JP2676114B2 - ｈＢＮＰを認識するモノクローナル抗体および該抗体を用いるｈＢＮＰの免疫測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、hBNPを認識するモノクローナル抗体および
該抗体を用いるhBNPの免疫測定法に関する。

さらに詳細には、hBNPのリング構造を認識し、10¹¹M
^-1以上の親和定数を有し、hBNPのＣ末端断片、rBNP、お
よびα−hANPを実質的に認識せず、IgG₁サブクラスに属
するモノクローナル抗体および該抗体を用いるhBNPのラ
ジオイムノアッセイに関する。

従来の技術 心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）の心臓におけ
る発見、およびそれに続く脳における発見以来、ANP
は、ホルモンおよび神経ペプチドとして、体液の恒常性
および血圧調節に関連するものとされてきた（Nakao,K.
ら,J.Hypertension 4［Suppl 6］:S492−S496,1986）。
本発明者らは既に、心臓におけるANPの合成および分泌
が、欝血性心臓疾患患者において、その重症度に応じて
増加することを示した（Sugawara,A.ら,J.Clin.Invest.
81:1962−1970,1988）。

最近、豚の脳から、脳ナトリウム利尿ペプチド（BN
P）が単離された。これには、26個のアミノ酸残基から
なる豚（ｐ）BNP−26と、32個のアミノ酸残基からなるp
BNP−32が存在する。また、これらは、ANPと顕著なアミ
ノ酸配列相同性を有しており、ANPと類似した末梢およ
び中枢での作用を有している（Sudoh,T.ら,Nture 332:7
8−81,1988）。本発明者らは、さらに、BNPは豚心臓で
も合成され、血流へ分泌されることを示した（Saito,Y.
ら,Biochem.Biophys.Res.Commun.158:360−368,198
9）。それに続き、ラット心臓から45アミノ酸残基から
なるラットBNP（rBNP）が単離された（Itoh,H.ら,Bioch
em.Biophy.Res.Commun.161:732−739,1989）。しかし、
現在なお、ヒトBNPに関する報告は殆ど無く、これは主
に、ヒトBNP（hBNP）がpBNPやrBNPに対する抗血清に交
差反応性を有しないためである。

最近、hBNP前駆体をコードするcDNA配列の解明に続き
（Sudoh,T.ら,Biochem.Biophys.Res.Commun.159:1427−
1434,1989）本発明者らは、ヒト心房からhBNPを単離
し、そのアミノ酸配列を決定した（Kambayashi,Y.ら,FE
BS Lett.259:341−345,1990）。hBNPは32アミノ酸残基
からなり、hBNP前駆体の配列77−108に一致する。

発明が解決しようとする課題 hBNPを特異的に認識するモノクローナル抗体は末だ得
られておらず、また、上記の様にhBNPはpBNPやrBNPに対
する抗血清に交差反応性を有しないため、hBNPに関する
報告はほとんどなく、未解明の部分が多く残されてい
る。

従って、hBNPを特異的に認識するモノクローナル抗体
が得られれば、hBNPに関する研究の進歩に大いに貢献す
るものとなり、hBNPの医薬などとしての応用が期待され
る。また、hBNPの測定系が確立されれば、hBNPの増減を
指標とする疾病の診断が可能になる。

課題を解決するための手段 上記の状況に鑑みて、本発明者らは、鋭意研究を行な
った結果、hBNPに対するモノクローナル抗体を調製し、
hBNPに特異的なラジオイムノアッセイ（RIA）を確立す
ることに成功した。さらに、このRIAを用いることによ
り、健常ヒト心臓および病的ヒト心臓におけるhBNPの合
成と分泌を詳細に検討することができた。

本発明は、hBNPを認識するモノクローナル抗体を提供
する。該モノクローナル抗体は、以下のような性状を有
しているがが好ましい。

（１）hBNPのリング構造を認識する （２）hBNPに対して10¹¹M^-1以上の親和定数を有する （３）hBNPのＣ末端断片、rBNP、およびα−hANPを実質
的に認識しない （４）IgG₁サブクラスに属する 詳細には、本発明においては、上記の性状を有するモ
ノクローナル抗体KY−hBNP−ＩおよびKY−hBNP−IIが得
られた。

