JP2663257B2 - 生体成分測定用試薬の安定化方法 - Google Patents
生体成分測定用試薬の安定化方法Info
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- peroxidase
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酸化酵素の反応を
利用した２試薬系の生体成分測定用試薬の盲検値（ブラ
ンク）の低下・安定化をはかるものであり、主として臨
床診断薬の品質の向上に役立てるものである。 【０００２】 【従来の技術】現在まで、生体成分を測定する試薬、例
えば血清中の遊離脂肪酸、トリグリセライド、コレステ
ロール、尿酸、グルコース等を測定する様々な試薬が開
発されている。特に近年は、酵素法が開発され、より短
時間により正確にこれらの物質の測定ができるようにな
った。酵素法では主に測定しようとする生体成分そのも
のに作用する、あるいはその生体成分から酵素により二
次的に生成した物質に作用する酸化酵素が用いられる。
即ち、酸化酵素の作用で生成する過酸化水素を、フェノ
ール系化合物あるいはアニリン系化合物の適当な水素供
与体と４−アミノアンチピリンあるいはメチルベンズチ
アゾロンヒドラゾン等の適当な酸化性色素カップラーと
でパーオキシダーゼの存在下発色させ（酸化性色素カッ
プリング反応）、その吸光度を測定することにより目的
の生体成分の測定を行なう。 【０００３】こうした酵素法は、１ステップ法あるいは
２ステップ法で行なわれており、前者は測定用試薬成分
が全部一緒になった１試薬系であり、後者は試薬成分を
２つにわけた２試薬系を使う。両方法を比較すると、試
薬の安定性あるいは測定する試料中に含まれる還元物質
の影響を受けにくい等の点で一般的に２ステップ法の方
が有利である。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、２ステ
ップ法による生体成分測定試薬でも１ステップ法と程度
の差こそあれ、その保存中に試薬ブランクの上昇があ
り、これが大きな問題になる。１ステップ法は１試薬中
に発色系の試薬、即ちパーオキシダーゼ、４−アミノア
ンチピリン又はメチルベンズチアゾロンヒドラゾン等の
酸化性色素カップラー、及びフェノール系化合物又はア
ニリン系化合物等の水素供与体が共存しているため、そ
の試薬の保存中にこれらの色素が容易に酸化を受けて発
色し試薬ブランクが上昇する傾向が強い。一方、２ステ
ップ法では２試薬系であるため、発色系の試薬を酸化性
色素カップラーと水素供与体の二つに分離できるので原
理的には試薬ブランクの上昇はないはずである。ところ
が、実際は１ステップ法よりは軽度であるが徐々に試薬
ブランクが上昇する。 【０００５】このような２試薬系で試薬ブランクが上昇
する問題について、本発明者らは詳細な検討を重ねた結
果、パーオキシダーゼを含有していない方の試薬（第１
試薬又は第２試薬）に原因があることをつきとめた。 【０００６】本発明の課題は、上記パーオキシダーゼを
含有していない方の試薬の組成を改善し、測定試薬のブ
ランク上昇を抑える安定な方法を提供することである。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明は、酸化酵素の作
用により生成した過酸化水素をパーオキシダーゼの存在
下、酸化性色素カップリング反応で比色定量することに
より目的の生体成分を測定する２試薬系の測定用試薬に
おいて、パーオキシダーゼを含有していない方の試薬に
特にカタラーゼを添加し、かつ発色系試薬の水素供与体
と酸化性色素カップラーを第１試薬と第２試薬に別々に
なるように処方することを特徴とする生体成分測定用試
薬の安定化方法である。 【０００８】本発明を実施するには、２試薬系測定用試
薬のうち発色系試薬の水素供与体と酸化性色素カップラ
ーを第１試薬と第２試薬に別々になるように処方し、パ
ーオキシダーゼを含有していない方の試薬に、安定化剤
として特にカタラーゼを添加する。カタラーゼは、パー
オキシダーゼを含有していない方にのみ添加するか、あ
るいは第１試薬、第２試薬両者に添加処方する。 【０００９】また、パーオキシダーゼを含有していない
方の試薬に、カタラーゼとともにパーオキシダーゼを添
