JP2026504827A - スパイラル構造を含む脂質ナノ粒子製造用チップおよびこれを用いた脂質ナノ粒子の製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、スパイラル構造を含む脂質ナノ粒子製造用チップおよびこれを用いた脂質ナノ粒子の製造方法に関し、核酸を含む水相溶液および脂質を含む油相溶液の混合効率を高めて、水相溶液と油相溶液との界面で自己組織化過程により均一な脂質ナノ粒子を形成することができる。また、前記スパイラル構造を含む脂質ナノ粒子製造用チップを用いて均一な形状および直径を有する脂質ナノ粒子の効率的な製造が可能な製造方法に関する。
【選択図】図２

Description

本発明は、スパイラル構造を含む脂質ナノ粒子製造用チップおよびこれを用いた脂質ナノ粒子の製造方法に関する。

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、細胞不透過性である治療用核酸、タンパク質、およびペプチドのような生物学的活性化合物に対する効果的な薬物伝達システムである。

通常、ワクチンは「第１世代」、「第２世代」および「第３世代」ワクチンに細分され、遺伝子ワクチン、すなわち、遺伝子ワクチン接種のためのワクチンは、通常、「第３世代」ワクチンと理解される。遺伝子ワクチンは典型的に、生体内で病原体または腫瘍抗原に対して特徴的なペプチドまたはタンパク質（抗原）断片の発現を可能にする遺伝子組換え核酸分子からなる。遺伝子ワクチンは、患者への投与時、標的細胞による吸収後に発現する。投与された核酸の発現は、暗号化されたタンパク質の生産をもたらす。このようなタンパク質が患者の免疫系によって異物として認識される場合、免疫反応が触発される。

遺伝子ワクチン接種の観点から、ＤＮＡのみならず、ＲＮＡも投与のための核酸分子として利用可能である。ＤＮＡは相対的に安定的で取扱いやすいことが知られている。

しかし、ＤＮＡの利用は、損傷した遺伝子の機能喪失におけるような突然変異誘発性イベントを潜在的にもたらす、投与されたＤＮＡ断片の、患者のゲノム内への望まない挿入の危険を抱えている。

遺伝子ワクチン接種のためにＤＮＡの代わりにＲＮＡを用いることにより、望まないゲノム統合および抗－ＤＮＡ抗体の生成の危険は最小化されるか、防止される。しかし、ＲＮＡは偏在するＲＮアーゼによって容易に分解されうる、極めて不安定で、不透過性、脆弱性および免疫原性の問題を有する。

ここ数年間多くの発展が成し遂げられたにもかかわらず、適応免疫反応を誘発できるｍＲＮＡワクチン接種のための効率的な方法として、脂質ナノ粒子製剤を用いた。

前記脂質ナノ粒子製剤は、生体内核酸の伝達を改善することができる。

前記脂質ナノ粒子を用いた薬物伝達システムは、イオン化脂質、非イオン化脂質（ｎｏｎ－Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）、中性脂質および融合性脂質を含む多成分製剤である。カチオン性のイオン化脂質はアニオン性核酸に結合するのに対し、他の成分は脂質ナノ粒子の安定した自己組織化を支援する。

前記脂質ナノ粒子は、最適な薬物：脂質の比率で製造されて、血清で分解および除去から核酸を保護し、全身または局所伝達に適し、核酸の細胞内伝達を提供することができる。

前記脂質ナノ粒子は、従来の製造方法で製造する時、製造された粒子の大きさが均一でなくて、別の分類工程を要するなどの生産効率が低下する問題がある。

このような問題を解決し、直径が均一な脂質ナノ粒子を生産して生産効率を高められる脂質ナノ粒子を製造するためのチップおよび製造方法の開発が必要である。

ＵＳ１０，８３５，８７８

本発明の目的は、スパイラル構造を含む脂質ナノ粒子製造用チップおよびこれを用いた脂質ナノ粒子の製造方法を提供することである。

本発明の他の目的は、核酸を含む水相溶液および脂質を含む油相溶液の混合効率を高めて、水相溶液と油相溶液との界面で自己組織化過程により均一な脂質ナノ粒子を形成できるスパイラル構造を含む脂質ナノ粒子製造用チップを提供することである。

本発明の他の目的は、前記スパイラル構造を含む脂質ナノ粒子製造用チップを用いて均一な形状および直径を有する脂質ナノ粒子の効率的な製造が可能な製造方法を提供することである。

上記の目的を達成するために、本発明は、脂質ナノ粒子製造用チップに関し、油相溶液供給部と、水相溶液供給部と、スパイラル構造を含むミキサ部とを含み、前記ミキサ部は、前記油相溶液供給部および前記水相溶液供給部に連結され、前記油相溶液供給部を介して供給される油相溶液と、前記水相溶液供給部を介して供給される水相溶液とが混合されて、脂質ナノ粒子を形成することができる。

