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JP2562862B2 - 鋳型依存性酵素的核酸合成用プライマーとしてのオリゴヌクレオチド同時合成および直接標識化のための機能性担体 - Google Patents

鋳型依存性酵素的核酸合成用プライマーとしてのオリゴヌクレオチド同時合成および直接標識化のための機能性担体

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Publication number
JP2562862B2
JP2562862B2 JP5504888A JP50488893A JP2562862B2 JP 2562862 B2 JP2562862 B2 JP 2562862B2 JP 5504888 A JP5504888 A JP 5504888A JP 50488893 A JP50488893 A JP 50488893A JP 2562862 B2 JP2562862 B2 JP 2562862B2
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JP
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synthesis
oligonucleotides
labeling
oligonucleotide
primers
Prior art date
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Application number
JP5504888A
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JPH06506700A (ja
Inventor
ゼーリゲル，ハルトムート
マルキェヴィッチ，ヴォイツィェッチ・テ
グレーゲル，カブリエーレ
レーシュ，ルージー
クロッツ，マルギット
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Boehringer Mannheim GmbH
Publication of JPH06506700A publication Critical patent/JPH06506700A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2562862B2 publication Critical patent/JP2562862B2/ja
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 核酸断片のDNAまたはRNAへのハイブリダイゼーション
および螢光色素または親和性基などによるそれらの非放
射性標識化と組み合わせたそれらの鋳型依存性酵素的伸
長に関する技術は、生体医用分野におけるオリゴヌクレ
オチドの多くの応用の基礎である。これらは、例えば、
サンガー（Sanger）のジデオキシ法に従う標識プライマ
ーによる核酸の配列決定または核酸診断用薬に関連する
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の使用を含む。非放射性
標識法は、放射性同位体の取り扱いおよび放射性同位体
による汚染の問題ならびにそれらの貯蔵および廃棄の困
難さを回避するので、一般に、かかる目的のため好まし
い。
非放射性標識化基（Labelling group）の導入は、原
則的には、化学的または酵素的手段によって達成でき
る。これに関連して、オリゴヌクレオチド鎖自体の合成
は、一般に、化学的手段によって行わわれると仮定しな
ければならない。したがって、例えば、デオキシヌクレ
オチジルーターミナルトランスフェラーゼによって触媒
された５−ブロモ−dUTP［ヌークリアサイディズ・アン
ド・ヌークリアタイディズ（Nucleosides ＆ Nucleotid
es）８、805−813（1989）］、ビオチン−dutp［ヌーク
リニック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）
16、4077−4095（1988）］またはジゴキシゲニン−dUTP
［Biol.Chem.Hoppe Serler371、971−927（1990）］と
オリゴヌクレオチドを反応させることによる次なる酵素
標識化は、さらなる処理段階の必要性によって、最初か
ら複雑である。しかしながら、とりわけ、これは、通
常、オリゴヌクレオチド鎖の３′末端を越える、構造的
に修飾されたヌクレオシド−５′トリリン酸による伸長
であることに注意すべきである。この工程では、（鋳型
に依存して）１を超えるヌクレオチド単位が、通常、
３′末端に自動的に結合し、その結果、この方法で標識
されたオリゴヌクレオチドは、最初から、全ての鋳型依
存性鎖伸長のために使用することはできない。ビオチニ
ル化したデオキシウリジン残基をオリゴヌクレオチドの
３′末端に酵素的に結合する方法は、ディエヌエイ（DN
A）３、３、第269〜277頁（1984）。
EP−Ａ−0 325 970には、所定の大きさの細孔を有す
る担体上で行われるオリゴヌクレオチドの化学的または
／および酵素的合成方法が開示されている。
デオキシリボヌクレオチドは、核塩基に、糖残基に、
またはヌクレオチド間結合（リン酸結合）で適当な基を
導入することによって、化学的手段により非放射性標識
され得る。現在、これは、ほとんどもっぱら、オリゴヌ
クレオチドの合成およびプロセッシングの間またその後
に行われる。この方法では、オリゴヌクレオチド鎖の
５′−OH末端［ヌークリイック・アシッズ・リサーチ
（Nucleic Acid Res.）14、6227−6245（1986）；ヌー
クリイック・アシッズ・リサーチ14、7985−7994（198
6）］、５′末端または内部の核酸塩基［ヌークリイッ
ク・アシッズ・リサーチ15、3131−3139）（1987）；ジ
ャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J.Org.
Chem.）55、5931−5933（1990）］あるいは５′−末端
リン酸基［ヌークリイック・アシッズ・リサーチ18、43
55−4360（1990）］またはヌクレオチド間リン酸基［ヌ
ークリアサイディズ・アンド・ヌークリアタイディズ
（Nucleosides ＆ Nucleotides）10、303−306（199
1）］が置換される。Ｎ−４位で標識されたモノヌクレ
オシドは、オリゴヌクレオチドプローブを合成するため
の固相に結合することについて提案されているEP−Ａ−
0 423 839に開示されている。ほとんどの標識化反応
は、鎖の化学的合成後の反応によって行われる。この場
合、反応相手は、比較的不安定なオリゴヌクレオチド鎖
