果抗原g92ポリペプチドを生産することがで
きない偽狂犬病ウイルス突然変異体を生産するために、
選択可能な遺伝子の生産物を生産する偽狂犬病ウイルス
組換え体について選択する、 を含んでなることを特徴とする方法によって生産され
た、g92遺伝子中の挿入の結果抗原g92ポリペプチドを生
産することができない偽狂犬病ウイルス。 １３．前記挿入は約８〜5000bpである特許請求の範囲第
12項記載の偽狂犬病ウイルス。 １４．工程（３）の得られる突然変異体がg92遺伝子中
の挿入の結果抗原g92ポリペプチドを生産することがで
きずかつtk遺伝子中の突然変異の結果機能的TKを生産す
ることができないように、工程（３）の感染性DNAは機
能的TKを生産することができない偽狂犬病ウイルス突然
変異体から誘導される特許請求の範囲第12項記載の偽狂
犬病ウイルス。 １５．機能的TKを生産することができない偽狂犬病ウイ
ルス突然変異体は、tk遺伝子中の欠失の結果、それを生
産することができない特許請求の範囲第14項記載の偽狂
犬病ウイルス。 １６．前記偽狂犬病ウイルス突然変異体はPRV（BUK-dl
3）である特許請求の範囲第15項記載の偽狂犬病ウイル
ス。 １７．前記偽狂犬病ウイルス突然変異体は、また、gI遺
伝子中の突然変異の結果、gIを生産することができない
特許請求の範囲第12項記載の偽狂犬病ウイルス。 １８．工程（３）の得られる突然変異体が、g2遺伝子中
の挿入の結果、抗原g92ポリペプチドを生産することが
できない温度抵抗性偽狂犬病ウイルス突然変異体である
ように、工程（３）の感染性DNAは温度抵抗性偽狂犬病
ウイルスから誘導される特許請求の範囲第12項記載の偽
狂犬病ウイルス。 １９．工程（４）： （４） g92遺伝子中の挿入の結果、抗原g92ポリペプチ
ドを生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウイル
ス突然変異体を選択しかつ生産するために、工程（３）
の得られる偽狂犬病ウイルスを温度感受性ウイルスに対
して非許容性温度において増殖する、 をさらに含む特許請求の範囲第12項記載の偽狂犬病ウイ
ルス。 ２０．前記クローニングベクターはpBR322、pBR325、pK
H47、pBR328、pHC79、ファージ・シャロン28、pKB11、p
KSV-10およびpMAR420から成る群より選択される特許請
求の範囲第12項記載の偽狂犬病ウイルス。 ２１．前記クローニングベクターはpBR322である特許請
求の範囲第20項記載の偽狂犬病ウイルス。 ２２．工程（２）の得られる雑種プラスミドはpPRVTK/S
tu12である特許請求の範囲第12項記載の偽狂犬病ウイル
ス。 ２３．前記選択可能な遺伝子は、tk遺伝子、トランスポ
ゾンTn5遺伝子および大腸菌（E，coli）lacZ遺伝子から
成る群より選択される特許請求の範囲第12項記載の偽狂
犬病ウイルス。 ２４．前記選択可能な遺伝子はtk遺伝子である特許請求
の範囲第23項記載の偽狂犬病ウイルス。 ２５．前記tk遺伝子は、HSV-1tk遺伝子、HSV-2tk遺伝
子、マーモセットのヘルペスウイルスtk遺伝子、ニワト
リtk遺伝子、ヒトtk遺伝子および偽狂犬病ウイルスtk遺
伝子から成る群より選択される特許請求の範囲第24項記
載の偽狂犬病ウイルス。 ２６．前記tk遺伝子は偽狂犬病ウイルスtk遺伝子である
特許請求の範囲第25項記載の偽狂犬病ウイルス。 ２７．前記偽狂犬病ウイルスは凍結乾燥されている特許
請求の範囲第12項記載の偽狂犬病ウイルス。 ２８．工程： （１） クローニングベクターと偽狂犬病ウイルスg92
遺伝子の実質的にすべておよびそのフランキング配列を
含有するDNA断片とを含んでなる雑種プラスミドを構成
し、 （２） 機能的選択可能な遺伝子を暗号化するDNA断片
を工程（１）の得られた雑種プラスミドの偽狂犬病ウイ
ルスg92遺伝子の中に挿入し、こうして機能的選択可能
な遺伝子を偽狂犬病ウイルスg92遺伝子のDNA配列によっ
てフランキングし、 （３） 選択可能な遺伝子の生産物を生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスからの感染性DNAをもつ工程
（２）の雑種プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞
の中に同時トラスフェクションし、そして選択可能な遺
伝子の生産物を生産することができない偽狂犬病ウイル
スについて選択し、 （４） g92遺伝子の実質的にすべてより少なくが存在
し、同時に欠失の各側に隣接して偽狂犬病ウイルスDNA
が保持されるように、工程（１）の雑種プラスミドから
DNA配列を欠失し、 （５）g92遺伝子中の欠失の結果抗原g92ポリペプチドを
生産することができない偽狂犬病ウイルス突然変異体を
