JP2641400B2

JP2641400B2 - 細胞における代謝を分析するための方法および装置

Info

Publication number: JP2641400B2
Application number: JP6303905A
Authority: JP
Inventors: ルドルフ・ハチエク; エリッヒ・ウエー・エフ・ハイツ
Original assignee: AA FUAU ERU MEDEIKARU INSUTORUMENTSU AG
Current assignee: AA FUAU ERU MEDEIKARU INSUTORUMENTSU AG
Priority date: 1993-12-09
Filing date: 1994-12-07
Publication date: 1997-08-13
Anticipated expiration: 2012-08-13
Also published as: JPH07218510A; US5489515A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、液体に境を接する細胞
の代謝を分析するための方法および装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞にあっては微生物または他の生細胞
が問題であり、これらは人間、動物または植物の有機体
から取出されおよび／またはこのような有機体に由来す
る。例えば、液体は水性の栄養液である。細胞の代謝を
検査した際、細胞の少なくとも一つの代謝により液体内
に水素イオンが放出される。水素イオンの放出は、直接
行われるか、または細胞がある物質を液体内に放出し、
次いでこの物質が解離することにより水素イオンを放出
する。例えば、多くの代謝プロセスの際に、細胞は二酸
化炭素を生成し、次いでこの二酸化炭素が、細胞を取巻
く液体内で炭酸を生ずる。これに加えて、細胞内には低
分子の脂肪族ヒドロキシ酸、例えば乳酸が生成し、この
ヒドロキシ酸は、細胞膜を透過して液体に運ばれる。他
の場合にあっては、液体内に元々あったおよび／または
検査中に放出された水素イオンは、もちろん通常のよう
に少なくとも部分的に水分子に付着する。

【０００３】刊行物“Light-Adressable Potentiometri
c Sensor for Biochemical System",Dean G.Hafeman,J.
Wallace Parce,Hrden M. Mcconnel 著、２４０版、１９
８８年、１１８２頁−１１８５頁および“Silicon Micr
omachining in the Fabrication of Biosensor Using L
iving Cells",Luc J.Bousse,J.Wallace Parce,John C.O
wicki and Karen M.Kercso著 Tech. Dig. IEEE Solid S
tate Sensor Workshop,1990,173 頁−１７６頁から知ら
れている、生細胞の代謝を検査するための装置は、細胞
および水性の液体を収容するための室を有する。これら
の装置は、液体のｐＨ−値を測定するためのセンサ手段
を備えている。このセンサ手段は、シリコン−半導体−
センサを備えており、測定の際液体に境を接するこのセ
ンサの表面が、電気的な絶縁層、即ちシリコンヒドロキ
シニトリド層またはシリコンニトリド層によって形成さ
れている。このセンサ手段は、更にセンサを照明するた
めの少なくとも一つの発光ダイオード、および液体とセ
ンサ間に電位差を発生させるために液体内に浸漬される
少なくとも１つの電極とを備えている。検査の際、間欠
的に栄養液体が室を経て導かれ、液流が遮断されている
間センサによって発生した光電流を測定する。得られた
結果は、細胞の代謝によって誘起されるｐＨ−値の変化
の尺度、従って代謝自体の尺度となる。

【０００４】しかし、多数の細胞はこれを取巻いている
液体のｐＨ−値の変化に敏感である。公知の装置の場
合、ｐＨ−値が測定の間に変化するので、公知の装置お
よびそれらの作業には、液体が測定時間の大部分の間細
胞のための不都合なｐＨ−値にあると言う欠点を有す
る。

【０００５】多くの代謝の際、細胞を取り巻く液体内に
生じる炭酸は、部分的に水素イオンおよび炭酸水素塩に
解離する。この炭酸水素塩は解離しなかった炭酸と共に
緩衝物質として作用し、ｐＨ−値の変化を低減し、測定
結果をゆがめる。

【０００６】これらの公知の装置の他の欠点は、ｐＨ−
値を測定するためのセンサ手段が比較的多くの異なる部
材、即ちシリコン−センサに加えて、更に少なくとも一
つの発光ダイオードおよび少なくとも一つの電極を必要
とするという点にある。

【０００７】刊行物“Preparation of Iridium Oxide a
nd its Application in Sensor-Actuator System" W.Ol
thuis,J.C.van Kerkhof,P.Berveld,M.Bos,W.E.van der
Linden著Sensors and Actuator B,4,1991 年151 頁−15
6 頁、Elsevier Sequoiaには酸化イリジウム層を有し、
水素イオンを放出および受容するための電極として使用
される物体を備えた電量滴定のための装置が開示されて
いる。この刊行物には、細胞の代謝を検査するための上
記の装置の使用に関しては何等の示唆も含まれていな
い。ｐＨ−値は滴定の間に変化するので、細胞の代謝の
検査に使用する場合には、上記のような測定は、Hafgem
an等およびBousse等の上記刊行物から知られているｐＨ
−値の変化の測定と同様に、細胞を取り巻く液体が測定
の間最適なｐＨ−値にないと言う欠点を有している。

