JP2677546B2 - Ｖｉｉｉ因子フラグメントのコンプレックスの凝固活性剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】この発明は、ＶＩＩＩ因子の分子
量９２ないし２１０ｋｄのＮ末端フラグメント及びＶＩ
ＩＩ因子の分子量８０ないし７０ｋｄのＣ末端フラグメ
ントの凝固活性コンプレックスに関する。 【０００２】 【従来の技術】ＶＩＩＩ因子は血液中に天然に存在する
蛋白質である。これは、ＦＸから活性化ＦＸ（ＦＸａ）
への転化に補因子として関与する。ＶＩＩＩ因子の存在
により、ＦＸａの生成速度は約２００，０００倍に増大
される（ジエイジェン等、J. Biol. Chem. 156, p.343
3,1981)。ＶＩＩＩ因子が欠乏すると（血友病Ａ）、出
血が止まらなくなる。 【０００３】凝固カスケードにおけるＶＩＩＩ因子の役
割は以下のように表わすことができる。 【０００４】 【化１】ＶＩＩＩ因子はトロンビン又はＦＸａにより活性化さ
れ、トロンビン、ＦＸａ又はプロテインＣにより不活性
化される。 【０００５】血友病Ａ患者はＶＩＩＩ製剤を予防的に又
は出血の際に緊急的に投与される。 【０００６】ＶＩＩＩ因子はヒト血漿から回収され、蛋
白質の約１ｐｐｍがＶＩＩＩ因子である。この方法では
ＶＩＩＩ因子を僅かにしか製造することができない。従
って、培養細胞内でＶＩＩＩ因子を生合成的に製造する
ことが望ましい。これには３つの研究者グループが成功
している（ウッド等、Nature 312, p.330,1984；トゥー
ル等、Nature 312,p.342,1984;ツルエト等、DNA 4,p.33
3,1985）。 【０００７】培養細胞中では外来蛋白質２ｍｇ／ｍｌを
製造することができる。ＶＩＩＩ因子については、これ
は２０，０００単位／ｍｌに相当する。この濃度はＶＩ
ＩＩ因子について文献に記載されているものをはるかに
超えるものである。その理由の１つはＶＩＩＩ因子が分
子量約３３０ｋｄ（ベーハーら、Nature 312，1984）の
極めて大きな蛋白質であるということである。 【０００８】血漿又は細胞培養物から精製されたＶＩＩ
Ｉ因子は、分子量約８０ｋｄのＶＩＩＩ因子軽鎖又はＶ
ＩＩＩ−ＬＣと呼ばれるフラグメントと、分子量約９２
ないし２１０ｋｄのＶＩＩＩ重鎖又はＶＩＩＩ−ＨＣと
呼ばれるフラグメントとを有する。これらのフラグメン
トは３３０ｋｄの蛋白質から蛋白質分解により生成さ
れ、８０ｋｄのＶＩＩＩ−ＬＣはＣ末端断片であり、Ｖ
ＩＩＩ−ＨＣはその大きさが分解の程度に依存するＮ末
端フラグメントである。 【０００９】このように、凝固活性ＶＩＩＩ因子は８０
ｋｄのフラクメントと９２ｋｄ以上のフラグメントとを
有することが知られている（フルチャー及びマーマン、
Symposium on VIII 、スクリップス・クリニック、198
2）。 【００１０】 【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】これらのフラグメントを生体外で結合して凝固
活性ＶＩＩＩ因子にできると、ＶＩＩＩ因子をより小さ
なフラグメントから製造することは有利である。これら
のフラグメントは、ＶＩＩＩ因子そのものよりも大きさ
が小さいので、大量に生合成することがより容易であ
る。さらに、フラグメントはコンプレックスの形成によ
り電荷及び分子量が変化するので、後で細胞培養物から
精製する場合に有利である。フラグメントだけでなくコ
ンプレックスも精製することができるので、より純粋な
