JP2648855B2 - ペプチド、その抗体およびエンドセリンの定量 - Google Patents
ペプチド、その抗体およびエンドセリンの定量Info
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/57536—Endothelin, vasoactive intestinal contractor [VIC]
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規ペプチド、それに対する抗体ならびに
エンドセリン（Endothelin）やその類縁体の免疫学的定
量用キットに関するものであり、特に臨床診断の分野に
おいて有用である。
エンドセリン（Endothelin）やその類縁体の免疫学的定
量用キットに関するものであり、特に臨床診断の分野に
おいて有用である。
従来技術と解決課題 本発明の発明者の一人である眞崎らは、ヒト上皮細胞
培養上清中に見い出される血管収縮性ペプチドを単離精
製し、これをエンドセリンと名付けた［血管第11巻１号
BS2頁1988年］。その後、眞崎らは、エンドセリンが次
式で表される構造をとる、との新たな知見を得た。
培養上清中に見い出される血管収縮性ペプチドを単離精
製し、これをエンドセリンと名付けた［血管第11巻１号
BS2頁1988年］。その後、眞崎らは、エンドセリンが次
式で表される構造をとる、との新たな知見を得た。
エンドセリンは循環系調節に関与する内因性因子であ
ると予想され、その体内動態は本態性高血圧症などの病
態生理の一端を担うと考えられる。また、エンドセリン
のこのような生理活性の発現には、そのＮ末端から中央
部にかけての環状部分、ならびにＣ末端付近の疎水性部
位の全部が必要と考えられる。
ると予想され、その体内動態は本態性高血圧症などの病
態生理の一端を担うと考えられる。また、エンドセリン
のこのような生理活性の発現には、そのＮ末端から中央
部にかけての環状部分、ならびにＣ末端付近の疎水性部
位の全部が必要と考えられる。
生体体液中のエンドセリンの量が追跡できれば、この
ような病変の診断が可能と考えられる。しかし、エンド
セリンの定量についての報告はない。そこで本発明者ら
は、エンドセリンおよびその類縁体を製造し、これに対
する抗体を創製し、この抗体を利用したエンドセリンま
たはその類縁体の定量法を確立して本発明を完成した。
ような病変の診断が可能と考えられる。しかし、エンド
セリンの定量についての報告はない。そこで本発明者ら
は、エンドセリンおよびその類縁体を製造し、これに対
する抗体を創製し、この抗体を利用したエンドセリンま
たはその類縁体の定量法を確立して本発明を完成した。
課題を解決するための手段 本発明は、次式（１−１） Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp （１−１） または次式（２−１） Cys−Ser−Ser−Leu−Met−Asp−Lys−Glu （２−１） で表されるペプチドまたはそれらの塩に関する。
これらのペプチドは、エンドセリンまたはその類縁体
を認識する抗体を調整するためのハプテンなどとして有
用である。
を認識する抗体を調整するためのハプテンなどとして有
用である。
なお、本明細書において用いられる記号は、次のアミ
ノ酸残基を意味する。
ノ酸残基を意味する。
Cys:システイン Ser:セリン Leu:ロイシン Met:メチオニン Asp:アスパラギン酸 Lys:リシン Glu:グルタミン酸 Val:バリン Tyr:チロシン Phe:フェニルアラニン His:ヒスチジン Ile:イソロイシン Trp:トリプトファン 式（１−１）または（２−１）で表されるペプチドお
よびそれらの塩は、アミノ酸を１個ずつ縮合せしめる方
法、複数のアミノ酸からなる縮合物同士を縮合せしめる
方法、またはこれらを組み合わせた方法により製造でき
る。このような縮合は、例えばアジド法、混合酸無水物
法、ジシクロヘキシルカルボジイミド法、活性エステル
法などの常法により、液相や固相において、好ましくは
固相において行える。固相法は、反応に関与せしめる必
要のない官能基を保護したアミノ酸と、パム（pam）樹
脂の如き不溶性担体とを、アミノ酸のカルボキシル基を
通じて結合させ、保護基を脱離し、これに反応に関与せ
しめる必要のない官能基を保護したアミノ酸をカップル
させ、所望のペプチド鎖になるまでこの操作を繰り返
し、次いでフッ化水素処理などにより不溶性担体との結
合を切断し、保護基が残存するときはこれを脱離して目
的とするペプチドを得る方法である。通常、フッ化水素
処理により大部分の保護基が脱離されるので、大抵は保
護基脱離操作を独立して行う必要がない。
よびそれらの塩は、アミノ酸を１個ずつ縮合せしめる方
法、複数のアミノ酸からなる縮合物同士を縮合せしめる
方法、またはこれらを組み合わせた方法により製造でき
る。このような縮合は、例えばアジド法、混合酸無水物
法、ジシクロヘキシルカルボジイミド法、活性エステル
法などの常法により、液相や固相において、好ましくは
固相において行える。固相法は、反応に関与せしめる必
要のない官能基を保護したアミノ酸と、パム（pam）樹
脂の如き不溶性担体とを、アミノ酸のカルボキシル基を
通じて結合させ、保護基を脱離し、これに反応に関与せ
しめる必要のない官能基を保護したアミノ酸をカップル
させ、所望のペプチド鎖になるまでこの操作を繰り返
