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JP2025507371A - α－メチレン－γ－ブチロラクトンを合成する方法 - Google Patents

α－メチレン－γ－ブチロラクトンを合成する方法 Download PDF

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JP2025507371A JP2024547595A JP2024547595A JP2025507371A JP 2025507371 A JP2025507371 A JP 2025507371A JP 2024547595 A JP2024547595 A JP 2024547595A JP 2024547595 A JP2024547595 A JP 2024547595A JP 2025507371 A JP2025507371 A JP 2025507371A
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Abstract

本出願は、α-メチレン-γ-ブチロラクトンを調製する方法であって、
a)イソプレノールのC1-ヒドロキシル基をアセチル化してイソプレニルアセテートを得る工程；
b)全細胞生体内変換により前記イソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを形成する工程であって、
i)細胞(CB)を、該細胞がイソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを形成することを可能にする条件下で、前記イソプレニルアセテートを含有する培養培地、または前記イソプレニルアセテートを含有する有機相に接している培養培地と接触させること；および
ii)場合により、得られた4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを単離すること、を含み、
ここで、前記細胞(CB)は、イソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールの形成を触媒する少なくとも1つのアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性を示す、工程；
c)4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを酸化させて4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を得る工程；および
d)前記4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を、γ-ヒドロキシ-α-メチレン酪酸へのヒドロキシ分解およびそれに続く前記γ-ヒドロキシ-α-メチレン酪酸の環化により、α-メチレン-γ-ブチロラクトンに変換させる工程、
を含む方法が提供される。

Description

本開示は、イソプレノールからα-メチレン-γ-ブチロラクトン(MBL)を合成する方法に関する。より具体的には、本開示は、イソプレノールからα-メチレン-γ-ブチロラクトン(MBL)を合成する多工程方法であって、この方法の少なくとも１つの工程は、全細胞生体内変換を含む。この方法では、それ自体で有用性を有する多数の重要な中間化合物が特定される。
大規模な汎用化学品や特殊化学品市場向けに、石油系原料に代わる再生可能な、または持続可能な高分子材料を開発するために、重要な研究が行われている。バイオ由来のポリ乳酸やポリヒドロキシアルカノエート(PHA)、例えばポリ-3-ヒドロキシブチレート(P3HB)、ポリ-4-ヒドロキシブチレート(P4HB)、ポリヒドロキシバレレート(PHV)、ポリヒドロキシヘキサノエート(PHH)、ポリヒドロキシオクタノエート(PHO)、およびそれらのコポリマーは、この点で長い間注目を集めてきた。これとは対照的に、不飽和ラクトンは、植物源から単離されるか、バイオマス供給原料の微生物発酵で得られるイタコン酸またはレブリン酸から誘導されるが、これまであまり広く研究されてこなかった。
不飽和ラクトンの利点は、1分子中に2つの異なる官能基、特にビニルとラクトンを有し、前記官能基の両方が重合可能であることである。従って、これらのモノマーは、ビニル付加重合における(メタ)アクリレートの置き換え、またはラクトン開環重合(ROP)を介する分解性ポリエステルの調製のための(コ)モノマーとして有用である。これらの不飽和モノマー、特に、α-メチレン-γ-ブチロラクトン(MBL)、β-ヒドロキシ-α-メチレン-γ-ブチロラクトン(H-MBL)、β-およびγ-メチル-α-メチレン-γ-ブチロラクトン(β-MBL、γ-MMBL)およびアンゼリカラクトン(α-およびβ-AL)が得られる不飽和モノマーを用いて、官能性ポリマーが、ペンダント二重結合、ペンダントラクトン環、またはさまざまなポスト官能基化を可能にする他のペンダント置換基を有する官能性ポリマーを誘導することができる。
本開示は、α-メチレン-γ-ブチロラクトン(MBL)を製造するための新規な合成経路に関する。前述のホモポリマーおよびコポリマーのプラットフォームモノマーであることに加え、MBL構造単位は、α-メチレン-γ-ブチロラクトン自体において、また様々なセスキテルペノイドの一部として、抗細菌活性、細胞毒性活性、抗炎症活性、抗酸化活性、アレルギー活性および抗菌活性を含む複数の生物学的特性を示すことが認識されている。
米国特許第5,166,357号(Orlekら)は、α-メチレン-γ-ブチロラクトンの合成経路であって、i)塩基の存在下、γ-ブチロラクトンとエチルホルメートとを反応させること、ii)得られたα-ホルミル-γ-ブチロラクトンナトリウム塩を、窒素下、テトラヒドロフラン中のパラホルムアルデヒドと還流させること、からなる2工程シーケンスを含む、合成経路を開示している。蒸留により、所望のα-メチレン-γ-ブチロラクトンが無色の油として得られる。
米国特許第6,362,346 B1号(Coulsonら)には、α-メチレン-γ-ブチロラクトンを調製する方法であって、テトラヒドロ-3-フロン酸およびテトラヒドロ-3-フロン酸のエステルからなる群から選択されるフロン酸および強酸触媒の混合物を、α-メチレン-γ-ブチロラクトンが形成される条件下で加熱することを含む方法が記載されている。
WO2012/116977(DSM IP Assets BV)には、3-メチレン-Y-ブチロラクトン(Z)を調製する方法であって、i)ヒドロホルミル化触媒の存在下、1,4-ブテン-ジオール(X)またはそのエステル誘導体cis-1,4-ジアセトキシブテン(Y)をH2気体およびCO気体にかけることで、アルデヒド基またはヘミアセタールを含む化合物の混合物を含む中間生成物を形成する、ヒドロホルミル化工程；およびii)前記中間生成物またはその加水分解誘導体が酸化剤によって酸化されることでZを形成する、酸化工程、を含む方法が記載されている。
WO2012/116977に記載の実施態様において、中間生成物は、ヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)ブタナール(X1)、4-ヒドロキシ-2-メチレンブタナール(X2)、3-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-オール(X3)および3-メチレンテトラヒドロフラン-2-オール(X4)の混合物である。これらの中間体の収量は開示されていないが、1,4-ブテン-ジオール(X)は分子間アセタール化により効率的に変換できず、この効率の低さがZの収率の低さにつながると主張されている。さらに、前記中間体からのZの生成は効率的ではない：塩基触媒作用下でも、特に、X1およびX3の環化反応と脱水反応；X1およびX2のH2による対応するアルコールへの還元；およびX1、X2、X4およびZの水素化による対応するアルカンの生成など、競合する反応がある。このような副反応は、保護された出発物質であるcis-1,4-ジアセトキシブテン(Y)を使用することで最小限に抑えられるかもしれないが、これには、出発物質の追加コスト、ヒドロホルミル化の反応時間が長くなること、保護基が無駄になることによる好ましくない分子経済性のような欠点がある。
当業者はさらに、WO2012/116977の方法が、有毒なリン配位子を有する遷移金属触媒の存在下、温度および圧力の過酷な条件下での爆発性合成ガスの使用に依存していることに留意するであろう。合成ガスは化石系炭素源の高温処理によって生成されることが知られている。また、Co、RhおよびPd系遷移金属触媒の天然資源は地政学的に限られている。
Trottaら, Synthesis of methylene butyrolactone polymers from itaconic acid, J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem.2017,55, 2730-2737には、バイオ再生可能な供給原料として入手可能なβ-モノメチルイタコネートの選択的付加戦略によるα-メチレン-γ、γ-ジメチル-γ-ブチロラクトン(Me2MBL)およびα-メチレン-γ-ブチロラクトン(MBL、tulipalin A)への変換を報告されている。
WO 2002101013 A2(DuPont)には、α-メチレン-γ-ブチロラクトン(Tulipalin A)およびその中間体の天然生合成に関与すると示されているタンパク質をコードする遺伝子のクローニングが記載されている。該引用文献には、より具体的には、(a) 該引用文献の配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:14、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22および配列番号:24に記載の1つのアミノ酸配列をコードする単離された核酸断片；(b) 以下のハイブリダイゼーション条件下で上記の配列とハイブリッド形成する単離された核酸断片:65℃で0.1 X SSC、0.1％SDS、および2X SSC、0.1％SDS、続いて0.1 XSSC、0.1％ SDSで洗浄；(c) (a)または(b)に完全に相補的な単離された核酸断片、からなる群から選択されるツリポシドA合成タンパク質をコードする単離された核酸断片が開示されている。この引用文献で提案されている生合成生合成経路は、中間生成物γ-メチレングルタメートに至るヒドラターゼ工程または他の酵素反応も含んでおらず、この理由だけで、この経路は実施不可能であるか、または他の点でこの引用文献では不完全または不十分に開示されていると考えられる。
WO2001068803A2(Maxygen Inc.)には、単純な炭素源を重合可能な基質に、ポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)に変換させる酵素、生化学経路および全細胞バイオプロセスを調製する方法が記載されている。特に、イタコネート産生真菌アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)におけるα-メチレン-γ-ヒドロキシ酪酸合成のための人工経路が記載されている。該引用文献では、イタコネートが真菌の内因性酵素によってイタコニル-CoAに変換され、次にイタコニル-CoAがα-α-メチレンスクシネートセミアルデヒドに変換され、さらにα-メチレン-γ-ヒドロキシ酪酸に変換されることを示唆している。これらの還元的工程は、それぞれクロストリジウム・クルイベリ(Clostridium kluyveri)由来のスクシネート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびγ-ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼによって触媒されることが示唆されている。これらの反応を触媒できる可能性のある酵素は、この引用文献の表1にリストアップされているが、関連する実験データは示されていない。絶対嫌気性生物由来の酵素の多くは酸素に非常に敏感であるため、好気性生物への導入に問題があると考えられる。
本発明者らは、生物学的に再生可能であり得る供給原料から出発してα-メチレン-γ-ブチロラクトン(Tulipalin A)への新規な合成経路を提供する必要性が当該技術分野に存在すると考える。
本開示の第一の態様において、α-メチレン-γ-ブチロラクトンを調製する方法であって、
a)イソプレノールのC1-ヒドロキシル基をアセチル化してイソプレニルアセテートを得る工程；
b)全細胞生体内変換により前記イソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを形成する工程であって、
i)細胞(CB)を、該細胞がイソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを形成することを可能にする条件下で、前記イソプレニルアセテートを含有する培養培地、または前記イソプレニルアセテートを含有する有機相に接している培養培地と接触させること；および
ii)場合により、得られた4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを単離すること、
を含み、
ここで、前記細胞(CB)は、イソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールの形成を触媒する少なくとも1つのアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性を示す、工程；
c)前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを酸化させて4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を得る工程；および
d)前記4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を、γ-ヒドロキシ-α-メチレン酪酸への加水分解分解およびそれに続く前記γ-ヒドロキシ-α-メチレン酪酸の環化により、α-メチレン-γ-ブチロラクトンに変換させる工程、
を含む方法が提供される。
この方法の工程の出発点であるイソプレノールは、商業的に供給され得るものであり、石油由来の化学物質であるイソブテンおよびホルムアルデヒドから得ることができる。しかし、この化合物は、イソプレノールを生成するための合成微生物システムから供給されることが好ましい。
工程b)の利用される細胞(CB)は、アルカンモノオキシゲナーゼの遺伝子を、場合によりAlkオペロンの一部として有する。重要な実施態様において、工程b)の前記細胞(CB)は、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)GP01由来のAlkB遺伝子のホモログによってコードされるアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性の増加を示すように遺伝子の組換えがなされている。前記細胞(CB)が、AIkBGT遺伝子クラスター；AlkBGTJH遺伝子クラスター；およびAlkBGTJHL遺伝子クラスターからなる群から選択される、シュードモナス・プチダGP01由来のAlkB遺伝子によってコードされるアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性の増加を示すように遺伝子の組換えがなされている場合、良好な結果が得られている。
本開示の工程c)は、化学的に実施され得るが、重要な実施態様において、工程c)は、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを、好気的条件下で、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素；場合により、酵素の酸化活性を増強する少なくとも1つの媒介化合物、と接触させることを含む酵素的酸化プロセスを特徴とする。
工程c)は、2つの重要な実施態様が認められる全細胞生体内変換によって同様に実施され得る。
第一の実施態様において、工程c)は、全細胞生体内変換により行われ、
i)細胞(CC)を、該細胞(CC)が4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールから4-アセトキシ-2-メチレン-酪酸を形成することを可能にする条件下で、前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを含有する培養培地、または4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを含有する有機相に接している培養培地と接触させること；および
ii)得られた4-アセトキシ-2-メチレン-酪酸を単離すること、
を含み、
ここで、前記細胞(CC)は、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素の活性を示す。好ましくは、前記酸化活性を示す少なくとも1つの酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)；アルコールオキシダーゼ(AlcOx)；アルデヒドデヒドロゲナーゼ(AlDH)；およびラッカーゼからなる群から選択される。
第二の実施態様において、工程c)は、全細胞生体内変換により行われ、
i)第一の細胞(CC1)を、該細胞が4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールを形成することを可能にする条件下で、前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを含有する培養培地、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを含有する有機相に接している培養培地と接触させること；
ii)場合により、得られた4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールを単離すること；
iii)第二の細胞(CC2)を、該細胞が4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールから4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を形成することを可能にする条件下で、前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールを含有する培養培地、または前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールを含む有機相に接している培養培地と接触させること；および
iv)得られた4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を単離すること、
を含み、
ここで、前記第一および第二の細胞(CC1、CC2)はそれぞれ、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素の活性を示す。好ましくは、前記第一の細胞(CC1)は、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、アルコールオキシダーゼ(AlcOx)およびラッカーゼからなる群から選択される、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素の活性の増加を示すように遺伝子の組換えがなされており；前記第二の細胞(CC2)は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(AlDH)およびラッカーゼからなる群から選択される、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素の活性の増加を示すように遺伝子の組換えがなされている。
酸化活性を示す前記酵素に関して、前記アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)酵素が、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)GP01由来のAlkJ遺伝子のホモログによってコードされること；および／または、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼ(AlDH)酵素が、シュードモナス・プチダGP01由来のAlkH遺伝子のホモログによってコードされることが特に好ましい。
本開示はまた、上記の方法で得られたα-メチレン-γ-ブチロラクトン(MBL)の、ポリマー鎖中にペンダントラクトン環を有するホモポリマーまたはコポリマー(p-MBL)を得るためのアニオン重合プロセス、またはポリエステルを得るための開環重合プロセスにおけるモノマーとしての使用を提供する。
本開示の第二の態様において、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを調製する方法であって、
a)イソプレノールのC1-ヒドロキシル基をアセチル化してイソプレニルアセテートを得る工程；
b)全細胞生体内変換により前記イソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを形成する工程であって、
i)細胞(CB)を、該細胞がイソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを形成することを可能にする条件下で、前記イソプレニルアセテートを含有する培養培地、または前記イソプレニルアセテートを含有する有機相に接している培養培地と接触させること；および
ii)得られた4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを単離すること、
を含み、
ここで、前記細胞(CB)は、イソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールの形成を触媒する少なくとも1つのアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性を示す、工程、
を含む方法が提供される。
工程b)の利用される細胞(CB)は、アルカンモノオキシゲナーゼの遺伝子を、場合によりAlkオペロンの一部として有する。
本開示は、α-メチレン-γ-ブチロラクトン(MBL)の合成のための、本明細書中上記および添付の特許請求の範囲においてで定義される全細胞生体内変換によって得られる前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールの使用を提供する。本開示はまた、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールの加水分解による2-メチレンブタン-1,2-ジオールの合成であって、前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールは、本明細書中上記および添付の特許請求の範囲において定義される全細胞生体内変換によって得られる、合成を提供する。前記加水分解は、塩基性条件下で行わってもよく、酸性条件下で行わってもよく、適切なリパーゼもしくはカルボキシルエステラーゼ酵素を用いて酵素的に行わってもよい。
本開示はまたさらに、全細胞生体内変換により式(BII)の化合物から式(BIII)の化合物を調製する方法：
［式中、
nは、0～8の整数であり；
R1は、C1-C4アルキルであり；