本発明のモノクローナル抗体KY−hBNP−ＩまたはKY−
hBNP−IIを産生するハイブリドーマは、茨城県つくば市
東１丁目１番３号の微生物工業技術研究所に、平成２
（1990）年４月11日から、Mouse Hybridoma KY−hBNP−
ＩおよびMouse Hybridoma KY−hBNP−II、微工研条寄第
2862号（FERM BP−2862）および微工研条寄第2863号
（FERM BP−2863）として、それぞれブタペスト条約に
基づき寄託されている。

本発明のハイブリドーマは、hBNP免疫活性を有するペ
プチドで免疫したマウスの脾臓細胞と、適切なマーカー
を有するミエローマ細胞との融合により得られたハイブ
リドーマから、上記の様な性状を有するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得
られる。このハイブリドーマの調製は、実質的に、Muko
yama,M.ら,Hypertension 12:117−121,1988に記載の方
法に従えばよい。hBNP免疫活性を有するペプチドとして
は、本来のhBNP（hBNP前駆体の77−108アミノ酸配列に
対応）のみならず、例えばhBNP前駆体の83−108アミノ
酸配列に対応するhBNP−26を使用してもよい。

得られたハイブリドーマはマウスの腹腔内で増殖さ
せ、該腹腔内に蓄積された腹水からモノクローナル抗体
を採集する。ハイブリドーマを培養液中で培養し、該培
養液からモノクローナル抗体を採集することも可能であ
るが、生産性の点で前者が好ましい。

本発明は、さらに、上記の性状を有するモノクローナ
ル抗体を用いるhBNPの免疫測定法を提供する。この免疫
測定法としては、ラジオイムノアッセイが好ましい。本
発明のRIAは、上記の優れた性状を有するモノクローナ
ル抗体を使用するので、最小検出濃度が0.3fmol/tube、
50％結合阻害濃度が2.5〜3fmol/tubeと極めて高感度で
あり、かつ、α−hANPやrBNPと実質的に交差反応性を有
さずhBNPに極めて特異的である。また、本発明のRIAは
極めて高感度かつ特異的であるため、例えば血漿からhB
NPを抽出することなく、血漿サンプル中のBNPレベルを
直接測定することが可能である。

さらに、このRIAを用いることにより、健常ヒト心臓
および病的ヒト心臓におけるhBNPの合成と分泌を詳細に
検討することができた。

本発明においては、BNPがヒトの新規な心臓ホルモン
であることが示された。冠状静脈洞から採取された血漿
中のhBNPの濃度の上昇（表III）から、循環血液中のhBN
P源が心臓であることは明らかである。組織hBNPレベル
は、心房よりも心室のほうが低いが、BNP/ANP比は心房
よりも心室のほうが遥かに高く、心臓の全hBNP量に対す
る心室hBNPの比率は、心室ANPのそれと較べて、一桁高
い値を示す（表Ｉ）。これらの知見から、心室がかなり
の量のhBNPを産生分泌するので、心室は、循環血液中の
hANPよりも、循環血液中のhBNPにより大きな影響を及ぼ
すと考えられる。以上の仮説は、心室の心臓細胞が、心
房の心臓細胞よりも迅速に、コンスティテューティブ
（constitutive）経路を介して分泌するという報告にも
支持される。

