JP2589088B2 - 抗ストレプトリジンｏの定量法 - Google Patents
抗ストレプトリジンｏの定量法Info
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- JP2589088B2 JP2589088B2 JP62169498A JP16949887A JP2589088B2 JP 2589088 B2 JP2589088 B2 JP 2589088B2 JP 62169498 A JP62169498 A JP 62169498A JP 16949887 A JP16949887 A JP 16949887A JP 2589088 B2 JP2589088 B2 JP 2589088B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗ストレプトリジンＯ（以下「ASO」と略称
する）の定量法に関し、更に詳細には、免疫比濁法を改
良した、自動分析に適するASOの定量法に関する。
する）の定量法に関し、更に詳細には、免疫比濁法を改
良した、自動分析に適するASOの定量法に関する。
ストレプトリジンＯ（以下「SLO」と略称する）はヒ
ト由来連鎖球菌の産生する溶血性毒素であり、抗原性を
有するため、体内で溶連菌がSLOを産生するとこれに対
する抗体であるASOが生成される。従つて、例えば血清
中のASO量を測定することにより、連鎖球菌感染症、こ
とにその続発疾患とされているリウマチ熱、急性糸球体
腎炎などの診断が可能である。
ト由来連鎖球菌の産生する溶血性毒素であり、抗原性を
有するため、体内で溶連菌がSLOを産生するとこれに対
する抗体であるASOが生成される。従つて、例えば血清
中のASO量を測定することにより、連鎖球菌感染症、こ
とにその続発疾患とされているリウマチ熱、急性糸球体
腎炎などの診断が可能である。
従来、ASOを測定する方法としては、抗原であるSLOが
検体血清中の抗体であるASOと反応し、毒素活性が中和
されることを利用してASOを測定するランツランダール
法及びマイクロタイター法；抗原であるSLOを担体ラテ
ツクスに感作し、抗原抗体反応をラテツクスの凝集とし
て自動分析機により検出してASOを測定するラテツクス
比濁法；スライドグラス上でASOとSLOを抗原抗体反応せ
しめ、生じた凝集の量を肉眼により観察してASOを測定
するラテツクススライド凝集法等が採用されてきた。
検体血清中の抗体であるASOと反応し、毒素活性が中和
されることを利用してASOを測定するランツランダール
法及びマイクロタイター法；抗原であるSLOを担体ラテ
ツクスに感作し、抗原抗体反応をラテツクスの凝集とし
て自動分析機により検出してASOを測定するラテツクス
比濁法；スライドグラス上でASOとSLOを抗原抗体反応せ
しめ、生じた凝集の量を肉眼により観察してASOを測定
するラテツクススライド凝集法等が採用されてきた。
しかしながら、ランツランダール法及びマイクロタイ
ター法は実施に際してウサギ、ヒツジまたはヒトＯ型赤
血球を必然的に必要とし、しかも赤血球は新鮮なもので
なければ測定値にバラツキを生じてしまうという欠点が
あつた。また測定法自体も煩雑であり、反応時間も１時
間30分と比較的長いため測定の自動化が困難であること
などの問題がある。
ター法は実施に際してウサギ、ヒツジまたはヒトＯ型赤
血球を必然的に必要とし、しかも赤血球は新鮮なもので
なければ測定値にバラツキを生じてしまうという欠点が
あつた。また測定法自体も煩雑であり、反応時間も１時
間30分と比較的長いため測定の自動化が困難であること
などの問題がある。
また、ラテツクス比濁法はラテツクスの非特異的凝集
により測定値がばらついたり、試薬の乾燥により自動分
析機が詰まるなどの問題がある。
