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JP2552479B2 - ボルデテラ属細菌の培養培地及び培養法 - Google Patents

ボルデテラ属細菌の培養培地及び培養法

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JP2552479B2
JP2552479B2 JP62073960A JP7396087A JP2552479B2 JP 2552479 B2 JP2552479 B2 JP 2552479B2 JP 62073960 A JP62073960 A JP 62073960A JP 7396087 A JP7396087 A JP 7396087A JP 2552479 B2 JP2552479 B2 JP 2552479B2
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cyclodextrin
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JP62073960A
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クンタン−ミレー，マリー−ジヨセ，ベ．
アルマンジヨン，フランソワ
ドニキアン，ルーペン．エール
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PASUTSUURU MERIU SEROMU E UAKUSAN
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PASUTSUURU MERIU SEROMU E UAKUSAN
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Publication date
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Publication of JPS62253377A publication Critical patent/JPS62253377A/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はボルデテラ（Bordetella）属の細菌の培養用
の新規な培地組成物に関する。この培地組成物はＤ−グ
ルコース重合体のエーテル化誘導体の少なくとも１種を
含むことを特色とする。また、本発明はこの培地を用い
るボルデテラ属細菌の培養方法にも関する。
ボルデテラ属の細菌、例えば百日咳菌（ボルデテラ・
パータッシス,Bordetella pertussis），パラ百日咳菌
（ボルデテラ・パラパータッシス,Bordetella parapert
ussis）及び気管支敗血症菌（ボルデテラ・ブロンキセ
プチカ,Bordetella bronchisepitica）は安全合成培地
で主に培養するには困難な問題があり、完全に満足でき
る合成培地はまだなかった。
百日咳菌は百日咳の病原菌であり、これを工業的に大
規模に培養することは、無細胞の百日咳ワクチン又は増
殖用菌種（Whole germs）を生産するのに必要である。
百日咳菌フェーズＩ（phase I）の菌を培地で培養す
ると、培地中にはパータッシス毒素（これはLPF,又はLP
F−HA,すなわちLeukocytosis Promoting Factor−Hemag
gulutininともいわれる）及びＦ−HA（線状血球凝集素,
Filamentous Hemagglutinin）が産生される。これらの
物質は無細胞の百日咳ワクチン組成物に配合できる抗原
物質である。
ボルデテラ属の細菌は当初はボルデー・ジャング（Bo
rdet−Gengou）培地といわれる固形培地で培養するのが
通例であった。
百日咳菌フェーズＩの菌の培養用の液体培地の一例は
J.W.ホーニブルック〔（Hornibrook）〔“Public Healt
h Reports",54巻,41号,1847−1851頁（1939年）〕によ
り発表されている。このホーニブルック培地は澱粉を含
有するものである。ホーニブルックによれば、澱粉の代
りにβ−デキストリン又はα−デキストリンを含有させ
得ることが指摘されている。これらのデキストリン類
は、こゝではα−シクロデキストリンまたはβ−シクロ
デキストリンと称するが、これらはポテト澱粉にβ．マ
セランス（macerans）菌を作用させて得られたポリオサ
イド（polyosides）である。
ホーニブルック培地はその後に改良を加えられ、スタ
イナー（Stainer）及びシヨルテ（Scholte）により完全
合成液体培地が完成された〔“J.Gen.Microbiology",63
巻,211−220頁（1970）〕。
このスタイナー・シヨルテ培地は、現在ではSS培地と
呼ばれるものであり、これの化学組成は特定されるもの
であり、これは天然産の物質又はこれの誘導体、例えば
