JP2501569C - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、成人Ｔ細胞白血病ウィルス〔ＡＴＬＶと略称されるが、ヒトＴ細胞
白血病ウィルス（ＨＴＬＶ−１と略称される）とも称されている〕のｇａｇ遺伝 子またはその一部とＡＴＬＶのｅｎｖ遺伝子またはその一部とが結合した融合遺
伝子によってコードされるポリペプチドを抗原物質として用いる免疫学的方法に
より試料中の抗ＡＴＬＶ抗体を検出する方法に関する。従って本発明は臨床診断
の分野において有用である。 従来技術 従来、抗原抗体反応は広い分野で利用されている技術であるが、特に医療分野
では病気の診断、治療および予防に幅広く応用されている。これらは抗原抗体反
応の高い特異性に依存しており、この高い特異性が診断の正確性、治療および予
防の有効性を保証している。 成人Ｔ細胞白血病（以下ＡＴＬという）はＡＴＬＶ（ＨＴＬＶ−１）が原因と
考えられており、ＡＴＬＶ（ＨＴＬＶ−１）感染の血清診断はＡＴＬの診断およ
び感染の予防などにとって重要である。ＡＴＬＶ感染は、血清中のＡＴＬ−関連
抗原（以下ＡＴＬＡという）に対する抗体の有無を抗原抗体反応を利用して検出
することにより行われている。従来知られている抗ＡＴＬＶ抗体検出方法として
は、抗原物質としてＡＴＬＶのｇａｇ遺伝子の産物であるＰ−２４を用いる方法
（以下Ｐ−２４法と称す）、抗原物質として全ＡＴＬＶの遺伝子産物であるポリ
ペプチドを用いる方法および抗原物質としてｅｎｖ遺伝子産物を用いる方法が知
られている。 発明が解決しようとする問題点 抗ＡＴＬＶ抗体の検出における上記従来法において偽陰性および偽陽性の診断
結果が得られることがあり、さらに優れた検出方法の開発が望まれている。 問題点を解決するための手段 本発明者は、抗ＡＴＬＶ抗体の優れた検出方法を見出すべく研究を行った結果
、ＡＴＬＶのｇａｇ遺伝子とｅｎｖ遺伝子とが結合した融合遺伝子によってコー
ドされるポリペプチドを抗原物質として用いた場合に抗ＡＴＬＶ抗体の検出が極
めて精度よく行われることを見出し、本発明を完成した。 以下に本発明を詳細に説明する。 本発明は、ＡＴＬＶのｇａｇ遺伝子またはその一部とＡＴＬＶのｅｎｖ遺伝子
またはその一部とが結合した融合遺伝子によってコードされるポリペプチドを抗 原物質として用いる免疫学的方法により試料中の抗ＡＴＬＶ抗体を検出すること
を特徴とする抗ＡＴＬＶ抗体の検出方法に関する。 本発明に抗原物質として用いるポリペプチドとしては、ｇａｇ遺伝子またはそ
の一部とｅｎｖ遺伝子またはその一部とが結合した融合遺伝子によってコードさ
れるものであればいかなるものも用いることができる。好適には、参考例１に示
した方法で製造される下記アミノ酸配列を有するもの（以下ｇａｇ−ｅｎｖ蛋白
という）が用いられる。ｇａｇ−ｅｎｖ蛋白は、Ｐ−２４のＮ末端側１４番目の
アミノ酸（プロリン）から１３９番目のアミノ酸（グリシン）までのポリペプチ
ドとｅｎｖのＮ末端側１９７番目のアミノ酸（スレオニン）から２９５番目のア
ミノ酸（プロリン）までのポリペプチドとが結合したポリペプチドのＮ末端側に
メチオニン−アスパラギン酸が、Ｃ末端側にリジン（Ｌｙｓ）が付加されたポリ
ペプチドである。 本発明が適用される試料としては、血液などの体液や尿などがあげられる。 本発明で用いる免疫学的方法としては、下記のものがあげられ、各文献記載の
方法を用いて実施できる。 ○エンザイム・イムノアッセイ（以下ＥＩＡという） 酵素免疫測定法，医学書院，石川栄治ら，1978年， ○ラジオ・イムノアッセイ（以下ＲＩＡという）免疫血清学，医歯薬出版，稲井
真彌ら，1981年 ○フルオレッセンス・イムノアッセイ（以下ＦＩＡという） 同 上 ○逆受身凝集反応 同 上 ○フィトヘマトアグリチネーション 同 上 ○レーザーネフロメトリー 同 上 ○免疫溶血反応（赤血球またはリポソームを用いる方法） 同 上 ○パーティクルアグリチネーション 最新検査，医典社，Vol.2 No2，151〜157,1984，Gann 75，845，1984 ＲＩＡ，ＥＩＡ，ＦＩＡにおいては、均一系のみならず、サンドイッチ法など
の不均一系の分析方法も可能である。 具体例としてＥＩＡをサンドイッチ法で行う例を下記に示す。 抗原物質をマイクロタイタープレートのウェルにコーティングし、血清試料を
適当な緩衝液たとえば緩衝液Ａ〔０.１５Ｍ ＮａＣｌ，０.１％ゼラチン，１％
牛血清アルブミンおよび０.１％ＮａＮ3を含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７.２）〕で希釈した液をウエルに入れ、４〜３７℃，１時間〜１週間
静置し、適当な緩衝液、たとえば緩衝液Ｂ〔０.０５％ Tween ２０および０.１
５Ｍ ＮａＣｌを含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.２）〕でウ
エルをよく洗浄する。ウサギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のＦａｂフラグメントと
ホースラ ディッシュパーオキシダーゼとを過沃素酸法により結合させたコンジュゲートを
適当な緩衝液、たとえば緩衝液Ｂで希釈した液をウエルに入れる。４〜４５℃で
１〜２４時間静置後、同じ緩衝液で洗浄する。ついで適当な基質溶液たとえばオ
ルソ・フェニレンジアミン基質溶液〔０.０２％，オルソ・フェニレンジアミン
および３５ｍＭ過酸化水素を含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.
