JP2577743B2 - 安定な顆粒球コロニ−刺激因子含有製剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒト組換え顆粒球コロニー刺激因子含有製剤
に関し、特に容器壁上への吸着または会合、重合、酸化
等による活性成分の損失、不活性化を有利に防止し、安
定化させたヒト組換え顆粒球コロニー刺激因子含有製剤
に関するものである。

従来の技術 最近では各種感染症の化学療法等においては、耐性菌
発生、原因菌の交代現象、あるいは高い副作用などが臨
床的に重大な問題となっており、そのため、例えば抗生
物質、抗菌剤等による上記の如き化学的療法とは別に、
感染菌宿主の防禦機能を活性化するような物質を用いる
ことにより、上記化学療法の根本的な問題の解決を図ろ
うとする動きがある。即ち、例えば細菌感染の初期には
宿主のもつ防禦機能のうちで白血球の貧食殺菌作用が最
も強く影響すると考えられており、そこで好中球の増
殖、分化成熟を促進することにより宿主の感染防禦機能
の亢進を図ることが重要と考えられる。このような作用
を示す極めて有用な物質の一つとして顆粒球コロニー刺
激因子（Ｇ−CSF）があり、既にこれを用いた感染防禦
剤が本出願人によって別途特許出願されている（特願昭
60−23777号）。

発明が解決しようとする問題点 上記の如く、各種化学療法においては、各種の回避し
得ない問題があり、そのために被感染体即ち宿主の防禦
機能を賦活化し得るように物質を薬剤として用いる試み
がなされている。

Ｇ−CSFは勿論、それ自身に宿主の防禦機能を賦活化
する活性を有し、臨床上の治療効果をさらに十分に発揮
すべく、上述した薬剤との併用の場合に於ても、その目
的を遂行する上で極めて有用であることが判明した。

このＧ−CSFは極めて微量で使用され、通常成人一人
当たり、0.1〜500μｇ（好ましくは５〜50μｇ）のＧ−
CSFを含有する製剤を１〜７回／週の割合で投与する。
しかしながら、このＧ−CSFは、例えば注射用アンプ
ル、注射器等の器壁に対し吸着性を示すことから、特に
この薬剤を水溶液等の注射薬として利用する場合には、
アンプル等の容器、注射器等の器壁に吸着されてしま
い、Ｇ−CSFの医薬としての活性を十分有効に発揮させ
ることができず、あるいはこのような吸着に基く損失分
を予め見積って余分に医薬中に添加しておかねばならな
い。

その上、Ｇ−CSFは不安定で、外的因子の影響を受け
易く、温度、湿度、酸素、紫外線等に起因して会合、重
合あるいは酸化などの物理的、化学的変化を生じて、大
きな活性の低下を招く。

このことは、極めて微量の投与量のＧ−CSFを極めて
正確に投与しようとする治療行為の完全な遂行を困難に
する。そこでこのような問題点を解決し有効成分の活性
の低下を十分に防止できる製品を開発する必要が生じ
る。本発明の目的は、このような点にあり、即ち安定な
Ｇ−CSF含有製剤を提供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明者等は上記目的とするＧ−CSF含有製剤の安定
性を改善すべく種々検討・研究した結果、ヒト組換えＧ
−CSFに製薬上許容される特定の糖類を添加することが
有効であることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明の安定なヒト組換えＧ−CSF含有製剤
は、ヒト組換えＧ−CSFとグリセリン、キシリトール、
マンニトール、グルクロン酸、ナイラミン酸、ケトグル
コール酸、ヒアルロン酸およびその塩、ヘパリン、キチ
ンおよびその誘導体、キトサンおよびその誘導体、デキ
ストリン、平均分子量5,000〜150,000のデキストラン並
びにアルギン酸およびその塩からなる群から選ばれる少
なくとも１種の糖類とを含むことを特徴とする。

本発明におけるヒト組換えＧ−CSFは、高純度に精製
されたものであって、ヒトＧ−CSFをコードする遺伝子
を用いて組換体DNAを作製し、これを適当な宿主細胞
（例えば大腸菌、C127細胞、チャイニーズハムスターの
卵胞細胞等）で発現させるなどによって得ることができ
る。すなわち、本発明におけるヒト組換えＧ−CSFは、
ヒトＧ−CSF活性を有するポリペプチドをコードする遺
伝子を組み込んだ組換えベクターで宿主を形質転換して
得られる形質転換体が産生するヒトＧ−CSF活性を有す
るポリペプチドまたは糖蛋白質である。