であり、その結果、副反応の危険性がかなりある。場合
によっては、標識化基は、適当なアミドホスファイト誘
導体を試薬として使用することによって導入される。か
かる試薬は、通常、あまり安定ではなく、限定された期
間、溶液中に貯蔵することができるだけである。最近、
オリゴヌクレオチド鎖の３′−OH末端での基の導入を可
能にするCPG担体が開示された（ペニンスラ・ラボラト
リーズ・インコーポレイテッド（Peninsula Laborarie
s,Inc.）、ベルモント（Belmont）、カリフォルニア、
カタログ1990−91、第188頁）。
しかしかなら、３′−OH末端は、さらなる鎖伸長に対
してこれらに基によってブロックされており、その結
果、この方法で標識されたオリゴヌクレオチドは、鋳型
依存性ポリメラーゼ反応用プライマーとしては考えられ
ない。今まで、鋳型依存性ポリメラーゼ反応のために使
用される全てのオリゴヌクレオチドについて、もっぱ
ら、５′−末端標識オリゴヌクレオチドが使用された。
この場合、一方では、内部標識化基がハイブリダイゼー
ションを妨害し、他方では、これがこの位値に非生物的
置換基を含有する場合は、鋳型依存性ポリメラーゼが
３′末端を越えてプライマーを伸長しないと思われた。
驚くべきことに、本発明者らは、デオキシオリゴヌク
レオチドがDNAポリメラーゼによるプライマーとしても
受入れられ、それらが３′−末端塩基に螢光色素などの
標識化基を含有する場合でさえ、ポリヌクレオチドに取
り込まれることを見いだした。この場合、それらは、
５′−末端標識化基を与えられたプライマーと同一の能
力を取り込む。本発明者らは、オリゴヌクレオチド合成
の間またはその後に、適当な官能基を与えられたアミド
ホスファイト誘導体の使用を必要とせずに、オリゴヌク
レオチド配列が標識形態で得られ、使用され得るという
この発見に基づいて、好ましいプロセスを開発した。
したがって、本発明は、高分子担体に結合した標識化
基によって修飾されたモノヌクレオシド、末端標識オリ
ゴヌクレオチドの合成のための該モノヌクレオシドの使
用ならびにポリメラーゼ触媒連鎖伸長用プライマーとし
てのこれらのオリゴヌクレオチドの使用に関する。
本発明は、化学的オリゴヌクレオチド合成のための固
相または液相としての標識化相の精製および使用に基づ
く。
標識化相は、以下に記載のとおり、それらの機能性化
のタイプによって、オリゴヌクオチド鎖の最初の部分
に、自体が標識化基またはその前駆体である１または数
個の置換基を結合する高分子担体と解される。置換基
は、オリゴヌクレオチド合成および標識化相からのオリ
ゴヌクレオチドの切断の後、その３′−OH基がポリメラ
ーゼによる鋳型依存性鎖伸長のために遊離することによ
って結合される。この場合の担体は、いずれか所望の、
非架橋または架橋重合体ならびに有機または無機物質、
好ましくは、ポリスチレン誘導体、シリカゲルまたはCP
G（controlled pore glass）、あるいは好適なアンカー
基の存在によって（好ましくはスペーサーを介して）ヌ
クレオシドまたはヌクレオチドに結合することができる
ポリエチレングリコールの可溶性誘導体、例えば、化学
的オリゴヌクレオチド合成について一般的なこれらの担
体などである。
本発明の定義内の標識化相は、標識化基を与えられた
ヌクレオシドもしくはヌクレオチドまたはその誘導体も
しくは前駆体に非ヌクレオシド・スペーサーを介して結
合する前記タイプの担体を記すために使用される。この
場合、モノヌクレオシドが好ましい。
使用できる非ヌクレオシド・スペーサーは、例えば、
「長鎖アルキルアミン」スペーサーなどの、ヌクレオシ
ドおよびヌクレオチドおよび担体を結合するための化学
的オリゴヌクレオチド合成における通常のリンカーであ
る［オリゴヌークリアタイド，シンセシス，ア・プラク
ティカル・アプローチ（Oligonucleotide,Synthesis,A
practical approach）；エム・ジェイ・ゲイト（M.J.Ga
it）、アイ・アール・エル・プレス（IRL Press）1984
オックスフォード］。
本発明の定義内のアンカー基は、他の化学化合物を水
性媒体または有機溶媒中で共有結合することができる担
体の化学的基である。好ましいアンカー基は、アミノ
基、ヒドロキシル基、またはメルカプト基である。NH2
が特に好ましい。
標識化基なる語は、オリゴヌクレオチド鎖自体に対し
て固有ではない固相または液相で合成されたオリゴヌク
レオチドに特定の構造的性質を与えることができる、標
識化相に固定されたヌクレオシドと共有結合し、所望に
より、スペーサーを介して結合した全ての置換基を意味
する。非放射性標識化基が好ましい。好ましくは、螢光
基、発光基、抗原基または親和性媒介基および鎖体形成
基である。さらにまた、所望により保護形態であっても
よい、標識結合能を有するアミノ基などのこれらの基も
含むと解される。広い意味では、例えば、オリゴヌクレ
オチド鎖の置換基として、DNAもしくはRNA（またはタン
パク）を特異的に結合または切断する能力によってオリ
ゴヌクレオチドの可能な治療用途を可能にするこれらの
基も、本発明の定義内の標識化基と称する。特に好まし
い標識化基は、フルオレセイン、ジゴキシゲニンおよび
ビオチンなどのハプテンである。ハプテンは、それ自体
では免疫応答を起こさないが、巨大分子担体に結合した
後は免疫応答を起こす、500g/mol未満の分子量を有する
免疫的反応性化学化合物である。
本発明の定義内のオリゴヌクレオチドは、生物学的ヌ
クレオチド単位からなる配列、ならびに全体的または部
分的に、生物学的DNAもしくはRNAと比較して構造的に修
飾された構築用ブロック（building block）および／ま
たは修飾されたヌクレオチド間結合からなる配列と解さ
れる。
該標識化相の使用によって、文献で公知の方法に従
い、および文献で公知のシンソン（synthon）を使用し
て、自動化プロセスで、本発明のオリゴヌクレオチドを
製造することもできる。これは文献で公知の方法と同様
に標識化相によって導入された標識化基に加えて、同一
の型または別の型の標識化基が合成の間にオリゴヌクレ
オチド鎖におけるいずれか他の所望の位置で導入される
場合を排除しない。しかしながら、標識化相で合成され
たオリゴヌクレオチドは、単に通常の生物学的核酸構築
用ブロックであり得るだけである。
該オリゴヌクレオチドは、所望の配列の３′から５′
末端に合成されるのが好ましい。適当なシンソンを使用
する場合（実施例を参照）、別法としては、核塩基が本
発明の定義内の標識化基と置換される１または数個のヌ
クレオチドを３′末端で使用する合成を、所望の担体上
で５′から３′末端に行うこともできる。
本発明のオリゴヌクレオチドを製造するために、アン
カー基（好ましくは、アミノ基）を有する担体を、好ま
しくは３′ヒドロキシル基で活性化され、かつ、他の反
