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JP2633881B2 - 免疫調節組成物及びそれらの使用 - Google Patents

免疫調節組成物及びそれらの使用

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JP2633881B2
JP2633881B2 JP62504476A JP50447687A JP2633881B2 JP 2633881 B2 JP2633881 B2 JP 2633881B2 JP 62504476 A JP62504476 A JP 62504476A JP 50447687 A JP50447687 A JP 50447687A JP 2633881 B2 JP2633881 B2 JP 2633881B2
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JP
Japan
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cells
antigen
peptide
cell
molecule
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JP62504476A
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English (en)
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エル． ゲフター，マルカム
ギレット，ジーン‐ジェラード
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Massachusetts Institute of Technology
Original Assignee
Massachusetts Institute of Technology
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27360777&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2633881(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
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Publication of JPH01500595A publication Critical patent/JPH01500595A/ja
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Publication of JP2633881B2 publication Critical patent/JP2633881B2/ja
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Description

【発明の詳細な説明】 序説 技術分野 免疫学における方法及び組成物に関し、ここで免疫系
は、特定の移植抗原及びＴ細胞に対して活性化又は不活
性化され得る。その方法及び組成物は、予防接種，器官
移植，自己免疫疾患，病原感染，及び免疫系を含む他の
健康状態の情況を含む。
発明の背景 脊椎動物は、広範囲の種類の障害，ウィルス及びウィ
ルス性微生物、たとえば細菌及び菌類による悪性、遺伝
的疾患、悪性及び種々の毒素の効果に対して自身を保護
するために複雑なシステムを発育して来た。そのシステ
ムは、非自己とは異なるような自己を認識する能力に基
ずいて進化して来た。広範囲の種類の防御機構は、食作
用、溶菌（たとえば補体介在又はペルホリン介在の），
キラーＴ細胞、たとえば細胞障害−Ｔ−リンパ球，天然
のキラー細胞、抗体依存性細胞障害細胞及び同様のもの
を含む。種々のタイプの細胞が異なった機構を有し、そ
れによって侵入物又は内因性疾患細胞が除去され得る。
免疫防御機構のキイーは、Ｔ−細胞である。Ｔ−細胞
は、それらがそれらの天然の宿主に関連する１又は少数
の特異的移植抗原に対する抗原に応答することに制限さ
れることが見出された。イン ビトロで、１つのハプロ
タイプの宿主からのＴ−細胞は、異なったハプロタイプ
の宿主の移植抗原に対する抗原に応答する。そのＴ−細
胞レセプターのレパートリーはＢ−細胞免疫グロブリン
のレパートリーよりも狭いように思われる。さらに、抗
原に直接的に結合するよりもむしろ、そのＴ−細胞レセ
プターは、抗原エピトープ及び移植抗原に対する同時結
合を必要とするように思われる。
移植抗原は２種のクラス、すなわちクラスＩおよびク
ラスIIに分割され、ここでクラスＩの抗原は宿主細胞上
に比較的遍在し、ところがクラスIIの抗原はリンパ球、
マクロファージ及び樹枝状細胞に比較的限定される。異
なったＴ−細胞が、１つの又は他のクラスの移植抗原に
対して活性化されるように思われる。主に、Ｔ−細胞の
活性の性質は、移植抗原（Ｔ−細胞はその抗原に対して
相補的である）のクラスと共に変化するであろう。
実際に、Ｔ−細胞クローンは特異的抗原及び特異的移
植抗原の対立遺伝子を認識すると思われる。さらに、抗
原の配列における変化は、Ｔ−細胞、抗原及び抗原を付
与する細胞が一緒に培養される場合、その応答の性質に
影響を及ぼす。変化の性質に依存して、すべての３種の
可能性、すなわち不変化、増強された刺激又は減じられ
た刺激が見出される。
前記の観点から、イン ビボ及びイン ビトロで免疫
応答を調整することができることが実質的な興味の対象
であり、ここでその１つが特定の免疫応答の刺激又は不
活性化を提供する。この態様において、特定の出来事に
対する自然の応答は、防御応答を高めるために特定のリ
ンパ球を刺激することによって、又は免疫応答を減じ又
は防ぐために特定のリンパ球を不活性化することによっ
て調節され得る。防御の源として免疫システムを用いる
ことによって、医学及び疫病へのより全体的なアプロー
チが達成され得る。
関連文献 Ｔ−細胞の制限及び免疫システムが理解されて来た異
常な前進及び速度を示すレビュウ文献は、Berzofski,Th
e Year in Immunology（1986）2:28〜38;Schwartz,Ann.
Rev.Immunol.（1985）3:237〜261;Shastriなど.,J.Exp.
Med.（1986）164:882〜896によって示される。また、Sh
astriなど．前記（1985）162:332〜345;Unanue及びAlle
n,Science（1987）236:551〜557;Guilletなど.,Science
（1987）235:865〜870（これは、本出願に記載の研究の
一部を開示する）も参照のこと。
ペプチド相同体に関する興味およびIa遺伝子生成物間
の相互作用、抗原フラグメント及びＴ−細胞レセプター
の理解に関する対象の文献は、Delisi及びBerzofsky,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA（1985）82:7048〜7052;Wattsな
ど.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1985）82:5480〜5484;Sc
hwartsなど.,J.Immunol.（1985）135:2957〜2607;Babbi
ttなど.,Nature（1985）317:359〜361;Gammondなど.,Na
ture（1986）319:413〜415;Babbittなど.,Proc,Natl.Ac
ad.Sci.USA（1986）83:4509〜4513;Wattsなど.,Nature
（1986）320:179〜181;Finneganなど.,J.Exp.Med.（198
6）164:897〜910;Lechlerなど.,J.Exp.Med.（1986）16
3:678〜696;Ashwell及びSchwartz,Nature（1986）320:1
76〜179;Townsendなど.,Cell（1986）44:959〜968;Shim
onkevitzなど.,J.Immunol.（1984）133:2067〜2074;Ber
kaverなど.,J.Immunol.（1986）136:2498〜2503;Bastin
など.,J.Exp.Med.（1987）165:1508〜1523;及びHirayam
aなど.,Nature（1987）327:426〜430に見出される。
他の興味ある文献として、Rock及びBenacerraf,J.Ex
p.Med.（1984）160:1824〜1829;Rock及びBenacerraf,前
記（1983）157:1618〜1634;Raoなど.,Cell（1984）36:8
89〜895;Berkowerなど.,J.Immunol.（1984）132:1320〜
1378;Ashwellなど.,前記（1986）136:389〜395;Mengle
−Gaw及びMcDevitt,Pro.Nattl.Acad,Sci.USA（1983）8
0:762〜765;Werdelin,J.Immunol.（1982）129:1883〜18
91;Choiなど.,Science（1983）222:283〜286;Lakeyな
ど.,Eur.J.Immunol.（1986）16:721〜727;Marx,Science
（1987）235:843〜844;Kaiser及びKezdy,Science,（198
4）223:249〜254を挙げることができる。
また、アメリカ特許第4,599,230号及び第4,469,677号
も参照のこと。他の興味ある特許として、アメリカ特許
第4,473,555号；第4,478,823号；及び4,565,696号を挙
げることができる。
発明の要約 １又はそれよりも多くの移植抗原によって制限され
た、強められた親和性の免疫系のための隣接性の及び／
又は非隣接性のアミノ酸配列を定義されたオリゴペプチ
ドを含んで成る方法及び組成物が提供される。リンパ系
が１又はそれよりも多くの抗原と接触される場合、免疫
応答を調節するために使用され得るオリゴぺプチドが調
製される。使用される組成物は、単一のオリゴペプチド
又はオリゴペプチドの混合物を有し、その結果、単一の
組成物は、多くのハプロタイプを有する１又はそれより
も多くの細胞系と共に使用され得る。高められた親和性
のアミノ酸配列を定義するための方法がまた提供され
る。
図面の簡単な説明 第１図は、移植抗原のドメインに関連する、外部レセ
プター及び内部リガンドから成る内部相補性の図による
説明である。
第２図は、関連するペプチドによるＴ−細胞ハイブリ
ドーマ7B7.3の活性の阻害の図による説明である。活性
は、培地（RPMI 1640）のみ（●−●）における又は20
μＭ（□−□）もしくは60μＭ（○−○）でのP12−24
の存在下における、種々の濃度のP15−26の存在下で測
定された。A20 Ｂ−細胞リンパ腫（５×104個の細胞／
ウェル）が抗原存在性細胞として使用された。24時間の
培養の後、50μｌの上清液を収穫し、そしてIL−２依存
性CTL−１細胞系（104個の細胞／ウェル）中への〔3H〕
チミジンの導入の後、IL−２濃度について検定した。そ
れらの値は、非経験的に行なわれた実験から取られた三
回のサンプルの相加平均を表わす。
第３図は、鶏のオボアルブミン（Ova）又はスタフィ
ロコッカス ヌクレアーゼ（Nase）によるＴ−細胞ハイ
ブリドーマ7B7.3の活性の阻害の図による説明である。
活性は、培値（RPMI 1640）のみ（●−●）における又
は30μＭのOva（P324−336）（□−□）もしくは60μＭ
のNase（P61−81）（○−○）における、種々の濃度のP
15−26の存在下で測定された。それらの値は、第１図に
説明されたように三回のサンプルの相加平均を表わす。
第４図は、培地のみ（□−□）において、インフルエ
ンザ赤血球凝集素P111−120（▲−▲）又はP12−26（○
−○）もしくはインフルエンザが赤血球凝集素部位２
（P126−138）（●−●）（そぞれ50μＭでの）の存在
