JP2522903B2 - 抗炎症治療薬としてのｉ型ホスホリパ―ゼａ▲下２▼に対するモノクロ―ナル抗体 - Google Patents
抗炎症治療薬としてのｉ型ホスホリパ―ゼａ▲下２▼に対するモノクロ―ナル抗体Info
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- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、急性膵炎への適用に特に適した抗炎症治療
薬の製造に、Ｉ型ホスホリパーゼA2に対するモノクロー
ナル抗体を使用することに関する。
薬の製造に、Ｉ型ホスホリパーゼA2に対するモノクロー
ナル抗体を使用することに関する。
急性膵炎には原因療法も対症療法もない（The Merck
Manual of Diagnosis and Therapy15（1987）,763−767
ページ）。急性膵炎の根本的な病因は、膵臓の自己消化
である。ホスホリパーゼA2はこの過程で決定的な機能を
はたすと考えられてきた。ホスホリパーゼA2は、この自
己消化の過程で、細胞膜上で溶解活性を示し、膜のリン
脂質からアラキドン酸を遊離させる。アラキドン酸の代
謝物（プロスタグランジンおよびロイコトリエン）は、
炎症反応の重要な要因である。
Manual of Diagnosis and Therapy15（1987）,763−767
ページ）。急性膵炎の根本的な病因は、膵臓の自己消化
である。ホスホリパーゼA2はこの過程で決定的な機能を
はたすと考えられてきた。ホスホリパーゼA2は、この自
己消化の過程で、細胞膜上で溶解活性を示し、膜のリン
脂質からアラキドン酸を遊離させる。アラキドン酸の代
謝物（プロスタグランジンおよびロイコトリエン）は、
炎症反応の重要な要因である。
ホスホリパーゼA2には二種類ある。Ｉ型と命名された
ホスホリパーゼA2は、おもに膵臓組織にみられ、急性膵
炎に重要な役割を担っている。これに対して、II型ホス
ホリパーゼA2は多くの様々な組織に存在する。
ホスホリパーゼA2は、おもに膵臓組織にみられ、急性膵
炎に重要な役割を担っている。これに対して、II型ホス
ホリパーゼA2は多くの様々な組織に存在する。
マウスにおいて抗炎症作用を有する、ホシホリパーゼ
A2の低分子阻害剤が、EP−A0 248 597に記載されてい
る。しかしながら、これらの化合物は、約80％阻害のた
めに200−400μｇの投与が必要である。このような大量
投与では、これらの低分子阻害剤の副作用のため、治療
への適用可能性が著しく制限される。JP088193に記載さ
れたホスホリパーゼA2阻害剤も、成人患者の膵炎治療に
は一日当り100−1000mgの投与が提案されており、上記
のような欠点を有する。EP−Ａ−0 405 864に記載され
た、微生物サーシノトリチュム・ファルカチスポルム
（Circinotrichum falcatisporum）由来のホスホリパー
ゼA2阻害剤は、精製ラットホスホリパーゼA2の阻害に関
して、17.5から300μg/ml以上のIC50値を有する。した
がって、これもまた治療に適用するためには非常な高用
量で使用されなければならない。
A2の低分子阻害剤が、EP−A0 248 597に記載されてい
る。しかしながら、これらの化合物は、約80％阻害のた
めに200−400μｇの投与が必要である。このような大量
投与では、これらの低分子阻害剤の副作用のため、治療
への適用可能性が著しく制限される。JP088193に記載さ
れたホスホリパーゼA2阻害剤も、成人患者の膵炎治療に
は一日当り100−1000mgの投与が提案されており、上記
のような欠点を有する。EP−Ａ−0 405 864に記載され
た、微生物サーシノトリチュム・ファルカチスポルム
（Circinotrichum falcatisporum）由来のホスホリパー
ゼA2阻害剤は、精製ラットホスホリパーゼA2の阻害に関
して、17.5から300μg/ml以上のIC50値を有する。した
がって、これもまた治療に適用するためには非常な高用
量で使用されなければならない。
やはり抗炎症作用を有する別のホスホリパーゼA2阻害
剤は、37kDリポコルチンである（B.Wallnerら,Nature32
0（1986）,77−81）。しかしながら、リポコルチンは安
定性に欠けるため、治療に使用するには適さない。ホス
ホリパーゼA2に対して阻害作用を有する、大きさとして
15−26個のアミノ酸からなるペプチドが、EP−A0 327 3
34に記載されている。しかしながら、これらのペプチド
のうち、10μg/ml以下のIC50値を有するのは、わずかに
一つだけである。とはいえ、保護基のついていない16個
のアミノ酸からなるこのペプチドがリポコルチンより高
い安定性を有するとの証明は、なされていない。
剤は、37kDリポコルチンである（B.Wallnerら,Nature32