し、次いでフッ化水素処理などにより不溶性担体との結
合を切断し、保護基が残存するときはこれを脱離して目
的とするペプチドを得る方法である。通常、フッ化水素
処理により大部分の保護基が脱離されるので、大抵は保
護基脱離操作を独立して行う必要がない。
反応に関与せしめる必要のない官能基としては、アミ
ノ基、水酸基、カルボキシル基、SH基、インドールやイ
ミダゾール環におけるNH基などがある。これらの基
は、通常保護基で保護される。アミノ保護基としてはBo
cと略称されるｔ−ブチルオキシカルボニルや、ClZと略
称される２−クロルベンジルオキシカルボニルなどが、
水酸基保護基としてはBzlと略称されるベンジルや、BrZ
と略称されるＰ−ブロムベンジルオキシカルボニルなど
が、カルボキシル保護基としてはOcHexと略称されるシ
クロヘキシルエステルが、SH保護基としてはAcmと略称
されるアセタミドメチルや４−MeBzlと略称される４−
メチルベンジルなどが、更にはインドール環やイミダゾ
ール環におけるNH保護基としてはForと略称されるホ
ルミルや、Tosと略称させるｐ−トルエンスルホニルな
どが、保護基の例として挙げられる。
ノ基、水酸基、カルボキシル基、SH基、インドールやイ
ミダゾール環におけるNH基などがある。これらの基
は、通常保護基で保護される。アミノ保護基としてはBo
cと略称されるｔ−ブチルオキシカルボニルや、ClZと略
称される２−クロルベンジルオキシカルボニルなどが、
水酸基保護基としてはBzlと略称されるベンジルや、BrZ
と略称されるＰ−ブロムベンジルオキシカルボニルなど
が、カルボキシル保護基としてはOcHexと略称されるシ
クロヘキシルエステルが、SH保護基としてはAcmと略称
されるアセタミドメチルや４−MeBzlと略称される４−
メチルベンジルなどが、更にはインドール環やイミダゾ
ール環におけるNH保護基としてはForと略称されるホ
ルミルや、Tosと略称させるｐ−トルエンスルホニルな
どが、保護基の例として挙げられる。
なお、エンドセリンは後記実施例１の記載に従って製
造することができる。そこには、エンドセリンの特定部
位おける２組の−SS−結合の形成方法についても言及さ
れている。
造することができる。そこには、エンドセリンの特定部
位おける２組の−SS−結合の形成方法についても言及さ
れている。
本発明は、また、前記ペプチド（１−１）または（２
−１）に対する抗体に関する。本発明の抗体は、ペプチ
ド（１−１）または（２−１）のみならず、これらのペ
プチド残基をその分子の構成成分として含むペプチドを
も認識する。このような本発明の抗体が認識するペプチ
ドとしては、エンドセリンや、構成アミノ酸数がエンド
セリンより多いもの若しくは少ないもの、エンドセリン
の構成アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものなどが
挙げられる。本明細書では、本発明の抗体が認識するこ
れらのペプチドを、前記ペプチド（１−１）および（２
−１）を含めて、「エンドセリンまたはその類縁体」と
総称する。
−１）に対する抗体に関する。本発明の抗体は、ペプチ
ド（１−１）または（２−１）のみならず、これらのペ
プチド残基をその分子の構成成分として含むペプチドを
も認識する。このような本発明の抗体が認識するペプチ
ドとしては、エンドセリンや、構成アミノ酸数がエンド
セリンより多いもの若しくは少ないもの、エンドセリン
の構成アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものなどが
挙げられる。本明細書では、本発明の抗体が認識するこ
れらのペプチドを、前記ペプチド（１−１）および（２
−１）を含めて、「エンドセリンまたはその類縁体」と
総称する。
本発明の抗体は、式（１−１）または（２−１）で表
されるペプチドと免疫原性タンパクとの結合物（ハプテ
ン抗原）を、適当なアジュバントとともにウサギにモル
モット、山羊、羊などの動物に非経口投与（免疫）し、
その血清を採取し、公知の処理をなすことによって容易
に得られる。ここにおける免疫原性タンパクとしてはア
ルブミン、グロブリン、サイログロブリン、貝ヘモシア
ニン、エデスチンなどが挙げられる。これらの免疫原性
タンパクと式（１−１）または（２−１）で表されるペ
プチドとの結合は、結合剤を用いる常法に従って行え
る。結合剤としては、ペプチド（１−１）若しくは（２
−１）のアミノ基と免疫原性タンパクのアミノ基の間を
化学的に結合するグルタルアルデヒド、トルエンジイソ
シアネート、ジハロゲン化ジニトロベンゼン、またはペ
プチド（１−１）若しくは（２−１）のSH基と免疫原性
タンパクのアミノ基とを架橋する例えば特公昭58−8395
号明細書に記載のｍ−MBSと略称されるマレイミド誘導
体、更に、ペプチドのアミノ基若しくはカルボキシル基
と免疫原性タンパクのカルボキシル基若しくはアミノ基
との間を結合する水溶性カルボジイミドの如きカルボジ
イミド誘導体などが挙げられる。SH基が存在しない免疫
原性タンパクは、特開昭57−142967号明細書に開示され
ている、例えばＮ−（アセチルメルカプトアセトキシ）
サクシンイミドを用いて、SH基を導入してから結合に供
することができる。かくして得られるペプチド（１−
１）または（２−１）と免疫原性タンパクとの結合物で
動物を十分免疫することにより、所望の抗体が得られ
る。モノクローナル抗体は、このように免疫された動物
