JP2583115B2 - 組換えマレック病ウイルスおよびその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ニワトリ細胞またはニワトリ体内において
外来遺伝子産物を発現させることが可能な新規なウイル
スベクターに関するものである。さらには、これを用い
たニワトリ用多価生ワクチンに関する。

発明の背景および従来技術 現在の養鶏分野においては種鶏，産卵鶏，及び肉用鶏
の別を問わず、ワクチネーションによる疾病予防は重要
な衛生対策の柱である。しかしながら、そのワクチネー
ションの実態は実に過密とも言えるほど頻回であり、し
たがってこれに要する人件費の大きさは養鶏家にとって
大きな経済的負担となっている。この点の打開策とし
て、一つには既存の数種ワクチンを単純に混合すること
が考えられる。しかしながら、生ワクチンの場合にはウ
イルス相互の干渉という問題があり、又、不活化ワクチ
ン混合の場合においても容量的な限界がある。さらにこ
のような問題に加えて、生ワクチンと不活化ワクチンの
混合においては、ゲル（アジュバント）への生ワクチン
抗原の吸着による力価低下という問題があり、従来の技
術では現実的に問題が残されている。

最近ではこのような点を踏まえ、第二の打開策として
ウイルスベクターを使用することが試みられつつある。
すなわち、一つのウイルスに複数のワクチン抗原の遺伝
子を組み込むことで多価の生ワクチンを作製するという
方法である。この方法により、前述したようなウイルス
相互の干渉、あるいは不活化ワクチン混合時における接
種量の増大という問題を生じない多価ワクチンを作出す
ることが可能であると考えられる。

これまでに、ウイルスをベクターとして使うことを目
的とした研究は、既にワクシニアウイルス、アデノウイ
ルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、レトロウイル
ス等で実施されており、いずれもインビトロの系におい
て、HBs抗原（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）あるいは狂
犬病ウイルスや帯状疱疹ウイルス等の糖蛋白抗原の発現
に成功している。しかしながら、ワクシニアウイルスを
除いては、いずれのウイルスも本来、腫瘍原性を有する
ウイルス属に属することから、これらのウイルスをヒト
または動物へ投与することは、安全性の面から問題が多
く現実的ではない。また、ワクシニアウイルスの場合、
ウイルス自体の安全性に問題はないものの、本発明が目
的とする鳥類へのウイルスベクターとして見た場合に
は、接種の対象となる鳥類がワクシニアウイルス本来の
宿主ではないことから、仮に鳥類へのウイルスベクター
として使用されたとしても、その効果に多くは期待でき
ない。同様に、前述の他のウイルスベクターを用いた場
合にも、鳥類がこれらのウイルス本来の宿主ではないこ
とから高い効果は期待できない。

このような点から、鳥類のポックスウイルス（例えば
ニワトリの鶏痘ウイルス）をベクターとして使うことが
考えられ、既にウイルスベクターとしての検討もなされ
ており、そのウイルスDNAに外来遺伝子挿入の可能なこ
とが示されている［佐伯ら、第35回日本ウイルス学会P2
09（1987）］。

しかしながら、例えば、現在の養鶏分野においては、
鶏痘に対する免疫は、鶏痘ウイルスの免疫持続期間が短
いことから、通常、ニワトリの飼育期間中に数回のワク
チンウイルス（弱毒鶏痘ウイルスまたは鳩痘ウイルス）
接種が必要とされている。このようなことから、ポック
スウイルスをウイルスベクターとして用いた場合には、
仮に複数の抗原を組み込んだウイルスベクターが作出さ
れワクチンとして使用されたとしても、頻回のワクチネ
ーションが必要になると考えられる。

