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JP2558956B2 - Immunological assay method for human osteocalcin, reagent and kit therefor, antibody against human osteocalcin, hybridoma producing the same, and method for producing the same - Google Patents

Immunological assay method for human osteocalcin, reagent and kit therefor, antibody against human osteocalcin, hybridoma producing the same, and method for producing the same

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Publication number
JP2558956B2
JP2558956B2 JP2503017A JP50301790A JP2558956B2 JP 2558956 B2 JP2558956 B2 JP 2558956B2 JP 2503017 A JP2503017 A JP 2503017A JP 50301790 A JP50301790 A JP 50301790A JP 2558956 B2 JP2558956 B2 JP 2558956B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
osteocalcin
human osteocalcin
human
recognition site
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2503017A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
健治 細田
仁美 本田
貴明 窪田
安彦 増保
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Teijin Ltd
Original Assignee
Teijin Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Teijin Ltd filed Critical Teijin Ltd
Priority to JP2503017A priority Critical patent/JP2558956B2/en
Application granted granted Critical
Publication of JP2558956B2 publication Critical patent/JP2558956B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、例えば骨の代謝の状態を診断することが可
能なヒト検体中のヒト・オステオカルシンの免疫学的測
定方法、そのための試薬及びキツト、ヒト・オステオカ
ルシンに対する抗体、それを産生するハイブリドーマ、
その産生方法及びその抗体を利用する一連の技術に関す
る。更に詳しくは本発明は、ヒト検体中に含まれる極め
て微量の完全ヒト・オステオカルシンまたはそのフラグ
メントのいずれも区別して測定しうる一連の技術に関す
る。
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for immunologically measuring human osteocalcin in a human sample, which is capable of diagnosing the state of bone metabolism, reagents and kits therefor, and human osteocalcin. An antibody, a hybridoma that produces it,
The present invention relates to a production method and a series of techniques utilizing the antibody. More specifically, the present invention relates to a series of techniques capable of discriminating and measuring extremely trace amounts of completely human osteocalcin or a fragment thereof contained in a human sample.

背景の技術 オステオカルシンは、bone gla protein(BGP)と称
される、ビタミンK依存性の骨カルシウム結合性タンパ
クである。殊にヒト・オステオカルシンは5800の分子量
を有し、49のアミノ酸より構成されている比較的小さい
タンパクである。
BACKGROUND ART Osteocalcin is a vitamin K-dependent bone calcium-binding protein called bone gla protein (BGP). In particular, human osteocalcin has a molecular weight of 5800 and is a relatively small protein composed of 49 amino acids.

このタンパクは、オステオブラスト(骨芽球)から産
生され、骨の非コラーゲンタンパクの構成成分の約20%
を占めている。このタンパクにはγ−carboxyglutamic
acid residuesがあり、ハイドロキシアパタイトと強い
アフイニテイがあり、それゆえに骨マトリツクス形成に
重要な役割を有しているものと推定されている。
This protein is produced by osteoblasts (osteoblasts) and accounts for about 20% of the non-collagen protein component of bone.
Occupy. This protein contains γ-carboxyglutamic
It has acid residues, has hydroxyapatite and strong affinity, and is therefore presumed to have an important role in bone matrix formation.

このオステオカルシンは、最初ニワトリ及び牛の骨か
ら見い出された(Proc.Nat.Acad.Soi.USA Vol.72、No.1
0 pp3925−3929(October 1975)及び同Vol.73、No.5、
pp1447−1451、(May 1976)]。次いでヒト・オステオ
カルシンが分離されそのアミノ酸配列も決定された[Th
e Journal of Biological Chemistry Vol.255、No.18、
pp8685−8691、(1980)]。この文献には、ヒト・オス
テオカルシンのアミノ酸配列がウシ(Calf)及びメカジ
キ(Swordfish)のオステオカルシンのアミノ酸配列と
対比して示され、これらのオステオカルシンは可成り類
似した構造であることが示されている。
This osteocalcin was first found in chicken and cow bones (Proc.Nat.Acad.Soi.USA Vol.72, No.1).
0 pp3925-3929 (October 1975) and Vol.73, No.5,
pp1447-1451, (May 1976)]. Next, human osteocalcin was isolated and its amino acid sequence was also determined [Th
e Journal of Biological Chemistry Vol.255, No.18,
pp8685-8691, (1980)]. In this document, the amino acid sequence of human osteocalcin is shown in comparison with the amino acid sequences of bovine (Calf) and swordfish (Swordfish) osteocalcin, and it is shown that these osteocalcins have fairly similar structures. .

一方ヒト・オステオカルシンの測定について下記の報
告がなされている。
On the other hand, the following reports have been made on the measurement of human osteocalcin.

(1)Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.77、No.4,pp2234−
2238(1980);P.A.Priceらは、この文献において、ウシ
・オステオカルシンに対するウサギ抗体を用いてラジオ
イムノアツセイ法によるヒトプラズマ中のヒト・オステ
オカルシンの測定について報告し、このウサギ抗体は、
ウシ・オステオカルシンのC末端領域を認識しているこ
とも報告している。
(1) Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.77, No.4, pp2234-
2238 (1980); PAPrice et al. In this reference reported the measurement of human osteocalcin in human plasma by the radioimmunoassay method using a rabbit antibody against bovine osteocalcin, which rabbit antibody
It also reports that it recognizes the C-terminal region of bovine osteocalcin.

(2)J.Clin.Invest.Vol.66、pp878−883(1980); P.A.Priceらは、この文献において、前記文献と同様
にウシ・オステオカルシンに対するウサギ抗体を用い
て、ラジオイムノアツセイ法により、ヒトプラズマ中の
ヒト・オステオカルシンを測定し、骨の病気の患者は、
健常人と比べてオステオカルシン量が増加していること
を認めている。
(2) J. Clin. Invest. Vol. 66, pp878-883 (1980); PAPrice et al., In this document, using a rabbit antibody against bovine osteocalcin in the same manner as in the above document, by a radioimmunoassay method, Human osteocalcin in human plasma was measured, and patients with bone disease
It is admitted that the amount of osteocalcin is increased as compared with the healthy person.

(3)J.Clin.Invest.Vol.71、pp1316−1321(1983); P.D.Delmasらは、この文献において、女性の年令とオ
ステオカルシンの量の関係を調べ、年令の増加と共にオ
ステオカルシンの増加が認められることを示している。
この文献においては、ヒト・オステオカルシンの測定
は、前記(1)のP.A.Priceらと同じウサギ抗体を使用
する方法で行ったことが記載されている。
(3) J. Clin. Invest. Vol. 71, pp1316-1321 (1983); PD Delmas et al. Investigated the relationship between female age and the amount of osteocalcin in this document, and found that osteocalcin increased with age. It shows that it is recognized.
This document describes that the measurement of human osteocalcin was carried out by the method using the same rabbit antibody as in PAPrice et al. (1) above.

(4)Bone 、9−13(1985); B.D.Catherwoodらは、健常人における年令とオステオ
カルシンの量について調べ、年令の増加と共に少しずつ
減少していることを報告している。そしてこの文献の方
法では、ヒト・オステオカルシンのC末端の37−49のア
ミノ酸配列のペプチドを合成し、このペプチドを用いて
抗体を調製し、得られた抗体を利用して競合法によるラ
ジオイムノアツセイにより、ヒト・オステオカルシンを
測定している。
(4) Bone 6 , 9-13 (1985); BD Catherwood et al. Investigated the amounts of age and osteocalcin in healthy individuals and reported that they gradually decreased with increasing age. In the method of this document, a peptide having a C-terminal 37-49 amino acid sequence of human osteocalcin was synthesized, an antibody was prepared using this peptide, and the obtained antibody was used to perform a radioimmunoassay by a competitive method. According to Sei, human osteocalcin is measured.

(5)日本特許公開昭63−209596及び同平1−160493号
公報; これらの特許公報には、ウシのオステオカルシンに対
するいくつかのモノクローナル抗体及びその利用につい
て記載され、殊にC末端45(Phe)−49(Val)を認識す
るモノクローナル抗体及び中間体のアミノ酸領域21(Gl
e)−30(Asp)を認識するモノクローナル抗体を用い
て、サンドイツチ法によるヒト・オステオカルシンの測
定方法について記載されている。したがって、この方法
も、ウシとヒトのオステオカルシンの共通アミノ酸配列
を利用して、ウシ・オステオカルシンに対する抗体を用
いて測定系を構成し、ヒトの血中系の測定系を行ってい
ることになる。
(5) Japanese Patent Publication No. Sho 63-209596 and Japanese Patent Laid-Open No. 160493/160493; these patent publications describe several monoclonal antibodies against bovine osteocalcin and their use, especially C-terminal 45 (Phe). Amino acid region 21 (Gl of the monoclonal antibody and intermediate that recognizes -49 (Val))
e) A method for measuring human osteocalcin by the Sangerci method using a monoclonal antibody that recognizes -30 (Asp) is described. Therefore, this method also uses the common amino acid sequence of bovine and human osteocalcin to construct a measurement system using an antibody against bovine osteocalcin to perform a human blood system measurement system.

発明が解決しようとする課題 しかしながら、前記した従来の測定方法は、それぞれ
いくつかの問題点をかかえている。すなわち、前記
(1)〜(3)の文献における問題点の第1は、ウシと
の共通な部分に対する抗体を用いているために誤った結
果が得られる可能性があることである。この根拠とし
て、Posterら(J.B.C.,255,8685(1980))が、immunoa
ffinity columnを用いて証明しているように、他の動物
の骨中のオステオカルシン量と比較すると、ヒトの骨中
ののオステオカルシンの含有率は非常に少なく、ヒトの
オステオカルシンが他の動物のオステオカルシンと立体
構造や生理的役割が異なる可能性が示唆されているから
である。
DISCLOSURE OF THE INVENTION Problems to be Solved by the Invention However, the above-mentioned conventional measuring methods have some problems, respectively. That is, the first problem in the documents (1) to (3) is that an erroneous result may be obtained because an antibody against a common portion with bovine is used. As a basis for this, Poster et al. (JBC, 255,8685 (1980))
As demonstrated by using the affinity column, the content of osteocalcin in human bone is very low compared to the amount of osteocalcin in bones of other animals, and human osteocalcin is This is because it is suggested that the three-dimensional structure and physiological role may be different.

動物のオステオカルシンとヒトのオステオカルシンの
アミノ酸配列が類似していても、抗原の立体構造が異な
れば、動物のオステオカルシンの免疫により得られた抗
体がヒトのオステオカルシンと完全な交叉反応性を有す
るとは限らず、特に、ヒト血清中に存在するオステオカ
ルシンの量を正確に検出することが困難であろうと推定
され、従来の方法ではヒト・オステオカルシンの生理学
的意義を正確に反映しえないことになる。
Even if the amino acid sequences of animal osteocalcin and human osteocalcin are similar, if the three-dimensional structure of the antigen is different, the antibody obtained by immunization of animal osteocalcin may not have complete cross-reactivity with human osteocalcin. In particular, it is presumed that it will be difficult to accurately detect the amount of osteocalcin present in human serum, and the conventional method cannot accurately reflect the physiological significance of human osteocalcin.

さらに、ヒトとウシのオステオカルシンの立体構造が
異なるであろうと推定される根拠には、ヒトとウシのN
末端17残基目が前者のGluに対し後者がGlaと相違する点
にもある。
Furthermore, the reason why the three-dimensional structures of human and bovine osteocalcin may be different is based on N and human.
The terminal 17th residue is different from the former Glu, whereas the latter is different from Gla.

Glaは、γ−カルボキシグルタミン酸転移酵素によっ
てGluから生合成されるが、オステオカルシンにおける
そのメカニズムは、オステオカルシンの前駆体タンパク
のN端側に、その酵素が結合し、タンパク表面にあるGl
uをGlaに変換することによる。ヒトのN末端17残基のみ
が、他の動物由来のそれと異なりGluであることから、
他の動物のオステオカルシンの17Glaと異なりGla転移酵
素による作用がおよばない立体配置に17Gluがあること
が推定され、それゆえヒト・オステオカルシンは、ウシ
・オステオカルシン等と立体構造が異なることが推定さ
れる。
Gla is biosynthesized from Glu by γ-carboxyglutamyltransferase, and its mechanism in osteocalcin is that the enzyme binds to the N-terminal side of the osteocalcin precursor protein, and Gl is present on the protein surface.
By converting u to Gla. Since only the human N-terminal 17 residues are Glu unlike those derived from other animals,
Unlike 17Gla of osteocalcin of other animals, it is presumed that 17Glu exists in the configuration that is not affected by the Gla transferase, and therefore human osteocalcin is presumed to have a different stereostructure from bovine osteocalcin and the like.

従来の測定法の問題点の第2は、その免疫学的測定手
段にある。すなわち、ヒト検体中のヒト・オステオカル
シンの含有量は極めて微量であり、例えば健常人の血清
中のオステオカルシンの濃度は、約1〜10ng/ml程度で
ありまたは腎疾患や骨粗鬆症などの患者のそれは数10ng
/ml程度であって、このような微量のオステオカルシン
を正確に測定するためには、高感度の測定系を確立する
必要がある。ところが前記Priceらの方法及びCatherwoo
dらの方法は、いわゆる放射性物質を用いる競合法であ
り、そのため再現性、感度が問題になる。なぜなら競合
法は、その設定条件が非常に難しく、それゆえに競合法
によって構成された測定系は再現性が良くないからであ
る。特異性に関しても、1種の抗体を用いることから、
その1種の抗体のみにその特異性が依存し、それゆえ特
異性も低いことが多い。
The second problem of the conventional measuring method is the immunological measuring means. That is, the content of human osteocalcin in a human sample is extremely small, for example, the concentration of osteocalcin in serum of a healthy person is about 1 to 10 ng / ml, or that of patients with renal disease or osteoporosis 10 ng
It is about / ml, and it is necessary to establish a highly sensitive measurement system in order to accurately measure such a small amount of osteocalcin. However, the method of Price et al. And Catherwoo
The method of d et al. is a competitive method using a so-called radioactive substance, and therefore reproducibility and sensitivity are problems. This is because the competitive method is very difficult to set, and therefore the measurement system constituted by the competitive method is not reproducible. Regarding specificity, since one type of antibody is used,
The specificity depends only on that one antibody and is therefore often low.

また感度に関しても、ラベル抗原との微妙な競合法を
採用するため、サンドイツチ法に比べて、感度の低下は
いなめない。
Regarding the sensitivity, the delicate competitive method with the labeled antigen is adopted, and therefore the decrease in sensitivity is less than that of the Sangerci method.

これに対して前記(5)の日本特許公開公報に記載さ
れたウシのオステオカルシンに対するモノクローナル抗
体を用いるサンドイッチ法による測定方法は、従前の競
合法に比べれば優れた方法ではあるが、その方法は大き
な欠点を有している。すなわち、このサンドイツチ法で
は、オステオカルシンの中間領域のアミノ酸配列を認識
するモノクローナル抗体とC末端領域のアミノ酸配列を
認識するモノクローナル抗体を組合せて使用している
が、この方法では高感度でオステオカルシンを測定する
ことは困難である。その理由はオステオカルシンは49個
のアミノ酸から構成される比較的小さいペプチドである
ことから考えて、前記2つのモノクローナル抗体はそれ
らの抗原決定部位が互いに近すぎることによるものと考
えられる。
On the other hand, the measuring method by the sandwich method using the monoclonal antibody against bovine osteocalcin described in the above-mentioned Japanese Patent Publication (5) is an excellent method as compared with the conventional competitive method, but the method is large. It has drawbacks. That is, in this Sangerti method, a monoclonal antibody that recognizes the amino acid sequence of the intermediate region of osteocalcin and a monoclonal antibody that recognizes the amino acid sequence of the C-terminal region are used in combination, but this method measures osteocalcin with high sensitivity. Is difficult. The reason is considered to be that osteocalcin is a relatively small peptide composed of 49 amino acids, and it is considered that the antigen determination sites of the two monoclonal antibodies are too close to each other.

さらに前記した公知の測定方法は、他の重要な問題を
有している。というのは従来の測定方法ではヒト検体中
の完全(intact)オステオカルシンをそのフラグメント
と区別して測定し得ないことである。すなわち、従来の
測定方法ではその測定系及びそれに使用される抗体の特
徴から考えて、完全オステオカルシン及びそのフラグメ
ントの一部を区別せず合計として、測定している。
Furthermore, the known measuring method described above has another important problem. This is because it is impossible to measure the intact osteocalcin in a human specimen by distinguishing it from the fragment by the conventional measuring method. That is, in the conventional measuring method, in consideration of the characteristics of the measuring system and the antibody used therefor, the total osteocalcin and a part of the fragment thereof are measured as a total without distinction.

ヒト検体中の完全オステオカルシンとそのフラグメン
トを区別して、それぞれを正確に測定することは、患者
の病態、その進行状態、治療完治の判断などに重要な目
安となることが最近の研究により明らかとなっている。
Recent studies have revealed that distinguishing between complete osteocalcin and its fragments in human specimens and accurately measuring each can be an important indicator for the patient's pathology, its progress, and judgment of complete treatment. ing.

すなわち、オステオカルシンはビタミンKの作用によ
りγ−カルボキシル化され骨形成に関与しており、一方
骨吸収時にはオステオカルシンは大部分いくつかの分割
されたフラグメントの形で溶出する可能性があることが
報告されている[J.Clin.Invest.Vol.77、pp1762−1767
(1986)]。従ってヒト検体中の完全オステオカルシン
及びそのフラグメントのそれぞれを正確に測定すること
によって、患者の病態が吸収或いは骨形成のいずれの傾
向にあるのかを正しく判断する目安とすることができ
る。
That is, it was reported that osteocalcin is involved in bone formation by being γ-carboxylated by the action of vitamin K, while osteocalcin may be mostly eluted in the form of several divided fragments during bone resorption. [J.Clin.Invest.Vol.77, pp1762-1767
(1986)]. Therefore, by accurately measuring each of complete osteocalcin and its fragments in a human sample, it can be used as a standard for correctly judging whether the pathological condition of the patient is the tendency of absorption or bone formation.

前記した従来公知のオステオカルシンの測定方法は、
測定感度自体に前記した欠点を有しているばかりでな
く、完全オステオカルシンのみを正確に測定し得ないの
みならず、そのフラグメントを選択的に測定する方法と
しても適していないということができる。
The above-mentioned conventionally known method for measuring osteocalcin is
Not only does the measurement sensitivity itself have the above-mentioned drawbacks, but not only complete osteocalcin cannot be accurately measured, but also it is not suitable as a method for selectively measuring its fragments.

そこで本発明の第1の目的は、ヒト検体中の完全オス
テオカルシンを高感度で測定するための免疫学的測定方
法、試薬及びキツトを提供することにある。
Therefore, a first object of the present invention is to provide an immunological measuring method, a reagent and a kit for measuring complete osteocalcin in a human specimen with high sensitivity.

本発明は第2の目的は、ヒト検体中の完全ヒト・オス
テオカルシン及びそのフラグメントを合せて高感度で測
定するための免疫学的測定方法、試薬及びキツトを提供
することにある。
A second object of the present invention is to provide an immunological assay method, reagent and kit for assaying fully human osteocalcin and its fragments in a human sample with high sensitivity.

本発明の他の目的は、ヒト検体中のオステオカルシン
のフラグメントを高感度で測定するための免疫学的測定
方法を提供することにある。
Another object of the present invention is to provide an immunoassay method for highly sensitively measuring a fragment of osteocalcin in a human sample.

本発明のさらに他の目的は、ヒト検体或いは完全ヒト
・オステオカルシンを含有している試料中から、完全ヒ
ト・オステオカルシンを高純度で分離するための免疫学
的方法及びその方法に用いられる免疫吸着体を提供する
ことにある。
Still another object of the present invention is an immunological method for separating fully human osteocalcin with high purity from a human sample or a sample containing completely human osteocalcin and an immunoadsorbent used in the method. To provide.

本発明のさらに他の目的は、前記した測定方法、試
薬、キツト及び分離方法に使用しうるモノクローナル抗
体、及びポリクローナル抗体、これらを産生するハイブ
リドーマ、これら抗体の製造方法を提供することにあ
る。
Still another object of the present invention is to provide a monoclonal antibody and a polyclonal antibody which can be used in the above-mentioned assay method, reagent, kit and separation method, hybridomas producing them, and a method for producing these antibodies.

本発明のさらに他の目的は、以下の説明から一層明ら
かとなるであろう。
Still other objects of the present invention will become more apparent from the following description.

課題を解決するための手段 本発明者の研究によれば、前記本発明の目的及び利点
の一部は、下記完全ヒト・オステオカルシンの測定系
(I)、完全ヒト・オステオカルシン及びそのフラグメ
ントの合計量の測定系(II)及び完全ヒト・オステオカ
ルシン及びそのフラグメントの合計量の測定系(III)
によって達成されることが見出された。以下これらの測
定系のそれぞれについて説明する。
According to the study of the present inventor, some of the objects and advantages of the present invention are as follows: total human osteocalcin assay system (I), total human osteocalcin and total fragments thereof. System (II) and total human osteocalcin and its fragments (III)
Have been found to be achieved by. Each of these measurement systems will be described below.

完全ヒト・オステオカルシンの測定系(I); 本発明によれば、先ず、 ヒト検体中のヒト・オステオカルシンを固相抗体及び
標識抗体を使用して免疫学的に測定する方法において、 (1)一方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのN末端
側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有
するヒト・オステオカルシンに対する抗体またはそれと
同じ認識部位を有するそのフラグメント(N末端抗体)
であり、 (2)他方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのC末端
側36〜49のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有
するヒト・オステオカルシンに対する抗体またはそれと
同じ認識部位を有するそのフラグメント(C末端抗体)
であることを特徴とする完全ヒト・オステオカルシンの
免疫学的測定方法、そのための試薬及びキツトが提供さ
れる。
Complete Human Osteocalcin Assay System (I); According to the present invention, first, in a method for immunologically assaying human osteocalcin in a human sample using a solid phase antibody and a labeled antibody, (1) Is an antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site (N-terminal antibody)
(2) The other antibody is an antibody to human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of C-terminal 36 to 49 of human osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site (C Terminal antibody)
An immunological assay method for fully human osteocalcin, a reagent therefor, and a kit therefor are provided.

