JP2651766B2 - 成人ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子の検出方法 - Google Patents
成人ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子の検出方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子の検出方法、さら
に詳しくは成人Ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子の検出方法
に関するものである。本発明の方法は主に臨床検査の分
野で利用される。
に詳しくは成人Ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子の検出方法
に関するものである。本発明の方法は主に臨床検査の分
野で利用される。
【０００２】
【従来の技術】ポリメラーゼチェインリアクション（Ｐ
ＣＲ）は被検出遺伝子の中の特定の領域をはさむ２種の
プライマーを用いて、その特定塩基配列の遺伝子断片を
増幅させる反応を意味している。ＰＣＲ技術は１９８５
年にMullisらによって発表されたが（R.Saiki, S.Schar
f, F.Faloona, K.Mullis, G.Horn. H.Erlich,N.Arnhei
m, Science 230,1350(1985))、以来微量の遺伝子を容易
に１万ないし１００万倍に増幅する方法として広く応用
されつつある。
ＣＲ）は被検出遺伝子の中の特定の領域をはさむ２種の
プライマーを用いて、その特定塩基配列の遺伝子断片を
増幅させる反応を意味している。ＰＣＲ技術は１９８５
年にMullisらによって発表されたが（R.Saiki, S.Schar
f, F.Faloona, K.Mullis, G.Horn. H.Erlich,N.Arnhei
m, Science 230,1350(1985))、以来微量の遺伝子を容易
に１万ないし１００万倍に増幅する方法として広く応用
されつつある。
【０００３】ＰＣＲによって増幅された遺伝子の検出方
法としては、以下に述べるように多くの方法が報告され
ている（例えば、加藤、蛋白質 核酸 酵素 35, No.1
7, 2957(1990) ）。 （１） 電気泳動法：ＰＣＲ増幅産物の電気泳動後、泳
動ゲルをエチジウムブロマイド処理して、紫外線照射下
で蛍光検出する方法である。最も一般的に行われる方法
である。 （２） ドットブロッティング法：ＰＣＲ増幅産物を変
性後、ニトロセルロースあるいはナイロン膜上に固定
し、標識されたプローブと膜上の遺伝子とをハイブリダ
イズさせる。その後ハイブリダイズしなかったプローブ
を洗浄除去し、膜上に残存するプローブを、その標識を
介して検出する。プローブの標識としては、酵素、ラジ
オアイソトープ（ＲＩ）等が用いられる。 （３） サザンブロッティング法（E.Southern, J.Mol.
Biol.98, 503(1975)）：ＰＣＲ増幅産物の電気泳動後、
遺伝子を泳動ゲルからニトロセルロース膜に移行させ、
標識されたプローブと膜上の遺伝子とをハイブリダイズ
させる。次いでハイブリダイズしなかったプローブを洗
浄除去し、膜上に残存するプローブをその標識を介して
検出する。プローブの標識としては、酵素、ラジオアイ
ソトープ（ＲＩ）等が用いられる。 （４） 標識プライマーを用いてＰＣＲを行う方法：上
記の三つの方法はＰＣＲ増幅産物に限らず、遺伝子一般
の検出に用いられるのに対して、これはＰＣＲに特有の
方法である。即ち、プライマーを酵素、ＲＩ、蛍光色素
等によって標識しておくと、ＰＣＲ増幅後の産物に標識
が取り込まれることになる。これを利用してＰＣＲ産物
を電気泳動し、取り込まれた標識体を検出する試みがい
くつかなされている。
法としては、以下に述べるように多くの方法が報告され
ている（例えば、加藤、蛋白質 核酸 酵素 35, No.1
7, 2957(1990) ）。 （１） 電気泳動法：ＰＣＲ増幅産物の電気泳動後、泳
動ゲルをエチジウムブロマイド処理して、紫外線照射下
で蛍光検出する方法である。最も一般的に行われる方法
である。 （２） ドットブロッティング法：ＰＣＲ増幅産物を変
性後、ニトロセルロースあるいはナイロン膜上に固定
し、標識されたプローブと膜上の遺伝子とをハイブリダ
イズさせる。その後ハイブリダイズしなかったプローブ
を洗浄除去し、膜上に残存するプローブを、その標識を
介して検出する。プローブの標識としては、酵素、ラジ
オアイソトープ（ＲＩ）等が用いられる。 （３） サザンブロッティング法（E.Southern, J.Mol.
Biol.98, 503(1975)）：ＰＣＲ増幅産物の電気泳動後、
遺伝子を泳動ゲルからニトロセルロース膜に移行させ、
標識されたプローブと膜上の遺伝子とをハイブリダイズ
させる。次いでハイブリダイズしなかったプローブを洗
浄除去し、膜上に残存するプローブをその標識を介して
検出する。プローブの標識としては、酵素、ラジオアイ
ソトープ（ＲＩ）等が用いられる。 （４） 標識プライマーを用いてＰＣＲを行う方法：上
記の三つの方法はＰＣＲ増幅産物に限らず、遺伝子一般
の検出に用いられるのに対して、これはＰＣＲに特有の
方法である。即ち、プライマーを酵素、ＲＩ、蛍光色素
等によって標識しておくと、ＰＣＲ増幅後の産物に標識
が取り込まれることになる。これを利用してＰＣＲ産物
を電気泳動し、取り込まれた標識体を検出する試みがい
くつかなされている。
【０００４】例えば、Kempらは増幅ＤＮＡアッセイ法と
言われる方法を発表した（D.Kemp,D.Smith, S.Foote,
N.Samaras, and M.Peterson, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA.86, 2423(1989) ）。この方法ではまず通常のＰＣ
Ｒを行った後、さらに標識プライマーを用いた第二ＰＣ
Ｒを３サイクル行う。第二ＰＣＲにおいては、一方のプ
ライマーにビオチンを他方のプライマーに酵母の転写活
性化因子ＧＣＮ４に対する結合塩基配列をそれぞれ標識
しておく。一方、酵素免疫測定用のマイクロタイタープ
レートにはＧＣＮ４を固定化しておく。第二ＰＣＲ増幅
産物をこのマイクロタイタープレートに分注して増幅さ
れた標的遺伝子をＧＣＮ４結合配列を介して固相にトラ
ップする。トラップされた遺伝子の一方の端はビオチン
で標識されているので、それをペルオキシターゼ標識ア
ビジンを用いた酵素免疫測定法によって検出する。
言われる方法を発表した（D.Kemp,D.Smith, S.Foote,
N.Samaras, and M.Peterson, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA.86, 2423(1989) ）。この方法ではまず通常のＰＣ
Ｒを行った後、さらに標識プライマーを用いた第二ＰＣ
Ｒを３サイクル行う。第二ＰＣＲにおいては、一方のプ
ライマーにビオチンを他方のプライマーに酵母の転写活
性化因子ＧＣＮ４に対する結合塩基配列をそれぞれ標識
しておく。一方、酵素免疫測定用のマイクロタイタープ
レートにはＧＣＮ４を固定化しておく。第二ＰＣＲ増幅
産物をこのマイクロタイタープレートに分注して増幅さ
れた標的遺伝子をＧＣＮ４結合配列を介して固相にトラ
ップする。トラップされた遺伝子の一方の端はビオチン
で標識されているので、それをペルオキシターゼ標識ア
ビジンを用いた酵素免疫測定法によって検出する。
【０００５】これらの方法のなかで、（１）、（３）は
ＰＣＲ増幅産物のサイズに基づいて検出するものである
ので特異性の点で劣る。（２）、（３）は煩雑な操作を
伴うプローブハイブリダイゼーションを用いるものであ
るので多数検体の処理には不向きである。（４）の方法