の抗体産生細胞を脾臓より採取し、以下常法に従って、
ミエローマ細胞との融合、クローン性細胞のスクリーニ
ングなどの操作を経て創製できる。
されるペプチドと免疫原性タンパクとの結合物（ハプテ
ン抗原）を、適当なアジュバントとともにウサギにモル
モット、山羊、羊などの動物に非経口投与（免疫）し、
その血清を採取し、公知の処理をなすことによって容易
に得られる。ここにおける免疫原性タンパクとしてはア
ルブミン、グロブリン、サイログロブリン、貝ヘモシア
ニン、エデスチンなどが挙げられる。これらの免疫原性
タンパクと式（１−１）または（２−１）で表されるペ
プチドとの結合は、結合剤を用いる常法に従って行え
る。結合剤としては、ペプチド（１−１）若しくは（２
−１）のアミノ基と免疫原性タンパクのアミノ基の間を
化学的に結合するグルタルアルデヒド、トルエンジイソ
シアネート、ジハロゲン化ジニトロベンゼン、またはペ
プチド（１−１）若しくは（２−１）のSH基と免疫原性
タンパクのアミノ基とを架橋する例えば特公昭58−8395
号明細書に記載のｍ−MBSと略称されるマレイミド誘導
体、更に、ペプチドのアミノ基若しくはカルボキシル基
と免疫原性タンパクのカルボキシル基若しくはアミノ基
との間を結合する水溶性カルボジイミドの如きカルボジ
イミド誘導体などが挙げられる。SH基が存在しない免疫
原性タンパクは、特開昭57−142967号明細書に開示され
ている、例えばＮ−（アセチルメルカプトアセトキシ）
サクシンイミドを用いて、SH基を導入してから結合に供
することができる。かくして得られるペプチド（１−
１）または（２−１）と免疫原性タンパクとの結合物で
動物を十分免疫することにより、所望の抗体が得られ
る。モノクローナル抗体は、このように免疫された動物
の抗体産生細胞を脾臓より採取し、以下常法に従って、
ミエローマ細胞との融合、クローン性細胞のスクリーニ
ングなどの操作を経て創製できる。
本発明は、また、上記の抗体を用いるエンドセリンま
たはその類縁体の免疫学的定量用キットに関する。エン
ドセリンまたはその類縁体の定量は、少なくとも次の試
薬 （ａ）標識物で標識されたエンドセリンまたはその類縁
体、 （ｂ）式（１−１）または（２−１）で表されるペプチ
ドに対する抗体そのものまたはその不溶化物、 （ｃ）試薬（ｂ）が抗体そのものであるときは、これと
試薬（ａ）とを反応させたときの反応物と残余とを分離
するための試薬 から構成されるキットを用いることにより容易に実施で
きる。
たはその類縁体の免疫学的定量用キットに関する。エン
ドセリンまたはその類縁体の定量は、少なくとも次の試
薬 （ａ）標識物で標識されたエンドセリンまたはその類縁
体、 （ｂ）式（１−１）または（２−１）で表されるペプチ
ドに対する抗体そのものまたはその不溶化物、 （ｃ）試薬（ｂ）が抗体そのものであるときは、これと
試薬（ａ）とを反応させたときの反応物と残余とを分離
するための試薬 から構成されるキットを用いることにより容易に実施で
きる。
試薬（ａ）は、標識物とエンドセリン若しくはその類
縁体との結合物（標識抗原）であり、先に述べた、ペプ
チド（１−１）または（２−１）と免疫原性タンパクと
の結合の場合と同様にして調製できる。標識物としては
酵素、放射性物質、蛍光物質、スピン化合物などが挙げ
られ、特に酵素が好ましい。酵素としては、β−カラク
トシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リパーゼ、パー
オキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼなどが用いられる。
縁体との結合物（標識抗原）であり、先に述べた、ペプ
チド（１−１）または（２−１）と免疫原性タンパクと
の結合の場合と同様にして調製できる。標識物としては
酵素、放射性物質、蛍光物質、スピン化合物などが挙げ
られ、特に酵素が好ましい。酵素としては、β−カラク
トシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リパーゼ、パー
オキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼなどが用いられる。
試薬（ｂ）は本発明の抗体そのものか、または本発明
の抗体と不溶性担体とを結合させた不溶化抗体である。
不溶性担体と抗体との結合も前記と同様にして行える。
不溶性担体としては本分野で用いられるものであればい
ずれでもよいが、米国特許4,166,767号明細書に開示の
細菌細胞璧片が特に好ましく用いられる。
の抗体と不溶性担体とを結合させた不溶化抗体である。
不溶性担体と抗体との結合も前記と同様にして行える。
不溶性担体としては本分野で用いられるものであればい
ずれでもよいが、米国特許4,166,767号明細書に開示の
細菌細胞璧片が特に好ましく用いられる。
試薬（ｃ）として普通に用いられるのは、試薬（ｂ）
たる抗体に対する抗体（第２抗体）であって不溶化され
たもの（第２不溶化抗体）である。第２抗体は、例えば
ウサギ血清から得られたIgG分画を抗原として、他の動
物、例えばモルモットを免疫することにより調整でき
る。
たる抗体に対する抗体（第２抗体）であって不溶化され
たもの（第２不溶化抗体）である。第２抗体は、例えば
ウサギ血清から得られたIgG分画を抗原として、他の動
物、例えばモルモットを免疫することにより調整でき
る。
このほか、緩衝化剤、標識活性測定用試薬、検量線作