生産するために、工程（３）の選択した偽狂犬病ウイル
スからの感染性DNAをもつ工程（４）の得られる雑種プ
ラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞の中に同時トラ
スフェクションし、そして選択可能な遺伝子の生産物を
生産しない偽狂犬病ウイルスについて選択する、 を含んでなることを特徴とする方法によって生産され
た、g92遺伝子中の欠失の結果抗原g92ポリペプチドを生
産することができない偽狂犬病ウイルス。 ２９．前記欠失は約10〜1500bpの大きさである特許請求
の範囲第28項記載の偽狂犬病ウイルス。 ３０．前記欠失は約74〜200bpの大きさである特許請求
の範囲第29項記載の偽狂犬病ウイルス。 ３１．抗原g92ポリペプチドが生産されずかつ欠失され
たg92遺伝子配列の各側に隣接する偽狂犬病ウイルスDNA
配列が保持され、こうしてg92遺伝子中に欠失および挿
入の組み合わせの結果、工程（５）の得られる偽狂犬病
ウイルス突然変異体が抗原g92ポリペプチドを生産する
ことができないように、オリゴヌクレチドリンカーまた
は異質DNA配列を工程（４）における欠失したg92遺伝子
配列の代わりに挿入する特許請求の範囲第28項記載の偽
狂犬病ウイルス。 ３２．オリゴヌクレチドまたは異質DNA配列は約８〜500
0bpの大きさである特許請求の範囲第31項記載の偽狂犬
病ウイルス。 ３３．工程（５）の得られる突然変異体がg92遺伝子中
の欠失の結果抗原g92ポリペプチドを生産することがで
きずかつtk遺伝子中の突然変異の結果機能的TKを生産す
ることができないように、工程（３）の感染性DNAは機
能的TKを生産することができない偽狂犬病ウイルス突然
変異体から誘導される特許請求の範囲第28項記載の偽狂
犬病ウイルス。 ３４．機能的TKを生産することができない偽狂犬病ウイ
ルス突然変異体は、tk遺伝子中の欠失の結果、それを生
産することができない特許請求の範囲第34項記載の偽狂
犬病ウイルス。 ３５．前記偽狂犬病ウイルス突然変異体はPRV（BUK-dl
3）である特許請求の範囲第34項記載の偽狂犬病ウイル
ス。 ３６．前記偽狂犬病ウイルス突然変異体は、また、gI遺
伝子中の突然変異の結果、gIを生産することができない
特許請求の範囲第28項記載の偽狂犬病ウイルス。 ３７．工程（５）の得られる偽狂犬病ウイルスの突然変
異体が、g2遺伝子中の欠失の結果、抗原g92ポリペプチ
ドを生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウイル
ス突然変異体であるように、工程（３）の感染性DNAは
温度抵抗性偽狂犬病ウイルスから誘導される特許請求の
範囲第28項記載の偽狂犬病ウイルス。 ３８．工程（６）： （６） g92遺伝子中の欠失の結果、抗原g92ポリペプチ
ドを生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウイル
スを選択しかつ生産するために、工程（５）の得られる
偽狂犬病ウイルスを温度感受性ウイルスに対して非許容
性温度において増殖する、 をさらに含む特許請求の範囲第28項記載の偽狂犬病ウイ
ルス。 ３９．前記クローニングベクターはpBR322、pBR325、pK
H47、pBR328、pHC79、ファージ・シャロン28、pKB11、p
KSV-10およびpMAR420から成る群より選択される特許請
求の範囲第28項記載の偽狂犬病ウイルス。 ４０．前記クローニングベクターはpBR322である特許請
求の範囲第39項記載の偽狂犬病ウイルス。 ４１．工程（２）の得られる雑種プラスミドはpPRVTK/S
tu12である特許請求の範囲第28項記載の偽狂犬病ウイル
ス。 ４２．工程（４）の得られる雑種プラスミドはpBUK:gCd
lSalである特許請求の範囲第28項記載の偽狂犬病ウイル
ス。 ４３．前記選択可能な遺伝子は、tk遺伝子、トランスポ
ゾンTn5遺伝子および大腸菌（E．coli）lacZ遺伝子から
成る群より選択される特許請求の範囲第28項記載の偽狂
犬病ウイルス。 ４４．前記選択可能な遺伝子はtk遺伝子である特許請求
の範囲第43項記載の偽狂犬病ウイルス。 ４５．前記tk遺伝子は、HSV-1tk遺伝子、HSV-2tk遺伝
子、マーモセットのヘルペスウイルスtk遺伝子、ニワト
リｋ遺伝子、ヒトtk遺伝子および偽狂犬病ウイルスtk遺
伝子から成る群より選択される特許請求の範囲第44項記
載の偽狂犬病ウイルス。 ４６．前記tk遺伝子は偽狂犬病ウイルスtk遺伝子である
特許請求の範囲第45項記載の偽狂犬病ウイルス。 ４７．前記偽狂犬病ウイルスは凍結乾燥されている特許
請求の範囲第28項記載の偽狂犬病ウイルス。 ４８．工程： （１） クローニングベクターと偽狂犬病ウイルスg92
遺伝子の実質的にすべておよびそのフランキング配列を