応性基（例えば、５′OHおよび核塩基の主要アミノ基）
が通常野手段で保護されているモノヌクレオシドと反応
させる。このモノヌクレオシドは、好ましくは、塩基の
アミノ上または塩基に結合したさらなる置換基上に、末
端標識化基、好ましくは保護された反応性基を有するス
ペーサーを有する。
このヌクレオシドが合成されるべきオリゴヌクレオチ
ドの他のモノヌクレオシド単位中で生じない基を該塩基
上に含有する場合、この塩基で、完成したオリゴヌクレ
オチドを選択的に標識することができる。
次いで、５′−Ｏ−保護基（例えば、ジメトキシトリ
チル）は、好ましくはスペーサーを介して担体に結合し
た保護モノヌクレオチドを含有する、この方法で製造さ
れた標識化相から切断される。次いで、従来技術から公
知のオリゴヌクレオチド合成は、好ましくは、所望のヌ
クレオチド配列が達成されるまで、ホスホロアミダイト
によるヌクレオチド構築用ブロックの結合を介する固相
法によって標識化相で行われる。
該合成の後、標準オリゴヌクレオチド鎖は、所望によ
り保護基を遊離し、標識化基またはそれらの前駆体がオ
リゴヌクレオチド鎖の３′末端に（それらが他の位置に
結合していた場合にはその位置にも）残存するような方
法で高分子から切断される。
標識化相が単に標識化基の前駆体を含有する場合、ま
たは、合成の間に３′位に標識化基の前駆体が導入され
るだけの場合、これは、次なる工程で、実際の標識化基
に変換されなければならない。
本発明の定義内の３′末端で標識されたオリゴヌクレ
オチドは、DNAまたはRNAポリメラーゼによって触媒され
た鋳型依存性重合でプライマーとして使用することがで
きる。このために、種々の鋳型依存性ポリメラーゼ反応
の変形について文献に開示されている通常の反応条件を
使用することができる（例えば、EP−A O 200 362）。
例えば、一本鎖DNAの配列分析のために、本発明に従
って、３′位がフルオレセインで標識化されたプライマ
ーを使用することが可能であった。配列決定は、フォル
マシア・カンパニー（Pharmacia Company）（Pharmacia
−LKB AutoproimerTR Synthesis Kit（27−9290−0
1））の作業指示に従って、エフ・サンガー（F.Sange
r）ら［プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA）74、5463−5467（1977）］のジ
デオキシ法にしたがって行うことができる。この方法で
は、実施例４に従って、pUC19−DNAの約500塩基までお
よびタコのDNA D3の配列を解読することができた。
同様にかなり長い配列を解読させるM13mp18の配列決
定を実施例５に記載する。
例えば、文献から公知の指示に従って、各々、３′位
がフルオレセインで標識された実施例６に記載のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを（非標識リバースプライマー
と一緒に）使用することによって、二本鎖M13mp18RF DN
Aの141および145塩基の断片を増幅することができた。
ゲル電気泳動後、臭化エチジウム染色によって、増幅し
たDNA断片を可視化した。フルオレセイン残基の存在を
螢光測定で検出した。
本発明の定義内の標識オリゴヌクレオチドを得るため
の標識化相の使用は、これらの相がメリィフィールド合
成用の固相または液相としてオリゴヌクレオチドの合成
を可能にするだけではなく、同時に、安定な標識化試薬
の特徴を有するという点で特に優れている。したがっ
て、従来、オリゴヌクレオチド合成の間またはその後に
使用しなければならなかった他の標識化試薬を使用する
必要がない。
かかる標識化試薬は、しばしば、特に、それらがアミ
ドホスファイト試薬である場合、制限された安定性を有
するだけである。さらに、標識化相を使用すると、さら
なる試薬または合成段階を必要とせずに、自動化法でオ
リゴヌクレオチド鎖の実際の合成を慣用的に行うことが
可能であるということが特に優れている。かくして、標
識化基の導入が必要な、全てでなくても必須の段階は、
オリゴヌクレオチド合成の開始前に移される。
かくして、標識化相１バッチで、３′末端で適当な標
識ヌクレオシド（または数個の適当なヌクレオシド）を
有する種々の所望の配列を生成することが可能である。
これに対して、従来、例えば、PCR診断薬用の一連の配
列決定プライマーまたはアンプリマー（amplimer）から
の個々のオリゴヌクレオチドを別々に標識することが必
要であった。かくして、標識化相およびそれによって得
られた３′標識オリゴヌクレオチドの使用は、プライマ
ーとして３′末端標識オリゴヌクレオチドを使用する鋳
型依存性ポリメラーゼ反応、特に、サンガーによる配列
決定反応またはPCRに基づくこれら全ての方法の合理化
を可能にする。
これは、ｎ個の配列決定プライマー１組を非放射性標
識するために、少なくともｎ個の標識化反応または標識
化段階がもはや必要とされず、代わりに４つの標識化相
だけであるということの結果である。不安定なペアリン
グ（ＴおよびＣとＩ、ＡおよびＧとＵ）を利用すると、
必要なものは、２つの標識化相に減少する。標識化相の
生成の間の標識化反応のためになおも必要なものを考慮
すると、オリゴヌクレオチドの標識化に必要な労力は、
約2/n〜4/nに減少する。これは、例えば種々の配列プラ
イマー約100個１組の生成について、標識化労力の96〜9
8％を省くことができる。例えば、大きな配列決定法の
ためにプライマー1000個が必要な場合、節約は、99.6〜
99.8％に減少する。
第１図は、トシルで修飾したデオキシシチジン担体の
合成、修飾オリゴヌクレオチドの放出、およびリポータ
ー基（この場合、フルオレセイン）との反応を示す。
第２図は、デオキシアデノシンおよびデオキシグアノ
シンに関する同様の方法を示す。
第３図は、ハロゲン化されたヌクレオシド誘導体で開
始される、スペーサーを（すでに）含有するデオキシウ
リジン担体の合成を示す。
第４図ａは、プライマーRPによるpUC DNAの配列決定
に関する。
第４図ｂは、プライマーＡによるpUC DNAの配列決定
に関する。
第４図ｃは、プライマーＢによるpUC DNAの配列決定
に関する。
第５図ａは、プライマーＤによるM13 DNAの配列決定
に関する。
第５図ｂは、プライマーＥによるM13 DNAの配列決定
に関する。
本発明を、以下の実施例によってさらに詳細に説明す
る。
実施例１ 標識化相を得るための保護された標識ヌクレオシドの
合成 ａ）デオキシシチジン担体（第１図） aa）５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−ｐ−トル
エンスルホニル−２′−デオキシシチジンの合成 無水ピリジン（20ml）中、塩化トリメチルシリル（2.
