JP2649285B2 - ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルスフュージョンプロテイン遺伝子及び該遺伝子を含む物質 - Google Patents
ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルスフュージョンプロテイン遺伝子及び該遺伝子を含む物質Info
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- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトパラインフルエンザ4A型ウイルス（以
下、PIV−4Aと略称する）フュージョンプロテイン（以
下、Ｆ蛋白と略称する）をコードする遺伝子に関し、よ
り詳しくは、PIV−4A・Ｆ蛋白の遺伝子RNAを相補性を示
し、さらにPIV−4A・Ｆ蛋白の全コード領域を含むの
で、例えば、PIV−4Aの感染症の検査薬としてあるいは
治療薬として有用な遺伝に関する。
下、PIV−4Aと略称する）フュージョンプロテイン（以
下、Ｆ蛋白と略称する）をコードする遺伝子に関し、よ
り詳しくは、PIV−4A・Ｆ蛋白の遺伝子RNAを相補性を示
し、さらにPIV−4A・Ｆ蛋白の全コード領域を含むの
で、例えば、PIV−4Aの感染症の検査薬としてあるいは
治療薬として有用な遺伝に関する。
例えば、ウイルス感染症の治療効果を高めるには、感
染ウイルスを同定し、その同定結果に基づいて適切な治
療を行なうことが必要である。
染ウイルスを同定し、その同定結果に基づいて適切な治
療を行なうことが必要である。
従来、ウイルスは血清学的性上に基づいて同定されて
いる。その主な方法としてはエンザイムリンクドイムノ
ソルベントアッセイ法（以下、ELISA法と略称する）、
中和反応法、補体結合反応法、血球凝集抑制反応法、蛍
光抗体法、寒天内沈降反応法等が知られているが、これ
らいずれの方法も、検体中のウイルスに対する抗体を測
定することにより判定を行うものであって、確度の高い
判定を行うためには、一般的に感染１週間後のウイルス
抗体価が上昇し始める段階で行わなければならず、場合
によっては、さらに数週間後に再測定を行って確認する
ことが必要であり、従って、発症前及び早期診断が難し
いという問題点がある。
いる。その主な方法としてはエンザイムリンクドイムノ
ソルベントアッセイ法（以下、ELISA法と略称する）、
中和反応法、補体結合反応法、血球凝集抑制反応法、蛍
光抗体法、寒天内沈降反応法等が知られているが、これ
らいずれの方法も、検体中のウイルスに対する抗体を測
定することにより判定を行うものであって、確度の高い
判定を行うためには、一般的に感染１週間後のウイルス
抗体価が上昇し始める段階で行わなければならず、場合
によっては、さらに数週間後に再測定を行って確認する
ことが必要であり、従って、発症前及び早期診断が難し
いという問題点がある。
通常、PIV−4Aの測定にはELISA法が用いられており、
この方法は、検体中のPIV−4Aに対する抗体を測定する
もので、例えば、PIV−4Aを固定化したプレートに、被
検体を加え反応させた後洗浄し、さらに抗PIV−4A抗体
を加え同様にして反応させ、次いで酵素標識抗体を加え
て反応後、発色させることにより測定するものである
が、この方法も上記同様発症前及び早期診断が難しく、
必然的に治療の開始時期を遅らせる結果となり、治療効
果を高めるのが難しいという問題点を有している。
この方法は、検体中のPIV−4Aに対する抗体を測定する
もので、例えば、PIV−4Aを固定化したプレートに、被
検体を加え反応させた後洗浄し、さらに抗PIV−4A抗体
を加え同様にして反応させ、次いで酵素標識抗体を加え
て反応後、発色させることにより測定するものである
が、この方法も上記同様発症前及び早期診断が難しく、
必然的に治療の開始時期を遅らせる結果となり、治療効
果を高めるのが難しいという問題点を有している。
本発明は、上記のような問題点の解決を可能とするも
ので、特にPIV−4A感染症の早期診断を可能にする検査
薬に有用な遺伝子を提供するものである。
ので、特にPIV−4A感染症の早期診断を可能にする検査
薬に有用な遺伝子を提供するものである。
本発明は、遺伝子を構成する塩基配列の全部または一
部が、下記［式］ の全部または一部で表される遺伝子（以下、DNA断片と
略称することもある）を提供することによって、PIV−4
A感染症の発症前及び早期診断が難しいという問題点の
解決を図ったものである。
部が、下記［式］ の全部または一部で表される遺伝子（以下、DNA断片と
略称することもある）を提供することによって、PIV−4
A感染症の発症前及び早期診断が難しいという問題点の
解決を図ったものである。
本発明によって提供されるDNA断片は、PIV−4A・Ｆ蛋
白の遺伝子RNAに相補性を示すので、これをPIV−4A同定
用検査薬に用いた場合、PIV−4Aの同定を直接行うこと
ができ、従来の抗体測定による間接的同定法による問題
点の解決が可能となり、また、本発明のPIV−4A・Ｆ蛋
白遺伝子は、PIV−4A・Ｆ蛋白の全コード領域を含むの
で、発現されたＦ蛋白を抗体作成の際の抗原として、あ
るいは、ワクチンの原料として用いることができるの
で、PIV−4A感染症の治療薬用途に有用である。
白の遺伝子RNAに相補性を示すので、これをPIV−4A同定
用検査薬に用いた場合、PIV−4Aの同定を直接行うこと
ができ、従来の抗体測定による間接的同定法による問題
点の解決が可能となり、また、本発明のPIV−4A・Ｆ蛋
白遺伝子は、PIV−4A・Ｆ蛋白の全コード領域を含むの
で、発現されたＦ蛋白を抗体作成の際の抗原として、あ
るいは、ワクチンの原料として用いることができるの
で、PIV−4A感染症の治療薬用途に有用である。
本発明における上記［式］で表されるDNA断片の製造
方法は、特に制限はなく、常法に従うことができ、例え
ば、 （ａ） PIV−4A感染細胞から得られるmRNAより調製さ
れたcDNAを大腸菌のプラスミドベクター等の適当なベク