含有するDNA断片とを含んでなる雑種プラスミドを構成
し、 （２） 機能的選択可能な遺伝子を暗号化するDNA断片
を工程（１）の得られた雑種プラスミドの偽狂犬病ウイ
ルスg92遺伝子の中に挿入し、こうして機能的選択可能
な遺伝子を偽狂犬病ウイルスg92遺伝子のDNA配列によっ
てフランキングし、 （３） 選択可能な遺伝子の生産物を生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスからの感染性DNAをもつ工程
（２）の雑種プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞
の中に同時トラスフェクションし、そして選択可能な遺
伝子の生産物を生産することができない偽狂犬病ウイル
スについて選択し、 （４） 抗原g92ポリペプチドが生産されずかつ挿入の
各側に隣接して偽狂犬病ウイルスDNA配列が保持される
保持されるように、オリゴヌクレチドリンカーまたは異
質DNA配列を工程（１）の中に挿入し、 （５） g92遺伝子中の挿入の結果抗原g92ポリペプチド
を生産することができない偽狂犬病ウイルス突然変異体
を生産するために、工程（３）の選択した偽狂犬病ウイ
ルスからの感染性DNAをもつ工程（４）の得られる雑種
プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞の中に同時ト
ラスフェクションし、そして選択可能な遺伝子の生産物
を生産しない偽狂犬病ウイルスについて選択する、 を含んでなることを特徴とする方法によって生産され
た、g92遺伝子中の挿入の結果抗原g92ポリペプチドを生
産することができない偽狂犬病ウイルス。 ４９．前記挿入は約８〜5000bpである特許請求の範囲第
48項記載の偽狂犬病ウイルス。 ５０．工程（５）の得られる突然変異体がg92遺伝子中
の挿入の結果抗原g92ポリペプチドを生産することがで
きずかつtk遺伝子中の突然変異の結果機能的TKを生産す
ることができないように、工程（３）の感染性DNAは機
能的TKを生産することができない偽狂犬病ウイルス突然
変異体から誘導される特許請求の範囲第48項記載の偽狂
犬病ウイルス。 ５１．機能的TKを生産することができない偽狂犬病ウイ
ルス突然変異体は、tk遺伝子中の欠失の結果、それを生
産することができない特許請求の範囲第50項記載の偽狂
犬病ウイルス。 ５２．前記偽狂犬病ウイルス突然変異体はPRV（BUK-dl
3）である特許請求の範囲第51項記載の偽狂犬病ウイル
ス。 ５３．前記偽狂犬病ウイルス突然変異体は、また、gI遺
伝子中の突然変異の結果、gIを生産することができない
特許請求の範囲第48項記載の偽狂犬病ウイルス。 ５４．工程（５）の得られる偽狂犬病ウイルスの突然変
異体が、g2遺伝子中の挿入突然変異の結果、抗原g92ポ
リペプチドを生産することができない温度抵抗性偽狂犬
病ウイルス突然変異体であるように、工程（３）の感染
性DNAは温度抵抗性偽狂犬病ウイルスから誘導される特
許請求の範囲第48項記載の偽狂犬病ウイルス。 ５５．工程（６）： （６） g92遺伝子中の挿入突然変異の結果、抗原g92ポ
リペプチドを生産することができない温度抵抗性偽狂犬
病ウイルスを選択しかつ生産するために、工程（５）の
得られる偽狂犬病ウイルスを温度感受性ウイルスに対し
て非許容性温度において増殖する、 をさらに含む特許請求の範囲第48項記載の偽狂犬病ウイ
ルス。 ５６．前記クローニングベクターはpBR322、pBR325、pK
H47、pBR328、pHC79、ファージ・シャロン28、pKB11、p
KSV-10およびpMAR420から成る群より選択される特許請
求の範囲第48項記載の偽狂犬病ウイルス。 ５７．前記クローニングベクターはpBR322である特許請
求の範囲第56項記載の偽狂犬病ウイルス。 ５８．工程（２）の得られる雑種プラスミドはpPRVTK/S
tu12である特許請求の範囲第48項記載の偽狂犬病ウイル
ス。 ５９．前記選択可能な遺伝子は、tk遺伝子、トランスポ
ゾンTn5遺伝子および大腸菌（E．coli）lacZ遺伝子から
成る群より選択される特許請求の範囲第48項記載の偽狂
犬病ウイルス。 ６０．前記選択可能な遺伝子はtk遺伝子である特許請求
の範囲第59項記載の偽狂犬病ウイルス。 ６１．前記tk遺伝子は、HSV-1tk遺伝子、HSV-2tk遺伝
子、マーモセットのヘルペスウイルスtk遺伝子、ニワト
リtk遺伝子、ヒトtk遺伝子および偽狂犬病ウイルスtk遺
伝子から成る群より選択される特許請求の範囲第60項記
載の偽狂犬病ウイルス。 ６２．前記tk遺伝子は偽狂犬病ウイルスtk遺伝子である
特許請求の範囲第61項記載の偽狂犬病ウイルス。 ６３．前記偽狂犬病ウイルスは凍結乾燥されている特許
