JP2559535B2 - 無機陰イオンの分析方法および分析装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、液体クロマトグラフィ
ーにより、生体試料中の無機陰イオンを分析する方法お
よび分析装置に関し、特に、除タンパク処理を自動化し
得る構成を備えた分析方法および分析装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、液体クロマトグラフィーを利
用して生体試料中の無機陰イオンを分析する方法とし
て、イオンクロマトグラフィーを利用した分析方法が知
られている。もっとも、生体試料中のイオンを測定対象
とするイオンクロマトグラフィーについての報告はさほ
ど多くはなかった。「イオンクロマトグラフィー」（機
器分析実技シリーズ 日本分析化学会編、共立出版 第
２０４−２０５頁（１９８８））には、試料として血清
を用いた陰イオン測定例が挙げられている。この測定法
では、アセトニトリルによって血清試料を除タンパク
し、しかる後、試料中に含まれている過剰の塩素イオン
を除去するための処理を施し、注入試料として用意して
いる。そして、陰イオン分析カラムを用い、電気伝導度
計により陰イオンを検出している。この測定法では、溶
出順に、亜硝酸イオン、硝酸イオン、リン酸イオンおよ
び硫酸イオンの測定が可能である。

【０００３】上記のように、試料が血清等の生体試料の
場合には、予め除タンパク処理を施さねばならない。さ
もないと、生体試料中には多くのタンパク質が含有され
ているため、そのままカラムに注入すると、タンパク質
がカラムに不可逆的に吸着し、カラムを劣化させるから
である。従って、生体試料の分析にあたっては、上記の
ように予め除タンパク処理を施し、該除タンパク処理が
施された試料をカラムに注入しなければならない。除タ
ンパク処理としては、過塩素酸もしくはトリクロロ酢酸
のような酸、又はエタノールもしくはアセトニトリルの
ような有機溶媒を試料に添加し、タンパク質を変性さ
せ、遠心分離により変性されたタンパク質を除去し、上
澄みを注入試料として用いる方法が一般的である。しか
しながら、これらの除タンパク処理では、添加された酸
に由来する妨害ピークを発生させたり、あるいはリン酸
イオンやカルシウムイオン等が試料中に沈澱したりする
といった問題があった。

【０００４】そこで、上記のような除タンパク処理に基
づく問題を解決するものとして、近年、限外濾過膜を用
いた除タンパク法が行われている。最近では、ディスポ
ーザブル型の限外濾過器も市販されており、シリンジ加
圧タイプと遠心タイプの２つの形式のものが存在する。
このような限外濾過膜を用いた除タンパク法によれば、
酸や有機溶媒を用いた除タンパク処理で問題となってい
た点を改善することができる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、限外濾
過膜を用いて除タンパク処理を行う場合、処理にかなり
の時間がかかり、かつコストがかなり高くつくといった
問題があった。また、酸や有機溶媒による除タンパク処
理、並びに限外濾過膜による除タンパク処理の何れにお
いても、一般に分析時間が非常に長くなり、分析を自動
化することが難しく、測定の再現性も十分でないといっ
た問題もあった。

【０００６】よって、本発明の目的は、生体試料をその
まま液体クロマトグラフィーに注入することを可能と
し、除タンパク処理の自動化を図ることにより短時間で
分析を行うことができ、さらに再現性に優れた無機陰イ
オンの分析方法および分析装置を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本願の第１発明は、液体
クロマトグラフィーにより生体試料中の無機陰イオンを
分析する方法であって、除タンパク用移動相によりヒド
ロキシアパタイトが充填されたタンパク質保持カラムに
試料中の無機陰イオンを保持させることなく、該生体試
料中のタンパク質成分を保持させ、試料中の無機陰イオ
ンをタンパク質保持カラムよりも下流側に配置された陰
イオン保持カラムに保持させる工程と、分析用移動相に
より、陰イオン保持カラムから無機陰イオンを脱着させ
て陰イオン分析カラムに導き、該無機陰イオンを陰イオ
ン分析カラムで分離する工程とを備える。

【０００８】また、本願の第２発明は、上記第１発明を
実施するための分析装置であり、第１移動相送液手段、
流路切換手段、陰イオン分析カラムおよび検出手段がこ
の順序で直列に接続されてなる第１流路と、第２移動相
送液手段、試料注入手段およびヒドロキシアパタイトが
充填されたタンパク質保持カラムがこの順序で直列に接
続されており、かつ前記流路切換手段に下流側が接続さ
れた第２流路と、前記流路切換手段に入口側および出口
側が接続された陰イオン保持カラムとを備え、流路切換
手段が、陰イオン保持カラムを第２流路の下流端に接続
した状態と、陰イオン保持カラムを第１流路に接続した
状態とを切り換え得るように構成されているものであ
る。