加処方してもよい。 【００１０】これに用いるカタラーゼについては起源は
問わず添加濃度は１Ｕ／ml以上が望ましい。 【００１１】本発明において過酸化水素を生成させる酸
化酵素試薬とは、目的の生体成分測定に対応し、アシル
コエンザイムＡオキシダーゼ、グリセリン−３−リン酸
オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼ、ウリカーゼ等をさし示す。 【００１２】発色系試薬の水素供与体としては、フェノ
ール系化合物又はアニリン系化合物の公知のものを用
い、酸化性色素カップラーとしては、４−アミノアンチ
ピリン又はメチルベンズチアゾロンヒドラゾンを用いる
ことができる。 【００１３】本発明は、実質的にどんな緩衝剤を含む生
体成分測定用試薬においても有効である。一般的にはp
Ｈ４〜９の範囲であり、リン酸、トリス、ＰＩＰＥＳ、
ＨＥＰＥＳ、トリシン、グリシン等の公知の緩衝剤が用
いられる。 【００１４】 【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に示す。 【００１５】実施例 遊離脂肪酸測定用試薬の安定化法 【００１６】（１）試薬の調製 試薬１ ５０mＭリン酸二水素カリウム−水酸化カリウム緩衝液
（pＨ７．０）にアシルコエンザイムＡシンセターゼ
０．４Ｕ／ml、コエンザイムＡ０．３mＭ、ＡＴＰ１．
５mＭ、４−アミノアンチピリン２mＭ、塩化マグネシウ
ム１mＭを含有する溶液を調製し、これに安定化剤とし
てカタラーゼを、０．１Ｕ／ml、１Ｕ／ml、１０Ｕ／m
l、１００Ｕ／ml、あるいは１０００Ｕ／mlとなるよう
に加える。これを第１試薬として、遮光容器中、２〜８
℃で７日間保存する。 【００１７】試薬２ １０mＭリン酸二水素カリウム−水酸化カリウム緩衝液
（pＨ７．０）にアシルコエンザイムＡオキシダーゼ５
Ｕ／ml、ＦＡＤ３μＭ、Ｎ−エチルマレイミド１mＭ、
パーオキシダーゼ４Ｕ／ml、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−m−トルイジン３mＭ
を含有する溶液を調製する。これを第２試薬として遮光
容器中、２〜８℃で７日間保存する。 【００１８】（２）測定操作 精製水０．０５mlに試薬１を１．０ml加えて、３７℃で
５分間放置し、次いで試薬２を２．０ml加えて３７℃で
５分間反応後、吸光度を５５５nmで測定する。（水を対
照） 【００１９】比較例 実施例の試薬１におけるカタラーゼのみ除いて、他は全
く同一の試薬１、２を調製し、操作法についても実施例
と同様とする。 【００２０】（３）結果 表１に示した通り、パーオキシダーゼを含んでいない第
１試薬にカタラーゼを添加することにより、試薬ブラン
クの上昇が著しく抑えられた。 【００２１】 【表１】 【００２２】 【発明の効果】各種生体成分を測定する２試薬系の測定
用試薬において、パーオキシダーゼを含有していない方
の試薬に特にカタラーゼを添加し、かつ発色系試薬の水
素供与体と酸化性色素カップラーを第１試薬と第２試薬
に別々になるように処方することにより、試薬ブランク
の経時的な上昇を防止することが可能になった。
利用した２試薬系の生体成分測定用試薬の盲検値（ブラ
ンク）の低下・安定化をはかるものであり、主として臨
床診断薬の品質の向上に役立てるものである。 【０００２】 【従来の技術】現在まで、生体成分を測定する試薬、例
えば血清中の遊離脂肪酸、トリグリセライド、コレステ
ロール、尿酸、グルコース等を測定する様々な試薬が開
発されている。特に近年は、酵素法が開発され、より短
時間により正確にこれらの物質の測定ができるようにな
った。酵素法では主に測定しようとする生体成分そのも
のに作用する、あるいはその生体成分から酵素により二
次的に生成した物質に作用する酸化酵素が用いられる。
即ち、酸化酵素の作用で生成する過酸化水素を、フェノ
ール系化合物あるいはアニリン系化合物の適当な水素供
与体と４−アミノアンチピリンあるいはメチルベンズチ
アゾロンヒドラゾン等の適当な酸化性色素カップラーと
でパーオキシダーゼの存在下発色させ（酸化性色素カッ
プリング反応）、その吸光度を測定することにより目的
の生体成分の測定を行なう。 【０００３】こうした酵素法は、１ステップ法あるいは