発明の目的 このような状況下において、鳥類を宿主とする、免疫
持続期間の長いウイルスを利用した効果的なウイルスベ
クターの開発に鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、
マレック病ウイルスに外来遺伝子を効率よく組み込むこ
とに成功し、マレック病ウイルスをウイルスベクターと
して用いることが可能なことを見いだし本発明を完成す
るに至った。すなわち、本発明は、鳥類用のワクチンと
して利用することが可能な、新規な組換えマレック病ウ
イルスならびにその製法、さらにはこの組換えマレック
病ウイルスを用いた鳥類用多価生ワクチンを提供するも
のである。

発明の構成および効果 マレック病は人畜を含めて、唯一ワクチンによってそ
の発病が防がれる悪性腫瘍であるが、その防御メカニズ
ムとしては、ワクチンウイルスが終生持続感染すること
により、鶏等鳥類体内においてマレック病ウイルスに対
する液性及び細胞性免疫を惹起、終生持続せしめ、その
結果、強毒ウイルスによる腫瘍化を抑えていると考えら
れている。

すなわち、本発明に従い、他の疾病に対するワクチン
抗原をコードする外来遺伝子をマレック病ウイルスに組
み込み、これを鳥類に接種した場合においても、通常の
マレック病ウイルスと同様な機序により本組換えウイル
ス接種鶏において、長期又は終生に亘って外来遺伝子に
由来する抗原が発現され、該抗原に対する液性又は細胞
性免疫が誘導・保持されることが期待される。すなわ
ち、本発明に従えば、鶏等の鳥類に対して初生時の一回
投与のみで多数の病原体に対して免疫を賦与しうる多価
生ワクチンを作出することが可能である。

現在、マレック病に対するワクチンとしては、マレッ
ク病Ｉ型ウイルス（MDV-I型）を弱毒化したもの、七面
鳥ヘスペスウイルス（HVT）からなるもの、またはマレ
ック病II型ウイルスと七面鳥ヘルペスウイルスを混合し
たものが存在する。マレック病自体はＩ型ウイルスの感
染により引き起こされることがわかっており、したがっ
て、その発症防御には、血清学的に同じ型に属するマレ
ック病Ｉ型ウイルス弱毒株をワクチンとして用いること
が最も効果的であると考えられる。すなわち、本発明に
おいて、マレック病ワクチンも含めた多価ワクチンとし
て本発明の組換えマレック病ウイルスを使用する場合に
は、マレック病Ｉ型ウイルスを使用することが好まし
い。

本発明のような、他のウイルスベクターをはるかに凌
駕する特質をもつマレック病ウイルスをベクターとする
多価生ワクチン作製のためには、まず、マレック病ウイ
ルスDNA上において、外来遺伝子を挿入することが可能
な部位、または削除可能な部位を見い出すことが必須で
ある。

しかしながら、マレック病ウイルスDNAについては、
ポックスウイルス、アデノウイルスのようには解析が進
んでおらず、わずかに、二・三の制限酵素によるマッピ
ングが示されているのみであり［福地邦彦ら,J.Virol.,
51,p102（1984）］、また、特定の蛋白質をコードする
ことが明かな部分はgAをコードする、マレック病ウイル
ス遺伝子を制限酵素BamHIで切断し得られるBamHI-B断片
１箇所のみであり、［R.J.ISFORTら,J.gen.Virol.,61,p
2614（1987）］他の領域の遺伝子に関してはほとんど解
析がなされていない。

ところで、gAは、gBと共にウイルスの産生する主要な
糖蛋白質であり、動物体内に接種された場合にgBのよう
な中和抗体の産生は今のところ認められていないもの
の、gAが細胞性免疫を惹起することは十分推定される。
したがって、マレック病ウイルスにベクターとワクチン
としての両方の機能を持たせることを考えた場合に、こ
のgA遺伝子に外来遺伝子を挿入しgAを変異化させること
はワクチン効果の低下につながると予想された。

この他、ウイルスの増殖に必須ではない遺伝子として
TK遺伝子が挙げられ、ヘルペスウイルスの場合、外来遺
伝子の挿入部位に利用されている。マレックウイルスＩ
型の場合にもTK遺伝子が存在することは推定されるが、
一般にTK遺伝子の欠損はウイルスの増殖性の低下につな
がるとされており、（12th International Herpes Viru
s Workshop p68,1987）、従ってワクチン効果を考慮し
た場合には、TK遺伝子中に外来遺伝子を挿入することは
好ましくないと考えられる。