0（1986）,77−81）。しかしながら、リポコルチンは安
定性に欠けるため、治療に使用するには適さない。ホス
ホリパーゼA2に対して阻害作用を有する、大きさとして
15−26個のアミノ酸からなるペプチドが、EP−A0 327 3
34に記載されている。しかしながら、これらのペプチド
のうち、10μg/ml以下のIC50値を有するのは、わずかに
一つだけである。とはいえ、保護基のついていない16個
のアミノ酸からなるこのペプチドがリポコルチンより高
い安定性を有するとの証明は、なされていない。
滑液由来のヒトホスホリパーゼA2に対するモノクロー
ナル抗体がTakayamaらによって記述されているが（Bioc
hem,Biophys.Res.Comm.167（1990）,1309−1315）、こ
れは膵臓由来のホスホリパーゼA2には結合しない。
ナル抗体がTakayamaらによって記述されているが（Bioc
hem,Biophys.Res.Comm.167（1990）,1309−1315）、こ
れは膵臓由来のホスホリパーゼA2には結合しない。
膵臓由来のホスホリパーゼA2に対するモノクローナル
抗体がEP−A0 287 397およびJ.Clin.Biochem.Nutr.11
（1991）,79−89に記載されている。これらの抗体のう
ちいくつかは、IC50値0.2ng/mlでホスホリパーゼA2の酵
素活性を阻害する。しかしながら、これらの抗体の診断
上での利用が記載されているにすぎない。
抗体がEP−A0 287 397およびJ.Clin.Biochem.Nutr.11
（1991）,79−89に記載されている。これらの抗体のう
ちいくつかは、IC50値0.2ng/mlでホスホリパーゼA2の酵
素活性を阻害する。しかしながら、これらの抗体の診断
上での利用が記載されているにすぎない。
これに対して、本発明の目的は、その阻害作用によっ
てその阻害剤を急性膵炎の治療薬として使用することが
可能であるような、ホスホリパーゼA2の阻害剤を提供す
ることであった。
てその阻害剤を急性膵炎の治療薬として使用することが
可能であるような、ホスホリパーゼA2の阻害剤を提供す
ることであった。
この目的は、100ng/ml未満の濃度でホスホリパーゼA2
活性を少なくとも50％阻害する、Ｉ型ホスホリパーゼA2
に対するモノクローナル抗体またはその抗体の機能フラ
グメントを、炎症性の症状、特に急性膵炎に使用できる
治療薬を製造するために、使用することによって達成さ
れる。
活性を少なくとも50％阻害する、Ｉ型ホスホリパーゼA2
に対するモノクローナル抗体またはその抗体の機能フラ
グメントを、炎症性の症状、特に急性膵炎に使用できる
治療薬を製造するために、使用することによって達成さ
れる。
驚くべきことには、Ｉ型ホスホリパーゼA2に対するモ
ノクローナル抗体、またはそのような抗体の機能的な誘
導体を使用して、炎症反応、特に急性膵炎、幹癬、腹膜
炎または敗血症に対して、著しく有効な治療薬が得られ
ることが明らかになった。完全抗体のほか、モノクロー
ナルFabまたはＦ（ab′）フラグメントならびに二価の
Ｆ（ab′）２フラグメント等の機能的抗体フラグメント
も、上記に適す。
ノクローナル抗体、またはそのような抗体の機能的な誘
導体を使用して、炎症反応、特に急性膵炎、幹癬、腹膜
炎または敗血症に対して、著しく有効な治療薬が得られ
ることが明らかになった。完全抗体のほか、モノクロー
ナルFabまたはＦ（ab′）フラグメントならびに二価の
Ｆ（ab′）２フラグメント等の機能的抗体フラグメント
も、上記に適す。
以上より、本発明はまた、Ｉ型ホスホリパーゼA2に対
するモノクローナル抗体、またはそのような抗体の機能
的な誘導体を、所望により通常の製剤用担体基剤、賦形
剤、助剤および添加剤とともに含んでなる医薬組成物、
ならびに急性膵炎の治療に特に使用することができる製
剤を製造する方法に関する。
するモノクローナル抗体、またはそのような抗体の機能
的な誘導体を、所望により通常の製剤用担体基剤、賦形
剤、助剤および添加剤とともに含んでなる医薬組成物、
ならびに急性膵炎の治療に特に使用することができる製
剤を製造する方法に関する。
ハイブリドーマ系統DSM ACC2026およびDSM ACC2025か
ら得られるモノクローナル抗体が、本発明による使用に
特に好適であることが明らかとなっている。
ら得られるモノクローナル抗体が、本発明による使用に
特に好適であることが明らかとなっている。
上記に加えて、本発明のさらに好ましい主題は、細胞
系DSM ACC2026および／またはDSM ACC2025から得られる
Ｉ型ホスホリバーゼA2に対するモノクローナル抗体と同
様の様式でＩ型ホスホリパーゼA2に結合することができ
る、Ｉ型ホスホリパーゼA2に対するモノクローナル抗体
に関する。
系DSM ACC2026および／またはDSM ACC2025から得られる
Ｉ型ホスホリバーゼA2に対するモノクローナル抗体と同