本発明においては、血漿hBNPレベルが、CHF患者にお
いて、その重症度に比例して顕著に増加することが示さ
れた。血漿BNP−LIレベルは、通常では1fmol/ml以下で
あるが、最も重篤な症例においては500fmol/mlにまで達
した（第４図）。このように、hBNPの血漿レベルの％増
加率は、重篤な症例では、ANPに比べて１桁以上も大き
いものであった（表II）。血漿hBNPレベルのこのような
上昇は、表IIIに示されるように、病的心臓ではhBNPの
分泌が増加することによるものである。以上から、病的
心臓においては、ANPの合成分泌が心房のみならず心室
においても増加していることがわかる、従って、CHFに
見られるhBNPの血漿レベルの上昇は、ANPよりも格段に
高く、心室hBNPによるものであると考えられる。これ
は、病的心臓の心室のhBNPmRNAの総量が心房よりもかな
り多いという、本発明者らの知見とよく一致した。

本発明におけるもうひとつの重要な知見は、hBNPがα
−hANPよりも長く循環血液中に保持されるということで
あり、これはBNP/ANP比の増加の順位が、冠状静脈洞＜
大動脈＜大腿静脈である（表III）ことから明らかであ
る。またこの事実は、循環器系からのhBNPの代謝クリア
ランスが、α−hANPよりも低いことを示している。従っ
て、CHF患者では、心臓からのhBNPの分泌の増加に加え
て、hBNPのクリアランスの低さが血漿hBNPレベルの上昇
をさらに増強することになる。ナトリウム利尿ペプチド
受容体は２つのカテゴリー、すなわち、クリアランス受
容体と、膜型グアニル酸シクラーゼに結合した生物学的
に活性な受容体に分類されるという仮説がある。そこで
本発明者らは、ヒトおよび牛の肺から調製されたクリア
ランス受容体へのhBNPの結合活性と、培養ヒト糸球体間
質細胞および牛内皮細胞でのhBNPのcGMP産生能を調べ
た。hBNPおよびα−hANPのcGMP産生能は同等であるが、
hBNPのクリアランス受容体への結合活性はα−hANPの約
７％であった。このことは、循環血液からのhBNPのクリ
アランスが遅いという興味深い事実と一致する。BNPに
比較的特異的な生物学的に活性な受容体の最近の発見を
考え合わせると、α−hANPと異なるhBNPの生物学的臨床
的特徴は、hBNPの生理学的病態生理学的意義を解明する
手がかりとなり、CHFのような病的状態においては、ANP
よりもhBNPが重要な役割を果たしていることを示唆して
いる。

hBNP前駆体の翻訳後の切断は、ヒトANP前駆体とは異
なっている。ANPは前駆体γ−ANPとして心臓細胞に蓄積
され、分泌の際にPro⁹⁷−Arg⁹⁸間がタンパク質分解酵素
に切断され、α−hANPとなる。hBNP前駆体中には、hBNP
配列の前に、同じ切断シグナルPro⁷⁵−Arg⁷⁶が存在する
が、hBNPが心臓における主な蓄積形態であり、かつ成熟
ホルモンとして体内を循環する。このhBNPの切断様式
は、rBNPと同じであるが、ANP様式をとるpBNPとは異な
る。ANPやBNPなどのナトリウム利尿ペプチドの異なる切
断様式のメカニズムや意義を解明するためには、さらな
る研究が必要であろう。

本発明は、BNPが新規なヒトの心臓ホルモンであり、C
HF患者においてBNPの循環血液中への分泌および蓄積がA
NPよりも顕著に増加することを明らかにした。受容体の
多様性に関する最近の報告を考慮すると、これらの知見
は、巧妙な２つのナトリウム利尿ペプチド系において、
BNPがANPとは異なる生理学的病態生理学的役割を果たし
ていることを示唆している。

以上の検討結果から、本発明のRIAが、心臓病を含む
循環器疾患の診断に有用であることは明らかであり、ま
たANPの測定と組み合わせることにより、循環器疾患の
詳細な診断が可能になる。