において、種々の濃度のオボアルブミン（P324−336）
及びA20を示す細胞と共に培養される場合、DO−11.10 T
−細胞ハイブリドーマの阻害の図による説明である。与
えられたそれらの値は、第１図に説明されたように三回
のサンプルの相加平均を表わす。
第５図は、Ｉ−EdクラスII分子によって制限されたペプ
チドのアミノ酸配列を示す。ミオグロビン（P135−14
7）がＩ−Ed-により制限されたＴ−細胞クローンによっ
て認識される。スタフィロコッカスアウレウス（Stephy
loccoccus aureus）からのヌクレアーゼ（P66−78）
は、Ｈ−Zdにより制限されたＴ−細胞クローンによて認
識される。λリプレッサーからのcIタンパク質（P12−2
4）,I−EB d配列（69−81）,I−EB K配列（69−81）が存
在する。インフルエンザウィルスからの赤血球凝集素
は、Ｉ−Edにより制限されたＴ−細胞ハイブリドーマに
よって認識される。次にＩ−EB d配列（28−36）及びＩ
−EB K配列（28−36）が存在する。
括弧内の数字は、免疫原又はIa分子のいづれかにおけ
るアミノ酸残基の位置を表わす。括弧内のLeuは、赤血
球凝集素からのペプチド111〜120の最初の位置でのロイ
シン及びフェニルアラニンが赤血球凝集素−特異性Ｉ−
Ed−制限のＴ−細胞クローンの刺激のために対応するこ
とを意味する。下線をほどこされた残基は、抗原とＩ−
EB dタンパク質領域との同一性を示す。
第６図は、オボアルブミン及びミオグロビンの一部の
アミノ酸配列とクラスII抗原のアミノ酸配列との比較を
示す。オボアルブミン（P326−339）は、DO−11.10によ
って認識される。Ｉ−AB d配列（42−55）。ミオグロビ
ン（P102−118）。括弧内の数字は、天然の分子におけ
るアミノ酸残基の位置を表わす。
第７図は、Ｉ−AdクラスII分子によって制限された５
種のペプチドのアミノ酸配列、すなわちミオグロビン
（P106〜118）；オボアルブミン（P323〜336）；λリプ
レッサーcI（P12−26）；スタフィロコッカス アウレ
ウスからのヌクレアーゼ（P66−80）及びブタクサ類の
アレルゲン（P54−65）を示す。括弧内の数字は免疫系
分子内のアミノ酸残基の位置を表わす。ダッシュは、上
記ペプチドに相当する位置での欠失を表す。
第８図は、Ｉ−EKクラスII分子によって制限された４
種のペプチドのアミノ配列、すなわち蛾シトクロームｃ
（P95−103）；スタフィロコッカス アウレウスからの
ヌクレアーゼ（P87−97）；λリプレッサーからのcIタ
ンパク質（P18−26）及びニワトリ卵白リゾチーム（P88
−96）を示す。括弧内の数は、免疫原分子内のアミノ酸
残基の位置を表わす。
特定の態様の記載 新規オリゴペプチド及びハプテン又は抗原に通常関連
するエピトープに対するリンパ系の免疫応答を調節する
ことにおけるそれらの使用が提供される。そのオリゴペ
プチドは、エピトープと免疫学的に交差反応する対象の
免疫原と比較して、１又はそれよりも多くの移植抗原の
ためにより高い親和性を有するように構築されている。
そのオリゴペプチド配列は、フラグメント又は完全なポ
リペプチドの一部として天然に存在するポリペプチド、
又は組換技法又は化学合成によって調製された合成ポリ
ペプチドのフラグメントである。
エピトープに関しては、そのエピトープは、レセプタ
ー、特に免疫グロブリン及びＴ−細胞レセプターによる
認識の基本要素又は最小の単位であり、ここでその配列
は隣接することができ、又は隣接しなくてもよく、そし
て前記レセプターの認識に対して不可欠なアミノ酸がそ
の配列において隣接していても良くそして／又は隣接し
てなくても良い。
本発明に使用されるポリペプチド試薬は１〜２個の領
域を有するであろう。最初の領域は、目的の移植抗原に
対して高められた結合性を提供するアミノ酸配列を有す
るオリゴペプチドを含有するであろう。その移植抗原に
結合するアミノ酸配列は“アグレトープ（agretope）”
として言及されるであろう。そのアグレトープは、１又
は限定された数の移植抗原に特異的に結合する認識の単
一の単位である。そのアグレトープは、しばしば分離さ
れた個々のアミノ酸残基を有する、一組のアグレトープ
アミノ酸残基によって定義される。そのアグレトープ性
残基間に散在されているアミノ酸は、それら自体によっ
て又は１又はそれよりも多くのアグレトープ残基と共に
エピトープ認識を提供することができる。アミノ酸配列
は、１又はそれよりも多くの異なった認識の単位を有
し、その結果、オリゴペプチド上に存在するアグレトー
プに関しては、多くの組のアグレトープアミノ酸単位が
存在し、ここで少ない出来事ではあるが、同じ組でさ
え、隣接するアミノ酸に依存して、その結合親和性にお
いて異なることが理解されるべきである。アグレトープ
アミノ酸を分離する散在アミノ酸は、どのＴ−細胞レセ
プターがアグレトープ含有性オリゴペプチド及び移植抗
原の複合体に結合するかに関して選択される。その散在
されたアミノ酸は“エピトープ,"（エピトープ，すなわ
ちそのアミノ酸が多くの認識部位を定義することができ
る）として言及されるが、しかし本発明の性質の観点か
ら、“第１エピトープ”として言及されるであろう。エ
ピトープを定義するこの散在された配列は、特定の免疫
原に対する免疫応答を増強するか又は減じるかいずれか
に依存して、特定のサブセットのＴ−細胞を活性化し、
又は特定のサブセットのＴ−細胞の活性化を妨げるため
に選択され得る。アグレトープ及び第１エピトープを含
むオリゴペプチドは、前記第１エピトープによって結合
された同じＴ−細胞レセプターを結合することができる
か又は結合することができ得ない第２エピトープとして
考えられ得る目的の抗体配列に結合され得る。
しかしながら、目的の移植抗原のためのアグレトープ
の高められた親和性のおかげで、高められた免疫応答が
目的の抗体配列に対して得られるであろう。種々の組成
物を用いることにより上記のようにして変性された、リ
ンパ球システムの免疫応答は、１又はそれよりも多くの
特定の免疫原に不活性化又は活性化されることによっ
て、調節され得る。
調節される免疫応答は、３組の複合体、たとえば移植
抗原を有する細胞、前記移植抗原により制限されるＴ−
細胞レセプター及び移植抗原及びＴ−細胞レセプターの
組合せに特異的に結合するポリペプチドに基づいて予測
される。移植抗原は２種のクラス、すなわちクラスＩ及
びクラスIIに分けられ得る。クラスＩは、哺乳宿主のほ
とんどの細胞上に遍在し、そして見出され、そして多型
性α−鎖及び保護されたβ−鎖を有する。対照的に、ク
ラスIIの移植抗原は、比較的少ない組の細胞、主として
リンパ球マクロファージに制限され、そして多型性α−
及びβ−鎖を有する。クラスＩの移植抗原の場合、それ
は、細胞異常又は疾患状態、たとえばウィルス感染、マ
イコプラズマ感染、新形成又は同様のもの、もしくは器
官移植に主に関係する。関与されるＴ−細胞は通常、異
常細胞の破壊を引き起こすであろう。
対照的に、クラスIIの移植抗原は細胞免疫系の活性化
に関与し、異常な生理学的状態に対する宿主の保護に関
与される細胞の拡張をもたらす。その異常な生理学的状
態は、病原菌、たとえばウィルス、細菌、菌類、原生生
物、毒素又は同様のものの侵入に関与される。さらに、
そのクラスII細胞は、種々の自己免疫疾患、たとえばリ
ウマチ様関節炎、局部的な円板状紅斑性狼瘡，糖尿病、
等、並びにクラスＩの移植抗原に関係する細胞異常又は
疾患状態に関与される。
クラスＩの移植抗原はまた、器官移植の拒絶にも関与
される。その免疫系は、移植された器官上に存在する移
植抗原の外来性性質を認識することができ、そしてその
器官を攻撃することができる。この場合、外来性細胞か
らの宿主の保護は所望されないが、しかしむしろ、器官
移植を攻撃するために特異的である免疫系のサブセット
を減じることが所望される。
多くの場合、イン ビトロでリンパ球応答を調節する
ことにもまた興味が存在するであろう。これらの情況
は、マイコプラズマ又はウィルスにより感染された細胞
を特異的に破壊し、腫瘍性及び正常な細胞の混合物から
特定のサブセットの細胞を除去し、その混合物中に特定
のサブセットの細胞を拡張し、種々のリンホカイン、た
とえばIL−２の産生のためにならし培地を提供し、又は
同様のことを含むことができる。イン ビトロシステム
は、完全な血液、血漿、血清、細胞画分、正常な又は不
滅化された細胞、等を含むことができる。
オリゴペプチドが定義される態様は、移植抗原の配
列、多型性領域及び移植抗原によって制限された免疫原
に関係される。移植抗原の配列は、移植抗原によって制
限される抗原の免疫優性配列の間に相同関係を有するこ
とによって定義され得、ここで移植抗原の多型性領域が
含まれても良く又は含まれなくても良い。（免疫優性配
列の討論のためには、たとえばBerzofsky,（1986）前記
及び本明細書に引用された参考文献を参照のこと）。
移植抗原は、多型性領域を有し、ここで個々の対立遺
伝子が特定の宿主に関連している。大部分、宿主は二倍
体及びヘテロ接合性であり、その結果それぞれの宿主は
２種のハプロタイプを有し、こでそれらは、宿主が特定
の遺伝子座で、ホモ接合性でない場合、その同じ遺伝子
座から特定の移植抗原型の２種の異なったコピーが存在
するであろうことを意味する。
免疫優性配列の相同関係は、その相同関係の比較を可
能にする他のアルゴリズムも使用され得るけれども、FA
STPアルゴリズムを用いて比較することができる。FASTP
の説明に関しては、Lipman及びPearson,Science（198
5）227:1435〜1441を参照のこと。その免疫優性配列
は、所望の相同関係を提供するために、欠失又は挿入の
配列におけるアミノ酸の数に基づいて、約30％又はそれ
以上、及び全体の20％まで、通常約15％よりも多くない
相同関係を有すべきである。すなわち、最良の相同関係
を提供するために、まず非保存性置換、次に欠失及び挿
入を計算する。所望により、相同関係は、保存性置換よ
りむしろ同一性を含むであろう。通常、挿入又は欠失に
関与されるアミノ酸は合計２個よりも多くなく、そして
挿入又は欠失、通常欠失において約１個よりも多くない
であろう。
次の表は、保存性置換を示し、ここで同じ線上のアミ
ノ酸は、同じ線上の他のアミノ酸により置換され得る。
アミノ酸 脂肪族 非極性 G,A,（Ｐ） V,L,I 極性 中性 C,M,S,T N,Q 酸性 D,E 塩基性 K,L,（Ｈ） 芳香族 F,W,Y,（Ｈ） プロリン（Ｐ）は、等価物と思われるが、しかし同じ
線上の他のアミノ酸と通常、置換されないであろう。同
様に、ヒスチジン（Ｈ）は同じ線上の他のアミノ酸によ
り置換され得るが、しかし通常、等価物とは思われない
であろう。さらに、いくらかの場合、酸性、塩基性及び
極性のアミノ酸（N,Q）は相同関係を決定することにお
いて、１つを他のものと置換することができる。
通常、少なくとも２個の免疫優性配列がアグレトープ
のためのコンセンサス配列の決定に関与し、より普通に
は３個〜約８個の配列で十分であるべきであり、通常３
〜６個の配列で十分であろう。その免疫優性配列は多く
の方法により同定され得る。特に、移植抗原によって制
限されたタンパク質は、多くの配列に分離され得、そし
てこれらの配列は合成され、そして次にアッセイに使用
され得、ここで特定の移植抗原を含む細胞及び該移植抗
原によって制限されそして特定の抗原に対して特異的な
Ｔ−細胞が混合される。（アッセイのための実験部分を
参照のこと。）IL−２（インターロイキン−２）の分泌
のレベルを決定することによって、免疫優性である配列
を決定することができる。いくらかの抗原においては、
１以上の免疫優性配列が存在し得るけれども、普通、単
一の免疫優性配列が存在するであろう。しかしながら、
１以上の配列が存在する場合、それらの両配列は、特定
の移植抗原への結合親和性を能率的にするためのコンセ
ンサス配列を定義することに使用され得る。
普通、７個よりも多くないアグレトープに関与するア
ミノ酸、より普通には５個よりも多くないアグレトープ
を定義するアミノ酸、通常少なくとも２個、より普通に
は少なくとも３個のアミノ酸が存在するであろう。それ
