JP2596716B2 - 固相抽出によるｄｎａ精製に有用なフッ素化表面 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、一般的には固相抽出に
よるＤＮＡの精製に関し、より特定すれば、適当な条件
下でＤＮＡを結合でき、かつ、ＤＮＡを溶出できるフッ
素化表面に関する。

【０００２】

【従来技術】高度に精製された二本鎖（ｄｓ）プラスミ
ドＤＮＡ、一本鎖（ｓｓ）ファージＤＮＡ、染色体ＤＮ
Ａおよびアガロースゲルから精製されたＤＮＡ断片は、
分子生物学の分野において決定的に重要である。理想的
には、ＤＮＡを精製する方法は、簡単、迅速であり、か
つ、あるとしても付加的なサンプル操作をほとんど必要
としないべきである。そのような方法により得られたＤ
ＮＡは、即座に形質転換、制限分析、連結または配列決
定に供しやすいものであるべきである。このような特徴
すべてを有する方法は、ＤＮＡサンプル調製の自動化、
研究の目標到達および診断試験において極めて興味を引
き付けるはずである。典型的には、粗アルコール沈殿物
からのプラスミドＤＮＡの調製は労力を要し、ほとんど
の場合、ＣｓＣｌグラジエント、ゲル濾過、イオン交換
クロマトグラフィー、またはＲＮａｓｅ、プロティナー
ゼＫおよび繰り返しのアルコール沈殿工程を利用する。
これらの方法は、ＣｓＣｌおよび他の塩、エチジウムブ
ロマイドおよびアルコールを除去するために、その後に
さらにサンプル調製を必要とする。同様な議論は、ＤＮ
Ａ断片を精製するためのこれらあらゆる方法を用いる場
合にあてはまる。これらの方法におけるさらなる問題
は、小さく、かつ、陰性に荷電した細胞成分がＤＮＡと
共に精製されうることである。即ち、ＤＮＡは不所望の
レベルの汚染物を含みうる。

【０００３】ＤＮＡは固相を用いても精製されうる。慣
用的固相抽出技術は、（１）溶出の間にＤＮＡを容易に
回収するためにデザインされた表面のために、十分な量
のＤＮＡを確保および保持しがたく、または（２）過剰
にＤＮＡを表面に結合させるために溶出の間にＤＮＡ分
子の回収を妨害する表面を利用してきた。固相抽出にお
いて利用される場合にこれらの問題を引き起こす慣用的
金属表面は、シリカ表面、例えばガラスおよびセライト
（Ｃｅｌｉｔｅ）を含む。これらの種の表面へのＤＮＡ
の十分な結合は、高濃度のカオトロプまたは一般的に毒
性であり、危険であり、および／または高価であるアル
コールの利用によってのみ達成されうる。例えば、ＤＮ
Ａはカオトロプの存在下でガラス砕片粉末およびグラス
ファイバーフィルターに結合することが知られている。
カオトロピックイオンは典型的にはアルコールを用いて
洗浄され、そしてＤＮＡは低塩濃度溶液または水により
溶出される。重要なこととして、ＲＮＡおよび蛋白質は
結合しない。しかしながら、ガラス砕片粉末の使用にお
ける重大な短所は、結合許容量が低いことである。さら
に、ガラス粉末は、しばしば、完全に回収されず、硼酸
緩衝液と適合せず、そして大きいＤＮＡにニックを入れ
る傾向を有する。同様に、グラスファイバーフィルター
は低いＤＮＡ結合許容量を有する非孔性表面を提供す
る。他のシリカ、例えばシリカゲルおよびガラスビーズ
は、ＤＮＡの結合および回収には不適当である。現在、
ＤＮＡの固相抽出のために選択された固相は、セライ
ト、例えばバイオラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅ
ｎｅ（商標名）に見いだされるものである。破砕ガラス
粉末を用いた場合のように、高濃度のカオトロプがセラ
イトへのＤＮＡの十分な結合に必要とされる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】慣用的ＤＮＡ精製法に
おけるこれらの問題は、ＤＮＡを含む懸濁液中のＤＮＡ
を結合し、そしてＤＮＡを下記表面から溶出させるのに
十分な親水性および十分な陽性荷電性（ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ）を示す、フッ素化表面に関する
本発明により解決される。一般的に、親水性および陽性
荷電性は、フッ素化表面において示され、そして、フー
リエ変換赤外線分光分析法（ＦＴＩＲ）により測定され
る酸素の存在として、および電子表面組成分析（ＥＳＣ
Ａ）により検出される置換原子の存在として、定量され
る。本発明の好ましいフッ素化表面は、フッ素化Ａｌ
（ＯＨ）₃、フッ素化ＳｉＯ₂、およびフッ素化セライト
を含む。