かかる測定系(I)によれば、検体中の完全ヒト・オ
ステオカルシンが選択的に且つ高感度に測定でき、ヒト
・オステオカルシンのフラグメントは測定されない。
According to this measurement system (I), fully human osteocalcin in a sample can be selectively and highly sensitively measured, and a human osteocalcin fragment is not measured.

本発明の前記測定系(I)の特徴は、ヒト・オステオ
カルシンの49個のアミノ酸配列において、そのN末端領
域及びC末端領域を認識する2種の抗体を組合せて使用
すること、殊にそれぞれの末端領域におけるアミノ酸配
列を決定したことにある。
The feature of the assay system (I) of the present invention is that two antibodies that recognize the N-terminal region and the C-terminal region of the 49 amino acid sequence of human osteocalcin are used in combination. The amino acid sequence in the terminal region has been determined.

すなわち一方の抗体は、ヒト・オステオカルシンのN
末端側(Tyr)〜20(Arg)位までのアミノ酸配列領域中
に特異的認識部位を有しており、他方の抗体は、ヒト・
オステオカルシンのC末端側36(Ile)〜49(Val)位ま
でのアミノ酸配列領域中に特異的認識部位を有してい
る。
That is, one antibody is N of human osteocalcin.
It has a specific recognition site in the amino acid sequence region from the terminal side (Tyr) to 20 (Arg) position, and the other antibody is human
It has a specific recognition site in the amino acid sequence region from the C-terminal 36 (Ile) to 49 (Val) of osteocalcin.

本発明の前記測定系(I)において、N末端側のアミ
ノ酸配列領域を特異的に認識する抗体(N末端抗体)
は、ヒト・オステオカルシンに対するモノクローナル抗
体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよく、ま
たそのフラグメントのいずれであってもよい。
In the measurement system (I) of the present invention, an antibody (N-terminal antibody) that specifically recognizes the amino acid sequence region on the N-terminal side
May be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody against human osteocalcin, or may be a fragment thereof.

なお本発明において、抗体のフラグメントとは、その
抗体と同等の認識部位(エピトープ)を有し、且つ同じ
ように抗原に対して親和力を有する抗体の断片を言い、
具体的にはその抗体がFab′、F(ab′)またはFacb
の各フラグメント、好ましくはFab′またはF(ab′)
フラグメントを意味する。
In the present invention, the term “antibody fragment” refers to a fragment of an antibody having a recognition site (epitope) equivalent to that of the antibody, and similarly having an affinity for an antigen,
Specifically, the antibody is Fab ′, F (ab ′) 2 or Facb
Of each fragment, preferably Fab 'or F (ab')
Means 2 fragments.

一方前記測定系(I)におけるC末端側のアミノ酸配
列領域を特異的に認識する抗体(C末端抗体)は、ヒト
・オステオカルシンに対するモノクローナル抗体及びポ
リクローナル抗体のいずれであってもよいが、ポリクロ
ーナル抗体であるのが好ましい。またこれら抗体はフラ
グメントであることもできる。殊にC末端抗体として
は、C末端側の40(Glu)〜49(Val)位までのアミノ酸
配列領域中に認識部位を有する抗体またはそのフラグメ
ントであるものが好ましい。
On the other hand, the antibody specifically recognizing the amino acid sequence region on the C-terminal side in the measurement system (I) (C-terminal antibody) may be either a monoclonal antibody against human osteocalcin or a polyclonal antibody. Preferably. These antibodies can also be fragments. In particular, the C-terminal antibody is preferably an antibody or a fragment thereof having a recognition site in the amino acid sequence region from 40 (Glu) to 49 (Val) on the C-terminal side.

前記測定系(I)においては、N末端抗体及びC末端
抗体のいずれもポリクローナル抗体またはそのフラグメ
ントであることが好ましい結果を与える。また標識抗体
がFab′またはF(ab′)フラグメントであるのが有
利であり、さらにその標識抗体は、酵素により標識化さ
れているのが望ましい。
In the measurement system (I), it is preferable that both the N-terminal antibody and the C-terminal antibody are polyclonal antibodies or fragments thereof. It is also advantageous that the labeled antibody is a Fab ′ or F (ab ′) 2 fragment, and the labeled antibody is preferably enzymatically labeled.

測定系(I)においては、固相抗体における抗体が、
ヒト・オステオカルシンのN末端側1〜20のアミノ酸配
列領域中に特異的な認識部位を有するヒト・オステオカ
ルシンに対するポリクローナル抗体であり、且つ標識抗
体における抗体がヒト・オステオカルシンのC末端側36
〜49のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有する
ヒト・オステオカルシンに対するポリクローナル抗体ま
たはそのF(ab′)フラグメントである組合が検体中
の完全ヒト・オステオカルシンの測定感度が最も高く優
れている。
In the measurement system (I), the antibody in the solid phase antibody is
A polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region 1 to 20 on the N-terminal side of human osteocalcin, and the antibody in the labeled antibody is the C-terminal side of human osteocalcin 36
The combination of a polyclonal antibody against human osteocalcin or a F (ab ′) 2 fragment thereof having a specific recognition site in the amino acid sequence region of ˜49 has the highest measurement sensitivity of fully human osteocalcin in the sample. .

この測定系(I)に使用されるモノクローナル抗体及
びポリクローナル抗体、これらの調製、並びに、試薬及
びキツトについては後に詳細に説明する。
The monoclonal and polyclonal antibodies used in this assay system (I), their preparation, reagents and kits will be described in detail later.

完全ヒト・オステオカルシン及びそのフラグメントの合
計量の測定系(II); さらに、本発明によれば、ヒト検体中のヒト・オステ
オカルシン及びそのフラグメントを固相抗体及び標識抗
体を使用して免疫学的に測定する方法において、 (1)一方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのN末端
側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有
するヒト・オステオカルシンに対するモノクローナル抗
体またはそれと同じ認識部位を有するそのフラグメント
であり、 (2)他方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのN末端
側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有
するヒト・オステオカルシンに対するポリクローナル抗
体またはそれと同じ認識部位を有するそのフラグメント
である、 ことを特徴とする完全ヒト・オステオカルシン及びその
フラグメントの合計量の免疫学的測定方法、そのための
試薬及びキツトが提供される。
A system for measuring the total amount of fully human osteocalcin and its fragments (II); Furthermore, according to the present invention, human osteocalcin and its fragments in a human specimen are immunologically analyzed using a solid phase antibody and a labeled antibody. In the method for measurement, (1) one antibody has a specific recognition site in the amino acid sequence region of N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin or a monoclonal antibody to human osteocalcin or the same recognition site as that (2) The other antibody is a polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of the N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site Complete human osteocalcal characterized by Methods of immunoassay for the total amount of syn and fragments thereof, reagents and kits therefor are provided.

かかる測定系(II)によれば、検体中の完全ヒト・オ
ステオカルシン及びそのフラグメントの合計量を高感度
で測定することができる。検体中の完全ヒト・オステオ
カルシン及びそのフラグメントの合計量は、それ自体、
患者の病態の状況を判断するフアクターである。しかし
この測定系(II)は、前記測定系(I)と組合せると、
それら測定値の差は、検体中のヒト・オステオカルシン
のフラグメントの量を示していることになるのでその意
味で価値がある。このフラグメント量は骨吸収の状況を
正確に把握しうるフアクターとなるものである。従来、
このフラグメントを選択的に完全ヒト・オステオカルシ
ンと区別して測定しうる測定系は知られていなかった。
According to this measurement system (II), the total amount of fully human osteocalcin and its fragments in a sample can be measured with high sensitivity. The total amount of fully human osteocalcin and its fragments in the sample itself is
It is a factor that determines the condition of a patient's pathology. However, when this measurement system (II) is combined with the measurement system (I),
The difference between the measured values is valuable in that sense because it indicates the amount of the human osteocalcin fragment in the sample. The amount of this fragment serves as a factor that can accurately grasp the state of bone resorption. Conventionally,
No assay system has been known that can selectively measure this fragment from fully human osteocalcin.

本発明の前記測定系(II)の特徴は、ヒト・オステオ
カルシンのN末端領域を認識するモノクローナル抗体及
びポリクローナル抗体を組合せて使用する点にある。
The feature of the measurement system (II) of the present invention is that a monoclonal antibody and a polyclonal antibody that recognize the N-terminal region of human osteocalcin are used in combination.

すなわち一方の抗体は、ヒト・オステオカルシンのN
末端側1(Tyr)〜20(Arg)位までのアミノ酸配列領域
中に特異的に認識部位を有するヒト・オステオカルシン
に対するモノクローナル抗体またはそのフラグメントで
あり、他方の抗体は、N末端側1〜20位のアミノ酸配列
領域中に認識部位を有するポリクローナル抗体またはそ
のフラグメントである。
That is, one antibody is N of human osteocalcin.
A monoclonal antibody against human osteocalcin or a fragment thereof having a recognition site specifically in the amino acid sequence region from the terminal side 1 (Tyr) to 20 (Arg) position, and the other antibody is located at the N terminal side 1 to 20 position. Is a polyclonal antibody having a recognition site in the amino acid sequence region of or a fragment thereof.

この測定系(II)においては、固相抗体が前記モノク
ローナル抗体またはそのフラグメントであり、標識抗体
が前記ポリクローナル抗体またはそのフラグメントであ
る組合せが好ましい。その標識抗体のポリクローナル抗
体はFab′またはF(ab′)フラグメントであるのが
有利であり、さらに標識抗体は酵素により標識化されて
いるのが望ましい。
In this measurement system (II), a combination in which the solid phase antibody is the above monoclonal antibody or a fragment thereof and the labeled antibody is the above polyclonal antibody or a fragment thereof is preferable. Advantageously, the polyclonal antibody of the labeled antibody is a Fab ′ or F (ab ′) 2 fragment, and preferably the labeled antibody is enzymatically labeled.

完全ヒト・オステオカルシン及びそのフラグメントの合
計量の測定系 (III); さらに、本発明によれば、ヒト検体中のヒト・オステ
オカルシン及びそのフラグメントを固相抗体及び標識抗
体を使用して免疫学的に測定する方法において、該固相
抗体及び標識抗体における抗体は、いずれもヒト・オス
テオカルシンのN末端側1〜20のアミノ酸配列領域中に
特異的な認識部位を有するヒト・オステオカルシンに対
するポリクローナル抗体またはそれと同じ認識部位を有
するそのフラグメントであることを特徴とする完全ヒト
・オステオカルシン及びそのフラグメントの合計量の免
疫学的測定方法、そのための試薬及びキツトが提供され
る。
System for measuring total amount of fully human osteocalcin and its fragments (III); Furthermore, according to the present invention, human osteocalcin and its fragments in human specimens can be immunologically analyzed using a solid phase antibody and a labeled antibody. In the method for measurement, the solid phase antibody and the antibody in the labeled antibody are both the same as the polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of the N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin or the same. There is provided a method for immunologically measuring the total amount of fully human osteocalcin and a fragment thereof, which is a fragment thereof having a recognition site, a reagent and a kit therefor.

かかる測定系(III)によれば、前記測定系(II)と
同様に、検体中の完全ヒト・オステオカルシン及びその
フラグメントの合計量が感度よく測定される。上記測定
系(III)は、固相抗体及び標識抗体はいずれもヒト・
オステオカルシンのN末端側1(Tyr)〜20(Arg)位ま
でのアミノ酸配列中に認識部位を有するポリクローナル
抗体またはそのフラグメントである。この測定系(II
I)において、標識抗体は、前記ポリクローナル抗体の
F(ab′)またはF(ab′)フラグメントであるのが
好ましく、また、その標識抗体は酵素により標識化され
ているのが一層好ましい。
According to this measurement system (III), the total amount of fully human osteocalcin and its fragments in a sample can be measured with high sensitivity, as in the measurement system (II). In the above measurement system (III), both the solid phase antibody and the labeled antibody are human.
It is a polyclonal antibody or a fragment thereof having a recognition site in the amino acid sequence from the N-terminal side 1 (Tyr) to 20 (Arg) of osteocalcin. This measurement system (II
In I), the labeled antibody is preferably an F (ab ′) or F (ab ′) 2 fragment of the polyclonal antibody, and more preferably the labeled antibody is enzymatically labeled.

測定系(I)〜(III)の好ましい態様 本発明の測定系(I)〜(III)において、使用され
る固相抗体及び標識抗体の組合せ、その組合せの効果及
び特徴については前述した通りであるが、次に前述した
抗体またはそのフラグメントを組合せて使用し、ヒト検
体中の完全ヒト・オステオカルシン及び/またはそのフ
ラグメントを測定する方法、試薬及びキツトに関し、具
体的手段及び好ましい態様について更に詳しく説明す
る。以下の説明は特に断わらない限り測定系(I)〜
(III)に共通した手段及び態様である。
Preferred Embodiments of Measurement Systems (I) to (III) In the measurement systems (I) to (III) of the present invention, the combination of the solid phase antibody and the labeled antibody used, and the effects and characteristics of the combination are as described above. However, the specific means and preferred embodiments of the method, reagent and kit for measuring fully human osteocalcin and / or fragments thereof in a human sample by using the above-mentioned antibodies or fragments thereof in combination are described in more detail below. To do. Unless otherwise specified, the following description is based on the measurement system (I)-
It is means and modes common to (III).

(i)ヒト検体 本発明によるヒト・オステオカルシンまたはそのフラ
グメントの測定に適用されるヒト検体は、これらが含ま
れているヒト検体であれば種々のものでよいが、一般に
は血清、血漿、尿またはこれらと同等物であるのが好ま
しい。とりわけ血清であるのが最も好ましい。
(I) Human Specimen The human specimen applied to the measurement of human osteocalcin or a fragment thereof according to the present invention may be any human specimen containing these, but in general, serum, plasma, urine or It is preferable that these are equivalent. Most preferably, it is serum.

(ii)測定手段 前記した各測定系において、それぞれの抗体及びその
フラグメントを組合せて使用する限り、それ自体良く知
られた免疫学的測定方法(所謂サンドイツチ法)が採用
され、その方法は、一段法であってもよくまた二段法で
あってもよい。
(Ii) Measuring means As long as the respective antibodies and fragments thereof are used in combination in each of the above-mentioned measuring systems, a well-known immunological measuring method (so-called Sangertisch method) is adopted, and the method is It may be a method or a two-step method.

以下その一態様について説明する。 One aspect thereof will be described below.

ヒト・オステオカルシンに対する一方の抗体(第1抗
体)を適当な不溶性担体(例えばプラスチツク容器)に
固定化する(以下これを“固定化抗体”という)。つい
で不溶性担体と測定しようとする試薬または検体試料と
の非特異的結合を避けるために適当な物質(例えば牛血
清アルブミン)で不溶性担体の表面を被覆する。このよ
うにして得られた第1抗体が固定化された不溶性担体を
検体試料と一定時間及び温度で接触させ反応させる。こ
の間に固相抗体(第1抗体)と検体中のヒト・オステオ
カルシン及びそのフラグメントが結合する。ついで適当
な洗浄液で洗った後、適当な標識物質(例えば酵素)で
標識したヒト・オステオカルシンに対する他方の抗体
(第2抗体)の溶液(例えば水溶液)を、不溶性担体に
おける固相抗体に結合したヒト・オステオカルシン及び
そのフラグメントと一定時間及び温度で接触させ第2抗
体と反応させる。これを適当な洗浄液で洗い、次いで不
溶性担体上の固相抗体とヒト・オステオカルシン及びそ
のフラグメントを介して結合して存在する第2抗体に標
識された標識物質の量を測定する。
One antibody against human osteocalcin (first antibody) is immobilized on an appropriate insoluble carrier (for example, plastic container) (hereinafter, this is referred to as "immobilized antibody"). Then, the surface of the insoluble carrier is coated with a suitable substance (for example, bovine serum albumin) in order to avoid nonspecific binding between the insoluble carrier and the reagent or sample to be measured. The thus obtained insoluble carrier on which the first antibody is immobilized is brought into contact with a sample for a certain period of time and temperature to react. During this period, the solid phase antibody (first antibody) is bound to human osteocalcin and its fragment in the sample. Then, after washing with an appropriate washing solution, a solution (eg, an aqueous solution) of the other antibody (second antibody) against human osteocalcin labeled with an appropriate labeling substance (eg, enzyme) is bound to the solid phase antibody in the insoluble carrier. -Contact with osteocalcin and its fragment for a certain period of time and temperature to react with the second antibody. This is washed with a suitable washing solution, and then the amount of the labeling substance labeled with the second antibody present by binding to the solid phase antibody on the insoluble carrier through human osteocalcin and its fragment is measured.

なお上記2段法による反応は、固相抗体、標識抗体及
びヒト・オステオカルシンを含有する検体を同時に混合
し、一定時間及び温度でこれら三者を同時に接触させて
反応(1段法)させることもできる。
In the reaction according to the above two-step method, a solid phase antibody, a labeled antibody and a sample containing human osteocalcin are simultaneously mixed, and these three parts are simultaneously contacted for a certain time and temperature to carry out the reaction (one-step method). it can.

かくしてその値から検体試料中のヒト・オステオカル
シンまたはそれとフラグメントの合計量を算出すること
ができる。
Thus, the total amount of human osteocalcin or its and the fragments in the sample can be calculated from the value.

(iii)測定試薬及びキツト 本発明による測定試薬及びキツトは、前記した測定系
(I)〜(III)におけるそれぞれの抗体及びそのフラ
グメントの組合せを使用した固相抗体及び標識抗体を基
本的にして構成される。
(Iii) Assay Reagent and Kit The assay reagent and kit according to the present invention are basically a solid-phase antibody and a labeled antibody using a combination of the respective antibodies and their fragments in the above-mentioned assay systems (I) to (III). Composed.

すなわち、完全ヒト・オステオカルシンまたはそれと
そのフラグメントの合計量の免疫学的測定用の試薬は、
前記測定系(I)〜(III)のそれぞれにおける、一方
の抗体またはそのフラグメントを不溶性担体に固定化し
た固相抗体及び他方の抗体またはそのフラグメントを標
識化した標識抗体とからなる。
That is, the reagent for immunological measurement of the total amount of fully human osteocalcin or its and its fragments is
In each of the above measurement systems (I) to (III), it comprises a solid phase antibody in which one antibody or a fragment thereof is immobilized on an insoluble carrier and a labeled antibody in which the other antibody or a fragment thereof is labeled.

一方完全ヒト・オステオカルシンまたはそれとそのフ
ラグメントの合計量の免疫学的測定用のキツトは、 (a)固相抗体、 (b)標識抗体、 (c)溶解剤、 (d)洗浄剤及び (e)酵素で標識化された標識抗体を使用する場合に
は、酵素活性を測定するための基質及び反応停止剤、 を組合せてなり、前記(a)の固相抗体及び(b)の標
識抗体は、前述した測定系(I)〜(III)のそれぞれ
から選択される。
On the other hand, a kit for immunological measurement of the total amount of fully human osteocalcin or its fragments is as follows: (a) solid phase antibody, (b) labeled antibody, (c) lysing agent, (d) detergent and (e) When using a labeled antibody labeled with an enzyme, a substrate for measuring the enzyme activity and a reaction terminator are combined, and the solid antibody of (a) and the labeled antibody of (b) are It is selected from each of the measurement systems (I) to (III) described above.

前記本発明の免疫学的測定方法、試薬及びキツトにお
いて、固相抗体として使用される不溶性担体として、例
えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポ
リエステル、ポリアクリルニトリル、弗素樹脂、架橋デ
キストラン、ポリサツカライドなどの高分子、その他
紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組合せなど
を例示することができる。
In the immunological assay method, reagent and kit of the present invention, examples of the insoluble carrier used as a solid-phase antibody include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, and polysaccharide. Examples include polymers, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof.

また不溶性担体の形状としては、トレイ状、球状、繊
維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管などの種々の
形状であることができる。
The shape of the insoluble carrier may be various shapes such as tray, sphere, fiber, rod, disc, container, cell, and test tube.

また、標識抗体の標識物質としては、酵素、蛍光物
質、蛍光物質及び放射性物質等を使用するのが有利であ
る。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフオス
フアターゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、蛍光物質とし
てはフルオレツセインイソチオシアネート、フイコビリ
プロテイン等、発光物質としてはイソルシノール、ルシ
ゲニン等、そして放射性物質としては125I、131I、
14C、3H等を用いることができるが、これらは例示した
ものに限らず、免疫学的測定法に使用し得るものであれ
ば、他のものでも使用できる。
Further, it is advantageous to use an enzyme, a fluorescent substance, a fluorescent substance, a radioactive substance and the like as a labeling substance of the labeled antibody. As the enzyme, peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, as the fluorescent substance, fluorescein isothiocyanate, phycobiliprotein, etc., as the luminescent substance, isorcinol, lucigenin, etc., and as the radioactive substance, 125 I, 131 I,
Although 14 C, 3 H and the like can be used, these are not limited to those exemplified, and any other substances can be used as long as they can be used for immunoassay.

標識物質が酵素である場合には、その活性を測定する
ために基質、必要により発色剤が用いられる。
When the labeling substance is an enzyme, a substrate and, if necessary, a color former are used to measure its activity.

酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質
としてH2O2を用い、発色剤として2,2′−アジノジ−
[3−エチルベンズチアゾリンスルホン酸]アンモニウ
ム塩(ABTS)、5−アミノサリチル酸、o−フエニレン
ジアミン、4−アミノアンチビリン、3,3′、5,5′−テ
トラメチルベンジジン等、酵素にアルカリフオスフアタ
ーゼを用いる場合は基質としてo−ニトロフエニルフオ
スフエート等、酵素にβ−D−ガラクトシダーゼを用い
る場合は基質としてフルオレイン−ジ−(β−D−ガラ
クトピラノシド)、4−メチルウンベリフエリル−β−
D−ガラクトピラノシド等を用いることができる。
When peroxidase is used as enzyme, using H 2 O 2 as substrate, as a color-developing agent 2,2' Ajinoji -
[3-Ethylbenzthiazolinesulfonic acid] ammonium salt (ABTS), 5-aminosalicylic acid, o-phenylenediamine, 4-aminoantivirine, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine, etc. When using phosphatase, o-nitrophenyl phosphonate, etc. is used as the substrate, and when using β-D-galactosidase as the enzyme, fluorein-di- (β-D-galactopyranoside), 4- Methylumbelliferyl-β-
D-galactopyranoside or the like can be used.