様の様式でＩ型ホスホリパーゼA2に結合することができ
る、Ｉ型ホスホリパーゼA2に対するモノクローナル抗体
に関する。
「同様の様式で結合することができる抗体」とは、そ
の抗体において、上記した特定の公知抗体とのエピトー
プの重複が検出できるような抗体を意味する。このよう
なエピトープの重複は、競合的試験法によって決定する
ことができる。このため、特定の抗原または特別なエピ
トープへの結合に関して、ある抗体が公知の抗体とどの
程度競合するかを調べるために、例えば、エンザイムイ
ムノアッセイが用いられる。この方法では、適当な抗原
を、標識した公知のモノクローナル抗体、および過剰量
の被験抗体とともにインキュベートする。生成した複合
体を固定化し、液相から固相を分離し、二相のうちの一
方に於て結合した標識を検出することによって、被験抗
体が特定の抗体を結合からどの程度置換することができ
るかを容易に判定することができる。105倍過剰で、最
低50％の置換があれば、その場合にはエピトープの重複
が存在する。
の抗体において、上記した特定の公知抗体とのエピトー
プの重複が検出できるような抗体を意味する。このよう
なエピトープの重複は、競合的試験法によって決定する
ことができる。このため、特定の抗原または特別なエピ
トープへの結合に関して、ある抗体が公知の抗体とどの
程度競合するかを調べるために、例えば、エンザイムイ
ムノアッセイが用いられる。この方法では、適当な抗原
を、標識した公知のモノクローナル抗体、および過剰量
の被験抗体とともにインキュベートする。生成した複合
体を固定化し、液相から固相を分離し、二相のうちの一
方に於て結合した標識を検出することによって、被験抗
体が特定の抗体を結合からどの程度置換することができ
るかを容易に判定することができる。105倍過剰で、最
低50％の置換があれば、その場合にはエピトープの重複
が存在する。
細胞系DSM ACC2026および／またはDSM ACC2025から得
られるＩ型ホスホリパーゼA2に対するモノクローナル抗
体が、特に好ましい。
られるＩ型ホスホリパーゼA2に対するモノクローナル抗
体が、特に好ましい。
さらにこの発明は、細胞系DSM ACC2026および／また
はDSM ACC2025に関する。
はDSM ACC2025に関する。
本発明のモノクローナル抗体は、動物を精製ホスホリ
パーゼA2で免疫感作し、その動物の脾細胞を不死化し、
100ng/ml未満のIC50値でホスホリパーゼA2活性を阻害す
る抗体をその培養上清に含有するような不死化細胞をク
ローン化することによって得られる。このようなクロー
ンによって産生されたモノクローナル抗体を、つぎに、
公知の方法にしたがって単離する。
パーゼA2で免疫感作し、その動物の脾細胞を不死化し、
100ng/ml未満のIC50値でホスホリパーゼA2活性を阻害す
る抗体をその培養上清に含有するような不死化細胞をク
ローン化することによって得られる。このようなクロー
ンによって産生されたモノクローナル抗体を、つぎに、
公知の方法にしたがって単離する。
免疫感作は、例えばマウスやラットといった通常これ
に使用される動物を使って行なう。
に使用される動物を使って行なう。
免疫感作された動物の脾細胞の不死化は、J.of Imm.M
eth.39（1980）,285−308に記述された方法にしたがっ
て、骨髄腫細胞系P3X63−Ag8.653（ATCC CRL 1580）と
の融合によって行なうことが望ましい。しかしながら、
そのほかに、当業者に公知の他の方法を用いて、脾細胞
を不死化することもできる。
eth.39（1980）,285−308に記述された方法にしたがっ
て、骨髄腫細胞系P3X63−Ag8.653（ATCC CRL 1580）と
の融合によって行なうことが望ましい。しかしながら、
そのほかに、当業者に公知の他の方法を用いて、脾細胞
を不死化することもできる。
クローニングのために、例えば蛍光活性化セルソータ
ーによって細胞を分離する。ホスホリパーゼA2に対する
所望の抗体を産生する不死化細胞を検出するために、ホ
スホリパーゼA2との反応性について、培養上清試料をEL
ISA試験によってテストする。ホスホリパーゼA2の酵素
活性を阻害する抗体を得るために、ホスホリパーゼA2と
結合する抗体を産生するクローンの培養上清を、さら
に、酵素的な試験によってホスホリパーゼA2活性の阻害
についても試験する。
ーによって細胞を分離する。ホスホリパーゼA2に対する
所望の抗体を産生する不死化細胞を検出するために、ホ
スホリパーゼA2との反応性について、培養上清試料をEL
ISA試験によってテストする。ホスホリパーゼA2の酵素
活性を阻害する抗体を得るために、ホスホリパーゼA2と
結合する抗体を産生するクローンの培養上清を、さら
に、酵素的な試験によってホスホリパーゼA2活性の阻害
についても試験する。
培養上清が所望のホスホリパーゼA2活性阻害を示すク