【０００５】本発明のフッ素化表面は、他の細胞成分か
らＤＮＡを精製するための方法において特に有用であ
る。これらの方法においては、細胞成分の懸濁液をフッ
素化表面に接触させ、該フッ素化表面を洗浄して該表面
に結合したＤＮＡ以外の細胞成分を除去し、そして、結
合したＤＮＡを該表面から溶出する。ＤＮＡを該フッ素
化表面に結合させるためには、低濃度のカオトロプがＤ
ＮＡ結合緩衝液に含まれていることが必要である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、フッ素化表面
に関するが、該表面は細胞成分の懸濁液中のＤＮＡを結
合し、そして該表面からＤＮＡを溶出させるのに十分な
親水性および十分な陽性荷電特性を示す。極めて低濃度
のカオトロプまたはアルコールを利用して、本発明のフ
ッ素化表面を用いてＤＮＡを精製することができること
が見いだされた。

【０００７】ＤＮＡは２つの方法により固相表面に相互
作用する。第１に、ＤＮＡは、ＤＮＡのヒドロキシル基
と固相の表面成分との間の水素結合を通して表面に相互
作用する。第２の相互作用は、陰性に荷電したＤＮＡの
リン酸と陽性に荷電した固相表面の要素との間で生じ
る。固相表面の親水性および陽性荷電特性は、細胞成分
の懸濁液、核酸および他の物質の懸濁液、および／また
は核酸の懸濁液からＤＮＡを結合させ、そして上記固相
表面からＤＮＡを溶出させるようなものでなければなら
ない。即ち、固相物質の陽性荷電（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏ
ｓｉｔｉｖｅ）特性は、はるかに高い陽性電荷（ｐｏｓ
ｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ）を有し得ず、または、ＤＮ
Ａが表面に固着して溶出され得ない。この特性は多くの
金属基材表面に関しても真実であり、該表面はＤＮＡの
精製に関して利用不可能性をもたらす。

【０００８】ケイ素含有物質、例えば、シリカ、セライ
ト、ガラス粉末等は混ざった結果を伴ってＤＮＡの精製
に用いられてきた。これら表面のいくつかは、低い結合
特性を有し、および／またはＤＮＡの結合に関して、高
濃度のカオトロプまたはアルコールの使用を必要とす
る。他の表面、例えば、Ａｌ（ＯＨ）₃は懸濁液中のＤ
ＮＡをほぼ１００％結合するが、結合ＤＮＡを溶出しな
いことが見いだされた。即ち、ＤＮＡの精製に関して適
切な親水性および陽性荷電特性を示し、および／または
より低い濃度のカオトロプまたはアルコールを用いたＤ
ＮＡの精製のための固相表面、特にフッ素化表面の固相
を生産することが望まれる。固相表面において、親水性
の特性は、水分子を引き付ける基の存在により達成され
る。適切な基は、−ＯＨ，−ＮＨ，−Ｆ，−Ｈまたは二
重結合酸素を含む基、例えばカルボニル、スルフォニル
またはホスフォニルを含む。陽性荷電特性は、陽性に荷
電した原子の存在により達成される。適切な陽性荷電原
子は、Ｓｉ，ＢまたはＡｌを含む。本発明によれば、適
切なフッ素含有基を導入して親水性の特性が達成され、
そして、Ｓｉ、Ａｌまたは他の適切な陽性荷電原子を導
入して陽性荷電特性が達成されることにより、フッ素化
表面が調製される。本発明の好ましいフッ素化表面は、
フッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃、フッ素化ＳｉＯ₂、およびフッ
素化セライトを含む。