また本発明による前記免疫学的測定用のキツトにおい
て(c)溶解剤としては、免疫学的測定に通常使用され
るものであればよく、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸
緩衝液、酢酸緩衝液などを含んだpHが6.0〜8.0の範囲の
ものが好適な例として示される。さらに(d)洗浄剤と
しては、同様に免疫学的測定に一般的に使用されている
ものがそのまま使用される。その例としては、生理食塩
水、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液及びこれらの混合
液が挙げられる。これらの洗浄剤にはさらにトリトンX1
00、Tween20またはBrig35の如き非イオン系界面活性
剤、ドデシル硫酸ナトリウムの如きイオン系界面活性剤
を加えられてもよい。
In the kit for immunological measurement according to the present invention, the solubilizer (c) may be any of those usually used in immunological measurement, and examples thereof include phosphate buffer, Tris-hydrochloride buffer, and acetate buffer. A suitable example is one having a pH in the range of 6.0 to 8.0 including the above. Further, as the detergent (d), those generally used for immunological measurement are used as they are. Examples include physiological saline, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, and mixtures thereof. These cleaning agents also include Triton X1
Nonionic surfactants such as 00, Tween 20 or Brig 35, ionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate may be added.

(iv)表面平滑な不溶性担体の使用 本発明者らの研究によれば、本発明による前記したヒ
ト検体中のヒト・オステオカルシン及びそのフラグメン
トの測定系において、不溶性担体としてその表面が鏡面
化された平滑性のものを使用すると粗面の担体に比べて
該担体に対する検体中のタンパク或いは標識抗体などの
非特異的吸着反応が抑制され測定感度が向上し且つ安定
性も増すことがわがった。
(Iv) Use of Insoluble Carrier with Smooth Surface According to the research conducted by the present inventors, in the above-mentioned assay system for human osteocalcin and its fragments in human samples, the surface thereof was mirror-finished as an insoluble carrier. It was found that when a smooth carrier is used, non-specific adsorption reaction of the protein or labeled antibody in the sample to the carrier is suppressed as compared with the carrier having a rough surface, the measurement sensitivity is improved and the stability is also increased.

従来、免疫学的測定系において測定感度を高めるため
に、不溶性担体としては、むしろその表面を研磨して粗
面化し、表面積を多くしたものが使用されていた。しか
しながら、ヒト・オステオカルシン及びそのフラグメン
トの如き検体中に極く微量しか含まれていない場合には
表面の平滑性が増えるに従って、非特異的吸着が抑えら
れ、測定感度が増加するのである。
Conventionally, in order to increase the measurement sensitivity in an immunological measurement system, as an insoluble carrier, one having a large surface area used by polishing the surface of the insoluble carrier has been used. However, when the sample such as human osteocalcin and its fragment is contained in a very small amount, non-specific adsorption is suppressed and the measurement sensitivity is increased as the surface smoothness increases.

かくて不溶性担体は、その表面の中心線平均粗さ(R
a)が1.5μm以下の鏡面化された平滑表面を有するもの
が有利である。
Thus, the insoluble carrier has a center line average roughness (R
Advantageously, a) has a mirror-finished smooth surface of 1.5 μm or less.

中心線平均粗さ(Ra)は、粗さ曲線からその中心線の
方向に測定長さlの部分を抜取り、この抜取り部分の中
心線をX軸、縦倍率の方向をY軸とし、あらさ曲線をy
=f(x)で表わしたとき、次式で与えられるRaの値を
ミクロン単位で表わした値を意味する。
The center line average roughness (Ra) is obtained by extracting a portion of the measurement length 1 from the roughness curve in the direction of the center line, setting the center line of the extracted portion as the X axis and the direction of the vertical magnification as the Y axis. To y
= F (x) means that the value of Ra given by the following equation is expressed in micron units.

この中心線平均粗さ(Ra)については、JIS B0601−
1982(日本)、ANSI B46.1−1979(USA)及びR 468
−1966(ISO)に説明されている。
Regarding this center line average roughness (Ra), JIS B0601-
1982 (Japan), ANSI B46.1-1979 (USA) and R 468
-1966 (ISO).

なお以下の本発明の実施例では、不溶性担体は東京精
密(株)製の表面粗さ計サーフコム を用いて表面粗さ
を測定した。
 In the following examples of the present invention, the insoluble carrier is
SURFCOM, a surface roughness meter manufactured by Mikko Co., Ltd. Surface roughness using
Was measured.

前記平滑な表面を有する不溶性担体の材質及び形状は
特に制限されず、前記に説明したものが示される。特に
好ましい例としてはポリスチレンビーズが挙げられる。
The material and shape of the insoluble carrier having a smooth surface are not particularly limited, and those described above are shown. Particularly preferable examples include polystyrene beads.

(v)免疫反応における特定タンパクの添加 本発明の免疫測定系において免疫反応溶液中に分子量
1.6万〜5.0万及び等電点1.0〜5.0である蛋白質又はそれ
を含む混合物を存在せしめ、これらの免疫反応溶液にお
ける最終濃度が0.02〜0.9重量%となるように調製する
と、非特異的吸着が抑制され、したがってバツクグラン
ドが低くなり高感度が得られやすくなり好ましいことが
わかった。かかる蛋白質又はそれを含む混合物は、本発
明の免疫学的測定方法に用いる試薬及びキツトの他の一
部を構成する免疫測定試薬に免疫反応溶液中に前記所定
の量となるように含有せしめることもできる。かかる蛋
白質としては、例えばカゼイン、ペプシン、オボグリコ
プロテイン、オロソムコイドなどが挙げられる。このよ
うな混合物としては、例えば主成分として前記タンパク
質10〜60重量%、好ましくは20〜50重量%、糖(例えば
乳糖)30〜80重量%、好ましくは40〜60重量%、その他
脂肪(例えば0.5〜2重量%)灰分(例えば5〜12重量
%)、水分(例えば2〜8重量%)などを含むことがで
きる。このような混合物としては典型的なのはスキムミ
ルクである。スキムミルクはタンパク質としてカゼイン
を含むものであるが、カゼインを単独で使用した場合に
比べて、スキムミルクは、免疫反応溶液中における分散
性が良く、非特異的吸着を低減させる効果が高く、温度
4℃における保存性が良い(沈澱が生じにくい)という
特徴を有する。なお、スキムミルクとしては、脱脂した
ミルクであれば、如何なる由来のミルクであっても良
く、最も典型的なもののひとつとしては、市販されてい
るDifco社製のスキムミルクがある。
(V) Addition of specific protein in immune reaction In the immunoassay system of the present invention, the molecular weight in the immune reaction solution is
Non-specific adsorption can be achieved by allowing a protein having 16,000 to 50,000 and an isoelectric point of 1.0 to 5.0 or a mixture containing the protein to be present and adjusting the final concentration of these immunoreaction solutions to 0.02 to 0.9% by weight. It has been found that this is preferable because it is suppressed, and therefore the background is lowered and high sensitivity is easily obtained. Such a protein or a mixture containing the same should be contained in the reagent used in the immunoassay method of the present invention and the immunoassay reagent constituting another part of the kit in the immunoreaction solution in the predetermined amount. You can also Examples of such proteins include casein, pepsin, ovoglycoprotein, orosomucoid and the like. Such a mixture includes, for example, 10 to 60% by weight of the protein as a main component, preferably 20 to 50% by weight, sugar (e.g., lactose) 30 to 80% by weight, preferably 40 to 60% by weight, other fats (e.g., 0.5 to 2% by weight) ash (for example, 5 to 12% by weight), water (for example, 2 to 8% by weight), and the like can be included. A typical example of such a mixture is skim milk. Skim milk contains casein as a protein, but skim milk has better dispersibility in the immunoreaction solution, has a higher effect of reducing nonspecific adsorption, and is stored at a temperature of 4 ° C as compared with the case of using casein alone. It has a good property (precipitation does not easily occur). The skim milk may be milk of any origin, as long as it is defatted milk, and one of the most typical ones is commercially available skim milk manufactured by Difco.

ヒト・オステオカルシンのフラグメントの測定方法 前述したように、本発明の測定系(I)に従えばヒト
検体中の完全ヒト・オステオカルシンをそのフラグメン
トと区別して高感度で測定でき、一方測定系(II)また
は(III)に従えばヒト検体中の完全ヒト・オステオカ
ルシン及びそのフラグメントの合計量を高感度で測定す
ることが可能であるから、これらの測定系の結果からヒ
ト検体中のヒト・オステオカルシンのフラグメントを正
確に知ることができる。従来ヒト・オステオカルシンの
フラグメントの量を完全ヒト・オステオカルシンと区別
して正しく測定する方法は知られてはいない。
Method for Measuring Fragment of Human Osteocalcin As described above, according to the measuring system (I) of the present invention, it is possible to measure fully human osteocalcin in a human specimen with its fragment with high sensitivity, while measuring system (II) Alternatively, according to (III), it is possible to measure the total amount of fully human osteocalcin and its fragments in a human sample with high sensitivity. Therefore, the results of these measurement systems show that the fragments of human osteocalcin in a human sample are You can know exactly. Heretofore, there is no known method for accurately measuring the amount of human osteocalcin fragment by distinguishing it from fully human osteocalcin.

かくして本発明によれば、 (i)前記測定系(II)または(III)における測定方
法に従ってヒト検体中の完全ヒト・オステオカルシン及
びそのフラグメントの合計量を測定し、 (ii)前記測定系(I)における測定方法に従ってヒト
検体中の完全ヒト・オステオカルシンを測定し、 (iii)次いで前記(i)及び(ii)で測定された値の
差を算出することからなるヒト・オステオカルシンのフ
ラグメントの測定方法が提供される。
Thus, according to the present invention, (i) the total amount of fully human osteocalcin and its fragments in a human sample is measured according to the measurement method in the measurement system (II) or (III), and (ii) the measurement system (I ) A method for measuring a fragment of human osteocalcin, which comprises measuring fully human osteocalcin in a human sample according to the measurement method described in 1), and (iii) then calculating the difference between the values measured in (i) and (ii) above. Will be provided.

かかる測定方法により、ヒト検体中のヒト・オステオ
カルシンのフラグメントの量を、完全ヒト・オステオカ
ルシンと区別して正確に測定しうる。ヒト・オステオカ
ルシンのフラグメントの量は骨吸収の状態を知りうる1
つの目安と考えられるのでその量を測定することは種々
の病態の判断に役立つことになる。
By such a measuring method, the amount of the human osteocalcin fragment in the human sample can be accurately measured by distinguishing it from fully human osteocalcin. The amount of human osteocalcin fragments can determine the state of bone resorption 1
Since it is considered as one guide, measuring the amount will be useful for judging various pathological conditions.

完全ヒト・オステオカルシンの分離法及び精製法 本発明によって得られた前記N末端抗体を使用するこ
とによって、完全ヒト・オステオカルシン含有液から、
完全ヒト・オステオカルシンを容易に分離することがで
き、また高度に精製された完全ヒト・オステオカルシン
を得ることができる。かくして下記方法(I)及び方法
(2)による完全ヒト・オステオカルシンの分離法及び
精製法が提供される。
Method for separating and purifying complete human osteocalcin By using the N-terminal antibody obtained according to the present invention, a solution containing a complete human osteocalcin can be obtained.
Complete human osteocalcin can be easily separated, and highly purified complete human osteocalcin can be obtained. Thus, a method for separating and purifying fully human osteocalcin by the following method (I) and method (2) is provided.

方法1 (i)完全ヒト・オステオカルシン含有液を、ヒト・オ
ステオカルシンのN末端側1〜20のアミノ酸配列領域中
に特異的認識部位を有するヒト・オステオカルシンに対
する抗体またはそれと同じ認識部位を有するそのフラグ
メント(N末端抗体)を結合した固相と接触させて、該
固相に完全ヒト・オステオカルシンを吸着させ、 (ii)次いで完全ヒト・オステオカルシンを吸着した固
相に溶出液を接触させて、完全ヒト・オステオカルシン
を固相から溶出させ、 (iii)得られた完全ヒト・オステオカルシン含有溶出
液から、完全ヒト・オステオカルシンを分離する、 ことを特徴とする完全ヒト・オステオカルシンの分離
法。
Method 1 (i) An antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site ( N-terminal antibody) -bonded solid phase to adsorb fully human osteocalcin to the solid phase, and (ii) contact eluate to the solid phase adsorbed to fully human osteocalcin to completely human A method for separating complete human osteocalcin, characterized in that osteocalcin is eluted from the solid phase, and (iii) complete human osteocalcin is separated from the obtained eluate containing complete human osteocalcin.

方法2 工程: (a)完全ヒト・オステオカルシン含有液をヒト・オス
テオカルシンに対する抗体を結合した第1の固相と接触
させて、第1の固相に完全ヒト・オステオカルシンを吸
着させ、 (b)完全ヒト・オステオカルシンを吸着した第1の固
相に溶出液を接触させて、完全ヒト・オステオカルシン
を第1の固相から溶出させ、 (c)得られた完全ヒト・オステオカルシン含有溶出液
を、ヒト・オステオカルシンに対する他の抗体を結合し
た第2の固相と接触させて、第2の固相に完全ヒト・オ
ステオカルシンを吸着させ、 (d)完全ヒト・オステオカルシンを吸着した第2の固
相に溶出液を接触させて完全ヒト・オステオカルシンを
第2の固相から溶出させ、 (e)得られた完全ヒト・オステオカルシン含有溶出液
から精製された完全ヒト・オステオカルシンを分離す
る、 よりなる完全ヒト・オステオカルシン含有液からの精製
された完全ヒト・オステオカルシンの分離法であって、 (1)一方の固相に結合した抗体が、ヒト・オステオカ
ルシンのN末端側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的
な認識部位を有するヒト・オステオカルシンに対する抗
体またはそれと同じ認識部位を有するそのフラグメント
(N末端抗体)であり、 (2)他方の固相に結合した抗体が、ヒト・オステオカ
ルシンのC末端側36〜49のアミノ酸配列領域中に特異的
な認識部位を有するヒト・オステオカルシンに対する抗
体またはそれと同じ認識部位を有するそのフラグメント
(C末端抗体)である、 ことを特徴とする精製された完全ヒト・オステオカルシ
ンの分離法。
Method 2 step: (a) contacting a fully human osteocalcin-containing solution with a first solid phase to which an antibody against human osteocalcin is bound to adsorb fully human osteocalcin to the first solid phase; The eluate is contacted with the first solid phase on which human osteocalcin is adsorbed to elute the fully human osteocalcin from the first solid phase, and (c) the obtained fully human osteocalcin-containing eluate is Contacting with a second solid phase bound with another antibody against osteocalcin to adsorb completely human osteocalcin to the second solid phase, and (d) eluate to the second solid phase adsorbing completely human osteocalcin Complete human-osteocalcin is eluted from the second solid phase by contacting with each other, and (e) the complete human-osteocalcin-containing eluate obtained is purified. A method for separating purified human osteocalcin from a human-osteocalcin-containing solution, which comprises separating human osteocalcin, wherein (1) the antibody bound to one of the solid phases is an N-terminal of human osteocalcin. An antibody to human osteocalcin having a specific recognition site in the side 1 to 20 amino acid sequence region or a fragment thereof (N-terminal antibody) having the same recognition site as that, (2) an antibody bound to the other solid phase Is an antibody to human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of C-terminal 36 to 49 of human osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site (C-terminal antibody), And a method for separating purified human osteocalcin.

前記方法1及び2によれば、完全ヒト・オステオカル
シン含有液から、完全ヒト・オステオカルシンを純度よ
く分離でき、殊に方法2によれば極めて高純度の完全ヒ
ト・オステオカルシンを分離することができる。得られ
た完全ヒト・オステオカルシンは、試薬、標準物質また
は薬剤成分として使用される。
According to the above methods 1 and 2, completely human osteocalcin can be separated with high purity from the completely human osteocalcin-containing liquid, and particularly according to method 2, extremely highly pure human osteocalcin can be separated. The resulting fully human osteocalcin is used as a reagent, standard or drug component.

前記方法1及び2において、完全ヒト・オステオカル
シン含有液としては、完全ヒト・オステオカルシンを含
有していればよく、その濃度は関係がなく、種々のもの
であってもよい。例えばヒト体液或いはその処理物(血
清、血漿または煮ようなど)でもよく、また遺伝子操作
により人為に製造された完全ヒト・オステオカルシンの
含有液であってもよい。
In the above methods 1 and 2, the fully human osteocalcin-containing liquid may be any liquid as long as it contains completely human osteocalcin, and its concentration is not related and may be various. For example, it may be a human body fluid or a processed product thereof (serum, plasma, boiled water, etc.), or a solution containing completely human osteocalcin artificially produced by genetic engineering.

前記方法1及び2において使用されるN末端抗体及び
C末端抗体は、前記した測定系(I)、(II)及び(II
I)で説明したものを使用することができるが、いずれ
の抗体もポリクローナル抗体或いはそのフラグメントで
あることが望ましい。また抗体を結合させる固相として
は測定系(I)、(II)及び(III)で説明した不溶性
担体をそのまま使用することができる。その中で固相は
デキストランゲル、アガロースゲルまたはポリビニルゲ
ルであるのが好ましい。
The N-terminal antibody and the C-terminal antibody used in the methods 1 and 2 are the same as the above-mentioned measurement systems (I), (II) and (II).
Although those described in I) can be used, any antibody is preferably a polyclonal antibody or a fragment thereof. As the solid phase to which the antibody is bound, the insoluble carrier described in the measurement systems (I), (II) and (III) can be used as it is. Among them, the solid phase is preferably dextran gel, agarose gel or polyvinyl gel.

また方法1及び方法2において、固相に吸着させた完
全ヒト・オステオカルシンを溶出させるために使用する
溶出液としては、通常知られた酸性緩衝液が使用され
る。
In Method 1 and Method 2, a commonly known acidic buffer solution is used as an eluent used to elute the fully human osteocalcin adsorbed on the solid phase.

免疫吸着体 本発明者らによって見出されたヒト・オステオカルシ
ンに体する抗体を使用し、それを固相に結合させること
によって、有益な下記(i)〜(iii)の3種の免疫吸
着体が提供される。
Immunoadsorbents The three immunoadsorbents of the following (i) to (iii), which are useful by using an antibody which is found by the present inventors and which binds to human osteocalcin, and which is bound to a solid phase Will be provided.

(i)ヒト・オステオカルシンのN末端1〜20のアミノ
酸配列領域中に特異的認識部位を有するヒト・オステオ
カルシンに対するモノクローナル抗体またはそれと同じ
認識部位を有するそのフラグメントを固相に結合した免
疫吸着体。
(I) An immunoadsorbent in which a monoclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of N-terminals 1 to 20 of human osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site is bound to a solid phase.

(ii)ヒト・オステオカルシンのN末端1〜20のアミノ
酸配列領域中に特異的認識部位を有するヒト・オステオ
カルシンに対するポリクローナル抗体またはそれと同じ
認識部位を有するそのフラグメントを固相に結合させた
免疫吸着体。
(Ii) An immunoadsorbent in which a polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of the N-terminals 1 to 20 of human osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site is bound to a solid phase.

(iii)ヒト・オステオカルシンのC末端側36〜49のア
ミノ酸配列領域中に特異的認識部位を有するヒト・オス
テオカルシンに対するポリクローナル抗体またはそれと
同じ認識部位を有するそのフラグメントを固相に結合し
た免疫吸着体。
(Iii) An immunoadsorbent in which a polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of C-terminal 36 to 49 of human osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site is bound to a solid phase.

前記免疫吸着体は、いずれも完全ヒト・オステオカル
シンを吸着することができるので、前述した完全ヒト・
オステオカルシンの分離法における吸着剤として使用す
ることができる。前記免疫吸着体における固相として
は、測定系(I)、(II)及び(III)において説明し
た不溶性担体であることができるが、具体的には、デキ
ストラン、アガロースゲル、ポリビニルゲルまたは金属
粒子であるのが好ましい。不溶性担体と抗体との結合
は、通常の方法、例えばブロムシアン法やエポキシ、ア
ミノ、カルボキシル、もしくはホルミル基等を介して結
合させることができる。
Each of the immunoadsorbents described above is capable of adsorbing fully human osteocalcin.
It can be used as an adsorbent in the method of separating osteocalcin. The solid phase in the immunoadsorbent may be the insoluble carrier described in the measurement systems (I), (II) and (III), and specifically, dextran, agarose gel, polyvinyl gel or metal particles. Is preferred. The insoluble carrier and the antibody can be bound to each other by an ordinary method, for example, the Bromcian method, epoxy, amino, carboxyl, or formyl group.

モノクローナル抗体 本発明によれば、ヒト・オステオカルシンのN末端側
1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有す
るヒト・オステオカルシンに対するモノクローナル抗体
が提供される。
Monoclonal Antibody According to the present invention, a monoclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin is provided.

本発明によるこのモノクローナル抗体は、ケーラーと
ミルシユタインによる細胞融合法(G.Khler and Mils
tein、Nature(London)、256、495−497(1975))に
より作製されたハイブリドーマを培養して分泌させ、そ
の培養液から分離することにより調製された。すなわ
ち、ヒト・オステオカルシンのN末端アミノ酸配列1Try
−Leu−Tyr−Gln−Trp−Lue−Gly−Ala−Pro−Val−Pro
−Tyr−Pro−Asp−Pro−Leu−Glu−Pro−Arg−20Argを
有するペプチド(以下、1Try−20Argと略記する)を合
成し、これにキヤリア蛋白を結合させて、マウスに免疫
した後、このマウスのリンパ球をマウス・ミエローマ細
胞と融合させハイブリドーマを作製した。このようにし
て得たハイブリドーマは、融合された種々のリンパ球の
それぞれに応じて種々のモノクローナル抗体を産生する
ので、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマをクローニングによってクローン化されたハイ
ブリドーマとして単離した。このクローン化ハイブリド
ーマをイン・ビトロで培養してモノクローナル抗体を分
泌させた。この培養上清からヒト・オステオカルシンの
N末端アミノ酸配列に対する前記モノクローナル抗体を
分離した。
This monoclonal antibody according to the present invention is used for the cell fusion method by G. Khler and Mils
Tein, Nature (London), 256 , 495-497 (1975)) was prepared by culturing and secreting the hybridoma and separating it from the culture solution. That is, the N-terminal amino acid sequence 1 Try of human osteocalcin
-Leu-Tyr-Gln-Trp-Lue-Gly-Ala-Pro-Val-Pro
A peptide having -Tyr-Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro-Arg- 20 Arg (hereinafter abbreviated as 1 Try- 20 Arg) was synthesized, and a carrier protein was bound to the peptide to immunize a mouse. After that, the lymphocytes of this mouse were fused with mouse myeloma cells to prepare hybridomas. The hybridoma thus obtained produces various monoclonal antibodies depending on each of various fused lymphocytes, and thus the hybridoma producing the desired monoclonal antibody is isolated as a cloned hybridoma by cloning. did. This cloned hybridoma was cultured in vitro to secrete the monoclonal antibody. From the culture supernatant, the monoclonal antibody against the N-terminal amino acid sequence of human osteocalcin was isolated.