ローンを増殖させ、それらのクローンによって産生され
る抗体を公知の方法にしたがって単離する。
ローンを増殖させ、それらのクローンによって産生され
る抗体を公知の方法にしたがって単離する。
ホスホリパーゼA2に対するモノクローナル抗体を産生
する本発明のバイブリドーマ細胞系DSM ACC2026およびD
SM ACC2025を、1991年10月12日に、“ドイチェ・ザムル
ング・フォン・ツェルクルツレン・ウント・マイクロオ
ーガンジーメン・ゲーエムベーハー”、マッシュローダ
ー ベイグ １ベー，デー3300 ブラウンシュベイグ
（“Deutshe Sammlung von Zellkulturen und Mikroorg
anismen GmbH",Mascheroder Weg 1b,D−3300Braunschwe
ig）に寄託した。
する本発明のバイブリドーマ細胞系DSM ACC2026およびD
SM ACC2025を、1991年10月12日に、“ドイチェ・ザムル
ング・フォン・ツェルクルツレン・ウント・マイクロオ
ーガンジーメン・ゲーエムベーハー”、マッシュローダ
ー ベイグ １ベー，デー3300 ブラウンシュベイグ
（“Deutshe Sammlung von Zellkulturen und Mikroorg
anismen GmbH",Mascheroder Weg 1b,D−3300Braunschwe
ig）に寄託した。
本発明を図１とともに以下の実施例によって説明す
る。
る。
図１は、モノクローナル抗体DSM ACC2026（＋）およ
びDSM ACC2025（□）によるホスホリパーゼA2活性の阻
害を示す。
びDSM ACC2025（□）によるホスホリパーゼA2活性の阻
害を示す。
実施例1:I型ホスホリパーゼA2に対するモノクローナル
抗体の産生 完全フロイントアジュバントと混合した50μｇの精製
ホスホリパーゼA2（EC3.1.1.4,V.Kozumplikら、Biochi
m.Biophys.Acta1002（1989）,395−397）を用いて、週
齢12週のBalb/cマウスを腹腔内で免疫感作する。その後
２回、それぞれ１カ月の間隔をおいて、各回50μｇずつ
不完全フロイントアジュバントとともに注射により投与
する。細胞融合の３日前に、さらに50μｇを生理食塩水
に混合して、静脈注射する。
抗体の産生 完全フロイントアジュバントと混合した50μｇの精製
ホスホリパーゼA2（EC3.1.1.4,V.Kozumplikら、Biochi
m.Biophys.Acta1002（1989）,395−397）を用いて、週
齢12週のBalb/cマウスを腹腔内で免疫感作する。その後
２回、それぞれ１カ月の間隔をおいて、各回50μｇずつ
不完全フロイントアジュバントとともに注射により投与
する。細胞融合の３日前に、さらに50μｇを生理食塩水
に混合して、静脈注射する。
ＫhlerおよびMilstein（J.of Imm.Meth.39（198
0）,285−308）によって最初に記述された方法の変法に
したがって、免疫感作したマウスの脾細胞を骨髄腫細胞
系P3X63−Ag8.653（ATCC CRL 1580）と融合させる。融
合細胞をRPMI1640培地（10％FCS,2mmol/l L−グルタミ
ンおよび1mmol/lピルビン酸ナトリウム、ならびに0.1mm
ol/lヒポキサンチンおよび10μmol/lアザセリンを含有
する）で培養する。
0）,285−308）によって最初に記述された方法の変法に
したがって、免疫感作したマウスの脾細胞を骨髄腫細胞
系P3X63−Ag8.653（ATCC CRL 1580）と融合させる。融
合細胞をRPMI1640培地（10％FCS,2mmol/l L−グルタミ
ンおよび1mmol/lピルビン酸ナトリウム、ならびに0.1mm
ol/lヒポキサンチンおよび10μmol/lアザセリンを含有
する）で培養する。
一次培養の陽性細胞（実施例２および３によって判定
する）を、融合の２週間後に蛍光活性化セルソーターを
用いて、クローン化する。この過程で、細胞をそれぞれ
96ウェルのマイクロタイタープレートに入れる。
する）を、融合の２週間後に蛍光活性化セルソーターを
用いて、クローン化する。この過程で、細胞をそれぞれ
96ウェルのマイクロタイタープレートに入れる。
実施例2:産生された抗体の特異性の決定 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）を用い
て、ハイブリドーマ細胞の培養上清における抗体の特異
性を決定した。
て、ハイブリドーマ細胞の培養上清における抗体の特異
性を決定した。
このために、96ウェルのマイクロタイタープレートを
100μｌホスホリパーゼA2抗原〔５μg/ml炭酸バッファ
ー溶液、ベンリンガー マンハイム ゲーエムベーハー
（Boehringer Mannheim GmbH），カタログ番号726 55