【０００８】我々独自の学術的な研究が示すところによ
ると、Olthuis 等の上記刊行物に記載された方法に従っ
た酸化イリジウム層の構成は、多結晶性の、暗色の、十
分に不透明な酸化層の生成を招く。このような酸化イリ
ジウム層を水素イオン交換またはｐＨ−値の測定に使用
した場合、それらの水素イオン交換率もしくは測定感度
が、時間の経過とともに比較的強く変化すると言う欠
点、および付加的な顕微鏡又は光学的な検査にとって透
明な酸化層を必要とする装置には不適当であると言う欠
点を有する。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記
の公知の装置の欠点がなく、少なくとも一つの代謝プロ
セスの際に、液体内に放出される水素イオンの量を測定
することが可能で、しかも液体のｐＨ−値が検査の間細
胞にとって不都合な方法で変わることのない、細胞の代
謝を分析するための方法および装置を提供することであ
る。更に、必要な場合、測定を極めて迅速に行い得るよ
うにすることである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記の課題は、本発明に
よる方法にあって、制御電極および対向電極を液体と接
触させること、電流を制御電極と対向電極の間の液体を
通して導き、かつ制御して、制御電極が酸化還元反応に
より水素イオンを受容または放出するようにし、ｐＨ−
値が設定値と等しくなるようにすること、および電流お
よび／または電流に応じて変化する値を測定することに
よって解決される。

【００１１】更に、上記の方法を実施するための本発明
による装置の特徴とするところは、液体と接触しかつ水
素イオンを受容または放出するために形成されている制
御電極および液体と接触する対向電極が設けられている
こと、ｐＨ−センサ手段、制御電極および対向電極が電
気的な回路手段で電気的に接続されていること、および
この電気的な回路手段が、制御電極および対向電極間で
液体を経て流れる電流を発生して、電流および／または
電流に応じて変化する値を測定し、そしてｐＨ−値が設
定値に等しくなるように電流および水素イオン交換を制
御するように構成されていることである。

【００１２】検査の際、細胞は、装置の表面で不動であ
り、次いで装置の表面に接していない少なくとも一つの
表面領域および他の細胞に接していない少なくとも一つ
の表面領域で液体に境を接している。しかし、場合によ
っては細胞を、部分的又は全体的に液体内に懸濁させて
もよい。即ち、液体は細胞を少なくとも大部分囲繞して
いる。

【００１３】本発明による装置を使用する場合、ｐＨ−
センサ手段、水素イオン交換のための、即ち水素イオン
供与体および／または受容体として形成されている制御
電極および対向電極を液体と接触させる。更に、ｐＨ−
センサ手段により液体のｐＨ−値が測定される。更に、
電気的な回路手段により、制御電極から対向電極および
／またはこの逆の方向で液体を流過する電流が発生し、
従って制御電極は水素イオンを液体と交換する。即ち、
電流の方向に応じて、制御電極が水素イオンを放出およ
び受容する。回路手段は、ｐＨ−値が設定値と等しくな
るようにこの電流を制御する。これに加えて、この回路
手段は、液体を流過する電流および／または電流に応じ
て変化する値を測定する。

【００１４】分析または測定の間ｐＨ−値が調整される
設定値は、少なくとも所定の測定時間の間は一定であ
り、検査される細胞にとって最適な値に等しい。この最
適なｐＨ−値は色々な種類の細胞にとって異なっている
ことが認められる。従って装置は手動で調節可能な調節
手段を有しており、これにより、検査する種類の細胞の
最適なｐＨ−値に相当する設定値を手動で調節すること
が可能である。

【００１５】本発明の装置の好ましい態様にあっては、
回路手段は液体を流過する電流の強さを自動的に制御す
るのみならず、その方向をも自動的に調節し、必要に応
じて制御電極が水素イオンを放出または受容するように
働く。場合によっては、手動で操作可能な制御手段を設
け、これにより電流方向を選択的に手動または自動的に
調節することも可能である。

【００１６】ｐＨ−値を制御するために液体を経て導か
れる電流は、単位時間あたり細胞により液体内に放出お
よび／または解離される水素イオンの量と数の尺度であ
り、ｐＨ−値が一定の設定値に調整された場合には、放
出および／または解離する水素イオンの割合に比例す
る。

【００１７】装置は、例えば少なくとも手動で操作可能
な操作機構および／または自動的に働く回路手段により
測定の開始時点および測定時間および／または積分時間
の持続時間が決定されるように構成されている。更に、
この回路手段は、測定時間および／または積分時間の
間、液体を流過する電流の強さが積分されるように構成
されている。

【００１８】ｐＨ−値の実際値が設定値の周辺を動揺
し、従って制御プロセスにおいて電流方向が変った場合
には、積分の際電流の方向に応じて電流の強さに正また
は負の符号を与える。積分は、測定時間および／または
積分時間の間電流を形成する電荷量の尺度および細胞に
より放出および／または解離される水素イオンの量の尺
度を与える。ｐＨ−値が測定時間および／または積分時
間の間一定の設定値に制御された場合、積分および電荷
量は、液体内に放出および／または解離される水素イオ
ンの量に比例する。

【００１９】ｐＨ−値を測定するために使用される、本
発明のｐＨ−センサ手段は、特にｐＨ−センサ電極を有
しており、このｐＨ−センサ電極は、分析の際細胞に境
界を接している液体と接触し、その液体に対する電位は
液体のｐＨ−値に依存している。更に、このｐＨ−セン
サ手段は補助電極を備えていて、その液体に対する電位
は少なくとも実質的にｐＨ−値から独立しており、即ち
ｐＨ−値が変わった際一定にとどまるか、またはｐＨ−
測定電極の電位の変化よりも著しく小さく変化するに過
ぎない。

【００２０】上記の装置は、特に上記の電極を支持する
ように構成されている絶縁性の支持体部分を有する支持
体を備えている。この絶縁支持体部分は、例えば、一つ
の部材から成り、本質的に平坦な小さな板によって形成
されており、例えば、この板は酸化アルミニウムのよう
な結晶性の金属酸化物、即ち合成の、透明でかつ無色の
サファイアの部材から成る。この絶縁支持体部分は、例
えば平坦な表面を有しており、この表面の上には中間室
により互いに分離されている導電性および／または半導
電性の層が載置されていて、この層は上記の電極または
少なくとも細胞を分析する際に液体と接触する自由表面
領域を形成している。

