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JP2567199B2 - 枯草菌およびその形成方法 - Google Patents

枯草菌およびその形成方法

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JP2567199B2
JP2567199B2 JP5302053A JP30205393A JP2567199B2 JP 2567199 B2 JP2567199 B2 JP 2567199B2 JP 5302053 A JP5302053 A JP 5302053A JP 30205393 A JP30205393 A JP 30205393A JP 2567199 B2 JP2567199 B2 JP 2567199B2
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JP
Japan
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plasmid
dna
lactamase
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bacillus subtilis
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JP5302053A
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グランデイ・グイド
メレ・アントニオ
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Eni Tecnologie SpA
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Eniricerche SpA
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Publication date
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Publication of JP2567199B2 publication Critical patent/JP2567199B2/ja
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は分子生物学に関し、より
具体的には枯草菌（Ｂａｃｉｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）中において異種蛋白の発現を可能とする枯草菌プラ
スミッドベクターの作成に係る。
【０００２】
【従来の技術】必要とされる蛋白およびポリペプチドの
遺伝子コードを含むプラスミドを有するバクテリアの培
養により、酵素やホルモンのようなポリペプチド及び蛋
白を製造することが知られている。
【０００３】また、望ましい遺伝子を含む上記プラスミ
ドをもった宿主バクテリアを培養し、通常は宿主と異な
る微生物で産生される遺伝的生成物を得るために、組換
えＤＮＡ技術により雑種組換えプラスミドを作成するこ
とについても知られている。
【０００４】雑種プラスミドの作成においては、例えば
宿主バクテリア内で複製され得るプラスミドのようなク
ローニングベクターが、望ましい生産物の暗号に対応し
た遺伝子または遺伝子群を含む異種ＤＮＡフラグメント
と結合される。米国特許明細書第４２３７２２４号によ
れば、組換えＤＮＡの調製は次の段階からなっている。
【０００５】・適当な制限酵素を用いることにより、異
種ＤＮＡを切断する。
【０００６】・得られたフラグメントを、リガーゼ酵素
を用いることによりベクター内に挿入する。
【０００７】・得られた雑種分子を宿主細胞内に移す。
【０００８】・得られたクローンに目的とする特定の蛋
白またはポリペプチドに対応する暗号が含まれることを
確認するために、これらを分離（スクリーニング）す
る。
【０００９】組換えＤＮＡ技術に使用されるベクター
は、クローニングに用いられる一または二以上の制限酵
素によって認識される部位を含んだ環状のＤＮＡ分子か
らなっている。
【００１０】従って、ベクターを選択的な制限酵素で処
理することにより、線状のＤＮＡ分子が得られる。
【００１１】その分子を、予め同じ制限酵素で切断した
異種ＤＮＡ試料とリガーゼ酵素の存在下で混合したとす
れば、生成物はプラスミドベクターと異種ＤＮＡフラグ
メントからなる雑種分子となる。
【００１２】その分子（「組換え雑種プラスミド」と呼
ばれる）は、転換機構（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｍｅｃ
ｈａｎｉｓｕｍ）により宿主細胞中に移される。組換え
ＤＮＡ技術に用いられるプラスミドベクターは、自然界
に見られる微生物中に存在する天然のベクターでもよ
く、また遺伝子工学により作成される合成ベクターであ
ってもよいが、宿主細胞中で自己複製できるものでなけ
ればならない。
【００１３】更に、特定の異種蛋白は宿主細胞中で合成
されるから、そのＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮ
