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JP2025524923A - クローディン－６結合部分及びその使用 - Google Patents

クローディン－６結合部分及びその使用

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JP2025524923A
JP2025524923A JP2025504062A JP2025504062A JP2025524923A JP 2025524923 A JP2025524923 A JP 2025524923A JP 2025504062 A JP2025504062 A JP 2025504062A JP 2025504062 A JP2025504062 A JP 2025504062A JP 2025524923 A JP2025524923 A JP 2025524923A
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チューチュワン ジュワン
シャオフー ファン
ホーフェイ ホウ
ジエンルイ ジュー
ダン ジャオ
レイ ヤン
ジエ マオ
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レジェンド バイオテック アイルランド リミテッド
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Abstract

本開示は、抗クローディン－６抗体（例えば、ＶＨＨドメイン抗体）、及びクローディン－６に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。前記キメラ抗原受容体は、細胞外抗原結合ドメインにおける抗クローディン－６抗体と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。開示されたＣＡＲ構築体を形質導入された免疫エフェクター細胞は、がん免疫療法に用いることができる。

Description

相互参照
本出願は、２０２２年７月２９日に提出された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２２／１０９０７７の優先権を主張し、その内容は、全体として参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、本出願と共に提出された配列表を参照により組み合わせ、該配列表は、ＸＭＬファイルフォーマットであり、「ＩＥＣ２３００７８ＰＣＴ－ｓｅｑｌ．ｘｍｌ」と題され、２０２３年７月２６日に作成され、６８，９６９バイトのサイズを有する。
１．分野
本開示は、クローディン－６を標的とする抗体（例えば、ドメイン抗体）、キメラ抗原受容体及び操作された免疫細胞、並びにそれらの使用方法の分野に関する。
２．背景
クローディン（ＣＬＤＮ）は、重要な密着結合タンパク質であり、主に内皮細胞又は上皮細胞において組織特異的に発現する（Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，１４；２２（２４）：１３４１６（２０２１）（非特許文献１）を参照されたい）。ＣＬＤＮファミリーのメンバーとして、クローディン－６（ＣＬＤＮ６）は、バリア、特に肺上皮バリア及び表皮透過性バリア（ＥＰＢ）の形成において重要な役割を果たすことが見出されている。ＣＬＤＮ６発現の変化は、様々ながんの進行に関連し、且つＣＬＤＮ６の影響を受ける腫瘍の悪性表現型は、増殖とアポトーシス、遊走と浸潤及び薬物耐性を含み、これらは、いずれもＣＬＤＮ６により媒介される重要なシグナル伝達経路によって制御されることが証明されている。ＣＬＤＮ６は、がん胎児性標的であり、それは、いくつかの固形腫瘍において高度に発現するが、正常な組織において発現しないことが証明されている（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，６１（６）：１０４３－５６（２０２１）（非特許文献２）、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．，１３（５７９）：ｅａｂｂ６２８２（２０２１）（非特許文献３）を参照されたい）。同じ発現プロファイルは、別のがん胎児性標的ＧＰＣ３において示された。本技術分野では、新たな抗クローディン－６結合剤及び免疫療法、例えば、クローディン－６を標的とするＣＡＲ－Ｔ療法が必要とされている。
Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，１４；２２（２４）：１３４１６（２０２１） Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，６１（６）：１０４３－５６（２０２１） Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．，１３（５７９）：ｅａｂｂ６２８２（２０２１）
３．概要
一態様では、本明細書は、抗クローディン－６（ＣＬＤＮ６）単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を提供し、それは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又は（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。いくつかの態様において、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、ＩＭＧＴ番号付けスキーム、ＡｂＭ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、Ｃｏｎｔａｃｔ番号付けスキーム又はそれらの組み合わせに従ってＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３を確定する。
一態様では、本明細書は、抗クローディン－６単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を提供し、それは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの態様において、本明細書による抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示す一つ又は複数のＦＲ領域をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書は、抗クローディン－６ ｓｄＡｂを提供し、それは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書は、抗クローディン－６ ｓｄＡｂを提供し、それは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
いくつかの態様において、抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、ラクダ科動物のｓｄＡｂである。いくつかの態様において、抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、ヒト化ｓｄＡｂである。
いくつかの態様において、抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、作用物質と遺伝子融合又は化学コンジュゲーションしている。
別の態様では、本明細書は、融合タンパク質を提供し、それは、本明細書による抗クローディン－６ ｓｄＡｂと、Ｆｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ）とを含む。いくつかの態様において、ヒトＩｇＧ１Ｆｃは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１～２５のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本明細書は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、それは、本明細書による抗クローディン－６ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体の細胞外抗原結合ドメインは、一つ又は複数のさらなる抗原結合ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、これらのさらなる結合ドメインのうちの少なくとも一つは、ＧＰＣ３に結合する。いくつかの態様において、さらなる抗原結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含むＶＨに示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列を含むＶＬに示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３とを含む。
いくつかの態様において、さらなる抗原結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３とを含む。
いくつかの態様において、さらなる抗原結合ドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインとを含み、該ＶＨドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、該ＶＬドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、さらなる抗原結合ドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインとを含み、該ＶＨドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含み、該ＶＬドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、さらなる抗原結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、さらなる抗原結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーを介して互いに融合している。
いくつかの態様において、ペプチドリンカーの長さは、約５０アミノ酸以下である。
いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２及びＰＤ１からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインはＣＤ８αに由来する。
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、該一次細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来する。
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ１３７に由来する。
いくつかの態様において、本明細書によるＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む。いくつかの態様において、該ヒンジドメインはＣＤ８αに由来する。
いくつかの態様において、本明細書によるＣＡＲは、ポリペプチドのＮ－末端に位置するシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、シグナルペプチドはＣＤ８αからのものである。
いくつかの態様において、本明細書は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、それは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本明細書は、核酸を提供し、それは、本明細書による抗クローディン－６ ｓｄＡｂ、融合タンパク質又はＣＡＲ、又はそれらの断片をコードする。
別の態様では、本明細書による核酸は、キメラ受容体をコードする配列をさらに含む。いくつかの態様において、キメラ受容体をコードする核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３の核酸配列を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体をコードする核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２及び４４～４５のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
別の態様では、本明細書は、ベクターを提供し、それは、本明細書による核酸を含む。
別の態様では、本明細書は、操作された免疫エフェクター細胞を提供し、それは、本明細書によるＣＡＲ、核酸及び／又はベクターを含む。いくつかの態様において、操作された免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞又はそれらの組み合わせである。
別の態様では、本明細書は、医薬組成物を提供し、それは、本明細書による抗クローディン－６ ｓｄＡｂ、核酸、ベクター又は操作された免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
別の態様では、本明細書は、対象の疾患又は障害を処置する方法を提供し、該方法は、有効量の、本明細書による抗クローディン－６ ｓｄＡｂ、操作された免疫エフェクター細胞又は医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、疾患又は障害は、クローディン－６関連疾患又は障害、及び／又はＧＰＣ３関連疾患又は障害である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、がん、例えば、固形腫瘍がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）、卵巣がん（ＯＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、類内膜がん（ＥＣ）及びＡＦＰ＋胃がん（ＡＦＰ＋ＧＣ）からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象の疾患又は障害を処置するための方法をさらに提供し、該方法は、有効量の、ＣＬＤＮ６アンタゴニストとＧＰＣ３アンタゴニストとの組み合わせ、又はＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストを、対象に投与することを含む。ＣＬＤＮ６アンタゴニスト、ＧＰＣ３アンタゴニスト及び／又はＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、複数のクラスを有することができ、例えば、アンタゴニストは、操作された受容体、操作された免疫細胞、抗体、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、アプタマー及び小分子ＲＮＡから選択されてもよい。
一態様では、ＣＬＤＮ６アンタゴニストは、ＣＬＤＮ６を特異的に標的とする操作された受容体を含む操作された免疫細胞であり、該操作された受容体は、少なくとも一つの抗ＣＬＤＮ６結合部分（例えば、本明細書による抗ＣＬＤＮ６ ｓｄＡｂ）を含む細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、ＧＰＣ３アンタゴニストは、ＧＰＣ３を特異的に標的とする操作された受容体を含む操作された免疫細胞であり、該操作された受容体は、少なくとも一つの抗ＧＰＣ３結合部分を含む細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、ＣＬＤＮ６を特異的に標的とする操作された受容体（例えば、本明細書によるＣＬＤＮ６ ＣＡＲ）及びＧＰＣ３を特異的に標的とする操作された受容体は、異なる操作された免疫細胞において発現する。これに応じて、ＣＬＤＮ６アンタゴニストとＧＰＣ３アンタゴニストとの組み合わせは、本明細書に記載のＣＬＤＮ６を特異的に標的とする操作された受容体を含む第１群の操作された免疫細胞とＧＰＣ３を特異的に標的とする操作された受容体の第２群の操作された免疫細胞との組み合わせである。
いくつかの態様において、ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、操作された免疫細胞であり、それは、ＣＬＤＮ６を特異的に標的とする第１の操作された受容体と、ＧＰＣ３を特異的に標的とする第２の操作された受容体とを含み、即ち二種類の操作された受容体は、同じ免疫細胞において共発現する。より具体的には、ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、操作された免疫細胞であり、それは、ＣＬＤＮ６を特異的に標的とする第１の操作された受容体と、ＧＰＣ３を特異的に標的とする第２の操作された受容体とを含み、ここで、（１）ＣＬＤＮ６を特異的に標的とする第１の操作された受容体は、少なくとも一つの抗ＣＬＤＮ６結合部分を含む第１の細胞外抗原結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン及び第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、且つ（２）ＧＰＣ３を特異的に標的とする第２の操作された受容体は、少なくとも一つの抗ＧＰＣ３結合部分を含む第２の細胞外抗原結合ドメイン、第２の膜貫通ドメイン及び第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、操作された免疫細胞であり、それは、ＣＬＤＮ６を標的とする第１のＣＡＲと、ＧＰＣ３を標的とする第２のＣＡＲとを含み、ここで、（１）第１のＣＡＲは、少なくとも一つの抗ＣＬＤＮ６結合部分（例えば、本明細書による抗ＣＬＤＮ６ ｓｄＡｂ）を含有する第１の細胞外抗原結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン及び第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、（２）第２のＣＡＲは、少なくとも一つの抗ＧＰＣ３結合部分を含有する第２の細胞外抗原結合ドメイン、第２の膜貫通ドメイン及び第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここで、該第１のＣＡＲと該第２のＣＡＲは、機能的に連結され、該第１のＣＡＲは、ＧＰＣ３を標的とする該第２のＣＡＲのＮ末端又はＣ末端に位置し、任意選択的に、該第１のＣＡＲは、切断可能ペプチドを介して該第２のＣＡＲに機能的に連結され、又は該第１のＣＡＲと該第２のＣＡＲは、切断可能ペプチドの切断のためには連結していない。
いくつかの態様において、ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、ＣＬＤＮ６及びＧＰＣ３を同時に標的とする操作された受容体を含む操作された免疫細胞であり、該操作された受容体は、少なくとも一つの抗ＣＬＤＮ６結合部分（例えば、本明細書による抗ＣＬＤＮ６ ｓｄＡｂ）及び少なくとも一つの抗ＧＰＣ３結合部分を含む細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、ＣＬＤＮ６及びＧＰＣ３を同時に標的とするＣＡＲ（「ＣＬＤＮ６×ＧＰＣ３二重特異性ＣＡＲ」）を含む操作された免疫細胞であり、ここで、該ＣＬＤＮ６×ＧＰＣ３特異性ＣＡＲは、（１）少なくとも一つの抗ＣＬＤＮ６結合部分及び少なくとも一つの抗ＧＰＣ３結合部分を含む細胞外抗原結合ドメイン、（２）膜貫通ドメイン及び（３）細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここで、該抗ＣＬＤＮ６結合部分は、該抗ＧＰＣ３結合部分のＮ末端又はＣ末端に位置し、任意選択的に、該抗ＣＬＤＮ６結合部分は、ＧＳリンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）３などのペプチドリンカーを介して該抗ＧＰＣ３結合部分に機能的に連結される。
いくつかの態様において、疾患又は障害は、クローディン－６関連疾患又は障害、及び／又はＧＰＣ３関連疾患又は障害である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、がん、例えば、固形腫瘍がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）、卵巣がん（ＯＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、類内膜がん（ＥＣ）及びＡＦＰ＋胃がん（ＡＦＰ＋ＧＣ）からなる群から選択される。いくつかの態様において、対象は、少なくとも一つのＣＬＤＮ６薬剤に対して耐性を有し、及び／又はここで、対象は、少なくとも一つのＧＰＣ３薬剤に対して耐性を有する。
ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ．Ｌｕｃ細胞及びＯＶ９０細胞へのキメラ抗体の結合を示した図である。 図１Ａの説明を参照。 図１Ａの説明を参照。 図１Ａの説明を参照。 図１Ａの説明を参照。 ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ．Ｌｕｃ細胞及びＯＶ９０細胞へのヒト化キメラ抗体の結合を示した図である。 図２Ａの説明を参照。 図２Ａの説明を参照。 図２Ａの説明を参照。 図２Ａの説明を参照。 異なるＣＬＤＮファミリーに対するＣＡＲ－Ｔのインビトロ細胞傷害性を示した図である。「ＵｎＴ」は、ＣＡＲを形質導入されていないＴ細胞を表す。「ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ」は、関連しない対照ＣＡＲ－Ｔとして用いられる。 図３Ａの説明を参照。 図３Ａの説明を参照。 異なるＣＬＤＮファミリーに対するＣＡＲ－ＴのＩＦＮ－γ放出を示した図である。「ＵｎＴ」は、ＣＡＲを形質導入されていないＴ細胞を表す。「ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ」は、関連しない対照ＣＡＲ－Ｔとして用いられる。 図４Ａの説明を参照。 図４Ａの説明を参照。 図４Ａの説明を参照。 ＯＶ９０．Ｌｕｃ異種移植マウスにおけるＣＬＤＮ６ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ有効性を示した図である。「ＵｎＴ」は、ＣＡＲを形質導入されていないＴ細胞を表す。 図５Ａの説明を参照。 図５Ａの説明を参照。 異なるＧＰＣ３及びＣＬＤＮ６発現レベルを有する腫瘍細胞と共培養されたＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性を示した図である。「ＵｎＴ」は、ＣＡＲを形質導入されていないＴ細胞を表す。 外因的に導入されたＴＧＦβＲ及びＩＬ２３Ｒ構築体を説明した図である。 ＯＶ９０．Ｌｕｃ細胞皮下腫瘍切片におけるＧＰＣ３及びＣＬＤＮ６の発現を示した図である。 ＯＶ９０．Ｌｕｃ異種移植マウスにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ有効性（０．２Ｍ ＣＡＲ＋／マウス）を示した図である。「ＵｎＴ」は、ＣＡＲを形質導入されていないＴ細胞を表す。 図８Ａの説明を参照。
５．詳細な説明
本開示は、クローディン－６に結合する新規抗体、クローディン－６及び／又はＧＰＣ３に結合するキメラ抗原受容体、あるいはそれらを含む及び／又はキメラ受容体を発現する操作された細胞、並びにそれらの改善された性質に、部分的に基づくものである。
５．１． 定義
本明細書に記載されるか又は参照される技術及び手順には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版 ２００１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌらによる編集，２００３）、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ａｎによる編集 ２００９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｌｂｉｔａｒによる編集 ２０１０）、及びＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ 第１巻と第２巻（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎとＤｕｂｅｌによる編集，第２版 ２０１０）に記載される広く利用されている方法など、概して当業者によって従来の方法を用いてよく理解されているもの及び／又は一般的に採用されているものが含まれる。本明細書において特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語は、当業者に一般的に理解されている意味を有する。本明細書の解釈上、以下の用語の説明が適用され、且つ任意の適切な場合に、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆も同様である。記載される用語のいずれかの説明が、参照により本明細書に援用されるいずれかの文献と矛盾する場合、以下に記載される用語の説明が優先されるべきである。
「抗体」、「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」という用語は、本明細書において同義的に使用されてもよく、最も広義に使用され、且つ具体的には、例えば、モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、完全長の又はインタクトなモノクローナル抗体を含む）、マルチエピトープ又はモノエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナル又は一価抗体、多価抗体、少なくとも二つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を呈する限り、二重特異性抗体）、一本鎖抗体及びそれらの断片（例えば、ドメイン抗体）を包含し、以下に記載のとおりである。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及び／又は親和性成熟抗体並びに他の種（例えば、マウス、ウサギ、ラマなど）からの抗体であり得る。「抗体」という用語は、免疫グロブリン系ポリペプチドにおけるＢ細胞のポリペプチド生成物を含むことが意図され、それは、特定の分子抗原に結合する能力を有し、且つ二つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、ここで各対のポリペプチド鎖は、一本の重鎖（約５０～７０ｋＤａ）と一本の軽鎖（約２５ｋＤａ）を有し、各本の鎖の各アミノ末端部分が約１００～約１３０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、且つ各本の鎖の各カルボキシ末端部分が定常領域を含む。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｅｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋによる編集，第２版 １９９５）及びＫｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第３版 １９９７）を参照されたい。抗体は、合成抗体、組換えにより産生された抗体、ラクダ科種（例えば、ラマ又はアルパカ）由来を含む抗体又はそれらのヒト化変異体、イントラボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体及び上記のいずれかの機能性断片（例えば、抗原結合断片）をさらに含むが、それらに限らず、これらの機能性断片は、抗体重鎖又は軽鎖ポリペプチドの一部を指し、該断片の由来となった抗体の結合活性の一部又は全てを保持している。機能性断片（例えば、抗原結合断片）の非限定的な例としては、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（例えば、単一特異性、二重特異性などを含む）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合により連結されるＦｖｓ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及びミニボディが挙げられる。具体的には、本明細書による抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗原結合ドメイン又は抗原に結合する抗原結合部位を含有する分子（例えば、抗体の一つ又は複数のＣＤＲ）を含む。このような抗体断片は、例えば、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓによる編集，１９９５）、Ｈｕｓｔｏｎら，１９９３，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ２２：１８９－２２４、ＰｌｕｃｋｔｈｕｎとＳｋｅｒｒａ，１９８９，Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １７８：４９７－５１５、及びＤａｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第２版 １９９０）という文献に記載されている。本明細書による抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤとＩｇＡ）又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１とＩｇＡ２）であり得る。抗体は、アゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体であり得る。抗体は、アゴニストでもアンタゴニストでもないものであり得る。
「抗原」は、抗体が選択的に結合することのできる構造である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン又は他の天然に存在する化合物もしくは合成化合物であり得る。標的抗原は、ポリペプチドであってもよい。抗原は、細胞に関連していてもよく、例えば、細胞上又は細胞中に存在する。
「インタクトな」抗体は、抗原結合部位並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む抗体である。定常領域は、ヒト定常領域又はそのアミノ酸配列変異体を含んでもよい。インタクトな抗体は、一つ又は複数のエフェクター機能を有してもよい。
「一本鎖Ｆｖ」（「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される）は、単一のポリペプチド鎖に連結されるＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、該ポリペプチドリンカーは、ｓＦｖが抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能にする。ｓＦｖに関する概説は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅによる編集，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ページ２６９～３１５（１９９４）を参照されたい。
「重鎖単独抗体」又は「ＨＣＡｂ」という用語は、機能性抗体を含み、それは、重鎖を含むが、通常４鎖抗体に見られる軽鎖を欠く。例えば、ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ又はアルパカ）は、ＨＣＡｂを産生することが知られている。
本明細書で使用される「単一ドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」は、単一のモノマー可変抗体ドメインを指し、且つ抗原に結合することができる（例えば、クローディン－６に結合する単一ドメイン抗体）。単一ドメイン抗体は、本明細書に記載のＶＨＨドメインを含む。単一ドメイン抗体の例は、例えば、ラクダ科種（例えば、ラマ）からの抗体、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、及び抗体に由来するもの以外の単一ドメイン足場などの、軽鎖を天然に欠いている抗体を含むが、それに限らない。単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン抗体）は、任意の種に由来してもよく、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ及びウシを含むが、それらに限らない。例えば、本明細書に記載されているように、単一ドメイン抗体は、ラクダ科種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコから産生された抗体に由来してもよい。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖を天然に欠いている重鎖抗体を産生することができ、このような他の種に由来するＶＨＨは、本開示の範囲内にある。いくつかの態様において、本明細書による単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の構造を有する。単一ドメイン抗体は、本明細書に記載されているように、別の分子（例えば、作用物質）と遺伝子融合又は化学コンジュゲーションすることができる。単一ドメイン抗体は、大きい結合分子（例えば、多重特異性抗体又はキメラ抗原受容体）の一部であり得る。
「結合」という用語は、分子間の相互作用を指し、例えば、複合体を形成することを含む。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用及び／又はファンデルワールス相互作用を含む非共有結合性相互作用であってもよい。複合体は、共有結合性又は非共有結合性の結合、相互作用又は力によって一体に保持された二つ以上の分子の結合をさらに含んでもよい。抗体上の単一の抗原結合部位と標的分子（例えば、抗原）の単一のエピトープとの間の全体としての非共有結合性相互作用の強度は、該エピトープに対する抗体又は機能性断片の親和性である。結合分子（例えば、抗体）と一価抗原との解離速度（ｋｏｆｆ）と会合速度（ｋｏｎ）との比率（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）は、解離定数ＫＤであり、親和性に反比例する。ＫＤ値が低いほど、抗体の親和性は高くなる。ＫＤの値は、抗体と抗原との複合体によって異なり、且つｋｏｎとｋｏｆｆに依存する。本明細書による抗体の解離定数ＫＤは、本明細書による任意の方法又は当業者に周知の任意の他の方法を用いて確定することができる。一つの結合部位における親和性が、常に抗体と抗原との間の相互作用の真の強度を反映しているとは限らない。複数の反復する抗原決定基を含有する複合抗原（例えば、多価抗原）が、複数の結合部位を含有する抗体と接触する場合、一つの部位における抗体の抗原との相互作用により、二番目の部位における反応の可能性が増加することになる。多価抗体と抗原との間のこのような複数の相互作用の強度は、アビディティと呼ばれる。
本明細書に記載される結合分子に関連して、「～に結合する」、「～に特異的に結合すること」などの用語及び類似の用語も本明細書で同義的に使用され、抗原（例えば、ポリペプチド）に特異的に結合する抗原結合ドメインの結合分子を指す。抗原に結合するか又は特異的に結合する結合分子又は抗原結合ドメインは、例えば、イムノアッセイ、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）又は当業者に周知の他の技術によって同定することができる。結合分子又は抗原結合ドメインがいかなる交差反応性抗原よりも高い親和性で抗原に結合する場合に、結合分子又は抗原結合ドメインは、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの実験技術を用いて確定したように、抗原に結合するか又は特異的に結合することができる。典型的には、特異的又は選択的反応はバックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも２倍になることになり、バックグラウンドの１０倍を超えることもあり得る。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３２－３６（Ｐａｕｌによる編集，第２版 １９８９）における結合特異性に関する考察を参照されたい。結合分子又は抗原結合ドメインが「非標的」タンパク質に結合する程度は、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析又はＲＩＡにより確定したように、結合分子又は抗原結合ドメインとその特定の標的抗原との結合の約１０％であってもよい。抗原に結合する結合分子又は抗原結合ドメインは、例えば、結合分子が、例えば、抗原を標的化する治療剤及び／又は診断剤として使用され得るように、十分な親和性で抗原に結合することができる結合分子又は抗原結合ドメインを含む。抗原に結合する結合分子又は抗原結合ドメインは、１μＭ、８００ｎＭ、６００ｎＭ、５５０ｎＭ、５００ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ又は０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有してもよい。結合分子又は抗原結合ドメインは、異なる種からの抗原で保存され得る抗原エピトープに結合する。
結合分子又は抗原結合ドメインは、「キメラ」配列を含んでもよく、ここで、重鎖及び／又は軽鎖の一部は、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である一方、鎖の残りの部分は、別の種に由来するか又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体及びこのような抗体の断片における対応する配列と同一又は相同であり、それらが所望の生物学的活性を示すものであればよい（米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎら，１９８４，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１－５５を参照されたい）。キメラ配列は、ヒト化配列を含んでもよい。
結合分子又は抗原結合ドメインは、非ヒト（例えば、ラクダ科動物、ネズミ、非ヒト霊長類動物）抗体の「ヒト化」形態の部分を含んでもよく、これらの非ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン（例えば、受容体抗体）からの配列を含み、ここで、天然ＣＤＲ残基は、所望の特異性、親和性及び能力を有するラクダ科動物、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類動物などの非ヒト種（例えば、ドナー抗体）の対応するＣＤＲからの残基に置き換えられる。ヒト免疫グロブリン配列の一つ又は複数のＦＲ領域残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられ得る。なお、ヒト化抗体は、受容体抗体又はドナー抗体で発見されていない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに改善するために行われる。ヒト化抗体重鎖又は軽鎖は、少なくとも一つ又は複数の可変領域の実質的に全てを含んでもよく、ここで、全て又は実質的に全てのＣＤＲは、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、且つ全て又は実質的に全てのＦＲは、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－２９（１９８８）、Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：５９３－９６（１９９２）、Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８９：４２８５－８９（１９９２）、米国特許第６，８００，７３８、６，７１９，９７１、６，６３９，０５５、６，４０７，２１３及び６，０５４，２９７号を参照されたい。
結合分子又は抗原結合ドメインは、「完全ヒト抗体」又は「ヒト抗体」の一部を含んでもよく、ここで、これらの用語は、本明細書で同義的に使用され、且つヒト可変領域と、例えば、ヒト定常領域とを含む抗体を指す。結合分子は、抗体配列を含んでもよい。該用語は、ヒト由来の可変領域及び定常領域を含み得る抗体を指す。「完全ヒト」抗体は、ポリペプチドに結合し、且つ核酸配列によりコードされる抗体をさらに包含してもよく、これらの核酸配列は、ヒト生殖系列免疫グロブリン核酸配列の天然に存在する体細胞変異体である。「完全ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域と定常領域を有する抗体を含み、例えば、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ公開番号９１－３２４２を参照されたい）によって記載されているとおりである。「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し及び／又はヒト抗体を製造するための技術のいずれかを用いて産生された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。ヒト抗体は、当分野の既知の様々な技術を用いて産生することができ、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１（１９９１））と酵母ディスプレイライブラリー（Ｃｈａｏら，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １：７５５－６８（２００６））を含む。ヒトモノクローナル抗体の製造にも用いられ得る方法は、Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７（１）：８６－９５（１９９１）、及びｖａｎ Ｄｉｊｋとｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５： ３６８－７４（２００１）という文献に記載されている。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してこのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効になったトランスジェニック動物（例えば、マウス）に抗原を投与することによって製造され得る（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６（５）：５６１－６６（１９９５）、ＢｒｕｇｇｅｍａｎｎとＴａｕｓｓｉｎｇ，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８（４）：４５５－５８（１９９７）、及びＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１と６，１５０，５８４号を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって産生されるヒト抗体は、さらに、例えば、Ｌｉら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０３：３５５７－６２（２００６）を参照されたい。
結合分子又は抗原結合ドメインは、「組換えヒト抗体」の一部を含んでもよく、ここで、該語句は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現した抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニック及び／又はトランスクロモソミック動物（例えば、マウス又はウシ）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ． Ｄ．ら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：６２８７－６２９５（１９９２）を参照されたい）又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングに関わる任意の他の方式によって製造、発現、産生又は単離された抗体など、組換え方式によって製造、発現、産生又は単離されたヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有し得る（Ｋａｂａｔ，Ｅ． Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ公開番号９１－３２４２を参照されたい）。しかしながら、いくつかの態様において、このような組換えヒト抗体に対してインビトロ変異誘発を行う（又は、ヒトＩｇ配列のトランスジェニック動物を用いる場合、インビボ体細胞変異誘発を行う）ため、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来してその近縁であるが、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー内に自然に存在しないものであり得る配列である。
結合分子又は抗原結合ドメインは、「モノクローナル抗体」の一部を含んでもよく、ここで、本明細書で使用される用語は、実質的に均一な抗体群から入手された抗体を指し、例えば、少量で存在し得る天然に存在する可能な突然変異又は周知の翻訳後修飾（例えば、アミノ酸異性体化又は脱アミド、メチオニン酸化又はアスパラギンもしくはグルタミン脱アミド）を除いて、該群を構成する各抗体は同一であり、各モノクローナル抗体が、通常、抗原上の単一のエピトープを識別することになる。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」は、単一のハイブリドーマ又は他の細胞により産生された抗体である。用語「モノクローナル」は、抗体を製造するための任意の特定の方法に限定されない。例えば、本開示に用いられ得るモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって製造されてもよく、又は組換えＤＮＡ方法を用いて細菌又は真核生物の動物もしくは植物細胞において製造されてもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－２８（１９９１）及びＭａｒｋｓら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１－９７（１９９１）に記載される技術を用いてファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。クローン細胞株及びそれが発現するモノクローナル抗体の他の製造方法は、当分野において周知である。例えばＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌらによる編集，第５版 ２００２）を参照されたい。
典型的な４鎖抗体単位は、二本の同一の軽（Ｌ）鎖と二本の同一の重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＧの場合に、４鎖単位は、通常、約１５０，０００ダルトンである。各本のＬ鎖は、一つの共有結合性ジスルフィド結合を介してＨ鎖に連結される一方、二本のＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに依存して一つ又は複数のジスルフィド結合を介して互いに連結される。各本のＨ鎖とＬ鎖は、規則的に間隔を置いて配置された鎖内ジスルフィド結合をさらに有する。各本のＨ鎖は、Ｎ－末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、α鎖とγ鎖のうちのそれぞれについて三つの定常ドメイン（ＣＨ）が続く一方、μアイソタイプ及びεアイソタイプについて四つのＣＨドメインが続く。各本のＬ鎖は、Ｎ－末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の境界面を形成すると考えられる。ＶＨとＶＬのペアリングは、一緒になって単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラス抗体の構造特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７１（Ｓｔｉｔｅｓらによる編集，第８版 １９９４）とＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊａｎｅｗａｙら，第５版 ２００１）を参照されたい。
用語「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」は、抗原に結合する抗体領域を指す。従来のＩｇＧは、通常、二つのＦａｂ領域を含み、各Ｆａｂ領域は、Ｙ字型ＩｇＧ構造の二つのアームの一方に存在する。各Ｆａｂ領域は、通常、重鎖と軽鎖のそれぞれの一つの可変領域及び一つの定常領域で構成される。より具体的には、Ｆａｂ領域における重鎖の可変領域及び定常領域は、ＶＨ領域及びＣＨ１領域であり、Ｆａｂ領域における軽鎖の可変領域及び定常領域は、ＶＬ領域及びＣＬ領域である。Ｆａｂ領域におけるＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬは、本開示に係る抗原結合能を付与するように様々な方法で配列され得る。例えば、従来のＩｇＧのＦａｂ領域に似ているように、ＶＨ領域及びＣＨ１領域は、一つのポリペプチド上にあってもよく、ＶＬ領域及びＣＬ領域は、単独のポリペプチドにあってもよい。代替的に、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬ領域は、以下の節でより詳細に記載されるように、全て同じポリペプチド上にあり、且つ異なる順序で配向されてもよい。
用語「可変領域」、「可変ドメイン」、「Ｖ領域」又は「Ｖドメイン」は、抗体の軽鎖又は重鎖の一部を指し、それは、通常、軽鎖又は重鎖のアミノ末端に位置し、且つ長さが重鎖で約１２０～１３０個のアミノ酸及び軽鎖で約１００～１１０個のアミノ酸であり、且つ各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性に用いられる。重鎖の可変領域は、「ＶＨ」と呼ばれてもよい。軽鎖の可変領域は、「ＶＬ」と呼ばれてもよい。用語「可変」は、抗体における可変領域のいくつかのセグメントが配列に大きな違いを呈するという事実を指す。Ｖ領域は、抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変領域の１１０個のアミノ酸範囲内に均等に分布しているわけではない。代わりに、Ｖ領域は、約１５～３０個のアミノ酸の、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、変化が小さい（例えば、相対的に変化しない）セグメントで構成され、これらのセグメントは、長さがそれぞれ約９～１２個のアミノ酸である、「超可変領域」と呼ばれる、変化が大きい（例えば、極端的に変化する）短領域によって隔てられている。重鎖と軽鎖の可変領域はそれぞれ、主にβシート構造を用いる四つのＦＲを含み、それらは、三つの超可変領域を介して連結され、この三つの超可変領域は連結されてループを形成し、且ついくつかの場合にβシート構造の一部を形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲによってごく接近して一体に保持されており、且つ他方の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（例えば、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版，１９９１）を参照されたい）。定常領域は、抗体による抗原への結合に直接的には関わらないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）への抗体の関与など、様々なエフェクター機能を呈する。可変領域は、種々の抗体間で配列が広く異なる。具体的な態様において、可変領域は、ヒト可変領域である。
用語「Ｋａｂａｔに係る可変領域残基の番号付け」又は「Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置の番号付け」及びこれらの変化形は、Ｋａｂａｔら前掲における抗体編成の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域に使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインＦＲ又はＣＤＲの短縮又は挿入に対応するより少なく又は別のアミノ酸を含有してもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、残基５２の後の単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び残基８２の後の三つ挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含んでもよい。所与の抗体の残基のＫａｂａｔ番号付けは、抗体配列と「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列との相同性領域におけるアラインメントによって確定することができる。可変ドメインにおける残基（およそ軽鎖の残基１～１０７及び重鎖の残基１～１１３）に言及する場合、通常、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（例えば、上記Ｋａｂａｔら）を用いる。免疫グロブリン重鎖定常領域における残基に言及する場合、通常、「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」（例えば、Ｋａｂａｔら前掲に報告されるＥＵインデックス）を用いる。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ １ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。他の番号付けシステムは、例えば、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃｏｎｔａｃｔ、ＩＭＧＴ及びＡＨｏｎによって記載されている。
抗体に関連して使用される時、用語「重鎖」は、約５０～７０ｋＤａのポリペプチド鎖を指し、ここで、アミノ末端部分は、約１２０～１３０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は定常領域を含む。重鎖定常領域に基づくアミノ酸配列は、定常領域が、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びミュー（μ）と称される五つの異なるタイプ（例えば、アイソタイプ）のうちの一つであり得る。別個の重鎖はサイズが異なる：α、δ及びγは約４５０個のアミノ酸を含有するが、μ及びεは約５５０個のアミノ酸を含有する。軽鎖と組み合わせになると、これらの異なるタイプの重鎖はそれぞれ、五つの周知のクラス（例えば、アイソタイプ）の抗体であるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを産生し、ＩｇＧの四つのサブクラス、即ちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。
抗体に関連して使用される時、用語「軽鎖」は、約２５ｋＤａのポリペプチド鎖を指し、ここで、アミノ末端部分は、約１００～約１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は定常領域を含む。軽鎖のおよその長さは２１１～２１７個のアミノ酸である。定常ドメインに基づくアミノ酸配列には、二つの異なるタイプが存在し、カッパ（κ）又はラムダ（λ）と称される。
本明細書で使用される用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」、「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」は、同義的に使用される。「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン（Ｉｇ又は抗体）ＶＨ β－シートフレームワークの非フレームワーク領域内の三つの超可変領域（Ｈ１、Ｈ２又はＨ３）の一つ、又は抗体ＶＬ β－シートフレームワークの非フレームワーク領域内の三つの超可変領域（Ｌ１、Ｌ２又はＬ３）の一つを指す。ＶＨドメインにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３とも称される。ＶＬドメインにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３とも称される。そのため、ＣＤＲは、フレームワーク領域配列の範囲内に散在する可変領域配列である。
ＣＤＲ領域は当業者に周知であり、且つ周知の番号付けシステムによって定義されている。例えば、Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づくものであり、最も一般的に用いられている（例えば、Ｋａｂａｔら前掲、Ｎｉｃｋ Ｄｅｓｃｈａｃｈｔら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１０； １８４：５６９６－５７０４）を参照されたい）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置を指す（例えばＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－１７（１９８７）を参照されたい）。Ｋａｂａｔの番号付け規則を用いて番号付けした時、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、Ｈ３２とＨ３４との間で変化し、これはループの長さに依存する（これは、Ｋａｂａｔの番号付けレジメンが挿入をＨ３５ＡとＨ３５Ｂに置くためであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループが３２で終わり、３５Ａのみが存在する場合、ループが３３で終わり、３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、ループが３４で終わる）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの折衷案に相当し、且つＯｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアに使用されている（例えばＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ第２巻（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎとＤｕｂｅｌによる編集，第２版，２０１０）を参照されたい）。「コンタクト」超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造に対する分析に基づく。開発され、広く採用されている別の汎用的な番号付けシステムは、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｌａｆｒａｎｃら，Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７（１）：５５－７７（２００３））である。ＩＭＧＴは、ヒト及び他の脊椎動物の免疫グロブリン（ＩＧ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に特化した総合情報システムである。本明細書では、ＣＤＲは、軽鎖又は重鎖内のアミノ酸配列及び位置を指す。免疫グロブリン可変ドメインの構造内でのＣＤＲの「位置」は種間で保存的であり、且つループと呼ばれる構造中に存在するため、構造的特徴に従い可変ドメイン配列をアラインメントする番号付けシステムを用いることにより、ＣＤＲ及びフレームワーク残基が容易に識別される。該情報は、一つの種の免疫グロブリンからのＣＤＲ残基を、通常ヒト抗体からのアクセプターフレームワークに移植し、置き換えるために用いることができる。ＨｏｎｅｇｇｅｒとＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９： ６５７－７０（２００１）は、別の番号付けシステム（ＡＨｏｎ）を開発した。例えば、Ｋａｂａｔ番号付けとＩＭＧＴ独自の番号付けシステムとを含む番号付けシステム間の対応関係は、当業者に周知である（例えば、Ｋａｂａｔ前掲、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ前掲、Ｍａｒｔｉｎ前掲、Ｌｅｆｒａｎｃら前掲を参照されたい）。これらの超可変領域又はＣＤＲからの各残基は、以下の表１に例示されている。
