JP2025506171A - Ｇｐｃ２を標的とする、ｃｄ２８ヒンジおよび膜貫通含有キメラ抗原受容体、ならびにその使用 - Google Patents

Abstract

グリピカン－２（ＧＰＣ２）を標的とし、ＣＤ２８ヒンジ領域およびＣＤ２８膜貫通ドメインを有する、最適化されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が記載される。開示されたＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＧＰＣ２特異的抗体ＣＴ３またはそのヒト化バージョンに由来する。最適化されたＣＡＲは、細胞内共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインもまた含む。最適化されたＣＡＲを発現する免疫細胞または誘導多能性幹細胞は、ＧＰＣ２陽性固形腫瘍、例えば、神経芽腫を処置するために使用され得る。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２２年２月１５日出願の米国仮出願第６３／３１０，４５６号に基づく利益を主張する。

政府支援の声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって授与されたプロジェクト番号Ｚ０１ ＢＣ０１０８９１、ＺＩＡ ＢＣ０１０８９１、Ｚ０１ Ｚ１Ａ ＢＣ０１０７８８、Ｚ１Ａ ＢＣ０１１３３４およびＺＩＡ ＢＣ ０１２０６６の下で政府の支持を得てなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

開示の分野
本開示は、ＣＤ２８に由来するヒンジ領域および膜貫通ドメインを含む、腫瘍抗原グリピカン－２（ＧＰＣ２）に対して特異的な最適化されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。本開示は、例えば、固形腫瘍を処置するための、ＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲの使用にさらに関する。

電子的配列表の組込み
２０２３年１月２６日に作成された、４２３９－１０７４３４－０２．ｘｍｌと命名されたＸＭＬファイル（６３，２５２バイト）として本明細書と共に提出された電子的配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

背景
ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、重要なクラスのがん治療薬として出現し、世界中で活発に開発され試験されている。ＣＤ１９ターゲティングＣＡＲ Ｔ細胞を使用した血液学的がんにおける最初の成功の後、種々のＣＡＲ戦略が、固形腫瘍を処置することを目的として、厳密に操作され、試験されてきた。

グリピカン－２（ＧＰＣ２）は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって細胞表面に結合される、ヘパラン硫酸プロテオグリカンの６メンバーのグリピカンファミリーのうちの１つのメンバーである（Li et al., Trends Cancer 4(11):741-754, 2018）。ＧＰＣ２ ｍＲＮＡおよびタンパク質は、神経芽腫および他の小児がんにおいて上昇する（Orentas et al., Front Oncol 2:194, 2012；Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 114(32):E6623-E6631, 2017；ＷＯ ２０２０／０３３４３０；およびＷＯ ２０１８／０２６５３３）。

神経芽腫は、小児における頭蓋外固形腫瘍の最も一般的な型である。これは、交感神経系の神経内分泌組織に由来し、米国では小児がんの約８～１０％を占める（Maris and Hogarty, Lancet 369:2106-2120, 2007）。神経芽腫は、複雑で不均一な疾患であり、患者のほぼ５０％は、多様な集中処置が使用される場合であっても、がんの広範な播種および不良な長期生存によって特徴付けられる高リスク表現型を有する（Yu et al., New Engl J Med 363:1324-1334, 2010）。標準的な治療を受けている患者のおよそ４５％が、再発を有し、転移性疾患が原因で最終的に死亡する（Matthay et al., New Engl J Med 341:1165-1173, 1999）。このように、神経芽腫の安全かつ有効な処置への緊急かつ満たされていない要求が存在する。

国際公開第２０２０／０３３４３０号 国際公開第２０１８／０２６５３３号

Li et al., Trends Cancer 4(11):741-754, 2018 Orentas et al., Front Oncol 2:194, 2012 Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 114(32):E6623-E6631, 2017 Maris and Hogarty, Lancet 369:2106-2120, 2007 Yu et al., New Engl J Med 363:1324-1334, 2010 Matthay et al., New Engl J Med 341:1165-1173, 1999

要旨
ヒトＣＤ２８に由来するヒンジ領域および膜貫通ドメインを含む、最適化されたＧＰＣ２特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、本明細書で開示される。ＣＤ２８ヒンジおよびＣＤ２８膜貫通ドメインを有するＧＰＣ２特異的ＣＡＲは、驚くべきことに、ＣＤ８に由来するヒンジ領域およびＣＤ８またはＣＤ２８のいずれかに由来する膜貫通（ＴＭ）ドメインを有するＧＰＣ２特異的ＣＡＲと比較して、ＧＰＣ２陽性細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで死滅させ、動物モデルにおいてＧＰＣ２陽性腫瘍を根絶するにあたり、より有効であることが、本明細書で実証される。

ＧＰＣ２に対して特異的な細胞外抗原結合ドメイン；ＣＤ２８ヒンジ領域；ＣＤ２８膜貫通ドメイン；細胞内共刺激ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが、本明細書で提供される。一部の態様では、抗原結合ドメインは、可変重（ＶＨ）ドメインおよび可変軽（ＶＬ）ドメインを含み、ＶＨおよびＶＬドメインは、ＧＰＣ２特異的抗体ＣＴ３またはそのヒト化バージョン（例えば、ｈＣＴ３－１、ｈＣＴ３－２、ｈＣＴ３－３またはｈＣＴ３－４）のＣＤＲ配列を含む。一部の例では、抗原結合ドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にリンカー配列を含み、抗原結合ドメインは、ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向またはＶＬ－リンカー－ＶＨ配向であり得る。

開示されたＣＡＲをコードする核酸分子がさらに提供される。一部の態様では、核酸分子は、５’から３’の方向で、第１の顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体シグナル配列（ＧＭＣＳＦＲｓｓ）をコードする核酸；抗原結合ドメインをコードする核酸；ＣＤ２８ヒンジ領域をコードする核酸；ＣＤ２８膜貫通ドメインをコードする核酸；共刺激ドメインをコードする核酸；シグナル伝達ドメインをコードする核酸；自己切断性２Ａペプチドをコードする核酸；第２のＧＭＣＳＦＲｓｓをコードする核酸；および短縮型ヒト上皮増殖因子受容体（ｈＥＧＦＲｔ）をコードする核酸を含む。一部の例では、核酸分子は、第１のＧＭＣＳＦＲｓｓをコードする核酸の５’側に、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター配列をさらに含む。開示された核酸分子を含むベクター（例えば、レンチウイルスベクター）がさらに提供される。

本明細書で開示されるＣＡＲを発現する、および／または本明細書で開示されるＣＡＲをコードする単離された核酸分子もしくはベクターを含有する、単離された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）もまた、提供される。

薬学的に許容される担体と、本明細書で開示されるＣＡＲ、核酸分子、ベクターまたは細胞とを含む組成物が、さらに提供される。

対象においてＧＰＣ２陽性がんを処置する、またはＧＰＣ２陽性がんの腫瘍成長もしくは転移を阻害する方法もまた、提供される。一部の態様では、これらの方法は、本明細書で開示されるＣＡＲ、核酸分子、ベクター、細胞または組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む。一部の例では、ＧＰＣ２陽性がんは、固形腫瘍、例えば、神経芽腫、髄芽腫または網膜芽細胞腫である。