ＡをｍＲＮＡに転写し、且つ関連するリボゾーム及び酵
素がｍＲＮＡを蛋白に転化することを可能とする特定の
配列を含んでいる必要がある。
【００１４】これらの認識配列は微生物によって相違す
るかもしれない。結局、与えられた宿主細胞中で異種蛋
白が発現するためには、蛋白の構造遺伝子を、宿主細胞
に特異的な認識配列の制御下に置く必要がある。組換え
ＤＮＡについての殆どの研究は、大腸菌細胞を、異種蛋
白を生産するための宿主細胞に用いて行なわれて来た。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながらこの微生
物の病原性の故に、得られた生成物を食品や薬剤の分野
で使用するには危険を伴ない、従って工業的応用には不
適当である。
【００１６】従って、上記の欠点をもたない微生物中に
おいて、異種遺伝子を発現させるのが有利であると考え
られていた。
【００１７】このような微生物のなかで、枯草菌は特に
興味あるものである。
【００１８】その遺伝子工学における使用は、その非病
原性、工業的醗酵プロセスで慣用的に用いられているこ
と、及び合成された蛋白の幾つかを培養媒質中に放出す
る能力の故に特に魅力的である。
【００１９】しかし、枯草菌を組換え遺伝子技術による
蛋白合成のための可能な宿主として使用することには、
例えば異種遺伝子が発現する効率限界等、未だ数多くの
問題が存在する。その原因の一部は、適当なベクターが
ないことによる。
【００２０】従って、本発明は組換えＤＮＡ技術に用い
られ、枯草菌中において高効率で異種蛋白遺伝子の発現
が可能な新規プラスミドベクターに関するものである。
【００２１】
【課題を解決するための手段】この目的のために、本発
明によれば以下の段階からなるプロセスにより、ｐＳＭ
２３プラスミドからｐＳＭ１１２プラスミドベクターが
調製される。
【００２２】ａ）特異的制限酵素でｐＳＭ２３プラスミ
ドを線状化する。
【００２３】ｂ）リガーゼ酵素でプラスミドＤＮＡを環
化し、ｐＳＭ２９プラスミドを分離する。
【００２４】ｃ）ｐＥ１９４複製起源を含むｐＳＭ２９
のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを分離する。
【００２５】ｄ）ｐＵＢ１１０の複製起源を含む大きな
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを環状化する。
【００２６】ｅ）ｐＳＭ１１２プラスミドベクターを分
離する。
【００２７】本発明において、ｐＳＭ２３プラスミド
は、イタリア特許Ａ／２３１６６号に記載された方法に
より得られる。この方法では、バチルス・ゲネティック
・ストック・センター（ＢＧＳＣ）に寄託されたｐＥ１
９４プラスミド（ＢＧＳＣ １Ｅ７）を、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託
されたｐＢＲ３２２プラスミド（ＡＴＣＣ ３７０１
７）及びプラスミドｐＵＢ１１０（ＡＴＣＣ ３７０１
５）と引き続き結合させることによって、ｐＳＭ２３プ
ラスミドを得る。なお、上記のｐＥ１９４プラスミド
は、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of
Bacteriology ）第150 巻第２号第804 〜814頁（1982
年５月）および同第137 巻第１号第635 〜643 頁（1979
年１月）に記載されており、既に充分に特徴付けられて
いる。プラスミドｐＳＭ２３（その制限地図を図１に示
す）は、リボゾーム認識部位（ＲＢＳ）のすぐ後に露出
した単一のＥｃｏＲＩ部位と、枯草菌中で作用する二つ
の複製起源、即ちプラスミドｐＵＢ１１０起源およびプ
ラスミドｐＥ１９４起源とを有している。
【００２８】更に特徴的には、ｐＵＢ１１０に対応した
フラグメントは、そのＢａｍＨＩ制限部位がｐＥ１９４
のプロモータ−ＲＥＳ領域近くに位置するように配向さ
れている。
【００２９】これら二つの領域の存在は、特に機能的複
製起源を含む別のＤＮＡフラグメントが挿入されるとき
は不安定な現象を引起す原因になると思われるから、プ
ラスミドｐＳＭ２３はｐＥ１９４の複製起源が除去され
てｐＵＢ１１０の複製起源だけが保持されるように修飾
されている。この場合にも、高温（５１℃）において作
用するという利点を有している。
【００３０】この目的のために、中間体プラスミドｐＳ
Ｍ２９が作製されている。その制限地図（図１に図示）
において、ｐＥ１９４に関するｐＵＢ１１０の配置はプ
ラスミドｐＳＭ２３の場合と反対になっている。
【００３１】従って、本発明によると、カナマイシン耐
性のための遺伝子コード（ｋｍR ）を含んだプラスミド
ｐＳＭ２３は、ＸｂａＩ制限酵素を用いた公知の手段に
より大きさの異なる二つのフラグメントに切断される。
一つはｐＵＢ１１０の複製起源を含む約４６５０塩基対
（ｂｐ）のフラグメントであり、他の一つはｐＥ１９４
の複製起源を含む約３０００ｂｐのフラグメントであ
る。
【００３２】そのフラグメントは、引続きＴ4 リガーゼ
酵素の存在下で結合され、得られたリガーゼの混合物は
枯草菌ＢＧＣＳ ＩＡ２４６の細胞を公知の方法で適当