R2は、HまたはC1-C4アルキルであり；
R3は、HまたはC1-C4アルキルである］
であって、
i)細胞(CB)を、該細胞が前記式(BII)の化合物から前記式(BIII)の化合物を形成することを可能にする条件下で、前記式(BII)の化合物を含有する培養培地、または前記式(BII)の化合物を含有する有機相に接している培養培地と接触させること；および
ii)得られた式(BIII)の化合物を単離すること、
を含み、
ここで、前記細胞(CB)は、前記式(BII)の化合物のCn+3-ヒドロキシル化を触媒する少なくとも1つのアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性を示す、方法を提供する。
本開示のこの態様の利用細胞(CB)は、モノオキシゲナーゼの遺伝子を、場合によりAlkオペロンの一部として有する。
定義
本明細書で使用される単数形の「a」、「an」、「the」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数形の参照語を含む。
本明細書で使用される用語「含む(comprising)」、「含む(comprises)」および「で構成されてい(comprised of)」は、「含む(including)」、「含む(includes)」、「含有する(containing)」または「含有する(contains)」と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、追加の、記載されていない構成員、要素または方法工程を排除しないものである。
本明細書で使用される用語「からなる(consisting of)」とは、特定されていない要素、成分、構成員または方法ステップを除外するものである。完全性を期すため、用語「含む(comprising)」は「からなる(consisting of)」を包含する。
量、濃度、寸法および他のパラメータが、範囲、好ましい範囲、上限値、下限値、または好ましい上限値および下限値の形で表現されている場合、得られた範囲が文脈で明確に言及されているかどうかにかかわらず、任意の上限値または好ましい値を任意の下限値または好ましい値と組み合わせることによって得られる範囲も具体的に開示されていると理解すべきである。
さらに、標準的な理解に従って、「0～」と表される重量範囲は、具体的には0wt.％を含むものであり、前記範囲によって定義される成分は、組成物中に存在してもしなくてもよい。
本明細書において、「好ましい」、「好ましくは」、「望ましい」および「特に」という語は、特定の状況下で、特定の利点を与え得る本開示の実施態様を指すために頻繁に使用される。しかしながら、1つ以上の好ましい(preferable)、好ましい(preferred)、望ましい、または特定の実施態様の記載は、他の実施態様が有用でないことを意味するものではなく、本開示の範囲からそれらの他の実施態様を除外することを意図するものではない。
本出願全体を通じて使用される用語「であり得る(may)」という語は、義務的な意味ではなく、許容的な意味、すなわち、～する可能性があるという意味で使用される。
本明細書で使用される室温は、23℃±2℃である。本明細書で使用される「周囲条件」とは、組成物が位置する、または組成物から得られる粘着物またはコーティング物が位置する周囲の温度および圧力を意味する。
用語「イソプレノール」とは、式C5H10Oの化合物を意味する。イソプレノールのIUPAC名は3-メチルブト－3-エン-1-オールであり、イソプレノールの同義語にはイソブテニルカルビノール、およびメタリルカルビノールが含まれる。
本明細書において、「Tulipalin A」は、α-メチレン-γ-ブチロラクトンと互換的に称される。Tulipalin AのIUPAC名は、3-メチリデンオキソラン-2-オン(C5H6O2)である。
本明細書で使用される「アセチル化する」または「アセチル化」という用語は、アセチル基を、ヒドロキシル(-OH)基を有する化合物の分子に導入するプロセスを意味する。アセチル化により、前記-OH基のHをCH3CO-基に置き換える。
本明細書において、「C1-Cnアルキル」基とは、1～n個の炭素原子を含む一価の基であって、アルカンのラジカルであり、直鎖および分枝状の有機基を含む基である。このように、「C1-C4アルキル」基とは、1～4個の炭素原子を含む一価の基であって、アルカンのラジカルであり、直鎖および分枝状の有機基を含む基である。アルキル基の例としては、メチル；エチル；プロピル；イソプロピル；n-ブチル；イソブチル；sec-ブチル；およびtert-ブチルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、このようなアルキル基は、非置換であってもよく、1つ以上のハロゲンによって置換されていてもよい。所定の部分(R)について適用可能な場合、アルキル基内の1つ以上の非ハロゲン置換基の許容範囲は、本明細書中に記載される。
本明細書で使用される用語「水」は、水道水、湧水、精製水、脱イオン水、脱塩水および蒸留水を包含することを意図するものである。水は、液体形態で本発明の組成物に含まれる。固体水は、硬化組成物の強度発現に必要な水和物の形成に動員できないため、固体水粒子(氷)の存在は望ましくない。
本明細書で使用される「塩基性」とは、酸ではなく塩基である性質を意味する。より詳細には、酸および塩基のルイス理論によれば、塩基は電子対供与体である。この定義は、プロトン受容体として作用する化合物であるブレンステッド-ローリー(Brφnsted-Lowry)塩基を含むが、これに限定されるものではない。
本明細書で使用される「モノマー」および「コモノマー」という用語は、それ自体または他の類似の分子もしくは化合物との組み合わせによってポリマー、合成樹脂またはエラストマーに変換することができる分子を意味する。この用語は、小分子に限定されず、オリゴマー、ポリマー、およびそれ自身または他の類似の分子または化合物と結合することができる他の大きな分子を含む。
本明細書で使用される「マクロモノマー」とは、重合反応を進行させることができる官能基を少なくとも1つ有するポリマーを意味する。したがって、マクロモノマーは、定義された構造のホモポリマーまたはコポリマーに変換することができる高分子モノマーである。本明細書で使用されるマクロモノマーが、1つの官能基に結合した1つを超えるポリマー鎖を含むことを排除するものではない。
本明細書で使用される用語「酵素」とは、化学反応を触媒するタンパク質を意味する。酵素の触媒機能は、その「酵素活性」または「活性」を構成する。本明細書で使用される用語「基質」とは、酵素がその触媒活性を発揮して生成物を生成する物質を意味する。
本明細書で使用される用語「モノオキシゲナーゼ」または「ヒドロキシラーゼ」は、電子伝達タンパク質、NADHまたはNADPHなどの電子供与体を必要とするアルカンまたはアルケンなどの基質へのヒドロキシル基の取り込みを触媒する、BRENDA：EC(酵素委員会)1.14に定義される酵素を意味する。
本明細書で使用される「ラッカーゼ」とは、4電子伝達プロセスにおいて酸素の水への還元を伴う、単電子奪取によるアルコールの酸化を触媒する、BRENDA:EC(酵素委員会)1.10.3.2に定義される多銅含有オキシダーゼである。BRENDA:EC1.1.1.1で定義される、受容体としてNAD+またはNADP+を必要とする亜鉛酵素と、BRENDA:EC1.1.1.3で定義される、受容体としてNAD+またはNADP+を必要とする金属非依存性酵素が含まれる。本明細書で使用される「アルデヒドデヒドロゲナーゼ」(AlDH)は、BRENDA:EC1.2.1.3で定義される、受容体としてNAD+またはNADP+を必要とする酵素である。本明細書で使用される用語「アルコールオキシダーゼ」(AlcOx)は、BRENDA:EC1.1.3.13に定義される、受容体として酸素を利用するオキシドレダクターゼ酵素を意味する。
本明細書で使用される用語「媒介化合物」または「媒介物」とは、酸化活性を示す酵素と二次基質または電子供与体との間で電子をシャトルする酸化還元媒介物として機能する化学的化合物を指すために互換的に使用されることがある。このような化学的媒介化合物は、当技術分野では「エンハンサー」および「促進剤」として言及されることがある。
用語「核酸」とは、ヌクレオチド(リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドの多量体型、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態を意味する。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチドアナログから作られたRNAまたはDNAのいずれかのアナログ、および記載される実施態様に適用可能なように、一本鎖(センスまたはアンチセンスなど)および二本鎖ポリヌクレオチドも含むと理解されるべきである。
記録された配列リスト(配列番号)に対するパラメータ「ヌクレオチド同一性」は、確立された公知の方法を用いて本明細書中で決定され得る。このアルゴリズムおよび同等のアルゴリズムを実施するSmith-Watermanアルゴリズムコンピュータプログラムには、以下が含まれるが、これらに限定されない：Deveroy, J.et al., Nucleic Acid Research 12:387, 1984に記載されているGAPを含むGCGソフトウェア；および、とりわけAltschul, S.et al., Journal of Molecular Biology 215:403-410, 1990に記載のBLASTP、BLASTNおよびFASTA。
本明細書で使用される用語「発現ベクター」とは、宿主においてコード配列を発現させることができる1つ以上の適当な制御配列(複数可)に作動可能に結合されているDNAコード配列(例えば、遺伝子配列)を含むDNA構築物を意味する。このような制御配列には、転写をもたらすプロモーター、このような転写を制御する任意のオペレーター配列、適当なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。ベクターはプラスミド、ファージ粒子、または潜在的なゲノムインサートであり得る。一旦適当な宿主に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムから独立して複製し機能することもできるし、場合によってはゲノム自体に組み込まれることもある。
用語「全細胞生体内変換」とは、微生物による適切な基質から生成物への変換を意味する。
細胞に関して本明細書で使用される用語「野生型」とは、野生で自然に見出されるゲノム構成を有する細胞を示す。従って、用語「野生型」には、遺伝子配列が人為的な変異によって少なくとも部分的に改変された細胞や遺伝子は含まれない。
タンパク質に関して本明細書で使用される用語「変異体」とは、野生型以外のタンパク質のバージョンを意味する。この変化は、例えば、得られるタンパク質が変異体と称され得る点変異によって、当業者に周知の方法によって影響され得る。
本明細書で使用される用語「非組換え実験細胞」とは、前駆野生型細胞に由来するクローン集団である細胞株から得られた細胞を意味する。クローン集団は、多くの場合、インビトロでの継続的または長期的な成長と分裂によって得られる。クローン集団の実験室での保存やトランスファーの際に、核型に自発的または誘導的な変化が起こることがある。そのため、細胞株から得られた実験室細胞は、祖先細胞と正確に同一でないことがあり、細胞株はそれらのバリアントを包含する。
本明細において、用語「オペロン」とは、単一のプロモーターの制御下にある遺伝子のクラスターを含むDNAの機能単位を示す。
波長600nmでの光学密度(「OD600」と略される)とは、波長600nmの光を1cmのパス長で培養したときの吸光度から、細胞培養物を含まない培地の1cmのパス長の吸光度を差し引いた値を計算することによって得られる、培養物中の細胞密度の標準尺度を意味する。
細胞培養に関して使用される用語「培地」は、細胞を取り巻く環境の成分を含む。培地は固体相、液体相、気体相、または混合相であり得る。培地には、液体成長培地と、細胞成長を維持しない液体培地が含まれる。寒天、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲンマトリックスなどのゼラチン培地も含まれる。例示的な気体培地には、ペトリ皿または他の固体または半固体の支持体上で成長する細胞が曝されている気相が含まれる。用語「培地」とは、まだ細胞と接触していなくても、細胞培養に使用することを意図する材料も意味する。
用語「最少培地」とは、ある種の野生型の成長は支持するが、その種の1つ以上の栄養要求株の成長は支持しない培地を含む。添加最少培地(supplemented minimal medium)とは、ある栄養要求株の成長を支持するための1つ以上の追加物質を含む最少培地である。「限定培地(Defined medium)」または「限定最少培地(defined minimal medium)」とは、化学的に限定された(通常は精製された)成分からなる培地を意味する。「限定培地」は、酵母抽出物やビーフ・ブロスなど、特性の悪い生物学的抽出物を含まない。
完全を期すために、高密度培養の成長に適した培地とは、他の条件(温度や酸素移動速度など)がそのような成長を可能にする場合に、細胞培養物が3以上のOD600に達することを可能にする培地である。
本明細書に記載の組成物の粘度は、特に規定がない限り、ブルックフィールド粘度計を使用して、20℃および50％相対湿度(RH)の標準条件で測定される。ブルックフィールド粘度計の校正、スピンドルの種類および回転速度は、測定する組成物に適した製造業者の指示に従って選択される。
本明細書で使用される「重合条件」とは、温度、圧力、雰囲気、重合混合物に使用される出発成分の比率、反応時間、または重合混合物の外部刺激など、少なくとも1つのモノマーのポリマーへの形成を引き起こす条件である。重合プロセスは、バルク、溶液、または他の従来の重合モードで行うことができる。このプロセスは、重合メカニズムに適した任意の反応条件で操作される。
本明細書で使用される用語「アニオン重合」とは、動力学的連鎖担体がアニオンであるイオン重合メカニズムを意味する。従って、アニオン重合反応は、ポリマー鎖の成長が、モノマー(複数可)とポリマー鎖上の反応性部位(複数可)との反応によって進行し、各成長ステップの終了時に反応性部位(複数可)が再生される連鎖反応である。本明細書では、炭素-炭素二重結合を含むモノマーから高分子を生成するためにアニオン重合を使用する。重合はモノマーの二重結合への求核付加によって開始され、開始剤はヒドロキシド、アルコキシド、シアン化物、カルバニオンなどのアニオンを含む。
本明細書で使用される用語「開環重合」とは、適切な触媒の存在下、環状化合物(モノマー)が開環して線状ポリマーを形成する重合を示す。反応システムは、所望の結果として得られる高分子化合物、環状化合物および／または線状オリゴマーの混合物の間の平衡に向かう傾向があり、その平衡の達成は、環状モノマーの性質および量、使用される触媒および反応温度に大きく依存する。重合における溶媒および／またはエマルジョンの使用は、反応が完了した後のそれらの除去が複雑である可能性があるため、推奨されない。
本明細書において、本発明の組成物は、特定の化合物、元素、イオンまたは他の同種の成分を「実質的に含有しない」と定義され得る。用語「実質的に含有しない」とは、化合物、元素、イオンまたは他の同種の成分が、組成物に意図的に添加されず、組成物の所望の特性に(悪影響を)及ぼさない、せいぜい微量しか存在しないことを意味することが意図されるものである。例示的な微量は、組成物の重量に対して1000ppm未満である。用語「実質的に含有しない」とは、特定の化合物、元素、イオン、または他の同様の成分が、組成物から完全に存在しないか、または当該技術分野で一般的に使用される技術によって測定可能ないかなる量でも存在しない、それらの実施態様を包含する。
本明細書で使用される用語「無水」は、用語「実質的に水を含有しない」と等価である。水は、所定の組成物に意図的に添加されることはなく、せいぜい、組成物の所望の特性に(悪影響を)及ぼさない微量しか存在しない。
本発明の詳細な説明
本開示の工程a)に提供されるイソプレノールは、商業的に入手され得るものであり、そのようなものとして、石油系イソブテンおよびホルムアルデヒドから誘導され得るものであり得る。しかしながら、化合物は、当該技術分野で公知のイソプレノールの生成のための合成微生物システムから供給されることが好ましい。
本開示の重要な実施態様において、工程a)の前記イソプレノールは、発酵段階を介して得られ、前記段階は、
微生物成長のための基質を含む発酵培地を提供すること；および
前記培地に、細菌、カビおよび酵母からなる群から選択される1つ以上の微生物の培養物を含む接種材料を導入すること、を含み、
ここで、前記1つ以上の微生物は、前記炭水化物を発酵させてイソプレノールを形成することを特徴とする。
用語「発酵培地」とは、本明細書において、発酵容器内に保持される三相(固体-液体-気体)システムを示すために使用されるものである。液相は、水、溶存栄養素、微生物成長のための溶存基質および溶存代謝産物を含み、水の供給源は限定されず、特に、プロセス水、例えば、バックセットおよび／またはシンスティレージ(thin stillage)、スクラバー水、蒸発かん凝縮液または蒸留物、蒸留からのサイドストリッパー水、または他の発酵植物製品のプロセス水などのプロセス水が含まれる。固相は、個々の細胞、ペレット、微生物成長のための不溶性基質および沈殿した代謝産物を含む。
微生物成長の文脈において、用語「基質」とは、酵素の作用によって別の化合物に変換される、または変換されることを意味する物質または化合物を意味する。用語「基質」とは、バイオマス由来の炭水化物のような出発物質として使用するのに適した炭素源を提供する化合物だけでなく、微生物に関連する代謝経路において使用される中間代謝産物も包含することを意図している。発酵培地は、典型的には、基質として、糖などの1つ以上の発酵性炭水化物を含み得る。
本発明の発酵プロセスで使用される発酵基質および他の原料を含む発酵培地は、発酵プロセスの前に、または発酵プロセスと同時に、粉砕、液状化、糖化などにより処理され得る。従って、発酵培地は、発酵微生物を添加する前の培地、例えば、液状化および／または糖化における培地、または液状化および／または糖化から生じる培地、ならびに発酵微生物を含む培地、例えば、糖化発酵同時(SSF)または一工程発酵プロセスにおいて使用される培地を意味することができる。完全を期すために、抗菌剤が接種微生物の前に発酵培地に添加される上述の実施態様では、液化および／または糖化の間に前記薬剤が添加されることも含まれる。
本明細書で使用される「接種材料」とは、発酵容器に添加されることが意図されているが、微生物群落の最終組成を限定しない複合微生物群落の元となる供給源を意味し、最終組成は発酵容器の運転条件および生産性によって決定される。接種材料は一般に、適当な増殖タンクで所望の微生物を増殖させることによって形成されるが、このタンクは発酵容器よりもはるかに小さい。
接種材料は、典型的には、自然選択によって、またはバイオテクノロジー的手段によって、目的の発酵産物を生成するように適合された微生物の1つ以上の生産株の培養物を含む。例示的ではあるが非限定的な接種材料は、Kang et al. Isopentenyl diphosphate (IPP)-bypass mevalonate pathways for isopentenol production Metabolic Engineering Vol. 34: 25-25 (2016)に記載されているエシェリキア・コリ(Escherichia coli)の培養物を含む。
イソプレノールの発酵生成については、さらに有益な文献が知られている。例えば、US 20080092829 (Renninger et al.)には、生物工学によって作られた微生物を含む微生物からのイソプレノールの生成が記載されている：開示されている生合成経路の一つは、メバロン酸(MVA)経路を含み、その経路では、メバロン酸が生成され、ジホスホリル化され、次いで脱炭酸-脱水されてイソプレニル-ピロリン酸になり、最後に2回脱リン酸化されてイソプレノールになる。E.coli株から2-メチル-D-エリスリトール-4-ホスファターゼ(MEP)経路を介してイソプレノールを形成することも知られている。さらに、EP 2 516 656 A(Global Bioenergies et al.)は、イソプレノールを製造する方法であって、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33)活性を有する酵素を含む酵素経路でメバロン酸をイソプレノールに変換させる工程を含むことを特徴とする方法を開示している。
この発酵の実施態様は、炭水化物源からイソプレノール（isprenol）を得る発酵プロセスを、本開示の全細胞生体内変換によって実施され得る工程a)～c)にカップリングさせることを可能にする点で重要である。より詳細には、本明細書に以下に記載されるように、微生物の特異的生産菌株(production strain)、例えば、限定されないが、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)など、を使用して、炭水化物源から出発して4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を得ることができる。ただし、前記生産菌株が、工程b)の細胞(CB)および工程c)の細胞(CC)が特徴付けられる酵素活性を示すことを条件とする。
工程A)
本開示の工程a)は、アセチル化を介した、イソプレノールのC1-ヒドロキシル基のO-保護を提供する：
工程a)のアセチル化反応は単に、有効なアセチル化条件下で、イソプレノールをアセチル化試薬で処理することを含み得る。適当なアセチル化試薬の非限定的な例としては、酢酸、無水酢酸および塩化アセチルが挙げられる：前記試薬の1つ以上の使用は排除されない。さらに、アセチル化条件は、20℃～150℃、例えば20℃～100℃の温度を含み得る。触媒の使用は有益であり、本開示を限定する意図はないが、この点に関して、過塩素酸；過塩素酸マグネシウム；過塩素酸銅；硫酸；塩酸；臭化水素酸；トリクロロ酢酸；塩化銅；硫酸銅；塩化亜鉛；酢酸亜鉛；硫酸亜鉛；過ヨウ素酸メタカリウム；ジメチルスルフェート；およびジメチルスルフェートを挙げることができる。
上記はさておき、本開示の工程a)が、インビトロまたは全細胞生体内変換のいずれかを介して実施される酵素プロセスによって構成されることを排除するものではない。後者の点に関して、US20100180491A1(Taek-Soon Leeら)には、イソプレニルアセテートが生成するような条件下で、イソプレノールと特に酢酸とのエステル化を触媒することができる酵素、例えば、アルコールアセチルトランスフェラーゼ(AAT)、ワックスエステルシンターゼ/ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(WS/DGAT)またはリパーゼを発現する遺伝組換え宿主細胞を培養することが記載されている。さらに、Zada et al. Metabolic engineering of エシェリキア(Escherichia) coli for production of mixed isoprenoid alcohols and their derivatives, Biotechnology for Biofuels, Volume 11: 210 (2018)には、イソプレノールのC1-ヒドロキシ基のアセチル化についても記載されており、ここでは、アセチルトランスフェラーゼ、特にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)の酵素的触媒作用下で、アセチル補酵素A(Acetyl-CoA)がアセチル化試薬として作用する。
