JP2612684B2 - Transformed microorganism into which recombinant DNA containing cyclomaltodextrin glucanotransferase gene has been introduced and its use - Google Patents
Transformed microorganism into which recombinant DNA containing cyclomaltodextrin glucanotransferase gene has been introduced and its useInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、シクロマルトデキストリン グルカノトラ
ンスフェラーゼ（EC 2.4.1.19）遺伝子を含む組換えDNA
とその利用、更に詳細には、バチルス ステアロサーモ
フィラス又はバチルス マセランス由来であって、制限
酵素EcoRI、HindIII、PvuII、KpnI、HindIII、XbaIおよ
びSalIにより切断される切断部位をこの順序で有し、ま
た、制限酵素EcoRI、HindIII、PvuII、KpnI、HindIIIお
よびXbaIにより切断される切断部位をこの順序で有し、
さらには、制限酵素Saue3AI、SalI、PvuII、AvaI、PstI
およびBamHIにより切断される切断部位をこの順序で有
し、制限酵素PvuIIの作用によりシクロマルトデキスト
リン グルカノトランスフェラーゼ形質発現能を失う組
換えDNAを有する形質転換微生物、および、その形質転
換微生物によるシクロマルトデキストリン グルカノト
ランスフェラーゼの製造方法に関する。The present invention relates to a recombinant DNA comprising a cyclomaltodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19) gene.
And its use, more particularly, having a cleavage site derived from Bacillus stearothermophilus or Bacillus macerans, which is cleaved by restriction enzymes EcoRI, HindIII, PvuII, KpnI, HindIII, XbaI and SalI in this order. Also have cleavage sites in this order, cleaved by restriction enzymes EcoRI, HindIII, PvuII, KpnI, HindIII and XbaI,
Furthermore, restriction enzymes Saue3AI, SalI, PvuII, AvaI, PstI
And a transformed microorganism having a recombinant DNA having a cleavage site which is cleaved by BamHI in this order, and which loses the ability to express cyclomaltodextrin glucanotransferase due to the action of the restriction enzyme PvuII, and cyclomalto by the transformed microorganism. The present invention relates to a method for producing dextrin glucanotransferase.
従来の技術 シクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラ
ーゼ（以下、CGTaseと略称する。）は、マセランス ア
ミラーゼとも言われ、古くからバチルス マセランス
（Bacillus macerans）の産生する酵素として知られて
いる。2. Description of the Related Art Cyclomaltodextrin glucanotransferase (hereinafter, abbreviated as CGTase) is also referred to as macerans amylase, and has long been known as an enzyme produced by Bacillus macerans.
近年、CGTaseは、バチルス マセランスだけでなく、
バチルス ステアロサーモフィラス（Bacillus stearot
hermophilus）、バチルス サーキュランス（Bacillus
circulans）などの微生物によっても産生されることが
知られ、その糖転移作用が工業的に広く利用されるよう
になってきた。In recent years, CGTase has been used not only in Bacillus macerans,
Bacillus stearot
hermophilus), Bacillus circulans (Bacillus)
circulans) are known to be produced also by microorganisms, and the transglycosylation thereof has been widely used industrially.
例えば、糊化澱粉液にCGTaseを作用させてシクロデキ
ストリンを製造し、また、液化澱粉とスクロースとの混
合溶液にCGTaseを作用させ澱粉からスクロースへの糖転
移反応に利用してグリコシルスクロースを製造してい
る。最近、シクロデキストリンは、例えば、酸化又は揮
発しやすい有機化合物を包接してより安定な包接化合物
を形成するためのホストとしての需要が増大し、また、
グリコシルスクロースは、上品な甘味を有する低う蝕性
甘味料（林原株式会社製造、登録商標カップリングシュ
ガー）としての需要が増大している。For example, a cyclodextrin is produced by allowing CGTase to act on a gelatinized starch solution, and glycosyl sucrose is produced by utilizing CGTase to act on a mixed solution of liquefied starch and sucrose to utilize for a sugar transfer reaction from starch to sucrose. ing. Recently, the demand for cyclodextrin as a host for inclusion of, for example, an organic compound which is easily oxidized or volatilized to form a more stable inclusion compound has been increased,
Glycosyl sucrose has been increasingly demanded as a low-cariogenic sweetener having an elegant sweetness (manufactured by Hayashibara Co., Ltd., coupling sugar).
このような需要の増大に応えるためCGTaseの安定供給
が急務になってきた。In order to respond to such an increase in demand, stable supply of CGTase has become urgent.
発明が解決しようとする問題点 本発明者等は、CGTaseの広範な給源確保と、CGTase産
生量の向上を目ざして鋭意研究を続けてきた。Problems to be Solved by the Invention The present inventors have intensively studied to secure a wide source of CGTase and to improve the amount of CGTase produced.
その結果、生体外での遺伝子組換え技術により、制限
酵素Pvu IIによる切断部位を有するCGTase遺伝子を含む
組換えDNAと、その組換えDNAを宿主微生物に導入した形
質転換微生物を得、更に、この形質転換微生物を栄養培
地に培養してCGTaseを大量に生産し得ることを見いだ
し、本発明を完成した。As a result, by in vitro gene recombination technology, a recombinant DNA containing a CGTase gene having a cleavage site with the restriction enzyme Pvu II, and a transformed microorganism obtained by introducing the recombinant DNA into a host microorganism, were further obtained. The present inventors have found that a large amount of CGTase can be produced by culturing a transformed microorganism in a nutrient medium, and completed the present invention.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
まず、本発明は、CGTase産生能を有する供与体微生物
よりその微生物のDNAを分離精製した後、例えば、超音
波、制限酵素などで切断し、得られたDNA断片と、同様
にしてベクターを切断して得られたベクター断片とを、
例えば、DNAリガーゼなどより結合させ、CGTase遺伝子
を含む組換えDNAを形成する。First, the present invention involves separating and purifying the DNA of a microorganism from a donor microorganism having CGTase-producing ability, for example, by sonication, cutting with a restriction enzyme, etc., and cutting the vector in the same manner as the obtained DNA fragment. And the vector fragment obtained by
For example, the recombinant DNA is bound with a DNA ligase or the like to form a recombinant DNA containing the CGTase gene.
この際、供与体微生物としては、CGTase産生能を有す
る微生物、例えば、特開昭47-20373号公報、特開昭50-6
3189号公報、特開昭50-88290号公報およびHans Bender,
Arch.Microbiol.Vol.111,271〜282（1977年）などに示
されているバチルス マセランス、バチルス メガテリ
ウム、バチルス サーキュランス、バチルス ポリミキ
サ、バチルス ステアロサーモフィラスなどのバチルス
属、クレーブシーラ ニューモニアェなどのクレーブシ
ーラ属などの細菌が適宜選ばれる。At this time, as the donor microorganism, a microorganism having CGTase-producing ability, for example, JP-A-47-20373, JP-A-50-6
No. 3189, JP-A-50-88290 and Hans Bender,
Bacillus macerans, Bacillus megaterium, Bacillus circulans, Bacillus polymixer, Bacillus genus such as Bacillus stearothermophilus, Claveseala such as Craveseala Numoniae shown in Arch.Microbiol.Vol.111,271-282 (1977). Bacteria such as genera are appropriately selected.
また、CGTase産生能を遺伝子組換えにより導入した形
質転換微生物を供与体微生物として利用することもでき
る。In addition, a transformed microorganism into which CGTase-producing ability has been introduced by genetic recombination can also be used as a donor microorganism.
供与体微生物由来のDNAは、供与体微生物を、例え
ば、液体培地で約１〜３日間通気攪拌培養し、得られる
培養物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させる
ことによって調製することができる。溶菌方法は、例え
ば、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵
素による処理や超音波処理などが用いられる。また、必
要によりプロテアーゼなどの他の酵素剤やラウリル硫酸
ナトリウムなどの界面活性剤を併用することも、更に凍
結融解処理を施すことも自由である。The DNA derived from the donor microorganism is prepared by, for example, culturing the donor microorganism in a liquid medium with aeration and stirring for about 1 to 3 days, collecting the resulting culture by centrifugation, and then lysing it. be able to. As the lysis method, for example, treatment with a cell wall lysing enzyme such as lysozyme or β-glucanase, or ultrasonic treatment is used. If necessary, other enzyme agents such as protease, a surfactant such as sodium lauryl sulfate, and the like, and freezing and thawing treatment can be freely used.
このようにして得られる溶菌物からDNAを分離、精製
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出、除蛋
白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、ア
ルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせる
ことによって行うことができる。In order to separate and purify DNA from the lysate thus obtained, conventional methods are used, for example, by appropriately combining methods such as phenol extraction, protein removal treatment, protease treatment, ribonuclease treatment, alcohol precipitation, and centrifugation. be able to.
DNAを切断する方法は、例えば、超音波処理、制限酵
素処理などにより行うことができるが、得られるDNA断
片とベクター断片との結合を容易にするためには、制限
酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する、例え
ばEcoR I、Hind III、BamH I、Sal I、Sal I、Xma I、M
bo I、Xba I、Sac I、Pst IなどのII型制限酵素が適し
ている。The method of cutting DNA can be carried out, for example, by sonication, treatment with a restriction enzyme, and the like.However, in order to facilitate binding of the obtained DNA fragment to a vector fragment, a restriction enzyme, particularly a specific nucleotide sequence, is used. Works, eg EcoR I, Hind III, BamH I, Sal I, Sal I, Xma I, M
Type II restriction enzymes such as bo I, Xba I, Sac I, Pst I are suitable.
ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖しうる
ファージ又はプラスミドが適している。A phage or plasmid capable of autonomous propagation in a host microorganism is suitable as a vector.
ファージとしては、例えば、エッシェリヒア コリを
宿主微生物とする場合には、λgt・λＣ、λgt・λＢな
どがバチルス ズブチリスを宿主微生物とする場合に
は、ρ11、ψ１ーψ105などが使用できる。As the phage, for example, when Escherichia coli is used as a host microorganism, λgt · λC, λgt · λB, and the like, when Bacillus subtilis is used as a host microorganism, ρ11, Δ1-Δ105, and the like can be used.
また、プラスミドとしては、例えば、エッシェリヒア
コリを宿主微生物とする場合には、pBR322、pBR325な
どが、バチルス ズブチリスを宿主微生物とする場合に
は、PUB110、pTZ4（pTP4）、pC194などが使用でき、更
に、例えば、エッシェリヒア コリ、バチルス ズブチ
リスなどの二以上の宿主微生物で自律的増殖の可能な、
例えばpHV14、TRp7、YEp7、pBS7などのベクターを利用
することも可能である。このようなベクターを、先に述
べたDNAと同様に制限酵素などで切断し、ベクター断片
を得る。Examples of the plasmid include pBR322 and pBR325 when Escherichia coli is used as a host microorganism, and PUB110, pTZ4 (pTP4) and pC194 when Bacillus subtilis is used as a host microorganism. For example, capable of autonomous growth on two or more host microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis,
For example, vectors such as pHV14, TRp7, YEp7, and pBS7 can be used. Such a vector is cut with a restriction enzyme or the like in the same manner as the DNA described above to obtain a vector fragment.
DNA断片とベクター断片とを結合させる方法は、公知
のDNAリガーゼを用いる方法であればよく、例えば、DNA
断片とベクター断片とをアニーリングの後、生体外で適
当なDNAリガーゼの作用により組換えDNAを作成する。必
要ならば、アニーリングの後、宿主微生物に導入して、
生体内のDNAリガーゼを利用して組換えDNAにすることも
できる。The method of binding the DNA fragment and the vector fragment may be a method using a known DNA ligase, for example, DNA
After annealing the fragment and the vector fragment, a recombinant DNA is prepared in vitro by the action of an appropriate DNA ligase. If necessary, after annealing, introduce into the host microorganism,
Recombinant DNA can also be obtained by using in vivo DNA ligase.
宿主微生物としては、組換えDNAが安定かつ自律的増
殖が可能でその形質発現のできるものであればよい。な
かでも、α−アミラーゼ（EC 3.2.1.1）産生能を欠いて
いる微生物は、CGTase産生量の測定が容易であるだけで
なく、産生されるCGTaseの分離、精製も容易であり有利
に利用できる。Any host microorganism may be used as long as the recombinant DNA is capable of stable and autonomous growth and capable of expressing its trait. Among them, microorganisms lacking the ability to produce α-amylase (EC 3.2.1.1) are not only easy to measure the amount of CGTase produced, but also easy to separate and purify the CGTase produced, and can be advantageously used. .
宿主微生物に組換えDNAを導入する方法は、公知の方
法、例えば、宿主微生物がエッシェリヒア属に属する微
生物の場合にはカルシュウムイオン存在下で行ない、バ
チルス属に属する微生物の場合にはコンピテントセル法
又はプロトプラスト法などを採用することができる。A method for introducing a recombinant DNA into a host microorganism is a known method, for example, in the case where the host microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia, in the presence of calcium ions, and in the case of a microorganism belonging to the genus Bacillus, the competent cell method. Alternatively, a protoplast method or the like can be employed.
組換えDNAが導入された形質転換微生物の選択方法
は、澱粉を含む平板培地上で生育し、かつ、澱粉からシ
クロデキストリンを生成するものを選択すればよい。As a method for selecting a transformed microorganism into which the recombinant DNA has been introduced, a microorganism that grows on a plate medium containing starch and that generates cyclodextrin from the starch may be selected.
このようにして一度選択されたCGTase遺伝子を含む組
換えDNAは、形質転換微生物から取り出して、他の宿主
微生物に導入することも容易に実施できることが判明し
た。またCGTase遺伝子を含む組換えDNAを制限酵素など
により切断してCGTase遺伝子を含むDNA断片とし、これ
と同様にプラスミドなどのベクターを切断して得られる
ベクター断片とを結合させることも容易に実施できるこ
とが判明した。It has been found that the recombinant DNA containing the CGTase gene once selected in this way can be easily taken out from a transformed microorganism and introduced into another host microorganism. In addition, the recombinant DNA containing the CGTase gene can be cleaved with a restriction enzyme or the like into a DNA fragment containing the CGTase gene, and a vector fragment obtained by cutting a vector such as a plasmid can be easily ligated in the same manner. There was found.
また、本発明のCGTase遺伝子を含む組換えDNAは、制
限酵素Pvu II（東洋紡績株式会社製造）による切断部位
を有しており、制限酵素Pvu IIの作用を受けCGTase遺伝
子が切断され、その形質発現能を失うことが判明した。Further, the recombinant DNA containing the CGTase gene of the present invention has a cleavage site with the restriction enzyme Pvu II (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and the CGTase gene is cleaved by the action of the restriction enzyme Pvu II, and the It was found that the expression ability was lost.
更に、このようにして得られた形質転換微生物を栄養
培地で培養することにより多量のCGTaseを安定して産生
しることも見いだした。Furthermore, they have found that a large amount of CGTase can be stably produced by culturing the thus obtained transformed microorganism in a nutrient medium.
栄養培地には、例えば、炭素源、窒素源、ミネラル、
更に必要ならば、アミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄
養素などを含有させればよい。Nutrient media include, for example, carbon sources, nitrogen sources, minerals,
If necessary, organic trace nutrients such as amino acids and vitamins may be contained.
この際、炭素源としては、澱粉、澱粉部分加水分解
物、グルコース、フラクトース、スクロースなどの糖質
が有利に用いられる。窒素源としては、アンモニアガ
ス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機
窒素源、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンステ
ィープリカー、肉エキスなどの有機窒素源が適宜用いら
れる。At this time, as the carbon source, starch, starch partially hydrolysate, saccharides such as glucose, fructose, and sucrose are advantageously used. As the nitrogen source, an inorganic nitrogen source such as ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salt and nitrate, and an organic nitrogen source such as peptone, yeast extract, defatted soybean, corn steep liquor, meat extract and the like are appropriately used.
培養方法は、例えば、液体培地をpH4〜10、温度25〜6
5℃の範囲に維持しつつ、通気攪拌などの好気的条件下
で約１〜４日間培養し、CGTaseを生成蓄積せしめればよ
い。The culture method is, for example, a liquid medium at pH 4 to 10 and a temperature of 25 to 6
CGTase may be produced and accumulated under aerobic conditions such as aeration and stirring for about 1 to 4 days while maintaining the temperature in the range of 5 ° C.
培養物中のCGTaseは、そのままを採取し利用すること
もできるが、一般には常法に従って、過、遠心分離な
どによりCGTase溶液と微生物菌体とに分離した後に利用
される。CGTase in the culture can be collected and used as it is, but is generally used after being separated into a CGTase solution and microbial cells by a conventional method such as filtration or centrifugation.
CGTaseが菌体中に存在する場合には、細胞を超音波、
界面活性剤、細胞壁溶解酵素などで処理し、次いで
過、遠心分離などしてCGTase溶液を採取する。When CGTase is present in the cells, the cells are sonicated,
Treat with a surfactant, a cell wall lysing enzyme and the like, and then collect the CGTase solution by filtration and centrifugation.
このようにして得られるCGTase溶液を、例えば、減圧
濃縮、膜濃縮し、更に、硫安、硫酸ソーダなどによる塩
析、メタノール、エタノール、アセトンなどによる分別
沈澱法などを適宜組み合せて精製し、より高純度のCGTa
seを採取し、工業用CGTase剤として有利に利用できる。The CGTase solution thus obtained is purified, for example, by concentration under reduced pressure and membrane concentration, and further by appropriately combining salting out with ammonium sulfate, sodium sulfate, etc., and fractional precipitation with methanol, ethanol, acetone, etc., and the like. CGTa of purity
se is collected and can be advantageously used as an industrial CGTase agent.
本発明でいうCGTase1単位とは、pH5.5、0.02Mの酢酸
緩衝液及び２×10-3Ｍの塩化カルシウムを含む0.3w/w％
のソリユブルスターチ溶液5mlに適当に希稀した酵素液
0.2mlを加え40℃で10分間反応した後、その反応液0.5ml
をとり、0.02N−硫酸水溶液15mlに混合して反応を停止
させ、更にこの反応停止後に0.1Nヨウ素ヨウ化カリウム
溶液0.2mlを加えて発色させ、次いで660nmにおける吸光
度を測定して、40℃で10分間反応させることによりソリ
ユブルスターチ15mgのヨウ素の呈色を完全に消失させる
酵素量をいう。The CGTase1 unit as used in the present invention refers to 0.3 w / w% containing a pH 5.5, 0.02 M acetate buffer and 2 × 10 −3 M calcium chloride.