な状態に変換するために用いられる。その変換Ｉされた
細胞は、５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む適当な培地
上でプラーク形成した後に分離される。
【００３３】この方法によれば、ｋｍR 遺伝子をもつプ
ラスミドを含んだ細胞のみが得られる。これらの中か
ら、ＢａｍＨＩ部位をもったプラスミドを含み、且つ該
プラスミド中でＢａｍＨＩ部位がＥｃｏＲＩ部位から所
定の距離をおいて位置しているコロニーが選択される。
【００３４】本発明によると、ｐＳＭ２９プラスミドは
ＤＮＡ分子を単一の部位で切断するＢａｍＨＩ制限酵素
で処理され、続いて特異的コンバータに結合される。こ
こで「コンバータ」とは、制限酵素によって生じた結合
性末端を他の酵素の結合性末端に変換するための合成Ｄ
ＮＡ分子である。この場合に用いられるコンバータは、
下記のアミノ酸配列を有するＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで
ある。
【００３５】 ５′ＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧ３′ＧＣＴＴＡＡＧ ＣＣＴＡＧ ＥｃｏＲＩ 次いで、得られたＤＮＡ分子はＥｃｏＲＩ制限酵素で二
つのフラグメントに切断される。一方のフラグメントは
３．２×１０6 Ｄの分子量（ＭＷ）を有し、ｐＥ１９４
の複製起源を含む他方のフラグメントは１．５×１０6
ＤのＭＷを有している。これらのフラグメントは、引続
いてリガーゼＴ4 酵素で環化される。
【００３６】このリガーゼの混合物は、５μｇ／ｍｌの
カナマイシンを含む適当な培地上でプラークすることに
より選択された枯草菌ＢＧＳＣ ＩＡ２４６の細胞を変
換するために用いられる。
【００３７】得られたコロニーの中から、ｐＵＢ１１０
の複製起源を含むフラグメントに対応した４９５０ｂｐ
のフラグメントからなるプラスミドを含んでいるものが
選択される。
【００３８】記号ｐＳＭ１１２で表示されるプラスミド
は、ＥＲＭ−ＲＢＳ認識部位の近くに露出したＥｃｏＲ
Ｉ部位およびＢａｍＨＩ部位を有し、これら部位が枯草
菌にカナマイシン耐性を与え、また複製能を与える。
【００３９】得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＳｓｔＩ、ＸｂａＩ、ＨｐａII、Ｂｇ
III で切断した後、寒天ゲル上での電気泳動により生じ
たバンドの分析によって、プラスミドｐＳＭ１１２につ
いて図３に示す制限地図が確認された。
【００４０】図２は、またＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
部位ならびにリボゾーム認識部位の近傍領域におけるシ
ーケンスを与えている。
【００４１】ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位におい
て、制限酵素で切断した後、異種ＤＮＡから得られたＤ
ＮＡフラグメントをクローニングすることが可能であ
る。
【００４２】枯草菌ＢＧＳＣ ＩＡ２４６（ｐＳＭ１１
２）はイリノイ州ペオリアの北中央部（Ｎｏｒｔｈ Ｃ
ｅｎｔｒａｌ Ｒｅｒｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｏｒｉａ，Ｉ
ｌｌｉｎｏｉｓ）にある農業研究教育センター（Ａｇｒ
ｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｅｎｔｒｅ）に寄託されている。
【００４３】本発明により枯草菌中で異種遺伝子を発現
させ得るｐＳＭ１１２の能力の一例として、大腸菌ＡＴ
ＣＣ３７０１７のプラスミドｐＢＲ３２２中に存在する
β−ラクタマーゼ遺伝子のクローニングについて説明す
る。ｐＳＭ１１２を記号ｐＳＭ１１９で特定されるβ−
ラクタマーゼ遺伝子と融合させて誘導されたプラスミド
が、公知の方法により適当な状態にされた枯草菌ＩＡ２
４６中に挿入される。
【００４４】このクローニング方法の興味ある特徴は、
枯草菌の変換細胞を適当な培地で培養すると、β−ラク
タマーゼを合成するだけでなく、これを高効率で培地肉
汁中に分泌し、従って同定および精製が容易なことであ
る。
【００４５】よく知られているように、蛋白の排出は
「リーダーペプチド」、即ち、蛋白の末端が未だ細胞の
中に存在しているときその末端ＮＨ2 に位置するアミノ
酸シーケンスの存在に依存する。分子レベルでの機構は
未だ少ししか知られていないが、「リーダーペプチド」
が細胞膜に対して内部的に結合し、蛋白の残部が細胞膜
を透過して移送されるのを容易にすることは明白であ
る。
【００４６】従って、成熟した蛋白からの「リーダーペ
プチド」の切断および分離にはメンブランプロテアー
ゼ」の関与が含まれており、分離された蛋白は細胞外に
放出される。
【００４７】グラム陰性のバクテリアから排出される蛋
白中のリーダーペプチドの大きさは、グラム陽性のバク
テリアから排出される蛋白のそれよりも小さいことが認
められている。
【００４８】前者の場合のリーダーペプチドの長さはア
ミノ酸数で平均２１〜２４であるのに対し、後者の場合
の長さはアミノ酸数で２７〜３７である。
【００４９】従って、組換えＤＮＡ技術によってグラム