次に、本発明のヒト・オステオカルシンに対するモノ
クローナル抗体を作成する具体的方法について詳細に説
明する。
Next, a specific method for producing the monoclonal antibody against human osteocalcin of the present invention will be described in detail.

A.抗原の作成 抗原としては、ヒト・オステオカルシンやヒト・オス
テオカルシンを酵素的に切断して得られるヒト・オステ
オカルシンのアミノ酸配列を有するペプチドあるいは合
成ペプチドなどを用いることができるが、ここでは合成
ペプチド(1Try−20Arg)を用いた場合について説明す
る。
A. Preparation of Antigen As the antigen, a peptide having an amino acid sequence of human osteocalcin obtained by enzymatically cleaving human osteocalcin or human osteocalcin, a synthetic peptide, or the like can be used, but here, a synthetic peptide ( The case where 1 Try- 20 Arg) is used will be described.

1)N末端ペプチド(1Try−20Arg)の合成ヒト・オス
テオカルシンのN末端アミノ酸配列20残基及び21残基目
にシステインを入れた、第1図で示すペプチドを合成し
た。
1) Synthesis of N-Terminal Peptide ( 1 Try- 20 Arg) The peptide shown in FIG. 1 was synthesized, in which cysteine was inserted at the 20th and 21st residues of the N-terminal amino acid sequence of human osteocalcin.

合成についてはABI社ペプチド合成機を用いた。以
下、このペプチドの名称をOst−N(20)とする。
ABI peptide synthesizer was used for the synthesis. Hereinafter, the name of this peptide is Ost-N (20).

2)抗原(Ost−N(20)とキヤリヤー蛋白の結合体の
作成 代表的なキヤリヤ蛋白であるキーホール リンペツト
ヘモシアニン(KLH)をキヤリヤー蛋白とし、N−
(m−アレイミド安息香酸)−N−サイクシンイミドエ
ステル(MBS)よりKLHをMSB化した。一方、Ost−N(2
0)を2−メルカプトエタノールによりSH基をフリーに
し、MBS化KLHにOst−N(20)を滴下しながら反応溶液
をpH6.0〜6.5に保ちつつ反応させた。3時間反応後、透
析し、得られた生成物を抗原として用いた。
2) Preparation of conjugate of antigen (Ost-N (20) and carrier protein) Keyhole limpet hemocyanin (KLH), which is a typical carrier protein, is used as carrier protein and N-
KLH was converted to MSB from (m-arylamidobenzoic acid) -N-cyclinimide ester (MBS). On the other hand, Ost-N (2
SH group was made free with 2-mercaptoethanol, and the reaction solution was allowed to react while dropping Ost-N (20) on MBS-form KLH while maintaining the pH at 6.0 to 6.5. After reacting for 3 hours, it was dialyzed and the obtained product was used as an antigen.

B.合成ペプチド−KLH結合体による抗原刺激リンパ球の
調製 雄Balb/cマウスを用いたが、他の系のマスウ、ラツ
ト、ウサギ、モルモツトなど抗原刺激リンパ球を得るこ
とができる動物であれば特に限定する必要はなく、また
動物もしくはヒトのリンパ球を取り出して、インビトロ
に抗原刺激リンパ球を得る方法であってもよい。
B. Preparation of antigen-stimulated lymphocytes by synthetic peptide-KLH conjugates Male Balb / c mice were used, but any animal that can obtain antigen-stimulated lymphocytes such as other strains of mouse, rat, rabbit, guinea pig. The method is not particularly limited, and may be a method in which animal or human lymphocytes are taken out to obtain antigen-stimulated lymphocytes in vitro.

マウスに合成ペプチド−KLH結合体を10〜100μgを完
全フロイント・アジユバントとともに腹腔投与後、3〜
4週間間隔で同量を不完全アジユバントとともに腹腔投
与した。その間角投与後10日目に採血して血清抗体価を
測定し抗体価が5万倍以上上がっていることを確認し、
1〜50μgの合成ペプチド−KLH結合体を静脈内投与し
て3〜4日後に脾臓を無菌的に取り出し、それから脾臓
細胞懸濁液を調製した。
3 to 10 μg of synthetic peptide-KLH conjugate was intraperitoneally administered to mice together with complete Freund's adjuvant.
The same amount was intraperitoneally administered at an interval of 4 weeks together with incomplete adjuvant. Meanwhile, blood was collected 10 days after administration of horn and serum antibody titer was measured to confirm that the antibody titer increased by 50,000 times or more.
Three to four days after the intravenous administration of 1 to 50 μg of the synthetic peptide-KLH conjugate, the spleen was aseptically removed, and a spleen cell suspension was prepared therefrom.

抗原刺激をうけたリンパ球としては、脾細胞がよく用
いられるが、リンパ節細胞、末梢血リンパ球などであっ
てもよい。
Spleen cells are often used as antigen-stimulated lymphocytes, but may be lymph node cells, peripheral blood lymphocytes, or the like.

C.細胞融合 抗原刺激をうけた脾細胞を、マウス骨髄腫細胞と融合
促進剤の使用により一般に用いられている方法(たとえ
ば「日本生化学会編、続生化学実験講座、5巻、70−71
頁、東京化学同人」)で細胞融合した。
C. Cell fusion Antigen-stimulated spleen cells are generally used by the use of mouse myeloma cells and a fusion promoter (for example, “Biochemical Society, edited by Bioscience Laboratory, Vol. 5, 70-71”).
Page, Tokyo Kagaku Dojin ”).

所望する細胞融合が可能な他の方法、たとえば電気的
融合法などで細胞融合してもよい。
The cells may be fused by another method that allows desired cell fusion, such as an electrical fusion method.

マウス骨髄腫細胞としては、細胞融合に適したライン
が多く知られており、そのいずれであってもよいが、本
発明ではP3−X63−Ag8−U1細胞(以下P3U1と略記する)
(D.E.Yelton et al.,Current Topics in Microbiology
and Immunolgy,81,1(1978))を用いた。
As the mouse myeloma cells, many lines suitable for cell fusion are known, and any of them may be used, but in the present invention, P3-X63-Ag8-U1 cells (hereinafter abbreviated as P3U1).
(DEYelton et al., Current Topics in Microbiology
and Immunolgy, 81 , 1 (1978)) was used.

融合促進剤としては、平均分子量1,000〜6,000のポリ
エチレングリコールが用いられるが、この分野で知られ
ている他の融合促進剤を使用することもできる。
As the fusion accelerator, polyethylene glycol having an average molecular weight of 1,000 to 6,000 is used, but other fusion accelerators known in this field can also be used.

D.クローン化ハイブリドーマの取得 細胞融合した細胞懸濁液、すなわち未融合の脾細胞と
骨髄腫細胞及び融合した細胞(ハイブリドーマ)の混合
物を、ハイブリドーマのみが生育しうる選択培地で希釈
し、それを別の容器内(マイクロプレート)に分注し
て、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間(約1時
間)培養した。
D. Obtaining cloned hybridoma Cell-fused cell suspension, that is, a mixture of unfused splenocytes and myeloma cells and fused cells (hybridomas) is diluted with a selective medium in which only hybridomas can grow, The mixture was dispensed in another container (microplate) and cultured for a sufficient time (about 1 hour) to kill unfused cells.

培地は薬物抵抗性(例えば8−アザグアニン抵抗性)
で未融合の骨髄腫細胞を生育させないもの(例えば、ヒ
ポキサンチン、アミノプリン、チミジン(HAT)培地)
が使用された。
The medium is drug resistant (eg 8-azaguanine resistant)
That does not grow unfused myeloma cells (eg, hypoxanthine, aminopurine, thymidine (HAT) medium)
Was used.

培養容器内にハイブリドーマが生育していることを確
認した後、その培養上清を採取し、合成ペプチド Ost
−N(20)に対するモノクローナル抗体について酵素免
疫測定法(Enzyme Linked Immune Sorbent Assay(以下
ELISAと略記する))によりスクリーニングした。
After confirming that the hybridoma is growing in the culture vessel, the culture supernatant is collected and the synthetic peptide Ost
Enzyme Linked Immune Sorbent Assay (below
Abbreviated as ELISA))).

得られた抗体陽性容器内のハイブリドーマを、一般に
用いられている方法(例えば限界希釈法、軟寒天法、フ
イブリンを用いたクローニング法など)でクローニング
して、抗ヒト・オステオカルシ・モノクローナル抗体を
分泌するクローン化ハイブリドーマを取得した。
The hybridoma in the obtained antibody-positive container is cloned by a commonly used method (eg, limiting dilution method, soft agar method, cloning method using fibrin, etc.) to secrete anti-human osteocalci monoclonal antibody. To obtain a cloned hybridoma.

E.ハイブリドーマ培養液からの抗ヒト・オステオカルシ
ン・モノクローナル抗体の調製 クローン化ハイブリドーマをマウス腹腔内で培養、増
殖させその腹水又は血清を採取して、それから一般に用
いられている方法(例えば硫酸アンモニウム沈澱、DEAE
−セルロース・カラム、プロテイン−A−アフイニイテ
イー・カラム)により抗ヒト・オステオカルシン・モノ
クローナル抗体を分離した。
E. Preparation of Anti-Human Osteocalcin Monoclonal Antibody from Hybridoma Culture Medium Cloned hybridomas are cultivated and propagated in the abdominal cavity of mice, their ascites or serum is collected, and then a commonly used method (for example, ammonium sulfate precipitation, DEAE) is used.
-Cellulose column, protein-A-affinity column) was used to separate anti-human osteocalcin monoclonal antibody.

ハイブリドーマの培養は、上記の他ヌード・アウスま
たはヌード・ラツトなどの腹腔内であっても、あるいは
適当な栄養培地を用いてイン・ビトロで行ってもよい。
In addition to the above, the culture of the hybridoma may be performed in the abdominal cavity of nude aus or nude rat, or may be performed in vitro using an appropriate nutrient medium.

上記本発明によるモノクローナル抗体は、ヒト・オス
テオカルシンのN末端側の1〜20位のアミノ酸配列領域
中に特異適な認識部位を有している。また本発明のこの
モノクローナル抗体は、ヒト・オステオカルシンのN末
端側の1〜19のアミノ酸配列を有するペプチドにも結合
する。このモノクローナル抗体は、ウシ・オステオカル
シンに対する交叉反応性が50%以下である。
The above-mentioned monoclonal antibody according to the present invention has a specific suitable recognition site in the amino acid sequence region of 1 to 20 positions on the N-terminal side of human osteocalcin. The monoclonal antibody of the present invention also binds to a peptide having an amino acid sequence of 1 to 19 on the N-terminal side of human osteocalcin. This monoclonal antibody has a cross-reactivity of 50% or less with bovine osteocalcin.

このモノクローナル抗体は、前記した本発明の測定系
(I)、(II)及び(III)、分離法、免疫吸着体にお
ける抗体として使用される。
This monoclonal antibody is used as an antibody in the above-mentioned measurement systems (I), (II) and (III) of the present invention, the separation method, and the immunoadsorbent.

ポリクローナル抗体(I) 本発明によれば、ヒト・オステオカルシンのN末端側
1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有す
るヒト・オステオカルシンに対するポリクローナル抗体
が提供され、このポリクローナル抗体は、ウシ・オステ
オカルシンに対する交叉反応性が50%以下である。また
このポリクローナル抗体は、ヒト・オステオカルシンの
N末端側1〜19のアミノ酸配列を有するペプチドにも結
合する。
Polyclonal antibody (I) According to the present invention, there is provided a polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of the N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin, the polyclonal antibody being bovine.・ Cross-reactivity to osteocalcin is less than 50%. This polyclonal antibody also binds to a peptide having the amino acid sequence of N-terminal side 1 to 19 of human osteocalcin.

このポリクローナル抗体は、下記アミノ酸配列 H−Try−Leu−Tyr−Gln−Trp−Leu−Gly−Ala−Pro−V
al−Pro−Try−Pro−Asp−Pro−Leu−Glu−Pro−Arg−A
rg−OH で表わされるペプチドをキヤリアータンパクと結合させ
て得られたポリペプチドを免疫抗原として動物に免疫
し、その動物より取得することができる。
This polyclonal antibody has the following amino acid sequence H-Try-Leu-Tyr-Gln-Trp-Leu-Gly-Ala-Pro-V.
al-Pro-Try-Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro-Arg-A
It can be obtained from an animal by immunizing an animal with a polypeptide obtained by binding a peptide represented by rg-OH to a carrier protein as an immunizing antigen.

上記免疫のための方法としては、ペプチド比較的大き
な分子に変換し、それをアジユバンドと混ぜ、被免疫動
物に投与しそれ自体知られた方法に従って抗体を作成す
る。
As a method for immunization, a peptide is converted into a relatively large molecule, which is mixed with aziband and administered to an immunized animal to prepare an antibody according to a method known per se.

免疫に当ってペプチドを大きな分子に変換するには、
ペプチドとキヤリアータンパクと結合させる方法と他の
高分子物質と結合させる方法がある。このキヤリアータ
ンパクとしては、アルブミン、キーホール リンペツト
ヘモシアニン(KLH)またはプロテインAなどが挙げ
られるがアルブミンまたはKLHが好ましい。また他の高
分子物質としては、ポリビニルピロリドンの如き水溶性
高分子が挙げられる。
To convert peptides into large molecules for immunization,
There are a method of binding a peptide to a carrier protein and a method of binding to another polymer substance. Examples of the carrier protein include albumin, keyhole limpet hemocyanin (KLH), protein A and the like, and albumin or KLH is preferable. Other polymer substances include water-soluble polymers such as polyvinylpyrrolidone.

ペプチドとキヤリアータンパクと結合させるに当って
は、ペプチドのCOOH末端基を利用する場合にはカルボジ
イミドを用い、一方NH2末端基を利用する場合にはグル
タルアルデヒドが好ましく使用される。さらに特異的な
結合を求める場合にはペプチドにシステインを導入して
キヤリアータンパク側にマレイミド基またはジチオピリ
ジル基を導入しこれを結合させることにより作成する。
In coupling the peptide with the carrier protein, carbodiimide is used when the COOH end group of the peptide is used, while glutaraldehyde is preferably used when the NH 2 end group is used. When a more specific bond is required, cysteine is introduced into the peptide to introduce a maleimide group or a dithiopyridyl group on the carrier protein side, and this is made to bind.

またアジユバンドとしては完全フロインドアジユバン
ド不完全フロインドアジユバンドまたは水酸化アルミニ
ウムなどが使用される。
As the azimuth band, complete Freund's azimuth band, incomplete Freund's azimuth band, aluminum hydroxide or the like is used.

さらに免疫すべき動物としては、山羊、ウサギ、馬、
羊、犬、マウス、モルモツト、ブタなどがある。
Animals to be further immunized include goats, rabbits, horses,
There are sheep, dogs, mice, guinea pigs, pigs, etc.

ポリクローナル抗体(II) さらに本発明によれば、ヒト・オステオカルシンのC
末端側43(Arg)〜49(Val)位のアミノ酸配列領域中に
特異的な認識部位を有するヒト・オステオカルシンに対
するポリクローナル抗体が提供される。
Polyclonal antibody (II) Further according to the present invention, C of human osteocalcin
Provided is a polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region at the terminal side 43 (Arg) to 49 (Val) position.

かかるポリクローナル抗体は下記アミノ酸配列 H−Arg−Arg−Phe−Tyr−Gly−Pro−Val−OH で表わされるペプチドをキヤリアータンパクと結合させ
て得られたポリペプチドを免疫抗原として動物に免疫し
その動物から取り出すことができる。
Such a polyclonal antibody is obtained by binding a peptide represented by the following amino acid sequence H-Arg-Arg-Phe-Tyr-Gly-Pro-Val-OH to a carrier protein and immunizing an animal with a polypeptide obtained as an immunizing antigen. Can be removed from the animal.

免疫のための方法は、前記ポリクローナル抗体(I)
において説明した方法と基本的に同じ方法が採用され
る。
The method for immunization includes the polyclonal antibody (I)
The method basically the same as the method described in 1. is adopted.

図面の簡単な説明 第1図は、実施例1(A)にて作成したヒト・オステ
オカルシンN末端1〜20残基と21残基目にシステインを
入れた合成ペプチドのアミノ酸配列を示す。
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows the amino acid sequence of a synthetic peptide prepared in Example 1 (A), in which N-terminal 1 to 20 residues of human osteocalcin and cysteine at the 21st residue were inserted.

第2図は、実施例2(A)にて作成したヒト・オステ
オカルシンのC末端43〜49位の合成ペプチドのアミノ酸
配列を示す。
FIG. 2 shows the amino acid sequence of the synthetic peptide at the C-terminal positions 43 to 49 of human osteocalcin prepared in Example 2 (A).

第3図は、参考例の(A)にて作成したヒト・オステ
オカルシンC末端36〜49残基及び35残基目にシステイン
を有する合成ペプチドのアミノ酸配列を示す。
FIG. 3 shows the amino acid sequences of synthetic peptides having human osteocalcin C-terminal 36 to 49 residues and cysteine at the 35th residue prepared in (A) of Reference Example.

第4図は、実施例3において作成した完全ヒト・オス
テオカルシン測定系(I)による測定結果を示す。
FIG. 4 shows the measurement results by the fully human osteocalcin measurement system (I) prepared in Example 3.

第5図は実施例3において標識抗体としてF(ab′)
を用いた測定結果を示す。
FIG. 5 shows F (ab ′) as a labeled antibody in Example 3.
The measurement result using 2 is shown.

第6図は、実施例4における完全ヒト・オステオカル
シンとそのフラグメントの反応性の測定結果を示す。
FIG. 6 shows the results of measuring the reactivity of fully human osteocalcin and its fragments in Example 4.

第7図は、実施例5における逆相HPLCにおける緩衝液
の流入条件を示す。
FIG. 7 shows conditions of inflow of buffer solution in reverse phase HPLC in Example 5.

第8図は、実施例5における各フラクシヨンのヒト・
オステオカルシンの抗原活性を示す。
FIG. 8 shows humans of each fraction in Example 5.
3 shows the antigenic activity of osteocalcin.

第9図は実施例6による健常人及び骨肉腫患者の血清
中のヒト・オステオカルシンの測定結果を示す。
FIG. 9 shows the measurement results of human osteocalcin in serum of healthy subjects and osteosarcoma patients according to Example 6.

第10図は、実施例7による副甲状腺機能亢進症患者の
血漿中のヒト・オステオカルシンの測定結果を示す。
FIG. 10 shows the measurement results of human osteocalcin in plasma of patients with hyperparathyroidism according to Example 7.

第11図は、実施例8による完全ヒト・オステオカルシ
ン及びそのフラグメントの合計量の測定系(III)の測
定結果を示す。
FIG. 11 shows the measurement results of the measurement system (III) for the total amount of fully human osteocalcin and its fragments according to Example 8.

第12図は、実施例12による完全ヒト・オステオカルシ
ンの測定結果を示す。
FIG. 12 shows the measurement results of fully human osteocalcin according to Example 12.

第13図は、実施例14による完全ヒト・オステオカルシ
ン及びそのフラグメントの合計量の測定系(II)の測定
結果を示す。
FIG. 13 shows the measurement results of the total amount of fully human osteocalcin and fragments thereof according to Example 14 in the measurement system (II).

第14図は、実施例16における各フラクシヨンのヒト・
オステオカルシンの抗原活性を示す。
FIG. 14 is a diagram of humans of each fraction in Example 16.
3 shows the antigenic activity of osteocalcin.

第15図は、実施例17における健常人、腎疾患患者及び
骨粗鬆症患者の血清中のヒト・オステオカルシンN末端
フラグメントの測定結果を示す。
FIG. 15 shows the measurement results of human osteocalcin N-terminal fragment in serum of healthy subjects, renal disease patients and osteoporosis patients in Example 17.

第16図は、実施例18におけるヒト・オステオカルシン
フラグメント測定における臨床意義を示す。
FIG. 16 shows clinical significance in measuring human osteocalcin fragment in Example 18.

実施例 以下実施例により本発明を詳述するが、これは本発明
の理解を容易にするためのものであって、本発明はこれ
らに限定されるものではない。なお実施例中“%”とあ
るのは“重量%”を意味する。
EXAMPLES The present invention is described in detail below with reference to examples, but this is for facilitating the understanding of the present invention, and the present invention is not limited to these. In the examples, “%” means “% by weight”.

実施例1 (N末端1〜20位のアミノ酸配列領域中に認識部位を有
するポリクローナル抗体の作成) (A)N末端1〜20残基のペプチドの合成 ヒト・オステオカルシンのN末端に特異的なアミノ酸
配列1〜20残基及び21残基目にシステインを入れた、第
1図で示すペプチドを合成した。
Example 1 (Preparation of Polyclonal Antibody Having Recognition Site in Amino Acid Sequence Region of N-Terminal 1 to 20 Position) (A) Synthesis of Peptide of N-Terminal 1 to 20 Residues Amino Acid Specific to N-Terminal of Human Osteocalcin The peptides shown in FIG. 1 were synthesized with cysteines at residues 1-20 and 21 of the sequence.

合成についてはABI社ペプチド合成機を用いた。この
ペプチドの名称をOst−N(20)とした。
ABI peptide synthesizer was used for the synthesis. The name of this peptide was Ost-N (20).