イーストエキス，ポリプペプトン，等を含有しない。
このSS培地には、天然物質のような組成の複雑な物質
が存在しないので、この培地中で菌により産生、排泄さ
れた蛋白質抗原、例えばパータッシス毒素及びＦ−HAの
精製が更に容易にできる。また、SS培地を用いると、培
養終期に得られた菌体又は菌種（germ）懸濁液の品質の
再現性が良い。
このSS培地は、必須成分として一定量で次の物質、す
なわちグルタミン酸ナトリウム、Ｌ−プロリン、塩化ナ
トリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、塩化
マグネシウム、塩化カルシウム、トリス−ヒドロキシメ
チルアミノ−メタンを含み，これに次の物質、すなわち
Ｌ−シスチン、硫酸第一鉄、アスコルビン酸、グルタチ
オン（還元型）及びナイアシン（niacin）が添加されて
ある。
また、改良型のSS培地には、カザミノ酸又はこれに対
応のペプチド類の溶液が配合される。
しかしながら、SS培地を用いても、工業的大規模生産
に見合う十分な量の前記の抗原を発現（expression）さ
せることができない。しかも、このSS液体培地を用いる
と、培養を静置条件で行った時にしか、Ｆ−HA抗原を産
生できない。
攪拌又は振とう液体培養でパータッシス毒素及びＦ−
HAを産生するために、今泉らによればβ−シクロデキス
トリンのメチル誘導体を加用した改良型のスタイナー・
シヨルテ培地が提案された。このβ−シクロデキストリ
ンのメチル誘導体、すなわち環式ポリオキサイドは、ヘ
プタキス（2,6−Ｏ−ジメチル）−β−シクロデキスト
リンともいわれるものであり、これを加用すると、菌体
量を増大するばかりでなく、パータッシス毒素及びＦ−
HAの産生も増大する。
しかしながら、このβ−シクロデキストリン・メチル
誘導体を用いる場合には経済的問題が生ずる。その理由
は、β−シクロデキストリンを原料として用いる酵素反
応によって2,6−位に置換したジメチル誘導体を調製す
る工程を必要とするからである。
本発明の目的とするころは、ボルデテラ属細菌の発育
を助長できる化学的に特定され得る化合物であって、特
に高収率でパータッシス毒素及びＦ−HAの同時的な産生
を助長できる化合物を主成分とする培地を提供するにあ
り、また価格の高いシクロデキストリンのエーテル化誘
導体の使用を避けることのできる新規な培地を提供する
ことにある。
本発明は研究の結果、分子量が少なくとも2,000に等
しいＤ−グルコース重合体のエーテル化誘導体は、パー
タッシス毒素の産生にも、Ｆ−HAの産生にも影響を与え
ず、ただし、ボルデテラ属の培養中の菌の生育を抑制し
さえするけれども、Ｄ−グルコース重合体のエーテル化
誘導体をシクロデキストリン又はこれの誘導体と併用し
た場合には、菌の発育を助け及び／又はパータッシス毒
素とＦ−HAの高収率産生を促進するという驚くべき事実
を発見した。
したがって、本発明の要旨とするところは、ボルデテ
ラ属細菌培養用の培地組成物において、栄養性培地にシ
クロデキストリン又はこれの誘導体と、分子量が少なく
とも2,000のＤ−グルコース重合体のエーテル化誘導体
の１つ又はそれ以上とを配合、含有させてなることを特
徴とする、ボルデテラ属細菌培養用の培地組成物にあ
る。
本発明において使用されるエーテル化生成物を誘導す
るＤ−グルコース重合体はそのグルコース単位がアミロ
ースにおけるごとくα−結合によって結合されている重
合体又はセルロースにおけることごくβ−結合によって
結合されている重合体である。
Ｄ−グルコース重合体のエーテル化誘導体の代表的な
例としてはセルロース中のヒドロキシル基の一部が低級
アルキル又は低級ヒドロキシアルキル基によってエーテ
ル化されている形態のセルロースのエーテル化誘導体を
あげることができる。セルロースのエーテル化誘導体の
代表的な例は特にメチルセルロース，ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース，ヒドロキシエチルセルロース，ヒ
ドロキシブチルセルロース等を包含し、これらの生成物
はいずれもたとえばダウケミカル社、カラーコン社、ユ
ニオンカーバイド社及びハーキュレス社から主として入
手し得る市販製品である。同様に、主としてハーキュレ
ス社又はデュポン社から入手し得る市販製品であるカル
ボキシメチルセルロースも使用することができる。Ｄ−
グルコース重合体のエーテル化誘導体のその他の代表例
は澱粉及び特にアミロースの対応する誘導体を包含す
る。
Ｄ−グルコース重合体のエーテル化誘導体の分子量の
上限は臨界的ではない。しかしながら、該エーテル化誘
導体はその分子量及び置換度が使用濃度において該誘導
体が水に可溶性であるような値をもつように選定される
ことが好ましい。一般に、本発明の培値はＤ−グルコー
ス重合体のエーテル化誘導体は0.01〜2g/、好ましく
は0.05〜0.5g/、の割合で含有する。
Ｄ−グルコース重合体のエーテル化誘導体は数段階
で、一般に２〜６段階で培地に添加することができる。