成用標準抗原溶液などの試薬が用いられる。
成用標準抗原溶液などの試薬が用いられる。
これらの試薬を用いてエンドセリンまたはその類縁体
の定量は、 検体と試薬（ａ）および試薬（ｂ）との反応させ、 試薬（ｂ）として不溶化抗体を用いたときは、反応
混液を遠心して、遊離の試薬（ａ）（上清）とその他の
もの（沈殿）とを分離（B/F分離）し、 試薬（ｂ）として本発明の抗体そのものを用いたと
きは、更に試薬（ｃ）を反応させてからB/F分離を行
い、 またはで分離した上清、または沈殿中の標識物
の活性を測定する、 ことにより容易に実施できる。
の定量は、 検体と試薬（ａ）および試薬（ｂ）との反応させ、 試薬（ｂ）として不溶化抗体を用いたときは、反応
混液を遠心して、遊離の試薬（ａ）（上清）とその他の
もの（沈殿）とを分離（B/F分離）し、 試薬（ｂ）として本発明の抗体そのものを用いたと
きは、更に試薬（ｃ）を反応させてからB/F分離を行
い、 またはで分離した上清、または沈殿中の標識物
の活性を測定する、 ことにより容易に実施できる。
具体例 次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
実施例１ ペプチドの製造 １−Ａ エンドセリンの製造 Boc−Trp（For）−OCH2−パム樹脂（0.50mM）を出発
原料とし、アプライド・バイオシステム社のBoc−アミ
ノ酸誘導体カートリッジ（2.0mM）を用い、トリフルオ
ロ酢酸によるBocの脱離後、対称酸無水物法にて順次Ｃ
末端側からペプチド鎖を延長する。但し、Boc−Asp（Oc
Hex）、Boc−Glu（OcHex）、Boc−His（Tos）、Boc−Cy
s（Acm）は（株）ペプチド研究所製の粉末を専用カート
リッジに封入後使用した。このようにして次式で表され
るペプチド−樹脂の結合物を得る。
原料とし、アプライド・バイオシステム社のBoc−アミ
ノ酸誘導体カートリッジ（2.0mM）を用い、トリフルオ
ロ酢酸によるBocの脱離後、対称酸無水物法にて順次Ｃ
末端側からペプチド鎖を延長する。但し、Boc−Asp（Oc
Hex）、Boc−Glu（OcHex）、Boc−His（Tos）、Boc−Cy
s（Acm）は（株）ペプチド研究所製の粉末を専用カート
リッジに封入後使用した。このようにして次式で表され
るペプチド−樹脂の結合物を得る。
Boc−Cys（Acm）−Ser（Bzl）−Cys（４−MeBzl） −Ser（Bzl）−Ser（Bzl）−Leu−Met−Asp （OcHex）−Lys（ClZ）−Glu（OcHex）−Cys （４−MeBzl）−Val−Tyr（BrZ）−Phe−Cys（Acm） −His（Tos）−Leu−Asp（OcHex）−Ile−Ile−Trp （For）−OCH2−樹脂 このペプチド結合樹脂1.0gをｐ−クレゾール3.0mlの
存在下、無水フッ化水素12mlで−２℃、１時間処理しAc
mとFor以外の全保護基を脱離する。フッ化水素を減圧留
去し、残渣にジエチルエーテルを加えて固化させ、これ
を濾取し、エーテル洗浄後、減圧乾燥する。これをトリ
フルオロ酢酸20mlに溶解し、樹脂を濾去し、濃縮する。
残渣にエーテルを加え析出した沈殿を濾取し、エーテル
洗浄後、減圧乾燥し、２個のAcm、２個のSH基、１個のT
rp（For）を有するペプチドを得る。これを0.5mMになる
ように0.1M酢酸アンモニウム（pH7.2）−8M尿素緩衝液
に溶解し、撹拌下、フェリシアン化カリウム水溶液（1.
5当量）を滴下する。40分後、反応混液を200mlのダイア
イオンHP−20のカラムに添加し水で洗浄後、アセトニト
リル／トリフルオロ酢酸／水（75:0.1:1:25）で溶出す
る。パウリ反応陽性分画を減圧濃縮し凍結乾燥してエン
ドセリンの１位と15位のCysのAcmで保護され、その３位
と11位の間でジスルフィド結合をもつペプチドを得る。
これを1N塩酸水（15当量）含有メタノール−水（4:1）
に1.0mMになるように溶解し、0.05Mヨウ素−メタノール
（16当量）を激しく撹拌しながら一度に加える。室温で
１時間反応後、0.05Mアスコルビン酸水溶液（16当量）
を加えて反応を停止する。反応混液を濃縮し、ダイアイ
オンHP−20に吸着させ水で十分洗浄しアセトニトリル／
トリフルオロ酢酸／水（75:0.1:25）で溶出し、エンド
セリンのTrpがForで保護されたものを得る。これを濃縮
し残渣を50mlの水に溶解し、氷冷下、1N水酸化ナトリウ
ム水溶液5mlを加えてForを脱離する。２分後1N塩酸水溶
液5mlで中和し、ウオーターズPrep/LCシステム500およ
びカートリッジカラム（C18、300A）を用いてアセトニ
トリル／トリフルオロ酢酸／水（20:0.1:80）から（45:
0.1:55）の濃度直線勾配法により精製し、エンドセリン
30mgを得る。
存在下、無水フッ化水素12mlで−２℃、１時間処理しAc
mとFor以外の全保護基を脱離する。フッ化水素を減圧留
去し、残渣にジエチルエーテルを加えて固化させ、これ
を濾取し、エーテル洗浄後、減圧乾燥する。これをトリ
フルオロ酢酸20mlに溶解し、樹脂を濾去し、濃縮する。
残渣にエーテルを加え析出した沈殿を濾取し、エーテル
洗浄後、減圧乾燥し、２個のAcm、２個のSH基、１個のT
rp（For）を有するペプチドを得る。これを0.5mMになる
ように0.1M酢酸アンモニウム（pH7.2）−8M尿素緩衝液
に溶解し、撹拌下、フェリシアン化カリウム水溶液（1.