陽性のバクテリア、より特定的に言えば枯草菌から異種
蛋白を分泌させるためには、その蛋白遺伝子をグラム陽
性のバクテリアに特異的なリーダーペプチドの制御下に
置く必要があると思われる。
【００５０】英国特許出願番号２０９１２６８号には、
成熟β−ラクタマーゼのＤＮＡ暗号配列を、発現を制御
する部分を含んだＤＮＡ領域およびバチルスアミロリケ
ファチエンス（Ｂａｃｉｌｕｓ Ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ
ｆａｃｉｅｎｓ．）のαアミラーゼ排出を指令するリー
ダーペプチドと融合させることによって、ｐＢＲ３２２
のβ−ラクタマーゼが枯草菌中で発現され、且つ分泌さ
れることが記載されている。
【００５１】本発明によると、Ｅ．ｃｏｌｉのβ−ラク
タマーゼが、蛋白自体のリーダーペプチドを用いること
により、Ｂ．サブチリスから高効率で排出されることが
わかった。
【００５２】本発明によると、ｐＳＭ１１２から小さな
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを除去した後に、
ｐＳＭ１１２プラスミドベクターにＥ．ｃｏｌｉのβ−
ラクタマーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを挿入す
ることにより、公知の方法でｐＳＭ１１９ハイブリッド
プラスミドが得られる。
【００５３】β−ラクタマーゼ遺伝子を含むフラグメン
トは、β−ラクタマーゼ部位を位置決めし、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｂｅｓｅａｒｃｈ１０（１９８２）
６４８７−６５００（Ｍ．Ｊ．Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａ
ｌ）に記載された試験管内突然変異技術を用い、ｐＢＲ
３２２のＰｖｕII部位をＢａｍＨＩ部位と置換した後、
ｐＢｒ３２２から単離される。
【００５４】β−ラクタマーゼ遺伝子は、ｐＢＲ３２２
をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素により消化した
後、この方法により容易に単離される。
【００５５】図５に示す方法により得た、ｐＳＭ１１５
と呼ばれる突然変異プラスミドは、一連のβ−ラクタマ
ーゼの前駆体およびｐＢＲ３２２の複製源を含んでい
る。前述のｐＳＭ１１５プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉに
アンピリシン耐性を与え、またβ−ラクタマーゼ遺伝子
のＡＴＧの直前のＥｃｏＲＩ部位を有している。
【００５６】このプラスミドは、ＥｃｏＲＩおよびＢａ
ｍＨＩ制限酵素により切断され、異なった大きさの２つ
のフラグメントが生じる。大きなＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉフラグメント（約２１５０Ｂｐ）はｐＳＭ１１２ベク
ターに挿入され、ｐＳＭ１１９と呼ばれるハイブリッド
プラスミドが形成される。
【００５７】ハイブリッドプラスミドｐＳＭ１１９は、
次に適切に製造されたＢ．サブチリスＢＧＳＣ ＩＡ２
４６の細胞に挿入され、変換された細胞は５μｇ／ｍｌ
のカナマイシンを含む培地にプラークさせることにより
単離される。
【００５８】この方法は、カナマイシン耐性を与える遺
伝子をもったハイブリッドプラスミドｐＳＭ１１９を含
むクローンを単離するために用いられる。
【００５９】微生物Ｂ．サブチリスＢＧＳＣ ＩＡ２４
６（ｐＳＭ１１９）は、米国イリノイ州のアグリカルチ
ュラルリサーチカルチャーセンターに寄託されている。
【００６０】クローン遺伝子が自らを発現し得るもので
あるならば、基本的条件は、転写開始配列とリボゾーム
認識部位との間に５〜１０塩基の間隔を維持するよう
に、そのＡＴＧを、ベクターに挿入されたフラグメント
の末端５′の非常に近くに位置せしめることである。特
に、ここに記載されたｐＳＭ１１９の構成では、その距
離は６塩基である。
【００６１】図７は、ｐＳＭ１１９の制限マップと、β
−ラクタマーゼ遺伝子のＡＴＧの最も近い配列を示す。
本発明に従って、Ｂ．サブチリスＢＧＳＣ ＩＡ２４６
（ｐＳＭ１１９）の細胞が、炭素、窒素および微量元素
を含む当業者に周知の液体培地内で培養され、培地肉汁
および細胞抽出物内でβ−ラクタマーゼの産生が測定さ
れた。
【００６２】酵素は培地中に高効率（７５％）で分泌さ
れるが、このことは、β−ラクタマーゼの前駆体のリー
ダーペプチドがＢ．サブチリスの分泌メカニズムによっ
て認識され、用いられることを示している。
【００６３】
【実施例】以下の実施例は本発明を例示するものであっ
て、何ら本発明を限定するものではない。
【００６４】 実施例１：（プラスミドｐＳＭ２９の構築） ０．３μｇのプラスミドｐＳＭ２３を、ｐＨ７．４の６
ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）塩酸塩（トリス−Ｈ
Ｃｌ）、１００ｍＭのＭａＣｌおよび６ｍＭのＭｇＣｌ
2 を含む２０μｌの溶液に懸濁させ、ＸｂａＩ（ＢＲ
Ｌ）制限酵素の０．３ユニットにより切断した。この混