5ml、20mol）と２′−デオキシシチジン・塩酸塩（1.32
g、5mmol）を撹拌しつつ１時間反応させる。次いで、該
反応混合物を、水分を除去しつつ、蒸発によって体積約
15mlに濃縮し、次いで、ｐ−トルエンスルホニルクロリ
ド（1.9g、10mmol）を添加する。良く密封した反応容器
を乾燥器中60℃で一晩貯蔵する。該混合物の薄層クロマ
トグフィーによる試験は、出発物質の完全な転換を示
す。ジクロロメタン（50ml）の添加によって反応体積を
増加させ、次いで、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（60
ml）と一緒に振盪することによって有機相を抽出する。
水性層をジクロロメタン（20ml）で２回抽出する。合わ
せた抽出物を水ジェット式真空中で濃縮し、ピリジンで
体積を約15mlにする。これに濃アンモニア水溶液（15m
l）を添加し、薄層クロマトグフィーによって脱シリル
化の進行をモニターする。４時間後、該反応は、定量的
になる。次いで、減圧下、反応混合物を濃縮し、次い
で、得られた４−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−２′−
デオキシシチジン粗製生成物を、無水ピリジン（３×20
ml）を用いた蒸発処理によって濃縮し、次いで、無水ピ
リジン（20ml）に再度溶解する。4,4′−ジメトキシト
リチルクロリド（1.70g、5mmol）を添加する。薄層クロ
マトグフィーによってトリチル化反応を観察し、該反応
は、２時間以内に終了する。該反応混合物をジクロロメ
タン（50ml）および0.5M炭酸水素ナトリウム水溶液（50
ml）に分配する。水性層を、さらにジクロロメタン（２
×50ml）で抽出し、有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで
乾燥し、次いで、濃縮する。溶離剤としてジクロロメタ
ン／メタノールを用いてシリカゲルカラム上でクロマト
グラフィー精製に付した後、純粋な５′−Ｏ−ジメトキ
シトリチル−４−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−２′−
デオキシシチジンを得る。該生成物をベンゼン（（20m
l）に溶解し、冷凍し、オイルポンプ式真空中で凍結乾
燥する。純粋な生成物を白色固体物質として単離する。
2.520g、収率73.7％。
ab）５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−ｐ−トル
エンスルホニル−２′−デオキシシチジン−３′−Ｏ−
モノコハク酸のトリエチルアンモニウム塩の合成 無水ジクロロメタン中トリエチルアミン（0.14ml、1m
mol）と一緒に、５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−
Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−２′−デオキシシチジン
128mg、0.187mmol）、無水コハク酸（50mg、0.05mmol）
および４−N,N−ジメチルアミノピリジン（DMAP、3mg、
0.02mmol）を、水分を除去しつつ撹拌する。薄層クロマ
トグラフィーによる分析は、反応が２時間以内で終了す
ることを示す。該反応混合物を炭酸水素ナトリウム水溶
液（10ml）およびジクロロメタン（10ml）に分配する。
水性層をジクロロメタン（２×10ml）で再抽出し、合わ
せた抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで、濃
縮する。残存する粗製生成物を1,4−ジオキサン（3ml）
に溶解し、冷凍し、次いで、オイルポンプ式真空下で凍
結乾燥する。所望の生成物は、白色固体物質として形成
する:165mg、収率99％。
ac）５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−ｐ−トル
エンスルホニル−２′−デオキシシチジン３′−（２−
シアノエチル）−N,N−ジイソプロピルホスホロアミダ
イトの製造 ジイソプロピル化エチルアミン（2ml、11.5mmol）の
存在下、無水ジクロロメタン（10ml）中で５′−Ｏ−ジ
メトキシトリチル−４−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−
２′−デオキシシチジン（1.368g、2mmol）を電磁撹拌
器で撹拌し、次いで、水分を除去しつつ、前記混合物に
N,N−ジイソプロピルアミノ−（２−シアノエトキシ）
−クロロホスフィン（0.535ml、2.40mmol）を添加す
る。該反応は、TLC分析によって示すことができるよう
に、約15分以内に定量的になる。メタノール（10.1ml）
の添加によって該反応を停止し、次いで、該反応混合物
にジクロロメタン（30ml）を添加し、炭酸水素ナトリウ
ム水溶液（20ml）と一緒に振盪することによって抽出す
る。該水性相をジクロロメタン（２×10ml）で再抽出
し、合わせた抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥する。
粗製生生成物を、溶離剤として最終組成10:85:5（体
積）を有するｎ−ヘキサン−アセトン−トリエチルアミ
ンの混合物を使用して、シリカゲルカラム上でクロマト
グラフィーに付して精製する。ベンゼン（20ml）からの
凍結乾燥によって、所望の純粋な生成物を白色粉末とし
て単離する。
ad）５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−（2,2′
−（エチレンジオキシ）−ジエチルアミノ）−２′−デ
オキシシチジンの合成 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−ｐ−トルエ
ンスルホニル−２′−デオキシシチジン（205mg、0.3mm
ol）のピリジン7.5ml中溶液に無水2,2′−（エチレンジ
オキシ）−ジエチルアミン（1.2ml、12mmol）を添加す
る。反応容器をしっかりと密封し、50℃のオーブン中に
一晩置く。室温に冷却した後、反応混合物を水15mlおよ
びジクロロメタン7.5mlで抽出する。有機相を無水硫酸
ナトリウムで乾燥し、蒸発によって濃縮する。ジクロロ
メタン／メタノールの勾配液を使用してシリカゲルクロ
マトグラフィーによってさらなる精製を行う。無色泡状
質170mg（理論収量の85％）を得る。
ae）５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−［８−
（フルオレセイン−４−イル）チオウレイド−2,2′−
（エチレンジオキシ）−ジエチルアミノ］−２′−デオ
キシシチジンの合成 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−（2,2（−
エチレンジオキシ）−ジエチルアミノ）−２′−デオキ
シシチジン（66mg、0.01mmol）をDMF1mlに溶解する。こ
れにホウ酸ナトリウム緩衝液（1M、pH9.2）0.1mlおよび
フルオレセインイソチオシアネート（38mg、0.01mmol）
を添加する。暗所中、室温で一晩、該調製物を放置す
る。該反応混合物をホウ酸ナトリウム緩衝液（10ml）お
よびジクロロメタン（10ml）で抽出する。乳濁液を遠心
によって解乳化し、有機相を分離する。抽出を再度２回
繰り返す。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、
濾液を蒸発によって濃縮し、該生成物を、アセトンおよ
び炭酸水素ナトリウム飽和水溶液の混合物を使用して、
リバースカラムクロマトグラフィー（メルク（Merk）、
RP−２シリカゲル）によって精製する。生成物119mgを
橙色の油状物として得る。
ｂ）デオキシアデノシン担体（第２図） ba）６−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−２′−デオキシ
アデノシンの合成 デオキシアデノシン（1.15g、4.0mmol）を、毎回無水
ピリジン10mlと一緒に３回共蒸留に付し、次いで、ピリ
ジン（120ml）中、塩化トリメチルシリル（4ml、32mmo
l）と一緒に室温で１時間撹拌する。次いで、該混合物
を、水分を除去しつつ、蒸発によって約100mlの体積に
濃縮する。ｐ−トルエンスルホニルクロリド（1.83g、