5当量）を滴下する。40分後、反応混液を200mlのダイア
イオンHP−20のカラムに添加し水で洗浄後、アセトニト
リル／トリフルオロ酢酸／水（75:0.1:1:25）で溶出す
る。パウリ反応陽性分画を減圧濃縮し凍結乾燥してエン
ドセリンの１位と15位のCysのAcmで保護され、その３位
と11位の間でジスルフィド結合をもつペプチドを得る。
これを1N塩酸水（15当量）含有メタノール−水（4:1）
に1.0mMになるように溶解し、0.05Mヨウ素−メタノール
（16当量）を激しく撹拌しながら一度に加える。室温で
１時間反応後、0.05Mアスコルビン酸水溶液（16当量）
を加えて反応を停止する。反応混液を濃縮し、ダイアイ
オンHP−20に吸着させ水で十分洗浄しアセトニトリル／
トリフルオロ酢酸／水（75:0.1:25）で溶出し、エンド
セリンのTrpがForで保護されたものを得る。これを濃縮
し残渣を50mlの水に溶解し、氷冷下、1N水酸化ナトリウ
ム水溶液5mlを加えてForを脱離する。２分後1N塩酸水溶
液5mlで中和し、ウオーターズPrep/LCシステム500およ
びカートリッジカラム（C18、300A）を用いてアセトニ
トリル／トリフルオロ酢酸／水（20:0.1:80）から（45:
0.1:55）の濃度直線勾配法により精製し、エンドセリン
30mgを得る。
本品は、10〜60％アセトニトリル−0.1％トリフルオ
ロ酢酸を溶出液とする高速液体クロマトグラフィ（グラ
ジエント）に付した場合、18.0分に溶出する。また、30
％アセトニトリル−0.1％トリフルオロ酢酸によるイソ
クラチックな溶出では16.8分に溶出し、この溶出位置は
ヒトのエンドセリンと完全に一致するとともにラットの
肺動脈標本を用いる収縮活性もヒトエンドセリンと同等
であった。6N塩酸で100℃22時間加水分解後のアミノ酸
分析値は次のとおりである。（カッコ内は理論値） Trp0.28（１）、Lys0.97（１）、His1.01（１）、Asp2.
00（２）、Ser2.55（３）、Glu1.04（１）、1/2（Cys）
２ 1.92（４）、Val0.93（１）、Met0.86（１）、Ile0.98
（２）、Leu1.92（２）、Tyr0.97（１）、Phe1.00
（１） １−Ｂ エンドセリンの異性体の製造 １−Ａに準じて、２個のジスルフィドの結合の位置の
みがエンドセリンと異なるペプチドを得る。
ロ酢酸を溶出液とする高速液体クロマトグラフィ（グラ
ジエント）に付した場合、18.0分に溶出する。また、30
％アセトニトリル−0.1％トリフルオロ酢酸によるイソ
クラチックな溶出では16.8分に溶出し、この溶出位置は
ヒトのエンドセリンと完全に一致するとともにラットの
肺動脈標本を用いる収縮活性もヒトエンドセリンと同等
であった。6N塩酸で100℃22時間加水分解後のアミノ酸
分析値は次のとおりである。（カッコ内は理論値） Trp0.28（１）、Lys0.97（１）、His1.01（１）、Asp2.
00（２）、Ser2.55（３）、Glu1.04（１）、1/2（Cys）
２ 1.92（４）、Val0.93（１）、Met0.86（１）、Ile0.98
（２）、Leu1.92（２）、Tyr0.97（１）、Phe1.00
（１） １−Ｂ エンドセリンの異性体の製造 １−Ａに準じて、２個のジスルフィドの結合の位置の
みがエンドセリンと異なるペプチドを得る。
このペプチドは、10〜60％アセトニトリル−0.1％ト
リフルオロ酢酸を溶出液とする高速液体クロマトグラフ
ィ（グラジエント）に付した場合エンドセリンと同じ位
置（18分）に溶出されるが、30％アセトニトリル−0.1
％トリフルオロ酢酸のイソクラチック条件による溶出で
は15.4分に溶出され、この溶出位置は１−Ａで得たヒト
エンドセリンと一致せず、またその生理活性はヒトエン
ドセリンの10分の１以下であった。
リフルオロ酢酸を溶出液とする高速液体クロマトグラフ
ィ（グラジエント）に付した場合エンドセリンと同じ位
置（18分）に溶出されるが、30％アセトニトリル−0.1
％トリフルオロ酢酸のイソクラチック条件による溶出で
は15.4分に溶出され、この溶出位置は１−Ａで得たヒト
エンドセリンと一致せず、またその生理活性はヒトエン
ドセリンの10分の１以下であった。
１−Ｃ ペプチド（１−１）または（２−１）の製造 １−Ａと同様にして次のペプチドを得る。これらのペ
プチドのアミノ酸分析は理論値と一致した。
プチドのアミノ酸分析は理論値と一致した。
なお、下記において、Cys（SH）はSH基を有するCysを
意味し、また、Acmを付したCysのSH基は保護されてい
る。
意味し、また、Acmを付したCysのSH基は保護されてい
る。
Cys（SH）−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp （１−１） Tyr−Phe−Cys（SH）−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp
（１−２） Clu−Cys（SH）−Val−Tyr−Phe−Cys （Acm）−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp （１−３） Met−Asp−Lys−Glu−Cys（SH）−Val−Tyr−Phe−Cys （Acm）−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp （１−４） Cys（SH）−Ser−Ser−Leu−Met−Asp−Lys−Glu−Cys （Acm）−Val−Tyr−Phe−Cys（Acm）−His−Leu −Asp−Ile−Ile−Trp （１−５） Cys（SH）−Ser−Ser−Leu−Met−Asp−Lys−Glu（２−
１） 実施例２ ハプテン抗原の調製 ２−Ａ ブタサイログロブリン7.8mgと実施例１で製造したエ