たとえば、該エーテル化誘導体は各段階で0.01〜1g/
の割合で添加される。
シクロデキストリン（又はその誘導体の一種）は本発
明の培地中に0.5〜5g/、好ましくは１〜2g/）の量
で存在させる。
シクロデキストリンはα−シクロデキストリン，β−
シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンであり
得る。シクロデキストリンの誘導体は主としてエーテル
化誘導体である。
本発明はさらに、ボルデテラ属の細菌の培養、特にボ
ルデテラ・パータッシスの攪拌又は振盪培地の培養にお
いて培養菌の増殖及び／又はパータッシス毒素抗原及び
Ｆ−HAの発現（expression）を助長するために、前記定
義したごときＤ−グルコース重合体のエーテル化誘導体
とシクロデキストリン又はその誘導体とを併用する方法
に関する。
特に本発明は前述した培地組成物を使用してボルデテ
ラ属の細菌を培養する方法に関するものである。ボルデ
テラ属の細菌をシクロデキストリン又はその誘導体を含
む適当な培地中で培養することからなる本発明の方法は
この培地に前述したごときＤ−グルコース重合体の少な
くとも一種のエーテル化誘導体を添加することを特徴と
するものである。
Ｄ−グルコース重合体のエーテル化誘導体は前述した
ごとく0.01〜2g/、好ましくは0.05〜0.5g/の添加量
を与えるように培養当初に全量を一度に添加してもよく
あるいは数段階に分けて添加してもよい。
以下に攪拌された液体培地中で行われる本発明の特定
の方法について説明する。
本発明の方法に有用な代表的な基礎培地は主としてつ
ぎの組成（１当り）をもつSS変性培地を包含する。
グルタミン酸ナトリウム 10.72 g Ｌ−プロリン 0.24 g KH2PO4 0.50 g KCl 0.20 g MgCl2・6H2O 0.10 g CaCl2 0.02 g トリスヒドロキシメチルアミノメタン 6.10 g カザミノ酸＊ 10.00 g NaCl 2.50 g Ｌ−システイン 40.00mg FeSO4・7H2O 10.00mg アスコルビン酸 20.00mg 還元グルタチオン 100.00mg ナイアシン 4.00mg ＊又はカゼインの酵素水解によって製造された対応する
ペプチド類 前培養はシクロデキストリンを含有し又は含有しない
変性SS培地中で行なわれる。
厳密にいえば、培養はファーメンター（発酵槽）に細
菌を菌数108又は109個/ml程度の菌濃度で接種すること
により行われる。菌濃度は650nmにおいて分光光度分析
により光学密度を測定することによって求められる。
ファーメンター中の培地はシクロデキストリンを1.7g
/の濃度で含有する変性SS培地である。
培養は攪拌及び通気条件下で35〜37℃、好ましくは36
℃で行われる。
使用されるＤ−グルコース重合体のエーテル化誘導体
は平均分子量9,300をもちかつその特定のアルコール基
がメチル化されている（置換率％：約30重量％）セルロ
ースである。
メチルセルロースの添加を一度に全量添加という様式
で行なう場合、添加量は好ましくは約0.1g/である。
この添加は菌が指数増殖期にある時点で、一般に培養24
時間後に、行なうことができる。
メチルセルロースの添加を数段階で行なう場合にも、
全添加量は好ましくは0.1g/である。
メチルセルロース溶液は４段階で、たとえば培養７時
間後,24時間後,33時間後及び38時間後に添加することが
できる。
バイオマスの生成量（evolution）は培養期間中に650
nmにおける光学密度を測定することによって及び1ml当
り10の“乳白度単位”に相当する標準OMSを用いて乳白
度を測定することによって求められる。上記乳白度単位
は菌数10億個/mlに相当する。
上澄液中のパータッシス毒素抗原及びＦ−HAの量はそ
れぞれヤギ及びロバの高度免疫処置された血清を用いて
生起する免疫親和性に基づいて純化された抗Ｆ−HA抗体
及び抗パータッシス毒素抗体を用いるELISA試験によっ
て求められる。
培養操作の期間は微生物の発育状態及び培地上清中へ
のパータッシス毒素及びＦ−HAの発現状態に関係する。
この期間は一般に30〜72時間、より多くの場合40〜45時
間である。
つぎに本発明を実施例によって説明するが、これらは
何等本発明を限定するものではない。
実施例１ 本発明の培地組成物がボルデテラ・パータッシスの第
１期（フェーズＩ）の発育（development）に対して及
びこの培地中でのパータッシス毒素抗原及びＦ−HAの産
生に対して有利な効果を与えることを例証するために、
つぎに示す培地組成物の比較試験を行なった。
（１） 変性スタイナー（Stainer）及びショルテ（Sch
olte）の培地（カゼイン水解物によって供給される）； （２） 培地Ａ＝β−シクロデキストリンを1.67g/の
濃度で含有する変性スタイナー・ショルテの培地； （３） β−2,6−ジ−Ｏ−メチルシクロデキストリン
を1.67g/の最終濃度で含有する変性スタイナー・ショ
ルテの培地（A.Imaizumi,Y.Suzuki,S.Ono,H.Sato及びY.