合物を３７℃で１時間インキュベートした。等量のフェ
ノールを加えることにより反応をストップさせ、その後
エーテルにより水相から抽出した。
【００６５】１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．
５容量の９５％エタノール中に懸濁させた後、−２０℃
出１晩放置して線状プラスミドＤＮＡを析出させた。
【００６６】１１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する
ことにより、反応混合物から析出ＤＮＡを分離した。析
出物を５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０
ｍＭのＭｇＣｌ2 、１Ｍのジチオトレイトールおよび
０．５Ｍのアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）を含
む溶液１０μｌ中に再懸濁させ、０．５ユニットのＴ4
ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）酵素により常温（２０〜２５
℃）で４時間環化した。
【００６７】次に、全リガーゼ混合物を用いて、Ｊ．Ｍ
ｏＬ．Ｂｉｏｌ．５６（１９７１）２０９−２２１，
Ｄ．Ｄｕｂｎａｕ ｅｔ ａｌ．に示す方法によって、
製造されたバチラスサブチリスＢＧＳＣ ＩＡ２４６の
細胞を変換した。
【００６８】変換された細胞を、５μｇ／ｍｌのカナマ
イシンを含むＤＩＦＣＯトリプトーゼ血液寒天培地にブ
ラークさせることにより選択した。
【００６９】このように操作することにより、耐カナマ
イシン遺伝子を有するプラスミドを含むＢ．サブチリス
細胞が唯一の生成物として得られた。
【００７０】Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｍｔ ＤＮＡ ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１６４−１６５（１９８３）
（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔａｌ）に記載された急速抽
出法により、１０ｋｍR コロニーからプラスミドを抽出
および精製した。
【００７１】１０種の試験されたプラスミドの２種は、
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素による処理の後、
より小さなフラグメントＸｂａＩ（ｐＥ１９４）がｐＳ
Ｍ２３から反対方向に挿入されるという事実に従って、
それぞれ約２７４０および４８９０の２つのバンドを有
していた。２種のプラスミドのうちの１つが精製され、
Ｐｓｍ２９（図２）と命名された。
【００７２】実施例２：（ｐＥ１９４の複製起点を有す
るフラグメントの切出し、およびプラスミドｐＳＭ１１
２の構築） 実施例１と同様にして得たプラスミドｐＳＭ２９１μｇ
を、６ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭの
ＮａＣｌおよび６ｍＭのＭｇＣｌ2 を含有する溶液５０
μｌに懸濁させ、３７℃の温度で１時間ＢａｍＨＩ（Ｂ
ＲＬ）制限酵素１Ｕで処理した。
【００７３】この処理の終点で等量のフェノールを加え
ることによって反応を停止し、水相からエーテルで抽出
した。
【００７４】この溶液を−７０℃で１０分間保持し、３
Ｍの酢酸ナトリウム１／１０容および９５％エタノール
２．５容を加えると、プラスミドＤＮＡが沈殿した。
【００７５】沈殿物を遠心によって溶液から回収し、７
０％エタノールで洗浄し、減圧乾燥した。
【００７６】得られたプラスミドＤＮＡを、６０ｍＭの
トリス塩酸（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、１
５ｍＭのジチオトレイトール、１ｍＭのスペルミジンお
よび１ｍＭのＡＴＰを含有する溶液１０μｌに再懸濁さ
せ、上と同様の組成を有し、かつ供給会社の指示に従っ
てキナーゼＴ4 （バイオラブズ）酵素１２Ｕによって３
７℃で１時間および６５℃で５分間前処理したＢａｍＨ
Ｉ−ＥｃｏＲＩ（ワーシントン）コンバーター１６０ｍ
ｇを含有する溶液１０μｌと混合した。
【００７７】得られた混合物にＴ4 ＤＮＡリガーゼ酵素
０．５Ｕを加えた後、１４℃で一夜反応させた。反応時
間の終点で、温度を６５℃で５分間保持することによっ
て反応を停止した。水３５μｌ、５ＭのＮａＣｌＯ4 お
よびイソプロパノール５０μｌを加えた後、溶液を、高
分子量ＤＮＡが完全に沈殿するまで３７℃に保持した。
沈殿したＤＮＡを１００００ｒｐｍで１０分間の遠心
により溶液から分離し、７０％エタノールで洗浄し、減
圧乾燥した後、１００ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．
５）、５０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＭｇＣｌ2 を
含有する溶液２０μｌ中に懸濁させた。
【００７８】ＥｃｏＲＩ制限酵素２０Ｕを加えた後、溶
液を３７℃で２時間、ついで６５℃で５分間反応させ
た。
【００７９】ＤＮＡを、上に述べたようにして溶液から