本開示の上述のおよび他の特色は、添付の図面を参照して進むいくつかの態様の以下の詳細な説明から、より明らかになる。

ＣＡＲ構築物。（図１Ａ）ＣＡＲ構築物ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢｚ、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚおよびＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚの概略図。（図１Ｂ）ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ設計の詳細な概略図。 ＧＰＣ２発現ＩＭＲ５細胞（図２Ａ）およびＧＰＣ２ノックアウト（ＫＯ）ＩＭＲ５細胞（図２Ｂ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞死滅アッセイ。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＩＭＲ５細胞を死滅させるにあたり、ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも強力であった。両方の型のＣＡＲ Ｔ細胞が、ＧＰＣ２－ＫＯ ＩＭＲ５細胞に対して最小限の影響を有し、それらのＧＰＣ２特異性を実証した。 ＩＭＲ５転移モデルにおけるＣＴ３．８Ｈ．ＢＢｚおよびＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の比較。（図３Ａ）実験設計。マウスに、１０００万個のＣＡＲ Ｔ細胞の注入の２８日前に、ＩＭＲ５－ｌｕｃをｉ．ｖ．接種した。マウスを、注入後毎週イメージングした。（図３Ｂ）モックおよびＣＡＲ Ｔ細胞処置したマウスの生物発光画像。（図３Ｃ）ＣＡＲ Ｔ細胞注入の２、４、６および８週間後に測定した生物発光。（図３Ｄ）ＣＡＲ Ｔ細胞注入後の、モックおよびＣＡＲ Ｔ細胞処置したマウスの生存。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、マウスにおいて神経芽腫腫瘍を退縮させるにあたり、ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも有意に強力であった。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ処置群中の全てのマウスが、研究の最後まで生存した。 同上。 同所ＩＭＲ５マウスモデルにおけるＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚおよびＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の比較。（図４Ａ～４Ｃ）３人の異なるヒトドナー：Ａ２６Ｍ（図４Ａ）、Ａ５９Ｆ（図４Ｂ）およびＡ２５Ｆ（図４Ｃ）由来のＴ細胞を使用した。中程度の腫瘍負荷を有するマウスに、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲまたはＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞５００万個を投与した。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、３人全てのドナーについて、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも優れていた。（図４Ｄ～４Ｅ）モック処置したマウスならびにドナーＡ２６Ｍ（図４Ｄ）およびドナーＡ５９Ｆ（図４Ｅ）に由来するＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚまたはＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスの生物発光画像。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、中程度のサイズのＩＭＲ５腫瘍を根絶するにあたり、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも強力であった。（図４Ｆ）フロー試料のゲーティング戦略を示すフローサイトメトリープロット。生細胞を、ＣＤ３＋ヒト細胞についてゲートし、ＣＡＲ陽性細胞のパーセンテージを決定した。（図４Ｇ）ドナーＡ２６ＭおよびＡ５９Ｆについて、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲまたはＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲを発現するＣＤ３＋細胞のパーセンテージを示すグラフ。両方のドナーについて、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも高いレベルのＣＡＲ発現を保持した。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＣＡＲ活性化の尺度としての、ＣＡＲリン酸化の検出。（図５Ａ）ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢｚ、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚおよびＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞を、未刺激としたか、またはプロテインＬもしくはＧＰＣ２－Ｆｃで刺激し、ＣＡＲリン酸化を、ウエスタンブロットによって検出した。（図５Ｂ）ＣＡＲリン酸化における変化倍数を示すグラフ。ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲは、刺激なしで試験した場合、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲよりも高いリン酸化レベルを有した。ＧＰＣ２刺激ありでは、両方のＣＡＲが、それらのリン酸化レベルを上方調節した。これらの結果は、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚが、ＣＡＲ消耗を引き起こすことが公知の、より強壮性のＣＡＲシグナル伝達（リン酸化）を有することを実証している。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、より低い強壮性のＣＡＲシグナル伝達を有するが、抗原提示（ＧＰＣ２－Ｆｃ）により、適切なＣＡＲ活性化を示す。 同所ＩＭＲ５動物モデルにおける低用量または高用量化学療法を用いたＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の比較。大きい腫瘍負荷を有するマウスを、５００万個のＣＡＲ Ｔ細胞の注入前に３日間にわたって、化学療法なし、低用量化学療法または高用量化学療法（フルダラビン／シクロホスファミド）で処置した。（図６Ａ）生物発光によって測定した腫瘍サイズ。（図６Ｂ）化学療法およびＣＡＲ Ｔ細胞注入の１０週間後の腫瘍重量。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚは、高腫瘍負荷マウスにおいて低用量コンディショニング化学療法を与えた場合、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚよりも性能が良かった。 同上。 ヒト化ＣＴ３（ｈＣＴ３）抗体の結合親和性。４つのヒト化ＣＴ３抗体の結合親和性（４．０ｎＭ、３．６ｎＭ、２．５ｎＭおよび３．３ｎＭ）が親ＣＴ３抗体の結合親和性（２．２ｎＭ）と類似であることを実証するグラフのセットが示される。 同上。 ヒト化ＣＴ３抗体は、細胞表面ＧＰＣ２に結合する。４つ全てのヒト化ＣＴ３抗体が、細胞表面ＧＰＣ２に結合する能力を維持することを実証するフローサイトメトリープロットが示される。 ヒト化ＣＴ３ベースのＣＡＲ Ｔ細胞による細胞死滅。グラフは、ＣＴ３－８Ｈ－ＢＢｚ、ｈＣＴ３－１－８Ｈ－ＢＢｚ、ｈＣＴ３－２－８Ｈ－ＢＢｚ、ｈＣＴ３－３－８Ｈ－ＢＢｚおよびｈＣＴ３－４－８Ｈ－ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＧＰＣ２発現ＩＭＲ５細胞の特異的溶解を示す。４つ全てのヒト化ＣＴ３－８Ｈ－ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＴ３－８Ｈ－ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＩＭＲ５細胞に対する改善された死滅活性を示した。 ＧＰＣ２結合ドメインがＶＨ－リンカー－ＶＬ配向（上）またはＶＬ－リンカー－ＶＨ配向（下）を有する、２つのヒト化ＣＴ３－２８Ｈ－ＢＢｚ ＣＡＲ構築物の概略図。 ３つのＧＰＣ２－ＣＡＲ構築物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの比較。（図１１Ａ）可変ヒンジ、ＴＭおよび共刺激ドメインを有する、前臨床研究に使用した３つのＣＡＲ構築物の概要。（図１１Ｂ）腫瘍細胞と共培養して２４時間の時点での、ＧＰＣ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン分泌プロファイル。３つの異なるＧＰＣ２－ＣＡＲで形質導入したヒトＴ細胞を、ＧＰＣ２－ＫＯまたはＧＰＣ２－ＷＴ ＩＭＲ－５腫瘍細胞と共に成長させた。インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）および可溶性Ｆａｓリガンド（ｓＦＡＳＬ）のレベルは、ＧＰＣ２の存在下で有意に増加したが、試験した３つのＣＡＲにわたって同等であった。（図１１Ｃ）休止中のおよびＣＡＲ架橋されたＴ細胞におけるＣＡＲシグナル伝達を実証するためのウエスタンブロット分析。（図１１Ｄ）図１１Ｃからのウエスタンブロットシグナルの密度測定定量化。ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢζは、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζおよびＣＴ３．８Ｈ．ＢＢζについては欠如している、休止時のＣＡＲの顕著な強壮性のシグナル伝達を示す。しかし、抗原特異的ＣＡＲ活性化は、ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢζと比較して、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζにおいてより高いリン酸化レベルを誘導する。 同上。 同上。 ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζは、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＴ３．８Ｈ．ＣＤ２８ＢＢζよりも性能が良い。（図１２Ａ）腫瘍注射の５０日後の腫瘍重量。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζは、全ての治療群にわたって、最も有意な腫瘍退縮を誘導した。（図１２Ｂ）モデル系および実験レジメン。（図１２Ｃ）形質導入なし（ＵＴ）のモックＴ細胞で処置したマウスまたは未処置の対照およびＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスの長期生物発光イメージング（ＢＬＩ）シグナル。毎週のＢＬＩにより、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ－ＣＡＲ Ｔ処置した動物が、研究の持続時間にわたって持続したそれらのＢＬＩシグナルにおける強い減少を実証したことが明らかになった。対照的に、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢζまたはより低い細胞用量のＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ Ｔ細胞の各々で処置したマウスは、一時的な応答を示したが、最終的には進行した。（図１２Ｄ）図１２Ｃからのマウスの生存曲線。（図１２Ｅ）フローサイトメトリー分析による、８０日目の図１２Ｃにおける処置マウスの腫瘍から単離されたＣＡＲ^＋Ｔ細胞の持続。 同上。 同上。 ＧＰＣ２－ＣＡＲ Ｔ細胞製造は、増殖性および細胞傷害性エフェクターＴ細胞を生じる。（図１３Ａ）ＣＡＲ Ｔ製造の８日目の捕捉された免疫細胞の割合。（図１３Ｂ）一様多様体の近似（ＵＭＡＰ）、（図１３Ｃ）ＴｏｔａｌＳｅｑによって検出されたＣＤ８およびＣＤ４タンパク質発現レベル、（図１３Ｄ）クラスターアノテーション、および（図１３Ｅ）ドナー１から製造された細胞のサブセットのフラクション。（図１３Ｆ）ＵＭＡＰ、（図１３Ｇ）ＣＤ８およびＣＤ４タンパク質発現レベル、（図１３Ｈ）クラスターアノテーション、ならびに（図１３Ｉ）ドナー２から製造された細胞のサブセットのフラクション。（図１３Ｊ～１３Ｋ）産生された細胞の発現変動遺伝子（ＤＥＧ）分析。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＧＰＣ２－ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）にホーミングし、細胞傷害性エフェクター集団としてｉｎ ｖｉｖｏで富化する。（図１４Ａ）ＢＬＩを使用するｉｎ ｖｉｖｏでのＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ Ｔ細胞追跡。Ｔ細胞を、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬＵＣ）－ＧＦＰを発現するように形質導入し、ホーミングおよび拡大増殖について連続的にモニタリングした。（図１４Ｂ～１４Ｃ）３つ全てのＣＡＲが、ＵＴモック細胞と比較して、ＴＭＥにおいて富化し拡大増殖する。^＊ｐ＜０．０５；スチューデントｔ検定。（図１４Ｄ～１４Ｅ）ＩＭＲ－５保有マウスは、Ｔ細胞注射を受けた。８日後、腫瘍を単離し、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを実施した。腫瘍および腫瘍に由来する免疫細胞の定量化が示される。（図１４Ｆ～１４Ｇ）腫瘍細胞および５つの免疫サブセットを示すＵＭＡＰプロット。棒グラフは、免疫割合を定量化する。（図１４Ｈ）ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ 対 ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢζ（上パネル）およびＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ 対 ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢζ（下パネル）を比較する、発現変動遺伝子のボルケーノプロット。（図１４Ｉ）機能によってグループ分けし、図１４Ｈにおいて行われた両方の比較から抽出した、発現変動遺伝子。（図１４Ｊ）複合経路分析（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｐａｔｈｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）により、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞が、グランザイムＡ経路を上方調節するが、ミトコンドリアの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）および真核生物開始因子２（ＥＩＦ２）に関連する経路を下方調節することが明らかである。略語：ＣＴＬＡ－４、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４；ｍＴＯＲ、ラパマイシンの哺乳動物標的；ＴＡＭ、腫瘍関連マクロファージ；ｐＤＣ、形質細胞様樹状細胞；ＰＤ－１；プログラム細胞死タンパク質－１；ＰＤ－Ｌ１、プログラム死－リガンド１；ｓｅｑ、配列決定。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＧＰＣ２－ＣＡＲ（ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ） 対 ＧＤ２－ＣＡＲ（Ｋ６６６．２８Ｈ．ＢＢζ）の直接比較。（図１５Ａ）ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζおよびＫ６６６．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の形質導入効率。（図１５Ｂ）変動するＥ：Ｔ比で３つのＮＢ系に対して両方のＣＡＲを試験するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ。^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；二元配置分散分析。（図１５Ｃ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍再チャレンジアッセイ。ＣＡＲ Ｔ細胞を、２４時間毎に再チャレンジした。細胞傷害性活性を、２４時間、９６時間および７日の時点で測定した。^＊ｐ＜０．０５；対応のあるｔ検定。（図１５Ｄ）腫瘍インプランテーションの５０日後の腫瘍重量。^＊ｐ＜０．０５；スチューデントｔ検定。（図１５Ｅ）インプランテーションの５０日後に収集した腫瘍の画像。スケールバー＝１．０ｃｍ。（図１５Ｆ）１つの大腿骨に由来する骨髄細胞のフロー分析。腫瘍細胞は、ｈＣＤ４５^－ｍＣＤ４５^－ＧＤ２^＋ＧＦＰ^＋細胞として同定される。大腿骨１つ当たりの総細胞数がプロットされ、各点は、１匹のマウスを示す。 同上。 同上。 同上。