具体的には、次の（ｉ）及び（ii）で示すヒトＧ−CS
Fが特に好ましく用いられる。

（ｉ）次の理化学的性質を有するヒトＧ−CSF。

分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法による測定で約19,000±1,000。

等電点:pI＝5.5±0.1、pI＝5.8±0.1、pI＝6.1±0.1
の三つの等電点のうち少なくとも１つを有する。

紫外部吸収:280nmに極大吸収を有し、250nmに極小値
を持つ。

Ｎ末端から21残基目迄のアミノ酸配列が次の如くであ
る。

H₂N−Thr−Pro−Leu−Gly−Pro−Ala−Ser−Ser−Leu−Pro− Gln−Ser−Phe−Leu−Leu−Lys−Cys−Leu−Glu−Gln−Val− （ii）下記のアミノ酸配列またはその一部で表わされる
ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチド
又はこれと糖鎖部を有する糖蛋白質を含有するヒトＧ−
CSF。

（Met）_n Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu （Val Ser Glu）_m Gys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala AsP Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gun Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro（但しｍは０又は１を表わし、ｎは０
又は１を表わす）。

なおこれらのＧ−CSFの詳細な製造方法については、
本出願人が先に出願した特願昭59−153273号、特願昭60
−269455号、特願昭60−269456号、特願昭60−270838
号、特願昭60−270839号明細書を参照されたい。

これ等の方法で得られたヒト組換えＧ−CSF含有液は
必要により公知の手段でさらに精製、濃縮した後凍結保
存とするかまたは凍結乾燥などの手段により水分を除去
して保存することができる。

このようにして得たヒト組換えＧ−CSFは本発明によ
って安定なヒト組換えＧ−CSF含有製剤とすることがで
きる。

本発明の安定なヒト組換えＧ−CSF含有製剤を得るの
に使用する糖類としては、グリセリン、キシリトール、
マンニトール、グルクロン酸、ナイラミン酸、ケトグル
コール酸、ヒアルロン酸およびその塩、ヘパリン、キチ
ンおよびその誘導体、キトサンおよびその誘導体、デキ
ストリン、平均分子量5,000〜150,000のデキストラン並
びにアルギン酸およびその塩があり、いずれも有利に使
用でき、これらは単独であるいは２種以上の混合物とし
て添加できる。

これらの糖類は一般にヒト組換えＧ−CSF1重量部に対
し１重量部〜10,000重量部の範囲内で使用することが好
ましい。

更に本発明のヒト組換えＧ−CSF含有製剤は、その製
剤化の目的に応じて希釈剤、溶解補助剤、等張化剤、賦
形剤、pH調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化
防止剤等を含有してもよい。例えば、含硫還元剤として
は、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステ
イン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノール
アミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグ
リコール酸およびその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタ
チオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸など
のスルフヒドリル基を有するものなどを例示できる。

また、酸化防止剤としてはエリソルビン酸、ジブチル
ヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α
−トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸およびその塩、
Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸
ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウ
ム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエ
チレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、ピロリン
酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウムの如きキレート剤
などを例示できる。

あるいはまた賦形剤として、グリシン、システイン、
スレオニン、シスチン、トリプトファン、メチオニン、
リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、アルギニンな
どのアミノ酸を添加してもよい。

本発明の安定化されたＧ−CSF含有製剤は経口、各種
注射などの非経口等各種の投与形式で使用でき、該投与
形式に応じた様々な剤形で実現できる。例えば、投与形
としては錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤等の
経口投与剤、あるいは静注、筋注、皮下注、皮内注用等
の溶液、懸濁注射剤、凍結乾燥剤あるいは、坐剤、経鼻
剤、膣剤等の経粘膜投与剤形を典型的なものとして例示
できる。

作用 上記の如く、感染症等の化学的療法においては、抗生
物質、抗菌剤等の薬剤の他、患者の抵抗力、活性などと
いった免疫応答力にもとずいた防禦機能自体をも同時に
改善するために、この目的で有効な成分を添加併用する
ことが臨床上極めて有用な手段であることが判明してき
た。

この種の成分の一つであるＧ−CSFは極めて微量で使
用される。従って、Ｇ−CSFを極低濃度の水溶液等とし
て取扱う場合には、例えば注射器等に入れたり、アンプ
ル等の容器に収容して使用されることが多いが、このよ
うな場合に、上記の如く成分の容器、注射器等の器壁に
対する吸着性が高いことから、これらの器壁等に吸着し
てしまい、薬液中での有効濃度を、あるいは所定単位用
量中の成分の目的とする活性を維持することが困難であ
るといった問題がみられた。従って、有効量以上の量
を、吸着により失われる量を考慮して、予め添加してお
く必要があった。