【０００９】通常、本発明のフッ素化表面は、適当なフ
ッ化物を所望の表面と反応させることにより調製され
る。あらゆるフッ化物、好ましくはフッ化ナトリウムお
よびフッ化テトラブチルアンモニウムがこの反応に利用
される。適当な表面は、ＤＮＡを結合するが溶出しない
ものを含む。そのような表面は、Ａｌ（ＯＨ）₃、Ｓｉ
Ｏ₂、セライト、またはフッ化物による求核作用に供さ
れる陽性荷電エレメントを含む他の固体を含む。異なる
量のフッ化物をその表面に有する表面は、異なる比率の
フッ化物と表面を反応させることにより調製される。通
常、フッ化物を固相表面に加える。適当な溶剤、例えば
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を加えて、反応混合物を
一晩還流することが好ましいが、２４時間以上還流する
こともできる。より多くのＴＨＦを加えて一晩加熱する
ことにより乾燥を保つ。別法としては、反応混合物を単
に一晩加熱することができる。フッ素化表面を濾過し、
洗浄し、簡単に空気乾燥し、そして１００℃において約
１時間オーブン乾燥する。次に、フッ素化表面をデシケ
ーター中で保存する。

【００１０】フッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃表面は、上記一般
的記載により、好ましくは還流により調製される。ＤＮ
Ａは通常、未処理のＡｌ（ＯＨ）₃表面に強く結合し、
溶出の間保持される。フッ素の存在は、Ｆ（δ−）の析
力およびＤＮＡのリン酸バックボーンのために、処理さ
れたＡｌ（ＯＨ）₃表面へのＤＮＡの緩やかな結合を引
き起こし、その結果、結合したＤＮＡは溶出工程の間に
フッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃表面から溶出するはずである。
通常、Ａｌ（ＯＨ）₃上のフッ素のパーセンテージが増
加すれば、処理表面からのＤＮＡの溶出も増加する。Ａ
ｌ（ＯＨ）₃に対して約０．０５から約１．５当量のフ
ッ素を反応させることにより調製されたフッ素化Ａｌ
（ＯＨ）₃表面は、生物学的サンプルからの良好なＤＮ
Ａの回収を提供することが見いだされた。好ましくは、
フッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃表面は、Ａｌ（ＯＨ）₃と約０．
３から約０．９当量のフッ素を反応させることにより調
製し、最も好ましくは、Ａｌ（ＯＨ）₃と約０．３当量
のフッ素を反応させることにより調製する。ＤＮＡの回
収に関しては、０．３当量のフッ素でフッ素化されたＡ
ｌ（ＯＨ）₃が、超微小綿性セライト（Ｓｕｐｅｒ Ｆ
ｉｎｅ ＳｕｐｅｒＦｌｏｓｓ Ｃｅｌｉｔｅ）より性
能が優れている。

【００１１】フッ素化酸化セライト表面は、上記一般的
記載により、好ましくは還流により調製される。ＤＮＡ
は通常、未処理の酸化セライト表面に強く結合し、溶出
の間保持される。フッ素の存在は、処理された酸化セラ
イト表面へのＤＮＡの緩やかな結合を引き起こし、その
結果、結合したＤＮＡは溶出工程の間にフッ素化酸化セ
ライト表面から溶出するはずである。通常、酸化セライ
ト上のフッ素のパーセンテージが増加すれば、処理表面
からのＤＮＡの溶出も増加する。酸化セライトに対して
過剰量のフッ素を反応させることにより調製されたフッ
素化酸化セライト表面は、生物学的サンプルからの良好
なＤＮＡの回収を提供することが見いだされた。好まし
くは、フッ素化酸化セライト表面は、酸化セライトと約
０．３から約０．９当量のフッ素を反応させることによ
り調製する。ＤＮＡの回収に関して、これらのフッ素化
酸化セライトのいくつかが、超微小綿性セライトより性
能が優れている。

【００１２】本発明のフッ素化表面は、他の細胞成分ま
たは潜在的汚染物からＤＮＡを精製するのに用いられ
る。ＤＮＡはあらゆる源から得ることができ、そのよう
な源としてはそれらに限定されないが、粗細胞抽出物、
生物学的流体、ファージ懸濁液、アガロースゲルおよび
放射性標識反応物を含む。ＤＮＡは、二本鎖、一本鎖、
環状または直鎖状であり得、またあらゆるサイズであり
得る。あらゆる源からＤＮＡを得るための当該分野にお
いて公知の慣用的技術を利用して、精製のためにＤＮＡ
を調製する。ＤＮＡを得るための典型的な方法は、ＤＮ
Ａの懸濁液を得ることにより終了する。生物学的サンプ
ルからのＤＮＡの単離に関しては、例えば、Ｈａｒｄｉ
ｎｇ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：６９４７（１９８９）
およびＭａｒｋｏ，Ｍ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２１：３８２
（１９８２）を参照されたい。プラスミドＤＮＡの単離
方法は、Ｌｕｔｚｅ，Ｌ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６１５
０（１９９０）に見いだされうる。生物学的サンプルか
らの二本鎖ＤＮＡの抽出は、Ｙａｍａｄａ，Ｏ ｅｔ
ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７：２０３（１９９０）に見い
だされうる。ほとんどのＤＮＡ溶液は、適当な緩衝液、
例えばＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、ＴＥＡ（４０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液中のＤＮ
Ａ、または溶解物からなる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第
２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８
９）を参照されたい。