【０００９】

【作用】本発明の分析方法では、生体試料がヒドロキシ
アパタイトが充填されたタンパク質保持カラムにそのま
まの状態で導かれ、該タンパク質保持カラムにおいて試
料中の無機陰イオンは保持されることなく、タンパク質
が保持される。タンパク質保持カラムに保持されなかっ
た無機陰イオンを含む試料は、陰イオン保持カラムに保
持される。他方、分析用移動相により該陰イオン保持カ
ラムから無機陰イオンが脱着され、陰イオン分析カラム
に導かれて、該陰イオン分析カラムで無機陰イオンが分
離される。即ち、本発明では、除タンパク処理は、上記
タンパク質保持カラムで行われるため、分析に先立って
予め生体試料を除タンパク処理する必要がない。また、
限外濾過膜を用いた従来の除タンパク法のように、処理
に長時間を要せず、また比較的高価なディスポーザブル
型の製品を使用する必要もない。

【００１０】すなわち、本発明の分析方法および装置
は、従来の生体試料中の無機陰イオンの分析方法および
装置において種々の問題を引き起こしていた除タンパク
処理を、ヒドロキシアパタイトが充填されたタンパク質
保持カラムを用いて自動化することにより解決したこと
に、一つの特徴を有する。また、本発明の分析装置で
は、生体試料中からタンパク質を除去するにあたって
は、ヒドロキシアパタイトが充填されたタンパク質保持
カラムでタンパク質を保持させ、無機陰イオンについて
は陰イオン保持カラムに保持させ、しかる後、流路切換
手段を切り換えることにより陰イオン保持カラムに吸着
されていた無機陰イオンを分析用移動相により脱着し、
陰イオン分析カラムに導くことが可能とされている。従
って、流路切換手段により陰イオン保持カラムを第１流
路に接続して無機陰イオンの分離および分析を行ってい
る間に、第２流路に接続されたタンパク質保持カラムを
再生することができる。よって、生体試料中の無機陰イ
オンの分析時間を大幅に短縮することができると共に、
分析系全体を自動化することも容易である。

【００１１】以下、本発明の分析方法および装置を、図
１を参照して、より具体的に説明する。図１は、本発明
の分析方法および装置の概略を説明するための概略構成
図である。第１流路Ａは、第１移動相送液手段１、流路
切換手段２、陰イオン分析カラム３および検出手段４を
直列に接続することにより構成されている。また、第２
流路Ｂは、第２移動相送液手段５、試料注入手段６およ
びヒドロキシアパタイトが充填されたタンパク質保持カ
ラム７を直列に接続することにより構成されており、そ
の下流端が流路切換手段２に接続されている。さらに、
流路切換手段２には、陰イオン保持カラム８が接続され
ている。

【００１２】流路切換手段２は、第２流路Ｂに陰イオン
保持カラム８を接続した状態、すなわち図１の流路ａ−
陰イオン保持カラム８−流路ｃを接続した状態と、第１
流路Ａに陰イオン保持カラム８を接続した状態、すなわ
ち陰イオン保持カラム８を流路ｄ，ｅ間に接続した状態
とを切り換え得るように構成されている。次に、図１を
参照しつつ本発明の分析方法を説明する。

【００１３】試料の注入 流路切換手段２による接続状態を、陰イオン保持カラム
８が第２流路Ｂに接続された状態とする。すなわち、流
路ａ−陰イオン保持カラム８−流路ｃを接続した状態と
する。この状態で、第２移動相送液手段５より除タンパ
ク用移動相を送液し、試料注入手段６から試料を第２流
路Ｂに注入する。

【００１４】除タンパク処理 第２流路Ｂに注入された試料を、タンパク質保持カラム
７に導き、該タンパク質保持カラム７において試料中の
タンパク質を保持させる。この場合、試料中の無機陰イ
オンはタンパク質保持カラム７に保持されることなく、
陰イオン保持カラム８に導かれ、該陰イオン保持カラム
８に保持される。

【００１５】無機陰イオンの分離 次に、流路切換手段２の接続状態を切り換え、陰イオン
保持カラム８を第１流路Ａに接続する。すなわち、流路
ｄ−陰イオン保持カラム８−流路ｅが接続された状態と
する。そして、第１移動相送液手段１により、分析用移
動相を送液し、陰イオン保持カラム８から無機陰イオン
を脱着し、陰イオン分析カラム３に導き、該陰イオン分
析カラム３において各陰イオンに分離する。