所与のＣＤＲの境界は、識別に用いられるレジメンに応じて異なり得る。そのため、特に指定されない限り、所与の抗体又はその領域（例えば、可変領域）の「ＣＤＲ」及び「相補性決定領域」という用語並びに抗体又はその領域の各ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２）は、上記の任意の既知のレジメンによって定義される相補性決定領域を包含すると理解されるべきである。いくつかの場合に、一つ又は複数の特定のＣＤＲを識別するためのレジメンを指定し、例えば、ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＣｏｎｔａｃｔ方法により定義されたＣＤＲである。他の場合に、ＣＤＲの特定のアミノ酸配列が与えられる。注意すべきこととして、ＣＤＲ領域は、様々な番号付けシステムの組み合わせ、例えば、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムの組み合わせ、Ｋａｂａｔ及びＡｂＭ番号付けシステムの組み合わせ又はＫａｂａｔ及びＩＭＧＴ番号付けシステムの組み合わせによって定義されてもよい。そのため、「特定のＶＨに記載されているようなＣＤＲ１」などの用語は、上記例示的なＣＤＲ番号付けシステムにより定義された任意のＣＤＲ１を含むが、それに限らない。可変領域（例えば、ＶＨ又はＶＬ）が与えられると、当業者は、該領域内のＣＤＲが種々の番号付けシステム又はその組み合わせによって定義され得ることを理解するであろう。
超可変領域は、ＶＬにおける２４－３６又は２４－３４（Ｌ１）、４６－５６又は５０－５６（Ｌ２）及び８９－９７又は８９－９６（Ｌ３）、並びにＶＨにおける２６－３５又は２６－３５Ａ（Ｈ１）、５０－６５又は４９－６５（Ｈ２）及び９３－１０２、９４－１０２又は９５－１０２（Ｈ３）などの「拡張された超可変領域」を含んでもよい。
用語「定常領域」又は「定常ドメイン」は、軽鎖と重鎖のカルボキシ末端部分を指し、それは、抗体と抗原との結合に直接的には関わらないが、様々なエフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体との相互作用を呈する。該用語は、免疫グロブリン分子の一部を指し、該免疫グロブリン分子の一部は、免疫グロブリンの他の部分、即ち可変領域と比べて、より保存的なアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列は、抗原結合部位を含有する。定常領域は、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域並びに軽鎖のＣＬ領域を含有し得る。
用語「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、ＣＤＲの両側に位置する可変領域残基を指す。ＦＲ残基は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ドメイン抗体、ダイアボディ、線形抗体及び二重特異性抗体に存在する。ＦＲ残基は、超可変領域残基又はＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書における用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ－末端領域を定義するためのものであり、例えば、天然配列Ｆｃ領域と、組換えＦｃ領域と、変異体Ｆｃ領域とを含む。免疫グロブリン重鎖Ｆｃ領域の境界は異なる可能性があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０位置のアミノ酸残基からそのカルボキシ末端まで広がると定義される。Ｆｃ領域のＣ－末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の産生又は精製中、又は抗体の重鎖をコードする核酸に対して組換えてエンジニアリングを行うことによって除去され得る。そのため、インタクトな抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群及びＫ４４７残基を含む抗体とそれを含まない抗体との混合物を有する抗体群を含んでもよい。「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、貪食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御などが挙げられる。このようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域を結合領域又は結合ドメイン（例えば、抗体可変領域又はドメイン）と組み合わせる必要があり、且つ当業者に周知の様々なアッセイを用いて評価することができる。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも一つのアミノ酸修飾（例えば、置換、付加又は欠失）のために天然配列Ｆｃ領域と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比べて少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、例えば、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域に約１～約１０個のアミノ酸置換、又は約１～約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書の変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域との少なくとも約８０％の相同性、又はそれと少なくとも約９０％の相同性、例えば、それと少なくとも約９５％の相同性を有してもよい。
本明細書で使用される「エピトープ」は、当分野における用語であり、且つ結合分子（例えば、抗体）が特異的結合できる抗原の局所的領域を指す。エピトープは、線形エピトープ又は立体構造的、非線形的もしくは不連続的エピトープであってもよい。ポリペプチド抗原の場合に、例えば、エピトープは、ポリペプチドの連続したアミノ酸であってもよく（「線形」エピトープ）、又はエピトープは、ポリペプチドの二つ又はそれ以上の非連続領域からのアミノ酸を含んでもよい（「立体的」、「非線形的」又は「不連続的」エピトープ）。当業者によれば、一般に、線状エピトープは、二次、三次又は四次構造に依存することも又はしないこともあると理解されるであろう。例えば、結合分子は、天然の三次元タンパク質構造に折り畳まれているか否かに関係なく、１群のアミノ酸に結合することができる。結合分子は、エピトープを識別して結合するために、エピトープを構成するアミノ酸残基が特定の立体配座（例えば、屈曲、ねじれ、旋回又は折り畳み）を呈する必要がある。
ペプチド、ポリペプチド又は抗体配列の「パーセント（％）配列同一性」及び「相同性」は、最大配列同一性パーセントを実現するために配列アラインメント及び必要な場合にギャップを導入し、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮されない時、候補配列における、特定のペプチド又はポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同じであるアミノ酸残基のパーセントとして定義される。所属分野の技術の範囲内にある様々な方式により、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて、アラインメントを実現してアミノ酸配列同一性パーセントを確定することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大限のアラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含め、アラインメントの測定に適切なパラメータを確定することができる。
「特異性」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ又は抗体）による抗原の特定のエピトープに対する選択的識別を指す。例えば、天然抗体は、単一特異的である。本明細書で使用される「多重特異性」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ又は抗体）が二つ又はそれ以上の抗原結合部位を有することを示し、ここで、少なくとも二つが異なる抗原に結合する。本明細書で使用される「二重特異性」は、抗原結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ又は抗体）が二つの異なる抗原結合特異性を有することを示す。本明細書で使用される「単一特異性」ＣＡＲは、一つ又は複数の結合部位を有する抗原結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ又は抗体）を示し、各結合部位が同じ抗原に結合する。
本明細書で使用される「価」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ又は抗体）に所定の数の結合部位が存在することを示す。例えば、天然抗体又は全長抗体は、二つの結合部位を有し、且つ二価である。このように、「三価」、「四価」、「五価」及び「六価」という用語は、それぞれ、抗原結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ又は抗体）に二つの結合部位、三つの結合部位、四つの結合部位、五つの結合部位及び六つの結合部位が存在することを表す。
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、一つ又は複数の抗原をＴ細胞などの免疫エフェクター細胞に特異的に移植するために用いることができる遺伝子操作された受容体を指す。いくつかのＣＡＲは、「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」又は「キメラ免疫受容体」とも呼ばれる。ＣＡＲは、一つ又は複数の抗原（例えば、腫瘍抗原）に特異的な細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞及び／又は他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよい。「ＣＡＲ－Ｔ細胞」は、ＣＡＲを発現するＴ細胞を指す。
用語「ポリペプチド」及び「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書で同義的に使用され、且つ任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖又は分岐鎖であってもよく、それは、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、且つ非アミノ酸によって分断され得る。これらの用語は、既に天然に修飾されたか又は介入によって修飾されたアミノ酸ポリマーをさらに包含する。例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化又は任意の他の操作又は修飾である。該定義は、例えば、一つ又は複数のアミノ酸類似体を含有するポリペプチドをさらに含み、非天然アミノ酸及び当分野の既知の他の修飾を含むが、それらに限らない。理解すべきこととして、本開示のポリペプチドが抗体又は免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーに基づいてもよいため、例えば、「ポリペプチド」は、一本鎖又は二本以上の会合した鎖として存在し得る。
本明細書で同義的に使用されるように、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、且つＤＮＡとＲＮＡとを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼ又は合成反応によってポリマーに取り込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチド及びその類似体を含んでもよい。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、短く、通常一本鎖であり、合成されたポリヌクレオチドを指し、その長さが、通常（必ずしもそうとは限らない）約２００個のヌクレオチド未満である。用語「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」とは、互いに排他的というわけではない。ポリヌクレオチドについての上記の説明は、オリゴヌクレオチドにも等しく全面的に適用可能である。本開示の結合分子を産生する細胞は、親ハイブリドーマ細胞、並びに抗体をコードする核酸が導入された細菌及び真核宿主細胞を含んでもよい。特に指定のない限り、本明細書に開示される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’方向と称される。５’から３’への新生ＲＮＡ転写物の付加方向は転写方向と称される。ＤＮＡ鎖においてＲＮＡ転写物と同じ配列を有する、ＲＮＡ転写物の５’末端より５’側にある配列領域は、「上流配列」と称され、ＤＮＡ鎖においてＲＮＡ転写物と同じ配列を有する、ＲＮＡ転写物の３’末端より３’側にある配列領域は、「下流配列」と称される。
「単離された核酸」は、天然配列に天然に付随する他のゲノムＤＮＡ配列並びにリボソーム及びポリメラーゼなどのタンパク質又は複合体と実質的に分離されている核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ又は核酸混合物）である。「単離された」核酸分子は、核酸分子の天然の供給源に存在する他の核酸分子と分離されている核酸分子である。なお、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技術によって産生される場合、他の細胞物質又は培地を実質的に含まなくてもよいか、又は化学的に合成される場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。本明細書に記載の抗体をコードする一つ又は複数の核酸分子は、単離又は精製され得る。該用語は、その天然に存在する環境から除去された核酸配列を含み、且つ組換え又はクローニングされたＤＮＡ単離物及び化学的に合成された類似体又は異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な分子は、該分子の単離された形態を含んでもよい。具体的には、本明細書に記載の、ＣＡＲ又は抗体をコードする「単離された」核酸分子は、少なくとも一つの汚染物の核酸分子から同定され単離された核酸分子であり、該核酸分子は、通常、それが産生された環境において該少なくとも一つの汚染物の核酸分子と会合する。
別段の説明がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮退形態を呈し、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句は、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかの形態において一つ又は複数のイントロンを含有し得る程度で、イントロンをさらに含んでもよい。
用語「制御配列」は、特定の宿主生物において、機能的に連結されたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適用される制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択的なオペロン配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
本明細書で使用される「機能的に連結される」という用語及び同様の語句（例えば、遺伝的に融合される）は、核酸又はアミノ酸を指すために用いられる場合、それぞれ核酸配列又はアミノ酸配列の操作可能な連結を指し、それらは互いに機能的関係に置かれている。例えば、プロモーター、エンハンサーエレメント、オープンリーディングフレーム、５’及び３’ＵＴＲ並びにターミネーター配列が作動可能に連結されると、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）の正確な産生が起こる。機能的に連結された核酸エレメントは、オープンリーディングフレームの転写を引き起こし、最終的にポリペプチドの産生（即ち、オープンリーディングフレームの発現）を引き起こし得る。別の例として、作動可能に連結されたペプチドは、その機能ドメインが互いに適切な距離に置かれており、各ドメインに所期の機能を付与するペプチドである。
「ベクター」という用語は、核酸配列を宿主細胞に導入するように、例えば、本明細書に記載の結合分子（例えば、抗体）をコードする核酸配列を含む核酸配列を担持するか又は含むための物質を指す。適用可能なベクターは、例えば、発現ベクター、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム及び人工染色体を含み、それは、選択配列、又は宿主細胞染色体に安定的に組込むことができる標識を含んでもよい。なお、ベクターは、一つ又は複数の選択的標識遺伝子と適切な発現制御配列とを含んでもよい。含まれる選択的標識遺伝子は、例えば、抗生物質又は毒素に対する耐性を提供し、栄養欠乏を補充するか又は培地中にない重要栄養素を供給する。発現制御配列は、当分野に周知の構成型及び誘導型プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含んでもよい。二つ又はそれ以上の核酸分子を共発現させようとする時（例えば、抗体重鎖及び軽鎖又は抗体ＶＨ及びＶＬ）、二つの核酸分子を、例えば、単一の発現ベクター又は単独の発現ベクターに挿入してもよい。単一のベクター発現について、コード核酸は、一つの共通の発現制御配列に機能的に連結されるか、又は異なる発現制御配列、例えば、一つの誘導型プロモーター及び一つの構成型プロモーターに連結され得る。宿主細胞への核酸分子の導入は、当分野に周知の方法を用いて確認することができる。これらの方法は、例えば、ｍＲＮＡのＮｏｒｔｈｅｒｎブロット又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの核酸分析、遺伝子生成物の発現に用いられる免疫ブロット又は導入された核酸配列もしくはそれに対応する遺伝子生成物の発現を試験する他の適切な分析方法を含む。当業者は、核酸分子が所望の生成物を産生するのに十分な量で発現されていることを理解し、さらに、当分野に周知の方法で発現レベルを最適化して十分な発現を得ることができることを理解すべきである。
本明細書で使用される用語「宿主」は、動物、例えば、哺乳類（例えば、ヒト）を指す。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、核酸分子でトランスフェクトされ得る特定の標的細胞及びこのような細胞の子孫又は潜在的な子孫を指す。このような細胞の子孫は、次世代に起こり得る突然変異もしくは環境の影響又は宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組込みが原因で、核酸分子でトランスフェクトされる親細胞と同じではないこともある。
本明細書で使用される用語「自家」は、同じ個体に由来する任意の材料を指し、ここで、該材料が後に該個体に再導入される。
「同種異系」は、同じ種の異なる個体に由来する移植片を指す。
本明細書で使用される「トランスフェクトした」又は「形質転換した」又は「形質導入した」という用語は、外来核酸を宿主細胞に転移又は導入するプロセスを指す。「トランスフェクトした」又は「形質転換した」又は「形質導入した」細胞は、外因性核酸を用いて、トランスフェクト、形質転換又は形質導入した細胞である。該細胞は、初代標的細胞及びその子孫を含む。
本明細書で使用される「薬学的に許容可能」という用語は、連邦もしくは州政府の規制当局によって承認され、又は米国薬局方、欧州薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方においてリストされて動物、より具体的にはヒトに使用することを意味する。
「賦形剤」は、液体又は固体の充填剤、希釈剤、溶媒又はカプセル化材料などの薬学的に許容される材料、組成物又はビヒクルを指す。賦形剤としては、例えば、カプセル化材料又は添加剤、例えば、吸収促進剤、酸化防止剤、接着剤、緩衝液、キャリア剤、コーティング剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、香味剤、保湿剤、潤滑剤、香料、防腐剤、噴射剤、離型剤、滅菌剤、甘味剤、可溶化剤、湿潤剤及びそれらの混合物が挙げられる。用語「賦形剤」はさらに、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全又は不完全））又はビヒクルを指してもよい。
賦形剤は、薬学的に許容可能な賦形剤であってもよい。薬学的に許容可能な賦形剤の例としては、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝液、アスコルビン酸を含む酸化防止剤、低分子量（例えば、約１０個のアミノ酸残基未満）のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール類、ナトリウムなどの塩形成性対イオン、及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。薬学的に許容可能な賦形剤の他の例は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎとＧｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版，１９９０）に記載されている。
各成分は、医薬製剤の他の成分と適合性があるという意味で「薬学的に許容可能」であってもよく、且つ合理的なリスク対効果比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性又は他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒト及び動物の組織又は臓器と接触するのに適している。例えば、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ： Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５； Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，第６版； Ｒｏｗｅらによる編集、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ： ２００９； Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，第３版、ＡｓｈとＡｓｈによる編集、Ｇｏｗｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ： ２００７、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，第２版、Ｇｉｂｓｏｎによる編集、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ： Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００９を参照されたい。薬学的に許容可能な賦形剤は、用いられる投与量及び濃度で、それに曝露される細胞又は哺乳類にとって非毒性であり得る。薬学的に許容可能な賦形剤は、水性ｐＨ緩衝溶液であってもよい。
賦形剤は、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成供給源のものを含む油及び水などの無菌の液体であってもよい。組成物（例えば、医薬組成物）が静脈内投与される時、水は例示的賦形剤である。生理食塩水溶液、グルコース水溶液及びグリセリン溶液も液体賦形剤として、特に注射用溶液に用いることができる。賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、エチレングリコール、水、エタノールなどをさらに含んでもよい。該組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝剤をさらに含んでもよい。組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。経口組成物は、製剤を含み、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な賦形剤を含んでもよい。
薬物化合物を含む組成物は、例えば、単離又は精製の形態の結合分子（例えば、抗体）及び好適な量の賦形剤を含んでもよい。
本明細書で使用される「有効量」又は「治療有効量」という用語は、抗体又は作用物質及び本明細書による抗体もしくは医薬組成物を含む治療用分子の、所望の結果をもたらすのに十分な量を指す。
用語「対象」と「患者」は、同義的に使用され得る。本明細書で使用される対象は、非霊長類動物又は霊長類動物（例えば、ヒト）などの哺乳類であってもよい。対象は、ヒトであってもよい。対象は、疾患又は障害に罹患していると診断される哺乳類、例えば、ヒトであってもよい。代替的に、対象は、疾患又は障害が進行するリスクがある哺乳類、例えば、ヒトであってもよい。
「投与」は、例えば、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内送達及び／又は本明細書に記載されるもしくは当分野に周知の任意の他の物理的送達方法により、体外に存在する物質を患者の体内に注射するか又は他の方式で物理的に送達する行為を指す。
本明細書で使用される「処置する（ｔｒｅａｔ）」「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、一つ又は複数の療法の投与による疾患又は病態の進行、重症度及び／又は持続時間を低減又は改善することを指す。処置は、患者が潜在的状態を依然として有している可能性があるにもかかわらず、患者の改善が観察されるように、潜在的病態に関連する一つ又は複数の症状が低減されているか、寛解されているか及び／又は緩和されているか否かを評価することによって確定され得る。用語「処置すること」は、疾患の制御及び改善を含む。「制御する（ｍａｎａｇｅ）」「制御（ｍａｎａｇｉｎｇ）」「制御すること（ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）」という用語は、対象が、必ずしも疾患の治癒をもたらすとは限らない療法から得た有益な効果を指す。
「アンタゴニスト」という用語は、標的抗原の生理的作用又は標的抗原媒介性シグナル伝達経路を干渉又は抑制する物質を指す。当分野では様々なタイプのアンタゴニストが既知であり、操作された免疫細胞、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの操作された受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞抗原カップリング剤（ＴＡＣ）又はその一部、抗体、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、アプタマー、小分子ＲＮＡ及び化学化合物阻害剤を含むが、それらに限らない。
本明細書で使用される「ＣＬＤＮ６アンタゴニストとＧＰＣ３アンタゴニストとの組み合わせ」という用語は、抗ＣＬＤＮ６に特異的に拮抗するがＧＰＣ３に拮抗しない第１の物質と、ＧＰＣ３に特異的に拮抗するがＣＬＤＮ６に拮抗しない第２の物質との組み合わせを指す。第１の物質と第２の物質は、分離してもよいし、連結、融合又は複合化してもよい。ＣＬＤＮ６アンタゴニストは、ＣＬＤＮ６に結合するがＧＰＣ３に結合しない細胞外抗原結合ドメインを有する第１のＣＡＲであってもよく、且つＧＰＣ３アンタゴニストは、ＧＰＣ３に結合するがＣＬＤＮ６に結合しない細胞外抗原結合ドメインを有する第２のＣＡＲであってもよく、第１のＣＡＲと第２のＣＡＲは、個別のポリペプチドであってもよく、又は同じ鎖で一緒に連結されてもよい。ＣＬＤＮ６アンタゴニストは、ＣＬＤＮ６に結合するがＧＰＣ３に結合しないＣＡＲを発現する第１群の操作された免疫細胞であってもよく、且つＧＰＣ３アンタゴニストは、ＧＰＣ３に結合するがＣＬＤＮ６に結合しないＣＡＲを発現する第２群の操作された免疫細胞であってもよい。第１の物質と第２の物質が、両物質の拮抗能力を保持する新たな分子として連結又は融合し得る場合、該新たな分子は、「ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニスト」と見なされ得る。
本明細書で使用される「ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニスト」という用語は、ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３の両方に拮抗する能力を有する物質を指す。ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３に結合できる細胞外抗原結合ドメインを有するＣＡＲであってもよい。ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３に結合できる細胞外抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する操作された免疫細胞であってもよい。ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、第１のＣＡＲと第２のＣＡＲを発現する操作された免疫細胞であってもよく、該第１のＣＡＲは、ＣＬＤＮ６に結合するがＧＰＣ３に結合しない細胞外抗原結合ドメインを有し、該第２のＣＡＲは、ＧＰＣ３に結合するがＣＬＤＮ６に結合しない細胞外抗原結合ドメインを有する。ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、また抗ＣＬＤＮ６×ＧＰＣ３抗体であってもよい。
「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」及び「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、疾患、障害、病態又は関連する症状（例えば、糖尿病又はがん）が発生（又は再発）する可能性を低減することを指す。
本明細書で使用されるがんの進行を「遅延」させるとは、疾患の進行を遅らせ、抑制し、減速させ、延ばし、安定させ及び／又は遅くすることを指す。この遅延は、疾患の歴史及び／又は処置される個体に応じて、異なる時間長を有してもよい。当業者には明らかなこととして、該個体が該疾患に罹患していないため、十分又は有意な遅延は、実際的には、予防を含んでもよい。該方法を用いない場合に比べて、がんの進行を「遅延」させる方法は、所与の時間範囲内で疾患進行の確率を低減し、及び／又は所与の時間範囲内で疾患の程度を低減する方法である。このような比較は、通常、統計学的に有意な数の個体を使用した臨床試験に基づく。がんの進行は、標準的な方法を用いて検出することができ、これらの標準的な方法は、コンピュータ体軸断層撮影（ＣＡＴスキャン）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、腹部超音波検査、凝固検査、動脈造影法又は生検を含むが、それらに限らない。進行は、最初に検出不能であり得るがんの進行を指してもよく、且つ発生、再発及び発作を含む。
本明細書で使用される「クローディン－６関連疾患又は障害」は、クローディン－６がその中で発現するか又は異常に発現（例えば、過剰発現）する細胞又は組織を含む疾患又は障害を指す。クローディン－６関連疾患又は障害は、クローディン－６がそれにおいて異常に発現する細胞を含んでもよい。クローディン－６関連疾患又は障害は、その中又はそれにおけるクローディン－６の少なくとも一つの活性が欠如している細胞を含んでもよい。いくつかの態様において、クローディン－６関連疾患又は障害は、がん、例えば、固形腫瘍がんである。
本明細書で使用される「ＧＰＣ３関連疾患又は障害」は、ＧＰＣ３がその中で発現又は過剰発現する細胞又は組織を含む疾患又は障害を指す。ＧＰＣ３関連疾患又は障害は、ＧＰＣ３がそれにおいて異常に発現する細胞を含んでもよい。ＧＰＣ３関連疾患又は障害は、その中又はそれにおけるＧＰＣ３の少なくとも一つの活性が欠如している細胞を含んでもよい。いくつかの態様において、ＧＰＣ３関連疾患又は障害は、がん、例えば、固形腫瘍がんである。
用語「約」及び「大約」は、所定値又は範囲から２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内又はそれ未満を指す。
本開示及び請求項で使用されるように、単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」及び「該（ｔｈｅ）」は、文脈において明確に記載されていない限り、複数形を含む。
理解すべきこととして、本明細書のいずれかの部分において用語「含む」で態様を説明し、「からなる」及び／又は「実質的にからなる」で説明された類似した態様も提供する。さらに理解すべきこととして、本明細書のいずれかの部分において語句「実質的にからなる」で態様を説明し、「からなる」で説明された類似した態様も提供する。
語句「ＡとＢとの間」又は「Ａ～Ｂの間」で使用される用語「～の間」は、ＡとＢを含む範囲を指す。
本明細書において「Ａ及び／又はＢ」などの語句で使用される用語「及び／又は」は、ＡとＢ、Ａ又はＢ、Ａ（単独）、及びＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」などの語句で使用される用語「及び／又は」は、Ａ、Ｂ及びＣ、Ａ、Ｂ又はＣ、Ａ又はＣ、Ａ又はＢ、Ｂ又はＣ、Ａ及びＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、並びにＣ（単独）の態様のうちの各々を含むことが意図される。
５．２． 単一ドメイン抗体
５．２．１． 結合クローディン－６の単一ドメイン抗体
一態様では、本明細書は、クローディン－６に結合できる単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン）を提供する。
いくつかの態様において、本明細書による単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン）は、ヒトクローディン－６に結合する。ＣＬＤＮ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ５６７４７）発達において密着結合の形成に関与する４回膜貫通タンパク質である。
本明細書による抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、一つ又は複数のクローディン－６の活性を調節することができる。いくつかの態様において、本明細書による抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、アンタゴニスト抗体である。
本明細書による抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８ Ｍ又はそれ未満、例えば、１０－８ Ｍ～１０－１３ Ｍ、例えば、１０－９ Ｍ～１０－１３ Ｍ）の解離定数（ＫＤ）でクローディン－６（例えば、ヒトクローディン－６）に結合することができる。結合親和性を測定する複数の方法は当分野で既知のものであり、そのいずれの方法も本開示の目的のために使用することができ、ＲＩＡによる、例えば、目的抗体のＦａｂ形態及びその抗原を用いた（Ｃｈｅｎら，１９９９，Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３：８６５－８１）もの、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によるもの、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）による、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｒｅｄ９６システムを用いたもの、又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）による、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－２０００又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－３０００を用いたものを含む。「会合速度」又は「ｋｏｎ」も、上記同じバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｒｅｄ９６、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－２０００又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－３０００システムを用いて測定することができる。
いくつかの態様において、本明細書による抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ＶＨＨドメインである。本明細書による例示的ＶＨＨドメインは、以下の第６のセクションに記載のように産生され、且つこれらのＶＨＨドメインは、７７ＬＩＣＮＢ０１、７７ＬＩＣＮＢ０２、７７ＬＩＣＮＢ０３、７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ１及び７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ２と称される。
そのため、いくつかの態様において、本明細書による単一ドメイン抗体は、７７ＬＩＣＮＢ０１、７７ＬＩＣＮＢ０２、７７ＬＩＣＮＢ０３、７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ１及び７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ２のうちのいずれか一つの一つ又は複数のＣＤＲ配列を含む。いくつかの態様において、本明細書は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という構造を含む、クローディン－６に結合する単一ドメイン抗体を提供し、ここで、ＣＤＲ配列は、７７ＬＩＣＮＢ０１、７７ＬＩＣＮＢ０２、７７ＬＩＣＮＢ０３、７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ１及び７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ２におけるそれらから選択される。
いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列の一つ、二つ又は全ての三つのＣＤＲを含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列の一つ、二つ又は全ての三つのＣＤＲを含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列の一つ、二つ又は全ての三つのＣＤＲを含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列の一つ、二つ又は全ての三つのＣＤＲを含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列の一つ、二つ又は全ての三つのＣＤＲを含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物からのものである。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ヒト化したものである。抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、レシピエントヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークを含んでもよい。
いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１を有し、該ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＣＤＲ１のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ２を有し、該ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＣＤＲ２のアミノ酸配列を有する。他の態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有し、該ＣＤＲ１及びＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ１及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。ＣＤＲ配列は、周知の番号付けシステムに従って確定することができる。いくつかの態様において、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。いくつかの態様において、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。いくつかの態様において、ＡｂＭ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。他の態様において、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。他の態様において、Ｃｏｎｔａｃｔ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。ＣＤＲは、上記任意の番号付けスキームの組み合わせに従って確定することができる。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物からのものである。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ヒト化したものである。抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、レシピエントヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークを含んでもよい。
いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１を有し、該ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣＤＲ１のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ２を有し、該ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣＤＲ２のアミノ酸配列を有する。他の態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有し、該ＣＤＲ１及びＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ１及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。ＣＤＲ配列は、周知の番号付けシステムに従って確定することができる。いくつかの態様において、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。いくつかの態様において、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。いくつかの態様において、ＡｂＭ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。他の態様において、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。他の態様において、Ｃｏｎｔａｃｔ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。ＣＤＲは、上記任意の番号付けスキームの組み合わせに従って確定することができる。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物からのものである。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ヒト化したものである。抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、レシピエントヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークを含む。
いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１を有し、該ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すＣＤＲ１のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ２を有し、該ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すＣＤＲ２のアミノ酸配列を有する。他の態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有し、該ＣＤＲ１及びＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ１及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。ＣＤＲ配列は、周知の番号付けシステムに従って確定することができる。いくつかの態様において、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。いくつかの態様において、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。いくつかの態様において、ＡｂＭ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。他の態様において、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。他の態様において、Ｃｏｎｔａｃｔ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。ＣＤＲは、上記任意の番号付けスキームの組み合わせに従って確定することができる。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物からのものである。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ヒト化したものである。抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、レシピエントヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークを含む。
いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１を有し、該ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すＣＤＲ１のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ２を有し、該ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すＣＤＲ２のアミノ酸配列を有する。他の態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有し、該ＣＤＲ１及びＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ１及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。ＣＤＲ配列は、周知の番号付けシステムに従って確定することができる。いくつかの態様において、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。いくつかの態様において、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。いくつかの態様において、ＡｂＭ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。他の態様において、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。ＣＤＲは、上記任意の番号付けスキームの組み合わせに従って確定することができる。他の態様において、ＣＤＲはＣｏｎｔａｃｔに従って番号付けられる。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物からのものである。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ヒト化したものである。抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、レシピエントヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークを含む。
いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１を有し、該ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すＣＤＲ１のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ２を有し、該ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すＣＤＲ２のアミノ酸配列を有する。他の態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有し、該ＣＤＲ１及びＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ１及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有し、該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。ＣＤＲ配列は、周知の番号付けシステムに従って確定することができる。いくつかの態様において、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。いくつかの態様において、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。いくつかの態様において、ＡｂＭ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。他の態様において、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。他の態様において、Ｃｏｎｔａｃｔ番号付けスキームに従ってＣＤＲを確定する。ＣＤＲは、上記任意の番号付けスキームの組み合わせに従って確定することができる。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物からのものである。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ヒト化したものである。抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、レシピエントヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークを含む。
いくつかの態様において、本明細書は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という構造を含む、クローディン－６に結合する単一ドメイン抗体を提供し、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含み、及び／又は（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物からのものである。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ヒト化したものである。抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、レシピエントヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークを含んでもよい。
他の態様において、本明細書は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という構造を含む、クローディン－６に結合する単一ドメイン抗体を提供し、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物からのものである。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ヒト化したものである。抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、レシピエントヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークを含んでもよい。
いくつかの態様において、ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、且つＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物からのものである。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ヒト化したものである。抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、レシピエントヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークを含んでもよい。
いくつかの態様において、ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含み、且つＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物からのものである。いくつかの態様において、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ヒト化したものである。抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、レシピエントヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークを含んでもよい。
いくつかの態様において、単一ドメイン抗体は、７７ＬＩＣＮＢ０１、７７ＬＩＣＮＢ０２、７７ＬＩＣＮＢ０３、７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ１及び／又は７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ２の一つ又は複数のフレームワーク領域をさらに含む。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の配列を含むＶＨＨドメインに由来する一つ又は複数のフレームワークを含む。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の配列を含むＶＨＨドメインに由来する一つ又は複数のフレームワークを含む。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の配列を含むＶＨＨドメインに由来する一つ又は複数のフレームワークを含む。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の配列を含むＶＨＨドメインに由来する一つ又は複数のフレームワークを含む。いくつかの態様において、単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の配列を含むＶＨＨドメインに由来する一つ又は複数のフレームワークを含む。
いくつかの態様において、本明細書による単一ドメイン抗体は、ヒト化単一ドメイン抗体である。ヒト化単一ドメイン抗体は、以下のセクション６に例示される方法又は以下のセクションに記載される方法を使用して生成され得る。
本明細書に記載のフレームワーク領域は、ＣＤＲ番号付けシステムの境界に従って確定される。換言すれば、ＣＤＲが、例えば、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａにより確定される場合、フレームワーク領域は、可変領域においてＮ末端からＣ末端への形でＣＤＲを取り囲むアミノ酸残基である：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。例えば、ＦＲ１は、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、ＡｂＭ番号付けシステム、ＩＭＧＴ番号付けシステム又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムにより定義されるＣＤＲ１アミノ酸残基のＮ末端のアミノ酸残基として定義され、ＦＲ２は、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、ＡｂＭ番号付けシステム、ＩＭＧＴ番号付けシステム又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムにより定義されるＣＤＲ１とＣＤＲ２アミノ酸残基の間のアミノ酸残基として定義され、ＦＲ３は、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、ＡｂＭ番号付けシステム、ＩＭＧＴ番号付けシステム又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムにより定義されるＣＤＲ２とＣＤＲ３アミノ酸残基の間のアミノ酸残基として定義され、且つＦＲ４は、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、ＡｂＭ番号付けシステム、ＩＭＧＴ番号付けシステム又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムにより定義されるＣＤＲ３アミノ酸残基のＣ末端のアミノ酸残基として定義される。
いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗クローディン－６単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗クローディン－６単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗クローディン－６単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗クローディン－６単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗クローディン－６単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片は、抗体７７ＬＩＣＮＢ０１、７７ＬＩＣＮＢ０２、７７ＬＩＣＮＢ０３、７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ１及び７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ２のうちのいずれか一つに対して一定のパーセント同一性を有するアミノ酸配列を含む。
二つの配列（例えば、アミノ酸配列又は核酸配列）の間の同一性パーセントは、数学的アルゴリズムを用いて確定することができる。二つの配列を比較するための数学的アルゴリズムの非限定的例は、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：２２６４ ２２６８（１９９０）のアルゴリズムであり、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：５８７３ ５８７７（１９９３）に修正された。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３（１９９０）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれている。本明細書に記載の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、例えば、スコア＝１００、ワード長さ＝１２であるＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータセットを用いて、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施してもよい。本明細書に記載のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、例えば、スコア５０、ワード長さ＝３であるＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータセットを用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施してもよい。比較目的のためのギャップありアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９ ３４０２（１９９７）に記載されたＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを使用することができる。代替的に、ＰＳＩ ＢＬＡＳＴは、分子間の距離関係を検出する反復検索（Ｉｄ．）に用いられてもよい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合、（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴの）対応するプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ワールドワイドウェブのアメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）を使用することができる。配列を比較するための数学的アルゴリズムの別の非限定的例は、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７（１９９８）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれており、該プログラムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である。ＡＬＩＧＮプログラムを用いてアミノ酸配列の比較を行う場合、ＰＡＭ１２０重み残基テーブルを用いることができ、ギャップ長ペナルティは１２であり、ギャップペナルティは４である。ギャップが許容されるか又は許容されない場合、上記技術と同様の技術を用いて二つの配列の間のパーセント同一性を確定することができる。パーセント同一性を計算する場合、通常、完全一致のみが計算される。