配列
添付の配列表に列挙された核酸およびアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基についての標準的な文字略号およびアミノ酸についての一文字コードを使用して示される。各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、相補鎖は、示された鎖に対する任意の言及によって含まれると理解される。添付の配列表中：
配列番号１は、ＣＴ３ ＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２は、ＣＴ３ ＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３は、ＣＴ３ ＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４は、ＣＴ３ ＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＣＴ３ ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６は、ＣＴ３ ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
配列番号７は、ｈＣＴ３－１（ＶＨ－ＶＬ）ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号８は、ｈＣＴ３－１（ＶＨ－ＶＬ）ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
配列番号９は、ｈＣＴ３－１（ＶＬ－ＶＨ）ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、ｈＣＴ３－１（ＶＬ－ＶＨ）ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ｈＣＴ３－２（ＶＨ－ＶＬ）ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、ｈＣＴ３－２（ＶＨ－ＶＬ）ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ｈＣＴ３－２（ＶＬ－ＶＨ）ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１４は、ｈＣＴ３－２（ＶＬ－ＶＨ）ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ｈＣＴ３－３（ＶＨ－ＶＬ）ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１６は、ｈＣＴ３－３（ＶＨ－ＶＬ）ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
配列番号１７は、ｈＣＴ３－３（ＶＬ－ＶＨ）ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１８は、ｈＣＴ３－３（ＶＬ－ＶＨ）ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
配列番号１９は、ｈＣＴ３－４（ＶＨ－ＶＬ）ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２０は、ｈＣＴ３－４（ＶＨ－ＶＬ）ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
配列番号２１は、ｈＣＴ３－４（ＶＬ－ＶＨ）ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２２は、ｈＣＴ３－４（ＶＬ－ＶＨ）ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
配列番号２３は、ＣＤ２８ヒンジ領域をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、ＣＤ２８ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号２５は、ＣＤ２８膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２６は、ＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２７は、４－１ＢＢシグナル伝達部分をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２８は、４－１ＢＢシグナル伝達部分のアミノ酸配列である。
配列番号２９は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３０は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３１は、ＧＭＣＳＦＲシグナル配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３２は、ＧＭＣＳＦＲシグナル配列のアミノ酸配列である。
配列番号３３は、Ｔ２Ａ自己切断性ペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３４は、Ｔ２Ａ自己切断性ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３５は、ｈＥＧＦＲｔをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３６は、ｈＥＧＦＲｔのアミノ酸配列である。
配列番号３７は、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ構築物をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３８は、以下の特色を含む、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ構築物のアミノ酸配列である：
残基１～２２ － ＧＭＣＳＦＲシグナル配列
残基２３～２４ － 制限酵素部位
残基２５～２６８ － ＣＴ３ ｓｃＦｖ
残基２６９～２７０ － 制限酵素部位
残基２７１～３０９ － ＣＤ２８ヒンジ
残基３１０～３３６ － ＣＤ２８膜貫通ドメイン
残基３３７～３７８ － ４－１ＢＢ共刺激ドメイン
残基３７９～４９０ － ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
残基４９１～５０８ － Ｔ２Ａ部位
残基５０９～５３０ － ＧＭＣＳＦＲシグナル配列
残基５３１～８６５ － ｈＥＧＦＲｔ
配列番号３９は、以下の特色を含む、ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ構築物のアミノ酸配列である：
残基１～２２ － ＧＭＣＳＦＲシグナル配列
残基２３～２４ － 制限酵素部位
残基２５～２６８ － ＣＴ３ ｓｃＦｖ
残基２６９～２７０ － 制限酵素部位
残基２７１～３１５ － ＣＤ８ヒンジ
残基３１６～３３６ － ＣＤ８膜貫通ドメイン
残基３３７～３７８ － ４－１ＢＢ共刺激ドメイン
残基３７９～４９０ － ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
残基４９１～５０８ － Ｔ２Ａ部位
残基５０９～５３０ － ＧＭＣＳＦＲシグナル配列
残基５３１～８６５ － ｈＥＧＦＲｔ
配列番号４０は、以下の特色を含む、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲ構築物のアミノ酸配列である：
残基１～２２ － ＧＭＣＳＦＲシグナル配列
残基２３～２４ － 制限酵素部位
残基２５～２６８ － ＣＴ３ ｓｃＦｖ
残基２６９～２７０ － 制限酵素部位
残基２７１～３１５ － ＣＤ８ヒンジ
残基３１６～３４２ － ＣＤ２８膜貫通ドメイン
残基３４３～３８３ － ＣＤ２８共刺激ドメイン
残基３８４～４２５ － ４－１ＢＢ共刺激ドメイン
残基４２６～５３７ － ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
残基５３８～５５５ － Ｔ２Ａ部位
残基５５６～５７７ － ＧＭＣＳＦＲシグナル配列
残基５７８～９１２ － ｈＥＧＦＲｔ