沈殿させ、分離および水洗した後、５０ｍＭのトリス塩
酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、１ｍＭのジ
チオトレイトール、１ｍＭのＡＴＰおよびＴ4 ＤＮＡリ
ガーゼ０．５Ｕを含有する溶液１０μｌに懸濁させた。
【００８０】反応を１４℃で一夜おこなった。
【００８１】上で得たリガーゼ混合物５μｌをＢ．サブ
チリスＢＧＳＣ ＩＡ２４６の細胞の転換に用いた。コ
ンバーターは、カナマイシンを５μｇ／ｍｌの割合で含
むＴＢＡＢ培地のプラーク上で選別した。
【００８２】コンバーターは、カナマイシンを５μｇ／
ｍｌの割合で含むＴＢＡＢ培地のプラーク上で選別し
た。
【００８３】高速抽出法により１０ｋｍR コロニーから
プラスミドを選別した。これらプラスミドのうち５つ
が、アガロースゲル上での分析により、約４９４０ｂｐ
のバンドからなることが見出された。ＥｃｏＲＩ、Ｂａ
ｍＨＩ、ＳｓｔＩ、ＸｂａＩ、ＨｐａIIおよびＢｇｌII
の各酵素で切断した後、得られたバンドをアガロースゲ
ル上で分析したところ、プラスミドｐＳＭ１１２に対し
図３に示す制限酵素切断地図を確認した。
【００８４】実施例３（β−ラクタマーゼのＡＴＧの前
へのＥｃｏＲＩ部位の形成、およびｐＢＲ３２２からの
β−ラクタマーゼ遺伝子の分離 大腸菌ＪＭ８３（ＢＲＬ）の細胞を下記組成のＹＴ媒基１０ｍｌ、 （組成） 量（ｇ／） トリプトン １０．０ イースト抽出液 ５．０ ＮａＣｌ ５．０ グリコール １．０ Ｈ2 Ｏ １．０ およびＭ１３ｍｐ９ファージ溶液１ｍｌ中（なお、これ
にｐＢＲ３２２の小さなＥｃｏＲＩ ＰｓｔＩ断片を公
知の方法により予め導入した）で、３７℃で１８時間培
養した。この混合物はＹＴ１ｌを感染させるのに用い
た。
【００８５】３７℃で７時間培養させたのち、細胞を遠
心分離し、上澄液中のファージを、室温でポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）の２０％溶液および２．５ＭＮａ
Ｃｌを含む溶液２５０ｍｌを加え２０分間析出させた。
【００８６】この析出物を遠心分離し、１０ｍＭのトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）および１ｍＭのエチレンジ
アミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む溶液１０ｍｌ中に再懸
濁させた。
【００８７】この混合物を等量のフェノール／クロロホ
ルム（１：１）で３回、さらに等量のクロロホルムで３
回処理した。
【００８８】さらに、３Ｍ酢酸ナトリウム１／１０容お
よび９５％エタノール２．５容を加えたのち、−２０℃
でファージＤＮＡを析出させた。ついで１０．０００ｒ
ｐｍの遠心分離を２０分間おこない懸濁液からファージ
ＤＮＡを分離した。次にこれを真空乾燥させたのち、最
終濃度が１μｇ／ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）および１ｍＭ ＥＤＴＡの溶液中に再懸濁させ
た。
【００８９】フィージＤＮＡ２．５μｇおよび末端５′
でホスホリル化した合成オリゴヌクレオチド（図５の配
列を有する）０．２μｇを、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ：７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 および５０ｍ
ＭのＮａＣｌを含む溶液１０μｌ中に懸濁させ、６５℃
で５分間、１４℃で３０分間培養した。
【００９０】次に、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ：
７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０ｍＭのジチオス
レイトール、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのデオキシシトシ
ントリホスフェート（ＣＴＰ）、１ｍＭのデオキシチミ
ジントリホスフェート（ＴＴＰ）、１ｍＭのデオキシグ
アノシントリホスフェート（ＧＴＰ）および１ｍＭのデ
オキシアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶
液１０μｌを上記反応混合物中に添加し、さらにＴ4 リ
ガーゼ３単位（Ｕ）および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｋｌｅｎｏｗ断片）２．５（Ｕ）の存在下で１４℃で
２２時間培養した。そののち、反応混合物を臭化エチル
を０．６μｇ／ｍｌ含む０．８％アガロースゲル０．８
％と接触させ、電位差１００Ｖを加えて分離した。
【００９１】３時間後、紫外線で可視の共有結合により
閉じたＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）を上記ゲルから電気的に
溶出させ、これを用い、Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ
（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３（１９７９）１５９−１