らのアミノ酸は、タンデムに存在し、又は１〜４個のア
ミノ酸、普通２〜４個のアミノ酸によって分離され得
る。相同関係、特に同一性、すなわち所望により少なく
とも２個のアミノ酸の同一性、より所望には少なくとも
３個のアミノ酸の同一性及びコンセンサス配列の間隔を
比較することによって、そのコンセンサス配列の決定の
ために使用される、１又はそれよりも多くの、普通すべ
ての抗原よりも移植抗原に関してより高い親和性を有す
るであろう配列を定義することができる。従って、相同
関係を有するアミノ酸は、タンデムな相同関係が生じる
けれども、任意の２種のアミノ酸の間で、１〜4,4〜８
又は６〜12個のアミノ酸、普通２〜３又は４〜９個のア
ミノ酸だけ離れて存在する。コンセンサス配列が定義さ
れた後、アグレトープ及び第１エピトープを含む免疫優
性領域を定義するために、特定の移植抗原によって制限
されたいづれかの抗原を走査することができる。次に、
その配列に関する情報がリンパ球システムの免疫調節の
ために使用され得る。
アグレトープ及びエピトープ（オリゴ−ａ−ｅ）を含
むオリゴペプチドは通常、それが結合する移植抗原の多
型性領域に存在する配列と異なるであろう。移植抗原の
レセプターに対して内部リガンドとして作用する多型性
領域に配列が存在することが見出される。従って、この
領域は、多くの場合、移植抗原によって制限された免疫
優性領域に対してある相同関係を有するであろう。しか
しながら、前記内部リガンドは、コンセンサス配列とい
くらかの程度の相同関係を共有するけれども、通常、コ
ンセンサス配列と相当に異なるであろう。移植抗原の内
部リガンド配列に対して同一の配列を有するオリゴ−ａ
−ｅを使用することによって、Ｔ−細胞応答を実質的に
阻害することができる。その効果は、オリゴ−ａ−ｅが
自己として認識されているかのようであり、そして三成
分複合体は形成されず、又は形成される場合、Ｔ−細胞
は活性化されない。
多くの抗原が文献に記載されて来た。ここで特定の配
列が、特定の病原菌又は毒素に対する宿主の保護のため
に抗体の産生に有用なものであるとして記載されて来
た。これらの組成物は、大部分、約5KDよりも短かく、
通常約3KDよりも短かく、その結果、それらは通常ハプ
テンと思われる。これらの配列は、抗体目標配列として
使用され得、そしてオリゴ−ａ−ｅに連結され得る。そ
の得られた分子は、新規ポリペプチドを形成するために
２種のドメインを有し、ここでそれぞれのドメインは全
体の分子の約70％よりも短く、普通オリゴ−ａ−ｅアグ
レトープ含有性ドメインは約30〜70％であり、そして抗
体目標配列のドメインは約10〜60％である。
大部分、オリゴ−ａ−ｅアグレトープ含有性ドメイン
は、約８〜30個のアミノ酸、より普通には約８〜20個の
アミノ酸を有し、そして抗体目標配列は約５〜25個のア
ミノ酸、より普通には約５〜20個のアミノ酸を有するで
あろう。
アグレトープ含有性ドメインは、種々の方法で選択さ
れ得る。１つは一般的なオリゴ−ａ−ｅを使用すること
ができ、ここで第１エピトープがまた種々の方法で選択
され得る。第１エピトープが、それと共に使用されるで
あろう大部分の宿主における移植多型性領域と同一でな
いことを確めながら、第１エピトープを任意に選択する
ことができる。他方、それは、無害性エピトープ、たと
えばすでに示された、破傷風トキソイド、キーホールリ
ンペット（貝類）のヘモシアニン、ウシγ−グロブリ
ン、BCG、ヒトγ−グロブリン又は細胞内在性タンパク
質、特に関連するエピトープ部位を有するように選択さ
れる。最後に、それが、抗体目標配列を使用するための
目的といくらかの関係を共有する対象のエピトープを有
することができ、たとえばその第１エピトープは、抗体
目標配列とは異なるが、但し、抗体目標配列の抗原と同
じ抗原、又はその抗原に関連する異なった抗原上に存在
するエピトープであることができる。たとえば、ウィル
スの場合、第１エピトープ及び抗体目標配列は同じか又
は異なったカプシドタンパク質，エンベロープタンパク
質、特上に存在することができる。特定の抗体目標配列
は、病原性微生物、たとえば細菌及びウィルスの中和性
抗体目標配列（エピトープ）を含む。
免疫優性領域を定義し、そして異種配列（すなわち、
それらが正常に連結される天然の配列以外の配列）に結
合されない、本発明に使用されるオリゴペプチドは、シ
トクロムc,オホアルブミン、ミオグロビン、スタフィロ
コッカス アウレウスからのヌクレアーゼ、リゾチー
ム,1,2及び３個のアミノ酸の反復配列、インフルエンザ
赤血球凝集素，天然に存在する、約20個よりも少ないア
ミノ酸のホルモン、たとえばオキシトシン，ブラジキニ
ン及びアンギオテンシン，ヘルペス糖タンパク質d,イン
シュリン，特定のウシインシュリンＢ−鎖，ネズミのミ
エリン塩基性タンパク質，ブタクサのアレルゲンRa3,ヒ
トAChレセプター−γVP1口蹄ウィルス，アンジオテンシ
ン2,フィブリノペプチドＢ−14,最小刺激性ポリマー,HL
A,CW3,ミエリン塩基性タンパク質，特定のウサギ及びテ
ンジクネズミ，狂犬病糖タンパク質，インフルエンザマ
トリックスタンパク質，結核菌65Kdタンパク質又は本出
願の有効な提出日の前、調製された他のジゴペプチドを
含まないであろう。
すでに指摘されたように、アグレトープは通常、対象
の抗原よりも移植抗原に対してより強い結合親和性を有
し、その結果そのオリゴ−ａ−ｅは、三成分複合体を形
成することにおいて対象の抗原とうまく競争することが
できる。そのオリゴ−ａ−ｅ配列は、完全な配列の分子
又はより大きなペプチドの一部に過ぎないかも知れな
い。そのオリゴ−ａ−ｅは、第２エピトープに種々の方
法で連結され得る。
イン ビボ目的に関しては、宿主が暴露される対象の
目標抗原が存在するであろう。たとえば、クローズマッ
チが器官移植の供与者と受領者との間に作られる場合、
強い免疫応答をもたらすことができる，器官上に存在す
るわずかな抗原性配列又はエピトープが存在する。本発
明によれば、１つは、宿主による拒絶応答を減じるため
に、そのような抗原の免疫優性領域に応答するＴ−細胞
を阻害することができる。もう１つの場合、個人が、寄
生病が流行している地域に入る場合、その個人は、細胞
及び体液の保護を得るために、その寄生抗原と交差反応
する、１又はそれよりも多くの抗体目標配列を有するオ
リゴペプチドにより予防接種を受けるであろう。これら
の及び多くの他の情況が本発明によって取り扱われるで
あろう。異なった情況のためにオリゴペプチドを調製す
ることにおいては、種々の方法が使用されるであろう。
１つの組成物は、宿主中に存在する１又はそれよりも
多くの移植抗原に対して対象の抗原の親和性を高めるた
めに、免疫優性部位で突然変異化された対象の抗原を有
するであろう。特に、Ｂ−細胞及びクラスII移植抗原に
関しては、対象の免疫原の種々のエピトープがリンパ球
システムに存在するＢ−細胞の表面免疫グロブリンに結
合し、それによってその免疫優性配列は移植抗原に結合
し、そして特定の免疫優性配列を認識するＴ−細胞に付
与されるであろう。高い結合親和性のために、高められ
た免疫応答が達成されるであろう。突然変異化された免
疫原を使用することによって、多くのＢ−細胞が、特定
の免疫優性領域を認識するＴ−細胞レセプターを有する
Ｔ−細胞と一緒に活性化され得る。
他方、突然変異化された領域を単独で使用することが
でき、それによって特定のＴ−細胞と共に免疫優性領域
に結合する少々のＢ−細胞のみが活性化されるであろ
う。もう１つの方法は、免疫優性領域が直接的には又は
普通約50個以下のアミノ酸、より普通には約30個以下の
アミノ酸を有する架橋を通して連結され得る抗原上に存
在する１又はそれよりも多くのエピトープ部位を選択す
ることである。この態様においては、単一の融合タンパ
ク質が得られ、ここで免疫優性領域が１又はそれよりも
多くの対象のエピトープ部位に融合される。
融合タンパク質を有するよりもむしろ、対象のペプチ
ドに免疫優性領域を結合することによってその免疫優性
領域を連結することができる。その結合は、種々の形を
取ることができ、その特定の態様の結合は臨界ではな
い。従って、オリゴペプチドの末端又は他の部位で存在
すべきシステインを提供することができ、ここで対象の
抗原がマレイミド基により官能化され得る。システイン
により変性された免疫優性配列とその官能化された抗原
とを組合わせることによって、チオエチル結合が得られ
る。適切ならば、免疫優性配列上に存在するカルボキシ
ル基が、カルボジイミドを用いて、又は活性エステル、
たとえばp−ニトロフェニルエステルを形成して活性化
され、ここでオリゴペプチド上に存在するいづれか利用
できるアミノ基がブロックされる。オリゴペプチドと対
象の抗原とが反応し、ペプチド結合を形成した後、その
ブロッキング基が除去され得る。Fieser及びFieser,Rea
gents for Organic Synthesis,第３巻,Wiley−Intersci
ence,NY,1972により記載されているような他の技法もま
た、使用され得る。
免疫優性領域は、オリゴ−ａ−ｅを提供するために、
アグレトープに関してのみならず、また第１エピトープ
に関しても変性され得る。従って、免疫優性領域を認識
するであろうＴ−細胞レセプターを変性することがで
き、その結果その免疫優性領域は、１以上のＴ−細胞に
よって、又は野生型の免疫優性領域を認識するＴ−細胞
と異なるＴ−細胞によって認識され得る。特に、免疫優
性領域が抗体目標配列に連結される場合、いづれかのＴ
−細胞応答を最少にし、又は実質的に免疫学的非反応性
エピトープに対してＴ−細胞応答を提供するために、ア
グレトープの変性が所望される。
この情況においては、第１エピトープは、ワクチン、
たとえば破傷風トキシド又は前に記載されたような他の
比較的無毒の抗原のエピトープをまねるために変性され
得る。他方、活性化されるＴ−細胞レセプターが存在し
ない配列にその第１エピトープを変性することができ
る。これは、特定のエピトープが結合するために非相同
性のＴ−細胞レセプターを見出す、“レパートリーにお
けるホール（hole in the repertoire）”であると思わ
れる。自己エピトープをまねるそれらのエピトープは、
この特性及び特定のハプロタイプに発見されるであろう
他のエピトープを提供するであろうことが予期される。
所望の結果に依存して、アグレトープの種々の組合せ、
すなわち第１エピトープ及び抗体目標配列が、Ｂ−細胞
及び／又はＴ−細胞の特定のサブセットを活性化又は不
活性化するために使用され得る。従って、特定の目的へ
の調節のために、Ｔ−又はＢ−細胞の単一のサブセット
又はＴ−又はＢ−細胞のいづれか又は両者のサブセット
の群を選択的に選択することができる。
たとえば、特定のエピトープに対して特異的なＢ−細
胞の特定のサブセットの不活性化が所望される場合、２
種の領域を有するポリペプチドが調製されるであろう。
１つの領域（すなわち抗体目標配列）は、対象のエピト
ープをまねるアミノ酸配列を含むであろう。他の領域
は、たとえば、対象の宿主の移植抗原の多型領域の配列
に対して同一の配列を結合するＴ−細胞レセプターを付
与しないであろうオリゴ−ａ−ｅであろう。この場合、
その得られたポリペプチドは、活性化をブロックする条
件下で第２エピトープを認識し、そしてＴ−細胞レセプ
ターに付与されるこれらのＢ−細胞によて結合されるで
あろう。さらに、その抗体目標配列は、移植抗原へのエ
ピトープの親和性を最少にするために選択されるであろ
う。この場合、Ｔ−細胞は、移植抗原へのポリペプチド
の結合により活性化されず、その結果、そのポリペプチ
ドを認識するこれらのＢ−細胞はＴ−細胞によって刺激
されないまま残るであろう。Ｂ−細胞のＴ−細胞刺激を
ブロックしたい場合、オリゴ−ａ−ｅを非活性化するＴ
−細胞が使用され得る。
Ｔ−細胞の特定のサブセットを刺激したい場合、クラ
スII移植抗原に対して特異的なアグレトープを使用する
ことができる。この場合、第１エピトープは、対象のＴ
−細胞の特定のサブセットに向けられるように選択され
る。この態様においては、たとえば悪性条件の場合、自
己免疫疾患の場合、又は同様の場合におけるように、特
定の抗原に向けられるＴ−細胞集団を構築することがで
きる。