詳細な説明
Ｉ． 略語
ＡＬＬ 急性リンパ芽球性白血病
ＡＲＭＳ 胞巣状横紋筋肉腫
ＢＬＩ 生物発光イメージング
ＣＡＲ キメラ抗原受容体
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＣＮＳ 中枢神経系
ＤＲＣＴ 線維形成性小円形細胞腫瘍
Ｅ：Ｔ エフェクター 対 標的
ＥＦ１α 伸長因子１アルファ
ＥＧＦ 上皮増殖因子
ＥＧＦＲ 上皮増殖因子受容体
ＥＲＭＳ 胎児性横紋筋肉腫
ｆｆＬＵＣ ホタルルシフェラーゼ
ＧＰＣ２ グリピカン－２
ＧＭＣＳＦＲｓｓ 顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体シグナル配列
ｈＥＧＦＲｔ ヒト短縮型上皮増殖因子受容体
ｉＰＳＣ 誘導多能性幹細胞
ｉ．ｖ． 静脈内
ＫＯ ノックアウト
ＮＢ 神経芽腫
ＮＫ ナチュラルキラー
ＰＤＸ 患者由来異種移植片
ＲＭＳ 横紋筋肉腫
ｓｃＦｖ 単鎖可変断片
ＴＭ 膜貫通
ＴＭＥ 腫瘍微小環境
ＶＨ 可変重
ＵＴ 形質導入なし
ＶＬ 可変軽
ＷＴ 野生型

ＩＩ． 用語の要約
他に注記しない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における多くの一般的な用語の定義は、Krebs et al. (eds.), Lewin's genes XII, published by Jones & Bartlett Learning, 2017中で見出され得る。本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他を示さない限り、単数形ならびに複数形の両方を指す。例えば、用語「１つの（ａｎ）抗原」は、単数または複数の抗原を含み、語句「少なくとも１つの抗原」と等価とみなされ得る。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられた任意のおよび全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびに全ての分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）または分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ）値は、他に示されない限り、近似であり、記述目的のために提供されることが、さらに理解されるべきである。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な多くの方法および材料が使用され得るが、特定の適切な方法および材料が、本明細書に記載される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定を意図しない。種々の態様の審査を促進するために、用語の以下の説明が提供される：

４－１ＢＢ：Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）で活性化されたリンパ球によって、およびナチュラルキラー細胞が含まれる他の細胞によって発現される、共刺激分子。４－１ＢＢのライゲーションは、サイトカイン産生、抗アポトーシス分子の発現、および増強された免疫応答を生じる、シグナル伝達カスケードを誘導する。４－１ＢＢの例示的なアミノ酸配列は、配列番号２８として本明細書に示される。

急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）：リンパ芽球の過剰産生によって特徴付けられる急性形態の白血病。ＡＬＬは、小児において最も一般的であり、２～５歳でピークに達する。

投与：任意の有効な経路によって、対象に薬剤、例えば、本明細書で提供されるＣＡＲまたはＣＡＲ発現細胞を提供するまたは与えること。例示的な投与経路には、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内、脳室内、頭蓋内、髄内、静脈内、動脈内（肝動脈内が含まれる）、骨内、硝子体内および腫瘍内）、直腸、経皮、鼻腔内、膣および吸入経路が含まれるがこれらに限定されない。一部の例では、投与は、局所的である。一部の例では、投与は、全身性である。

抗体：抗原、例えば、ＧＰＣ２のエピトープを認識し結合する（例えば、特異的に認識し特異的に結合する）少なくとも１つの可変領域を含むポリペプチドリガンド。哺乳動物免疫グロブリン分子は、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖から構成され、その各々は、それぞれ可変重（Ｖ_Ｈ）領域および可変軽（Ｖ_Ｌ）領域と呼ばれる可変領域を有する。一緒になって、Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は、抗体によって認識される抗原への結合を担う。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）の哺乳動物免疫グロブリンが存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ。一部の哺乳動物、例えば、ラクダ、アルパカおよびラマは、軽鎖を欠如する重鎖抗体を有する。哺乳動物において見出されない抗体アイソタイプには、ＩｇＸ、ＩｇＹ、ＩｇＷおよびＩｇＮＡＲが含まれる。ＩｇＹは、鳥類および爬虫類によって産生される主な抗体であり、哺乳動物ＩｇＧおよびＩｇＥと類似した一部の機能性を有する。ＩｇＷおよびＩｇＮＡＲ抗体は、軟骨魚類、例えば、サメによって産生されるが、ＩｇＸ抗体は、両生類において見出される。ＩｇＮＡＲ抗体は、重鎖抗体である。