Enzyme solution appropriately diluted in 5 ml of soy bull starch solution
After adding 0.2 ml and reacting at 40 ° C. for 10 minutes, the reaction solution 0.5 ml
The reaction was stopped by mixing with 15 ml of 0.02 N-sulfuric acid aqueous solution, and after the reaction was stopped, 0.2 ml of a 0.1 N potassium iodide iodide solution was added to develop a color.Then, the absorbance at 660 nm was measured, and at 40 ° C. The amount of the enzyme that completely eliminates the coloration of iodine of 15 mg of soybean starch by reacting for 10 minutes.
以下、実施例で本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
実施例１ バチルス ステアロサーモフィラスCGTase遺
伝子のエッシェリヒア コリへのクローニング （１） バチルス ステアロサーモフィラスの耐熱性CG
Tase遺伝子を含む染色体DNAの調製 バチルス ステアロサーモフィラスの耐熱性CGTase遺
伝子を含む染色体DNAは、斉藤、三浦等の方法（Bioche
m.Biophys.Acta,Vol.72、619〜629,1963）に準じて調製
した。即ち、バチルス ステアロサーモフィラス FERM
−P No.2225をブレイン ハート インフュージョン培
地で50℃、一夜通気攪拌培養した。培養液を遠心分離に
て集菌し、得られた菌体をTES緩衝液（pH8.0、トリスア
ミノメタン、塩酸、EDTA、塩化ナトリウム含有）に懸濁
し、次にリゾチームをml当り2mgの割合で加え、37℃で3
0分間保持した。これを、−20℃で一夜結凍した後、TSS
緩衝液（pH9.0、トリスアミノメタン、HCl、ラウリル硫
酸ナトリウム、塩化ナトリウム含有）を加え、60℃に加
温した後、TESフェノール混液（TES緩衝液（pH7.5）１
容とフェノール４容との混合液）を加え、氷水中で冷却
後、遠心分離し上清を得た。この上清に２倍容の冷エタ
ノールを加え粗染色体DNAを回収し、これをSSC緩衝液
（pH7.1、塩化ナトリウム、クエン酸３ナトリウム含
有）に溶解し、リボヌクレアーゼ（シグマ社製造、商品
名 RNase A）およびプロテアーゼ（科研製薬株式会社
製造、商品名 Pronase E）を作用させ、次いで、TESフ
ェノール混液を加え、冷却し遠心分離して、得られる上
清に２倍容の冷エタノールを加え精製染色体DNAを回収
し、緩衝液（pH7.5、トリスアミノメタン、HCl、EDTA含
有）に溶解して−20℃に保存した。Example 1 Cloning of Bacillus stearothermophilus CGTase gene into Escherichia coli (1) Heat-resistant CG of Bacillus stearothermophilus
Preparation of chromosomal DNA containing Tase gene The chromosomal DNA containing the thermostable CGTase gene of Bacillus stearothermophilus can be obtained by the method of Saito, Miura, et al.
m. Biophys. Acta, Vol. 72, 619-629, 1963). That is, Bacillus stearothermophilus FERM
-P No. 2225 was cultured in a Brain Heart Infusion medium at 50 ° C overnight with aeration and agitation. The culture solution is collected by centrifugation, and the obtained cells are suspended in TES buffer (pH 8.0, containing trisaminomethane, hydrochloric acid, EDTA, and sodium chloride), and then lysozyme is added at a rate of 2 mg / ml. At 37 ° C
Hold for 0 minutes. After freezing overnight at -20 ℃, TSS
After adding a buffer solution (pH 9.0, containing trisaminomethane, HCl, sodium lauryl sulfate, and sodium chloride) and heating to 60 ° C., a TES phenol mixture (TES buffer solution (pH 7.5) 1
The mixture was cooled in ice water and centrifuged to obtain a supernatant. Two volumes of cold ethanol was added to the supernatant to recover crude chromosomal DNA, which was dissolved in SSC buffer (pH 7.1, containing sodium chloride and trisodium citrate), and ribonuclease (manufactured by Sigma, trade name) RNase A) and protease (Pronase E, manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.), then add a TES phenol mixture, cool and centrifuge, and add 2 volumes of cold ethanol to the resulting supernatant for purification. The chromosomal DNA was recovered, dissolved in a buffer (pH 7.5, containing trisaminomethane, HCl, and EDTA) and stored at -20 ° C.
（２） プラスミド pBR322の調製 プラスミド pBR322（ATCC 37017）は、J.Meyers等の
方法（J.Bacteriol.,Vol.127,1524〜1537、1976）に準
じてエッシェリヒア コリから分離、調製した。(2) Preparation of plasmid pBR322 Plasmid pBR322 (ATCC 37017) was isolated and prepared from Escherichia coli according to the method of J. Meyers et al. (J. Bacteriol., Vol. 127, 1524-1537, 1976).
（３） CGTase遺伝子を含む組換えDNAの作製 実施例１−（１）で調製した耐熱性CGTase遺伝子を含
む精製染色体DNAに対して、制限酵素Mbo I（株式会社ニ
ッポンジーン製造）を作用させ、DNA断片が１〜20Kbpに
なるよう染色体DNAを部分的に切断した。一方、実施例
１−（２）で調製したプラスミドpBR322に対して、制限
酵素BamH I（株式会社ニッポンジーン製造）を作用さ
せ、完全に切断し、次いで、プラスミド断片のセルフラ
イゲーションを防止するため、エッシェリヒア コリ由
来のアルカリフォスファターゼ（宝酒造株式会社製造）
を作用させ、pBR322断片の５′末端を脱リン酸化した。(3) Preparation of recombinant DNA containing CGTase gene The purified chromosomal DNA containing the heat-resistant CGTase gene prepared in Example 1- (1) was treated with restriction enzyme Mbo I (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) to obtain DNA. The chromosomal DNA was partially cut so that the fragment became 1 to 20 Kbp. On the other hand, a restriction enzyme BamHI (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) was allowed to act on the plasmid pBR322 prepared in Example 1- (2) to completely cut the plasmid, and then Escherichia coli was added to prevent self-ligation of the plasmid fragment. Escherichia coli-derived alkaline phosphatase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.)
To dephosphorylate the 5 'end of the pBR322 fragment.
両断片の結合は、T4 DNAリガーゼ（株式会社ニッポン
ジーン製造）を４℃で一夜反応させて行ない、組換えDN
Aを作製した。Binding of both fragments was carried out by reacting T4 DNA ligase (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) at 4 ° C. overnight, and the recombinant DN was
A was prepared.
（４） 組換えDNAのエッシェリヒア コリへの導入 宿主微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているエ
ッシェリヒア コリHB101（ATCC 33694）を用いた。(4) Introduction of recombinant DNA into Escherichia coli As a host microorganism, Escherichia coli HB101 (ATCC 33694) lacking amylase-producing ability was used.
本微生物をＬ培地で37℃、４時間培養し集菌した後、
10mM塩化ナトリウム、50mM塩化マンガンを含有する10mM
酢酸塩緩衝液（pH5.6）に懸濁し、遠心分離にて集菌
し、続いて25mM塩化カルシウム、125mM塩化マンガンを
含有する10mM酢酸塩緩衝液（pH5.6）に懸濁したもの
に、実施例１−（３）で得た組換えDNAを加え、氷水中
で30分間静置した。更に、37℃に加温し、Ｌ培地を加え
37℃で30分間保ち、これを、抗生物質アンピシリン50μ
g/mlを含有し、かつ澱粉2mg/mlを含有するＬ−アガー平
板培地上に拡げ、37℃で24時間保ち、コロニーを形成さ
せた。After culturing this microorganism in L medium at 37 ° C. for 4 hours and collecting the cells,
10mM containing 10mM sodium chloride, 50mM manganese chloride
Suspended in acetate buffer (pH 5.6), collected by centrifugation, and subsequently suspended in 10 mM acetate buffer (pH 5.6) containing 25 mM calcium chloride and 125 mM manganese chloride. The recombinant DNA obtained in Example 1- (3) was added, and the mixture was allowed to stand in ice water for 30 minutes. Further, the mixture was heated to 37 ° C, and L medium was added.
Hold at 37 ° C. for 30 minutes and add 50 μl of the antibiotic ampicillin
g / ml and spread on L-Agar plate containing 2 mg / ml starch and kept at 37 ° C for 24 hours to allow colonies to form.
本平板から、ヨード呈色法により、澱粉を分解し、サ
イクロデキストリンを生成しているコロニーを選択し、
CGTase遺伝子を含む組換えDNAが導入されている形質転
換微生物を選択した。本微生物を増殖させ、実施例１−
（２）のプラスミドの調製方法に準じて組換えDNAを取
り出し、これに各種制限酵素を作用させ、その切断部位
を決定した後、制限酵素EcoR I（株式会社ニッポンジー
ン製造）で完全切断し、次いで、実施例１−（３）と同
様にT4 DNAリガーゼを作用させ、組換えDNAを作製し、
実施例１−（４）の方法に準じてCGTase遺伝子を含む小
型の組換えDNAを保有する形質転換微生物を選択した。From this plate, the starch was decomposed by the iodine coloration method, and colonies producing cyclodextrin were selected.