アセチル化の化学的または生化学的様式に関係なく、上記の反応の進行は、1H NMR、フーリエ変換赤外スペクトロスコピー、超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)、ガスクロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィー(TLC)を挙げることができる公知の技術によってモニターすることができる。化学的アセチル化プロセスの適切な変換時点で、水性塩基、例えば炭酸水素ナトリウムまたは炭酸カリウムを添加することで反応をクエンチし得る。
反応生成物(II)は単離され得て、工程b)において粗製形態で使用され得る。あるいは、イソプレニルアセテート(II)は、溶媒抽出、濾過、蒸発およびクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない当業者に公知の方法を用いて精製され得る。
工程B)
本開示のこの工程は、全細胞生体内変換による4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の形成を提供する。これは以下の反応スキームに描かれている：
この工程の利用される細胞(CB)は、アルカンモノオキシゲナーゼの遺伝子を、場合によりAlkオペロンの一部として有する。一実施態様において、利用される細胞(CB)は、アルカンモノオキシゲナーゼ遺伝子を、場合によりAlkオペロンの一部として、特に遺伝子産物AlkB、AlkHおよびAlkJを含有するAlkオペロンの一部として保有する野生型細胞または非組換えの実験室細胞であり得る。シュードモナス・プチダが挙げられ、その野生型遺伝子型は2つのAlkオペロンを含み、第一のオペロンは遺伝子産物AlkB、AlkF、AlkG、AlkH、AlkJ、AlkKおよびAlkLをコードし、第二のオペロンはAlkSおよびAlkTをコードし、ここで、AlkSは第一のalkオペロンの発現を調節する機能を有する。
あるいは、利用される細胞(CB)は、野生型と比較してイソプレニルアセテート(II)から出発してより多くの4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)を生成することができるように、その野生型に対して遺伝子の組換えがなされているものであり得る。この比較は、以下の両方を包含することを意図している:i)野生型の遺伝子の組換えがなされた細胞が検出可能な量の4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを生成する場合；および、ii)野生型の遺伝子の組換えがなされた細胞が検出可能な量の4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを形成することができない場合。従って、前記第二のカテゴリーの細胞ii)に関しては、検出可能な量の4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールが形成されるのは、野生型に対して遺伝子の組換えを行って工程b)で使用される細胞を作成した場合のみである。
利用される細胞(CB)は、24時間の規定された時間間隔において、野生型細胞よりも少なくとも10倍、例えば少なくとも100倍または少なくとも1000倍多い4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)を形成するように遺伝子の組換えがなされていることが好ましい。生成物形成の増加は、本開示の工程b)に従って使用される細胞と野生型細胞とを、同じ初期細胞密度、栄養培地および培養条件下で、指定された時間間隔にわたって別々に培養し、次いで各栄養培地中の標的生成物の量を測定することによって決定することができる。
本開示の工程b)で使用される細胞(CB)は、原核生物または真核生物であり得る。それらは、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞、植物細胞、または微生物、例えば真菌、カビもしくは細菌であり得て、好ましい微生物は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)に寄託された微生物である。酵母は、この文脈において重要な微生物(真菌)であり得るが、細菌を用いることが好ましく、したがって、http://www.dsmz.de/species/bacteria.htmを参考にすることができる。
本発明における野生型シュードモナス・プチダ使用の可能性は、上述した通りである。本発明を限定する意図はないが、遺伝子の組換えがなされ、本開示の工程b)において使用され得る好ましい細胞(CB)は、以下の遺伝子から選択され得る：コリネバクテリウム(Corynebacterium)；ブレビバクテリウム(Brevibacterium)；バチルス(Bacillus)；ラクトバチルス(Lactobacillus)；ラクトコッカス(Lactococcus)；カンジダ(Candida)；ピキア(Pichia)；クルイベロミセス(Kluveromyces)；サッカロミセス(Saccharomyces)；エシェリキア(Escherichia)；ザイモモナス(Zymomonas)；ヤロウイア(Yarrowia)；メチロバクテリウム(Methylobacterium)；ラルストニア(Ralstonia)；シュードモナス(Pseudomonas)；バークホルデリア(Burkholderia)；およびクロストリジウム(Clostridium)。特に好ましいのは、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)およびシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)からなる群から選択される細胞(CB)の使用である。エシェリキア・コリ(Escherichia coli)BL21株で良好な結果が得られている。
野生型と比較して、工程b)による遺伝子組換え細胞(CB)は、イソプレニルアセテートのC4-ヒドロキシル化を触媒するアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の少なくとも1つの活性の増加を示さなければならない：イソプレニルアセテート(II)の直接的なC4-ヒドロキシル化は、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)につながる。
酵素アルカンモノオキシゲナーゼは、シュードモナス・プチダGP01由来のAlkB遺伝子、その変異体およびホモログによってコードされ得る。例えば、酵素アルカンモノオキシゲナーゼは、AIkBGT遺伝子クラスター；AlkBGTJH遺伝子クラスター；およびAlkBGTJHL遺伝子クラスターからなる群から選択される、シュードモナス・プチダGP01由来のAlkB遺伝子によってコードされ得る。それぞれの遺伝子配列の単離は、例えば、van Beilen et al., "Functional Analysis of Alkane Hydroxylases from Gram-Negative and Gram-Positive Bacteria", Journal of Bacteriology, Vol. 184 (6), pages 1733-1742 (2002)に記載されている。さらに、AlkB、AlkF、AlkGおよびAlkTをコードするDNA配列情報は、GenBank AJ 245436.1として同定されたシュードモナス・プチダOCTプラスミドalk遺伝子クラスターから得られ；そして、AlkBGTがクローニングされたpCom10ベクターのプラスミド配列は、GenBank AJ 302087.1に見出すことができる。
変異体は、イソプレニルアセテートに対するAlkBの活性を改善するために提供され、予測モデルに基づく合理的な設計によって決定され得ると考えられる。例えば、AlkBの構造は、European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)から入手可能なAlphaFold2予測ソフトウェアによって予測することができ；位置は、イソプレニルアセテートを配位子として用いたドッキング研究に基づいて変異から選択される。それぞれ選択される位置の単一変異体は、pBT10構築物の部位特異的突然変異誘発によって作製され得る。例示的な変異体には以下が含まれるが、これらに限定されない：AlkB(I233V)、Kochら[8]に開示された変異体；およびAlkB(F164L)、野生型AlkBのアミノ酸フェニルアラニン(Phe)をロイシン(Leu)に交換する、イソプレニルアセテートをリガンドとして用いたドッキング研究から同定された単一変異体。
同定された配列に対して少なくとも40％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも75％の同一性を有する核酸配列によってコードされる酵素は、本発明の方法における使用に適している。完全性のために、AlkB遺伝子のさらなる例示的なホモログには、以下が含まれるが、これらに限定されない：シュードモナス・プチダP1から得られるAlkB-P1；マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)から得られるAlk1-MO；およびアルカニボラックス・ボークメンシス(Alcanivorax borkumensis)から得られるAlkB1。
遺伝子組換え細胞(CB)において前述の酵素の細胞内活性の増加を達成するために、以下の手段の1つ以上を採用することができる：酵素をコードする遺伝子配列のコピー数の増加；遺伝子への強力なプロモーターの使用；より強力なリボソーム結合部位の使用；コドン最適化の使用；および、例えば、Koch et al., “In Vivo Evolution of Butane Oxidation by Terminal Alkane Hydroxylases AlkB and CYP153A6”, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 75 (2), pages 337-344 (2009)に記載の、活性が増加した対応する酵素をコードする遺伝子または対立遺伝子の利用。
本発明による方法で使用される遺伝子組換え細胞は、所望の遺伝子、この遺伝子の対立遺伝子またはその一部、および遺伝子の発現を可能にするベクターを含む発現ベクターによる形質転換、形質導入、および／またはコンジュゲーションによって作成される。異種発現は、細胞の染色体または染色体外複製ベクターに遺伝子またはその対立遺伝子を組み込むことによって達成される。本開示を限定する意図はないが、WO2009/077461(Evonik Degussa GmbH)は、細胞の遺伝子形質転換に関する有益な文献を提供している。
4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールの製造において、以下のサブ工程が特定され得る：
b) i)先に定義した細胞(CB)を、該細胞がイソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを形成することを可能にする条件下で、イソプレニルアセテートを含有する培養培地、またはイソプレニルアセテートを含有する有機相に接している培養培地のいずれかと接触させること；および
場合により、b)ii)得られた4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを単離すること。
細胞(CB)は、バイオリアクター内で前記培養培地と接触させることができ、したがって、バッチプロセス、フィードバッチプロセスまたは反復フィードバッチプロセスにおいて、連続的または非連続的に培養することができる。
従来のバッチ式バイオリアクターシステムは、培地の組成がそれぞれのバイオプロダクション事象の開始時に確立され、実質的にバイオプロダクション事象の終了時に終了する期間中に人為的な変更や添加を受けない「閉鎖型」とみなされることが多い。このような状況では、バイオプロダクション事象の開始時に、培地は所望の微生物(単数または複数)で接種され、バイオプロダクションはシステムに何も加えることなく起こることが許容される。しかし、本開示において、「バッチ」タイプのバイオプロダクション事象は、それぞれのバイオプロダクション事象の開始時に培地の基質含有量が確立されているが、pHや酸素濃度などの因子の制御が試みられているシステムを包含する。
標準的なバッチシステムの変種として、フェドバッチシステムがある。フェドバッチ・バイオプロダクションプロセスは、基質を含む栄養素が、バイオプロダクションの進行に伴って少しずつ添加されるという例外を除いた典型的なバッチシステムを含む。フェドバッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害しがちで、培地中の基質量を制限することが望ましい場合に有用である。フェドバッチシステムにおける実際の栄養素濃度の測定は、例えばサンプリングによって直接行われてもよく、pH、溶存酸素、CO2などの廃ガス分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定されてもよい。
連続的バイオプロダクションは、限定バイオプロダクション培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に同量の調整培地がさらなる処理のために除去される「オープン」システムと考えられている。連続的バイオプロダクションは、ケモスタット培養システムであれ灌流培養システムであれ、一般に培養を制御された密度範囲内に維持し、細胞は主に対数期成長にある。連続的バイオプロダクションは、排水、洗浄、次のバイオプロダクション事象のための装置の準備に関連するダウンタイムを制限することができる。さらに、蒸留のような下流の単位操作を連続的に行う方が、バッチモードで行うよりも経済的な傾向がある。また、連続的バイオプロダクションでは、細胞成長や最終生成物濃度に影響する1つまたは複数の因子の調節が可能である。
バイオプロダクションシステムを、バイオリアクター内で、化学生成物(III)を得るためのイソプレニルアセテート(II)基質分子の所望の変換(C4-ヒドロキシル化)を得るのに十分な時間、適切な温度範囲内および制御された溶存酸素濃度範囲内に維持する。この工程に適した温度範囲として、20℃～50℃、例えば20℃～40℃を挙げることができる。この工程で使用されるバイオリアクターでは、嫌気条件を維持し得て、酸素または空気などの酸素含有ガスの添加によって好気的条件を維持するのが一般的である。栄養培地を含む液体培養物の溶存酸素レベルをモニターすることで、所望の好気的、微好気的または嫌気的条件を維持または確認してもよい。
この工程で使用される培養培地は、所望の最終生成物(III)を生成するために使用される微生物の要求に適したものでなければならないことは、当業者には明らかであろう。培養培地を形成するために、少なくとも1つの増殖因子またはその前駆体；少なくとも1つの窒素源；少なくとも1つのリン源；および、マンガン、ホウ素、コバルト、銅、モリブデン、亜鉛、カルシウム、マグネシウム、鉄、ニッケルおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つの微量金属源が適切に組み合わされ得る。適当な増殖因子としては、アミノ酸およびビタミン、例えばビオチン、ビタミンB12、ビタミンB12の誘導体、チアミンおよびパントテン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、モルト抽出物、コーンスティープリカー(corn-steep liquor)、大豆粉、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。リン源としては、リン酸、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウムまたはリン酸水素二カリウムが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、培地は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、アンモニア水などの無機酸および塩基を含むpH調整剤；消泡剤；およびプラスミド安定性を維持するための抗生物質などのアジュバントを含み得る。
培地は限定培地であってもよい。また、工程b)は、最少培地または添加最少培地を用いて実施され得る。さらに、商業的に調製された培地の使用を排除するものではなく、特に以下のものを挙げることができる：ルリアベルタニ(LB)ブロス；M9最少培地；サブローデキストロース(SD)ブロス；酵母培地(YM)ブロス、および酵母合成最少培地(Ymin)。
前述の場合による工程b)ii)において、得られた4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールをバイオリアクターから単離してもよい。本発明は、工程b)およびc)の両方とも全細胞生体内変換により行われ、各工程で利用される細胞(以下のCB、CC)が同じである実施形態を包含するので、このサブ工程は場合によるものであるとみなされる。その実施態様はさておき、利用される細胞(CB)に応じて、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールの単離は、宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合には培養培地から、またはそれがそれほど分泌されない場合には、それを産生する宿主細胞から直接のいずれかであり得る。単離された化合物(III)は、場合により、溶媒抽出、濾過、蒸発、蒸留、結晶化およびクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の方法を用いて精製してもよい。
工程C)
本開示のこの工程では、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(V)への酸化を提供する。この酸化は、以下の反応スキームに示されるように、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタナール(IV)が中間生成物として形成される2段階方法(i)、ii))と見なすことができる。
本方法の工程c)は、2つの主要な実施態様に分けられ得る：第一の実施態様において、2つの酸化段階(c)i)、c)ii))は、中間単離および場合による2-アセトキシ-2-メチレン-ブタナール(IV)の精製を伴う別個のものであり；そして第二の実施態様において、2つの酸化段階は、2-アセトキシ-2-メチレン-ブタナール(IV)のこの中間単離を伴わず、したがって「ワンポット」合成として行われる。しかしながら、第二の実施態様の性能は、各酸化段階を順次駆動するために反応条件を経時的に変更することを除外するものではない。
この反応順序は、酸化試薬の使用による化学酸化、生体触媒による酸化、または工程b)およびc)の両方を触媒する全細胞生体触媒内または工程b)とは別に工程c)を触媒する分離した全細胞生体触媒内でのいずれかの全細胞生体内変換によって実現され得ると考えられる。本明細書では、生体触媒による酸化または全細胞生体内変換のいずれかを使用することが好ましい。従来の化学的酸化法は、少なくとも等モル量の酸化試薬の使用を必要とすることが多く、その原子効率は比較的低い。さらに、化学的経路の実用化は、過酸化、選択性の低さ、有機溶媒の使用によって制限されることが多い。逆に、生体触媒による酸化および全細胞生体内変換は、優れた選択性と温和な反応条件を特徴とする。
工程c)化学的酸化
工程c)が2つの異なる反応段階で化学的に実施される場合、その第一段階(c)i))は、第一級アルコール(III)の対応するアルデヒド(IV)への酸化である。この段階で有用性を見出すことができる酸化剤を限定する意図は特にない。例示的な試薬としては、銅、コバルトおよびクロムの酸化物；銅、銀およびそれらの混合物；白金；二酸化白金；硝酸セリウムアンモニウム；臭素酸ナトリウム；四酢酸鉛；六価クロム；重クロム酸ナトリウムまたは重クロム酸カリウム；重クロム酸ピリジニウム；クロム酸；コリンズ試薬；クロロクロム酸ピリジニウム； 塩化クロミル；ジ-tert-ブチルクロメート；二酸化マンガン；テトラクロロ-o-ベンゾキノン；テトラクロロ-p-ベンゾキノン；2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-p-ベンゾキノン；ジメチルスルフィドおよび塩素；超原子価ヨウ素化合物；N-クロロスクシンイミド(NCS)；tert-ブチルヒドロペルオキシド(TBHP)；およびジメチルスルホキシド(DMSO)。米国特許第5,132,465 A号は、この点に関して有益な背景文献を提供している。
第二段階(c)ii))では、アルデヒド(IV)の対応するカルボン酸(V)への酸化を必要とする。この工程に適した酸化剤としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：Jones試薬；過マンガン酸カリウム；酸化銀；および硝酸。このような酸化剤は、硫酸のような触媒とともに使用され、さらに、溶媒として水、またはアセトン、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノールのような水混和性溶媒のいずれかを使用することが好ましい。酸化反応(段階c)ii))は、慣例的に20℃～50℃の温度で0.5時間～5時間行われる。
当業者に認識されるように、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(IV)への直接または「ワンポット」酸化は、特定の状況下で実施することができる：典型的には、化学量論的過剰の酸化剤が必要であり、中間生成物として形成されたアルデヒド(IV)は、反応混合物中に保持されなければならない。水性培地中で、クロム酸(H2CrO4)；Na2CrO4；K2CrO4；K2Cr2O7；K2Cr2O7；過マンガン酸塩；およびJones試薬から選択される酸化剤を化学量論的過剰で使用した場合、4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(V)が主要生成物となる。完全のために、前記Jones試薬の化学量論的過剰とは、4-アセトキシ-2-メチレンブタン-1-オール(III)に対するそのクロム酸の化学量論的過剰を意味する。4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)を、2-アセトキシ-2-メチレン-ブタナール(IV)を中間単離することなく、4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(V)に酸化するのに適していると思われる代替的な方法が、特に、WO99/52849；WO2006/001387；およびUS2009/0124806A1に開示されている。
工程c)の反応の進行は、1H NMR、フーリエ変換赤外スペクトロスコピー、超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)、ガスクロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィー(TLC)などの公知の技術によってモニターすることができる。