により測定値がばらついたり、試薬の乾燥により自動分
析機が詰まるなどの問題がある。
更に、ラテツクススライド凝集法も目視による方法で
あるため、測定の自動化が困難であるという問題を有し
ている。
あるため、測定の自動化が困難であるという問題を有し
ている。
従つて、精度が高く、現在汎用の生化学用自動分析機
に好適に適用できるASOの定量法の開発が望まれてい
た。
に好適に適用できるASOの定量法の開発が望まれてい
た。
本発明者らは上記問題点を解決すべく鋭意検討を行な
つたところ、フェニル基を有するポリオキシエチレンエ
ーテル系非イオン性界面活性剤（以下、単に「非イオン
性界面活性剤」と称する）を凝集促進剤として使用し、
抗原抗体反応開始後の凝集発生による吸光度変化を測定
すれば、容易にかつ高精度でASOが測定できること及び
この方法は自動分析機に有利に適用し得るものであるこ
とを見出し、本発明を完成した。
つたところ、フェニル基を有するポリオキシエチレンエ
ーテル系非イオン性界面活性剤（以下、単に「非イオン
性界面活性剤」と称する）を凝集促進剤として使用し、
抗原抗体反応開始後の凝集発生による吸光度変化を測定
すれば、容易にかつ高精度でASOが測定できること及び
この方法は自動分析機に有利に適用し得るものであるこ
とを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は検体にSLO及び非イオン性界面活
性剤を添加し、生じた凝集による吸光度変化量を測定す
ることを特徴とするASOの定量法である。
性剤を添加し、生じた凝集による吸光度変化量を測定す
ることを特徴とするASOの定量法である。
本発明を実施するには、まず、ASOを含む検体中に好
ましくは過剰のSLO及び非イオン性界面活性剤を添加す
る。
ましくは過剰のSLO及び非イオン性界面活性剤を添加す
る。
検体としては、各種体液が用いられるが、一般には血
清が好ましい。また、SLOとASOとの凝集反応系の好まし
い温度範囲は室温ないし40℃程度、pH範囲は4.5〜8.5で
あるので、本発明の実施には反応系をこの条件に適合さ
せることが必要である。なお、SLO及び非イオン性界面
活性剤の添加時及びその後においては、系が均一となる
よう撹拌をおこなうことが必要である。更に本発明にお
いて用いられる非イオン性界面活性剤は、例えばそのHL
B値が13〜20以上のものが特に好ましい。より具体的に
は例えばポリオキシエチレンオクチルフエニルエーテル
（EO＝30〜100のもの）、ポリオキシエチレンノニルフ
エニルエーテル（EO＝30〜100のもの）、などが挙げら
れ、これらは単独でまたは組み合わせて使用することが
できる。
清が好ましい。また、SLOとASOとの凝集反応系の好まし
い温度範囲は室温ないし40℃程度、pH範囲は4.5〜8.5で
あるので、本発明の実施には反応系をこの条件に適合さ
せることが必要である。なお、SLO及び非イオン性界面
活性剤の添加時及びその後においては、系が均一となる
よう撹拌をおこなうことが必要である。更に本発明にお
いて用いられる非イオン性界面活性剤は、例えばそのHL
B値が13〜20以上のものが特に好ましい。より具体的に
は例えばポリオキシエチレンオクチルフエニルエーテル
（EO＝30〜100のもの）、ポリオキシエチレンノニルフ
エニルエーテル（EO＝30〜100のもの）、などが挙げら
れ、これらは単独でまたは組み合わせて使用することが
できる。
また、SLO及び非イオン性界面活性剤の検体への添加
は、同時に行なつても、あらかじめ非イオン性界面活性
剤を加えておいた検体中へSLOを添加しても、いずれで
も良く、これらの添加量は、一般には、SLOが検体100μ
当り200〜1,000単位以上、非イオン性界面活性剤が２
〜20重量％程度である。