ターに導入し大腸菌にクローン化させ、 プローブとしてヌクレオカプシドRNAを用いてスク
リーニングを行う方法。
方法は、特に制限はなく、常法に従うことができ、例え
ば、 （ａ） PIV−4A感染細胞から得られるmRNAより調製さ
れたcDNAを大腸菌のプラスミドベクター等の適当なベク
ターに導入し大腸菌にクローン化させ、 プローブとしてヌクレオカプシドRNAを用いてスク
リーニングを行う方法。
プローブとして上記式で表される塩基配列に基づい
て合成されたオリゴヌクレオチドを用いてスクリーニン
グを行う方法、 PIV−4Aに対する抗体を用いてスクリーニングを行
う方法。
て合成されたオリゴヌクレオチドを用いてスクリーニン
グを行う方法、 PIV−4Aに対する抗体を用いてスクリーニングを行
う方法。
等でPIV−4A・Ｆ蛋白遺伝子をコードするクローンを単
離し、この単離されたクローンのプラスミドからインサ
ートDNAを分離する方法、 （ｂ） 上記［式］で表されるPIV−4A・Ｆ蛋白の遺伝
子RNAに相補性を示す塩基配列に基づいて、ホスホアミ
ダイト法（Nature、310巻、105頁、1984年）に従って合
成ヌクレオチドを作成する方法、 （ｃ） 上記（ａ）及び（ｂ）を併用する方法、 等によって製造することができる。
離し、この単離されたクローンのプラスミドからインサ
ートDNAを分離する方法、 （ｂ） 上記［式］で表されるPIV−4A・Ｆ蛋白の遺伝
子RNAに相補性を示す塩基配列に基づいて、ホスホアミ
ダイト法（Nature、310巻、105頁、1984年）に従って合
成ヌクレオチドを作成する方法、 （ｃ） 上記（ａ）及び（ｂ）を併用する方法、 等によって製造することができる。
上記方法によって得られた本発明のDNA断片は、以下
のようにして用いることができる。
のようにして用いることができる。
例えば、上記方法で得られたDNA断片は、必要ならば
適当な制限酵素（例えば、Bg1 II等）で十数塩素以上、
好ましくは20塩基以上にさらに切断後、放射線同位元素
等で標識して検査薬とし、この検査薬を検体（咽頭液
等）から抽出したRNAを固定化したナイロン膜等と反応
後、オートラジオグラフィー等で判定するノーザンハイ
ブリダイゼーション法（以下、ノーザン法と省略する）
等でPIV−4Aの同定を行うことができる。
適当な制限酵素（例えば、Bg1 II等）で十数塩素以上、
好ましくは20塩基以上にさらに切断後、放射線同位元素
等で標識して検査薬とし、この検査薬を検体（咽頭液
等）から抽出したRNAを固定化したナイロン膜等と反応
後、オートラジオグラフィー等で判定するノーザンハイ
ブリダイゼーション法（以下、ノーザン法と省略する）
等でPIV−4Aの同定を行うことができる。
なお、本発明においては、上記［式］の全部または一
部で表される単位それ自体で検査薬等として有用である
が、該単位を適宜なDNAベクターに組み込んでも上記同
様に用いることができ、さらに該ベクターは必ずしもDN
Aベクターである必要はなく、それ以上の他の適宜な物
質、例えば、ポリマー、セルロール、ガラスビーズ、医
薬品等に組み込んで、あるいは、これらと混合する等し
ても使用できる。
部で表される単位それ自体で検査薬等として有用である
が、該単位を適宜なDNAベクターに組み込んでも上記同
様に用いることができ、さらに該ベクターは必ずしもDN
Aベクターである必要はなく、それ以上の他の適宜な物
質、例えば、ポリマー、セルロール、ガラスビーズ、医
薬品等に組み込んで、あるいは、これらと混合する等し
ても使用できる。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明す
る。
る。
調査薬への応用 （１） RNA調製 牛胎児血清５％を含むイーグル必須培養液中で初代サ
ル腎細胞を増殖させた後、この培養液を新たに調整した
アクチノマイシンＤ（２μg/ml）を含むイーグル必須培
養液と交換した。次いでPIV−4A（東芝株）を接種し、
同培養液中で24時間培養を行なった。ウイルス感染培養
細胞をトリプシン/EDTA混合液で剥した後、8000rpmで10
分間遠心することにより細胞を集め、グアニジンイソチ
オシアネート液（6Mグアニジンイソチオシアネート、5m
Mクエン酸ナトリウム、0.1M 2−メルカプトエタノー
ル、0.5％ラウロイルザルコシン酸ナトリウム）を加
え、ホモゲナイザー中で素早く溶解し、21G注射針をつ
けた注射筒に５回通すことで染色体DNAをせん断した。
得られた細胞溶解液を再度8000rpmで遠心し、得られた
上澄液9mlを5.7M塩化セシウム水溶液3mlの入った別の遠
心チューブに重層し、ベックマンローラー（Beckman SW
40Ti rotor）にて、37000rpmで18時間、18℃で超遠心を
行い、遠心後RNAペレットを回収した。
ル腎細胞を増殖させた後、この培養液を新たに調整した
アクチノマイシンＤ（２μg/ml）を含むイーグル必須培
養液と交換した。次いでPIV−4A（東芝株）を接種し、
同培養液中で24時間培養を行なった。ウイルス感染培養
細胞をトリプシン/EDTA混合液で剥した後、8000rpmで10
分間遠心することにより細胞を集め、グアニジンイソチ
オシアネート液（6Mグアニジンイソチオシアネート、5m
Mクエン酸ナトリウム、0.1M 2−メルカプトエタノー
ル、0.5％ラウロイルザルコシン酸ナトリウム）を加
え、ホモゲナイザー中で素早く溶解し、21G注射針をつ
けた注射筒に５回通すことで染色体DNAをせん断した。
得られた細胞溶解液を再度8000rpmで遠心し、得られた
上澄液9mlを5.7M塩化セシウム水溶液3mlの入った別の遠
心チューブに重層し、ベックマンローラー（Beckman SW
40Ti rotor）にて、37000rpmで18時間、18℃で超遠心を
行い、遠心後RNAペレットを回収した。
上記のようにして得られるRNAから、オリゴdTセルロ
ーズType7〔フアルマシア（Pharmacia）社製〕を用いて
ポリＡ鎖を含むmRNA〔以下、poly（Ａ＋）RNAと略称す
る〕を分離、精製した。
ーズType7〔フアルマシア（Pharmacia）社製〕を用いて