６２）の方法により適応させた大腸菌ＪＭ１７／１８
（ＢＲＬ）を変換させた。
【００９２】一重らせんＤＮＡを公知の方法により９４
変換プラーク（溶菌斑）から分離し、最終濃度、５０μ
ｇ／μｌで１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）お
よび１ｍＭのＥＤＴＡを含む溶液中に懸濁させた。この
懸濁液１μｌをニトロセルロースフィルタにより吸収さ
せ、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ、
０．０１５Ｍくえん酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ７．２）、１０×Ｄｅｕｂａｒｄｔ溶液（０．２％ウ
シアルブミン、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２
％フイコール）、ウシ胸線ＤＮＡ（音波処理したもの）
を含む溶液１０ｍｌ中に２３℃で３時間浸漬させ、つい
でキナーゼ標識付オリゴヌクレオチド１×１０6 ｃｐｍ
およびＡＴＰ３２ｐの存在下で変性させた。ついで６×
ＳＳＣで４６℃で３回洗滌したのち、フィルタを放射線
撮影した。
【００９３】その結果、９個のサンプルはＤＮＡ断片で
強く交雑化されていた。
【００９４】そのＤＮＡ分子の一つの配列を分析した結
果、所望の突然変異が見られ、β−ラクタマーゼ遺伝子
のＡＴＧの前にＥｃｏＲＩ部位が存在していた。
【００９５】次にＭ．Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１０（１９８２）６４８
７−６５００）による方法で突然変異させた再組換えフ
ァージＤＮＡの二重らせん形を精製し、ついでＥｃｏＲ
ＩおよびＰｓｔＩ制限酵素で二重消化をおこなった。
【００９６】この消化により３つの断片が得られ、その
一つは２００ｂｐで当初のＥｃｏＲＩ部位と突然変異化
によって得られた部位との距離に相当し、他の一つの断
片は５５０ｂｐでβ−ラクタマーゼ遺伝子中の新しいＥ
ｃｏＲＩ部位および新しいＰｓｔＩ部位によって区画さ
れ、残りの一つは７５００ｂｐでファージ分子全体（図
５）に相当するものであった。
【００９７】アクリルアミドゲルから５５０ｂｐ Ｅｃ
ｏＲＩ ＰｓｔＩ断片を電気的に溶出させ、Ｔ4 ＤＮＡ
リガーゼ酵素を用いｐＢＲ３２２の大きいＥｃｏＲＩ−
ＰｓｔＩ断片中に挿入した。
【００９８】このリガーゼ混合物を用い、テトラシクリ
ン抵抗を有する大腸菌ＨＢ１０１（ＢＲＬ）の細胞を変
換させた。
【００９９】プラスミドｐＳＭ１１０をこの変換クロー
ンの一つから分離した。図５に示すその制限図はテトラ
シクリンおよびアンピシリンに対し抵抗を示す予期した
構造のものである。
【０１００】実施例４（ｐＳＭ１１０におけるＰｖｕII
部位のＢａｍＨＩによる置換） ６ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭの
ＮａＣｌ、６ｍＭのＭｇＣｌ2 を含む溶液３０μｌ中に
ｐＳＭ１１０を０．１μｇ懸濁させ、ＰｖｕII（ＢＲ
Ｌ）制限酵素０．１単位で切断した。
【０１０１】得られたプラスミドＤＮＡをホスホリル化
ＢａｍＨＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）連結剤にモル比１：５０
０で連結させた。
【０１０２】リガーゼ反応は１４℃で１８時間おこなっ
た。反応終点時に、ＤＮＡをメーカー（Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）の処方規定に沿ってＢａｍＨＩ制限酵素で処理し、
ついで酢酸ナトリウム（３Ｍ）１／１０容量部とエタノ
ール２．５容量部を添加して析出させた。
【０１０３】析出したＤＮＡを１００００ｒｐｍの遠心
分離により回収し、６６ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）、６ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０ｍＭのジチオスレ
イトール、１ｍＭのＡＴＰを含む溶液に１μｈ／ｍｌの
濃度で懸濁させたのちＴ4 リガーゼ酵素で連結させた。
【０１０４】このリガーゼ混合物をついでアンピシリン
に抵抗を示す大腸菌ＨＢ１０１の適当な細胞を変換させ
るために使用した。
【０１０５】公知の手法により変換コロニーからｐＳＭ
１１５を分離した。約２５８０ｂｐのこのプラスミド
を、ＢａｍＨＩ連結剤をＰｖｕII末端に連結さたのちｐ
ＳＭ１１０の大きいＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片を閉じる
ことにより得た。
【０１０６】実施例５（ｐＳＭ１１２へのβ−ラクタマ
ーゼ遺伝子の挿入） ｐＳＭ１１２ １μｇとｐＳＭ１５ １μｇをそれぞれ
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｓｃｏＲＩを用い供給者
（ＢＲＬ）によって与えられた方法で消化した。 この
ＤＮＡを３Ｍの酢酸ナトリウム１／１０容と９５％エタ
ノール２．５容を加えて析出させた。