は電気泳動を用いないで酵素免疫測定法を用いるので、
多数の検体の検査に適していると報告されている。しか
し第二ＰＣＲを必要としている点に一般化する上での難
点が指摘される。そこで、第二ＰＣＲを行わず、第一Ｐ
ＣＲに上記標識プライマーを用いて数十回のサイクルで
増幅反応を行うことも考えられる。しかし、その場合に
は大過剰の未反応標識プライマー、とくにＧＣＮ４結合
性塩基配列で標識したプライマーが残存して、ＰＣＲ産
物が固相と反応するのを阻害するおそれがあり、それを
避けるためにＰＣＲ産物を固相と反応させる前に未反応
の標識プライマーを分離除去しておくことが必要とな
る。
ＰＣＲ増幅産物のサイズに基づいて検出するものである
ので特異性の点で劣る。（２）、（３）は煩雑な操作を
伴うプローブハイブリダイゼーションを用いるものであ
るので多数検体の処理には不向きである。（４）の方法
は電気泳動を用いないで酵素免疫測定法を用いるので、
多数の検体の検査に適していると報告されている。しか
し第二ＰＣＲを必要としている点に一般化する上での難
点が指摘される。そこで、第二ＰＣＲを行わず、第一Ｐ
ＣＲに上記標識プライマーを用いて数十回のサイクルで
増幅反応を行うことも考えられる。しかし、その場合に
は大過剰の未反応標識プライマー、とくにＧＣＮ４結合
性塩基配列で標識したプライマーが残存して、ＰＣＲ産
物が固相と反応するのを阻害するおそれがあり、それを
避けるためにＰＣＲ産物を固相と反応させる前に未反応
の標識プライマーを分離除去しておくことが必要とな
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】このように従来の酵素
免疫測定法によるＰＣＲ増幅産物の検出法は、ＰＣＲ産
物からの未反応標識プライマーの分離除去を必要とする
か、あるいはそれを避けるために前記のKempらの方法の
ように、わざわざ第二ＰＣＲを実施しなければならない
といった余分な煩雑な操作を必要としているのが実情で
ある。当業界では酵素免疫測定法を用いた簡易なＰＣＲ
増幅産物の検出方法の開発が期待されているが、ＰＣＲ
により増幅された成人Ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子の検
出方法について未だ満足すべき方法は見い出されていな
い。本発明の目的は、成人Ｔ細胞白血病ウィルスである
ＨＴＬＶ−１の遺伝子増幅に好適なプライマー対を提供
すると共に、ＰＣＲにより増幅された成人Ｔ細胞白血病
ウィルス遺伝子（ＨＴＬＶ−１）を簡易に酵素免疫測定
法によって検出する方法を提供することにある。
免疫測定法によるＰＣＲ増幅産物の検出法は、ＰＣＲ産
物からの未反応標識プライマーの分離除去を必要とする
か、あるいはそれを避けるために前記のKempらの方法の
ように、わざわざ第二ＰＣＲを実施しなければならない
といった余分な煩雑な操作を必要としているのが実情で
ある。当業界では酵素免疫測定法を用いた簡易なＰＣＲ
増幅産物の検出方法の開発が期待されているが、ＰＣＲ
により増幅された成人Ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子の検
出方法について未だ満足すべき方法は見い出されていな
い。本発明の目的は、成人Ｔ細胞白血病ウィルスである
ＨＴＬＶ−１の遺伝子増幅に好適なプライマー対を提供
すると共に、ＰＣＲにより増幅された成人Ｔ細胞白血病
ウィルス遺伝子（ＨＴＬＶ−１）を簡易に酵素免疫測定
法によって検出する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決するために鋭意研究した結果、成人Ｔ細胞白血病ウ
ィルスであるＨＴＬＶ−１の遺伝子増幅を行う際のプラ
イマーとして、以下の２種類の遺伝子配列（Ｐ1 、
Ｐ2 ）を見出した。 Ｐ1 ：ＧＡＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＡＧＣ Ｐ2 ：ＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＣＡＡ さらに、上記２種類の遺伝子配列（Ｐ1 、Ｐ2 ）を用い
てＰＣＲを行う際に、一方のプライマーとして固相に固
定化されたレセプターＲa と反応するリガンドＡで標識
されたプライマーＡ−Ｐ1 及び他方のプライマーとして
は検出用標識体Ｅにより標識されたリガンドＢに対する
レセプターＲb と反応するプライマーＢ−Ｐ2 を用いる
ことにより、容易でしかも特異的かつ高感度に成人Ｔ細
胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ−１）遺伝子のＰＣＲ増幅
産物を検出できることを見い出し、本発明を完成するに
至った。なお、本発明の検出方法によれば、ＰＣＲ反応
後の増幅産物から未反応の標識プライマー（特にプライ
マーＡ−Ｐ1 ）を分離除去することなく酵素免疫測定用
の固相と反応させても十分な感度で測定対象遺伝子を検
出することができる。
解決するために鋭意研究した結果、成人Ｔ細胞白血病ウ
ィルスであるＨＴＬＶ−１の遺伝子増幅を行う際のプラ
イマーとして、以下の２種類の遺伝子配列（Ｐ1 、
Ｐ2 ）を見出した。 Ｐ1 ：ＧＡＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＡＧＣ Ｐ2 ：ＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＣＡＡ さらに、上記２種類の遺伝子配列（Ｐ1 、Ｐ2 ）を用い
てＰＣＲを行う際に、一方のプライマーとして固相に固
定化されたレセプターＲa と反応するリガンドＡで標識
されたプライマーＡ−Ｐ1 及び他方のプライマーとして
は検出用標識体Ｅにより標識されたリガンドＢに対する
レセプターＲb と反応するプライマーＢ−Ｐ2 を用いる
ことにより、容易でしかも特異的かつ高感度に成人Ｔ細
胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ−１）遺伝子のＰＣＲ増幅
産物を検出できることを見い出し、本発明を完成するに
至った。なお、本発明の検出方法によれば、ＰＣＲ反応
後の増幅産物から未反応の標識プライマー（特にプライ
マーＡ−Ｐ1 ）を分離除去することなく酵素免疫測定用
の固相と反応させても十分な感度で測定対象遺伝子を検
出することができる。
【０００８】即ち、本発明の要旨は、リガンドＡによっ
て標識された以下の遺伝子配列（Ｐ1 ）からなるプライ
マーＡ−Ｐ1 及びリガンドＢによって標識された以下の
遺伝子配列（Ｐ2 ）からなるプライマーＢ−Ｐ2 からな
るプライマー対を用いて、被検出遺伝子をポリメラーゼ
チェインリアクションによって増幅する工程、得られる
遺伝子増幅産物をリガンドＡに対するレセプターＲa が
固定化された固相と反応させる工程、得られる遺伝子増
幅産物を検出用標識体Ｅによって標識されたリガンドＢ
に対するレセプターＥ−Ｒb と反応させる工程、および
検出用標識体の量を測定する工程を有することを特徴と
する成人Ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子の検出方法に関す
る。 Ｐ1 ：ＧＡＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＡＧＣ Ｐ2 ：ＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＣＡＡ
て標識された以下の遺伝子配列（Ｐ1 ）からなるプライ
マーＡ−Ｐ1 及びリガンドＢによって標識された以下の
遺伝子配列（Ｐ2 ）からなるプライマーＢ−Ｐ2 からな
るプライマー対を用いて、被検出遺伝子をポリメラーゼ
チェインリアクションによって増幅する工程、得られる
遺伝子増幅産物をリガンドＡに対するレセプターＲa が