また、前記ミキサ部は、周面に螺旋軌跡に沿って交互に形成された山部および谷部を含むことができる。

また、前記ミキサ部の断面は、山部による外径が１ｍｍ～２ｍｍであり、谷部による内径が０．５ｍｍ～０．６ｍｍであってもよい。

また、前記ミキサ部は、周面の螺旋軌跡の間隔（Ｐｉｔｃｈ）が１ｍｍ～３ｍｍであってもよい。

また、前記ミキサ部は、山部および谷部の深さ（Ｄｅｐｔｈ）が０．１ｍｍ～０．５ｍｍであってもよい。

また、前記ミキサ部は、周面の螺旋軌跡によって形成された谷部の幅（Ｗｉｄｔｈ）が０．１ｍｍ～０．５ｍｍであってもよい。

また、前記ミキサ部は、油相溶液および水相溶液が混合される混合区間と、前記油相溶液および水相溶液が完全に混合された混合溶液が安定化される安定化区間とを含み、前記混合区間および安定化区間の長さ比が１：１～１：５であってもよい。

また、前記ミキサ部は、排出部に連結され、前記排出部は、油相溶液供給部および水相溶液供給部に連結されたミキサ部の他の一端に連結されてもよい。

本発明の他の実施例による脂質ナノ粒子の製造方法は、核酸を含む水相溶液を製造するステップと、脂質を有機溶液に溶解して油相溶液を製造するステップと、前記水相溶液および油相溶液を、請求項１に記載の脂質ナノ粒子製造用チップ上の油相溶液供給部および水相溶液供給部に供給するステップと、前記油相溶液供給部および水相溶液供給部に供給された油相溶液および水相溶液がミキサ部内で混合されて、脂質ナノ粒子を形成するステップとを含むことができる。

また、前記油相溶液および水相溶液は、ミキサ部の周面上の螺旋軌跡に沿って流動して混合されて混合溶液を形成し、前記混合溶液が螺旋軌跡に沿って流動して安定化できる。

また、前記油相溶液および水相溶液は、ミキサ部の周面上の螺旋軌跡に沿って界面を形成し、前記界面上で油相溶液の脂質と水相溶液の核酸とが自己組織化過程により脂質ナノ粒子を形成することができる。

また、前記油相溶液および水相溶液は、ミキサ部を流動して混合溶液を形成する混合区間と、前記混合溶液が安定化される安定化区間とを移動し、前記混合区間および安定化区間の長さ比が１：１～１：５であってもよい。

また、前記油相溶液および水相溶液を油相溶液供給部および水相溶液供給部にそれぞれ供給する時の流量比が１：１～１：５であってもよい。

また、前記油相溶液および水相溶液の総流量は５ｍＬ／ｍｉｎ～５０ｍＬ／ｍｉｎであってもよい。

また、前記脂質ナノ粒子を形成するステップの後、希釈および濾過する後処理ステップを追加的に含むことができる。

本発明は、核酸を含む水相溶液および脂質を含む油相溶液の混合効率を高めて、水相溶液と油相溶液との界面で自己組織化過程により均一な脂質ナノ粒子を形成することができる。

また、前記スパイラル構造を含む脂質ナノ粒子製造用チップを用いて均一な形状および直径を有する脂質ナノ粒子の効率的な製造が可能である。

本発明の一実施例による従来の脂質ナノ粒子製造用チップに関する図である。 本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップに関する図である。 本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップおよびミキサ部が結合する部分に関する拡大図である。 本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップのミキサ部に関する図である。 本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップのミキサ部の断面に関する図である。 本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップのミキサ部内の混合区間および安定化区間に関する図である。 本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップのミキサ部に注入される油相溶液および水相溶液の流れに関する図である。 本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップのミキサ部の断面における油相溶液および水相溶液の流れに関する図である。 本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップのミキサ部内の流体の流れに関する実験結果である。 本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップのミキサ部内の油相溶液および水相溶液の総流量の変化による流体の流れに関する実験結果である。 本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップのミキサ部内の流体の流れに関する実験結果である。 本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップのミキサ部内の流体の流れに関する実験結果である。 本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップのミキサ部内の流体の流れに関する実験結果である。 本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップのミキサ部内の流体の流れに関する実験結果である。 本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップのミキサ部内の流体の流れに関する実験結果である。

本発明は、油相溶液供給部と、水相溶液供給部と、スパイラル構造を含むミキサ部とを含み、前記ミキサ部は、前記油相溶液供給部および前記水相溶液供給部に連結され、前記油相溶液供給部を介して供給される油相溶液と、前記水相溶液供給部を介して供給される水相溶液とが混合されて、脂質ナノ粒子を形成する脂質ナノ粒子製造用チップに関する。

以下、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように、本発明の実施例について詳細に説明する。しかし、本発明は種々の異なる形態で実現可能であり、ここで説明する実施例に限定されない。

ｍＲＮＡはメッセンジャーリボ核酸（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲｉｂｏＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）の略語で、遺伝情報を有するＤＮＡがｍＲＮＡになり、これを用いてタンパク質が合成される過程でＤＮＡとタンパク質とを連結する中間体である。

コロナ１９によって、ｍＲＮＡワクチンの関心および開発が集中している。ｍＲＮＡワクチンは、他のタイプのワクチンに比べていくつかの利点がある。ｍＲＮＡワクチンの最も大きな長所は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）がプラットフォーム技術に相当し、コロナ１９のように変異が多く発生するウイルスに対抗して、迅速な技術開発が可能であるということである。