ポリＡ鎖を含むmRNA〔以下、poly（Ａ＋）RNAと略称す
る〕を分離、精製した。
（２） cDNAライブラリーの作成 cDNAライブラリーは、岡山・バーグ法に従い合成し
た。すなわち、上記poly（Ａ＋）RNA4μｇに蒸留水５μ
ｌを加え、65℃で10分間加熱した後急冷し、次にオリゴ
dTプライムドベクター〔pUC118ベクターのKpn Iサイト
にオリゴdTを付加した（0.8〜1.2μg/μｌ）〕10μｌ、
合成反応液（500mM Tris−塩酸緩衝液 pH8.3、300mM 塩
化カリウム、80mM 塩化マグネシウム、3mMジチオスレイ
トール）３μｌ、及び、20mM dATP、20mM dCTP、20mM d
GTP、20mM dTTPを各々１μｌづつ加え、さらに20unitsR
Nasin,40unitsリバーストランスクリプターゼを加えた
後、蒸留水で全量を30μｌとし、42℃で30分間反応を行
い第一鎖cDNAを合成した。第一鎖cDNA合成終了後、dGTP
存在下ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼを用いて10〜30個のdG塩基を付加した。次に制限
酵素Hind IIIによる消化を行い、さらにdC塩基鎖を持つ
リンカーとアニール後、大腸菌ライゲースにより閉環状
とした。最後にRNaseH存在下、DNAポリメラーゼにより
第二鎖の合成を行い、完全なプラスミドDNAを作成し
た。次に塩化カルシウム処理を施すことにより得られる
コンペテント細胞（DH1）100〜200μｌに、0.4M 塩化マ
グネシウム/0.1M 塩化カルシウムの混合液10μｌ、及
び、上記プラスミドDNA0.02μｇを加え、０℃で40分
間、次いで42℃で90秒間放置し、次に培養液（バクトト
リプトン10g、イーストイクストラクト5g、塩化ナトリ
ウム5gを1000mlの蒸留水に溶解した溶液）1.5mlを加
え、37℃で40分間放置することにより形質転換細胞を得
た。
た。すなわち、上記poly（Ａ＋）RNA4μｇに蒸留水５μ
ｌを加え、65℃で10分間加熱した後急冷し、次にオリゴ
dTプライムドベクター〔pUC118ベクターのKpn Iサイト
にオリゴdTを付加した（0.8〜1.2μg/μｌ）〕10μｌ、
合成反応液（500mM Tris−塩酸緩衝液 pH8.3、300mM 塩
化カリウム、80mM 塩化マグネシウム、3mMジチオスレイ
トール）３μｌ、及び、20mM dATP、20mM dCTP、20mM d
GTP、20mM dTTPを各々１μｌづつ加え、さらに20unitsR
Nasin,40unitsリバーストランスクリプターゼを加えた
後、蒸留水で全量を30μｌとし、42℃で30分間反応を行
い第一鎖cDNAを合成した。第一鎖cDNA合成終了後、dGTP
存在下ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼを用いて10〜30個のdG塩基を付加した。次に制限
酵素Hind IIIによる消化を行い、さらにdC塩基鎖を持つ
リンカーとアニール後、大腸菌ライゲースにより閉環状
とした。最後にRNaseH存在下、DNAポリメラーゼにより
第二鎖の合成を行い、完全なプラスミドDNAを作成し
た。次に塩化カルシウム処理を施すことにより得られる
コンペテント細胞（DH1）100〜200μｌに、0.4M 塩化マ
グネシウム/0.1M 塩化カルシウムの混合液10μｌ、及
び、上記プラスミドDNA0.02μｇを加え、０℃で40分
間、次いで42℃で90秒間放置し、次に培養液（バクトト
リプトン10g、イーストイクストラクト5g、塩化ナトリ
ウム5gを1000mlの蒸留水に溶解した溶液）1.5mlを加
え、37℃で40分間放置することにより形質転換細胞を得
た。
上記により200μｌのコンペテント細胞（DH1）に、0.
02μｇのプラスミドDNAを導入することにより、アンピ
シリン存在下で1500個の独立したクローンを得た。
02μｇのプラスミドDNAを導入することにより、アンピ
シリン存在下で1500個の独立したクローンを得た。
（３） ヌクレオカプシドRNAプローブの調製 PIV−4A感染初代サル腎細胞に、0.6％ノニデットＰ−
40、10mM バナジルリボヌクレオチド複合体を含む溶液
（0.15M 塩化ナトリウム、0.05M Tris−塩酸緩衝液）を
加え、氷中で１時間ピペティングによる可溶化を行い、
8000rpmで10分間遠心した。次いで塩化セシウムの40％
水溶液、30％水溶液、25％水溶液の各々1ml、2.5ml、1m
lをこの順に重層した遠心チューブに、上記遠心で得ら
れた上澄液9mlをさらに重層し、ベックマンローターSW4
0Tiにて37000rpm、18時間、16℃で平衡密度勾配遠心を
行った。遠心後30％の塩化セシウム水溶液層に生じたウ
イルスのヌクレオカプシドバンドを回収した。次に0.1
％SDS及びプロテイナーゼＫ（2.5mg/ml）を加え、56℃
で15分間蛋白分解を行った後、フェノール及びフェノー
ル／クロロホルム混液で処理を行い、ヌクレオカプシド
RNAを得た。得られたヌクレオカプシドRNAに50mM Tris
−塩酸緩衝液pH9.7を加え、95℃で10分間加温した後、
室温まで徐々に冷やした。次にこのRNA溶液20μｌに緩
衝液（250mM Tris−塩酸、50mM 塩化マグネシウム、25m
M DTT,7.5mM スペルミン、500mM 塩化カリウム）10μ
ｌ、及び32PATP（100μCi/600pM）３μｌ、T4−DNAカイ
ネース2unitsを加えた後、蒸留水で全量を50μｌとし、
37℃で１時間反応させヌクレオカプシドRNAプローブを
得た。
40、10mM バナジルリボヌクレオチド複合体を含む溶液
（0.15M 塩化ナトリウム、0.05M Tris−塩酸緩衝液）を
加え、氷中で１時間ピペティングによる可溶化を行い、
8000rpmで10分間遠心した。次いで塩化セシウムの40％
水溶液、30％水溶液、25％水溶液の各々1ml、2.5ml、1m
lをこの順に重層した遠心チューブに、上記遠心で得ら
れた上澄液9mlをさらに重層し、ベックマンローターSW4