最終生産物を得ることができる。 【００１１】実験により、フラグメントを単に結合した
のでは凝固活性産物が得られないことが示された。文献
にもＶＩＩＩ因子のフラグメントを凝固活性複合物(coa
gulation active complex)に転化する方法及び条件は記
載されていない。 【００１２】この発明は、凝固不活性ＶＩＩＩ重鎖（Ｖ
ＩＩＩ−ＨＣ、Ｎ末端フラグメント）を複合促進剤(com
plex promoting agent) の存在下で凝固不活性軽鎖（Ｖ
ＩＩＩ−ＬＣ、Ｃ末端フラグメント）と反応させること
により凝固活性複合物が生成されるという知見に基く。
これは非常に驚くべきことである。なぜなら、文献では
ＦＶＩＩＩ−ＨＣ及びＦＶＩＩＩ−ＬＣの精製を報告し
ているが、（デンマーク特許出願5387/85 参照）、結合
により活性を創製することが理論上及び実際上非常に重
要なことであるにもかかわらず、活性創製結合の試みに
ついては何も報告していないからである。 【００１３】ブルケ等（アブストラクト 14p. 111 "Re
search in clinic and laboratory"16, 1986)はＶＩＩ
Ｉ−ＬＣ及びＶＩＩＩ−ＨＣの両方のＤＮＡでトランス
フェクトされた細胞から生体内で凝固活性ＶＩＩＩ因子
を製造することに成功した。しかしながら、種々の条件
が試されたが、ＶＩＩＩ−ＬＣ及びＶＩＩＩ−ＨＣをそ
れぞれ含む培養上清を混合することによっては凝固活性
を得ることができなかった。 【００１４】ＶＩＩＩ−ＬＣはヒト血漿から精製するこ
とができ、凝固活性を有さない(WO86/02838参照）。Ｖ
ＩＩＩ−ＨＣフラグメントもまた、血漿から精製するこ
とができる（ツルエ等、DNA 4,p.333,1985）。このフラ
グメントもまた凝固活性を有さない。 【００１５】この発明では、１又は２以上の２価の金属
イオンが複合促進剤として好ましく用いられる。この型
の適当な剤の例としてＭｎ²⁺、Ｃａ²⁺及びＣｏ²⁺を挙げ
ることができる。他の適当な複合促進剤はＦＩＸａ及び
ＦＸ並びにＲ−ＳＨ及び／又はＲ−Ｓ−Ｓ−Ｒ化合物に
反応性を有する物質である。所望ならば、これらの剤の
混合物を用いることもできる。 【００１６】定義 ＦＶＩＩＩ−ＬＣ即ちＦＶＩＩＩ（ＶＩＩＩ因子）の軽
鎖は、ＦＶＩＩＩの全長のＣ末端領域からのフラグメン
トである。このフラグメントの分子量は通常約８０ｋｄ
であるが、７０ｋｄ以下であることもある。８０ｋｄの
分子量を有するフラグメントは文献記載のＦＶＩＩＩ−
ＬＣ抗原に対する分析において免疫反応性を有するが、
ＦＶＩＩＩ−ＨＣ抗原に対する分析においては免疫反応
性を有さない。 【００１７】ＦＶＩＩＩ−ＨＣ即ちＦＶＩＩＩの重鎖は
ＦＶＩＩＩ全長のＮ末端領域からのフラグメントであ
る。このフラグメントの分子量は通常９２ｋｄである
が、それ以下のことも、又は２１０ｋｄまでのこともあ
る。血漿から精製されたＦＶＩＩＩ−ＨＣは９２ないし
２１０ｋｄのフラグメントの混合物から成る。９２ｋｄ
以上の分子量を有するフラグメントは文献に記載された
ＦＶＩＩＩ−ＨＣ抗原に対する分析において免疫反応性
を有するが、ＦＶＩＩＩ−ＬＣ抗原に対する分析におい
ては免疫反応性を有さない。 【００１８】凝固活性ＦＶＩＩＩは、凝固試験において
血友病Ａ血漿の凝固時間を短縮することができる蛋白質
である。凝固活性ＦＶＩＩＩはさらにコアテスト(Coate
st）試験（後述）においてＦＸａの形成を促進すること
ができ、従って色原体の転化を行なうことができる。凝