具体的には、保護タンパク質抗原（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ）を識別し、前記抗原に対する遺伝子をシーケンシングして、ｍＲＮＡを製造することができる。このような方式を用いて新規ｍＲＮＡを製造し、従来のｍＲＮＡワクチンの剤形設計および製造工程を用いる場合、迅速なｍＲＮＡワクチンの製造が可能である。これは、互いに異なる抗原をコードするｍＲＮＡが化学的、物理的に非常に類似しているため、新たなｍＲＮＡワクチンの剤形設計および製造工程は、従来のｍＲＮＡワクチンの剤形および製造工程と同一のステップで行われることを意味する。

リン酸塩基の負電荷のため、ｍＲＮＡは一般的に非経口用に使用されるｐＨ範囲で多価アニオン性巨大分子である。前記のように、負電荷を帯びるｍＲＮＡの電気的な性質を利用して、正電荷を帯びるイオン化脂質（ｉｏｎｉｓａｂｌｅ ｌｉｐｉｄまたはｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ）を用いて脂質ナノ粒子を製造することができる。具体的には、イオン化脂質は正電荷を帯びる脂質で、負電荷を帯びるｍＲＮＡと電気的な引力により互いに強く結合する。前記イオン化脂質のほか、追加的に非イオン化脂質（ｎｏｎ－Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）、中性脂質および融合性脂質を含んで脂質ナノ粒子を形成する。

ＵＳ９３６４４３５Ｂ２の核酸－脂質粒子は、（ａ）核酸、（ｂ）カチオン性脂質、（ｃ）非カチオン性脂質、および（ｄ）融合性脂質を含み、粒子内の脂質の総含有量を基準として、前記カチオン性脂質を５０ｍｏｌ％～８５ｍｏｌ％含み、前記非カチオン性脂質を１３ｍｏｌ％～４９．５ｍｏｌ％含み、融合性脂質を０．５ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％含むことを開示している。

また、ＥＰ２２７９２５４Ｂ１の核酸－脂質粒子は、粒子内の脂質の総含有量を基準として、前記カチオン性脂質を５０ｍｏｌ％～６５ｍｏｌ％含み、前記非カチオン性脂質を４９．５ｍｏｌ％以下で含み、コレステロールまたはその誘導体を３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％含み、融合性脂質を０．５ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％含むことを開示している。

前記のように核酸を含む脂質ナノ粒子を製造するためには、核酸を含む水相溶液と脂質を含む油相溶液とを用いて製造するもので、前記水相溶液および油相溶液を混合できる脂質ナノ粒子製造用チップを用いている。

前記脂質ナノ粒子製造用チップは、微細流体法により前記水相溶液と油相溶液とを混合するためのもので、前記水相溶液と油相溶液とが接する界面上で自己組織化過程により脂質ナノ粒子が形成できる。具体的には、後述するように、水相溶液の流れと油相溶液の流れとを混合することにより、２つの流体の界面で脂質とｍＲＮＡとの自己組織化（ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ）により脂質ナノ粒子を含む混合液を製造することができる。

前記脂質ナノ粒子を製造するための従来のチップは、ＷＯ２０１８／１９０４２３のように、二次元的屈曲の流路を有する流路構造体で、バッフルを互い違いに配置した構造であり得る。

前記バッフルを互い違いに配置した構造の流路構造体は、バッフルの幅、長さおよび配置を調整することにより、溶液の希釈速度を制御してナノ粒子の直径調整が可能であることを特徴とする。

あるいは、ＫＲ１０－２３６１１２３Ｂ１のように、円環体混合エレメントにより分岐した（ｂｉｆｕｒｃａｔｅｄ）流体の流れを有する流体混合器を用いる方策も提案されている。前記流体混合器は、図１のようなチップの構造で、後述する本発明の脂質ナノ粒子製造用チップに比べて、油相溶液および水相溶液の完全な混合が現れず、脂質ナノ粒子の生産効率が相対的に低かったり、粒子の均一な程度において差が現れる。

すなわち、従来の多様な脂質ナノ粒子を製造するためのチップが開発されたが、従来の脂質ナノ粒子を製造するためのチップは、油相溶液と水相溶液とが界面を形成して混合されなければならないが、油相溶液と水相溶液との混合が相対的に容易でない問題がある。

そこで、本発明では、新規なスパイラル構造を含む脂質ナノ粒子製造用チップを提供するものであって、前記スパイラル構造を含む脂質ナノ粒子用チップを用いる場合、核酸を含む水相溶液および脂質を含む油相溶液の混合効率を高めて、水相溶液と油相溶液との界面で自己組織化過程により均一な脂質ナノ粒子を形成することができる。

具体的には、本発明の一実施例による脂質ナノ粒子製造用チップは、油相溶液供給部と、水相溶液供給部と、スパイラル構造を含むミキサ部とを含み、前記ミキサ部は、前記油相溶液供給部および前記水相溶液供給部に連結され、前記油相溶液供給部を介して供給される油相溶液と、前記水相溶液供給部を介して供給される水相溶液とが混合されて、脂質ナノ粒子を形成することができる。

前記ミキサ部は、排出部に連結され、前記排出部は、油相溶液供給部および水相溶液供給部に連結されたミキサ部の他の一端に連結されてもよい。

より具体的には、本発明の脂質ナノ粒子製造用チップは、図２の通りである。図２によれば、油相溶液供給部１００と、水相溶液供給部２００と、スパイラル構造を含むミキサ部３００と、排出部４００とを含むことができる。