0Tiにて37000rpm、18時間、16℃で平衡密度勾配遠心を
行った。遠心後30％の塩化セシウム水溶液層に生じたウ
イルスのヌクレオカプシドバンドを回収した。次に0.1
％SDS及びプロテイナーゼＫ（2.5mg/ml）を加え、56℃
で15分間蛋白分解を行った後、フェノール及びフェノー
ル／クロロホルム混液で処理を行い、ヌクレオカプシド
RNAを得た。得られたヌクレオカプシドRNAに50mM Tris
−塩酸緩衝液pH9.7を加え、95℃で10分間加温した後、
室温まで徐々に冷やした。次にこのRNA溶液20μｌに緩
衝液（250mM Tris−塩酸、50mM 塩化マグネシウム、25m
M DTT,7.5mM スペルミン、500mM 塩化カリウム）10μ
ｌ、及び32PATP（100μCi/600pM）３μｌ、T4−DNAカイ
ネース2unitsを加えた後、蒸留水で全量を50μｌとし、
37℃で１時間反応させヌクレオカプシドRNAプローブを
得た。
（４） コロニーハイブリダイゼーション 上記の形質転換細胞100〜200μｌを、アンピシリン
（120μg/ml）を含む15cmの寒天プレート（10gバクトト
リプトン、5gイーストイクストラクト、5g塩化ナトリウ
ム、15gアガーを加え蒸留水で全量を1000mlとした）に
蒔き、12時間、37℃で培養した。ニトロセルロース膜に
生じたコロニーを写し取り37℃で６時間培養した。次に
この膜、0.5N水酸化ナトリウム/1.5M 塩化ナトリウム混
合液で10分間処理し、さらに1.5M 塩化ナトリウムを含
む0.5M Tris−塩酸緩衝液pH8.0に10分間置いた後、0.3M
塩化ナトリウム/0.03M クン酸ナトリウム混合液中で５
分間リンスした。リンス後膜を風乾し、80℃で１時間吸
引しながらベーキングを行うことによりDNAを膜に固定
した。
（120μg/ml）を含む15cmの寒天プレート（10gバクトト
リプトン、5gイーストイクストラクト、5g塩化ナトリウ
ム、15gアガーを加え蒸留水で全量を1000mlとした）に
蒔き、12時間、37℃で培養した。ニトロセルロース膜に
生じたコロニーを写し取り37℃で６時間培養した。次に
この膜、0.5N水酸化ナトリウム/1.5M 塩化ナトリウム混
合液で10分間処理し、さらに1.5M 塩化ナトリウムを含
む0.5M Tris−塩酸緩衝液pH8.0に10分間置いた後、0.3M
塩化ナトリウム/0.03M クン酸ナトリウム混合液中で５
分間リンスした。リンス後膜を風乾し、80℃で１時間吸
引しながらベーキングを行うことによりDNAを膜に固定
した。
このようにして得られた膜５枚当りに、変性鮭RNA（1
mg/ml）1ml、SSPE液（3.6M 塩化ナトリウム、200mM 第
一りん酸ナトリウム、20mM EDTA）7.5ml、デンハード液
（２％BSA、２％Ficoll、２％ポリビニルピロリドン）
1.25ml、10％SDS 1.25mlからなるプレハイブリダイゼー
ション液を加え、42℃で12時間反応させ、次に新たに調
製した上記プレハイブリダイゼーション液に上記ヌクレ
オカプシドRNAプローブを、500万Ci/mlとなるように加
え、42℃で18時間反応を行った。
mg/ml）1ml、SSPE液（3.6M 塩化ナトリウム、200mM 第
一りん酸ナトリウム、20mM EDTA）7.5ml、デンハード液
（２％BSA、２％Ficoll、２％ポリビニルピロリドン）
1.25ml、10％SDS 1.25mlからなるプレハイブリダイゼー
ション液を加え、42℃で12時間反応させ、次に新たに調
製した上記プレハイブリダイゼーション液に上記ヌクレ
オカプシドRNAプローブを、500万Ci/mlとなるように加
え、42℃で18時間反応を行った。
反応終了後、0.1％ SDSを含む20倍希釈のSSPE液中で4
2℃で５分間２回洗浄し、次に0.1％ SDSを含む200倍希
釈のSSPE液中で42℃で15分間２回洗浄を行った。洗浄終
了後膜を風乾し、Ｘ線フィルム（RX5、コダック社製）
を用いて、−80℃で12時間オートラヂオグラフィーを行
い、数個の陽性クローンを得た。
2℃で５分間２回洗浄し、次に0.1％ SDSを含む200倍希
釈のSSPE液中で42℃で15分間２回洗浄を行った。洗浄終
了後膜を風乾し、Ｘ線フィルム（RX5、コダック社製）
を用いて、−80℃で12時間オートラヂオグラフィーを行
い、数個の陽性クローンを得た。
（５） ノーザン法 上記の陽性クローンを用いてノーザン法を行った。す
なわち、前記（１）の方法で得られたPIV−4A感染細胞
由来poly（Ａ＋）RNA、ウイルス非感染細胞由来poly
（Ａ＋）RNA及びrRNAマーカーを、各々1.5％ アガロー
スゲル中で電気泳動後、ナイロン膜（Hybond−Ｎ、アマ
シャム社製）に転写し、風乾後UV照射することによりRN
Aをナイロン膜に共有結合させ、次に上記の各陽性クロ
ーンをプローブとして各々ハイブリダイゼーションを行
った。
なわち、前記（１）の方法で得られたPIV−4A感染細胞
由来poly（Ａ＋）RNA、ウイルス非感染細胞由来poly
（Ａ＋）RNA及びrRNAマーカーを、各々1.5％ アガロー
スゲル中で電気泳動後、ナイロン膜（Hybond−Ｎ、アマ
シャム社製）に転写し、風乾後UV照射することによりRN
Aをナイロン膜に共有結合させ、次に上記の各陽性クロ
ーンをプローブとして各々ハイブリダイゼーションを行
った。
すなわち、ナイロン膜を上記プレハイブリダイゼーシ
ョン液中で42℃で12時間反応させ、次に各陽性クローン
から作られた32Pでラベルされたプローブを100万Ci/ml
となるようにプレハイブリダイゼーション液に加え、42
℃で18時間反応させた。反応終了後上記（４）と同様に
洗浄を行い、Ｘ線フィルムを用いてオートラジオグラフ
ィーを行い、その結果2100baseの位置にハイブリダイズ
するクローンを１個得た。このクローンをp4AFと命名し
た。
ョン液中で42℃で12時間反応させ、次に各陽性クローン
から作られた32Pでラベルされたプローブを100万Ci/ml
となるようにプレハイブリダイゼーション液に加え、42
℃で18時間反応させた。反応終了後上記（４）と同様に