本明細書中で用いられる略号は、以下の通り。

BNP:脳性ナトリウム利尿ペプチド hBNP:ヒトBNP pBNP:豚BNP rBNP:ラットBNP ANP:心房性ナトリウム利尿ペプチド −LI:一様免疫反応性 CHF:欝血性心疾患 NYHA:New York Heart Association 実施例 モノクローナル抗体の調製 2.3mgのhBNP−26（hBNP［83−108］）を、カルボジイ
ミドを用いて、牛チログロブリン（9.1mg、Sigma）に結
合させた（Nakao,K.ら,Biochem.Biophys.Res.Commun.12
4:815−821,1984）。フロイントの完全アジュバントに
乳濁させた20μｇのhBNP−26を有する上記結合物を、２
〜３週間隔で２ケ月にわたり、BALB/cマウスに皮下投与
して、免疫する。２匹のマウスにおいて抗体価が上昇し
たので、より高い反応性を示した１匹を、細胞融合に用
いた。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞X63−Ag8.653と
の融合は、Mukoyama,M.ら,Hypertension 12:117−121,1
988に記載の方法に従った。得られたハイブリドーマ
は、hBNPのRIAにより抗体産生能に基づき選択し、限界
希釈法によりクローン化して、BALB/cマウスの腹腔内で
増殖させた。モノクローナル抗体のアイソタイプは、マ
ウスモノクローナルタイピングキット（Miles社製）を
用いて、オクタロニー法により決定した。結合親和性
は、hBNPのRIAを用いるスキャッチャードプロットによ
り求めた。

組織と抽出 心臓組織は、心臓の合併症を有しない患者から剖検に
より得、またCHF患者から剖検または心臓外科手術によ
り得た。サンプルは、液体窒素中で直ちに凍結し、抽出
まで−70℃で保存した。組織からのBNPの抽出は、Sugaw
ara,A.ら,J.Clin.Invest.81:1962−1970,1988に記載の
方法で行なった。

血漿サンプル 血漿サンプルは、通常の塩摂取量（163±15mEq/d）の
11人の健常者（25−33歳、平均29.6歳）、および39人の
心臓病患者（16−78歳、平均54.5歳）から採取した。そ
の患者のうち、12人は冠不全、９人は心臓弁膜症、７人
は肥大性心筋症、７人は高血圧性心疾患、２人は先天性
心疾患、１人は肥大性閉塞性心筋症、１人は心筋炎であ
った。New York Heart Association（NYHA）の分類に従
えば、８人がクラスI,10人がクラスII、16人がクラスII
I、５人がクラスIVに分類される。腎臓疾患はいずれも
有していなかった。血液は、一夜絶食後仰臥位で前肘静
脈から午前９時に採集し、Na₂EDTA（1mg/ml）とアプロ
チニン（1,000KIU/ml）を含む冷却したガラスチューブ
に直ちに移し、４℃で遠心した。心臓カテーテルを挿入
している６人の患者では、血漿サンプルは、冠状静脈
洞、大動脈、大腿静脈を含む種々の部位から採集した。
血漿は直ちに凍結し、アッセイまで−20℃で保存した。

hBNPのRIA ［Tyr⁰］−hBNP−26（１μｇ）を、クロラミンＴ法
（Nakao,K.ら,Biochem.Biophys.Res.Commun.124:815−8
21,1984）により、放射性ヨウ素で標識した。［¹²⁵I］
［Tyr⁰］−hBNP−26の比活性は、500〜900μCi/μｇで
あった。モノクローナル抗体（腹水最終希釈率、1:5×1
0⁶）は、0.2mlのアッセイバッファー（0.1％ゼラチン、
0.1％Tfiton X−100、1mM Na₂EDTA、0.2mM L−cystin
e、および0.1％NaN₃を含む50mMリン酸バッファー、pH7.
4）中で、標準hBNPまたはサンプルのいずれかと共に、2
4時間４℃でインキュベートする。次いで、0.05mlの［
¹²⁵I］［Tyr⁰］−hBNP−26（10,000cpm）を加え、その
混合物をさらに24時間４℃でインキュベートする。結合
リガンドと遊離リガンドは、デキストランコーテッドチ
ャコール法（Nakao,K.ら,Biochem.Biophys.Res.Commun.
124:815−821,1984）により分離した。