固定化された固相と反応させる工程、得られる遺伝子増
幅産物を検出用標識体Ｅによって標識されたリガンドＢ
に対するレセプターＥ−Ｒb と反応させる工程、および
検出用標識体の量を測定する工程を有することを特徴と
する成人Ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子の検出方法に関す
る。 Ｐ1 ：ＧＡＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＡＧＣ Ｐ2 ：ＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＣＡＡ
【０００９】本発明の検出方法については、前記の各工
程を有するものであればよく、各工程の順序は適宜選択
される。例えば次の３種の態様が挙げられる。まず第１
の態様について図１を用いて詳述する。 （１） まずＰＣＲを行う。この工程では、測定対象遺
伝子をテンプレートとして通常それに対して大過剰のプ
ライマー（この場合、プライマーＡ−Ｐ1 およびプライ
マーＢ−Ｐ2 ）が用いられる。もちろんこれ以外にも耐
熱性のＤＮＡポリメラーゼ、基質塩基等もＰＣＲ反応液
に仕込まれる。ＰＣＲ反応後の溶液中には図１に示した
両末端に標識Ａと標識Ｂを備えたもの(I) が増幅産物と
して含まれる。これ以外にも大過剰に用いたプライマー
の残りも存在する。 （２） 次に、レセプターＲa が固定化された固相と上
記ＰＣＲ反応産物とを反応させる。この工程では、固相
上のレセプターＲa は増幅産物(I) のリガンドＡと反応
して、レセプターＲa と増幅産物(I) の結合した(II)を
生成する。しかし、ＰＣＲ反応産物中に残存するプライ
マーＡ−Ｐ1 もレセプターＲa と反応しうるので、レセ
プターＲa とプライマーＡ−Ｐ1 の結合した(III) も生
成する。 （３） 前記（２）の反応物の洗浄操作の後、固相とレ
セプターＥ−Ｒb とを反応させる。この工程では、固相
上の(II)のリガンドＢがレセプターＥ−Ｒb と結合して
(IV)になる。(III) はそのまま残る。 （４） 前記（３）の反応物の洗浄操作の後、固相上の
検出用標識体Ｅの活性を測定する。
程を有するものであればよく、各工程の順序は適宜選択
される。例えば次の３種の態様が挙げられる。まず第１
の態様について図１を用いて詳述する。 （１） まずＰＣＲを行う。この工程では、測定対象遺
伝子をテンプレートとして通常それに対して大過剰のプ
ライマー（この場合、プライマーＡ−Ｐ1 およびプライ
マーＢ−Ｐ2 ）が用いられる。もちろんこれ以外にも耐
熱性のＤＮＡポリメラーゼ、基質塩基等もＰＣＲ反応液
に仕込まれる。ＰＣＲ反応後の溶液中には図１に示した
両末端に標識Ａと標識Ｂを備えたもの(I) が増幅産物と
して含まれる。これ以外にも大過剰に用いたプライマー
の残りも存在する。 （２） 次に、レセプターＲa が固定化された固相と上
記ＰＣＲ反応産物とを反応させる。この工程では、固相
上のレセプターＲa は増幅産物(I) のリガンドＡと反応
して、レセプターＲa と増幅産物(I) の結合した(II)を
生成する。しかし、ＰＣＲ反応産物中に残存するプライ
マーＡ−Ｐ1 もレセプターＲa と反応しうるので、レセ
プターＲa とプライマーＡ−Ｐ1 の結合した(III) も生
成する。 （３） 前記（２）の反応物の洗浄操作の後、固相とレ
セプターＥ−Ｒb とを反応させる。この工程では、固相
上の(II)のリガンドＢがレセプターＥ−Ｒb と結合して
(IV)になる。(III) はそのまま残る。 （４） 前記（３）の反応物の洗浄操作の後、固相上の
検出用標識体Ｅの活性を測定する。
【００１０】次に第２の態様について図２を用いて詳述
する。 （１） まず、第１の態様における（１）と同様にＰＣ
Ｒを行う。従って、ＰＣＲ反応後の溶液中には図２に示
した両末端に標識Ａと標識Ｂを備えたもの(I) が増幅産
物として含まれる。これ以外にも大過剰に用いたプライ
マーの残りも存在する。 （２） 次に、レセプターＥ−Ｒb と上記ＰＣＲ反応産
物とを反応させる。この工程では、レセプターＥ−Ｒb
は増幅産物(I) のリガンドＢと反応して、レセプターＥ
−Ｒb と増幅産物(I) の結合した(V) を生成する。しか
し、ＰＣＲ反応産物中に残存するプライマーＢ−Ｐ2 も
レセプターＥ−Ｒb と反応しうるので、レセプターＲa
とプライマーＢ−Ｐ2 の結合した(VI)も生成する。 （３） レセプターＲa が固定化された固相をレセプタ
ーＥ−Ｒb と増幅産物(I) との結合物(V) と反応させ
る。この工程では、結合物(V) のリガンドＡが固相上の
レセプターＲa と結合して(IV)になる。(VI)はそのまま
残る。 （４） 前記（３）の反応物の洗浄操作の後、固相上の
検出用標識体Ｅの活性を測定する。
する。 （１） まず、第１の態様における（１）と同様にＰＣ
Ｒを行う。従って、ＰＣＲ反応後の溶液中には図２に示
した両末端に標識Ａと標識Ｂを備えたもの(I) が増幅産
物として含まれる。これ以外にも大過剰に用いたプライ
マーの残りも存在する。 （２） 次に、レセプターＥ−Ｒb と上記ＰＣＲ反応産
物とを反応させる。この工程では、レセプターＥ−Ｒb
は増幅産物(I) のリガンドＢと反応して、レセプターＥ
−Ｒb と増幅産物(I) の結合した(V) を生成する。しか
し、ＰＣＲ反応産物中に残存するプライマーＢ−Ｐ2 も
レセプターＥ−Ｒb と反応しうるので、レセプターＲa
とプライマーＢ−Ｐ2 の結合した(VI)も生成する。 （３） レセプターＲa が固定化された固相をレセプタ
ーＥ−Ｒb と増幅産物(I) との結合物(V) と反応させ
る。この工程では、結合物(V) のリガンドＡが固相上の
レセプターＲa と結合して(IV)になる。(VI)はそのまま
残る。 （４） 前記（３）の反応物の洗浄操作の後、固相上の
検出用標識体Ｅの活性を測定する。
【００１１】次に第３の態様について図３を用いて詳述
する。 （１） まず、第１の態様における（１）と同様にＰＣ
Ｒを行う。従って、ＰＣＲ反応後の溶液中には図３に示
した両末端に標識Ａと標識Ｂを備えたもの(I) が増幅産
物として含まれる。これ以外にも大過剰に用いたプライ
マーの残りも存在する。 （２） 次に、レセプターＲa が固定化された固相およ
びレセプターＥ−Ｒb と上記ＰＣＲ反応産物とを同時に
反応させる。この工程では、固相およびレセプターＥ−
Ｒb は増幅産物(I) のリガンドＡおよびリガンドＢとそ
れぞれ反応して、レセプターＲa 、レセプターＥ−Ｒb
および増幅産物(I) の結合した(IV)を生成する。しか
し、ＰＣＲ反応産物中に残存するプライマーＡ−Ｐ1 は
レセプターＲa と、またＰＣＲ反応産物中に残存するプ
ライマーＢ−Ｐ2 はレセプターＥ−Ｒb と反応しうるの
で、それぞれレセプターＲa とプライマーＡ−Ｐ1 の結
合した(III) およびレセプターＥ−Ｒb とプライマーＢ
−Ｐ2 の結合した(VI)も生成する。 （３） 前記反応物の洗浄操作の後、固相上の検出用標
識体Ｅの活性を測定する。
する。 （１） まず、第１の態様における（１）と同様にＰＣ
Ｒを行う。従って、ＰＣＲ反応後の溶液中には図３に示
した両末端に標識Ａと標識Ｂを備えたもの(I) が増幅産
物として含まれる。これ以外にも大過剰に用いたプライ
マーの残りも存在する。 （２） 次に、レセプターＲa が固定化された固相およ
びレセプターＥ−Ｒb と上記ＰＣＲ反応産物とを同時に
反応させる。この工程では、固相およびレセプターＥ−
Ｒb は増幅産物(I) のリガンドＡおよびリガンドＢとそ
れぞれ反応して、レセプターＲa 、レセプターＥ−Ｒb
および増幅産物(I) の結合した(IV)を生成する。しか
し、ＰＣＲ反応産物中に残存するプライマーＡ−Ｐ1 は
レセプターＲa と、またＰＣＲ反応産物中に残存するプ
ライマーＢ−Ｐ2 はレセプターＥ−Ｒb と反応しうるの