【００１６】タンパク質保持カラムの洗浄および再生 上記無機陰イオンの分離工程と並行して、第２移動相送
液手段５によって洗浄用移動相を送液し、それによって
タンパク質保持カラム７に保持されているタンパク質を
溶出させる。洗浄終了後、タンパク質保持カラム７の再
生を行うために、第２移動相送液手段５により送液する
移動相を、除タンパク用移動相に切り換える。

【００１７】次測定の準備 タンパク質保持カラム７の再生終了後、流路切換手段２
の接続状態を陰イオン保持カラム８が第２流路Ｂに接続
されるように切り換える。上記のように、本発明の分析
方法では、流路切換手段２を切り換えることにより、陰
イオン保持カラム８が第２流路Ｂに接続された状態と、
第１流路Ａに接続された状態とを切り換えることがで
き、それによって無機陰イオンの分離工程を実施しつ
つ、次測定の試料注入工程および除タンパク処理工程を
同時に実施することができる。従って、多数の生体試料
を順次測定する場合、１検体あたりの分析時間を大幅に
短縮することができる。

【００１８】本発明の分析方法および分析装置において
用いられるタンパク質保持カラム７の充填剤としては、
試料中に含まれるタンパク質を保持することができ、か
つ無機陰イオンを殆ど保持しない充填剤であるヒドロキ
シアパタイトに限定される。ヒドロキシアパタイトは、
歯や骨の無機成分と同じ化学組成を有し、生体親和性に
優れた材料として知られており、クロマトグラフィー用
の充填剤としては、医学や生化学分野でタンパク質、核
酸、酵素等の高分子物質の分離や精製に使用されてい
る。本発明で用い得るヒドロキシアパタイトについて
は、比表面積、細孔分布およびカルシウムとリン酸の比
（Ｃａ／Ｐ比）等は特に問わないが、生体試料の不可逆
的吸着がなく、カラム化したときに通液できる形状や粒
径および通液したときにつぶれない程度の機械的強度を
有するものを用いることが必要である。陰イオン分析カ
ラム３の充填剤としては、無機陰イオンを分離できる充
填剤であれば任意のものを用いることができる。たとえ
ば、官能基として第４級アンモニウム基が導入されたイ
オン交換体を挙げることができる。具体的には、イオン
クロマトグラフィー用陰イオン分析用カラムとして、種
々のメーカーから市販されているものを用いることがで
きる。

【００１９】陰イオン保持カラム８の充填剤としては、
上記陰イオン分析カラム３の充填剤と同一の充填剤、あ
るいは陰イオン分析カラム３で用いた充填剤よりも保持
力が弱い充填剤を用いればよい。検出手段４としては、
測定対象物質である各種無機陰イオンを検出できるもの
を適宜選択することができる。イオンクロマトグラフィ
ーでは、電気伝導度検出器を使用するのが一般的であ
る。無機陰イオンのうち、亜硝酸イオンや硝酸イオンの
ように紫外吸収を有するものを分析する場合には、紫外
吸光度検出器を使用することも可能である。

【００２０】除タンパク用移動相としては、ヒドロキシ
アパタイトが充填されたタンパク質保持カラム７におい
てタンパク質だけを保持させ、無機陰イオンを保持させ
ないものを用いることが必要であり、例えば、濃度が１
０ｍＭ以下のリン酸緩衝液あるいは脱イオン水が用いら
れ、洗浄用移動相としては、タンパク質保持カラムに保
持されているタンパク質を溶出し得るものを用いること
が必要であり、例えば、濃度が１００ｍＭ以上、６００
ｍＭ以下のリン酸緩衝液が用いられる。

【００２１】分析用移動相としては、陰イオン保持カラ
ム８に保持されている無機陰イオンを溶出することがで
き、陰イオン分析カラム３で各陰イオンに分離できるも
のが用いられる。例えば濃度が０．１ｍＭ以上、５０ｍ
Ｍ以下の緩衝液が用いられる。