２）〕をウエルに入れ、１５〜３７℃で５〜６０分間静置する。２Ｎ Ｈ2ＳＯ4
で反応を停止させ、室温で１〜１０分間放置後、マイクロタイタープレート用フ
ォトメーターで４１０ｎｍおよび６００ｎｍにおける吸光度（Ｏ.Ｄ.）を測定し
、前者の値から後者の値を差し引いた値を抗体値とする。 ここに示した方法は一例示であり、抗体や基質液、発色剤などの変更は、適宜
行うことができる。 ｇａｇ−ｅｎv蛋白を用いる本発明方法は優れた抗ＡＴＬＡ抗体の検出方法で
あるが、ｇａｇ遺伝子産物とｅｎｖ遺伝子産物とを同一担体上に結合させたもの
（以下カクテル抗原ポリペプチドという）を用いても本発明方法と同様に優れた
効果が期待できる。カクテル抗原ポリペプチドは、ｇａｇ遺伝子産物とｅｎｖ遺
伝子産物とを適当な担体たとえばリポソーム，合成樹脂またはガラス製の固相担
体に物理的または化学的に吸着させることにより製造することができる。 本発明方法は、抗ＡＴＬＶ抗体の検出に優れた効果を示すが、Ｐ−２４と交差
反応を示す疾患として知られているＴＳＰ（Tropical Spastic Paraplesia，熱
帯性痙攣性対麻痺症），ＨＡＭ（ＨＴＬＶ−１関連脊髄病），ＭＳ（Multiple
Sclerosis,多発性硬化症）およびＡＴＬ以外の各種の癌（たとえば肝癌，子宮癌
）に適用できる。 実施例1． 抗原物質としてｇａｇ−ｅｎｖ蛋白（ｇａｇ−ｅｎｖ法）またはｇａｇ遺伝子
産物の断片であるＰ−２４を用いるＥＩＡ（Ｐ−２４法）ならびに天然のＡＴＬ ＨＴＬＶ−１保菌者および正常人血清における抗ＡＴＬＶ抗体の検出を行った。 （１）ｇａｇ−ｅｎｖ蛋白およびＰ−２４を用いるＥＩＡ（サンドイッチ法） 血清試料としてＡＴＬ患者またはＨＴＬＶ−１保菌者５７名および正常人３０ 名の血清を用いた。ｇａｇ−ｅｎｖ蛋白としては参考例１の方法で得られるポリ
ペプチドを用い、Ｐ−２４は特開昭６０−６１５３４号に記載の方法に従って得
られるｇａｇポリペプチドを用いた。 １μｇのｇａｇ−ｅｎｖ蛋白および３μｇのＰ−２４をそれぞれマイクロタイ
タープレート（Nunc社）のウェルにコーティングした。 各血清を緩衝液Ａ（０.１５Ｍ ＮａＣｌ，０.１％ゼラチン，１％牛血清アル
ブミンおよび０.１％ＮａＮ3を含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７
.２）で２０倍に希釈した。この希釈液１００μｌを上記ウエルに入れ、室温で
２時間静置後、緩衝液Ｂ〔０.０５％ Tween２０（和光純薬工業社製）および０.
１５Ｍ ＮａＣｌを含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７.２〕１５
０μｌで３回洗浄した。 ウサギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のＦａｂフラグメント（酵素免疫測定法，医
学書院，石川栄治ら，1978）とホースラディシュパーオキシダーゼ（Sigma 社製
）とを過沃素酸法（同上文献）により結合させたコンジュゲート（８０／ml）を
緩衝液Ｂで２０倍に希釈した溶液１００μｌを各ウエルに入れた。室温で２時間
静置後、緩衝液Ｂ１５０μｌで３回洗浄した。ついで、オルソ・フェニレンジア
ミン基質溶液（０.０２％オルソ・フェニレンジアミンおよび３５ｍＭ過酸化水
素を含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７.２）１００μｌを各ウエ
ルに入れ、室温で１５分間静置した。２Ｎ Ｈ2ＳＯ4 ５０μｌを各ウエルに入
れて反応を停止させ、１０分間室温で放置後、マイクロタイタープレート用フォ
トメーターＭＴＰ−２２型（コロナ社製）で４１０ｎｍおよび６００ｎｍにおけ
る吸光度（Ｏ.Ｄ.）を測定し、その差で抗体値を得た。試験はすべて二系列で行
い平均値を測定値とした。 検査29(1)：91−94（1985）に記載の方法（エーザイ法）にて１項と同じ試料に
ついて抗ＡＴＬＶ抗体検出を行った。 （３）正常人３０名の血清について１および２項で測定した測定値（Ｏ.Ｄ.）の
平均値および標準偏差値は次のとおりであった。 ｇａｇ−ｅｎｖ ０.０５５±０.０１３ Ｐ−２４ ０.０１０±０.００４ エーザイ ０.０４０±０.００９ 平均値と標準偏差値の２倍との和をカットオフ値とすると、Ｐ−２４の場合０
.０１８，ｇａｇ−ｅｎv蛋白の場合０.０８１，エーザイの場合０.０５９がカッ
トオフ値となる。 ＡＴＬ患者またはＨＴＬＶ−１保菌者５７名についての測定結果を第１表に示
す。 【第１表】 第１の測定値と、上記のカットオフ値で陽性率を算出した結果を第２表に示す
。 【第２表】 第２表により、正常人についてはどの方法でも偽陽性は０％であり、ＡＴＬ患
者またはＨＴＬＶ−１保菌者ではＰ−２４の場合１０名が偽陰性（カットオフ値
０.０１８以下），エーザイ法の場合１名が偽陰性（カットオフ値０.０５９以下
）を示すのに対しｇａｇ−ｅｎｖ蛋白の場合偽陰性（カットオフ値０.０８１以
下）は１名もなく、１００％の陽性率を示すことがわかる。 エーザイ法とＰ−２４法またはｇａｇ−ｅｎｖ法との相関性について計算した
結果を第５図および第６図に示す。エーザイ法とＰ−２４法との相関係数は０.
８２９４，エーザイ法とｇａｇ−ｅｎｖ法の相関係数は０.７４７９であった。
この相関計数の値は、エーザイ法，Ｐ−２４法，ｇａｇ−ｅｎｖ法が互に相関関
係を有していることを示している。 参考例1． （１）プラスミドｐＫＹＰ２６およびｐＥＦＭ２の分離精製 ｐＫＹＰ２６の含む大腸菌〔Escherichia coli ＩＫＹＰ２６(ＦＥＲＭ ＢＰ
−８６３)〕およびｐＥＦＭ２を含む大腸菌（Escherichia coli ＥＥＦＭ２（
ＡＴＣＣ５３２２８）〕をそれぞれ５０／mlのアンピシリンを含むＬ培地（１％
バクトトリプトン、０.５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ，ｐＨ７.５）１０ml、で
３７℃、１８時間培養した。この培養液全量を５０μｇ／mlのアンピシリンを含
むＬ培地１ｌに植菌し、３７℃で培養した。４時間後に、クロラムフェニコール
を１７０μｇ／mlとなるように加え、さらに３７℃、１６時間培養した。遠心分
離法（５，０００rpm １０分間）により集菌を行い、０.８％ＮａＣｌで菌体を
洗浄した後、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８.０）２０mlに懸濁し、氷冷した。１
０mg／mlのリゾチームを８ml加え氷中に１０分間静置した後、０.５Ｍ ＥＤＴ
Ａを９.６ml加え、氷中に１０分間静置し、２％トリトンＸ−１００（和光純薬
工業社製）を２.３ml加え氷中にさらに１時間静置した。50,000×ｇで４℃、１
時間超遠心分離を行い、上清約４０mlを得た。次にこの上清に３Ｍ ＮａＯＨを
加えｐＨを１２.５として、室温で１０分間静かに撹拌した。２Ｍトリス塩酸（
ｐＨ７.５）を加え、ｐＨを８.５にもどし、さらに３分間撹拌した。この時点で
液の容量は約５５mlであった。１／９容の５Ｍ ＮａＣｌを加えた後、１０ｍＭ
トリス塩酸(ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡで飽和したフェノールを等量加え、激
しく撹 拌した後、低速遠心分離法（３，３００rpm，１０分間、以下同条件）により水
層を集めた（以下、この処理をフェノール抽出と略記する）。１／２５０容の５
mg／ml RNase A（シグマ社製）を加え、３７℃、１時間ＲＮＡ分解反応を行った
後、１／５容の５Ｍ ＮａＣｌを加え、１／３容の３０％ＰＥＧ６０００（半井
化学薬品社製）を加え−２０℃に２時間静置した。遠心分離法で沈殿を集め、１
０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７.５）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる液２mlに溶か
し、ソジウム・ドデシル・サルフェイト（ＳＤＳ）を０.５％となるように加え
、Proteinase Ｋ（シグマ社製）を５０μｇ／mlとなるように加えて、３７℃１
時間蛋白質分解反応を行った。フェノール抽出を３回繰り返し行った後、等量の
クロロホルムを加え、激しく撹拌した後低速遠心分離法により水層を集めた。１
／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、２.５倍容のエタノールを加え、−２０
℃，１時間静置した。冷却遠心分離法（４℃，11,000 rpm，１０分間）で沈殿を
集め、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７.５）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる液１m