【００２１】ｐＨ−測定電極および制御電極は、それら
の自由表面を形成し、測定の際液体に境を接する少なく
とも一種の金属酸化物から成る層を有する。この金属酸
化物層は、少なくともある程度導電性および／または半
導電性でなければならない。

【００２２】ｐＨ−測定電極および制御電極の金属酸化
物層は、特にイリジウム或いはパラジウムの少なくとも
一種の酸化物から成る。しかし、制御電極の金属酸化物
層は、ジルコニウム、ニオブ、ロジウム、タンタル、レ
ニウム、白金から成る群の少なくとも一つの金属の少な
くとも一種の酸化物から成っていてもよい。その際、酸
化物層は、特に上記の群の単一または二種以上の酸化物
からなる。

【００２３】酸化イリジウム層は、制御電極を形成する
水素イオン供与体および／または受容体として特別良好
であり、またｐＨ−測定電極を形成させるのにも十分に
適している。何故ならば、この酸化イリジウムは、水素
イオン交換のためには、小さな電極電位しか必要としな
いからである。この電極電位は、例えば液体内に存在し
ている塩化物イオンが酸化される電位以下にある。更
に、酸化イリジウムから成る層を有する電極の場合、水
素イオン交換のために必要な電極電位もまた水の電解を
誘起する電位よりも小さい。酸化パラジウムから成る層
もまた水素イオン交換のための制御電極およびｐＨ−測
定電極を形成するのに良好である。

【００２４】制御電極およびｐＨ−測定電極の酸化物層
が、色々な酸化数に酸化されうる金属の酸化物を有する
場合には、少なくとも酸化物層の自由表面を形成しかつ
分析の際液体に境を接している酸化物層の部分は、最大
限可能な酸化数の酸化物から成ることが好ましい。この
ことは、酸化物層をより以上の酸化から保護し、これに
より酸化物層の化学的な安定性に寄与する。酸化イリジ
ウム層の場合、少なくとも酸化物層の自由表面を形成す
る部分は、最大の酸化数の酸化物、即ちIrO₂からなる。

【００２５】絶縁支持体部分には、特にこの支持体部分
とｐＨ−測定電極もしくは制御電極を形成する半導電性
金属酸化物層間に、コーティングまたは中間層が設けら
れており、これらは導電性の金属層から成る。この金属
層は、その酸化物またはその酸化物類が金属酸化物層を
形成する金属または金属類から成る。その際、金属酸化
物層は、コーティングとは反対の最大の酸化数の酸化物
層からなる部分と金属層との間に、更にこれらの層と境
を接している移行部分(transition region )を有してお
り、この移行部分は低い酸化数の酸化物からなる。

【００２６】ｐＨ−測定電極および／または制御電極の
金属酸化物層がイリジウム酸化物から成る場合、存在し
ている金属層はイリジウムから成る。この場合、その表
面に存在している、IrO₂から成る領域とイリジウムから
成る金属層間の酸化物層は、更にIr₂O₃から成る領域を
有していてもよい。

【００２７】本発明の装置の好ましい実施例にあって
は、ｐＨ−測定電極および／または制御電極の金属酸化
物層、または分析および測定の際液体と接触する電極の
自由表面領域を形成する金属酸化物層の少なくとも一部
分は単結晶性である。このような単結晶性の金属酸化物
層は、安定した構造を有する。更に、この金属酸化物層
は、多結晶性の酸化物層と異なり、内部界面を有してい
ない。これにより、酸化物層はコンパクトになり、全く
亀裂および微小亀裂を含まず、実際に使用した際も亀裂
を有していない。従って、装置を使用した際、この単結
晶性の金属酸化物層が液体と接触しても、液体はこの金
属酸化物層内に浸透しない。

【００２８】上記のすべての特性は、単結晶性の金属酸
化物層を有する電極が、以下に詳しく述べる検査および
測定の際、短期間でも、また長期間にわたっても安定で
あり、良好な再現性を有する挙動を示すことに寄与す
る。

【００２９】ｐＨ−測定電極と共にｐＨ−測定のために
働く補助電極は、例えば少なくとも部分的に塩化銀また
は塩化第一水銀からなり、上記支持体部分に設けられ
て、検査の際液体と接触する塩化銀または塩化第一水銀
からなる層を有する。

【００３０】液体を流過する電流を発生させるために制
御電極と協働する対向電極は、例えば少なくとも部分的
に金属材料からなり、上記支持体部分に設けられる金属
層を有する。

【００３１】装置の有利な構成にあっては、小板からな
る支持体部分が、少なくとも１つの他の部分と共に細胞
と液体を収容するための空域を区画しており、この空域
に電極が接している。この空域は特に、自由な、即ち空
のかつ固形物を含まない、四方が周囲に対して密閉され
ている中間空域からなる。電極は互いに並立して設けら
れており、相対的に寸法が小さく、例えば包絡環(Huell
kreis)または包絡正方形(Huellquadrat)内に存在してお
り、これらの直径または辺の長さは最高１０ｍｍである
か、または最高５ｍｍである。電極を支持する表面に対
して直角に測定した中間空域の高さは、特に最高３ｍ
ｍ、例えばほぼ１ｍｍである。装置のこの構成と寸法設
定は、比較的僅かな量の細胞と液体を分析することを可
能にする。更に、細胞から液体内に放出および／または
解離する水素イオンの量は、短い測定時間に十分正確に
測定できる。従って水素イオンの量は、例えば最長３０
秒の測定時間で、または最長１０秒の測定時間ですら測
定可能である。