固活性はＶＩＩＩ：Ｃとして記載される。 【００１９】プロトロンビンコンプレックスはγカルボ
キシグルタミン酸を含む凝固因子、すなわちＦＩＩ、Ｆ
ＶＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸプロテインＣ又はこれらの凝固
因子の活性型である（ディビー等、Advances in enzymo
logy 48 p.277,1979）。このＦＩＸは凝固因子ＩＸで、
ＦＩＸａはその活性型であり、ＦＸは凝固因子Ｘで、Ｆ
Ｘａはその活性型である。 【００２０】方法 ＶＩＩＩ：Ｃについてのコアテスト試験 この試験では、ＦＶＩＩＩ：ＣはＦＩＸａ、ＦＸ、Ｃａ
²⁺及びリン脂質（ＰＬ）から成る系中で測定する（ロー
ゼン等、Thromb Haemostas 54p.818,1985)。ＦＸａはＦ
ＶＩＩＩ：Ｃに依存する量だけ形成される。試験は以下
に示すようにして行なわれる。 【００２１】ＦＶＩＩＩ：Ｃについてのコアテスト試験 １．５０μ１の試料を５０μ１の活性化試薬（ＦＩＸａ
／ＦＸとＰＬとの混合物）と混合する。インキュベーシ
ョン時間１０分、２２℃。 【００２２】２．２５μ１の２５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を加
え、混合物を２２℃で２０分間インキュベーションす
る。 【００２３】３．５μ１のＦＸａについての色原体（Ｓ
２２２２）を加える。 【００２４】４．１５分インキュベーション後、クエン
酸を加え、試料のＥ₄₀₅ を読む。 【００２５】コアテスト試験においてはＦＶＩＩＩの酵
素的活性化を行なうことはできない。なぜなら、この試
験においてＶＩＩＩはＦＩＸａ／ＦＸ、ＰＬ及びＣａ²⁺
とのインキュベーションにより完全に活性化されるから
である。 【００２６】ＦＶＩＩＩ−ＬＣの免疫学的定量 ＦＶＩＩＩ−ＬＣ抗原（Ａｇ）は特異的免疫分析（ノー
ドファン等、Thromb Haemostas 53,p.346,1985）により
測定される。ヒト阻害剤抗体をマイクロプレートにコー
トし、試料を加え、結合したＶＩＩＩ−ＬＣをヒト阻害
剤ＩｇＧのパーオキシダーゼでラベルしたＦ（ａｂ’）
₂ で検出する。正常ヒト血漿は対照として用いる。 【００２７】ＦＶＩＩＩ−ＨＣの免疫学的定量 ＦＶＩＩＩ−ＨＣ抗原（Ａｇ）は特異的阻害分析により
測定する。イヌの阻害剤抗体を、解放された(loose）ウ
ェルを有するマイクロプレートにコートする。試料及び
¹²⁵Ｉ−ＦＶＩＩＩ−ＨＣを加える。試料中のＦＶＩＩ
Ｉ−ＨＣは結合される ¹²⁵Ｉ−ＦＶＩＩＩ−ＨＣの量を
決定する。対照は１単位のＦＶＩＩＩ：Ｃ当たり１単位
のＦＶＩＩＩ：Ｃ当たりに１単位のＦＶＩＩＩ−ＨＣを
含むように設定されたＦＶＩＩＩ濃厚物（ＦＶＩＩＩノ
ルディスク）である。 【００２８】免疫分析により測定されたＦＶＩＩＩ−Ｌ
Ｃ及びＦＶＩＩＩ−ＨＣの量は相対的に記載される。す
なわち、種々の型のＦＶＩＩＩについてのユニットＦＶ
ＩＩＩ：Ｃ、ユニットＦＶＩＩＩ−ＬＣＡｇ、ユニット
ＦＶＩＩＩ−ＨＣＡｇは１：１：１ではない。然しなが
ら、種々の分析ユニットは類似するものと推定される。
然し、コアテスト試験において全ての蛋白質が凝固活性
であるＦＶＩＩＩ試料についてのＶＩＩＩ：Ｃユニッ
ト、ＦＶＩＩＩ−ＬＣＡｇユニット及びＦＶＩＩＩ−Ｈ
ＣＡｇユニットの間には何らかの相違点があるのかもし
れない。 【００２９】分子量の測定 分子量は還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定する（ラエム