【０１０７】得られたプラスミドＤＮＡを５０ｍＭのト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ：７．５）、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ2 、１ｍＭのジチオスレイトールを含む溶液１０μｌ
中に、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ酵素０．１Ｕの存在下で懸濁
させた。
【０１０８】この混合物５μｌを用い、カナマイシン５
μｇ／ｍｌを含むトリプトースブラッドアガールベース
（ＴＢＡＢ）（ＤＩＦＣＯ製）のプラークによりカナマ
イシンに対し抵抗を有する枯草菌ＢＧＳＣ ＩＡ２４６
を変換させた。
【０１０９】この変換コロニーの一つは都合よく分離さ
れた。これはプラスミドｐＳＭ１１９を含み、β−ラク
タマーゼ遺伝子を有するｐＳＭ１１５のＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片とｐＳＭ１１２の大きいＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片からなっていた。 実施例６（枯草菌ＢＧＳＣ ＩＡ２４６（ｐＳＭ１１
９）からのβ−ラクタマーゼの製造）
【０１１０】この接種したフラスコを静かに撹拌しなが
ら３７℃で培養した。
【０１１１】細胞中および上澄液中で種々の間隔を以っ
てβ−ラクタマーゼ酵素の生成をＯ′Ｃａｌｌａｇｈａ
ｎ ｅｔ ａｌ（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅ
ｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ １（１９
７２）２８３−２８８）に記載の方法により測定した。
β−ラクタマーゼの１Ｕは３７℃で１分当りニトロセフ
ィナのナノモルを加水分解するのに必要な酵素の量とし
て定義された。
【０１１２】サンプルを１００００ｒｐｍで５分間遠心
分離し、上澄液を回収した。
【０１１３】細胞を０．１Ｍりん酸塩緩衝液（ｐＨ：
７．０）２５ｍｌ中に懸濁させ、音波処理により分解さ
せた。
【０１１４】図６は枯草菌ＢＧＳＧ ＩＡ２４６（ｐＳ
Ｍ１１９）培養の上澄液および細胞中でのβ−ラクタマ
ーゼ活性の測定結果を示す。
【０１１５】下記表Ｉは枯草菌ＢＧＳＧ ＩＡ２４６
（ｐＳＭ１１９）中のβ−ラクタマーゼの形成を示して
いる。
【０１１６】 表 Ｉ ＜菌 種＞ ＜β−ラクタマーゼ活性＞ 枯草菌ＢＧＳＧ ＩＡ２４６ ０．１Ｕ／ｍｌ 枯草菌ＢＧＳＧ ＩＡ２４６ ３８０Ｕ／ｍｌ （ｐＳＭ１１９） （細胞中での測定）
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＳＭ２３の制限マップ。
【図２】プラスミドｐＳＭ２９の制限マップ。
【図３】プラスミドｐＳＭ１１２の制限マップ。
【図４】プラスミドｐＳＭ１１２を得るためのトランス
フォーメーション。
【図５】合成オリゴヌクレオチドおよび試験管内突然変
異。
【図６】Ｂ．サブチリスＩＡ２４６（ｐＳＭ１１９）の
培地の上澄および細胞において測定したβ−ラクタマー
ゼ活性。
【図７】プラスミドｐＳＭ１１９の制限マップおよびβ
−ラクタマーゼのＡＴＧへの最も近いシーケンス。

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 β−ラクタマーゼを形成するために用い
    られるプラスミドであって、プラスミドｐＳＭ１１５お
    よびｐＳＭ１１２の線状断片を連結させることによって
    得られることを特徴とするハイブリッド組換型ｐＳＭ１
    １９プラスミド。
  2. 【請求項２】 β−ラクタマーゼ暗号付遺伝子を含むハ
    イブリッド組換型ｐＳＭ１１９プラスミドの形成方法で
    あって： （ａ）β−ラクタマーゼに対する暗号付プラスミドｐＳ
    Ｍ１１５のＤＮＡを切断して線状ＤＮＡ配列を得ること
    と、 （ｂ）ｐＳＭ１１２ベクターを切断して第２の線状ＤＮ
    Ａ配列を得ることと、 （ｃ）上記（ａ），（ｂ）で得られた線状ＤＮＡ配列を
    Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ酵素により連結させることとを特徴
    とする方法。
  3. 【請求項３】 プラスミドｐＳＭ１１５が、β−ラクタ
    マーゼの変換の開始を決定するＡＴＧの前にＥｃｏＲＩ
    部位を位置させ、次いでｐＢＲ３２２のＰｖｕＩＩ制限
    部位をＢａｍＨＩ部位で置換することにより、ｐＢＲ３
    ２２から得られるものである請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 ｐＳＭ１１５プラスミドが、β−ラクタ
    マーゼ先駆物質の全配列およびｐＢＲ３２２の複製起点
    を有することを特徴とする請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 プラスミドｐＳＭ１１９を有する枯草
    菌。
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