9.5mmol）およびジメチルアミノピリジン（1.0g、9.3mm
ol）を添加し、水分を除去しつつ、還流させながら60℃
で50時間撹拌する。反応をモニターするために試料を採
取し、濃アンモニアで脱シリル化し（約２時間）、回転
蒸発機に付し、ジクロロメタン中に取る。薄層クロマト
グラフィー（移動溶媒塩化メチレン／メタノール＝9:
1）による試験は、完全な変換が得られないことを示
す；したがって、分解生成物が増加するとすぐに該反応
を停止する。ジクロロメタン（100ml）の添加によって
反応体積が増加し、次いで、該混合物を炭酸水素ナトリ
ウム飽和水溶液（250ml）と一緒に振盪することによっ
て抽出し、水性相をジクロロメタン（２×50ml）で再抽
出する。有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、次い
で、水ジェット式真空中で蒸発して、体積を約100mlに
濃縮する。濃アンモニア水溶液（100ml）を添加し、脱
シリル化の経過を、薄槽クロマトグフィーによってモニ
ターする；該反応は、４時間後に終了する。多くの分解
生成物を形成するので、粗製生成物を、シリカゲル（Me
rck7734）および溶離剤として塩化メチレン／メタノー
ル（10:1）を用いて重力カラム上で精製する。
bb）５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−６−Ｎ−ｐ−トル
エンスルホニル−２′−デオキシアデノシンの合成 ６−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−２′−デオキシア
デノシン（4.0g、9.8mmol）を無水ピリジン（３×15m
l）と一緒に共蒸留に付し、次いで、ピリジン（50ml）
中に取り、アルゴン下、4,4′−ジメトキシトリチルク
ロリド（3.75g、11mmol）を添加する。薄層クロマトグ
フィーによるモニターリングは、該反応が２時間後に終
了することを示す。ジクロロメタン（50ml）を添加し、
該混合物を、0.5M炭酸水素ナトリウム溶液と一緒に振盪
することによって抽出する。水性相をジクロロメタン
（２×50ml）で再抽出し、合わせた有機抽出物を硫酸ナ
トリウムで乾燥し、回転蒸発機に付す。この方法で得ら
れた粗製生成物を、溶離剤として塩化メチレン／メタノ
ールを使用してシリカゲルカラム（Merck H 60）上でク
ロマトグラフィーに付して精製する。
bc）５′−Ｏ−DMTr−６−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル
−２′−デオキシアデノシン−３′−Ｏ−モノコハク酸
のトリエチルアンモニウム塩の合成 ５′−Ｏ−DMTr−６−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−
２′−デオキシアデノシン（200mg、0.28mmol）、無水
コハク酸（70mg、0.7mmol）、４−N,N−ジメチルアミノ
ピリジン（DMAP、4.5mg、0.03mmol）および無水トリエ
チルアミン（0.2ml、1.4mmol）を無水塩化メチレンに溶
解し、室温で２時間撹拌する。次いで、反応混合物を炭
酸水素ナトリウム水溶液（10ml）およびジクロロメタン
（10ml）に分配し、水性相をジクロロメタン（２×10m
l）で再抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾
燥し、回転蒸発機に付す。この方法で得られた生成物を
精製せずにさらに処理する。
bd）５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−８−（2,2′−
（エチレンジオキシ）−ジエチルアミノ）−２′−デオ
キシアデノシンの合成 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−８−ブロモ−２′−
デオキシアデノシン（100mg、0.15mmol）のピリジン0.5
ml中溶液に無水2,2−（エチレンジオキシ）−ジエチル
アミン（0.5ml）を添加する。反応容器をしっかりと密
封し、70℃のオーブンに一晩貯蔵する。実施例ad）にお
ける５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−2,2′−
（エチレンジオキシ）−ジエチルアミノ）−２′−デオ
キシチジンについての方法と同様に、さらに処理し、精
製する。
be）５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−８−８−（フルオ
ロセイン−４−イル）チオウレイド−2,2′−（エチレ
ンジオキシ）−ジエチルアミノ）−２′−デオキシアデ
ノシンの合成 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−８−Ｎ−（2,2′−
（エチレンジオキシ）−ジエチルアミノ）−２′−デオ
キシアデノシン（82mg、0.12mmol）をDMF 1mlに溶解す
る。これにホウ酸ナトリウム緩衝液（1M、pH9.2）0.1ml
およびフルオレセインイソチオシアネート（47mg、0.12
mmol）を添加する。暗所中、室温で一晩、該調製物を放
置する。反応混合物をホウ酸ナトリウム緩衝液（10ml）
およびジクロメタン（10ml）で抽出する。該乳濁液を遠
心によって解乳化し、有機相を分離する。抽出をさらに
２回繰り返す。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥
し、濾液を蒸発によって濃縮し、次いで、該生成物をア
セトンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液の混合物を使用
してリバースカラムクロマトグラフィー（メルク（Merc
k）、RP−２シリカゲル）に付して精製する。橙色油状
物として生成物97mgを得る。
ｃ）デオキシグアノシン担体 bb）と同様に５′−Ｏ−DMTr−２−Ｎ−ｐ−トルエン
スルホニル−２′−デオキシグアノシンの合成を行う
（第２図）。
ｄ）デオキシウリジン担体（第３図） da）５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ブロモ−２′
−デオキシアデノシンの合成 ５−ブロモ−２′−デオキシウリジン（4.0g、13mmo
l）を無水ピリジン（３×15ml）と一緒に共蒸発に付
し、次いで、ピリジン（50ml）中に取り、アルゴン下、
4,4′−ジメトキシトリチルクロリド（4.88g、14.3mmo
l）を添加する。薄層クロマトグフィーによるモニター
リングは、２時間後に該反応が終了することを示す。ジ
クロロメタン（50ml）を添加し、該混合物を、0.5M炭酸
水素ナトリウム溶液と一緒に振盪することによって抽出
する。水性相をジクロロメタン（２×50ml）で再抽出
し、合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、回
転蒸発機に付す。この方法で得られた粗製生成物を、溶
離剤として塩化メチレン／メタノールを使用してシリカ
ゲルカラム上でクロマトグラフィーに付して精製する。
db）５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５（2,2′−（エ
チレンジオキシ）−ジエチルアミノ）−２′−デオキシ
ウリジンの合成 水分を除去しつつ、無水エタノール（10ml）に５′−
Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ブロモ−２′−デオキシ
ウリジン（0.7g、1.2mmol）を溶解する。乾燥2,2′−
（エチレンジオキシ）−ジエチルアミン（0.7ml、4.8mm
ol）を添加し、該混合物を還流させながら24時間加熱す
る。次いで、真空蒸発によって乾固するまで該溶液を濃
縮する。ジクロロメタン（30ml）に油状残留物を取り、
過剰のジアミンのほとんどを除去するために、塩化カリ
ウム飽和水溶液（２×30ml）で抽出する。有機相を硫酸
ナトリウムで乾燥し、回転蒸発機を付す。さらにジアミ
ンを除去するために、残留物を少量の水（２〜3ml）に
温浸する。水を除去して廃棄する。該生成物を、粉末状
コンシステンシーを示すまで、デシケーター中、オイル
ポンプ式真空下で五酸化リンにより乾燥する。
実施例２ 保護された標識ヌクレオシドのコハク酸エステルを使
用するオリゴヌクレオチド合成のための標識化相の生成