ンドセリン3.0mgを0.1Mリン酸緩衝液（pH7）1mlに溶解
する。この混液に撹拌しながら１％グルタルアルデヒド
水溶液250μを加え、室温で２時間撹拌する。この反
応混液を0.9％NaClの２に対して４℃48時間透析した
後、透析内液の全量を0.9％NaClで10mlに希釈懸濁し、1
mlずつに小分けし、凍結保存する。
（１−２） Clu−Cys（SH）−Val−Tyr−Phe−Cys （Acm）−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp （１−３） Met−Asp−Lys−Glu−Cys（SH）−Val−Tyr−Phe−Cys （Acm）−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp （１−４） Cys（SH）−Ser−Ser−Leu−Met−Asp−Lys−Glu−Cys （Acm）−Val−Tyr−Phe−Cys（Acm）−His−Leu −Asp−Ile−Ile−Trp （１−５） Cys（SH）−Ser−Ser−Leu−Met−Asp−Lys−Glu（２−
１） 実施例２ ハプテン抗原の調製 ２−Ａ ブタサイログロブリン7.8mgと実施例１で製造したエ
ンドセリン3.0mgを0.1Mリン酸緩衝液（pH7）1mlに溶解
する。この混液に撹拌しながら１％グルタルアルデヒド
水溶液250μを加え、室温で２時間撹拌する。この反
応混液を0.9％NaClの２に対して４℃48時間透析した
後、透析内液の全量を0.9％NaClで10mlに希釈懸濁し、1
mlずつに小分けし、凍結保存する。
２−Ｂ エンドセリン2.0mgとブタサイログロブリン6.7mgとを
1mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH7）に溶解し、４℃で冷却し
ながら水溶性カルボジイミド塩酸塩30mgを加える。10℃
で一夜反応させた後に反応混液を４℃で0.9％NaClに対
して透析し、透析内液の全量を0.9％NaClで10mlに希釈
懸濁し、その1mlずつを小分けし、凍結保存する。
1mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH7）に溶解し、４℃で冷却し
ながら水溶性カルボジイミド塩酸塩30mgを加える。10℃
で一夜反応させた後に反応混液を４℃で0.9％NaClに対
して透析し、透析内液の全量を0.9％NaClで10mlに希釈
懸濁し、その1mlずつを小分けし、凍結保存する。
２−Ｃ BSA（ウシ血清アルブミン）14mgを1mlの0.1Mリン酸緩
衝液（pH7）に溶解し、撹拌下で冷却しながらｍ−MBSの
テトラヒドロフラン溶液（11.6mg/0.5ml）を加えて、室
温で２時間反応させる。反応混液をエーテルで洗浄し、
過剰のｍ−MBSを除去する。水溶液層部分を凍結乾燥
し、これを2mlの純水に溶解し、実施例１−Ｃで得た11.
5mgのペプチド（２−１）を加え、一夜10℃で反応さ
せ、次いで反応混液を純水で十分透析し、凍結乾燥して
ペプチド（２−１）とBSAとの結合物19.0mgを得る 同様にしてペプチド（１−１）とBSAとの結合物を調
製する。
衝液（pH7）に溶解し、撹拌下で冷却しながらｍ−MBSの
テトラヒドロフラン溶液（11.6mg/0.5ml）を加えて、室
温で２時間反応させる。反応混液をエーテルで洗浄し、
過剰のｍ−MBSを除去する。水溶液層部分を凍結乾燥
し、これを2mlの純水に溶解し、実施例１−Ｃで得た11.
5mgのペプチド（２−１）を加え、一夜10℃で反応さ
せ、次いで反応混液を純水で十分透析し、凍結乾燥して
ペプチド（２−１）とBSAとの結合物19.0mgを得る 同様にしてペプチド（１−１）とBSAとの結合物を調
製する。
実施例３ 抗体の調製 ３−Ａ 抗エンドセリン抗体 実施例２−Ａで製造したエンドセリン−ブタサイログ
ロブリン結合物を0.9％NaCl溶液に１％濃度になるよう
に溶解し、等量のフロインド完全アジュバントを加えて
W/O型エマルジョンをつくり、ウサギの足蹠２カ所、背
部皮下８カ所に0.1mlずつ注射する。２週間後に背部皮
下５カ所に0.1mlずつ注射する。以後同様な追加免疫を
２週間毎に６回行う。最終免疫後、10日目に頚動脈より
全血を採取する。この血清5mlに等量の0.1Mリン酸緩衝
液（pH7）を加え、氷冷下、飽和硫安溶液10mlを加え、2
0分間撹拌する。これを遠心（12000×ｇ、10分間）し、
沈殿を分離する。この沈殿を同リン酸緩衝液5mlに溶解
し等量の飽和硫安を加え、同様にして沈殿を遠心分離す
る。沈殿を5mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH7）に溶解し0.9
％NaCl含有0.02Mリン酸緩衝液（pH7）の２に対して４
℃24時間透析し、抗体含有溶液を得る。
ロブリン結合物を0.9％NaCl溶液に１％濃度になるよう
に溶解し、等量のフロインド完全アジュバントを加えて
W/O型エマルジョンをつくり、ウサギの足蹠２カ所、背
部皮下８カ所に0.1mlずつ注射する。２週間後に背部皮
下５カ所に0.1mlずつ注射する。以後同様な追加免疫を
２週間毎に６回行う。最終免疫後、10日目に頚動脈より
全血を採取する。この血清5mlに等量の0.1Mリン酸緩衝
液（pH7）を加え、氷冷下、飽和硫安溶液10mlを加え、2
0分間撹拌する。これを遠心（12000×ｇ、10分間）し、
沈殿を分離する。この沈殿を同リン酸緩衝液5mlに溶解
し等量の飽和硫安を加え、同様にして沈殿を遠心分離す
る。沈殿を5mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH7）に溶解し0.9
％NaCl含有0.02Mリン酸緩衝液（pH7）の２に対して４