lに溶かした。このようにしてｐＫＹＰ２６およびｐＥＦＭ２を各々８００μｇ
を得ることができた。ｐＫＹＰ２６の構造は、ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩ，ＢａｍＨ
Ｉ，ＢｇｌII，ｐｓｔＩで切断してアガロースゲル電気泳動で確認した。またｐ
ＥＦＭ２の構造は、ＸｈｏＩ，ＫｐｎＩ，ＢｇｌII，ＨｐａＩ，ＰｓｔＩで切断
してアガロースゲル電気泳動で確認した。 （２）ＡＴＬＶのＰ２４遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの造成 (２)−１ ｐＡＦＢ７の造成： ｐＧＥＬ１〔Escherichia coli IGEL1（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９）から常法に
より採取〕の５μｇを１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７.５），７ｍＭ ＭｇＣｌ2，
６ｍＭメルカプトエタノールおよび１００ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液（以下、Ｙ
−１００緩衝液と略記する）４０μｌに溶かし、制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製
、以下特記しない限り制限酵素は宝酒造社製を用いた）１０単位、ＢａｍＨＩ８
単位を加え、３７℃，２時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により
ｌｐｐターミネーターを含む約１，７００ｂｐのＤＮＡ断片を約０.２μｇ得た
。 これとは別に、ｐＧＥＬ１の１０μｇを１００μｌのＹ−１００緩衝液に溶か
し、制限酵素ＰｓｔＩを１６単位加え、３７℃，１時間消化反応を行った。アガ ロースゲル電気泳動法によりｐｓｔＩ消化が完全に行われたのを確認した後、制
限酵素ＨｐａＩを３単位加え、３７℃，３０分間消化反応を行いＨｐａＩ部分分
解を行った。この反応液からＬＧＴ法によりｔｒｐ系のプロモーターを含む約９
４０ｂｐの部分分解ＤＮＡ断片約０.２μｇを得た。 次に、ｐＡＦＡ１０（ＡＴＣＣ３９５８２に担持された第１図に示すプラスミ
ド）の３０μｇを２５０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＨｐａＩ
１４０単位、ＢａｍＨＩ３０単位を加え、３７℃，３時間消化反応を行い、この
反応液からＬＧＴ法でＰ２４遺伝子を含む、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を約０.
５μｇ得た。 上記で得たｐＧＥＬ１由来のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片（約１，７００ｂｐ）
約０.１μｇ，ＰｓｔＩ−ＨｐａＩ断片（約９４０ｂｐ）約０.１５μｇおよびｐ
ＡＦＡ１０由来のＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片（約７００ｂｐ）約０.２μｇを２
０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７.５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０ｍＭジチオスレイ
トールおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む溶液（以下、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液と略
記する）２０μｌに溶かし、３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加え
、４℃，１６時間結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株〔ボリバーら，ジーン２，75（1977）〕
を形質転換し、ＡｐRのコロニーを得、このコロニーよりバーンボイムらの方法
〔ヌクレイック・アシド・リサーチ７，1513（1979）〕によりプラスミドＤＮＡ
を回収し、第１図に示したｐＡＦＢ７を得た。 (２)−２ ｐＡＡＢ６の造成： ｐＴＡＧ４２４Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−３４１に担持された第２図に示すプラス
ミド，特開昭６０−６１５３４）２μｇを２０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし
、制限酵素ＢａｍＨＩを４単位加え、３７℃，２時間消化反応を行った。 つづいて該溶液のＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭになるように調整し、制限酵素Ｎ
ｃｏＩ（ニッポンジーン社製）を４単位加え、３７℃，２時間消化反応を行った
。つづいて、ＢａｍＨＩ，ＮｃｏＩで切断したＤＮＡを３３ｍＭトリス−酢酸（
ｐＨ７.９），６６ｍＭ酢酸カリウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，５ｍＭジチ
オスレイトール，および０.４ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
を 含む溶液（以下、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液と略記する）２０μｌに溶かし
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）１単位を加え、３７℃，３０分反応を
行った。 上記の酵素処理液を２０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶かし、３単位の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃，１８時間結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、ＡｐRのコロニーを得、
このコロニーより前記バーンボイムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、
第２図に示したｐＡＡＢ６を得た。 (２)−３ ｐＡＨＡ１の造成： 前項で得たｐＡＡＢ６の１５μｇを１００μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、
制限酵素ＳｔｕＩ１５単位とＣｌａＩ〔ニュー・イングランド・バイオ・ラブス
（New England Bio Labs）社製〕２０単位を加え、３７℃，３時間消化反応を行
い、この反応液からＬＧＴ法でｐ２４遺伝子の前半部分を含む約４００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を約０.３μｇ得た。 次にｐＧＥＬ１の５μｇを４０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ｃ
ｌａＩ〔ニュー・イングランド・バイオ・ラブス（New England Bio Labs）社製
〕５単位，ｐｓｔ１８単位を加え、３７℃，２時間消化反応を行った。この反応
液からＬＧＴ法でｔｒｐ系のプロモーター部分を含む約１，０００ｂｐのＤＮＡ
断片を約０.２μｇ得た。 これとは別に、第１項で得たｐＫＹＰ２６の２μｇを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７.５），７ｍＭ ＭｇＣｌ2，６ｍＭメルカプトエタノールおよび１０ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含む溶液（以下、Ｙ−１０緩衝液と略記する）３０μｌに溶かし
、制限酵素ＫｐｎＩ５単位を加え、３７℃，２時間消化反応を行った。このＫｐ
ｎＩで切断したＤＮＡを２０μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液に溶かしＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ１単位を加え、３７℃，３０分間反応をおこなった。このＤ
ＮＡ反応液を３０μｌの−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ｐｓｔＩ４単位を加
え、３７℃，２時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法でｌｐｐ系のタ
ーミネーター部分を含む約１，７００ｂｐのＤＮＡ断片を約０.２μｇ得た。 上記で得たｐＡＡＢ６由来のＳｔｕＩ−ＣｌａＩ断片（約４００ｂｐ）約０.