Ｂ−及びＴ−細胞の両者を刺激するためには、対象の
抗原に対して特異的なエピトープを有するオリゴ−ａ−
ｅを使用することができる。さらに、その同じ又は関連
抗原の他のエピトープに連結されるオリゴ−ａ−ｅを使
用することもでき、その結果多くのＢ−細胞が刺激さ
れ、ここでは異なったサブセットのＢ−細胞が異なった
エピトープ部位に対して特異的である。この刺激は多く
の異なった情況に適用されるであろう。さらに、多くの
オリゴ−ａ−ｅを有するオリゴペプチド又はタンパク質
を調製することができ、その結果、その同じ分子は多く
の移植抗原に対して効果的であろう。
たとえば、ワクチンの調製においては、特定の病原
菌、たとえばウィルス又は細菌のために異なった菌株の
エピトープが提供され、その結果それらの異なった菌株
のすべてを認識するＢ−細胞が、単一の分子によって同
時に刺激されるであろう。多くの生物体、たとえば妊娠
女性に対するTORCHシリーズ（トキソプラスマ症，風
疹，サイトメガロウィルス及び単純ヘルペスウィルス）
に対して宿主を予防接種したい場合、別の分子のエピト
ープがまた提供され得る。従って、特に、一連の抗原が
関与されるこれらの情況において、その主方法論は、単
一の分子が異なった生物体に関連する多くのエピトープ
に対する免疫化及び結合されるべき多くの移植抗原を提
供することを可能にする。
普通、異なった抗体目標配列の数は、０〜20、より普
通には約０〜10、便利には約１〜６の範囲であろう。そ
の抗体目標配列のそれぞれは、少なくとも約５個、普通
８個のアミノ酸、及び約30個よりも多くなく、より普通
には約20個よりも多くないアミノ酸を有するであろう。
個々のエピトープの性質に依存して、エピトープは頭と
尾とを連結され得又は約１〜30個のアミノ酸、普通約１
〜20個のアミノ酸の架橋基によって分離され得る。その
架橋基は、便利な配列ではあるが、しかし普通、エピト
ープ配列の正しい結合により干渉を避けるために、そし
て宿主に対して有害であるエピトープに所望としない免
疫応答の創造を避けるために選択されるであろう。
本発明の組成物は、単一のポリペプチド又はポリペプ
チドの混合物、普通ポリペプチドの混合物である。一般
的に、ポリペプチドの数は約20を越えず、より普通には
約12を越えず、そして好ましくは約８を越えず、より好
ましくは約６を越えない。その混合物は普通、対象の集
団中に最っとも頻繁に見出される移植抗原に向けられる
であろう。すなわち、特定の移植抗原は、ある集団群、
たとえば種々の種類、たとえばヒト，他の霊長類，家
畜，実験動物，等、たとえば羊，豚，馬，鳥，等により
頻繁に存在する。最っとも一般的な移植抗原、すなわち
クラスＩ又はクラスIIのいづれか又は両者に結合するア
グレトープを適切に選択することによって、関与される
異なったポリペプチドの合計数を最少にする機会が存在
する。さらに、多くの場合、異なった移植抗原が、コン
センサス配列において特定のアミノ酸を共有することが
でき、その結果対象の抗原に関するより高く又は等価の
親和性が単一のオリゴ−ａ−ｅ又はコンセンサス配列を
有する多くの移植抗原により達成され得る。
大部分、ほとんどの宿主はヘテロ接合体であるので、
１以上の移植抗原の対立遺伝子の関与を所望する場合、
２種の移植抗原が実質的に類似するコンセンサス配列を
持ないなら、少なくとも２種の異なったコンセンサス配
列の分子及びヒトにおいては６種までのコンセンサス配
列の分子を有することが所望されるであろう。
本発明の組成物は、宿主への投与のために又はイン
ビトロでの使用のために種々の方法で配合され得る。そ
れらは、宿主への投与のためには、いづれかの便利な生
理学的に許容される媒体中に配合され得る。これらの媒
体は、水，食塩水，リン酸緩衝溶液，オイルエマルジョ
ン，等を含む。ある場合、錠剤、マイクロカプセル、た
とえば持効性のリポゾーム、ゲル、粉末、沈澱物、たと
えばミヨウバン、又は同様のものとして本発明のペプチ
ドを配合することが所望される。ある場合は、便利な投
与システム、たとえばカテーテル、一定の拡散膜、ポン
プ又は同様のものを用いることによって、宿主中に連続
した注入を提供することが所望される。これらの配合法
及び技法は当業界において良く知られている。投与はた
とえば血管内，腹膜内，皮下内に注射によって又は局所
的に皮内パッチ、等によって行なわれ得る。
本発明の組成物の量は、特定の目的、投与の方法、宿
主の性質、処理の持続期間、反復処理の頻度、及び同様
のものに依存して広く異なるであろう。従って、ほとん
どの場合、それぞれの組成物に関しては、使用される量
は実験的に決定されるであろう。しかしながら、宿主へ
のオリゴペプチドの投与に関しては、ある一般的な考慮
が行なわれる。オリゴペプチドは一般的に宿主のkg当り
約0.01〜10μｇの範囲であり、ここで濃度は一般的に約
10μg/ml〜1mg/mlの範囲であろう。他の添加物、たとえ
ば安定剤、抗生物質、賦形剤、アジュバント、吸着のた
めの沈澱物、持効性添加物、等が配合物に含まれ得る。
本発明のポリペプチドは便利な手段によって調製され
得る。普通、化学合成又は組換え技法が使用されるであ
ろう。大部分、本発明に使用されるポリペプチドは、20
0個よりも少ないアミノ酸、より普通には150個よりも少
ないアミノ酸、好ましくは約100個よりも少ないアミノ
酸及びより好ましくは約75個よりも少ないアミノ酸、一
般的には約８〜60個の範囲のアミノ酸を有するであろ
う。しかしながら、前に示したように、野生型又は天然
に存在するタンパク質が使用され、ここでその免疫優性
領域は移植抗原の親和性を変えるために突然変異化され
ている。
既知の技法に基づいて、本発明の組成物をコードする
遺伝子を合成することができる。
オリゴデオキシヌクレオチド一本鎖を合成するための
技法は十分に確立され、そしてその鎖は200個又はそれ
以上の塩基から得られる。鎖を適切にオーバーラップす
ることによって、大きな合成配列が調製され得る。他
方、利用できる抗原の免疫優性配列を突然変異化する場
合、種々の技法、たとえばイン ビトロ突然変異生成、
合成配列の制限及び挿入又は同様のものが突然変異を正
確に導びくために利用できる。突然変異が行なわれる特
定の方法は、本発明に臨界ではない。
遺伝子が得られた後、それは発現のために従来の技法
に従って使用され得る。相当な数の発現ベクターが商業
的には又は当業界で利用可能であり、そしてこれは本発
明に利点を与えることができる。それらのベクターによ
り形質転換された宿主は、宿主ゲノム中に安定した染色
体外維持又は組込みを提供することができる。便利な発
現宿主として、E．コリ（E.coli）B.サブチリス（B.sub
tilis），B.リケニホルミス（B.licheniformis），サッ
カロミセス（Saccharomyces），たとえばセレビシアエ
（cerevisiae），クルイベロミセス（kluyveromyce
s），たとえばラクチス（lactis）を挙げることができ
る。微生物、特に細菌及び菌類、たとえば酵母が好まし
いであろう。
所望により、それらの構成体は、分泌のために既知の
シグナルリーダーと一緒に調製され得る。シグナルリー
ダーは、酵母のα−因子，α−アミラーゼ，ペニシリナ
ーゼ，表面膜タンパク質，等を含む。そのプロセシング
シグナルを有するシグナルリーダーは、成熟に基づいて
シグナルリーダー及びプロセシングシグナルを失う、融
合前駆体を提供するために、遺伝子の５′末端で連結さ
れ得る。
一般的に遭遇される移植抗原である場合、本発明のヒ
ト移植抗原はクラスIIを含む:Figneroa及びKlein,Immun
ology Today（1986）7:78〜81及びここに引用された文
献を参照のこと；クラスＩに関しては、Klein及びFigne
roa前記.,（1986）7:41〜44及びここに引用された文献
を参照のこと。そのヒトクラスII抗原は、DP,DQ及びDR
に分けられ、ここでマウスＨ−LA（Ｉ−Ａ）がHLA−DQ
に対応し、そしてマウスＨ−LE（Ｉ−Ｅ）がDRに対応す
る。種々の移植抗原が種々の役割を示すことができる。
Hirayamaなど.,前記及びここに引用された文献によって
報告されたように、サプレッサーＴ−細胞（CD8+）がDQ
により制限され、そしてヘルパーＴ−細胞（CD4+）がDR
により制限されることが示唆される。この関係を用い
て、ヘルパー細胞又はサプレッサー細胞のいずれかが、
抗原のエピトープへの宿主の免疫応答の免疫調節を提供
するために刺激され得る。
第１エピトープ及び対象の抗体目標配列は、表面膜タ
ンパク質，エンベロープタンパク質，カプシドタンパク
質，腫瘍遺伝子，移植抗原，毒素，アレルゲン，炭化水
素，多糖類，等を含むであろう。ウィルス関連抗原は、
ヘルペス，肝炎,HIV,インフルエンザ,FeLV,ライノウィ
ルス及び他の病原性ウィルスのようなウィルスを含むで
あろう。単細胞病原菌に関連する抗原は、プラスモジウ
ム（Plasmodium），ヘモフィラス（Hemophilus），E.コ
リ，サルモネラ（Salmonella），トリパノゾーム（Trip
anosomes），プスードモナス（Pseudomones）及びトキ
ソプラズマ病及び他の病原性細菌並びに寄生体のような
生物体を含むであろう。腫瘍遺伝子に関連する抗原は、
ヒト,fas,mye,abl,ras,等のような腫瘍遺伝子を含むで
あろう。毒素に関連する抗原は、アフラトキシン、ジフ
テリア、ボツリヌス毒素、等のような毒素を含むであろ
う。対象の病原菌のリストは、アメリカ特許第3,996,34
5号に見出すことができる。
多数のエピトープが、広範囲の種類の対象の生物体の
ために定義されて来た。中和性抗体が向けられるエピト
ープに特別の興味が存在する。そのようなエピトープの
開示は、関連文献部分に引用された多くの文献に存在す
る。
種々のエピトープが、移植抗原の多型性領域に結合す
るためにコンセンサス配列を有する配列に連結され得
る。クラスII多型性ドメインβ−２及び３β−３可変領
域に関与する領域が特に興味の対象である。これらのド
メインにおいては、アミノ酸20〜40,及び65〜85、より
特定には２〜30及び68〜78が興味の対象である。従っ
て、本発明に従って調製される組成物は、コンセンサス
配列によって定義されたようなアグレトープに関連する
アミノ酸を含むことによって移植抗原のための配列の親
和性を増強する、少なくとも１つの突然変異を有するこ
とによってこれらの領域から異なるであろう。
例示のワクチンは、プラスモジウム（Plasmodium）寄
生体、特にファルシパラム（falciparum）に対する抗体
目標配列を含むワクチンである。テトラマー(N-A-N-P)n
〔ここでｎは少なくとも3,及び普通12よりも多くない〕
の少なくとも３個の反復単位を有する抗体目標配列が調
製される。このオリゴマーは、特に宿主ハプロタイプの
ために特異的親和性を有する１又はそれよりも多くのオ
リゴ−ａ−ｅに共有結合又は融合され得る。〔プラスモ
ジウムの説明に関しては、Lavale,など.,Sciencd（198
5）228:1436〜1440;Millerなど.,Science（1986）234:1
349〜1356を参照のこと。〕そのオリゴ−ａ−ｅは、そ
れぞれのハプロタイプに関して無害の第１エピトープ及
び少なくとも３種、好ましくは少なくとも４種のメンバ
ーのコンセンサス配列を有するように選択され得る。マ
ロビアワクチンを調製するために使用される同じ方法が
他の寄生体及び病原菌に拡張され得る。
配列決定されているクラスＩ及びクラスII抗原の多型
性領域の配列は次のものである。
特定の対象のドメインは、クラスIIの第３可変領域、
より詳しくはアミノ酸68〜80である。この領域において
は、多型性アミノ酸は、Ｌ−Ｅ−D*−A*−Ｒ−Ａ−S*−
Ｖ−Ｄ−Ｔ−Y*−Ｃ−Ｒ〔ここでその多型性部位が＊を
有する〕であり、その結果、その部位でのアミノ酸は保
存的に又は非保存的に変化することができる。
次の例は例示的であって、限定するものではない。
まず、観察が行なわれ、続いてその観察を得るために
実験手段が行なわれるであろう。
実験 Ｔ−細胞ハイブリドーマを、Guilletなど.,Science
（1985）235:865〜870;及びLechlerなど.,J.Exp.Med.