【００３２】単結晶性の金属酸化物層は、例えば真空中
で薄層技術(duennschichttechnolohisch) 方法により造
られ、それと同時に支持体上に設けられる。その際、酸
化物層は、支持体の金属層により形成されている表面に
載置される。酸化イリジウム層を造るためには、例え
ば、第一の蒸着プロセスにおいて、絶縁性の最低限８０
０℃の温度に耐える、既に述べたように例えばサファイ
ア小板からなる支持体上に、純粋なイリジウムから成る
金属層が形成されるまで、イリジウムを蒸発させる。引
続き第二の蒸着プロセスにおいて、この金属層上にさら
にイリジウムを蒸着させ、同時に支持体部分を含む空域
に酸素を導入する。この支持体部分は、第二の蒸着プロ
セスの間少なくとも約６００℃から８００℃に加熱す
る。第二の蒸着プロセスにおいて、金属層上に単結晶性
の酸化イリジウム層が形成される。同じような方法で、
単結晶性の金属酸化物層を上記の他の金属から造ること
ができる。

【００３３】絶縁支持体部分が、金属酸化物層を有する
少なくとも一つの電極に加えて、更に例えば塩化銀から
なる補助電極および／または白金からなる対向電極を支
持している場合、銀または白金は、支持体部分上に蒸着
され、銀は、その後、塩化銀に転換される。従って、色
々な電極と電気的に接続される条導体を、支持体部分上
に蒸着させることが可能である。これは、支持体部分に
経費をかけないで、多数の電極を支持している支持体部
分の製造を可能にする。

【００３４】しかし、蒸着ではなく、他の方法で造られ
た金属層に金属酸化物層を載置することも可能である。
更に、場合によっては、酸化物−単結晶を増大させ、次
いでこれを裁断および／または研削することによって、
酸化物層を造ることも可能である。次いで、この際形成
される板を、支持体上に固定する。

【００３５】本発明による装置の有利な構成にあって
は、金属酸化物層の厚みは最低５０ｎｍ〜最高１ｎｍで
ある。酸化物層が薄層技術により造られる場合、その厚
みは例えば１０００ｎｍ以下である。ｐＨ−測定電極の
一部が金属酸化物層で形成されている場合、その層は約
１００ｎｍ〜３００ｎｍの厚みで形成されるのが有利で
ある。このような比較的僅かな厚みは迅速な測定を可能
にする。制御電極の一部が金属酸化物層で形成されてい
る場合は、十分な量の水素イオンが放出および／または
受容されるように、この厚みを形成するのが有利であ
る。その際酸化物層は例えば最低３００ｎｍから恐らく
約６００ｎｍまで、またはそれ以上であってもよい。金
属酸化物層が光透過性でなければならない場合、酸化物
層は最高約３００ｎｍの厚みにするのが有利であり、従
って酸化物層はできるだけ少ない光を吸収する。制御電
極および／またはｐＨ−測定電極の一部を形成する金属
酸化物層は、場合によっては、単結晶性であるかわり
に、多結晶性であってもよい。

【００３６】更に、ｐＨ−測定電極および／または制御
電極は、場合によっては、金属酸化物層の代わりに、少
なくとも部分的に白金から成る層を備えていてもよい。
更に、ｐＨ−センサ手段に、場合によっては、ｐＨ−測
定電極の代わりに、ドープしたシリコンの層およびシリ
コンニトリド層またはシリコンオキシドニトリド層を備
えたｐＨ−シリコン−半導体−センサまたは−検出器を
設けることが可能である。その際センサは、上記したHa
feman 等およびBousse等の著作から公知になっているセ
ンサと構成が幾分類似している。補助電極は、二つの上
記刊行物から知られている電極の機能を示す少なくとも
一つの電極によって置き換えられる。

【００３７】細胞から放出される水素イオンの量を測定
する前に、水溶液からなる電解質溶液を準備する。液体
は、これが細胞と接触する以前に、特に検査する細胞の
ための最適なｐＨ−値と僅かな緩衝能力を有しているに
過ぎないか、またはこの緩衝能力を全く有していない。
最大限でも僅かしかない緩衝能力または緩衝能力の欠如
は、測定の間に細胞から放出される水素イオンの量を迅
速にかつ正確に測定することに寄与する。

【００３８】検査の際細胞に境を接して、細胞を大体囲
繞している水性の液体は、検査の開始時、例えばグルコ
ースおよび／またはグルタミンのような少なくとも一種
の栄養素を含んでいてもよい。更に、液体は、細胞の成
長のために重要な少なくとも一種の添加物と通常のこの
ような多くの添加物、例えばビタミン類、アミノ酸類、
塩類、ヌクレオシド類、ホルモン類、外因性の成長要素
を含んでいてもよい。更に、液体は、酸素および／また
は二酸化炭素のような溶解ガスを含んでいてもよい。

【００３９】更に、液体に少なくとも一種の試薬を添加
し、この試薬の細胞に対する作用を検査する。この試薬
として、例えば薬理的な作用物質または環境から出る有
害物質が添加される。

【００４０】検査の際、例えば電気分析、即ち電量分析
的にｐＨ−値を一定に維持することによって、少なくと
も一つの代謝プロセスの間に、微生物または他の細胞か
ら液体に放出される一種またはそれ以上の酸の量を測定
することが可能である。この酸の量は例えば細胞におけ
る活力の尺度である。