１ μｇ，ｐＧＥＬ１由来のＣｌａＩ−ＰｓｔＩ断片（約１，０００ｂｐ）約０.２
μｇ，ｐＫＹＰ２６由来のＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片（約７００ｂｐ）約０.１μ
ｇを３０のＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶かし、４単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを
加え、４℃，１８時間結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、ＡｐRのコロニーを得、
このコロニーより前記バーンボイムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、
第２図に示したｐＡＨＡ１を得た。 (２)−４ ｐＡＦＧ１０の造成： 前項で得たｐＡＨＡ１の５μｇを５０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限
酵素ＰｓｔＩを８単位加え、３７℃，２時間消化反応を行った。この反応液から
ＬＧＴ法でｔｒｐ系のプロモーター部分およびＰ２４遺伝子のＮ末端部分を含む
約１，１００ｂｐのＤＮＡ断片を約０.５μｇ得た。 次に、第１項で造成したｐＡＦＢ７の６μｇを、３０μｌのＹ−１００緩衝液
に溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩを８単位加え、３７℃，２時間消化反応を行った
。この反応液に０.２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０），１２０ｍＭ ＣａＣｌ2
，１２０ｍＭ ＭｇＣｌ2，２Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡからなる
液５μｌを加え、滅菌水を１５μｌ加え、３０℃に３分間保温した。ＢＡＬ３１
ヌクレアーゼ〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリース（Bethesda Research Labo
ratories）社製〕を１０単位加え３０℃で８０秒間分解反応を行った。反応後フ
ェノール抽出を行い、エタノール沈殿法でＤＮＡを回収した。このＤＮＡを３０
μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ｐｓｔＩを８単位加え、３７℃，２
時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法で、Ｐ２４遺伝子部分を含む約
４５０ｂｐのＤＮＡ断片を約０.１μｇ得た。 上記で得たｐＡＨＡ１由来のｐｓｔＩ断片（約１，１００ｂｐ）約０.２μｇ
，ｐＡＦＢ７由来のＰｓｔＩ−ＢＡＬ３１ヌクレアーゼ分解断片（約４５０ｂｐ
）０.１μｇ、および前項で得たｐＫＹＰ２６由来のＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片（
約１，７００ｂｐ）０.１μｇを３０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶かし
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃，１８時間結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、ＡｐRのコロニーを得、 このコロニーより前記バーンボイムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、
第３図に示したｐＡＦＧ１０を得た。Ｐ２４をコードする領域のＣ末端の塩基配
列を決定したところ、第３図に示した様にＰ２４のＣ末端までを含み、さらにＶ
ａｌ・Ｖａｌ・Ｌｅｕ・Ｓｅｒ・Ａｓｎが付いた構造になっていることが確認さ
れた。 （３）ＡＴＬＶのｇａｇ遺伝子によりコードされる抗原ポリペプチドとｅｎｖ遺
伝子によりコードされる抗原ポリペプチドとが融合したハイブリッド抗原ポリペ
プチドをコードする組換え対プラスミドｐＥＴＩ７の造成： 第２項で得た組換え体プラスミドｐＡＦＧ１０の１０μｇを１００μｌのＹ−
１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＸｈｏＩを１０単位，ＳｔｕＩを１２単位加え
、３７℃，３時間消化反応を行った。 この反応液からＬＧＴ法によりトリプトプァン系のプロモーターとＰ２４遺伝
子の前半を含む約６３０ｂｐのＤＮＡ断片約０.５μｇを得た。 次に第１項で得たｐＥＦＭ２の５μｇを５０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし
、制限酵素ＸｈｏＩを１０単位，ＨｐａＩを８単位加え、３７℃，３時間消化反
応を行った。この反応液からＬＧＴ法により、ｅｎｖ遺伝子の後半を含む約２，
７００ｂｐのＤＮＡ断片を約１μｇ得た。 上記で得たｐＡＦＧ１０由来のＸｈｏＩ−ＳｔｕＩ断片（約６３０ｂｐ）０.
０５ｐmoleとｐＥＦＭ２由来のＸｈｏＩ−ＨｐａＩ断片（約２，７００ｂｐ）０
.０１ｐmoleを４０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ５単位を加え、４℃，１８時間結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、ＡｐRのコロニーを得、
このコロニーより前記バーンボイムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、
第４図に示したｐＥＴＩ７を得た。 （４）ｐＥＴＩ７を保有する大腸菌によるｇａｇ遺伝子によりコードされる抗原
ポリペプチドとｅｎｖ遺伝子によりコードされる抗原ポリペプチドとの融合ポリ
ペプチドの生産： 第３項３で得られた組換え体プラスミドｐＥＴＩ７を用い常法により大腸菌Ｗ
３１１０ＳｔｒＡ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２）を形質転換した。得られた ＡｐRのコロニーを８mlのＭＣＧ培地〔０.６％ Ｎａ2ＨＰＯ4，０.３％ＫＨ2Ｐ
Ｏ4，０.５％ ＮａＣｌ，０.１％ ＮＨ4Ｃｌ，０.５％グルコース，０.５％カ
ザミノ酸，１ｍＭ ＭｇＳＯ4，４μｇ／mlビタミンＢ1，ｐＨ７.２〕に接種し、
３０℃で１８時間培養した。得られた培養液を８，０００rpm，１０分間遠心し
て菌体を回収した。この菌体をレムリのサンプルバッファーに懸濁後、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーにて染色
して、分子量約２５，０００の部位にポリペプチドバンドを検出した。このバン
ドは該プラスミドを含まない大腸菌を用いた場合には存在しなかった。 このポリペプチドの分子量は、プラスミドｐＥＴＩ７の構造から予想されるハ
イブリッド抗原ポリペプチドの分子量（２５，０５１.０２）と一致した。 （５）第４項で述べた培養液１ｌより遠心分離（８，０００ rpm，３０分間）し
て得られた菌体を２００mlの脱イオン水に懸濁し、マントンガウリンホモゲナイ
ザー（製造元；MANTON-GAULIN MANUFACTURING Co.，INC．USA）により４００kg
／cm2の圧力で菌体破砕を行い、沈殿画分を遠心分離により得た。本沈殿画分は
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分析するとｇａｇ−ｅｎｖ蛋白８４
５mgを含有していた。 本沈殿画分を４％（W／V）トリトンＸ−１００，１０ｍＭエチレンジアミン四
酢酸ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）に分散し遠心分離に
より再び沈殿画分を得、この沈殿を２ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム，
０.３％（V／V）２−メルカプトエタノール，７Ｍ尿素を含むリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７.４）で溶解し、あらかじめ７Ｍ尿素を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（以下、
平衡化緩衝液とよぶ，ｐＨ７.０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌＣＭトヨパール６
５０（東洋曹達工業社製）１００mlに通塔、吸着させた。 平衡化緩衝液でカラムを洗浄後、０.１Ｍ ＮａＣｌを加えた平衡化緩衝液で