リ、Nature 227p.680,1970）。 【００３０】ＶＩＩＩ因子の製造 対照試験のためのＶＩＩＩ試料はヤギ抗フォン・ウィレ
ブランド(von Willebrand)因子セファロース（ツルエ
等、DNA 4 P.333,1985）上でのアフィニティクロマトグ
ラフィーによりＦＶＩＩＩ濃厚物(WO 84/03628参照）か
ら製造した。 【００３１】ＦＶＩＩＩ−ＬＣ（試料Ａ）の調製 ＦＶＩＩＩ−ＬＣは数種類の方法（例えばWO 86/02838)
により血漿から精製することができる。ここでは、オー
・ノードファング等、Thrombosis and Haemostasis,Vo
l.54,p.586-590,1985により記載された方法により製造
された、ノルディオクト(nordiocto）のモノクローナル
４７ＩｇＧ上でのアフィニティクロマトグラフィーによ
って単離された、高度に濃縮されたＦＶＩＩＩ−ＬＣを
用いる。２００ｍｌの緩衝液Ａ（０．０２Ｍイミダゾー
ル、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｎＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
７．４）中にＶＩＩＩ−ＬＣＡｇ濃度１１０単位／ｍｌ
に溶解されたノルディオクトを７ｍｌの４７ＩｇＧセフ
ァロース（９ｍｇ／ｍｌのＩｇＧと結合）と共にインキ
ュベートした。インキュベーション混合物をカラム上に
注ぎ、溶離物を回収した。ゲルを４０ｍｌ緩衝液Ａ及び
０．６５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗った。ＦＶＩ
ＩＩ−ＬＣは４０ｍｌの２０ｍＭイミダゾール／０．６
５Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ／５０％エチレン
グリコール／ｐＨ７．４で溶離した。４ｍｌのピーク画
分を５０ｍＭイミダゾール／０．１５ＭＮａＣｌ／１０
％グリセロール／０．０２％ ＮａＮ₃ ／ｐＨ７．４に
対して透析した。透析した試料中のＦＶＩＩＩ成分は第
１表に示してある。 【００３２】ＦＶＩＩＩ−ＨＣ（試料Ｂ）の調製 ＦＶＩＩＩ−ＨＣは、モノクローナル５６ＩｇＧセファ
ロース（オー・ノードファン等、Thrombosis and Haemo
stasis,Vol.54,p.586-590,1985に記載された方法により
製造）上でアフィニティクロマトグラフィーによりＦＶ
ＩＩＩ試料から製造した。５６ＩｇＧセファロースは、
ＶＩＩＩ−ＬＣを介してＦＶＩＩＩ−ＬＣ／Ｆ ＶＩＩ
Ｉ−ＨＣコンプレックスを結合した。 ⁴⁰⁵ＦＶＩＩＩ−
ＨＣＡｇ単位／ｍｌを有する２５ｍｌのＦＶＩＩＩ試料
を１．５ｍｌの５６ＩｇＧセファロース（４ｍｇの５６
ＩｇＧ／ｍｌと結合）と共に一夜インキュベートした。
インキュベーション混合物をカラムに注ぎ、溶離物を回
収した。ゲルを、０．３５Ｍ ＣａＣｌ₂ を含む５ｍｌ
の緩衝液Ｂ（２０ｍＭイミダゾール／０．１５ＭＮａＣ
ｌ／１０％グリセロール／０．１Ｍリジン／ｐＨ７．
４）で洗った。次いでゲルを総ＮａＣｌ含量０．６５Ｍ
の１５ｍｌの緩衝液Ｂで洗い、さらに１０ｍＭＥＤＴＡ
及び０．０２％ＮａＮ₃ を含む緩衝液Ｂ（ＥＤＴＡ緩衝
液）で洗った。ゲルを脱水し、室温下で５ｍｌのＥＤＴ
Ａ緩衝液と共に１時間インキュベートした。インキュベ
ーション後、ＦＶＩＩＩ−ＨＣを５ｍｌのＥＤＴＡ緩衝