いくつかの態様において、ＶＨＨドメインを含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体を提供し、該ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するもののうちのいずれか一つである。いくつかの態様において、少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するもののうちのいずれか一つのＶＨＨ配列は、参照配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、該配列を含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、クローディン－６に結合する能力を保持する。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～１１から選択されるアミノ酸配列において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。いくつかの態様において、置換、挿入又は欠失は、ＣＤＲ以外の領域（即ちＦＲ）で起こる。任意選択的に、抗クローディン－６単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～１１から選択されるアミノ酸配列を含み、該配列の翻訳後修飾を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、ここで、該単一ドメイン抗体はクローディン－６に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、ここで、該単一ドメイン抗体はクローディン－６に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、ここで、該単一ドメイン抗体はクローディン－６に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、ここで、該単一ドメイン抗体はクローディン－６に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、ここで、該単一ドメイン抗体はクローディン－６に結合する。
例えば、アラニンスキャニングを組み合わせることによって機能性エピトープをプロットして、クローディン－６タンパク質における本明細書による抗クローディン－６単一ドメイン抗体との相互作用に必要なアミノ酸を同定することができる。クローディン－６に結合する抗クローディン－６単一ドメイン抗体の立体配座及び結晶体構造を用いてエピトープを同定することができる。本開示は、本明細書による任意の抗クローディン－６単一ドメイン抗体と同じエピトープに特異的に結合する抗体を提供することができる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合することができる抗体が提供される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合することができる抗体が提供される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合することができる抗体が提供される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合することができる抗体が提供される。
いくつかの態様において、本明細書は、本明細書に記載のいずれか一つの抗クローディン－６単一ドメイン抗体と競合的に、クローディン－６に特異的に結合する抗クローディン－６抗体又はその抗原結合断片を提供する。競合的結合は、ＥＬＩＳＡアッセイによって確定することができる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体と競合的に、クローディン－６に特異的に結合する抗体を提供することができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体と競合的に、クローディン－６に特異的に結合する抗体を提供することができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体と競合的に、クローディン－６に特異的に結合する抗体を提供することができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体と競合的に、クローディン－６に特異的に結合する抗体を提供することができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む抗クローディン－６単一ドメイン抗体と競合的に、クローディン－６に特異的に結合する抗体を提供することができる。
いくつかの態様において、本明細書は、上記抗クローディン－６単一ドメイン抗体のうちのいずれか一つを含むクローディン－６結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、クローディン－６結合タンパク質は、モノクローナル抗体であり、ラクダ科動物の、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む。いくつかの態様において、抗クローディン－６抗体は、抗体断片、例えば、ＶＨＨ断片である。いくつかの態様において、抗クローディン－６抗体は、任意の抗体クラス又はアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）のＦｃ領域を含む重鎖のみの全長抗体である。Ｆｃ領域は、低下したか又は最小化されたエフェクター機能を有してもよい。いくつかの態様において、クローディン－６結合タンパク質は、本明細書による抗クローディン－６単一ドメイン抗体を含む融合タンパク質である。クローディン－６結合タンパク質は、本明細書による抗クローディン－６単一ドメイン抗体を含む多重特異性抗体であってもよい。他の例示的クローディン－６結合分子は、以下のセクションでより詳しく説明される。
いくつかの態様において、任意の上記態様による抗クローディン－６抗体（例えば、抗クローディン－６単一ドメイン抗体）又は抗原結合タンパク質は、以下の第５．２．２～５．２．７セクションに記載されているように、単独又は組み合わせて、任意の特徴を含んでもよい。
５．２．２．ヒト化単一ドメイン抗体
本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、ヒト化単一ドメイン抗体を含む。ラクダ科種からの単一ドメイン抗体をヒト化するための一般的な戦略は、記載されており（例えば、Ｖｉｎｃｋｅら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２８４（５）：３２７３－３２８４（２００９）を参照されたい）、且つ本明細書に開示されるヒト化ＶＨＨドメインを産生に用いることができる。ラクダ科種からのヒト化単一ドメイン抗体の設計は、ＶＨＨにおける標識残基、例えば、残基１１、３７、４４、４５及び４７（Ｋａｂａｔに従って番号付けされた残基）を含んでもよい（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ７４：２７７－３０２（２００１））。
ヒト化抗体、例えば、本明細書に開示されるヒト化単一ドメイン抗体は、当分野の既知の様々な技術を用いて産生することができ、ＣＤＲ移植（欧州特許第ＥＰ ２３９，４００号、国際公開番号ＷＯ ９１／０９９６７、及び米国特許第５，２２５，５３９、５，５３０，１０１及び５，５８５，０８９号）、ベニヤリング又は再現化（欧州特許第ＥＰ ５９２，１０６及びＥＰ ５１９，５９６号、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９－４９８（１９９１）、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５－８１４（１９９４）、及びＲｏｇｕｓｋａら，ＰＮＡＳ ９１：９６９－９７３（１９９４））、鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２）、及び例えば、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、ＷＯ ９３１７１０５、Ｔａｎら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９：１１１９ ２５（２００２）、Ｃａｌｄａｓら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １３（５）：３５３－６０（２０００）、Ｍｏｒｅａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０（３）：２６７ ７９（２０００）、Ｂａｃａら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２（１６）：１０６７８－８４（１９９７）、Ｒｏｇｕｓｋａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ９（１０）：８９５ ９０４（１９９６）、Ｃｏｕｔｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５（２３ Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ－ ５９７７ｓ（１９９５）、Ｃｏｕｔｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５（８）：１７１７－２２（１９９５）、Ｓａｎｄｈｕ ＪＳ，Ｇｅｎｅ １５０（２）：４０９－１０（１９９４）とＰｅｄｅｒｓｅｎらＪ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３５（３）：９５９－７３（１９９４）に開示される技術を含むが、それらに限らない。さらに、米国特許第ＵＳ ２００５／００４２６６４ Ａ１号（２００５年２月２４日）を参照されたく、そのうちの各々は、全体として参照により本明細書に組込まれる。
いくつかの態様において、本明細書による単一ドメイン抗体は、クローディン－６（ヒトクローディン－６を含む）に結合するヒト化単一ドメイン抗体であってもよい。例えば、本開示のヒト化一本鎖抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７－１１に示す一つ又は複数のＣＤＲを含んでもよい。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法は、当分野の既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト由来から導入された一つ又は複数のアミノ酸残基を有してもよい。これらの非ヒトアミノ酸残基は、通常、「インポート」残基と呼ばれ、これらの残基は、典型的に、「インポート」可変ドメインから取られる。例えば、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－２７（１９８８）及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－３６（１９８８）の方法に従って、超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによってヒト化を行うことができる。以下の第６のセクションに記載されるように、本明細書による単一ドメイン抗体のヒト化を行う。
いくつかの場合に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植により構築され、ここで、親非ヒト抗体のＣＤＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体フレームワークに移植される。例えば、Ｐａｄｌａｎらは、抗原に実際に接触するのがＣＤＲ中の残基の約三分の一のみであることを明らかにし、これらを「特異性決定残基」又はＳＤＲ（Ｐａｄｌａｎら，ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９：１３３－３９（１９９５））と呼んだ。ＳＤＲ移植技術において、ＳＤＲ残基のみがヒト抗体フレームワークに移植される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）を参照されたい）。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を製造するためのヒト可変ドメインの選択が重要となり得る。例えば、いわゆる「最良適合」方法により、周知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対して非抗体の可変ドメインの配列をスクリーニングする。非ヒト抗体に最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワークとして選択してもよい（Ｓｉｍｓら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：２２９６－３０８（１９９３）及びＣｈｏｔｈｉａら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－１７（１９８７））。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体に用いることができる（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４２８５－８９（１９９２）及びＰｒｅｓｔａら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：２６２３－３２（１９９３））。いくつかの場合に、フレームワークは、最も豊富なヒトサブクラスＶＬ６サブグループＩ（ＶＬ６Ｉ）及びＶＨサブグループＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）のコンセンサス配列に由来する。別の方法では、ヒト生殖系列遺伝子は、フレームワーク領域の供給源として用いられる。
ＣＤＲの比較に基づく代替的なパラダイムでは、超ヒト化と呼ばれ、ＦＲの相同性は無関係である。該方法は、非ヒト配列を機能的ヒト生殖系列遺伝子レパートリーと比較することを含む。そして、マウス配列と同じ又は近縁のカノニカル構造をコードする遺伝子を選択する。続いて、非ヒト抗体とカノニカル構造を共有する遺伝子において、ＣＤＲ内で最も高い相同性を有する遺伝子をＦＲドナーとして選択する。最後、非ヒトＣＤＲをこれらのＦＲに移植する（例えば、Ｔａｎら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９：１１１９－２５（２００２）を参照されたい）。
通常、抗原に対するその親和性及び他の有利に作用する生物学的特性を保持するために抗体をヒト化することが望ましい。該目標を実現するために、一つの方法によれば、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いて親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を分析する方法によってヒト化抗体を製造する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に入手可能であり、且つ当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の三次元立体配座構造を説明し表示するコンピュータプログラムを得ることができる。これらは、例えば、ＷＡＭ（ＷｈｉｔｅｌｅｇｇとＲｅｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １３：８１９－２４（２００２））、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ（ＳａｌｉとＢｌｕｎｄｅｌｌ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３４：７７９－８１５（１９９３））及びＳｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒ（ＧｕｅｘとＰｅｉｔｓｃｈ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：２７１４－２３（１９９７））を含む。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な作用の分析、例えば、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このように、受容体及びインポート配列からＦＲ残基を選択し組み合わせることによって、一つ又は複数の標的抗原に対する親和性の増加などの、必要な抗体特徴を得ることができる。通常、抗原結合に影響を与える点では、超可変領域残基は直接且つ最も顕著に関与する。
別の抗体ヒト化方法は、Ｈｕｍａｎ Ｓｔｒｉｎｇ Ｃｏｎｔｅｎｔ（ＨＳＣ）と呼ばれる抗体ヒト化度の計量に基づく。該方法は、マウス配列をヒト生殖系列遺伝子レパートリーと比較し、その差異をＨＳＣとしてスコア化する。そして、グローバル同一性測定を用いるのではなく、そのＨＳＣを最大にすることによって、標的配列をヒト化して、複数の異なるヒト化変異体を産生する（Ｌａｚａｒら，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４４：１９８６－９８（２００７））。
上記方法に加えて、ヒト化抗体を産生し選択するために経験的方法も使用され得る。これらの方法は、ヒト化変異体の大規模ライブラリーの作成及びエンリッチメント技術又はハイスループットスクリーニング技術を用いた最適なクローンの選択に基づく方法を含む。抗体変異体は、ファージ、リボソーム及び酵母ディスプレイライブラリーから並びに細菌コロニースクリーニングにより単離され得る（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３：１１０５－１６（２００５）、Ｄｕｆｎｅｒら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２４：５２３－２９（２００６）、Ｆｅｌｄｈａｕｓら，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２１：１６３－７０（２００３）、及びＳｃｈｌａｐｓｃｈｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ． １７：８４７－６０（２００４）を参照されたい）。
ＦＲライブラリー方法において、ＦＲ内の特定の位置に一纏まりの残基変異体を導入し、そしてライブラリーのスクリーニングにより、移植されたＣＤＲを最良に支持するＦＲを選択する。置換対象残基は、ＣＤＲ構造に寄与する可能性があると同定される「バーニア」残基の一部又は全部（例えば、ＦｏｏｔｅとＷｉｎｔｅｒ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：４８７－９９（１９９２）を参照されたい）、又はＢａｃａらＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１０６７８－８４（１９９７）の同定からのより限定的な１群の標的残基を含んでもよい。
ＦＲシャッフリングにおいて、ＦＲ全体は、選択された残基変異体のコンビナトリアルライブラリーを作成することなく、非ヒトＣＤＲと組み合わせる（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）を参照されたい）。ワンステップＦＲシャッフリングプロセスを用いてもよい。このような方法は、得られた抗体が、増強した発現、増加した親和性及び熱安定性を含む、改善された生物化学的及び物理化学的特性を示すため、有効であることが証明される（例えば、Ｄａｍｓｃｈｒｏｄｅｒら，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４４：３０４９－６０（２００７）を参照されたい）。
「ヒューマニアリング」（ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ）方法は、必須の最小特異性決定基（ＭＳＤ）の実験的同定に基づき、ヒトＦＲライブラリーへの非ヒト断片の逐次置き換え及び結合の評価に基づく。該方法は、通常、エピトープが、異なるヒトＶセグメントＣＤＲを有する複数のサブクラスからの抗体を保持し同定することを引き起こす。
「ヒトエンジニアリング」（ｈｕｍａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）方法は、抗体のアミノ酸配列に対して特異性改変を行って非ヒト抗体又は抗体断片を改変することによって、ヒトにおいて低下した免疫原性を有する修飾された抗体を産生することに関し、該修飾された抗体は、元の非ヒト抗体の必要な結合特性を依然として保持している。通常、該技術は、非ヒト抗体のアミノ酸残基を「低リスク」、「中間リスク」又は「高リスク」残基に分類することに関する。分類は、全体的リスク／リターン計算を用いて行われ、該計算は、特定の置換（例えば、ヒトの免疫原性に対する）の予測利益、及び置換が得られた抗体の折り畳みに影響を及ぼすリスクを評価する。非ヒト抗体可変領域からのアミノ酸配列を、特定又はコンセンサスヒト抗体配列の対応する領域とアラインメントすることにより、非ヒト抗体配列の所与の位置（例えば、低リスク又は中間リスク）において置換されることになる特定のヒトアミノ酸残基を選択することができる。非ヒト配列における低リスク又は中間リスク位置のアミノ酸残基は、アラインメントによりヒト抗体配列における対応する残基を置換することができる。ヒトエンジニアリングタンパク質を製造するための技術は、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５－１４（１９９４）、米国特許第５，７６６，８８６、５，７７０，１９６、５，８２１，１２３及び５，８６９，６１９号、及びＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１１７９４に記載されている。
複合ヒト抗体は、例えば、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）技術（Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて産生され得る。複合ヒト抗体を産生するために、Ｔ細胞エピトープを回避するように複数のヒト抗体可変領域配列の断片から可変領域配列を設計することによって、得られた抗体の免疫原性を最小限する。
脱免疫化抗体は、その中のＴ細胞エピトープが除去された抗体である。脱免疫化抗体を製造する方法が記載されている。例えば、Ｊｏｎｅｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ５２５：４０５－２３（２００９），ｘｉｖ及びＤｅ Ｇｒｏｏｔら，Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４４：１４８－１５３（２００６）を参照されたい。脱免疫化抗体は、Ｔ細胞エピトープが欠失している可変領域及びヒト定常領域を含む。簡単に説明すると、抗体の可変領域をクローニングし、続いてＴ細胞増殖アッセイにおいて抗体可変領域に由来するオーバーラップペプチドを試験することによってＴ細胞エピトープを同定する。コンピュータ方法によってＴ細胞エピトープを同定してヒトＭＨＣ ＩＩクラスに結合するペプチドを同定する。可変領域に突然変異を導入してヒトＭＨＣ クラスＩＩとの結合を除去する。そして、突然変異した可変領域を用いて脱免疫化抗体を産生する。
５．２．３． 単一ドメイン抗体変異体
いくつかの態様において、本明細書に記載の、クローディン－６に結合する単一ドメイン抗体の一つ又は複数のアミノ酸配列修飾を考慮した。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性の最適化が必要とされる場合があり、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、低下した免疫原性又は溶解性を含むが、それらに限らない。そのため、本明細書に記載の、クローディン－６に結合する単一ドメイン抗体に加えて、本明細書に記載の、クローディン－６に結合する単一ドメイン抗体の変異体を製造することも期待される。例えば、適切なヌクレオチド変化をコードＤＮＡに導入するか及び／又は所望の抗体又はポリペプチドを合成することによって単一ドメイン抗体変異体を製造することができる。アミノ酸の改変は、単一ドメイン抗体の翻訳後プロセスを変化させ得ることが当業者に理解される。
化学修飾
いくつかの態様において、本明細書による単一ドメイン抗体は、化学修飾されたものであり、例えば、任意のタイプの分子を介して単一ドメイン抗体に共有結合した。抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質の加水分解及び切断、細胞リガンド又は他のタンパク質との連結又は一つ又は複数の免疫グロブリンドメイン（例えば、Ｆｃ又はＦｃの一部）とのコンジュゲーションによって既に化学修飾された抗体を含んでもよい。複数の化学修飾のうちのいずれか一つは、既知の技術によって行うことができ、特異的化学的切断、アセチル化、製剤化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、それらに限らない。また、抗体は、一つ又は複数の非古典的なアミノ酸を含有してもよい。
本明細書による抗体を改変して、抗体のグリコシル化程度を増加又は低下させることができる。アミノ酸配列を改変して一つ又は複数のグリコシル化部位を産生又は除去することによって、抗体グリコシル化部位の付加又は欠失を容易に実現することができる。
本明細書による単一ドメイン抗体がＦｃ領域と融合する場合、それに連結する炭水化物を改変してもよい。哺乳類細胞から産生された天然抗体は、通常、分岐型バイ接触角オリゴ糖を含み、該分岐型バイ接触角オリゴ糖は、通常、Ｎ結合を介してＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に連結される。例えば、ＷｒｉｇｈｔらＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトースとびシアル酸、及びバイ接触角オリゴ糖構造の「ステム」においてＧｌｃＮＡｃに連結されるフコースを含んでもよい。本明細書による結合分子におけるオリゴ糖に対して修飾を行って、いくつかの改善した特性を有する変異体を産生することができる。
他の態様において、本明細書による単一ドメイン抗体がＦｃ領域と融合する場合、本明細書による抗体変異体は、前記Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）連結されるフコースを欠く炭水化物構造を有し得る。例えば、このような抗体におけるフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％又は２０％～４０％であってもよい。フコースの量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定された、Ａｓｎ２９７に連結される全ての糖構造（例えば、複合体化、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対するＡｓｎ ２９７位置の糖鎖におけるフコースの平均量を計算することによって確定され、例えば、ＷＯ ２００８／０７７５４６に記載のとおりである。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中の約位置２９７（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号）に位置するアスパラギン残基を指し、しかしながら、抗体における微小な配列変化のため、Ａｓｎ２９７は、位置２９７の上流又は下流約±３個のアミノ酸、即ち位置２９４と位置３００との間に位置する場合もある。このようなフコシル化変異体は、改善したＡＤＣＣ機能を有してもよい。例えば、米国特許公開番号ＵＳ ２００３／０１５７１０８及びＵＳ ２００４／００９３６２１を参照されたい。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関わる刊行物の例として、ＵＳ ２００３／０１５７１０８、ＷＯ ２０００／６１７３９、ＷＯ ２００１／２９２４６、ＵＳ ２００３／０１１５６１４、ＵＳ ２００２／０１６４３２８、ＵＳ ２００４／００９３６２１、ＵＳ ２００４／０１３２１４０、ＵＳ ２００４／０１１０７０４、ＵＳ ２００４／０１１０２８２、ＵＳ ２００４／０１０９８６５、ＷＯ ２００３／０８５１１９、ＷＯ ２００３／０８４５７０、ＷＯ ２００５／０３５５８６、ＷＯ ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、ＯｋａｚａｋｉらＪ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３６：１２３９－１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ－ＯｈｎｕｋｉらＢｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８７： ６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生できる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化欠損型Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（ＲｉｐｋａらＡｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２４９：５３３－５４５（１９８６）、米国特許出願番号ＵＳ ２００３／０１５７１０８、及びＷＯ ２００４／０５６３１２、特に例１１）、及びノックアウト細胞株、例えば、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－ＯｈｎｕｋｉらＢｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８７： ６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）、及びＷＯ ２００３／０８５１０７を参照されたい）が挙げられる。
本明細書による単一ドメイン抗体を含む結合分子は、等分されるオリゴ糖がさらに提供され、例えば、ここで、Ｆｃ領域に接続されるバイ接触角オリゴ糖はＧｌｃＮＡｃにより等分される。このような変異体は、減少したフコシル化及び／又は改善したＡＤＣＣ機能を有してもよい。このような変異体の例は、例えば、ＷＯ ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔら）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）及びＵＳ ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に連結されるオリゴ糖に少なくとも一つのガラクトース残基がある変異体をさらに提供する。このような変異体は、改善したＣＤＣ機能を有してもよい。このような変異体は、例えば、ＷＯ １９９７／３００８７、ＷＯ １９９８／５８９６４及びＷＯ １９９９／２２７６４に記載されている。
本発明の単一ドメイン抗体とＦｃ領域を含む分子において、一つ又は複数のアミノ酸修飾をＦｃ領域に導入することによって、Ｆｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、一つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）が含まれるヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでもよい。
本出願では、いくつかの（全てではない）エフェクター機能を有する変異体が考慮され、これらの機能により、該抗体変異体は、応用に適する望ましい候補となり、これらの応用において、結合分子のインビボ半減期が重要であるが、いくつかのエフェクター機能（例えば、補体及びＡＤＣＣ）は、必要でないか又は有害である。インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイを行うことによって、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行うことにより、結合分子がＦｃγＲ結合能を有しない（したがってＡＤＣＣ活性を欠く可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能を保持できることを保証することができる。米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．らＰｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照されたい）とＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）、５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照されたい）では、目的分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例が記載されている。代替的に、非放射性アッセイ方法を用いてもよく、例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とを含む。代替的に又は付加的に、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されたような動物モデルにおいて、目的分子のＡＤＣＣ活性を評価してもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイを行うことにより、抗体がＣ１ｑに結合できず、且つそのためＣＤＣ活性を欠くことを確認することができる。例えば、ＷＯ ２００６／０２９８７９とＷＯ ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑとＣ３ｃとの結合のＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．とＭ．Ｊ． Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。当分野の既知の方法で、ＦｃＲｎ結合とインビボクリアランス／半減期確定を行ってもよい（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら，Ｉｎｔ’ｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照されたい）。
低下したエフェクター機能を有する結合分子は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの一つ又は複数を置換する抗体（米国特許第６，７３７，０５６）を含む。このようなＦｃ突然変異体は、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７における二つ又はそれ以上のものを置換するＦｃ突然変異体を含み、残基２６５及び２９７がアラニン置換される、「ＤＡＮＡ」と称されるＦｃ突然変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ＦｃＲへの結合性が向上又は低下したいくつかの変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ ２００４／０５６３１２及びＳｈｉｅｌｄｓら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ９（２）： ６５９１－６６０４（２００１）を参照されたい）。
変異体は、一つ又は複数のアミノ酸の置換を有するＦｃ領域を含んでもよく、これらの置換（例えば、Ｆｃ領域内の位置２９８、３３３及び／又は３３４にある置換（残基のＥＵ番号））は、ＡＤＣＣを改善する。Ｆｃ領域内に改変が発生してもよく、それによりＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の改変（即ち、向上又は低下）を引き起こし、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ ９９／５１６４２及びＩｄｕｓｏｇｉｅら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４： ４１７８－４１８４（２０００）に記載のとおりである。
延長した半減期と新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との改善した結合を有する結合分子（それは、母体ＩｇＧの胎児への転移を担当する（Ｇｕｙｅｒら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：２４９（１９９４）））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１に記載されている（Ｈｉｎｔｏｎら）。それらの分子は、一つ又は複数のアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含み、ここで、これらの置換は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合を改善した。このようなＦｃ変異体は、２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４という一つ又は複数のＦｃ領域残基において置換を有するもの、例えば、Ｆｃ領域残基４３４を置換するものを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。さらにＤｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＦｃ領域変異体の他の例に関わるＷＯ ９４／２９３５１を参照されたい。
システインエンジニアリング抗体の産生を必要とする可能性があり、ここで、抗体の一つ又は複数の残基は、システイン残基によって置換される。置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在し得る。システインを用いてそれらの残基を置換することで、反応性チオール基は、抗体のアクセス可能な部位に位置決めされ、且つ本明細書にさらに記載されるように、抗体を他の部分、例えば、薬物部分又はリンカー－薬物部分にコンジュゲートして、免疫コンジュゲートを産生するために用いられてもよい。
置換、欠失又は挿入
変異は、単一ドメイン抗体又はポリペプチドをコードする一つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよく、元の抗体又はポリペプチドに対するアミノ酸配列の改変を引き起こす。置換変異誘発の目的部位は、ＣＤＲとＦＲとを含む。
アミノ酸置換は、セリンでロイシンを置き換えるように、似ている構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸でアミノ酸を置き換えた結果であってもよく、例えば、保存的アミノ酸の置き換えであってもよい。当業者に周知の標準的技術は、本明細書による分子コードするヌクレオチド配列に突然変異を導入するために用いられてもよく、例えば、アミノ酸置換を引き起こす部位特異的変異誘発とＰＣＲ媒介性変異誘発とを含む。挿入又は欠失は、任意選択的に、約１～５個のアミノ酸の範囲内であってもよい。置換、欠失又は挿入は、元の分子に対して２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換又は２個未満のアミノ酸置換を含んでもよい。置換は、一つ又は複数の予測された非必須アミノ酸残基において行われた保存的アミノ酸置換であってもよい。許容される変化は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に行い、且つ得られた変異体の親抗体が示す活性を試験することによって確定することができる。
アミノ酸配列の挿入は、長さが一つの残基から複数の残基を含有するポリペプチドの範囲内にあるアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合と、単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入とを含む。末端挿入の例としては、Ｎ－末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。
本開示は、保存的アミノ酸置換により生成された単一ドメイン抗体を含む。保存的アミノ酸置換において、アミノ酸残基は、似ている電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基に置換される。上記のように、当分野では、似ている電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーが定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。代替的に、突然変異は、全て又は一部のコード配列に沿って、例えば、飽和変異誘発によって、ランダムに導入されてもよく、且つ得られた突然変異体の生物学的活性をスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。変異誘発後、コードされたタンパク質を発現することができ、且つタンパク質の活性を確定することができる。特性を保持するか又は著しく変えないために、保存的（例えば、似ている特性及び／又は側鎖を有するアミノ酸群内で）置換を行ってもよい。例示的置換は、以下の表２に示されている。
アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に基づいてグループ分けすることができる（例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７３－７５（第２版 １９７５）を参照されたい）：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、及び（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。代替的に、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及び（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。例えば、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防止するために、単一ドメイン抗体の正確な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基は、例えば、アラニン又はセリンなどの別のアミノ酸で置換されてもよい。非保存的置換は、これらのクラスにおける一つのメンバーを別のクラスに交換する必要がある。
置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一つ又は複数の超可変領域残基の置換に係る。通常、さらなる研究に用いられる、一つ又は複数の得られた変異体を選択し、親抗体に対して、いくつかの生物学的特性（例えば、増加した親和性、低下した免疫原性）で修飾（例えば、改善）し、及び／又は、親抗体のいくつかの生物学的特性を実質的に保持する。例示的置換型変異体は、例えば、ファージディスプレイに基づく親和性成熟技術（例えば、本明細書に記載のそれらの技術）で容易に生成できる親和性成熟抗体である。簡単に説明すると、一つ又は複数のＣＤＲ残基は突然変異し、且つ変異体抗体は、ファージにディスプレイし、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）をスクリーニングする。
ＣＤＲにおいて改変（例えば、置換）を行って、例えば、抗体親和性を改善することができる。このような改変は、ＣＤＲ「ホットポイント」、即ち体細胞成熟過程期間に高頻度で突然変異したコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０７：１７９－１９６（２００８）を参照されたい）及び／又はＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）において行われてもよく、ここで、得られた変異体抗体又はその断片の結合親和性を試験する。二次ライブラリーからの構築及び再選択による親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎらによる編集，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの場合に、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング又はオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発）のうちの任意の方法によって、多様性を成熟のために選択された可変遺伝子に導入する。そして、二次ライブラリーを作成する。そして、ライブラリーをスクリーニングし、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入する別の方法は、ＣＤＲガイド方法に関し、ここで、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６個の残基）はランダム化された。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングによって特異的に同定することができる。以下のセクションでは、親和性成熟に関するより詳しい説明が提供される。
このような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、置換、挿入又は欠失は、一つ又は複数のＣＤＲ内に発生してもよい。例えば、ＣＤＲにおいて、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書による保存的置換）を行ってもよい。本明細書による変異体ＶＨＨ配列のいくつかの態様において、各ＣＤＲは、改変されていないものであるか又は一つ、二つ又は三つ以下のアミノ酸置換を含有するものである。
ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５（１９８９）に記載のように、標的変異誘発を行うことができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法において、標的残基の残基又は残基群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）を用いて置換を行うことで、抗体と抗原の相互作用が影響を受けたか否かを確定する。アミノ酸の位置に別の置換を導入することで、初期置換に対する機能的感受性を実証することができる。代替的に、又は付加的に、抗原－抗体複合体の結晶構造を確定して抗体と抗原との間の接触点を同定することができる。このような接触残基及び隣接残基は、置換候補物として標的化されるか又は除去され得る。変異体は、所望の特性を含むか否かを確定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列の挿入は、長さが一つの残基から百個又はそれ以上の残基を含むポリペプチドの範囲内にあるアミノ末端及び／又はカルボキシ末端の融合と、単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入とを含む。末端挿入の例としては、Ｎ－末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のＮ末端又はＣ末端を、抗原結合ドメイン抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）又はポリペプチドと融合させることを含む。
変化は、オリゴヌクレオチド媒介性（部位特異的）変異誘発、アラニンスキャニング及びＰＣＲ変異誘発などの当分野の既知の方法を用いて行ってもよい。単一ドメイン抗体変異体ＤＮＡを産生するために、クローニングされたＤＮＡに対して、部位特異的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２３７：１－７（１９８６）及びＺｏｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：６４８７－５００（１９８２）を参照されたい）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら，Ｇｅｎｅ ３４：３１５－２３（１９８５）を参照されたい）又は他の既知の技術を行ってもよい。
５．２．４． インビトロでの親和性成熟
親抗体に比べて、親和性、安定性又は発現レベルなどの改善した特性を有する抗体変異体は、インビトロでの親和性成熟によって製造され得る。天然プロトタイプと同様に、インビトロでの親和性成熟は、突然変異及び選択の原理に基づいている。抗体ライブラリーは、生物（例えば、ファージ、細菌、酵母又は哺乳類細胞）の表面にディスプレイするか、又はそのコードｍＲＮＡ又はＤＮＡと（例えば、共有結合的又は非共有結合的に）会合する。ディスプレイされた抗体の親和性の選択は、抗体をコードする遺伝子情報を有する生物又は複合体の単離を許容する。ファージディスプレイなどのディスプレイ方法を用いた２ラウンド又は３ラウンドの突然変異及び選択は、通常、親和性が低いナノモル範囲内にある抗体断片を産生する。親和性成熟された抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する可能性がある。
ファージディスプレイは、抗体をディスプレイし選択するための一般的な方法である。抗体は、ファージコートタンパク質との融合体としてＦｄ又はＭ１３ファージの表面にディスプレイされる。選択は、抗原に曝露してファージディスプレイを可能にする抗体のそれらの標的への結合に関し、該プロセスは「パニング」と呼ばれる。抗原に結合するファージは、回収され、細菌に感染させてさらなるラウンドの選択のためのファージを産生するために用いられる。概説について、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １７８：１－３７（２００２）及びＢｒａｄｂｕｒｙとＭａｒｋｓ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０：２９－４９（２００４）を参照されたい。
酵母ディスプレイ系（例えば、Ｂｏｄｅｒら，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １５：５５３－５７（１９９７）及びＣｈａｏら，Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １：７５５－６８（２００６）を参照されたい）では、抗体は、酵母レクチンタンパク質Ａｇａ２ｐの接着サブユニットと融合することができ、該接着サブユニットは、Ａｇａ１ｐとのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に連結される。Ａｇａ２ｐディスプレイタンパク質により、タンパク質を細胞表面から突出させることによって、酵母細胞壁上の他の分子との潜在的な相互作用を最小化する。磁気分離とフローサイトメトリーは、ライブラリーをスクリーニングして、改善した親和性又は安定性を有する抗体を選択するために用いられる。ビオチン化抗原及び蛍光団にコンジュゲートする第２の試薬、例えば、ストレプトアビジンで酵母を標識して、目的可溶性抗原との結合を測定する。一本鎖抗体の両側に位置するヘマグルチニン又はｃ－Ｍｙｃエピトープタグ（例えば、ｓｃＦｖ）の免疫蛍光標識によって抗体表面の発現の変化を測定する。発現は、ディスプレイされたタンパク質の安定性に関連することが示され、且つそのため、抗体を選択して安定性及び親和性を向上させることができる（例えば、Ｓｈｕｓｔａら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９２：９４９－５６（１９９９）を参照されたい）。酵母ディスプレイの別の利点は、小胞体シャペロン及び品質管理機序を利用し、ディスプレイされたタンパク質が真核酵母細胞の小胞体において折り畳まれることである。成熟が完了すると、抗体親和性は、容易に「滴定」すると共に、酵母表面にディスプレイすることができ、それにより各クローンを発現し精製する必要がなくなる。酵母表面ディスプレイの理論上の制限は、他のディスプレイ方法よりも小さい可能性のあるファンクションディスプレイサイズであり、しかしながら、最近の方法では、酵母細胞の交配系を用いてサイズが約１０１４である組み合わせ多様性を産生する（例えば、米国特許公開２００３／０１８６３７４及びＢｌａｉｓｅら，Ｇｅｎｅ ３４２：２１１－１８（２００４）を参照されたい）。
リボソームディスプレイにおいて、抗体－リボソーム－ｍＲＮＡ（ＡＲＭ）複合体を産生して、無細胞系での選択に用いる。特定の抗体ライブラリーをコードするＤＮＡライブラリーは、終結コドンを欠くスペーサー配列遺伝子と融合する。該スペーサー配列は、翻訳時に依然としてペプチドｔＲＮＡに連結され、リボソームチャネルを占有することにより、目的タンパク質をリボソームから突出させ、折り畳ませる。得られたｍＲＮＡ、リボソーム及びタンパク質の複合体は、表面が結合するリガンドと結合することにより、リガンドとの親和により抗体及びそのコードｍＲＮＡを捕捉すると共に単離することを可能にする。そしてリボソームが結合するｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、そして変異誘発を行って、次のラウンドの選択に用いることができる（例えば、Ｆｕｋｕｄａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３４：ｅ１２７（２００６）を参照されたい）。ｍＲＮＡディスプレイでは、ピューロマイシンをアダプター分子として用いて抗体とｍＲＮＡとの間で共有結合を確立する（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８：３７５０－５５（２００１））。
これらの方法は完全にインビトロで行われるため、他の選択技術に比べて優れている二つの主な利点を提供する。第１に、ライブラリーの多様性は、細菌細胞の形質転換効率に制限されず、試験管に存在するリボソーム及び異なるｍＲＮＡ分子の数のみに制限される。第２に、どのような多様化ステップの後にもライブラリーを形質転換する必要がないため、各ラウンドの選択後に、ランダムな突然変異を、例えば、非校正ポリメラーゼにより容易に導入することができる。
哺乳類ディスプレイ系を用いてもよい。
標的方式又はランダム導入により、多様性を抗体ライブラリーのＣＤＲに導入することもできる。前の方法は、高レベル又は低レベルの変異誘発により抗体の全てのＣＤＲを順に標的とするか、もしくは体細胞超突然変異の単離されたホットポイントを標的とすること（例えば、Ｈｏら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０：６０７－１７（２００５）を参照されたい）、又は実験もしくは又は構造的理由に基づいて、親和性に影響を与える残基を疑うことを含む。また、ＤＮＡシャッフリング又は類似の技術により天然な多様化領域を置き換えることによって多様性を導入してもよい（例えば、Ｌｕら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８：４３４９６－５０７（２００３）、米国特許第５，５６５，３３２と６，９８９，２５０号を参照されたい）。代替的技術は、フレームワーク領域残基まで延びる高可変ループを標的とし（例えば、Ｂｏｎｄら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３４８：６９９－７０９（２００５）を参照されたい）、ＣＤＲにおいて、ループ欠失及び挿入を使用するか、又はハイブリダイゼーションに基づく多様化を使用する（例えば、米国特許公開番号２００４／０００５７０９を参照されたい）。ＣＤＲにおいて多様性を産生する他の方法は、例えば、米国特許第７，９８５，８４０号に開示されている。抗体ライブラリーの生成及び／又は抗体親和性成熟に用いられ得る別の方法は、例えば、米国特許第８，６８５，８９７と８，６０３，９３０号及び米国公開番号２０１４／０１７０７０５、２０１４／００９４３９２、２０１２／００２８３０１、２０１１／０１８３８５５と２００９／００７５３７８に開示されており、それらは、それぞれ参照により本明細書に組込まれる。
ライブラリーのスクリーニングは、当分野に既知の様々な技術により完成され得る。例えば、単一ドメイン抗体は、固体支持体、カラム、針又はセルロース／ポリ（ビニリデンフルオライド）膜／他のフィルタに固定化し、吸着プレートに付着した宿主細胞において発現するか又は細胞選別に用いるか、又はビオチンとコンジュゲートして、ストレプトアビジンで被覆されるビーズで捕捉するか、又は任意の他の方法に用いられてディスプレイライブラリーをパニングすることができる。
インビトロでの親和性成熟の方法に関する概説は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１０５－１６（２００５）、ＱｕｉｒｏｚとＳｉｎｃｌａｉｒ，Ｒｅｖｉｓｔａ Ｉｎｇｅｎｅｒｉａ Ｂｉｏｍｅｄｉａ ４：３９－５１（２０１０）、及びそれらの参考文献を参照されたい。
５．２．５． 単一ドメイン抗体の修飾
単一ドメイン抗体の共有結合修飾は、本開示の範囲に含まれる。共有結合修飾は、単一ドメイン抗体の標的化アミノ酸残基を、単一ドメイン抗体の所定の側鎖又はＮ末端もしくはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることを含む。他の修飾は、グルタミニルとアスパラギニル残基のそれぞれ対応するグルタミルとアスパルチル残基への脱アミド、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖α－アミノ基のメチル化（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ７９－８６（１９８３）を参照されたい）、Ｎ－末端アミンのアセチル化及び任意のＣ－末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本開示の範囲に含まれる単一ドメイン抗体の他のタイプの共有結合修飾は、上記の抗体又はポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変えることと（例えば、Ｂｅｃｋら，Ｃｕｒｒ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４８２－５０１（２００８）、及びＷａｌｓｈ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． Ｔｏｄａｙ １５：７７３－８０（２０１０））、例えば、米国特許第４，６４０，８３５、４，４９６，６８９、４，３０１，１４４、４，６７０，４１７、４，７９１，１９２又は４，１７９，３３７号に記載の方法で抗体を複数の非タンパク質ポリマーのうちの一つ、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンに連結することとを含む。本開示のクローディン－６に結合する単一ドメイン抗体はさらに、一つ又は複数の免疫グロブリン定常領域又はその一部（例えば、Ｆｃ）遺伝子と融合又はコンジュゲートして、半減期を延長し、及び／又は既知のＦｃ媒介性エフェクター機能を付与することができる。
また、本開示のクローディン－６に結合する一本鎖抗体を修飾してキメラ分子を形成することができ、これらのキメラ分子は、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列、例えば、エピトープタグ（例えば、Ｔｅｒｐｅ，Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６０：５２３－３３（２００３）を参照されたい）又はＩｇＧ分子のＦｃ領域（例えば、Ａｒｕｆｆｏ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２２１－４２（ＣｈａｍｏｗとＡｓｈｋｅｎａｚｉによる編集，１９９９）を参照されたい）と融合する、クローディン－６に結合する一本鎖抗体を含む。クローディン－６に結合する一本鎖抗体は、以下でより詳しく説明されるように、クローディン－６に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生成するために用いられてもよい。