で、それぞれレセプターＲa とプライマーＡ−Ｐ1 の結
合した(III) およびレセプターＥ−Ｒb とプライマーＢ
−Ｐ2 の結合した(VI)も生成する。 （３） 前記反応物の洗浄操作の後、固相上の検出用標
識体Ｅの活性を測定する。
【００１２】本発明の検出方法に用いられる一対のプラ
イマーは、各々被増幅ＤＮＡの５’末端側にハイブリダ
イズして、ＤＮＡポリメラーゼによる増幅反応を開始さ
せる能力を有する遺伝子断片である。通常それは１０な
いし４０個のヌクレオチドから、好ましくは２０ないし
３０個のヌクレオチドからなる遺伝子断片であり、本発
明においては前述のようなＰ1 およびＰ2 が好適なもの
として使用される。
イマーは、各々被増幅ＤＮＡの５’末端側にハイブリダ
イズして、ＤＮＡポリメラーゼによる増幅反応を開始さ
せる能力を有する遺伝子断片である。通常それは１０な
いし４０個のヌクレオチドから、好ましくは２０ないし
３０個のヌクレオチドからなる遺伝子断片であり、本発
明においては前述のようなＰ1 およびＰ2 が好適なもの
として使用される。
【００１３】本発明の検出方法においては、プライマー
Ｐ1 はリガンドＡによって、また他方のプライマーＰ2
はリガンドＢによって標識される。本発明におけるリガ
ンドとは、プライマーをそれで標識した時その反応性を
阻害しない程度の比較的分子量が低く、かつ特定のタン
パク質（抗体、レセプター、その他の結合性蛋白質）と
結合する能力を有する化合物を意味する。例えば、ビオ
チンのような特定の蛋白質（アビジン）と結合し得る化
合物、あるいはジゴキシゲニンのような抗体と結合し得
るハプテン等があげられる。プライマー１分子あたりに
標識するリガンドの分子数としては１個で十分なことが
多いが、複数個であってもかまわない。
Ｐ1 はリガンドＡによって、また他方のプライマーＰ2
はリガンドＢによって標識される。本発明におけるリガ
ンドとは、プライマーをそれで標識した時その反応性を
阻害しない程度の比較的分子量が低く、かつ特定のタン
パク質（抗体、レセプター、その他の結合性蛋白質）と
結合する能力を有する化合物を意味する。例えば、ビオ
チンのような特定の蛋白質（アビジン）と結合し得る化
合物、あるいはジゴキシゲニンのような抗体と結合し得
るハプテン等があげられる。プライマー１分子あたりに
標識するリガンドの分子数としては１個で十分なことが
多いが、複数個であってもかまわない。
【００１４】プライマーを開始点とするヌクレオチドの
重合反応はプライマーの３’末端を伸長する形で進行す
るので、それを邪魔しないようにリガンドは通常プライ
マーの５’末端側に結合される。プライマーの５’末端
への標識リガンドの結合方法は種々の方法が知られてお
り、特に限定されるものではないが、最も一般的に行わ
れる方法としては、プライマーの５’末端側にアミノリ
ンカー試薬を縮合させた後、それにＮ−ヒドロキシサク
シミド化されたリガンドを縮合する方法があげられる
（内村、蛋白質 核酸 酵素 ３５、３１５７（１９９
０））。
重合反応はプライマーの３’末端を伸長する形で進行す
るので、それを邪魔しないようにリガンドは通常プライ
マーの５’末端側に結合される。プライマーの５’末端
への標識リガンドの結合方法は種々の方法が知られてお
り、特に限定されるものではないが、最も一般的に行わ
れる方法としては、プライマーの５’末端側にアミノリ
ンカー試薬を縮合させた後、それにＮ−ヒドロキシサク
シミド化されたリガンドを縮合する方法があげられる
（内村、蛋白質 核酸 酵素 ３５、３１５７（１９９
０））。
【００１５】本発明の検出方法におけるレセプターと
は、上記のリガンドと結合しうる蛋白質を意味する。前
記のビオチンに対してはアビジン、ジゴキシゲニンに対
しては抗ジゴキシゲニン抗体がそれぞれのリガンドに対
するレセプターである。リガンドとして各種のハプテン
を用いる時それに対する抗体をレセプターとして用いる
ことができる。本発明の検出方法においては２種のレセ
プターＲa とレセプターＲb が用いられる。例えば、リ
ガンドＡとしてジゴキシゲニン、レセプターＲa が抗ジ
ゴキシゲニン抗体、そしてリガンドＢとしてビオチン、
レセプターＲb がアビジンという組合せ、あるいはリガ
ンドＡとしてビオチン、レセプターＲa がアビジンそし
てリガンドＢとしてジゴキシゲニン、レセプターＲb が
抗ジゴキシゲニン抗体という組合せが例示される。本発
明においては、レセプターＲa は固相に固定化されてお
り、レセプターＲb は検出用標識体と結合されている。
は、上記のリガンドと結合しうる蛋白質を意味する。前
記のビオチンに対してはアビジン、ジゴキシゲニンに対
しては抗ジゴキシゲニン抗体がそれぞれのリガンドに対
するレセプターである。リガンドとして各種のハプテン
を用いる時それに対する抗体をレセプターとして用いる
ことができる。本発明の検出方法においては２種のレセ
プターＲa とレセプターＲb が用いられる。例えば、リ
ガンドＡとしてジゴキシゲニン、レセプターＲa が抗ジ
ゴキシゲニン抗体、そしてリガンドＢとしてビオチン、
レセプターＲb がアビジンという組合せ、あるいはリガ
ンドＡとしてビオチン、レセプターＲa がアビジンそし
てリガンドＢとしてジゴキシゲニン、レセプターＲb が
抗ジゴキシゲニン抗体という組合せが例示される。本発
明においては、レセプターＲa は固相に固定化されてお
り、レセプターＲb は検出用標識体と結合されている。
【００１６】固相と検出用標識体としては、既知の酵素
免疫測定法等に用いられるものが本発明においても用い
られる。すなわち固相としてはマイクロタイタープレー
ト、チューブ、ビーズ、さらには特開平１−２１２３４
７号公報に記載されている細径管等が用いられる。固相
にはリガンドＡに対するレセプターＲa が固定化されて
いる。該レセプターの固相への固定化は通常の方法によ
って行われる。最も一般的にはプラスチック製の固相に
物理吸着によってレセプターが固定化され、続いてウシ
血清アルブミン等によっていわゆるブロッキングが行わ
れる。アミノ基のような官能基を有する固相に共有結合
で固定化することも可能である。
免疫測定法等に用いられるものが本発明においても用い
られる。すなわち固相としてはマイクロタイタープレー
ト、チューブ、ビーズ、さらには特開平１−２１２３４
７号公報に記載されている細径管等が用いられる。固相
にはリガンドＡに対するレセプターＲa が固定化されて
いる。該レセプターの固相への固定化は通常の方法によ
って行われる。最も一般的にはプラスチック製の固相に
物理吸着によってレセプターが固定化され、続いてウシ
血清アルブミン等によっていわゆるブロッキングが行わ
れる。アミノ基のような官能基を有する固相に共有結合
で固定化することも可能である。
【００１７】また検出用標識体としては、通常アルカリ
フォスファターゼ、ペルオキシターゼ、ウレアーゼ等の
酵素が用いられる。例えば上記特開平１−２１２３４７
号公報に開示されているように細径管を固相とする場合
は、ウレアーゼが好適である。固相上にトラップされた
酵素の検出には、通常の酵素免疫測定法に用いられる手
段が採用される。すなわち酵素に対する基質が発色性の
ものであれば吸光光度計が、蛍光性のものであれば蛍光
光度計が、また化学発光性のものであれば発光光度計
が、それぞれ用いられる。さらに、例えば上記特開平１
−２１２３４７号公報に開示された系のように酵素反応
に伴って基質溶液のｐＨが変化する場合には、検出器と
してｐＨ電極やｐＨ感応性電界効果トランジスタ（ｐＨ
−ＦＥＴ）が用いられることもある。
フォスファターゼ、ペルオキシターゼ、ウレアーゼ等の
酵素が用いられる。例えば上記特開平１−２１２３４７
号公報に開示されているように細径管を固相とする場合
は、ウレアーゼが好適である。固相上にトラップされた
酵素の検出には、通常の酵素免疫測定法に用いられる手