【００１３】ＤＮＡが適当な溶液または懸濁液中に得ら
れたら、本発明のフッ素化表面を該溶液または懸濁液に
加える。別法として、ＤＮＡ溶液または懸濁液を本発明
のフッ素化表面に加えることができる。ＤＮＡ溶液また
は懸濁液を本発明のフッ素化表面に接触させた後、典型
的には結合緩衝液を加えてフッ素化表面へのＤＮＡの結
合を助ける。適当な結合緩衝液は、公知のカオトロプ、
例えばＮａＣｌＯ₄およびＮａＩ、および他の薬品、例
えば塩酸グアニジンまたはイソプロパノールを含む。Ｄ
ＮＡをフッ素化表面に結合させた後、純化ＤＮＡを該表
面から溶出する。適当な溶出剤は、水または１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０を含む。通常、結合ＤＮＡを含む
フッ素化表面は、例えば遠心分離または濾過、およびＤ
ＮＡ溶出前の洗浄により分離される。適当な洗浄剤は、
８０／２０エタノール／５０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．
０、および他の低分子量アルコールを含む。

【００１４】本発明のフッ素化表面を用いた精製により
得られたＤＮＡは、さらなる操作を必要とせずに、制限
酵素消化、クローニング、配列決定、診断等に用いられ
る。本発明により調製された多量のＤＮＡ、およびその
あとの最小限の工程によりＤＮＡを精製するためのスピ
ードは、本発明のフッ素化表面がＤＮＡサンプルの調製
の自動化に有用でありうることを意味する。

【００１５】本発明は、以下の実施例を参照して説明さ
れるが、実施例は例示の目的で示されたものであり、如
何なる意味においても本発明を限定するものではない。
当分野において公知の標準的技術または以下に特定して
記載される技術を用いた。

【００１６】

【実施例】

実施例１ フッ素化表面の合成 Ａ．フッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃ Ａｌ（ＯＨ）₃と０．０５から０．３当量のフッ化物を
反応させたフッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃表面は、以下の比率
のテトラブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ；
Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）とＡｌ
（ＯＨ）₃（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて調製された。

【００１７】

【表１】 ＴＢＡＦ Ａｌ（ＯＨ）₃ 反応番号 当量 ｍｌ ｍＭｏｌ ｇ ｍＭｏｌ １ ０．３ ２．２０ ２．２０ ０．５ ６．６７ ２ ０．１ ０．７００ ０．７００ ０．５ ６．４１ ３ ０．０５ ０．０３５ ０．０３５ ０．５ ６．４１ 反応１は、ＴＢＡＦを固体のＡｌ（ＯＨ）₃に加えるこ
とにより実施した。次に、１０ｍｌのＴＨＦを加え、そ
して混合物を再び撹拌しながら加熱して還流した。２０
ｍｌのＴＨＦを加え、そして混合物を一晩室温において
還流した。反応混合物を、次に室温まで冷やして濾過し
た。フッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃を２０ｍｌの水で３回洗浄
してＦ^-を除去し、そして１５ｍｌのアセトンで３回洗
浄した。洗浄した物質を３０分間空気乾燥して、１００
℃において３０分間加熱乾燥した。乾燥したフッ素化Ａ
ｌ（ＯＨ）₃はデシケーター中で保存した。