抗体可変領域は、「フレームワーク」領域と、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」として公知の超可変領域とを含有する。ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合を主に担う。抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを３次元空間に位置付け、並べるように機能する。所与のＣＤＲのアミノ酸配列境界は、Kabat et al. （Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991；「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Chothia et al. （Chothia and Lesk, J Mol Biol 196:901-917, 1987；Chothia et al., Nature 342:877, 1989；およびAl-Lazikani et al., JMB 273,927-948, 1997を参照されたい；「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、Kunik et al. （Kunik et al., PLoS Comput Biol 8:e1002388, 2012；およびKunik et al., Nucleic Acids Res 40:W521-524, 2012を参照されたい；「Ｐａｒａｔｏｍｅ ＣＤＲ」）およびＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（Lefranc, Nucleic Acids Res 29:207-9, 2001を参照されたい；「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）によって記載されるものが含まれる、いくつかの周知の番号付けスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。Ｋａｂａｔ、ＰａｒａｔｏｍｅおよびＩＭＧＴデータベースは、オンラインで維持される。

「単一ドメイン抗体」は、さらなる抗体ドメインの非存在下で抗原または抗原のエピトープに特異的に結合することが可能な、単一のドメイン（可変ドメイン）を有する抗体を指す。単一ドメイン抗体には、例えば、Ｖ_Ｈドメイン抗体、Ｖ_ＮＡＲ抗体、ラクダ科動物Ｖ_ＨＨ抗体およびＶ_Ｌドメイン抗体が含まれる。Ｖ_ＮＡＲ抗体は、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を産生する軟骨魚類、例えば、テンジクザメ（ｎｕｒｓｅ ｓｈａｒｋ）、テンジクザメ（ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ ｓｈａｒｋ）、アブラツノザメおよびバンブーシャーク（ｂａｍｂｏｏ ｓｈａｒｋ）によって産生される。ラクダ科動物Ｖ_ＨＨ抗体は、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカおよびグアナコが含まれるいくつかの種によって産生される。

「モノクローナル抗体」は、リンパ球の単一のクローンによって、または単一の抗体のコード配列がトランスフェクトされた細胞によって、産生される抗体である。モノクローナル抗体は、公知の方法によって産生される。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。

「キメラ抗体」は、１つの種、例えば、ヒト由来のフレームワーク残基と、別の種由来のＣＤＲ（一般に、抗原結合を付与する）とを有する。

「ヒト化」抗体は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（例えば、マウス、ウサギ、ラット、サメ、ラクダまたは合成）免疫グロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲとを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。一態様では、ヒト化免疫グロブリン中の全てのＣＤＲが、ドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合、それらは、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、即ち、少なくとも約８５～９０％、例えば、約９５％またはそれよりも高く同一である。したがって、おそらくはＣＤＲを除くヒト化免疫グロブリンの全ての部分が、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化または他のモノクローナル抗体は、抗原結合に対しても他の免疫グロブリン機能に対しても実質的に影響を有さないさらなる保存的アミノ酸置換を有し得る。

結合親和性：抗原、例えば、ＧＰＣ２に対する、抗体または他の抗原結合性分子の親和性。一態様では、親和性は、Frankel et al., Mol. Immunol., 16:101-106, 1979によって記載されたＳｃａｔｃｈａｒｄ法の改変によって計算される。別の態様では、結合親和性は、抗原／抗体解離速度によって測定される。別の態様では、高い結合親和性は、競合ラジオイムノアッセイによって測定される。別の態様では、結合親和性は、ＥＬＩＳＡによって測定される。一部の態様では、結合親和性は、バイオレイヤー干渉技術に基づくＯｃｔｅｔシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して測定される。他の態様では、Ｋｄは、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＳ－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥＳ－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。他の態様では、抗体親和性は、フローサイトメトリーによって測定される。抗原（例えば、ＧＰＣ２）に「特異的に結合する」抗体またはＣＡＲは、高い親和性で抗原に結合するが、他の無関係の抗原には有意には結合しない抗体またはＣＡＲである。

化学療法剤：異常な細胞成長によって特徴付けられる疾患の処置において治療有用性を有する任意の化学的薬剤。かかる疾患には、腫瘍、新生物およびがんが含まれる。一態様では、化学療法剤は、ＧＰＣ２陽性腫瘍を処置する際に使用される薬剤である。一態様では、化学療法剤は、放射性化合物である。本明細書で提供される方法で使用され得る例示的な化学療法剤は、Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition；Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2^nd ed.,(C)2000 Churchill Livingstone, Inc；Baltzer, L., Berkery, R. (eds.): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995；Fischer, D.S., Knobf, M.F., Durivage, H.J. (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993)に開示されている。一例では、化学療法剤は、生物製剤、例えば、治療的抗体（例えば、治療的モノクローナル抗体）、例えば、抗ＧＰＣ２抗体、ならびに他の抗がん抗体、例えば、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤＬ１（例えば、ペムブロリズマブおよびニボルマブ）、抗ＣＴＬＡ４（例えば、イピリムマブ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブ）、抗ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ）、またはそれらの組合せ（例えば、抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４）である。組合せ化学療法は、がんを処置するための１つよりも多くの薬剤の投与である。一例は、放射性、生物学的もしくは化学的化合物、またはそれらの組合せと組み合わせて使用される、ＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ発現免疫細胞の投与である。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：抗原結合性部分、例えば、単一ドメイン抗体（例えば、Ｖ_ＮＡＲ、Ｖ_ＨＨまたはＶ_Ｈ）またはｓｃＦｖと、シグナル伝達ドメイン、例えば、Ｔ細胞受容体由来のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）とを含むキメラ分子。多くの例では、ＣＡＲは、抗原結合性部分、ヒンジ領域、膜貫通ドメインおよびエンドドメイン（ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ）を含む。エンドドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有するシグナル伝達鎖、例えば、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγを含み得る。一部の例では、エンドドメインは、少なくとも１つのさらなる共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ＭＹＤ８８－ＣＤ４０、ＫＩＲ２ＤＳ２および／またはＤＡＰ１０の細胞内部分をさらに含む。一部の例では、ＣＡＲは、多重特異性（例えば、二重特異性）またはバイシストロニックである。多重特異性ＣＡＲは、異なる抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープに各々結合する少なくとも２つの抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖおよび／または単一ドメイン抗体）から構成される単一のＣＡＲ分子である（例えば、米国特許出願公開第２０１８／０２３０２２５号を参照されたい）。例えば、二重特異性ＣＡＲは、異なる抗原に各々結合する２つの抗原結合ドメインを有する単一のＣＡＲ分子を指す。バイシストロニックＣＡＲは、異なる抗原に結合する抗原結合性部分を各々が含有する２つの完全なＣＡＲ分子を指す。一部の例では、バイシストロニックＣＡＲ構築物は、切断リンカーによって連結された２つの完全なＣＡＲ分子を発現する。二重特異性またはバイシストロニックＣＡＲを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）またはｉＰＳＣは、結合性部分がそれに対して指向される抗原の両方を発現する細胞に結合することができる（例えば、Qin et al., Blood 130:810, 2017；およびＷＯ／２０１８／２１３３３７を参照されたい）。一部の態様では、ＣＡＲは、Xu et al. (Cell Discovery 4:62, 2018)に記載される２つが繋がれた（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎｅｄ）抗体－Ｔ細胞受容体（ＡｂＴＣＲ）、またはLiu et al. (Sci Transl Med 13(586):eabb5191, 2021)によって記載される合成Ｔ細胞受容体および抗原受容体（ＳＴＡＲ）である。