このような状況において、本発明者らは、まだあまり
解析の進んでいない遺伝子についても効果的な組換えマ
レック病ウイルスの作出に関して研究を進めた結果、マ
レック病Ｉ型ウイルス遺伝子のBamHI-H断片（マレック
病ウイルス遺伝子を制限酵素BamHIで切断して生じる８
番目に大きな遺伝子断片）を用いることにより組換えマ
レック病ウイルスを作出することが可能であることを見
いだした。

マレック病ウイルス遺伝子BamHI-H断片には、マレッ
ク病ウイルスを構成するgAのような主要な蛋白質はコー
ドされていないと考えられていることから、本発明にお
けるマレック病ウイルス遺伝子のBamHI-H断片を用いて
外来遺伝子断片をウイルスゲノムに組み込んだ組換えマ
レック病ウイルスは、マレック病ワクチンとしての効果
を落とすことなく、目的の外来遺伝子を効率よく発現す
る非常に優れた多価生ワクチンとなりうる。

本発明で開示されるように、これまでに組換えウイル
スベクターとして知られていないマレック病ウイルスを
用い、このウイルスDNAにおいて外来遺伝子組み込みの
可能な部位があり、しかも、当該部位に外来遺伝子を挿
入したとき該組換えウイルスが増殖し、外来遺伝子を発
現することが出来ることを見いだしたことは、本発明に
おいて最も特筆すべきことである。

以下、本発明の組換えマレック病ウイルスの作出法に
ついてさらに記述する。

一般に、本発明のような組換えウイルスを作出するた
めには以下のような手順が必要となる。

（１）ウイルスDNAの一部をベクターにクローニングす
る。

（２）ウイルスDNA断片がクローニングされたベクター
に、目的とする外来遺伝子の発現が可能な遺伝子断片を
挿入したプラスミドを構築する。

（３）該プラスミドをウイルス感染細胞に形質導入す
る。

（４）適当な方法で外来遺伝子を保持する組換えウイル
スを選択する。

本発明においては、マレック病Ｉ型ウイルスの遺伝子
から各種遺伝子のクローニングをおこなった。しかしな
がら、外来遺伝子をマレック病ウイルスゲノムに組み込
む際に使用するウイルス由来遺伝子断片としては、BamH
I-H断片が最も好ましいことが見いだされた。

ウイルスに外来遺伝子を組み込む際に用いる遺伝子断
片（プラスミド）の基本構造としては、マレック病ウイ
ルス由来の遺伝子を有し、さらに動物細胞もしくは動物
ウイルス由来のプロモーターの下流に目的の外来構造遺
伝子を接続した構造を有する。このようなプラスミドを
用いることにより、ウイルス由来遺伝子断片に相同性の
あるウイルスゲノムの中に該プラスミドが組み込まれ
る。また、該プラスミドをウイルスに形質導入する際に
は、予めプラスミドを適当な制限酵素で切断し線状化
し、これを形質導入することも可能である。

本発明では、まず、（１）として、ウイルスDNAを制
限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動により、各断
片を分離したのちゲルより回収し、各断片をプラスミド
にクローニングする方法を行った。この際に使用するク
ローニングベクターとしては、コスミド、ファージ等の
いずれも利用することができる。

次に、（２）としては、プラスミドにクローニングさ
れた各ウイルス断片を任意な制限酵素で一箇所切断また
は二箇所切断して一部欠損させたものへ動物細胞内で機
能するプロモーターを発現されるべき構造遺伝子の上流
にもつ外来遺伝子を挿入する。