段が採用される。すなわち酵素に対する基質が発色性の
ものであれば吸光光度計が、蛍光性のものであれば蛍光
光度計が、また化学発光性のものであれば発光光度計
が、それぞれ用いられる。さらに、例えば上記特開平１
−２１２３４７号公報に開示された系のように酵素反応
に伴って基質溶液のｐＨが変化する場合には、検出器と
してｐＨ電極やｐＨ感応性電界効果トランジスタ（ｐＨ
−ＦＥＴ）が用いられることもある。
【００１８】なお酵素の代わりに蛍光性分子、化学発光
性分子、放射性同位元素等を検出用標識体としてレセプ
ターＲb に結合させておくことも可能である。これらの
場合には固相上にトラップされたこれら標識体を直接蛍
光光度計、発光光度計、あるいは放射能カウンターでそ
れぞれ検出する。
性分子、放射性同位元素等を検出用標識体としてレセプ
ターＲb に結合させておくことも可能である。これらの
場合には固相上にトラップされたこれら標識体を直接蛍
光光度計、発光光度計、あるいは放射能カウンターでそ
れぞれ検出する。
【００１９】次に本発明の方法におけるＰＣＲ反応条件
について述べる。遺伝子増幅用のポリメラーゼとして
は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。その仕込
濃度としては０．１〜１０ｕｎｉｔ／１００μｌが好ま
しい。プライマー濃度としては、０．０５〜１０μＭ、
好ましくは０．２〜２μＭ仕込まれる。またテンプレー
トＤＮＡとしては１〜１０8 コピー／１００μｌが仕込
まれる。基質のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の仕
込濃度は通常１〜１０００μＭである。このほかに所定
濃度の塩化カリウム、塩化マグネシウム、ゼラチン等が
仕込まれ、適当な緩衝溶液たとえばトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．３）中で反応が行われる。
について述べる。遺伝子増幅用のポリメラーゼとして
は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。その仕込
濃度としては０．１〜１０ｕｎｉｔ／１００μｌが好ま
しい。プライマー濃度としては、０．０５〜１０μＭ、
好ましくは０．２〜２μＭ仕込まれる。またテンプレー
トＤＮＡとしては１〜１０8 コピー／１００μｌが仕込
まれる。基質のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の仕
込濃度は通常１〜１０００μＭである。このほかに所定
濃度の塩化カリウム、塩化マグネシウム、ゼラチン等が
仕込まれ、適当な緩衝溶液たとえばトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．３）中で反応が行われる。
【００２０】ＰＣＲ反応はよく知られているように、
（１）熱変性ステップ（通常９０〜９５℃、１〜２
分）、（２）プライマーのアニーリングステップ（通常
３７〜６５℃、１〜３分）、（３）プライマーの伸長ス
テップ（通常６５〜８０℃、１〜３分）の３ステップを
２０〜５０回繰り返すことにより行われる。この３工程
を１サイクル経る毎に１回の複製が行われるので、ｎサ
イクル繰り返すことによって理論的には２n 倍のＤＮＡ
が得られる。
（１）熱変性ステップ（通常９０〜９５℃、１〜２
分）、（２）プライマーのアニーリングステップ（通常
３７〜６５℃、１〜３分）、（３）プライマーの伸長ス
テップ（通常６５〜８０℃、１〜３分）の３ステップを
２０〜５０回繰り返すことにより行われる。この３工程
を１サイクル経る毎に１回の複製が行われるので、ｎサ
イクル繰り返すことによって理論的には２n 倍のＤＮＡ
が得られる。
【００２１】ＰＣＲのサイクル数を増やすことによっ
て、理論的な増幅率は向上するが、実際にはプライマー
のミスマッチングやポリメラーゼのエラーにより、非特
異的な増幅反応の確率も増加するので、むやみにサイク
ル数を増やすわけにはいかない。しかし、測定対象テン
プレートの濃度が１〜１０コピー／１００μｌのように
極端に低い場合、可能な限りサイクル数を増やす必要が
ある。そのような場合、特異性を犠牲にせずに増幅率を
上げる方法として、第２ＰＣＲを行う、いわゆるＮｅｓ
ｔｅｄ ＰＣＲを採用することも可能である（M.Frohma
n, G.Martin,Techniqe,1,165(1989)）。この場合には第
２ＰＣＲにおいて本発明の方法を用いるのが良い。すな
わち最初のＰＣＲは標識プライマーを用いないで行い、
第２ＰＣＲでは第１ＰＣＲの増幅の内側にあるプライマ
ーセットを用いるが、これを本発明の方法に従って標識
する。こうすることによって、第１回目の増幅で生じた
非特異的産物が第２回目の増幅のテンプレートになる可
能性を排除して目標産物の特異性をあげることができ
る。
て、理論的な増幅率は向上するが、実際にはプライマー
のミスマッチングやポリメラーゼのエラーにより、非特
異的な増幅反応の確率も増加するので、むやみにサイク
ル数を増やすわけにはいかない。しかし、測定対象テン
プレートの濃度が１〜１０コピー／１００μｌのように
極端に低い場合、可能な限りサイクル数を増やす必要が
ある。そのような場合、特異性を犠牲にせずに増幅率を
上げる方法として、第２ＰＣＲを行う、いわゆるＮｅｓ
ｔｅｄ ＰＣＲを採用することも可能である（M.Frohma
n, G.Martin,Techniqe,1,165(1989)）。この場合には第
２ＰＣＲにおいて本発明の方法を用いるのが良い。すな
わち最初のＰＣＲは標識プライマーを用いないで行い、
第２ＰＣＲでは第１ＰＣＲの増幅の内側にあるプライマ
ーセットを用いるが、これを本発明の方法に従って標識
する。こうすることによって、第１回目の増幅で生じた
非特異的産物が第２回目の増幅のテンプレートになる可
能性を排除して目標産物の特異性をあげることができ
る。
【００２２】このようにして得られたＰＣＲ増幅産物を
リガンドＡに対するレセプターＲa を固定化した固相と
反応させるには、ＰＣＲ反応溶液をこのまま固相と反応
させてもよいし、適当な緩衝液で希釈して反応させても
よい。さらに該緩衝液にウシ血清アルブミン等の動物血
清成分を非特異吸着防止のために加えておいてもよい。
ＰＣＲ反応溶液と固相との反応は０〜５０℃で１０分間
ないし１晩、好ましくは室温〜４０℃で１０分間ないし
２時間行われる。その後固相は洗浄される。洗浄は通常
洗浄用緩衝液で十分に行われる。
リガンドＡに対するレセプターＲa を固定化した固相と
反応させるには、ＰＣＲ反応溶液をこのまま固相と反応
させてもよいし、適当な緩衝液で希釈して反応させても
よい。さらに該緩衝液にウシ血清アルブミン等の動物血
清成分を非特異吸着防止のために加えておいてもよい。
ＰＣＲ反応溶液と固相との反応は０〜５０℃で１０分間
ないし１晩、好ましくは室温〜４０℃で１０分間ないし
２時間行われる。その後固相は洗浄される。洗浄は通常
洗浄用緩衝液で十分に行われる。
【００２３】また、ＰＣＲ増幅産物を検出用標識体Ｅに
よって標識されたリガンドＢに対するレセプターＥ−Ｒ
b と反応させるには、レセプターＥ−Ｒb にも非特異吸
着の防止のために動物の血清成分やさらに必要に応じて
界面活性剤を加えておいてもよい。この反応も０〜５０
℃で１０分間ないし１晩、好ましくは室温〜４０℃で１
０分間ないし２時間行われる。
よって標識されたリガンドＢに対するレセプターＥ−Ｒ
b と反応させるには、レセプターＥ−Ｒb にも非特異吸
着の防止のために動物の血清成分やさらに必要に応じて
界面活性剤を加えておいてもよい。この反応も０〜５０
℃で１０分間ないし１晩、好ましくは室温〜４０℃で１
０分間ないし２時間行われる。
【００２４】本発明において適宜なされる洗浄操作は、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含