前記油相溶液供給部１００および水相溶液供給部２００は、ミキサ部３００の一端にそれぞれ結合可能である。前記油相溶液供給部１００および水相溶液供給部２００を介して、油相溶液および水相溶液がミキサ部３００の内部に流入することができ、前記ミキサ部３００内で油相溶液および水相溶液が混合されて、脂質ナノ粒子を形成することができる。

前記図２による本発明の脂質ナノ粒子製造用チップは、より具体的には、油相溶液供給部１００および水相溶液供給部２００がｚ軸を基準として位置し、ｙ軸方向に垂直に延びた後、ｘ軸方向のミキサ部３００に結合できる。

前記油相溶液供給部１００および水相溶液供給部２００は、同一にｚ軸を基準として位置して油相溶液と水相溶液とがそれぞれ注入できるようにし、前記油相溶液および水相溶液がそれぞれ油相溶液供給部１００および水相溶液供給部２００を介して流れて、油相溶液の流れと水相溶液の流れとの出会う部分で垂直にミキサ部３００に連結されて、前記油相溶液の流れと水相溶液の流れとがすべてミキサ部３００の内部に移動する。

前記油相溶液の流れと水相溶液の流れとの出会う部分および前記部分で垂直にミキサ部３００に連結される部分に関する拡大図が、図３の通りである。

前記油相溶液および水相溶液のそれぞれの流れとミキサ部３００内での混合溶液の流れに関する説明は後述する。

前記図３によれば、油相溶液供給部１００および水相溶液供給部２００は、互いに対向する方向で接し、前記油相溶液供給部１００および水相溶液供給部２００が接した部分で垂直にミキサ部３００に連結される。

本発明のミキサ部３００は、上述したようにスパイラル構造を含むことを構造的な特徴とし、具体的には、前記スパイラル構造は、周面に螺旋軌跡に沿って交互に形成された山部３１０および谷部３２０を含むことを特徴とする。

前記スパイラル構造は、周面が螺旋軌跡によって山部３１０および谷部３２０が繰り返し形成されたことを特徴とし、山部３１０による外径と谷部３２０による内径との差が現れる。すなわち、図５のように、山部３１０による断面の円に対する直径（Ｄｉａｍｅｔｅｒ、３３０）を特定することができ、谷部３２０は、螺旋軌跡によって凹入した部分で、前記谷部３２０による断面の円に対する直径３４０も特定することができる。

前記ミキサ部３００の断面は、山部３１０による外径３３０が１ｍｍ～２ｍｍであり、谷部３２０による内径３４０が０．５ｍｍ～０．６ｍｍであってもよいし、山部３１０による外径３３０が１ｍｍ～１．８ｍｍであり、谷部３２０による内径３４０が０．５１ｍｍ～０．５９ｍｍであってもよいし、山部３１０による外径３３０が１ｍｍ～１．５ｍｍであり、谷部３２０による内径３４０が０．５２ｍｍ～０．５８ｍｍであってもよい。後述するように、前記ミキサ部３００内で油相溶液および水相溶液の流れが発生する時、ミキサ部３００の外径３３０に沿った流れが発生し、内径３４０に沿って流れる流れが発生可能である。すなわち、ミキサ部３００内で油相溶液および水相溶液の混合が発生する時、ミキサ部３００の外径３３０に沿って流れて混合が発生したりもし、内径３４０に沿って流れる流れも発生し、前記外径３３０に沿って流れる流れと内径３４０に沿って流れる流れとが流体の移動によって混合されながら、完全に混合された混合溶液として形成される。これは、本発明のミキサ部３００内に注入された油相溶液および油相溶液の流れは、スパイラル構造の形状による流れによってのみ混合が発生するのではなく、前記ミキサ部３００の周面に沿って流れる流れと中心部で一直線に流れる流れとの間の混合が発生する。

前記本発明のミキサ部３００は、図４のように、周面の螺旋軌跡の間隔（Ｐｉｔｃｈ、３５０）、山部３１０および谷部３２０の深さ（Ｄｅｐｔｈ、３７０）、および周面の螺旋軌跡によって形成された谷部の幅（Ｗｉｄｔｈ、３６０）を特定することができる。具体的には、周面の螺旋軌跡の間隔（Ｐｉｔｃｈ、３５０）が１ｍｍ～３ｍｍであり、山部３１０および谷部３２０の深さ（Ｄｅｐｔｈ、３７０）が０．１ｍｍ～０．５ｍｍであり、周面の螺旋軌跡によって形成された谷部の幅（Ｗｉｄｔｈ、３６０）が０．１ｍｍ～０．５ｍｍであってもよく、周面の螺旋軌跡の間隔（Ｐｉｔｃｈ、３５０）が１．５ｍｍ～２．５ｍｍであり、山部３１０および谷部３２０の深さ（Ｄｅｐｔｈ、３７０）が０．２ｍｍ～０．４ｍｍであり、周面の螺旋軌跡によって形成された谷部の幅（Ｗｉｄｔｈ、３６０）が０．２ｍｍ～０．４ｍｍであってもよい。

前記間隔（Ｐｉｔｃｈ、３５０）は、スパイラル構造によって周面の特定の地点で周面に沿って回転移動させて、開始した地点と同一の地点までの長さを意味するものである。前記深さ（Ｄｅｐｔｈ、３７０）は、ミキサ部３００の断面上における山部３１０と谷部３２０との間隔を意味するものである。谷部の幅（Ｗｉｄｔｈ、３６０）は、スパイラル構造の繰り返される間隔を意味するもので、谷部の幅３６０によって、螺旋軌跡が特定の区間内で繰り返される回数の差が現れる。