液で溶離した。２ｍｌのピーク画分を５０ｍＭイミダゾ
ール／０．１５ｍ ＮａＣｌ／１０％グリセロール／
０．０２％ ＮａＮ₃ ／ｐＨ７．４に対して透析した。
透析試料中のＦＶＩＩＩ成分の含量は表１に示されてい
る。 【００３３】 表 １ 透析されたFVIII-LC試料及びFVIII-HC試料中の FVIIIフラグメント FVIII:C FVIII-LCAg FVIII-HCAg 単位／ｍｌ 単位／ｍｌ 単位／ｍｌ FVIII-LC（試料Ａ） ＜０．０１ ７７０ １．８ FVIII-HC（試料Ｂ） ＜０．０１ ０．１ ２０００ 試料Ａ及びＢはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。添付
の図面参照のこと。図面において、レーン１は試料Ａ
（ＦＶＩＩＩ−ＬＣ）、４ＦＶＩＩＩ−ＬＣＡｇ単位に
対応し、レーン２は分子量マーカーを含み、レーン３は
試料Ｂ（ＦＶＩＩＩ−ＨＣ）、８ＦＶＩＩＩ−ＨＣＡｇ
単位に対応する。 【００３４】 【実施例】次に、この発明をいくつかの実施例により説
明する。 【００３５】例１ 試料Ａ及びＢをそれぞれ緩衝液Ｃ（５０ｍＭ イミダゾ
ール、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ
７．４）で１０倍に希釈した。２０μｌのＡ（１：１０
に希釈）を２０μｌのＢ １：１０、３μｌの０．１５
Ｍ ＭｎＣｌ₂ 、及び４０μｌの緩衝液Ｃと混合した。
２２℃で４８時間のインキュベーション後、インキュベ
ーション混合物はコアテストで測定して１２００ｍ単位
のＶＩＩＩ：Ｃ／ｍｌを含んでいた。 【００３６】次の実験を比較のために行った。 【００３７】実験Ａ この実験は例に記載したように繰返したが、３μｌの
０．１５Ｍ ＭｎＣｌ₂の代りに３μｌの緩衝液Ｃを加
える変更をした。２２℃で４８時間のインキュベーショ
ン後、このインキュベーション混合物はコアテストで測
定して５ｍ単位未満のＶＩＩＩ：Ｃ／ｍｌを含んでい
た。 【００３８】実験Ｂ 試料Ａを緩衝液Ｃで４０倍に希釈した。８０μｌのＡ
（１：４０に希釈）を３μｌの０．１５Ｍ ＭｎＣｌ₂
と混合した。４８時間のインキュベーション後、インキ
ュベーション混合物は５単位未満のＶＩＩＩ：Ｃ／ｍｌ
を含んでいた。同様に試料Ｂとのインキュベーション混
合物は５ｍ単位未満のＶＩＩＩ：Ｃ／ｍｌを含んでい
た。 【００３９】実験Ｃ 緩衝液Ｃで１０００倍に希釈した８０μｌのＦＶＩＩＩ
試料を３μｌの０．１５Ｍ ＭｎＣｌ₂ と混合した。４
８時間インキュベーションの後、１７０ｍ単位のＶＩＩ
Ｉ：Ｃ／ｍｌを測定した。緩衝液Ｃで１０００倍に希釈
した８０μｌのＦＶＩＩＩ試料を３μｌの緩衝液Ｃと混
合した。４８時間インキュベーションの後、１４０ｍ単
位のＦＶＩＩＩ：Ｃ／ｍｌを測定した。 【００４０】例２ 試料Ａ及びＢをそれぞれ緩衝液Ｃで１０倍に希釈した。
２０μｌのＡ １：１０を２０μｌのＢ（１／１０に希
釈）、３μｌの２．２Ｍ ＣａＣｌ₂ 及び４０μｌの緩
衝液Ｃと混合した。２２℃で１２日間のインキュベーシ
ョンの後、インキュベーション混合物は１３００ｍ単位
のＶＩＩＩ：Ｃ／ｍｌを含んでいた。 【００４１】次の実験は比較のために行った。この試験
は上記の方法を繰返したが、３μｌの緩衝液を２．２Ｍ
ＣａＣｌ₂の代わりに加えた。２２℃で１２日間のイ
ンキュベーションの後、インキュベーション混合物は５
ｍ単位未満のＶＩＩＩ：Ｃ／ｍｌを含んでいた。 【００４２】例３ 試料Ａ及びＢをそれぞれ緩衝液Ｃで１００倍に希釈し