この際に用いる外来遺伝子発現の為のプロモーターと
しては、動物細胞もしくは動物ウイルス由来のプロモー
ターが使用されるが、特に好ましくはニワトリのβ−ア
クチン遺伝子プロモーターが使用される（第１図参
照）。このニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーター
は、従来よく知られているSV40初期遺伝子プロモーター
等と比較して、極めて高いプロモーター活性を有してい
る（発明者：宮崎純一、山村研一ら、特願昭63-157569
号）。さらに、ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモー
ターとSV40初期遺伝子プロモーターのハイブリッドプロ
モーターを使用すればβ−アクチン遺伝子プロモーター
のみの場合に較べて、さらに高い外来遺伝子の発現が可
能となる（第２図参照）。

（３）のウイルスDNAへの外来遺伝子を含むウイルス
断片の相同組換えであるが、例えば、カイコを宿主とす
るバキュロウイルスのようにウイルスDNAが比較的短い
ものでは、ウイルスDNAと該プラスミドを同時に細胞に
形質導入する方法がとられるが、マレック病ウイルスの
場合、そのDNAは160Kbp-180Kbpと長い為に、このような
方法での相同組換えは困難であり、従って本発明では、
ワクシニアウイルスの例を参考に該プラスミドを導入す
る方法［M.MACKETTら,Proc.Natl.Acad.Sci.,79,p7415
（1982）］つまり、培養細胞にウイルスを感染させた後
に、該プラスミドを導入するという方法が用いられる。

この際、形質導入の方法はリン酸カルシウム法、DEAE
-Dextran法、エレクトロポーレーション法のいずれでも
行うことができる。

（４）の組換えウイルスの選択方法に関しては、発現
させるべくウイルスに組み込まれた外来遺伝子に応じた
測定系が使用される。例えば、その一例として、本実施
例に示すようにβ−ガラクトシダーゼ（β‐gal）をコ
ードする遺伝子（Lac-Z遺伝子）をマレック病ウイルス
に組み込み、β−ガラクトシダーゼを発現している組換
えウイルスを選択する場合には、β−ガラクトシダーゼ
に対する基質［例えばX-Gal（５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）］を細
胞シートに重層する寒天液中に添加することで、β−ガ
ラクトシダーゼ活性をもつウイルスのプラークを色別す
ることが可能である。［S.CHAKRABBARTIら、Mol.Cell.B
iol.,5,p3403（1985）；佐伯ら，第35回日本ウイルス学
会（1987）］。

このようにして得られる、本発明の組換えマレック病
ウイルスは、鳥類、特にニワトリ用の多価生ワクチンと
して非常に有効である。すなわち、ニワトリの他の感染
症に対するワクチン抗原を発現可能な外来遺伝子を組み
込まれた組換えマレック病ウイルスは、本来のマレック
病ウイルスが持つ非常に優れた免疫持続効果を有する、
極めて利用価値の高い多価生ワクチンとなる。

以下、実施例にしたがい、本発明はさらに詳細に説明
するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。

実施例1:マレック病ウイルスDNA-BamHI-Hフラグメント
の単離 マレック病Ｉ型ウイルスを鶏胚繊維芽細胞（CEF）に
接種後、細胞変性効果（CPE）を強く呈した時点でウイ
ルス感染細胞をハーベストし、平井らの方法［J.gen.Vi
rol.,45,p119（1979）］に従って、ウイルスDNAを精製
した。