洗浄を行い、Ｘ線フィルムを用いてオートラジオグラフ
ィーを行い、その結果2100baseの位置にハイブリダイズ
するクローンを１個得た。このクローンをp4AFと命名し
た。
なお、各陽性クローンのプローブは、各クローンをHi
nd III及びEcoR Iで消化後、低融点アガロースを用いた
電気泳動によりインサートDNAを分離し、抽出後、32PdC
TPを用いたランダムプライムラベルにより得た。
nd III及びEcoR Iで消化後、低融点アガロースを用いた
電気泳動によりインサートDNAを分離し、抽出後、32PdC
TPを用いたランダムプライムラベルにより得た。
（６） PIV−4A・Ｆ蛋白遺伝子に相補性を示すDNAの制
限酵素地図の作成及び塩基配列の決定 上記（５）で得られたクローンp4AFを種々の制限酵素
で切断して、その制限酵素地図を作成し、第１図にその
結果を示した。
限酵素地図の作成及び塩基配列の決定 上記（５）で得られたクローンp4AFを種々の制限酵素
で切断して、その制限酵素地図を作成し、第１図にその
結果を示した。
すなわち、第１図は、クローンp4AFをHind III、Nde
I、Sca I及びEcoR Iの各制限酵素で切断後、得られたフ
ラグメントをプラスミドpUC118のマルチクローニングサ
イトに各々導入し、SEQUENASE TMキット（東洋紡社製）
を用いてシークエンスを行い、また、一部はキロシーク
エンス用デレーションキット（宝酒造社製）の用いてデ
レションミュータントを作成し、シークエンスを行い塩
素配列を決定することによって作成した制限酵素地図で
あり、図面において１及び３はベクターDNAであり、２
はインサートDNAで本発明のDNA断片である。
I、Sca I及びEcoR Iの各制限酵素で切断後、得られたフ
ラグメントをプラスミドpUC118のマルチクローニングサ
イトに各々導入し、SEQUENASE TMキット（東洋紡社製）
を用いてシークエンスを行い、また、一部はキロシーク
エンス用デレーションキット（宝酒造社製）の用いてデ
レションミュータントを作成し、シークエンスを行い塩
素配列を決定することによって作成した制限酵素地図で
あり、図面において１及び３はベクターDNAであり、２
はインサートDNAで本発明のDNA断片である。
その結果は、前記［式］に示す通りであった。
（７） PIV−4Aの同定 （７−１） インサートインサートDNAの全体を用いる
場合； 上記（５）で得られたp4AFクローンを、Pst I及びSac
Iで切断後、低融点アガロースを用いた電気泳動により
薬2100塩基対の位置に泳動されるバンドを切り出し、抽
出し、エタノール沈澱によりインサートDNAを回収し
た。得られたインサートDNA1μｌ（10pmoles/μｌ）当
り、緩衝液（0.5M Tris−塩酸 pH7.6、0.1M MgCl2、50m
M ヂチオスレイトール、1mM スペルミジン塩酸、1mM ED
TA）２μｌ、蒸留水11.4μｌ、（γ32P）ATP5μｌ（2nm
oles/μｌ）、バクテリオフアージT4ポリヌクレオチド
キナーゼ8unitを加えた後、37℃で45分間反応した。次
に反応液をBio−gel P60（日本バイオ・ラッドラボラト
リーズ株式会社製）により精製し得られた精製品をプロ
ーブとして用いた。
場合； 上記（５）で得られたp4AFクローンを、Pst I及びSac
Iで切断後、低融点アガロースを用いた電気泳動により
薬2100塩基対の位置に泳動されるバンドを切り出し、抽
出し、エタノール沈澱によりインサートDNAを回収し
た。得られたインサートDNA1μｌ（10pmoles/μｌ）当
り、緩衝液（0.5M Tris−塩酸 pH7.6、0.1M MgCl2、50m
M ヂチオスレイトール、1mM スペルミジン塩酸、1mM ED
TA）２μｌ、蒸留水11.4μｌ、（γ32P）ATP5μｌ（2nm
oles/μｌ）、バクテリオフアージT4ポリヌクレオチド
キナーゼ8unitを加えた後、37℃で45分間反応した。次
に反応液をBio−gel P60（日本バイオ・ラッドラボラト
リーズ株式会社製）により精製し得られた精製品をプロ
ーブとして用いた。
次に、前記（１）の方法で得られたPIV−4A感染細胞
由来RNA、ウイルス非感染細胞由来RNAを0.35μｇずつナ
イロン膜にプロットした後、風乾、UV照射し、前記
（４）のプレハイブリダイゼーション液中で42℃で12時
間反応させた。次に沸騰水浴中で２分間置いた後急冷処
理を施した先のプローブを100万Ci/mlとなるように加
え、さらに42℃で18時間反応させた。反応終了後、0.1
％ SDSを含む20倍希釈のSSPE液中で42℃で５分間２回洗
浄し、次に0.1％ SDSを含む200倍希釈のSSPE液中で42℃
で15分間２回洗浄を行った。洗浄終了後膜を風乾し、Ｘ
線フィルムを用いて−80℃で12時間オートラジオグラフ
ィーを行った。
由来RNA、ウイルス非感染細胞由来RNAを0.35μｇずつナ
イロン膜にプロットした後、風乾、UV照射し、前記
（４）のプレハイブリダイゼーション液中で42℃で12時
間反応させた。次に沸騰水浴中で２分間置いた後急冷処
理を施した先のプローブを100万Ci/mlとなるように加
え、さらに42℃で18時間反応させた。反応終了後、0.1
％ SDSを含む20倍希釈のSSPE液中で42℃で５分間２回洗
浄し、次に0.1％ SDSを含む200倍希釈のSSPE液中で42℃
で15分間２回洗浄を行った。洗浄終了後膜を風乾し、Ｘ
線フィルムを用いて−80℃で12時間オートラジオグラフ
ィーを行った。
その結果、PIV−4A感染細胞由来RNAをプロットした部
分には、試料中のPIV−4AウイルスRNAとハイブリッドを
形成した同プローブにより生じる陽性シグナルを認めら
れ、PIV−4Aに感染していることが確認された。これに
対して、ウイルス非感染細胞由来RNAをプロットした部
分には反応が全く認められなかった。
分には、試料中のPIV−4AウイルスRNAとハイブリッドを
形成した同プローブにより生じる陽性シグナルを認めら
れ、PIV−4Aに感染していることが確認された。これに
対して、ウイルス非感染細胞由来RNAをプロットした部