請求の範囲第48項記載の偽狂犬病ウイルス。 ６４．（１） g92遺伝子中の欠失、挿入、または欠失
および挿入の両者の結果、抗原g92ポリペプチドを生産
することができない偽狂犬病ウイルスの製薬学的に有効
な量、および （２） 製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 を含んでなることを特徴とする偽狂犬病のためのワクチ
ン。 ６５．前記偽狂犬病ウイルスは、g92遺伝子中の欠失の
結果、抗原g92ポリペプチドを生産することができない
特許請求の範囲第64項記載の偽狂犬病のためのワクチ
ン。 ６６．前記欠失は約10〜1500bpの大きさである特許請求
の範囲第64項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 ６７．前記欠失は約75〜200bpの大きさである特許請求
の範囲第66項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 ６８．前記挿入は約８〜5000bpである特許請求の範囲第
64項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 ６９．前記偽狂犬病ウイルスは、また、tk遺伝子中の突
然変異の結果、機能的TKを生産することができない特許
請求の範囲第64項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 ７０．tk遺伝子中の前記突然変異は欠失突然変異である
特許請求の範囲第69項記載の偽狂犬病のためのワクチ
ン。 ７１．前記偽狂犬病ウイルスは、また、gI遺伝子中の突
然変異の結果、機能的gIを生産することができない特許
請求の範囲第64項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 ７２．前記偽狂犬病ウイルスは、また、温度抵抗性であ
る特許請求の範囲第64項記載の偽狂犬病のためのワクチ
ン。 ７３．前記ウイルスはPRV（dlg92/ditk）（ATCC No.VR-
2116）の同定特性を有する特許請求の範囲第64項記載の
偽狂犬病のためのワクチン。 ７４．前記偽狂犬病ウイルスは凍結乾燥されている特許
請求の範囲第64項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 ７５．前記製薬学的に許容されうる担体または希釈剤は
偽狂犬病ウイルスに対する抗体を含有しない2.5〜15％
の血清を含有する生理学的に緩衝化された媒質である特
許請求の範囲第64項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 ７６．前記血清はブタ血清、子牛血清、胎児子牛血清、
ウマ血清および子羊血清から成る群より選択される特許
請求の範囲第75項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 ７７．前記製薬学的に有効な量は104.5〜107.5p.f.u.で
ある特許請求の範囲第64項記載の偽狂犬病のためのワク
チン。 ７８．前記製薬学的に有効な量は105.0〜107.0p.f.u.で
ある特許請求の範囲第77項記載の偽狂犬病のためのワク
チン。 ７９．（１） g92遺伝子中の欠失、挿入、または欠失
および挿入の両者の結果、抗原g92ポリペプチドを生産
することができない偽狂犬病ウイルスの製薬学的に有効
な量、前記偽狂犬病ウイルスは、工程： （ａ） クローニングベクターと偽狂犬病ウイルスg92
遺伝子の実質的にすべておよびそのフランキング配列を
含有するDNA断片とを含んでなる雑種プラスミドを構成
し、 （ｂ） 機能的選択可能な遺伝子を暗号化するDNA断片
を、工程（ａ）の得られた雑種プラスミドの偽狂犬病ウ
イルスg92遺伝子の中に挿入し、こうして機能的選択可
能な遺伝子を偽狂犬病ウイルスg92遺伝子のDNA遺伝子に
よってフランキングし、 （ｃ） 選択可能な遺伝子の生産物を生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスからの感染性DNAをもつ工程
（ｂ）の雑種プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞
の中に同時トラスフェクションし、そしてg92遺伝子中
の挿入の結果抗原g92ポリペプチドを生産することがで
きない偽狂犬病ウイルス突然変異体を生産するために、
選択可能な遺伝子の生産物を生産する偽狂犬病ウイルス
組換え体について選択する、 を含んでなる方法によって生産されたたものである、お
よび （２） 製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 を含んでなることを特徴とする偽狂犬病のためのワクチ