すなわち、まず遠心により集めたウイルス感染細胞に
２倍量の１％‐NP40溶液（0.01M-Tris-HCl,pH7.4,0.01M
-NaCl,0.0015M-MgCl₂）を加えて30分間氷冷した後、ピ
ペッティングした。この溶液を2500回転で10分間遠心分
離し、その上清を40％‐60％（w/w）のショ糖溶液（0.0
2M Tris-HCl,pH7.4,0.15M NaCl）に重層、175KGで２時
間遠心後、40％ショ糖溶液と60％ショ糖溶液の中間に形
成されたマレック病ウイルスに由来するカプシドの層を
分取した。さらに、この中間層を再度0.02M Tris-HCl,p
H7.4,0.15M NaCl溶液に懸濁し、160KGで１時間遠心して
ペレッティングさせた。このペレットを、プロテイネー
スＫ（ベーリンガー・マンハイム）を0.1％に含む１％
‐SDS溶液（0.1％ Tris-HCl,pH7.4,0.01M-EDTA,1％‐Sa
rcocinate;半井化学）に浮遊させ、37℃で一晩放置し
た。その後、フェノール処理、エタノール沈澱によりDN
Aを回収し、TE緩衝液（10mM Tris-HCl,pH7.4,1mM-EDT
A）に溶解し、10％‐30％のグリセロールグラディエン
ト溶液に重層後、175KGで４時間遠心した。次に管底よ
り溶液を分画し、ウイルスDNAを含む分画をとり、10％
−トリクロル酢酸を等量加えて、DNAを沈澱させ回収し
た。

次に、この精製DNA 10μｇを制限酵素BamHI（宝酒
造；以下、本実施例で示した試薬は、特に記載のない限
り宝酒造製あるいは東洋紡製を使用した。）で切断し、
0.5％−アガロースゲル電気泳動で各断片を分離後、Ｈ
断片をエレクトロエリューション法によりゲルから浴出
し、フェノール処理、エタノール沈澱により回収した。
このようにして得た断片約40ngをpUC19 20ngとT4DNAリ
ガーゼにより連結させ、大腸菌コンピテントセル（JM10
9）に形質導入し、アンピシリン及びX-Galを含む寒天平
板上に広げた。形質転換によってβ‐galを産生しなく
なった白色のコロニーを採取し、100μg/mlにアンピシ
リンを含むLB培地で培養した後、常法であるアルカリ法
によって菌体内のプラスミドを回収し、これをBamHIで
切断することにより、BamHI-H断片の挿入されたプラス
ミドを保有する形質転換体を選出した。

このようにして得られたプラスミドをpMBHと命名した
（第３図参照）。

実施例2:LacZ遺伝子を挿入されたＨ断片をもつプラスミ
ド「pMBH-1L」の構築 pMBHをBglIIで切断し、大腸菌由来のアルカリフォス
ファターゼ（BAP）により５′末端の脱リン酸化を行っ
た。

一方、上流にニワトリ由来β−アクチン遺伝子のプロ
モーターを持つ大腸菌由来のLacZ遺伝子をpAc-LacZより
BamHI及びXhoIで切り出し、0.8％ゲルで分離後、5.2Kbp
の断片を回収し、平滑末端化したのち、その40ngを上記
の直線化したpMBH 20ngとT4リガーゼによって連結しHB1
01に導入した。このものをアンピシリン（100μg/ml）
を含む寒天平板に広げ37℃で培養した後、アンピシリン
に耐性な６個の形質転換コロニーを選択し、100μg/ml
のアンピシリンを含むLB培地で培養し、プラスミドを単
離した後、BamHI及びHindIIIによる切断パターンを分析
した。0.8％アガロースゲル電気泳動で予想されたパタ
ーンを示した一つのプラスミドをpMBH-1Lと命名した
（第３図参照）。