は、同時に行なつても、あらかじめ非イオン性界面活性
剤を加えておいた検体中へSLOを添加しても、いずれで
も良く、これらの添加量は、一般には、SLOが検体100μ
当り200〜1,000単位以上、非イオン性界面活性剤が２
〜20重量％程度である。
次いで、抗原抗体反応で生じる凝集による吸光度変化
量が測定される。
量が測定される。
本発明方法で用いる測定波長は一般には300〜400nmで
ある。また、反応開始直後の凝集生成の著しい時期にお
いての吸光度の変化を測定することが重要であるので、
一般には反応開始後５〜７分までに、好ましくは反応開
始後３分以内に吸光度測定を終了させることが望まし
い。また、測定用機器としては、光度計を有する汎用の
自動分析機であればよく、特に限定されない。なお、本
発明方法においてより精度を高めるためには、単位時間
当りの吸光度変化の測定値から最小二乗法により吸光度
変化量を求めれば良い。
ある。また、反応開始直後の凝集生成の著しい時期にお
いての吸光度の変化を測定することが重要であるので、
一般には反応開始後５〜７分までに、好ましくは反応開
始後３分以内に吸光度測定を終了させることが望まし
い。また、測定用機器としては、光度計を有する汎用の
自動分析機であればよく、特に限定されない。なお、本
発明方法においてより精度を高めるためには、単位時間
当りの吸光度変化の測定値から最小二乗法により吸光度
変化量を求めれば良い。
最後に、検量線を用いることにより、吸光度変化量か
らASO量が測定される。
らASO量が測定される。
検量線は、ASOを含まない検体液、例えばASOを含まな
い標準血清と、濃度既知のASOを用いることにより容易
に調製される。
い標準血清と、濃度既知のASOを用いることにより容易
に調製される。
本発明方法を容易に実施するためには、本方法を実施
するために必要な成分、すなわち、必須成分であるSLO
及び非イオン性界面活性剤のほか、検体のpHを一定範囲
に保ち、濁りを防ぐための緩衝液、防腐剤、無機塩等を
含有する分析試薬用キツトを利用すると有利である。
するために必要な成分、すなわち、必須成分であるSLO
及び非イオン性界面活性剤のほか、検体のpHを一定範囲
に保ち、濁りを防ぐための緩衝液、防腐剤、無機塩等を
含有する分析試薬用キツトを利用すると有利である。
このような分析試薬用キツトの一例を示せば次の通り
である。
である。
第１試薬： 非イオン性界面活性剤 ２〜20 重量％ 防腐剤 ０〜0.2重量％ 無機塩（NaCl、リン酸ナトリウム等） 0.5〜３ 重量％ 精製水 バランス （緩衝液を用い、pHを5.5〜8.0に保持する） 第２試薬： SLO 1,000〜10,000単位/ml 非イオン性界面活性剤 ２〜20 重量％ 防腐剤 ０〜0.2重量％ 無機塩等 0.5〜３ 重量％ 精製水 バランス （緩衝液を用い、pHを5.5〜8.0に保持する） 〔発明の効果〕 本発明の定量法は、ラテツクス等の担体や赤血球を用
いないため、赤血球の種類や鮮度に依存する誤差の発生
や、ラテツクスなどの担体の非特異的凝集による測定値
のバラツキがなく、また、一定時間経過後の吸光度の差
でなく反応初期の吸光度変化量を測定するものであるた
め、高い精度でASOを定量することが可能である。ま
た、凝集促進剤の添加により、凝集時間が５〜10分程度
に短縮されるため、現在汎用の生化学用自動分析機に適
用することができる。更に凝集促進剤として非イオン性
界面活性剤を使用しているため、反応セルや試薬分注機
構の洗浄の手間が軽減され、自動分析機の光学的部分や
試薬分注機構も保護される。
いないため、赤血球の種類や鮮度に依存する誤差の発生
や、ラテツクスなどの担体の非特異的凝集による測定値
のバラツキがなく、また、一定時間経過後の吸光度の差