【００２２】

【実施例の説明】図２は、本発明の一実施例の無機陰イ
オン分析装置を示す構成図である。図２において、第１
流路Ａには、分析用移動相１１が貯留された移動相容器
１１ａおよび送液ポンプ１２からなる第１移動相送液手
段、流路切換手段としての高圧流路切換バルブ１３、陰
イオン分析カラム１４並びに検出器１５がこの順序で直
列に接続されている。また、第２流路Ｂの基端部には低
圧流路切換バルブ１６が接続されている。低圧流路切換
バルブ１６には、除タンパク用移動相１７またはタンパ
ク質脱着（洗浄）用移動相１８が供給されるように、移
動相容器１７ａ，１８ａが接続されている。低圧流路切
換バルブ１６の下流側には送液ポンプ１９が接続されて
いる。除タンパク用移動相１７、移動相容器１７ａ、タ
ンパク質脱着用移動相１８、移動相容器１８ａ、低圧流
路切換バルブ１６および送液ポンプ１９により第２移動
相送液手段が構成されている。送液ポンプ１９の下流側
には、試料注入手段としてのインジェクター２０が接続
されている。インジェクター２０の下流側には、タンパ
ク質保持カラムとしてのヒドロキシアパタイト充填カラ
ム２１が接続されており、該ヒドロキシアパタイト充填
カラム２１の下流側は、高圧流路切換バルブ１３に接続
されている。

【００２３】また、陰イオン保持カラム２２が高圧流路
切換バルブ１３のポートｈ，ｋ間に接続されている。高
圧流路切換バルブ１３は、六方バルブで構成されてお
り、上記ヒドロキシアパタイト充填カラム２１の出口側
が、該六方バルブのポートｇに接続されている。また、
第１流路Ａ中の送液ポンプ１２の下流側がポートｉに、
陰イオン分析カラム１４の入口側がポートｊに接続され
ている。上記高圧流路切換バルブ１３の各ポートｇ〜ｌ
間は、図示の実線で示す接続状態Ｉと、破線で示す接続
状態IIとに切換られるように構成されている。

【００２４】なお、２３はデータ処理器を示し、検出器
１５で得られる検出量から測定値を計算するために設け
られている。また、図示しないコントローラーにより、
送液ポンプ１２，１９のオン・オフ、低圧流路切換バル
ブ１６の切り換え、インジェクター２０の動作、高圧流
路切換バルブ１３の切り換え、検出器１５の動作等が制
御される。

【００２５】次に、図２に示した実施例の分析装置を用
いて行った具体的な実験例につき説明する。使用した各
装置は以下の通りである。 送液ポンプ１２，１９…島津製作所製ＬＣ−９Ａ インジェクター２０ …島津製作所製ＳＩＬ−６Ｂ 検出器１５ …島津製作所製、紫外吸光度検出器（ＳＰＤ−６ＡＶ） 低圧流路切換バルプ１６…積水化学工業社製ＳＧＲ−７２０ 高圧流路切換バルブ１３…島津製作所製ＦＣＶ−２ＡＨ データ処理器２３ …島津製作所製Ｃ−Ｒ３Ａ コントローラー …島津製作所製ＳＣＬ−６Ｂ ヒドロキシアパタイト充填カラム２１ …三井東圧化学社製ヒドロキシアパタイト充填カラム ＨＣＡ−Ｃｏｌｕｍｎ Ａ−４００７，（カラム径 ４．０ｍｍ×長さ７５ｍｍ） 陰イオン分析カラム１４…日本ミリポア社製ＩＣ−Ｐａｋ Ａｎｉｏｎ 陰イオン保持カラム２２…東ソー社製ＩＣ−Ｃｏｎｃ−Ａ（イオン交換基は第 ４級アンモニウム基） また、使用した移動相は、以下の通りである。

【００２６】 除タンパク用移動相１７…脱イオン水（比抵抗１６ＭΩ−ｃｍ） タンパク質脱着（洗浄）用移動相１８ …３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８） 分析用移動相１１…２ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８） また、上記各移動相の送液速度は、以下の通りとした。
分析用移動相１１については１．２ｍｌ／分、除タンパ
ク用移動相１７については１．０ｍｌ／分、タンパク質
脱着用移動相１８については１．０ｍｌ／分とした。