む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）等の洗浄緩衝液
を用いて行われる。最後に固相上にトラップされた酵素
の活性を測定するために、基質溶液が加えられ、前述の
ような検出方法に従って基質の分解速度、もしくは所定
時間内の基質の分解量が測定される。
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含
む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）等の洗浄緩衝液
を用いて行われる。最後に固相上にトラップされた酵素
の活性を測定するために、基質溶液が加えられ、前述の
ような検出方法に従って基質の分解速度、もしくは所定
時間内の基質の分解量が測定される。
【００２５】
【実施例】以下、実施例により更に詳しく本発明を説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ 成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）の感染の有無を診断する目
的で、その原因ウィルスであるＨＴＬＶ−１の遺伝子を
検出するために、つぎの二つのプライマーを作成した。 Ｐ1 ：ＧＡＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＡＧＣ Ｐ2 ：ＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＣＡＡ プライマーＰ1 およびＰ2 はそれぞれＡＴＬの原因ウィ
ルスであるＨＴＬＶ−Ｉの６８２６−６８４３番目およ
び６６４９−６６６８番目の遺伝子配列に相当する。そ
れぞれのプライマーの合成、およびその5'末端へのアミ
ノリンカー試薬の導入は、アプライドバイオ社のＤＮＡ
合成機（ＡＢＩ３８０Ｂ）を用いて行った。プライマー
Ｐ1 にはＮ−ヒドロキシサクシニイミド化ジゴキシゲニ
ンを反応させた後、高速液体クロマトグラフィでジゴキ
シゲニン化Ｐ1 （Ｄｉｇ−Ｐ1 ）を未反応原料から分離
した。同様にプライマーＰ2 とＮ−ヒドロキシサクシニ
イミド化ビオチン（クロンテック社製）とを反応させる
ことにより、ビオチン化Ｐ2 （Ｂｉｏ−Ｐ2 ）を得た。
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ 成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）の感染の有無を診断する目
的で、その原因ウィルスであるＨＴＬＶ−１の遺伝子を
検出するために、つぎの二つのプライマーを作成した。 Ｐ1 ：ＧＡＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＡＧＣ Ｐ2 ：ＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＣＡＡ プライマーＰ1 およびＰ2 はそれぞれＡＴＬの原因ウィ
ルスであるＨＴＬＶ−Ｉの６８２６−６８４３番目およ
び６６４９−６６６８番目の遺伝子配列に相当する。そ
れぞれのプライマーの合成、およびその5'末端へのアミ
ノリンカー試薬の導入は、アプライドバイオ社のＤＮＡ
合成機（ＡＢＩ３８０Ｂ）を用いて行った。プライマー
Ｐ1 にはＮ−ヒドロキシサクシニイミド化ジゴキシゲニ
ンを反応させた後、高速液体クロマトグラフィでジゴキ
シゲニン化Ｐ1 （Ｄｉｇ−Ｐ1 ）を未反応原料から分離
した。同様にプライマーＰ2 とＮ−ヒドロキシサクシニ
イミド化ビオチン（クロンテック社製）とを反応させる
ことにより、ビオチン化Ｐ2 （Ｂｉｏ−Ｐ2 ）を得た。
【００２６】ＨＴＬＶ−Ｉプロウィルス遺伝子が組込ま
れた株化細胞（ＭＴ−１）から染色体ＤＮＡを公知の方
法により調製し、これを測定対象遺伝子（テンプレー
ト）とし、次いで、ＰＣＲを以下のように行った。テン
プレートとして、１００００コピーに相当する上記ＤＮ
ＡとＤｉｇ−Ｐ1 ２００ｎＭおよびＢｉｏ−Ｐ2 ２００
ｎＭで仕込んだ後ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応溶液に
は、反応用緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ
2 ，０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン）１０μｌ、基質原液
（１．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよび
ｄＴＴＰを含む水溶液）１６μｌ、およびＴａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（宝酒造（株）製）２．５ｕｎｉｔを蒸
留水で希釈して全体で１００μｌとし、これを５００μ
ｌチューブに入れて、溶液の上層にミネラルオイルを加
えた。これを熱変性ステップ９５℃で１分、アニーリン
グステップ６０℃で２分、伸長ステップ７２℃で１分間
処理し、その操作を合計３５サイクル繰り返した。その
後、ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を用いてＰＣＲ産
物の水溶液を得、ＯＤ２６０ｎｍの値を測定することに
よりＰＣＲ産物の濃度を決定した。
れた株化細胞（ＭＴ−１）から染色体ＤＮＡを公知の方
法により調製し、これを測定対象遺伝子（テンプレー
ト）とし、次いで、ＰＣＲを以下のように行った。テン
プレートとして、１００００コピーに相当する上記ＤＮ
ＡとＤｉｇ−Ｐ1 ２００ｎＭおよびＢｉｏ−Ｐ2 ２００
ｎＭで仕込んだ後ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応溶液に
は、反応用緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ
2 ，０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン）１０μｌ、基質原液
（１．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよび
ｄＴＴＰを含む水溶液）１６μｌ、およびＴａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（宝酒造（株）製）２．５ｕｎｉｔを蒸
留水で希釈して全体で１００μｌとし、これを５００μ
ｌチューブに入れて、溶液の上層にミネラルオイルを加
えた。これを熱変性ステップ９５℃で１分、アニーリン
グステップ６０℃で２分、伸長ステップ７２℃で１分間
処理し、その操作を合計３５サイクル繰り返した。その
後、ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を用いてＰＣＲ産
物の水溶液を得、ＯＤ２６０ｎｍの値を測定することに
よりＰＣＲ産物の濃度を決定した。
【００２７】Ｄｉｇ−Ｐ1 およびＢｉｏ−Ｐ2 の増副産
物を検出するための抗ジゴキシゲニン抗体固定化マイク
ロプレートは以下のようにして作成した。まず１００ｍ
Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に抗ジゴキシゲニン
のＦａｂフラグメント（ベーリンガーマンハイム社）を
溶かして１０μｇ／ｍｌの濃度とした。市販のマイクロ
プレートの各ウエルにこの抗体溶液１００μｌずつを添
加し、３７℃で３時間放置した。その後ウエル中の液を
捨てて、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで４回洗浄