【００１８】反応２および３は、ＴＢＡＦ、Ａｌ（Ｏ
Ｈ）₃および１０−１５ｍｌのＴＨＦを一緒に混合する
ことにより実施した。還流コンデンサーをつけて、反応
混合物を一晩撹拌しながら還流した。次に、反応混合物
を室温まで冷やして濾過した。フッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃
を１０ｍｌのアセトンで３回、１５ｍｌの水で３回、そ
して１５ｍｌのアセトンで３回洗浄した。洗浄した物質
を２０分間空気乾燥して、１００℃において１時間加熱
乾燥し、そして、デシケーター中で保存した。

【００１９】Ｂ．フッ素化セライト ０．３当量以上の過剰量のフッ化物をＳｉＯ₂と反応さ
せた酸化セライトからなるフッ素化セライト表面は、以
下の比率のＴＢＡＦとセライト（ＳｉＯ₂）を用いて調
製された。

【００２０】

【表２】 ＴＢＡＦ セライト＊ 反応番号 当量 ｍｌ ｍＭｏｌ ｇ ｍＭｏｌ １ ０．３ ２．８ ２．８ ０．５ ８．３３ ２ ０．６ ５．６ ５．６ ０．５ ８．３３ ３ ０．９ ９．０ ９．０ ０．５ ８．３３ ４ 過剰量 １２．０ １２．０ ０．５ ８．３３ ＊ セライト５４５は、使用前にＨＮＯ₃またはＨ₂ＳＯ
₄で酸洗浄することにより、酸化した。

【００２１】反応１は、フッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃表面の
反応１に記載されているとおり実施した。反応２−４
は、フッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃表面の反応２および３に記
載されているとおり実施した。

【００２２】実施例２ 超微小綿性セライトを標準として用いたＤＮＡ回収分析 超微小綿性セライトを標準として用いたケイ素含有物質
のＤＮＡ回収能力の分析に関して、以下の物質を利用し
た。

【００２３】超微小綿性セライト（Ｍａｎｖｉｌｌｅ；
１：５ｗ／ｗ（水中））［ＳＦＳＦ］ λ ＤＮＡ（ＢＲＬカタログ番号５６１２５Ａ） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０（１Ｍストックを希
釈） 結合緩衝液（Ｈ₂Ｏまたは６Ｍストックから希釈したＮ
ａＣｌＯ₄） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０中の８０％エタノール ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏ エチジウムブロマイド（１０ｍｇ／ｍｌ） １％アガロース １×ＴＡＥ（５０×ストックから希釈） Ｔｙｐｅ ＩＩローディング染料（２５％Ｆｉｃｏｌｌ
４００、２５％ブロムフェノールブルー、２５％キシレ
ンシアノール） Ｔｙｐｅ ５７および５５ポラロイドフィルム ５０μｌのλＤＮＡ溶液（３１μｇＤＮＡ／反応に関し
て０．５μｌのλＤＮＡ（５０μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ，ｐＨ７．０中））を８本のチューブに加えた。２０
μｌのＳＦＳＦをＤＮＡに加えた（約３０μｇ）。４０
０μｌの結合緩衝液を以下のとおりに、ＤＮＡに加え
た：Ｈ₂Ｏをチューブ１に；１．０，１．５，２，２．
５，３，３．５および４ＭのＮａＣｌＯ₄をチューブ２
−８にそれぞれ加えた。混合物を１０分間室温において
揺動しながらインキュベートした。チューブを遠心分離
して上清を捨てた。その結果得られた沈殿物を、８０／
２０エタノール／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０にて
２回洗浄した。ＤＮＡは、３７℃において１０分間２０
μｌの水に、該沈殿物から溶出した。チューブを遠心分
離して各チューブの上清を別々のチューブに保存した。
沈殿物を再び前記のとおりに溶出して、チューブを遠心
分離して上清を集めた。２μｌのＴｙｐｅ ＩＩローデ
ィング染料を各チューブの上清に加えて、混合物を１％
アガロース、１×ＴＡＥゲルに流した。ゲルは約２５分
間、１００−１３０ボルトにて１×ＴＡＥ緩衝駅中で泳
動した。ゲルを水中のエチジウムブロマイド（約１：１
０００）で約２０〜３０分間染色した。紫外線したでＴ
ｙｐｅ５７のフィルムにより写真を撮り、可能であれ
ば、Ｔｙｐｅ５５のフィルムでネガをとった。