溶出し、高純度画分２５０mlを得た。本画分は４３０mgのｇａｇ−ｅｎｖ蛋白を
含有していた。この高純度画分を、１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９.４）３ｌを外
液として透析し、生じた沈殿を遠心分離により除去後、遠心分離上清として目的
ｇａｇ−ｅｎｖ蛋白溶液４００mlを得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析すると、 蛋白純度は９０％以上であり、収量は１６０mgであった。 発明の効果 本発明によれば、抗ＡＴＬＶ抗体の検出を精度高く行うことができ、ＡＴＬの
血清診断を効果的に行うことができる。さらに本発明方法はＰ−２４と交差反応
を示す疾患に応用できる。
白血病ウィルス（ＨＴＬＶ−１と略称される）とも称されている〕のｇａｇ遺伝 子またはその一部とＡＴＬＶのｅｎｖ遺伝子またはその一部とが結合した融合遺
伝子によってコードされるポリペプチドを抗原物質として用いる免疫学的方法に
より試料中の抗ＡＴＬＶ抗体を検出する方法に関する。従って本発明は臨床診断
の分野において有用である。 従来技術 従来、抗原抗体反応は広い分野で利用されている技術であるが、特に医療分野
では病気の診断、治療および予防に幅広く応用されている。これらは抗原抗体反
応の高い特異性に依存しており、この高い特異性が診断の正確性、治療および予
防の有効性を保証している。 成人Ｔ細胞白血病（以下ＡＴＬという）はＡＴＬＶ（ＨＴＬＶ−１）が原因と
考えられており、ＡＴＬＶ（ＨＴＬＶ−１）感染の血清診断はＡＴＬの診断およ
び感染の予防などにとって重要である。ＡＴＬＶ感染は、血清中のＡＴＬ−関連
抗原（以下ＡＴＬＡという）に対する抗体の有無を抗原抗体反応を利用して検出
することにより行われている。従来知られている抗ＡＴＬＶ抗体検出方法として
は、抗原物質としてＡＴＬＶのｇａｇ遺伝子の産物であるＰ−２４を用いる方法
（以下Ｐ−２４法と称す）、抗原物質として全ＡＴＬＶの遺伝子産物であるポリ
ペプチドを用いる方法および抗原物質としてｅｎｖ遺伝子産物を用いる方法が知
られている。 発明が解決しようとする問題点 抗ＡＴＬＶ抗体の検出における上記従来法において偽陰性および偽陽性の診断
結果が得られることがあり、さらに優れた検出方法の開発が望まれている。 問題点を解決するための手段 本発明者は、抗ＡＴＬＶ抗体の優れた検出方法を見出すべく研究を行った結果
、ＡＴＬＶのｇａｇ遺伝子とｅｎｖ遺伝子とが結合した融合遺伝子によってコー
ドされるポリペプチドを抗原物質として用いた場合に抗ＡＴＬＶ抗体の検出が極
めて精度よく行われることを見出し、本発明を完成した。 以下に本発明を詳細に説明する。 本発明は、ＡＴＬＶのｇａｇ遺伝子またはその一部とＡＴＬＶのｅｎｖ遺伝子
またはその一部とが結合した融合遺伝子によってコードされるポリペプチドを抗 原物質として用いる免疫学的方法により試料中の抗ＡＴＬＶ抗体を検出すること
を特徴とする抗ＡＴＬＶ抗体の検出方法に関する。 本発明に抗原物質として用いるポリペプチドとしては、ｇａｇ遺伝子またはそ
の一部とｅｎｖ遺伝子またはその一部とが結合した融合遺伝子によってコードさ
れるものであればいかなるものも用いることができる。好適には、参考例１に示
した方法で製造される下記アミノ酸配列を有するもの（以下ｇａｇ−ｅｎｖ蛋白
という）が用いられる。ｇａｇ−ｅｎｖ蛋白は、Ｐ−２４のＮ末端側１４番目の
アミノ酸（プロリン）から１３９番目のアミノ酸（グリシン）までのポリペプチ
ドとｅｎｖのＮ末端側１９７番目のアミノ酸（スレオニン）から２９５番目のア
ミノ酸（プロリン）までのポリペプチドとが結合したポリペプチドのＮ末端側に
メチオニン−アスパラギン酸が、Ｃ末端側にリジン（Ｌｙｓ）が付加されたポリ
ペプチドである。 本発明が適用される試料としては、血液などの体液や尿などがあげられる。 本発明で用いる免疫学的方法としては、下記のものがあげられ、各文献記載の
方法を用いて実施できる。 ○エンザイム・イムノアッセイ（以下ＥＩＡという） 酵素免疫測定法，医学書院，石川栄治ら，1978年， ○ラジオ・イムノアッセイ（以下ＲＩＡという）免疫血清学，医歯薬出版，稲井
真彌ら，1981年 ○フルオレッセンス・イムノアッセイ（以下ＦＩＡという） 同 上 ○逆受身凝集反応 同 上 ○フィトヘマトアグリチネーション 同 上 ○レーザーネフロメトリー 同 上 ○免疫溶血反応（赤血球またはリポソームを用いる方法） 同 上 ○パーティクルアグリチネーション 最新検査，医典社，Vol.2 No2，151〜157,1984，Gann 75，845，1984 ＲＩＡ，ＥＩＡ，ＦＩＡにおいては、均一系のみならず、サンドイッチ法など
の不均一系の分析方法も可能である。 具体例としてＥＩＡをサンドイッチ法で行う例を下記に示す。 抗原物質をマイクロタイタープレートのウェルにコーティングし、血清試料を
適当な緩衝液たとえば緩衝液Ａ〔０.１５Ｍ ＮａＣｌ，０.１％ゼラチン，１％
牛血清アルブミンおよび０.１％ＮａＮ3を含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７.２）〕で希釈した液をウエルに入れ、４〜３７℃，１時間〜１週間
静置し、適当な緩衝液、たとえば緩衝液Ｂ〔０.０５％ Tween ２０および０.１
５Ｍ ＮａＣｌを含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.２）〕でウ
エルをよく洗浄する。ウサギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のＦａｂフラグメントと
ホースラ ディッシュパーオキシダーゼとを過沃素酸法により結合させたコンジュゲートを
適当な緩衝液、たとえば緩衝液Ｂで希釈した液をウエルに入れる。４〜４５℃で
１〜２４時間静置後、同じ緩衝液で洗浄する。ついで適当な基質溶液たとえばオ
ルソ・フェニレンジアミン基質溶液〔０.０２％，オルソ・フェニレンジアミン
および３５ｍＭ過酸化水素を含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.
２）〕をウエルに入れ、１５〜３７℃で５〜６０分間静置する。２Ｎ Ｈ2ＳＯ4
で反応を停止させ、室温で１〜１０分間放置後、マイクロタイタープレート用フ
ォトメーターで４１０ｎｍおよび６００ｎｍにおける吸光度（Ｏ.Ｄ.）を測定し
、前者の値から後者の値を差し引いた値を抗体値とする。 ここに示した方法は一例示であり、抗体や基質液、発色剤などの変更は、適宜
行うことができる。 ｇａｇ−ｅｎv蛋白を用いる本発明方法は優れた抗ＡＴＬＡ抗体の検出方法で
あるが、ｇａｇ遺伝子産物とｅｎｖ遺伝子産物とを同一担体上に結合させたもの
（以下カクテル抗原ポリペプチドという）を用いても本発明方法と同様に優れた
効果が期待できる。カクテル抗原ポリペプチドは、ｇａｇ遺伝子産物とｅｎｖ遺
伝子産物とを適当な担体たとえばリポソーム，合成樹脂またはガラス製の固相担
体に物理的または化学的に吸着させることにより製造することができる。 本発明方法は、抗ＡＴＬＶ抗体の検出に優れた効果を示すが、Ｐ−２４と交差
反応を示す疾患として知られているＴＳＰ（Tropical Spastic Paraplesia，熱
帯性痙攣性対麻痺症），ＨＡＭ（ＨＴＬＶ−１関連脊髄病），ＭＳ（Multiple
Sclerosis,多発性硬化症）およびＡＴＬ以外の各種の癌（たとえば肝癌，子宮癌
）に適用できる。 実施例1． 抗原物質としてｇａｇ−ｅｎｖ蛋白（ｇａｇ−ｅｎｖ法）またはｇａｇ遺伝子
産物の断片であるＰ−２４を用いるＥＩＡ（Ｐ−２４法）ならびに天然のＡＴＬ ＨＴＬＶ−１保菌者および正常人血清における抗ＡＴＬＶ抗体の検出を行った。 （１）ｇａｇ−ｅｎｖ蛋白およびＰ−２４を用いるＥＩＡ（サンドイッチ法） 血清試料としてＡＴＬ患者またはＨＴＬＶ−１保菌者５７名および正常人３０ 名の血清を用いた。ｇａｇ−ｅｎｖ蛋白としては参考例１の方法で得られるポリ
ペプチドを用い、Ｐ−２４は特開昭６０−６１５３４号に記載の方法に従って得
られるｇａｇポリペプチドを用いた。 １μｇのｇａｇ−ｅｎｖ蛋白および３μｇのＰ−２４をそれぞれマイクロタイ
タープレート（Nunc社）のウェルにコーティングした。 各血清を緩衝液Ａ（０.１５Ｍ ＮａＣｌ，０.１％ゼラチン，１％牛血清アル
ブミンおよび０.１％ＮａＮ3を含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７
.２）で２０倍に希釈した。この希釈液１００μｌを上記ウエルに入れ、室温で
２時間静置後、緩衝液Ｂ〔０.０５％ Tween２０（和光純薬工業社製）および０.