についての一般的指示 空気の非存在下、無水ジクロロメタン（3ml）中、室
温で一晩、好適な方法で保護したコハク酸ヌクレオシド
のトリエチルアンモニウム塩（0.185mmol、例えば、実
施例1bc）、担体（1.0g）、N,N−ジシクロヘキシルカル
ボジミン（100mg、1mmol）、４−N,N−ジメチルアミノ
ピリジン（DMAP、6mg、0.05mmol）、トリエチルアミン
（0.07ml、0.5mmol）を振盪する。次いで、担体を濾去
し、ジクロロメタン（50ml）で洗浄し、マスキング反応
のために、ジクロロメタン（2ml）中、無水酢酸（0.35m
l）、トリエチルアミン（1ml）、DMPA（12mg）と一緒に
フラスコ中に移し、２時間反応させる。担体を濾去し、
ジクロロメタン、メタノール、ジクロロメタンおよびジ
エチルエーテル（各々25ml）で連続して洗浄し、重量が
一定に維持されるまで、デシケーター中、オイルポンプ
式真空下で乾燥する。
18μmol/g（またはアデノシン誘導体の場合、26μmol
/g）の充填量で、前記指示に従って、５′−Ｏ−ジメト
キシトリメチル−４−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−
２′−デオキシシチジン（または−アデノシン）を有す
るあLCAA−CPG 500A担体を生成する。
４−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−２′−デオキシシ
チジンまたは６−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−２′−
デオキシアデノシンを有する「長鎖アミノアルキル」CP
G担体（LCAA−CPG 500）の誘導体形成 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ｐ−トルエンスルホ
ニル−２′−デオキシヌクレオシド−３′−Ｏ−モノコ
ハク酸のトリエチルアンモニウム塩（0.186mmol）、LCA
A−CPG 500A（ピアース・カンパニー（Pierce Compan
y）、1000g）、N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（200mg、1mmol）、４−N,N−ジメチルアミノピリジ
ン（DMAP、6mg、0.05mmol）およびトリエチルアミン
（0.07ml、0.5mmol）を、水分を除去しつつ、室温で一
晩、注意して機械的に撹拌する。担体を濾去し、ジクロ
ロメタン（50ml）で洗浄し、未反応ヒドロキシル基をマ
スキングするために、反応フラスコ中に移し、乾燥ジク
ロロメタン（2ml）中の無水酢酸（0.35ml）、トリエチ
ルアミン（1ml）、DMAP（12mg）と一緒に２時間振盪す
る。担体を濾去し、ジクロロメタン、メタノール、ジク
ロロメタンおよびジエチルエーテル（各々25ml）で連続
して洗浄し、重量が一定に維持されるまで、デシケータ
ー中、オイルポンプ式真空下で乾燥する。文献に開示さ
れた方法に従って、酸による処理の後、少量の担体試料
を使用して行うジメトキシトリチルカチオンの分光光度
測定によって担体の充填量を決定し、シチジン誘導体に
ついては、18μmol/gであり、アデノシン誘導体につい
ては、26μmol/gである。
アミノ基を有する別の担体（例えばCPG 1400）につい
て、該反応を同様に行う。
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−８−（８−フルオレ
セイン−４−イル）チオウレイド−2,2′−（エチレン
ジオキシ）−ジエチルアミノ）−２′−デオキシアデノ
シンまたは５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−
（８−フルオレセイン−４−イル）チオウレイド−2,
2′−（エチレンジオキシ）−ジエチルアミノ−２′−
デオキシシチジンを有するLCAA−CPG 500の誘導体形成 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−８−（８−フルオレ
セイン−４−イル）チオウレイド2,2−（エチレンジオ
キシ）−ジエチルアミノ）−２′−デオキシアデノシン
（55mg、0.05mmol）をジクロロメタン／ピリジン（1:
1、3.5ml）に溶解し、次いで、トリエチルアミン（0.3m
l）、４−N,N−ジメチルアミノピリジン（DMAP、12mg）
および無水コハク酸（200mg）を添加する。暗所中、室
温で一晩、反応させる。次いで、該反応混合物を蒸発に
よって濃縮し、ジクロロメタン／炭酸水素ナトリウム水
溶液で抽出する。硫酸ナトリウムで乾燥した後、有機相
を蒸発によって濃縮し、ピリジンと一緒に共蒸発に付
す。この方法で得た粗製生成物にLCAA−CPG 500°Ａ（3
00mg、ピアース・カンパニー（Pierce Company）、DMAP
（6mg）、トリエチルアミン（0.07ml）、ジシクロヘキ
シルカルボジイミド（DCCI、200mg）およびジクロロメ
タン（1.5ml）を添加する。該反応混合物を室温で一晩
振盪し、担体を濾去し、ジクロロメタン、メタノールお
よびジエチルエーテルで洗浄する。その後、誘導体形成
した担体を丸底フラスコ中に移し、無水酢酸（0.5m
l）、ピリジン（1ml）、DMAP（12mg）およびジクロロメ
タン（5ml）を添加する。３時間後、担体を濾去し、洗
浄し、デシケーター中、オイルポンプ式真空下で乾燥す
る。担体の充填量は、アデシン誘導体については、19.6
μmol/gであり、シチジン誘導体については、19.5μmol
/gである。
これらの担体を用いて、実施例５に記載のプライマー
ＤおよびプライマーＥを合成した。
実施例３ 標識化相を使用する標識オリゴヌクレオチドの合成のた
めの一般的作業指示 ａ）ｐ−トルエンスルホニル基を有するオリゴヌクレオ
チドの合成およびそれらの、2,2′−（エチレンジオキ
シ）−ジエチルアミンとの反応 好適な担体（0.2μmol）およびホスホロアミダイトを
使用する製造者のプロトコールに従って、ファルシア・
エルケイビー・カンパニー（Pharmacia LKB Company）
（スウェーデン）からのGene Assembler Plusを使用し
て、オリゴヌクレオチドを合成する。エッペンドルフ反
応容器中、室温で濃アンモニア水溶液による処理によっ
て、１時間以内に担体からオリゴヌクレオチドを切断す
る。Speed−vacエバポレーター中で、プールした溶液を
濃縮乾固する。部分的に脱保護したオリゴヌクレオチド
に無水2,2′−（エチレンジオキシ）−ジエチルアミン
（100μｌ）を添加し、該反応容器を閉じ、超音波浴
中、室温でオリゴヌクレオチドを溶解する（５〜10
分）。80℃のインキュベーター中に反応溶液を一晩置
く。ｐ−トルエンスルホニル基を除いて完全に脱保護さ
れた生成物をアミン溶液から沈殿させる。反応容器を遠
心し、該溶液を注意して除去する。無水エタノール（10
0μｌ）を添加し、超音波浴によって沈殿物を洗浄し
（５〜10分）、次いで遠心する。上清を廃棄し、洗浄工
程を１回繰り返す。Speedvacエバポレーター中で粗製生
成物の沈殿物を乾燥し、次いで、さらなる実験に使用す
る。
ｂ）アミノアルキル−オリゴヌクレオチドのフルオレセ
インイソチオシアネートとの反応 フルオレセイン残基のオリゴヌクレオチドへの導入方
法は、フォルマシア・エルケイビー・カンパニー（Phar
macia LKB Company）（Pharmacia−LKB AutoprimerTM S
ynthesis Kit（27−9290−01））のプロトコールと実質
的に同じである。精製していないオリゴヌクレオチドの
沈殿物を0.15Mホウ酸ナトリウム緩衝液（pH9.2）（100
μｌ）に溶解し、新しく調製したフルオレセインイソチ
オシアネート異性体Ｉ（1mg）の無水ジメチルスルホキ
シド（30μｌ）中溶液を添加する。暗所中、室温で４〜
20時間、該反応を行い、実質的に同一の結果を有する。
該反応混合物をNAP−10カラム（ファルマシア−エルケ
イビー（Pharmacia−LKB））に適用し、再蒸留水（pH8
〜9.5、アンモニアで調節）で洗浄する。オリゴヌクレ
オチドを含有するフラクション（1.3ml）をプールし、
所望の標識オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（20％、7M尿素）またはHPLCによって単離