更に、特にＧ−CSFについてみると、これは不安定な
ものであり、温度、湿度、酸素、紫外線等の外的因子に
よって大きな影響を受け、会合、重合あるいは酸化など
の物理的、化学的変化を生じ活性の低下を招く。

そこで、本発明ではヒト組換えＧ−CSF製剤に前記糖
類を添加することにより上記諸問題点を解決した。前記
糖類の使用によるヒト組換えＧ−CSFの安定化効果並び
に容器壁等への付着損失防止効果の明確な機構は明らか
ではないが、前記糖類の存在下においては、ヒト組換え
Ｇ−CSF分子各々が添加された糖中に分散され、その結
果ヒト組換えＧ−CSFの分子間の相互作用が高度に緩和
され、会合、重合等の確率が大幅に減じられ、また同時
に、添加された糖により容器壁上の吸着表面とヒト組換
えＧ−CSFとの間に水和層が形成され、これにより吸着
が防止され、これらの総合的な効果として安定性が著し
く向上したものと考えた。

上記の吸着による損失、会合、重合、酸化等による活
性低下の問題は、注射用溶液、懸濁剤などにおいて特に
顕著であるが、その他の錠剤、カプセル剤等の製剤過程
においてもみられる大きな問題であり、これらも本発明
に従って前記糖類を使用することによって同様に解決で
きる。

このような理由から、前記糖類の添加量は、特にその
下限は臨界的であり、ヒト組換えＧ−CSF1重量部に対し
１重量部〜10,000重量部の範囲内の量で含有することが
望ましい。

上記の如く、効果的に器壁等への吸着が防止でき、更
に安定性を向上させ得ることは、微量成分としてのＧ−
CSFの有効利用を可能とし、更に高価な成分の浪費が防
止されることから、製品コストの低下を図ることにもつ
ながる。

実施例 以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明す
る。しかしながら、本発明は以下の例によって何等制限
されるものではない。

尚、以下の実施例においてヒト組換えＧ−CSFの残存
活性の測定は以下の如く実施した。

（ａ） マウス骨髄細胞を用いる軟寒天法 ウマ血清0.4ml、被検体0.1ml、C3H/HeN（メス）マウ
スの骨髄細胞浮遊液0.1ml（0.5〜１×10⁵有核細胞）、
寒天を0.75％含む改変マッコイ5A培養液0.4mlを混合
し、直径35mmの組織培養用プラスチックディッシュに入
れて固まらせた後、37℃、５％炭酸ガス/95％空気、100
％湿度の条件にて５日間培養し、形成されたコロニー数
（50個以上の細胞からなる集落を１コロニーとする）を
数え、１個のコロニーを形成する活性を１単位（Unit）
とした。

尚、上記（ａ）の方法において用いた「改変マッコイ
5A培養液」は次の如くして作製した。

「改変マッコイ5A培養液（２倍濃度）」 マッコイ5A培養液〔ギブコ（GIBCO）社製〕12g、MEM
アミノ酸ビタミン培地（日水製薬社製）2.55g、重炭酸
ナトリウム2.18g、ペニシリンＧカリウム50000単位を２
回蒸溜水500mlに溶解後、0.22μｍのミリポアフィルタ
ーにて濾過滅菌を行った後使用した。

（ｂ） 逆相系高速液体クロマトグラフィー法 C8逆相カラム（4.6mm×300mm,5μｍ）を用い、ｎ−プ
ロパノール、トリフルオロ酢酸を移動相に使用し、Ｇ−
CSFとして１μｇ相当量以上を注入し、以下のグラジエ
ント条件で残存活性の測定をする。

溶媒（Ａ）:30％ｎ−プロパノール， 0.1％トリフルオロ酢酸 溶媒（Ｂ）:60％ｎ−プロパノール、 0.1％トリフルオロ酢酸 測定波長:210nm 本法で測定されたＧ−CSFの残存量は、上記（ａ）の
マウス骨髄細胞を用いる軟寒天法の測定結果と極めて高
い相関性を示した。