分には反応が全く認められなかった。
（７−２） インサートDNAの一部断片を用いる場合； 上記（５）で得られたp4AFクローンを、Bgl IIで切断
後、低融点アガロースを用いた電気泳動により約350〜4
50塩基対の位置に泳動されるバンドを切り出し、DNA断
片を抽出した後エタノール沈澱により回収した。得られ
たDNA断片はランダムプライムラベリングによりプロー
ブとした。
後、低融点アガロースを用いた電気泳動により約350〜4
50塩基対の位置に泳動されるバンドを切り出し、DNA断
片を抽出した後エタノール沈澱により回収した。得られ
たDNA断片はランダムプライムラベリングによりプロー
ブとした。
すなわち、DNA断片0.1μｇに蒸留水10μｌを加え沸騰
水中で２分間置き急冷し、次に牛血清アルブミン１μｌ
（10mg/ml）、ランダム液〔0.44M HEPES pH6.6、110mM
Tris−塩酸pH8、11mM MgCl2、22mM 2−メルカプトエタ
ノール、44μM dATP、44μM dGTP、44μM dTTP、0.12mM
Tris−塩酸pH7.5、0.12mM EDTA、11units/mlオリゴヌ
クレオチドpd（Ｎ）６（ファルマシア株式会社製）〕1
1.4μｌ、（α32P）dCTP5μｌ（100μCi/600pM）、クレ
ノウ2.5unitsを加え室温で６時間反応させた。得られた
反応液を、Bio−gel P60により精製しプローブとした。
水中で２分間置き急冷し、次に牛血清アルブミン１μｌ
（10mg/ml）、ランダム液〔0.44M HEPES pH6.6、110mM
Tris−塩酸pH8、11mM MgCl2、22mM 2−メルカプトエタ
ノール、44μM dATP、44μM dGTP、44μM dTTP、0.12mM
Tris−塩酸pH7.5、0.12mM EDTA、11units/mlオリゴヌ
クレオチドpd（Ｎ）６（ファルマシア株式会社製）〕1
1.4μｌ、（α32P）dCTP5μｌ（100μCi/600pM）、クレ
ノウ2.5unitsを加え室温で６時間反応させた。得られた
反応液を、Bio−gel P60により精製しプローブとした。
次に、前記（１）の方法で得られたPIV−4A感染細胞
由来RNA、ウイルス非感染細胞由来RNAを0.35μｇずつナ
イロン膜にプロットした後、風乾、UV照射し、前記
（４）のプレハイブリダイゼション液中で42℃で12時間
反応させた。次に沸騰水浴中で２分間置いた後急冷処理
を施した先のプローブを100万Ci/mlとなるように加え、
さらに42℃で18時間反応させた。反応終了後、0.1％ SD
Sを含む20倍希釈のSSPE液中で42℃で５分間２回洗浄
し、次に0.1％ SDSを含む200倍希釈のSSPE液中で42℃で
15分間２回洗浄を行った。洗浄終了後膜を風乾し、Ｘ線
フィルムを用いて−80℃で12時間オートラジオグラフィ
ーを行った。
由来RNA、ウイルス非感染細胞由来RNAを0.35μｇずつナ
イロン膜にプロットした後、風乾、UV照射し、前記
（４）のプレハイブリダイゼション液中で42℃で12時間
反応させた。次に沸騰水浴中で２分間置いた後急冷処理
を施した先のプローブを100万Ci/mlとなるように加え、
さらに42℃で18時間反応させた。反応終了後、0.1％ SD
Sを含む20倍希釈のSSPE液中で42℃で５分間２回洗浄
し、次に0.1％ SDSを含む200倍希釈のSSPE液中で42℃で
15分間２回洗浄を行った。洗浄終了後膜を風乾し、Ｘ線
フィルムを用いて−80℃で12時間オートラジオグラフィ
ーを行った。
その結果、PIV−4A感染細胞由来RNAをプロットした部
分には、試料中のPIV−4AウイルスRNAとハイブリッドを
形成した同プローブにより生じる陽性シグナルが認めら
れ、PIV−4Aに感染していることが確認された。これに
対して、ウイルス非感染細胞由来RNAをプロットした部
分には反応が全く認められなかった。
分には、試料中のPIV−4AウイルスRNAとハイブリッドを
形成した同プローブにより生じる陽性シグナルが認めら
れ、PIV−4Aに感染していることが確認された。これに
対して、ウイルス非感染細胞由来RNAをプロットした部
分には反応が全く認められなかった。
（７−３）前記［式］で表される塩基配列に基ずいて合
成されたオリゴヌクレオチドを用いる場合； 前記［式］で示される塩基配列に基ずいて、十数塩基
以上のオリゴヌクレオチドを合成し、プローブとするこ
とが出来る。
成されたオリゴヌクレオチドを用いる場合； 前記［式］で示される塩基配列に基ずいて、十数塩基
以上のオリゴヌクレオチドを合成し、プローブとするこ
とが出来る。
すなわち、DNA合成機〔DNAシンセサイザー モデル38
1A（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社
製）〕を用い合成したオリゴヌクレオチド（５′−ATGA
ATCTAGGAACGGTACCGA−３′）を、オリゴヌクレオチド精
製カートリッジ（アプライドバイオシステムズジャパン
株式会社製）を用いて精製した。得られた合成オリゴヌ
クレオチド１μｌ（10pmoles/μｌ）当り、前記（７−
１）の緩衝液２μｌ、蒸留水11.4μｌ（γ32P）ATP5μ
ｌ（2nmoles/μｌ）、バクテリオフアージT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ8unitを加えた後、37℃で45分間反応し
た。次に反応液をBio−gelP60により精製し、得られた
精製品をプローブとして用いた。
1A（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社
製）〕を用い合成したオリゴヌクレオチド（５′−ATGA
ATCTAGGAACGGTACCGA−３′）を、オリゴヌクレオチド精
製カートリッジ（アプライドバイオシステムズジャパン
株式会社製）を用いて精製した。得られた合成オリゴヌ
クレオチド１μｌ（10pmoles/μｌ）当り、前記（７−
１）の緩衝液２μｌ、蒸留水11.4μｌ（γ32P）ATP5μ