9〕でコートし、〔DulbeccoおよびVogt,J.Exp.Meth.99
（1954）,167−182にしたがってPBSで1:25に希釈した〕
100μｌ培養上清とともに室温で２時間インキュベート
し、350μl PBS/0.05％ツイーン（Tween）20で３回洗浄
する。抗体を含有する試料溶液を添加した後、これを室
温で１時間インキュベートし、再び洗浄する。その後、
これをPOD−標識ヒツジ抗−マウス免疫グロブリンＧ（1
0mU,Boehringer Mannheim GmbH,カタログ番号13 17 37
7）とともに、室温で１時間インキュベートし、350μl
PBS/0.05％Tween20で３回洗浄し、3.25mmol/l過ホウ酸
ナトリウム（Boehringer Mannheim GmbH,カタログ番号1
204 530）を含有する40mmol/lクエン酸バッファーpH4.4
に溶解した100μl ABTS （1mg/ml,Boehringer Mannhei
m GmbH,カタログ番号756 407）を添加して検出反応をス
タートさせる。室温で30分インキュベートした後、EIIS
A読み取り装置で405nmでの吸光度を測定する。
100μｌホスホリパーゼA2抗原〔５μg/ml炭酸バッファ
ー溶液、ベンリンガー マンハイム ゲーエムベーハー
（Boehringer Mannheim GmbH），カタログ番号726 55
9〕でコートし、〔DulbeccoおよびVogt,J.Exp.Meth.99
（1954）,167−182にしたがってPBSで1:25に希釈した〕
100μｌ培養上清とともに室温で２時間インキュベート
し、350μl PBS/0.05％ツイーン（Tween）20で３回洗浄
する。抗体を含有する試料溶液を添加した後、これを室
温で１時間インキュベートし、再び洗浄する。その後、
これをPOD−標識ヒツジ抗−マウス免疫グロブリンＧ（1
0mU,Boehringer Mannheim GmbH,カタログ番号13 17 37
7）とともに、室温で１時間インキュベートし、350μl
PBS/0.05％Tween20で３回洗浄し、3.25mmol/l過ホウ酸
ナトリウム（Boehringer Mannheim GmbH,カタログ番号1
204 530）を含有する40mmol/lクエン酸バッファーpH4.4
に溶解した100μl ABTS （1mg/ml,Boehringer Mannhei
m GmbH,カタログ番号756 407）を添加して検出反応をス
タートさせる。室温で30分インキュベートした後、EIIS
A読み取り装置で405nmでの吸光度を測定する。
実施例3:酵素活性の阻害試験 ヒト十二指腸ホスホリパーゼA2（実施例１参照）を、
「遊離脂肪酸テストキット」（Boehringer Mannheim Gm
bH,カタログ番号1056 239）の中のTrisバッファーで希
釈する。この酵素溶液20μｌを、様々な濃度の被験抗体
溶液10μｌとともに25℃で15分間インキュベートする
（表１参照）。つぎに、基質〔「遊離脂肪酸テストキッ
ト」（Boehringer Mannheim GmbH,カタログ番号1056 23
9）の中のレシチン乳濁液〕20μｌを加え、37℃で60分
間インキュベートする。この過程で、ホスホリパーゼA2
活性によって放出される脂肪酸を、「遊離脂肪酸テスト
キット」（Boehringer Mannheim GmbH,カタログ番号105
6 239）を用いて、使用説明書にしたがって吸光度を測
定することにより、定量する。その結果を以下の表１お
よび図１に、抗体なしでの酵素活性と比較した％阻害と
して示す（いずれの場合も、３回の測定の平均値であ
る）。
「遊離脂肪酸テストキット」（Boehringer Mannheim Gm
bH,カタログ番号1056 239）の中のTrisバッファーで希
釈する。この酵素溶液20μｌを、様々な濃度の被験抗体
溶液10μｌとともに25℃で15分間インキュベートする
（表１参照）。つぎに、基質〔「遊離脂肪酸テストキッ
ト」（Boehringer Mannheim GmbH,カタログ番号1056 23
9）の中のレシチン乳濁液〕20μｌを加え、37℃で60分
間インキュベートする。この過程で、ホスホリパーゼA2
活性によって放出される脂肪酸を、「遊離脂肪酸テスト
キット」（Boehringer Mannheim GmbH,カタログ番号105
6 239）を用いて、使用説明書にしたがって吸光度を測
定することにより、定量する。その結果を以下の表１お
よび図１に、抗体なしでの酵素活性と比較した％阻害と
して示す（いずれの場合も、３回の測定の平均値であ
る）。
実施例4:ホスホリパーゼA2に対する抗体のエピトープ重
複の判定 ある抗体とモノクローナル抗体DSM ACC2025またはDSM
ACC2026とのエピトープの重複を検出するために、競合