Transformed microorganisms into which the recombinant DNA containing the CGTase gene had been introduced were selected. The microorganism was grown, and Example 1-
Recombinant DNA is taken out according to the method for preparing a plasmid in (2), various restriction enzymes are allowed to act on the DNA, the cleavage site is determined, and the DNA is completely digested with EcoRI (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.). In the same manner as in Example 1- (3), T4 DNA ligase was allowed to act to produce a recombinant DNA.
A transformed microorganism having a small recombinant DNA containing the CGTase gene was selected according to the method of Example 1- (4).
更に、この小型の組換えDNAを制限酵素Sal I（株式会
社ニッポンジーン製造）で完全切断し、以後、前記のEc
oR Iの場合と同様に処理して、CGTase遺伝子を含む更に
小型の組換えDNAを保有する形質転換微生物を選択し
た。Further, this small recombinant DNA was completely cut with a restriction enzyme Sal I (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.),
By treating in the same manner as in the case of oRI, a transformed microorganism having a smaller recombinant DNA containing the CGTase gene was selected.
本微生物の一菌株をエッシェリヒア コリ TCH201
（FERM P−7924）と命名し、これが保有する組換えDNA
をpTCH201と命名した。Escherichia coli TCH201
(FERM P-7924) and the recombinant DNA it possesses
Was named pTCH201.
組換えDNA pTCH201について、バチルス ステアロサ
ーモフィラス由来DNA部分の制限酵素切断地図を第１図
に示す。FIG. 1 shows a restriction map of the DNA portion derived from Bacillus stearothermophilus for the recombinant DNA pTCH201.
第１図から明らかなように、制限酵素Pvu II（東洋紡
績株式会社製造）、Kpn I、Hind III（株式会社ニッポ
ンジーン製造）、Xba I（宝酒造株式会社製造）で切断
を受けることが判明した。As is clear from FIG. 1, it was found that cleavage was caused by restriction enzymes Pvu II (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), Kpn I, Hind III (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), and Xba I (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.).
一方、制限酵素EcoR I、BamH I、Pst I、Xho I、Bgl
II、Acc I（以上、株式会社ニッポンジーン製造）では
切断されなかった。On the other hand, restriction enzymes EcoR I, BamH I, Pst I, Xho I, Bgl
II, Acc I (above, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) did not cut.
実施例２ バチルス ステアロサーモフィラスCGTase遺
伝子のバチルス ズブチリスへのクローニング （１） 組換えDNA pTCH201の調製 組換えDNA pTCH201は、実施例１−（２）の方法に準
じてエッシェリヒア コリ TCH201（FERM P−7924）か
ら分離調製した。Example 2 Cloning of Bacillus stearothermophilus CGTase Gene into Bacillus subtilis (1) Preparation of Recombinant DNA pTCH201 The recombinant DNA pTCH201 was prepared according to the method of Example 1- (2), Escherichia coli TCH201 (FERM P. −7924).
（２） プラスミド pUB110の調製 プラスミド pUB110（ATCC 37015）は、gryczanらの
方法（J.Bacteriol.,Vol.134,318〜329,1978）に準じて
バチルス ズブチリスから分離、調製した。(2) Preparation of plasmid pUB110 Plasmid pUB110 (ATCC 37015) was isolated and prepared from Bacillus subtilis according to the method of gryczan et al. (J. Bacteriol., Vol. 134, 318-329, 1978).
（３） CGTase遺伝子を含む組換えDNAの作製 実施例２−（１）で調製した耐熱性CGTase遺伝子を含
む組換えDNA pTCH201に対して、制限酵素EcoR IおよびX
ba Iを同時に作用させ完全に切断した。(3) Preparation of Recombinant DNA Containing CGTase Gene With respect to the recombinant DNA pTCH201 containing the thermostable CGTase gene prepared in Example 2- (1), restriction enzymes EcoR I and X
ba I was simultaneously acted to cut completely.
一方、実施例２−（２）で調製したプラスミド pUB1
10に対して、制限酵素EcoR IおよびXba Iを同様に作用
させ完全に切断した。On the other hand, plasmid pUB1 prepared in Example 2- (2)
10 were treated with the same restriction enzymes EcoR I and Xba I in the same manner to completely cut.
両断片の結合は、T4 DNAリガーゼを用いて、実施例１
−（３）と同様に作用させ組換えDNAを作製した。Binding of both fragments using T 4 DNA ligase, Example 1
-Recombinant DNA was prepared in the same manner as in (3).
（４） 組換えDNAのバチルス ズブチリスへの導入 宿主微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているバ
チルス ズブチリス 715Aを用いた。本微生物をブレイ
ン ハート インフュージョン培地で28℃、５時間培養
し集菌した後、Schaefferらの方法（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,Vol.73,2151〜2155,1976）に準じてプロトプラス
ト懸濁液を調製した。(4) Introduction of recombinant DNA into Bacillus subtilis Bacillus subtilis 715A lacking amylase-producing ability was used as a host microorganism. The microorganism was cultured in a Brain Heart Infusion medium at 28 ° C. for 5 hours and collected, followed by the method of Schaeffer et al. (Proc. Natl. Acad. Sc.
Protoplast suspension was prepared according to i.USA, Vol.73,2151-2155,1976).
本液に、実施例２−（３）で調製した組換えDNAを加
え、関口らの方法（Agr.Bio.Chem.,Vol.46,1617〜1621,
1982）に準じて形質転換を行った後、HCP培地に抗生物
質カナマシン250μg/mlを含有し、かつ澱粉10mg/mlを含
有するアガー平板培地上に拡げ、28℃、72時間保ち、コ
ロニーを形成させた。To this solution, the recombinant DNA prepared in Example 2- (3) was added, and the method of Sekiguchi et al. (Agr. Bio. Chem., Vol. 46, 1617-1621) was added.
1982), spread on an agar plate medium containing 250 μg / ml of the antibiotic Kanamachine and 10 mg / ml of starch in the HCP medium, and kept at 28 ° C. for 72 hours to form colonies. I let it.
以後、実施例１−（４）の方法に準じて耐熱性CGTase
遺伝子を含む組換えDNAが導入されている形質転換微生
物を選択した。本微生物の一菌株をバチルス ズブチリ
ス TCU211（FERM P−7927）と命名し、これが保有する
組換えDNAをpTCU211と命名した。Thereafter, the heat-resistant CGTase was prepared according to the method of Example 1- (4).
A transformed microorganism into which the recombinant DNA containing the gene was introduced was selected. One strain of this microorganism was named Bacillus subtilis TCU211 (FERM P-7927), and the recombinant DNA carried by this strain was named pTCU211.
組換えDNA pTCU211について、バチルス ステアロサ
ーモフィラス由来DNA部分の制限酵素切断地図を第２図
に示す。第２図から明らかなように、制限酵素Pvu II、
Kpn I、Hind IIIで切断を受けることが判明した。FIG. 2 shows a restriction map of the DNA portion derived from Bacillus stearothermophilus for the recombinant DNA pTCU211. As is clear from FIG. 2, the restriction enzyme Pvu II,
Kpn I and Hind III were found to undergo cleavage.
一方、制限酵素EcoR I、BamH I、Pst I、Xho I、Bgl
II、Acc I、Xba Iでは切断されなかった。On the other hand, restriction enzymes EcoR I, BamH I, Pst I, Xho I, Bgl
It was not cleaved by II, Acc I and Xba I.
実施例３ 形質転換微生物によるCGTase （１） 形質転換微生物によるCGTaseの調製 バチルス ステアロサーモフィラス由来の耐熱性CGTa
se遺伝子を含む組換えDNAを導入した形質転換微生物エ
ッシェリヒア コリ TCH201（FERM P−7924）およびバ
チルス ズブチリス TCU211（FERM P−7927）を用いて
CGTaseを調製した。Example 3 CGTase by transformed microorganism (1) Preparation of CGTase by transformed microorganism Heat-resistant CGTa derived from Bacillus stearothermophilus
Using the transformed microorganism Escherichia coli TCH201 (FERM P-7924) and Bacillus subtilis TCU211 (FERM P-7927) into which the recombinant DNA containing the se gene has been introduced.
CGTase was prepared.
また、これら形質転換微生物と宿主微生物ならびに供
与体微生物をバチルス ステアロサーモフィラスの産生
するCGTase産生量を比較した。The amount of CGTase produced by Bacillus stearothermophilus was compared between the transformed microorganism, the host microorganism and the donor microorganism.