でなく反応初期の吸光度変化量を測定するものであるた
め、高い精度でASOを定量することが可能である。ま
た、凝集促進剤の添加により、凝集時間が５〜10分程度
に短縮されるため、現在汎用の生化学用自動分析機に適
用することができる。更に凝集促進剤として非イオン性
界面活性剤を使用しているため、反応セルや試薬分注機
構の洗浄の手間が軽減され、自動分析機の光学的部分や
試薬分注機構も保護される。
以下に実施例を挙げて説明するが、本発明はこれに限
定されるものではない。
定されるものではない。
実施例 143検体の血清について下記の操作方法及び標準検量
線を用いASOを求めた。一方、これらの検体血清につい
てラテツクス比濁法及びマイクロタイター法によつても
ASOを求め、これら方法と本発明方法の相関関係を調べ
た。
線を用いASOを求めた。一方、これらの検体血清につい
てラテツクス比濁法及びマイクロタイター法によつても
ASOを求め、これら方法と本発明方法の相関関係を調べ
た。
本発明方法とラテツクス比濁法との相関図を第３−Ａ
図、本発明方法とマイクロタイター法との相関図を第３
−Ｂ図に示す。
図、本発明方法とマイクロタイター法との相関図を第３
−Ｂ図に示す。
（１） 使用機器 日立7050型自動分析装置 （２） 試薬 （ｉ）第１試薬 HEPES緩衝液（pH7.2） ………0.05M NaCl ………0.15M アジ化ソーダ 0.1重量％ ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル ………7.2重量％ （ii）第２試薬 SLO液 SLOの調製 Ａ群溶連菌をトツド・ヘヴイト培地で16〜20時間培養
し、菌体を除去した上清から硫酸アンモニウム塩析によ
りSLOを得た。このSLOを0.005Mリン酸緩衝液で充分に透
析し、溶血価1000単位/mlに調整し、凍結乾燥する。
し、菌体を除去した上清から硫酸アンモニウム塩析によ
りSLOを得た。このSLOを0.005Mリン酸緩衝液で充分に透
析し、溶血価1000単位/mlに調整し、凍結乾燥する。
SLO液の調製 で調製したSLOを、第１試薬と同様な成分液で溶血
価1000単位/mlとなるよう溶解し、第２試薬とした。
価1000単位/mlとなるよう溶解し、第２試薬とした。
（３） 操作方法 上記機器及び試薬を用いて行なつた測定操作の概略を
第１図に示す。まず反応セル中に水のみ入れた、セルブ
ランクの340nmの吸光度を測定し、次いで水を排出後検
体血清20μ及び第１試薬350μを入れ、１回目の吸
光度を測定した。以後20秒間隔で計32回、10分間にわた
り測定した。ここでセルブランクの吸光度は、装置内の
演算機構により自動的に各測定値より差し引かれる。第
１試薬の添加５分後に第２試薬50μを添加し、反応を
開始させた。
第１図に示す。まず反応セル中に水のみ入れた、セルブ
ランクの340nmの吸光度を測定し、次いで水を排出後検
体血清20μ及び第１試薬350μを入れ、１回目の吸
光度を測定した。以後20秒間隔で計32回、10分間にわた
り測定した。ここでセルブランクの吸光度は、装置内の
演算機構により自動的に各測定値より差し引かれる。第
１試薬の添加５分後に第２試薬50μを添加し、反応を
開始させた。
上記各測定値の内、第19〜21回目（第２試薬添加後１
分〜１分40秒）に測定された吸光度を採り、最小二乗法
により単位時間当たりの吸光度変化量を算出した。
分〜１分40秒）に測定された吸光度を採り、最小二乗法
により単位時間当たりの吸光度変化量を算出した。
（４） 標準検量線の作成 ASOが陰性の血清及び280Todd単位の血清を用いて次の
希釈系列を調整した。
希釈系列を調整した。
希釈比 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.