【００４１】添付図面に図示されている実施例を参照し
て、以下に本発明を詳細に説明する。

【００４２】

【実施例】図１〜図３は、概略図であって、実寸で示し
たものではない。

【００４３】細胞における代謝を検査するための電気分
析的で、電量分析的な測定のための測定装置は、図１か
ら明らかなように容器形状および／または室状の装置を
有しており、この装置はセンサ５０を形成している。こ
のセンサは支持体５３を備えている本体５１を有する。
支持体は支持体部分を備えており、この支持体部分は平
坦であり、電気的に絶縁性であるサファイア板から成る
四角形の小板５４により形成されている。図１に示すよ
うに、この小板５４は、その上部の平坦な面を構成する
表面に、図２に示す４つの電極、即ちｐＨ−測定電極５
６、制御および／または水素イオン交換電極５７、補助
電極５８および対向電極５９を備えている。それぞれの
電極は、小板上に設けられた条導体５６ａ、５７ａ、５
８ａおよび５９ａと電気的に接続されている。ｐＨ−測
定電極５６は、図２に平面図で示したように、完全な環
から成る環形状の領域を有している。制御および／また
は水素イオン交換電極５７は、条導体５６ａの通過を可
能にする間隙を除いて、ほぼｐＨ−測定電極５６を囲繞
している。従って、制御および／または水素イオン交換
電極５７は、ほぼＣ−字形であり、上記の間隙によって
中断される環形状を形成し、ｐＨ−測定電極５６よりも
著しく大きな表面を有する。制御および／または水素イ
オン交換電極５７の表面は、特にｐＨ−測定電極５６の
表面よりも少なくとも５倍、例えば７倍から１５倍ほど
大きい。両電極５８、５９の各々は、電極５７に比較し
て狭く、ほぼ半環状のアーチ部を形成していて、電極５
７の外縁部に沿って走っている。４つの条導体は、小板
５４の四辺の一辺を形成する縁部に対して平行に指向し
ている。

【００４４】ｐＨ−測定電極５６および部分的に図３に
も示した制御および／または水素イオン交換電極５７
は、それぞれ小板５４上に直接蒸着された純粋なイリジ
ウムの層からなる１つのコーティング６５、およびこの
コーティング上に載置されたイリジウムからなる単結晶
性の酸化物層６６を有する。条導体５６ａおよび５７ａ
は、電極５６、５７のコーティングと接続したイリジウ
ム層からなる。補助電極５８は塩化銀からなり、これと
接続されている条導体５８ａは銀からなる。補助電極５
９およびこれと接続されている条導体５９ａは白金から
なる。

【００４５】色々な電極と条導体との間には、これらを
互いに分離している幅狭な中間空域、即ち間隙が存在し
ている。電極５６、５７を形成しているコーティング６
５および酸化物層６６の縁部は、保護層−その一部は図
３において電極５７の外縁部に認められ、参照符号６８
で示した−によって電気的に絶縁状態で、検査の際液体
に対して分離されている。保護層６８は、例えば他の元
素が組込まれないで、蒸着された純粋な珪素または二酸
化珪素からなる。

【００４６】支持体５３の電極を備えている側には、小
板７１が設けられており、この小板は電極群５６、５
７、５８、５９に対して同心的に貫通している孔７１ａ
を備えている。この孔の直径はこれらの電極群の包絡環
とほぼ等しい。

【００４７】更に、同様に小板から成る覆い部分７３が
設けられており、この覆い部分は小板７１の小板５４と
は反対側に載っており、この小板の孔７１ａ内に突出し
ている突起７３ａを有する。小板５４、７１と覆い部分
７３は互いに境を接し合って孔７１ａの空いている部分
によって形成されて、周囲に対して気密に閉鎖され、か
つ細胞および液体を収容するための中間空域７５を形成
している。覆い部分７３は２つの通路を備えており、こ
れらの通路は突起７３ａの縁部と孔７１ａの縁部との間
で上記の中間空域７５に開口しており、液体が通る通路
のための流入口７３ｂおよび流出口７３ｃを形成してい
る。

【００４８】小板７１は、電気的に絶縁された状態にあ
り、例えば合成物質から成るが、鉱物質のガラスから形
成されていてもよい。覆い部分７３は、例えば合成物質
から成る。小板５４と覆い部分７３は、例えば締付け装
置のような固定手段で取り外せるように保持されてい
る。小板７１は、小板５４または覆い部分７３と完全に
接続されているか、または小板５４および覆い部分７１
から取り外せるように覆い部分および小板５４の間に固
定されている。更に、覆い部分７１は場合によっては、
図１と図３に示したように、電極５８、５９の外縁部に
載置されていてもよいが、完全に覆っていてはならな
い。従って、すべての電極５６、５７、５８、５９は、
中間空域７５に隣接している。平面図で見て、この中間
空域７５内に存在しているイリジウムからなる条導体５
６ａの部分は、例えば蒸着された珪素から成る絶縁体に
よって中間空域７５に対して覆われている。しかし、他
の電極の中心部内に存在している環状の領域に加えて、
ｐＨ−測定電極５６が、更にその領域と接続している、
真っ直ぐな、少なくとも中間空域７５の縁部にまで延在
し、酸化イリジウム層を備えた、絶縁体によって覆われ
ていない領域を備えていることも可能である。この場
合、蒸着された電極が図１と図３において著しく誇張さ
れた厚みで示されていることが認められる。中間空域７
５がセンサを組立てた際周囲に対して気密に閉鎖される
ように、場合によっては更に電気的に絶縁されて、弾性
的に変形可能な封隙兼絶縁材料の層を、電極５８、５９
を囲繞しかつ小板７１によって覆われている小板５４の
領域上および条導体上、並びにこれらの間に挿入または
載置することが可能である。