液体培地は、コーンスティープリカー1.0w/v％、硫酸
アンモニウム0.1w/v％、炭酸カルシウム1.0w/v％、澱粉
1w/v％および水からなり、pH7.2に調製して120℃で20分
間滅菌し、冷却して調製した。エッシェリヒア コリ
TCH201の場合には、この培地に、抗生物質アンピシリン
をml当り50μｇの割合で加えて植菌し、またエッシェリ
ヒア コリ HB101の場合には抗生物質を加えずに植菌
し、それぞれ37℃、48時間通気攪拌培養した。The liquid medium is corn steep liquor 1.0 w / v%, ammonium sulfate 0.1 w / v%, calcium carbonate 1.0 w / v%, starch
It was made up of 1 w / v% and water, adjusted to pH 7.2, sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, and cooled. Escherichia coli
In the case of TCH201, the antibiotic ampicillin was added to this medium at a rate of 50 μg per ml and inoculated, and in the case of Escherichia coli HB101, the medium was inoculated without the antibiotic and incubated at 37 ° C. for 48 hours, respectively. The cells were cultured with aeration and stirring.
また、バチルス ズブチリス TCU201の場合には、前
記液体培地に抗生物質カナマイシンをml当り５μｇの割
合で加えて植菌し、また、バチルス ズブチリス 715A
の場合には抗生物質を加えずに植菌し、それぞれ28℃で
72時間培養した。In the case of Bacillus subtilis TCU201, the liquid medium was inoculated with the antibiotic kanamycin at a rate of 5 μg per ml and inoculated with Bacillus subtilis 715A.
In the case of, inoculate without adding antibiotics,
The culture was performed for 72 hours.
また、バチルス ステアロサーモフィラス FERM−P
No.2225の場合には、前記液体培地に抗生物質を加える
ことなく、50℃で48時間培養した。各培養液を、遠心分
離し、上清と菌体とに分離し、上清はそのまま活性測定
し、菌体は超音波処理にて破壊した後活性測定し、培養
液量に換算して活性を求めた。結果は、第１−１表に示
す。In addition, Bacillus stearothermophilus FERM-P
In the case of No. 2225, the liquid medium was cultured at 50 ° C. for 48 hours without adding an antibiotic. Each culture solution was centrifuged, separated into supernatant and bacterial cells, the supernatant was measured for activity as it was, the cells were destroyed by sonication, and the activity was measured. I asked. The results are shown in Table 1-1.
第１−１表の結果から明らかなごとく、形質転換微生
物からのCGTase産生量は向上しており、工業的生産方法
として好都合である。 As is clear from the results in Table 1-1, the amount of CGTase produced from the transformed microorganism has been improved, which is convenient as an industrial production method.
（２） 形質転換微生物によるCGTaseの安定温度 実施例３−（１）で調製したエッシェリヒア コリ
TCH201の上清を硫安0.6飽和で塩析して粗CGTase剤を調
製、採取した。このCGTase剤を用いて、その安定温度に
ついて調べた。(2) Stable temperature of CGTase by transformed microorganism Escherichia coli prepared in Example 3- (1)
The supernatant of TCH201 was salted out with 0.6 saturation of ammonium sulfate to prepare and collect a crude CGTase agent. Using this CGTase agent, its stable temperature was examined.
5mMのCaCl2を含有する50mMトリス−マレイン酸塩緩衝
液（pH7.0）中にて、CGTase剤を異なる温度で30分間イ
ンキュベートした。その後、残存するCGTase活性を測定
し、その残存活性を相対活性で表した。結果は、第１−
２表に示す。50mM Tris containing CaCl 2 of 5 mM - at maleate buffer (pH 7.0) and incubated 30 minutes CGTase agent at different temperatures. Thereafter, the remaining CGTase activity was measured, and the remaining activity was expressed as a relative activity. The result is
The results are shown in Table 2.
第１−２表の結果から、形質転換微生物からのCGTase
は、70℃まで安定であることが判明した。また、これと
同様に、バチルス ズブチリス TCU211の安定温度につ
いても調べたところ、エッシェリヒア コリ TCH201と
同様の結果を得た。 From the results in Table 1-2, CGTase from the transformed microorganism
Was found to be stable up to 70 ° C. Similarly, when the stable temperature of Bacillus subtilis TCU211 was examined, the same result as that of Escherichia coli TCH201 was obtained.
（３） 形質転換微生物によるCGTaseの等電点 実施例３−（１）で得たエッシェリヒア コリ TCH2
01の上清を硫安0.6飽和で塩析して粗CGTase剤を調製、
採取した。このCGTase剤を用いて、エヌ カシンプーラ
ス（N.Catsimpoolas）の方法［アナリティカル バイオ
ケミストリィ（Analytical Biochemistry）,Vol.26,pp.
480〜482,（1968年）］に準じて、CGTaseの等電点を調
べた。具体的には、等電点電気泳動用ゲル（LKB社製、
商品名「アンフォライン」）を充填した長さ65mmのガラ
ス製カラムを用い、200Vの安電圧で16時間、更に、400V
の定電圧で１時間の通電条件にて、等電点電気泳動を行
った。通電終了後、ガラス製カラムからゲルを取り出
し、これを5mm間隔に切断し、水抽出して、そのpHを測
定することにより、ゲル全体のpH勾配を求めた。これと
は別に、ガラス製カラムから取り出したゲルをクーマシ
ー・ブルーで染色し、脱色処理を行った後、波長600nm
にてクロマトスキャナー（島津製作所製、商品名「Mode
l CS−930」）にかけた。結果は、第５図に示す。(3) Isoelectric point of CGTase by transformed microorganism Escherichia coli TCH2 obtained in Example 3- (1)
Salting out the supernatant of 01 with ammonium sulfate 0.6 saturation to prepare a crude CGTase agent,
Collected. Using this CGTase agent, the method of N. Catsimpoolas [Analytical Biochemistry, Vol.
480-482, (1968)], and the isoelectric point of CGTase was examined. Specifically, gels for isoelectric focusing (LKB,
Using a glass column 65 mm long filled with “Ampholine” (trade name), low voltage of 200V for 16 hours, and 400V
Isoelectric focusing was carried out at a constant voltage for 1 hour under the conditions of current supply. After completion of the energization, the gel was taken out of the glass column, cut at 5 mm intervals, extracted with water, and its pH was measured to determine the pH gradient of the entire gel. Separately, the gel removed from the glass column was stained with Coomassie Blue, decolorized, and treated at a wavelength of 600 nm.
Chromatography scanner (manufactured by Shimadzu Corporation, trade name "Mode
l CS-930 ”). The results are shown in FIG.
本実験結果から、形質転換微生物からのCGTaseの等電
点は、5.0±0.1（±SD,n＝８）であることが判明し
た。また、これと同様に、バチルス ズブチリス TCU2
11の等電点についても調べたところ、エッシェリヒア
コリ TCH201と同様の結果を得た。From the results of this experiment, it was found that the isoelectric point of CGTase from the transformed microorganism was 5.0 ± 0.1 (± SD, n = 8). Similarly, Bacillus subtilis TCU2
When I also examined the eleven isoelectric points, Escherichia
Similar results were obtained with E. coli TCH201.
更に、実施例３−（１）で得たエッシェリヒア コリ
TCH201及びバチルス ズブチリス TCU211の上清を硫
安0.6飽和で塩析して粗CGTase剤を調製、採取したCGTas
e剤を用いて、澱粉からスクロースへの糖転移量、澱粉
からのシクロデキストリン生成量、シクロデキストリン
α、β、γの生成比率、至適温度、至適pH、安定温度、
安定pHなどの酵素的性質について調べたところ、形質転
換微生物のCGTaseは、供与体微生物バチルス ステアロ
サーモフィラスのそれと類似する性質を示した。Furthermore, the Escherichia coli obtained in Example 3- (1) was used.
The crude CGTase was prepared by salting out the supernatant of TCH201 and Bacillus subtilis TCU211 with 0.6 saturation of ammonium sulfate.
Using the e agent, the amount of sugar transfer from starch to sucrose, the amount of cyclodextrin produced from starch, the production ratio of cyclodextrin α, β, γ, optimal temperature, optimal pH, stable temperature,
Examination of the enzymatic properties such as stable pH revealed that the transformed microorganism CGTase exhibited properties similar to those of the donor microorganism Bacillus stearothermophilus.
実施例４ バチルス マセランス CGTase遺伝子のエッ
シェリヒア コリへのクローニング （１） バチルス マセランスのCGTase遺伝子を含む染
色体DNAの調製 バチルス マセランスのCGTase遺伝子を含む染色体DN
Aは、バチルス マセランス 17Aを28℃で培養した以外
は、実施例１−（１）の方法に準じて調製した。Example 4 Cloning of Bacillus macerans CGTase gene into Escherichia coli (1) Preparation of chromosomal DNA containing Bacillus macerans CGTase gene Chromosome DN containing Bacillus macerans CGTase gene
A was prepared according to the method of Example 1- (1) except that Bacillus macerans 17A was cultured at 28 ° C.
（２） CGTase遺伝子を含む組換えDNAの作製 実施例４−（１）で調製したバチルス マセランス由
来のCGTase遺伝子を含む精製染色体DNAに対して、制限
酵素Hind III（株式会社日本ジーン製造）を作用させ、
実施例１−（３）と同様に部分的に切断した。(2) Preparation of recombinant DNA containing CGTase gene The restriction enzyme Hind III (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) acts on the purified chromosomal DNA containing the CGTase gene derived from Bacillus macerans prepared in Example 4- (1). Let
It was partially cut in the same manner as in Example 1- (3).