１５Ｍ ＮａＣｌを含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７.２〕１５
０μｌで３回洗浄した。 ウサギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のＦａｂフラグメント（酵素免疫測定法，医
学書院，石川栄治ら，1978）とホースラディシュパーオキシダーゼ（Sigma 社製
）とを過沃素酸法（同上文献）により結合させたコンジュゲート（８０／ml）を
緩衝液Ｂで２０倍に希釈した溶液１００μｌを各ウエルに入れた。室温で２時間
静置後、緩衝液Ｂ１５０μｌで３回洗浄した。ついで、オルソ・フェニレンジア
ミン基質溶液（０.０２％オルソ・フェニレンジアミンおよび３５ｍＭ過酸化水
素を含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７.２）１００μｌを各ウエ
ルに入れ、室温で１５分間静置した。２Ｎ Ｈ2ＳＯ4 ５０μｌを各ウエルに入
れて反応を停止させ、１０分間室温で放置後、マイクロタイタープレート用フォ
トメーターＭＴＰ−２２型（コロナ社製）で４１０ｎｍおよび６００ｎｍにおけ
る吸光度（Ｏ.Ｄ.）を測定し、その差で抗体値を得た。試験はすべて二系列で行
い平均値を測定値とした。 検査29(1)：91−94（1985）に記載の方法（エーザイ法）にて１項と同じ試料に
ついて抗ＡＴＬＶ抗体検出を行った。 （３）正常人３０名の血清について１および２項で測定した測定値（Ｏ.Ｄ.）の
平均値および標準偏差値は次のとおりであった。 ｇａｇ−ｅｎｖ ０.０５５±０.０１３ Ｐ−２４ ０.０１０±０.００４ エーザイ ０.０４０±０.００９ 平均値と標準偏差値の２倍との和をカットオフ値とすると、Ｐ−２４の場合０
.０１８，ｇａｇ−ｅｎv蛋白の場合０.０８１，エーザイの場合０.０５９がカッ
トオフ値となる。 ＡＴＬ患者またはＨＴＬＶ−１保菌者５７名についての測定結果を第１表に示
す。 【第１表】 第１の測定値と、上記のカットオフ値で陽性率を算出した結果を第２表に示す
。 【第２表】 第２表により、正常人についてはどの方法でも偽陽性は０％であり、ＡＴＬ患
者またはＨＴＬＶ−１保菌者ではＰ−２４の場合１０名が偽陰性（カットオフ値
０.０１８以下），エーザイ法の場合１名が偽陰性（カットオフ値０.０５９以下
）を示すのに対しｇａｇ−ｅｎｖ蛋白の場合偽陰性（カットオフ値０.０８１以
下）は１名もなく、１００％の陽性率を示すことがわかる。 エーザイ法とＰ−２４法またはｇａｇ−ｅｎｖ法との相関性について計算した
結果を第５図および第６図に示す。エーザイ法とＰ−２４法との相関係数は０.
８２９４，エーザイ法とｇａｇ−ｅｎｖ法の相関係数は０.７４７９であった。
この相関計数の値は、エーザイ法，Ｐ−２４法，ｇａｇ−ｅｎｖ法が互に相関関
係を有していることを示している。 参考例1． （１）プラスミドｐＫＹＰ２６およびｐＥＦＭ２の分離精製 ｐＫＹＰ２６の含む大腸菌〔Escherichia coli ＩＫＹＰ２６(ＦＥＲＭ ＢＰ
−８６３)〕およびｐＥＦＭ２を含む大腸菌（Escherichia coli ＥＥＦＭ２（
ＡＴＣＣ５３２２８）〕をそれぞれ５０／mlのアンピシリンを含むＬ培地（１％
バクトトリプトン、０.５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ，ｐＨ７.５）１０ml、で
３７℃、１８時間培養した。この培養液全量を５０μｇ／mlのアンピシリンを含
むＬ培地１ｌに植菌し、３７℃で培養した。４時間後に、クロラムフェニコール
を１７０μｇ／mlとなるように加え、さらに３７℃、１６時間培養した。遠心分
離法（５，０００rpm １０分間）により集菌を行い、０.８％ＮａＣｌで菌体を
洗浄した後、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８.０）２０mlに懸濁し、氷冷した。１
０mg／mlのリゾチームを８ml加え氷中に１０分間静置した後、０.５Ｍ ＥＤＴ
Ａを９.６ml加え、氷中に１０分間静置し、２％トリトンＸ−１００（和光純薬
工業社製）を２.３ml加え氷中にさらに１時間静置した。50,000×ｇで４℃、１
時間超遠心分離を行い、上清約４０mlを得た。次にこの上清に３Ｍ ＮａＯＨを
加えｐＨを１２.５として、室温で１０分間静かに撹拌した。２Ｍトリス塩酸（
ｐＨ７.５）を加え、ｐＨを８.５にもどし、さらに３分間撹拌した。この時点で
液の容量は約５５mlであった。１／９容の５Ｍ ＮａＣｌを加えた後、１０ｍＭ
トリス塩酸(ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡで飽和したフェノールを等量加え、激
しく撹 拌した後、低速遠心分離法（３，３００rpm，１０分間、以下同条件）により水
層を集めた（以下、この処理をフェノール抽出と略記する）。１／２５０容の５
mg／ml RNase A（シグマ社製）を加え、３７℃、１時間ＲＮＡ分解反応を行った
後、１／５容の５Ｍ ＮａＣｌを加え、１／３容の３０％ＰＥＧ６０００（半井
化学薬品社製）を加え−２０℃に２時間静置した。遠心分離法で沈殿を集め、１
０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７.５）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる液２mlに溶か
し、ソジウム・ドデシル・サルフェイト（ＳＤＳ）を０.５％となるように加え
、Proteinase Ｋ（シグマ社製）を５０μｇ／mlとなるように加えて、３７℃１
時間蛋白質分解反応を行った。フェノール抽出を３回繰り返し行った後、等量の
クロロホルムを加え、激しく撹拌した後低速遠心分離法により水層を集めた。１
／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、２.５倍容のエタノールを加え、−２０
℃，１時間静置した。冷却遠心分離法（４℃，11,000 rpm，１０分間）で沈殿を
集め、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７.５）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる液１m
lに溶かした。このようにしてｐＫＹＰ２６およびｐＥＦＭ２を各々８００μｇ
を得ることができた。ｐＫＹＰ２６の構造は、ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩ，ＢａｍＨ
Ｉ，ＢｇｌII，ｐｓｔＩで切断してアガロースゲル電気泳動で確認した。またｐ
ＥＦＭ２の構造は、ＸｈｏＩ，ＫｐｎＩ，ＢｇｌII，ＨｐａＩ，ＰｓｔＩで切断
してアガロースゲル電気泳動で確認した。 （２）ＡＴＬＶのＰ２４遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの造成 (２)−１ ｐＡＦＢ７の造成： ｐＧＥＬ１〔Escherichia coli IGEL1（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９）から常法に
より採取〕の５μｇを１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７.５），７ｍＭ ＭｇＣｌ2，
６ｍＭメルカプトエタノールおよび１００ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液（以下、Ｙ
−１００緩衝液と略記する）４０μｌに溶かし、制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製
、以下特記しない限り制限酵素は宝酒造社製を用いた）１０単位、ＢａｍＨＩ８
単位を加え、３７℃，２時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により
ｌｐｐターミネーターを含む約１，７００ｂｐのＤＮＡ断片を約０.２μｇ得た
。 これとは別に、ｐＧＥＬ１の１０μｇを１００μｌのＹ−１００緩衝液に溶か
し、制限酵素ＰｓｔＩを１６単位加え、３７℃，１時間消化反応を行った。アガ ロースゲル電気泳動法によりｐｓｔＩ消化が完全に行われたのを確認した後、制
限酵素ＨｐａＩを３単位加え、３７℃，３０分間消化反応を行いＨｐａＩ部分分
解を行った。この反応液からＬＧＴ法によりｔｒｐ系のプロモーターを含む約９
４０ｂｐの部分分解ＤＮＡ断片約０.２μｇを得た。 次に、ｐＡＦＡ１０（ＡＴＣＣ３９５８２に担持された第１図に示すプラスミ
ド）の３０μｇを２５０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＨｐａＩ
１４０単位、ＢａｍＨＩ３０単位を加え、３７℃，３時間消化反応を行い、この
反応液からＬＧＴ法でＰ２４遺伝子を含む、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を約０.