前記のようなスパイラル構造であるミキサ部３００の間隔３５０、深さ３７０および幅３６０の差によって、スパイラル構造の特徴が変化し、スパイラル構造の特徴が変化する場合、前記ミキサ部３００内で流れる流体の流れが変化し、前記ミキサ部３００の間隔３５０、深さ３７０および幅３６０に対する本発明の範囲と後述するミキサ部３００の混合区間と安定化区間上の長さ比の範囲内で油相溶液および水相溶液の混合によって均一な脂質ナノ粒子を形成可能にする。

前記ミキサ部３００は、油相溶液および水相溶液が混合される混合区間３８０と、前記油相溶液および水相溶液が完全に混合された混合溶液が安定化される安定化区間３９０とを含み、前記混合区間３８０および安定化区間３９０の長さ比が１：１～１：５であってもよい。

流体の流れについては、具体的には、図６～８の通りである。

具体的には、図７は、上述したように、油相溶液供給部１００および水相溶液供給部２００を介して、油相溶液および水相溶液が注入されると、前記油相溶液および水相溶液が互いに対向する方向に流れ、前記油相溶液の流れと水相溶液の流れとが接する部分でミキサ部３００に連結されて、前記油相溶液の流れと水相溶液の流れとが界面を形成してミキサ部３００に移動する。

前記ミキサ部３００に移動した油相溶液および水相溶液は界面を形成し、前記界面上で脂質ナノ粒子が形成され、同時に、油相溶液および水相溶液は混合されて、混合溶液を形成する。この時、前記油相溶液および水相溶液は、ミキサ部３００内で、図８のような流体の流れによって混合効果をさらに高めることができる。

すなわち、前記本発明のミキサ部３００は、上述したように、スパイラル構造であることを特徴とし、スパイラル構造であるミキサ部３００の周部に沿って、流体の流れが発生し、前記流体の流れは、油相溶液および水相溶液の混合効率を高めることができ、界面上で均一な脂質ナノ粒子の形成を促進することができる。

前記ミキサ部３００に沿って混合される油相溶液および水相溶液は、ミキサ部３００内で油相溶液および水相溶液が混合される混合区間３８０と、前記油相溶液および水相溶液が完全に混合された混合溶液が安定化される安定化区間３９０とを経て、均一な脂質ナノ粒子を形成することができる。

上述したように、油相溶液および水相溶液は、ミキサ部３００内で完全に混合されて混合溶液を形成し、前記混合溶液を形成する時、油相溶液中の脂質と水相溶液の核酸とが自己組織化により脂質ナノ粒子を形成するものの、前記脂質ナノ粒子の安定化のために、ミキサ部３００内で完全に混合された混合溶液の流れ内で安定化されるステップが行われる。

前記混合区間３８０および安定化区間３９０の長さ比が１：１～１：５であり、１：１～１：４であり、１：２～１：４であってもよい。前記長さ範囲内で油相溶液および水相溶液が完全に混合され、以後、安定化区間内で完全に混合された混合溶液が移動する。前記のような流体の流れ内で、脂質ナノ粒子の形成と形成した脂質ナノ粒子の安定化が同時に行われる。

前記流体の混合について、より詳しく説明すれば、図９の通りである。図９は、本発明の脂質ナノ粒子製造用チップ内のミキサ部３００の区間別に油相溶液および水相溶液の混合されることを、染色溶液により確認したものである。油相溶液の代わりに黄色溶液を用い、水相溶液の代わりに青色溶液を用い、前記溶液が完全に混合されると、緑色溶液として色により混合の有無を確認した。

具体的には、前記図９に表示した３箇所の部分における流動の実験結果値（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）である。実験に使用された作動流体は、水相溶液としては脱イオン水（Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ Ｗａｔｅｒ）を使用し、黄色染料を５０μＭの濃度に希釈した溶液を使用し、油相溶液としてはエタノールに青色染料を５０μＭの濃度に希釈した溶液を使用した。２つの溶液のミキサ部の内部での溶液間の接触面の撮影は、ミキサ部の上面と垂直な方向で撮影した。撮影したイメージの画素（Ｐｉｘｅｌ）に基づく強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を、イメージの横方向（ｘ軸）をｎの個数に分け、縦方向（ｙ軸）をｍの個数に分けて、それぞれのイメージでｎ－ｂｙ－ｍ Ｐｉｘｅｌにより分析した。測定しようとする位置でそれぞれの流量に合った流体の流れが時間に応じて変化しない定常状態（Ｓｔｅａｄｙ Ｓｔａｔｅ）に安定化された時、撮影をし、追加的により正確な相対的な分析のために油相溶液が流れる時と脱イオン水のみ流れる時を撮影し、油相溶液のみ流れる時を１００％Ｍｉｘｉｎｇ、すなわち完全に混合が行われた状態値として反映し、脱イオン水のみ流れる時を０％Ｍｉｘｉｎｇ、まだＭｉｘｉｎｇが行われていない状態として値を反映した。

図９のＡ区間は、ミキサ部３００の開始部分で溶液の混合を確認したもので、Ａ区間は黄色溶液と青色溶液とが混合される区間で、黄色溶液および青色溶液も確認され、前記２つの溶液が混合されて緑色を示す部分も確認される。