(B)抗原(Ost−N(20)とキヤリヤータンパクの結
合体)の作成 キーホール リンペツト ヘモシアニン(KLH)をキ
ヤリアータンパクとし、N−(m−マレイミド安息香
酸)−N−サクシンイミドエステル(MBS)によりKLHを
MBS化した。一方、Ost−N(20)を2−メルカプトエタ
ノールによりSH基をフリーにし、MBS化KLHにOst−N(2
0)を滴下しながら反応溶液をpH6.0〜6.5に保ちつつ反
応させた。3時間反応後、透析し、得られた生成物を抗
原として用いた。
(B) Preparation of antigen (conjugate of Ost-N (20) and carrier protein) Keyhole limpet hemocyanin (KLH) was used as carrier protein and N- (m-maleimidobenzoic acid) -N-succinimide ester ( KLH by MBS)
Converted to MBS. On the other hand, Ost-N (20) was made free of SH groups with 2-mercaptoethanol, and MBS-form KLH was converted to Ost-N (2
0) was added dropwise and the reaction solution was allowed to react while maintaining the pH at 6.0 to 6.5. After reacting for 3 hours, it was dialyzed and the obtained product was used as an antigen.

(C)ポリクローナル抗体の作成 Ost−N(20)のKLH結合体を500μg/l shotにて家兎
に免疫をした。
(C) Preparation of polyclonal antibody Rabbits were immunized with Ost-N (20) KLH conjugate at 500 μg / l shot.

2週間間隔で6回免疫後、抗体価が上昇したため採血
をし、抗体をプロテインA−Sepharoseで精製、目的と
する抗体を得た。
After immunization 6 times at intervals of 2 weeks, blood was collected because the antibody titer increased, and the antibody was purified by protein A-Sepharose to obtain the desired antibody.

実施例2 (C末端43〜49位のアミノ酸配列領域中に認識部位を有
するポリクローナル抗体の作成) (A)C末端43〜49位のアミノ酸残基のペプチドの合成 ヒト・オステオカルシンのC末端に特異的なアミノ酸
配列43〜49位のアミノ酸残基を有する第2図に示すペプ
チドをABI社ペプチド合成機を用いて合成した。このペ
プチドの名称をOst−C(7)とした。
Example 2 (Preparation of Polyclonal Antibody Having Recognition Site in C-Terminal 43-49th Amino Acid Sequence Region) (A) Synthesis of Peptide of C-Terminal 43-49th Amino Acid Residue Specific to C-terminal of human osteocalcin The peptide shown in FIG. 2 having the amino acid residues at the 43-49th amino acid sequence was synthesized using ABI's peptide synthesizer. The name of this peptide was designated as Ost-C (7).

(B)抗原(Ost−C(7)とキヤリアタンパクの結合
体)の作成 Ost−C(7)とKLHとを同重量ずつ混合し、カルボジ
イミド(DCC)を反応させ、Ost−C(7)とKLHの結合
体を作成した。
(B) Preparation of Antigen (Ost-C (7) and Carrier Protein Conjugate) Ost-C (7) and KLH are mixed in equal weights and reacted with carbodiimide (DCC) to prepare Ost-C (7). And a KLH conjugate was created.

得られた生成物をHPLCのゲル濾過を用いて生成した。 The resulting product was produced using HPLC gel filtration.

(C)ポリクローナル抗体の作成 Ost−C(7)のKLH結合体を、500μ/l shotにて家兎
に免疫した。以後は実施例1と同様にして、目的とする
抗体を得た。
(C) Preparation of Polyclonal Antibody Ost-C (7) KLH conjugate was immunized into rabbits at 500 μl / shot. Thereafter, the target antibody was obtained in the same manner as in Example 1.

参考例 (C末端35〜19位のアミノ酸配列領域中に認識部位を有
するポリクローナル抗体の作成) (A)C末端35〜49位のアミノ酸残基のペプチド合成 ヒト・オステオカルシンC末端に特異的なアミノ酸配
列36〜49残基及び35残基目にシステインを有する第3図
に示すペプチドを合成した。
Reference Example (Preparation of Polyclonal Antibody Having Recognition Site in Amino Acid Sequence Region at C-Terminal 35-19 Position) (A) Peptide Synthesis of Amino Acid Residue at C-Terminal 35-49 Position Amino acid specific to C-terminal of human osteocalcin The peptide shown in FIG. 3 having cysteines at residues 36-49 and 35 of the sequence was synthesized.

合成についてはABI社ペプチド合成機を用いた。この
ペプチドの名称をOst−C(15)とした。
ABI peptide synthesizer was used for the synthesis. The name of this peptide was designated as Ost-C (15).

(B)Ost−C(15)とキヤリアタンパクの結合 実施例2の(B)と同じ方法を用い、上記Ost−C(1
5)とKLHの結合体を作成した。
(B) Binding of Ost-C (15) to Carrier Protein Using the same method as in (B) of Example 2, the above Ost-C (1
5) and a KLH conjugate were prepared.

(C)ポリクローナル抗体の作成 実施例2の(C)と同じ方法を用い、上記Ost−C(1
5)のKLH結合体を抗原として、目的とする抗体を得た。
(C) Preparation of Polyclonal Antibody Using the same method as in (C) of Example 2, the Ost-C (1
The target antibody was obtained using the KLH conjugate of 5) as an antigen.

実施例3(完全ヒト・オステオカルシン測定系(I)の
構成) (A)ホスラデイツシユ・ペルオキシダーゼ(HRP)標
識抗体の調製 (1)抗Ost−N(20)抗体(IgC)のHRP標識化; 前記実施例により得られた抗Ost−N(20)抗体のImg
/ml0.01Mリン酸0.15M NaCl(pH7.4)溶液2mlに、MBS10
mg/mlの濃度のジメチルホルムアミド溶液50μを添加
し、25℃の温度で30分間反応させた。次いでセフアデツ
クスG−25を充填したカラムを用い、0.1Mリン酸緩衝液
(0.1MPB)(pH6.0)でゲル濾過を行い、マレイミド化
抗体と未反応MBSとを分離した。
Example 3 (Structure of Complete Human Osteocalcin Assay System (I)) (A) Preparation of Phosphorus dashisyu Peroxidase (HRP) Labeled Antibody (1) HRP Labeling of Anti-Ost-N (20) Antibody (IgC); Img of anti-Ost-N (20) antibody obtained by example
/ ml 0.01M phosphoric acid 0.15M NaCl (pH7.4) solution 2ml, MBS10
50 μm of a dimethylformamide solution having a concentration of mg / ml was added, and the mixture was reacted at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes. Then, using a column packed with Sephadex G-25, gel filtration was performed with 0.1 M phosphate buffer (0.1 MPB) (pH 6.0) to separate the maleimidated antibody and unreacted MBS.

一方、HRPの10mg/mlの0.1MPB(pH6.5)溶液2mlにS−
アセチルメルカプト無水コハク酸の60mg/mlジメチルホ
ルムアミド溶液120μを加え、25℃で2時間反応させ
た。次に0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)を800μ、
0.1MEDTA160μ、1M ヒドロキシルアミン1.6mlを加
え、0℃で4分間反応させた。その後、反応液をコロジ
オンバツグに入れ、0.1MPB(pH6.0)、5mMEDTA含有溶液
を用いて、4℃で3日間透析し、チオール化HRPを得
た。
On the other hand, 2 ml of a 10 mg / ml solution of HRP in 0.1 MPB (pH 6.5) was added to S-
120 μl of a 60 mg / ml dimethylformamide solution of acetylmercaptosuccinic anhydride was added and reacted at 25 ° C. for 2 hours. Next, 800 μl of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0),
160 M of 0.1 M EDTA and 1.6 ml of 1 M hydroxylamine were added, and the mixture was reacted at 0 ° C. for 4 minutes. Then, the reaction solution was placed in a collodion bag and dialyzed with a solution containing 0.1MPB (pH 6.0) and 5mM EDTA at 4 ° C for 3 days to obtain a thiolated HRP.

次に、マレイミド化抗体2mgとチオール化HRP4mgとを
混合し、コロジオンバツグを用いて氷冷下に4〜10mg/m
lの蛋白濃度になるまで濃縮し、15〜20℃で一夜放置し
た。その液を、ウルトロゲルACA 44(LKB社)を充填し
たカラムでゲル濾過し、HRP標識抗Ost−N(20)抗体を
得た。
Next, 2 mg of maleimidated antibody and 4 mg of thiolated HRP were mixed, and 4-10 mg / m under ice cooling using a collodion bag.
It was concentrated to a protein concentration of 1 and left overnight at 15-20 ° C. The solution was subjected to gel filtration through a column packed with Ultrogel ACA 44 (LKB) to obtain an HRP-labeled anti-Ost-N (20) antibody.

(2)抗Ost−N(20)抗体(F(ab′)のHRP標識
化; 前記実施例1により得られた抗Ost−N(20)抗体の
2.0mg/mlのPBS溶液1mlに、1Mの酢酸緩衝液(pH4.2)100
μと、40μgのペプシンを20μの同緩衝液に溶解し
て加え、37℃、4時間反応させた。反応終了後、PBSに
て平衡化したセフアデツクスG25カラム(φ2cm×45cm)
を用いて分離しF(ab′)を採取した。HRP標識抗Ost
−N(20)(F(ab′))抗体の調整は、実施例1
(A)(1)に準じて行なった。
(2) HRP labeling of anti-Ost-N (20) antibody (F (ab ') 2 ; of the anti-Ost-N (20) antibody obtained in Example 1 above
To 1 ml of 2.0 mg / ml PBS solution, add 1M acetate buffer (pH 4.2) 100
μ and 40 μg of pepsin were dissolved in 20 μ of the same buffer and added, and reacted at 37 ° C. for 4 hours. After completion of the reaction, Sephadex G25 column (φ2cm × 45cm) equilibrated with PBS
And F (ab ') 2 was collected. HRP labeled anti-ost
Preparation of the -N (20) (F (ab ') 2 ) antibody was carried out according to Example 1
(A) The procedure was performed according to (1).

(3)抗Ost−N(20)抗体(Fab′)のHRP標識化; 抗Ost−N(20)抗体のF(ab′)分画を前記
(2)に準じて作成し、これをメルカプトエチルアミン
を用いて還元してトーソーG3000SWカラムによるゲル濾
過HPLCにてFab′を精製した。
(3) HRP labeling of anti-Ost-N (20) antibody (Fab ′); F (ab ′) 2 fraction of anti-Ost-N (20) antibody was prepared according to the above (2), and this was prepared. Fab ′ was purified by gel filtration HPLC using a Tosoh G3000SW column by reduction with mercaptoethylamine.

一方HRPは、実施例3(A)(l)の抗Ost−N(20)
抗体のマレイミド化に準じて、HRPをマレイミド化し
た。次に、抗Ost−N(20)抗体(Fab′)2mgとマレイ
ミド化HRP4mgとを混合し、フイルトロン(限外濾過装
置)を用いて濃縮した後、4℃で16時間反応させた。こ
れを、トーソーG3000SWカラムによるゲル濾過HPLCにて
単離精製して、HRP標識抗Ost−N(20)(Fab′)抗体
を得た。
On the other hand, HRP is the anti-Ost-N (20) of Example 3 (A) (l).
HRP was maleimidized according to the maleimidization of the antibody. Next, 2 mg of the anti-Ost-N (20) antibody (Fab ′) and 4 mg of maleimidated HRP were mixed, concentrated using a Filtron (ultrafiltration device), and then reacted at 4 ° C. for 16 hours. This was isolated and purified by gel filtration HPLC using a Toso G3000SW column to obtain an HRP-labeled anti-Ost-N (20) (Fab ') antibody.

(B)抗体固定化ビーズの調製 (1)抗体の固定化 ポリスチレン製ビーズ(直径6mm)をよく洗浄してか
ら、抗Ost−C(7)及び抗Ost−C(15)抗体の20μg/
mlの濃度を有するPBS溶液中に4℃の温度で1昼夜放置
した後、PBSで洗浄し、1%牛血清アルブミン(BSA)の
PBS溶液中に、4℃の温度で1昼夜放置してポストコー
テイング処理をして、抗Ost−C(7)、抗Ost−C(1
5)抗体固定化ビーズを得た。
(B) Preparation of antibody-immobilized beads (1) Immobilization of antibody After washing polystyrene beads (6 mm in diameter) thoroughly, 20 μg / anti-Ost-C (7) and anti-Ost-C (15) antibodies
After leaving it in a PBS solution having a concentration of ml at a temperature of 4 ° C. for 1 day, it was washed with PBS, and 1% bovine serum albumin (BSA) was added.
After anti-Ost-C (7) and anti-Ost-C (1
5) The antibody-immobilized beads were obtained.

(2)抗体固定化ビーズの活性評価 上記(1)で調製した抗Ost−C(7)抗体及び抗Ost
−C(15)抗体のそれぞれの活性を、以下の手法で調べ
た。各抗体を固定化したビーズ各1個と、精製したヒト
・オステオカルシン(標準物質)を0〜50ng/mlの範囲
で含有する1%BSA含有0.05Mトリス−塩酸、0.15M NaC
l緩衝液(0.05M TBS)(pH8.0)200μとHRP標識抗Os
t−N(20)抗体のFab′分画を含有する1%BSA含有0.0
5M TBS(pH8.0)溶液200μを試験管に添加して、4
℃の温度で17時間インキユベートした。次に試験管内の
溶液を吸引除去した後、0.05M TBS(pH8.0)で洗浄し
てから、3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン塩酸
塩、0.02%H2O2 2.5mMを含有する、0.1Mリン酸/クエ
ン酸緩衝液(pH4.3)を0.4mlずつ各試験管に加え、25℃
の温度で30分間反応させた後、反応停止剤として1N硫酸
水溶液を1mlずつ加えて酵素反応を停止させた。
(2) Activity evaluation of antibody-immobilized beads Anti-Ost-C (7) antibody and anti-Ost prepared in (1) above
The activity of each -C (15) antibody was examined by the following method. 0.05M Tris-HCl, 0.15M NaC containing 1% BSA containing 1 bead immobilized with each antibody and purified human osteocalcin (standard substance) in the range of 0 to 50 ng / ml
l Buffer (0.05M TBS) (pH8.0) 200μ and HRP labeled anti-Os
0.0% containing 1% BSA containing Fab ′ fraction of t-N (20) antibody
Add 200μ of 5M TBS (pH8.0) solution to the test tube and
Incubated for 17 hours at a temperature of ℃. Next, the solution in the test tube was removed by suction and washed with 0.05M TBS (pH8.0), and then 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine hydrochloride, 0.02% H 2 O 2 2.5mM 0.1M Phosphate / Citrate buffer (pH4.3) containing 0.4ml is added to each test tube at 25 ℃
After reacting at the temperature of 30 minutes, 1 ml of 1N sulfuric acid aqueous solution was added as a reaction terminator to stop the enzyme reaction.

次いで、この溶液を分光光度計を用いて450nmの波長
における吸収強度を測定し、これを標準物質濃度0〜10
0ng/mlに対応してプロツトした。結果を第4図に示す。
Then, the absorption intensity of this solution was measured at a wavelength of 450 nm using a spectrophotometer, and the concentration of the standard substance was adjusted to 0-10.
Plated corresponding to 0 ng / ml. Results are shown in FIG.

(C)測定系の構成 実施例3(B)(l)で調製した、光Ost−C(7)
固定化ビーズ1個と、精製したヒト・オステオカルシン
(標準物質)を0〜20ng/mlの範囲で含有する1%BSA含
有0.05M TBS(pH8.0)200μと実施例3(A)(1)
〜(3)で作成した各種HRP標識抗体の1%BSA含有0.05
M TBS(pH8.0)溶液200μとを、固体化抵抗ビーズと
HRP標識抗体のIgG、F(ab′)分画との組み合わせで
それぞれの試験管に添加して、25℃の温度で2時間イン
キユベートした。次に試験管内の溶液を吸引除去した
後、0.05M TBS(pH8.0)で洗浄してから、3,3′,5,5′
−テトラメチルベンジン塩酸塩0.02%H2O2 2.5mMを含
有する0.1Mリン酸/クエン酸緩衝液(pH4.3)を0.4mlず
つ各試験管に加え、25℃の温度で30分間反応させた後、
反応停止剤として1N硫酸水溶液を1mlずつ加えて酵素反
応を停止させた。次いで、この溶液を分光光度計を用い
て450nmの波長における吸収強度を測定し、これを標準
物質濃度0〜20ng/mlに対応してプロツトすることによ
りHRP標準抗体の分画によるN/S比(抗原Ong/mlの吸光度
を抗原20ng/mlの吸光度で割った値)を算出した。結果
を第1表に示す。
(C) Configuration of measurement system Optical Ost-C (7) prepared in Example 3 (B) (l)
Example 3 (A) (1) with one immobilized bead and 0.05 M TBS (pH 8.0) 200 µ containing 1% BSA containing purified human osteocalcin (standard substance) in the range of 0 to 20 ng / ml.
~ Various HRP-labeled antibodies prepared in (3) containing 1% BSA 0.05
M TBS (pH8.0) solution 200μ and solidified resistance beads
The HRP-labeled antibody was added to each test tube in combination with IgG and F (ab ') 2 fractions and incubated at a temperature of 25 ° C for 2 hours. Then, remove the solution in the test tube by suction, wash with 0.05M TBS (pH8.0), and then remove 3,3 ', 5,5'.
-Add 0.4 ml of 0.1 M phosphoric acid / citrate buffer (pH 4.3) containing tetramethylbenzidine hydrochloride 0.02% H 2 O 2 2.5 mM to each test tube and allow to react at 25 ° C for 30 minutes. After
The enzymatic reaction was stopped by adding 1 ml of 1N sulfuric acid aqueous solution as a reaction terminator. Then, the absorption intensity of this solution at a wavelength of 450 nm was measured using a spectrophotometer, and this was plotted at a standard substance concentration of 0 to 20 ng / ml to obtain an N / S ratio by fractionation of the HRP standard antibody. (A value obtained by dividing the absorbance of antigen Ong / ml by the absorbance of antigen 20 ng / ml) was calculated. The results are shown in Table 1.

第1表のごとくHRP標識抗体の種類によって測定感度
がかわり、F(ab′)、IgG分画のものがバツクグラ
ンドが低く、より高感度な測定系を構成することが明ら
かである。
As shown in Table 1, it is clear that the measurement sensitivity changes depending on the type of HRP-labeled antibody, and that the F (ab ') 2 and IgG fractions have a low background and constitute a higher sensitivity measurement system.

HRP標識抗体(F(ab′))を用いた検量線を第5
図に示す。
The calibration curve using HRP-labeled antibody (F (ab ′) 2 )
Shown in the figure.

実施例4 [完全ヒト・オステオカルシン測定系(I)の完全分子
特異性の検討(1)] ヒト・オステオカルシン1μg/ml(0.1Mトリス緩衝液
pH8.0)を1.7ml調製し、その各々0.2mlをトリプシンを
用いて、各々、ヒト・オステオカルシン/トリプシン
(w/w比)が1/2()、1/1)、2/1()、10/1
()、50/1()、1/10()となるように調製し、
25℃、60分間反応させ、それぞれをベンザミジンにて反
応を停止させた。得られたそれぞれの反応液を前記完全
ヒト・オステオカルシン測定系(I)を用いて測定した
結果を第6図に示した。
Example 4 [Study on Perfect Molecular Specificity of Complete Human Osteocalcin Assay System (I) (1)] Human osteocalcin 1 μg / ml (0.1 M Tris buffer)
pH8.0) was prepared in 1.7 ml, and 0.2 ml of each was prepared using trypsin, and human osteocalcin / trypsin (w / w ratio) was 1/2 (), 1/1), 2/1 (), respectively. , 10/1
(), 50/1 (), 1/10 (),
The reaction was carried out at 25 ° C for 60 minutes, and the reaction was stopped with benzamidine. The results of measurement of each of the obtained reaction solutions using the above-mentioned fully human osteocalcin measurement system (I) are shown in FIG.

第6図の結果から、未処理のヒト・オステオカルシン
がトリプシンになる切断条件がきびしくなるに従って、
オステオカルシンの量が0に収束する結果が得られ、こ
のことはヒト・オステオカルシンの完全分子特異性を示
唆しているものと考えられる。
From the results of FIG. 6, as the untreated human osteocalcin becomes trypsin, the cleavage conditions become more severe,
The result that the amount of osteocalcin converged to 0 was obtained, which is considered to suggest the complete molecular specificity of human osteocalcin.

実施例5 [完全ヒト・オステオカルシン測定系(I)の完全分子
特異性の検討(2)] ヒト・オステオカルシン99ngを200μの0.1Mトリス
緩衝液(pH8.0)に溶解し、トリプシン[ヒト・オステ
オカルシン:トリプシン=1:0.5(w/w)]を用いて25
℃、60分間反応させ、ベンサミジンにて反応を停止させ
た。
Example 5 [Examination of Complete Molecular Specificity of Complete Human Osteocalcin Assay System (I) (2)] 99 ng of human osteocalcin was dissolved in 200 µ of 0.1 M Tris buffer (pH 8.0), and trypsin [human osteocalcin was used. : Trypsin = 1: 0.5 (w / w)]
The reaction was performed at 60 ° C for 60 minutes, and the reaction was stopped with benzamidine.

反応液を逆相HPLC(ODS120Tカラム)を下記条件にて
分離した。
The reaction solution was separated by reverse phase HPLC (ODS120T column) under the following conditions.