し、次いで２％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎを２００μｌ添加した後、４℃で湿箱中に一夜放置
した。
物を検出するための抗ジゴキシゲニン抗体固定化マイク
ロプレートは以下のようにして作成した。まず１００ｍ
Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に抗ジゴキシゲニン
のＦａｂフラグメント（ベーリンガーマンハイム社）を
溶かして１０μｇ／ｍｌの濃度とした。市販のマイクロ
プレートの各ウエルにこの抗体溶液１００μｌずつを添
加し、３７℃で３時間放置した。その後ウエル中の液を
捨てて、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで４回洗浄
し、次いで２％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎを２００μｌ添加した後、４℃で湿箱中に一夜放置
した。
【００２８】ＰＣＲ産物を、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液
（ｐＨ８．３），４０ｍＭのＫＣｌ，２ｍＭのＭｇＣｌ
2 を用いて１×１０-12 Ｍから８×１０-12 Ｍの濃度に
希釈し、このうちの１００μｌを上記の方法で作成した
抗ジゴシゲニン抗体固相化プレートの１ウエルに分注
し、３７℃で１時間インキュベートし、１次免疫反応を
行った。１次免疫反応終了後液を捨てて、０．１％ゼラ
チンを含むＰＢＳでウエルを４回洗浄した。その後スト
レプトアビジン−アルカリフォスファターゼ結合体（Ｂ
ＲＬ社製）を２％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１００
０倍希釈し、洗浄後のウエルに１００μｌ添加し、３７
℃で１時間インキュベートし、２次免疫反応を行った。
その後液を捨てて、０．１％ゼラチンを含むＰＢＳでウ
エルを４回洗浄した。３．３ｍｇ／ｍｌパラニトロフェ
ニルリン酸（シグマ社製）と０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を
含む１Ｍジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ１０．０）
水溶液を１ウエルあたり１００μｌ添加し、室温にて３
０分間発色させた時点で、０．２Ｎ ＮａＯＨ水溶液２
５μｌ／ウエルを添加して反応を停止させ、４０５ｎｍ
の波長で吸光度を測定した。その結果、図４に示すよう
に、１×１０-12 Ｍの濃度から特異シグナルを得た。こ
のことにより本発明の方法により簡便に成人Ｔ細胞白血
病ウィルス遺伝子を検出できることが示された。
（ｐＨ８．３），４０ｍＭのＫＣｌ，２ｍＭのＭｇＣｌ
2 を用いて１×１０-12 Ｍから８×１０-12 Ｍの濃度に
希釈し、このうちの１００μｌを上記の方法で作成した
抗ジゴシゲニン抗体固相化プレートの１ウエルに分注
し、３７℃で１時間インキュベートし、１次免疫反応を
行った。１次免疫反応終了後液を捨てて、０．１％ゼラ
チンを含むＰＢＳでウエルを４回洗浄した。その後スト
レプトアビジン−アルカリフォスファターゼ結合体（Ｂ
ＲＬ社製）を２％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１００
０倍希釈し、洗浄後のウエルに１００μｌ添加し、３７
℃で１時間インキュベートし、２次免疫反応を行った。
その後液を捨てて、０．１％ゼラチンを含むＰＢＳでウ
エルを４回洗浄した。３．３ｍｇ／ｍｌパラニトロフェ
ニルリン酸（シグマ社製）と０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を
含む１Ｍジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ１０．０）
水溶液を１ウエルあたり１００μｌ添加し、室温にて３
０分間発色させた時点で、０．２Ｎ ＮａＯＨ水溶液２
５μｌ／ウエルを添加して反応を停止させ、４０５ｎｍ
の波長で吸光度を測定した。その結果、図４に示すよう
に、１×１０-12 Ｍの濃度から特異シグナルを得た。こ
のことにより本発明の方法により簡便に成人Ｔ細胞白血
病ウィルス遺伝子を検出できることが示された。
【００２９】実施例２ Ｄｉｇ−Ｐ1 およびＢｉｏ−Ｐ2 の増幅産物を検出する
ための抗ジゴキシゲニン抗体固定化ポリプロピレン性ピ
ペットチップを以下のようにして作成した。まず１５０
ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ
７．４）（ＰＢＳ）に抗ジゴキシゲニンのＦａｂフラグ
メント（ベーリンガーマンハイム社）を溶かして５０μ
ｇ／ｍｌの濃度とした。ポリプロピレン性ピペットチッ
プ先端部を抗体溶液（２５μｌ）中に、３７℃で２時間
放置した。その後１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ），１
０％シュークロースを含むＰＢＳで５回洗浄し、１％Ｂ
ＳＡ，１０％シュークロース，ＰＢＳを４００μｌ添
加、４℃で湿箱中に一夜放置した後、減圧乾燥し抗ジゴ
キシゲニン固定化ピペットチップを作製した。
ための抗ジゴキシゲニン抗体固定化ポリプロピレン性ピ
ペットチップを以下のようにして作成した。まず１５０
ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ
７．４）（ＰＢＳ）に抗ジゴキシゲニンのＦａｂフラグ
メント（ベーリンガーマンハイム社）を溶かして５０μ
ｇ／ｍｌの濃度とした。ポリプロピレン性ピペットチッ
プ先端部を抗体溶液（２５μｌ）中に、３７℃で２時間
放置した。その後１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ），１
０％シュークロースを含むＰＢＳで５回洗浄し、１％Ｂ
ＳＡ，１０％シュークロース，ＰＢＳを４００μｌ添
加、４℃で湿箱中に一夜放置した後、減圧乾燥し抗ジゴ
キシゲニン固定化ピペットチップを作製した。
【００３０】実施例１と同様に、ＰＣＲ産物を、５０ｍ
ＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．３），４０ｍＭのＫＣ
ｌ，２ｍＭのＭｇＣｌ2 で１×１０-12 Ｍから８×１０
-12 Ｍの濃度に希釈し、５０μｌずつサンプルカップに
分注した。そのうち３５μｌを一次反応カップに移し、
抗ジゴキシゲニン固定化ピペットチップと１０分間、３
７℃で一次反応を行った。その後ＰＢＳ（ｐＨ７．８）
でピペットチップの洗浄を充分行い、二次反応をおこな
った。アビジン−ウレアーゼ結合体を１％ＢＳＡを含む
ＰＢＳ（ｐＨ７．８）でＸ１０００に希釈して一次反応
産物と５分間、３７℃で二次反応を行った。１０ｍＭの
ＮＨ4 Ｃｌでピペットチップを充分に洗浄してから、１
００ｍＭ尿素、１０ｍＭのＮＨ4 Ｃｌ液と該ピペットチ
ップを接触させ、ピペットチップ内のｐＨ変化を特開平
１−２１２３４７号公報に開示の方法によりｐＨ−ＦＥ
Ｔを検出器として用いて測定した。その結果図５に示す
様に、実施例１と同様に１×１０-12 Ｍの濃度から特異
シグナルを得た。このことにより本発明の方法において
ｐＨ−ＦＥＴを用いることにより簡便に成人Ｔ細胞白血
病ウィルス遺伝子を検出できることが示された。
ＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．３），４０ｍＭのＫＣ
ｌ，２ｍＭのＭｇＣｌ2 で１×１０-12 Ｍから８×１０
-12 Ｍの濃度に希釈し、５０μｌずつサンプルカップに
分注した。そのうち３５μｌを一次反応カップに移し、
抗ジゴキシゲニン固定化ピペットチップと１０分間、３
７℃で一次反応を行った。その後ＰＢＳ（ｐＨ７．８）
でピペットチップの洗浄を充分行い、二次反応をおこな