本明細書は、融合タンパク質をさらに提供し、該融合タンパク質は、本開示のクローディン－６に結合する一本鎖抗体と、異種ポリペプチドとを含む。いくつかの態様において、抗体遺伝子と融合又は化学的にコンジュゲートする異種ポリペプチドは、細胞表面で発現するクローディン－６を有する細胞に抗体を標的とするために用いられ得る。
本明細書は、クローディン－６抗原に結合する抗体セットをさらに提供する。抗体セットは、異なる結合速度、異なる解離速度、クローディン－６抗原に対する異なる親和性及び／又はクローディン－６抗原に対する異なる特異性を有し得る。セットは、約１０～約１０００又はそれ以上の抗体を含むか、又は約１０～約１０００又はそれ以上の抗体から構成され得る。抗体セットは、例えば、９６ウェル又は３８４ウェルのプレートに用いて、ＥＬＩＳＡなどの測定に用いることができる。
５．２．６． 単一ドメイン抗体の製造
単一ドメイン抗体を調製する方法は記述されている。例えば、Ｅｌｓ Ｐａｒｄｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，９（３）： ６７４（２０１４）を参照されたい。単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）は、当分野で既知の方法で取得することができ、例えば、免疫ラクダ科種（例えば、ラクダ又はラマ）を免疫化し、それからハイブリドーマを得るか、又は当分野で既知の分子生物学的技術で単一ドメイン抗体ライブラリーをクローニングし、その後にＥＬＩＳＡにより、選択されていないライブラリーの単一のクローンもしくはファージディスプレイを使用することによって選択する。
本明細書による単一ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体をコードする核酸を含有するベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞を培養することによって産生され得る。本開示の抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技術を用いて得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞又はＢ細胞などの抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。代替的に、ヌクレオチド合成装置又はＰＣＲ技術を用いて、ポリヌクレオチドを合成することができる。取得すると、ポリペプチドをコードする配列を、宿主細胞において異種ポリヌクレオチドを複製し発現することができる組換えベクターに挿入する。当分野で取得可能な多くの既知のベクターは、本開示の目的に用いられ得る。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸の大きさ及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。本開示の抗体を発現することに適した宿主細胞は、グラム陰性又はグラム陽性生物を含む古細菌と真正細菌などの原核生物、糸状菌又は酵母などの真核微生物、昆虫又は植物細胞などの無脊椎動物細胞、及び哺乳類宿主細胞株などの脊椎動物細胞を含む。宿主細胞は、上記発現ベクターで形質転換され、従来の栄養培地で培養され、該従来の栄養培地は、適切に修飾されてプロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は必要な配列をコードする遺伝子を増幅する。当分野で既知の標準的なタンパク質精製方法を用いて、宿主細胞により産生された抗体を精製する。
ベクター構築、発現及び精製を含む抗体産生方法は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎら，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ： Ｆｒｏｍ ＰＣＲ ｔｏ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ２０３－５２（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによる編集，１９９６）、ＫｗｏｎｇとＲａｄｅｒ，Ｅ． ｃｏｌｉ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）、ＴａｃｈｉｂａｎａとＴａｋｅｋｏｓｈｉ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆａｂ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（Ａｌ－Ｒｕｂｅａｉによる編集，２０１１）、及びＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ａｎによる編集，２００９）という文献でさらに記載されている。
無論、当分野で周知の代替的な方法を用いて抗クローディン－６単一ドメイン抗体を製造することが期待されている。例えば、適切なアミノ酸配列又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成により産生され得る（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９６９）とＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９－５４（１９６３）を参照されたい）。インビトロでのタンパク質合成は、手動技術を用いるか又は自動化によって行うことができる。抗クローディン－６抗体の各部分は、個別に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法で組み合わせて必要な抗クローディン－６抗体を産生することができる。代替的に、抗体は、米国特許第５，５４５，８０７と５，８２７，６９０号に開示されるように、操作された発現抗体のトランスジェニック動物の細胞又は体液、例えば、乳液から精製され得る。
具体的には、本明細書による単一ドメイン抗体又は他のクローディン－６結合タンパク質は、以下の方法により生成することができ、ラマを免疫化し、単一のＢ細胞の選別を行い、Ｖ遺伝子の抽出を行い、クローディン－６結合タンパク質（例えば、ＶＨＨ－Ｆｃ融合体）をクローンし、そして小規模の発現及び精製を行う。また、クローディン－６に結合する単一ドメイン抗体及び他の分子に対して別のスクリーニングを行ってもよく、ＥＬＩＳＡ陽性、ＢＬＩ陽性及び１００ｎＭ未満のＫＤのうちの一つ又は複数を選択することを含む。これらの選択基準は、以下のセクション６に記載されるように組み合わせることができる。また、単独のＶＨＨ結合タンパク質（及びクローディン－６に結合する他の分子）の、クローディン－６を発現する細胞への結合能を測定することができる。ＦＡＣＳを用いてクローディン－６を発現する細胞を分析し、蛍光標識されたＶＨＨ分子の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定して、このような測定を行うことができる。以下では、上記各態様についてより詳しく説明する。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、通常、関連する抗原及びアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）又は腹膜内（ｉｐ）注射によって動物に産生される。二官能性又は誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介してコンジュゲートされる）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介してコンジュゲートされる）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここで、Ｒ及びＲ１は、独立して、低級アルキル基である）を用いて、関連抗原を、免疫化対象種において免疫原性を有するタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又はダイズトリプシン阻害剤とコンジュゲートする。使用可能なアジュバントの例は、フロイント完全アジュバントとＭＰＬ－ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロース二菌型マイコバクテリア酸エステル）を含む。免疫スキームは、過度の実験を行うことなく、当業者により選択することができる。
例えば、動物に対して、例えば、１００μｇ又は５μｇのタンパク質又はコンジュゲート（それぞれウサギ又はマウスに用いられる）を３体積のフロイント完全アジュバントと組み合わせ、溶液を複数の部位で皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート又は誘導体に対する免疫化を行う。一ヶ月後、複数の部位で皮下注射することにより、フロイント完全アジュバント中のペプチド又はコンジュゲートの１／５～１／１０元の量を用いて、動物に対して追加免疫を行う。７～１４日後、動物から採血し、血清の抗体力価を測定する。力価プラトー期まで動物を追加免疫する。コンジュゲートは、また組換え細胞培養物においてタンパク質融合体を製造することができる。なお、ミョウバンなどの凝集剤は免疫応答を増強するのに適する。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に同質の抗体群から得られ、即ち、少量に存在する可能性のあり天然に存在する突然変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて、該群を構成する各抗体は同じである。そのため、修飾語「モノクローナル」は、個別抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。
例えば、モノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により記述されたハイブリドーマ方法で製造されてもよく、又は組換えＤＮＡ方法によって製造されてもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。
ハイブリドーマ方法において、適切な宿主動物に対して免疫化を行って、免疫化用のタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか又は産生できるリンパ球を誘導する。代替的に、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。そして、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を生成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ページ５９～１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
免疫剤は、通常、抗原タンパク質又はその融合変異体を含む。Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８６），ページ５９～１０３。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳類細胞である。このように製造されたハイブリドーマ細胞を適切な培地に接種し、その中で増殖させ、該培地は、融合していない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一つ又は複数の物質を含んでもよい。好ましい不死化骨髄腫細胞株は、効果的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定的な高レベルの産生を支援し、且つＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である細胞である。
ハイブリドーマ細胞がその中で増殖する培地における抗原に対するモノクローナル抗体の産生を測定する。ハイブリドーマ細胞を培養する培地における、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の存在を測定することができる。このような技術と測定は、当分野で既知のものである。例えば、結合親和性は、Ｍｕｎｓｏｎら，Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析によって確定することができる。
所望の特異性、親和性及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを、限界希釈法によってサブクローンし、標準的な方法（上記Ｇｏｄｉｎｇ）により増殖させることができる。この目的に用いられる適切な培地は、例えば、Ｄ－ＭＥＭ又はＲＰＭＩ－１６４０培地を含む。なお、ハイブリドーマ細胞は、哺乳類において腫瘍としてインビボで増殖することができる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製法、例えば、タンパク質Ａ－アガロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーにより、培地、腹水又は血清から適切に単離される。
モノクローナル抗体は、また、米国特許第４，８１６，５６７号及び上に記載されるように、組換えＤＮＡ方法で製造され得る。従来の方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを容易に単離し配列決定する。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は免疫グロブリンを産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にそれをトランスフェクトして、このような組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する概説文章は、Ｓｋｅｒｒａら，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６－２６２（１９９３）とＰｌｉｉｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖｓ． １３０：１５１－１８８（１９９２）を含む。
ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５４（１９９０）に記載される技術を用いて生成された抗体ファージライブラリーから抗体を単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）とＭａｒｋｓら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）。その後の刊行物は、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９－７８３（１９９２））及びコンビナトリアル感染とインビボ組換えによって高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体を産生することを非常に大きいファージライブラリーを構築する方策とすることを記載している（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：２２６５－２２６６（１９９３））。そのため、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の的実行可能な代替法である。
ＤＮＡは、例えば、コード配列を置換するか（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、又は非免疫グロブリンポリペプチドの全て又は一部のコード配列を共有結合によりコード配列に連結することによって、修飾され得る。キメラ二価抗体を産生するために、このような非免疫グロブリンポリペプチドは置換されてもよく、該キメラ二価抗体は、抗原に対して特異性を有する一つの抗原結合部位と、異なる抗原に対して特異性を有するさらなる抗原結合部位とを含む。
キメラ又はハイブリッド抗体は、また合成タンパク質化学における既知の方法（架橋剤に関するそれらの方法を含む）を用いてインビトロで製造され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応又はチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的に用いられる適切な試薬の例は、イミノチオレートとメチル－４－メルカプトブチルイミド酸塩を含む。
原核細胞における組換え産生
本開示の抗体をコードするポリ核酸配列は、標準的な組換え技術により得ることができる。所望のポリ核酸配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。代替的に、ヌクレオチド合成装置又はＰＣＲ技術を用いて、ポリヌクレオチドを合成することができる。取得すると、ポリペプチドをコードする配列を、原核宿主において異種ポリヌクレオチドを複製し発現することができる組換えベクターに挿入する。当分野で取得可能な多くの既知のベクターは、本開示の目的に用いられ得る。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸の大きさ及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは異なる成分を含有し、これは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅又は発現、又はその両方）及び所在する宿主細胞とのその適合性に依存する。ベクター成分は、通常、複製起点、選択標識遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入物及び転写終結配列を含むか、それらに限らない。
通常、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターは、これらの宿主と組み合わせて使用される。ベクターは、通常、複製部位、及び形質転換細胞において表現型選択を提供できる標識配列を有する。例えば、大腸菌は、通常、ｐＢＲ３２２（大腸菌種に由来するプラスミド）で形質転換される。特定の抗体を発現するためのｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒらの米国特許第５，６４８，２３７号に詳しく記載されている。
なお、宿主微生物と適合するレプリコン及び制御配列を含有するファージベクターは、これらの宿主と関連する形質転換ベクターとして用いられ得る。例えば、ＧＥＭ（商標）－１１などのファージは、組換えベクターを製造するために用いることができ、該ベクターは、大腸菌ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換するために用いることができる。
本出願の発現ベクターは、二つ又はそれ以上のプロモーター－シストロン対を含んでもよく、各ポリペプチド成分をコードする。プロモーターは、その発現を調節するシストロン上流（５’）に位置する非翻訳調節配列である。原核プロモーターは、通常、誘導型と構成型の２種類に分けられる。誘導型プロモーターは、培養条件の変化（例えば、栄養物の存在又は不存在、又は温度の変化）に応じて、その制御下でシストロンの転写レベルの増加を開始するプロモーターである。
多くの潜在的な宿主細胞に識別される多数のプロモーターは周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化により、ソースＤＮＡからプロモーターを除去し、単離されたプロモーター配列を本出願のベクターに挿入することによって、本発明の抗体をコードするシストロンＤＮＡに機能的に連結され得る。天然プロモーター配列及び複数の異種プロモーターは、いずれも標的遺伝子の増幅及び／又は発現をガイドするために用いられ得る。異種プロモーター、天然標的ポリペプチドプロモーターに比べて、通常、発現する標的遺伝子のより大きな転写とより高い収量を可能にするため、使用することができる。
原核宿主に適するプロモーターは、ＰｈｏＡプロモーター、β－ガラクトシダーゼとラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系とｔａｃ又はｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターを含む。しかしながら、細菌に作用する他のプロモーター（例えば、他の既知の細菌又はファージプロモーター）も適切なものである。それらの核酸配列が開示されたため、当業者は、リンカー又はアダプターを用いて、標的ペプチドをコードするシストロンにそれらを機能的に連結して（ＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔらＣｅｌｌ ２０： ２６９（１９８０））、任意の必要な制限部位を提供することができる。
一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、発現するポリペプチドの膜貫通転座をガイドする分泌シグナル配列成分を含む。通常、シグナル配列は、ベクターの構成部分であってもよく、又はベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本開示の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞により識別され処理され（即ち、シグナルペプチダーゼにより切断され）得るシグナル配列であるべきである。異種ポリペプチド天然シグナル配列を識別し加工しない原核宿主細胞に対して、シグナル配列は、原核シグナル配列で置換されてもよく、該原核シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ又は耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー配列、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰから選択される。
本開示による抗体の産生は、宿主細胞の細胞質に発生し得るため、シストロンごとに分泌シグナル配列が存在する必要がない。いくつかの宿主菌株（例えば、大腸菌ｔｒｘＢ-菌株）は、ジスルフィド結合の形成に有利な細胞質条件を提供することによって、発現されるタンパク質サブユニットの正確な折り畳みと組み立てを可能にする。
本開示の抗体を発現することに適した原核宿主細胞は、グラム陰性又はグラム陽性生などの古細菌と真正細菌を含む。有用な細菌の例は、エシェリヒア属（例えば、大腸菌）、バチルス属（例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、エンテロバクター属、シュードモナス属（例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｕｒｕｇｉｎｏｓａ））、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、クレブシエラ属、プロテウス属、シゲラ属、根粒菌属、ビトレオシラ属又はパラコッカス属を含む。いくつかの態様において、グラム陰性細胞を使用する。大腸菌細胞は宿主として用いられ得る。大腸菌菌株の例は、菌株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ページ１１９０～１２１９、ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）及びその誘導体、遺伝子型Ｗ３１１０ ＡｆｈｕＡ（ＡｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ＡｏｍｐＴ Ａ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲを有する菌株３３Ｄ３（米国特許第５，６３９，６３５号）を含む。他の菌株及びそれらの誘導体、例えば、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）と大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１，６０８）も適切なものである。これらの例は、説明するためのものであり、限定的なものではない。確定された遺伝子型を有する任意の上記細菌の誘導体を構築する方法は、当分野で既知のものであり、例えば、Ｂａｓｓら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９－３１４（１９９０）に記載されている。レプリコンの細菌細胞での複製可能性を考慮して、通常、適切な細菌を選択する必要がある。例えば、周知のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＫＮ４１０）でレプリコンを供給する場合、大腸菌、セラチア菌又はセラチア菌種は宿主として好適に使用され得る。
典型的には、宿主細胞は、最小限の量のタンパク質加水分解酵素を分泌すべきであり、且つ別のプロテアーゼ阻害剤を細胞培養物に理想的に組込むことができる。
宿主細胞は、上記発現ベクターで形質転換され、従来の栄養培地で培養され、該従来の栄養培地は、適切に修飾されてプロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は必要な配列をコードする遺伝子を増幅する。形質転換は、ＤＮＡが、染色体外エレメントとして、又は染色体組込み体を介して複製することができるように、ＤＮＡを原核宿主に導入することを指す。使用する宿主細胞に応じて、これらの細胞に適する標準的な技術を用いて形質転換を行う。塩化カルシウムを用いたカルシウム処理は、通常、大量の細胞壁障壁を含有する細菌細胞に用いられる。別の形質転換方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用する別の技術は、エレクトロポレーションである。
本出願の抗体を産生するのに適した原核細胞は、当分野で既知の培地で増殖し、選択した宿主細胞を培養することに適する。適切な培地の例は、ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）と必要な栄養補充物を含む。培地は、発現ベクターの構築に基づいて選択した選択剤をさらに含有してもよく、それにより発現ベクターを含有する原核細胞の増殖を選択的に許容する。例えば、アンピシリンを培地に加え、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を増殖させる。
炭素、窒素及び無機リン酸源以外の任意の必要な補充物は、適切な濃度で、単独で導入するか又は別の補充物又は媒体、例えば、複合窒素源との混合物として導入されてもよい。任意選択的に、培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトール及びジチオスレイトールから選択される一つ又は複数の還元剤を含有してもよい。原核宿主細胞は、適切な温度及びｐＨで培養される。
本出願の発現ベクターにおいて誘導型プロモーターを用いる場合、プロモーター活性化に適する条件下でタンパク質の発現を誘導する。本出願の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターは、ポリペプチドの転写を制御するために用いられる。そのため、形質転換された宿主細胞は、リン酸塩制限培地中で培養して誘導する。例えば、リン酸塩制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３：１３３－１４７（２００２）を参照されたい）。使用するベクター構築体に応じて、当分野で既知の複数の他の誘導物を使用することができる。
本開示の発現される抗体は、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、それから回収される。タンパク質の回収は、通常、微生物の破壊に関し、通常、浸透圧ショック、超音波処理又は溶解などの方法を用いる。細胞が破壊されると、遠心分離又は濾過によって細胞破片又は完全な細胞を除去することができる。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製され得る。代替的に、タンパク質を培地に輸送し、それから単離することができる。培地から細胞を除去し、濾過し、培養物上清を濃縮して、産生したタンパク質をさらに精製することができる。発現するポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びＷｅｓｔｅｒｎブロットアッセイなどの通常既知の方法を用いてさらに単離し同定することができる。
代替的に、発酵方法によってタンパク質を大量に産生する。様々な大規模な流加発酵手順は、組換えタンパク質を産生するために用いることができる。本開示の抗体の収量及び品質を高めるために、様々な発酵条件を変えることができる。例えば、シャペロンは、細菌宿主細胞において産生された異種タンパク質の正確な折り畳みと溶解に役立つことが証明された。ＣｈｅｎらＪ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７４：１９６０１－１９６０５（１９９９）、米国特許第６，０８３，７１５号、米国特許第６，０２７，８８８号、ＢｏｔｈｍａｎｎとＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１７１００－１７１０５（２０００）、ＲａｍｍとＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１７１０６－１７１１３（２０００）、Ａｒｉｅら，Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３９：１９９－２１０（２００１）。
発現する異種タンパク質（特にタンパク質加水分解に敏感なもの）のタンパク質加水分解を最小化するために、タンパク質加水分解酵素を欠くいくつかの宿主菌株は、本開示に用いることができ、例えば、米国特許第５，２６４，３６５号、米国特許第５，５０８，１９２号、Ｈａｒａら，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３－７２（１９９６）に記載のとおりである。タンパク質加水分解酵素を欠く、一つ又は複数のシャペロンを過剰発現するプラスミドで形質転換された大腸菌菌株は、本出願の抗体をコードする発現系における宿主細胞として用いることができる。
本明細書で産生された抗体は、さらに精製して、実質的に均質な製剤を得て、さらなる測定及び使用に用いることができる。当分野で既知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の手順は適切な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムでの分画分離、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又は陽イオン交換樹脂、例えば、ＤＥＡＥでのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を用いたゲル濾過。固相上に固定化されたタンパク質Ａは、例えば、いくつかの態様において、本開示の結合分子の免疫親和性精製に用いることができる。タンパク質Ａを固定化する固相は、ガラス又はシリカ表面を含むカラム、又は制御される微多孔質ガラス又はケイ酸カラムであってもよい。カラムは、汚染物の非特異的な付着を防ぐために、グリセロールなどの試薬でコーティングされている場合がある。そして固相を洗浄して、固相に非特異的に結合する汚染物を除去する。最後に、溶出によって固相から目的抗体を回収する。
真核細胞における組換え産生
真核発現について、ベクター成分は、通常、シグナル配列、複製起点、一つ又は複数の標識遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列のうちの一つ又は複数を含むが、それらに限らない。
真核宿主に用いられるベクターは、シグナル配列、又は成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ－末端に特異的切断部位がある他のポリペプチドの挿入物であってもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞により識別され処理され（即ち、シグナルペプチダーゼにより切断される）異種シグナル配列であってもよい。哺乳類細胞発現において、哺乳類シグナル配列及びウイルス分泌リーダー配列、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルを得ることができる。このような前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレームにおいて本出願の抗体をコードするＤＮＡに連結され得る。
通常、哺乳類発現ベクターは、複製起点成分を必要としない（ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含有するため、通常、使用できる）。
発現及びクローニングベクターは、選択遺伝子を含有してもよく、選択標識とも呼ばれる。選択遺伝子は、抗生物質又は他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート又はテトラサイクリン）に対する耐性を付与するタンパク質をコードし、栄養要求性欠陥を補い、又は複合培地から得られない重要栄養素を提供することができる。
選択される形態の一例では、薬物により宿主細胞の増殖を阻止する。異種遺伝子により形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、そのため選択される形態において生存している。このような優位性選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンという薬物を使用する。
哺乳類細胞に用いられる適切な選択標識の別の例は、本出願の抗体をコードする核酸を取り込むことができる細胞を同定できるものである。例えば、まずメトトレキサート（Ｍｔｘ）（ＤＨＦＲの競合的アンタゴニスト）を含有する培地中で全ての形質転換体を培養することによって、ＤＨＦＲ選択遺伝子により形質転換された細胞を同定する。野生型ＤＨＦＲを用いる場合、例示的適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠如しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。代替的に、ＤＮＡ配列をコードするポリペプチド、野生型ＤＨＦＲタンパク質及びアミノグリコシド３’－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択標識により形質転換又は共形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、選択標識に用いられる選択剤、例えば、アミノグリコシド抗生物質を含有する培地中の細胞増殖によって選択することができる。
発現及び克隆ベクターは、通常プロモーターを含有し、該プロモーターは、宿主生物により識別され、必要なポリペプチド配列をコードする核酸に機能的に連結される。真核遺伝子は、ＡＴに富む領域を有し、転写開始部位の約２５～３０個の塩基上流に位置する。多くの遺伝子の転写開始の７０～８０個の塩基上流に発見される別の配列を含んでもよい。大多数の真核生物の３’末端は、ポリアデニル酸テールをコード配列の３’末端に付加するためのシグナルであってもよい。これらの配列は、いずれも真核発現ベクターに挿入され得る。
哺乳類宿主細胞からのベクターのポリペプチド転写は、例えば、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、逆転写ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られたプロモーター、異種哺乳類プロモーター（例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター）、ヒートショックプロモーターにより制御することができ、これらのプロモーターが宿主細胞株と適合すればよい。
本開示の抗体をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、通常、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。現在、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファフェトプロテイン及びインスリン）からの多くのエンハンサー配列が知られている。例としては、複製起点の後期側に位置するＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ １００－２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側に位置するポリオーマエンハンサーとアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモーターを活性化するためのエンハンサーエレメントは、さらにＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７－１８（１９８２）を参照されたい。エンハンサーは、ポリペプチドコード配列の５’又は３’位置でベクターにスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターの５’部位に位置する。
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物からの有核細胞）に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有する。このような配列は、通常、真核又はウイルスＤＮＡもしくはｃＤＮＡの５’、場合によって３’非翻訳領域から得られ得る。これらの領域は、ｍＲＮＡコードするポリペプチドの非翻訳部分でポリアデニル酸化断片に転写されるヌクレオチド断片を含有する。有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル酸化領域である。
本明細書のベクターにおいてＤＮＡをクローン又は発現するための適切な宿主細胞は、本明細書に記載の高等真核細胞を含み、脊椎動物宿主細胞を含む。培養（組織培養）において、脊椎動物細胞の増殖は一般的な手順になっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胎児腎臓株（２９３又は２９３細胞サブクローンは浮遊培地で増殖するために用いられ、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３－２５１（１９８０））、ザル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４－６８（１９８２））、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝がん細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。
宿主細胞は、抗体を産生するための上記発現又は克隆ベクターにより形質転換することができ、従来の栄養培地中で培養され、該従来の栄養培地は、適切に修飾されてプロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は必要な配列をコードする遺伝子を増幅する。
本出願の抗体を産生するための宿主細胞は、複数の培地で培養することができる。市販の培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）は、宿主細胞の培養に適する。なお、Ｈａｍら，Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら，Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４、４，６５７，８６６、４，９２７，７６２、４，５６０，６５５又は５，１２２，４６９号、ＷＯ ９０／０３４３０、ＷＯ ８７／００１９５、又は米国特許再発行３０，９８５に記載の培地のいずれも宿主細胞の培地として使用可能である。これらの培地のうちのいずれか一つは、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン又は上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物）、微量元素（通常、マイクロモル範囲内の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）及びグルコース又は等価エネルギーを補充することができる。当業者に既知の適切な濃度の任意の他の必要な補充物をさらに含んでもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために以前に選択された宿主細胞と共に使用されたものであり、且つ当業者にとって明らかである。
組換え技術を用いる場合、抗体は、細胞内、ペリプラズム隙間に産生するか、又は培地に直接分泌することができる。抗体が細胞内に産生されると、最初のステップとして、例えば、遠心分離又は限外濾過によって微粒子破片、宿主細胞又は溶解断片を除去する。抗体が培地に分泌された場合、通常、まず、市販されているタンパク質濃縮フィルタ（例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）によりこの発現系からの上清を濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質加水分解を阻害するために前記ステップのいずれに含まれてもよく、且つ外来汚染物の成長を防止するために抗生物質を含んでもよい。
細胞から製造されるタンパク質組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができ、ここで、アフィニティークロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドに連結されるマトリックスは、通常、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。アガロースに比べて、機械的に安定したマトリックス、例えば、孔径制御可能なガラス又はポリ（スチレン－ジビニル）ベンゼンは、より速い流速及びより短い処理時間を可能にする。回収対象抗体に応じて、他のタンパク質精製技術、例えば、イオン交換カラムでの分画分離、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカゲルクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、クロマトグラフィークロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿を使用してもよい。任意の一つ又は複数の予備精製ステップの後、目的抗体と汚染物を含む混合物に対して低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを行ってもよい。
５．２．７． 単一ドメイン抗体を含む結合分子
別の態様では、本明細書は、本明細書による単一ドメイン抗体（例えば、クローディン－６に対するＶＨＨドメイン）を含む結合分子を提供する。以下のセクション５．３に記載の本明細書によるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に加えて、いくつかの態様において、本明細書による、クローディン－６に対する単一ドメイン抗体は、他の結合分子の一部でもある。本明細書には、本開示の例示的結合分子が記載されている。
融合タンパク質
様々な態様において、本明細書による単一ドメイン抗体は、別の作用物質、例えば、タンパク質ベースの実体と融合するか又は化学的にコンジュゲートすることができる。単一ドメイン抗体は、作用物質と化学的にコンジュゲートするか、又は他の方式で作用物質と非共有結合的にコンジュゲートすることができる。作用物質は、ペプチド又は抗体（又はそれらの断片）であってもよい。
そのため、いくつかの態様において、本明細書は、異種タンパク質又はポリペプチド（又はそれらの断片、例えば、約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個又は約５００個のアミノ酸又は５００個超のアミノ酸のポリペプチド）と組換えて融合するか又は化学的にコンジュゲート（共有結合的又は非共有結合的コンジュゲート）して融合タンパク質を生成する単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン）及びその使用を提供する。具体的には、本明細書は、本明細書による単一ドメイン抗体の抗原結合断片（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）及び異種タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
なお、本明細書による抗体は、標識又は「タグ」配列（例えば、ペプチド）と融合して精製を促進することができる。標識又はタグアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、ヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ及び「ＦＬＡＧ」タグであってもよい。
一部（ポリペプチドを含む）を抗体と融合させるか又はコンジュゲートする方法は既知のものである（例えば、Ａｒｎｏｎら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４３－５６（Ｒｅｉｓｆｅｌｄらによる編集，１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ６２３－５３（Ｒｏｂｉｎｓｏｎらによる編集，第２版，１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４７５－５０６（Ｐｉｎｃｈｅｒａらによる編集，１９８５）、Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ３０３－１６（Ｂａｌｄｗｉｎらによる編集，１９８５）、Ｔｈｏｒｐｅら，Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ６２：１１９－５８（１９８２）、米国特許第５，３３６，６０３、５，６２２，９２９、５，３５９，０４６、５，３４９，０５３、５，４４７，８５１、５，７２３，１２５、５，７８３，１８１、５，９０８，６２６、５，８４４，０９５、と５，１１２，９４６号、ＥＰ ３０７４３４、ＥＰ ３６７１６６、ＥＰ ３９４８２７、ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０６５７０、ＷＯ ９６／０４３８８、ＷＯ ９６／２２０２４、ＷＯ ９７／３４６３１とＷＯ ９９／０４８１３、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８８： １０５３５－３９（１９９１）、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４－８６（１９８８）、Ｚｈｅｎｇら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：５５９０－６００（１９９５）、及びＶｉｌら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１１３３７－４１（１９９２））を参照されたい。
融合タンパク質は、例えば、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング及び／又はコドンシャッフリング（「ＤＮＡシャッフリング」と総称される）技術によって産生され得る。ＤＮＡシャッフリングは、本明細書による単一ドメイン抗体の活性を変えるために用いることができ、例えば、高い親和性と低い解離速度を有する抗体を含む（例えば、米国特許第５，６０５，７９３、５，８１１，２３８、５，８３０，７２１、５，８３４，２５２と５，８３７，４５８号、Ｐａｔｔｅｎら，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８：７２４－３３（１９９７）、Ｈａｒａｙａｍａ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６（２）：７６－８２（１９９８）、Ｈａｎｓｓｏｎら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８７：２６５－７６（１９９９）、及びＬｏｒｅｎｚｏとＢｌａｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８－１３（１９９８）を参照されたい）。抗体又はコードされる抗体は、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入又は他の方法によりランダムな変異誘発を行って変えることができる。本明細書による抗体をコードするポリヌクレオチドは、一つ又は複数の異種分子の一つ又は複数の成分、モチーフ、セグメント、部分、ドメイン、断片などと組換えを行うことができる。
本明細書による単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン）は、第２の抗体にコンジュゲートして抗体異種コンジュゲートを形成することができる。
様々な態様において、単一ドメイン抗体は作用物質と遺伝子融合する。遺伝子融合は、単一ドメイン抗体と作用物質との間にリンカー（例えば、ポリペプチド）を配置することによって実現することができる。リンカーは、柔軟なリンカーであってもよい。
単一ドメイン抗体は、治療用分子遺伝子とコンジュゲートすることができ、ここで、ヒンジ領域は、単一ドメイン抗体を治療用分子に連結する。
本明細書は、本明細書による様々な融合タンパク質を製造する方法をさらに提供する。以上のセクション５．２．６に記載の様々な方法は、本明細書による融合タンパク質を製造するために用いられ得る。
具体的な態様において、本明細書による融合タンパク質を組換え、発現する。本明細書による融合タンパク質の組換え発現には、該タンパク質又はそれらの断片をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築が必要となる場合がある。本明細書によるタンパク質又はそれらの断片をコードするポリヌクレオチドを得ると、当分野で周知の技術を用いて、組換えＤＮＡ技術により、該分子を産生するためのベクターを産生することができる。そのため、本明細書には、コードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を製造する方法が記載されている。当業者に周知の方法は、コード配列及び適切な転写と翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために用いられ得る。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ遺伝子組換えを含む。複製可能なベクターをさらに提供し、それは、プロモーターに機能的に連結される、本明細書による融合タンパク質又はそれらの断片又はＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む。
従来技術によって発現ベクターを宿主細胞に転移させ、そして従来技術によってトランスフェクトされた細胞を培養して、本明細書による融合タンパク質を産生することができる。そのため、本明細書は、異種プロモーターに機能的に連結される、本明細書による融合タンパク質又はそれらの断片をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞をさらに提供する。
複数の宿主発現ベクター系は、本明細書による融合タンパク質を発現するために用いられ得る。このような宿主発現系は、ビヒクルを表し、目的コード配列がこれらのビヒクルにより産生され、その後に精製することができ、それと共に細胞も表し、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換又はトランスフェクトする場合、これらの細胞は、本明細書による融合タンパク質をインサイチュで発現することができる。これらは、微生物、例えば、コード配列を含有する組換えファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌と枯草菌）、コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、パストリス）、コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したか又はコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、又は組換え発現構築体を含有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０及び３Ｔ３細胞）を含むが、それらに限らず、これらの組換え発現構築体は、哺乳類細胞ゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、牛痘ウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する。大腸菌などの細菌細胞、又は真核細胞、特に完全な組換え抗体分子を発現するための細菌細胞は、組換え融合タンパク質を発現するために用いられ得る。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳類細胞とヒトサイトメガロウイルスからの主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターとの結合は、抗体又はその変異体の有効な発現系である。具体的な態様において、本明細書による融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成型プロモーター、誘導型プロモーター又は組織特異的プロモーターにより調節される。
細菌系において、発現する融合タンパク質の所望の使用に応じて、複数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、このような融合タンパク質を大量に産生する必要がある場合、融合タンパク質の医薬組成物を製造するために、精製しやすい高レベルの融合タンパク質生成物の発現をガイドするベクターが必要となる場合がある。これらのベクターは、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら，ＥＭＢＯ １２：１７９１（１９８３））であって、コード配列はフレームワークにおいてｌａｃ Ｚコード領域と共にベクターに単独で連結することができ、それによって融合タンパク質を産生する大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：３１０１－３１０９（１９８５）、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４：５５０３－５５０９（１９８９））などを含むが、それらに限らない。ｐＧＥＸベクターは、また外因性ポリペプチドをグルタチオン５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現するために用いられ得る。通常、このような融合タンパク質は、可溶性であり、且つマトリックスグルタチオンアガロースビーズに吸着し結合し、そして遊離グルタチオンの存在下で溶出することによって、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターをトロンビン又は因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計し、それによりクローニングされた標的遺伝子生成物はＧＳＴ部分から放出され得る。
哺乳類宿主細胞において、多くのウイルスベースの発現系を用いることができる。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、目的コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及びトリパータイトリーダー配列に連結することができる。そしてインビトロ又はインビボ組換えによって該キメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）での挿入は、生存しており、且つ感染した宿主で融合タンパク質を発現できる組換えウイルスを産生することができる（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８ １：３５５－３５９（１９８４）を参照されたい）。挿入されたコード配列の有効な翻訳には、特定の開始シグナルが必要となる場合がある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンと隣接配列とを含む。なお、挿入断片全体の翻訳を確保するために、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームと同位相でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成を含む様々な供給源を有することができる。適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含み、それによって発現効率を向上させることができる（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１－５４４（１９８７）を参照されたい）。
なお、挿入された配列の発現を調節するか又は書房の特定の方式で遺伝子生成物を修飾し加工する宿主細胞株を選択することができる。タンパク質生成物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）及び加工（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質と遺伝子生成物の翻訳後加工及び修飾に用いられる特徴的及び特異的機序を有する。適切な細胞株又は宿主系を選択して、発現した外因性タンパク質の正確な修飾及び加工を確保することができる。そのため、一次転写物、グリコシル化及び遺伝子生成物のリン酸化の加工に適切な細胞機序を有する真核宿主細胞を使用することができる。このような哺乳類宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯとＴ４７Ｄ、ＮＳ０（いかなる免疫グロブリン鎖も内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３ＯとＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞を含むが、それらに限らない。
組換えタンパク質を長期間にわたって高収量で産生するために、安定的な発現を利用してもよい。例えば、融合タンパク質を安定的に発現する細胞株を操作してもよい。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するために、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル酸化部位など）及び選択標識により制御されるＤＮＡで形質転換されてもよい。外因性ＤＮＡを導入した後、操作された細胞を富化培地中で１～２日間増殖させ、そして選択的培地に移してもよい。組換えプラスミドにおける選択標識は、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定的に組込み、増殖して病巣を形成することを可能にし、病巣は、またクローニングされ、増殖して細胞株をなることができる。該方法は、融合タンパク質を発現する細胞株のエンジニアリングに有利に用いられ得る。このような操作された細胞株は、結合分子と直接又は間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価に特に有用である。