実施例１ Ｇ−CSF5μｇに第１表に示す糖類を添加したＧ−CSF5
μg/ml含有製剤（20mMリン酸緩衝液、100mM塩化ナトリ
ウム含有、pH7.4）を無菌的に調製し、次いで凍結乾製
剤を製造した。G0 CSF活性の経時変化は上記（ａ）マウ
ス骨髄細胞を用いる軟寒天法で測定した。結果は第１表
に示す。尚、表中活性（％）とは、初期単位に対する相
対的割合であり、以下の式で定義される。

凍結乾燥条件は以下の通りである： 安定化剤を添加したＧ−CSF溶液を無菌サルファ処理
ガラスバイアルに入れ、−40℃以下で４時間凍結し、−
40℃から０℃、真空度0.03から0.1Torrで、48時間一次
乾燥した。次いで０℃から20℃、真空度0.03から0.08To
rrで12時間二次乾燥し、バイアル内部を無菌乾燥窒素ガ
スで大気圧になるまで置換する。次いで凍結乾燥用ゴス
栓で打栓し、アルミニウムキャップで密封する。

実施例２ Ｇ−CSF10μｇに第２表に示す糖類を添加したＧ−CSF
10μg/ml含有製剤（20mMリン酸緩衝液、100mM塩化ナト
リウム含有、pH7.4）を無菌的に調製し、サルファ処理
ガラスバイアル内に無菌的に充填、密封してＧ−CSF溶
液製剤を製造した。これらの溶液製剤について、Ｇ−CS
F活性の経過時変化を実施例１と同様の方法で測定し、
その結果を第２表に示した。

実施例３ Ｇ−CSF10μｇに第３表に示す糖類を添加したＧ−CSF
10μg/ml含有製剤（20mMリン酸緩衝液、100mM塩化ナト
リウム含有、pH7.4）を無菌的に調製し、サルファ処理
シリコーンコーティングガラスバイアル中に1ml充填
し、４℃で放置し、0.5、２および24時間後の溶液中の
Ｇ−CSFの残存活性を上記（ｂ）の逆相系高速液体クロ
マトグラフィー法により測定し残存率（％）を求め、こ
れらの糖類のヒト組換えＧ−CSF吸着防止効果を評価し
た。その結果を第３表に示す。

発明の効果 以上詳しく述べたように、本発明によれば、グリセリ
ン、キシリトール、マンニトール、グルクロン酸、ノイ
ラミン酸、ケトグルコール酸、ヒアルロン酸およびその
塩、ヘパリン、キチンおよびその誘導体、キトサンおよ
びその誘導体、デキストリン、平均分子量5,000〜150,0
00のデキストラン並びにアルギン酸およびその塩からな
る群から選ばれる少なくとも１種の糖類を所定濃度で用
いたことにより、製剤中に極微量で存在するヒト組換え
Ｇ−CSFの温度、湿度、酸素、紫外線等の外的因子にも
とずく会合、重合、あるいは酸化もしくは、容器壁等へ
の吸着の結果として生ずる、有効成分の損失、活性の低
下等に関する問題点を効果的に解決することが可能とな
った。

従って、患者に対するヒト組換えＧ−CSFの投与量を
極めて正確に投与、管理することが可能となり、しかも
高価なヒト組換えＧ−CSFの有効利用ができ、ヒト組換
えＧ−CSF含有製剤のコスト節減を図ることも可能とな
る。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−36326（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−140707（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−81781（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−230729（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−258125（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−155136（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−59000（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−48933（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−25333（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−181223（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−59625（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−92620（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−92619（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト組換え顆粒球コロニー刺激因子とグリ
   セリン、キシリトール、マンニトール、グルクロン酸、
   ノイラミン酸、ケトグルコール酸、ヒアルロン酸および
   その塩、ヘパリン、キチンおよびその誘導体、キトサン
   およびその誘導体、デキストリン、平均分子量5,000〜1
   50,000のデキストラン並びにアルギン酸およびその塩か
   らなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類とを含むこ
   とを特徴とする、安定なヒト組換え顆粒球コロニー刺激
   因子含有製剤。
2. 【請求項２】糖類がマンニトール、ヒアルロン酸および
   その塩並びに平均分子量5,000〜150,000のデキストラン
   からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項
   １記載の安定なヒト組換え顆粒球コロニー刺激因子含有
   製剤。
3. 【請求項３】上記糖を顆粒球コロニー刺激因子１重量部
   に対し１重量部〜10,000重量部の範囲内の量で含有する
   ことを特徴とする、請求項１または２記載の安定なヒト
   組換え顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。