２ステップ法で行なわれており、前者は測定用試薬成分
が全部一緒になった１試薬系であり、後者は試薬成分を
２つにわけた２試薬系を使う。両方法を比較すると、試
薬の安定性あるいは測定する試料中に含まれる還元物質
の影響を受けにくい等の点で一般的に２ステップ法の方
が有利である。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、２ステ
ップ法による生体成分測定試薬でも１ステップ法と程度
の差こそあれ、その保存中に試薬ブランクの上昇があ
り、これが大きな問題になる。１ステップ法は１試薬中
に発色系の試薬、即ちパーオキシダーゼ、４−アミノア
ンチピリン又はメチルベンズチアゾロンヒドラゾン等の
酸化性色素カップラー、及びフェノール系化合物又はア
ニリン系化合物等の水素供与体が共存しているため、そ
の試薬の保存中にこれらの色素が容易に酸化を受けて発
色し試薬ブランクが上昇する傾向が強い。一方、２ステ
ップ法では２試薬系であるため、発色系の試薬を酸化性
色素カップラーと水素供与体の二つに分離できるので原
理的には試薬ブランクの上昇はないはずである。ところ
が、実際は１ステップ法よりは軽度であるが徐々に試薬
ブランクが上昇する。 【０００５】このような２試薬系で試薬ブランクが上昇
する問題について、本発明者らは詳細な検討を重ねた結
果、パーオキシダーゼを含有していない方の試薬（第１
試薬又は第２試薬）に原因があることをつきとめた。 【０００６】本発明の課題は、上記パーオキシダーゼを
含有していない方の試薬の組成を改善し、測定試薬のブ
ランク上昇を抑える安定な方法を提供することである。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明は、酸化酵素の作
用により生成した過酸化水素をパーオキシダーゼの存在
下、酸化性色素カップリング反応で比色定量することに
より目的の生体成分を測定する２試薬系の測定用試薬に
おいて、パーオキシダーゼを含有していない方の試薬に
特にカタラーゼを添加し、かつ発色系試薬の水素供与体
と酸化性色素カップラーを第１試薬と第２試薬に別々に
なるように処方することを特徴とする生体成分測定用試
薬の安定化方法である。 【０００８】本発明を実施するには、２試薬系測定用試
薬のうち発色系試薬の水素供与体と酸化性色素カップラ
ーを第１試薬と第２試薬に別々になるように処方し、パ
ーオキシダーゼを含有していない方の試薬に、安定化剤
として特にカタラーゼを添加する。カタラーゼは、パー
オキシダーゼを含有していない方にのみ添加するか、あ
るいは第１試薬、第２試薬両者に添加処方する。 【０００９】また、パーオキシダーゼを含有していない
方の試薬に、カタラーゼとともにパーオキシダーゼを添
加処方してもよい。 【００１０】これに用いるカタラーゼについては起源は
問わず添加濃度は１Ｕ／ml以上が望ましい。 【００１１】本発明において過酸化水素を生成させる酸
化酵素試薬とは、目的の生体成分測定に対応し、アシル
コエンザイムＡオキシダーゼ、グリセリン−３−リン酸
オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼ、ウリカーゼ等をさし示す。 【００１２】発色系試薬の水素供与体としては、フェノ
ール系化合物又はアニリン系化合物の公知のものを用
い、酸化性色素カップラーとしては、４−アミノアンチ
ピリン又はメチルベンズチアゾロンヒドラゾンを用いる
ことができる。 【００１３】本発明は、実質的にどんな緩衝剤を含む生
体成分測定用試薬においても有効である。一般的にはp
Ｈ４〜９の範囲であり、リン酸、トリス、ＰＩＰＥＳ、
ＨＥＰＥＳ、トリシン、グリシン等の公知の緩衝剤が用
いられる。 【００１４】 【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に示す。 【００１５】実施例 遊離脂肪酸測定用試薬の安定化法 【００１６】（１）試薬の調製 試薬１ ５０mＭリン酸二水素カリウム−水酸化カリウム緩衝液
（pＨ７．０）にアシルコエンザイムＡシンセターゼ
０．４Ｕ／ml、コエンザイムＡ０．３mＭ、ＡＴＰ１．
５mＭ、４−アミノアンチピリン２mＭ、塩化マグネシウ
ム１mＭを含有する溶液を調製し、これに安定化剤とし
てカタラーゼを、０．１Ｕ／ml、１Ｕ／ml、１０Ｕ／m