℃24時間透析し、抗体含有溶液を得る。
３−Ｂ ペプチド（１−１）または（２−１）に対する
抗体 実施例２−Ｃの結合物を用いるほかは３−Ａと同様に
して、それぞれの抗体を得る。
抗体 実施例２−Ｃの結合物を用いるほかは３−Ａと同様に
して、それぞれの抗体を得る。
実施例４ 不溶化第２抗体の調製 ラクトバチルス プランタルムATCC 8014の細菌細胞
壁片（以下、LP細胞壁片という）40mgを精製水に1mlに
懸濁させ、十分に均一化した後に1mgの抗ウサギIgGモル
モット抗体を加え、撹拌下、15μの1M酢酸ナトリウム
緩衝液（pH4）、５％水溶性カルボジイミド水溶液30μ
および25％グルタルアルデヒド15μを順次加え、室
温で１時間撹拌する。反応混液を遠心（1500×ｇ、10分
間）して上清を捨て、沈殿に5mlの緩衝液Ａ（0.1％BSA
−0.1％NaN3−0.9％NaCl−0.04Mリン酸緩衝液、pH7）を
加えて遠心洗浄する。これを５回くりかえし、LP細胞壁
片0.5％を含有する2000mlの緩衝液Ａに懸濁する。
壁片（以下、LP細胞壁片という）40mgを精製水に1mlに
懸濁させ、十分に均一化した後に1mgの抗ウサギIgGモル
モット抗体を加え、撹拌下、15μの1M酢酸ナトリウム
緩衝液（pH4）、５％水溶性カルボジイミド水溶液30μ
および25％グルタルアルデヒド15μを順次加え、室
温で１時間撹拌する。反応混液を遠心（1500×ｇ、10分
間）して上清を捨て、沈殿に5mlの緩衝液Ａ（0.1％BSA
−0.1％NaN3−0.9％NaCl−0.04Mリン酸緩衝液、pH7）を
加えて遠心洗浄する。これを５回くりかえし、LP細胞壁
片0.5％を含有する2000mlの緩衝液Ａに懸濁する。
実施例５ 酸素標識抗原の調製 （Ａ−１） エンドセリンとｍ−MBSとの結合 100μｇのエンドセリンを含む1mlの0.1Mリン酸緩衝液
（pH7）にｍ−MBS100μｇ含有ジメチルホルムアミド溶
液100μを加え、室温で30分間撹拌する（Ｉ液）。
（pH7）にｍ−MBS100μｇ含有ジメチルホルムアミド溶
液100μを加え、室温で30分間撹拌する（Ｉ液）。
（Ａ−２） 結合 一方、500μｇのβ−ガラクトシダーゼ（以下、β−G
alと略す。ベーリンガーマンハイム社、大腸菌由来）を
含む400μの0.1Mリン酸緩衝液（pH7）と飽和硫安溶液
400μの混液を調製し、これを上記Ｉ液と混合撹拌
し、室温で１時間撹拌する（II液）。
alと略す。ベーリンガーマンハイム社、大腸菌由来）を
含む400μの0.1Mリン酸緩衝液（pH7）と飽和硫安溶液
400μの混液を調製し、これを上記Ｉ液と混合撹拌
し、室温で１時間撹拌する（II液）。
緩衝液Ａで十分洗浄したセファローズ6B（ファルマシ
ア社、2.7×40cm）に上記II液を流し、緩衝液Ａで溶出
し、4mlずつ分画し、No.13〜15の分画をプールしたもの
を緩衝液Ａで希釈して酵素標識抗原とする。
ア社、2.7×40cm）に上記II液を流し、緩衝液Ａで溶出
し、4mlずつ分画し、No.13〜15の分画をプールしたもの
を緩衝液Ａで希釈して酵素標識抗原とする。
（Ｂ） 5mgのβ−Gal含有0.02Mリン酸緩衝液（pH7）の10mlに
マレイミド500μｇを含む水1mlを加え、室温で１時間撹
拌した後、同緩衝液5mlで２回透析する。その内液3mlに
ｍ−MBS100μｇ含有ジメチルスルホキシド溶液250μ
を加え、室温で２時間撹拌する。これに実施例１−Ｃで
得たペプチド（２−１）の100μｇを含む水溶液250μ
を加え、さらに２時間撹拌し、反応混液をセファローズ
6Bカラム（1.6×920cm）にかけて緩衝液Ａで溶出し、4m
lずつ分画しβ−Gal−ペプチド（２−１）を含む分画24
mlを得る。
マレイミド500μｇを含む水1mlを加え、室温で１時間撹
拌した後、同緩衝液5mlで２回透析する。その内液3mlに
ｍ−MBS100μｇ含有ジメチルスルホキシド溶液250μ
を加え、室温で２時間撹拌する。これに実施例１−Ｃで
得たペプチド（２−１）の100μｇを含む水溶液250μ
を加え、さらに２時間撹拌し、反応混液をセファローズ
6Bカラム（1.6×920cm）にかけて緩衝液Ａで溶出し、4m
lずつ分画しβ−Gal−ペプチド（２−１）を含む分画24
mlを得る。
同様にして実施例１−Ｃで得られたペプチド（１−
１）の酵素標識抗原を作製する。
１）の酵素標識抗原を作製する。
実施例６ エンドセリンの定量 （１） 試薬 標準抗原溶液 種々濃度のエンドセリン緩衝液Ａ溶液 酵素標識抗原溶液 抗エンドセリン抗体（第１抗体）溶液 不溶化第２抗体懸濁液 0.9％NaCl溶液 緩衝液Ａ 酵素基質溶液 0.3m M4−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラク
トシド−1mM MgCl2−40％エチレングリコール−0.1％Na
N3 酵素反応停止液 0.1M K2HPO4−NaOH（pH11） （２） 定量操作 第１抗原抗体反応 検量線作成用および検体用の試験官（１×10cm）に標
準抗原溶液または検体（血清など）100μを入れ、さ
らに第１抗体を加え撹拌後、37℃で60分間温置する。次
に酵素標準抗原溶液100μを加え、37℃30分間温置す
る。
トシド−1mM MgCl2−40％エチレングリコール−0.1％Na
N3 酵素反応停止液 0.1M K2HPO4−NaOH（pH11） （２） 定量操作 第１抗原抗体反応 検量線作成用および検体用の試験官（１×10cm）に標
準抗原溶液または検体（血清など）100μを入れ、さ
らに第１抗体を加え撹拌後、37℃で60分間温置する。次
に酵素標準抗原溶液100μを加え、37℃30分間温置す
る。
第２抗原抗体反応とB/F分離 反応液に不溶化第２抗体懸濁液200μを加え、37℃
で15分間温置した後、全試験管に0.9％NaCl溶液2mlを加