複数の選択系を使用することができ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２））及びアデニングアニンホスホリボシルトランスフェラー（Ｌｏｗｙら，Ｃｅｌｌ ２２：８－１７（１９８０））を含むが、それらに限らず、遺伝子は、それぞれｔｋ－、ｈｇｐｒｔ－又はａｐｒｔ－細胞に用いることができる。なお、代謝拮抗剤耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として用いられ得る：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）、Ｏ’Ｈａｒｅら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））、アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（ＷｕとＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５（１９９１）、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３－５９６（１９９３）、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２（１９９３）、及びＭｏｒｇａｎとＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１－２１７（１９９３）、Ｍａｙ，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：ｌ５５－２ １５（１９９３））、及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術分野で一般的に知られている方法は、所望の組換えクローンの選択に一般的に使用することができ、且つこれらの方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（による編集），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、及びＤｒａｃｏｐｏｌｉら（による編集），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第１２章と第１３章，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１）という文献に記載されており、これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組込まれる。
融合タンパク質の発現レベルは、ベクター増幅により高められ得る（概説について、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎとＨｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，第３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照されたい）。融合タンパク質を発現するベクター系における標識が増幅可能なものである場合、宿主細胞培養物に存在する阻害剤レベルの増加は、標識遺伝子のコピー数の増加を引き起こす。増幅領域が融合タンパク質遺伝子に関連するため、融合タンパク質の産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅら，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２５７（１９８３））。
宿主細胞は、本明細書による複数の発現ベクターと同時トランスフェクトすることができる。ベクターは、同じ選択標識を含有してもよく、これらの選択標識は、対応するコードされるポリペプチドを同等に発現させることができる。代替的に、複数のポリペプチドをコードし、発現することができる単一のベクターを使用することができる。コード配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含んでもよい。
本明細書による融合タンパク質が組換え発現によって産生されると、当分野で既知の、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン分子）を精製するための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にタンパク質Ａ後の特定の抗原的に対する親和性、サイズカラムクロマトグラフィー及びＫａｐｐａ ｓｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィー）、遠心分離、差異溶解度又はタンパク質を精製するための任意の他の標準的な技術によって精製することができる。なお、本明細書による融合タンパク質分子は、本明細書に記載の又は当分野で既知の異種ポリペプチド配列と融合して精製を促進することができる。
免疫コンジュゲート
本開示は、免疫コンジュゲートをさらに提供し、これらの免疫コンジュゲートは、一つ又は複数の細胞毒性剤、例えば、化学治療剤又は薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はそれらの断片）又は放射性同位体にコンジュゲートする本明細書に記載の任意の抗体（例えば、抗クローディン－６単一ドメイン抗体）を含む。
免疫コンジュゲートは、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であってもよく、ここで、抗体は、一つ又は複数の薬物とコンジュゲートし、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０、５，４１６，０６４号及び欧州特許第ＥＰ ０ ４２５ ２３５ Ｂ１号を参照されたい）、アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥとＤＦ（ＭＭＡＥとＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３、５，７８０，５８８及び７，４９８，２９８号を参照されたい）、ドラスタチン、カリケアミシン又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４、５，７１４，５８６、５，７３９，１１６、５，７６７，２８５、５，７７０，７０１、５，７７０，７１０、５，７７３，００１及び５，８７７，２９６号、Ｈｉｎｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：３３３６－３３４２（１９９３）、及びＬｏｄｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：２９２５－２９２８（１９９８）を参照されたい）、アントラサイクリン、例えば、ドノマイシン又はドキソルビシン（Ｋｒａｔｚら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １３：４７７－５２３（２００６）、Ｊｅｆｆｒｅｙら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８－３６２（２００６）、Ｔｏｒｇｏｖら，Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． １６：７１７－７２１（２００５）、Ｎａｇｙら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：８２９－８３４（２０００）、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら，Ｂｉｏｏｒｇ． ＆ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９－１５３２（２００２）、Ｋｉｎｇら，Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４５：４３３６－４３４３（２００２）、及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）、メトトレキサート、ビンデシン、タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル及びオルタキセル、トリコテセン、及びＣＣ１０６５を含むが、それらに限らない。
免疫コンジュゲートは、酵素活性毒素又はその断片にコンジュゲートする本明細書に記載の抗体を含んでもよく、該酵素活性毒素又はそれらの断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、ミデカマイシンＡ鎖、α－サルシニン、アブリン、ジアンチン、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ－Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、トキシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテシンを含むが、それらに限らない。
免疫コンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして、放射性コンジュゲートを形成する本明細書に記載の抗体を含んでもよい。複数の放射性同位体は、放射性コンジュゲートの製造に用いられてもよい。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートが検出に用いられる場合、それは、シンチレーション研究に用いられる放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとも呼ばれる）に用いられるスピン標識、例えば、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでもよい。
抗体と細胞毒性剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジンジメルカプト）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノスルファン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ジスアゾ化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、二重窒素誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）で製造することができる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているようにリシン免疫毒素を製造することができる。炭素－１４－標識化１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ ＭＸ－ＤＴＰＡ ）は、放射性ヌクレオチドと抗体をコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。ＷＯ ９４／１１０２６を参照されたい。
リンカーは、細胞におけるコンジュゲートの放出を促進する「切断可能なリンカー」であってもよいが、本明細書では、切断不可能なリンカーも考慮した。本開示のコンジュゲートに用いられるリンカーは、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾンリンカー）、ジスルフィド結合含有リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー（例えば、アミノ酸を含むペプチドリンカー、これらのアミノ酸、例えば、バリン及び／又はシトルリン、例えば、シトルリン－バリン又はフェニルアラニン－リジン）、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、チオエーテルリンカー又は多剤輸送タンパク質媒介性耐性を回避するように設計される親水性リンカーを含むが、それらに限らない。
本明細書の免疫コンジュゲート又はＡＤＣは、架橋剤試薬を用いて製造されるこのようなコンジュゲートを考慮するが、それらに限らず、これらの架橋剤試薬は、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから入手された）ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣとスルホ－ＳＭＰＢ及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ビニルスルホン）を含むが、それらに限らない。
他の態様において、本明細書による抗体は、例えば、診断分子とコンジュゲート又は組換え融合を行う。このような診断及び検出は、例えば、抗体を検出可能な物質とカップリングすることによって完了することができ、これらの検出可能な物質は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼであるが、それらに限らない様々な酵素と、例えば、ストレプトアビジン／ビオチン又はアビジン／ビオチンであるが、それらに限らない接合団と、例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジナミドフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンであるが、それらに限らない蛍光材料と、例えば、ルミノールであるが、それに限らない発光材料と、例えば、ルシフェラーゼ、フルオレセイン又はイクオリンであるが、それらに限らない生物発光材料と、２２５Ａｃγ放射線、オージェ放射線、β放射線、α放射線又は陽電子放出放射性同位体などの化学発光材料とを含むが、それらに限らない。
５．３． キメラ抗原受容体
別の態様では、本明細書は、細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、該細胞外抗原結合ドメインは、本明細書による、クローディン－６に結合する単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）を含む。本発明のＶＨＨドメインを含む例示的ＣＡＲ（即ち、ＶＨＨに基づくＣＡＲ）は、以下のセクション６で説明される。
いくつかの態様において、本明細書によるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、（ａ）本明細書による、クローディン－６に特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）と、任意選択的な一つ又は複数のさらなる結合ドメインとを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。以下では、各部分及びさらなる領域をより詳しく説明する。
５．３．１． 細胞外抗原結合ドメイン
本明細書に記載のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、一つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６又はそれ以上のうちのいずれか一つ）の単一ドメイン抗体を含む。単一ドメイン抗体は、ペプチド結合又はペプチドリンカーを介して互いに直接融合することができる。
本開示のＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを含み、該細胞外抗原結合ドメインは、一つ又は複数の単一ドメイン抗体を含む。ｓｄＡｂは、同じ又は異なる供給源を有し、且つ同じ又は異なるサイズを有してもよい。いくつかの態様において、本明細書による細胞外抗原結合ドメインは、少なくとも一つの結合ドメインを含み、且つ該少なくとも一つの結合ドメインは、本明細書による、クローディン－６に結合する単一ドメイン抗体を含み、例えば、以上のセクション５．２に記載されている抗クローディン－６単一ドメイン抗体である。
いくつかの態様において、本明細書は、ポリペプチドを含むＣＡＲを提供し、該ポリペプチドは、（ａ）抗クローディン－６ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、ここで、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、以上のセクション５．２に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂである。
いくつかの態様において、本明細書は、ポリペプチドを含むＣＡＲを提供し、該ポリペプチドは、（ａ）抗クローディン－６ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、ここで、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又は（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。いくつかの態様において、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、ＩＭＧＴ番号付けスキーム、ＡｂＭ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、Ｃｏｎｔａｃｔ番号付けスキーム又はそれらの組み合わせに従ってＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３を確定する。いくつかの態様において、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの態様において、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列からなる。
他の態様において、細胞外抗原結合ドメインは、二つ又はそれ以上の抗原結合ドメインを含む。この二つ又はそれ以上の抗原結合ドメインにおいて、少なくとも一つは、本明細書による、クローディン－６に結合するＶＨＨ、及び一つ又は複数のさらなる抗原に結合する一つ又は複数のさらなる結合ドメインであり、例えば、一つ又は複数のさらなる抗原を標的とする１、２、３、４又はそれ以上のさらなる単一ドメイン抗体結合領域（ｓｄＡｂ）である。いくつかの態様において、これらのさらなる結合ドメインのうちの少なくとも一つは、ＧＰＣ３に結合する。いくつかの具体的な態様において、さらなる結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３とを含む。いくつかの態様において、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、ＩＭＧＴ番号付けスキーム、ＡｂＭ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、Ｃｏｎｔａｃｔ番号付けスキーム又はそれらの組み合わせに従ってＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３を確定する。他の態様において、さらなる結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ３を含む。いくつかの態様において、さらなる結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８を含有するＶＨドメインと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含有するＶＬドメインとを含む。いくつかの態様において、さらなる結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨドメインと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬドメインとを含む。いくつかの態様において、さらなる結合ドメインは、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの態様において、さらなる抗原結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、さらなる抗原結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーを介して互いに融合する。
本明細書による一つ又は複数の抗原結合ドメインに加えて、本明細書によるＣＡＲは、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、シグナルペプチド、細胞内シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインのうちの一つ又は複数をさらに含んでもよく、それらは、それぞれ以下でより詳しく説明される。
例えば、いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、該一次細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来する。いくつかの態様において、該細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ１３７に由来する。いくつかの態様において、クローディン－６ ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αヒンジドメイン）をさらに含む。いくつかの態様において、クローディン－６ ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端へ、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、クローディン－６ ＣＡＲは、単一特異的である。いくつかの態様において、クローディン－６ ＣＡＲは１価である。いくつかの態様において、本明細書によるクローディン－６×ＧＰＣ３ ＣＡＲは、二重特異的である。
ペプチドリンカー
本発明のＣＡＲに複数の抗体（例えば、複数の抗体断片）が存在する場合、各抗体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合することができる。抗体は、いかなるペプチドリンカーもない場合に互いに直接融合することができる。異なる抗体を連結するペプチドリンカーは、同じであってもよく、又は異なってもよい。ＣＡＲの異なるドメインもペプチドリンカーを介して互いに融合することができる。
抗体及び／又は各ドメインの構造及び／又は機能的特徴に依存して、ＣＡＲにおける各ペプチドリンカーは、同じ又は異なる長さ及び／又は配列を有してもよい。各ペプチドリンカーは、独立して選択され、最適化され得る。ＣＡＲに使用される一つ又は複数のペプチドリンカーの長さ、柔軟度及び／又は他の特性は、特性に何らかの影響を与える可能性があり、一つ又は複数の特定抗原又はエピトープに対する親和性、特異性又はアビディティを含むが、それらに限らない。例えば、隣接する二つのドメインが空間的に互いに干渉しないよう確保するために、より長いペプチドリンカーを選択してもよい。短いペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に設置されてもよい。ペプチドリンカーは、柔軟な残基（例えば、グリシン及びセリン）を含んでもよく、それによって隣接するドメインは、互いに自由に移動する。例えば、グリシン－セリン二剤は、適切なペプチドリンカーであってもよい。
ペプチドリンカーは、任意の適切な長さを有してもよい。ペプチドリンカーの長さは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００個又はそれ以上のアミノ酸のうちのいずれか一つであってもよい。ペプチドリンカーの長さは、約１００、７５、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５個又はより少ないアミノ酸のうちのいずれか一つ以下であってもよい。ペプチドリンカーの長さは、約１個のアミノ酸から約１０個のアミノ酸、約１個のアミノ酸から約２０個のアミノ酸、約１個のアミノ酸から約３０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸から約１５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸から約２５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸から約３０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸から約３０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸から約５０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸から約１００個のアミノ酸又は約１個のアミノ酸から約１００個のアミノ酸のうちのいずれか一つであってもよい。
ペプチドリンカーは、天然に存在する配列又は非天然に存在する配列を有してもよい。例えば、重鎖のみを有する抗体に由来するヒンジ領域の配列は、リンカーとして用いられてもよい。例えば、ＷＯ１９９６／３４１０３を参照されたい。ペプチドリンカーは、柔軟なリンカーであってもよい。例示的な柔軟なリンカーは、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー及び当分野で既知の他の柔軟なリンカーを含む。当分野で既知の他のリンカーは、例えば、ＷＯ ２０１６０１４７８９、ＷＯ ２０１５１５８６７１、ＷＯ ２０１６１０２９６５、ＵＳ ２０１５０２９９３１７、ＷＯ ２０１８０６７９９２、ＵＳ７７４１４６５、Ｃｏｌｃｈｅｒら，Ｊ． Ｎａｔ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８２：１１９１－１１９７（１９９０）及びＢｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）に記載されるように、本明細書によるＣＡＲに含まれてもよく、各開示内容は、参照により本明細書に組込まれる。
いくつかの具体的な態様において、ペプチドリンカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のアミノ酸配列を含む。
５．３．２． 膜貫通ドメイン
本開示のＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと直接又は間接的に融合し得る膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然又は合成供給源に由来してもよい。本明細書で使用される「膜貫通ドメイン」は、細胞膜、例えば、真核細胞膜において熱力学的に安定的な任意のタンパク質構造を指す。本明細書に記載のＣＡＲに適した膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得ることができる。代替的に、それは、合成された、非天然タンパク質セグメント、例えば、細胞膜において熱力学的に安定的なハイドロフォビンセグメントであってもよい。
膜貫通ドメインの三次元構造に基づいて膜貫通ドメインを分類する。例えば、膜貫通ドメインには、α螺旋、一つのα螺旋以上の複合体、βバレル、又は細胞リン脂質二重層に跨ることができる任意の他の安定構造が形成され得る。なお、膜貫通ドメインはさらに、同様に又は代わりに、膜貫通ドメインが膜を通過する回数及びタンパク質の配向を含む膜貫通ドメイントポロジー構造に基づいて分類され得る。例えば、一回膜貫通タンパク質は細胞膜を一回通過するが、複数回膜貫通タンパク質は細胞膜を少なくとも２（例えば、２、３、４、５、６、７又はそれ以上）回通過する。膜タンパク質は、細胞内側及び外側に対するその末端及び一つ又は複数の膜貫通セグメントのトポロジー構造に依存して、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型に定義され得る。Ｉ型膜タンパク質は、単一の膜貫通領域を有し、タンパク質のＮ－末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に位置し、該タンパク質のＣ－末端が細胞内側に存在するように配向される。ＩＩ型膜タンパク質も単一の膜貫通領域を有するが、タンパク質のＣ－末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、該タンパク質のＮ－末端が細胞に内側に存在するように配向される。ＩＩＩ型膜タンパク質は、複数の膜貫通セグメントを有し、膜貫通セグメントの数並びにＮ－末端及びＣ－末端の位置に基づいてさらに分類され得る。
本明細書に記載のＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｉ型一回膜貫通タンパク質に由来してもよい。複数回膜貫通タンパク質からの膜貫通ドメインは、本明細書に記載のＣＡＲに適合するために用いられてもよい。複数回膜貫通タンパク質は、複合体（少なくとも２、３、４、５、６、７又はそれ以上）α螺旋又はβシート構造を含んでもよい。複数回膜貫通タンパク質のＮ末端及びＣ末端は、脂質二重層の反対側に存在してもよく、例えば、タンパク質のＮ末端は脂質二重層の細胞内側に存在するが、該タンパク質のＣ末端は細胞外側に存在する。
ＣＡＲ的膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤｌ ｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、クローディン－６、ＩＬ－２Ｒ β、ＩＬ－２Ｒ γ、ＩＬ－７Ｒ ａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ及び／又はＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメインから選択された膜貫通ドメインを含んでもよい。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２及びＰＤ１からなる群から選択される分子に由来する。
いくつかの具体的な態様において、膜貫通ドメインはＣＤ８αに由来する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のアミノ酸配列を含むＣＤ８αの膜貫通ドメインである。
本明細書に記載のＣＡＲに用いられる膜貫通ドメインは、合成された、非天然タンパク質セグメントの少なくとも一部をさらに含んでもよい。膜貫通ドメインは、合成された、非天然α螺旋又はβシートであってもよい。タンパク質セグメントは、少なくとも約２０個のアミノ酸、例えば、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のアミノ酸であってもよい。合成された膜貫通ドメインの例は、当分野に既知のものであり、例えば、米国特許第７，０５２，９０６号及びＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０００／０３２７７６において、その関連開示内容は、参照により本明細書に援用される。
本明細書による膜貫通ドメインは、膜貫通領域と、膜貫通ドメインのＣ－末端側に位置する細胞内領域とを含んでもよい。膜貫通ドメインの細胞内領域は、三つ又はそれ以上のアミノ酸を含んでもよく、且ついくつかの態様において、膜貫通ドメインの脂質二重層における配向に有利である。いくつかの態様において、一つ又は複数のシステイン残基は、膜貫通ドメインの膜貫通領域に存在する。一つ又は複数のシステイン残基は、膜貫通ドメインの細胞内領域に存在し得る。膜貫通ドメインの細胞内領域は、正に荷電したアミノ酸を含んでもよい。膜貫通ドメインの細胞内領域は、アミノ酸アルギニンと、セリンと、リジンとを含んでもよい。
膜貫通ドメインの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸残基を含んでもよい。本明細書によるＣＡＲの膜貫通ドメインは、疎水性人工配列を含んでもよい。例えば、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットは、膜貫通ドメインのＣ末端位置に存在し得る。膜貫通領域は、主に疎水性アミノ酸残基、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン又はバリンを含んでもよい。膜貫通領域は、疎水性であってもよい。膜貫通領域は、ポリロイシン－アラニン配列を含んでもよい。タンパク質又はタンパク質セグメントの親水性又は疎水性又は親水性特徴は、当分野の既知の任意の方法、例えば、Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性分析によって評価され得る。
５．３．３． 細胞内シグナル伝達ドメイン
本開示のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の少なくとも一つの正常なエフェクター機能を活性化する役割を担う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、又はサイトカインの分泌を含む補助活性であってもよい。そのため、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特定の機能を実行するように細胞に指示するタンパク質部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合に鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分を使用することについては、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりにこのような短縮部分を使用してもよい。そのため、用語の細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインを含む任意の短縮部分を指すことが意図される。
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、実質的に免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインからなる細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「一次細胞内シグナル伝達ドメイン」は、刺激的に作用して免疫エフェクターを機能するように誘導する細胞内シグナル伝達配列を指す。一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ又はＩＴＡＭと呼ばれるシグナル伝達モチーフを含有してもよい。本明細書で使用される「ＩＴＡＭ」は、保存的タンパク質モチーフであり、通常、免疫細胞で発現するシグナル伝達分子の尾部に存在する。モチーフは、６～８個のアミノ酸により隔てられたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの二つのリピートを含んでもよく、ここで、各ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、保存的モチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６－８）ＹｘｘＬ／Ｉを産生する。シグナル伝達分子におけるＩＴＡＭは、細胞内シグナル伝達にとって重要であり、該シグナル伝達は、少なくとも一部がシグナル伝達分子活性化後のＩＴＡＭにおけるチロシン残基のリン酸化により媒介される。ＩＴＡＭは、シグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のドッキング部位としても機能し得る。ＩＴＡＭを例示的に含有する一次細胞内シグナル配列は、ＣＤ３ζ、ＦｃＲ γ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲ β（Ｆｃ ε Ｒｉｂ）、ＣＤ３ γ、ＣＤ３ δ、ＣＤ３ ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来するものを含む。
いくつかの態様において、該一次細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインで構成されてもよい。一次細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインであってもよい。いくつかの態様において、ＣＤ３ζの一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含む。
５．３．４． 共刺激シグナル伝達ドメイン
抗原特異性シグナルを刺激することに加えて、多くの免疫エフェクター細胞は、細胞の増殖、分化及び生存を促進し、細胞のエフェクター機能を活性化するために共刺激を必要とする。いくつかの態様において、ＣＡＲは、少なくとも一つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される用語「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、細胞内シグナル伝達を媒介して免疫応答（例えば、エフェクター機能）を誘導するタンパク質の少なくとも一部を指す。本明細書に記載のキメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激タンパク質からの細胞内シグナル伝達ドメインであってもよく、それは、シグナルを伝達し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球又は好酸球などの免疫細胞により媒介される反応を調節する。「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、共刺激分子の細胞内部分であってもよい。用語「共刺激分子」は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）における相同結合パートナーを指し、それは、共刺激リガンドに特異的に結合することによって、免疫細胞の共刺激応答、例えば、限定されないが、増殖及び生存を媒介する。
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、単一の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、二つ又はそれ以上（例えば、約２、３、４個又はそれ以上のうちのいずれか一つ）の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、二つ又はそれ以上の同じ共刺激シグナル伝達ドメインを含んでもよい。細胞内シグナル伝達ドメインは、異なる共刺激タンパク質（例えば、本明細書に記載のいずれか二つ又はそれ以上の共刺激タンパク質）からの二つ又はそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含んでもよい。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメイン）と、一つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。一つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメイン）は、任意選択的なペプチドリンカーを介して互いに融合することができる。一次細胞内シグナル伝達ドメイン及び一つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の適切な順序で並べられ得る。いくつかの態様において、一つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメイン）との間に位置する。複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、相加的又は相乗的刺激効果を提供することができる。
宿主細胞（例えば、免疫細胞）における共刺激シグナル伝達ドメインの活性化は、サイトカインの産生及び分泌、貪食特性、増殖、分化、生存及び／又は細胞傷害性を増加又は減少させるように細胞を誘導することができる。任意の共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載のＣＡＲに適用可能である。共刺激シグナル伝達ドメインの一つ又は複数のタイプは、例えば、エフェクター分子がそれに発現することになる免疫エフェクター細胞のタイプ（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球又は好酸球）及び所望の免疫エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣエフェクター）などの要因に基づいて選択される。ＣＡＲに用いられる共刺激シグナル伝達ドメインの例は、共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインであってもよく、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－ １、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ及びＰＤＣＤ６）と、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－α及びＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）と、ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６及びＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）と、任意の他の共刺激分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡ クラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｉｋａｒｏｓ、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、Ｄｅｃｔｉｎ－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）及びＮＫＧ２Ｃとを含むが、それらに限らない。
いくつかの態様において、一つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様において、本開示のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン（即ち、４－１ＢＢ）を含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含み、それは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の任意の共刺激シグナル伝達ドメインの変異体も本開示の範囲内にあり、それにより共刺激シグナル伝達ドメインは、免疫細胞の免疫応答を調節することができる。野生型対象物に比べて、共刺激シグナル伝達ドメインは、１０個まで（例えば、１、２、３、４、５又は８個）のアミノ酸残基変異を含んでもよい。一つ又は複数のアミノ酸変化を含むこのような共刺激シグナル伝達ドメインは、変異体と呼ばれてもよい。突然変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の突然変異は、シグナル伝達の増加及び免疫応答に対する刺激の増強をもたらすことができる。突然変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の突然変異は、シグナル伝達の減少及び免疫応答に対する刺激の低下をもたらすことができる。
５．３．５． ヒンジ領域
本開示のＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメインを含んでもよい。ヒンジドメインは、通常、タンパク質の二つのドメインの間で発現するアミノ酸セグメントであり、且つタンパク質の一つ又は二つの柔軟なドメインの互いに対する移動を可能にすることができる。エフェクター分子の膜貫通ドメインに対する細胞外抗原結合ドメインのこのような柔軟性及び移動を提供する任意のアミノ酸配列を使用することができる。
ヒンジドメインは、約１０～１００個のアミノ酸、例えば、約１５～７５個のアミノ酸、２０～５０個のアミノ酸又は３０～６０個のアミノ酸のうちのいずれか一つを含んでもよい。ヒンジドメインの長さは、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０又は７５個のアミノ酸のうちのいずれか一つであってもよい。
ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインであってもよい。ヒンジドメインを含む当分野の既知の任意のタンパク質のヒンジドメインは、いずれも本明細書に記載のキメラ受容体に適用可能である。ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であってもよく、且つキメラ受容体に柔軟性を与える。いくつかの態様において、該ヒンジドメインはＣＤ８αに由来する。ヒンジドメインは、ＣＤ８αのヒンジドメインの一部であってもよく、例えば、ＣＤ８αのヒンジドメインの少なくとも１５個（例えば２０、２５、３０、３５又は４０個の）連続したアミノ酸の断片を含有する。いくつかの態様において、ＣＤ８αのヒンジドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のアミノ酸配列を含む。
抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤ抗体）のヒンジドメインは、本明細書に記載のｐＨ依存性キメラ受容体系にも適用可能である。ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１とＣＨ２を連結するヒンジドメインであってもよい。ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインであってもよく、且つ抗体及び該抗体の一つ又は複数の定常領域のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、抗体及び該抗体のＣＨ３定常領域のヒンジドメインを含んでもよい。ヒンジドメインは、抗体及び該抗体のＣＨ２とＣＨ３定常領域のヒンジドメインを含んでもよい。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＤ抗体であってもよい。任意選択的に、抗体は、ＩｇＧ抗体である。抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体であってもよい。ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域及びＣＨ２とＣＨ３定常領域を含んでもよい。ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域及びＣＨ３定常領域を含んでもよい。
非天然ペプチドは、本明細書に記載のキメラ受容体のヒンジドメインとして用いられてもよい。Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間のヒンジドメインは、ペプチドリンカー、例えば、（ＧｘＳ）ｎリンカーであってもよく、ここで、ｘ及びｎは、独立して、３～１２の整数であってもよく、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又はそれ以上を含む。
５．３．６． シグナルペプチド
本開示のＣＡＲは、ポリペプチドのＮ－末端位置のシグナルペプチド（シグナル配列とも呼ばれる）を含んでもよい。通常、シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞内の所望の部位に標的化するペプチド配列である。シグナルペプチドは、エフェクター分子を細胞の分泌経路に標的化し、脂質二重層へのエフェクター分子の組込み及び固着を可能にすることができる。本明細書に記載のＣＡＲに適用し、天然に存在するタンパク質のシグナル配列又は合成された非天然シグナル配列を含むシグナルペプチドは、当業者には明らかであろう。シグナルペプチドは、ＣＤ８α、ＧＭ－ＣＳＦ受容体α及びＩｇＧ１重鎖からなる群から選択される分子に由来してもよい。いくつかの態様において、シグナルペプチドはＣＤ８αからのものである。いくつかの態様において、ＣＤ８αのシグナルペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のアミノ酸配列を含む。
５．３．７． クローディン－６及び／又はＧＰＣ３に結合する例示的ＣＡＲ
クローディン－６に結合する例示的ＣＡＲは、以下のセクション６に示すように生成され、例えば、ＣＮＢＣＡＲ１である。いくつかの態様において、本明細書は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のアミノ酸配列を含むか又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のアミノ酸配列からなるＣＡＲを提供する。いくつかの態様において、本明細書によるＣＡＲは、以下のセクション６における例示的ＣＡＲのいずれか一つに対して一定の同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドを含むクローディン－６ ＣＡＲを提供する。
いくつかの態様において、本明細書は、本明細書による任意のクローディン－６ ＣＡＲをコードする核酸を提供する。以下では、核酸配列及びベクターに関するより詳しい説明が提供される。
クローディン－６及びＧＰＣ３に結合する例示的ＣＡＲは、以下のセクション６に示すように生成され、例えば、ＣＮＢＣＡＲ３である。いくつかの態様において、本明細書は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を含むか又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列からなるＣＡＲを提供する。いくつかの態様において、本明細書によるＣＡＲは、以下のセクション６における例示的ＣＡＲのいずれか一つに対して一定の同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むクローディン－６×ＧＰＣ３ ＣＡＲを提供する。
いくつかの態様において、本明細書は、本明細書による任意のクローディン－６×ＧＰＣ３ ＣＡＲをコードする核酸を提供する。以下では、核酸配列及びベクターに関するより詳しい説明が提供される。
本明細書による他の例示的ＣＡＲは、キメラ受容体をさらに含む。いくつかの態様において、キメラ受容体は、ＴＧＦβＲ及び／又はＩＬ２３Ｒを含む。本明細書によるＣＡＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列を含んでもよい。本明細書によるＣＡＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のアミノ酸配列を含んでもよい。本明細書は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＣＡＲを提供することができる。本明細書は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＣＡＲを提供することができる。
いくつかの態様において、本明細書は、本明細書による任意のＣＡＲ及びキメラ受容体をコードする核酸を提供する。以下では、核酸配列及びベクターに関するより詳しい説明が提供される。
５．４． 操作された免疫エフェクター細胞
別の態様では、本明細書は、本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれか一つを含む宿主細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）を提供する。
そのため、いくつかの態様において、本明細書は、ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を含み、該ＣＡＲは、ポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、（ａ）一つ又は複数の抗クローディン－６ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、ここで、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、以上のセクション５．２に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂであり、例えば、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又は（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むものを含む。いくつかの態様において、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、ＩＭＧＴ番号付けスキーム、ＡｂＭ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、Ｃｏｎｔａｃｔ番号付けスキーム又はそれらの組み合わせに従ってＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３を確定する。いくつかの態様において、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの態様において、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、細胞外抗原結合ドメインは、一つ又は複数のさらなる抗原結合ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、さらなる結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３とを含む。いくつかの態様において、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、ＩＭＧＴ番号付けスキーム、ＡｂＭ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、Ｃｏｎｔａｃｔ番号付けスキーム又はそれらの組み合わせに従ってＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３を確定する。他の態様において、さらなる結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ３を含む。いくつかの態様において、さらなる結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８を含有するＶＨドメインと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含有するＶＬドメインとを含む。いくつかの態様において、さらなる結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨドメインと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬドメインとを含む。いくつかの態様において、さらなる結合ドメインは、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの態様において、さらなる抗原結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、さらなる抗原結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーを介して互いに融合する。いくつかの態様において、ペプチドリンカーの長さは約５０個のアミノ酸以下である。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２及びＰＤ１からなる群から選択される。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、該一次細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来する。いくつかの態様において、該細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ－末端と膜貫通ドメインのＮ－末端との間に位置するヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αヒンジドメイン）をさらに含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ－末端に位置するシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端へ、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
他の具体的な態様において、本明細書は、ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供し、該ＣＡＲは、ポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６又は２８のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６又は２８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、操作された免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞又は胚性幹細胞である。Ｔ細胞は、αβＴ細胞又はγδＴ細胞であってもよい。操作された免疫エフェクター細胞は、自家由来であってもよい。操作された免疫エフェクター細胞は、異種であってもよい。
操作された免疫エフェクター細胞は、一つ又は複数の治療用タンパク質及び／又は免疫調節剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤をさらに発現することができる。
５．４．２． ベクター
本開示は、本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれか一つをクローニングし発現するためのベクターを提供する。ベクターは、真核細胞、例えば、哺乳類細胞における複製及び組込みに適する。ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、牛痘ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター及びその誘導体を含むが、それらに限らない。ウイルスベクター技術は、当分野に周知のものであり、且つ例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）並びに他のウイルス学及び分子生物学的マニュアルに記載されている。
哺乳類細胞に遺伝子を移入するための多くのウイルスベースのシステムが開発されている。例えば、逆転写ウイルスは遺伝子送達システムのために便利なプラットフォームを提供する。当分野の既知の技術を用いて異種核酸をベクターに挿入し、逆転写ウイルス粒子にパッケージングすることができる。そして組換えウイルスを単離し、操作された哺乳類細胞にそれをインビトロ又はエクスビボ送達することができる。多くの逆転写ウイルス系は、当分野に既知のものである。アデノウイルスベクターを使用してもよい。多くのアデノウイルスベクターは当分野に既知のものである。レンチウイルスベクターを使用してもよい。自己不活性化型レンチウイルスベクターを使用してもよい。例えば、免疫調節剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）コード配列を担持する自己不活性化型レンチウイルスベクター及び／又はキメラ抗原受容体を担持する自己不活性化型レンチウイルスベクターは、当分野に既知のレジメンパッケージングでパッケージングされ得る。当分野の既知の方法を用いて、得られたレンチウイルスベクターを哺乳類細胞（例えば、初代ヒトＴ細胞）への形質導入に用いてもよい。レンチウイルスなどの逆転写ウイルスに由来するベクターは、トランスジェニックの長期的で安定的な組込み及び子孫細胞での増殖を可能にするため、長期的な遺伝子転移を実現するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、低免疫原性も有しており、非増殖性細胞に形質導入することができる。
いくつかの態様において、ベクターは、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸のうちのいずれか一つを含む。核酸は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位及び一つ又は複数の選択可能標識を用いることを含め、当分野における任意の周知の分子クローニング方法を用いてベクターにクローニングされ得る。核酸は、プロモーターに機能的に連結され得る。哺乳類細胞における遺伝子発現のための様々なプロモーターが探索されており、本開示では、当分野に既知のプロモーターのいずれも使用し得る。プロモーターは、構成型プロモーター又は調節型プロモーター、例えば、誘導型プロモーターに大別され得る。
ＣＡＲをコードする核酸は、構成型プロモーターに機能的に連結され得る。構成型プロモーターは、異種遺伝子（トランスジェニックとも呼ばれる）の宿主細胞での構成的発現を可能にする。本明細書で考慮される例示的な構成型プロモーターは、サイトメガロウイルスウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ヒト伸長因子－１α（ｈＥＦ１α）、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、ホスホグリセロキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、シミアンウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）及びＣＭＶ初期エンハンサーにカップリングされるニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧＧ）を含むが、それらに限らない。このような構成型プロモーターのトランスジェニック発現ドライブに対する効率は、多くの研究において広く比較されている。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ． Ｍｉｌｏｎｅらは、ＣＭＶ、ｈＥＦ１α、ＵｂｉＣ及びＰＧＫが初代ヒトＴ細胞におけるキメラ抗原受容体発現をドライブする効率を比較し、ｈＥＦ１αプロモーターが、最も高いレベルのトランスジェニック発現を誘導するだけでなく、且つＣＤ４及びＣＤ８ヒトＴ細胞において最適に維持されると結論付けた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（８）： １４５３－１４６４（２００９））。ＣＡＲをコードする核酸は、ｈＥＦ１αプロモーターに機能的に連結され得る。