前記図９のＢ区間は、Ａ区間を通過して２つの溶液の混合程度を確認するもので、Ａ区間に比べてより緑色を示す部分が確認されて、相対的に完全な混合溶液がさらに含まれていることを確認することができる。

前記図９のＣ区間は、安定化区間を確認したもので、完全に混合された溶液状態であることを色により確認することができる。

これに対し、図１は、ＫＲ１０－２３６１１２３Ｂ１における脂質ナノ粒子製造用チップに対する流体の混合に関するもので、本発明のように、油相溶液および水相溶液が注入された後、混合される過程で前記チップの全体区間内で完全な混合が現れないことを確認可能で、本発明の脂質ナノ粒子製造用チップに比べて油相溶液および水相溶液の完全な混合程度において差が現れることを確認することができる。

図１の脂質ナノ粒子製造用チップを使用すれば、上述したように、油相溶液および水相溶液の完全な混合が現れなかったり、そうでなければ、完全な混合のためには、チップ内の円環体混合エレメントが追加的に結合されなければならない。すなわち、前記油相溶液および水相溶液が完全に混合できない場合は、油相溶液および水相溶液の混合される過程上で脂質ナノ粒子が形成されるとはいえ、本発明の脂質ナノ粒子製造用チップとは異なって安定化区間を経ていないので、脂質ナノ粒子の間に衝突が発生したり、かたまりが発生することもあり、均一な脂質ナノ粒子への製造が容易でない問題が発生しうる。また、完全な混合のために、円環体混合エレメントが追加的に結合される場合は、チップのサイズが大きくなり、費用的な面で好ましくない。

本発明の他の実施例による脂質ナノ粒子の製造方法は、核酸を含む水相溶液を製造するステップＳ１００と、脂質を有機溶液に溶解して油相溶液を製造するステップＳ２００と、前記水相溶液および油相溶液を上述した脂質ナノ粒子製造用チップ上の油相溶液供給部１００および水相溶液供給部２００に供給するステップＳ３００と、前記油相溶液供給部１００および水相溶液供給部２００に供給された油相溶液および水相溶液がミキサ部３００内で混合されて、脂質ナノ粒子を形成するステップＳ４００とを含むことができる。

具体的には、前記Ｓ１００ステップは、核酸を溶媒に混合して、水相溶液を製造する。前記溶媒はクエン酸溶液で、ｐＨ３．０であるが、前記例に限定されず、核酸を混合して、脂質ナノ粒子を製造できる溶媒は制限なくすべて使用可能である。

前記核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、アンチセンスＯＤＮ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、ＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）、およびこれらの混合からなる群より選択可能であり、好ましくは、ｍＲＮＡであるが、前記例に限らない。

前記核酸は、疾病を予防または治療するための用途であり、一例として、コロナ１９ワクチンのように、コロナ１９ウイルスに対抗するためのスパイクタンパク質を合成する。前記例に限らず、疾病の予防または治療のための核酸はすべて使用可能である。

前記Ｓ２００ステップは、イオン化脂質、非イオン化脂質（ｎｏｎ－Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）、中性脂質および融合性脂質を有機溶液に溶解して油相溶液を製造することである。

前記イオン化脂質は、ＡＬＣ－０３１５（ジェネバント）、ＡＬＣ－０１５９（ジェネバント）、ＤＬｉｎＤＡＰ、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡまたはＳＭ１０２（アルブトゥス）などを用いることができる。前記イオン化脂質は例示に限らず、脂質ナノ粒子の製造に用いられるイオン化脂質は制限なくすべて使用可能である。

前記非イオン化脂質は、融合性脂質とともに脂質ナノ粒子の安定性を高めるために含まれてもよい。脂質ナノ粒子は、目的とする組織や器官に核酸を到達させるためのものであるが、体内注入後、目的とする組織や器官に到達する前に破壊される問題がある。このような問題を防止すべく、非イオン化脂質および融合性脂質を含むことができる。具体的には、前記非イオン化脂質は、ＤＳＰＣ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＯＰＥ（ｄｉｏｌｅｏｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＰＰＥ（ｂｉｓ（ｄｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅ）、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジアシルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジアシルホスファチジルセリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）、およびこれらの混合からなる群より選択され、好ましくは、ＤＳＰＣであるが、前記例に限らない。

前記融合性脂質は、コレステロール、トコフェロール、およびこれらの混合からなる群より選択されてもよいし、好ましくは、コレステロールであるが、前記例に限らない。

前記中性脂質は、粒子の大きさを調整し、保管中の凝集を防止する立体障壁の役割を果たすために含まれるもので、具体的には、ポリエチレングリコール２０００ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ（２０００）ＤＳＰＥ）、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ、ＤＰＧ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＯＰＥ、およびこれらの混合からなる群より選択されてもよいし、好ましくは、ＤＭＧ－ＰＥＧであるが、前記例に限らない。

前記油相溶液を製造するために使用される有機溶液は、アルコールであり、具体的には、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノールなどであってもよいが、好ましくは、エタノールであるが、前記例に限らず、イオン化脂質を均一に溶解させることができる有機溶媒は制限なくすべて使用可能である。