【００４９】センサ５０を備えた測定装置は、電気的な
測定装置７７、即ち図２においてブロック図で示した測
定機器を備えている。条導体５６ａ、５７ａ，５８ａ，
５９ａは、例えば差込み接続部を介して電気的な回路手
段を備えた測定装置７７と電気的に接続されている。こ
の測定装置は、測定増幅器７８を備えており、この測定
増幅器の入力は、ｐＨ−測定電極５６および補助電極５
８と接続されている。測定装置７７は、更に電気的に制
御可能な電源７９を備えており、この電源の出力は制御
および／または水素イオン交換電極５７および対向電極
５９に接続されている。更に、この測定装置７７は、例
えばデジタル様式で働くプロセッサを有する測定兼制御
回路８０を備えている。更に、表示および／または記録
装置８１が設けられている。上記の測定兼制御回路８０
は、測定増幅器７８の出力、電源７９の制御入力、およ
び表示および／または記録装置８１と接続されている。

【００５０】更に、液体を準備し、調整し、かつ中間空
域５７内に供給するための準備手段と供給手段が設けら
れている。準備手段は例えば、液体中の所望のｐＨ−値
に調整し、液体を所望の温度に加熱および／または冷却
し、液体内に一定の気体分圧、特に酸素および／または
二酸化炭素分圧を発生させるように形成されている。更
に、加熱および／または冷却装置並びに温度制御装置が
設けられており、これらの装置によりセンサは上記のよ
うに、特に分析の際中間空域７５内に存在している液体
および細胞が所望の温度に維持される。更に、誘電泳動
手段(Dielektrophorese-Mittel) が設けられており、こ
の誘電泳動手段により、細胞が中間空域７５に接した表
面の所定の領域に付着して、不動となるように、中間空
域７５内の細胞の運動が制御される。

【００５１】更に、誘電泳動手段は、例えば誘電泳動電
極を備えており、この誘電泳動電極は、縁部、角偶およ
び／または小さな曲率半径を備えた多数の突起を有して
おり、この手段は、不均質な交番電界(alternating ele
ctrical field)を中間空域５７内に生成するように、交
流発電器と接続、設置されている。誘電泳動電極は金属
層によって形成されており、例えば中間空域７５に接し
ている覆い部分７３の面に設けられている。場合によっ
ては誘電泳動電極は、その代わりに、小板５４の中間空
域７５とは反対側に設けることが可能であり、この場
合、この電極は、小板および電極５６、５７、５８、５
９および／またはこれらの間に存在する間隙を通して機
能することによって、誘電泳動のための交番電界を中間
空域７５内に発生させる。

【００５２】電極５６、５７、５８、５９が、電解質の
水性液体と接触した際、ｐＨ−測定電極５６および補助
電極５８を用いて電気分析的に、例えば電位計によりｐ
Ｈ−値を測定することが可能である。両電極５６および
５８間に生じる電位は、多かれ少なかれｐＨ−値と直線
的な関係にあり、このｐＨ−値は、ほぼ４〜９の範囲内
にあって、電位の低下に伴い上昇する。

【００５３】制御および／または水素イオン交換電極５
７および対向電極５９の間に、水素イオンを含む電解質
水溶液を通して電流が導かれた際、電極５７の酸化イリ
ジウム層が、電流の方向に応じて、酸化還元反応により
水素イオンを受容または放出する。この反応は、以下の
式

【００５４】

【外１】で簡単に表すことができる。測定の際に電極５７が、特
に水素イオンを放出するか、または受容するかに応じ
て、必要な場合この測定前および場合によっては先行し
て行われる測定の後、酸化物層６６のイリジウムを、カ
ソード電流で還元するか、アノード電流で酸化し、これ
により酸化物層に水素イオンを飽和させるか、または水
素イオンを取り除く。これについてはは、上記Olthuis
等の刊行物を参照されたい。

【００５５】センサ５０および電気的な測定装置７７を
備えた測定装置は、例えば少なくとも一つの代謝プロセ
スの際、細胞培養液の生細胞から放出される酸の量を測
定するのに使用される。この測定を実施するために、例
えば調整された栄養液およびこの中に懸濁されている細
胞を含む懸濁液中の分析される細胞は、流入口７３ｂを
経て中間空域７５中に導入される。液体は、例えば水お
よびこの水中に溶解している少なくとも一種の栄養物質
に加えて、実施される分析の種類に応じて、更に溶解し
た酸素を含んでおり、しかも例えば中間空域７５内に入
れた際二酸化炭素と炭酸を含まない。導入される懸濁液
は、例えば中間空域７５を完全に満たさなければならな
い。懸濁液を導入した後、一定の測定時間の間細胞から
放出および／または解離する水素イオンの量を、センサ
内で電量分析的に測定することが可能である。

【００５６】電量分析的な測定は、例えば液体および細
胞を導入した後、直ちに開始される。しかし、細胞を中
間空域７５内に導入した時点と、測定を開始する時点と
の間に、更に待機および付着時間を間挿し、その間に細
胞を中間空域７５に境を接するセンサ部分の少なくとも
一つの部分の表面に付着させ、これにより細胞を固定す
ることも可能である。誘電泳動手段が設けられている場
合、この付着は誘電泳動によって制御および促進され
る。必要な場合、待機および付着時間の後、測定開始前
に更に新しい調整された液体で中間空域７５を洗浄し、
その際洗浄液が流出口７３を経て中間空域７５から流出
する。洗浄により、引続き行われる測定の開始の際に、
この液体が正確に定められた組成、例えば正確に定めら
れた溶解ガス含有量を有することが可能となる。