ｌ（2nmoles/μｌ）、バクテリオフアージT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ8unitを加えた後、37℃で45分間反応し
た。次に反応液をBio−gelP60により精製し、得られた
精製品をプローブとして用いた。
次に、前記（１）の方法で得られたPIV−4A感染細胞
由来RNA、ウイルス非感染細胞由来RNAを0.35μｇずつナ
イロン膜にプロットした後、風乾、UV照射し、前記
（４）のプレハイブリダゼーション液中で42℃で12時間
反応させた。次に先のプローブを100万Ci/mlとなるよう
に加え、さらに42℃で18時間反応させた。反応終了後、
0.1 DSを含む20倍希釈のSSPE液中で42℃で５分間２回洗
浄し、次に0.1％ SDSを含む200倍希釈のSSPE液中で42℃
で15分間２回洗浄を行った。洗浄終了後膜を風乾し、Ｘ
線フィルムを用いて−80℃で12時間オートラジオグラフ
ィーを行った。
由来RNA、ウイルス非感染細胞由来RNAを0.35μｇずつナ
イロン膜にプロットした後、風乾、UV照射し、前記
（４）のプレハイブリダゼーション液中で42℃で12時間
反応させた。次に先のプローブを100万Ci/mlとなるよう
に加え、さらに42℃で18時間反応させた。反応終了後、
0.1 DSを含む20倍希釈のSSPE液中で42℃で５分間２回洗
浄し、次に0.1％ SDSを含む200倍希釈のSSPE液中で42℃
で15分間２回洗浄を行った。洗浄終了後膜を風乾し、Ｘ
線フィルムを用いて−80℃で12時間オートラジオグラフ
ィーを行った。
その結果、PIV−4A感染細胞由来RNAをプロットした部
分には、試料中のPIV−4AウイルスRNAとハイブリッドを
形成した同プローブにより生じる陽性シグナルが認めら
れ、PIV−4Aに感染していることが確認された。これに
対して、ウイルス非感染細胞由来RNAをプロットした部
分には反応が全く認められなかった。
分には、試料中のPIV−4AウイルスRNAとハイブリッドを
形成した同プローブにより生じる陽性シグナルが認めら
れ、PIV−4Aに感染していることが確認された。これに
対して、ウイルス非感染細胞由来RNAをプロットした部
分には反応が全く認められなかった。
治療薬への応用 （８） p4AFクローンにコードされているタンパク質を
発現する場合； p4AFクローンは、Ｆ蛋白遺伝子のほぼ全領域及びＦ蛋
白のコードされる遺伝子領域を全て含んでいることか
ら、p4AFクローンのインサートDNAを適当なベクターに
組み込むことにより、その遺伝子中にコードされている
蛋白質を発現することが可能であり、発現された蛋白質
は抗体を作る場合の抗原、ワクチンの原料等に利用する
ことも可能であり、蛋白質の発現には種々の方法、例え
ば、兎赤血球ライセイト等を用いたin vitro合成系、大
腸菌や枯草菌等の微生物を用いた系、酵母、昆虫、哺乳
動物等の細胞を用いた系等が種々の遺伝子にコードされ
ているタンパク質の発現に利用できる。
発現する場合； p4AFクローンは、Ｆ蛋白遺伝子のほぼ全領域及びＦ蛋
白のコードされる遺伝子領域を全て含んでいることか
ら、p4AFクローンのインサートDNAを適当なベクターに
組み込むことにより、その遺伝子中にコードされている
蛋白質を発現することが可能であり、発現された蛋白質
は抗体を作る場合の抗原、ワクチンの原料等に利用する
ことも可能であり、蛋白質の発現には種々の方法、例え
ば、兎赤血球ライセイト等を用いたin vitro合成系、大
腸菌や枯草菌等の微生物を用いた系、酵母、昆虫、哺乳
動物等の細胞を用いた系等が種々の遺伝子にコードされ
ているタンパク質の発現に利用できる。
p4AFクローンのインサートDNA中の開始コドン（ATG;
前記［式］の78番から80番）が、発現ベクター pKK233
−３（ファルマシア株式会社製）のリボゾーム結合部位
から数えて10から15塩基対の位置にくるようにする。す
なわち、前記［式］で表される塩基配列の０番から77番
までを除去したデレーションインサートDNAを作製し、p
KK 223−３ベクターのSma I部位に導入し、得られたク
ローンをE.coliJM109に導入し、アンピシリンを100μg/
ml含むYT培養液（バクトトリプトン16g、イーストイク
ストラクト10g、塩化ナトリウム5gを蒸留水に溶かし1l
とする）中で37℃で12時間振とう培養する。次にイソプ
ロピルチオガラクトシドを2mMとなるように加え、37℃
で５時間さらに振とう培養を行う。培養終了後、培養液
を10000rpm、10分間、15℃で遠心し、その沈澱物を得
る。次に、沈澱物を30mM 塩化ナトリウムを含む30mM Tr
is−塩酸緩衝液（pH7.5）で洗浄した後、上記緩衝液に
懸濁し、懸濁液1ml当りリゾチーム1mg及び0.25M EDTA25
μｌを加えて15分間室温に放置した後、凍結融解を４回
行う。次にこの融解液を10000rpm、60分間、４℃で遠心
してその上澄みを得、得られた上澄み液中の目的タンパ
ク質の同定を、駒田らの方法（J.gen Virol、1989年、
第70巻、第3487−3492頁）及び伊藤らの方法（Archives
of Virology、1987年、第95巻、第211−224頁）等で行
い。抗PIV−4A抗体を用いた免疫沈降操作の後、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により分析し、大腸菌中に
Ｆ蛋白が発現されていることが確認できた。
前記［式］の78番から80番）が、発現ベクター pKK233
−３（ファルマシア株式会社製）のリボゾーム結合部位
から数えて10から15塩基対の位置にくるようにする。す
なわち、前記［式］で表される塩基配列の０番から77番
までを除去したデレーションインサートDNAを作製し、p
KK 223−３ベクターのSma I部位に導入し、得られたク
ローンをE.coliJM109に導入し、アンピシリンを100μg/
ml含むYT培養液（バクトトリプトン16g、イーストイク
ストラクト10g、塩化ナトリウム5gを蒸留水に溶かし1l
とする）中で37℃で12時間振とう培養する。次にイソプ