前記Ｓ３００ステップは、前記Ｓ１００およびＳ２００ステップで製造した水相溶液および油相溶液を、油相溶液供給部１００および水相溶液供給部２００に注入して流れるようにすることである。前記油相溶液供給部１００および水相溶液供給部２００にそれぞれ注入された油相溶液および水相溶液に対する流れは、上述したように、互いに対向する方向に流れ、前記２つの流れの交差点でミキサ部３００に連結されて、ミキサ部３００内で層流（ｌａｍｉｎａｒ ｆｌｏｗ）を形成してミキサ部３００内で混合できる。

前記Ｓ４００ステップは、ミキサ部３００に注入された水相溶液と油相溶液とが交差点で層流を形成してミキサ部３００内で混合され、前記水相溶液中の核酸、前記油相溶液中のイオン化脂質、非イオン化脂質、中性脂質および融合性脂質が静電的引力による自己組織化過程により、結合して脂質ナノ粒子を形成することができる。すなわち、水相溶液と油相溶液とを混合して脂質ナノ粒子を製造し、前記油相溶液には４種の脂質がすべて混合された状態を利用することができる。

前記核酸は、具体的には、ｍＲＮＡであり、ｍＲＮＡは、前述したように、アニオン性であり、イオン化脂質はカチオン性で、相互間の静電的引力によって結合する力が発生し、これによって脂質ナノ粒子を形成することができる。

前記Ｓ４００ステップで、前記油相溶液および水相溶液は、ミキサ部３００の周面上の螺旋軌跡に沿って流動して混合されて混合溶液を形成することができ、この時、油相溶液および水相溶液が混合される混合区間３８０と、前記混合区間３８０を通過して脂質ナノ粒子を形成した混合溶液が螺旋軌跡に沿って流動して安定化される安定化区間３９０とを通過する。すなわち、前記混合区間３８０内では、前記油相溶液および水相溶液は、ミキサ部３００の周面上の螺旋軌跡に沿って界面を形成し、前記界面上で油相溶液の脂質と水相溶液の核酸とが自己組織化過程により脂質ナノ粒子を形成することができる。前記ミキサ部３００の周面上で螺旋軌跡に沿って油相溶液と水相溶液とが界面を形成することは、上述したように、図８のような流れによって形成できる。

前記油相溶液および水相溶液を油相溶液供給部および水相溶液供給部にそれぞれ供給する時の流量比が１：１～１：５であり、１：１～１：４であり、１：２～１：４であってもよい。前記範囲内で混合して使用する時、粒子の大きさが均一な脂質ナノ粒子への製造が可能である。より具体的には、前記範囲未満で含む場合、後工程の進行時、エタノールの含有量が多くて脂質ナノ粒子の形状維持困難の問題があり、前記範囲超過で含む場合、水相溶液が多量含まれることにより、水相溶液中の脂質粒子の動きが制限されて直径が過度に小さい粒子を形成する問題がある。

前記油相溶液および水相溶液の総流量は５ｍＬ／ｍｉｎ～５０ｍＬ／ｍｉｎであり、総流量は１０ｍＬ／ｍｉｎ～４５ｍＬ／ｍｉｎであり、総流量は１５ｍＬ／ｍｉｎ～４０ｍＬ／ｍｉｎであってもよい。前記総流量範囲内で、前記ミキサ部３００の混合区間３８０内で油相溶液と水相溶液とが早い時間で完全に混合可能で、均一な脂質ナノ粒子を製造することができる。

図１０は、本発明の油相溶液および水相溶液の総流量によるミキサ部３００内の混合区間３８０の長さを確認するためのもので、前記範囲内では、ミキサ部３００の混合区間３８０および安定化区間３９０の長さ比が１：１～１：５の範囲内で完全な混合溶液を形成することを確認することができる。

図１１～図１５は、総流量を４ｍＬ／ｍｉｎ～６８ｍＬ／ｍｉｎに変更し、図９と同一のＡ～Ｃ区間での流動の実験結果値（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）を確認した結果である。前記図１４の実験結果とともに確認すれば、油相溶液および水相溶液の総流量が４ｍＬ／ｍｉｎである場合は、完全な混合溶液を形成するまで、ミキサ部３００の導入部である０ｍｍ～２ｍｍの区間内でｍｉｘｉｎｇ ｉｎｄｅｘが著しく低くなるため、混合溶液中で脂質ナノ粒子の形成が容易でない問題がある。

また、油相溶液および水相溶液の総流量が５２ｍＬ／ｍｉｎであるか、６８ｍＬ／ｍｉｎである場合にも、ミキサ部３００のＡ部分で油相溶液および水相溶液の混合される速度が相対的に遅くて、混合溶液中で脂質ナノ粒子の形成が容易でない問題がある。

これに対し、油相溶液および水相溶液の総流量が２０ｍＬ／ｍｉｎであるか、３６ｍＬ／ｍｉｎである場合は、ミキサ部３００のＡ部分で２つの溶液の爆発的な混合が発生し、迅速に混合されることを確認することができ、完全な混合溶液を形成する区間が短くて、混合区間内で均一な直径を有する脂質ナノ粒子を形成することができる。

前記Ｓ４００ステップで形成された脂質ナノ粒子は、以後、希釈および濾過する後処理ステップを追加的に含むことができる。

前記本発明の脂質ナノ粒子製造用チップは、ガラス基板、シリコンウエハまたは高分子フィルムからなる群より選択された素材に形成されてもよいが、前記素材の例は前記例に限らず、マイクロチャネルの形成が可能な素材はすべて使用可能である。