【００５７】液体と細胞の温度は測定の開始前と測定中
に所望の値に調節される。必要な場合、更に流入口７３
ｂ並びに流出口７３ｃ或いは流入口と流出口とを接続し
ている導管を閉じ、従って中間空域７５を周囲の雰囲気
に対して完全に遮断する。

【００５８】電量分析的な測定の際、測定兼制御回路８
０は、栄養液のｐＨ−値に関する尺度となるｐＨ−測定
電極５６および補助電極５８間の電位差を測定する。更
に、電源７９は、制御および／または水素イオン交換電
極５７および対向電極５９間で栄養液を通って流れる直
流電流を発生する。この電流は、均一であってもよく、
またはパルス列を形成してもよく、制御および／または
水素イオン交換電極５７が水素イオンを栄養液から受容
できるように整向されている。測定兼制御回路８０は、
自動的に電源７９を制御し、電極５７により受容される
水素イオンの量が細胞から放出される水素イオンの量を
補い、その時の栄養液のｐＨ−実際値が、手動で操作可
能な調節部材により調節された細胞の発育に好都合な所
定のｐＨ−設定値に等しくなるようにする。場合によっ
ては、測定兼制御回路８０は、電流の方向を一時的に逆
方向に整向し、これにより電極５７が、一時的に水素イ
オンを放出する。制御は例えば"FUZZY" 論理を使用して
行われる。更に、測定兼制御回路８０は、所定の、例え
ば手動で調節可能な測定時間の間、制御および／または
水素イオン交換電極５７と対向電極５９との間で栄養液
を流過する電流を測定し、積分し、測定時間の間栄養液
のｐＨ−値を一定に保持するために、総じてこの栄養液
を流過した電荷量を測定する。これは、細胞から直接液
体に放出される酸および／またはこの中で形成される酸
の量の尺度である。表示および／または記録装置８１
は、例えば電荷量またはこれに比例する値および場合に
よってはｐＨ−値を表示および／または記録する。

【００５９】測定を行った後、場合によっては、細胞が
中間空域７５内に残留するように、中間空域７５を液体
で洗浄し、その際液体の組成または温度または他のパラ
メータを変えることが可能である。これにより、例えば
他の電量分析的な測定を行うことが可能である。中間空
域７５内に存在している細胞の分析を終了する際は、細
胞が洗い出されるように、中間空域７５を洗浄する。こ
れに加えて、必要な場合は、中間空域７５を区画してい
る部分を洗浄するために、一時的に小板５４から覆い部
７３を外し、必要な場合は、制御および／または水素イ
オン交換電極５７を電気化学的に再生し、その後再び新
しい試料を中間空域７５内に導入する。

【００６０】測定のために、栄養液を中間空域７５内に
導入する前に、この栄養液に更に例えば医薬または環境
有害物から成る物質を添加し、それらの細胞に対する作
用を分析することが可能である。また、測定のために、
酸素に加えてまたは酸素の代わりに、他の気体を栄養液
に溶解することが可能である。即ち、センサ５０を小さ
なバイオリアクターとして使用し、このバイオリアクタ
ー内で細胞を培養し、その際細胞の代謝を分析すること
が可能である。

【００６１】図４から認められる多重センサ９０は、支
持体９３を備えた本体９１を有する。この支持体は、主
構成部分としてサファイアから成る小板９４を備えてお
り、この小板は多数の、例えば４つの電極群９５および
条導体群５９ａを有する。各々の電極群９５は、同様に
設けられた電極５６、５７、５８、５９の４つの電極を
有する。各々の条導体群９５ａは、４つの条導体を備え
ており、それぞれ一つの電極と接続されている。図４に
示すように、例えばすべての条導体は、四角形の小板９
４の同じ辺で終わっている。覆い部７３に相当する覆い
部９７および小板７１に対応する図示されていない小板
と共に、小板９４は、各々の電極群９５のための中間空
域を区画しており、これは分析する液体を収容する。更
に、覆い部９７は、流入口７３ｂと流出口７３ｃと同様
に、対応する中間空域に開口している流入口と流出口を
備えている。多重センサ９０は、測定装置と共に同時に
多数の試料の測定を可能にする。

【００６２】本発明による測定装置は更に様々な点で改
変可能である。例えば、サファイアからなる小板５４お
よび９４をセラミック材料から成る小板または小板の形
態をしていない部材で置換えることが可能である。

【００６３】図１に示すセンサにあっては、流入口７３
ｂおよび流出口７３ｃを設けなくてもよく、従って中間
空域７５は、完全に密閉される。分析する試料は、ピペ
ットまたは類似のもので、覆い部７３を取外して一時的
に開いた中間空域内に導入される。同じことが、図４に
示した多重センサ９０に関しても言える。更に、同じ一
つの部材から成り、絶縁性の小板上に４以上、例えば６
または２４の電極群を有する多重センサを使用すること
も可能である。

【００６４】図１と図４に示した覆い部７３、７９およ
び／または支持体５３、９３およびセンサの電極は、透
明な材料からなり、センサ内に存在している細胞を顕微
鏡および／または光学的な分析方法により分析すること
も可能である。