血漿BNP様免疫活性（BNP−LI）は、抽出後または抽出
無しで測定した。抽出無しのRIAでは、25μｌの血漿を
インキュベーション混合物に加えた。無ホルモン血漿
（Sugawara,A.ら,Hypertension 8［Suppl I］:I−151−
155,1986）を、標準曲線の構築および血漿サンプルの希
釈に用いた。抽出を行なうアッセイでは、５〜10mlのサ
ンプルをSep−Pak C₁₈カートリッジ（Waters）で処理し
た（Saito,Y.ら,Biochem.Biophys.Res.Commun.158:360
−368,1989）。血漿に添加した３〜15fmol/mlのhBNPの
平均回収率は、70％だった。抽出後の血漿中のBNP−LI
の最小検出量は0.4fmol/mlであり、抽出無しの血漿中の
BNP−LIの最小検出量は10fmol/mlだった。

ANPのRIA ANPのRIAは、Nakao,K.ら,Biochem.Biophys.Res.Commu
n.124:815−821,1984に記載の方法に従った。このRIA
は、α−hANPのＣ末端部位（α−hANP［17−28］）を認
識する。hBNPとの交差反応性は、分子レベルで0.01％未
満だった。

高速ゲル浸透クロマトグラフィー （HP−GPC） HP−GPCは、Sugawara,A.ら,J.Clin.Invest.81:1962−
1970,1988に記載の方法で、TSK−GEL G2000 SWカラム
（7.5×600mm、東洋曹達）を用いて行なった。

逆相高速液体クロマトグラフィー （RP−HPLC） RP−HPLCは、Nucleosil 5C₁₈カラム（4.6×150mm、Na
gel）を用いて行ない、0.1％トリフルオロ酢酸中のアセ
トニトリル濃度勾配15％→30％により溶出した（Kambay
ashi,Y.ら,Biochem.Biophys.Res.Commun.163:233−240,
1989）。

統計分析 データは、平均±標準偏差（SE）で示した。統計分析
は、スチューデント検定、ダンカンマルチプルレンジ検
定またはウィルコクソン検定を適宜用いて行なった。直
線回帰分析を用いて、結果の相関性を決定した。

結果 モノクローナル抗体の調製および特性化 細胞融合の後、288ウエルのうち３つのクローンが抗
体反応陽性を示した。これらをさらに培養し、クローン
化して、強い反応性を有するクローンを２つ選択した。
このようにして確立されたモノクローナル抗体の１つ
を、KY−hBNP−Ｉと命名した。このモノクローナル抗体
は、IgG₁サブクラスに属し、hBNPに対して親和定数1.0
×10¹¹M^-1を有する。hBNPのRIAにおけるこのモノクロー
ナル抗体の特異性を第１図Ａに示す。hBNP−26は、hBNP
と同一の交差反応性を示したが、hBNPのＣ末端断片であ
るhBNP［103−108］は交差反応性を示さなかった（0.00
1％未満）。これらの結果は、本発明のモノクローナル
抗体がhBNPのリング構造を認識することを示している。

もう一方の抗体は、KY−hBNP−IIと命名した。これ
は、IgG₁サブクラスに属し、hBNPに対して親和定数1.8
×10¹¹M^-1を有する。hBNPのRIAにおけるこのモノクロー
ナル抗体の特異性を第１図Ｃに示す。hBNP−26は、hBNP
と同一の交差反応性を示したが、hBNPのＣ末端断片であ
るhBNP［103−108］は交差反応性を示さなかった（0.00
1％未満）。これらの結果は、本発明のモノクローナル
抗体がhBNPのリング構造を認識することを示している。

hBNPのRIA KY−hBNP−Ｉを用いるhBNPのRIAではその標準曲線
（第１図Ａ）から明らかなように、最小検出量は0.3fmo
l/tubeであり、50％結合阻害濃度は3fmol/tubeであっ
た。α−hANPやrBNPとの交差反応性は0.005％未満であ
った。pBNP−32は分子レベルで0.1％の交差反応性を示
した。測定内および測定間誤差は、それぞれ8.4％（ｎ
＝８）および6.4％（ｎ＝８）であった。