（1986）163:678〜696（特に本明細書に引用された参考
文献）に記載されているようにして得た。阻害又は活性
化を決定するための方法は、Guilletなど.,前記に記載
されている。
非刺激性ペプチド相同体による抗原−特異的 Ｔ−細胞活性化の阻害 非刺激性ペプチド相同体による抗原−特異的Ｔ−細胞
活性化の阻害を、Ｔ−細胞ハイブリドーマ7B7.3及びＴ
−細胞ハイブリドーマ8Iを用いて調べた。
7B7.3は、バクテリオファージλリプレッサー,cIに由
来する免疫優性ペプチドにより免疫化されたBalb/cマウ
スに由来した。それは、Ｉ−Adの関係においてペプチド
P15−26（cIのアミノ酸残基15〜26を含む）により刺激
される。Ｔ−細胞ハイブリドーマ8IはA/J株に由来し、
そしてＩ−EKの関係下で同じペプチド（P15−26）を認
識する。7B7.3も8Iも、相同ペプチドP12−14（cIの残基
12−24を含む）によって刺激され得ない。しかしなが
ら、Balb/cマウスに由来する他のＴ−細胞は、Ｉ−Adの
関係下でP12−24を認識することができる。これは、P12
−24がＩ−Ad分子に結合することができるが、しかしそ
れが特異的なＴ−細胞相互作用残基（エピトープ）を欠
くために、たぶん7B7.3を刺激することはできないこと
を示唆する。P15−26依存性7B7.3活性は、ペプチドP12
−24がまた培養中に含まれる場合、阻害されるであろう
ことが見出された。第２図を参照のこと。
7B7.3の場合、P12−24は、投与量依存性態様において
P15−26による活性化を阻害し；その阻害の効力はイン
ヒビターの濃度に依存した。P12−24は、P15−26のため
に7B7.3の明確な親和性を変えた（例IIを参照のこ
と）。阻害効果は、培養中におけるP15−26の濃度を高
めることによって逆にされた。
対照的に、その同じペプチド（P12−24）は、ハイブ
リドーマのIL−２応答により示されるように、8I活性化
に対して統計学的に有意な効果を持たなかった。
他のＩ−Ad−制限ペプチドによるレプレッサー− 特異的Ｔ−細胞活性化の阻害 7B7.3のP15−26依存性活性化を阻害するために、他の
２種の抗原系に由来するペプチドの競争能力を決定し
た。この目的のために、スタフィロコッカスヌクレアー
ゼ（Nase）、すなわち残基61−80（P61−80）及びオボ
アルブミン（Ova）、すなわち残基324−336（P324−33
6）に由来するペプチドを用いて、7B7.3のcI P15−26依
存性活性化を阻害した。それぞれは、Ｉ−Ad−制限さ
れ、そしてそのそれぞれの抗原のために免疫優性であ
る。この研究は例IIIに詳しく説明されている。
結果は、7B7.3活性化が、これらのペプチドによっ
て、投与量依存性態様下で阻害されることを示した。そ
の同じペプチドがＩ−EK制限のP12−26特異性Ｔ−細
胞、8Iに対して有意な効果を持たないことで特異性が見
られる。
他のＩ−Ad−制限ペプチドによるオボアルブミン− 特異的Ｔ−細胞活性化の阻害 Ｔ−細胞ハイブリドーマDO−11.10は、オボアルブミ
ン特異性であり、そしてＩ−Ad−制限される。それは、
オボアルブミンに由来するペプチドP323−339に対して
応答する。それは、切断された相同体P324−336に対し
てほとんど応答しない。P324−336ペプチドを刺激体と
して使用した。λリプレッサーcIペプチドP12−26及び
インフルエンザ赤血球凝集素部位２ペプチド（Ｉ−Ad制
限された）を、可能なインヒビターとして使用した。こ
れらのいずれも、DO−11.10を刺激することはできな
い。第４図に示されるように、これらの非刺激性ペプチ
ドは、オボアルブミン−特異的Ｔ−細胞活性化に対して
インヒビターとして作用する。Ｉ−Edにより制限され
た、インフルエンザ赤血球凝集素由来のペプチドP111−
120を、対照として使用し、そしてオボアルブミン−特
異性Ｔ−細胞活性化に対して効果を持たなかった。
この研究の結果は、同じクラスII分子（Ｉ−Ad）によ
り制限された非関連性ペプチドによるＴ−細胞活性化の
競争阻害を示した。
インビトロでのクラスII分子へのリプレッサーペプチド P12−26の結合 λリプレッサー（cI）P12−26ペプチドを125Iにより
ラベルし、そして種々のクラスII分子に結合するその能
力について試験した。そのペプチドは、第１表（例Ｖ）
に示されるように、ｄ及びｋハプロタイプから単離され
たクラスII分子に結合することができることが観察され
た。Ｉ−Ad及びＩ−EK分子は、ペプチドのための制限成
分であり、しかしＩ−AK及びＩ−Ed分子はそうではな
い。
Ｉ−Ed分子はBalb/cマウスに由来するP12−26特異的
Ｔ−細胞のための制限成分として作用することが決して
観察されなかった事実にもかかわらず、P12−26ペプチ
ドはそのＩ−Ed分子に最っとも堅く結合する。
P12−26の結合がＩ−Ed分子にに対して特異的である
かを決定するために、Ｉ−Edによって制限される（そし
て結合される）ことが知られているミオグロビン誘導の
ペプチドと結合のために競争するその能力が試験され
た。その結合は第２表（例Ｖ）に示されているように特
異的である。
P12−26はまた、それらのそれぞれのクラスII分子に
結合するために他の免疫優性ペプチドとも競争する。し
かしながら、競争はＩ−AK、すなわちP12−26によって
結合されないクラスII分子によって制限されたリゾチー
ム由来のペプチドに関しては観察されない（例Ｖの第１
表を参照のこと）。事実、P12−26は、その相対的な結
合能力及びその相対的な競争能力によって示されるよう
に、Ｉ−Ed分子に最っとも結合する。
この予期しない結果を考慮して、cIのNH2末端のドメ
インにより免疫化されたBalb/cマウス中におけるＩ−Ed
により制限されたＴ−細胞の存在が再試験された。
Ｉ−Ed分子の関係においてP12−26を認識することが
できるcI免疫マウス中にＴ−細胞が不在であると思われ
る。P12−26及びＩ−Ed分子に関して明らかにレパート
リーにおけるホールが存在する。
Ｉ−ａ分子のレベルでの競争 スタフィロコッカスのヌクレアーゼ及びオボアルブミ
ンの両者に由来の免疫優性ペプチドは、cI−特異的Ｔ−
細胞ハイブリドーマのＴ−細胞活性化を阻害することが
できる。観察される阻害の程度は、競争体に対する刺激
体の割合に依存し、そして従って、活性体に対する阻害
は天然で競争すると思われる。同様に、Ｉ−Ad−制限の
ペプチドは、オボアルブミン−特異的Ｔ−細胞ハイブリ
ドーマの活性化を阻害することが示される。
P12−26−特異的Ｔ−細胞7B7.3の阻害を観察するため
には、弱刺激性切断相同体、P15−26を活性体として使
用することが必要であった。同様に、オボアルブミン−
特異的Ｔ−細胞DO−11.10に関しては、不完全な刺激性
ペプチド相同体が活性体として使用された。
自己の相同体としての抗原ペプチド cIペプチドはＩ−Ad及びＩ−Edの両者に結合し、そし
てNaseペプチドは、明らかに両クラスII分子によって制
限され得、そして多分両者に結合することができる事実
の観点から、２種のペプチドのアミノ酸配列が、Ｉ−Ad
又はＩ−Edのいづれかによって制限された他のペプチド
のアミノ酸配列と比較された。
第５図に示すように、マッコウクジラのミオグロビン
に由来する、Ｉ−Ed−制限の免疫優性ペプチドは、残基
1,2,5,6,9及び13でcIペプチド及びNaseペプチドの両者
に対して相同関係を有する（第５図を参照のこと）。
cIペプチドが他のＩ−Ed制限のペプチドに相同である
とすれば、Ｉ−Ed分子の関連下でそれを認識することが
できるＴ−細胞が明らかに存在しないということは不明
確であった。これを説明するために、Ｉ−Ed−制限のペ
プチド及びＩ−Ed分子自体の配列の比較が行なわれた。
EB鎖の第３超可変領域（残基69−81）において、一列に
並べられる場合、残基1,2,5及び13は、Ｉ−Ed分子によ
って制限されたペプチドに相同である結果が示された
（第５図を参照のこと）。cIペプチドは、残基1,2,3,4,
5及び11でＩ−EB d分子に等しく、そして13で相同であ
る。さらに、この領域におけるＩ−EB K分子の配列とＩ
−EB d分子の配列との比較は、残基3,4,7及び11が単に多
型性残基であることを示す。cIペプチドは、これらの多
型性残基の３個でＩ−Ed分子に一致し；他のＩ−Ed−制
限のペプチドはそうではない。この同一性が、推定され
る “レパートリーにおけるホール”を説明すると思われ
る。
第５図に示されるように、インフルエンザ赤血球凝集
素に由来する、Ｉ−Ed−制限の免疫優性ペプチドは、上
記の他のペプチドに対してほとんど相同関係を持たない
（残基１及び２でを除く）。しかしながら、このペプチ
ドは、Ｉ−EB d分子自体に対して著しい相同関係を有す
る。この場合、比較のために使用されるＩ−EB d分子の
残基がEB鎖の第２超可変領域から取られる。Mengle−Ga
w,L.及びH.McDevitt,Proceedings of the National Aca
demy of Sciences,USA（1983）80:7621〜7625。一列に
並べられる場合、残基1,2,3,4,6及び10は同一であり、
そして残基７及び９は相同である。インフルエンザペプ
チドは、残基５でＩ−EB d分子に対する挿入を受け、そ
してこの残基はＴ−細胞の認識のためのエピトープであ
ることが示された。Hackett,C.など.,Journal of Immun
ology,（1985）135:1391〜1394。
要約 従って、上記の及び続く例における研究は次のことを
示す。抗原特異的Ｔ−細胞の活性化（すなわち、特定の
クラスII分子によって結合された特異的ペプチドによる
活性化）は、刺激性ペプチドが与えられるクラスII関連
物と同じものに相同ペプチドが、与えられる場合、その
相同ペプチドによって阻害され得る。これは、その相同
ペプチドがＴ−細胞を活性化することができない場合で
さえ真実である。しかしながら、その同じ相同ペプチド
は、異なったクラスII分子によって結合される特異的ペ
プチドを認識するＴ−細胞の活性化を阻害しない。
第１の場合、これは、クラスII抗原への結合のため競
争を支持し、そしてＴ−細胞活性化におけるその相同ペ
プチドによる干渉は、クラスII分子へのその結合の結果
である（従って、特異的ペプチドがそれを行なうことを
妨げる）。第２の場合、それは、第２のクラスII分子へ
の結合のために相同ペプチドと特異的ペプチドとの間の
競争が存在しないので、その相同ペプチドはＴ−細胞の
活性化を干渉しないことを支持する。
たった１つのペプチド結合部位がそれぞれのクラスII
分子上に存在し、そして与えられたクラスII分子によっ
て制限された無関連のペプチドが、クラスII分子への結
合において競争を通して特異的Ｔ−細胞を刺激するため
に、それぞれ他の能力の競争インヒビターとして作用す
ることも示された。
次のペプチド及びＩ−EdクラスII分子自体のアミノ酸
配列の比較は、Ｔ−細胞の認識のための抗原内の免疫優
性ペプチドの選択が、移植抗原に結合するためのその能
力に向けられる結論を支持する： 1.cIペプチド、すなわちＩ−Ad及びＩ−DKにより制限さ
れるが、しかしＩ−Ed分子に最っとも堅く結合する、λ
リプレッサーに由来する免疫優性ペプチド； 2.Naseペプチド、すなわちＩ−Ad及びＩ−Edにより制限
され、そしてたぶん両者に結合する、スタフィロコッカ
スのヌクレアーゼに由来する免疫優性ペプチド； 3.I−Edにより制限される、マッコウクジラのミオグロ
ビン由来の免疫優性ペプチド；及び 4.I−Edにより制限される、マッコウクジラの赤血球凝
集素に由来する免疫優性ペプチド。
第５図の上部に要約されているペプチド１−３の比較
は、13残基のうち６個で（すなわち1,2,5,6,9及び13
で）、３個の間の相同関係を示した。そのような相同関
係は、それらの通常の制限及び／又は同じクラスII分子
（Ｉ−Ed）に結合するための能力を説明する。
これらの３個のＩ−Ed−制限のペプチドの配列とＩ−
Ed分子自体の配列との比較は、ペプチド中の及びIB鎖の
第３超可変領域中の４個の残基の間に相同関係を示し
た。たとえば、マッコウクジラのミオグロビンペプチ
ド、cIペプチド及びEB鎖において、ロイシン（非極性ア
ミノ酸）は残基１で存在し、グルタミン酸は残基２で、
アルギニン（塩基性アミノ酸）は残基５で存在し;Nase
においては、これらの位置のそれぞれでの残基は同じか
又は相同であり：すなわちバリン（非極性）は残基１
で、グルタミン酸（同じアミノ酸）は残基２で、そして
リシン（塩基性）は残基５で存在する。すべての３個の
免疫優性ペプチドは、残基13でリシン（塩基性アミノ
酸）を有し、そしてクラスII分子はその位置でアルギニ
ン（または塩基性アミノ酸）を有することが示された。
これらの３個のペプチドのアミノ酸配列とまたＩ−Ed
−制限されている、インフルエンザのペプチドのアミノ
酸配列との比較は、ほとんど相同関係を示さなかった。
インフルエンザのペプチド配列とＩ−Ed分子の第２超可