工程c)の4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(V)生成物は、反応器から単離することができる。後続の合成工程で使用する前に、単離された4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(V)は、場合により、溶媒抽出、濾過、蒸発、蒸留、結晶化およびクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の方法を使用して精製してもよい。
工程c)酵素的酸化
生体触媒による酸化に関しては、酵素的酸化または遺伝子組換え細胞に基づく全細胞生体内変換のいずれかを優先的に使用することを提案するのは賢明ではない。確かに、単離された酵素と比較すると、全細胞触媒の使用は、手順を簡素化し、コストを削減し、酵素の安定性を改善する。しかし、特定の状況では、酵素の活性型は全細胞生体内変換への利用を妨げる。
本開示は、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)を、好気的条件下で、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素と、場合により、酵素の酸化活性を増強する少なくとも1つの媒介化合物と接触させることを含む、酵素的酸化プロセスを特徴とする工程c)を提供する。反応混合物は、好ましくは、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)1kgあたり前記少なくとも1つの酵素を0.001～10mg含むべきである。
前記酸化活性を示す少なくとも1つの酵素は、通常、アルコールおよびアルデヒド酸化酵素から選択される:広い基質スペクトルを有するこのような酵素は、文献に記載されており、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、例えばエシェリキア・コリ(Escherichia coli)EcAdhZ3-LND；アルコールオキシダーゼ(AlcOx)、例えばアスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)LCAO_Af；アルデヒドデヒドロゲナーゼ(AlDH)；およびラッカーゼについて言及することができる。
本発明を限定する意図はないが、有用なアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)酵素はAlkJ遺伝子のホモログによってコードされるものであり得て、有用なアルデヒドデヒドロゲナーゼ(AlDH)酵素はシュードモナス・プチダGP01由来のAlkH遺伝子によってコードされるものであり得る。AlkJアルコールデヒドロゲナーゼおよびAlkHデヒドロゲナーゼのDNA配列情報は、GenBank AJ 245436.1として同定されたシュードモナス・プチダOCTプラスミドalk遺伝子クラスターから得ることができる。そして、記録された配列に対して少なくとも40％、好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％の同一性を有する核酸によってコードされる酵素は、本発明の方法における使用に適している。
当業者に認識されるように、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)酵素の作動可能な活性は、ヒドリド受容体としての酸化補因子、特に酸化ニコチンアミド補因子の存在下でのみ達成される可能性がある。同様に、アルコールオキシダーゼ(AlcOx)は、還元当量を分子状酸素に転移し、化学量論的副生成物としてH2O2を生成することによって機能し、フラビン依存性またはCu2+依存性であり得る。さらに、ADHおよびAlcOxは、アルデヒドのプロトンがヒドリドとして引抜かれないため、一般にアルデヒドを酸化させることができないことが知られている。このメカニズム上の制限は、カルボニル基を一時的に攻撃して、それをヒドリドにより(hydridically)引抜かれるプロトンを含むアルコールに変える求核補因子を与えることによって解決することができる。アルデヒドデヒドロゲナーゼ(AlDH)は、酵素活性部位のシステイン部分を介してこのアプローチを利用する。
上記の考察に基づき、酵素の酸化活性を増強する少なくとも1つの媒介化合物が反応混合物中に存在することが慣用的であろう。前記少なくとも一つの媒介化合物は反応混合物中に、好ましくは、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール1kgあたり0.001～10mg/kgの量で存在すべきである。
一般に、このような媒介化合物は、酸化される化合物に選択的に結合する。酸化される化合物(B)に対する媒介化合物(A)の結合の程度は、以下の結合反応から得られる化学平衡定数(Kd)によって定量することができる：
化学平衡定数(Kd)は次式で与えられる：
本明細書では、媒介化合物が、酸化される化合物に対する化学平衡定数(Kd)が1x10-4未満、好ましくは1x10-6未満であることが好ましい。
本発明を限定する意図はないが、媒介化合物の適当なクラスとしては、酸化ニコチンアミド補因子；抗体およびその結合特性を保持する断片；ペプチド；ならびに、ペプチドが非天然アミノ酸および／またはアミノ酸間の非天然化学結合の取り込みによって修飾されたペプチドミミックが挙げられる。さらに、ラッカーゼを含むシステムは、ラッカーゼ媒介物システム(LMS)の公知の化合物を含むことができ、その化合物について、HBT(1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)；ABTS[2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)]；NHA(N-ヒドロキシアセトアニリド)；NEIAA(N-アセチル-N-フェニルヒドロキシルアミン)；HBTO(3-ヒドロキシl,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン)；シリングアルダジン；およびVIO(ビオルル酸)を言及することができる。また、媒介化合物に関する有益な開示には、以下のものがある：WO 94/04678 A(Castermanら)；WO-94/25591 A(Unilever PLC et al.)；およびWO 94/29457 A(Unilever PLC)が挙げられる。
上述のように、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)を好気的条件下で酵素および媒介物と接触させる。最も経済的な酸素源は空気であり、空気は大気中からコストをかけずに容易に得られ、無毒であり、反応後に除去する必要がないという利点がある。あるいは、分子状酸素それ自体を使用してもよく、またはカタラーゼ酵素および過酸化水素の混合物のような分子状酸素遊離システムを使用してもよい。
例示的な実施において、導入された空気または酸素、またはその場で発生した酸素を、実質的に全ての4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)が4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(V)に変換するのに十分な時間、攪拌しながら反応混合物に混合する。典型的な反応期間は、24時間未満、例えば1～5時間である。
反応混合物は、そのpHが、酵素が活性であるための適切な範囲内にとどまることを確実にするために、緩衝溶液をさらに含むことができる。例えば、ほとんどのラッカーゼは酸性pH範囲で至適pHを示すが、pH 7以上では低活性または不活性を示す。そうは言っても、反応混合物のpHは一般に5～9の範囲、例えば5.5～8.5の範囲に保持される。このような範囲に使用される緩衝液を限定する意図はないが、イミダゾール；1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸(PIPES)；4-モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)；4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタン-スルホン酸(HEPES)；トリエタノールアミン；トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)；アルカリ金属リン酸塩；クエン酸；およびクエン酸三ナトリウムについて言及することができる。反応混合物を、反応が実質的に完了まで進行することを可能にする温度に維持する。酵素は、0℃～80℃の範囲の温度で活性であり得るが、10℃～50℃の範囲の温度を使用することがより一般的であろう。15℃～35℃の範囲の温度の使用は、反応混合物を室温から実質的に加熱または冷却する必要性をなくすので有利である。
工程c)の反応の進行は、1H NMR、フーリエ変換赤外スペクトロスコピー、超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)、ガスクロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィー(TLC)
を挙げることができる公知の技術によってモニターすることができる。
工程c)の4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(V)生成物は、反応器から単離することができる。単離された化合物(V)は、必要に応じて、溶媒抽出、濾過、蒸発、蒸留、結晶化およびクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の方法を用いて精製してもよい。
工程c)全細胞生体内変換
全細胞生体内変換によるこの工程の実施については、2つの選択肢が考えられる。4-アセトキシ-2-メチレン-酪酸を生成するための第一の実施態様においては、以下のサブ工程が実施される：
c) i)細胞(CC)を、該細胞が4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)から4-アセトキシ-2-メチレン-酪酸(V)を形成することを可能にする条件下で、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)を含有する培地、または4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを含有する有機相に接している培地のいずれかと接触させること；場合により
c) ii)得られた4-アセトキシ-2-メチレン-酪酸(V)を単離すること、
ここで、前記細胞(CC)は、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素の活性を示す。
この実施態様に関する予備的な点として、前記工程b)の細胞(CB)と工程c)の細胞(CC)とが同一であることを排除するものではなく、単一の細胞が前記両工程の関連する酵素活性を有していてもよい。それはさておき、工程c) i)の利用される細胞(CC)は、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素をコードする遺伝子を有する野生型細胞または非組換えの実験用細胞であってもよく、この点に関して、細胞は、Alkオペロン、特に、遺伝子産物AlkB、AlkHおよびAlkJを含有するAlkオペロンを場合により有していてもよい。この文脈でシュードモナス・プチダについて再び言及することができる。あるいは、本実施態様の利用される細胞(CC)は、野生型と比較して、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールから出発してより多くの4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を生成することができるように、その野生型に対して遺伝子の組換えを行ってもよい。この比較は、以下の両方を包含することを意図している:α)野生型の遺伝子の組換えがなされた細胞が検出可能な量の4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を産生する場合；およびβ)野生型の遺伝子の組換えがなされた細胞が検出可能な量の4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を生成することができない場合。従って、前記第二のカテゴリーの細胞β)に関しては、検出可能な量の4-アセトキシ-2-メチレン酪酸が形成されるのは、野生型に対して遺伝子の組換えを行って工程c)で使用される細胞を作成した場合のみである。
4-アセトキシ-2-メチレン-酪酸を生成するための工程c)の第二の実施態様において、以下のサブ工程が実施される：
c) i)細胞(CC1)を、該細胞が4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アール(IV)を形成することを可能にする条件下で、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)を含有する培養培地、または4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを含有する有機相に接している培養培地と接触させること；
c) ii)場合により得られた4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アール(IV)を単離すること；
c) iii)細胞(CC2)を、該細胞が4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールから4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(V)を形成することを可能にする条件下で、前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アール(IV)を含有する培養培地、または4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アール(IV)を含有する有機相に接している培養培地と接触させること；および
c) iv)得られた4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(V)を単離こと、
ここで、前記細胞(CC1、CC2)はそれぞれ、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素の活性の増加を示す。
上記のように、工程c) ii)を実施する必要はない。細胞(CC1)が培養培地中に4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アール(IV)を分泌する場合、細胞(CC2)は同じバイオリアクター内に配置されてもよく、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールの中間分離を行う必要はない。いずれかの細胞(CC2)が別個の下流バイオリアクター内に配置される場合、または4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールを産生する宿主細胞(CC1)がそれを分泌しない場合、工程c)ii)を行って、そのアルデヒドを単離してもよい。
この実施態様に関する予備的な点として、前記工程b)の細胞(CB)と工程c) i)の細胞(CC1)とが同一であることを排除するものではなく、単一の細胞が前記両工程の関連する酵素活性を有していてもよい。それはさておき、利用される細胞(工程c) i)は、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素をコードする遺伝子を有する野生型細胞または非組換えの実験用細胞であってもよく、この点に関して、細胞(CC1)は、場合によりAlkオペロン、特に遺伝子産物AlkHおよびAlkJを含有するAlkオペロンを有していてもよい。この文脈でシュードモナス・プチダについて再び言及することができる。あるいは、利用される細胞(CC1)は、野生型と比較して、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールから出発してより多くの4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールを生成することができるように、その野生型に対して遺伝子の組換えを行ってもよい。
利用される細胞(CC2)は、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素をコードする遺伝子を有する野生型細胞または非組換えの実験用細胞であってもよく、この点に関して、細胞(CC2)は、Alkオペロン、特に、遺伝子産物AlkHおよびAlkJを含有するAlkオペロンを場合により有してもよい。あるいは、利用される細胞(CC2)は、野生型と比較して、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールから出発してより多くの4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を生成することができるように、その野生型に対して遺伝子の組換えを行ってもよい。
上述したように、組換え細胞と野生型細胞との間のいかなる比較も、以下の両方を包含することを意図している:α)野生型の遺伝子の組換えがなされた細胞が検出可能な量の標的生成物を産生する場合；およびβ)野生型の遺伝子の組換えがなされた細胞が検出可能な量の標的産物を形成することができない場合。したがって、前記第二のカテゴリーの細胞β)に関しては、検出可能な量の標的生成物が形成されるのは、野生型に対して遺伝子の組換えを行って工程c) i)およびc) iii)で使用される細胞を作成した場合のみである。
各遺伝子組換え細胞(CC、CC1、CC2)は、24時間の規定された時間間隔において、それが野生型細胞よりも少なくとも10倍、例えば少なくとも100倍または少なくとも1000倍多くの標的産物を形成するように遺伝子の組換えがなされていることが好ましい。生成物形成の増加は、本開示の工程c)に従って使用される細胞および野生型細胞を、同一の初期細胞密度、栄養培地および培養条件下で特定の時間間隔で別々に培養し、次いで各栄養培地中の標的生成物の量を測定することによって測定することができる。
本開示の工程c)で使用される細胞(CC、CC1、CC2)は、独立して、原核生物または真核生物であり得る。これらは、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)、植物細胞または微生物、例えば真菌、カビまたは細菌であり得て、好ましい微生物は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)に寄託されているものである。酵母はこの文脈において重要な微生物(真菌)であり得るが、細菌を用いることが好ましく、したがって、http://www.dsmz.de/species/bacteria.htmを参考にすることができる。
本発明を限定する意図はないが、遺伝子の組換えがなされて、本開示の工程c)で使用され得る細胞(CC、CC1、CC2)は、好ましくは、遺伝子：コリネバクテリウム(Corynebacterium)；ブレビバクテリウム(Brevibacterium)；バチルス(Bacillus)；ラクトバチルス(Lactobacillus)；ラクトコッカス(Lactococcus)；カンジダ(Candida)；ピキア(Pichia)；クルイベロミセス(Kluveromyces)；サッカロミセス(Saccharomyces)；エシェリキア(Escherichia)；ザイモモナス(Zymomonas)；ヤロウイア(Yarrowia)；メチロバクテリウム(Methylobacterium)；ラルストニア(Ralstonia)；シュードモナス(Pseudomonas)；バークホルデリア(Burkholderia)；およびクロストリジウム(Clostridium)から独立して選択される。エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)およびシュードモナス・プチダからなる群から独立して選択される細胞(CC、CC1、CC2)の使用について、特定の選好が言及され得る。E. coli BL21株で良好な結果が得られている。
その野生型と比較して、工程c)による遺伝子組換え細胞(CC)は、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)酵素；アルコールオキシダーゼ(AlcOx)酵素；アルデヒドデヒドロゲナーゼ(AlDH)酵素；およびラッカーゼの少なくとも1つの活性の増加を示さなければならない。野生型と比較して、遺伝子組換え細胞(CC1)は、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)酵素；アルコールオキシダーゼ(AlcOx)酵素；およびラッカーゼの少なくとも1つの活性の増加を示さなければならない。また、野生型と比較して、遺伝子組換え細胞(CC2)は、アルデヒド脱水素酵素(AlDH)酵素およびラッカーゼの少なくとも1つの活性の増加を示さなければならない。
本発明を限定する意図はないが、酵素アルコールデヒドロゲナーゼはAlkJ遺伝子のホモログによってコードされるものであり得て、アルデヒドデヒドロゲナーゼはシュードモナス・プチダGP01由来のAlkH遺伝子によってコードされるものであり得る。AlkJアルコールデヒドロゲナーゼおよびAlkHデヒドロゲナーゼのDNA配列情報は、GenBank AJ 245436.1として同定されたシュードモナス・プチダOCTプラスミドalk遺伝子クラスターから得ることができる。そして、列挙された配列に対して少なくとも40％、例えば少なくとも75％、好ましくは少なくとも90％の同一性を有する核酸によってコードされる酵素は、本発明の方法における使用に適している。
遺伝子組換え細胞(CC、CC1、CC2)における前述の酵素の細胞内活性の増加を達成するために、以下の手段のうちの1つ以上を使用することができる：酵素をコードする遺伝子配列のコピー数の増加；遺伝子の強力なプロモーターの使用；より強いリボソーム結合部位の使用；コドン最適化の使用；および、活性が増加した対応する酵素をコードする遺伝子または対立遺伝子の利用。
該当する場合、遺伝子組換え細胞(CC、CC1、CC2)は、所望の遺伝子、この遺伝子の対立遺伝子またはその一部、および遺伝子の発現を可能にするベクターを含むベクターで形質変換転化、形質導入および／またはコンジュゲーションすることによって作成される。異種発現は、細胞の染色体または染色体外複製ベクターにおける遺伝子またはその対立遺伝子の組み込みによって達成される。本開示を限定する意図はないが、WO2009/077461(Evonik Degussa GmbH)は、細胞遺伝的形質変換転化の有益な参考文献を提供する。
利用される細胞(CC、CC1、CC2)は、1つ以上のバイオリアクター中で前記培地と接触させることができる:上記のように、細胞CC1およびCC2は、細胞CC1による標的生成物の分泌、独立株CC1およびCC2のプロセス適合性、および／または第2の酸化工程c) iii)前の中間体アルデヒドの単離に応じて、同じまたは別個のバイオリアクター内に配置することができる。1つ以上のバイオリアクター内で、細胞(CC、CC1、CC2)は、前述のように、バッチプロセス、供給バッチプロセス、または反復供給バッチプロセスにおいて連続的または不連続的に培養される。