相補性決定領域（ＣＤＲ）：抗体の結合親和性および特異性を定義する超可変アミノ酸配列の領域。哺乳動物免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は各々、それぞれＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３およびＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲを有する。単一ドメイン抗体は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含有する。

保存的バリアント：本開示の文脈では、「保存的」アミノ酸置換は、タンパク質、例えば、抗体の、ＧＰＣ２への親和性に実質的に影響しないまたはそれを減少させない置換である。一例として、ＧＰＣ２に特異的に結合するモノクローナル抗体は、多くても約１個、多くても約２個、多くても約５個、多くても約１０個、多くても約１５個、多くても約２０個または多くても約２５個の保存的置換を含み得、ＧＰＣ２ポリペプチドに特異的に結合し得る。用語「保存的バリアント」は、そのバリアントが活性を保持することを条件とした、置換されていない親アミノ酸の代わりの、置換されたアミノ酸の使用もまた含む。非保存的置換は、タンパク質の活性（例えば、親和性）を低減させる置換である。

機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換表は、周知である。以下の６つの群は、互いに保存的置換とみなされるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

本明細書の一部の態様では、本明細書で開示される任意のアミノ酸配列と比較して１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列が提供される。

接触させる：直接的な物理的関連状態に置くこと；固体形態および液体形態の両方が含まれる。

縮重バリアント：遺伝子コードの結果として縮重している配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。２０種の天然のアミノ酸が存在し、そのほとんどは、１つよりも多くのコドンによって特定される。したがって、ポリペプチドのアミノ酸配列が未変化である限り、全ての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。

線維形成性小円形細胞腫瘍（ＤＲＣＴ）：小児、特に少年において優勢に生じる軟部組織肉腫。ＤＲＣＴは、腹部において塊として主に生じる、高悪性度の稀な型のがんであるが、リンパ節、腹部の内層、横隔膜、脾臓、肝臓、胸壁、頭蓋、脊髄、腸、膀胱、脳、肺、精巣、卵巣および骨盤においても見出され得る。

エピトープ：抗原決定基。これらは、抗原性である（特異的免疫応答を惹起する）、分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、ポリペプチド上の特定の抗原性エピトープに特異的に結合する。

フレームワーク領域：ＣＤＲ間に差し挟まれたアミノ酸配列。フレームワーク領域には、可変軽および可変重フレームワーク領域が含まれる。フレームワーク領域は、抗原結合に適切な配向でＣＤＲを保持するように機能する。

神経膠腫：脳および脊髄において生じる腫瘍の一形態。神経膠腫は、アストロサイト、乏突起膠細胞および上衣細胞が含まれる、脳においてニューロンを取り囲み支持するグリア細胞に起源する。腫瘍がそこから生じる細胞の型に基づいて、３つのクラスの神経膠腫が存在する：アストロサイトーマ、上衣腫および乏突起神経膠腫。

グリピカン－２（ＧＰＣ２）：ＧＰＩアンカーによって細胞表面に結合される、ヘパラン硫酸（ＨＳ）プロテオグリカンの６メンバーのグリピカンファミリーのメンバー（Li et al., Trends Cancer 4(11):741-754, 2018）。ＧＰＣ２ ｍＲＮＡは、神経芽腫および他の小児がんにおいて高度に発現される（Orentas et al., Front Oncol 2:194, 2012）。ＧＰＣ２タンパク質は、神経芽腫症例の約半分において高度に発現され、高いＧＰＣ２発現は、低いＧＰＣ２発現を有する患者と比較して、不良な全生存期間と相関する（Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 114(32):E6623-E6631, 2017）。ＧＰＣ２は、セレブログリカン（ｃｅｒｅｂｒｏｇｌｙｃａｎ）プロテオグリカンおよびグリピカンプロテオグリカン２としても公知である。ＧＰＣ２のゲノム、ｍＲＮＡおよびタンパク質配列は、公に入手可能である（例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ２２１９１４を参照されたい）。

ＧＰＣ２陽性がん：ＧＰＣ２を発現または過剰発現するがん。ＧＰＣ２陽性がんの例には、神経芽腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、急性リンパ芽球性白血病、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、神経膠腫および骨肉腫が含まれるがこれらに限定されない。

異種：別々の遺伝的供給源または種に起源すること。

宿主細胞：ベクターがその中に伝播され得、そのＤＮＡが発現され得る、細胞。細胞は、原核生物または真核生物であり得る。一部の例では、原核生物細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。一部の例では、真核生物細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞である。この用語は、対象宿主細胞の任意の子孫もまた含む。複製の間に起こる変異が存在し得るので、全ての子孫が親細胞と同一なわけではない可能性があることが理解される。しかし、用語「宿主細胞」が使用される場合、かかる子孫が含まれる。

免疫応答：刺激に対する、免疫系の細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞または単球の応答。一態様では、応答は、特定の抗原に対して特異的である（「抗原特異的応答」）。一態様では、免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えば、ＣＤ４^＋応答またはＣＤ８^＋応答である。別の態様では、応答は、Ｂ細胞応答であり、特異的抗体の産生を生じる。

単離された：「単離された」生物学的成分、例えば、核酸、タンパク質（抗体が含まれる）またはオルガネラは、その成分が存在する環境（例えば、細胞）中の他の生物学的成分、例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびにオルガネラから、実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸およびタンパク質もまた包含する。

標識：別の分子の検出を促進するために、その分子、例えば、抗体またはタンパク質に直接的または間接的にコンジュゲートされる、検出可能な化合物または組成物。標識の具体的な非限定的な例には、蛍光タグ、酵素的連結および放射性同位体が含まれる。一例では、「標識された抗体」は、抗体中への別の分子の取込みを指す。例えば、標識は、検出可能なマーカー、例えば、放射性標識されたアミノ酸の取込み、または特徴的なアビジン（例えば、蛍光マーカーまたは光学的もしくは比色的な方法によって検出され得る酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分の、ポリペプチドへの結合である。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法が公知であり、使用され得る。ポリペプチドのための標識の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：ラジオアイソトープまたは放射性核種（例えば、^３５Ｓ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^９９ｍＴｃ、^１３１Ｉ、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎおよび^１２５Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素的標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）または磁気剤、例えば、ガドリニウムキレート。一部の態様では、標識は、潜在的な立体障害を低減させるために、種々の長さのスペーサーアームによって結合される。

リンカー：一部の例では、リンカーは、可変重鎖を可変軽鎖に間接的に結合させるように機能する、抗体結合性断片（例えば、ｓｃＦｖ断片）内のペプチドである。本明細書の一部の態様では、開示されたｓｃＦｖは、抗原結合ドメインのＶＨドメインとＶＬドメインとを接続する、異なる長さの（Ｇ_４Ｓ）_３リンカーを含む。「リンカー」は、ターゲティング部分、例えば、抗体をエフェクター分子、例えば、細胞毒または検出可能な標識に連結するように機能するペプチドもまた指し得る。用語「コンジュゲートする」、「接続する」、「結合させる」または「連結する」は、２つのポリペプチドを１つの連続するポリペプチド分子にすること、または放射性核種もしくは他の分子をポリペプチド、例えば、ｓｃＦｖに共有結合させることを指す。特定の文脈では、これらの用語は、リガンド、例えば、抗体部分をエフェクター分子に接続することに対する言及を含む。連結は、化学的または組換え手段のいずれかによるものであり得る。「化学的手段」は、２つの分子の間に形成された共有結合が存在し、１つの分子を形成するような、抗体部分とエフェクター分子との間での反応を指す。