変領域の配列との比較は、２個の間で著しく相同関係を
示したが、しかしながら６個の残基は同一であり、そし
て２個は相同であった。
その結果は、Ｔ−細胞の認識のための抗原内の免疫優
性ペプチドの選択の基本が移植抗原（たとえばクラスＩ
又はクラスII分子）に結合するためのその能力に向けら
れ、そしてそのような結合のための化学的必要条件が移
植抗原自体のセグメントとの相同関係に向けられている
結論を支持する。
これらの観察は、クラスII分子の特定のドメイン（そ
れぞれの鎖上で分離されている）に関連する内部相補体
（リガンド−レセプター）の存在を支持し、そして結合
のための内部“リガンド”が多型性領域によって一部コ
ードされていることを支持する。同様のことが、内部
“レセプター”のために真実であると思われるであろ
う。次に、免疫優性ペプチドは、内部“リガンド”を置
換し、そして同等の幾何学を持って、クラスII分子に結
合されるであろう。次に外来性“リガンド”（免疫優性
ペプチド）は、内部の自己“リガンド”の相同体として
Ｔ−細胞によって見出されるであろう。
上記のλリプレッサーペプチド（cI）の場合、外来性
リガンドは、自己のクラスII分子と見分けがつかず（多
型性部位で）、そして“レパートリーにおけるホール”
が、自己耐性によって引き起こされると思われる。“レ
パートリーにおけるホール”であると思われるものをも
たらす、自己としての認識の考えは、新規ではない。Bu
rnet,F.M.,Cambridge University Press（1959;Herne,
N.,European Journal of Immunology,（1971）1:1〜
５。しかしながら、本発明に示されたデータは、その概
念が物理的基礎を有することを示す最初の分子証拠を提
供する。
アロ反応性が外来性のクラスII分子の内部“リガン
ド”のＴ−細胞認識の結果であることを予期することは
正当である。その内部“リガンド”が多くの多型性残基
から構成され、そしてヒストトピック残基（クラスII分
子に結合するＴ−細胞の部位）がそうでない場合、与え
られたＴ−細胞は、自己のクラスII分子に結合される外
来性“リガンド”かそれ自体の内部“リガンド”により
結合される外来性のクラスII分子かを区別することはで
きない。２種のリガンドの間に同一性が存在する場合、
アロ反応性が得られるであろう。上記結果（すなわち、
すべての“リガンド”の間に相同関係が存在する）を仮
定すれば、外来性内部“リガンド”は、自己の相同とし
て容易に考えられ、そして従って自己＋Ｘに対して化学
的に等しいであろう。外来性“リガンド”のそれぞれの
多型性残基は、自己の関与において異なった外来性抗原
を理論上表わすことができるであろう。従って、多くの
％のＴ−細胞が単一のアロクラスII分子に応答すること
ができるであろう。Ashwell,J.など.,Journal of Immun
ology,（1986）136:389〜395。
オボアルブミンのＩ−Ad−制限の免疫優性ペプチドの
ための配列（本明細書に記載されている）が第６図に示
されている。それは、AB鎖の多型性領域（残基42〜55）
と共に一列に並べられている。Choi,Eなど.,Science,
（1983）221:283。それは、残基12,17,19及び20で同一
性を有する。この領域において多型性である単一の残基
は残基12であり、これはＩ−AB d分子（及びオボアルブ
ミン）においてヒスチジンであり、そしてＩ−AB d分子
（制限成分）及びＩ−AB K分子においてチロシンであ
る。Ｉ−Adの関連下でオボアルブミンを認識するオボア
ルブミン特異的Ｔ−細胞ハイブリドーマ、DO−11.10
は、Ｉ−AB bとのアロ反応を示す（但し、Ｉ−AB Kとは示
さない）。さらに、この領域は、DO−11.10のアロ反応
を調製するものとしてGermain及び彼の同僚によって示
された。このヒスチジン残基は、もう１つのオボアルブ
ミン特異的Ｔ−細胞の認識のために不可欠であるものと
してMcConnell及び彼の同僚によって示された。Lechle
r,R.など.,Journal of Experimental Medicine,（198
6）163:678〜696;Watts,T.など.,Proceedings of the N
ational Academy of Science,USA,（1985）82:5480。
これは、DO−11.10細胞が自己＋Ｘ（ここでＸはオボ
アルブミンペプチドである）及びアロ（ここでアロはＩ
−AB bである）を区別することができないことを示唆す
る。
本発明に記載されたオボアルブミンペプチドは、“許
容”残基の２つの領域（クラスII分子へのそれの結合を
可能にする）を含むように思われる。１つの領域は、位
置17〜20（Ｔ−細胞様DO−11.10はこの領域を必要とす
る）を含む。これらの残基のために欠失されたペプチド
は、それがＴ−細胞様DO−54.8を刺激することができる
事実によって示されるように、Ｉ−Ａに結合する。Shim
onkevitz,R.など.,Journal of Immunology（1984）133:
2167;Watts,T.,など.,Proceedings of the National Ac
ademy of Sciences,USA,（1985）82;5480。最近の証拠
は、位置12の先の領域における残基がまた、Ｉ−Ad結合
のために“許容”フレームワークも形成することを指摘
する。Cease,K.B.など.,Journal of Experimental Medi
cine,（1986）164:1779。Ｉ−Adの関連下でマッコウク
ジラのミオグロビンに由来するペプチドを認識するＴ−
細胞はまた、Ｉ−Abとのアロ反応も示す。Berkower,I.
など.,Journal of Immunology,（1986）164:1779。ミオ
グロビンは、位置2,5,7,8及び12でＩ−Ab分子との相同
関係を示す（第６図）。また、位置12でのヒスチジン残
基は、自己の関連下でのミオグロビン,I−Ad及びアロ,I
−Abの間で類似性を担当すると思われる。
明らかな相同関係特色は、同じクラスII分子によって
制限されるペプチドの間で必ずしも見出されない。それ
ぞれのリガンド様ドメインに関連するモチーフが見出さ
れるであろう（第５図及び６図）。第７図は、Ｉ−Ad分
子のためのリガンドに関連する３種のモチーフが存在す
ることを示すデータの編集を表わす。第８図における配
列は、Ｉ−EK分子のために２種のモチーフの可能性を示
す。
例１ Ｔ−細胞ハイブリドーマ及び抗原付与細胞の調製 MHC制限の態様下でＴ−細胞に対する抗原を付与す不Ｉ
−Ad−Ｉ−EK陽性A20.2JBalb/cBリンパ腫系は、Dr.J.Ka
ppler及びP.Marrackからの贈与であった。
DO−11.10は、オボアルブミンＩ−Ad制限のＴ−細胞ハ
イブリドーマである。Shimonkevitz,R.など.,Journal o
f Immunology,（1984）133:2067〜2074。TA.3は、（Bal
b/c×A/J）F1供与体からのリポ多糖刺激のＢ−細胞とM1
2.4.1.Balb/cBリンパ腫細胞系（Dr.L.Glimcherからの贈
与物）との融合により得られた。TA3B−細胞−Ｂリンパ
腫ハイブリドーマ,I−AK/d−Ｉ−EK/dの表現型は、この
細胞系がH2d又はH2K制限のTh（Ｔ−ヘルパ−リンパ球）
細胞ハイブリドーマのいづれかに対して抗原を付与する
ことができるようにする。
培養条件。Ｔ−細胞ハイブリドーマ及び抗原付与細胞
は、２×10-3Ｍのグルタミン,5×10-5Ｍの２−メルカプ
トエタノール,100μ/mlのペニシリン,100μg/mlのスト
レプトマイシン及び10％のウシ胎児血清により補充され
たRPMI 1640（Grand Island Biological Gampany,＃20
0.6140）を含む大きなウェル（24ウェルプレート,Costa
r ＃3424）中で維持された。それらの細胞系は、連続的
な希釈によって２日ごとに倍増され、そしてそれらが下
記の研究に使用する前、それぞれ5ml及び50mlの培地を
含むT25及びT75フラスコ（Falcon）中で拡張された。
ペプチド。すべてのペプチドは、前に記載されたよう
なMernifieldの固相法によって合成された。Mernifiel
d,R.,Journal of the American Chemical Society,（19
63）85:2149〜2154。合成されたペプチドのアミノ酸組
成及び配列分析は、予測した組成に対応する。配列決定
及び／又はHPLCによって決定される場合、そのペプチド
の純度は93〜94％である。
例II 非刺激性ペプチド相同体による 抗原特異的Ｔ−細胞の活性化の阻害 Ｔ−細胞ハイブリドーマ7B7.3は、λリプレッサーに
より免疫化されたBalb/cマウスに由来した。それは、Ｉ
−Adの関連下でペプチドP15−26（免疫原の残基15−2
6）により刺激され得る。A/J株に由来するＴ−細胞ハイ
ブリドーマ8Iは、その同じペプチドを認識するが、しか
しＩ−EKの関連を伴わない。また、Ｔ−細胞は、相同の
ペプチド相同体P12−24（免疫原の残基12−24）により
刺激され得ない。しかしながら、Balb/cに由来する他の
Ｔ−細胞は、Ｉ−Adの関連下でP12−24を認識すること
ができる。
これは、P12−24がＩ−Ad分子に結合することができ
るが、しかしたぶん7B7.3を刺激することはできないこ
とを示唆する。なぜならば、それは特異的なＴ−細胞の
相互反応残基（エピトープ）を欠失するからである。Ｔ
−細胞ハイブリドーマ〔適切な抗原濃度を含むRPMI完全
培地200μｌを含む96−ウェルの組織Costarプレート
（＃3596）のウェル中に５×104個の抗原付与細胞と共
にインキュベートされたＴ−細胞ハイブリドーマ（５×
104）〕の活性化はIL−２を分泌するそれらの能力によ
って測定された。24時間の培養の後、上清液（50μｌ）
を取り、そして次に、IL−２依存性CTL−Ｌ細胞の増殖
を維持するその能力によってIL−２含有量についてアッ
セイする。１μCiの3H−チミジンをウェル当りに添加し
た。６時間後、細胞を、自動細胞収穫機（Skartron In
c.,Sterling,VA）によって収穫し、そしてチミジン導入
をシンチレーション計数管によって測定した。
両ペプチドは13個の残基のうち11個を共有するので、
P15−26−依存性7B7.3活性化の阻害は、そのペプチドP1
2−24がまた、培養中に含まれる場合に観察された。第
２図を参照のこと。
Ｔ−細胞ハイブリドーマ7B7.3の活性は、10％ウシ胎
児血清のみを有するRPMI 1640又は20μＭのP12−24もし
くは60μＭのP12−24の存在下において、種々の濃度のP
15−26の存在下で測定された。A20 B−細胞リンパ腫
（５×104個の細胞／ウェル）を、抗原付与性細胞とし
て使用した。
24時間の培養の後、上清液（50μｌ）を収穫し、そして
次に、IL−２依存性CTL−Ｌ細胞系（104個の細胞／ウェ
ル）中への3Hチミジンの導入の後、IL−２濃度について
アッセイした。第２図における値は、３種のサンプルの
相加平均を表わす。
7B7.3の場合、P12−24は、投与量依存性態様でP15−2
6による活性化を阻害することが見出された。その阻害
の有効性はインヒビター濃度に依存する。第３図に示さ
れるように、P12−24は7B7.3へのP15−26の見掛の親和
性を変え:P15−16抗原投与量応答曲線の50％刺激点は、
P15−26が7B7.3のみと共に培養される場合、20.7±1.2
μＭの濃度である。7B7.3がP15−26及びP12−24と共に
同時培養される場合、５％刺激点は29.8±2.8μＭであ
り、そしてP12−24がそれぞれ20μＭ及び60μＭで存在
する場合、70.3μＭである。その阻害効果は、培養中に
おけるP15−26の濃度を高めることによって、逆にされ
得る。サンプルペプチド、P12−24は、ハイブリドーマ8
I、すなわちP12−26感受性、Ｉ−EK−制限のＴ−細胞ハ
イブリドーマのIL−２応答に対して効果を持たなかっ
た。Ｉ−Ad及びＩ−EKとの相互反応を必要とされるP12
−26の残基は異なっていることがまた、示された。従っ
て、Ｉ−EK制限のＴ−細胞のP12−24による阻害の不在
は、Ｉ−EK分子に結合するそのペプチドの無能性による
ものである。
例III 他のＩ−Ad−制限のペプチドによるリプレッサ
ー特異的Ｔ−細胞活性化の阻害 次の研究が、ハイブリドーマ7B7.3のP15−26−依存性
活性化を阻害する、スタフィロコッカスのヌクレアーゼ
（Nase），残基61−80（P61−80）及びオボアルブミン
（Ova），残基324−336（P324−336）に由来するペプチ
ドの競争能力を試験するために行なわれた。これらのペ
プチドのそれぞれは、それぞれの場合において、Ｉ−Ad
−制限され、そしてそれらのそれぞれの抗原に対して免
疫優性であるべきであることが示された。Finnegan,A.