【００２４】ゲルから、結合緩衝液として水を用いてＳ
ＦＳＦから少量のＤＮＡが溶出されたことが示された。
１，１．５，および２．０ＭのＮａＣｌＯ₄を結合緩衝
液として用いた場合も少量のＤＮＡが溶出された。溶出
ＤＮＡ量の劇的な増加は、２．５，３．０，３．５およ
び４．０ＭのＮａＣｌＯ₄を結合緩衝液として用いた場
合に観察された。ＳＦＳＦをＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ
（商標名）と比較すると、３．０ＭまでのＮａＣｌＯ₄
を結合緩衝液として用いた場合にはＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅ
ｎｅ（商標名）からのセライトからＤＮＡは全く溶出さ
れなかったことが観察されたが、ＳＦＳＦは天然状態の
ＤＮＡをいくらか結合し、２．５ＭのＮａＣｌＯ₄にお
いてより強くＤＮＡを結合した。即ち、ＳＦＳＦはＰｒ
ｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅより良好であった。以下の実施例に
おいては、ＳＦＳＦを標準として用いて、３ＭのＮａＣ
ｌＯ₄を結合緩衝液として用いた。

【００２５】実施例３ フッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃を用いたＤＮＡ回収分析 実施例１において調製されたフッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃を
用いたＤＮＡ回収の分析を、実施例２のとおりの方法で
実施したが、７チューブがフッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃の２
０μｌ懸濁液（約３０μｇ）を含み、そして１，１．
５，２，２．５，３，３．５および４ＭのＮａＣｌＯ₄
（各４００μｌ）を結合緩衝液として用いた点が異な
る。８番目のチューブ（対照）はＳＦＳＦの２０μｌ懸
濁液（約３０μｇ）を含み、３．０ＭのＮａＣｌＯ₄を
結合緩衝液として用いた。以下の結果が得られた。Ａｌ
（ＯＨ）₃と０．３当量のフッ素を反応させて得られた
フッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃（反応１）は、１．５ＭのＮａ
ＣｌＯ₄（即ち、１．５ＭのＮａＣｌＯ₄を結合緩衝液と
して用いた）まで良好なＤＮＡの回収を示し、ＳＦＳＦ
より優れていた。０．３当量のフッ素を反応させて得ら
れたフッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃は極めて良好なＤＮＡ回収
を示し、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅよりも優れていた（実
施例５を参照）。

【００２６】実施例４ フッ素化セライトを用いたＤＮＡ回収分析 実施例１において調製されたフッ素化セライトを用いた
ＤＮＡ回収の分析を、実施例３のとおりの方法で実施し
た。以下の結果が得られた。酸化セライトと０．３当量
のフッ素を反応させて調製されたフッ素化セライト（反
応１により還流せずに調製された）は、何らＤＮＡを回
収しなかった。反応１において調製された、酸化セライ
トと０．３当量のフッ素を反応させて得られたフッ素化
セライトは、２．０ＭのＮａＣｌＯ₄まで、いくらかの
ＤＮＡの回収を示した。反応２または３において調製さ
れた、酸化セライトと０．６または０．９当量のフッ素
を反応させて得られたフッ素化セライトは、１ＭのＮａ
ＣｌＯ₄までＤＮＡを溶出し、１．５ＭのＮａＣｌＯ₄ま
で良好な量のＤＮＡを溶出した。反応４において調製さ
れた過剰量のフッ素と反応して得られたフッ素化セライ
トは、１．５ＭのＮａＣｌＯ₄までＤＮＡ回収を示し
た。

【００２７】実施例５ ＤＮＡ回収の定量分析 λＤＮＡ（６５８μｌＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）中の５００
μｇＤＮＡ）の１：１０希釈液を調製した。ＤＮＡサン
プルは、各々が１０μｌの希釈λＤＮＡおよび２３０μ
ｌのＴＥ緩衝液を含むように調製された。標準ＤＮＡサ
ンプルは、４０μｌのＴＥ緩衝液および１０μｌの希釈
λＤＮＡを含むように調製された。３０μｌのＡｌ（Ｏ
Ｈ）₃、フッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃（実施例１の反応３）お
よびＰｒｅｐ−Ａ−ＧｅｎｅセライトをＤＮＡサンプル
に加えてから、７５０μｌのＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ結
合緩衝液を加えた。サンプルを１０分間室温にて撹拌し
た。サンプルを遠心分離してデカントした。遠心分離お
よびデカントと共に結合工程を繰り返した。５００μｌ
のＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ洗浄緩衝液を加えて、サンプ
ルを室温にて５分間撹拌した。サンプルを遠心分離、デ
カントして６０℃において１０分間乾燥した。２５μｌ
のＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ溶出緩衝液を加えて、サンプ
ルを混合してから６０℃において１０分間加熱した。サ
ンプルを遠心分離して上清を混合した。ゲル電気泳動は
実施例２に記載されたとおり、３μｌのＴｙｐｅＩＩロ
ーディング染料を７μｌの溶出ＤＮＡに加えて実施し
た。ゲル電気泳動から、Ａｌ（ＯＨ）₃表面からはＤＮ
Ａが全く溶出せず、フッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃およびＰｒ
ｅｐ−Ａ−ＧｅｎｅセライトからはＤＮＡが溶出したこ
とが示された。