【００２７】測定にあたっては、高圧流路切換バルブ１
３の接続状態および送液ポンプ１９で送液する第２移動
相の種類を下記の表１に示すように時間と共に切り換え
た。

【００２８】

【表１】

【００２９】測定に際しては、先ず亜硝酸イオン濃度が
５ｐｐｍおよび硝酸イオン濃度が５ｐｐｍの標準試料を
用意し、波長を２２０ｎｍ、注入量を１０μｌとして上
記条件で測定した。検量線は一点検量線法（ピーク面積
値で計算）により作成した。結果を、図３に示す。次
に、生体試料を用いた実施例を説明する。実施例 健常人の血液を、分離剤入り真空採血管（積水化学工業
社製、インセパックＳＩ−０７０６Ｓ）を用いて採血
し、凝固後、遠心分離し血清を得た。得られた血清のう
ち、２００μｌを試料瓶に採取し、インジェクター２０
にセットした。次に、標準試料を測定した場合と同一の
測定条件に従って測定を行った。なお、血清試料の注入
量は１０μｌとした。結果を、図４に示す。比較例１ 実施例１で用いた血清と、脱イオン水とを容量比で１対
１の割合で混合し、混合試料１ｍｌを限外濾過膜（ミリ
ポア社製、モルカットII、ＬＧＣ分画分子量１万）によ
り除タンパク処理した。濾過液０．５ｍｌを得るのに１
７分を要した。次に、この濾過液を試料として注入量を
２０μｌに設定して、実施例１と同様に測定を行った。
結果を、図５に示す。

【００３０】実施例１および比較例１では、実質的に
は、同じ量の血清を注入したことになるが、図４および
図５の結果の比較から明らかなように、亜硝酸イオンお
よび硝酸イオンの２つピークがいずれにおいても同じよ
うに分離されていることが分かる。従って、実施例１に
よれば、予め別工程により除タンパク処理を行わずと
も、血清試料中の硝酸イオンおよび亜硝酸イオンを正確
に測定し得ることが分かる。

【００３１】

【発明の効果】以上のように、本発明の無機陰イオン分
析方法および装置によれば、ヒドロキシアパタイトが充
填されたタンパク質保持カラムにおいてタンパク質が除
去されるため、生体試料を予め別途の工程で除タンパク
処理を行う必要がない。すなわち、除タンパク処理の自
動化を図ることができる。

【００３２】よって、従来の限外濾過法による除タンパ
ク処理を用いた方法に比べて、極めて短時間でタンパク
質を除去することができ、ひいては分析方法全体に要す
る時間を大幅に短縮することができる。また、本発明の
分析装置では、陰イオン保持カラムの接続状態を、流路
切換手段で切り換えることにより、陰イオン保持カラム
における無機陰イオンの検出と並行してタンパク質保持
カラムの再生を行うことができるため、連続測定の際の
測定時間を大幅に短縮することができると共に、分析方
法の自動化も容易となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の無機陰イオン分析方法および装置の概
略を説明するための概略構成図である。

【図２】実施例の無機陰イオンの分析装置の構成図であ
る。

【図３】標準試料のクロマトグラムを示す図である。

【図４】実施例１で亜硝酸イオンおよび硝酸イオンを分
析した場合のクロマトグラムを示す図である。

【図５】比較例１において亜硝酸イオンおよび硝酸イオ
ンを分析した場合のクロマトグラムを示す図である。

【符号の説明】 １ … 第１移動相送液手段 ２ … 流路切換手段 ３ … 陰イオン分析カラム ４ … 検出手段 ５ … 第２移動相送液手段 ６ … 試料注入手段 ７ … タンパク質保持カラム ８ … 陰イオン保持カラム Ａ … 第１流路 Ｂ … 第２流路

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 液体クロマトグラフィーによって、生体
   試料中の無機陰イオンを分析する方法であって、 除タンパク用移動相により試料中の無機陰イオンを保持
   させることなく試料中のタンパク質成分をヒドロキシア
   パタイトが充填されたタンパク質保持カラムに保持さ
   せ、試料中の無機陰イオンをタンパク質保持カラムより
   も下流に配置された陰イオン保持カラムに保持させる工
   程と、 分析用移動相により、陰イオン保持カラムから無機陰イ
   オンを脱着させて陰イオン分析カラムに導き、該陰イオ
   ン分析カラムで無機陰イオンを分離する工程とを備える
   ことを特徴とする無機陰イオンの分析方法。
2. 【請求項２】 第１移動相送液手段、流路切換手段、陰
   イオン分析カラムおよび検出手段がこの順序で直列に接
   続された第１流路と、 第２移動相送液手段、試料注入手段およびヒドロキシア
   パタイトが充填されたタンパク質保持カラムが直列に接
   続されており、該タンパク質保持カラムの下流端が前記
   流路切換手段に接続された第２流路と、 前記流路切換手段に入口側および出口側が接続された陰
   イオン保持カラムとを備え、 前記流路切換手段が、前記陰イオン保持カラムを第２流
   路の下流端に接続した状態と、前記陰イオン保持カラム
   を第１流路に接続した状態とを切り換え得るように構成
   されていることを特徴とする無機陰イオン分析装置。