ン。 ８０．前記挿入は約８〜5000bpである特許請求の範囲第
79項記載の偽狂犬病ウイルス。 ８１．工程（ｃ）の得られる突然変異体がg92遺伝子中
の挿入の結果抗原g92ポリペプチドを生産することがで
きずかつtk遺伝子中の突然変異の結果機能的TKを生産す
ることができないように、工程（ｃ）の感染性DNAは機
能的TKを生産することができない偽狂犬病ウイルス突然
変異体から誘導される特許請求の範囲第79項記載の偽狂
犬病のためのワクチン。 ８２．機能的TKを生産することができない偽狂犬病ウイ
ルス突然変異体は、tk遺伝子中の欠失の結果、それを生
産することができない特許請求の範囲第79項記載の偽狂
犬病のためのワクチン。 ８３．前記偽狂犬病ウイルス突然変異体はPRV（BUK-dl
3）である特許請求の範囲第82項記載の偽狂犬病のため
のワクチン。 ８４．前記偽狂犬病ウイルス突然変異体は、また、gI遺
伝子中の突然変異の結果、gIを生産することができない
特許請求の範囲第79項記載の偽狂犬病のためのワクチ
ン。 ８５．工程（ｃ）の得られる突然変異体が、g2遺伝子中
の挿入の結果、抗原g92ポリペプチドを生産することが
できない温度抵抗性偽狂犬病ウイルス突然変異体である
ように、工程（ｃ）の感染性DNAは温度抵抗性偽狂犬病
ウイルスから誘導される特許請求の範囲第79項記載の偽
狂犬病のためのワクチン。 ８６．工程（ｄ）： （ｄ） g92遺伝子中の挿入の結果、抗原g92ポリペプチ
ドを生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウイル
ス突然変異体を選択しかつ生産するために、工程（ｄ）
の得られる偽狂犬病ウイルスを温度感受性ウイルスに対
して非許容性温度において増殖する、 をさらに含む特許請求の範囲第79項記載の偽狂犬病のた
めのワクチン。 ８７．前記クローニングベクターはpBR322、pBR325、pK
H47、pBR328、pHC79、ファージ・シャロン28、pKB11、p
KSV-10およびpMAR420から成る群より選択される特許請
求の範囲第79項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 ８８．前記クローニングベクターはpBR322である特許請
求の範囲第87項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 ８９．工程（ｂ）の得られる雑種プラスミドはpPRVTK/S
tu12である特許請求の範囲第79項記載の偽狂犬病のため
のワクチン。 ９０．前記選択可能な遺伝子は、tk遺伝子、トランスポ
ゾンTn5遺伝子および大腸菌（E，coli）lacZ遺伝子から
成る群より選択される特許請求の範囲第79項記載の偽狂
犬病のためのワクチン。 ９１．前記選択可能な遺伝子はtk遺伝子である特許請求
の範囲第90項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 ９２．前記tk遺伝子は、HSV-1tk遺伝子、HSV-2tk遺伝
子、マーモセットのヘルペスウイルスtk遺伝子、ニワト
リtk遺伝子、ヒトtk遺伝子および偽狂犬病ウイルスtk遺
伝子から成る群より選択される特許請求の範囲第91項記
載の偽狂犬病のためのワクチン。 ９３．前記tk遺伝子は偽狂犬病ウイルスtk遺伝子である
特許請求の範囲第92項記載の偽狂犬病のためのワクチ
ン。 ９４．前記偽狂犬病ウイルスは凍結乾燥されている特許
請求の範囲第79項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 ９５．前記製薬学的に許容されうる担体または希釈剤は
偽狂犬病ウイルスに対する抗体を含有しない2.5〜15％
の血清を含有する生理学的に緩衝化された媒質である特
許請求の範囲第79項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 ９６．前記血清はブタ血清、子牛血清、胎児子牛血清、
ウマ血清および子羊血清から成る群より選択される特許
請求の範囲第95項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 ９７．前記製薬学的に有効な量は104.5〜107.5p.f.u.で
ある特許請求の範囲第79項記載の偽狂犬病のためのワク
チン。 ９８．前記製薬学的に有効な量は105.0〜107.0p.f.u.で
ある特許請求の範囲第97項記載の偽狂犬病のためのワク
チン。 ９９．（１） g92遺伝子中の欠失の結果、抗原g92ポリ
ペプチドを生産することができない偽狂犬病ウイルスの
製薬学的に有効な量、前記偽狂犬病ウイルスは、工程： （ａ） クローニングベクターと偽狂犬病ウイルスg92
遺伝子の実質的にすべておよびそのフランキング配列を