し、UV−Vis分光計によって特徴付けする。アナリティ
カル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）、165、44
2−447（1987）に従って、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ
／アルカリ性ウシホスファターゼによる切断を行う。
ｃ）フルオレセイン化デオキシヌクレオチドを有する担
体を使用するオリゴヌクレオチドの合成 製造者のプロトコールに従って、ファルマシア・エル
ケイビー・カンパニー（Pharmacia−LKB Company）（ス
ウェーデン）からのGene Assembler Plusを使用する好
適なホスホロアミダイトにより、オリゴヌクレオチドを
合成する。担体としてフルオレセイン−デオキシヌクレ
オチドにより誘導体形成したLCAA−CPG 500 A担体（10m
g、0.2μmol）を使用する。ファルマシア（Pharmacia）
の標準的なプロトコールと同様に、合成したオリゴヌク
レオチドの切断およびさらなるプロセッシングを行う。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（20％、7M尿素）また
は逆相HPLCによって、さらなる精製を行う。
実施例４ DNAポリメラーゼによって触媒化された鋳型依存性鎖伸
長における３′−末端標識オリゴヌクレオチドの使用 一例として、以下の修飾オリゴヌクレオチドを使用し
て配列決定の研究を行った： プライマーA:5′−CAGGAAACAGCTATAGX 配列番号１ プライマーB:3′−XAGGAAACAGCTATGAC 配列番号２ （3a、ｂに従って、両方のプライマーを精製した。） Ｘ＝フルオレセインで標識したシチジン。
参照物質として、通常の方法で５′−位でアミノリン
カーと反応させ、かつ、フルオレセインで標識した同様
のプライマーを使用した（プライマーRP）（ファルマシ
ア・カンパニー（Pharmacia Company）の指示）。研究
されるべきDNAとし、pUC19およびDNA（D3）を使用し
た。
ファルマシア・カンパニー（Pharmacia Company）の
作業指示に従って、サンガージデオキシ法によって全て
のプライマーについて配列決定を行う。pUC19 DNAに対
する配列決定の結果を第４図ａ、ｂおよびｃに示す。
以下のプライマーを使用して、同様に配列決定した。
プライマーC:5′−TTTCACACAGGAAACAGCTATGY配列番号３ Ｙ＝フルオレセインで標識したアデノシン。
実施例５ M13標準配列決定系における３′−末端標識オリゴヌク
レオチドの使用 配列決定研究のために２種類の万能M13配列決定プライ
マーを使用した： プライマーD:5′−TTGTAAAACGACGGCCY 配列番号４ （3cに従って調製した） プライマーE:5′−AAAACGACGGCCAGTGX 配列番号５ （3cに従って両方のプライマーを調製した） Ｙ＝フルオレセインで標識化したアデノシン。
Ｘ＝フルオレセインで標識化したシチジン。
研究されるべきDNAとしてM13mp18（ファルマシア・カ
ンパニー（Pharmacia Co.））を使用した。
ファルマシア・カンパニーの作業指示（T7配列決定キ
ット）に従って、サンガージデオキシ法によって両方の
プライマーについての配列決定を行った。配列決定の結
果を第５図ａおよびｂに示す。
配列表 配列番号:1 配列の長さ:17塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴:3′末端でフルオレセイン標準化したＣ 配列 CAGGAAACAG CTATAGC 17 配列番号:2 配列の長さ:17塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴:3′末端でフルオレセイン標準化したＣ 配列 CAGTATCGAC AAAGGAC 17 配列番号:3 配列の長さ:23塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴:5′末端でフルオレセイン標準化したＡ 配列 AGTATCGACA AAGGACACAC TTT 23 配列番号:4 配列の長さ:17塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴:3′末端でフルオレセイン標準化したＡ 配列 TTGTAAAACG ACGGCCA 17 配列番号:5 配列の長さ:17塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴:3′末端でフルオレセイン標準化したＣ 配列 AAAACGACGG CCAGTGC 17
フロントページの続き (72)発明者 グレーゲル，カブリエーレ ドイツ連邦共和国デー−7915エルヒンゲ ン、エルヒンゲル・シュトラーセ６番 (72)発明者 レーシュ，ルージー ドイツ連邦共和国デー−7900ウルム、ア イヒェネケルヴェーク10番 (72)発明者 クロッツ，マルギット ドイツ連邦共和国デー−7933シェルクリ ンゲン、ミュンジンゲル・シュトラーセ 18番 (56)参考文献 特表 昭62−503103（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】３′末端で開始される鋳型依存性DNAまた
    はRNAポリメラーゼ触媒化鎖伸長においてプライマーと
    して使用されるオリゴヌクレオチドであって、デオキシ
    ヌクレオシド、リボヌクレオシド、デオキシヌクレオチ
    ドまたはリボヌクレオチドの核塩基に共有結合した非放
    射性標識化基を有する所定の数および型のデオキシヌク
    レオシド、リボヌクレオシド、デオキシヌクレオチドま
    たはリボヌクレオチドを３′末端に有することを特徴と
    するオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】プライマーがその３′末端に非放射性標識
    化基を有するヌクレオシドを含有することを特徴とす
    る、プライマーを鋳型核酸にハイブリダイズし、次い
    で、その３′末端でプライマーの酵素的伸長が開始され
    ることからなる標識核酸の製造方法。
  3. 【請求項３】非放射性標識化基がデオキシヌクレオシ
    ド、リボヌクレオシド、デオキシヌクレオチドまたはリ
    ボヌクレオチドの核塩基に共有結合された請求項２記載
    の製造方法。
JP5504888A 1991-08-28 1992-08-22 鋳型依存性酵素的核酸合成用プライマーとしてのオリゴヌクレオチド同時合成および直接標識化のための機能性担体 Expired - Lifetime JP2562862B2 (ja)

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DE4128480,1 1991-08-28
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4418691A1 (de) * 1994-05-28 1996-02-22 Boehringer Mannheim Gmbh 3'-(4'-) nicht-radioaktiv markierte Nukleoside und Nukleotide mit Aminocarbonsäure-, Peptid- oder Carbonsäure-Spacer
CA2279673A1 (en) * 1995-12-15 1997-06-16 Enzo Therapeutics, Inc. Property effecting and/or property exhibiting constructs for the expression of non-native nucleic acids for therapeutic and diagnostic uses
US6291164B1 (en) 1996-11-22 2001-09-18 Invitrogen Corporation Methods for preventing inhibition of nucleic acid synthesis by pyrophosphate
US6235483B1 (en) * 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