分離条件: (i)カラム; TSK−gel(東ソー社製)ODS−1207(Lot 12THO257) (ii)緩衝液; A液 0.1%TFA/DW B液 80%アセトニトリル、0.1%TFA/DW (iii)分離; A→B 第7図に示したグラジエント(OD210nm) 1ml
/min Flow 各フラクシヨン1mlをサンプリングし、各フラクシヨ
ンのオステオカルシン抗原活性を、前記完全ヒト・オス
テオカルシン測定系(I)により測定した。その結果を
第8図の[本発明]の項に示した。その結果、第8図に
示されるように、フラクシヨンNo55近辺にのみ抗原活性
が認められ、ヒト・オステオカルシンの完全分子特異性
が確認された。一方同一の各フラクシヨンをミドリ十字
社製のCISキツトにて測定した結果を第8図の[従来
法]の項に示した。その結果、抗原活性は完全分子に相
当するフラクシヨンNo55近辺のみならず、フラクシヨン
No52近辺にも存在する。このことはこの従来法は完全分
子のみならず中間領域のフラグメントをも同時に測定す
る欠点を有していることが確認された。この従来法のフ
ラグメント測定は完全分子に対して非定量的であること
が第6図中の−△−△からわかる。
Separation conditions: (i) Column; TSK-gel (manufactured by Tosoh Corporation) ODS-1207 (Lot 12THO257) (ii) Buffer solution: A solution 0.1% TFA / DW B solution 80% acetonitrile, 0.1% TFA / DW (iii) Separation; A → B 1 ml of the gradient (OD210nm) shown in FIG.
/ min Flow 1 ml of each fraction was sampled, and the osteocalcin antigen activity of each fraction was measured by the fully human osteocalcin assay system (I). The results are shown in [Invention] of FIG. As a result, as shown in FIG. 8, the antigenic activity was observed only in the vicinity of fraction No55, confirming the complete molecular specificity of human osteocalcin. On the other hand, the results of measuring the same fractions with a CIS kit manufactured by Midori Jushisha are shown in the [Conventional method] section of FIG. As a result, the antigenic activity was found not only in the vicinity of fraction No55, which corresponds to the complete molecule, but also in the fraction.
It exists near No52. This confirms that this conventional method has the drawback of simultaneously measuring not only the complete molecule but also the fragment in the intermediate region. It can be seen from -Δ-Δ in FIG. 6 that this conventional fragment measurement is non-quantitative with respect to the complete molecule.

実施例6 (ヒト血清のオステオカルシンの測定) 実施例3によって確立した測定系(I)を用いて、骨
肉腫の患者について、その血清中のヒト・オステオカル
シン値を測定した。
Example 6 (Measurement of osteocalcin in human serum) The measurement system (I) established in Example 3 was used to measure the human osteocalcin level in serum of a patient with osteosarcoma.

その結果を第9図に示すが、その結果は明らかに健常
人に対して患者の測定値は高値を示し、本測定方法が実
際の患者中のオステオカルシンを測定しうることが明ら
かである。
The results are shown in FIG. 9. The results clearly show that the measured values of the patient are higher than those of the healthy person, and it is clear that this measuring method can measure the actual osteocalcin in the patient.

実施例7 (ヒト血漿中のオステオカルシンの測定) 実施例3によって確立した測定系(I)を用いて、副
甲状腺機能亢進症の患者について、その血漿中のヒト・
オステオカルシンの量を測定した。その結果を第10図に
示すが、その結果は明らかに健常人に対して患者の測定
値は高い値を示している。
Example 7 (Measurement of osteocalcin in human plasma) Using the measurement system (I) established in Example 3, a patient with hyperparathyroidism in a human plasma
The amount of osteocalcin was measured. The results are shown in Fig. 10. The results clearly show that the measured values of patients are higher than those of healthy people.

実施例8 [完全ヒト・オステオカルシン及びそのフラグメントの
合計量の測定系(III)の構成] 抗Ost−N(20)抗体のIgG分画20μg/mlPBS溶液を作
成し、それにポリスチレンボール(φ=6.3mm)を浸漬
し、抗Ost−N(20)抗体固定ポリスチレンボールを得
た。一方酵素標識抗体として抗Ost−N(20)抗体F(a
b′)を用い、抗原N末端1−19残基ペプチド[“抗
原ペプチド(N−19)”という]を濃度依存的に作成
し、抗Ost−N(20)対抗固定スチレンボールをを同時
に加え2時間37℃で反応した。反応後PBSにて3回洗浄
し発色反応を行った。その結果を第11図に示した。第11
図によれば抗原ペプチド(N−19)の量に依存してOD
450nmの変化があり、オステオカルシンN末端フラグメ
ント(N−19)のサンドイッチ法による測定の可能性が
得られた。
Example 8 [Constitution of measurement system (III) for total amount of fully human osteocalcin and its fragments] An anti-Ost-N (20) antibody IgG fraction 20 µg / ml in PBS was prepared, and polystyrene balls (φ = 6.3) were prepared. mm) was immersed in the solution to obtain polystyrene balls immobilized with anti-Ost-N (20) antibody. On the other hand, anti-Ost-N (20) antibody F (a
b ′) 2 was used to prepare an antigen N-terminal 1-19 residue peptide [referred to as “antigen peptide (N-19)”] in a concentration-dependent manner, and anti-Ost-N (20) anti-fixing styrene balls were simultaneously added The reaction was continued for 2 hours at 37 ° C. After the reaction, the plate was washed 3 times with PBS to carry out color reaction. The results are shown in Fig. 11. 11th
According to the figure, the OD depends on the amount of the antigen peptide (N-19).
There was a 450 nm change, giving the possibility of measuring the osteocalcin N-terminal fragment (N-19) by the sandwich method.

実施例9 (モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製) (1)抗原刺激リンパ球の調製 雄Balb/cマウスの腹腔内に、前記実施例1(A)及び
Bで得られたOst−N(20)−KLH結合体90μgと完全フ
ロイント・アジユバンドとのエマルジヨンを投与した。
その後3〜4週間間隔で5回、Ost−N(20)−KLH結合
体40〜50μgと不完全アジユバントとのエマルジヨンを
腹腔内投与した。5回目投与後14日目にOst−N(20)
−KLH結合体60μgを生理食塩水1.0mlに溶かし静脈内投
与し、その4日後に無菌的にマウスから脾臓を取り出
し、ステンレス製メツシユを通過させることにより、L
−グルタミン0.39g/、硫酸カナマイシン0.2g/及びN
aHCO3 2.0g/を補充したRPMI−1640(GIBCO製)中に
浮遊させた脾細胞懸濁液を調製した。該浮遊細胞を前記
培地で3回洗浄後、脾細胞懸濁液を調製した。
Example 9 (Preparation of monoclonal antibody-producing hybridoma) (1) Preparation of antigen-stimulated lymphocytes Male Balb / c mice were intraperitoneally injected with Ost-N (20) -obtained in Examples 1 (A) and B above. Emulsion of 90 μg of KLH conjugate and complete Freund's Ajyuband was administered.
Thereafter, an emulsion of 40 to 50 μg of Ost-N (20) -KLH conjugate and incomplete adjuvant was intraperitoneally administered 5 times at 3 to 4 week intervals. 14 days after the 5th administration, Ost-N (20)
-KLH conjugate (60 μg) was dissolved in physiological saline (1.0 ml) and administered intravenously. Four days later, the spleen was aseptically removed from the mouse and passed through a stainless mesh to obtain L.
-Glutamine 0.39 g /, kanamycin sulfate 0.2 g / and N
A splenocyte suspension suspended in RPMI-1640 (GIBCO) supplemented with 2.0 g / aHCO 3 was prepared. The floating cells were washed 3 times with the above medium, and then a splenocyte suspension was prepared.

(2)細胞融合 マウス骨髄腫細胞P3U1は、硫酸カナマイシン0.2g/
を補充したGIT合成培地(大五栄養化学(株)製)中で
培養した。骨髄種細胞は細胞融合の時点に細胞分裂の対
数期にあった。該脾細胞と該骨髄種細胞とを細胞数3対
1の比率で無血清RPMI−1640培地中に懸濁し、5分間13
00rpmで遠心分離した。上記培地を除去した後、沈降細
胞に平均分子量1,500の50%ポリエチレングリコール溶
液(Ph8.2)1mlを静かに加えつつ懸濁液とした。その後
無血清RPMI−1640培地9mlを加え、細胞を注意深く振盪
した。その後5分間1,000rpmで遠心分離して上清培地を
除去した後、細胞を沈降物として集めるGIT培地40mlに
懸濁した。
(2) Cell fusion Mouse myeloma cell P3U1 contains kanamycin sulfate 0.2 g /
The cells were cultured in GIT synthetic medium (manufactured by Daigo Nutrition Chemical Co., Ltd.) supplemented with. Myeloid cells were in the exponential phase of cell division at the time of cell fusion. The spleen cells and the myeloid cells were suspended in serum-free RPMI-1640 medium at a cell number ratio of 3: 1 for 5 minutes.
Centrifuge at 00 rpm. After removing the medium, 1 ml of a 50% polyethylene glycol solution (Ph8.2) having an average molecular weight of 1,500 was gently added to the precipitated cells to form a suspension. Then 9 ml of serum free RPMI-1640 medium was added and the cells were shaken carefully. After that, centrifugation was performed at 1,000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant medium, and the cells were suspended in 40 ml of GIT medium collected as a precipitate.

(3)クローン化ハイブリドーマの取得 融合細胞液を96マイクロプレート上に分配した(ウエ
ル1個につき200μ)。このプレートを37℃、5%CO2
雰囲気で培養した。1日後及び2日後に、それ以後2日
間隔で半分量の培地を新たなGIT/HAT培地と交換して培
養した。11日後にハイブリドーマの培養上清中の合成ペ
プチド(1Tyr−20Arg)に対する抗体について酵素免疫
定量法によりスクリーニングを行った。スクリーニング
に用いられた抗原は合成ペプチド(1Tyr−20Arg)、第
2抗体はアルカルフオスフアターゼ標識したヤギ抗マウ
スIgG抗体であった。
(3) Acquisition of cloned hybridoma The fused cell solution was distributed on a 96-microplate (200 µ per well). This plate is 37 ℃, 5% CO 2
Cultured in atmosphere. After 1 day and 2 days, half of the medium was replaced with a new GIT / HAT medium and cultured at intervals of 2 days thereafter. After 11 days, screening was performed for the antibody against the synthetic peptide ( 1 Tyr- 20 Arg) in the culture supernatant of the hybridoma by the enzyme immunoassay method. The antigen used for the screening was a synthetic peptide ( 1 Tyr- 20 Arg), and the second antibody was an alcalph phosphatase-labeled goat anti-mouse IgG antibody.

ハイブリドーマを分配した192ウエル中のうち124ウエ
ル中に融合細胞のコロニーを認め、その内8ウエルが抗
体陽性であった。
Among the 192 wells in which the hybridomas were distributed, colonies of fused cells were observed in 124 wells, and 8 wells of them were antibody-positive.

かくして得られた抗体陽性の各ウエル中のハイブリド
ーマを96マイクロプレートの1ウエル当り0.9細胞にな
るよう希望し、Balb/cマウスの胸腺細胞をフイーダー細
胞として加えプレートに分配し硫酸カナマイシン0.2g/
を補充したGIT培地で培養した。顕微鏡下で観察し確
実にシングル・コロニーであることを認めた。ハイブリ
ドーマの培養上清中の合成ペプチド(1Tyr−20Arg)に
対する抗体について酵素免疫定量法によりスクリーニン
グを行った。各ウエルとともに抗体陽性であり、抗ヒト
・オステオカルシン・モノクローナル抗体を産生してい
た。
The thus-obtained hybridomas in each antibody-positive well were desired to be 0.9 cells per well of 96 microplate, and thymocytes of Balb / c mice were added as feeder cells and distributed to the plate to obtain 0.2 g / kanamycin sulfate.
The cells were cultured in GIT medium supplemented with. Observation under a microscope confirmed that it was definitely a single colony. Screening was carried out by an enzyme immunoassay for the antibody against the synthetic peptide ( 1 Tyr- 20 Arg) in the culture supernatant of the hybridoma. The antibody was positive in each well and produced anti-human osteocalcin monoclonal antibody.

以上のようにして8つのクローン化ハイブリドーマを
取得した。
Eight cloned hybridomas were obtained as described above.

実施例10 (モノクローナル抗体の取得) (1)ハイブリドーマの培養 実施例9によって得たクローン化ハイブリドーマを、
2週間前にプリスタン(和光純薬)0.1mlを腹腔内投与
したBalb/cマウスに、細胞数106〜107個/匹腹腔内投与
した。その後7〜10日目に腹水液2〜3ml/匹を採取し
た。
Example 10 (Acquisition of Monoclonal Antibody) (1) Culture of Hybridoma The cloned hybridoma obtained in Example 9 was
The Balb / c mouse intraperitoneally administered with 0.1 ml of pristane (Wako Pure Chemical Industries) two weeks ago was intraperitoneally administered with 10 6 to 10 7 cells / mouse. On the 7th to 10th days thereafter, 2-3 ml of the ascites fluid / animal was collected.

(2)モノクローナル抗体の精製 採取した腹水液をEyらの方法(P.L.E.y et al.,Immun
ochemistry、15、429、436(1978)参照)により精製し
た。すなわち0.1Mリン酸緩衝液(pH8.0)で平衡化した
プロテインA−セフアロースカラム(ゲル容量5ml)
に、腹水液2〜3mlを流し、その後0.1Mクエン酸ナトリ
ウムのpHが6.0、5.0、4.0及び3.0である緩衝液を順次流
してカラムからモノクローナル抗体を溶出し、精製モノ
クローナル抗体を得た。
(2) Purification of monoclonal antibody The collected ascites fluid was subjected to the method of Ey et al. (PLEy et al., Immun
Ochemistry, 15 , 429, 436 (1978)). That is, Protein A-Sepharose column equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0) (gel volume 5 ml)
Then, 2 to 3 ml of ascites fluid was passed through the column, and then a buffer solution in which 0.1M sodium citrate had a pH of 6.0, 5.0, 4.0 and 3.0 was sequentially passed to elute the monoclonal antibody from the column to obtain a purified monoclonal antibody.

(3)精製したモノクローナル抗体のクラス 精製したモノクローナル抗体の特定のクラスを、クラ
ス特異性抗マウス抗血清を使用してオクタローニーゲル
拡散試験で決定した。その結果を下記表−2に示した。
(3) Class of Purified Monoclonal Antibody A specific class of purified monoclonal antibody was determined in an Octa Loney gel diffusion test using a class-specific anti-mouse antiserum. The results are shown in Table 2 below.

実施例11 (モノクローナル抗体の認識部位異同の検索) 日本免疫ハンドブック「抗腫瘍抗体としてのモノクロ
ーナル抗体」(日本臨床1984年春季増刊号)記載のbind
ing inhibition assay法によりモノクローナル抗体の認
識部位の異同について検索した。
Example 11 (Search for Differences in Recognition Sites of Monoclonal Antibody) The bind described in the Japan Immunology Handbook “Monoclonal Antibody as Antitumor Antibody” (Japanese Clinical 1984 Spring Special Issue)
The ing inhibition assay was used to search for differences in the recognition sites of monoclonal antibodies.

前記実施例2で作成したヒト・オステオカルシンのC
末端ペプチド(43Arg−49Val)に対するポリクローナル
抗体(抗Ost−C(7))の20μg/ml PBS溶液を96穴マ
イクロプレートにウエル当り100μずつ分配し、4℃
で一夜静置し、PBSで洗浄後0.5%BSA−PBSを加え、さら
に一夜静置して、抗Ost−C(7)抗体固定プレートを
作製した。このプレートに精製ヒト・オステオカルシン
の5ng/ml濃度の0.5%BSA−50mMトリス−HCl緩衝液pH8溶
液をウエル当り100μ加え、25℃で1.5時間反応後、50
mMトリス−HCl緩衝液で洗浄した。
C of human osteocalcin prepared in Example 2 above
A 20 μg / ml PBS solution of a polyclonal antibody (anti-Ost-C (7)) against the terminal peptide ( 43 Arg- 49 Val) was distributed to a 96-well microplate in an amount of 100 μ per well, and the temperature was 4 ° C.
The plate was left to stand overnight at 0 ° C., washed with PBS, added with 0.5% BSA-PBS, and left still overnight to prepare an anti-Ost-C (7) antibody-fixed plate. To this plate was added 100 μl of 0.5% BSA-50 mM Tris-HCl buffer pH 8 solution containing purified human osteocalcin at a concentration of 5 ng / ml, and reacted at 25 ° C for 1.5 hours.
It was washed with mM Tris-HCl buffer.

次にホースラデイツシユペルオキシダーゼ(HRP)標
識したヒト・オステオカルシン・モノクローナル抗体Cl
on−12Fの1μg/ml濃度の0.5%BSA−50mMトリス−HCl
(緩衝液をウエル当り50μと各種モノクローナル抗体
の20μg/ml0.5%BSA−50mMトリス−HCl緩衝液をウエル
当り50μを同時に加え、25℃で1.5時間反応させた。
ウエルを50mMトリス−HCl緩衝液(pH8)で洗浄後HRP用
基質液(0.1Mリン酸/クエン酸緩衝液(pH4.5)中に2,
2′−アジノージ[3−エチルエンズチアゾリンスルホ
ネート(6)]ジアンモニウム塩50mg/dlと2M H2O2 5
0μ/dlを含む)150μを加え25℃で6分発色させ
た。0.1Mシユウ酸水溶液を50μ加えて停止反応を行
い、415nmでプレート・リーダーにて測定した。その結
果を下記表−3に示した。
Next, human osteocalcin monoclonal antibody Cl labeled with horseradish peroxidase (HRP)
0.5% BSA-50 mM Tris-HCl at a concentration of 1 μg / ml of on-12F
(50 μl of buffer solution and 20 μg / ml 0.5% BSA-50 mM Tris-HCl buffer solution of various monoclonal antibodies at 50 μm / well were added simultaneously and reacted at 25 ° C. for 1.5 hours.
After washing the wells with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8), the substrate solution for HRP (0.1 M phosphate / citrate buffer (pH 4.5) 2,
2'Ajinoji [3-ethyl Ends thiazoline sulfonate (6)] diammonium salt 50 mg / dl and 2M H 2 O 2 5
150 μm (including 0 μ / dl) was added and color was developed at 25 ° C. for 6 minutes. The termination reaction was carried out by adding 50 μ of 0.1 M oxalic acid aqueous solution, and measurement was carried out at 415 nm with a plate reader. The results are shown in Table 3 below.

下記表−3に示した結果から、実施例6で得た8つの
モノクローナル抗体のうち、Clon−4F、Clon−12Fは、C
lon−9G、Clon−10B及びClon−12Eにより阻害されない
ことから、これらのモノクローナル抗体とは明らかに異
なるエピトープを認識するものであることがわかった。
また、Clon−5EとClon−2AとClon−12Fとはエピトープ
が同じか、あるいは近接して同時に結合できない抗体で
あることが明らかである。
From the results shown in Table 3 below, among the eight monoclonal antibodies obtained in Example 6, Clon-4F and Clon-12F were C
Since it was not inhibited by lon-9G, Clon-10B and Clon-12E, it was found that it recognizes an epitope distinct from those of these monoclonal antibodies.
Further, it is clear that Clon-5E, Clon-2A and Clon-12F are antibodies which have the same epitope or are in close proximity and cannot bind simultaneously.

対照としては、抗GST(グリタチオン)抗体を用い
た。
An anti-GST (glitathione) antibody was used as a control.

実施例12 [モノクローナル抗体を用いた完全ヒト・オステオカル
シン測定系(I)] (1)抗体固定化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ(直径6mm)をよく洗浄してか
ら、実施例10で得たモノクローナル抗体Clon−10Bの20
μg/mlの濃度を有するPBS溶液中に4℃の温度で1昼夜
放置した後、PBSで洗浄し、1%牛血清アルブミン(BS
A)のPBS溶液中に、4℃の温度で1昼夜放置してポスト
コーテイング処理をして、Clon−10B抗体固定化ビーズ
を得た。
Example 12 [Complete human osteocalcin assay system (I) using monoclonal antibody] (1) Preparation of antibody-immobilized beads Monoclonal antibody obtained in Example 10 after polystyrene beads (diameter 6 mm) were thoroughly washed 20 of Clon-10B
After allowing it to stand in a PBS solution having a concentration of μg / ml at a temperature of 4 ° C. for 1 day, it was washed with PBS, and 1% bovine serum albumin (BS
The Clon-10B antibody-immobilized beads were obtained by post-coating treatment in the PBS solution of A) at 4 ° C. for one day.

(2)HRP標識抗体の調製 前記実施例2で作成したヒト・オステオカルシンのC
末端ペプチド(43Arg−49Val)に対するポリクローナル
抗体(抗Ost−C(7))の2.0mg/mlのPBS溶液1mlに、1
Mの酢酸緩衝液(pH4.2)100μと、40μgのペプシン
を20μの同緩衝液に溶解して加え、37℃、4時間反応
させた。
(2) Preparation of HRP-labeled antibody C of human osteocalcin prepared in Example 2 above
1 ml of a 2.0 mg / ml PBS solution of a polyclonal antibody (anti-Ost-C (7)) against the terminal peptide ( 43 Arg- 49 Val) was added to
100 μM of M acetate buffer (pH 4.2) and 40 μg of pepsin were dissolved in 20 μM of the same buffer and added, and reacted at 37 ° C. for 4 hours.

反応終了後、PBSにて平衡化したセフアデツクスG25カ
ラム(φ2cm×45cm)を用いて分離しF(ab′)を採
取した。F(ab′)の1mg/ml 0.01Mリン酸0.15M Na
Cl(pH7.4)溶液2mlに、MBS10mg/mlの濃度のジメチルホ
ルムアミド溶液50μを添加し、25℃の温度で30分間反
応させた。次いでセラデックスG−25を充填したカラム
を用い、0.1Mリン酸緩衝液(0.1MPB)(pH6.0)でゲル
濾過を行い、マレイミド化抗体と未反応MBSとを分離し
た。
After completion of the reaction, separation was performed using a Sephadex G25 column (φ2 cm × 45 cm) equilibrated with PBS, and F (ab ′) 2 was collected. F (ab ') 2 1mg / ml 0.01M Phosphoric acid 0.15M Na
To 2 ml of Cl (pH 7.4) solution, 50 μm of a dimethylformamide solution having a concentration of 10 mg / ml MBS was added, and the mixture was reacted at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes. Then, using a column packed with Ceradex G-25, gel filtration was performed with 0.1 M phosphate buffer (0.1 MPB) (pH 6.0) to separate the maleimidated antibody and unreacted MBS.

一方、HRPの10mg/mlの0.1MPB(pH6.5)溶液2mlにS−
アセチルメルカプト無水コハク酸の60mg/mlジメチルホ
ルムアミド溶液120μを加え、25℃で2時間反応させ
た。
On the other hand, 2 ml of a 10 mg / ml solution of HRP in 0.1 MPB (pH 6.5) was added to S-
120 μl of a 60 mg / ml dimethylformamide solution of acetylmercaptosuccinic anhydride was added and reacted at 25 ° C. for 2 hours.