実施例3:LacZ遺伝子をもつマレック病ウイルスの作出 37℃で一晩培養した初代CEFをEDTA−トリプシン溶液
でハーベスト、洗浄後、５％牛血清（BS）添加イーグル
−MEM（E-MEM;日水）培地に20万個/mlの細胞濃度で浮遊
し、その40mlをファルコン社製組織培養フラスコ（NO.3
028）に入れ、37℃で16時間培養した。このときの細胞
のシート率は約50％であった。これにマレック病Ｉ型ウ
イルス感染CEFを約80万個接種し、37℃で４時間培養
後、再びEDTA−トリプシン溶液で細胞をハーベストし、
５％‐BS添加E-MEMで一度洗浄した後、ショ糖添加リン
酸バッファー（ショ糖272mM、リン酸カリウム7mM、MgCl
₂1mM、pH7.4）で２度細胞を洗浄し、最終的に0.7mlのシ
ョ糖添加リン酸バッファーに懸濁し、エレクトロポーレ
ーション用キュベット（バイオラッド,NO.165-2085）に
入れ、pMBH-1L40μｇを添加し10分間氷冷した。次に、
バイオラッド社製ジーンパルサーに添付されたマニュア
ルに従って、エレクトロポーレーションを行った。エレ
クトロポーレーションの条件は、200V-25μＦ、１回パ
ルスで行った。その後、さらに10分間氷冷した後、前日
培養した初代CEFをハーベストしたものと混合し、最終
的に200万個/mlの濃度になるよう５％BS添加E-MEM（日
水）に浮遊させ、径10cmのシャーレ（ファルコン社製、
No.3003）に13mlずつ10枚に分注し、37℃で培養した。
翌日、培地を除去、１％‐BSを添加したフェノールレッ
ド不含E-MEMにアガロースを１％濃度に添加した液を重
層し、さらに37℃で５日間培養した。次に、クロロフェ
ノールレッドβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（生化学工
業）を100μg/mlの濃度で含む１％−アガロース/E-MEM
液（フェノールレッド不含）を重層し、37℃で数時間お
いた。

この結果、シャーレ当り10個から30個の頻度で、β‐
gal活性を示す赤色のウイルスのプラークが認められ
た。このとき、赤色のプラークは、pMBH-1Lのみをエレ
クトロポーレーションにより導入したもの、又はウイル
スのみに同様な処置をした場合には認められなかった。
又、この赤色プラークをクローニングし前日培養した２
代目CEFに接種したところ、このプラークは継代され、
前述した方法によって再びβ‐galに由来する赤色プラ
ークを示し、安定してウイルスに組み込まれていること
が示された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーター下
流にLac-Z遺伝子を組み込んだプラスミドpAc-LacZの構
造を示す。 第２図は、ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーターと
SV40初期遺伝子プロモーターのハイブリッドプロモータ
ーの下流にLac-Z遺伝子を組み込んだプラスミドpAS-Lac
Zの構造を示す。 第３図は、マレック病Ｉ型ウイルスDNA BamHI-H断片が
組み込まれたプラスミドpMBHならびにプラスミドpMBH-1
Lの構築図を示す。

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】動物細胞もしくは動物ウイルス由来のプロ
   モーター下流に外来遺伝子を接続した遺伝子断片を、マ
   レック病１型ウイルス遺伝子BamHI−Ｈ断片の中に組み
   込んで得られる断片を含むプラスミドによって変異され
   た組換えマレック病１型ウイルス。
2. 【請求項２】マレック病１型ウイルス由来のBamHI−Ｈ
   遺伝子断片の挿入部位がBglII制限酵素切断部位である
   前記第（１）項記載の組換えマレック病１型ウイルス。
3. 【請求項３】外来遺伝子発現用プロモーターがニワトリ
   由来のβ−アクチン遺伝子プロモーターである前記第
   （１）項記載の組換えマレック病１型ウイルス。
4. 【請求項４】動物細胞もしくは動物ウイルス由来のプロ
   モーター下流に外来遺伝子を接続した遺伝子断片をマレ
   ック病１型ウイルス遺伝子BamHI−Ｈ断片に組み込み、
   これをマレック病１型ウイルスゲノムに組み込むことを
   特徴とする組換えマレック病１型ウイルスの製法。
5. 【請求項５】マレック病１型ウイルス由来のBamHI−Ｈ
   遺伝子断片の挿入部位がBglII制限酵素切断部位である
   前記第（４）項記載の組換えマレック病１型ウイルスの
   製法。
6. 【請求項６】外来遺伝子発現用プロモーターがニワトリ
   由来のβ−アクチン遺伝子プロモーターである前記第
   （４）項記載の組換えマレック病１型ウイルスの製法。