一方、実施例１−（２）の方法で調製したプラスミド
pBR32に対して、制限酵素Hind IIIを作用させ、完全
に切断し、次いで、実施例１−（３）で述べた方法で
５′末端の脱リン酸化を行ない、更に両断片の結合を、
実施例１−（３）の方法に準じて行ない、組換えDNAを
作製した。On the other hand, the plasmid prepared by the method of Example 1- (2)
The restriction enzyme Hind III was allowed to act on pBR32 to completely cleave it, and then the 5 ′ end was dephosphorylated by the method described in Example 1- (3).
The recombinant DNA was prepared according to the method of Example 1- (3).
（３） 組換えDNAのエッシェリヒア コリへの導入 宿主微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているエ
ッシェリヒア コリ HB101（ATCC 33694）を用いて、
実施例１−（４）の方法に準じて、組換えDNAが導入さ
れている形質転換微生物を選択した。この微生物から組
換えDNAを取り出し、これに各種制限酵素を作用させ、
その切断部位を決定した後、制限酵素SAU3A I（株式会
社ニッポンジーン製造）で部分切断し、一方、実施例１
−（２）の方法で得たプラスミド pBR322を制限酵素Ba
mH Iで完全に切断した後、実施例１−（３）と同様に
５′末端の脱リン酸化を行い、更にT4 DNAリガーゼを同
様に作用させ、組換えDNAを作製し、実施例１−（４）
の方法に準じてCGTase遺伝子を含む小型化の組換えDNA
を保有する形質転換微生物を選択した。(3) Introduction of recombinant DNA into Escherichia coli As a host microorganism, Escherichia coli HB101 (ATCC 33694) lacking amylase-producing ability was used.
According to the method of Example 1- (4), a transformed microorganism into which the recombinant DNA had been introduced was selected. Take out the recombinant DNA from this microorganism, act on it with various restriction enzymes,
After the cleavage site was determined, the fragment was partially cut with the restriction enzyme SAU3A I (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.).
-Plasmid pBR322 obtained by the method of (2) is replaced with restriction enzyme Ba.
After complete cleavage with mHI, dephosphorylation of the 5 'end was carried out in the same manner as in Example 1- (3), and further T4 DNA ligase was allowed to act in the same manner to prepare recombinant DNA. (4)
Miniaturized recombinant DNA containing CGTase gene according to the method of
The transformed microorganisms having the following were selected.
本微生物の一菌株をエッシェリヒア コリ MAH2（FE
RM P−7925）と命名し、これが保有する組換えDNAをpMA
H2と命名した。One strain of this microorganism was Escherichia coli MAH2 (FE
RM P-7925).
Named H2.
組換えDNA pMAH2について、バチルス マセランス由
来のDNA部分の制限酵素切断地図を第３図に示す。FIG. 3 shows a restriction map of the DNA portion derived from Bacillus macerans for the recombinant DNA pMAH2.
第３図から明らかなように、制限酵素Pvu II、Sal
I、Ava I（株式会社日本ジーン製造）、Pst I（株式会
社日本ジーン製造）で切断を受けることが判明した。As is clear from FIG. 3, the restriction enzymes Pvu II, Sal
I, Ava I (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) and Pst I (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) were found to be cut.
一方、制限酵素EcoR I、Hind III、Kpn I、BamH I、X
ba I、Xho I、Sma Iでは切断されなかった。On the other hand, restriction enzymes EcoR I, Hind III, Kpn I, BamH I, X
It was not digested with baI, XhoI, or SmaI.
実施例５ バチルス マセランス CGTase遺伝子のバチ
ルス ズブチリスへのクローニング （１） 組換えDNA pMAH2の調製 組換えDNA pMAH2は、実施例１−（２）の方法に準じ
てエッシェリヒア コリ MAH2（FERM P−7925）から分
離調製した。Example 5 Cloning of Bacillus macerans CGTase gene into Bacillus subtilis (1) Preparation of recombinant DNA pMAH2 Recombinant DNA pMAH2 was prepared from Escherichia coli MAH2 (FERM P-7925) according to the method of Example 1- (2). Separated and prepared.
（２） CGTase遺伝子を含む組換えDNAの作製 実施例５−（１）で調製したCGTase遺伝子を含む組換
えDNA pMAH2に対して、制限酵素EcoR IおよびBamH Iを
同時に作用させ完全に切断した。(2) Preparation of Recombinant DNA Containing CGTase Gene Restriction enzymes EcoR I and BamHI were allowed to act on the recombinant DNA pMAH2 containing the CGTase gene prepared in Example 5- (1) at the same time to completely cut it.
一方、実施例２−（２）の方法で調製したプラスミド
pUB110に対して、制限酵素EcoR IおよびBamH Iを同時
に作用させ完全に切断した。On the other hand, the plasmid prepared by the method of Example 2- (2)
The restriction enzymes EcoR I and BamH I were simultaneously acted on pUB110 to completely cut it.
両断片の結合は、T4 DNAリガーゼを用いて、実施例１
−（３）と同様に作用させ組換えDNAを作製した。The binding of both fragments was determined using T4 DNA ligase in Example 1
-Recombinant DNA was prepared in the same manner as in (3).
（３） 組換えDNAのバチルス ズブチリスへの導入 宿主微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているバ
チルス ズブチリス 715Aを用いて、実施例２−（４）
の方法に準じて、バチルス マセランス由来のCGTase遺
伝子を含む組換えDNAが導入されている形質転換微生物
を選択した。(3) Introduction of Recombinant DNA into Bacillus subtilis Using Bacillus subtilis 715A lacking amylase-producing ability as a host microorganism, Example 2- (4)
According to the above method, a transformed microorganism into which a recombinant DNA containing a CGTase gene derived from Bacillus macerans was introduced was selected.
本微生物の一菌株をバチルス ズブチリス MAU210
（FERM P−7926）と命名し、これが保有する組換えDNA
をpMAU210と命名した。組換えDNA pMAU210について、バ
チルス マセランス由来のDNA部分の制限酵素切断地図
を第４図に示す。第４図から明らかなように、制限酵素
Pvu II、Sal I、Ava I、Pat Iで切断を受けることが判
明した。One strain of this microorganism was Bacillus subtilis MAU210
(FERM P-7926) and the recombinant DNA it possesses
Was named pMAU210. FIG. 4 shows a restriction map of the DNA portion derived from Bacillus macerans for the recombinant DNA pMAU210. As is clear from FIG.
Pvu II, Sal I, Ava I and Pat I were found to undergo cleavage.
一方、制限酵素EcoR I、Hind III、Kpn I、BamH I、X
ba I、Xho I、Sma1では切断されなかった。On the other hand, restriction enzymes EcoR I, Hind III, Kpn I, BamH I, X
It was not cleaved by baI, XhoI or Sma1.
実施例６ 形質転換微生物によるCGTaseの調製 バチルス マセランス由来CGTase遺伝子を含む組換え
DNAを導入した形質転換微生物エッシェリヒア コリ M
AH2（FERM P−7925）およびバチルス ズブチリス MAU
210（FERM P−7926）を用いてCGTaseを調製した。ま
た、これら形質転換微生物と宿主微生物ならびに供与体
微生物バチルス マセランスの産生するCGTase産生量を
比較した。液体培地は実施例３の方法で調製した。Example 6 Preparation of CGTase by transformed microorganism Recombination containing CGTase gene derived from Bacillus macerans
Escherichia coli M, a transformed microorganism into which DNA has been introduced
AH2 (FERM P-7925) and Bacillus subtilis MAU
CGTase was prepared using 210 (FERM P-7926). In addition, the amounts of CGTase produced by these transformed microorganisms, the host microorganism, and the donor microorganism Bacillus macerans were compared. The liquid medium was prepared by the method of Example 3.
エッシェリヒア コリ MAH2の場合には、この培地に
抗生物質アンピシリンをml当り50μｇの割合で加えて植
菌し、また、エッシェリヒア コリ HB101の場合には
抗生物質を加えずに植菌し、それぞれ35℃で24時間通気
攪拌培養した。In the case of Escherichia coli MAH2, the antibiotic ampicillin was added to this medium at a rate of 50 μg per ml, and the cells were inoculated.In the case of Escherichia coli HB101, the cells were inoculated without antibiotics, and each was inoculated at 35 ° C. The cells were cultured with aeration and stirring for 24 hours.
また、バチルス ズブチリス MAU210の場合には、前
記液体培地に抗生物質カナマイシンをml当り５μｇの割
合で加えて植菌し、またバチルス ズブチリス 715Aの
場合には抗生物質を加えずに植菌し、それぞれ28℃、72
時間培養した。In the case of Bacillus subtilis MAU210, the liquid medium was inoculated with the antibiotic kanamycin at a rate of 5 μg per ml, and in the case of Bacillus subtilis 715A, inoculated with no antibiotic. ° C, 72
Cultured for hours.
また、バチルス マセランス 17Aの場合には、前記
液体培地に抗生物質を加えることなく、28℃で72時間培
養した。In the case of Bacillus macerans 17A, the liquid medium was cultured at 28 ° C. for 72 hours without adding an antibiotic.
各培養液は、実施例３の場合と同様に処理して活性を
測定した。結果は第２表に示す。Each culture was treated in the same manner as in Example 3 and the activity was measured. The results are shown in Table 2.