ATE335754T1 (de) 2001-03-19 2006-09-15 Harvard College Entwicklung neuer molekularer funktionen
CA2451524A1 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Nuevolution A/S Templated molecules and methods for using such molecules
US7491494B2 (en) * 2002-08-19 2009-02-17 President And Fellows Of Harvard College Evolving new molecular function
US8017323B2 (en) * 2003-03-26 2011-09-13 President And Fellows Of Harvard College Free reactant use in nucleic acid-templated synthesis
WO2007011722A2 (en) 2005-07-15 2007-01-25 President And Fellows Of Harvard College Reaction discovery system
WO2011034605A2 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
KR101838305B1 (ko) 2009-12-29 2018-03-13 큐알엔에이, 인크. ＮＲＦ1(Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ 1)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 핵 호흡 인자 1 관련된 질환의 치료
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
CN103384681B (zh) 2010-12-23 2018-05-18 霍夫曼-拉罗奇有限公司 结合剂
CN103384825B (zh) 2010-12-23 2017-05-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 通过二价结合剂检测经翻译后修饰的多肽
SG191153A1 (en) 2010-12-23 2013-07-31 Hoffmann La Roche Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
RU2644341C2 (ru) 2012-02-10 2018-02-08 Дженентек, Инк. Одноцепочечные антитела и другие гетеромультимеры
EP2867254B1 (en) 2012-06-27 2017-10-25 F. Hoffmann-La Roche AG Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
ES2597228T3 (es) 2012-06-27 2017-01-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Procedimiento para la selección y la producción de entidades de objetivación, como dianas, altamente selectivas y multiespecíficas, personalizadas, las cuales contienen por lo menos dos entidades de unión diferentes, y utilización de éstas
WO2014021938A1 (en) * 2012-08-02 2014-02-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and apparatus for nucleic acid synthesis using oligo-templated polymerization
PL3227332T3 (pl) 2014-12-03 2020-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Wielospecyficzne przeciwciała

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU666183A1 (ru) * 1977-06-15 1979-06-05 Новосибирский институт органической химии СО АН СССР Способ получени активных производных динуклеотидов
FR2519005B1 (fr) * 1981-12-29 1985-10-25 Pasteur Institut Fragments d'adn marques a l'une au moins de leurs extremites par des ribonucleotides modifies reconnaissables par des molecules affines et procede pour realiser une analyse de tels fragments d'adn
DK171161B1 (da) * 1985-03-28 1996-07-08 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
US4739044A (en) * 1985-06-13 1988-04-19 Amgen Method for derivitization of polynucleotides
US4762779A (en) * 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
SU1318600A1 (ru) * 1985-10-09 1987-06-23 Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Молекулярной Биологии Способ твердофазного синтеза олигонуклеотидов
US4868105A (en) * 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
SU1439108A1 (ru) * 1986-05-11 1988-11-23 Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Молекулярной Биологии Способ получени носителей дл твердофазного синтеза олигонуклеотидов
DE3801987A1 (de) * 1988-01-23 1989-07-27 Boehringer Mannheim Gmbh Traeger zur chemischen oder/und enzymatischen umsetzung von nukleinsaeuren oder nukleinsaeurefragmenten an festphasen
US5082934A (en) * 1989-04-05 1992-01-21 Naxcor Coumarin derivatives for use as nucleotide crosslinking reagents
US5141813A (en) * 1989-08-28 1992-08-25 Clontech Laboratories, Inc. Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis
US5403709A (en) * 1992-10-06 1995-04-04 Hybridon, Inc. Method for sequencing synthetic oligonucleotides containing non-phosphodiester internucleotide linkages

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