た。１００μｌのＡ及び１００μｌのＢを混合した。５
０μｌの混合物を上記のようにコアテストで試験した。
１．５ｍ単位／ｍｌが混合物中に測定された。５０μｌ
の混合物をＰＬの添加前ＦＩＸａ／ＦＸで１時間プレイ
ンキュベーションの変形コアテストでさらに試験した。
これによって、コアテスト活性は３．０ｍ単位／ｍｌに
上昇した。 【００４３】次の実験を比較のために行った。ＦＶＩＩ
Ｉ試料を緩衝液Ｃで３０，０００倍に希釈した。５０μ
ｌの希釈試料を上記のようにコアテストで試験した。
３．４ｍ単位／ｍｌが測定された。 【００４４】５０μｌの希釈ＦＶＩＩＩ試料をＰＬの添
加前ＦＩＸａ／ＦＸで１時間プレインキュベーションの
変形コアテストでさらに試験した。希釈ＦＶＩＩＩ試料
について３．８ｍ単位／ｍｌが測定された。 【００４５】例４ 例１に記載したように実験を行った場合、２４時間イン
キュベーション後１０００ｍ単位のＶＩＩＩ：Ｃ／ｍｌ
が測定された。４０μｌのＦＩＸａ／ＦＸを４０μｌの
緩衝液Ｃの代りに添加した場合、１６００ｍ単位／ｍｌ
が２４時間インキュベーションの後に測定された。 【００４６】次の実験を比較のために行った。実験は例
１、第１比較実験に記載したように行った。２４時間イ
ンキュベーション後、５ｍ単位未満／ｍｌがインキュベ
ーション混合物で測定された。 【００４７】比較のために他の実験を次のように行っ
た。緩衝液Ｃで５００倍に希釈した４０μｌのＦＶＩＩ
Ｉ試料を４０μｌのＦＩＸａ／ＦＸ及び３μｌの０．１
５Ｍ Ｍｎ²⁺と混合した。２４時間インキュベーション
後、１２０ｍ単位／ｍｌが測定された。４０μｌのＦＩ
Ｘａ／ＦＸを４０μｌの緩衝液Ｃで置換えると、１７０
ｍ単位／ｍｌが測定された。さらに３μｌの０．１５Ｍ
Ｍｎ²⁺を３μｌの緩衝液Ｃで置換えると、１４０ｍ単
位／ｍｌが測定された。 【００４８】例５ 試料Ａ及びＢをそれぞれ緩衝液Ｃで２０倍に希釈した。
２０μｌのＡ １／２０を２０μｌのＢ １／２０、４
０μｌのＦＩＸａ／ＦＸ及び３μｌの０．１５Ｍ Ｃａ
Ｃｌ₂ と混合した。２２℃で４時間のインキュベーショ
ンの後インキュベーション混合物は１９９ｍＵのＦＶＩ
ＩＩ：Ｃ／ｍｌを含んでいた。混合物のＦＩＸａ／ＦＸ
を４０μｌの緩衝液Ｃで置換すると、４３ｍＵのＦＶＩ
ＩＩ：Ｃ／ｍｌが４時間インキュベーションの後に測定
された。 【００４９】例６ それぞれ８００単位のＦＶＩＩＩ−ＬＣ：Ａｇ／ｍｌ及
び８５０単位のＦＶＩＩＩ−ＨＣ：Ａｇ／ｍｌを含むＦ
ＶＩＩＩ−ＬＣ及びＦＶＩＩＩ−ＨＣ試料を３倍に希釈
した。２０μｌのＦＶＩＩＩ−ＬＣの２０μｌの１／３
をＦＶＩＩＩ−ＨＣの２０μｌの１／３およびＭｅ²⁺の
１０μｌと混合した。混合物ＡではＭｅ²⁺は２５ｍＭｎ
²⁺に相当した。混合物ＢではＭｅ²⁺は２５０ｍＭ Ｃａ
²⁺に相当し、混合物ＣではＭｅ²⁺は２５ｍＭ Ｍｎ²⁺及
び２５０ｍＭ Ｃａ²⁺に相当した。２４時間インキュベ
ーション後、混合物Ａは１０．３単位のＦＶＩＩＩ：Ｃ
／ｍｌを含み、混合物Ｂは４．０単位、混合物Ｃは１
２．９単位のＦＶＩＩＩ：Ｃ／ｍｌを含んでいた。１４
４時間インキュベーション後、混合物Ａ、Ｂ及びＣはそ
れぞれ６．６単位、６．５単位及び１１．９単位のＶＩ
ＩＩ：Ｃ／ｍｌを含んでいた。 【００５０】例７ ＣＯＳ細胞は８０ｋＤ鎖を発現するプラスミドｐＳＶＦ
８−８０で移入された。デンマーク特許出願0428/87 参
照。８７０単位のＦＶＩＩＩ−ＬＣ：Ａｇ／ｍｌを含む
培養からの上澄みをプラスマ精製ＦＶＩＩＩ−ＨＣで補
充し最終濃度２０ＦＶＩＩＩ−ＨＣ：Ａｇ単位／ｍｌ及