l、１００Ｕ／ml、あるいは１０００Ｕ／mlとなるよう
に加える。これを第１試薬として、遮光容器中、２〜８
℃で７日間保存する。 【００１７】試薬２ １０mＭリン酸二水素カリウム−水酸化カリウム緩衝液
（pＨ７．０）にアシルコエンザイムＡオキシダーゼ５
Ｕ／ml、ＦＡＤ３μＭ、Ｎ−エチルマレイミド１mＭ、
パーオキシダーゼ４Ｕ／ml、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−m−トルイジン３mＭ
を含有する溶液を調製する。これを第２試薬として遮光
容器中、２〜８℃で７日間保存する。 【００１８】（２）測定操作 精製水０．０５mlに試薬１を１．０ml加えて、３７℃で
５分間放置し、次いで試薬２を２．０ml加えて３７℃で
５分間反応後、吸光度を５５５nmで測定する。（水を対
照） 【００１９】比較例 実施例の試薬１におけるカタラーゼのみ除いて、他は全
く同一の試薬１、２を調製し、操作法についても実施例
と同様とする。 【００２０】（３）結果 表１に示した通り、パーオキシダーゼを含んでいない第
１試薬にカタラーゼを添加することにより、試薬ブラン
クの上昇が著しく抑えられた。 【００２１】 【表１】 【００２２】 【発明の効果】各種生体成分を測定する２試薬系の測定
用試薬において、パーオキシダーゼを含有していない方
の試薬に特にカタラーゼを添加し、かつ発色系試薬の水
素供与体と酸化性色素カップラーを第１試薬と第２試薬
に別々になるように処方することにより、試薬ブランク
の経時的な上昇を防止することが可能になった。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．酸化酵素の作用により生成した過酸化水素をパーオ
キシダーゼの存在下、酸化性色素カップリング反応で比
色定量することにより目的の生体成分を測定する２試薬
系の測定用試薬において、パーオキシダーゼを含有して
いない方の試薬に特にカタラーゼを添加し、かつ発色系
試薬の水素供与体と酸化性色素カップラーを第１試薬と
第２試薬に別々になるように処方することを特徴とする
生体成分測定用試薬の安定化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30047895A JP2663257B2 (ja) | 1995-10-26 | 1995-10-26 | 生体成分測定用試薬の安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30047895A JP2663257B2 (ja) | 1995-10-26 | 1995-10-26 | 生体成分測定用試薬の安定化方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61285957A Division JP2562882B2 (ja) | 1986-12-02 | 1986-12-02 | 生体成分測定用試薬の安定化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08205892A JPH08205892A (ja) | 1996-08-13 |
| JP2663257B2 true JP2663257B2 (ja) | 1997-10-15 |
Family
ID=17885290
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30047895A Expired - Lifetime JP2663257B2 (ja) | 1995-10-26 | 1995-10-26 | 生体成分測定用試薬の安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2663257B2 (ja) |
-
1995
- 1995-10-26 JP JP30047895A patent/JP2663257B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08205892A (ja) | 1996-08-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19970506 |