など.,Journal of Experimental Medicine（1986）164:
897〜910;Shimonkevitz,R.など.,Journal of Immunolog
y（1984）。５×104個のTA3細胞がそれぞれのウェルに
添加された。種々の濃度のP15−26が、培地（10％ウシ
胎児血清を有するRPMI 1640）のみ又は30μＭのOva（P3
24−336）もしくは60μＭのNase（P62−80）のいづれか
と共に添加された。A20 Ｂ−細胞リンパ腫（５×104個
の細胞／ウェル）を、抗原付与細胞として使用した。次
に、7B7.3 T−細胞ハイブリドーマ（５×104個）を添加
し、そして24時間培養した。Ｔ−細胞刺激のレベルを、
例IIに示したようにしてIL−２濃度を決定することによ
ってアッセイした。第３図に示されるように、これらの
ペプチドは、投与量依存性態様で7B7.3の活性化を阻害
した。その阻害の程度は、それぞれの場合においてイン
ヒビーターに対する活性化体の割合に依存しない。
8I（Ｉ−EK−制限の）Ｔ−細胞ハイブリドーマ及びTA
3B付与細胞（５×104個）を、上記のようにして種々の
濃度のP15−26及び培値のみ又は60μＭのOva（P324−33
6）もしくは60μＭのNase（P61−80）のいづれかと共に
培養した。特異性は、このペプチドがＩ−EK−制限のP1
5−26−特異性Ｔ−細胞,8Iに対して効果を付与しないこ
とで見られる。さらに、Nase配列の残りの代表的な他の
ペプチドは、7B7.3の活性化を阻害することができなか
った。
例IV 他のＴ−Ad制限のペプチドによる オボアルブミン特異的Ｔ−細胞の活性化の阻害 Ｔ−細胞ハイブリドーマDO−11.10は、オボアルブミ
ン特異性であり、そしてＩ−Adにより制限される。それ
は、オボアルブミンに由来するペプチドP323−339に応
答する。それは、刺激体として使用される、切断された
相同体P324−336にほとんど応答しない。インヒビター
として、λリプレッサーペプチドP12−26及びインフル
エンザ赤血球凝集素（Ｉ−Ad制限の）由来するペプチド
インフルエンザ赤血球凝集素部位２（P126−138）を使
用した。これらのペプチドのいずれも、独力でDO−11.1
0を刺激することはできない。培地のみ又はインフルエ
ンザ赤血球凝集素P111−120もしくはP12−26又はインフ
ルエンザ赤血球凝集素部位２（P126−138）（それぞれ5
0μＭで）の存在下で、DO−11.10を、種々の濃度のOva
（P324−336）及びA20付与性細胞と共に培養した。24時
間の培養の後、解放されたIL−２の量を定量化すること
によって、刺激を決定した。第４図において、それらの
値は、３種のサンプルの相加平均を表わす。条件は、例
IIIに記載された。
第４図に示されるように、これらの非刺激性ペプチド
は、オボアルブミン特異的Ｔ−細胞活性に対してインヒ
ビターとして作用する。Ｉ−Ed制限の、インフルエンザ
赤血球凝集素由来のペプチドP111−120は、対照として
作用し；それは、オボアルブミン−特異的Ｔ−細胞の活
性化に対して効力を持たなかった。
例Ｖ インビトロにおけるクラスII分子へのリプレッサ
ーペプチドP12−26の結合 クラスII分子によって制限されたペプチドの間に観察
される競争阻害の機構をさらに研究するために、イン
ビトロにおけるクラスII分子へのペプチド結合の研究を
行なった。結果は第１表に示される。
ペプチドP12−26を、125Iのための受容体として作用
するために、Ｎ−末端へのチロシン残基の添加により変
性した。
セファロース4Bビーズ（Pharmacia Fine Chemicals,S
weden）に結合された次のモノクローナル抗体:MK−D6
（Ｉ−Ad−特異性）、10−３−６（Ｉ−AK−特異性）又
は14−４−４（Ｉ−Ed/K−特異性）を用いて、アフィニ
ティークロマトグラフィーによって、Ia−分子を、A20
（H2d）のNonidet P−40（NP−40）破壊物又はAKTB−1b
（H2K）細胞から精製した。
免疫原性ペプチドとIaとの間の関係の程度を決定する
ために、ゲル濾過アッセイを使用した。このアッセイ
は、Buns,S.など.,Proceeding of the National Academ
y of Sciences,USA（1986）83:3968に記載され、そして
これを引用によって本明細書に組み込む。手短に言え
ば、１％NP−40/PSB中、精製されたIa40μモルを、125I
よりラベルされたペプチド（それぞれの実験のために約
200,000cpm）0.2μモルと共に混合し、そして室温で48
時間インキュベートし、Ia−ペプチド複合体の形成を可
能にした。Ia−ペプチド複合体を、ゲル濾過により遊離
ペプチドから分離し、そしてIaに結合されたペプチドの
％を、回収された合計の125I−ラベルされたペプチドに
対する空隙率での125I−ラベルされたペプチドの割合と
して計算した。
第１表．クラスII分子への125I cI P12−26相同体の結
合 クラスII抗原 結合されたペプチドの％ Ｉ−Ad 1.6±0.8（ｎ＝５） Ｉ−Ed 8.9±2.2(n=7)* Ｉ−AK 0.3±0.5（ｎ＝５） Ｉ−EK 2.3±1.7（ｎ＝５） ＊結合のレベルは、99％以上の信頼レベルで他のクラス
II分子と有意に異なる。
第１表に示されるように、ペプチドP12−26は、予想
どおりに両分子に結合することができる。（結合のため
に使用される変性された形のP12−26は、Ｔ−細胞の活
性化に関して、P12−26と同じように活性的である。）
特異性は、Ｉ−AK分子に結合するためのP12−26の無能
性によって明白に示され；後者は、このペプチドの制限
のためにイン ビボで活性を示さない。しかしながら、
ペプチドP12−26は、Ｉ−Ed分子にひじょうに良く結合
する。Balb/c免疫マウスからのＴ−細胞は、この分子に
よって制限されないことが見出された。
P12−26の結合がＩ−Ed分子に対して特異的であるか
どうかを決定するために、Ｉ−Edによって制限されるこ
とが示された（そして結合することが）、ミオグロビン
由来のペプチドとの結合のために競争するその能力の試
験が行なわれた。結果は第２表に示される。
阻害アッセイのために、ラベルされていない投与量範
囲のcI P12−26ペプチドが、Ia及び125Iによりラベル
されたペプチドのインキュベーション混合物（600,120,
24,約48μＭ）に添加された。Iaとラベルされたペプチ
ドとの間の関連の程度を、第１表に記載されたようにゲ
ル濾過により決定した。インヒビターの不在下で結合さ
れたペプチドの百分率は、オボアルブミン（323〜332
9）/I−Adのためには10.6％；ミオグロビン（132〜15
3）/I−Edのためには6.5％；リゾチーム（46〜61）/I−
AKのためには21.5％；シトクロームｃ（88〜104）/I−E
Kのためには2.5％であった。結合の50％阻害を得るため
に必要とされる阻害性ペプチドの濃度を計算した。それ
ぞれの実験は３度くり返えされた。
P12−26はまた、それらのそれぞれのクラスII分子に
結合するために他の免疫優勢ペプチドとも競争する。し
かしながら、競争は、Ｉ−AKによって制限されたリゾチ
ーム由来のペプチド、すなわちP12−26によって結合さ
れなかったクラスII分子のためには、観察されない（第
１表を参照のこと）。事実、P12−26は、その相対的な
結合能力及びその相対的な競争能力によって示されるよ
うに、Ｉ−Ed分子に最っとも結合することは、注目すべ
きである。
P12−26がＩ−Ed分子に特異的に結合することを示す
結果の点から、cIのNH2末端のドメインにより免疫化さ
れたBalb/cマウス中にＩ−Edにより制限されたＴ−細胞
が存在するか否かの問題が再試験された。
15匹のcI免疫化マウスから回収されたP12−26に対し
て特異的な300個以上のハイブリッドのうち、Ｉ−Ed分
子によって制限されたものは示されなかった。すなわ
ち、それらはＩ−Adを発現するＬ細胞の存在下で抗原に
よって刺激され得るが、しかしＩ−Edを発現するＬ−細
胞の存在下で抗原によって刺激されることは示され得な
かった。
対照的に、ミオグロビン（P135−147）に対して特異
的な80個のハイブリットのうち、78個は、Ｉ−Edを発現
するＬ−細胞上でアッセイされる場合、Ｉ−Edに制限さ
れることが示された。さらに、P12−26免疫マウスから
の分別されていないリンパ節由来のＴ−細胞は、Shastr
iなどによって記載されているような標準のリンパ節増
殖アッセイ 〔Shastriなど.,Journal of Experimental Medicine,
（1986）164:882〕において10μＭのP12−26と共に培養
する場合、有意な増殖（68,000cpmのチミジンの取込
み）を示した。しかしながら、そのリンパ節細胞は、Ｉ
−Ad分子に対して特異的なモノクローナル抗体、MKD6が
10μＭのP12−26を有する同一の培養物に添加される場
合、添加された抗原を有さない培養物以上に有意な増殖
（1250cpm）を示すことができない。これらの同じ培養
物の増殖は、Ｉ−Edに対して特異的であり、そしてヘモ
シアニン特異性の、Ｉ−Ed制限のＴ−細胞ハイブリドー
マの刺激と阻害するモノクローナル抗体、34−１−4Sに
よって阻害されなかった（75,000cpm）。
従って、Ｉ−Ed分子の関連下でP12−26を認識するこ
とができる。cI免疫マウス中におけるＴ−細胞が不在し
ているように思われ；明らかに、P12−26及びＩ−Ed分
子に関してレパートリーにおけるホールが存在する。
次の研究は、マラリアワクチンとして使用するための
合成ポリペプチドに関する。
材料 合成ペプチドの合成及び分析は、前に記載された（Gu
illetなど.,前記）。この研究に使用されるペプチドは
次のものである： P12−26;λバクテリオファージのcIタンパク質由来で
ある。
P12−26LF;残基14及び15がLFによって置換されている
P12−26の変種である。
（NANP）１−12−26、（NANP）２−12−26及び（NAN
P）３−23−26;それぞれ19,23及び27個の残基の長さで
ある。それらは、１〜３回反復されたNANPで始まり、次
にP12−26を有する。
NANP−50は、50回反復されたNANPのポリマーである。
方法 抗体の製造 抗体の製造のために、完全フロイントアジュバント
（CFA）中に乳化された抗原〔（NANP）３−12−26〕100
μｇを、マウスの腹腔内及び足の肉趾に日０で１次注射
し、次いで、不完全フロイントアジュバント（IFA）中
に乳化された抗原50μｇを、21日後、２次皮下注射し
た。日7,21（追加免疫の前）、28,及び42日目に血液か
らの血清を使用した。
Ｔ−細胞の増殖 Ｔ−細胞増殖の研究のために、CFA中に乳化された100
μｇの（NANP）３−12−26を、マウスの尾及びまた足の
肉趾に日０で注射した。10日目に、ドレインノードを除
去した。10％FCS、５×10-5のM2ME、ペニシリン、スト