第２表の結果から明らかなごとく、形質転換微生物か
らのCGTase産生量は向上しており、工業的生産方法とし
て好適である。 As is clear from the results in Table 2, the amount of CGTase produced from the transformed microorganism has been improved, which is suitable as an industrial production method.
また、これら上清を硫安0.6飽和で塩析して粗CGTase
剤を調製採取した。Further, these supernatants were salted out with 0.6 saturation of ammonium sulfate to obtain crude CGTase.
The agent was prepared and collected.
このCGTase剤を用いて、実施例３の場合と同様に各種
の酵素的性質について比較したところ、形質転換微生物
のCGTaseは、供与体微生物バチルス マセランスのそれ
と類似する性質を示した。Using this CGTase agent, various enzymatic properties were compared in the same manner as in Example 3, and the CGTase of the transformed microorganism showed properties similar to those of the donor microorganism Bacillus macerans.
発明の効果 上記したことから明らかなように、本発明は、CGTase
産生能を有する供与体微生物から生体外遺伝子組換えの
技術により、バチルス ステアロサーモフィラス又はバ
チルス マセランス由来であって、制限酵素EcoRI、Hin
dIII、PvuII、KpnI、HindIII、XbaIおよびSalIにより切
断される切断部位をこの順序で有し、また、制限酵素Ec
oRI、HindIII、PvuII、KpnI、HindIIIおよびXbaIにより
切断される切断部位をこの順序で有し、さらには、制限
酵素Sau3AI、SalI、PvuII、AvaI、PstIおよびBamHIによ
り切断される切断部位をこの順序で有し、制限酵素PvuI
Iの作用によりシクロマルトデキストリン グルカノト
ランスフェラーゼ形質発現能を失うCGTase遺伝子を含む
組換えDNAを作製し、更に、この組換えDNAを宿主微生物
に導入した形質転換微生物を得て、この形質転換微生物
中で組換えDNAが安定、かつ、自律的に増殖しうること
を見いだした。Effect of the Invention As is clear from the above, the present invention provides a CGTase
Bacillus stearothermophilus or Bacillus macerans derived from a donor microorganism capable of producing by in vitro genetic recombination technology, and restriction enzymes EcoRI, Hin
dIII, PvuII, KpnI, HindIII, Xbal and SalI have a cleavage site in this order, and the restriction enzyme Ec
oRI, HindIII, PvuII, KpnI, HindIII and XbaI have a cleavage site in this order, and furthermore, a restriction site Sau3AI, SalI, PvuII, AvaI, PstI and the cleavage site cleaved by BamHI in this order. Has the restriction enzyme PvuI
A recombinant DNA containing a CGTase gene, which loses the ability to express cyclomaltodextrin glucanotransferase due to the action of I, is prepared, and a transformed microorganism obtained by introducing the recombinant DNA into a host microorganism is obtained. And found that the recombinant DNA was stable and could grow autonomously.
また、本発明は、CGTaseを安定供給するという見地か
ら、より広範な給源を確保するとともにCGTase産生量の
向上が容易に達成しうることとなり、その工業的意義は
大きい。Further, the present invention, from the viewpoint of stable supply of CGTase, can secure a wider range of sources and easily achieve an increase in the amount of CGTase production, and its industrial significance is significant.
第１図は、組換えDNA pTCH210について、バチルス ス
テアロサーモフィラス由来DNA部分の制限酵素切断地図
を示す。 第２図は、組換えDNA pTCU211について、バチルス ス
テアロサーモフィラス由来DNA部分の制限酵素切断地図
を示す。 第３図は、組換えDNA pMAH2について、バチルス マセ
ランス由来 DNA部分の制限酵素切断地図を示す。 第４図は、組換えDNA pMAU210について、バチルス マ
セランス由来DNA部分の制限酵素切断地図を示す。 第５図は、形質転換微生物によるCGTaseのクロマトスキ
ャナーによる図を示す。FIG. 1 shows a restriction map of a DNA portion derived from Bacillus stearothermophilus for recombinant DNA pTCH210. FIG. 2 shows a restriction map of a DNA portion derived from Bacillus stearothermophilus for the recombinant DNA pTCU211. FIG. 3 shows a restriction map of the DNA portion derived from Bacillus macerans for the recombinant DNA pMAH2. FIG. 4 shows a restriction map of the DNA portion derived from Bacillus macerans for the recombinant DNA pMAU210. FIG. 5 shows a diagram of CGTase by a transformed microorganism, obtained by a chromatoscanner.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 第７回分子生物学会年会プログラム・ 講演要旨集（昭59．11．16）講演番号Ｂ −78の要旨──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Agency reference number FI Technical indication (C12N 1/20 C12R 1:19) (C12N 9/10 C12R 1: 125) (C12N 9/10 (C12R 1:19) (56) References Abstracts of the 7th Annual Meeting of the Molecular Biology Program / Abstracts of Abstracts (Sept. 11, Nov. 16, 1984) Lecture Number B-78
Claims (26)
あって、制限酵素EcoRI、HindIII、PvuII、KpnI、HindI
II、XbaIおよびSalIにより切断される切断部位をこの順
序で有するDNA断片と、適宜のベクターを切断して得ら
れるベクター断片とを結合させた、シクロマルトデキス
トリン グルカノトランスフェラーゼ形質発現能を有
し、制限酵素PvuIIの作用によりシクロマルトデキスト
リン グルカノトランスフェラーゼ形質発現能を失う組
換えDNAを有する形質転換微生物。(1) a restriction enzyme derived from Bacillus stearothermophilus and having restriction enzymes EcoRI, HindIII, PvuII, KpnI and HindI;
II, a DNA fragment having a cleavage site to be cleaved by XbaI and SalI in this order, and a vector fragment obtained by cutting an appropriate vector were combined, having a cyclomaltodextrin glucanotransferase expression ability, A transformed microorganism having a recombinant DNA that loses the ability to express cyclomaltodextrin glucanotransferase due to the action of a restriction enzyme PvuII.
ロサーモフィラス由来のDNA部分の制限酵素切断地図で
示されることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
形質転換微生物。2. The transformed microorganism according to claim 1, wherein the recombinant DNA is represented by a restriction map of a DNA portion derived from Bacillus stearothermophilus in FIG.
はバチルス属に属する微生物であることを特徴とする特
許請求の範囲第１項または第２項記載の形質転換微生
物。3. The transformed microorganism according to claim 1, wherein the transformed microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia or Bacillus.
シェリヒア コリ（Escherichia coli）TCH201（FERM P
−7924）であることを特徴とする特許請求の範囲第３項
記載の形質転換微生物。4. The microorganism belonging to the genus Escherichia is Escherichia coli TCH201 (FERM P.
7. The transformed microorganism according to claim 3, wherein the transformed microorganism is a microorganism.
あって、制限酵素EcoRI、HindIII、PvuII、KpnI、HindI
IIおよびXbaIにより切断される切断部位をこの順序で有
するDNA断片と、適宜のベクターを切断して得られるベ
クター断片とを結合させた、シクロマルトデキストリン
グルカノトランスフェラーゼ形質発現能を有し、制限
酵素PvuIIの作用によりシクロマルトデキストリン グ
ルカノトランスフェラーゼ形質発現能を失う組換えDNA
を有する形質転換微生物。5. Derived from Bacillus stearothermophilus, restriction enzymes EcoRI, HindIII, PvuII, KpnI, HindI
A DNA fragment having a cleavage site in this order, which is cleaved by II and XbaI, and a vector fragment obtained by cutting an appropriate vector were ligated, having a cyclomaltodextrin glucanotransferase expression capability, a restriction enzyme Recombinant DNA that loses the ability to express cyclomaltodextrin glucanotransferase by the action of PvuII
A transformed microorganism having:
ロサーモフィラス由来のDNA部分の制限酵素切断地図で
示されることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の
形質転換微生物。6. The transformed microorganism according to claim 5, wherein the recombinant DNA is represented by a restriction map of a DNA portion derived from Bacillus stearothermophilus in FIG.
はバチルス属に属する微生物であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項または第６項記載の形質転換微生
物。7. The transformed microorganism according to claim 5, wherein the transformed microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia or Bacillus.
ズブチリス（Bacillus subtilis）TCU211（FERM P−792
7）であることを特徴とする特許請求の範囲第７項記載
の形質転換微生物。8. The microorganism belonging to the genus Bacillus is Bacillus.
Subtilis (Bacillus subtilis) TCU211 (FERM P-792
The transformed microorganism according to claim 7, wherein the transformed microorganism is 7).
酵素Sau3AI、SalI、PvuII、AvaI、PstIおよびBamHIによ
り切断される切断部位をこの順序で有するDNA断片と、
適宜のベクターを切断して得られるベクター断片とを結
合させた、シクロマルトデキストリン グルカノトラン
スフェラーゼ形質発現能を有し、制限酵素PvuIIの作用
によりシクロマルトデキストリン グルカノトランスフ
ェラーゼ形質発現能を失う組換えDNAを有する形質転換
微生物。9. A DNA fragment derived from Bacillus macerans and having cleavage sites in this order, which are cleaved by restriction enzymes Sau3AI, SalI, PvuII, AvaI, PstI and BamHI,
Recombinant DNA having the ability to express cyclomaltodextrin glucanotransferase, and the ability to express cyclomaltodextrin glucanotransferase due to the action of restriction enzyme PvuII, in which a vector fragment obtained by cutting an appropriate vector is ligated. A transformed microorganism having:
チルス マセランス由来のDNA部分の制限酵素切断地図
で示されることを特徴とする特許請求の範囲第９項記載
の形質転換微生物。10. The transformed microorganism according to claim 9, wherein the recombinant DNA is represented by a restriction map of a Bacillus macerans-derived DNA portion shown in FIG. 3 or 4.