びＭｎ²⁺を最終濃度５ｍＭとした。２２℃で２４時間イ
ンキュベーション後、混合物は１３７単位のＦＶＩＩ
Ｉ：Ｃ／ｍｌを含む。１０００ｍ単位のＦＶＩＩＩ−Ｌ
Ｃ：Ａｇ／ｍｌの濃度でプラスマ精製ＦＶＩＩＩ−ＬＣ
をＦＶＩＩＩ−ＨＣ及びＭｎ²⁺で同様に補充すると、イ
ンキュベーション混合物は３３ｍ単位のＦＶＩＩＩ：Ｃ
／ｍｌを２４時間インキュベーション後に含んでいた。
培養上澄みをＦＶＩＩＩ−ＨＣなしでＭｎ²⁺のみで補充
すると混合物は２４時間インキュベーション後２．５ｍ
単位未満のＦＩＩＩ：Ｃ／ｍｌを含んでいた。 【００５１】例８ ２５μｌのＦＶＩＩＩ−ＬＣを２５μｌのＦＶＩＩＩ−
ＨＣ、７μｌのＭｎＣｌ₂ 及び１０μｌのレドックス剤
と緩衝液Ｃ中で混合して表２に示す個々の成分の最終濃
度を得た。ＦＶＩＩＩ：Ｃは２０℃で５時間インキュベ
ーション後に測定した。 【００５２】 表 ２ レドックス剤の存在下の FVIII−LC及び FVIII−HCの組換え FXIII FXIII mM レドックス ５時間後 -LC:Ag -LC:Ag 剤 FVIII-LC:AG 単位／ml 単位／ml MnCl₂ に対する %FVIII:C １１ １１ ５ 無 ４．９ １１ １１ ５ 15μＭ DTT １６．８ １１ １１ ５ 150μＭ ME １８．８ １１ １１ ５ 30μＭ Cys １７．４ １１ １１２ ５ 15μＭ Cys ６８．８ １１ １１ ０ 無 ＜０．５ ＤＤＴ（ジチオトレイトール）、ＭＥ（メルカプトエタ
ノール）及びＣｙｓ（システイン）の上記濃度で、水性
緩衝液中で酸化及び還元形態の間に平衡が存在する。 【００５３】例９ ＦＶＩＩＩ−ＨＣを上記のようにし、かつＥＤＴＡ溶出
緩衝液及び透析緩衝液を５０μｍのメルカプトエタノー
ルと混合する変形をして製造した。希釈後ＦＶＩＩＩ−
ＨＣ試料との組換えが、メルカプト エタノールを３５
μＭに、ＭｎＣｌ₂ を５ｍＭに、ＦＶＩＩＩ−ＬＣを２
２ＦＶＩＩＩ−ＬＣ：Ａｇ単位／ｍｌに添加して室温で
緩衝液Ｃ中で２０時間インキュベーションで行われた。 【００５４】 表 ３ ２のＦＶＩＩＩ−ＨＣ試料タイプでの組換え 組換え混合物中 ２０時間後 FVIII-HC:Ag FVIII-HC:Ag FVIII-HC 単位／ｍｌ に対する％FVIII-HC 上記で製造した 試料１ ２．５９ ３１ 上記で製造した 試料２ ３．３１ ２７ この例で述べた ＭＥで製造した 試料３ ３．００ ８９ 例１０ 次の組成のインキュベーション混合物を分離ＦＶＩＩＩ
フラグメントから緩衝液Ｃ中で製造した。６０単位／ｍ
ｌのＦＶＩＩＩ−ＬＣ、６０単位／ｍｌのＦＶＩＩＩ−
ＨＣ，５０ｍＭのＣａＣｌ₂ 、２単位／ｍｌのＦＸ。 【００５５】室温で２０時間インキュベーション後、
６．９ＦＶＩＩＩ：Ｃ単位／ｍｌを測定した。ＦＸを含
まない対応インキュベーション混合物中、２０℃２０時
間インキュベーション後０．５９ＦＶＩＩＩ：Ｃ単位／
ｍｌを測定した。

【図面の簡単な説明】 【図１】試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析図である。

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．Ｍｎ²⁺又はＭｎ²⁺とＣａ²⁺との併用によって結合さ
   れ、分子量９２〜２１０ｋＤのＶＩＩＩ因子のＮ末端フ
   ラグメントと分子量８０〜７０ｋＤのＶＩＩＩ因子のＣ
   末端フラグメントとのコンプレックスを包含する凝固活
   性剤。