SatoによってJ.Clin,Microbiol.,17,No.5,781−786（19
83）に規定されている培地）；及び （４） 培地Ｂ＝前述したごとくカラーコン社によって
市販されているA15型のメチルセルロースを培地Ａに正
確に添加した培地。
これらの培地をボルデテラ・パータッシスの第Ｉ期
（フェーズＩ）のトハマ（Tohama）株を用いて有効容量
30をもつファーメンター中で試験する。
これらの培養は同一の発酵条件（攪拌，通気,pH,培養
時間等）下で行なう。
一定の時間間隔でバイオマス及び上清中のパータッシ
ス毒素及びＦ−HAの量を測定する。
これらの結果を第１図、第２図及び第３図に示す。
第１図は培地組成の関数としてバイオマスの生成量の
時間ごとの増加を示すグラフであり、第２図は培地組成
の関数としてＦ−HAの産生量の時間ごとの増加を示すグ
ラフであり、第３図は培地組成の関数としてパータッシ
ス毒素の産生量の時間ごとの増加を示すグラフである。
得られるこれらのグラフの曲線を分析するとつぎのこ
とが認められる。
スタイナー・ショルテの培地にβ−シクオデキストリ
ンを単独添加した場合にはバイオマスの増加は認められ
ず、さらにまたパータッシス毒素抗原及びＦ−HAの産生
も認められない。この培地中でかつ使用した発酵条件
（攪拌下）において、培地中にはＦ−HAの産生は認めら
れない。
他方、β−シクロデキストリンをその2,6−ジ−Ｏ−
メチル誘導体に代えた場合には、微生物の増殖及びパー
タッシス毒素及びＦ−HAの産生に効果があることが認め
られる。
最後に、培地Ｂ（メチルセルロースを添加したもの）
はバイオマスのより顕著な増加及び培地中におけるパー
タッシス毒素及びＦ−HAの産生のより一層の増加を与え
る。
Tohama株は日本国、大阪在の醗酵研究所（Institute
for Fermentation Collection）に寄託番号IFO−14073
として寄託されている菌株である。
さらに、この菌株は東京都港区白金台の東京大学医科
学研究所内、the Japanese Federation of Culture Col
lecion of Microorganisms、においても入手可能であ
る。
実施例２ バイオマスの発育及び培地の上清中のパータッシス毒
素抗原及びＦ−HAの発現（expression）に及ぼすセルロ
ースの種々の誘導体の影響を評価するために三角フラス
コ中において一連の培地試験を行なった。
凍結乾燥したボルデテラ・パータッシスのフェーズＩ
のTohama株の２個のアンプルを使用して、固体ボルデー
・ジャング培地を含む８本の試験管に接種した。湿潤雰
囲気中、36℃で68時間培養した後、各試験管に実施例１
に規定したごとき培地Ａ（β−シクロデキストリンを含
む変性SS）約25mlを加えた。得られる菌懸濁液を用いて
培地A500mlを含む容量２の三角フラスコ４個に接種し
た。これらのフラスコを撹拌下、36℃で24時間培養し
た。
これらの菌懸濁液を合し、得られる混合物を用いて培
地A450mlを含む容量の２の三角フラスコ18個に接種し
た。これらを攪拌下に48時間培養した。24時間培養した
時点で、２個ずつのフラスコの組の各組に第Ｉ表に示す
セルロース誘導体の１種を1.25g/含有する溶液25mlを
添加した。
42時間培養後に各供試培地中のパータッシス毒素及び
Ｆ−HAの濃度を酵素抗体法（immunoenzymatic method）
によって測定した。結果を第Ｉ表に示す。
メトセルA15,A4C及びA4M型（カラーコン社より市販）
のセルロースのメチル化誘導体はパータッシス毒素抗原
及びＦ−HAの産生に対してきわめて有利な効果を有する
ことが認められた。すなわち、42時間培養後の培地中の
パータッシス毒素の量は培地Ａを用いて得られた量の２
〜４倍であり、またＦ−HAの濃度については６〜30倍に