含有するDNA断片とを含んでなる雑種プラスミドを構成
し、 （ｂ） 機能的選択可能な遺伝子を暗号化するDNA断片
を工程（ａ）の得られた雑種プラスミドの偽狂犬病ウイ
ルスg92遺伝子の中に挿入し、こうして機能的選択可能
な遺伝子を偽狂犬病ウイルスg92遺伝子のDNA配列によっ
てフランキングし、 （ｃ） 選択可能な遺伝子の生産物を生産することがで
きない偽狂犬病ウイルスからの感染性DNAをもつ工程
（ｂ）の雑種プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞
の中に同時トラスフェクションし、そして選択可能な遺
伝子の生産物を生産することができない偽狂犬病ウイル
スについて選択し、 （ｄ） g92遺伝子の実質的にすべてより少なくが存在
し、同時に欠失の各側に隣接して偽狂犬病ウイルスDNA
が保持されるように、工程（ａ）の雑種プラスミドから
DNA配列を欠失し、 （ｅ） g92遺伝子中の欠失の結果抗原g92ポリペプチド
を生産することができない偽狂犬病ウイルス突然変異体
を生産するために、工程（ｃ）の選択した偽狂犬病ウイ
ルスからの感染性DNAをもつ工程（ｄ）の得られる雑種
プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞の中に同時ト
ラスフェクションし、そして選択可能な遺伝子の生産物
を生産しない偽狂犬病ウイルスについて選択する、 を含んでなる生産されたものである、および （２） 製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 を含んでなることを特徴とする偽狂犬病のためのワクチ
ン。 １００．前記欠失は約10〜1500bpの大きさである特許請
求の範囲第99項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 １０１．前記欠失は約74〜200bpの大きさである特許請
求の範囲第100項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 １０２．抗原g92ポリペプチドが生産されずかつ欠失さ
れたg92遺伝子配列の各側に隣接する偽狂犬病ウイルスD
NA配列が保持され、こうしてg92遺伝子中に欠失および
挿入の組み合わせの結果、工程（ｅ）の得られる偽狂犬
病ウイルス突然変異体が抗原g92ポリペプチドを生産す
ることができないように、オリゴヌクレチドリンカーま
たは異質DNA配列を工程（ｄ）における欠失したg92遺伝
子配列の代わりに挿入する特許請求の範囲第99項記載の
偽狂犬病ウイルス。 １０３．オリゴヌクレチドまたは異質DNA配列は約８〜5
000bpの大きさである特許請求の範囲第102項記載の偽狂
犬病のためのワクチン。 １０４．工程（ｅ）の得られる突然変異体がg92遺伝子
中の欠失の結果抗原g92ポリペプチドを生産することが
できずかつtk遺伝子中の突然変異の結果機能的TKを生産
することができないように、工程（ｃ）の感染性DNAは
機能的TKを生産することができない偽狂犬病ウイルス突
然変異体から誘導される特許請求の範囲第99項記載の偽
狂犬病のためのワクチン。 １０５．機能的TKを生産することができない偽狂犬病ウ
イルス突然変異体は、tk遺伝子中の欠失の結果、それを
生産することができない特許請求の範囲第104項記載の
偽狂犬病のためのワクチン。 １０６．前記偽狂犬病ウイルス突然変異体はPRV（BUK-d
l 3）である特許請求の範囲第104項記載の偽狂犬病のた
めのワクチン。 １０７．前記偽狂犬病ウイルス突然変異体は、また、gI
遺伝子中の突然変異の結果、gIを生産することができな
い特許請求の範囲第99項記載の偽狂犬病のためのワクチ
ン。 １０８．工程（ｅ）の得られる偽狂犬病ウイルスの突然
変異体が、g2遺伝子中の欠失の結果、抗原g92ポリペプ
チドを生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウイ
ルス突然変異体であるように、工程（ｃ）の感染性DNA
は温度抵抗性偽狂犬病ウイルスから誘導される特許請求
の範囲第99項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 １０９．工程（ｆ）： （ｆ） g92遺伝子中の欠失の結果、抗原g92ポリペプチ
ドを生産することできない温度抵抗性偽狂犬病ウイルス
を選択しかつ生産するために、工程（ｅ）の得られる偽
狂犬病ウイルスを温度感受性ウイルスに対して非許容性
温度において増殖する、 をさらに含む特許請求の範囲第99項記載の偽狂犬病のた
めのワクチン。 １１０．前記クローニングベクターはpBR322、pBR325、
pKH47、pBR328、pHC79、ファージ・シャロン28、pKB1