ロピルチオガラクトシドを2mMとなるように加え、37℃
で５時間さらに振とう培養を行う。培養終了後、培養液
を10000rpm、10分間、15℃で遠心し、その沈澱物を得
る。次に、沈澱物を30mM 塩化ナトリウムを含む30mM Tr
is−塩酸緩衝液（pH7.5）で洗浄した後、上記緩衝液に
懸濁し、懸濁液1ml当りリゾチーム1mg及び0.25M EDTA25
μｌを加えて15分間室温に放置した後、凍結融解を４回
行う。次にこの融解液を10000rpm、60分間、４℃で遠心
してその上澄みを得、得られた上澄み液中の目的タンパ
ク質の同定を、駒田らの方法（J.gen Virol、1989年、
第70巻、第3487−3492頁）及び伊藤らの方法（Archives
of Virology、1987年、第95巻、第211−224頁）等で行
い。抗PIV−4A抗体を用いた免疫沈降操作の後、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により分析し、大腸菌中に
Ｆ蛋白が発現されていることが確認できた。
本発明によって供給される、前記［式］で表される遺
伝子は、PIV−4A・Ｆ蛋白の遺伝子RNAに特異的に相補性
を示すので、PIV−4A感染症の早期診断の検査薬として
用いることができ、さらに前記［式］で表される遺伝子
は、PIV−4A・Ｆ蛋白の全コード領域を含むので、発現
されたNP蛋白を抗体作成の抗原として、またワクチンの
原料等として用いることが可能であるから、PIV−4A感
染症の検査及び治療の両方に同時に応用できる点できわ
めて有用である。
伝子は、PIV−4A・Ｆ蛋白の遺伝子RNAに特異的に相補性
を示すので、PIV−4A感染症の早期診断の検査薬として
用いることができ、さらに前記［式］で表される遺伝子
は、PIV−4A・Ｆ蛋白の全コード領域を含むので、発現
されたNP蛋白を抗体作成の抗原として、またワクチンの
原料等として用いることが可能であるから、PIV−4A感
染症の検査及び治療の両方に同時に応用できる点できわ
めて有用である。
第１図は、上記［式］で表されるPIV−4A遺伝子に相補
性を示すDNA（p4AF）のcDNA領域の制限酵素地図であ
る。 １及び３……ベクターDNA、 ２……インサートDNA、
性を示すDNA（p4AF）のcDNA領域の制限酵素地図であ
る。 １及び３……ベクターDNA、 ２……インサートDNA、
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (72)発明者 駒田 洋 三重県津市西古河町25―29 (72)発明者 鶴留 雅人 三重県津市渋見町763―35―７ (72)発明者 西尾 真智子 三重県伊勢市古市町168―５
Claims (5)
- 【請求項１】ヒトパラインフルエンザ4A型ウイルスフュ
ージョンプロテインをコードする下記の塩基配列を含ん
でなるヌクレオチド、または該配列に含まれる連続した
20塩基以上の塩基配列を有するヌクレオチドであって、
ヒトパラインフルエンザ4A型ウイルスフュージョンプロ
テインをコードするヌクレオチドのみに特異的にハイブ
リダイズするヌクレオチド。 - 【請求項２】請求項１に記載のヌクレオチドを含んでな
る、ヒトパラインフルエンザ4A型ウイルスのRNAの存在
不存在を検出するための診断薬組成物。 - 【請求項３】請求項１に記載のヌクレオチドを含んでな
る、発現ベクター。 - 【請求項４】請求項４に記載の発現ベクターによって形
質転換された原核生物または真核生物細胞宿主。 - 【請求項５】下記の塩基配列によってコードされる、ヒ
トパラインフルエンザ4A型ウイルスフュージョンプロテ
イン。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2325171A JP2649285B2 (ja) | 1990-11-29 | 1990-11-29 | ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルスフュージョンプロテイン遺伝子及び該遺伝子を含む物質 |
| EP19910919288 EP0513371A4 (en) | 1990-11-29 | 1991-10-15 | Human parainfluenza virus type 4a fusion protein and gene which codes for the same |
| PCT/JP1991/001402 WO1992009693A1 (en) | 1990-11-29 | 1991-10-15 | Human parainfluenza virus type 4a fusion protein and gene which codes for the same |
| US08/321,587 US5554526A (en) | 1990-11-29 | 1994-10-11 | Human parainfluenza virus type 4A fusion protein and gene coding for the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2325171A JP2649285B2 (ja) | 1990-11-29 | 1990-11-29 | ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルスフュージョンプロテイン遺伝子及び該遺伝子を含む物質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04197183A JPH04197183A (ja) | 1992-07-16 |
| JP2649285B2 true JP2649285B2 (ja) | 1997-09-03 |
Family
ID=18173805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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