次に0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)を800μ、0.
1MEDTA160μ、1Mヒドロキシルアミン1.6mlを加え、0
℃で4分間反応させた。その後、反応液をコロジオンバ
ッグに入れ、0.1MPB(pH6.0)、5mMEDTA含有溶液を用い
て、4℃で3日間透析し、チオール化HRPを得た。
Next, add 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0) to 800 μ,
1MEDTA160μ, 1M hydroxylamine 1.6ml was added,
The reaction was carried out at 4 ° C for 4 minutes. Thereafter, the reaction solution was placed in a collodion bag, and dialyzed at 4 ° C. for 3 days using a solution containing 0.1 MPB (pH 6.0) and 5 mM EDTA to obtain a thiolated HRP.

次に、マレイミド化抗体2mgとチオール化HRP4mgとを
混合し、コロジオンバッグを用いて氷冷下に4〜10mg/m
lの蛋白濃度になるまで濃縮し、15〜20℃で一夜放置し
た。その液を、ウルトロゲルAcA44(LKB社)を充填した
カラムでゲル濾過し、HRP標識抗Ost−C(7)抗体を得
た。
Next, 2 mg of maleimidated antibody and 4 mg of thiolated HRP were mixed, and 4-10 mg / m under ice cooling using a collodion bag.
It was concentrated to a protein concentration of 1 and left overnight at 15-20 ° C. The solution was subjected to gel filtration with a column packed with Ultrogel AcA44 (LKB) to obtain an HRP-labeled anti-Ost-C (7) antibody.

(3)サンドイッチEIA測定系 (1)で調整したClon−10B抗体固定化ビーズ1個
と、精製したヒト・オステオカルシン(標準物質)を0
〜20ng/mlの範囲で含有する1%BSA含有0.05M TBS(pH
8.0)200μと(2)で作成したHRP標識抗体の1%BSA
含有0.05M TBS(pH8.0)溶液200μとを、各試験管に
添加して、25℃の温度で2時間インキユベートした。次
に試験管内の溶液を吸引除去した後、0.05M TBS(pH8.
0)で洗浄してから、3,3′,5,5′−テトラメチルベンジ
ジン塩酸塩0.02%及びH2O2 2.5mMを含有する0.1Mリン
酸/クエン酸緩衝液(pH4.3)を0.4mlずつ各試験管に加
え、25℃の温度で30分間反応させた後、反応停止剤とし
て1N硫酸水溶液を1mlずつ加えて酵素反応を停止させ
た。次いで、この溶液を分光光度計を用いて450nmの波
長における吸収強度を測定した。これを標準物質濃度0
〜20ng/mlに対応してプロットした検量線を第12図に示
した。この結果から、本発明の測定方法を用いれば0.05
ng/mlまで精度よく測定可能であることがわかる。
(3) Sandwich EIA measurement system One Clon-10B antibody-immobilized bead prepared in (1) and purified human osteocalcin (standard substance)
0.05M TBS containing 1% BSA (pH: 20 ng / ml)
8.0) 200μ and 1% BSA of HRP-labeled antibody prepared in (2)
200 μL of 0.05 M TBS (pH 8.0) solution was added to each test tube and incubated at a temperature of 25 ° C. for 2 hours. Next, the solution in the test tube was removed by suction, and then 0.05 M TBS (pH 8.
After washing with 0), a 0.1 M phosphate / citrate buffer solution (pH 4.3) containing 0.03% of 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine hydrochloride and 2.5 mM of H 2 O 2 was added. 0.4 ml each was added to each test tube and reacted at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes, and then 1 ml of 1N sulfuric acid aqueous solution was added as a reaction terminator to stop the enzymatic reaction. Next, the absorption intensity of this solution was measured at a wavelength of 450 nm using a spectrophotometer. This is the standard substance concentration 0
The calibration curve plotted corresponding to ~ 20 ng / ml is shown in FIG. From this result, 0.05 using the measurement method of the present invention.
It can be seen that accurate measurement is possible up to ng / ml.

実施例13 (特異性の検討) 実施例12にて構成した測定系を用いて、ウシ・オステ
オカルシン(10、5、2.5、1.25ng/ml)を測定し、以下
の計算式に従って交叉反応性を算出した。なお、固相抗
体用のモノクローナル抗体(MCA)として、Clon−10B、
2A、12E、12F及び前記実施例1で作成したヒト・オステ
オカルシンのN末端ペプチド(1Tyr−20Arg)に対する
ポリクローナル抗体(PCA)(抗Ost−N(20))を所定
の濃度にて使用した。
Example 13 (Examination of specificity) Bovine osteocalcin (10, 5, 2.5, 1.25 ng / ml) was measured using the measurement system configured in Example 12, and cross-reactivity was determined according to the following calculation formula. It was calculated. As a monoclonal antibody (MCA) for solid phase antibody, Clon-10B,
Polyclonal antibody (PCA) (anti-Ost-N (20)) against 2A, 12E, 12F and the N-terminal peptide of human osteocalcin ( 1 Tyr- 20 Arg) prepared in Example 1 was used at a predetermined concentration. .

結果を表−4に示した。 The results are shown in Table-4.

実施例14 [モノクローナル抗体を用いた完全ヒト・オステオカル
シン及びそのフラグメントの合計量の測定系(II)の構
成] 実施例11で調製したN末端ペプチド(1Tyr−20Arg)
に対するモノクローナル抗体Clon−10Bを固定したビー
ズと、前記実施例1で作成したヒト・オステオカルシン
のN末端ペプチド(1Tyr−20Arg)に対するポリクロー
ナル抗体ost−N(20)を実施例11の方法と同様にして
調製たHRP標識Ost−N(20)抗体と、ヒト・オステオカ
ルシンのN末端ペプチド(1Tyr−20Arg)の0〜8ng/ml
の範囲で含有する溶液とを用いて、実施例8と同様な方
法でN末端ペプチド濃度と吸光度との関係を求め第13図
に示した。この結果から本発明の測定方法を用いれば0.
02ng/mlまで、精度よくヒト・オステオカルシンのN末
端フラグメントを測定可能であることがわかる。
Example 14 [Constitution of measurement system (II) for total amount of fully human osteocalcin and its fragments using monoclonal antibody] N-terminal peptide ( 1 Tyr- 20 Arg) prepared in Example 11
And the polyclonal antibody ost-N (20) against the N-terminal peptide of human osteocalcin ( 1 Tyr- 20 Arg) prepared in Example 1 and the monoclonal antibody Clon-10B were immobilized in the same manner as in Example 11. 0-8 ng / ml of the HRP-labeled Ost-N (20) antibody prepared in step 1 and the N-terminal peptide of human osteocalcin ( 1 Tyr- 20 Arg)
The relationship between the N-terminal peptide concentration and the absorbance was determined in the same manner as in Example 8 using the solution contained in the above range, and the result is shown in FIG. From this result, if the measuring method of the present invention is used, it is 0.
It can be seen that the N-terminal fragment of human osteocalcin can be accurately measured up to 02 ng / ml.

実施例15 [測定系(II)による分子特異性の検討(I)] ヒト・オステオカルシン1μg/ml(0.1Mトリス勧奨
液、pH8.0)を1.7ml調製し、その各々0.2mlをトリプシ
ンを用いて、ヒト・オステオカルシン/トリプシン(w/
w比)が、1/2()、1/1()、2/1()、10/1
()、50/1()、1/0()となるように調整し、2
5℃、60分間反応させそれぞれをベンザミジンにて反応
を停止させた。得られたそれぞれの反応液を測定系(I
I)を用いて測定した結果を第6図中にフラグメント測
定系として・・・・・○・・・・・で示した。
Example 15 [Study of molecular specificity by measurement system (II) (I)] 1.7 ml of human osteocalcin 1 μg / ml (0.1 M Tris recommended solution, pH 8.0) was prepared, and 0.2 ml of each was used with trypsin. Human osteocalcin / trypsin (w /
w ratio) is 1/2 (), 1/1 (), 2/1 (), 10/1
Adjust to (), 50/1 (), 1/0 (), then 2
The reaction was carried out at 5 ° C for 60 minutes, and the reaction was stopped with benzamidine. Each of the obtained reaction liquids was measured (I
The results measured using I) are shown in Fig. 6 as a fragment measurement system.

この結果、本測定系(II)は、ヒト・オステオカルシ
ンのトリプシンによる切断により完全分子が減少するに
も拘らず、その測定値は、ほぼ一定値を示していること
がわかる。このことより、本測定系(II)は、完全分子
とN末端フラグメントと同等に測定していることが明ら
かになった。
As a result, it can be seen that, in the present measurement system (II), the measured value shows an almost constant value, although the complete molecule is reduced by the cleavage of human osteocalcin by trypsin. From this, it was clarified that the present measurement system (II) performs measurement in the same manner as the complete molecule and the N-terminal fragment.

以上のことから本測定系(II)は、完全分子とN末端
フラグメントの合計量の測定値を反映していることが明
らかである。
From the above, it is clear that this measurement system (II) reflects the measured value of the total amount of the complete molecule and the N-terminal fragment.

実施例16 [測定系(II)による分子特異性の検討(2)] ヒト・オステオカルシン99ngを200μの0.1Mトリス
緩衝液(pH8.0)に溶解し、トリプシン[ヒト・オステ
オカルシン:トリプシン=1:0.5(w/w)]を用いて、25
℃、60分間反応させ、ベンザミジンにて反応を停止させ
た。
Example 16 [Study of molecular specificity by measurement system (II) (2)] 99 ng of human osteocalcin was dissolved in 200 μM of 0.1 M Tris buffer (pH8.0), and trypsin [human osteocalcin: trypsin = 1: 1]. 0.5 (w / w)]
The reaction was carried out at 60 ° C for 60 minutes, and the reaction was stopped with benzamidine.

反応液を逆相PLC(ODS120Tカラム)を用いて、前記実
施例5と同様の条件にて分離操作を行った。分離後、各
フラクシヨンのオステオカルシン抗原活性を、測定系II
(実施例14)にて測定した。その結果を第14図に示し
た。
The reaction solution was subjected to a separation operation using a reverse phase PLC (ODS120T column) under the same conditions as in Example 5 above. After separation, measure the osteocalcin antigen activity of each fraction by measuring system II.
It was measured in (Example 14). The results are shown in Fig. 14.

第14図の結果から、本測定系(II)によれば完全分子
とN末端フラグメント(N−19)の合計を測定しうるこ
とが明らかとなった。
From the results shown in FIG. 14, it was revealed that the total amount of the complete molecule and the N-terminal fragment (N-19) can be measured by this measurement system (II).

実施例17 [測定系(II)による患者検体中のオステオカルシンの
測定] 実施例14の手法により患者検体(腎疾患、骨粗鬆症)
のオステオカルシンを測定した。
Example 17 [Measurement of osteocalcin in a patient sample by the measurement system (II)] A patient sample (renal disease, osteoporosis) by the method of Example 14
Was measured for osteocalcin.

結果を第15図に示した。図のごとく、腎疾患、骨粗鬆
章の患者検体において高値を求めた。
The results are shown in Fig. 15. As shown in the figure, high values were obtained in patient samples of renal disease and osteoporosis chapter.

次に、高値の患者検体を逆相の高速液体クロマトグラ
フイーにてN末端フラグメントを分離精製した。
Next, the patient sample having a high value was subjected to reverse phase high performance liquid chromatography to separate and purify the N-terminal fragment.

この画分をアミノ酸シーケンサーで調べ1Tyr〜19Arg
のN末端フラグメントであることを確認した。これはCa
ren M.Gundbergら(J.Clin.Invest 77、1762(198
6))によって示されたものと一致した。
Check this fraction with an amino acid sequencer. 1 Tyr ~ 19 Arg
It was confirmed to be the N-terminal fragment of This is Ca
ren M. Gundberg et al. (J.Clin.Invest 77, 1762 (198
6)).

なお、上記測定値における患者血清中のフラグメント
は以下の式により算出した。
The fragment in the patient's serum in the above measured value was calculated by the following formula.

N末端フラグメント測定値=測定系(II)による測定
値−測定系(I)による測定値 実施例18 (フラグメント測定値の臨床意義の検討) 測定系(I)及び(II)を用いて、骨粗鬆症における
治療薬剤の効果を治療前群(n=16)と、治療中群[カ
ルシトニン投与(n=3)、エストロゲン投与(n=
4)]に分けて、フラグメント測定値/完全分子測定値
の平均値を第16図に示した。カルシトニン及びエストロ
ゲンは、いずれも骨吸収阻害剤であり、第16図の結果
は、フラグメント測定値/完全分子測定値の比はこれら
薬剤の治療による低下傾向を示しており、このことはフ
ラグメント測定値が骨吸収活性を示す可能を示唆してい
る。またエステロゲン投与群は、治療前と比べて危険率
10%で優位性を示した。
N-terminal fragment measurement value = measurement value by measurement system (II) −measurement value by measurement system (I) Example 18 (Examination of clinical significance of fragment measurement value) Osteoporosis using measurement systems (I) and (II) The effects of the therapeutic agents in the pretreatment group (n = 16) and the treatment group [calcitonin administration (n = 3), estrogen administration (n =
4)] and the average value of the fragment measurement value / complete molecule measurement value is shown in FIG. Calcitonin and estrogen are both bone resorption inhibitors, and the results in Fig. 16 show that the ratio of the fragment measurement value / total molecule measurement value tends to decrease with the treatment of these agents, which indicates that the fragment measurement value Indicates that it may exhibit bone resorption activity. In addition, the risk rate of the estrogen administration group was higher than that before treatment.
The advantage was 10%.