的エンザイムイムノアッセイを行なう。
複の判定 ある抗体とモノクローナル抗体DSM ACC2025またはDSM
ACC2026とのエピトープの重複を検出するために、競合
的エンザイムイムノアッセイを行なう。
このために、まず、試薬の使用説明書にしたがって、
ホスホリパーゼA2をＤ−ビオチニル−ε−アミドカプロ
ン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Boehri
nger Mannheim GmbH,カタログ番号1008 960）でビオチ
ニル化する。100μl PBS溶液中のこのビオチニル化抗原
300ngをストレプトアビジンでコートしたマイクロタイ
タープレート（EP−A0 344 578にしたがって製造され
た）に、室温で１時間インキュベートすることによって
結合させる。PBS/0.05％Tween20で４回洗浄した後、予
めパーオキシダーゼで標識した（最終濃度250mU/ml）モ
ノクローナ抗体DSM ACC2025またはDSM ACC2026、および
被験抗体とともに、90分間室温でインキュベートする。
再び、PBS/0.05％Tween20で４回洗浄した後、これを、
過ホウ酸ナトリウム（実施例２参照）を含有するバッフ
ァーと混合した酵素基質溶液ABTS とともに、室温で30
分間インキュベートし、つぎに、405nmでの吸光度を、
結合したPOD−標識モノクローナル抗体DSM ACC2025また
はDSM ACC2026の量として測定する。この値を、モノク
ローナル抗体DSM ACC2025またはDSM ACC2026とのみイン
キュベートした時に得られる吸光度と比較する。酵素複
合体（250mU/ml）としてのモノクローナル抗体DSM ACC2
025またはDSM ACC2026に対して、被験抗体を105倍過剰
したときに少なくとも50％の競合が観察される場合に
は、エピトープの重複が存在する。
ホスホリパーゼA2をＤ−ビオチニル−ε−アミドカプロ
ン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Boehri
nger Mannheim GmbH,カタログ番号1008 960）でビオチ
ニル化する。100μl PBS溶液中のこのビオチニル化抗原
300ngをストレプトアビジンでコートしたマイクロタイ
タープレート（EP−A0 344 578にしたがって製造され
た）に、室温で１時間インキュベートすることによって
結合させる。PBS/0.05％Tween20で４回洗浄した後、予
めパーオキシダーゼで標識した（最終濃度250mU/ml）モ
ノクローナ抗体DSM ACC2025またはDSM ACC2026、および
被験抗体とともに、90分間室温でインキュベートする。
再び、PBS/0.05％Tween20で４回洗浄した後、これを、
過ホウ酸ナトリウム（実施例２参照）を含有するバッフ
ァーと混合した酵素基質溶液ABTS とともに、室温で30
分間インキュベートし、つぎに、405nmでの吸光度を、
結合したPOD−標識モノクローナル抗体DSM ACC2025また
はDSM ACC2026の量として測定する。この値を、モノク
ローナル抗体DSM ACC2025またはDSM ACC2026とのみイン
キュベートした時に得られる吸光度と比較する。酵素複
合体（250mU/ml）としてのモノクローナル抗体DSM ACC2
025またはDSM ACC2026に対して、被験抗体を105倍過剰
したときに少なくとも50％の競合が観察される場合に
は、エピトープの重複が存在する。
実施例5:ホスホリパーゼA2に対するモノクローナル抗体
存在下における、Ｉ型PLA2が誘発するヒト白血球による
PGE2およびLTC4放出の阻害 密度遠心（Boehringer Mannheim GmbH,カタログ番号2
95949のリンパ球分離用媒質）によって末梢血からヒト
白血球を単離し、「遊離脂肪酸テストキット（Boehring
er Mannheim GmbH,カタログ番号1056 239）中のTrisバ
ッファー125mmol/l中に、細胞数が0.75x106個/mlとなる
ように調整する。様々な濃度の精製ヒトホスホリパーゼ
A2（実施例１および表２参照）を、モノクローナル抗体
DSM ACC2026（濃度は表２参照）およびヒト白血球の溶
液とともに、37℃で４時間インキュベートする。つぎ
に、細胞を800gで10分間遠心分離し、その上清中のPGE2
およびLTC4濃度を、ラジオイムノアッセイによって定量
する〔PGE2についてはビールマン、バッドノーハイム、
ドイツ国（Biermann,Bad Nauheim,Germany）およびLTC4
については、エヌイーエヌ デュポン、ドレイッヒ、ド
イツ国（NEN DuPont,Dreieich,Germany）〕。PGE2およ
びLTC4のそれぞれについて独立した２回の実験結果（ヒ