哺乳動物：この用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、用語「対象」は、ヒトおよび獣医対象、例えば、マウス、ラット、ウシ、ネコ、イヌ、ブタおよび非ヒト霊長類、の両方を含む。

髄芽腫：小脳において形成する、急激に成長する型のがん。髄芽腫は、脳脊髄液を介して脊髄にまたは脳の他の部分に広がる傾向がある。髄芽腫は、身体の他の部分にも広がり得るが、これは稀である。髄芽腫は、小児および若い成人において最も一般的である。髄芽腫は、中枢神経系胎児性腫瘍の一形態である。

新生物、悪性腫瘍、がんまたは腫瘍：新生物は、過剰な細胞分裂から生じる組織または細胞の異常な成長である。新生物成長は、腫瘍を生じ得る。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積または重量として測定され得る「腫瘍負荷」である。転移しない腫瘍は、「良性」と呼ばれる。周囲の組織に浸潤するおよび／または転移できる腫瘍は、「悪性」と呼ばれる。

神経芽腫：胚性神経堤細胞から生じる固形腫瘍。神経芽腫は一般に、副腎中およびその周囲で生じるが、交感神経組織が見出される場所ならどこでも、例えば、腹部、胸部、頸部、または脊椎近傍の神経組織において生じ得る。神経芽腫は、典型的には、５歳よりも若い小児において生じる。

作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関連して配置される場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、連続しており、必要に応じて、２つのタンパク質コード領域を同じリーディングフレームで接続する。

骨肉腫：骨において見出されるがん性腫瘍の一形態。骨肉腫は、間葉系起源の原始的な形質転換した細胞から生じる高悪性度のがんである。この型のがんは、小児および若い成人において最も高頻度である。

小児がん：０～１４歳の小児において発症するがん。主要な型の小児がんには、例えば、神経芽腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、胎児性横紋筋肉腫（ＥＲＭＳ）、胞巣状横紋筋肉腫（ＡＲＭＳ）、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍（ＤＲＣＴ）、骨肉腫、脳および他のＣＮＳ腫瘍（例えば、髄芽腫）、ウィルムス腫瘍、非ホジキンリンパ腫ならびに網膜芽細胞腫が含まれる。

薬学的に許容される担体：使用される薬学的に許容される担体は、従来のものである。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd ed., London, UK: Pharmaceutical Press, 2013は、本明細書で開示されるＣＡＲ発現細胞および他の組成物の薬学的送達に適切な組成物および製剤を記載している。担体の性質は、使用されている特定の投与様式に依存し得る。例えば、非経口製剤は通常、薬学的および薬理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどをビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤またはカプセル形態）について、従来の非毒性固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。

疾患を予防する、処置するまたは寛解させる：疾患を「予防する」は、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置する」は、それが発症し始めた後に、疾患または病理学的状態の徴候または症状を寛解させる治療介入、例えば、腫瘍負荷における低減、または転移の数もしくはサイズにおける減少を指す。「寛解させる」は、疾患、例えば、がんの徴候または症状の数または重症度における低減を指す。

精製された：精製されたという用語は、絶対的な純度を要求しない；むしろ、相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製されたペプチド調製物は、ペプチドまたはタンパク質が、そのペプチドまたはタンパク質が細胞内のその天然の環境中にあったときよりも富化されている、調製物である。同様に、精製された細胞は、その細胞が対象内のその天然の環境中にあったときよりも富化されている、またはその細胞が他の細胞型を実質的に含まない、細胞である。一態様では、調製物は、タンパク質またはペプチドが、調製物の総ペプチドまたはタンパク質含量の少なくとも５０％を占めるように、精製される。実質的な精製は、他のタンパク質または細胞成分からの精製を意味する。実質的に精製されたタンパク質は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％純粋である。したがって、１つの具体的な非限定的な例では、実質的に精製されたタンパク質は、少なくとも９０％が他のタンパク質も細胞成分も含まない。実質的に精製された細胞（例えば、本明細書で提供されるＣＡＲを発現する細胞）は、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％純粋であり得る。したがって、１つの具体的な非限定的な例では、本明細書で提供されるＣＡＲを発現する実質的に精製された細胞は、少なくとも９９％が他の細胞（例えば、本明細書で提供されるＣＡＲを発現しない他の免疫細胞または他の細胞）も細胞成分も含まない。

組換え：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有する、または配列の２つのさもなくば分離されていたセグメントの人工的な組合せによって作製される配列を有する、核酸である。この人工的な組合せは、化学的合成によって、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子操作技法によって、達成される場合が多い。

網膜芽細胞腫：網膜の組織中で形成するがんの一形態。網膜芽細胞腫は通常、５歳よりも若い小児において生じる。網膜芽細胞腫は、遺伝性または非遺伝性（孤発性）であり得る。

横紋筋肉腫（ＲＭＳ）：骨格筋起源の軟部組織悪性腫瘍。横紋筋肉腫の最も一般的な原発部位は、頭頸部（例えば、傍髄膜、眼窩、咽頭など）、泌尿生殖器および四肢である。他のあまり一般的でない原発部位には、体幹、胸壁、腹部（後腹膜および胆道が含まれる）および会陰／肛門領域が含まれる。少なくとも２つの型のＲＭＳが存在する；最も一般的な形態は、胞巣状ＲＭＳ（ＡＲＭＳ）および胎児性組織学的ＲＭＳ（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ＲＭＳ）（ＥＲＭＳ）である。横紋筋肉腫を有する小児のおよそ２０％は、ＡＲＭＳサブタイプを有する。このサブタイプの増加した頻度は、思春期において、ならびに四肢、体幹および会陰／肛門周囲領域が関与する原発部位を有する患者において、認められる。ＡＲＭＳは、第１３染色体上のＦＫＨＲとＰＡＸファミリーのメンバーとが関与する融合遺伝子をコードする染色体転座に関連する。胎児性サブタイプは、小児において最も頻繁に観察されるサブタイプであり、小児の横紋筋肉腫のおよそ６０～７０％を占める。胎児性組織学を有する腫瘍は、典型的には、頭頸部領域または泌尿生殖器において生じるが、いずれの原発部位でも生じ得る。ＥＲＭＳは、診断時のより若い年齢、ヘテロ接合性の喪失、および変更されたゲノムインプリンティングによって特徴付けられる。

試料（または生物学的試料）：対象から得られた、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡが含まれる）、タンパク質、またはそれらの組合せを含有する生物学的検体。例には、末梢血、組織、細胞、尿、唾液、組織生検、微細針吸引物、外科的検体および剖検材料が含まれるがこれらに限定されない。一例では、試料には、腫瘍生検、例えば、腫瘍組織生検が含まれる。

配列同一性：アミノ酸または核酸配列間の類似性は、配列間の類似性の観点から表現され、さもなくば、配列同一性と呼ばれる。配列同一性は、パーセンテージ同一性（または類似性もしくは相同性）の観点で頻繁に測定される；パーセンテージが高くなるほど、２つの配列はより類似している。ポリペプチドまたは核酸分子のホモログまたはバリアントは、標準的な方法を使用してアラインした場合、比較的高い程度の配列同一性を有する。