工程c)のこれらの実施態様において定義されるバイオリアクターまたは各バイオリアクター内で、バイオプロダクションシステムは、出発アルコールまたはアルデヒドの標的生成物への所望の変換を得るのに十分な時間、適切な温度範囲内および制御された溶存酸素濃度範囲内に維持される。20℃～50℃、例えば、20℃～40℃の温度範囲が好適であるとして挙げられる。嫌気的条件は、この工程で使用されるバイオリアクター内で維持され得るが、酸素または空気のような酸素含有ガスの添加を介して、その中で好気的条件を維持することがより典型的である。栄養培地を含む液体培養物の溶存酸素レベルをモニターすることで、所望の好気性、微好気性または嫌気性条件を維持または確認することができる。
この工程で使用される培養培地は、所望の最終生成物を生成するために使用される微生物の要求に適していなければならないことは、当業者にとって再び明らかであろう。培養培地を形成するために、少なくとも1つの増殖因子またはその前駆体；少なくとも一つの窒素源；少なくとも1つのリン源；および、マンガン、ホウ素、コバルト、銅、モリブデン、亜鉛、カルシウム、マグネシウム、鉄、ニッケルおよびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つの微量金属源が適切に組み合わされ得る。適当な増殖因子としては、アミノ酸およびビタミン、例えばビオチン、ビタミンB12、ビタミンB12の誘導体、チアミンおよびパントテン酸が挙げられるが、これらに限定されない。窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。リン源としては、リン酸、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウムまたはリン酸水素二カリウムが挙げられるが、これらに限定されない。培地は、無機酸および塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、アンモニア水を含むpH調整剤；消泡剤；プラスミドの安定性を維持するための抗生物質、などのアジュバントを含有してもよいことがさらに認識されるであろう。
培地は限定培地であり得る。また、工程b)は、最少培地または添加最少培地を用いて実施され得る。さらに、商業的に調製された培地の使用を排除するものではなく、特に以下のものを挙げることができる：ルリアベルタニ(LB)ブロス；M9最少培地；サブローデキストロース(SD)ブロス；酵母培地(YM)ブロス、および酵母合成最少培地(Ymin)。
上記の各実施態様の前述の最終サブ工程であるc) ii)またはc) iv)それぞれにおいて、得られた4-アセトキシ-2-メチレン酪酸をバイオリアクターから単離してもよい。使用される細胞に応じて、4-アセトキシ-2-メチレン酪酸の単離は、宿主細胞が培地中にそれを分泌する場合は培養培地から、分泌されない場合はそれを産生する宿主細胞から直接のいずれかである。単離された4-アセトキシ-2-メチレン酪酸は、溶媒抽出、濾過、蒸発、蒸留、結晶化およびクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の方法を用いて任意に精製してもよい。
工程D)
この工程は、4-アセトキシ-2-メチレン酪酸のα-メチレン-γ-ブチロラクトンへの変換を提供する。この工程を実施する方法を限定する意図は特にないが、2つの好ましい実施形態が言及に値する。
第一の実施態様において、この工程d)は、4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を30℃～300℃の温度、例えば30℃～150℃の温度で酸性条件にかけ、この条件下で加水分解が起こり、中間生成物としてγ-ヒドロキシ-α-メチレン酪酸を得る、ワンポット合成で実施され得る。このような酸性条件下では、γ-ヒドロキシ-α-メチレン酪酸を環化してα-メチレン-γ-ブチロラクトを得る。
工程d)のこの実施態様によれば、ルイス酸またはブレンステッド酸のいずれかが使用され得て、典型的には、前記ルイス酸または前記ブレンステッド酸の4-アセトキシ-2-メチレン酪酸に対するモル比は0.15～1:1の範囲であるべきである。適当なルイス酸としては、BF3；AlCl3；t-BuCl/Et2AlCl；Cl2/BCl3；AlBr3；AlBr3.TiCl4；ZrCl4；I2；SbCl5；WCl6；AlEt2Cl；PF5；VCl4；AlEtCl2；BF3Et2O；PCl5；PCl3；POCl3；TiCl6；FeCl3；NiCl2；およびSnCl4が挙げられるが、これらに限定されない。適当なブレンステッド酸は、有機酸でも無機酸でもよいが、pKa値が最大限でも2.5のブレンステッド酸、特にpKa値が2.5～-10のブレンステッド酸を使用することが好ましい。硫酸；リン酸；塩酸、臭化水素酸；ヨウ化水素酸；メタンスルホン酸；p-トルエンスルホン酸；ペルフルオロアルカンスルホン酸、例えばトリフルオロメタンスルホン酸(またはトリフル酸、CF3SO3H)、C2F5SO3H、C4F9SO3H、C5F11SO3H、C6F13SO3HおよびC8F17SO3H；テトラフルオロホウ酸；トリフルオロ酢酸；トリクロロ酢酸；およびシュウ酸からなる群から選択されるブレンステッド酸について言及することができる。
上記反応の進行は、1H NMR、フーリエ変換赤外スペクトロスコピー、超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)、ガスクロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィー(TLC)を挙げることができる公知の技術によってモニターすることができる。変換の適切なレベルで、反応混合物を最初に室温まで冷却することができる。次に、α-メチレン-γ-ブチロラクトンを単離し、その後のいずれかの合成工程において粗形態で使用してもよく、さらに精製してもよい。効果的な単離および精製方法には、溶媒抽出、濾過、蒸発、蒸留、結晶化およびクロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。
第二の実施態様において、α-メチレン-γ-ブチロラクトンは、α-ヒドロキシ-γ-メチレン酪酸(VI)を介する2段階方法で合成される。この2段階の反応は次の反応式で要約され得る。
アセトキシ(OAc)基のヒドロキシル基への第一段階変換は、還元的に、塩基性加水分解によって、または適当なリパーゼまたはカルボキシルエステラーゼ酵素を用いて酵素的に実行され得る。
還元的変換において、4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(V)をホウ化水素および水素化アルミニウム化合物から選択される少なくとも1つの水素化物供与体と接触させる。水素化物供与体は、例えば、水素化ホウ素カリウム(KBH4)；水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)；トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH(OAc)3)；ジボラン(B2H6)；水素化シアノホウ素ナトリウム(NaBH3CN)；水素化ホウ素亜鉛(ZnBH4)；水素化アルミニウム(AlH3)；および水素化アルミニウムリチウム(LiAlH4)からなる群から選択され得る。
好ましくは、水素化物供与体(複数可)は、4-アセトキシ-2-メチレン酪酸の量に対して少なくとも0.35モル当量の量で反応混合物全体に添加され、例えば、水素化物供与体は、4-アセトキシ-2-メチレン酪酸の量に対して0.5～2モル当量の量で添加され得る。当業者によって認識されるように、後者の水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)の当量範囲は、2～8倍過剰の水素化物(H)に相当し、完全な反応を確実にするのに役立つ。
水素化物供与体の選択および／または反応の所望の選択性により、この還元工程が行われるべき溶媒が決定される。工程d)のこの段階の例示的な溶媒は、水；C1-C8アルカノール；アセトニトリル；N,N-ジ(C1-C4)アルキルアシルアミド、例えばN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)およびN,N-ジメチルアセトアミド(DMAc)；ヘキサメチルホスホロアミド；N-メチルピロリドン；ピリジン；エステル、例えば(C1-C8)アルキルアセテート、エトキシジグリコールアセテート、ジメチルグルタレート、ジメチルマレアート、ジプロピルオキサレート、エチルラクテート、ベンジルベンゾエート、ブチルオクチルベンゾエートおよびエチルヘキシルベンゾエート；ケトン、例えばアセトン、エチルケトン、メチルエチルケトン(2-ブタノン)およびメチルイソブチルケトン； エーテル、例えばテトラヒドロフラン(THF)、2-メチルテトラヒドロフラン(2-MeTHF)および1,2-ジメトキシエタン；1,3-ジオキソラン；ジメチルスルホキシド(DMSO)；およびジクロロメタン(DCM)を含むか、これらに限定されない極性非プロトン性溶媒である。
4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(V)のγ-ヒドロキシ-α-メチレン酪酸(VI)への還元的変換は、水または空気を排除する特別な装置を必要としない。また、還元は、好ましい温度条件である室温を含む0～40℃の温度で行われ得る。
塩基性条件下での4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(V)のα-ヒドロキシ-γ-メチレン酪酸(VI)への変換において、水、4-アセトキシ-2-メチレン酪酸および塩基を含む反応混合物が提供される。塩基は、4-アセトキシ-2-メチレン酪酸の量に対して1～5モル当量の量で反応混合物中に存在しなければならない。塩基は、4-アセトキシ-2-メチレン酪酸の量に対して1.5～3モル当量または2～3モル当量の量で存在することが好ましい。
本発明を限定するものではないが、アルカリ金属(C1-C4)アルコキシド、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土類金属炭酸塩またはアルカリ金属水酸化物から選択される少なくとも1つの化合物からなることが望ましい。炭酸カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウムのうちの少なくとも1つを使用することが好ましい。
塩基性加水分解は還流条件下で行われ得る。当業者に理解されるように、還流温度は存在する反応物および溶媒に依存する。これは、この工程の還流温度(大気圧で)が100℃～2250℃、例えば125℃～2100℃であることが典型的であることを認めている。別の方法論では、塩基性加水分解は、反応が行われる温度に応じて自己圧力が発生する密閉オートクレーブ中で行われてもよい。100℃～2500℃、例えば100℃～2250℃の温度が確立され得て、そのような反応温度は0.5～40バールの範囲の自己圧力を生成する。
上記反応の進行は、1H NMR、フーリエ変換赤外スペクトロスコピー、超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)または薄層クロマトグラフィー(TLC)を挙げることができる公知の技術によってモニターすることができる。適切なレベル変換において、反応混合物を最初に室温まで冷却してもよい。次いで、α-ヒドロキシ-γ-メチレン酪酸(VI)を単離し、その後の合成工程で、粗製形態で使用してもよく、さらに精製してもよい。効果的な単離および精製方法には、溶媒抽出、濾過、蒸発、蒸留、結晶化およびクロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。
前述のスキームの第二段階は、酵素的に行うことができる:例えば、WO 2002101013 A2 (E.I.デュポン・ド・ヌムール・アンド・カンパニー)は、UDP-グルコースグルコシルトランスフェラーゼ酵素の作用下で、α-メチレン-γ-ヒドロキシブチレートからグルコシル化中間体を経てα-メチレン-γ-ブチロラクトンを形成することを開示している。
前記スキームの第二段階を化学的に行う場合、α-ヒドロキシ-γ-メチレン酪酸(VI)を30℃～300℃、例えば30℃～150℃の温度で強酸性条件にかけると、ヒドロキシ酸は環化してα-メチレン-γ-ブチロラクトン(VII)が得られる。この段階では、ルイス酸またはブレンステッド酸のいずれかを使用してもよく、典型的には、前記ルイス酸または前記ブレンステッド酸と4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(V)とのモル比は0.15～1:1の範囲であるべきである。適当なルイス酸は、三塩化アルミニウム；四塩化スズ；四塩化チタン；四塩化ジルコニウム；三塩化鉄；二塩化ニッケルを含むが、これらに限定されるものではない。適当なブレンステッド酸は、有機酸でも無機酸でもよいが、pKa値が最大限でも2.5のブレンステッド酸、特にpKa値が2.5～-10のブレンステッド酸を使用することが好ましい。硫酸；リン酸；塩酸、臭化水素酸；ヨウ化水素酸；メタンスルホン酸；p-トルエンスルホン酸；テトラフルオロホウ酸；トリフルオロ酢酸；トリクロロ酢酸；シュウ酸からなる群から選択されるブレンステッド酸について言及することができる。
第二の反応の進行は、上記参照技術によってモニターすることができる。適切なレベル変換において、反応混合物を最初に室温まで冷却してもよい。次に、α-メチレン-γ-ブチロラクトンを単離し、その後のいずれかの合成工程において粗製形態で使用してもよく、さらに精製してもよい。効果的な単離および精製方法には、溶媒抽出、濾過、蒸発、蒸留、結晶化およびクロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。
α-メチレン-γ-ブチロラクトンの適用
ペンダントラクトン環を有するポリマーの形成
本発明の開示は、ペンダントラクトン環を有するポリマーを形成するための上記定義のα-メチレン-γ-ブチロラクトン(以下、MBL)の重合を提供する。概して、重合はアニオン条件下で行われ、当業者は、重合のビニル付加経路が競合する開環重合経路より優位になるように適切な条件を選択するであろう。こうして得られたポリマーまたはコポリマー(p-MBL)は、その繰り返し単位中にラクトン構造を保持する。
前記モノマー(MBL)は、少なくとも1つのコモノマーを有するコポリマー(p-MBL)に組み込まれていてもよい。最も広くは、実施可能なコモノマーは、適切で実用的なアニオン重合条件下で合理的な重合反応速度を提供するものである。好ましくは、前記少なくとも1つのコモノマーは、(メタ)アクリロニトリル；アルキル(メタ)アクリル酸エステル；(メタ)アクリル酸；ビニルエステル；およびビニルモノマーからなる群から選択される、カルボニルを提供しないオレフィン系不飽和モノマーである。
適当なビニルモノマーには、エチレン；1,3-ブタジエン；イソプレーン；スチレン；ジビニルベンゼン；ヘテロ環式ビニル化合物；および、ビニルハライド、例えばクロロプレンが含まられる。適当なビニルエステルには、ビニルアセテート、ビニルプロピオネート、ビニルバーサテートおよびビニルラウレートが含まれる。アクリル酸およびメタクリル酸の適当なアルキルエステルは、C1-C14アルコールから誘導されるものであり、したがって、非限定的例して、メチルアクリレート；メチルメサクリレート；エチルアクリレート；エチルメサクリレート；n-ブチルアクリレート；n-ブチルメサクリレート；2-エチルヘキシルアクリレート；2-エチルヘキシルメサクリレート；イソプロピルアクリレート；ヒドロキシエチルメサクリレート；ヒドロキシプロピルメサクリレート；イソプロピルメサクリレート；n-プロピルアクリレート；n-プロピルメサクリレート；およびアルカンジオールのジ(メタ)アクリレートエステル、例えば1,6-ヘキサンジオールジアクリレートが挙げられる。
前記α-メチレン-γ-ブチロラクトン(MBL)および存在するいずれかのコモノマーのアニオン重合は、アルカリ金属オルガニル；アルカリ金属アルコキシド；アルカリ金属チオレート；アルカリ金属アミド；および元素周期律表第3a族の元素の化合物、好ましくはアルミニウムまたはホウ素オルガニルおよびアルミニウムアルコキシド、例えばアルミニウムトリメトキシド、アルミニウムトリエトキシド、アルミニウムトリプロポキシドおよびアルミニウムトリブトキシドからなる群から選択される開始剤の存在下で実施される。
開始剤の使用量は特に限定されないが、モノマー100重量部を基準として、通常0.0001～5重量部、好ましくは0.05～1重量部である。さらに、アニオン重合は、溶液中でまたは、溶媒を使用せずに溶融状態で行われ得る。使用される場合、重合に適した溶媒は、25℃で少なくとも1wt.％、好ましくは10wt.％を超えるポリマーを溶解できる非反応性の有機液体であるべきである。例示的な溶媒として、ジクロロメタンおよびテトラヒドロフラン(THF)を挙げることができる。
アニオン重合プロセスは、ルイス酸、特に、プロトン(H+)の供給源として機能することができない「非プロトン性」ルイス酸の存在下で行うことが望ましい。さらに、α-メチレン-γ-ブチロラクトン(MBL)のアニオン性ホモ重合または共重合は、開始化合物を意図的に含有させる場合を除き、無水条件下で、活性水素原子を有する化合物の非存在下で実施されるべきである。
プロセス圧力は、反応が低大気圧、大気圧または超大気圧で実施され得るという点で重要ではないが、アニオン重合は、典型的には、少なくとも25℃の温度で実施されるべきである。反応温度は200℃またはそれ以上であってもよいが、特に、作業可能な反応器圧力を維持するため、ポリマーの分解速度およびそれに伴う揮発性不純物または他の副生成物の生成を最小限に抑えるため、および場合により、触媒を不活性化または分解することなく適切な触媒活性を維持するために、温度が200℃、175℃、または150℃を超えないことが好ましい。
反応生成物は、当技術分野で公知の方法を用いて単離および精製してもよい。この文脈では、適切な技術として抽出、蒸発、蒸留およびクロマトグラフィーについて言及することができるが、反応生成物は、溶媒および未反応の出発物質を減圧下で蒸留することによって単離することが最も好都合である。(場合により精製された)反応生成物を生成時に貯蔵することが意図されている場合、ポリマーは、気密性および耐湿性シールを有する容器中に配置されるべきである。
本発明により得られるα-メチレン-γ-ブチロラクトンのアニオン重合によって誘導される例示的なホモポリマーまたはコポリマー(p-MBL)は、i)少なくとも2500g/モル、例えば10000～150000g/モル、好ましくは10000～100000g/モルの、ポリスチレン標準物を用いたテトラヒドロフラン中のゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によって測定される数平均分子量(Mn)；ii)50～200℃、例えば100～200℃のガラス転移温度(Tg)；iii)1.1～2.0、例えば1.10～1.90、好ましくは1.10～1.80の多分散性指数(polydispersity index, PDI)、を有する。
本発明のポリマー(p-MBL)は汎用性があり、それによって多くの用途があると考えられる。例えば、ラクトンを有するポリマーは、カチオン性部分を有する薬剤(ペプチドなどの治療剤を含む)を有するイオン性複合体を調製するために使用することができる。これらのポリマーに存在するラクトン環(複数可)は、アルカリヒドロキシドによって開環し、対応するヒドロキシカルボン酸のアルカリ金属塩を形成することもできる。さらに、ラクトン基(p-MBL)を含むポリマーは、ラクトンと反応することができる官能性化合物によって架橋することができる。非置換一級または二級アミンおよび多官能性アミン、例えば、ヒドロキシル置換モノ-、ジ-またはトリ-(C1-C12)アルキルアミン-は、この点で特に好ましい。従って、官能性ポリマー(p-MBL)は、コーティング組成物、シーラント組成物または接着組成物の硬化性、架橋性または他の反応性成分として有用性を見出すことができると予想される。
α-メチレン-γ-ブチロラクトン(MBL)またはそのホモポリマーおよびコポリマー(p-MBL)のポリエステル誘導体
本開示はまた、定義された方法に従って得られたα-メチレン-γ-ブチロラクトン(MBL)、またはアニオン重合によって得られたメチレン-γ-ブチロラクトン(p-MBL)の上記ホモポリマーおよびコポリマーのペンダントラクトン基のいずれかの開環重合によるポリエステルの形成を提供する。この点に関して、前記(コ)ポリマーp-MBLは、反応性マクロモノマーとみなすことができる。
本開示はさらに、ブロックまたはランダムコポリエステルの形成を提供し、それにより、前記メチレン-γ-ブチロラクトン(MBL)またはその(コ-)ポリマー(p-MBL)のラクトン官能基を使用して、環状カーボネート；環状無水物；オキサレート；ならびに5員環、6員環および／または7員環を有する環状エステルからなる群から選択される少なくとも1つのさらなるモノマー(M2)の開環重合を調節する。特に、前記少なくとも1つのさらなるモノマー(M2)は、ラクチド；グリコリド；ε-カプロラクトン；パラ-ジオキサノン；トリメチレンカーボネート；1,4-ジオキセパン-2-オン；1,5-ジオキセパン-2-オン；γ-ブチロラクトン；γ-メチル-α-メチレン-γ-ブチロラクトン；α-ブロモ-γ-ブチロラクトン；α-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトン；α-アセチル-γ-ブチロラクトン；スピロ環状-γ-ブチロラクトン；γ-バレロラクトン；α-アンゼリカ ラクトン；およびβ-アンゼリカラクトンからなる群から選択され得る。
本発明において利用される開環重合のメカニズムを制限する特定の意図はなく、したがって、塩基触媒を介したアニオン経路による環状モノマーの開環重合は厳密には排除されないが、本明細書においては、前記重合が酸触媒を介したカチオン経路によって進行することが好ましい。概して、いずれかの適切な酸性開環重合触媒が本明細書中で利用され得て、同様に、触媒の混合物が使用され得る。
ルイス酸とブレンステッド酸の両方がこの状況に適しているが、150℃未満の温度で有効である傾向があり、通常50℃～100℃の温度で有効であるので、後者が好ましい。
適切なルイス酸の例としては、BF3；AlCl3；t-BuCl/Et2AlCl；Cl2/BCl3；AlBr3；AlBr3.TiCl4；I2；SbCl5；WCl6；AlEt2Cl；PF5；VCl4；AlEtCl2；BF3Et2O；PCl5；PCl3；POCl3；TiCl6；およびSnCl4が挙げられるが、これらに限定されない。ブレンステッド酸またはプロトン酸型の触媒の例(場合により固体の無機支持体上に配置することができる)は、HCl；HBr；HI；H2SO4；HClO4；パラ-トルエンスルホン酸；トリフルオロ酢酸；および、ペルフルオロアルカンスルホン酸、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸(またはトリフリン酸、CF3SO3H)、C2F5SO3H、C4F9SO3H、C5F11SO3H、C6F13SO3HおよびC8F17SO3Hを含むが、これらに限定されない。これらの強酸の中で最も好ましいのは、トリフルオロメタンスルホン酸(トリフル酸、CF3SO3H)である。
前記開環重合のための触媒は、通常、重合されるモノマーの総重量を基準として1～1000重量ppmの濃度で使用され得る。好ましくは5～150重量ppm、最も好ましくは5～50ppmが使用される。モノマーと触媒との接触温度を高くすると触媒量が減少する場合がある。