ト白血球は二人の異なるドナーに由来する）を次の表２
に示す（いずれの場合も３回の定量の平均値である）。
ポジティブ対照混合物（Ｉ型ホスホリパーゼA2を含む
が、このホスホリパーゼA2に対するモノクローナル抗体
は含まないインキュベーション）において、ヒト末梢リ
ンパ球による炎症伝達物質PGE2およびLTC4の放出をPLA2
が誘発し、刺激することが、明白に示されている。この
ようなPGE2およびLTC4の放出は、in vivoでは炎症反応
を引き起こすが、Ｉ型ホスホリパーゼA2に対するモノク
ローナル抗体の添加により実質的に阻害することができ
る。
存在下における、Ｉ型PLA2が誘発するヒト白血球による
PGE2およびLTC4放出の阻害 密度遠心（Boehringer Mannheim GmbH,カタログ番号2
95949のリンパ球分離用媒質）によって末梢血からヒト
白血球を単離し、「遊離脂肪酸テストキット（Boehring
er Mannheim GmbH,カタログ番号1056 239）中のTrisバ
ッファー125mmol/l中に、細胞数が0.75x106個/mlとなる
ように調整する。様々な濃度の精製ヒトホスホリパーゼ
A2（実施例１および表２参照）を、モノクローナル抗体
DSM ACC2026（濃度は表２参照）およびヒト白血球の溶
液とともに、37℃で４時間インキュベートする。つぎ
に、細胞を800gで10分間遠心分離し、その上清中のPGE2
およびLTC4濃度を、ラジオイムノアッセイによって定量
する〔PGE2についてはビールマン、バッドノーハイム、
ドイツ国（Biermann,Bad Nauheim,Germany）およびLTC4
については、エヌイーエヌ デュポン、ドレイッヒ、ド
イツ国（NEN DuPont,Dreieich,Germany）〕。PGE2およ
びLTC4のそれぞれについて独立した２回の実験結果（ヒ
ト白血球は二人の異なるドナーに由来する）を次の表２
に示す（いずれの場合も３回の定量の平均値である）。
ポジティブ対照混合物（Ｉ型ホスホリパーゼA2を含む
が、このホスホリパーゼA2に対するモノクローナル抗体
は含まないインキュベーション）において、ヒト末梢リ
ンパ球による炎症伝達物質PGE2およびLTC4の放出をPLA2
が誘発し、刺激することが、明白に示されている。この
ようなPGE2およびLTC4の放出は、in vivoでは炎症反応
を引き起こすが、Ｉ型ホスホリパーゼA2に対するモノク
ローナル抗体の添加により実質的に阻害することができ
る。
Claims (5)
- 【請求項１】100ng/ml未満の濃度でホスホリパーゼA2活
性を少なくとも50％阻害する、Ｉ型ホスホリパーゼA2に
対するモノクローナル抗体、または該抗体のFab、Fab′
もしくはＦ（ab′）２フラグメントの、抗炎症治療薬の
製造への使用法。 - 【請求項２】100ng/ml未満の濃度でホスホリパーゼA2活
性を少なくとも50％阻害する、Ｉ型ホスホリパーゼA2に
対するモノクローナル抗体、または該抗体のFab、Fab′
もしくはＦ（ab′）２フラグメントを、通常の製剤用担
体基剤、賦形剤、助剤および添加剤とともに含んでなる
抗炎症治療薬。 - 【請求項３】細胞系DSM ACC2026またはDSM ACC2025から
得られるＩ型ホスホリパーゼA2に対するモノクローナル
抗体。 - 【請求項４】Ｉ型ホスホリパーゼA2に対するモノクロー
ナル抗体を産生する細胞系DSM ACC2026。 - 【請求項５】Ｉ型ホスホリパーゼA2に対するモノクロー
ナル抗体を産生する細胞系DSM ACC2025。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4142552.9 | 1991-12-21 | ||
| DE4142552A DE4142552A1 (de) | 1991-12-21 | 1991-12-21 | Monoklonale antikoerper gegen die typ i phospholipase a(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts) als entzuendungshemmendes therapeutikum |
| PCT/EP1992/002905 WO1993012816A1 (de) | 1991-12-21 | 1992-12-15 | Monoklonale antikörper gegen die typ i-phospholipase a2 als entzündungshemmendes therapeutikum |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06510912A JPH06510912A (ja) | 1994-12-08 |
| JP2522903B2 true JP2522903B2 (ja) | 1996-08-07 |