５μｇ得た。 上記で得たｐＧＥＬ１由来のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片（約１，７００ｂｐ）
約０.１μｇ，ＰｓｔＩ−ＨｐａＩ断片（約９４０ｂｐ）約０.１５μｇおよびｐ
ＡＦＡ１０由来のＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片（約７００ｂｐ）約０.２μｇを２
０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７.５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０ｍＭジチオスレイ
トールおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む溶液（以下、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液と略
記する）２０μｌに溶かし、３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加え
、４℃，１６時間結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株〔ボリバーら，ジーン２，75（1977）〕
を形質転換し、ＡｐRのコロニーを得、このコロニーよりバーンボイムらの方法
〔ヌクレイック・アシド・リサーチ７，1513（1979）〕によりプラスミドＤＮＡ
を回収し、第１図に示したｐＡＦＢ７を得た。 (２)−２ ｐＡＡＢ６の造成： ｐＴＡＧ４２４Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−３４１に担持された第２図に示すプラス
ミド，特開昭６０−６１５３４）２μｇを２０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし
、制限酵素ＢａｍＨＩを４単位加え、３７℃，２時間消化反応を行った。 つづいて該溶液のＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭになるように調整し、制限酵素Ｎ
ｃｏＩ（ニッポンジーン社製）を４単位加え、３７℃，２時間消化反応を行った
。つづいて、ＢａｍＨＩ，ＮｃｏＩで切断したＤＮＡを３３ｍＭトリス−酢酸（
ｐＨ７.９），６６ｍＭ酢酸カリウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，５ｍＭジチ
オスレイトール，および０.４ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
を 含む溶液（以下、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液と略記する）２０μｌに溶かし
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）１単位を加え、３７℃，３０分反応を
行った。 上記の酵素処理液を２０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶かし、３単位の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃，１８時間結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、ＡｐRのコロニーを得、
このコロニーより前記バーンボイムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、
第２図に示したｐＡＡＢ６を得た。 (２)−３ ｐＡＨＡ１の造成： 前項で得たｐＡＡＢ６の１５μｇを１００μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、
制限酵素ＳｔｕＩ１５単位とＣｌａＩ〔ニュー・イングランド・バイオ・ラブス
（New England Bio Labs）社製〕２０単位を加え、３７℃，３時間消化反応を行
い、この反応液からＬＧＴ法でｐ２４遺伝子の前半部分を含む約４００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を約０.３μｇ得た。 次にｐＧＥＬ１の５μｇを４０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ｃ
ｌａＩ〔ニュー・イングランド・バイオ・ラブス（New England Bio Labs）社製
〕５単位，ｐｓｔ１８単位を加え、３７℃，２時間消化反応を行った。この反応
液からＬＧＴ法でｔｒｐ系のプロモーター部分を含む約１，０００ｂｐのＤＮＡ
断片を約０.２μｇ得た。 これとは別に、第１項で得たｐＫＹＰ２６の２μｇを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７.５），７ｍＭ ＭｇＣｌ2，６ｍＭメルカプトエタノールおよび１０ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含む溶液（以下、Ｙ−１０緩衝液と略記する）３０μｌに溶かし
、制限酵素ＫｐｎＩ５単位を加え、３７℃，２時間消化反応を行った。このＫｐ
ｎＩで切断したＤＮＡを２０μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液に溶かしＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ１単位を加え、３７℃，３０分間反応をおこなった。このＤ
ＮＡ反応液を３０μｌの−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ｐｓｔＩ４単位を加
え、３７℃，２時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法でｌｐｐ系のタ
ーミネーター部分を含む約１，７００ｂｐのＤＮＡ断片を約０.２μｇ得た。 上記で得たｐＡＡＢ６由来のＳｔｕＩ−ＣｌａＩ断片（約４００ｂｐ）約０.
１ μｇ，ｐＧＥＬ１由来のＣｌａＩ−ＰｓｔＩ断片（約１，０００ｂｐ）約０.２
μｇ，ｐＫＹＰ２６由来のＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片（約７００ｂｐ）約０.１μ
ｇを３０のＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶かし、４単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを
加え、４℃，１８時間結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、ＡｐRのコロニーを得、
このコロニーより前記バーンボイムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、
第２図に示したｐＡＨＡ１を得た。 (２)−４ ｐＡＦＧ１０の造成： 前項で得たｐＡＨＡ１の５μｇを５０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限
酵素ＰｓｔＩを８単位加え、３７℃，２時間消化反応を行った。この反応液から
ＬＧＴ法でｔｒｐ系のプロモーター部分およびＰ２４遺伝子のＮ末端部分を含む
約１，１００ｂｐのＤＮＡ断片を約０.５μｇ得た。 次に、第１項で造成したｐＡＦＢ７の６μｇを、３０μｌのＹ−１００緩衝液
に溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩを８単位加え、３７℃，２時間消化反応を行った
。この反応液に０.２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０），１２０ｍＭ ＣａＣｌ2
，１２０ｍＭ ＭｇＣｌ2，２Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡからなる
液５μｌを加え、滅菌水を１５μｌ加え、３０℃に３分間保温した。ＢＡＬ３１
ヌクレアーゼ〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリース（Bethesda Research Labo
ratories）社製〕を１０単位加え３０℃で８０秒間分解反応を行った。反応後フ
ェノール抽出を行い、エタノール沈殿法でＤＮＡを回収した。このＤＮＡを３０
μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ｐｓｔＩを８単位加え、３７℃，２
時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法で、Ｐ２４遺伝子部分を含む約
４５０ｂｐのＤＮＡ断片を約０.１μｇ得た。 上記で得たｐＡＨＡ１由来のｐｓｔＩ断片（約１，１００ｂｐ）約０.２μｇ
，ｐＡＦＢ７由来のＰｓｔＩ−ＢＡＬ３１ヌクレアーゼ分解断片（約４５０ｂｐ
）０.１μｇ、および前項で得たｐＫＹＰ２６由来のＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片（
約１，７００ｂｐ）０.１μｇを３０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶かし
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃，１８時間結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、ＡｐRのコロニーを得、 このコロニーより前記バーンボイムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、
第３図に示したｐＡＦＧ１０を得た。Ｐ２４をコードする領域のＣ末端の塩基配
列を決定したところ、第３図に示した様にＰ２４のＣ末端までを含み、さらにＶ
ａｌ・Ｖａｌ・Ｌｅｕ・Ｓｅｒ・Ａｓｎが付いた構造になっていることが確認さ
れた。 （３）ＡＴＬＶのｇａｇ遺伝子によりコードされる抗原ポリペプチドとｅｎｖ遺
伝子によりコードされる抗原ポリペプチドとが融合したハイブリッド抗原ポリペ
プチドをコードする組換え対プラスミドｐＥＴＩ７の造成： 第２項で得た組換え体プラスミドｐＡＦＧ１０の１０μｇを１００μｌのＹ−
１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＸｈｏＩを１０単位，ＳｔｕＩを１２単位加え
、３７℃，３時間消化反応を行った。 この反応液からＬＧＴ法によりトリプトプァン系のプロモーターとＰ２４遺伝
子の前半を含む約６３０ｂｐのＤＮＡ断片約０.５μｇを得た。 次に第１項で得たｐＥＦＭ２の５μｇを５０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし
、制限酵素ＸｈｏＩを１０単位，ＨｐａＩを８単位加え、３７℃，３時間消化反
応を行った。この反応液からＬＧＴ法により、ｅｎｖ遺伝子の後半を含む約２，
７００ｂｐのＤＮＡ断片を約１μｇ得た。 上記で得たｐＡＦＧ１０由来のＸｈｏＩ−ＳｔｕＩ断片（約６３０ｂｐ）０.