ＣＡＲをコードする核酸は、誘導型プロモーターに機能的に連結され得る。誘導型プロモーターは、調節型プロモーターのクラスに属する。誘導型プロモーターは、一つ又は複数の条件、例えば、物理的条件、操作された免疫エフェクター細胞の微小環境もしくは操作された免疫エフェクター細胞の生理学的状態、誘導物（即ち、誘導剤）又はそれらの組み合わせにより誘導され得る。
誘導条件は、操作された哺乳類細胞及び／又は医薬組成物を受けた対象における内因性遺伝子の発現を誘導しない場合がある。誘導条件は、誘導物、照射（例えば、電離放射線、光）、温度（例えば、熱）、酸化還元状態、腫瘍環境及び操作された哺乳類細胞の活性化状態からなる群から選択され得る。
ベクターは、レンチウイルスベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞群からＣＡＲを発現する細胞を選択するために、選択標識遺伝子又はレポーター遺伝子をさらに含んでもよい。宿主細胞における発現を可能にするために、選択標識及びレポーター遺伝子には、両方とも適切な調節配列が隣接され得る。例えば、ベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列並びに核酸配列発現の調節に用いられ得るプロモーターを含有する。
ベクターは、ＣＡＲをコードする一つ以上の核酸を含んでもよい。ベクターは、第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列と第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列とを含有する核酸を含んでもよく、ここで、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第３の核酸配列を介して第２の核酸に機能的に連結される。自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ及びＦ２Ａからなる群から選択され得る。
５．４．３． 免疫エフェクター細胞
「免疫エフェクター細胞」は、免疫エフェクター機能を発揮し得る免疫細胞を指す。免疫エフェクター細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、且つＡＤＣＣエフェクター機能を発揮することができる。ＡＤＣＣを媒介する免疫エフェクター細胞の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単核細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、好中球、及び好酸球が挙げられる。
いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、αβＴ細胞又はγδＴ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８－、ＣＤ４－／ＣＤ８＋、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋、ＣＤ４－／ＣＤ８－又はそれらの組み合わせであってもよい。Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現し標的細胞（例えば、ＧＰＣ３＋腫瘍細胞）に結合した後に、ＩＬ－２、ＴＦＮ及び／又はＴＮＦを産生することができる。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現し標的細胞に結合した後に抗原特異性標的細胞を溶解することができる。
いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞はＮＫ細胞である。免疫エフェクター細胞は、樹立された細胞株、例えば、ＮＫ－９２細胞であってもよい。
いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞は、幹細胞（例えば、造血幹細胞、多能性幹細胞、ｉＰＳ、又は胚性幹細胞）から分化したものである。
操作された免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に導入することによって製造される。いくつかの態様において、いずれか一つの核酸又はいずれか一つの上記ベクターをトランスフェクトすることによって、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞に導入する。タンパク質を細胞膜に挿入すると共に細胞をマイクロ流体系（例えば、ＣＥＬＬ ＳＱＵＥＥＺＥ（登録商標））に通すことによって、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞に導入することができる（例えば、米国特許出願公開番号２０１４０２８７５０９を参照されたい）。
ベクター又は単離された核酸を哺乳類細胞に導入する方法は、当分野において既知である。記載されるベクターは、物理的、化学的、又は生物学的方法によって免疫エフェクター細胞に移入させることができる。
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、パーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞の産生方法は、当分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。エレクトロポレーションによってベクターを細胞に導入することができる。
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入する生物学的方法は、ＤＮＡとＲＮＡベクターを用いることを含む。ウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類、例えば、ヒトの細胞に挿入するための最も広く使用されている方法となっている。
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入するための化学的方法は、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系と、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースの系とを含む。インビトロ送達ビヒクルとしての例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
本明細書に記載の任意のＣＡＲをコードするＲＮＡ分子は、従来の方法（例えば、インビトロ転写）によって製造され、そして、ｍＲＮＡエレクトロポレーションなどの既知の方法によって免疫エフェクター細胞に導入され得る。例えば、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１０２７－１０３５（２００６）を参照されたい。
いくつかの態様において、形質導入又はトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞を、ベクター又は核酸に導入した後にエキソビボで増殖させる。形質導入又はトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞を培養して、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間、１２日間又は１４日間のいずれかにわたって増殖させてもよい。形質導入又はトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞は、操作された哺乳類細胞を選択するために、さらに評価又はスクリーニングされてもよい。
レポーター遺伝子は、トランスフェクト可能な細胞の同定及び調節配列の機能の評価に用いられ得る。通常、レポーター遺伝子は、受容体生物又は組織に存在しないか又は受容体生物又は組織に発現されず、且つその発現に対して容易に検出できる特性（例えば、酵素的活性）により示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡが受容体細胞に導入された後の適切な時間に検出される。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を含んでもよい（例えば、Ｕｉ－ＴｅｉらＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９： ７９－８２（２０００））。適切な発現系は、周知のものであり、且つ既知の技術を用いて製造されるか又は商業的に入手され得る。
操作された免疫エフェクター細胞にＣＡＲをコードする核酸が存在することを確認する他の方法は、例えば、ノーザンブロッティング法及びサザンブロッティング法、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の分子生物学的アッセイと、免疫学方法（例えば、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）によって特定のペプチドの有無を検出する生物化学的アッセイとを含む。
５．４．４． Ｔ細胞の供給源
Ｔ細胞に対して増幅及び遺伝子修飾を行う前に、対象からＴ細胞の供給源を得ることができる。Ｔ細胞は、多くの供給源から得ることができ、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む。当分野で入手可能な任意の数のＴ細胞株を使用することができる。当業者に周知の様々な技術（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）単離）を用いて、対象から採取した単位血液からＴ細胞を得ることができる。個体の循環血液からの細胞はアフェレーシス（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ）によって得られる。アフェレーシス生成物は、典型的に、リンパ球を含み、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球及び血小板を含む。アフェレーシスにより採取された細胞を洗浄して血漿部分を除去し、細胞を適切な緩衝液又は培地において後続の処理ステップに用いてもよい。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄する。洗浄溶液は、カルシウムを欠き、且つマグネシウムを欠いている場合があるか、又は多くの（全てではない場合）２価カチオンを欠いている場合がある。カルシウムが存在しない場合の初期活性化ステップは、活性化の拡大につながり得る。当業者であれば容易に理解できるように、洗浄ステップは、例えば、メーカーの指示に従って半自動化「フロースルー」遠心機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を使用するような当分野の既知の方法によって完了され得る。洗浄後、細胞を様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋なしＰＢＳ、プラズマライトＡ（ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ）又は緩衝液を含むか又は含まない他の食塩水溶液に再懸濁してもよい。代替的に、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁してもよい。
例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配遠心分離又は向流遠心エルトリエーションによって赤血球を溶解させ、且つ単球を枯渇して、末梢血リンパ球からＴ細胞を単離することができる。ポジティブ又はネガティブ選択技術によって、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などの、Ｔ細胞の特定のサブグループをさらに単離することができる。例えば、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞に対してポジティブ選択を行うのに十分な時間にわたって抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（即ち、３×２８）コンジュゲーションビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ）とインキュベートすることによって単離される。該期間は、約３０分間であってもよい。該期間の範囲は、３０分間～３６時間又はそれ以上の時間、及びその間の全ての整数値であってもよい。該期間は、少なくとも１、２、３、４、５又は６時間であってもよい。該期間は、１０～２４時間であってもよい。インキュベート期間は、２４時間であってもよい。白血病患者のＴ細胞の単離では、インキュベート時間（例えば、２４時間）を長くとることにより、細胞の収量を増加させることができる。他の細胞型に比べて、腫瘍組織又は免疫無防備状態の個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をする場合などのＴ細胞が少ない任意の場合に、長いインキュベート時間でＴ細胞を単離してもよい。なお、長いインキュベートを用いることにより、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の捕捉効率を向上させることができる。そのため、いくつかの態様において、Ｔ細胞とＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとの結合を可能にする時間を単純に短縮又は延長するか、及び／又はビーズとＴ細胞との比率を増加又は減少することによって、培養開始時又は培養中の他の時点にＴ細胞のサブグループを優先的に選択するか又は選択しないことができる。付加的に、ビーズ又は他の表面上の抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体の比率を増加又は減少させることによって、培養開始時又は他の所望の時点にＴ細胞のサブグループを優先的に選択するか又は選択しないことができる。当業者であれば、複数の選択ラウンドも使用可能であることを認識するであろう。選択手順を実施し、活性化及び増幅プロセスに「選択されていない」細胞を使用することが望ましい場合もある。「選択されていない」細胞もさらなるラウンドの選択を行うことができる。
ネガティブ選択によるＴ細胞群の濃縮は、ネガティブ選択された細胞に特有の表面標識に対する抗体との結合によって実現され得る。一つの方法は、ネガティブ磁気免疫付着又はフローサイトメトリーによって細胞選別及び／又は選択を行い、該方法は、ネガティブ選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体の混合物を用いる。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮させるために、モノクローナル抗体混合物は、通常、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ８に対する抗体を含む。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋及びＦｏｘＰ３＋を典型的に発現する調節性Ｔ細胞を濃縮させるか又はポジティブ選択することが望ましい場合がある。代替的に、抗Ｃ２５コンジュゲートビーズ又は他の類似した選択方法によってＴ調節性細胞を枯渇する。
ポジティブ又はネガティブ選択によって所望の細胞群を単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変えてもよい。細胞とビーズとの接触が最大限となることを確保するために、ビーズ及び細胞が一緒に混合される容積を著しく減少させる（即ち、細胞の増加を増加させる）ことが望ましい場合もある。例えば、２０億個の細胞／ｍｌの濃度を用いる。１０億の細胞／ｍｌの濃度を用いてもよい。１億個の細胞／ｍｌ超を用いてもよい。１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万又は５０００万個の細胞／ｍｌの濃度を用いてもよい。７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億個の細胞／ｍｌの濃度を用いてもよい。１．２５又は１．５０億個の細胞／ｍｌ濃度を用いてもよい。高濃度の使用は、細胞収量、細胞活性化及び細胞増殖の増加をもたらし得る。なお、高濃度の細胞の使用は、目的の標的抗原を弱発現する可能性のある細胞（例えば、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞）、又は多くの腫瘍細胞が存在する試料（即ち、白血病血液、腫瘍組織など）からの細胞のより有効な捕捉を可能にすることができる。このような細胞群は、治療的価値を有する可能性があり、入手が期待される。例えば、高い細胞濃度の使用は、通常弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞のより有効な選択を可能にする。
より低い濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を著しく希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用を最小限にする。これにより、粒子に結合するために所望の抗原を高量で発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、より高いレベルのＣＤ２８を発現し、且つ希釈濃度のＣＤ８＋ Ｔ細胞よりも有効に捕捉される。用いられる細胞の濃度は、５×１０６個／ｍＬである。用いられる濃度は、約１×１０５個／ｍＬ～１×１０６個／ｍＬ、及び両方の間にある任意の整数値であり得る。
細胞は、回転器上にて、２℃～１０℃又は室温で様々な速度で様々な長さの時間にわたってインキュベートされ得る。
刺激のためのＴ細胞は、洗浄ステップ後に凍結されてもよい。理論に束縛されるものではないが、凍結及び続く解凍ステップは、細胞群における顆粒球を除去し単球をある程度で除去することによってより均一な生成物を提供することができる。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップ後、細胞を凍結用溶液中に懸濁し得る。多くの凍結用溶液及びパラメータが当分野において既知であり、このような場合に有用であるが、一つの方法は、２０％ ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、又は１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ ＤＭＳＯ、又は３１．２５％ ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ ＤＭＳＯを含有する培地、又は例えば、Ｈｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の適切な細胞凍結培地を使用する。そして細胞を１℃／分間の速度で－８０℃に凍結し液体窒素貯蔵タンクの気相中に貯蔵することに関する。他の制御された凍結方法及び－２０℃又は液体窒素中での制御されていない即時の凍結が用いられ得る。
本明細書に記載されるように、凍結保存された細胞を解凍し洗浄し、活性化前に室温に一時間静置してもよい。
本開示において、本明細書に記載の増幅した細胞が必要になる可能性がある時よりも前の時点で対象から血液試料又はアフェレーシス生成物を採取することも企図される。そのため、任意の必要な時点で増幅対象の細胞供給源を採取し、Ｔ細胞などの必要な細胞を単離し凍結し、それにより後にＴ細胞療法において、本明細書に記載されるような、Ｔ細胞療法から利益を得る様々な疾患又は病態に使用することができる。血液試料又はアフェレーシスは、一般の健常な対象から取られ得る。血液試料又はアフェレーシス血液成分は、疾患に罹患するリスクがあるが、疾患に罹患していない一般の健常な対象から取られてもよく、且つその後の使用のために目的細胞を単離し凍結する。Ｔ細胞は、増幅し、凍結され、後に使用され得る。いくつかの態様において、試料は、本明細書に記載されているような特定の疾患の診断の直後であるが、何らかの処置の前に患者から採取される。様々な関連処置モダリティの前に対象の血液試料又はアフェレーシス血液成分から細胞を単離し、これらの関連処置モダリティは、ナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、エファリズマブ（ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、抗ウイルス剤、化学療法、放射線照射、免疫阻害剤（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩及びＦＫ５０６）、抗体又は他の免疫除去剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８）及び放射線照射などの作用物質で処置することを含むが、それに限らない。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリン及びＦＫ５０６）を抑制するか、又は成長因子誘導性シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼ（ラパマイシン）を抑制する（Ｌｉｕら．，Ｃｅｌｌ ６６：８０７－８１５（１９９１）、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら，Ｉｍｍｕｎ ７３：３１６－３２１（１９９１）、Ｂｉｅｒｅｒら，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎ． ５：７６３－７７３（１９９３））。患者の細胞を単離し、後に骨髓又は幹細胞移植、化学治療剤（例えば、フルダラビン）を使用するＴ細胞除去療法、外照射放射線療法（ＸＲＴ）、シトキサン又は抗体（例えば、ＯＫＴ３又はＣＡＭＰＡＴＨ）と併せて（例えば、その前、それと同時又はその後に）使用するためにそれを凍結してもよい。
Ｔ細胞は、処置後に患者から直接得ることができる。この点で、いくつかのがん処置後、特に免疫系に損傷を与える薬物による処置後、患者が通常であれば処置から回復しているところである期間に、処置直後、得られたＴ細胞の品質が最適であり得るか、又はそのエクスビボ増殖能力を改善することが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法でエクスビボ操作を行った後、これらの細胞は、生着及びインビボ増幅を増強する好ましい状態にあり得る。そのため、本開示の文脈において、該回復期間に血液細胞を採取することが企図され、Ｔ細胞、樹状細胞、又は他の造血系細胞を含む。なお、動員（例えば、ＧＭ－ＣＳＦによる動員）及びコンディショニングレジメンは、対象に条件を作り出すために用いられることができ、ここで、特に処置後に定義された時間ウィンドウの間、細胞型の再填充、再循環、再生及び／又は増幅に有利である。説明的細胞型は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞及び免疫系の他の細胞を含む。
５．４．５． Ｔ細胞の活性化及び増幅
いくつかの態様において、本明細書に記載のＣＡＲを有するＴ細胞の遺伝子修飾の前又は後に、Ｔ細胞は、通常、例えば、米国特許第６，３５２，６９４、６，５３４，０５５、６，９０５，６８０、６，６９２，９６４、５，８５８，３５８、６，８８７，４６６、６，９０５，６８１、７，１４４，５７５、７，０６７，３１８、７，１７２，８６９、７，２３２，５６６、７，１７５，８４３、５，８８３，２２３、６，９０５，８７４、６，７９７，５１４、６，８６７，０４１号、及び米国特許出願公開番号２００６０１２１００５という文献に記載の方法を用いて活性化され増幅され得る。
通常、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する試薬及びＴ細胞表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが付着している表面と接触することによって増幅することができる。具体的には、Ｔ細胞群は、本明細書に記載されるように、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片又は表面に固定される抗ＣＤ２抗体と接触するか、又はカルシウムイオンベクターに結合するプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触することによって刺激され得る。Ｔ細胞表面のヘルパー分子を共刺激するために、ヘルパー分子に結合するリガンドを用いてもよい。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、Ｔ細胞群を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させてもよい。ＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用してもよい。抗ＣＤ３抗体の例としては、ＵＣＨＴ１、ＯＫＴ３、ＨＩＴ３ａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳ）が挙げられ、当分野に周知の他の方法のように使用されてもよい（Ｇｒａｖｅｓ Ｊら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４６：２１０２（１９９１）、Ｌｉ Ｂ，ら．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１６：４８７（２００５）、Ｒｉｖｏｌｌｉｅｒ Ａ，ら，Ｂｌｏｏｄ １０４：４０２９（２００４））。当分野に周知の他の方法のように、抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられる（Ｂｅｒｇら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ． ３０（８）：３９７５－３９７７，（１９９８）、Ｈａａｎｅｎら，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９０（９）：１３１９１３２８，１９９９、Ｇａｒｌａｎｄら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ． ２２７（１－２）：５３－６３（１９９９））。
Ｔ細胞の一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、種々のレジメンによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する作用物質は、溶液中にあるか、又は表面にカップリングされ得る。表面にカップリングされる場合、作用物質は、同一の表面に（即ち、「シス」形式で）カップリングされるか又は単独の表面に（即ち、「トランス」形式で）カップリングされてもよい。代替的に、一つの作用物質は、溶液において表面及び別の作用物質にカップリングすることができる。共刺激シグナルを提供する試薬は、細胞表面に結合することができ、且つ一次活性化シグナルを提供する試薬は、溶液中にあるか又は表面とカップリングすることができる。両方の作用物質は、いずれも溶液中にあり得る。作用物質は、可溶性形態であってもよく、そしてＦｃ受容体を発現する細胞又は抗体又は作用物質に結合することになる他の結合剤などの表面に架橋結合され得る。この点で、例えば、米国特許出願公開番号２００４０１０１５１９及び２００６００３４８１０の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を参照されたく、それらは、本開示のいくつかの態様においてＴ細胞の活性化及び増幅に用いられると企図される。
いくつかの態様においてＴ細胞を、試薬をコーティングするビーズと組み合わせ、続いてビーズと細胞を分離し、そして細胞を培養する。培養前に、作用物質をコーティングするビーズと細胞とを分離せず、一緒に培養してもよい。まず磁力などの力を印加することによりビーズ及び細胞を濃縮させて、細胞表面マーカーの連結を増加させることによって、細胞刺激を誘導することができる。
例えば、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が付着している常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）とＴ細胞との接触を可能にすることによって連結され得る。細胞（例えば、１０４～４×１０８個のＴ細胞）及びビーズ（例えば、推奨力価が１：１００である抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子）を緩衝液中に組み合わせ、例えば、ＰＢＳ（２価カチオンを含まず、例えば、カルシウム及びマグネシウム）である。当業者は、任意の細胞濃度が用いられ得ることを容易に理解し得る。例えば、標的細胞は、試料中で非常に少量であり得、且つ試料の０．０１％しか占めていないか、又は試料全体（即ち１００％）が目的の標的細胞を含んでもよい。そのため、いかなる細胞数も本開示の範囲内である。細胞と粒子との接触が最大限となることを確保するために、粒子及び細胞が一緒に混合される容積を著しく減少させる（即ち、細胞の増加を増加させる）ことが望ましい場合もある。例えば、約２０億個の細胞／ｍＬの濃度を用いてもよい。１億個の細胞／ｍＬ超を用いてもよい。１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万又は５０００万個の細胞／ｍＬの濃度を用いてもよい。７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億個の細胞／ｍＬの濃度を用いてもよい。１．２５又は１．５０億個の細胞／ｍＬの濃度を用いてもよい。高濃度の使用は、細胞収量、細胞活性化及び細胞増殖の増加をもたらし得る。なお、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの、目的標的抗原を弱発現する可能性のある細胞のより有効な捕捉を可能にすることができる。このような細胞群は、治療的価値を有し得、且ついくつかの態様において入手が期待される。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞のより有効な選択を可能にする。
混合物は、数時間（約３時間）から約１４日又は両方の間の任意の時間整数値にわたって培養され得る。混合物は２１日培養され得る。ビーズとＴ細胞は、一緒に約８日培養される。ビーズとＴ細胞は、一緒に２～３日培養され得る。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上となり得るように、数回の刺激サイクルが必要であることもある。Ｔ細胞培養に適した条件は、適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又はＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））を含み、該培地は、増殖及び生存に必須な因子を含んでもよく、血清（例えば、ウシ胎仔血清又はヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ及びＴＮＦ－α又は当業者に周知の、細胞成長のための任意の他の添加剤を含む。細胞成長のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネート並びにＮ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノールなどの還元剤を含むが、それらに限らない。培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５及びＸ－ｖｉｖｏ ２０、最適化剤であって、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及びビタミンが加えられ、血清がないか又は適切な量の血清（又は血漿）もしくは１群の確定されたホルモンが補充される最適化剤、及び／又はＴ細胞を成長及び増幅させるのに十分な量のサイトカインを含んでもよい。抗生物質（例えば、ペニシリン及びストレプトマイシン）は、実験培養物のみに含まれ、対象に注入されることになる細胞培養物に含まれていない。標的細胞を、成長を支持するのに必須な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％ ＣＯ２）に維持する。異なる刺激時間に曝露されたＴ細胞は、種々の特徴を呈し得る。例えば、典型的な血液又はアフェレーシス血液成分の末梢血単核球生成物は、細胞傷害性又は抑制性Ｔ細胞群（ＴＣ、ＣＤ８）よりも多くのヘルパーＴ細胞群（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体の刺激によるＴ細胞エクスビボ増幅はＴ細胞群を産生し、該Ｔ細胞群は、約８～９日目前に主にＴＨ細胞で構成され、約８～９日目後に、Ｔ細胞群はますます多くなるＴＣ細胞群を含む。そのため、治療目的により、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞群を対象に注入することが有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異性サブグループが単離された場合、該サブグループをより大きな程度に増幅することが有益であり得る。
なお、ＣＤ４及びＣＤ８標識に加えて、他の表現型標識も有意に異なるが、細胞増殖中にかなり再現可能である。そのため、このような再現性により、特定の目的のために活性化されたＴ細胞生成物をカスタマイズすることが可能となる。
５．４．６． 外因的に導入されたＴＧＦβＲ及びＩＬ２３Ｒを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞
いくつかの態様において、本明細書によるＴ細胞は、外因的に導入された、ＴＧＦβＲとＩＬ２３Ｒとを含むキメラ受容体（本明細書では「ＴＦ２３」とも呼ばれる）をさらに発現する。
より具体的には、いくつかの態様において、外因的に導入されたＴＧＦβＲとＩＬ２３Ｒを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴＧＦβＲとＩＬ２３Ｒの両方を含むポリペプチドをコードする一つ又は複数の核酸を導入することによって産生され得る。
ＣＡＲ、ＴＧＦβＲ及びＩＬ２３Ｒは、それぞれ単独のポリペプチドとしてＴ細胞に個別に導入され得る。例えば、本明細書によるＣＡＲをコードする核酸、ＴＧＦβＲをコードする核酸及びＩＬ２３Ｒをコードする核酸をそれぞれＴ細胞に導入してもよい。
代替的に、三者のうちのいずれか両者又は三者全ては、一つの核酸により単一ポリペプチドとしてＴ細胞に一緒に導入されてもよく、該核酸は細胞内で翻訳される時に切断される。例えば、本明細書によるＣＡＲと、自己切断ペプチドリンカーを介して連結されるＴＧＦβＲとを含むポリペプチドをコードする核酸をＴ細胞に導入し、ＩＬ２３Ｒをコードする核酸をＴ細胞に別々に導入する。同様に、本明細書によるＣＡＲと、自己切断ペプチドリンカーを介して連結されるＩＬ２３Ｒとを含むポリペプチドをコードする核酸をＴ細胞に導入し、ＴＧＦβＲをコードする核酸をＴ細胞に別々に導入する。いくつかの態様において、自己切断ペプチドリンカーを介して互いに連結されるＣＡＲ、ＴＧＦβＲ及びＩＬ２３Ｒのうちの三者の全てを含むポリペプチドをコードする核酸をＴ細胞に導入してもよい。以上では、自己切断ペプチドリンカーがより詳細に説明されている。２Ａ自己切断ペプチドは、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ又はそれらの変異体からなる群から選択されてもよい。自己切断ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２のアミノ酸配列を含む２Ａ自己切断ペプチドＰ２Ａ断片であってもよい。
代替的に、本明細書によるＣＡＲ－Ｔ細胞は、複数の領域、例えば、ＣＡＲをコードする領域、ＴＧＦβＲをコードする領域及び／又はＩＬ２３Ｒをコードする領域を含むポリヌクレオチドから産生され得る。異なる領域は、同じプロモーターにより制御され得る。例えば、いくつかの態様において、本明細書は、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を用いて、一つのプロモーターからの複数の遺伝子を発現する。他の態様において、異なる領域は、単独のプロモーターにより制御される。
いくつかの具体的な態様において、本明細書によるＣＡＲ－Ｔ細胞には、ＴＦ２３キメラ受容体が外因的に導入され、該ＴＦ２３キメラ受容体は、ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメインを含み、図７Ａに示すとおりである。いくつかの具体的な態様において、本明細書によるＣＡＲ－Ｔ細胞は、外因的に導入されたポリペプチドを発現し、該ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２及び４４～４５のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含む。他の具体的な態様において、本明細書によるＣＡＲ－Ｔ細胞には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３の核酸配列を含むポリヌクレオチドが外因的に導入された。
５．５． ポリヌクレオチド
いくつかの態様において、本開示は、クローディン－６に結合する本発明の抗体（例えば、ＶＨＨドメイン抗体）をコードするポリヌクレオチド、及び本明細書に記載のクローディン－６に結合する抗体を含む融合タンパク質を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ形態又はＤＮＡ形態であってもよい。ＤＮＡは、ｃＤＮＡと、ゲノムＤＮＡと、合成ＤＮＡとを含み、且つ二本鎖又は一本鎖であってもよく、且つ一本鎖であれば、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ形態であってもよい。ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドであってもよい。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書によるクローディン－６結合ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ形態又はＤＮＡ形態であってもよい。ＤＮＡは、ｃＤＮＡと、ゲノムＤＮＡと、合成ＤＮＡとを含み、且つ二本鎖又は一本鎖であってもよく、且つ一本鎖であれば、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ形態であってもよい。ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドであってもよい。
本開示は、さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチドの変異体に関し、ここで、該変異体は、例えば、本開示のクローディン－６に結合する抗体又はＣＡＲの断片、類似体及び／又は誘導体をコードする。本開示は、ポリヌクレオチドを提供することができ、該ポリヌクレオチドは、本開示のクローディン－６に結合する抗体又はＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、且ついくつかの態様において、少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される「参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一性」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」という語句は、該ポリヌクレオチド配列が、該参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチド当たり五つまでの点突然変異を含み得ることを除いて、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一性を有することを意味することが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５％までのヌクレオチドを削除するかもしくは別のヌクレオチドで置換してもよく、又は参照配列における全ヌクレオチドの５％までの複数のヌクレオチドを参照配列に挿入してもよい。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位置又はそれらの末端位置の間にある、参照配列における単一のヌクレオチドの間に散在するか又は参照配列内にある一つ又は複数の連続した基における任意の場所で発生し得る。
ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域又は両方に変化を含有し得る。ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加、又は欠失を生じさせるが、コードされるポリペプチドの特性又は活性を変化させない変化を含んでもよい。ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換を含んでもよく、それは、（遺伝子コードの縮重に起因して）ポリペプチドのアミノ酸配列の変化を生じさせない。ポリヌクレオチド変異体は、種々の理由、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化する（即ち、ヒトｍＲＮＡのコドンを大腸菌などの細菌宿主に好ましいものに変更する）ために産生され得る。ポリヌクレオチド変異体は、配列の非コード又はコード領域において少なくとも一つのサイレント突然変異を含んでもよい。
ポリヌクレオチド変異体を産生して、コードされるポリペプチドの発現（又は発現レベル）を調節又は改変することができる。ポリヌクレオチド変異体を産生して、コードされるポリペプチドの発現を増加することができる。ポリヌクレオチド変異体を産生して、コードされるポリペプチドの発現を減少させることができる。親ポリヌクレオチド配列に比べて、ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの発現の増加を示してもよい。親ポリヌクレオチド配列に比べて、ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの発現の減少を示してもよい。
本明細書に記載の核酸分子を含むベクターがさらに提供される。一態様において、核酸分子を組換え発現ベクターに組込んでもよい。本開示は、本開示の任意の核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書で使用される「組換え発現ベクター」という用語は、遺伝子修飾されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド構築体を指し、該構築体が、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、且つベクターが、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを細胞内で発現させるのに十分な条件下で細胞と接触する場合、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、宿主細胞を介した発現が許容される。本明細書に記載のベクターは、全体的には天然に存在するものではなく、しかしながら、一部のベクターは、天然に存在するものであってもよい。記載される組換え発現ベクターは、任意のタイプのヌクレオチドを含んでもよく、ＤＮＡとＲＮＡを含むが、それらに限らず、それらは、一本鎖又は二本鎖、合成されるか又は一部が天然の供給源から得られたものであってもよく、且つ天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含有してもよい。組換え発現ベクターは、天然に存在するか又は非天然に存在するヌクレオチド間結合、又は二つのタイプの結合を含んでもよい。非天然に存在するか又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写又は複製を防げない。
本開示の組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであってもよく、且つ任意の適切な宿主を形質転換又はトランスフェクトするために用いられ得る。適切なベクターは、増殖及び増幅又は発現又はその両方を行うために用いられるように設計されるベクター、例えば、プラスミドとウイルスを含む。ベクターは、ｐＵＣ系（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びｐＥＸ系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）からなる群から選択されてもよい。ファージベクター、例えば、λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＥＭＢＬ４、λＮＭ１１４９及びλＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用することができる。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ０１．２、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１．３及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、逆転写ウイルスベクター、例えば、γ逆転写ウイルスベクターであってもよい。
例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら及び上記Ａｕｓｕｂｅｌらに記載される標準的な組換えＤＮＡ技術で組換え発現ベクターを製造することができる。原核又は真核宿主細胞内で機能する複製系を含むように、環状又は線状発現ベクターの構築体を製造してもよい。複製系は、例えば、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、２μプラスミド、λ、ウシパピローマウイルスなどに由来してもよい。
組換え発現ベクターは、調節配列、例えば、転写及び翻訳開始と終結コドンを含んでもよく、それらは、ベクターが導入される宿主のタイプ（例えば、細菌、植物、真菌又は動物）に特異的であり、場合によって決まり、ベクターがＤＮＡに基づくかＲＮＡに基づくかを考慮する。
組換え発現ベクターは、一つ又は複数の標識遺伝子を含んでもよく、それらは、形質転換又はトランスフェクトされた宿主を選択することを許容する。標識遺伝子は、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、栄養要求性宿主における相補性を含み、原栄養株などを提供する。前記発現ベクターの適切な標識遺伝子は、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ヒスチジノールｘ耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子を含む。
組換え発現ベクターは、本開示のヌクレオチド配列に機能的に連結される天然又は標準プロモーターを含んでもよい。プロモーターの選択、例えば、強いプロモーター、弱いプロモーター、組織特異的プロモーター、誘導型プロモーター及び発生特異的プロモーターは、当業者の一般的な技術範囲内にある。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとの組み合わせも当業者の技術範囲内にある。プロモーターは、非ウイルスプロモーター又はウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター又はマウス幹細胞ウイルスの長末端反復から見出されるプロモーターであってもよい。
組換え発現ベクターは、一過性発現、安定的発現又はその両方に用いられるように設計されてもよい。なお、組換え発現ベクターを製造して構成型発現又は誘導型発現に用いることができる。
なお、組換え発現ベクターに自殺遺伝子を含ませることができる。本明細書で使用される「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞の死を引き起こす遺伝子を指す。自殺遺伝子は、該遺伝子を発現する細胞に、作用物質、例えば、薬物に対する感受性を付与する遺伝子であってもよく、且つ細胞が作用物質と接触するか又は作用物質に曝露される場合に、細胞死を引き起こす。自殺遺伝子は、当分野で既知のものであり、且つ例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びニトロレダクターゼを含む。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、単離されたものである。ポリヌクレオチドは、実質的に純粋なものであってもよい。
本明細書に記載の核酸分子を含む宿主細胞がさらに提供される。宿主細胞は、異種核酸を含有する任意の細胞であってもよい。異種核酸は、ベクター（例えば、発現ベクター）であってもよい。例えば、宿主細胞は、任意の生体からの細胞であってもよく、任意の方式で選択され、修飾され、形質転換され、増殖し、使用されるか又は操作され、細胞、例えば、細胞発現遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列、タンパク質又は酵素によって物質を産生するためのものである。適切な宿主は確定され得る。例えば、ベクター骨格及び所望の結果に基づいて宿主細胞を選択することができる。例えば、プラスミド又はコスミドを原核宿主細胞に導入して、いくつかのタイプのベクターを複製することができる。ＤＨ５α、ＪＭ１０９及びＫＣＢ、ＳＵＲＥ（登録商標）コンピテント細胞及びＳＯＬＯＰＡＣＫ Ｇｏｌｄ細胞などの（それらに限らない）細菌細胞は、ベクターを複製及び／又は発現するための宿主細胞として用いられてもよい。また、細菌細胞（例えば、大腸菌ＬＥ３９２）は、ファージウイルスの宿主細胞として用いられてもよい。宿主細胞として用いられ得る真核細胞は、酵母（例えば、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００及びＹＰＨ５０１）、昆虫及び哺乳類を含むが、それらに限らない。複製及び／又は発現ベクターに用いられる哺乳類真核宿主細胞の例は、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、ＣＯＳ、Ｓａｏｓ、ＰＣ１２、ＳＰ２／０（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ－１５８１）、ＮＳ０（欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ Ｎｏ． ８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）マウス細胞株を含むが、それらに限らない。例示的ヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－ＴＩＢ－１９６）である。他の有用な細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来する細胞株、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６１）又はＤＧ４４を含む。
５．６． 医薬組成物
一態様では、本開示は、抗体（例えば、ＶＨＨ）、抗体の結合分子又は治療用分子又は本開示の操作された免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物をさらに提供する。いくつかの態様において、医薬組成物は、治療有効量の、抗体（例えば、本明細書によるＶＨＨ）、抗体の結合分子又は治療用分子又は本開示の操作された免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
いくつかの態様において、本明細書は、治療有効量の本明細書による抗体（例えば、本明細書によるＶＨＨ）と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。抗体は、本明細書による抗ＣＬＤＮ６ ｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）であってもよく、又は抗体は、抗ＣＬＤＮ６ ｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）と別の抗体（例えば、ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ）との組み合わせであってもよい。抗体は、アゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体であり得る。
いくつかの態様において、本明細書は、治療有効量の、本明細書による抗体を含む治療用分子（例えば、融合タンパク質、免疫コンジュゲート及び多重特異性結合分子）と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
他の態様において、本明細書は、治療有効量の、本明細書による抗体を含むＣＡＲと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。ＣＡＲは、本明細書によるＣＬＤＮ６ ＣＡＲであってもよい。ＣＡＲは、本明細書によるＣＬＤＮ６×ＧＰＣ３二重特異性ＣＡＲであってもよく、又はＣＡＲは、本明細書によるＣＬＤＮ６ ＣＡＲと、別の抗原（例えば、ＧＰＣ３）を標的とする別のＣＡＲとの組み合わせであってもよい。
他の態様において、本明細書は、治療有効量の、本明細書による操作された免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。操作された免疫エフェクター細胞は、本明細書によるＣＬＤＮ６ ＣＡＲを含んでもよい。操作された免疫エフェクター細胞は、本明細書によるＣＬＤＮ６×ＧＰＣ３二重特異性ＣＡＲを含んでもよい。代替的に、操作された免疫エフェクター細胞は、本明細書によるＣＬＤＮ６ ＣＡＲと、別の抗原（例えば、ＧＰＣ３）を標的とする別のＣＡＲとの組み合わせを含んでもよい。
他の態様において、本明細書は、例えば、ベクターにおける治療有効量の本明細書による核酸と、例えば、遺伝子治療に適する薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
「賦形剤」という用語は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全又は不完全））、キャリア剤又はビヒクルを指してもよい。薬物賦形剤は、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成供給源のものを含む油及び水などの無菌の液体であってもよい。生理食塩水溶液、グルコース水溶液及びグリセリン溶液も液体賦形剤として用いることができる。適切な薬物賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、エチレングリコール、水、エタノールなどを含む。該組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝剤をさらに含んでもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。適切な薬物賦形剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されている。このような組成物は、患者への投与に適した形態を提供するために、予防又は治療有効量の、例えば、精製された形態で、本明細書に提供される活性成分、及び適切な量の賦形剤を含むことになる。該製剤は投与方式に適しているべきである。
賦形剤の選択は、特定の細胞、結合分子及び／又は抗体及び／又は投与方法により部分的に確定され得る。そのため、複数の適切な製剤が存在する。
通常、許容可能なキャリア剤、賦形剤又は安定剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であり、且つ緩衝剤と、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、メタ重亜硫酸ナトリウムを含む酸化防止剤と、防腐剤、等張剤、安定剤、金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）と、ＥＤＴＡなどのキレート剤、及び／又は非イオン性界面活性剤とを含む。
緩衝剤は、特に安定性がｐＨ依存的である場合、治療効果を最適化する範囲内にｐＨを制御するために用いることができる。本開示に適した緩衝剤は、有機酸、無機酸及びそれらの塩を含む。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩である。なお、緩衝液は、ヒスチジン及びトリメチルアミン塩、例えば、Ｔｒｉｓを含んでもよい。
微生物の増殖を遅らせるため、保存剤を加えてもよい。本開示に適した防腐剤は、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウムと、ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩素、臭素、ヨウ素）、塩化ベンゼトニウム、チメロサール、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン類と、カテコールと、レソルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール及びｍ－クレゾールとを含む。
等張剤（「安定剤」と呼ばれることもある）は組成物における液体の張力を調節又は維持するために存在してもよい。タンパク質及び抗体などの大きな荷電生体分子と共に使用される場合、それらは、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用することによって分子間及び分子内相互作用の可能性を低下させることができるため、多くの場合に「安定剤」と呼ばれる。例示的等張剤は、多価糖アルコール類、三価以上の糖アルコール類、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールである。
別の例示的賦形剤は、（１）充填剤と、（２）溶解度促進剤と、（３）安定剤と、（４）変性又は容器壁への接着を防止する試薬とを含む。このような賦形剤は、多価糖アルコール類（上記に列挙した）と、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸と、スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール類（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコールなどの有機糖又は糖アルコール類と、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウムなどの含硫還元剤と、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は他の免疫グロブリン低分子量タンパク質と、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマーと、単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）と、二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）と、ラフィノースなどの三糖類と、デキストリン又はデキストランなどの多糖類とを含む。
治療剤の溶解を促進し、治療用タンパク質を撹拌誘発性凝集から保護するために、非イオン性界面活性剤又はデタージェント（「湿潤剤」とも呼ばれる）が存在し得、これは、活性治療用タンパク質又は抗体の変性を引き起こすことなく製剤が剪断表面応力に曝露されることも可能にする。適切な非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート類（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポロキサマー類（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール類、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル類（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。利用可能なアニオン性デタージェントとしては、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム及びジオクチルスルホン酸ナトリウムが挙げられる。カチオン性デタージェントとしては、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
医薬組成物は、インビボ投与に用いるために、滅菌されたものであり得る。医薬組成物は、滅菌濾過膜で濾過することによって滅菌され得る。本明細書の医薬組成物は、通常、滅菌の入り口を有する容器、例えば、皮下注射針によって穿刺可能なストッパを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルに入れられる。
投与経路は、単回又は複数回のボーラス注入又は適切な方式、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内もしくは関節内経路による注射もしくは注入、局所投与、吸入、又は持続放出もしくは遅延放出方式による長時間注入などの、既知且つ許容可能な方法に従って行われる。