開環重合は、10℃～150℃の範囲の温度で好都合に行われ得る。しかし、高温を回避することにより、低い沸点に起因する反応混合物からの揮発性モノマーの損失を制限することができるため、温度範囲は20℃または50℃～100℃であることが好ましい。
プロセス圧力は重要ではなく、したがって、重合反応は大気圧以下、大気圧、または超大気圧で行うことができるが、大気圧以上の圧力が好ましい。しかしながら、反応は無水条件下で、活性水素原子を有する化合物が存在しない状態で行うことが重要である。
反応の持続時間はシステムが平衡に達するのに要する時間に依存する。しかし、同様に、所望の生成物は、正確に所望の時間に平衡を停止することによって得ることができることが理解される。例えば、経時的に粘度を分析することによって、またはガスクロマトグラフィーを用いてモノマー変換率を分析することによって反応をモニターすることができ、所望の粘度またはモノマー変換率が達成されたときに反応を停止することができる。これらの考慮事項は別として、重合反応は、一般的には0.5時間～72時間、より一般的には1時間～30時間または1時間～20時間行われる。重合反応の最後に反応混合物中に存在する酸性触媒は容易に中和されて、反応生成物を安定化させることができる。
重合が完了すると、例えば濾過、クロスフロー濾過または遠心分離によって、固体の懸濁化合物を除去することができる。さらに、重合の出力は、ヒドロキシル官能性ポリエステルを単離および精製するために、当該技術分野で公知の方法を用いて加工することができる。この点に関しては、適当な技術として、抽出、蒸発、蒸留およびクロマトグラフィーについて言及することができる。単離に際して、ヒドロキシル官能化ポリエステルの典型的な収率は少なくとも40％であり、しばしば少なくとも60％であることが見出されている。
この開環重合法によって誘導され得る例示的なポリエステルは、ポリスチレン標準を用いたテトラヒドロフラン中のゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC)によって測定される分子量(Mn)が少なくとも5000、好ましくは10000～200000g/モルである。さらに、ポリマーは、1.0～2.5、好ましくは1.0～2.0の範囲の多分散性指数を特徴とし得る。
さらなるポリエステル形成
メチレン-γ-ブチロラクトン(MBL)またはその(コ-)ポリマー(p-MBL)は、エステル化におけるモノマーとしてさらに有用であり得て、ここで得られるコポリマーは、エステル結合を形成することができる少なくとも2つのコモノマーから誘導された非ラクトイル単位を含む。より具体的には、これらのコモノマーは、i)少なくとも1つのジオール；および(ii)少なくとも1つのジカルボン酸またはそのエステル形成誘導体、を含む。
この文脈での使用に適したジオール(i)としては、飽和および不飽和脂肪族およびシクロ脂肪族ジヒドロキシ化合物、ならびに芳香族ジヒドロキシ化合物が挙げられる。これらのジオールは、好ましくは250ダルトン以下の分子量を有する。本明細書中で使用される場合、用語「ジオール」は、その等価なエステル形成誘導体を含むと解釈されるべきであるが、ただし、分子量要件はジオールのみに関連し、その誘導体には関連しない。例示的なエステル形成性誘導体としては、ジオールのアセテート、ならびに例えばエチレングリコールのエチレンオキシドまたはエチレンカーボネートが挙げられる。
好ましいジオールは、2～10個の炭素原子を有するものである。これらのジオールの例として、エチレングリコール；プロピレングリコール；1,3-プロパンジオール；1,2-ブタンジオール；2-メチルプロパンジオール；1,3-ブタンジオール；1,4-ブタンジオール；2,3-ブタンジオール；ネオペンチルグリコール；ヘキサンジオール；デカンジオール；ヘキサメチレングリコール；シクロヘキサンジメタノール；レゾルシノール；およびヒドロキノンが挙げられる。このようなジオールの混合物を使用することができるが、この点に関しては、一般に、好ましくは、総ジオール含量を基準として、少なくとも約60モル％、好ましくは少なくとも80モル％が同じジオールである。
上記の文脈での使用に適したジカルボン酸(ii)には、脂肪族、シクロ脂肪族、および／または芳香族ジカルボン酸が含まれる。これらの酸は、好ましくは300ダルトン未満の分子量を有するべきである。本明細書で使用される用語「ジカルボン酸」とは、ポリエステルを形成する際にグリコールおよびジオールと反応して実質的にジカルボン酸と同様に機能する2つの官能性カルボキシル基を有するジカルボン酸の等価物を含む。これらの等価物には、酸ハロゲン化物および酸無水物のようなエステルおよびエステル形成反応性誘導体が含まれるが、上記の分子量優先性は酸に関するものであり、その等価エステルまたはエステル形成誘導体に関するものではない。したがって、300ダルトンよりも大きい分子量を有するジカルボン酸のエステル、または300ダルトンよりも大きい分子量を有するジカルボン酸の酸等価物は、その酸が300ダルトン未満の分子量を有する場合に含まれる。さらに、ジカルボン酸は、ポリマーの形成および本発明のポリマーの使用を実質的に妨害しない任意の置換基または組み合わせを含み得る。
好ましいジカルボン酸は、合計2～16個の炭素原子を有するアルキルジカルボン酸および合計8～16個の炭素原子を有するアリールジカルボン酸を含む群から選択されるものである。代表的なアルキルジカルボン酸としては、グルタル酸；アジピン酸；ピメリン酸；コハク酸；セバシン酸；アゼライン酸；およびマロン酸が挙げられる。代表的なアリールジカルボン酸としては、テレフタル酸；フタル酸；イソフタル酸；前記酸のジメチル誘導体；およびこれらの混合物が挙げられる。
本開示のさらなる実施態様
本発明はまた、全細胞生体内変換により式(BII)の化合物から式(BIII)の化合物を調製する方法：
［式中、
nは、0～8の整数であり；
R1は、C1-C4アルキルであり；
R2は、HまたはC1-C4アルキルであり；そして
R3は、HまたはC1-C4アルキルである］
であって、
iii)細胞(CB)を、該細胞が前記式(BII)の化合物から前記式(BIII)の化合物を形成することを可能にする条件下で、前記式(BII)の化合物を含有する培養培地、または前記式(BII)の化合物を含有する有機相に接している培養培地と接触させること；および、場合により
iv)得られた式(BIII)の化合物を単離すること、
を含み、
ここで、前記細胞(CB)は、前記式(BII)の化合物のCn+3-ヒドロキシル化を触媒する少なくとも1つのアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性を示す。
この工程で利用される細胞(CB)は、アルカンモノオキシゲナーゼの遺伝子を、場合によりAlkオペロンの一部として有する。一実施態様において、利用される細胞(CB)は、アルカンモノオキシゲナーゼの遺伝子を、場合によりAlkオペロン、特に遺伝子産物AlkB、AlkHおよびAlkJを含有するAlkオペロンの一部として有する野生型細胞または非組換えの実験室細胞であり得る。シュードモナス・プチダの野生型遺伝子型には2つのAlkオペロンがあり、第一のオペロンは遺伝子産物AlkB、AlkF、AlkG、AlkH、AlkJ、AlkKおよびAlkLをコードし、第二のオペロンはAlkSおよびAlkTをコードし、ここで、AlkSは第一のalkオペロンの発現を調節する機能を有する。
あるいは、利用される細胞(CB)は、その野生型と比較して、式(BII)の化合物から出発して式(BIII)の化合物をより多く産生することができるように、その野生型に対して遺伝子の組換えを行ってもよい。この比較は、以下の両方を包含することを意図している:i)野生型の遺伝子組換え細胞が検出可能な量の式(BIII)の化合物を産生する場合；ii)野生型遺伝子組換え細胞が検出可能な量の式(BIII)の化合物を形成することができない場合。従って、前記第二のカテゴリーの細胞ii)に関して、検出可能な量の式(BIII)の化合物が形成されるのは、野生型の遺伝子組換えを行ってこの方法の工程で使用される細胞をした場合のみである。
利用される細胞(CB)は、24時間の規定された時間間隔において、それが野生型細胞よりも少なくとも10倍、例えば少なくとも100倍または少なくとも1000倍多くの式(BIII)の化合物を形成するように遺伝子の組換えがなされていることが好ましい。生成物形成の増加は、本開示の工程b)に従って使用される細胞および野生型細胞を、同じ初期細胞密度、栄養培地および培養条件下で特定の時間間隔で別々に培養し、次いで各栄養培地中の標的生成物の量を測定することによって測定することができる。
本開示のこの工程で使用される細胞(CB)は、原核生物または真核生物であり得る。これらは、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)、植物細胞または微生物、例えば真菌、カビまたは細菌であり得て、好ましい微生物は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)に寄託されているものである。酵母はこの文脈において重要な微生物(真菌)であり得るが、細菌を用いることが好ましく、したがって、http://www.dsmz.de/species/bacteria.htmを参考にすることができる。
本発明における野生型シュードモナス・プチダの使用の可能性については上述した。本発明を限定する意図はないが、遺伝子の組換えがなされ、本開示のこの実施態様において使用され得る好ましい細胞(CB)は、遺伝子:コリネバクテリウム(Corynebacterium)；ブレビバクテリウム(Brevibacterium)；バチルス(Bacillus)；ラクトバチルス(Lactobacillus)；ラクトコッカス(Lactococcus)；カンジダ(Candida)；ピキア(Pichia)；クルイベロミセス(Kluveromyces)；サッカロミセス(Saccharomyces)；エシェリキア(Escherichia)；ザイモモナス(Zymomonas)；ヤロウイア(Yarrowia)；メチロバクテリウム(Methylobacterium)；ラルストニア(Ralstonia)；シュードモナス(Pseudomonas)；バークホルデリア(Burkholderia)；およびクロストリジウム(Clostridium)から選択され得る。エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)およびシュードモナス・プチダからなる群から選択される細胞(CB)の使用が特に好ましいと言及され得る。E.coli BL21株で良好な結果が得られている。
その野生型と比較して、本実施態様による遺伝子組換え細胞(CB)は、式(BII)の化合物のCn+3-ヒドロキシル化を触媒するアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の少なくとも1つの活性の増加を示さなければならない：式(BII)の化合物の直接的なCn+3-ヒドロキシル化は、式(BIII)の化合物を導く。
酵素アルカンモノオキシゲナーゼは、シュードモナス・プチダGP01由来のAlkB遺伝子、その変異体およびホモログによってコードされるものであり得る。例えば、酵素アルカンモノオキシゲナーゼは、AIkBGT遺伝子クラスター；AlkBGTJH遺伝子クラスター；およびAlkBGTJHL遺伝子クラスターからなる群から選択される、シュードモナス・プチダGP01由来のAlkB遺伝子によってコードされるものであり得る。それぞれの遺伝子配列の単離は、例えば、van Beilen et al., "Functional Analysis of Alkane Hydroxylases from Gram-Negative and Gram-Positive Bacteria", Journal of Bacteriology, Vol. 184 (6), pages 1733-1742 (2002)に記載されている。さらに、AlkB、AlkF、AlkGおよびAlkTをコードするDNA配列情報は、GenBank AJ-245436.1として同定されたシュードモナス・プチダOCTプラスミドalk遺伝子クラスターから得られ；また、AlkBGTがクローニングされたpCom10ベクターのプラスミド配列は、GenBank 302087.1に見出すことができる。
同定された配列に対して少なくとも40％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも75％の同一性を有する核酸配列によってコードされる酵素は、本発明の方法における使用に適している。完全性のために、AlkB遺伝子のさらなる例示的なホモログには、シュードモナス・プチダP1から得られたAlkB-P1；マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)から得られたAlk1-MO；およびアルカニボラックス・ボークメンシス(Alcanivorax borkumensis)から得られたAlkB1、を含むが、これらに限定されない。
遺伝子組換え細胞(CB)において前述の酵素の細胞内活性の増加を達成するために、以下の手段の1つ以上を採用することができる：酵素をコードする遺伝子配列のコピー数の増加；遺伝子のための強力なプロモーターの使用；より強力なリボソーム結合部位の使用；コドンの最適化の使用；活性が増加した対応する酵素をコードする遺伝子または対立遺伝子の利用；および、例えばKoch et al.,“In Vivo Evolution of Butane Oxidation by Terminal Alkane Hydroxylases AlkB and CYP153A6”, Applied and Environmental Microbiology, Vol 75 (2), pages 337-344 (2009)に記載の、活性の増加を示す、上記酵素の改変されたアミノ酸配列の利用。
本発明の方法に使用される遺伝子組換え細胞は、所望の遺伝子、この遺伝子の対立遺伝子またはその一部を含む発現ベクター、およびこの遺伝子の発現を可能にするベクターを用いて形質変換、形質導入および／またはコンジュゲーションにより作製される。異種発現は、細胞の染色体または染色体外複製ベクターにおける遺伝子またはその対立遺伝子の組み込みによって達成される。本開示を限定する意図はないが、WO2009/077461 (Evonik Degussa GmbH) は、細胞遺伝的形質変換の有益な参考文献を提供する。
細胞(CB)は、バイオリアクター中で前記培養培地と接触させることができ、したがって、工程b)に関連して上述したように、バッチプロセス、流加バッチプロセスまたは反復流加バッチプロセスにおいて連続的または非連続的に培養することができる。
バイオリアクター内で、バイオプロダクションシステムは、化合物(BII)基質分子の所望の変換(Cn+3-ヒドロキシル化)を得て化学製品(BIII)を得るのに十分な時間、適切な温度範囲内および制御された溶存酸素濃度範囲内に維持される。この工程に適した温度範囲としては、20℃～50℃、例えば20℃～40℃が挙げられる。嫌気的条件は、この工程で使用されるバイオリアクター内で維持され得るが、酸素または空気のような酸素含有ガスの添加を介して、その中で好気的条件を維持することがより典型的である。栄養培地を含む液体培養物の溶存酸素レベルをモニターすることで、所望の好気性、微好気性または嫌気性条件を維持または確認することができる。
この工程で使用される培養培地は、所望の最終生成物(BIII)を生成するために使用される微生物の要求に適していなければならないことは、当業者には明らかであろう。培養培地を形成するために、少なくとも1つの増殖因子またはその前駆体；少なくとも一つの窒素源；少なくとも1つのリン源；マンガン、ホウ素、コバルト、銅、モリブデン、亜鉛、カルシウム、マグネシウム、鉄、ニッケルおよびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つの微量金属源が適切に組み合わされ得る。適当な増殖因子としては、アミノ酸およびビタミン、例えばビオチン、ビタミンB12、ビタミンB12の誘導体、チアミンおよびパントテン酸が挙げられるが、これらに限定されない。窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。リン源としては、リン酸、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウムまたはリン酸水素二カリウムが挙げられるが、これらに限定されない。培地は、無機酸および塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、アンモニア水を含むpH調整剤；消泡剤；および、プラスミドの安定性を維持するための抗生物質などのアジュバントを含有してもよいことがさらに認識されるであろう。
培地は限定培地であり得る。また、本実施態様は、最少培地または追加最少培地を利用して実施してもよい。さらに、商業的に調製された培地の使用を排除するものではなく、特に以下のものを挙げることができる：ルリアベルタニ(LB)ブロス；M9最少培地；サブローデキストロース(SD)ブロス；酵母培地(YM)ブロス、および酵母合成最少培地(Ymin)。
化合物(BIII)は、場合により、バイオリアクターから単離することができ、この単離は、宿主細胞が培地中に分泌する場合は培養培地から、分泌しない場合はそれを産生する宿主細胞から直接のいずれかである。単離された化合物(BIII)は、その後、溶媒抽出、濾過、蒸発、蒸留、結晶化およびクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の方法を用いて精製してもよい。
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
特に断りのない限り、以下に記載するすべての化学物質および化合物は、Merck/Sigma-Aldrich、TCI chemicalsまたはCarl Rothから市販されている最高純度のものを購入した。
NMRスペクトロスコピー：1H-および13C-スペクトルは、AvanceTM III 300 MHz FT NMRスペクトロメーターを用いて記録し、分析には、5～10mgの分析物をCDCl3に溶解し、得られたスペクトルデータを文献と比較した。
ガスクロマトグラフィー-マススペクトロメトリー(GC-MS)：この分析は、所望の生成物の生成を定性的に確認するために使用した。分析条件は純粋な化合物を用いて設定した。すべての測定は、AOC-20i/sオートサンプラーとインジェクターユニットとZebron ZB-5MSiキャピラリーカラム(30m×0.25mm×0.25μm、Phenomenex社製)を装備した島津GCMS-QP2010 SE装置を用いて行った。試験パラメータの詳細は以下の表1に示す：

ガスクロマトグラフィー-水素炎イオン化検出器(GC-FID):この分析は、所望の生成物の生成を定量的に確認するために使用した。分析条件は純粋な化合物を用いて確立した。測定はすべて、AOC-20i Plusオートサンプラーとインジェクターユニット、Zebron ZB-5MSiキャピラリーカラム(30m x 0.25mm x 25μm、Phenomenex社製)を装備した島津Nexis GC-2030で行った。分析物の濃度は、安静時細胞緩衝液から抽出した既知濃度の純粋な化合物(0～6mM、内部標準物質ISTDで標準化)で試料を測定することによって作成した較正曲線から算出した。特に、酢酸イソプレニルの較正曲線は、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールに適用した。
試験パラメータの詳細は、以下の表2に示す：

実施例1：酢酸イソプレニル(II)の合成
磁気撹拌装置を備えた50mLの丸底フラスコに、60.9mmolの無水酢酸(Ac2O)および0.58mmolのMg(ClO)44を加えた。イソプレノール(I、58mmol)を滴下することによって反応を開始させた。反応は薄層クロマトグラフィー(シクロヘキサン：酢酸エチル(EtOAc)3：1)によりモニターした。
30分後、反応は完了し、水性NaHCO3を添加し、生成物をジエチルエーテル(Et2O)で抽出した。有機層をMgSO4で乾燥させ、溶媒を蒸発させて純粋なエステルを得た(収率：88％)。イソプレニルアセテート(II)の形成は、既知の文献[5]に対照してGC-MSおよびNMR-分光法によって確認した。
実施例2
2a)AlkBFGTのクローニングおよび発現
AlkBFGTを、Schreweら[1]およびvan Nulandら[2]によって記載されているのと類似の方法で、AlkLを切り出すことによって広宿主ベクターpCom10_AlkL[3]にクローニングして、ベクターpBT10を得た。
alkBFGおよびalkTをコードする合成DNA断片をIntegrated DNA Technologiesから入手した。断片を、Thermo Scientific CloneJET PCRクローニングキットを用いてpJET1.2ベクターにサブクローニングした。alkBFGおよびalkT断片を、FastCloning法[4]によりpCom10ベクター骨格に挿入した。pBT10の正しい集合は、コロニーPCRおよびSanger配列決定により確認した。
pBT10プラスミドを保有するE. coli BL21(DE3)を用いて、文献([1]、[2])に記載されているのと同様の条件でAlkBFGTを発現させた。E. coli BL21(DE3) pCom10_AlkLは、空ベクター対照実験に使用した。菌株は、50μg mL-1のカネイマイシンを添加したLuna-Bertani(LB)培地またはM9最少培地(1×M9塩、0.5％グルコース、2mM MgSO4、1ml L-1のUSFe微量元素)で成長させて選択した。5mLのLB培地に単一のコロニーを接種し、30℃、一定の撹拌(120rpm)下で一晩インキュベートした。500μLの一晩培養物(ONC)を100mL振とうフラスコ内の50mLのM9最少培地に移し、再び30℃で培養物を一晩インキュベートした。
発現には、100～400mLのM9最少培地に、波長600nmで測定した光学密度(OD600)が0.15になるまでM9-プレカルチャー(M9-preculture)を接種し、OD600が0.4～0.5になるまで30℃で培養した。0.05％(v/v)のジシクロプロピルケトン(DCPK)を添加することによって、組換え遺伝子の発現を誘導した。30℃で4時間発現させた後、遠心分離(4400xg、4℃、15分)により細胞を回収した。
2b)4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の全細胞生体内変換および単離
発現および回収後、細胞をOD600が10になるまで静止細胞緩衝液(50mM KPi、pH7.4、1％グルコース、2mM MgSO4)に再懸濁した。細胞を反応条件に5～10分間適応させた。次に、生物学的に3連で以下の反応を行った。
反応を、1.5mLガラスバイアル中で総容量300μLで行った。反応を、5mMの基質イソプレニルアセテート(II)、EtOH中のストック200mM、2.5％(v/v)EtOHを反応中に添加することによって開始させた。細胞を、25℃、一定の攪拌(180rpm)下で、24時間インキュベートした。反応を停止するために、混合物をさらに使用するまで-20℃で保存した。基質変換はGC-MSとGC-FIDで分析した。
陰性対照として、E.coli pBT10の代わりにE.coli pCom10_AlkLを使用した。AlkBFGTシステムの一般的な活性を確認するため、AlkBFGTによるn-オクタンから1-オクタノールへの変換、さらにオクタナールとオクタン酸への過酸化をモデル反応として行った。