1、pKSV-10およびpMAR420から成る群より選択される特
許請求の範囲第99項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 １１１．前記クローニングベクターはpBR322である特許
請求の範囲第110項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 １１２．工程（ｂ）の得られる雑種プラスミドはpPRVTK
/Stu12である特許請求の範囲第99項記載の偽狂犬病のた
めのワクチン。 １１３．工程（ｄ）の得られる雑種プラスミドはpBUK:g
CdlSalである特許請求の範囲第99項記載の偽狂犬病のた
めのワクチン。 １１４．前記選択可能な遺伝子は、tk遺伝子、トランス
ポゾンTn5遺伝子および大腸菌（E．coli）lacZ遺伝子か
ら成る群より選択される特許請求の範囲第99項記載の偽
狂犬病のためのワクチン。 １１５．前記選択可能な遺伝子はtk遺伝子である特許請
求の範囲第114項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 １１６．前記tk遺伝子は、HSV-1tk遺伝子、HSV-2tk遺伝
子、マーモセットのヘルペスウイルスtk遺伝子、ニワト
リtk遺伝子、ヒトtk遺伝子および偽狂犬病ウイルスtk遺
伝子から成る群より選択される特許請求の範囲第115項
記載の偽狂犬病のためのワクチン。 １１７．前記tk遺伝子は偽狂犬病ウイルスtk遺伝子であ
る特許請求の範囲第116項記載の偽狂犬病のためのワク
チン。 １１８．前記偽狂犬病ウイルスは凍結乾燥されている特
許請求の範囲第99項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 １１９．前記製薬学的に許容されうる担体または希釈剤
は偽狂犬病ウイルスに対する抗体を含有しない2.5〜15
％の血清を含有する生理学的に緩衝化された媒質である
特許請求の範囲第99項記載の偽狂犬病のためのワクチ
ン。 １２０．前記血清はブタ血清、子牛血清、胎児子牛血
清、ウマ血清および子羊血清から成る群より選択される
特許請求の範囲第119項記載の偽狂犬病のためのワクチ
ン。 １２１．前記製薬学的に有効な量は104.5〜107.5p.f.u.
である特許請求の範囲第99項記載の偽狂犬病のためのワ
クチン。 １２２．前記製薬学的に有効な量は105.0〜107.0p.f.u.
である特許請求の範囲第121項記載の偽狂犬病のための
ワクチン。 １２３．（１） g92遺伝子中の挿入の結果、抗原g92ポ
リペプチドを生産することができない偽狂犬病ウイルス
の製薬学的に有効な量、前記偽狂犬病ウイルスは、工
程： （ａ） クローニングベクターと偽狂犬病ウイルスg92
遺伝子の実質的にすべておよびそのフランキング配列を
含有するDNA断片とを含んでなる雑種プラスミドを構成
し、 （ｂ） 機能的選択可能な遺伝子を暗号化するDNA断片
を工程（ａ）の得られた雑種プラスミドの偽狂犬病ウイ
ルスg92遺伝子の中に挿入し、こうして機能的選択可能
な遺伝子を偽狂犬病ウイルスg92遺伝子のDNA配列によっ
てフランキングし、 （ｃ）選択可能な遺伝子の生産物を生産することができ
ない偽狂犬病ウイルスからの感染性DNAをもつ工程
（ｂ）の雑種プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞
の中に同時トラスフェクションし、そして選択可能な遺
伝子の生産物を生産することができない偽狂犬病ウイル
スについて選択し、 （ｄ） 抗原g92ポリペプチドが生産されずかつ挿入の
各側に隣接して偽狂犬病ウイルスDNA配列が保持される
保持されるように、オリゴヌクレチドリンカーまたは異
質DNA配列を工程（１）の中に挿入し、 （ｅ） g92遺伝子中の挿入の結果抗原g92ポリペプチド
を生産することができない偽狂犬病ウイルス突然変異体
を生産するために、工程（ｃ）の選択した偽狂犬病ウイ
ルスからの感染性DNAをもつ工程（ｄ）の得られる雑種
プラスミドを、偽狂犬病ウイルス宿主細胞の中に同時ト
ラスフェクションし、そして選択可能な遺伝子の生産物
を生産しない偽狂犬病ウイルスについて選択する、 を含んでなる生産されたものである、および （２） 製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 を含んでなることを特徴とする偽狂犬病のためのワクチ
ン。 １２４．前記挿入は約８〜5000bpである特許請求の範囲
第123記載の偽狂犬病ウイルス。 １２５．工程（ｅ）の得られる突然変異体がg92遺伝子
中の挿入の結果抗原g92ポリペプチドを生産することが
できずかつtk遺伝子中の突然変異の結果機能的TKを生産
することができないように、工程（ｃ）の感染性DNAは