８ 0.9 1.0 ASO（Todd単位） ０ 28 56 84 112 140 168 19
６ 224 252 280 これら11種の血清20μずつを用い、上記操作方法に
従つて単位時間当たりの吸光度変化量（ΔABS/min）を
求め、ASO濃度との関係をプロツトして標準検量線を作
成した。これを第２図に示す。
８ 0.9 1.0 ASO（Todd単位） ０ 28 56 84 112 140 168 19
６ 224 252 280 これら11種の血清20μずつを用い、上記操作方法に
従つて単位時間当たりの吸光度変化量（ΔABS/min）を
求め、ASO濃度との関係をプロツトして標準検量線を作
成した。これを第２図に示す。
（５） 結果 第３−Ａ図及び第３−Ｂ図から明らかなように、本発
明方法は従来法との良好な相関関係を有する。
明方法は従来法との良好な相関関係を有する。
第１図は、自動分析装置による吸光度測定手順の概略を
示す図面であり、第２図は、標準検量線を示す図面であ
る。 第３−Ａ図は、本発明方法とラテツクス比濁法との相関
を示す図面であり、第３−Ｂ図は、本発明方法とマイク
ロタイター法との相関を示す図面である。
示す図面であり、第２図は、標準検量線を示す図面であ
る。 第３−Ａ図は、本発明方法とラテツクス比濁法との相関
を示す図面であり、第３−Ｂ図は、本発明方法とマイク
ロタイター法との相関を示す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 柴田 英昭 東京都豊島区巣鴨２丁目11番１号 日水 製薬株式会社内 (56)参考文献 特開 昭53−44623（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−113758（ＪＰ，Ａ) 特開 昭49−42822（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−31960（ＪＰ，Ａ) 特開 昭48−37184（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−187862（ＪＰ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】検体にストレプトリジンＯ及びフェニル基
を有するポリオキシエチレンエーテル系非イオン性界面
活性剤を添加し、生じた凝集による吸光度変化量を測定
することを特徴とする抗ストレプトリジンＯの定量法。 - 【請求項２】吸光度変化量の測定を、ストレプトリジン
Ｏ及び非イオン性界面活性剤の添加後０〜７分の間にお
こなう特許請求の範囲第１項記載の抗ストレプトリジン
Ｏの定量法。 - 【請求項３】吸光度変化量の測定を、単位時間当りの吸
光度変化量として求め、この値を最小二乗法によって処
理し算出することによりおこなう特許請求の範囲第１項
記載の抗ストレプトリジンＯの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62169498A JP2589088B2 (ja) | 1987-07-07 | 1987-07-07 | 抗ストレプトリジンｏの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62169498A JP2589088B2 (ja) | 1987-07-07 | 1987-07-07 | 抗ストレプトリジンｏの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6413461A JPS6413461A (en) | 1989-01-18 |
| JP2589088B2 true JP2589088B2 (ja) | 1997-03-12 |
Family
ID=15887636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62169498A Expired - Lifetime JP2589088B2 (ja) | 1987-07-07 | 1987-07-07 | 抗ストレプトリジンｏの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2589088B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0534043A3 (en) * | 1991-09-25 | 1993-05-05 | Biokit Sa | Novel antistreptolysin-o reagent for use with beckman nephelometer system |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4837184A (ja) * | 1971-09-10 | 1973-06-01 | ||
| JPS4942822A (ja) * | 1972-09-04 | 1974-04-22 | ||
| JPS5344623A (en) * | 1976-09-30 | 1978-04-21 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Novel immunoassay |
| JPS5531960A (en) * | 1978-08-30 | 1980-03-06 | Nitsusui Seiyaku Kk | Latex sensing for cohesion reaction |
| JPS58113758A (ja) * | 1981-12-26 | 1983-07-06 | Shimadzu Corp | 免疫グロブリンの分析方法 |
-
1987
- 1987-07-07 JP JP62169498A patent/JP2589088B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6413461A (en) | 1989-01-18 |
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