4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の形成をNMRスペクトロスコピーにより確認するために、反応を全容量20mLにスケールアップし、100mL振とうフラスコ中で24時間反応時間行った。反応混合物をさらに使用するまで-20℃で保存した。
細胞懸濁液から酢酸エチル(EtOAc)で生成物を抽出した。有機層をMgSO4で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。粗抽出物をカラムクロマトグラフィー(固定相:シリカ60；溶媒:シクロヘキサン/EtOAc4:1)にかけ、精製した4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)を得た。化合物IIIを含有する画分の溶媒を蒸発させて純粋なIIIを得て、その収量は以下の表3で報告する。画分をTLC(シクロヘキサン:EtOAc、2:1；KMnO4染色による検出)により分析した。スペクトルデータを文献([6]、[7])のスペクトルデータと比較した。
全細胞生体内変換の分析のために、250μLの反応混合物を25μLの2M HClで酸性化し、激しく振盪することによって内部標準として1mMのメチルベンゾエートを含有する250μLのEtOAcで抽出した。相分離は遠心分離(16,000g、4℃、7分)によって達成した。有機相をMgSO4で乾燥させた。200μLの抽出物を直接GC-MSまたはGC-FID分析にかけ、それぞれ定性または定量分析した。
以下の表3に報告する収量データは、三重反応の算術平均と標準偏差(SD)として示されている。

実施例3
3a)AlkLの共発現を伴うAlkBFGTのクローニングおよび発現
AlkBFGTLを、Schreweら[1]およびvan Nulandら[2]によって記載されているのと類似の方法で、広宿主ベクターpCom10_AlkL[3]に同様にクローニングして、ベクターpBTL10を得た。
alkBFGおよびalkTをコードする合成DNA断片をIntegrated DNA Technologiesから入手した。AlkLをコードする遺伝子をpCom10_AlkLから増幅させた。断片を、Thermo Scientific CloneJET PCRクローニングキットを用いてpJET1.2ベクターにサブクローニングした。alkBFG、alkTおよびalkL断片を、FastCloning法[4]によりpCom10ベクター骨格に挿入した。pBTL10の正確なアセンブリは、コロニーPCRおよびSangerシークエンシングによって確認した。
pBTL10プラスミドを保有するE.coli BL21(DE3)を用いて、文献([1]、[2])に記載されているのと同様の条件下でAlkBFGTLを発現させた。E.coli BL21(DE3) pCom10_AlkLを空ベクター対照として使用した。菌株は、50μg mL-1のカナマイシンを添加したLuna-Bertani(LB)またはM9最少培地(1×M9塩、0.5％グルコース、2mM MgSO4、1ml/LのUSFe微量元素)のいずれかで成長させて選択した。5mLのLB培地に単一コロニーを接種し、30℃、一定の攪拌(120rpm)下で一晩インキュベートした。500μLの一晩培養物(ONC)を、100mL振とうフラスコ内の50mLのM9最少培地に移し、再び30℃で培養物を一晩インキュベートした。
発現には、100～400mLのM9最少培地に、波長600nmで測定した光学密度(OD600)が0.15になるまでM9-プレカルチャーを接種し、OD600が0.4～0.5になるまで30℃で培養した。0.05％(v/v)のジシクロプロピルケトン(DCPK)を添加することによって、組換え遺伝子の発現を誘導した。30℃で4時間発現させた後、遠心分離(4400xg、4℃、15分)により細胞を回収した。
3b)4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の全細胞生体内変換および単離
発現および回収後、細胞をOD600が10になるまで静止細胞緩衝液(50mM KPi、pH7.4、1％グルコース、2mM MgSO4)に再懸濁した。細胞を反応条件に5～10分間適応させた。次に、生物学的に3連で以下の反応を行った。
反応を、1.5mLガラスバイアル中で総容量300μLで行った。5mMの基質(イソプレニルアセテート(II)、EtOH中のストック200mM、2.5％(v/v)EtOH)の添加により反応を開始させた。細胞を、25℃、一定の撹拌下(180rpm)下で、24時間インキュベートした。反応を停止するために、混合物をさらに使用するまで-20℃で保存した。基質変換はGC-MSおよびGC-FIDで分析した。
陰性対照として、E.coli pBTL10の代わりにE.coli pCom10_AlkLを使用した。AlkBFGTLシステムの一般的な活性を確認するため、AlkBFGTLによるn-オクタンの1-オクタノールへの変換およびさらなるオクタナールおよびオクタン酸への過酸化をモデル反応として行った。
NMRスペクトロスコピーにより4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の形成を確認するために、反応を全容量20mLにスケールアップし、100mL振とうフラスコ内で24時間反応時間行った。反応混合物をさらに使用するまで-20℃で保存した。
生成物を、細胞懸濁液から酢酸エチル(EtOAc)で抽出した。有機層をMgSO4で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。粗抽出物をカラムクロマトグラフィー(固定相:シリカ60；溶媒:シクロヘキサン/EtOAc 4:1)にかけ、精製した4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)を得た。化合物IIIを含有する画分の溶媒を蒸発させて純粋なIIIを得て、その収量を以下の表4で報告する。画分をTLC(シクロヘキサン:EtOAc、2:1； KMnO4染色による検出)により分析した。スペクトルデータを文献([6]、[7])のスペクトルデータと比較した。
全細胞生体内変換の分析のために、250μLの反応混合物を25μLの2M HClで酸性化し、激しく振盪することによって内部標準として1mMのメチルベンゾエートを含有する250μLのEtOAcで抽出した。相分離は遠心分離(16,000g、4℃、7分)によって行った。有機相をMgSO4で乾燥させた。200μLの抽出物を直接GC-MSまたはGC-FID分析にかけ、それぞれ定性または定量分析した。
以下の表4に報告する収量データは、三重反応の算術平均と標準偏差(SD)として示されている。

実施例4
4a)AlkB変異体のクローニングおよび発現
それぞれがAlkB変異体を有する2つのAlkBFGT DNA断片を、Schreweら[1]およびvan Nulandら[2]によって記載されているように、AlkLを切り出すことにより、広宿主ベクターpCom10_AlkL[3]にクローニングして、ベクターpBT10_AlkB変異体を得た。以下のAlkB変異体は、以下のように同定される:AlkB(I233V)(Kochら[8]に開示されている変異体)；AlkB(F164L)(イソプレニルアセテートをリガンドとして用いたドッキング試験から同定された単一変異体であって、野生型AlkBのアミノ酸フェニルアラニン(Phe)がロイシン(Leu)に交換されているもの)。
alkBFGおよびalkTをコードする合成DNA断片をIntegrated DNA Technologiesから入手した。適宜、AlkLをコードする遺伝子をpCom10_AlkLから増幅させた。断片を、Thermo Scientific CloneJET PCRクローニングキットを用いてpJET1.2ベクターにサブクローニングした。alkBFG、alkT、および該当する場合にはAlkL断片を、FastCloning法[4]を介してpCom10ベクター骨格に挿入し、pBT10ベクターを得た。変異は部位特異的変異誘発により導入した。pBT10_AlkB変異体の正確な集合と変異誘発の成功を、コロニーPCRとSanger配列決定により検証した。
pBT10_AlkB変異体プラスミドを保有するE.coli BL21(DE3)を用いて、AlkB(mut)FGTまたは、該当する場合には、AlkB(mut)FGTLを、文献([1]、[2])に記載されているのと同様の条件下で発現させた。E.coli BL21(DE3) pCom10_AlkLを空ベクター対照として使用した。菌株は50μg mL-1のカナマイシンを添加したLuna-Bertani(LB)またはM9最少培地(1×M9塩、0.5％グルコース、2mM MgSO4、1ml/LのUSFe微量元素)のいずれかで増殖させて選択した。LB培地5mLに単一コロニーを接種し、30℃、一定の攪拌(120rpm)下で、一晩インキュベートした。500μLの一晩培養物(ONC)を、100mL振とうフラスコ内の50mLのM9最少培地に移し、再び30℃で培養物を一晩インキュベートした。
発現には、100～400mLのM9最少培地に、波長600nmで測定した光学密度(OD600)が0.15になるまでM9-プレカルチャーを接種し、OD600が0.4から0.5に達成するまで30℃で培養した。0.05％(v/v)のジシクロプロピルケトン(DCPK)を添加することによって、組換え遺伝子の発現を誘導した。30℃で4時間発現させた後、遠心分離(4400xg、4℃、15分)により細胞を回収した。
4b)4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の全細胞生体内変換および単離
発現および回収後、細胞をOD600が10になるまで静止細胞緩衝液(50mM KPi、pH7.4、1％グルコース、2mM MgSO4)中で再懸濁した。細胞を5～10分間反応条件に適合させた。次に、生物学的に3連で以下の反応を行った。。
反応は、1.5mLガラスバイアル中で総容量300μLで行った。反応を、5mMの基質イソプレニルアセテート(II)、EtOH中のストック200mM、2.5％(v/v)EtOHを反応中に添加することによって開始させた。細胞を、25℃、一定の攪拌(180rpm)下で、24時間インキュベートした。反応を停止するために、混合物をさらに使用するまで-20℃で保存した。基質変換はGC-MSおよびGC-FIDで分析した。
陰性対照として、E.coli pBT10_AlkB変異体の代わりにE.coli pCom10_AlkLを使用した。AlkBFGTまたは、適用可能な場合には、AlkBFGTLシステムの一般的な活性を確認するために、AlkBFGT(L)によるn-オクタンの1-オクタノールへの変換およびさらなるオクタナールおよびオクタン酸への過剰酸化をモデル反応として実施した。
NMRスペクトロスコピーにより4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の形成を確認するために、反応を全容量20mLまでスケールアップし、100mL振盪して24時間反応時間を実施した。反応混合物をさらに使用するまで-20℃で保存した。
生成物を、細胞懸濁液から酢酸エチル(EtOAc)で抽出した。有機層をMgSO4で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。粗抽出物をカラムクロマトグラフィー(固定相:シリカ60；溶媒:シクロヘキサン/EtOAc 4:1)にかけ、精製した4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)を得た。化合物IIIを含有する画分の溶媒を蒸発させて純粋なIIIを得て、その収量を以下の表5に報告する。画分をTLC(シクロヘキサン:EtOAc、2:1；KMnO4染色による検出)により分析した。スペクトルデータを文献([6]、[7])のスペクトルデータと比較した。
全細胞生体内変換の分析のために、250μLの反応混合物を25μLの2M HClで酸性化し、激しく振盪することによって内部標準として1mMのメチルベンゾエートを含有する250μLのEtOAcで抽出した。相分離は遠心分離(16,000g、4℃、7分)によって行った。有機相をMgSO4で乾燥させた。200μLの抽出物を直接GC-MSまたはGC-FID分析にかけ、それぞれ定性または定量分析した。
表5に報告されている反応の収量は、三重反応の平均と標準偏差(SD)として示されている。

実施例5
5a)AlkBのホモログのクローニングおよび発現
以下のホモログ(a)、(b)、(c))を、Schreweら[1]およびvan Nulandら[2]によって記載されているのと類似の方法で、独立して、AlkLを切り出すことによって広宿主ベクターpCom10_AlkL[3]にクローニングして、ベクターpBT10を得た:a)P.プチダGPo1(PpGPo1)由来のAlkBと90％のタンパク質配列同一性を有する、シュードモナス・プチダP1由来のAlkB(PpP1_AlkB；受託番号:P12691.1)；b)P. putida GPO1由来のAlkBと78％のタンパク質配列同一性を有する、マリノバクター・ヒドロカーボンクラスチカス(Marinobacter hydrocarbonclasticus)由来のAlkMO(Mh_AlkMO；RCW72391.1)；および、c)P. putida GPo1由来のAlkBと77％の蛋白質配列同一性を有するアルカニボラックス・ボークメンシス(Alcanivorax borkumensis)由来のAlkB1(Ab_AlkB1；AB110225.1)。
alkBFG、alkT、および独立して前述の同族体をコードする合成DNA断片をIntegrated DNA Technologiesから入手した。alkBFGTおよびalkT断片を、Thermo Scientific CloneJET PCRクローニングキットを用いてpJET1.2ベクターにサブクローニングした。alkBFGおよびalkTのDNA断片を、FastCloning法[4]によりpCom10ベクター骨格に挿入し、pBT10プラスミドを得た。ホモログa)～c)をP.プチダGPO1由来のalkB遺伝子を置き換えることによりpBT10骨格に挿入した。pBT10_AlkBhomologの正しい集合は、コロニーPCRおよびサンガー配列決定によって確認した。
pBT10_AlkBhomologプラスミドを保有するE.coli BL21(DE3)を独立に使用して、文献([1]、[2])に記載されているのと同様の条件下でAlkFGTおよび前記同族体を発現させた。E.coli BL21(DE3)pCom10_AlkLを空ベクター対照として使用した。菌株は、50μg/mLのカナマイシンを添加したLuna-Bertani(LB)またはM9最少培地(1×M9塩、0.5％グルコース、2mM MgSO4、1ml/LのUSFe微量元素)のいずれかで増殖させて選択した。LB培地5mLに単一コロニーを接種し、30℃で一晩インキュベートし、一定の攪拌(120rpm)を行った。500μLの一晩培養物(ONC)を、100mL振とうフラスコ中の50mLのM9最少培地に移し、培養を再び一晩30℃でインキュベートした。
発現には、100～400mLのM9最少培地に、波長600nmで測定した光学密度(OD600)が0.15になるようにM9-プレカルチャーを接種し、OD600が0.4から0.5に達成するまで30℃で成長させた。0.05％(v/v)のジシクロプロピルケトン(DCPK)を添加し、組換え遺伝子の発現を誘導した。30℃で4時間発現させた後、遠心分離(4400xg、4℃、15分)により細胞を回収した。
5b)4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の全細胞生体内変換および単離
発現および回収の後、3つの改変細胞をそれぞれ独立に、OD600が10になるまで静止細胞緩衝液(50mM KPi、pH7.4、1％グルコース、2mM MgSO4)に再懸濁した。細胞を反応条件に5～10分間適応させた。次に、生物学的に3連で以下の反応を行った。
反応は、全容量300μLの1.5mLガラスバイアルで行った。5mMの基質(イソプレニルアセテート(II)、EtOH中のストック200mM、2.5％(v/v)EtOH)の添加により反応を開始させた。細胞を25℃で24時間、一定の撹拌(180rpm)下で独立にインキュベートした。反応を停止するために、混合物をさらに使用するまで-20℃で保存した。基質変換はGC-MSおよびGC-FIDで分析した。
陰性対照として、E.coli pCom10_AlkLを使用した。AlkFGTおよびホモログ((a)、(b))またはc))システムの一般活性を確認するために、n-オクタンの1-オクタノールへの変換およびオクタナールおよびオクタン酸へのさらなる過酸化をモデル反応として行った。
NMRスペクトロスコピーにより4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の形成を確認するために、反応を全容量20mLまでスケールアップし、100mL振盪して24時間反応時間を実施した。反応混合物をさらに使用するまで-20℃で保存した。
生成物を、細胞懸濁液から酢酸エチル(EtOAc)で抽出した。有機層をMgSO4で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。粗抽出物をカラムクロマトグラフィー(固定相:シリカ60；溶媒:シクロヘキサン/EtOAc 4:1)にかけ、精製した4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)を得た。化合物IIIを含有する画分の溶媒を蒸発させて純粋なIIIを得て、その収量を以下の表6に報告する。画分をTLC(シクロヘキサン:EtOAc、2:1；KMnO4染色による検出)により分析した。スペクトルデータを文献([6]、[7])のスペクトルデータと比較した。
全細胞生体内変換の分析のために、250μLの反応混合物を25μLの2M HClで酸性化し、激しく振盪することによって内部標準として1mMのメチルベンゾエートを含有する250μLのEtOAcで抽出した。相分離は遠心分離(16,000g、4℃、7分)によって行った。有機相をMgSO4で乾燥させ、200μLの抽出物を直接GC-MSまたはGC-FID分析にかけ、それぞれ定性または定量分析した。
反応の収量は、本明細書の以下の表6に報告する。データは三重反応の平均と標準偏差として示されている。

実施例6
6a)輸送体蛋白質AlkLの共発現によるAlkBホモログのクローニングおよび発現
以下のホモログ(a)、(b)、(c))を、Schreweら[1]およびvan Nulandら[2]によって記載されているのと類似の方法で、独立して、広宿主ベクターpCom10_AlkL[3]にクローニングし、ベクターpBTL10を得た:a)P.putida GPo1由来のAlkBと90％のタンパク質配列同一性を有する、シュードモナス・プチダP1由来のAlkB(PpP1_AlkB；受託番号:P12691.1)；b)P. putida GPo1由来のAlkBと78％のタンパク質配列同一性を有する、マリノバクター・ヒドロカーボンクラスチカス(Marinobacter hydrocarbonclasticus)由来のAlkMO (Mh_AlkMO；RCW72391.1)；および、c)P. putida GPo1由来のAlkB(Ab_AlkB1；AB110225.1)と77％の蛋白質配列同一性を有する、アルカニボラックス・ボークメンシス(Alcanivorax borkumensis)由来のAlkB1(PpGPo1_AlkB)。
alkBFG、alkT、および独立して前述の同族体をコードする合成DNA断片をIntegrated DNA Technologiesから入手した。輸送体AlkLをコードする遺伝子をpCom10_AlkLプラスミドから増幅させた。alkBFGTおよびalkT断片を、Thermo Scientific CloneJET PCRクローニングキットを用いてpJET1.2ベクターにサブクローニングした。DNA断片alkBFG、alkLおよびalkTを、FastCloning法[4]を介してpCom10ベクター骨格に挿入し、pBTL10プラスミドを得た。ホモログa)～c)をP. putida GPO1由来のalkB遺伝子を置き換えることによりpBTL10骨格に挿入した。pBTL10_AlkBhomologの正しい集合は、コロニーPCRおよびサンガー配列決定によって確認した。
pBTL10プラスミドを保有するE. coli BL21(DE3)を独立に使用して、文献([1]、[2])に記載されているのと同様の条件下でAlkFGTLおよび前記同族体を発現させた。E. coli BL21(DE3)pCom10_AlkLを空ベクター対照として使用した。菌株は、50μg/mLのカナマイシンを添加したLuna-Bertani(LB)またはM9最少培地(1×M9塩、0.5％グルコース、2mM MgSO4、1ml/LのUSFe微量元素)のいずれかで成長させたて選択した。LB培地5mLに単一コロニーを接種し、30℃で一晩インキュベートし、一定の攪拌(120rpm)を行った。500μLの一晩培養物(ONC)を、100mL振とうフラスコ中の50mLのM9最少培地に移し、培養を再び一晩30℃でインキュベートした。
発現には、100～400mLのM9最少培地に、波長600nmで測定した光学密度(OD600)が0.15になるようにM9-プレカルチャーを接種し、OD600が0.4から0.5に達成するまで30℃で成長させた。0.05％(v/v)のジシクロプロピルケトン(DCPK)を添加し、組換え遺伝子の発現を誘導した。30℃で4時間発現させた後、遠心分離(4400xg、4℃、15分)により細胞を回収した。
6b)4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の全細胞生体内変換および単離
発現および回収の後、3つの改変細胞型の各々を、独立して、OD600が10になるまで静止細胞緩衝液(50mM KPi、pH 7.4、1％グルコース、2mM MgSO4)中に再懸濁した。細胞を5～10分間反応条件に適合させた。次に、生物学的に3連で以下の反応を行った。。
反応は、1.5mLガラスバイアル中で総容量300μLで行った。5mMの基質(イソプレニルアセテート(II)、EtOH中のストック200mM、2.5％(v/v)EtOH)の添加により反応を開始させた。細胞を25℃で24時間、一定の撹拌(180rpm)下で独立にインキュベートした。反応を停止するために、混合物をさらに使用するまで-20℃で保存した。基質変換はGC-MSおよびGC-FIDで分析した。
陰性対照として、E.coli pCom10_AlkLを使用した。AlkFGTLおよびホモログ((a)、(b))またはc))システムの一般活性を確認するために、n-オクタンの1-オクタノールへの変換およびオクタナールおよびオクタン酸へのさらなる過酸化をモデル反応として行った。
NMRスペクトロスコピーにより4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の形成を確認するために、反応を全容量20mLまでスケールアップし、100mL振盪して24時間反応時間を実施した。反応混合物をさらに使用するまで-20℃で保存した。