【００２８】サンプルは、ｔｒｉ−ｃａｒｂ３００シン
チレーションカウンターによっても分析した。各異なる
表面からの３つのサンプルを計数してＤＮＡの位置を決
定した。これらサンプルは、（１）元の結合緩衝液を第
１結合工程に用い；（２）溶出緩衝液を第２溶出工程に
用い；そして（３）結合マトリックス（表面）を用い
た。分析は、以下のとおりに実施した：（１）２容積の
６ｍｌシンチレーション液を結合緩衝液に加え；（２）
６ｍｌのシンチレーション液を４０μｌの溶出緩衝液に
加え；そして（３）６ｍｌのシンチレーション液を結合
マトリックスに加えた。この分析から、Ａｌ（ＯＨ）₃
は他の２つの表面に比べてより多くのＤＮＡ（９４．９
％）を元の溶液から回収したことが示された。しかしな
がら、そのうちの９９．３％は続く溶出において表面に
結合したまま残った。フッ素化Ａｌ（ＯＨ）₃は２４．
２％のＤＮＡを結合し、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅセライ
トより多かった。７４．６％の結合ＤＮＡがフッ素化Ａ
ｌ（ＯＨ）₃から回収された。このＤＮＡ量は、Ｐｒｅ
ｐ−Ａ−Ｇｅｎｅセライトよりはるかに大きいパーセン
テージであった。

【００２９】フッ素化セライトもゲル電気泳動技術によ
り分析した。ＤＮＡは実施例２の反応１により調製され
たフッ素化セライトから回収された。

【００３０】本発明の方法および組成物はさまざまな形
態の態様を含むものであり、本明細書において開示され
たもののみに限定されるものでないことは認識されるで
あろう。当業者には、本発明の精神を離れない限り、他
の態様も存在することは明らかであろう。即ち、記載さ
れた態様は例示であり、本発明を限定するものではな
い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アドリアン・ジーンネル・ハワード アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27606，ローリー，ヴァン・ストリート 5206 (72)発明者 ジェームズ・アーサー・ダウン アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27511，キャリー，チャーター・オーク ス・サークル 101

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）Ａｌ（ＯＨ）₃と、０.０５から１．
   ５等量のフッ素を反応させたことにより得られたフッ素
   化表面にＤＮＡを結合させるのに適当な条件下で、該表
   面をＤＮＡ含有懸濁液に接触させ； （ｂ）結合したＤＮＡを有する該フッ素化表面を洗浄
   し；そして （ｃ）該フッ素化表面からＤＮＡを溶出する； 工程からなる、ＤＮＡの精製方法。
2. 【請求項２】（ａ）Ａｌ（ＯＨ）₃と、０.１から０．９
   等量のフッ素を反応させたことにより得られたフッ素化
   表面にＤＮＡを結合させるのに適当な条件下で、該表面
   をＤＮＡ含有懸濁液に接触させ； （ｂ）結合したＤＮＡを有する該フッ素化表面を洗浄
   し；そして （ｃ）該フッ素化表面からＤＮＡを溶出する； 工程からなる、ＤＮＡの精製方法。
3. 【請求項３】（ａ）Ａｌ（ＯＨ）₃と、０.３等量のフッ
   素を反応させたことにより得られたフッ素化表面にＤＮ
   Ａを結合させるのに適当な条件下で、該表面をＤＮＡ含
   有懸濁液に接触させ； （ｂ）結合したＤＮＡを有する該フッ素化表面を洗浄
   し；そして （ｃ）該フッ素化表面からＤＮＡを溶出する； 工程からなる、ＤＮＡの精製方法。