達した。これらの使用条件下で、A15型のメチルセルロ
ースを使用してより良好な収率が得られた。
カルボキシメチル化誘導体はパータッシス毒素の発現
に対して有利な効果を有していた。しかしながら、パー
タッシス毒素の産生量はセルロースのメチル化誘導体を
用いて得られた産生量よりも低かった。他方、試験した
条件下ではセルロースのカルボキシメチル化誘導体はＦ
−HAの産生に対して認め得る効果を示さなかった。
実施例３ 本実施例は有効容量1000をもつファーメンター中で
倍地Ｂ（変性SS倍地＋β−シクロデキストリン＋メチル
セルロース）を使用してボルデテラ・パータッシス フ
ェーズＩのTohama株の培養を実施した場合を説明するも
のである。この培養の目的は培養上清中に著量のパータ
ッシス毒素抗原及びＦ−HAを産生すること及びそれと両
立的に高度に純化された活性成分、パータッシス アナ
トキシン及び／又はＦ−HA、をもつ無細胞の抗百日咳ワ
クチン化合物の製造を工業的規模で実施することであ
る。
この工業的規模の培養は次の工程からなる。
前培養Ｉ 固体ボルデー・ジャング倍地を含む試験管にボルデテ
ラ・パータッシス フェーズＩ Tohama株を接種する。
５個の凍結乾燥したアンプル−その各々はダイズ ト
リプチカーゼ倍地1mlによって支持されている−を使用
して、ボルデー・ジャング倍地を含む30本の試験管に接
種する。これらの試験管を湿潤雰囲気下、36℃のオーブ
ン中に60時間保持する。
前培養２ 各試験管に倍地A25mlを加える。純度をグラム試験法
によって検査した後、回収された菌懸濁液を混合する。
この混合物を使用してそれぞれが倍地A400mlを含有して
いる容量２の16個の三角フラスコに接種した。各フラ
スコにこの菌懸濁物の混合物約50mlを添加してからこれ
らのフラスコを振盪式攪拌条件下で36℃で24時間培養す
る。
グラム試験法によってこれらフラスコの純度を検査し
かつボルデー・ジャング倍地上に汚染菌の発育が認めら
れないことを確認した後に、これらのフラスコに菌懸濁
物を合しそして菌濃度を650nmにおける光学密度を測定
することによって求める。
前培養2:光学密度OD650nm＝1.80、これは約40×109個/m
lの菌濃度に相当する。
前培養3:予備ファーメンター工程 倍地A40を含む２基のファーメンターの各々に前工
程からの前培養3.2を接種して少なくとも109個/mlの
滴定値を示す菌濃度の菌懸濁物を与える。
培養は中程度の攪拌条件及び通気条件下に36℃で24時
間行なう。
この培養期間の終りにグラム試験法によって純度を確
認しそして菌密度を650nmにおける光学密度の測定によ
って求める。培養24時間後に各予備ファーメンターにつ
いて測定した光学密度は3.01及び3.37であり、これは約
64〜68×109個/mlの菌濃度に相当する。
工業的規模の培養 工業的規模の培養は実施例１に規定したごとき培値B1
000を含むファーメンター中で行なった。このファー
メンターに前工程の前培養を接種した。
接種後の菌濃度は５×109個/ml程度である。
培養は攪拌及び通気条件下、35℃で40時間行なった。
この培養期間中にカラーコンA15型のメチルセルロー
スの溶液を培養全期間にわたってバイオマスの生成量
（evolution）の関数として数段階に分割して添加し
た。すなわち、メチルセルロースの添加は培養７時間
後、24時間及び32時間後に行なった。各添加はメチルセ
ルロース1.25g/を含む培地Ａの溶液24をファーメン
ターに移すことによって行なった。
培養は合計40時間で停止した。
冷却後、培地にマーシオレート（merthiolate）を最
終濃度0.01％（P/V）で添加することによって不活性化
しそして連続的に遠心分離した。
上清は濾過により清澄化した。
バイオマスの生成量及び培養上清中の抗原物質の量
（ELISA試験により測定）を培養期間を通じて測定し、