KY−hBNP−IIを用いるhBNPのRIAではその標準曲線
（第１図Ｃ）から明らかなように、最小検出量は、0.3f
mol/tubeであり、50％結合阻害濃度は2.5fmol/tubeであ
った。α−hANPやrBNPとの交差反応性は、それぞれ0.14
％および0.01％であった。pBNP−32は分子レベルで3.0
％の交差反応性を示した。

健常心臓中のBNP−LI ヒト心房および心室抽出物の段階希釈曲線は、第１図
Ｂに示されるように、標準曲線と平行であった。健常心
房および心室中のBNP−LIの組織レベルおよび含有量
を、表Ｉに示す。心房中のBNP−LIの平均濃度は250pmol
/gであり、かなりの量のBNP−LI（18±3pmol/g）が心室
で検出された。組織重量を考慮すると、心室中のBNP−L
I総量（4.5nmol）は、全心臓中の総量（15.3nmol）の約
30％に匹敵した。BNP/ANP比は、心房において（2.6％）
よりも、心室において（49％）かなり高かった。

第２図Ａは、健常ヒト心房からの抽出物の典型的なHP
−GPCプロファイルを示す。BNP−LIは、心房において12
Kと3Kダルトンの２つの成分からなるが、3Kのほうが主
成分であった。3KのBNP−LIの溶出位置は、合成hBNPと
一致した。12K成分は、hBNP前駆体と一致した。心室か
らの抽出は、第２図Ａに示されるように、実質的に同一
のHP−GPCプロファイルを示した。対照的に、健常心臓
中のANP−LIは、α−hANPの前駆体であるγ−hANPであ
った（第２図Ａ）。3KのBNP−LIをさらに解析するため
に、心房抽出物のRP−HPLCプロファイルを分析した。第
２図Ｂに示されるように、3KのBNP−LIの保持時間は合
成hBNPと一致した。

健常人の血漿BNP−LI 血漿抽出物の段階希釈曲線はhBNPの標準曲線と平行で
あった（第１図Ｂ）。11人の健常人の血漿BNP−LIレベ
ルは0.90±0.07fmol/mlであり、一方そのANP−LIレベル
は6.4±0.9fmol/mlであった。血漿BNP/ANP比は16±２％
であった。

病的心臓におけるBNP−LI 病的心臓におけるBNP−LIレベルは表１に示す。正常
心臓のレベルと比較すると、心房におけるBNP−LIレベ
ルは差がないが、心室のレベルは２倍以上高かった。す
なわち、心室のBNP−LIレベルは、心房の22％にまで達
した。組織重量を考慮すると、心室内の全BNP−LI量
は、心房内の量を越える。ANP−LIの組織レベルは、病
的心臓の心房と心室の両方で上昇しており、心室内の全
ANP−LI量は、心臓全体の12％であった。

第３図ＡおよびＢは、それぞれ病的ヒト心房および心
室からの抽出物の代表的HP−GPCプロファイルを示す。
病的心臓の心房抽出物中のBNP−LIは２つの成分からな
り、ひとつは主成分のhBNPであり、一方は少量の前駆体
であった。これは、正常心房におけるプロファイルと一
致した（第２図Ａ）。病的心室のBNP−LIも実質的に同
一のHP−GPCプロファイルを示した（第３図Ｂ）。ANP−
LIに関しては、健常心臓ではほとんど検出できないα−
hANPが病的心房内で増加しており（第３図Ａ）、また心
室内ではγ−hANPがほとんどであった（第３図Ｂ）。