った。アビジン−ウレアーゼ結合体を１％ＢＳＡを含む
ＰＢＳ（ｐＨ７．８）でＸ１０００に希釈して一次反応
産物と５分間、３７℃で二次反応を行った。１０ｍＭの
ＮＨ4 Ｃｌでピペットチップを充分に洗浄してから、１
００ｍＭ尿素、１０ｍＭのＮＨ4 Ｃｌ液と該ピペットチ
ップを接触させ、ピペットチップ内のｐＨ変化を特開平
１−２１２３４７号公報に開示の方法によりｐＨ−ＦＥ
Ｔを検出器として用いて測定した。その結果図５に示す
様に、実施例１と同様に１×１０-12 Ｍの濃度から特異
シグナルを得た。このことにより本発明の方法において
ｐＨ−ＦＥＴを用いることにより簡便に成人Ｔ細胞白血
病ウィルス遺伝子を検出できることが示された。
【００３１】実施例３ ＨＴＬＶ−Ｉプロウィルス遺伝子が組込まれた株化細胞
（ＭＴ−１）から染色体ＤＮＡを公知の方法により調製
し、これを測定対象遺伝子（テンプレート）とし、ＰＣ
Ｒを以下のように行った。テンプレートとして、０，
１，１０，１００，１０００および１００００コピー相
当のＨＴＬＶ−Ｉプロウィルス遺伝子が含まれる様にＰ
ＣＲを行い、実施例１と同様に抗ジゴキシゲニン抗体固
定化マイクロプレートによりＰＣＲ産物を測定した。そ
の結果図６に示す様に、ＨＴＬＶ−Ｉプロウィルス遺伝
子１０コピー以上で特異シグナルを検出した。
（ＭＴ−１）から染色体ＤＮＡを公知の方法により調製
し、これを測定対象遺伝子（テンプレート）とし、ＰＣ
Ｒを以下のように行った。テンプレートとして、０，
１，１０，１００，１０００および１００００コピー相
当のＨＴＬＶ−Ｉプロウィルス遺伝子が含まれる様にＰ
ＣＲを行い、実施例１と同様に抗ジゴキシゲニン抗体固
定化マイクロプレートによりＰＣＲ産物を測定した。そ
の結果図６に示す様に、ＨＴＬＶ−Ｉプロウィルス遺伝
子１０コピー以上で特異シグナルを検出した。
【００３２】
【発明の効果】本発明の検出方法を用いることにより、
ＰＣＲ反応後の増幅産物から未反応の標識プライマーを
分離除去することなく、酵素免疫測定法により簡易かつ
高感度に成人Ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子を検出するこ
とが出来る。
ＰＣＲ反応後の増幅産物から未反応の標識プライマーを
分離除去することなく、酵素免疫測定法により簡易かつ
高感度に成人Ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子を検出するこ
とが出来る。
【図１】本発明の検出方法の第１の態様における各工程
の概略を示した図である。
の概略を示した図である。
【図２】本発明の検出方法の第２の態様における各工程
の概略を示した図である。
の概略を示した図である。
【図３】本発明の検出方法の第３の態様における各工程
の概略を示した図である。
の概略を示した図である。
【図４】実施例１におけるテンプレートＤＮＡの濃度と
吸光度との関係を示した図である。
吸光度との関係を示した図である。
【図５】実施例２におけるテンプレートＤＮＡの濃度と
ｐＨ−ＦＥＴ測定値との関係を示した図である。
ｐＨ−ＦＥＴ測定値との関係を示した図である。
【図６】実施例３におけるテンプレートＤＮＡのコピー
数と吸光度の関係を示した図である。
数と吸光度の関係を示した図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 リガンドＡによって標識された以下の遺
伝子配列（Ｐ1 ）からなるプライマーＡ−Ｐ1 及びリガ
ンドＢによって標識された以下の遺伝子配列（Ｐ2 ）か
らなるプライマーＢ−Ｐ2 からなるプライマー対を用い
て、被検出遺伝子をポリメラーゼチェインリアクション
によって増幅する工程、得られる遺伝子増幅産物をリガ
ンドＡに対するレセプターＲa が固定化された固相と反
応させる工程、得られる遺伝子増幅産物を検出用標識体
Ｅによって標識されたリガンドＢに対するレセプターＥ
−Ｒb と反応させる工程、および検出用標識体の量を測
定する工程を有することを特徴とする成人Ｔ細胞白血病
ウィルス遺伝子の検出方法。 Ｐ1 ：ＧＡＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＡＧＣ Ｐ2 ：ＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＣＡＡ - 【請求項２】 リガンドＡがジゴキシゲニン、レセプタ
ーＲa が抗ジゴキシゲニン抗体であり、リガンドＢがビ
オチン、レセプターＲb がアビジンである請求項１記載
の成人Ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子の検出方法。 - 【請求項３】 リガンドＡがビオチン、レセプターＲa
がアビジンであり、リガンドＢがジゴキシゲニン、レセ
プターＲb が抗ジゴキシゲニン抗体である請求項１記載
の成人Ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3359334A JP2651766B2 (ja) | 1991-12-30 | 1991-12-30 | 成人ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3359334A JP2651766B2 (ja) | 1991-12-30 | 1991-12-30 | 成人ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05176800A JPH05176800A (ja) | 1993-07-20 |
| JP2651766B2 true JP2651766B2 (ja) | 1997-09-10 |
Family
ID=18463984
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3359334A Expired - Fee Related JP2651766B2 (ja) | 1991-12-30 | 1991-12-30 | 成人ｔ細胞白血病ウィルス遺伝子の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2651766B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11137297A (ja) * | 1997-11-07 | 1999-05-25 | Kdk Corp | 遺伝子分析方法 |
| AU7955800A (en) * | 1999-10-25 | 2001-05-08 | Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd | Method of detecting target nucleic acid |
| KR20080011308A (ko) * | 2005-06-01 | 2008-02-01 | 올림푸스 가부시키가이샤 | 핵산의 검출 방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2002076A1 (en) * | 1988-11-21 | 1990-05-21 | Brent A. Burdick | Diagnostic kit and method using a solid phase capture means for detecting nucleic acids |
-
1991
- 1991-12-30 JP JP3359334A patent/JP2651766B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05176800A (ja) | 1993-07-20 |
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