医薬組成物は、制御放出又は持続放出系として提供され得る。制御放出又は持続放出を実現するために、ポンプを使用してもよい（例えば、Ｓｅｆｔｏｎ，Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １４：２０１－４０（１９８７）、Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７－１６（１９８０）、及びＳａｕｄｅｋら，Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１：５６９－７４（１９８９）を参照されたい）。ポリマー材料は、予防剤又は治療剤（例えば、本明細書に記載の融合タンパク質）又は本明細書による組成物の制御放出又は持続放出を実現するために用いられてもよい（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（ＬａｎｇｅｒとＷｉｓｅによる編集，１９７４）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＳｍｏｌｅｎとＢａｌｌによる編集，１９８４）、ＲａｎｇｅｒとＰｅｐｐａｓ，Ｊ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｖ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３：６１－１２６（１９８３）、Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０－９２（１９８５）、Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２５：３５１－５６（１９８９）、Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７１：１０５－１２（１９８９）、米国特許第５，６７９，３７７、５，９１６，５９７、５，９１２，０１５、５，９８９，４６３及び５，１２８，３２６号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９９／１５１５４及びＷＯ ９９／２０２５３を参照されたい）。持続放出製剤に用いられるポリマーの例は、ポリ（２－メタクリル酸ヒドロキシエチル）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン－コ－酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド類（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド類（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）類（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステル類を含むが、それらに限らない。持続放出製剤に使用されるポリマーは、不活性であり、浸出性不純物を含まず、貯蔵時に安定性があり、滅菌され、且つ生分解性であってもよい。制御放出又は持続放出系を特定の標的組織、例えば、鼻道又は肺付近に置いてもよいため、全身用量の一部のみが必要となる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ 第２巻，１１５－３８（１９８４）を参照されたい）。制御放出系は、例えば、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－３３（１９９０）によって検討されている。当業者に周知の任意の技術は、本明細書に記載の一つ又は複数の作用物質を含む持続放出製剤を産生するために用いられてもよい（例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９１／０５５４８及びＷＯ ９６／２０６９８、Ｎｉｎｇら，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３９：１７９－８９（１９９６）、Ｓｏｎｇら，ＰＤＡ Ｊ． ｏｆ Ｐｈａｒｍａ． Ｓｃｉ． ＆ Ｔｅｃｈ． ５０：３７２－９７（１９９５）、Ｃｌｅｅｋら，Ｐｒｏ． Ｉｎｔ’ｌ． Ｓｙｍｐ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌ． Ｂｉｏａｃｔ． Ｍａｔｅｒ． ２４：８５３－５４（１９９７）、及びＬａｍら，Ｐｒｏｃ． Ｉｎｔ’ｌ． Ｓｙｍｐ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ． Ｂｉｏａｃｔ． Ｍａｔｅｒ． ２４：７５９－６０（１９９７）を参照されたい）。
本明細書に記載の医薬組成物は、処置する特定の適応症の必要に応じて一つよりも多くの活性化合物又は活性剤をさらに含んでもよい。代替的に又は付加的に、組成物は、細胞毒性剤、化学療法剤、サイトカイン、免疫阻害剤又は増殖阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、所望の目的に有効な量で適宜組み合わせられて存在する。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって製造されるマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノパーティクル及びナノカプセル）又はマクロエマルションにも封入され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１８版に開示されている。
様々な組成物及び送達システムは、周知であり、且つ本明細書による治療剤と共に使用することができ、該組成物及び送達システムは、リポソーム、マイクロパーティクル、マイクロカプセルに封入され、本明細書による抗体又は治療用分子を発現することができる組換え細胞、レトロウイルスベクター又は他のベクターの一部として構築される核酸などを含む。
いくつかの態様において、本明細書による医薬組成物は、治療有効量又は予防有効量などの、疾患又は障害を処置又は予防するのに有効な量の結合分子及び／又は細胞を含む。いくつかの態様において、治療又は予防効果は、処置される対象を定期的に評価することによってモニタリングされる。数日以上の繰り返し投与については、病態に応じて、疾患症状の所望の抑制が起こるまで処置を繰り返して行う。しかしながら、他の投与量レジメンは、有用であり、且つ確定され得ることもある。
５．７． 方法及び使用
別の態様では、本明細書は、本願のクローディン－６結合分子を使用する方法及びこれらのクローディン－６結合分子の使用を提供し、これらのクローディン－６結合分子は、抗クローディン－６抗体（例えば、クローディン－６結合ＶＨＨ）、クローディン－６及び／又はＧＰＣ３に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はキメラ受容体を発現する操作された細胞を含む。
５．７．１． 治療方法及び使用
このような方法及び使用は、治療用方法及び使用を含み、例えば、分子、細胞又はそれらを含有する組成物を、クローディン－６及び／又はＧＰＣ３を発現するか又はクローディン－６及び／又はＧＰＣ３発現に関連する疾患、病態又は障害に罹患し、及び／又はその細胞又は組織がクローディン－６及び／又はＧＰＣ３を発現する対象に投与することに関する。いくつかの態様において、分子、細胞及び／又は組成物は、有効量で投与されて、疾患又は障害の処置を実現する。使用は、抗体と細胞のこれらの方法と処置における使用、及びこれらの治療方法を行うための薬物の製造における使用を含む。いくつかの態様において、これらの方法は、抗体もしくは細胞又はこれらの抗体もしくは細胞を含む組成物を、疾患又は病態に罹患しているか又は罹患の疑いがある対象に投与することによって行われる。いくつかの態様において、これらの方法は、これにより対象の疾患又は障害を処置する。
本明細書による処置は、疾患もしくは障害又はそれらに関連する症状、副効用もしくは結果もしくは表現型の完全又は部分的な改善又は減少をもたらすことができる。処置の理想的効果は、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は軽減、及び寛解又は予後の改善を含むが、それらに限らない。これらの用語は、疾患の完治、又は任意の症状又は全ての症状もしくはアウトカムに対する一つ又は複数の影響の完全除去を含むが、これを示唆するものではない。
本明細書で使用されるいくつかの態様において、本明細書による処置は、疾患又は障害の進行を遅延させ、例えば、疾患（例えば、がん）の進行を遅くし、妨げ、減速させ、阻止し、安定化し、抑制し及び／又は遅らせる。この遅延は、疾患の歴史及び／又は処置される個体に応じて、異なる時間長を有してもよい。当業者には明らかなこととして、個体が疾患又は障害に罹患していないため、十分又は有意な遅延は、実際的には、予防を包含することができる。例えば、進行がん（例えば、転移の進行）を遅延させる可能性がある。他の態様において、本明細書による方法又は使用は、疾患又は障害を予防する。
いくつかの態様において、疾患又は障害は、クローディン－６関連疾患又は障害である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、クローディン－６陽性がん、即ち、クローディン－６を発現又は過剰発現するがんである。いくつかの態様において、クローディン－６陽性がんは、固形腫瘍がんである。クローディン－６陽性がんの例は、胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）、卵巣がん（ＯＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、類内膜がん（ＥＣ）及びＡＦＰ＋胃がん（ＡＦＰ＋ＧＣ）を含むが、それらに限らない。
いくつかの態様において、疾患又は障害は、ＧＰＣ３関連疾患又は障害である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、ＧＰＣ３陽性がんであり、即ちＧＰＣ３を発現又は過剰発現するがんである。ＧＰＣ３陽性がんの例は、ＨＣＣ、黒色腫、卵巣明細胞がん、卵黄嚢腫（ＹＳＴ）、神経芽腫、肝芽腫、腎芽腫（ウィルムス腫瘍）、肺扁平上皮がん、肺腺がん、大細胞肺がん、小細胞肺がん、精巣非セミノーマ性胚細胞腫瘍、脂肪肉腫、子宮頸部上皮内腫瘍、副腎腺腫、神経鞘腫、胚性腫瘍、胃がん（例えば、アルファフェトプロテインを産生する胃がん）、結腸直腸がん、食道がん及び甲状腺がんを含むが、それらに限らない。いくつかの態様において、疾患又は障害は、ＨＣＣである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、黒色腫である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、卵巣明細胞がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、卵黄嚢腫（ＹＳＴ）である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、神経芽腫である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、肝芽腫である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、腎芽腫（ウィルムス腫瘍）である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、肺扁平上皮がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、肺腺がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、大細胞肺がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、小細胞肺がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、睾丸非精原細胞性生殖細胞瘤である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、脂肪肉腫である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、子宮頸部上皮内腫瘍である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、副腎腺腫である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、神経鞘腫である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、胚性腫瘍である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、胃がん（例えば、アルファフェトプロテインを産生する胃がん）である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、結腸直腸がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、食道がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、甲状腺がんである。
いくつかの態様において、これらの方法は、養子細胞療法を含み、これにより、提供されたクローディン－６標的化ＣＡＲを発現する、遺伝子操作された細胞を対象に投与する。このような投与は、クローディン－６標的化方式で細胞の活性化（例えば、Ｔ細胞の活性化）を促進して、疾患又は障害の細胞を標的化して破壊することができる。いくつかの態様において、提供されたクローディン－６標的化ＣＡＲを発現する、遺伝子操作された細胞は、さらに別の抗原結合ドメイン（例えば、ＧＰＣ３標的化ｓｃＦｖ）を発現する。いくつかの態様において、遺伝子操作された細胞は、さらにキメラ受容体を発現する。
いくつかの態様において、これらの方法は、これらの細胞又はこれらの細胞を含む組成物を、対象、組織又は細胞、例えば、疾患又は障害に罹患している、疾患又は障害のリスクにあるか又は疾患又は障害に罹患する疑いがある対象、組織又は細胞に投与することを含む。いくつかの態様において、例えば、養子Ｔ細胞療法などの養子細胞療法によって、処置対象の特定の疾患又は障害に罹患している対象に細胞、群及び組成物を投与する。いくつかの態様において、細胞又は組成物を対象、例えば、疾患又は障害に罹患しているか又は疾患又は障害のリスクにある対象に投与する。いくつかの態様において、これにより、これらの方法は、例えば、ＧＰＣ３を発現するがんにおける腫瘍負荷を軽減することによって疾患又は障害の一つ又は複数の症状を処置（例えば、改善）する。
養子細胞療法に用いられる細胞投与方法は、既知のものであり、例えば、米国特許出願公開番号２００３／０１７０２３８、米国特許第４，６９０，９１５号、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ８（１０）：５７７－８５（２０１１）、Ｔｈｅｍｅｌｉら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３１（１０）：９２８－９３３（２０１３）、Ｔｓｕｋａｈａｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４３８（１）： ８４－９（２０１３）、及びＤａｖｉｌａら，ＰｌｏＳ ＯＮＥ ８（４）： ｅ６１３３８（２０１３）という文献に記載されている。これらの方法は、本明細書による方法及び組成物と併用することができる。
細胞療法（例えば、養子Ｔ細胞療法）は、自己伝達によって実施することができ、ここで、細胞は、細胞療法を受ける対象又はこのような対象に由来する試料から単離され及び／又は他の方式で製造される。そのため、いくつかの態様では、細胞は、処置を必要とする対象に由来し、且つ単離され処理された後、同一の対象に投与される。細胞療法（例えば、養子Ｔ細胞療法）は、同種異系伝達によって実施することができ、ここで、細胞は、細胞療法を受けるか又は最終的に受けた対象以外の対象（例えば、第１の対象）から単離され及び／又は他の方式で製造される。そして細胞を同じ種の異なる対象、例えば、第２の対象に投与する。第１の対象と第２の対象は、遺伝的に同じであってもよい。第１の対象と第２の対象は、遺伝的に似ているものであってもよい。第２の対象は、第１の対象と同じＨＬＡタイプ又はスーパータイプを発現することができる。細胞療法（例えば、養子Ｔ細胞療法）は、同種異系伝達によって実施することができる。
細胞、細胞群又は組成物が投与される対象は、ヒトなどの霊長類動物である。対象は、男性又は女性であり得、且つ乳児、若年、青年、成人及び老年対象を含め、任意の適切な年齢であり得る。いくつかの例において、対象は、疾患、養子細胞療法のための、及び／又は毒性アウトカムを評価するための検証された動物モデルである。いくつかの態様において、対象は、少なくとも一つのＣＬＤＮ６薬剤に対して耐性を有する。いくつかの態様において、対象は、少なくとも一つのＧＰＣ３薬剤に対して耐性を有する。いくつかの態様において、対象は、少なくとも一つのＣＬＤＮ６薬剤及び少なくとも一つのＧＰＣ３薬剤に対して耐性を有する。
クローディン－６結合分子、例えば、クローディン－６に結合する抗体とキメラ抗原受容体及びそれらを発現する細胞は、任意の適切な方式、例えば、注射、例えば、静脈内又は皮下注射、眼内注射、眼窩周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、球後注射、球周囲注射又は後部強膜近傍送達によって投与され得る。それらは、非経口、肺内及び鼻腔内投与され、且つ局所処置が必要とされる場合、病巣内投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。
疾患又は病態を有効に予防及び／又は処置する、本明細書による予防剤又は治療剤の量は、標準的な臨床技術によって確定することができる。有効投与量は、インビトロ又は動物モデル試験システムから得られた投与量－反応曲線から推定され得る。疾患の予防又は処置について、結合分子又は細胞の適切な投与量は、処置する疾患又は障害のタイプ、結合分子のタイプ、疾患又は障害の重症度及び経過、治療剤が予防又は治療目的で投与されるか否か、過去の療法、患者の臨床病歴及び薬剤に対する反応、並びに主治医の判断に依存してもよい。いくつかの態様において、組成物、分子及び細胞は、一回又は一連の処置において患者に適切に投与される。
例えば、疾患のタイプ及び重症度に応じて、抗体の用量は、約１０μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上を含んでもよい。複数の投与量を間欠的に投与することができる。初期のより高い負荷投与量を投与し、その後に一つ又は複数のより低い投与量を投与してもよい。ここで、医薬組成物は、本明細書に記載の抗体のうちのいずれか一つを含んでもよく、医薬組成物は、毎日約１０ｎｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ個体体重又はそれ以上の用量、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与され、これは投与経路に依存する。文献では、特定の用量及び送達方法に関する指針が提供される（例えば、米国特許第４，６５７，７６０、５，２０６，３４４及び５，２２５，２１２号を参照されたい）。
結合分子を含有する遺伝子操作された細胞の場合に、対象に約一百万から約１千億個の細胞及び／又は体重１キログラム当たり該量の細胞を投与してもよい。ここで、該医薬組成物は、本明細書に記載の操作された免疫細胞のうちのいずれか一つを含んでもよく、該医薬組成物は、少なくとも約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、又は１０９個の細胞／ｋｇ個体体重のうちのいずれか一つの用量で投与される。投与量は、疾患又は障害及び／又は患者及び／又は他の処置の具体的な属性に応じて変化することができる。
いくつかの態様において、医薬組成物を一回投与する。いくつかの態様において、医薬組成物を複数回（例えば、２、３、４、５、６回又はそれ以上のうちのいずれか一つ）投与する。いくつかの態様において、医薬組成物は、投与サイクル中に一回又は複数回投与される。投与サイクルは、例えば１、２、３、４、５週又はそれ以上、又は１、２、３、４、５ヶ月又はそれ以上であってもよい。特定の患者に対する最適な投与量及び処置レジメンは、患者の疾患徴候をモニタリングし、それに応じて処置を調整することによって、医学分野の当業者により確定され得る。細胞を哺乳類（例えば、ヒト）に投与した後、複数の既知の方法のうちのいずれか一つによって、操作された細胞群及び／又は抗体の生物学的活性を測定することができる。評価のパラメータは、インビボ（例えば、イメージングによる）又はエクスビボ（例えば、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーによる）操作又は天然Ｔ細胞もしくは他の免疫細胞と抗原との特異的結合を含む。操作された細胞が標的細胞を破壊する能力は、例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３２（７）：６８９－７０２（２００９）及びＨｅｒｍａｎらＪ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８５（１）：２５－４０（２００４）に記載される細胞傷害性アッセイなどの当分野で既知の任意の適切な方法によって測定することができる。細胞の生物学的活性はさらに、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２及びＴＮＦなどのいくつかのサイトカインの発現及び／又は分泌のアッセイによって測定され得る。いくつかの態様では、生物学的活性は、腫瘍負荷又は負荷の減少などの臨床アウトカムを評価することによって測定される。
いくつかの具体的な態様において、本明細書は、対象の疾患又は障害を処置するための方法を提供し、該方法は、対象に結合分子を投与することを含み、該結合分子は、以上のセクション５．２に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ（例えば、クローディン－６に結合するＶＨＨ）を含み、例えば、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又は（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むものを含む。いくつかの態様において、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、ＩＭＧＴ番号付けスキーム、ＡｂＭ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、Ｃｏｎｔａｃｔ番号付けスキーム又はそれらの組み合わせに従ってＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３を確定する。いくつかの態様において、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの態様において、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、疾患又は障害は、クローディン－６関連疾患又は障害である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、クローディン－６陽性がん、即ちクローディン－６を発現又は過剰発現するがんである。いくつかの態様において、クローディン－６陽性がんは、固形腫瘍がんである。クローディン－６陽性がんの例は、胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）、卵巣がん（ＯＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、類内膜がん（ＥＣ）及びＡＦＰ＋胃がん（ＡＦＰ＋ＧＣ）を含むが、それらに限らない。
他の具体的な態様において、本明細書は、対象の疾患又は障害を処置するための方法を提供し、該方法は、対象に操作された免疫エフェクター細胞を投与することを含み、該操作された免疫エフェクター細胞は、本明細書によるＣＡＲ、例えば、以上のセクション５．２部分に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ（例えば、以下を含むものを含む）に結合するｓｄＡｂを含むＣＡＲを発現し、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又は（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３。いくつかの態様において、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、ＩＭＧＴ番号付けスキーム、ＡｂＭ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、Ｃｏｎｔａｃｔ番号付けスキーム又はそれらの組み合わせに従ってＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３を確定する。いくつかの態様において、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの態様において、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、該抗クローディン－６ ｓｄＡｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、操作された免疫エフェクター細胞において発現するＣＡＲは、一つ又は複数のさらなる抗原結合ドメインをさらに含む。他の態様において、さらなる結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む。いくつかの態様において、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、ＩＭＧＴ番号付けスキーム、ＡｂＭ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、Ｃｏｎｔａｃｔ番号付けスキーム又はそれらの組み合わせに従ってＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３を確定する。他の態様において、さらなる結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ３を含む。いくつかの態様において、さらなる結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８を含有するＶＨドメインと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含有するＶＬドメインとを含む。いくつかの態様において、さらなる結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨドメインと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬドメインとを含む。いくつかの態様において、さらなる結合ドメインは、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの態様において、さらなる抗原結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、さらなる抗原結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーを介して互いに融合する。いくつかの態様において、ペプチドリンカーの長さは約５０個のアミノ酸以下である。いくつかの態様において、操作された免疫エフェクター細胞において発現するＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２及びＰＤ１からなる群から選択される。いくつかの態様において、操作された免疫エフェクター細胞において発現するＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、該一次細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来する。いくつかの態様において、操作された免疫エフェクター細胞において発現するＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ－末端と膜貫通ドメインのＮ－末端との間に位置するヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αヒンジドメイン）をさらに含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ－末端に位置するシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端へ、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、疾患又は障害は、クローディン－６関連疾患又は障害である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、クローディン－６陽性がん、即ちクローディン－６を発現又は過剰発現するがんである。いくつかの態様において、クローディン－６陽性がんは、固形腫瘍がんである。クローディン－６陽性がんの例は、胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）、卵巣がん（ＯＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、類内膜がん（ＥＣ）及びＡＦＰ＋胃がん（ＡＦＰ＋ＧＣ）を含むが、それらに限らない。いくつかの態様において、疾患又は障害は、ＧＰＣ３関連疾患又は障害である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、ＧＰＣ３陽性がんであり、即ちＧＰＣ３を発現又は過剰発現するがんである。ＧＰＣ３陽性がんの例は、ＨＣＣ、黒色腫、卵巣明細胞がん、卵黄嚢腫（ＹＳＴ）、神経芽腫、肝芽腫、腎芽腫（ウィルムス腫瘍）、肺扁平上皮がん、肺腺がん、大細胞肺がん、小細胞肺がん、精巣非セミノーマ性胚細胞腫瘍、脂肪肉腫、子宮頸部上皮内腫瘍、副腎腺腫、神経鞘腫、胚性腫瘍、胃がん（例えば、アルファフェトプロテインを産生する胃がん）、結腸直腸がん、食道がん及び甲状腺がんを含むが、それらに限らない。いくつかの態様において、疾患又は障害は、ＨＣＣである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、黒色腫である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、卵巣明細胞がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、卵黄嚢腫（ＹＳＴ）である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、神経芽腫である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、肝芽腫である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、腎芽腫（ウィルムス腫瘍）である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、肺扁平上皮がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、肺腺がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、大細胞肺がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、小細胞肺がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、睾丸非精原細胞性生殖細胞瘤である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、脂肪肉腫である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、子宮頸部上皮内腫瘍である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、副腎腺腫である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、神経鞘腫である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、胚性腫瘍である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、胃がん（例えば、アルファフェトプロテインを産生する胃がん）である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、結腸直腸がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、食道がんである。いくつかの態様において、疾患又は障害は、甲状腺がんである。いくつかの態様において、対象は、少なくとも一つのＣＬＤＮ６薬剤に対して耐性を有し、及び／又はここで、対象は、少なくとも一つのＧＰＣ３薬剤に対して耐性を有する。
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象の疾患又は障害を処置するための方法をさらに提供し、該方法は、有効量の、ＣＬＤＮ６アンタゴニストとＧＰＣ３アンタゴニストとの組み合わせ、又はＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストを対象に投与することを含む。ＣＬＤＮ６アンタゴニスト、ＧＰＣ３アンタゴニスト及び／又はＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、複数のクラスを有することができ、例えば、アンタゴニストは、操作された受容体、操作された免疫細胞、抗体、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、アプタマー及び小分子ＲＮＡから選択されてもよい。
一態様では、ＣＬＤＮ６アンタゴニストは、ＣＬＤＮ６を特異的に標的とする操作された受容体を含む操作された免疫細胞であり、該操作された受容体は、少なくとも一つの抗ＣＬＤＮ６結合部分（例えば、本明細書による抗ＣＬＤＮ６ ｓｄＡｂ）を含む細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、ＧＰＣ３アンタゴニストは、ＧＰＣ３を特異的に標的とする操作された受容体を含む操作された免疫細胞であり、該操作された受容体は、少なくとも一つの抗ＧＰＣ３結合部分を含む細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、ＣＬＤＮ６を特異的に標的とする操作された受容体（例えば、本明細書によるＣＬＤＮ６ ＣＡＲ）及びＧＰＣ３を特異的に標的とする操作された受容体は、異なる操作された免疫細胞において発現する。これに応じて、ＣＬＤＮ６アンタゴニストとＧＰＣ３アンタゴニストとの組み合わせは、本明細書に記載のＣＬＤＮ６を特異的に標的とする操作された受容体を含む第１群の操作された免疫細胞とＧＰＣ３を特異的に標的とする操作された受容体の第２群の操作された免疫細胞との組み合わせである。
いくつかの態様において、ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、操作された免疫細胞であり、それは、ＣＬＤＮ６を特異的に標的とする第１の操作された受容体と、ＧＰＣ３を特異的に標的とする第２の操作された受容体とを含み、即ち二種類の操作された受容体は、同じ免疫細胞において共発現する。より具体的には、ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、操作された免疫細胞であり、それは、ＣＬＤＮ６を特異的に標的とする第１の操作された受容体と、ＧＰＣ３を特異的に標的とする第２の操作された受容体とを含み、ここで、（１）ＣＬＤＮ６を特異的に標的とする第１の操作された受容体は、少なくとも一つの抗ＣＬＤＮ６結合部分を含む第１の細胞外抗原結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン及び第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、且つ（２）ＧＰＣ３を特異的に標的とする第２の操作された受容体は、少なくとも一つの抗ＧＰＣ３結合部分を含む第２の細胞外抗原結合ドメイン、第２の膜貫通ドメイン及び第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、操作された免疫細胞であり、それは、ＣＬＤＮ６を標的とする第１のＣＡＲと、ＧＰＣ３を標的とする第２のＣＡＲとを含み、ここで、（１）第１のＣＡＲは、少なくとも一つの抗ＣＬＤＮ６結合部分（例えば、本明細書による抗ＣＬＤＮ６ ｓｄＡｂ）を含有する第１の細胞外抗原結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン及び第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、（２）第２のＣＡＲは、少なくとも一つの抗ＧＰＣ３結合部分を含有する第２の細胞外抗原結合ドメイン、第２の膜貫通ドメイン及び第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここで、該第１のＣＡＲと該第２のＣＡＲは、機能的に連結され、該第１のＣＡＲは、ＧＰＣ３を標的とする該第２のＣＡＲのＮ末端又はＣ末端に位置し、任意選択的に、該第１のＣＡＲは、切断可能ペプチドを介して該第２のＣＡＲに機能的に連結され、又は該第１のＣＡＲと該第２のＣＡＲは、切断可能ペプチドの切断のために連結していない。
いくつかの態様において、ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、ＣＬＤＮ６及びＧＰＣ３を同時に標的とする操作された受容体を含む操作された免疫細胞であり、該操作された受容体は、少なくとも一つの抗ＣＬＤＮ６結合部分（例えば、本明細書による抗ＣＬＤＮ６ ｓｄＡｂ）及び少なくとも一つの抗ＧＰＣ３結合部分を含む細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３のアンタゴニストは、ＣＬＤＮ６及びＧＰＣ３を同時に標的とするＣＡＲ（「ＣＬＤＮ６×ＧＰＣ３二重特異性ＣＡＲ」）を含む操作された免疫細胞であり、ここで、該ＣＬＤＮ６×ＧＰＣ３特異性ＣＡＲは、（１）少なくとも一つの抗ＣＬＤＮ６結合部分及び少なくとも一つの抗ＧＰＣ３結合部分を含む細胞外抗原結合ドメイン、（２）膜貫通ドメイン及び（３）細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここで、該抗ＣＬＤＮ６結合部分は、該抗ＧＰＣ３結合部分のＮ末端又はＣ末端に位置し、任意選択的に、該抗ＣＬＤＮ６結合部分は、ＧＳリンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）３などのペプチドリンカーを介して該抗ＧＰＣ３結合部分に機能的に連結される。いくつかの態様において、疾患又は障害は、クローディン－６関連疾患又は障害である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、クローディン－６陽性がん、即ち、クローディン－６を発現又は過剰発現するがんである。いくつかの態様において、クローディン－６陽性がんは、固形腫瘍がんである。クローディン－６陽性がんの例は、胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）、卵巣がん（ＯＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、類内膜がん（ＥＣ）及びＡＦＰ＋胃がん（ＡＦＰ＋ＧＣ）を含むが、それらに限らない。いくつかの態様において、疾患又は障害は、ＧＰＣ３関連疾患又は障害である。いくつかの態様において、疾患又は障害は、ＧＰＣ３陽性がんであり、即ちＧＰＣ３を発現又は過剰発現するがんである。ＧＰＣ３陽性がんの例は、ＨＣＣ、黒色腫、卵巣明細胞がん、卵黄嚢腫（ＹＳＴ）、神経芽腫、肝芽腫、腎芽腫（ウィルムス腫瘍）、肺扁平上皮がん、肺腺がん、大細胞肺がん、小細胞肺がん、精巣非セミノーマ性胚細胞腫瘍、脂肪肉腫、子宮頸部上皮内腫瘍、副腎腺腫、神経鞘腫、胚性腫瘍、胃がん（例えば、アルファフェトプロテインを産生する胃がん）、結腸直腸がん、食道がん及び甲状腺がんを含むが、それらに限らない。いくつかの態様において、対象は、少なくとも一つのＣＬＤＮ６薬剤に対して耐性を有し、及び／又はここで、対象は、少なくとも一つのＧＰＣ３薬剤に対して耐性を有する。
５．７．２． 診断及び検出の方法及び使用
別の態様では、本明細書による方法は、本明細書による結合分子、例えば、クローディン－６に結合する抗体及びこのような抗体を含有する分子（例えば、コンジュゲートと複合体）を使用して、例えば、クローディン－６及び／又は抗体により識別されるそのエピトープの存在を検出することによって、特定の処置と一つ又は複数の組織型又は細胞型との結合、及び／又は対象に通知する処置決定を検出、予後、診断、病期決定、確定することに関する。
診断又は検出方法に用いられる抗クローディン－６抗体（例えば、本明細書に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂのうちのいずれか一つ）が提供される。別の態様では、生体試料におけるクローディン－６の存在を検出する方法が提供される。該方法は、生体試料におけるクローディン－６タンパク質の存在を検出することを含んでもよい。クローディン－６は、ヒトクローディン－６であってもよい。これらの方法は、クローディン－６を発現する疾患又は障害に関連する診断及び／又は予後方法であってもよい。これらの方法は、抗体で生体試料をインキュベート及び／又は検出すること、及び／又は抗体を対象に投与することを含んでもよい。生体試料は、細胞又は組織又はそれらの一部、例えば、腫瘍又はがん組織又はそれらの生検物もしくは切片を含んでもよい。接触は、抗クローディン－６抗体と試料に存在するクローディン－６との結合が許容される条件下で行われ得る。これらの方法は、試料における抗クローディン－６抗体とクローディン－６との間に複合体が形成されたか否かを検出し、例えば、このような結合の存在又は不存在又はレベルを検出することをさらに含んでもよい。このような方法は、インビトロ又はインビボ方法であってもよい。一態様では、抗クローディン－６抗体は、抗クローディン－６抗体又は操作された抗原受容体による処置に適した対象を選択するために用いられ、例えば、ここで、クローディン－６は、患者を選択するためのバイオマーカーである。
試料（例えば、細胞、組織試料、溶解物、組成物又はそれに由来する他の試料）を抗クローディン－６抗体と接触させ、抗体と試料（例えば、試料におけるクローディン－６）との間の結合又は複合体の形成を確定又は検出することができる。同じ組織型の参照細胞と比べて試験試料における結合を証明又は検出した場合、それは、関連疾患又は障害が存在することを示し、及び／又は抗体を含有する治療剤は、試料に由来する組織又は細胞又は他の生体材料と同じ又は同じ型である組織又は細胞に特異的に結合する。試料は、人体組織からのものであってもよく、且つ疾患組織及び／又は正常な組織に由来してもよく、例えば、処置される疾患又は障害に罹患する対象及び／又はこのような対象と同じ種であるが処置される疾患又は障害に罹患していない対象に由来する。いくつかの場合に、正常な組織又は細胞は、処置される疾患又は障害に罹患する対象に由来するが、その自体が疾患細胞又は組織ではなく、例えば、所定の対象に存在するがんと同じであるか又は異なる器官に由来する正常な組織である。
特異的抗体－抗原結合を検出するための当分野で既知の様々な方法を用いることができる。例示的免疫測定は、蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、濁度抑制免疫測定法（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及び放射免疫測定法（ＲＩＡ）を含む。指示薬部分又は標識基を用いて該方法の様々な使用の需要を満たすことができ、これらの使用は往々にして、測定機器の利用可能性及びそれと適合する免疫測定手順により決められる。例示的標識は、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ又は３２Ｐ及び／又はクロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタン（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、リン（３２Ｐ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテニウム（９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレン（７５Ｓｅ）、（８５Ｓｒ）、硫黄（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、イットリウム（９０Ｙ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ又はβ－ガラクトシダーゼ）、蛍光部分又はタンパク質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ又はＢＦＰ）又は発光部分（例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）によるＱｄｏｔ（商標）ナノ粒子）を含む。上記様々な免疫測定を行うための様々な一般的な技術は既知のものである。
標識抗体（例えば、抗クローディン－６抗体）を提供することができる。標識は、直接検出された標識又は部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識及び放射性標識）、及び例えば、酵素的反応又は分子相互作用によって間接的に検出された部分、例えば、酵素又はリガンドを含むが、それらに限らない。抗体は、標識されない可能性があり、且つ任意の抗体に結合する標識抗体でその存在を検出することができる。
５．８． キット及び製造物品
本明細書に記載の任意の抗体、キメラ抗原受容体又は操作された免疫エフェクター細胞を含むキット、単位用量及び製造物品をさらに提供した。本明細書に記載の医薬組成物のうちのいずれか一つを含有するキットを提供することができ、且つ好ましくは、その取扱説明書を提供した。
本出願のキットは、適切な包装内にある。適切な包装は、バイアル、ボルト、缶、フレキシブル包装（例えば、密封されたポリエステルフィルム又はプラスチック袋）などを含むが、それらに限らない。キットは、任意選択的に、緩衝液と説明的情報などの他の構成部分を提供することができる。そのため、本出願は製造物品をさらに提供し、それは、バイアル（例えば、密封されたバイアル）、ボトル、ジャー、フレキシブル包装などを含む。
該製造物品は、容器、及び該容器にあるか又は該容器に関連するラベルもしくは包装インサートを含んでもよい。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、様々な材料（例えば、ガラス又はプラスチック）により形成され得る。通常、容器は、本明細書に記載の疾患又は障害（例えば、がん）を有効に処置する組成物を収容し、且つ無菌の入り口を有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパを有するバイアルであってもよい）。ラベル又は包装インサートは、組成物が個体の特定の病態の処置に使用されることを指示する。ラベル又は包装インサートは、組成物を個体に投与するための説明書をさらに含む。ラベルは、再構成及び／又は使用に関する指図を指示し得る。医薬組成物を収容する容器は、複数回使用のバイアルであってもよく、それは、再構築製剤の反復投与（例えば、２～６回の投与）を可能にする。包装インサートは、通常治療製品の商業用パッケージに含まれる説明書を指し、これらの説明書には、このような治療製品の使用の適応症、使用法、投与量、投与、禁忌及び／又は警告に関する情報が含まれる。付加的に、製造物品は、第２の容器をさらに含んでもよく、該容器は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
キット又は製造物品は、複数の単位投与量の医薬組成物及び取扱説明書を含んでもよく、それは、薬局（例えば、院内薬局及び調剤薬局）での貯蔵及び使用に十分な量で包装される。
簡潔にするために、本明細書ではいくつかの略語が使用される。一つの例は、アミノ酸残基を示す一文字略語である。アミノ酸及びそれに対応する三文字及び一文字略語は以下のとおりである。
本開示は、概して、多くの実施形態を説明する際に肯定的文言を用いて本明細書に開示される。本開示は、具体的には、物質又は材料、方法ステップ及び条件、レジメン、手順、アッセイ又は分析など、特定の主題が完全に又は部分的に除外される実施形態をさらに含む。そのため、本開示が、概して、本開示に含まれていない内容に基づいて本明細書で表されていない場合であっても、本開示に明示的に含まれていない態様は、依然として本明細書で開示される。
本開示の複数の態様について説明した。しかしながら、理解すべきこととして、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく様々な修正を行うことができる。そのため、以下の例は、請求項に記載される開示範囲を限定するのではなく、例示することが意図される。
６． 実施例
以下は、研究で使用される様々な方法及び材料に対する説明であり、且つ完全な開示内容及び本開示をどのように製造し使用するかの説明を当業者に提供することを目的とし、本発明者らがその開示内容であると考える範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が行われ且つ実施可能な全ての実験であることを意図するものではない。現在時制で書かれた例示的な説明を実行する必要はなく、これらの説明は、本開示の教示に関連するデータなどを生成するために実行され得ることを理解されたい。使用される数字（例えば、量、パーセントなど）の正確性を確保するように努力してきたが、実験誤差及び偏差も考慮すべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧である又は大気圧に近い。
６．１． 実施例１－ＣＬＤＮ６に対するＶＨＨの生成
６．１．１． 細胞株の構築
クローディン－６（ＣＬＤＮ６）に対して高い結合親和性を有する結合部分を含有する重鎖抗体又はＶＨＨを開発するために、ラクダを免疫化し、ファージディスプレイライブラリーを構築して、抗ＣＬＤＮ６ ＶＨＨリーダー配列を同定する。
Ｄｕｂｃａ．ｈｕＣＬＤＮ６細胞株は、以下で簡単に説明される方法に従って内部開発された。ヒトＣＬＤＮ６コード配列（ＮＭ＿０２１１９５．４）を合成し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限部位でそれをベクターｐＬＶＸ－ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３２１６４）にサブクローニングし、トランスファーベクターｐＬＶＸ－ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ．Ｐｕｒｏを得た。プラスミド混合物（ｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号１２２６０）、ｐＭＤ．２Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号１２２５９）及びｐＬＶＸ－ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ．Ｐｕｒｏを含む）を用いてＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３２１８０）宿主細胞に対して一過性トランスフェクションを行うことによって、レンチウイルスをパッケージングした。得られたＬＶ－ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ．ＰｕｒｏＲレンチウイルスを１００μＬ加えることによって、０．５×１０６個のＤｕｂｃａ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ２２７６（商標））に形質導入した。２～３日ごとに選択培地（１０％ ＦＢＳと２μｇ／ｍＬのピューロマイシンが補充されたＥａｇｌｅ最小必須培地）を更新することによって、形質導入された細胞をピューロマイシンで選択して、Ｄｕｂｃａ．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株を得た。
３ラウンドの選択後、得られた細胞株をトリプシンで消化した。得られた細胞を適切に保存し、さらなる使用の準備をした。
ヒトＣＬＤＮ６ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００とコンジュゲートした抗体（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＦＡＢ３６５６Ｎ）を用いて、フローサイトメトリーによってヒトＣＬＤＮ６のＤｕｂｃａ．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株での発現を検証した。簡単に言えば、２×１０５個のＤｕｂｃａ．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株又はＤｕｂｃａ細胞を、ヒトＣＬＤＮ６ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００とコンジュゲートした抗体と共に４℃で３０分インキュベートし、そしてＤＰＢＳで３回の洗浄－遠心分離－上清枯渇細胞洗浄のサイクルを行った。細胞をＡｔｔｕｎｅ ＮＸＴフローサイトメトリー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に供して、ヒトＣＬＤＮ６の発現レベルを検出した。標識されたＤｕｂｃａ．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、Ｄｕｂｃａ細胞の平均蛍光強度の２０３．２倍である。さらに、上記の当分野で既知の一般的な、安定的な細胞株生成手順により、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ３２１６（商標））を用いてＨＥＫ２９３Ｔ．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株を構築し、検証した。
ＣＬＤＮ６は、他のＣＬＤＮファミリーメンバー（ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４及びＣＬＤＮ９）と高い相同性を有する。上記Ｄｕｂｃａ．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株の生成及び製造手順に従って、さらに、ＣＬＤＮ陰性ＥＳ－２細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１９７８）を、ヒトＣＬＤＮ３（ＮＭ＿００１３０６．３）、ヒトＣＬＤＮ４（ＮＭ＿００１３０５．４）、ＣＬＤＮ６及びヒトＣＬＤＮ９（ＮＭ＿０２０９８２．３）を発現するよう内部開発した。上記の当分野で既知の一般的な安定型細胞株生成手順で上記細胞株を開発した。内部製造されたレンチウイルスＬＶ－ｈｕＣＬＤＮ３．Ｌｕｃ．Ｐｕｒｏ、ＬＶ－ｈｕＣＬＤＮ４．Ｌｕｃ．Ｐｕｒｏ又はＬＶ－ｈｕＣＬＤＮ９．Ｌｕｃ．Ｐｕｒｏストックを用いて宿主細胞に対して形質導入を行った。ピューロマイシンで形質導入細胞をスクリーニングして、安定的な細胞を得た。例えば、２Ａペプチドを用いて、ヒトＣＬＤＮ３とホタルルシフェラーゼを共発現するＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ３．Ｌｕｃ細胞株を開発した。２Ａペプチドを用いて、ヒトＣＬＤＮ４とホタルルシフェラーゼを共発現するＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ４．Ｌｕｃ細胞株を開発した。２Ａペプチドを用いて、ヒトＣＬＤＮ９とホタルルシフェラーゼを共発現するＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ９．Ｌｕｃ細胞株を開発した。なお、ヒトＣＬＤＮ３ ＰＥとコンジュゲートする抗体（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＦＡＢ４６２０Ｐ）を選択して、ＣＬＤＮ３の発現を検出した。ヒトＣＬＤＮ４ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７とコンジュゲートする抗体（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＦＡＢ４６２０Ｐ）を選択して、ＣＬＤＮ４の発現を検出した。そして、抗ＣＬＤＮ９抗体［ＹＤ４Ｅ９］（ＡＢＣＡＭ、カタログ番号ａｂ１８７１１６）を選択して、ＣＬＤＮ９の発現を検出した。なお、ＥＳ－２、ＰＡ－１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５７２）又はＯＶ９０（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１１７３２）細胞株を、ホタルルシフェラーゼのみを過剰発現するよう開発し、それぞれＥＳ－２．Ｌｕｃ細胞株、ＰＡ－１．Ｌｕｃ細胞株又はＯＶ９０．Ｌｕｃ細胞株とした。
６．１．２． 動物免疫及び免疫応答試験
以上のように製造された、Ｄｕｂｃａ．ｈｕＣＬＤＮ６細胞株を含む免疫原をアジュバント又はＰＢＳと混合し、成体の雄フタコブラクダに注射した。動物を、典型的には毎回ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）を使用するか又は使用せず、約１週間～２週間の間隔で５回免疫化した。免疫前段階及び毎回の免疫後に末梢血試料を収集した。勾配遠心分離により約１００ｍＬの末梢血からリンパ球を分離し、ＲＮＡＬａｔｅｒ（商標）を補充し、－８０℃で保存した。抗凝固処理血液試料を遠心分離することによって血清を得て、血清を－８０℃で保存した。
複数ラウンドの免疫化後、ＨＥＫ２９３Ｔ．ＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株結合によって抗原特異性抗体の力価を確定した。データによると、抗体力価が免疫化に伴って有意に増加した。
最後の免疫化から３～５日間後、頸静脈から１００ｍＬの血液を生産出血として収集した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ手順に従って血液から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を分離した。
６．１．３． ＶＨＨファージディスプレイライブラリーの構築
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１５５９６０２６）のマニュアルに従って、分離されたリンパ球（実施例１．２に由来する）から総ＲＮＡを抽出した。品質試験後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６１１０Ａ）のマニュアルに従って、オリゴ（ｄＴ）２０プライマーを用いて総ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ネステッドＰＣＲプライマー（特許ＣＮ １０５５５５３１０ Ｂを参照されたい）を設計し、ＶＨＨ断片の増幅に用い、ここで、二つのＳｆｉＩ制限部位を導入した。２ステップポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＶＨＨ断片を増幅させ、ＰＣＲ生成物をＳｆｉＩで消化し、ゲル精製を行い、そしてファージミドベクターｐＦＬ２４９（ＣＮ １０５５５５３１０ Ｂを参照されたい）に挿入し、該ファージミドベクターを大腸菌細胞にエレクトロポレートして、ファージディスプレイＶＨＨ免疫ライブラリーを生成した。
ごく一部の形質転換細胞を希釈し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンが補充された２×ＹＴプレートでストリークした。コロニーを計数して、ライブラリーの大きさを計算した。陽性クローンをランダムに選択し、配列決定して、ライブラリーの品質を評価した。残りの形質転換細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと２％グルコースが補充された２４５ｍｍ正方形２×ＹＴ－寒天皿にストリークした。培養皿からコロニーの菌叢を掻き落とした。細胞の小分けをライブラリープラスミドの単離に用いた。残りの部分にグリセリンを補充し、原液として－８０℃で保存した。
最後に、ＶＨＨライブラリーを構築した。陽性クローンに対して配列決定を行い、ライブラリーからのＶＨＨドメインは、良好なＣＤＲ３多様性を有していた。
６．１．４． ファージディスプレイのパニング