前記高分子フィルムは、ポリイミド（Ｐｏｌｙｉｍｉｄｅ）、ポリエチレン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）、フッ素化エチレンプロピレン（Ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）、ポリプロピレン（Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）、ポリエチレンテレフタレート（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）、ポリエチレンナフタレート（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｎａｐｈｔｈａｌａｔｅ）、ポリスルホン（Ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎｅ）、およびこれらの混合からなる群より選択できるが、前記例に限らない。

一例として、シリコンウエハにｅ－ｂｅａｍ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒを用いてアルミニウムを蒸着し、フォトリソグラフィ（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）手法を用いてフォトレジスト（ｐｈｏｔｏｒｅｓｉｓｔ）をアルミニウム上にパターニングする。以後、フォトレジストをマスクとして用いてアルミニウムエッチング（ｅｔｃｈｉｎｇ）し、フォトレジストを除去した後、アルミニウムをマスクとしてシリコンをＤＲＩＥ（ｄｅｅｐ ｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｅｔｃｈｉｎｇ）でエッチングし、アルミニウム除去後、ウエハ上にガラスを正極接合して密封して、製造することができる。

以上、本発明の好ましい実施例について詳細に説明したが、本発明の権利範囲はこれに限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲で定義している本発明の基本概念を利用した当業者の様々な変形および改良形態も本発明の権利範囲に属する。

本発明は、スパイラル構造を含む脂質ナノ粒子製造用チップおよびこれを用いた脂質ナノ粒子の製造方法に関する。

Claims (15)

1. 油相溶液供給部と、
   水相溶液供給部と、
   スパイラル構造を含むミキサ部とを含み、
   前記ミキサ部は、前記油相溶液供給部および前記水相溶液供給部に連結され、前記油相溶液供給部を介して供給される油相溶液と、前記水相溶液供給部を介して供給される水相溶液とが混合されて、脂質ナノ粒子を形成する、
   脂質ナノ粒子製造用チップ。
2. 前記ミキサ部は、周面に螺旋軌跡に沿って交互に形成された山部および谷部を含む、
   請求項１に記載の脂質ナノ粒子製造用チップ。
3. 前記ミキサ部の断面は、山部による外径が１ｍｍ～２ｍｍであり、谷部による内径が０．５ｍｍ～０．６ｍｍである、
   請求項２に記載の脂質ナノ粒子製造用チップ。
4. 前記ミキサ部は、周面の螺旋軌跡の間隔（Ｐｉｔｃｈ）が１ｍｍ～３ｍｍである、
   請求項１に記載の脂質ナノ粒子製造用チップ。
5. 前記ミキサ部は、山部および谷部の深さ（Ｄｅｐｔｈ）が０．１ｍｍ～０．５ｍｍである、
   請求項２に記載の脂質ナノ粒子製造用チップ。
6. 前記ミキサ部は、周面の螺旋軌跡によって形成された谷部の幅（Ｗｉｄｔｈ）が０．１ｍｍ～０．５ｍｍである、
   請求項２に記載の脂質ナノ粒子製造用チップ。
7. 前記ミキサ部は、油相溶液および水相溶液が混合される混合区間と、前記油相溶液および水相溶液が完全に混合された混合溶液が安定化される安定化区間とを含み、
   前記混合区間および安定化区間の長さ比が１：１～１：５である、
   請求項１に記載の脂質ナノ粒子製造用チップ。
8. 前記ミキサ部は、排出部に連結され、
   前記排出部は、油相溶液供給部および水相溶液供給部に連結されたミキサ部の他の一端に連結される、
   請求項１に記載の脂質ナノ粒子製造用チップ。
9. 核酸を含む水相溶液を製造するステップと、
   脂質を有機溶液に溶解して油相溶液を製造するステップと、
   前記水相溶液および油相溶液を、請求項１に記載の脂質ナノ粒子製造用チップ上の油相溶液供給部および水相溶液供給部に供給するステップと、
   前記油相溶液供給部および水相溶液供給部に供給された油相溶液および水相溶液がミキサ部内で混合されて、脂質ナノ粒子を形成するステップとを含む、
   脂質ナノ粒子の製造方法。
10. 前記油相溶液および水相溶液は、ミキサ部の周面上の螺旋軌跡に沿って流動して混合されて混合溶液を形成し、
    前記混合溶液が螺旋軌跡に沿って流動して安定化される、
    請求項９に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
11. 前記油相溶液および水相溶液は、ミキサ部の周面上の螺旋軌跡に沿って界面を形成し、前記界面上で油相溶液の脂質と水相溶液の核酸とが自己組織化過程により脂質ナノ粒子を形成する、
    請求項１０に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
12. 前記油相溶液および水相溶液は、ミキサ部を流動して混合溶液を形成する混合区間と、前記混合溶液が安定化される安定化区間とを移動し、
    前記混合区間および安定化区間の長さ比が１：１～１：５である、
    請求項１０に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
13. 前記油相溶液および水相溶液を油相溶液供給部および水相溶液供給部にそれぞれ供給する時の流量比が１：１～１：５である、
    請求項９に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
14. 前記油相溶液および水相溶液の総流量は５ｍＬ／ｍｉｎ～５０ｍＬ／ｍｉｎである、
    請求項９に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
15. 前記脂質ナノ粒子を形成するステップの後、
    希釈および濾過する後処理ステップを追加的に含む、
    請求項９に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。