Claims (43)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項1】ヒト検体中のヒト・オステオカルシンを固
相抗体及び標識抗体を使用して免疫学的に測定する方法
において、 (1) 一方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのN末
端側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を
有するヒト・オステオカルシンに対する抗体またはそれ
と同じ認識部位を有するそのフラグメント(N末端抗
体)であり、 (2) 他方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのC末
端側36〜49のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を
有するヒト・オステオカルシンに対する抗体またはそれ
と同じ認識部位を有するそのフラグメント(C末端抗
体)である、 ことを特徴とする完全ヒト・オステオカルシンの免疫学
的測定方法。
1. A method for immunologically measuring human osteocalcin in a human specimen using a solid-phase antibody and a labeled antibody, wherein (1) one antibody is 1 to 20 on the N-terminal side of human osteocalcin. Is an antibody to human osteocalcin having a specific recognition site in its amino acid sequence region or a fragment thereof having the same recognition site as that (N-terminal antibody), and (2) the other antibody is the C-terminal side of human osteocalcin. Immunology of fully human osteocalcin, which is an antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of 36 to 49 or a fragment thereof (C-terminal antibody) having the same recognition site as that. Measurement method.
【請求項2】該N末端抗体がポリクローナル抗体または
そのフラグメントである請求の範囲第1項による測定方
法。
2. The measuring method according to claim 1, wherein the N-terminal antibody is a polyclonal antibody or a fragment thereof.
【請求項3】該N末端抗体がモノクローナル抗体または
そのフラグメントである請求の範囲第1項による測定方
法。
3. The measuring method according to claim 1, wherein the N-terminal antibody is a monoclonal antibody or a fragment thereof.
【請求項4】該C末端抗体がポリクローナル抗体または
そのフラグメントである請求の範囲第1〜3項のいずれ
かによる測定方法。
4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the C-terminal antibody is a polyclonal antibody or a fragment thereof.
【請求項5】該N末端抗体及びC末端抗体がいずれもポ
リクローナル抗体またはそのフラグメントである請求の
範囲第1項による測定方法。
5. The measuring method according to claim 1, wherein both the N-terminal antibody and the C-terminal antibody are polyclonal antibodies or fragments thereof.
【請求項6】該C末端抗体がヒト・オステオカルシンの
C末端側40〜49位のアミノ酸配列領域中に特異的な認識
部位を有する抗体またはそのフラグメントである請求の
範囲第1項による測定方法。
6. The method according to claim 1, wherein the C-terminal antibody is an antibody or a fragment thereof having a specific recognition site in the amino acid sequence region of the 40-49th C-terminal side of human osteocalcin.
【請求項7】該C末端抗体がヒト・オステオカルシンの
C末端側36〜49位置のアミノ酸配列領域中に特異的な認
識部位を有するモノクローナル抗体またはそのフラグメ
ントである請求の範囲第1項による測定方法。
7. The measuring method according to claim 1, wherein the C-terminal antibody is a monoclonal antibody or a fragment thereof having a specific recognition site in the amino acid sequence region at the C-terminal 36-49 position of human osteocalcin. .
【請求項8】該標識抗体がFab′またはF(ab′)
ラグメントである請求の範囲第1項による測定方法。
8. The method according to claim 1, wherein the labeled antibody is Fab ′ or F (ab ′) 2 fragment.
【請求項9】固相抗体における固相は、中心線平均粗さ
(Ra)が1.5μm以下の平滑な表面を有するプラスチツ
ク・ビーズである請求の範囲第1項による測定方法。
9. The measuring method according to claim 1, wherein the solid phase of the solid phase antibody is plastic beads having a smooth surface with a center line average roughness (Ra) of 1.5 μm or less.
【請求項10】該ヒト検体が、血清、血漿、尿またはこ
れらの同等物である請求の範囲第1項による測定方法。
10. The measuring method according to claim 1, wherein the human sample is serum, plasma, urine or an equivalent thereof.
【請求項11】該固相抗体における抗体が、ヒト・オス
テオカルシンのN末端側1〜20のアミノ酸配列領域中に
特異的な認識部位を有するヒト・オステオカルシンに対
するポリクローナル抗体であり、且つ標識抗体における
抗体がヒト・オステオカルシンのC末端側36〜49のアミ
ノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有するヒト・オス
テオカルシンに対するポリクローナル抗体またはそのF
(ab′)フラグメントである請求の範囲第1項による
測定方法。
11. The antibody in the solid phase antibody is a polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin, and the antibody in the labeled antibody Is a polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of C-terminal 36 to 49 of human osteocalcin or its F
The measuring method according to claim 1, which is an (ab ′) 2 fragment.
【請求項12】ヒト検体中の完全ヒト・オステオカルシ
ンを固相抗体及び標識抗体を使用して免疫学的に測定す
るための試薬であつて、 (1) 一方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのN末
端側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を
有するヒト・オステオカルシンに対する抗体またはそれ
と同じ認識部位を有するそのフラグメント(N末端抗
体)であり、 (2) 他方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのC末
端側36〜49のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を
有するヒト・オステオカルシンに対する抗体またはそれ
と同じ認識部位を有するそのフラグメント(C末端抗
体)である、 ことを特徴とする完全ヒト・オステオカルシンを免疫学
的に測定するための試薬。
12. A reagent for immunologically measuring fully human osteocalcin in a human sample using a solid phase antibody and a labeled antibody, wherein (1) one antibody is N of human osteocalcin. An antibody to human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region on the terminal side 1 to 20 or a fragment thereof (N-terminal antibody) having the same recognition site as that, (2) the other antibody is human An antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of C-terminal 36-49 of osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site (C-terminal antibody), -A reagent for immunologically measuring osteocalcin.
【請求項13】(a) 固相抗体、 (b) 標識抗体、 (c) 溶解剤、 (d) 洗浄剤及び (e) 酵素で標識化された標識抗体を使用する場合に
は、酵素活性を測定するための基質及反応停止剤、 を組合せてなるヒト検体中の完全ヒト・オステオカルシ
ンを測定するためのキツトであつて、 (1) 一方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのN末
端側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を
有するヒト・オステオカルシンに対する抗体またはそれ
と同じ認識部位を有するそのフラグメント(N末端抗
体)であり、 (2) 他方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのC末
端側36〜49のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を
有するヒト・オステオカルシンに対する抗体またはそれ
と同じ認識部位を有するそのフラグメント(C末端抗
体)である、 ことを特徴とする完全ヒト・オステオカルシを免疫学的
に測定するためのキツト。
13. When using (a) solid phase antibody, (b) labeled antibody, (c) lysing agent, (d) detergent and (e) enzyme-labeled labeled antibody, enzyme activity is used. A kit for measuring fully human osteocalcin in a human sample, which comprises a substrate and a reaction terminator for measuring (1) one of the antibodies is N-terminal side 1 to human osteocalcin. An antibody to human osteocalcin having a specific recognition site in the 20 amino acid sequence region or a fragment thereof (N-terminal antibody) having the same recognition site as that, (2) the other antibody is the C-terminal of human osteocalcin An antibody to human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of the side 36 to 49, or a fragment thereof having the same recognition site (C-terminal antibody) ) And is, Kitsuto for a fully human osteocalcin, wherein measuring immunologically that.
【請求項14】ヒト検体中のヒト・オステオカルシン及
びそのフラグメントを固相抗体及び標識抗体を使用して
免疫学的に測定する方法において (1) 一方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのN末
端側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を
有するヒト・オステオカルシンに対するモノクローナル
抗体またはそれと同じ認識部位を有するそのフラグメン
トであり、 (2) 他方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのN末
端側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を
有するヒト・オステオカルシンに対するポリクローナル
抗体またはそれと同じ認識部位を有するそのフラグメン
トである、 ことを特徴とする完全ヒト・オステオカルシン及びその
フラグメントの合計量の免疫学的測定方法。
14. A method for immunologically measuring human osteocalcin and a fragment thereof in a human sample by using a solid phase antibody and a labeled antibody (1) One antibody is N-terminal side 1 of human osteocalcin Is a monoclonal antibody to human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of -20 or a fragment thereof having the same recognition site as the human antibody. (2) The other antibody is 1 to the N-terminal side of human osteocalcin Immunology of the total amount of fully human osteocalcin and its fragments, which is a polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the 20 amino acid sequence region or a fragment thereof having the same recognition site Measurement method.
【請求項15】該標識抗体が該ポリクローナル抗体また
はそれと同じ認識部位を有するそのフラグメントである
請求の範囲第14項による測定方法。
15. The method according to claim 14, wherein the labeled antibody is the polyclonal antibody or a fragment thereof having the same recognition site as that of the polyclonal antibody.
【請求項16】該標識抗体が該ポリクローナル抗体のFa
b′またはF(ab′)フラグメントである請求の範囲
第14項記載の測定方法。
16. The Fa of the polyclonal antibody is the labeled antibody.
15. The measuring method according to claim 14, which is a b ′ or F (ab ′) 2 fragment.
【請求項17】該標識抗体が酵素により標識化された抗
体である請求の範囲第14項による測定方法。
17. The measuring method according to claim 14, wherein the labeled antibody is an enzyme-labeled antibody.
【請求項18】該固相抗体における固相は、中心線平均
粗さ(Ra)が1.5μm以下の平滑な表面を有するプラス
チツク・ビーズである請求の範囲第14項による測定方
法。
18. The method according to claim 14, wherein the solid phase of the solid phase antibody is plastic beads having a smooth surface with a center line average roughness (Ra) of 1.5 μm or less.
【請求項19】該固相抗体における抗体が、ヒト・オス
テオカルシンのN末端側1〜20のアミノ酸配列領域中に
特異的な認識部位を有するヒト・オステオカルシンに対
するモノクローナル抗体であり、且つ標識抗体における
抗体が、ヒト・オステオカルシンのN末端側1〜20のア
ミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有するヒト・オ
ステオカルシンに対するポリクローナル抗体またはその
F(ab′)フラグメントである請求の範囲第14項記載
による測定方法。
19. The antibody in the solid phase antibody is a monoclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin, and the antibody in the labeled antibody 15. The method according to claim 14, wherein is a polyclonal antibody against human osteocalcin or an F (ab ′) 2 fragment thereof having a specific recognition site in the amino acid sequence region 1 to 20 on the N-terminal side of human osteocalcin. Measuring method.
【請求項20】ヒト検体中の完全ヒト・オステオカルシ
ン及びそのフラグメントの合計量の固相抗体及び標識抗
体を使用して免疫学的に測定するための試薬であつて、 (1) 一方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのN末
端側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を
有するヒト・オステオカルシンに対するモノクローナル
抗体またはそれと同じ認識部位を有するそのフラグメン
トであり、 (2) 他方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのN末
端側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を
有するヒト・オステオカルシンに対するポリクローナル
抗体またはそれと同じ認識部位を有するそのフラグメン
トである、 ことを特徴とする完全ヒト・オステオカルシン及びその
フラグメントの合計量を免疫学的に測定するための試
薬。
20. A reagent for immunologically measuring the total amount of fully human osteocalcin and its fragments in a human sample using a solid phase antibody and a labeled antibody, wherein (1) one of the antibodies is , A monoclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of the N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site, (2) the other antibody A fully human osteocalcin, which is a polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site as the polyclonal antibody. And immunoassay for the total amount of its fragments. .
【請求項21】(a) 固相抗体、 (b) 標識抗体、 (c) 溶解剤、 (d) 洗浄剤及び (e) 酵素で標識化された標識抗体を使用する場合に
は、酵素活性を測定するための基質及び反応停止剤、 を組合せてなるヒト検体中の完全ヒト・オステオカルシ
ン及びそのフラグメントの合計量を測定するためのキツ
トであつて、 (1) 一方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのN末
端側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を
有するヒト・オステオカルシンに対する抗体またはそれ
と同じ認識部位を有するそのフラグメント(N末端抗
体)であり、 (2) 他方の抗体が、ヒト・オステオカルシンのN末
端側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を
有するヒト・オステオカルシンに対するポリクローナル
抗体またはそれと同じ認識部位を有するそのフラグメン
ト(C末端抗体)である、 ことを特徴とする完全ヒト・オステオカルシン及びその
フラグメントの合計量を測定するためのキツト。
21. When (a) solid phase antibody, (b) labeled antibody, (c) lysing agent, (d) detergent and (e) enzyme-labeled labeled antibody are used, the enzyme activity is A kit for measuring the total amount of fully human osteocalcin and its fragments in a human sample, which comprises a substrate and a reaction terminator for measuring (1) one of the antibodies is human osteocalcin. (2) The other antibody is an antibody to human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of N-terminal side 1 to 20 or a fragment thereof having the same recognition site (N-terminal antibody), Polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin or the same A fragment thereof having a recognition site (C-terminal antibody), Kitsuto for measuring the total amount of fully human osteocalcin and fragments thereof, characterized in that.
【請求項22】ヒト検体中のヒト・オステオカルシン及
びそのフラグメントを固相抗体及び標識抗体を使用して
免疫学的に測定する方法において、該固相抗体及び標識
抗体における抗体は、いずれもヒト・オステオカルシン
のN末端側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識
部位を有するヒト・オステオカルシンに対するポリクロ
ーナル抗体またはそれと同じ認識部位を有するそのフラ
グメントであることを特徴とする完全ヒト・オステオカ
ルシン及びそのフラグメントの合計量の免疫学的測定方
法。
22. In a method for immunologically measuring human osteocalcin and a fragment thereof in a human sample by using a solid phase antibody and a labeled antibody, both the solid phase antibody and the labeled antibody are human. Fully human osteocalcin and a fragment thereof, which is a polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of N-terminal side 1 to 20 of osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site Immunoassay method for total amount of.
【請求項23】該標識抗体が酵素により標識化された抗
体である請求の範囲第22項による測定方法。
23. The measuring method according to claim 22, wherein the labeled antibody is an enzyme-labeled antibody.
【請求項24】該固相抗体における固相は、中心線平均
粗さ(Ra)が1.5μm以下の平滑な表面を有するプラス
チツク・ビーズである請求の範囲第22項による測定方
法。
24. The method according to claim 22, wherein the solid phase of the solid phase antibody is plastic beads having a smooth surface with a center line average roughness (Ra) of 1.5 μm or less.
【請求項25】ヒト検体中の完全ヒト・オステオカルシ
ン及びそのフラグメントの合計量を固相抗体及び標識抗
体を使用して免疫学的に測定するための試薬であつて、 該固相抗体及び標識抗体における抗体は、いずれもヒト
・オステオカルシンのN末端側1〜20のアミノ酸配列領
域中に特異的な認識部位を有するヒト・オステオカルシ
ンに対するポリクローナル抗体またはそれと同じ認識部
位を有するそのフラグメントであることを特徴とする完
全ヒト・オステオカルシン及びそのフラグメントの合計
量を免疫学的に測定するための試薬。
25. A reagent for immunologically measuring the total amount of fully human osteocalcin and a fragment thereof in a human sample using a solid phase antibody and a labeled antibody, the solid phase antibody and the labeled antibody All of the antibodies in 1 are polyclonal antibodies against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site. A reagent for immunologically measuring the total amount of fully human osteocalcin and its fragments.
【請求項26】(a) 固相抗体、 (b) 標識抗体、 (c) 溶解剤、 (d) 洗浄剤及び (e) 酵素で標識化された標識抗体を使用する場合に
は、酵素活性を測定するための基質及び反応停止剤、 を組合せてなるヒト検体中の完全ヒト・オステオカルシ
ン及びそのフラグメントの合計量を測定するためのキツ
トであつて、 該固相抗体及び標識抗体における抗体は、いずれもヒト
・オステオカルシンのN末端側1〜20のアミノ酸配列領
域中に特異的な認識部位を有するヒト・オステオカルシ
ンに対するポリクローナル抗体またはそれと同じ認識部
位を有するそのフラグメントであることを特徴とする完
全ヒト・オステオカルシン及びそのフラグメントの合計
量を測定するためのキツト。
26. When (a) a solid phase antibody, (b) a labeled antibody, (c) a lysing agent, (d) a detergent and (e) a labeled antibody labeled with an enzyme are used, the enzyme activity is A kit for measuring the total amount of fully human osteocalcin and a fragment thereof in a human sample, which comprises a substrate for measuring All are human polyclonal antibodies against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site. A kit for measuring the total amount of osteocalcin and its fragments.
【請求項27】ヒト検体中のヒト・オステオカルシンの
フラグメントを免疫学的に測定する方法であつて、 (i) 請求の範囲第14項または第22項記載の測定方法
に従ってヒト検体中の完全ヒト・オステオカルシン及び
そのフラグメントの合計量を測定し、 (ii) 一方請求の範囲第1項記載の測定方法に従って
ヒト検体中の完全ヒト・オステオカルシンを測定し、 (iii) 次いで前記(i)と(ii)で測定された値の
差を算出する、 ことを特徴とするヒト・オステオカルシンのフラグメン
トの測定方法。
27. A method for immunologically measuring a fragment of human osteocalcin in a human sample, comprising: (i) completely human in the human sample according to the measuring method according to claim 14 or 22. -The total amount of osteocalcin and its fragments is measured, and (ii) the fully human osteocalcin in a human sample is measured according to the measuring method according to claim 1, (iii) and then (i) and (ii) The method for measuring a fragment of human osteocalcin is characterized in that the difference between the values measured in (1) is calculated.
【請求項28】(i) 完全ヒト・オステオカルシン含
有液を、 ヒト・オステオカルシのN末端側1〜20のアミノ酸配列
領域中に特異的認識部位を有するヒト・オステオカルシ
ンに対する抗体またはそれと同じ認識部位を有するその
フラグメントを結合した固相と接触させて、該固相に完
全ヒト・オステオカルシンを吸着させ、 (ii) 次いで完全ヒト・オステオカルシンを吸着した
固相に溶出液を接触させて、完全ヒト・オステオカルシ
ンを固相から溶出させ、 (iii) 得られた完全ヒト・オステオカルシン含有溶
出液から、完全ヒト・オステオカルシンを分離する、 ことを特徴とする完全ヒト・オステオカルシンの分離
法。
28. (i) The completely human osteocalcin-containing solution is provided with an antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of the N-terminal side 1 to 20 of human osteocalci or the same recognition site as the antibody. The fragment having the fragment thereof is brought into contact with a solid phase bound thereto to adsorb fully human osteocalcin to the solid phase, and (ii) then the eluate is brought into contact with the solid phase adsorbing fully human osteocalcin to give completely human osteocalcin. Is eluted from the solid phase, and (iii) a complete human osteocalcin-containing eluate is separated from the obtained complete human osteocalcin-containing eluate.
【請求項29】該抗体がポリクローナル抗体である請求
の範囲第28項による分離法。
29. The separation method according to claim 28, wherein the antibody is a polyclonal antibody.
【請求項30】該固相がデキストランゲル・アガロース
ゲルまたはポリビニルゲルである請求の範囲第28項によ
る分離法。
30. The separation method according to claim 28, wherein the solid phase is dextran gel / agarose gel or polyvinyl gel.
【請求項31】工程: (a) 完全ヒト・オステオカルシン含有液を、ヒト・
オステオカルシンに対する抗体を結合した第1の固相と
接触させて、第1の固相に完全ヒト・オステオカルシン
を吸着させ、 (b) 完全ヒト・オステオカルシンを吸着した第1の
固相に溶出液を接触させて完全ヒト・オステオカルシン
を第1の固相から溶出させ、 (c) 得られた完全ヒト・オステオカルシン含有溶出
液を、ヒト・オステオカルシンに対する他の抗体を結合
した第2の固相と接触させて、第2の固相に完全ヒト・
オステオカルシンを吸着させ、 (d) 完全ヒト・オステオカルシンを吸着した第2の
固相に溶出液を接触させて完全ヒト・オステオカルシン
を第2の固相から溶出させ、 (e) 得られた完全ヒト・オステオカルシン含有溶出
液から精製された完全ヒト・オステオカルシンを分離す
る、 よりなる完全ヒト・オステオカルシン含有液からの精製
された完全ヒト・オステオカルシンの分離法であつて、 (1) 一方の固相に結合した抗体が、ヒト・オステオ
カルシンのN末端側1〜20のアミノ酸配列領域中に特異
的な認識部位を有するヒト・オステオカルシンに対する
抗体またはそれと同じ認識部位を有するそのフラグメン
ト(N末端抗体)であり、 (2) 他方の固相に結合した抗体が、ヒト・オステオ
カルシンのC末端側36〜49のアミノ酸配列領域中に特異
的な認識部位を有するヒト・オステオカルシンに対する
抗体またはそれと同じ認識部位を有するそのフラグメン
ト(C末端抗体)である、 ことを特徴とする精製された完全ヒト・オステオカルシ
ンの分離法。
31. Step: (a) adding a fully human osteocalcin-containing liquid to human
Contacting the first solid phase bound with an antibody against osteocalcin to adsorb fully human osteocalcin to the first solid phase, and (b) contacting the eluate to the first solid phase adsorbing fully human osteocalcin Complete human osteocalcin is eluted from the first solid phase, and (c) the obtained complete human osteocalcin-containing eluate is contacted with a second solid phase to which another antibody against human osteocalcin is bound. , Fully human on the second solid phase
(E) Completely human osteocalcin is adsorbed from the second solid phase by adsorbing osteocalcin, and (d) contacting the eluent with the second solid phase adsorbing fully human osteocalcin. A method for separating purified human-osteocalcin-containing eluate from purified human-osteocalcin-containing solution, comprising: (1) binding to one solid phase The antibody is an antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of the N-terminal side 1 to 20 of human osteocalcin or a fragment thereof (N-terminal antibody) having the same recognition site, The antibody bound to the other solid phase has an amino acid sequence of C-terminal 36-49 of human osteocalcin As a fragment (C-terminal antibody), separation of the fully human osteocalcin purified, characterized in that it comprises the antibody or the same recognition site as that against human osteocalcin having a specific recognition site in the region.
【請求項32】(i) ヒト・オステオカルシンのN末
端1〜20のアミノ酸配列領域中に特異的認識部位を有す
るヒト・オステオカルシンに対するモノクローナル抗体
またはそれと同じ認識部位を有するそのフラグメント、 (ii) ヒト・オステオカルシンのN末端1〜20のアミ
ノ酸配列領域中に特異的認識部位を有するヒト・オステ
オカルシンに対するポリクローナル抗体またはそれと同
じ認識部位を有するそのフラグメント、 または (iii) ヒト・オステオカルシンのC末端側36〜49の
アミノ酸配列領域中に特異的認識部位を有するヒト・オ
ステオカルシンに対するポリクローナル抗体またはそれ
と同じ認識部位を有するそのフラグメント を、固相に結合させた免疫吸着体。
32. (i) A monoclonal antibody to human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of the N-terminals 1 to 20 of human osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site, (ii) human A polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of N-terminal 1 to 20 of osteocalcin or a fragment thereof having the same recognition site, or (iii) C-terminal 36 to 49 of human osteocalcin An immunoadsorbent in which a polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region or a fragment thereof having the same recognition site as that thereof is bound to a solid phase.
【請求項33】固相が、プラスチツク容器、プラスチツ
クビーズ、ラテツクスビーズ、ガラスビーズまたは金属
粒子である請求の範囲第32項による免疫吸着体。
33. The immunoadsorbent according to claim 32, wherein the solid phase is a plastic container, plastic beads, latex beads, glass beads or metal particles.
【請求項34】ヒト・オステオカルシンのN末端側1〜
20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有するヒ
ト・オステオカルシンに対するモノクローナル抗体。
34. N-terminal side 1 to human osteocalcin
A monoclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of 20.
【請求項35】ウシ・オステオカルシンに対する交差反
応性が50%以下である請求の範囲第34項によるモノクロ
ーナル抗体。
35. The monoclonal antibody according to claim 34, which has a cross-reactivity with bovine osteocalcin of 50% or less.
【請求項36】請求の範囲第34項によるモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ。
36. A hybridoma producing a monoclonal antibody according to claim 34.
【請求項37】請求の範囲第36項によるハイブリドーマ
を培養し、その培養生成物から請求の範囲第34項による
モノクローナル抗体を得ることを特徴とするモノクロー
ナル抗体の製造方法。
37. A method for producing a monoclonal antibody, which comprises culturing the hybridoma according to claim 36 and obtaining the monoclonal antibody according to claim 34 from the culture product.
【請求項38】(i) 下記アミノ酸配列、 H−Tyr−Leu−Tyr−Gln−Trp−Leu−Gly−Ala−Pro−V
al−Pro−Tyr−Pro−Asp−Pro−Leu−Glu−Pro−Arg−A
rg−OH で表わされるペプチドをキヤリアータンパクと結合させ
て得られたポリペプチドを免疫抗原としてマウスに免疫
し、 (ii) マウスから脾臓細胞を取り出し、 (iii) この脾臓細胞をマウスの骨髄腫細胞と融合し
てハイブリドーマを得、 (iv) 所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを選別し、そして (v) 得られたハイブリドーマを培養する、 ことを特徴とする請求の範囲第32項記載のヒト・オステ
オカルシンに対するモノクローナル抗体の製造方法。
38. (i) The following amino acid sequence: H-Tyr-Leu-Tyr-Gln-Trp-Leu-Gly-Ala-Pro-V
al-Pro-Tyr-Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro-Arg-A
The polypeptide obtained by binding the peptide represented by rg-OH to the carrier protein was used as an immunizing antigen to immunize mice, and (ii) spleen cells were taken out from the mouse. 33. The human according to claim 32, wherein the hybridoma is fused with cells to obtain a hybridoma, (iv) a hybridoma producing a desired monoclonal antibody is selected, and (v) the obtained hybridoma is cultured. -Method for producing a monoclonal antibody against osteocalcin.
【請求項39】ヒト・オステオカルシンのN末端側1〜
20のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有するヒ
ト・オステオカルシンに対するポリクローナル抗体。
39. N-terminal side 1 of human osteocalcin
A polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the amino acid sequence region of 20.
【請求項40】ウシ・オステオカルシンに対する交叉反
応性が50%以下である請求の範囲第39項によるポリクロ
ーナル抗体。
40. The polyclonal antibody according to claim 39, which has a cross-reactivity with bovine osteocalcin of 50% or less.
【請求項41】下記アミノ酸配列、 H−Tyr−Leu−Tyr−Gln−Trp−Leu−Gly−Ala−Pro−V
al−Pro−Tyr−Pro−Asp−Pro−Leu−Glu−Pro−Arg−A
rg−OH で表わされるペプチドをキヤリアータンパクと結合させ
て得られたポリペプチドを免疫抗原として動物に免疫
し、その動物からポリクローナル抗体を取り出すことを
特徴とする請求の範囲第39項記載のヒト・オステオカル
シンに対するポリクローナル抗体の製造方法。
41. The following amino acid sequence: H-Tyr-Leu-Tyr-Gln-Trp-Leu-Gly-Ala-Pro-V
al-Pro-Tyr-Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro-Arg-A
The human according to claim 39, wherein the polypeptide represented by rg-OH is bound to a carrier protein to immunize an animal with a polypeptide obtained as an immunizing antigen, and a polyclonal antibody is taken out from the animal. A method for producing a polyclonal antibody against osteocalcin.
【請求項42】ヒト・オステオカルシンのC末端側43〜
49のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有するヒ
ト・オステオカルシンに対するポリクローナル抗体。
42. Human osteocalcin C-terminal side 43-
A polyclonal antibody against human osteocalcin having a specific recognition site in the 49 amino acid sequence region.
【請求項43】下記アミノ酸配列、 H−Arg−Arg−Phe−Tyr−Gly−Pro−Val−OH で表わされるペプチドをキヤリアータンパクと結合させ
て得られたポリペプチドを免疫抗原として動物に免疫し
その動物からポリクローナル抗体を取り出すことを特徴
とする請求の範囲第37項記載のヒト・オステオカルシン
に対するポリクローナル抗体の製造方法。
43. Immunize an animal with a polypeptide obtained by binding a peptide represented by the following amino acid sequence, H-Arg-Arg-Phe-Tyr-Gly-Pro-Val-OH, with a carrier protein as an immunizing antigen. 38. The method for producing a polyclonal antibody against human osteocalcin according to claim 37, wherein the polyclonal antibody is taken out from the animal.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2007029302A1 (en) * 2005-09-05 2009-03-12 株式会社島津製作所 Biopolymer immobilization substrate and biopolymer immobilization method using the same

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4410506A (en) * 1981-03-24 1983-10-18 The Regents Of The University Of California Immunoassay for vitamin K-dependent bone protein
JPS5943361A (en) * 1982-05-27 1984-03-10 ザ・リ−ジエンツ・オブ・ザ・ユニバ−シテイ・オブ・カリフオルニア Vitamin k dependency bone protein position-idiosyncrasy ( special ) measurement
JPS63209596A (en) * 1987-02-26 1988-08-31 Takara Shuzo Co Ltd Monoclonal antibody and use thereof
JPH01160493A (en) * 1987-12-18 1989-06-23 Takara Shuzo Co Ltd Monoclonal antibody and use thereof
EP0410004A1 (en) * 1989-02-10 1991-01-30 Teijin Limited Immunoassay of human osteocalcin, reagent and kit therefor
JPH0739439A (en) * 1993-07-23 1995-02-10 Fuso Taku Chair for 3 purposes
US5506111A (en) * 1989-02-10 1996-04-09 Teijin Limited Method of immunological assaying of human osteocalcin, reagent and kit therefor, antibody to human osteocalcin, hybridoma producing said antibody, and method of producing it

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4410506A (en) * 1981-03-24 1983-10-18 The Regents Of The University Of California Immunoassay for vitamin K-dependent bone protein
JPS5943361A (en) * 1982-05-27 1984-03-10 ザ・リ−ジエンツ・オブ・ザ・ユニバ−シテイ・オブ・カリフオルニア Vitamin k dependency bone protein position-idiosyncrasy ( special ) measurement
JPS63209596A (en) * 1987-02-26 1988-08-31 Takara Shuzo Co Ltd Monoclonal antibody and use thereof
JPH01160493A (en) * 1987-12-18 1989-06-23 Takara Shuzo Co Ltd Monoclonal antibody and use thereof
EP0410004A1 (en) * 1989-02-10 1991-01-30 Teijin Limited Immunoassay of human osteocalcin, reagent and kit therefor
US5506111A (en) * 1989-02-10 1996-04-09 Teijin Limited Method of immunological assaying of human osteocalcin, reagent and kit therefor, antibody to human osteocalcin, hybridoma producing said antibody, and method of producing it
JPH0739439A (en) * 1993-07-23 1995-02-10 Fuso Taku Chair for 3 purposes

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2007029302A1 (en) * 2005-09-05 2009-03-12 株式会社島津製作所 Biopolymer immobilization substrate and biopolymer immobilization method using the same
JP4656145B2 (en) * 2005-09-05 2011-03-23 株式会社島津製作所 Biopolymer immobilization substrate and biopolymer immobilization method using the same
US8551760B2 (en) 2005-09-05 2013-10-08 Shimadzu Corporation Substrate for immobilizing biopolymer and method of immobilizing biopolymer by using the same

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