【００６５】上記の実施例の場合、ｐＨ−測定電極、制
御電極、補助電極および対向電極は、互いに分離して設
けられているから、それらの間には直接的な電気的接続
がない。ｐＨ−値の測定と水素イオン交換のために使用
される電流の発生と制御は、連続的にかつ同時に、また
は場合によっては間欠的にかつ交番して行われる。

【００６６】しかし、場合によってはｐＨ−値測定のた
めの補助電極および液体を経て流れる電流を発生させる
ための対向電極を同じ電極で構成してもよい。この場
合、ｐＨ−値測定と水素イオン交換を行うための電流の
発生は、例えば交番して行われるが、連続的、かつ同時
的なｐＨ−値測定と電流の発生と制御も可能である。

【００６７】

【発明の効果】上記の本発明による測定方法および装置
により、従来の方法および装置が有する、酸化イリジウ
ム層を水素イオン交換またはｐＨ−値の測定に使用した
際、それらの水素イオン交換率または測定感度が時間の
経過につれ比較的強く変化すると言う欠点、および酸化
層が例えば付加的な顕微鏡または光学的な検査にとって
光透過性でなければならない装置には、それらが不適当
であると言う欠点が排除される。

【図面の簡単な説明】

【図１】電極群を備えた支持体と液体を収容するための
中間空域とを備えたセンサの断面図である。

【図２】図１に示したセンサの支持体の電極を備えた表
面の平面図と電気的な測定装置のブロック図である。

【図３】センサの図１において符号III で示した部分お
よび付加的な部分とを一緒に示した拡大図である。

【図４】図４は多数の群の電極を支持している支持体の
平面図である。

【符号の説明】

５０センサ５１支持体本体５３，９３支持体５４，７１，９４小板５６ｐＨ−測定電極５６ａ条導体５７制御および／または水素イオン交換電極５７ａ，条導体５８補助電極５８ａ条導体５９対向電極５９ａ条導体７１ａ孔７３，９７覆い部７３ａ突起７３ｂ流入口７３ｃ流出口７５中間空域７７測定装置７８測定増幅器７９電源８０測定兼制御回路８１表示および／または記録装置９０多重センサ９１本体９５電極群

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】液体に境を接する細胞の代謝を分析する
方法において、制御電極（５７）および対向電極（５
９）を液体と接触させること、電流を制御電極（５７）
および対向電極（５９）の間で液体を通して導きかつ制
御して、制御電極（５７）が酸化還元反応により水素イ
オンを受容または放出するようにし、ｐＨ−値が設定値
と等しくなるようにすること、および電流および／また
は電流に応じて変化する値を測定することを特徴とする
上記方法。
【請求項２】液体のｐＨを測定するためのｐＨ−セン
サ手段（５６，５８）を備えた、液体に境を接している
細胞の代謝を分析する装置において、液体と接触しかつ
水素イオンを受容または放出するために形成されている
制御電極（５７）および液体と接触する対向電極（５
９）が設けられていること、ｐＨ−センサ手段（５６、
５８）、制御電極（５７）および対向電極（５９）が電
気的な回路手段で電気的に接続されていること、および
電気的な回路手段が、制御電極（５７）および対向電極
（５９）間で液体を経て流れる電流を発生して、電流お
よび／または電流に応じて変化する値を測定し、そして
ｐＨ−値が設定値に等しくなるように電流および水素イ
オンの受容または放出を制御するように、構成されてい
ることを特徴とする上記装置。
【請求項３】ｐＨ−センサ手段が、液体と接触するｐ
Ｈ−測定電極（５６）を備えており、このｐＨ−測定電
極の液体に対する電位が、この液体のｐＨ−値に依存し
ていることを特徴とする請求項２に記載の装置。
【請求項４】電気的に絶縁性の支持体部分を備えた支
持体（５３）が設けられていること、およびｐＨ−測定
電極（５６）、制御電極（５７）および対向電極（５
９）が支持体部分上に設けられていてかつ導電性および
／または半導電性の層を備えていることを特徴とする請
求項３に記載の装置。
【請求項５】制御電極（５７）がｐＨ−測定電極（５
６）を少なくとも大方囲繞していること、および対向電
極（５９）が制御電極（５７）の外側に設けられている
ことを特徴とする請求項４に記載の装置。
【請求項６】液体と接触しかつｐＨ−値を測定するた
めのｐＨ−測定電極（５６）と協働する補助電極（５
８）が設けられており、この補助電極が同様に支持体部
分に制御電極（５７）の外部に設けられていることを特
徴とする請求項５に記載の装置。
【請求項７】ｐＨ−測定電極（５６）および／または
制御電極（５７）が、液体と接触する少なくとも一種の
金属酸化物からなる酸化物層（６６）を備えていること
を特徴とする請求項４から６までのいずれか一つに記載
の装置。
【請求項８】酸化物層（６６）が、イリジウム、パラ
ジウム、ジルコニウム、ニオブ、タンタル、レニウム、
白金から成る群の少なくとも一種の金属の少なくとも一
種の酸化物を有することを特徴とする請求項７に記載の
装置。
【請求項９】酸化物層が、単結晶である請求項８に記
載の装置。
【請求項１０】支持体（５３）が、これと結合されて
いる少なくとも一つの他の支持体部分（７１，７３）と
共に上記の電極（５６，５７，５８，５９）に境を接す
る空域（７５）を区画しており、この空域が特に周囲に
対して密閉されていることを特徴とする請求項４から９
までのいずれか一つに記載の装置。
【請求項１１】電気的な回路手段が、測定時間の間所
定の電流を形成する電荷量を測定するように構成されて
いることを特徴とする請求項２から１０までのいずれか
一つに記載の装置。