その結果を第II表に示す。
【図面の簡単な説明】 図面は本発明の特徴とする培地組成物が従来技術による
培地組成物と比較してボルデテラ・パータッシス（百日
咳菌）のフェーズＩの発育及びパータッシス毒素抗原及
びＦ−HAの産生に対して有利な効果を与えることを例証
する試験結果を示すもので、第１図はバイオマスの生成
量の時間ごとの増加を示すグラフ、第２図はＦ−HAの産
生量の時間ごとの増加を示すグラフそして第３図はパー
タッシス毒素抗原の産生量の時間ごとの増加を示すグラ
フである。第１〜３図中培地（１）〜（４）の組成はつ
ぎのとおりである。 培地（１）：変性スタイナー・ショルテ（SS）培地 培地（２）：変性SS培地＋β−シクロデキストリン 培地（３）：変性SS培地＋β−2,6−ジ−Ｏ−メチルデ
キストリン 培地（４）：変性SS培地＋β−シクロデキストリン＋メ
チルセルロース
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ボルデテラ属細菌培養用の培地組成物にお
    いて、栄養性培地にシクロデキストリン又はこれの誘導
    体と、分子量が少なくとも2,000のＤ−グルコース重合
    体のエーテル化誘導体の１つ又はそれ以上とを配合、含
    有させてなることを特徴とする、ボルデテラ属細菌培養
    用の培地組成物。
  2. 【請求項２】Ｄ−グルコース重合体のエーテル化誘導体
    は、低級アルキル基又はヒドロキシ低級アルキル基でセ
    ルロースのヒドロキシル基の一部分がエーテル化されて
    あるセルロース誘導体である特許請求の範囲第１項記載
    の組成物。
  3. 【請求項３】Ｄ−グルコース重合体のエーテル化誘導体
    は、メチルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセ
    ルロース、ヒドロキシエチル−セルロース又はヒドロキ
    シブチル−セルロースである特許請求の範囲第１項記載
    の組成物。
  4. 【請求項４】Ｄ−グルコース重合体のエーテル化誘導体
    はカルボキシメチル−セルロースである特許請求の範囲
    第１項記載の組成物。
  5. 【請求項５】Ｄ−グルコース重合体のエーテル化誘導体
    は、該組成物の１当りに0.01〜2gの範囲の量で配合さ
    れてある特許請求の範囲第１項記載の組成物。
  6. 【請求項６】Ｄ−グルコース重合体のエーテル化誘導体
    は、該組成物の１当りに0.05〜0.5gの範囲の量で配合
    されてある特許請求の範囲第１項記載の組成物。
  7. 【請求項７】シクロデキストリン又はこれの塩は該組成
    物の１当りに0.5〜5gの範囲の量で配合されてある特
    許請求の範囲第１項記載の組成物。
  8. 【請求項８】シクロデキストリン又はこれの塩は該組成
    物の１当りに１〜2gの範囲の量で配合されてある特許
    請求の範囲第１項記載の組成物。
  9. 【請求項９】シクロデキストリン又はこれの塩と、分子
    量が少なくとも2,000のＤ−グルコース重合体のエーテ
    ル化誘導体の１つ又はそれ以上とを含有する栄養性培地
    でボルデテラ属細菌を培養することから成る、ボルデテ
    ラ属細菌の培養方法。
  10. 【請求項１０】数段階に分けてＤ−グルコース重合体の
    エーテル化誘導体を添加し、その添加全量は0.01〜2g/
    の範囲である特許請求の範囲第９項記載の方法。
  11. 【請求項１１】数段階に分けてＤ−グルコース重合体の
    エーテル化誘導体を添加し、その添加全量は0.05〜0.5g
    /である特許請求の範囲第９項記の方法。
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