たはバチルス属に属する微生物であることを特徴とする
特許請求の範囲第９項または第10項記載の形質転換微生
物。11. The transformed microorganism according to claim 9, wherein the transformed microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia or Bacillus.
ッシェリヒア コリ MAH2（FERM P−7925）であること
を特徴とする特許請求の範囲第11項記載の形質転換微生
物。12. The transformed microorganism according to claim 11, wherein the microorganism belonging to the genus Escherichia is Escherichia coli MAH2 (FERM P-7925).
ズブチリス MAU210（FERM P−7926）であることを特
徴とする特許請求の範囲第11項記載の形質転換微生物。13. The transformed microorganism according to claim 11, wherein the microorganism belonging to the genus Bacillus is Bacillus subtilis MAU210 (FERM P-7926).
であって、制限酵素EcoRI、HindIII、PvuII、KpnI、Hin
dIII、XbaIおよびSalIにより切断される切断部位をこの
順序で有するDNA断片と、適宜のベクターを切断して得
られるベクター断片とを結合させた、シクロマルトデキ
ストリン グルカノトランスフェラーゼ形質発現能を有
し、制限酵素PvuIIの作用によりシクロマルトデキスト
リン グルカノトランスフェラーゼ形質発現能を失う組
換えDNAを有する形質転換微生物を、栄養培地で培養し
てシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラ
ーゼを産生せしめ、これを採取することを特徴とするシ
クロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼ
の製造方法。14. A bacterium derived from Bacillus stearothermophilus and containing restriction enzymes EcoRI, HindIII, PvuII, KpnI and Hin.
A DNA fragment having a cleavage site in this order, which is cleaved by dIII, XbaI and SalI, was combined with a vector fragment obtained by cleaving an appropriate vector, and has a cyclomaltodextrin glucanotransferase expression ability, A transformed microorganism having a recombinant DNA that loses the ability to express cyclomaltodextrin glucanotransferase due to the action of the restriction enzyme PvuII is cultured in a nutrient medium to produce cyclomaltodextrin glucanotransferase, which is collected. A method for producing cyclomaltodextrin glucanotransferase.
アロサーモフィラス由来のDNA部分の制限酵素切断地図
で示されることを特徴とする特許請求の範囲第14項記載
のシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラ
ーゼの製造方法。15. The cyclomaltodextrin gluca according to claim 14, wherein the recombinant DNA is represented by a restriction map of a DNA portion derived from Bacillus stearothermophilus in FIG. A method for producing a notransferase.
たはバチルス属に属する微生物であることを特徴とする
特許請求の範囲第14項または第15項記載のシクロマルト
デキストリン グルカノトランスフェラーゼの製造方
法。16. The method for producing cyclomaltodextrin glucanotransferase according to claim 14, wherein the transformed microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia or Bacillus.
ッシェリヒア コリ TCH201（FERM P−7924）であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第16項記載のシクロマル
トデキストリン グルカノトランスフェラーゼの製造方
法。17. The method for producing cyclomaltodextrin glucanotransferase according to claim 16, wherein the microorganism belonging to the genus Escherichia is Escherichia coli TCH201 (FERM P-7924).
であって、制限酵素EcoRI、HindIII、PvuII、KpnI、Hin
dIIIおよびXbaIにより切断される切断部位をこの順序で
有するDNA断片と、適宜のベクターを切断して得られる
ベクター断片とを結合させた、シクロマルトデキストリ
ン グルカノトランスフェラーゼ形質発現能を有し、制
限酵素PvuIIの作用によりシクロマルトデキストリン
グルカノトランスフェラーゼ形質発現能を失う組換えDN
Aを有する形質転換微生物を、栄養培地で培養してシク
ロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼを
産生せしめ、これを採取することを特徴とするシクロマ
ルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼの製造
方法。18. A Bacillus stearothermophilus derived restriction enzyme EcoRI, HindIII, PvuII, KpnI, Hin
A DNA fragment having cleavage sites cleaved by dIII and XbaI in this order, and a vector fragment obtained by cleaving an appropriate vector were ligated, having a cyclomaltodextrin glucanotransferase expression capability, a restriction enzyme Cyclomaltodextrin by action of PvuII
Recombinant DN that loses the ability to express glucanotransferase
A method for producing cyclomaltodextrin glucanotransferase, comprising culturing a transformed microorganism having A in a nutrient medium to produce cyclomaltodextrin glucanotransferase, and collecting the cyclomaltodextrin glucanotransferase.
アロサーモフィラス由来のDNA部分の制限酵素切断地図
で示されることを特徴とする特許請求の範囲第18項記載
のシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラ
ーゼの製造方法。19. The cyclomaltodextrin gluca according to claim 18, wherein the recombinant DNA is represented by a restriction map of a DNA portion derived from Bacillus stearothermophilus in FIG. A method for producing a notransferase.
たはバチルス属に属する微生物であることを特徴とする
特許請求の範囲第18項または第19項記載のシクロマルト
デキストリン グルカノトランスフェラーゼの製造方
法。20. The method for producing cyclomaltodextrin glucanotransferase according to claim 18 or 19, wherein the transformed microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia or Bacillus.
ズブチリス TCU211（FERM P−7927）であることを特
徴とする特許請求の範囲第20項記載のシクロマルトデキ
ストリン グルカノトランスフェラーゼの製造方法。21. The method for producing cyclomaltodextrin glucanotransferase according to claim 20, wherein the microorganism belonging to the genus Bacillus is Bacillus subtilis TCU211 (FERM P-7927).
限酵素Sau3AI、SalI、PvuII、AvaI、PstIおよびBamHIに
より切断される切断部位をこの順序で有するDNA断片
と、適宜のベクターを切断して得られるベクター断片と
を結合させた、シクロマルトデキストリン グルカノト
ランスフェラーゼ形質発現能を有し、制限酵素PvuIIの
作用によりシクロマルトデキストリン グルカノトラン
スフェラーゼ形質発現能を失う組換えDNAを有する形質
転換微生物を、栄養培地で培養してシクロマルトデキス
トリン グルカノトランスフェラーゼを産生せしめ、こ
れを採取することを特徴とするシクロマルトデキストリ
ン グルカノトランスフェラーゼの製造方法。22. A vector derived from Bacillus macerans and having a cleavage site in this order having cleavage sites cleaved by restriction enzymes Sau3AI, SalI, PvuII, AvaI, PstI and BamHI, and a vector obtained by cleaving an appropriate vector. The transformed microorganism having recombinant DNA, which has the ability to express cyclomaltodextrin glucanotransferase, and loses the ability to express cyclomaltodextrin glucanotransferase by the action of the restriction enzyme PvuII, in a nutrient medium, A method for producing cyclomaltodextrin glucanotransferase, which comprises culturing to produce cyclomaltodextrin glucanotransferase, and collecting the cyclomaltodextrin glucanotransferase.
チルス マセランス由来のDNA部分の制限酵素切断地図
で示されることを特徴とする特許請求の範囲第22項記載
のシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラ
ーゼの製造方法。23. The cyclomaltodextrin gluca according to claim 22, wherein the recombinant DNA is represented by a restriction map of a DNA portion derived from Bacillus macerans in FIG. 3 or FIG. A method for producing a notransferase.
たはバチルス属に属する微生物であることを特徴とする
特許請求の範囲第22項または第23項記載のシクロマルト
デキストリン グルカノトランスフェラーゼの製造方
法。24. The method for producing cyclomaltodextrin glucanotransferase according to claim 22 or 23, wherein the transformed microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia or Bacillus.
ッシェリヒア コリ MAH2（FERM P−7925）であること
を特徴とする特許請求の範囲第24項記載のシクロマルト
デキストリン グルカノトランスフェラーゼの製造方
法。25. The method for producing cyclomaltodextrin glucanotransferase according to claim 24, wherein the microorganism belonging to the genus Escherichia is Escherichia coli MAH2 (FERM P-7925).
ズブチリス MAU210（FERM P−7926）であることを特
徴とする特許請求の範囲第24項記載のシクロマルトデキ
ストリン グルカノトランスフェラーゼの製造方法。26. The method for producing cyclomaltodextrin glucanotransferase according to claim 24, wherein the microorganism belonging to the genus Bacillus is Bacillus subtilis MAU210 (FERM P-7926).
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| JP59255339A Expired - Lifetime JP2612684B2 (en) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | Transformed microorganism into which recombinant DNA containing cyclomaltodextrin glucanotransferase gene has been introduced and its use |
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Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
1984
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 第７回分子生物学会年会プログラム・講演要旨集（昭５９．１１．１６）講演番号Ｂ−７８の要旨 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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