機能的TKを生産することができない偽狂犬病ウイルス突
然変異体から誘導される特許請求の範囲第123記載の偽
狂犬病のためのワクチン。 １２６．機能的TKを生産することができない偽狂犬病ウ
イルス突然変異体は、tk遺伝子中の欠失の結果、それを
生産することができない特許請求の範囲第125記載の偽
狂犬病のためのワクチン。 １２７．前記偽狂犬病ウイルス突然変異体はPRV（BUK-d
l 3）である特許請求の範囲第125記載の偽狂犬病のため
のワクチン。 １２８．前記偽狂犬病ウイルス突然変異体は、また、gI
遺伝子中の突然変異の結果、gIを生産することができな
い特許請求の範囲第123記載の偽狂犬病のためのワクチ
ン。 １２９．工程（ｅ）の得られる偽狂犬病ウイルスの突然
変異体が、g2遺伝子中の挿入突然変異の結果、抗原g92
ポリペプチドを生産することができない温度抵抗性偽狂
犬病ウイルス突然変異体であるように、工程（ｃ）の感
染性DNAは温度抵抗性偽狂犬病ウイルスから誘導される
特許請求の範囲第123記載の偽狂犬病のためのワクチ
ン。 １３０．工程（ｆ）： （ｆ） g92遺伝子中の挿入突然変異の結果、抗原g92ポ
リペプチドを生産することができない温度抵抗性偽狂犬
病ウイルスを選択しかつ生産するために、工程（ｅ）の
得られる偽狂犬病ウイルスを温度感受性ウイルスに対し
て非許容性温度において増殖する、 をさらに含む特許請求の範囲第123記載の偽狂犬病のた
めのワクチン。 １３１．前記クローニングベクターはpBR322、pBR325、
pKH47、pBR328、pHC79、ファージ・シャロン28、pKB1
1、pKSV-10およびpMAR420から成る群より選択される特
許請求の範囲第123記載の偽狂犬病のためのワクチン。 １３２．前記クローニングベクターはpBR322である特許
請求の範囲第131項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 １３３．工程（ｂ）の得られる雑種プラスミドはpPRVTK
/Stu12である特許請求の範囲第123記載の偽狂犬病のた
めのワクチン。 １３４．前記選択可能な遺伝子は、tk遺伝子、トランス
ポゾンTn5遺伝子および大腸菌（E．coli）lacZ遺伝子か
ら成る群より選択される特許請求の範囲第123記載の偽
狂犬病のためのワクチン。 １３５．前記選択可能な遺伝子はtk遺伝子である特許請
求の範囲第134項記載の偽狂犬病のためのワクチン。 １３６．前記tk遺伝子は、HSV-1tk遺伝子、HSV-2tk遺伝
子、マーモセットのヘルペスウイルスtk遺伝子、ニワト
リtk遺伝子、ヒトtk遺伝子および偽狂犬病ウイルスtk遺
伝子から成る群より選択される特許請求の範囲第135項
記載の偽狂犬病のためのワクチン。 １３７．前記tk遺伝子は偽狂犬病ウイルスtk遺伝子であ
る特許請求の範囲第136項記載の偽狂犬病のためのワク
チン。 １３８．前記偽狂犬病ウイルスは凍結乾燥されている特
許請求の範囲第123項記載の偽狂犬病のためのワクチ
ン。 １３９．前記製薬学的に許容されうる担体または希釈剤
は偽狂犬病ウイルスに対する抗体を含有しない2.5〜15
％の血清を含有する生理学的に緩衝化された媒質である
特許請求の範囲第123項記載の偽狂犬病のためのワクチ
ン。 １４０．前記血清はブタ血清、子牛血清、胎児子牛血
清、ウマ血清および子羊血清から成る群より選択される
特許請求の範囲第139項記載の偽狂犬病のためのワクチ
ン。 １４１．前記製薬学的に有効な量は104.5〜107.5p.f.u.
である特許請求の範囲第123項記載の偽狂犬病のための
ワクチン。 １４２．前記製薬学的に有効な量は105.0〜107.0p.f.u.
である特許請求の範囲第141項記載の偽狂犬病のための
ワクチン。
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-
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- 1987-01-28 JP JP62016313A patent/JP2703538B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-28 AU AU68061/87A patent/AU6806187A/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
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| Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７３，（１９８２），Ｐ．１９３−１９８ |
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