０５ｐmoleとｐＥＦＭ２由来のＸｈｏＩ−ＨｐａＩ断片（約２，７００ｂｐ）０
.０１ｐmoleを４０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ５単位を加え、４℃，１８時間結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、ＡｐRのコロニーを得、
このコロニーより前記バーンボイムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、
第４図に示したｐＥＴＩ７を得た。 （４）ｐＥＴＩ７を保有する大腸菌によるｇａｇ遺伝子によりコードされる抗原
ポリペプチドとｅｎｖ遺伝子によりコードされる抗原ポリペプチドとの融合ポリ
ペプチドの生産： 第３項３で得られた組換え体プラスミドｐＥＴＩ７を用い常法により大腸菌Ｗ
３１１０ＳｔｒＡ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２）を形質転換した。得られた ＡｐRのコロニーを８mlのＭＣＧ培地〔０.６％ Ｎａ2ＨＰＯ4，０.３％ＫＨ2Ｐ
Ｏ4，０.５％ ＮａＣｌ，０.１％ ＮＨ4Ｃｌ，０.５％グルコース，０.５％カ
ザミノ酸，１ｍＭ ＭｇＳＯ4，４μｇ／mlビタミンＢ1，ｐＨ７.２〕に接種し、
３０℃で１８時間培養した。得られた培養液を８，０００rpm，１０分間遠心し
て菌体を回収した。この菌体をレムリのサンプルバッファーに懸濁後、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーにて染色
して、分子量約２５，０００の部位にポリペプチドバンドを検出した。このバン
ドは該プラスミドを含まない大腸菌を用いた場合には存在しなかった。 このポリペプチドの分子量は、プラスミドｐＥＴＩ７の構造から予想されるハ
イブリッド抗原ポリペプチドの分子量（２５，０５１.０２）と一致した。 （５）第４項で述べた培養液１ｌより遠心分離（８，０００ rpm，３０分間）し
て得られた菌体を２００mlの脱イオン水に懸濁し、マントンガウリンホモゲナイ
ザー（製造元；MANTON-GAULIN MANUFACTURING Co.，INC．USA）により４００kg
／cm2の圧力で菌体破砕を行い、沈殿画分を遠心分離により得た。本沈殿画分は
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分析するとｇａｇ−ｅｎｖ蛋白８４
５mgを含有していた。 本沈殿画分を４％（W／V）トリトンＸ−１００，１０ｍＭエチレンジアミン四
酢酸ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）に分散し遠心分離に
より再び沈殿画分を得、この沈殿を２ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム，
０.３％（V／V）２−メルカプトエタノール，７Ｍ尿素を含むリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７.４）で溶解し、あらかじめ７Ｍ尿素を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（以下、
平衡化緩衝液とよぶ，ｐＨ７.０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌＣＭトヨパール６
５０（東洋曹達工業社製）１００mlに通塔、吸着させた。 平衡化緩衝液でカラムを洗浄後、０.１Ｍ ＮａＣｌを加えた平衡化緩衝液で
溶出し、高純度画分２５０mlを得た。本画分は４３０mgのｇａｇ−ｅｎｖ蛋白を
含有していた。この高純度画分を、１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９.４）３ｌを外
液として透析し、生じた沈殿を遠心分離により除去後、遠心分離上清として目的
ｇａｇ−ｅｎｖ蛋白溶液４００mlを得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析すると、 蛋白純度は９０％以上であり、収量は１６０mgであった。 発明の効果 本発明によれば、抗ＡＴＬＶ抗体の検出を精度高く行うことができ、ＡＴＬの
血清診断を効果的に行うことができる。さらに本発明方法はＰ−２４と交差反応
を示す疾患に応用できる。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドｐＡＦＢ７の造成工程を示す。
第２図はプラスミドｐＡＨＡ１の造成工程を示す。
第３図はプラスミドｐＡＦＧ10の造成工程を示す。
第４図はプラスミドｐＥＴＩ７の造成工程を示す。
第５図は、エーザイ法の抗体値をＹ軸，Ｐ−２４法の抗体値をＸ軸としたとき
の相関図を示す。相関係数は０.８９２４である。単一度数分布による最小２乗
法（１次回帰）により、回帰式を求めるとＹ＝２.７４３７Ｘ＋０.２１５１を示
す。 第６図は、エーザイ法の抗体値をＹ軸，ｇａｇ−ｅｎｖ法の抗体値をＸ軸とし
たときの相関図を示す。相関係数は０.７４７９である。単一度数分布による最
小２乗法（１次回帰）により回帰式を求めるとＹ＝１.９４７３Ｘ−０.１１１９
を示す。
の相関図を示す。相関係数は０.８９２４である。単一度数分布による最小２乗
法（１次回帰）により、回帰式を求めるとＹ＝２.７４３７Ｘ＋０.２１５１を示
す。 第６図は、エーザイ法の抗体値をＹ軸，ｇａｇ−ｅｎｖ法の抗体値をＸ軸とし
たときの相関図を示す。相関係数は０.７４７９である。単一度数分布による最
小２乗法（１次回帰）により回帰式を求めるとＹ＝１.９４７３Ｘ−０.１１１９
を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (１)成人Ｔ細胞白血病ウィルス（以下ＡＴＬＶという）のｇａｇ遺伝子とＡＴＬ
Ｖのｅｎｖ遺伝子とが結合した融合遺伝子によってコードされるポリペプチドで
あって、下記アミノ酸配列を有するポリペプチドを抗原物質として用いる免疫学
的方法により試料中の抗ＡＴＬＶ抗体を検出することを特徴とする抗ＡＴＬＶ抗
体の検出法。(２)免疫学的方法が、ラジオ・イムノアッセイ，エンザイム・イムノアッセイ，
フルオレッセンス・イムノアッセイ，逆受身凝集反応，フィトヘマトアグリチネ
ーション，パーティクルアグリチネーション，レーザーネフロメトリーおよび免
疫溶血反応から選ばれる特許請求の範囲第１項記載の検出法。
Family
ID=
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