生成物を、細胞懸濁液から酢酸エチル(EtOAc)で抽出した。有機層をMgSO4で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。粗抽出物をカラムクロマトグラフィー(固定相:シリカ60；溶媒:シクロヘキサン/EtOAc 4:1)にかけ、精製した4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)を得た。化合物IIIを含有する画分の溶媒を蒸発させて純粋なIIIを得て、その収量を以下の表7に報告する。画分をTLC(シクロヘキサン:EtOAc、2:1；KMnO4染色による検出)により分析した。スペクトルデータを文献([6]、[7])のスペクトルデータと比較した。
全細胞生体内変換の分析のために、250μLの反応混合物を25μLの2M HClで酸性化し、激しく振盪することによって内部標準として1mMのメチルベンゾエートを含有する250μLのEtOAcで抽出した。相分離は遠心分離(16,000g、4℃、7分)によって行った。有機相をMgSO4で乾燥させ、200μLの抽出物を直接GC-MSまたはGC-FID分析にかけ、それぞれ定性または定量分析した。
反応の収量は、以下の表7に示す。データは三重反応の平均と標準偏差(SD)として示す。

実施例7:4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールの合成
Jones試薬を用いた化学酸化により前段階の4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の4-アセトキシ-2-メチレン-ブタナール(IV)への変換を達成した。CrO3と濃縮H2SO4からJones試薬を合成した。4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール(III)の粗抽出物(約0.7mmolの(III)を含む615mg)を、磁気撹拌装置を備えた丸底フラスコ中の6mLアセトンに溶解し、氷上に置き、ジョーンズ試薬(0.345ミリモル、0.5％ eq.)を滴下した。反応に続いてTLCを行った。45分後、2-プロパノールの添加により反応を停止させ、反応混合物をまず再蒸留水(ddH2O)で洗浄し、次に、EtOAcで抽出した。有機層を塩水と飽和NaHCO3の混合物(1:2)で2回洗浄し、次に、NaSO4で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、得られた残渣をNMRスペクトロスコピーに供して、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタナール(IV)の生成を確認した。
1H NMR (500 MHz, CDCl3 ): δ 9.51 (s, 1H), 6.31 (s, 1H), 6.07 (s, 1H), 4.15 (t, J= 6.6 Hz, 2H), 2.56 (t, J= 6.5 Hz, 2H), 1.99 (s, 3H) ppm.
実施例8：4-アセトキシ-2-メチレン酪酸(V)の合成
磁気撹拌を備えた10mL丸フラスコ中で、ピリジン(5.7eq.)中の無水酢酸(5.0eq.)を用いて、0℃で一晩、4-ヒドロキシ-2-メチレン酪酸(200mg、1.7ミリモル)をアセチル化した。反応を薄層クロマトグラフィー(TLC)によってモニターした:反応が完了したら、試薬をまず減圧下で蒸発によって除去した。得られた残渣を1M HCl(5mL)で洗浄し、EtOAc(3回、5mL)で抽出した。有機層を一緒にし、50℃の水浴中で減圧下で濃縮した。残った微量の試薬を不活性ガス下で蒸発させることによって除去し、表題化合物(V)を純粋な形態で黄色の粘性油(167mg、収率62％)として得た。表題化合物をNMRスペクトロスコピーに供したところ、その結果は文献に報告されたデータと完全に一致していた。
1H NMR (300 MHz, CDCl3 ): δ 6.37 (s, 1H), 5.73 (s, 1H), 4.23 (t, J= 6.6 Hz, 2H), 2.65 (t, J= 6.6 Hz, 2H), 2.03 (s, 3H) ppm.
実施例9:4-アセトキシ-2-メチレン酪酸のα-メチレン-γ-ブチロラクトン(Tulipalin A)へのラクトン化
10mgの4-アセトキシ-2-メチレン酪酸をHCl(10.0 eq.)に溶解し、再蒸留水を加えて全量1mLとした。反応混合物を80℃および800rpmでインキュベートした。インキュベーションの開始時、3時間後および20時間後に20μLの試料を採取し、それぞれ薄層クロマトグラフィー(TLC)(EtOAc:DCM、3:1)およびGC-FIDによって分析した。したがって、試料を、内部標準(ISTD)として1mMメチルベンゾエートを含有する100μLのEtOAcで抽出し、さらに溶媒で200μLに希釈した。GC-FID分析に先立ち、試料をN,O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(BSTFA、2μL)でシリル化し、そして60℃で1時間インキュベートすることによって誘導体化した。
参考試料
[1] Y. M. van Nuland et al., Appl. Environ. Microbiol. 2016, 82, 3801-3807.
[2] M. Schrewe et al., Advanced Synthesis & Catalysis 2011, 353, 3485-3495.
[3] M. K. Julsing et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78, 5724-5733.
[4] C. Li et al. BMC Biotechnol. 2011, 11, 92.
[5] N. Iranpoor et al., Journal of Sulfur Chemistry 2007, 28, 581-587.
[6] P. Ferraboschi et al. Tetrahedron: Asymmetry 1994, 5, 691-69
[7] Y. Kim et al., Tetrahedron: Asymmetry 2011, 22, 1658-1661.
[8] Koch et al. Applied Environmental Microbiology 2009, 75, 337-344.
前述の説明および実施例を考慮すると、特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく、等価な変更またはそれらの組み合わせを行うことができることは、当業者には明らかであろう。

Claims (23)

  1. α-メチレン-γ-ブチロラクトンを調製する方法であって、
    a)イソプレノールのC1-ヒドロキシル基をアセチル化してイソプレニルアセテートを得る工程；
    b)全細胞生体内変換により前記イソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを形成する工程であって、
    i)細胞(CB)を、該細胞がイソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを形成することを可能にする条件下で、前記イソプレニルアセテートを含有する培養培地、または前記イソプレニルアセテートを含有する有機相に接している培養培地と接触させること；
    ii)場合により、得られた4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを単離すること；を含み、
    ここで、前記細胞(CB)は、イソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールの形成を触媒する少なくとも1つのアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性を示す、工程；
    c)前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを酸化させて4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を生成する工程；および
    d)前記4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を、γ-ヒドロキシ-α-メチレン酪酸へのヒドロキシ分解およびそれに続く前記γ-ヒドロキシ-α-メチレン酪酸の環化により、α-メチレン-γ-ブチロラクトンに変換させる工程、
    を含む方法。
  2. 工程a)の前記イソプレノールが、発酵段階によって得られ、前記段階は、
    発酵性炭水化物を含む発酵培地を提供すること；および
    前記培地に、細菌、カビおよび酵母からなる群から選択される1つまたはそれ以上の微生物の培養物を含む接種材料を導入すること、
    を含み、
    ここで、前記1つまたはそれ以上の微生物は、前記炭水化物を発酵させてイソプレノールを形成することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  3. 工程a)が、イソプレノールを、20～150℃の温度で、酢酸、無水酢酸およびアセチルクロライドからなる群から選択されるアセチル化試薬で処理することを含む、請求項1または2に記載の方法。
  4. 工程a)が、イソプレノールを、アセチル化反応を触媒することができる酵素の存在下で、アセチル化試薬で処理することを含む、請求項1または2に記載の方法。
  5. 前記細胞(CB)が、アルカンモノオキシゲナーゼの遺伝子を、場合によりAlkオペロンの一部として有する、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記細胞(CB)が、シュードモナス・プチダGP01由来のAlkB遺伝子のホモログによってコードされるアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性の増加を示すように遺伝子の組換えがなされているか、または
    前記細胞(CB)が、シュードモナス・プチダGP01由来のAIkBGT遺伝子クラスターによってコードされるアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性の増加を示すように遺伝子の組換えがなされているか、または
    前記細胞(CB)が、シュードモナス・プチダGP01由来のAIkBGTJH遺伝子クラスターによってコードされるアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性の増加を示すように遺伝子の組換えがなされているか、または
    前記細胞(CB)が、シュードモナス・プチダGP01由来のAIkBGTJHL遺伝子クラスターによってコードされるアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性の増加を示すように遺伝子の組換えがなされている、
    請求項1～5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 工程c)が二段階酸化を含み、ここで:
    第一段階において、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールが4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールに酸化され；
    第二段階において、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールが4-アセトキシ-2-メチレン-酪酸に酸化される、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 工程c)が、前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを、クロム酸(H2CrO4)；Na2CrO4；K2CrO4；K2Cr2O7；K2Cr2O7；過マンガン酸塩；およびJones試薬から選択される化学量論的過剰の酸化剤と反応させることにより、前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールの中間単離を行わずに行われる、請求項7に記載の方法。
  9. 工程c)が、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを、好気的条件下で、
    酸化活性を示す少なくとも1つの酵素；
    場合により、酵素の酸化活性を向上させる少なくとも1つの媒介化合物、
    と接触させることを含む酵素的酸化プロセスを特徴とする、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
  10. 工程c)の反応混合物が、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール1kgあたり前記少なくとも1つの酵素0.001～10mgを含む、請求項9に記載の方法。
  11. 工程c)の反応混合物が、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オール1kgあたり前記少なくとも1つの媒介化合物0.001～10mgを含む、請求項9または10に記載の方法。
  12. 工程c)が、全細胞生体内変換により行われ、
    i)細胞(CC)を、該細胞が4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールから4-アセトキシ-2-メチレン-酪酸を形成することを可能にする条件下で、前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを含有する培養培地、または4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを含有する有機相に接している培養培地のいずれかと接触させること；および
    ii)得られた4-アセトキシ-2-メチレン-酪酸を単離すること、
    を含み、
    ここで、前記細胞(CC)は、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素の活性を示す、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記酸化活性を示す少なくとも1つの酵素が、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)；アルコールオキシダーゼ(AlcOx)；アルデヒドデヒドロゲナーゼ(AlDH)；およびラッカーゼからなる群から選択される、請求項9～12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 工程c)が、全細胞生体内変換により行われ、
    i)細胞(CC1)を、該細胞が4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールを形成することを可能にする条件下で、4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを含有する培養培地、または4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを含有する有機相に接している培養培地と接触させること；
    ii)場合により、得られた4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールを単離すること；
    iii)細胞(CC2)を、該細胞が4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールから4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を形成することを可能にする条件下で、前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールを含有する培養培地、または前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-アールを含有する有機相に接している培養培地と接触されること、および
    iv)得られた4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を単離すること、
    を含み、
    ここで、前記細胞(CC1、CC2)はそれぞれ、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素の活性の増加を示す、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記細胞(CC1)が、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、アルコールオキシダーゼ(AlcOx)およびラッカーゼからなる群から選択される、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素の活性の増加を示すように遺伝子の組換えがなされており；
    前記細胞(CC2)が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(AlDH)およびラッカーゼからなる群から選択される、酸化活性を示す少なくとも1つの酵素の活性の増加を示すように遺伝子の組換えがなされている、請求項14に記載の方法。
  16. 前記アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)酵素が、シュードモナス・プチダGP01由来のAlkJ遺伝子のホモログによってコードされ；および／または
    前記アルデヒドデヒドロゲナーゼ(AlDH)酵素が、シュードモナス・プチダGP01由来のAlkH遺伝子のホモログによってコードされる、請求項13または15に記載の方法。
  17. 工程d)が、前記4-アセトキシ-2-メチレン酪酸を30℃～300℃、好ましくは30℃～150℃の温度で酸性条件にかけることを含む、請求項1～16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを調製する方法であって、
    a)イソプレノールのC1-ヒドロキシル基をアセチル化してイソプレニルアセテートを得る工程；
    b)全細胞生体内変換によりイソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを形成する工程であって、
    i)細胞(CB)を、該細胞がイソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを形成することを可能にする条件下で、前記イソプレニルアセテートを含有する培養培地、または前記イソプレニルアセテートを含有する有機相に接している培養培地と接触させること、
    ii)得られた4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを単離すること、
    を含み、
    ここで、前記細胞(CB)は、イソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールの形成を触媒する少なくとも1つのアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性を示す、工程、
    を含む方法。
  19. 2-メチレンブタン-1,2-ジオールを調製する方法であって、
    a)イソプレノールのC1-ヒドロキシル基をアセチル化してイソプレニルアセテートを得る工程；
    b)全細胞生体内変換により前記イソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを形成する工程であって、
    i)細胞(CB)を、該細胞がイソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを形成することを可能にする条件下で、前記イソプレニルアセテートを含有する培養培地、または前記イソプレニルアセテートを含有する有機相に接している培養培地と接触させること；
    ii)得られた4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを単離すること、
    を含み、
    ここで、前記細胞(CB)は、イソプレニルアセテートから4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールの形成を触媒する少なくとも1つのアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性を示す、工程；および
    c)前記4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールを加水分解して2-メチレンブタン-1,2-ジオールを形成する工程、
    を含む方法。
  20. 全細胞生体内変換により式(BII)の化合物から式(BIII)の化合物を調製する方法：
    ［式中、
    nは、0～8の整数であり；
    R1は、C1-C4アルキルであり；
    R2は、HまたはC1-C4アルキルであり；
    R3は、HまたはC1-C4アルキルである］
    であって、
    v)細胞(CB)を、該細胞が前記式(BII)の化合物から前記式(BIII)の化合物を形成することを可能にする条件下で、前記式(BII)の化合物を含有する培養培地、または前記式(BII)の化合物を含有する有機相に接している培養培地と接触させること；および
    vi)得られた式(BIII)の化合物を単離すること、
    を含み、
    ここで、前記細胞(CB)は、前記式(BII)の化合物のCn+3-ヒドロキシル化を触媒する少なくとも1つのアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性を示す、方法。
  21. 前記細胞(CB)が、アルカンモノオキシゲナーゼの遺伝子を、場合によりAlkオペロンの一部として有する、請求項18～20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記細胞(CB)が、シュードモナス・プチダGP01由来のAlkB遺伝子のホモログによってコードされるアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性の増加を示すように遺伝子の組換えがなされているか、または
    前記細胞(CB)が、シュードモナス・プチダGP01由来のAIkBGT遺伝子クラスターによってコードされるアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性の増加を示すように遺伝子の組換えがなされているか、または
    前記細胞(CB)が、シュードモナス・プチダGP01由来のAIkBGTJH遺伝子クラスターによってコードされるアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性の増加を示すように遺伝子の組換えがなされているか、または
    前記細胞(CB)が、シュードモナス・プチダGP01由来のAIkBGTJHL遺伝子クラスターによってコードされるアルカンモノオキシゲナーゼ酵素の活性の増加を示すように遺伝子の組換えがなされている、請求項18～21のいずれか一項に記載の方法。
  23. 2-メチレンブタン-1,2-ジオールの合成のための、請求項18および21～22のいずれか一項に定義される方法に従って得られる4-アセトキシ-2-メチレン-ブタン-1-オールの使用。
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