CHFの血漿BNP−LI 血漿の段階希釈曲線はhBNPの標準曲線と平行であった
（第１図Ｂ）。第４図は、健常人と39人の心疾患患者に
おける血漿BNP−LIレベルを示す。CHFを有しない８人の
患者（NYHAクラスＩ）のうち、４人の患者で血漿BNP−L
Iレベルは10fmol/ml以下であり、他４人の患者で僅かに
上昇した（14〜22fmol/ml、平均±標準偏差;14.3±1.8f
mol/ml）。NYHAクラスIIの10人の患者のうち、４人では
BNP−LIレベルが10fmol/ml以下であったが、６人のBNP
−LIレベルが上昇し（12〜399fmol/ml）、全体では68.9
±37.9fmol/mlであった。重篤なCHFを有する21人の患者
（NYHAクラスIIIまたはIV）では、血漿BNP−LIレベルは
顕著に増加した（NYHAクラスIII、15〜539fmol/ml、15
5.4±39.1fmol/ml;クラスIV、119〜563fmol/ml、267.3
±79.9fmol/ml）。このように、血漿BNP−LIレベルの累
進的増加は、CHFの重症度に比例していた。

血漿ANP−LIレベルは病気の重症度に従って明らかに
増加し（NYHAクラスＩ、24.9±7.2fmol/ml;クラスII、5
2.4±19.4fmol/ml;クラスIII、109.3±21.8fmol/ml;ク
ラスIV、164.4±20.3fmol/ml）、血漿BNP−LIレベルと
相関性が高かった（ｒ＝0.747、ｐ＜0.01）。しかし、
血漿中のBNP−LI/ANP−LI比は、CHFの重症度に応じて、
著しく変化した。健常人では血漿BNP−LIレベルがANP−
LIレベルの16％であるのに対して、重篤なCHF（NYHAク
ラスIIIおよびIV）を有する患者の平均血漿BNP−LIレベ
ルはANP−LIレベルよりもずっと高かった。血漿内のBNP
−LIとANP−LIの関連をさらに分析するために、対象を
その血漿ANP−LIレベルに従って４つのグループに分類
した（表II）。通常の血漿ANP−LIレベルを有するグル
ープＡでは、血漿BNP−LIレベルはかなり低かった。グ
ループＢでは、BNP−LIレベルはANP−LIのレベル付近ま
で上昇した。グループＣでは、BNP−LIレベルはANP−LI
レベルとほとんど同じであった。ほとんどの患者がNYHA
クラスIIIおよびIVに分類されるグループＤでは、BNP−
LIレベルの上昇をさらに増大し、ANP−LIレベルを越え
た。グループＡのレベルと比較すると、グループＤのBN
P−LIの増加は200〜300倍であり、20〜30倍の増加であ
るANP−LIとくらべて遥かに高い値を示した。

第３図ＣはCHF患者の血漿抽出物の典型的なHP−GPCプ
ロファイルを示す。血漿BNP−LIは主にhBNPからなる
が、その前駆体が微量成分として存在した。

心臓カテーテル中の血漿BNP−LI 表IIIは、心臓カテーテルを施された６人の患者の種
々の部位から採集された血漿中のBNP−LIおよびANP−LI
レベルを示す。冠状静脈洞の血漿BNP−LIレベルと、冠
状動脈口付近の上行大動脈のレベルとを比較すると、全
ケースにおいて冠状静脈洞の血漿BNP−LIレベルが２〜
３倍高かった。これは、BNP−LIは、心臓から冠状静脈
洞を通して循環血液へ分泌されることを示している。

冠状静脈洞のBNP−LIレベルはCHFの重症度に比例して
増加した。さらに、冠状静脈洞と大動脈間のBNP−LIの
差、すなわちその分泌率の指標となる△（CS−Ao）BNP
においても、同様の増加が見られ、これはBNP−LIの分
泌が重篤なCHFにおいて増加していることを示してい
る。冠状静脈洞のANP−LIレベルと△（CS−Ao）ANPは、
重篤な症例において上昇する傾向が見られたが、その上
昇はBNP−LIレベルと較べてかなり小さなものであっ
た。従って、△（CS−Ao）に関するBNP/ANP比は重篤な
症例において増大し、BNPの分泌が重篤なCHFにおいてAN
Pの分泌と較べてより顕著に増加することを示してい
る。