レプトマイシン及び抗原を含むRPMI0.1mlを含む、平底
マイクロ力価プレートのウェル当り８×105個の細胞を
接種した。２日目、3Hチミジン（ICN）／μCiを、３成
分又は２成分培養物に添加した。16時間後、細胞を収穫
し、そして取込まれた3Hを、シンチレーション計数器に
よってアッセイした。
NANP3(NANP)n（ここでｎ反復の数を示す）に対する抗体
力価の評価 ELISA試験を用いた。接合されたNANP50又は12−26−B
SA〔10μg/ml,2μg/ml、それぞれ（25μｌ）〕を、室温
で１時間又は４℃で一晩にわたってポリビニルウェル中
に添加した。次に、ウェルをブロックし、血清を添加
し、そしてペルオキシダーゼに接合されたヤギ抗−マウ
スIgGを添加した（１×1000の希釈度）。最後に、基質
（ABTS）を添加し、そして吸光度を405nmで読んだ。血
清は、種々の希釈度で試験された。
結果 （NANP）３−12−26は、P12−26に対して特異的なＴ−
細胞を刺激する Ｔ−細胞ハイブリドーマ9H35及び9C12
7の活性化を研究した。抗原付与性細胞は、Ｂ−細胞リ
ンパ腫A20であり、そしてP12−26又は（NANP）３−12−
26のいずれかの抗原を種々の投与率（０〜50μg/ml）で
添加した。IL−２開放が、Ｔ−細胞の活性化の測定とし
て取られ、そして増殖のためにIL−２を必要とする指示
が細胞系に対してアッセイした。
得られた結果は、P12−26（cIタンパク質により免疫
化された動物から単離された）に対して特異的な、２種
のH2d−制限のＴ−ヘルパー細胞ハイブリドーマ、9H35
及び9C127のために、ペプチド（NANP）３−12−26が、
適切な（A20）抗原付与性細胞の存在下で刺激体として
作用することができることを示した。NANP含有ペプチド
は、より活性的である。この結果は、拡張されたクラス
II結合性ペプチドのＴ−細胞刺激性能力が、イン ビト
ロで研究される場合、ほとんど変えられないことを示
す。
（NANP）３−12−26ペプチドは、（NANP）50に対して特
異的なモノクローナル抗体及びP12−26に対して特異的
なモノクローナル抗体の両者に結合され得る モノクローナル抗体による（NANP）３−12−26の抗体
認識が研究された。抗原、すなわちP12−26に接合され
たウシ血清アルブミン（BSA）をマイクロウエルに吸収
し、そしてP12−26に対して特異的な、ホースラディシ
ュ ペルオキシダーゼ（HRP）によりラベルされた抗体
を添加した。
（NANP）３−12−26の不在下で又はP12−26LFの存在
下で、モノクローナル抗体B3.11の結合の阻害は存在し
ない。阻害が、P12−26,（NANP）３−12−26及びP12−2
6S（位置18）（減少する阻害の順序）により観察され
る。
上記研究をくり返した。但し、抗原は、マイクロウェ
ルに結合された、放射性ラベルされた（NANP）50であっ
た。P12−26又は（NANP）２−12−26は、結合を阻害し
ないが、所ろが（NANP）３及び（NANP）３−12−26は結
合を阻害したことが見出された。
その結果は、モノクローナル抗体、B3.11が、P12−26
により結合されたウシ血清アルブミンへのその結合を、
（NANP）３−12−26の添加によって阻害され得ることを
示す。同様に、マラリア寄生体−免疫マウスから単離さ
れた、（NANP）50に対して特異的なモノクローナル抗体
は、（NANP）３−12−26ペプチドによってその結合を阻
害され得る。これらの結果は、合成分子のNANP部分に対
して特異的な抗体が、追加のクラスII結合ペプチドの存
在下で“ハプテン”を認識することができることを再び
示す。(NANP)50 又は(NANP)3が免疫化のために使用される場
合、(NANP)50に対する抗体を合成することができないマ
ウスは、(NANP)3-12-26が免疫原として使用される場
合、(NANP)50、(NANP)3及びスポロゾイト(Sporozoites)
に対する抗体を合成することができる。
マウスの対を、（NANP）３−12−26,（NANP）50,（NA
NP）１−12−26及び（NANP）２−12−26より免疫化し
た。その血清力価を、方法のセクションに示されたよう
な直接的な結合アッセイによって、１次免疫化の後、７
日目、２次追加免疫化（対照の血清は検出可能な結合を
与えなかった）の後20日目、又は10日目のいづれかの日
に試験した。（NANP）３−12−26により免疫化されたマ
ウスからの血清（２次追加免疫化の後、10日目）は、従
来の放射性ラベルされた抗−マウスグロブリンRIAによ
って、サーカムスポロゾイト ファルシパラム（Circum
sporozoite falciparum）に直接的に結合することが見
出された。
リンパ節由来のＴ−細胞の増殖は、（NANP）３−12−
26により免疫化された後、８日目にマウス中に観察され
た。チミジンの取り込みによりアッセイされる場合、免
疫原、P12−26、（NANP）１−12−26及び（NANP）２−1
2−26によるＴ−細胞増殖が、見られた。これらの同じ
マウス中において（NANP）３又は（NANP）50による増殖
は見られない。これらの結果は、免疫原上でのクラスII
分子結合性配列の存在が、これらのマウス中において単
独では不活性である（NANP）３に、Ｔ−細胞刺激性活性
を付与するのに十分であることを示す。すべてのＴ−細
胞活性は、クラスII結合配列に向けられる。これらの結
果は、抗体活性が、免疫原の12−26部分上に存在する
（NANP）配列に対して、（NANP）３−12−26により免疫
化されたマウス中に誘発され、及びそのような“活性
化”配列が不活性配列に付加され、そしてその不活性配
列に対する抗体を産生することを示唆する。
類似する実験において、（NANP）３−12−26LFにより
免疫化されたBalb/cマウスは、免疫原に対するＴ−細胞
増殖応答（免疫化の後16日目に脾臓から取られた）を示
したが、しかし（NANP）３−12−26（P12−26のみに対
しても）に対してはそうでなかった。この結果は、免疫
原の（NANP）部分に対するＴ−細胞反応性の誘発が存在
しないことを再び示す。この場合、上記項に記載された
ように、（NANP）３−12−26は、クラスII分子に結合
し、そして活性化のためにＴ−細胞に付与することがで
きることは明らかである。（NANP）３−12−26LFにより
免疫化されたマウスはまた、（NANP）50ポリマーに対し
て特異的な抗体も誘発する。これらの抗体は、μ及びγ
−１クラスのものである。
免疫原の（NANP）部分へのＴ−細胞の反応性を検出す
るための無能性は、Balb/cマウスの性質であり、そして
免疫原の性質ではない。（NANP）３−12−26により免疫
化された57B61H−26は、（NANP）３又は（NANP）50に対
して直接的に応答することができ、そして免疫原の（NA
NP）部分に対するＴ−細胞反応性を伴って、（NANP）３
−12−26による免疫化に応答することができる。
従って、この方法の有用性は、ヒト病原菌に対する免
疫性の産生のための有用性を有するシステムに示され
る。
上記結果は、Ｂ−及び／又はＴ−細胞を刺激すること
又はＢ−及び／又はＴ−細胞を不活性化することに関し
て、広範囲の種類の情況、すなわちくイン ビトロ及び
イン ビボで免疫系を調節することにおける本発明の能
力及び広さを示す。本発明は、特定の出来事に応答して
及びさらに宿主の情況、すなわち宿主の移植抗原に対し
て、１又はそれよりも多くのサブセットのリンパ球を選
択することにおいて卓越した特異性を提供する。特定の
宿主の移植抗原の多型性領域をまねる能力によって、Ｔ
−細胞免疫系が実質的に不活性化され得る。対照的に、
目的の宿主の移植抗原に結合するためのコンセンサス配
列を変えることによって、１又は少々のサブセットのリ
ンパ球を特異的に活性化することができ、予防接種の目
的、病原性侵入体への増強された応答、又は免疫系によ
る保護に関連する他の出来事のために刺激された免疫系
を提供する。さらに、天然の組織への攻撃に関するリン
パ球を不活性化することによって、自己免疫系を調節す
ることができる。従って、細胞の機能に関して、特定の
細胞を増強し又は減じるために本発明の広範囲な使用が
存在する。
本明細書に言及されたすべての出版物及び特許出願
は、本発明が関係する当業者の熟練のレベルを示す。本
発明におけるすべての出版物及び特許出願は、あたかも
それぞれ個々の出版物又は特許出願が、引用によって組
込まれることを特別且つ個々に指摘されているかのよう
に、それと同じ程度に引用によって組込まれる。
前述の発明は、明確に理解するために例示的且つ例的
にいくらか詳細に記載されているけれども、請求の範囲
内で修飾及び変更を行なうことができる。

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】移植抗原に結合できるアグレトープ及びエ
    ピトープを含んで成る第１抗原であってそれに対して哺
    乳類宿主が応答するもののペプチド配列を含んで成る第
    １分子、並びに 移植抗原に結合できるアグレトープ及びエピトープを含
    んで成る抗原であってそれに対して哺乳類宿主が応答す
    るもののペプチド配列を有する第２分子、 を含んで成る組成物であって、ここで前記個々の分子は
    異なった移植抗原に特異的に結合し、 これによって、該組成物は前記第１抗原の前記エピトー
    プに対する哺乳類宿主の免疫応答を調節するのに有用で
    あることを特徴とする組成物。
  2. 【請求項２】いずれかのペプチド配列が免疫優性配列を
    含んで成る請求の範囲第１項記載の組成物。
  3. 【請求項３】各ペプチド配列が100個以下のアミノ酸を
    含んで成る請求の範囲第１項記載の組成物。
  4. 【請求項４】前記免疫優性配列がハプテン上に位置する
    請求の範囲第２項記載の組成物。
  5. 【請求項５】前記第１抗原のエピトープがハプテン上に
    位置する請求の範囲第１項記載の組成物。
  6. 【請求項６】少なくとも１種の分子が移植抗原をブロッ
    クする請求の範囲第１項記載の組成物。
  7. 【請求項７】少なくとも１種の分子がＴ−細胞のサブセ
    ットを不活性する請求の範囲第１項記載の組成物。
  8. 【請求項８】前記組成物が前記免疫応答を刺激すること
    によってその応答を調節する請求の範囲第１項記載の組
    成物。
  9. 【請求項９】少なくとも１種の分子がＴ−細胞のサブセ
    ットを刺激することにおいて効果的である請求の範囲第
    ８項記載の組成物。
  10. 【請求項１０】前記組成物が、免疫応答をブロックする
    ことによってその応答を調節する請求の範囲第１項記載
    の組成物。
  11. 【請求項１１】前記組成物がＴ−細胞のサブセットの活
    性化を妨げる請求の範囲第10項記載の組成物。
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