え、遠心（1500×ｇ、10分間）し上清を除去する。この
洗浄操作をさらにもう１回くりかえす。
で15分間温置した後、全試験管に0.9％NaCl溶液2mlを加
え、遠心（1500×ｇ、10分間）し上清を除去する。この
洗浄操作をさらにもう１回くりかえす。
酵素反応 沈殿に0.5mlの緩衝液Ａを加え、ミキサーで撹拌して
沈殿を完全に分散させた後、37℃で３分間予熱し、これ
に蛍光基質溶液100μを加える。同温度で温置し、20
分後、酵素反応停止液1.5mlを加えて撹拌する。
沈殿を完全に分散させた後、37℃で３分間予熱し、これ
に蛍光基質溶液100μを加える。同温度で温置し、20
分後、酵素反応停止液1.5mlを加えて撹拌する。
酵素活性の測定 反応混液の蛍光強度を測定する。
エンドセリン量の算出 標準抗原量と吸光度との関係を片対数グラフにプロッ
トし、得られる検量線より検体中のエンドセリン量を求
める。
トし、得られる検量線より検体中のエンドセリン量を求
める。
実施例７ 検量線 下記試薬を用いるほかは実施例６に従って、第１図の
エンドセリンの検量線を作成した。
エンドセリンの検量線を作成した。
酵素標識抗原〜エンドセリン−β−Gal結合物標準抗原
〜エンドセリン 抗体〜エンドセリンから調製した抗体 実施例８ 検量線 下記試薬を用いるほかは実施例６に従って、第２図の
ペプチドの検量線を作成した。
〜エンドセリン 抗体〜エンドセリンから調製した抗体 実施例８ 検量線 下記試薬を用いるほかは実施例６に従って、第２図の
ペプチドの検量線を作成した。
酵素標識抗原〜ペプチド（２−１）−β−Gal結合物 標準抗原〜ペプチド（２−１） 抗体〜ペプチド（２−１）から調製した抗体 実施例９ 検量線 下記試薬を用いるほかは実施例６に従って、第１図の
同様なエンドセリンの検量線を作成した。
同様なエンドセリンの検量線を作成した。
酵素標識抗原〜（１−１）−β−Gal結合物 標準抗原〜エンドセリン 抗体〜ペプチド（１−１）から調製した抗体
第１図および第２図はペプチドの検量線を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】次式（１−１） Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp （１−１） で表されるペプチドまたはその塩。
- 【請求項２】次式（２−１） Cys−Ser−Ser−Leu−Met−Asp−Lys−Glu （２−１） で表されるペプチドまたはその塩。
- 【請求項３】請求項１または２に記載のペプチドに対す
る抗体。 - 【請求項４】少なくとも下記の試薬から構成されてなる
エンドセリンまたはその類縁体の免疫学的定量用キッ
ト； （ａ）標識物で標識されたエンドセリンまたはその類縁
体、 （ｂ）請求項３記載の抗体そのものまたはその不溶化
物、 （ｃ）試薬（ｂ）が抗体そのものであるときは、これと
試薬（ａ）とを反応させたときの反応物と残余とを分離
するための試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63061125A JP2648855B2 (ja) | 1988-03-15 | 1988-03-15 | ペプチド、その抗体およびエンドセリンの定量 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63061125A JP2648855B2 (ja) | 1988-03-15 | 1988-03-15 | ペプチド、その抗体およびエンドセリンの定量 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01233297A JPH01233297A (ja) | 1989-09-19 |
| JP2648855B2 true JP2648855B2 (ja) | 1997-09-03 |
Family
ID=13162045
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63061125A Expired - Lifetime JP2648855B2 (ja) | 1988-03-15 | 1988-03-15 | ペプチド、その抗体およびエンドセリンの定量 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2648855B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4032127A1 (de) * | 1990-10-10 | 1992-04-16 | Basf Ag | Verwendung von disulfidverbrueckten proteinen und peptiden |
| JP3741447B2 (ja) * | 1992-10-23 | 2006-02-01 | 中外製薬株式会社 | エンドセリン−１遺伝子の機能が欠損したマウス |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0331100A1 (en) * | 1988-03-02 | 1989-09-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Anti-endothelin antibodies and their use |
-
1988
- 1988-03-15 JP JP63061125A patent/JP2648855B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01233297A (ja) | 1989-09-19 |
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