血漿BNP/ANP比は、いずれの症例においても、冠状静
脈洞よりも大動脈のほうが大きい。この比率は、大腿静
脈でさらに増加する。このBNP/ANP比の上昇は、△（CS
−Ao）に関する比率の上昇と比較しても注目される。こ
れらの結果は、BNPは、分泌後循環血液中において、ANP
よりも長く保持されることを示している。

発明の効果 BNPは、豚およびラットにおいて、心臓で合成され分
泌されることが、既に報告されていたが、ヒトにおける
BNPについてはほとんど何も知られていなかった。本発
明は、hBNPに対するモノクローナル抗体KY−hBNP−Ｉお
よびKY−hBNP−IIとhBNPの特異的で高感度なRIAを提供
する。KY−hBNP−ＩおよびKY−hBNP−IIは、hBNPの、ナ
トリウム利尿ペプチドの生物学的作用に必須なリング構
造を認識するので、本発明のRIAはhBNPのみならずＮ末
端やＣ末端が修飾（付加や削除）された形態のhBNP、例
えば、前駆体をも検出することができ、hBNPの生合成、
細胞内修飾および代謝を研究する上で有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図ＡおよびＢは、それぞれ、モノクローナル抗体KY
−hBNP−ＩによるhBNPのRIAにおける、hBNPの標準曲線
と関連ペプチドとの交差反応性および試料の希釈曲線を
示す。第１図Ｃは、モノクローナル抗体KY−hBNP−IIに
よるhBNPのRIAにおける、hBNPの標準曲線と関連ペプチ
ドとの交差反応性を示す。 第２図は、健常心房抽出物のHP−GPCプロファイル
（Ａ）およびRP−HPLCプロファイル（Ｂ）を示す（Ａ）
における矢印は、ポリペプチド分子量較正キット（Phar
macia）の一連のミオグロビンの溶出位置と、ボイド体
積（Vo）および全体積（Vt）を示す。さらに、γ−hAN
P、合成hBNPおよびα−hANPの溶出位置も示す。（Ｂ）
における矢印は、合成hBNPとα−hANPの保持時間を示
す。 第３図は、病的心臓の心房（Ａ）および心室（Ｂ）の抽
出物、およびCHF患者から採取した血漿のHP−GPCプロフ
ァイルを示す。矢印は第２図Ａと同義である。 第４図は、11人の健常人と39人の心疾患患者の血漿BNP
−LIレベルを示す。患者は、NYHAの機能的分類に従い分
類し、それぞれの群のBNP−LIレベルの平均±標準偏差
で示した。^＊Ｐ＜0.05と^＊＊Ｐ＜0.01は健常人群の値と
の比較。⁺P＜0.05と はNYHAクラスＩ群との比較。 はNYHAクラスＩ群との比較。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．166, Ｎｏ．３（1990．Ｆｅｂ．）ｐ．1080− 1087 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．158, Ｎｏ．１（1989）ｐ．120−128

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】hBNPのリング構造を特異的に認識し、FERM
   BP−2862またはFERM BP−2863の特性を有するハイブ
   リドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗
   体。
2. 【請求項２】hBNPに対して10¹¹M^-1以上の親和定数を有
   する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】hBNPのＣ末端断片、rBNP、およびα−hANP
   を実質的に認識しない請求項１に記載のモノクローナル
   抗体。
4. 【請求項４】IgG₁サブクラスに属する請求項１に記載の
   モノクローナル抗体。
5. 【請求項５】モノクローナル抗体KY−hBNP−ＩまたはKY
   −hBNP−IIである請求項１に記載のモノクローナル抗
   体。
6. 【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載のモノクロ
   ーナル抗体を産生するFERMBP−2862またはFERM BP−28
   63であるハイブリドーマ。
7. 【請求項７】請求項１〜５のいずれかに記載のモノクロ
   ーナル抗体を用いるhBNPの免疫測定法。
8. 【請求項８】ラジオイムノアッセイである請求項７に記
   載の免疫測定法。