Family
ID=6447869
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5511399A Expired - Fee Related JP2522903B2 (ja) | 1991-12-21 | 1992-12-15 | 抗炎症治療薬としてのｉ型ホスホリパ―ゼａ▲下２▼に対するモノクロ―ナル抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0618815B1 (ja) |
| JP (1) | JP2522903B2 (ja) |
| AT (1) | ATE136791T1 (ja) |
| DE (2) | DE4142552A1 (ja) |
| WO (1) | WO1993012816A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT1019068E (pt) | 1996-09-11 | 2009-10-08 | Elizabeth Shanahan-Prendergast | Formulações terapêuticas contendo veneno de serpente e/ou insecto para a profilaxia e terapia de neoplasmas |
| US6213930B1 (en) | 1999-03-15 | 2001-04-10 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of using anti-phospholipase A2 antibodies to enhance growth or improve feed efficiency |
| MXPA05005925A (es) * | 2002-12-02 | 2006-02-08 | Abgenix Inc | Anticuerpos dirigidos a la fosfolipasa a2 y sus usos. |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0717680B2 (ja) * | 1987-04-15 | 1995-03-01 | 塩野義製薬株式会社 | ヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼に対するモノクロ−ナル抗体、その製造法、該モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マおよび該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼の測定方法 |
| JP2984029B2 (ja) * | 1990-05-30 | 1999-11-29 | 塩野義製薬株式会社 | 膜型ホスホリパーゼａ▲下２▼を認識するモノクローナル抗体および膜型ホスホリパーゼａ▲下２▼の免疫測定法 |
-
1991
- 1991-12-21 DE DE4142552A patent/DE4142552A1/de not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-12-15 JP JP5511399A patent/JP2522903B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-12-15 AT AT93900055T patent/ATE136791T1/de active
- 1992-12-15 DE DE59206069T patent/DE59206069D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-15 WO PCT/EP1992/002905 patent/WO1993012816A1/de active IP Right Grant
- 1992-12-15 EP EP93900055A patent/EP0618815B1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59206069D1 (de) | 1996-05-23 |
| EP0618815B1 (de) | 1996-04-17 |
| DE4142552A1 (de) | 1993-06-24 |
| ATE136791T1 (de) | 1996-05-15 |
| EP0618815A1 (de) | 1994-10-12 |
| JPH06510912A (ja) | 1994-12-08 |
| WO1993012816A1 (de) | 1993-07-08 |
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