ヘルパーファージに感染させた後に、表面において遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質の形でＶＨＨをディスプレイする組換えファージ粒子が産生した。標準的な方法に従ってファージ粒子を製造し、４℃で濾過し滅菌した後に、さらなる研究のために保存した。各ラウンドのパニング前に、ヘルパーファージを加えることによって、ＶＨＨディスプレイファージ粒子をレスキューし増幅させた。
製造された上記Ｄｕｂｃａ．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株、ＨＥＫ２９３Ｔ．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株及びＰＡ－１．Ｌｕｃ細胞株をそれぞれファージライブラリーと共にインキュベートした。十分に洗浄した後に、１ｍｇ／ｍＬのトリプシンで溶出し、結合したファージ粒子を収集した。第２ラウンドの選択において、得られたファージ粒子をＤｕｂｃａ．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株と共にインキュベートした。十分に洗浄した後に、結合したファージをトリエチルアミンで溶出した。２ラウンドのパニング後に、ファージ濃縮を観察した。
６．１．５． ＥＬＩＳＡのスクリーニング
個々のライブラリークローンを９６ウェルの深型ウェルプレートに接種し、その発現を誘導した。細胞に基づくＥＬＩＳＡスクリーニングを行って、ＨＥＫ２９３Ｔ．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株を特異的に識別するＶＨＨクローンを単離した。ファージＥＬＩＳＡを行って、標的抗原に対して特異性を有するクローンを同定した。
個々の出力ファージクローンを９６ウェルの深型ウェルプレート中で増殖させ、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージで一晩レスキューした。抗原タンパク質に結合するクローンを同定するために、９６ウェルのＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、それぞれ組換えヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株を用いて、コーティング緩衝液において４℃で一晩コーティングし、そしてプレートをブロッキング緩衝液でブロッキングした。ブロッキング後に、一晩細胞培養物からのウェル当たり約５０μＬのファージ上清をプレートに加え、４℃で１．５時間インキュベートした。プレートを４回洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートした抗Ｍ１３モノクローナル抗体をプレートに加え、４℃で４５分間インキュベートした。プレートをさらに５回洗浄し、発色のために基質溶液をウェルに加えた。各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
スクリーニング後、高い結合能を有するクローンを選択して配列決定を行った。ＣＤＲ及びＶＨＨアミノ酸配列は表３にまとめられている。
６．２． 実施例２－キメラ抗ＣＬＤＮ６抗体の製造
６．２．１． ＶＨＨ発現プラスミドの構築
選択された抗体のＶＨＨコード配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）－コドン最適化により最適化し、ヒトコドンバイアス発現に用い、合成し、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）コード配列に融合し、キメラ形式の一過性発現に用いた。キメラ抗体コード配列をｐｃＤＮＡ３．４に基づく哺乳類発現系プラスミドにクローニングし、当分野で既知の一般的な分子生物学的技術を用いて、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより大量のプラスミドを製造し、タンパク質の産生に用いた。それと共に、ＣＬＤＮ６に対するＩＭＡＢ２０６－Ｃ４６Ｓ（ＷＯ ２０２０１６１１８６ Ａ１に由来する）の重鎖及び軽鎖配列を選択し、それを完全なＩｇＧ１として発現させた。それをＩＭＡＢ２０６－Ｃ４６Ｓと名付け、基準抗体として用いた。キメラ抗体を構築し、表４に示した。
６．２．２． キメラ抗体の発現及び精製
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ１４５２８）を無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１２３３８０１８）で増殖させた。オービタルシェーカー（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、３７℃及び５％ ＣＯ２下で、細胞を円錐フラスコ内に維持した。トランスフェクト前日、細胞を適切な密度でＣｏｒｎｉｎｇ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ円錐フラスコに接種した。トランスフェクションに対して、ＤＮＡとポリエーテルイミド（ＰＥＩ）を最適な割合で混合し、細胞を有する円錐フラスコに加えた。６日目に、上清を収集し、精製に用いた。細胞培養物であるブロスを遠心分離し、そして濾過した。濾過された上清を０．５ｍＬ／分で１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７０４０２０１）にローディングした。適切な緩衝液で洗浄し溶出した後に、抗体画分を収集し、中和した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔカタログ番号Ｍ４２０１２）により、タンパク質の純度を評価した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法により濃度を確定した。タンパク質発現の代表的なデータは表５にまとめられている。
６．３． 実施例３－キメラ抗ＣＬＤＮ６抗体の特徴づけ
６．３．１． 異なるＣＬＤＮファミリーへのＶＨＨ－ｈＩｇＧ１Ｆｃキメラ抗体の結合の特異性
細胞に基づくフローサイトメトリーにより、抗ＣＬＤＮ６抗体のＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ３．Ｌｕｃ細胞株、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ４．Ｌｕｃ細胞株、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株及びＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ９．Ｌｕｃ細胞株への結合能を試験した。簡単に言えば、ＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）中５×１０５個のＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ．Ｌｕｃ細胞株を、一連の希釈された抗ＣＬＤＮ６抗体と共に４℃で４５分インキュベートし、そしてＤＰＢＳで３回の、洗浄－遠心分離－上清枯渇細胞洗浄のサイクルを行った。洗浄後、細胞ペレットをＤＰＢＳに再懸濁し、ＰＥ標識された抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０９３０４）と共に、暗所において４℃で３０分インキュベートした。そしてＤＰＢＳを用いて、細胞に対して３回の洗浄－遠心分離－上清枯渇細胞洗浄サイクルを行った。そして、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴフローサイトメトリー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で細胞を操作して、抗体結合レベルを検出した。ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェアにおいて、各ウェルにおける細胞群の蛍光強度の幾何学的平均値に基づいてデータを分析した。結果は、図１及び表６に示されている。ＦＡＣＳは、蛍光活性化細胞選別を意味する。
図１及び表６に示すように、全てのキメラ抗体は、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞に対する有効な結合を用量依存的に示し、ＥＣ５０値の範囲は３．７７ｎＭ～１１．０１ｎＭである。なお、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ９．Ｌｕｃ細胞に非特異的に結合する高用量のＩＭＡＢ２０６－Ｃ４６Ｓキメラ抗体とは異なって、全てのＶＨＨ－ｈＩｇＧ１Ｆｃキメラ抗体は、いずれもＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞に特異的に結合するが、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ３．Ｌｕｃ細胞、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ４．Ｌｕｃ細胞又はＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ９．Ｌｕｃ細胞には結合しなかった。「ＥＣ５０」という用語は、最大半数有効濃度とも呼ばれ、所定の曝露時間後にベースラインと最大との間の中間の反応を誘導する抗体濃度を指す。
６．３．２． ＶＨＨ－ｈＩｇＧ１Ｆｃキメラ抗体の腫瘍細胞への結合の確認
ＯＶ９０（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１１７３２）は、典型的なＣＬＤＮ６陽性腫瘍細胞株である。それを収穫し、９６ウェルプレートにおいて、１％ ＰＢＳ－ＢＳＡ緩衝液に再懸濁した。以下の実験方法は、実施例６．３．１における方法と同じである。
図１及び表７に示すように、全てのＶＨＨ－ｈＩｇＧ１Ｆｃキメラ抗体は、いずれもＯＶ９０細胞に結合することができる。ＯＶ９０細胞結合において、全てのＶＨＨ－ｈＩｇＧ１Ｆｃキメラ抗体は、いずれも基準抗体（ＥＣ５０＝１６．７２ｎＭ）よりも高い親和性を有する（ＥＣ５０値が３．３８ｎＭ～１４．７５ｎＭである）。
６．４． 実施例４－ヒト化抗ＣＬＤＮ６キメラ抗体の製造
６．４．１． ヒト化設計
ＣＬＤＮ６に対して高い結合親和性を有する結合部分を含有する抗体をヒト化するために、Ｃｅ’ｃｉｌｅ Ｖｉｎｃｋｅら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００９，２８４：３２７３－３２８４）の説明又はＶＨＨ抗体フレームワークを再構成する方法によって、抗ＣＬＤＮ６ ＶＨＨ抗体アミノ酸残基をヒト化した。
モデリングＭＯＤＥＬＬＥＲを用いて、ラクダ科動物のＶＨＨの相同性モデリングを行った。７７ＬＩＣＮＢ０２の参照相同配列は、ラクダ科動物のＶＨＨ（タンパク質データベース、ＰＤＢコード：１ｍｖｆ）である。
ヒト生殖系列遺伝子とのアラインメントに基づいて、ＩＧＨＶ３－６６＊０１を７７ＬＩＣＮＢ０２のヒト受容体として選択した。タンパク質の三次元構造に基づいてアミノ酸の相対的溶媒接触度を計算した。ＶＨＨの一つのアミノ酸が溶媒に曝露された場合、元のアミノ酸でそれを置き換えた。本開示の例示的ヒト化ＶＨＨドメインは表８に示されている。
６．４．２． 抗体の発現及び精製
選択された抗体のヒト化ＶＨＨコード配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）－コドン最適化により最適化し、ヒトコドンバイアス発現に用い、合成し、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）コード配列に融合し、キメラ形式の一過性発現に用いた。キメラ抗体コード配列をｐｃＤＮＡ３．４に基づく哺乳類発現系プラスミドにクローニングし、当分野で既知の一般的な分子生物学的技術を用いて、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより大量のプラスミドを製造し、タンパク質の産生に用いた。本開示の例示的ヒト化キメラ抗体及びそれらの対応するヒト化ＶＨＨドメインは、表９に示されている。
ヒト化キメラ抗体を発現させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔカタログ番号Ｍ４２０１２）によってタンパク質の純度を評価した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法により濃度を確定した。タンパク質発現の代表的なデータは表１０にまとめられている。
６．５． 実施例５－ヒト化抗ＣＬＤＮ６キメラ抗体の特徴づけ
６．５．１． 異なるＣＬＤＮファミリーへのヒト化ＶＨＨ－ｈＩｇＧ１Ｆｃキメラ抗体の結合の特異性
実施例６．３．１における方法のように、細胞に基づくフローサイトメトリーにより、ヒト化抗ＣＬＤＮ６キメラ抗体のＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ３．Ｌｕｃ細胞株、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ４．Ｌｕｃ細胞株、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株及びＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ９．Ｌｕｃ細胞株への結合能を試験した。結果は、図２及び表１１に示されている。
図２及び表１１に示すように、７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ１－ｈＩｇＧ１Ｆｃ（ＥＣ５０＝７．０２ｎＭ）及び７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃ（ＥＣ５０＝７．００ｎＭ）キメラ抗体は、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞に対する有効な結合を用量依存的に示した。なお、ＩＭＡＢ２０６－Ｃ４６Ｓとは異なって、７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ１－ｈＩｇＧ１Ｆｃ及び７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃキメラ抗体は、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞に特異的に結合するが、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ３．Ｌｕｃ細胞、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ４．Ｌｕｃ細胞又はＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ９．Ｌｕｃ細胞には結合しなかった。
６．５．２． ヒト化ＶＨＨ－ｈＩｇＧ１Ｆｃキメラ抗体の腫瘍細胞への結合の確認
実施例６．３．２における方法のように、細胞に基づくフローサイトメトリーにより、ヒト化抗ＣＬＤＮ６キメラ抗体のＯＶ９０細胞への結合能を試験した。
最後に、図２及び表１２に示すように、７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ１－ｈＩｇＧ１Ｆｃ及び７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃキメラ抗体は、基準抗体（ＥＣ５０＝１６．５２ｎＭ）よりも高い親和性を有する（ＥＣ５０が６．９８ｎＭ～７．０５ｎＭである）。
６．６． 実施例６－キメラ抗原受容体を含有する操作されたＴ細胞の製造
Ｎ末端からＣ末端へＣＤ８αヒンジドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、ＣＤ１３７共刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）及びＣＤ３ζ一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）主鎖ポリペプチドをコードする核酸分子を合成し、それを、下流の前修飾されたレンチウイルスベクター（ｐＬＳＩＮＫ－ＢＢｚＢＢ）にクローニングし、構成型ｈＥＦ１αプロモーターに機能的に連結した。ベクターにおけるポリクローナル部位（ＭＣＳ）は、上記抗ＣＬＤＮ６ ＶＨＨ断片の一つと融合するＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）をコードする核酸配列に機能的に連結されるＫｏｚａｋ配列を含む核酸配列をＣＡＲ主鎖ベクターに挿入することを可能にし、ＣＡＲ主鎖配列の上流にあり、ＣＡＲ主鎖配列に機能的に連結される。ＣＤ８αシグナルペプチドと抗ＣＬＤＮ６ ＶＨＨ断片をコードする核酸配列を化学的に合成し、当分野で既知の分子クローニング技術により、ＥｃｏＲＩ（５’－ＧＡＡＴＴＣ－３’）とＳｐｅＩ（５’－ＡＣＴＡＧＴ－３’）制限部位を経て、それをｐＬＳＩＮＫ－ＢＢｚＢＢ ＣＡＲ主鎖にクローニングした。ＣＬＤＮ６ ＶＨＨ ＣＡＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）をＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１と名付けた。それと共に、ＩＭＡＢ２０６－Ｃ４６Ｓ（ＷＯ ２０２０１６１１８６Ａ１を参照されたい）からのｓｃＦｖ断片をヒトＣＤ８αヒンジ領域及び膜貫通領域と融合させ、２０６－Ｃ４６ＳＣＡＲと名付け、基準として用いた。なお、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ（ＷＯ ２０２００６９４０９ Ａ１からのＮｏｖａｒｔｉｓのＫＹＭＲＩＡＨ（登録商標））を、関連しない対照ＣＡＲ－Ｔとして選択した。
ｐＭＤＬｇ．ｐＲＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５１）、ｐＲＳＶ－ＲＥＶ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５３）及びｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５９）を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミド混合物と、ＣＡＲ構築体を発現するベクターとを、予備最適化された比でＰＥＩプレトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ＃１１５－０１０）と予め混合し、そして室温で１５分間インキュベートした。ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクト混合物に加えた。その後、細胞を、３７℃で、５％ ＣＯ２を有する細胞培養器において一晩インキュベートした。４℃及び３０００ｇ下で１５分間遠心分離してから上清を回収し、０．４５μｍ ＰＥＳフィルタによって濾過し、そして超速度で遠心分離してレンチウイルス濃縮を行った。そして上清を慎重に捨て、予冷されたＤＰＢＳでウイルス粒子を慎重にすすいだ。ウイルスを適宜液化し、－８０℃で保存した。ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣、ＡＴＣＣ）細胞株への形質導入を介する滴定法によって、ウイルス力価を確定した。
アフェレーシスにより健常なドナーから白血球を収集し、ＴｅｘＭＡＣＳ ＧＭＰ Ｍｅｄｉｕｍ＆１Ｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＃１７０－０７６－３０９）において細胞濃度を５×１０６個の細胞／ｍＬに調節した。そして、白血球を０．９％ ＮａＣｌ溶液と１：１（ｖ／ｖ）の比で混合した。３ｍＬ ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地を１５ｍＬの遠心管に加え、６ｍＬの希釈されたリンパ球混合物をｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地の上層にゆっくりと重ねた。２０℃で、リンパ球混合液を８００ｇで３０分絶えず遠心分離した。そして、２００μＬのピペットでリンパ球のバフィーコートを収集した。０．９％ ＮａＣｌ又はＲ１０を用いて、得られた画分を少なくとも６倍希釈して、溶液の密度を低下させた。そして、２０℃で、得られた画分を２５０ｇで１０分間遠心分離した。上清を完全に吸い出し、１０ｍＬのＲ１０を細胞ペレットに加えて、細胞ペレットを再懸濁した。２０℃で、混合物を２５０ｇで１０分さらに遠心分離した。上清をさらに吸引した。３００ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を含有する、３７℃で予熱したＴｅｘＭＡＣＳ ＧＭＰ Ｍｅｄｉｕｍ＆１Ｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＃１７０－０７６－３０９）２ｍＬを細胞ペレットに加え、細胞ペレットを軽く再懸濁した。トリパンブルー染色後、細胞数を確定し、該ＰＢＭＣ試料を後の実験のために用意した。
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｐａｎ Ｔ細胞分離キット（カタログ番号１３０－０９６－５３５）を用いて、以下に記載のメーカーのレジメンに従ってＰＢＭＣからヒトＴ細胞を精製した。まず細胞数を確定し、細胞懸濁液を３００ｇで１０分遠心分離した。そして上清を完全に吸い出し、１０７個の総細胞ごとに、４０μＬのＭＡＣＳ緩衝液（８μＭ ＥＤＴＡ ＋ ０．５％ＦＢＳが補充されたＤＰＢＳ）に細胞粒子を再懸濁した。Ｐａｎ Ｔ細胞ビオチン－抗体混合物を１０７個の総細胞当たり１０μＬ加え、十分に混合し、冷蔵庫（２℃～８℃）中で約５分インキュベートした。そして、１０７個の細胞当たり３０μＬのＭＡＣＳ緩衝液を加えた。１０７個の細胞当たり２０μＬのＰａｎ Ｔ細胞マイクロビーズ混合物を加えた。細胞懸濁液混合物を十分に混合し、冷蔵庫（２℃～８℃）中で１０分インキュベートした。磁気分離には少なくとも５００μＬが必要である。磁気分離の場合、ＬＳカラムを適切なＭＡＣＳ分離器の磁場に置いた。３ｍＬの緩衝液ですすぐことによってカラムを準備した。そして細胞懸濁液をカラムに適用し、標識されていない細胞を含むフロースルーを回収し、これは濃縮したＴ細胞画分を表す。３ｍＬの緩衝液でカラムを洗浄し、通過した標識されていない細胞を回収することによって別のＴ細胞を回収した。これらの標識されていない細胞は、濃縮したＴ細胞を再び表し、前のステップのフロースルーと組み合わせた。そして、回収された濃縮Ｔ細胞を遠心分離し、ＴｅｘＭＡＣＳ ＧＭＰ Ｍｅｄｉｕｍ＆１Ｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＃１７０－０７６－３０９）＋３００ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２に再懸濁した。
その後、メーカーのレジメンに従って、製造されたＴ細胞をヒトＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＃１３０－１１１－１６０）で４８時間予備活性化し、ここで、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子をＴ細胞活化試薬として加えた。
予備活性化されたＴ細胞にレンチウイルスストックを直接加えることにより、感染多重度（ＭＯＩ）が１５であるレンチウイルスストックを、予備活性化されたＴ細胞に形質導入した。一晩インキュベートした後、３７℃、５％ ＣＯ２の細胞培養器中で、形質導入された細胞をトランスジェニック発現させた。
細胞の形質導入から７日後、室温で、３００ｇで１０分遠心分離することによって細胞を収穫した。細胞ペレットを細胞培地又はＤＰＢＳで再懸濁し、等分し、室温で、３００ｇでさらに１０分遠心分離した。そして、細胞培地又はＤＰＢＳを用いて、さらなる使用のために細胞ペレットを再懸濁した。ＤＰＢＳ再懸濁細胞の等分試料を処理して、フローサイトメトリーによりＣＡＲ発現レベルを評価することに用いた。簡単に言えば、各群から１×１０６個のＴ細胞を収集し、そしてＶＨＨに基づくＣＡＲ－Ｔに用いられるＦＩＴＣ標識ＭｏｎｏＲａｂ（商標）ウサギ抗ラクダ科動物のＶＨＨ抗体（ｉＦｌｕｏｒ ６４７）ｍＡｂ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ＃Ａ０１９９４）又はｓｃＦｖに基づくＣＡＲに用いられるヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’）２（ＦＩＴＣ）（Ａｂｃａｍ＃ａｂ９８６５８）と共に、４℃で３０分インキュベートした。インキュベーション完了後、細胞を収集し、ＤＰＢＳで洗浄し、そして室温で、３００ｇで１分遠心分離した。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメトリー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）において、製造されたＣＡＲ－Ｔ細胞の発現レベルを検出した。
６．７． 実施例７－操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ特徴づけ
実施例１に記載されるように、製造された上記ＣＡＲ－Ｔ細胞を、それぞれＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株、ＯＶ９０．Ｌｕｃ細胞株又はＥＳ－２．Ｌｕｃ細胞株（陰性対照細胞）と２０～２４時間共インキュベートした。４：１、２：１又は１：１のエフェクター（ＣＡＲ－Ｔ細胞）と標的細胞との比（Ｅ：Ｔ）を選択した。ＣＡＲ－Ｔ細胞による共培養細胞への細胞傷害性を測定するために、メーカーのレジメンに従ってＯｎｅ－ｇｌｏ発光ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ６１２０）を製造し、共培養された細胞に加えて、ウェル内の残留ルシフェラーゼの活性を検出した。残留ルシフェラーゼの活性は、ウェル内の生存標的細胞の数と直接関連する。以下の式によって特異的細胞傷害性を計算した：特異的細胞傷害性％＝１００％×（１－（ＲＬＵ試料－ＲＬＵｍｉｎ）／（ＲＬＵＵｎＴ－ＲＬＵｍｉｎ））。ＲＬＵ試料は、本開示のＣＬＤＮ６ ＣＡＲを有するＣＡＲ－Ｔ細胞を用いてウェルにおいて測定したルシフェラーゼ活性を表す。ＲＬＵｍｉｎは、細胞傷害性アッセイが開始した時に、最終濃度が１％であるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が加えられたウェルにおいて確定されたルシフェラーゼ活性を指し、ＲＬＵＵｎＴは、ＣＡＲを形質導入されていないＴ細胞を有するウェルにおいて確定されたルシフェラーゼ活性を指す。
ＣｉｓｂｉｏからのＨＴＲＦキット（カタログ番号６２ＨＩＦＮＧＰＥＧ）を用いてインビトロ共培養アッセイからの上清を収集し、ＣＡＲ特異性サイトカインの放出（インターフェロンγ、ＩＦＮγ）の分析に用いた。簡単に言えば、アッセイ前にＨＴＲＦ試薬を室温に昇温させ、少なくとも３０分持続した。共培養アッセイからの１６μｌ／ウェルの上清を３８４ウェルのアッセイ用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ＃７８４０７５）に移し、その後、キットマニュアルに従って製造された、予め混合されたＨＴＲＦ試薬を４μｌ／ウェルで加えた。そしてパラフィンでプレートを封止し、室温で一晩インキュベートした。翌日、ＨＴＲＦ対応リーダーＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍ（Ｔｅｃａｎ）で該プレートを読み取った。キットによる標準曲線から得られたシグナルに基づいてＩＦＮγ濃度を計算した。
図３に示すように、４：１のＥ／Ｔ比（Ｅ／Ｔ＝４：１）では、２０６－Ｃ４６Ｓ ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞に対してより高い細胞傷害性を示した（ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔの９１．９８％ ± ０．７６％対２０６－Ｃ４６Ｓ ＣＡＲ－Ｔの７６．９５％ ± １．１０％）。２：１の低いＥ／Ｔ比（Ｅ／Ｔ＝２：１）では、２０６－Ｃ４６Ｓ ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞に対してより高い細胞傷害性を示した（ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔの６０．８３％ ± ３．４１％対２０６－Ｃ４６Ｓ ＣＡＲ－Ｔの３０．２５％ ± ４．８７％）。なお、４：１のＥ／Ｔ比では、２０６－Ｃ４６Ｓ ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＯＶ９０．Ｌｕｃ細胞に対するより高い殺傷効果を示した（ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔの６６．８９％ ± １．６６％対２０６－Ｃ４６Ｓ ＣＡＲ－Ｔの４７．５２％ ± ２．５０％）。２：１の低いＥ／Ｔ比では、２０６－Ｃ４６Ｓ ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞も、ＯＶ９０．Ｌｕｃ細胞に対するより高い殺傷効果を示した（ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔの４０．４５％ ± １．５９％対２０６－Ｃ４６Ｓ ＣＡＲ－Ｔの２５．５３％ ± ２．６２％）。
図４に示すように、Ｅ／Ｔ＝４：１及びＣＡＲ－Ｔ細胞の自発的放出において、陰性対照ＥＳ－２．Ｌｕｃ細胞（ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔに対して２４８．５６ ± １３．５６ｐｇ／ｍｌである）の共培養時のＩＦＮγに比べて、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔは、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞（ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔに対して２６３１４．５７ ± ４３３．４２ｐｇ／ｍｌである）又はＯＶ９０．Ｌｕｃ細胞（ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔに対して１８８１１．１５ ± ５４２．９０ｐｇ／ｍｌである）と共培養される場合、有意なＩＦＮγを示した。これらの結果により、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＩＦＮγをヒトＣＬＤＮ６特異的に放出できることが示された。
６．８． 実施例８－ＣＬＤＮ６ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍異種移植マウスでのインビボ有効性
ＯＶ９０．Ｌｕｃ細胞株卵巣がん全身性ＮＣＧ（ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｅｍ２６Ｃｄ５２Ｉｌ２ｒｇｅｍ２６Ｃｄ２２／ＮｊｕＣｒｌ）マウスモデルでＣＬＤＮ６ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍有効性を評価した。
上記のレンチウイルス形質導入を用いてＣＡＲ－Ｔ細胞を製造した。
免疫不全マウスＮＣＧにＯＶ９０．Ｌｕｃ細胞株を５×１０６個／マウスで皮下注射した。１０日後、皮下異種移植腫瘍を有するＮＣＧマウスにＣＬＤＮ６特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞（２．５×１０６個／マウス）を注射した。Ｔ細胞投与後約４週間以内に、これらのマウスの腫瘍体積を監視して、抗腫瘍有効性を評価した。一方向ＡＮＮＯＶＡを、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ９により実行される多重比較に用いた。
図５Ａ及び５Ｂに示すように、ＣＬＤＮ６ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、インビボで、ＯＶ９０．Ｌｕｃ細胞が移植された異種移植モデルに対する強固な抗腫瘍作用を示した。２０６－Ｃ４６Ｓ ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、該卵巣がん異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を効果的に排除し、重量は変化しなかった。なお、末梢血において、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の確固とした移植が観察された（図５Ｃ）。
６．９． 実施例９－ＣＬＤＮ６及びＧＰＣ３に対する組換え受容体の特徴づけ
不均一性は、胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）、卵巣がん（ＯＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）及び肝細胞がん（ＨＣＣ）などの固形腫瘍の大きな問題である。ＣＬＤＮ６は、がん胎児性標的であり、それは、これらの固形腫瘍において高度に発現するが、正常な組織において発現しない（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ． ２０１２年１２月；６１（６）：１０４３－５６及びＳｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０２１年２月３日；１３（５７９）：ｅａｂｂ６２８２）。別のがん胎児性標的ＧＰＣ３は、同じ発現プロファイルを示した（Ａｍ Ｊ ｐａｔｈｏｌ． ２０１８年９月；１８８（９）：１９７３－１９８１及びＡｄｖ Ａｎａｔ Ｐａｔｈｏｌ． ２０１４年１１月；２１（６）：４５０－６０．）。本研究は、固形腫瘍の不均一性及び標的喪失を克服するために、ＣＬＤＮ６とＧＰＣ３の両方に結合する二重特異性ＣＡＲを構築した。本研究の重点は、上記ヒト化抗ＣＬＤＮ６ ＶＨＨ抗体を、Ｌｅｇｅｎｄにより内部開発された抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ Ｈ９３抗体と結合することである。Ｈ９３のアミノ酸配列は、表１４に示されている。
６．９．１． 細胞株の構築及びがん細胞におけるＣＬＤＮ６とＧＰＣ３発現のフローサイトメトリー分析
実施例６．１．１における方法のように、ルシフェラーゼウイルスによりＰＡ－１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５７２）及びＯＶ９０（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１１７３２）をそれぞれ形質導入して、ルシフェラーゼ発現を有する細胞を得た。なお、全長ヒトＧＰＣ３（ＮＭ＿００４４８４．３）を合成し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによりそれをプラスミドにサブクローニングし、プラスミドをＰＬＶＸ－ｈｕＧＰＣ３．Ｌｕｃ．Ｐｕｒｏと名付けた。Ｎａｎｊｉｎｇ Ｌｅｇｅｎｄの内部ウイルスパッケージング系において力価の高い組換えレンチウイルスを産生し、ＥＳ－２．ｈｕＧＰＣ３．Ｌｕｃ細胞株を構築し、フローサイトメトリーによりその細胞での発現を監視した。
がん細胞におけるＣＬＤＮ６及びＧＰＣ３の発現を検出するために、７７ＬＩＣＮＢ０２Ｈ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃ抗体又はＨ９３－ｈＩｇＧ１Ｆｃ抗体（ＷＯ ２０２１１７０１００ Ａ１）を第１の抗体とし、ＰＥ抗ヒトＦｃ抗体（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃４１０７０８）を第２の抗体として、０．５Ｍ細胞を染色した。
表１５に示すように、ＰＡ－１．Ｌｕｃ ｃｅｌｌ及びＯＶ－９０．Ｌｕｃ細胞は、ＧＰＣ３及びＣＬＤＮ６ダブルポジティブ細胞であり、ＥＳ－２．ｈｕＧＰＣ３．Ｌｕｃ細胞は、ＧＰＣ３陽性ＣＬＤＮ６陰性細胞であり、ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞は、ＣＬＤＮ６陽性ＧＰＣ３陰性細胞である。
６．９．２ キメラ抗原受容体を含有する、操作されたＴ細胞の製造
上記方法に従って、キメラ抗原受容体を含有する、操作されたＴ細胞を製造した。ヒト化ＣＬＤＮ６ ＶＨＨ ＣＡＲをＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）と名付けた。ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ Ｈ９３ ＣＡＲをＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）と名付けた。それと共に、ＣＬＤＮ６及びＧＰＣ３の両方を標的とする二重特異性ＣＡＲをＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）と名付けた。上記の方法で全てのＣＡＲ－Ｔ細胞を製造した。
６．９．３ 異なるＧＰＣ３又はＣＬＤＮ６発現レベルを有する腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性
いくつかのタイプの標的細胞が存在する：ａ）ＧＰＣ３及びＣＬＤＮ６ダブルポジティブ細胞株：ＰＡ－１．Ｌｕｃ細胞株、ＯＶ９０．Ｌｕｃ細胞株、ｂ）ＧＰＣ３陽性及びＣＬＤＮ６陰性細胞株：ＥＳ－２．ｈｕＧＰＣ３．Ｌｕｃ細胞株、ｃ）ＣＬＤＮ６陽性及びＧＰＣ３陰性細胞株：ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞株。ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞を一定の比（それぞれ２×１０３個の細胞／ウェル、Ｅ／Ｔ＝４：１）で混合し、３８４ウェルプレートで２０時間培養した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する細胞傷害性を測定するために、メーカーのプロトコルに従ってＯｎｅ－ｇｌｏ発光ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ６１２０）を製造し、ウェル内の残留ルシフェラーゼの活性を検出するために、共培養された細胞に加えた。ルシフェラーゼは腫瘍細胞のみで発現するため、ウェル内の残留ルシフェラーゼの活性は、ウェル内の生存標的細胞の数と直接相関する。エフェクター細胞の非存在下で標的細胞に培地を加えることによって、ルシフェラーゼ活性の最大値を得た。細胞傷害性アッセイを開始する時に最終濃度が１％であるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を加えることによってルシフェラーゼ活性の最小値をアッセイした。以下の式によって特異的細胞傷害性を計算した：特異的細胞傷害性％＝１００％×（１－（ＲＬＵ試料－ＲＬＵｍｉｎ）／（ＲＬＵＵｎＴ－ＲＬＵｍｉｎ））。
図６に示すように、ＧＰＣ３陽性ＣＬＤＮ６陰性細胞株（ＥＳ－２．ｈｕＧＰＣ３．Ｌｕｃ細胞）に対して、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のみが同等なインビトロ細胞傷害性を示した（ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔに対して－８．２０ ± ３．０２％であり、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ２ ＣＡＲ－Ｔに対して８９．３６％ ± １．９９％であり、且つＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔに対して９０．０５％ ± ０．４９％である）。ＣＬＤＮ６陽性ＧＰＣ３陰性細胞株（ＥＳ－２．ｈｕＣＬＤＮ６．Ｌｕｃ細胞）に対して、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のみが同等なインビトロ細胞傷害性を示した（ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔに対して９０．６４ ± ０．９０％であり、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ２ ＣＡＲ－Ｔに対して－１９．６９％ ± ５．３２％であり、且つＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔに対して９３．８５％ ± ０．４９％である）。ＣＬＤＮ６及びＧＰＣ３ダブルポジティブ細胞株（ＰＡ－１．Ｌｕｃ細胞とＯＶ－９０．Ｌｕｃ細胞）に対して、全てのＣＡＲ－Ｔ細胞が、明らかなインビトロ細胞傷害性を示した。
６．１０． 実施例１０－ＣＬＤＮ６×ＧＰＣ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍不均一性異種移植マウスでのインビボ有効性
６．１０．１ キメラ抗原受容体を含有する、操作されたＴ細胞の製造
実施例９に記載の方法を用いて、ＴＧＦβＲ及びＩＬ２３Ｒを武装化し（ＴＦ２３、図７Ａ及びＰＣＴ／ＣＮ２０２２／０８７０１６を参照されたい）、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ２及びＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ３に外因的に導入し、それぞれＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１－ＴＦ２３、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ２－ＴＦ２３及びＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ３－ＴＦ２３と名付けた。ＴＦ２３は、二本のポリペプチド鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４：ＴＧＦβＲ２ＥＣ－ＩＬ２３ＲＴＭ－ＩＬ２３ＲＩＣ、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５：ＴＧＦβＲ１ＥＣ－ＩＬ１２Ｒβ１ＴＭ－ＩＬ１２Ｒβ１ＩＣ）を含み、それらは、自己切断２Ａリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）を介して連結される。全長ＴＦ２３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２であり、ＴＦ２３をコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３である。ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１－ＴＦ２３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９であり、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１－ＴＦ２３をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６である。ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ２－ＴＦ２３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０である。ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ３－ＴＦ２３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１であり、ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ３－ＴＦ２３をコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７である。実施例６．６に記載の方法で全てのＣＡＲ－Ｔ細胞を製造した。
６．１０．２． ＣＬＤＮ６(ＧＰＣ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、不均一な腫瘍を治療することができる
実施例６．９．１に記載されるように、ＯＶ９０．Ｌｕｃ細胞株皮下腫瘍切片においてＧＰＣ３とＣＬＤＮ６の発現を検出した。
厚さが３～４μｍである組織スライドグラスを５８℃～６０℃の乾燥オーブン中で１時間インキュベートし、その後に脱ろうし、水和し、蒸留水で洗浄した。クエン酸塩抗原回復溶液（ｐＨ ６．０）中で２０分間マイクロ波処理することによって抗原を回復させた。スライドグラスを室温で６０分冷却させた。室温で、３％過酸化水素で１０分間インキュベートすることによって、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。２℃～８℃で、スライドグラスを５％ヤギ血清含有ＰＢＳで一晩ブロッキングした。スライドグラスを、抗ＣＬＤＮ６抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－３９３６７１、１：１００）又は抗ＧＰＣ３抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、２μｇ／ｍＬ）と共に、３７℃で２時間インキュベートした。ポリマーに基づくＢｒｉｇｈｔＶｉｓｉｏｎ抗体ＢｒｉｇｈｔＶｉｓｉｏｎ ＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧ（ＭＸＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＫＩＴ－５００２）及びＩｍｍＰＡＣＴ ＤＡＢペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳＫ－４１０５）を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼにより標識された二次抗体により抗体結合を可視化した。
図７Ｂに示されるように、ＧＰＣ３は、ＯＶ９０．Ｌｕｃ細胞において均一に強く発現するが、ＣＬＤＮ６は、ＯＶ９０．Ｌｕｃ細胞において不均一に弱く発現する。そのため、ＯＶ９０．Ｌｕ細胞株を選択して、腫瘍不均一性異種移植マウスモデルを構築した。
免疫不全マウスＮＣＧにＯＶ９０．Ｌｕｃ細胞株を５×１０６個／マウスで皮下注射した。１０日後、皮下異種移植腫瘍を有するＮＣＧマウスにＣＡＲ－Ｔ細胞（０．２×１０６個／マウス）を注射した。ＣＡＲ－Ｔ細胞投与後約４週間以内に、これらのマウスの腫瘍体積を監視して、抗腫瘍有効性を評価した。一方向ＡＮＮＯＶＡを、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ９により実行される多重比較に用いた。
図８Ａ及び８Ｂに示すように、２０６－Ｃ４６Ｓ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、低用量（０．２Ｍ ＣＡＲ＋／マウス）で抗腫瘍作用を有しなかった。ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ１－ＴＦ２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、短期間腫瘍増殖を抑制し、ＣＡＲ－Ｔ細胞処置から６週間後にＯＶ９０が再発した。しかしながら、二重特異性ＬＣＡＲ－ＣＮＢＣＡＲ３－ＴＦ２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、このような不均一な腫瘍異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を効果的に排除し、重量は変化しなかった。
本明細書に援用された全ての特許、開示された出願及び参照文献の教示は、いずれも全体として参照により本明細書に組込まれる。例示的な態様が具体的に示され、説明されたが、当業者であれば理解できるように、添付の特許請求の範囲に包含される態様の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細において様々な変更がなされ得る。
以上から理解されるように、本明細書では、例示の目的で具体的な態様が説明されているが、本明細書により提供された精神及び範囲から逸脱することなく、様々な修正がなされてもよい。以上で言及された全ての参考文献は、全体として参照により本明細書に組込まれる。
配列表

Claims (50)

  1. （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、
    （ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、
    （ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、
    （ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又は、
    （ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
    を含む、抗クローディン－６単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）。
  2. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３が、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、ＩＭＧＴ番号付けスキーム、ＡｂＭ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、Ｃｏｎｔａｃｔ番号付けスキーム又はそれらの組み合わせに従って確定される、請求項１に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ。
  3. （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は、
    （ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
    を含む、請求項１又は２に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ。
  4. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示す一つ又は複数のＦＲ領域をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ。
  5. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ。
  6. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ。
  7. ラクダ科動物のｓｄＡｂである、請求項１に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ。
  8. ヒト化ｓｄＡｂである、請求項１に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ。
  9. 作用物質と遺伝子融合又は化学コンジュゲーションしている、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ。
  10. Ｆｃ領域と融合している、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ。
  11. 前記Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ１Ｆｃであり、任意選択的に、前記ヒトＩｇＧ１ＦｃがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ。
  12. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂと、ヒトＩｇＧ１Ｆｃとを含む、融合タンパク質であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１～２５のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
  13. （ａ）請求項１～９のいずれか一項に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、
    （ｂ）膜貫通ドメインと、
    （ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと
    を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  14. 前記細胞外抗原結合ドメインが、一つ又は複数のさらなる抗原結合ドメインをさらに含み、任意選択的に、前記さらなる結合ドメインのうちの少なくとも一つが、ＧＰＣ３に結合する、請求項１３に記載のＣＡＲ。
  15. 前記さらなる抗原結合ドメインが、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含むＶＨに示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列を含むＶＬに示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と
    を含む、請求項１４に記載のＣＡＲ。
  16. 前記さらなる抗原結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、請求項１５に記載のＣＡＲ。
  17. 前記さらなる抗原結合ドメインが、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインと
    を含む、請求項１６に記載のＣＡＲ。
  18. 前記さらなる抗原結合ドメインが、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインと
    を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。
  19. 前記さらなる抗原結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のＣＡＲ。
  20. 前記さらなる抗原結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のＣＡＲ。
  21. 前記抗原結合ドメインが、ペプチドリンカーを介して互いに融合している、請求項１４～２０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  22. 前記ペプチドリンカーの長さが、約５０アミノ酸以下である、請求項２１に記載のＣＡＲ。
  23. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２及びＰＤ１からなる群から選択される分子に由来する、請求項１３～２２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  24. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αに由来する、請求項２３に記載のＣＡＲ。
  25. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１３～２４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  26. 前記一次細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζに由来する、請求項２５に記載のＣＡＲ。
  27. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項２５又は２６に記載のＣＡＲ。
  28. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する、請求項２７に記載のＣＡＲ。
  29. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７に由来する、請求項２８に記載のＣＡＲ。
  30. 前記細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と前記膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む、請求項１３～２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  31. 前記ヒンジドメインが、ＣＤ８αに由来する、請求項３０に記載のＣＡＲ。
  32. ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチドをさらに含む、請求項１３～３１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  33. 前記シグナルペプチドが、ＣＤ８αに由来する、請求項３２に記載のＣＡＲ。
  34. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  35. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ又は請求項１２に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸。
  36. 請求項１３～３４のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を含む、核酸。
  37. 前記核酸が、キメラ受容体をコードする核酸配列をさらに含み、前記キメラ受容体が、ＴＧＦβＲとＩＬ２３Ｒとを含み、任意選択的に、前記キメラ受容体をコードする前記核酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３の核酸配列を含む、請求項３６に記載の核酸。
  38. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２及び４４～４５のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含む、キメラ受容体。
  39. 請求項３５～３７のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
  40. 請求項１３～３４のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項３８に記載のキメラ受容体、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の核酸又は請求項３９に記載のベクターを含む、操作された免疫エフェクター細胞。
  41. Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞又はそれらの組み合わせである、請求項４０に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
  42. 請求項３９に記載のベクターを細胞に導入することを含む、操作された免疫エフェクター細胞を産生するための方法。
  43. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の核酸、請求項３９に記載のベクター、請求項４０又は４１に記載の操作された免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
  44. 有効量の、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗クローディン－６ ｓｄＡｂ、請求項４０～４１のいずれか一項に記載の操作された免疫エフェクター細胞又は請求項４３に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象の疾患又は障害を処置する方法。
  45. 有効量の、ＣＬＤＮ６アンタゴニストとＧＰＣ３アンタゴニストとの組み合わせ、又はＣＬＤＮ６及びＧＰＣ３のアンタゴニストを対象に投与することを含む、対象の疾患又は障害を処置する方法。
  46. 前記疾患又は障害が、クローディン－６関連疾患もしくは障害、及び／又はＧＰＣ３関連疾患もしくは障害である、請求項４４又は４５に記載の方法。
  47. 前記疾患又は障害が、がんである、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記疾患又は障害が、固形腫瘍がんである、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記疾患又は障害が、胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）、卵巣がん（ＯＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、類内膜がん（ＥＣ）及びＡＦＰ＋胃がん（ＡＦＰ＋ＧＣ）からなる群から選択される、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記対象が、少なくとも一つのＣＬＤＮ６薬剤に対して耐性を有する、及び／又は前記対象が、少なくとも一つのＧＰＣ３薬剤に対して耐性を有する、請求項４４～４９のいずれか一項に記載の方法。
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