比較のための配列のアラインメントの方法は、公知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、以下に記載されている：Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988；Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988；Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989；Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988;およびPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988。Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994は、配列アラインメント法および相同性計算の詳細な検討を示している。

ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと併せた使用のために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）が含まれるいくつかの供給源から、およびインターネット上で、入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の記載は、インターネット上でＮＣＢＩウェブサイト上で入手可能である。

ＧＰＣ２に特異的に結合する抗体またはＣＡＲのホモログおよびバリアントは、典型的には、デフォルトパラメーターに設定したＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ２．０、ギャップありｂｌａｓｔｐを使用して、抗体またはＣＡＲのアミノ酸配列との全長アラインメントにわたって計数した、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性の保有によって特徴付けられる。約３０アミノ酸よりも大きいアミノ酸配列の比較のためには、Ｂｌａｓｔ ２配列関数が、デフォルトパラメーター（１１のギャップ存在コストおよび１のパーレジデューギャップコスト（ｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ））に設定したデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して使用される。短いペプチド（おおよそ３０アミノ酸よりも小さい）をアラインする場合、アラインメントは、デフォルトパラメーター（オープンギャップ９、伸長ギャップ１ペナルティ）に設定したＰＡＭ３０マトリックスを使用して、Ｂｌａｓｔ ２配列関数を使用して実施されるべきである。参照配列とさらに高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合、増加するパーセンテージ同一性、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示す。全体未満の配列が配列同一性について比較されている場合、ホモログおよびバリアントは、典型的には、１０～２０アミノ酸の短いウインドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、参照配列とのそれらの類似性に依存して、少なくとも８５％または少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有し得る。かかる短いウインドウにわたって配列同一性を決定するための方法は、インターネット上でＮＣＢＩウェブサイトにおいて入手可能である。これらの配列同一性の範囲は、ガイダンスのためだけに提供されている；提供された範囲の外側に入る強く重要なホモログが得られ得ることも完全に可能である。

対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物、例えば、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコおよび非ヒト霊長類が含まれる、ヒトおよび獣医対象の両方を含むカテゴリーである、生きた多細胞脊椎動物生物。

合成：実験室において人工的な手段によって産生されること、例えば、合成核酸またはタンパク質（例えば、抗体）は、実験室において化学的に合成され得る。

治療有効量：処置されている対象において所望の効果を達成するのに十分な、特定の物質の量。例えば、これは、腫瘍の成長を阻害または抑制するのに必要な量であり得る。一態様では、治療有効量は、腫瘍を排除する、腫瘍のサイズを低減させる、または腫瘍の転移を予防する、例えば、処置前のサイズ／体積／数と例えば比較して、腫瘍サイズおよび／もしくは体積を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくはさらには１００％低減させる、および／または転移の数および／もしくはサイズ／体積を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくはさらには１００％低減させるのに必要な量である。対象に投与される場合、所望のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を達成することが示されている標的組織濃度（例えば、腫瘍中）を達成する投薬量が、一般に使用される。

ベクター：宿主細胞中に導入され、それによって、形質転換された宿主細胞を産生する、核酸分子。ベクターは、宿主細胞におけるその複製を可能にする核酸配列、例えば、複製起点を含み得る。ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝子エレメントもまた含み得る。一部の例では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

ＩＩＩ． いくつかの態様の概観
ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、世界中で活発に開発され試験されている新たなクラスのがん治療薬である。ＣＤ１９ターゲティングＣＡＲ Ｔ細胞を使用した血液学的がんにおける最初の成功の後、種々のＣＡＲ戦略が、固形腫瘍を処置することを目的として、操作され、試験されてきた。しかし、固形腫瘍におけるＣＡＲ Ｔ細胞の成功は、腫瘍特異的抗原の不足、ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍部位において効率的に拡大増殖することができないこと、および不均一な抗原発現が含まれるいくつかの障壁によって制限されてきた（Kochenderfer et al., Blood. 2012;119(12):2709-2720；Porter et al., N Eng J Med 2011;365(8):725-733；Jiang et al., Front Immunol 2017;7:690；Gao et al., Clin Cancer Res 2014;20(24):6418-6428；Ishiguro et al., Cancer Res 2008;68(23):9832-9838；Losic et al., Nat Commun 2020;11(1):291；Li et al., Gastroenterology 158(8):2250-2265, 2020；Li et al., Cell Rep Med 2(6):100297, 2021）。

本開示は、これらの課題に対処し、ＧＰＣ２陽性腫瘍を処置するためのＣＡＲ発現細胞の有効性を改善する。本明細書で開示される操作されたＣＡＲは、ＧＰＣ２特異的抗体ＣＴ３（参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０２０／０３３４３０）またはそのヒト化バージョンに由来する抗原結合ドメインを含む。ＣＤ２８ヒンジ領域およびＣＤ２８膜貫通ドメインを含有するＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲを発現する免疫細胞は、ＣＤ８ヒンジ領域およびＣＤ８またはＣＤ２８のいずれかの膜貫通ドメインを含有するＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲと比較して、ＧＰＣ２陽性腫瘍を死滅させるにあたり有意に強力であることが、本明細書で開示される。さらに、同所神経芽腫モデルを使用して、ＣＤ２８ヒンジおよび膜貫通ドメインを有するＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲを発現する免疫細胞が、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインを有するＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲと比較して、ＧＰＣ２陽性腫瘍細胞に対して優れた拡大増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで示し、より高いレベルの腫瘍浸潤ＣＡＲ＋Ｔ細胞を生じ、増加した生存をもたらしたことが実証された。さらに、ＣＤ２８ヒンジおよび膜貫通ドメインを有するＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲを発現する免疫細胞は、神経芽腫に対する既存のＣＡＲ Ｔ細胞療法と比較して、神経芽腫モデルにおいて優れた抗腫瘍活性を示した。

ＧＰＣ２に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメイン；ＣＤ２８ヒンジ領域；ＣＤ２８膜貫通ドメイン；細胞内共刺激ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが、本明細書で提供される。一部の態様では、ＧＰＣ２特異的抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。ｓｃＦｖは、ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨの、Ｎ末端からＣ末端への配向を有し得る。

一部の態様では、抗原結合ドメインは、可変重（ＶＨ）ドメインおよび可変軽（ＶＬ）ドメインを含み、ＶＨドメインは、配列番号２（ＣＴ３ ＶＨドメイン配列）の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、ならびに／またはＶＬドメインは、配列番号４（ＣＴ３ ＶＬドメイン配列）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。一部の例では、ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴもしくはＰａｒａｔｏｍｅ番号付けスキーム、またはＫａｂａｔ、ＩＭＧＴおよびＰａｒａｔｏｍｅ番号付けスキームの組合せを使用して定義される。他の例では、ＣＤＲ配列は、異なる番号付けスキーム、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａを使用して決定される。

一部の態様では、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号２の残基３１～３５、５０～６６および９９～１１２を含み、ならびに／またはＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４の残基２４～３３、４９～５５および８８～９６を含む；ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号２の残基２６～３３、５１～５８および９７～１１２を含み、ならびに／またはＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４の残基２７～３１、４９～５１および８８～９６を含む；ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号２の残基２６～３５、４７～６１および９７～１１２を含み、ならびに／またはＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４の残基２７～３３、４５～５５および８８～９５を含む；あるいはＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号２の残基２６～３５、４７～６６および９７～１１２を含み、ならびに／またはＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４の残基２４～３３、４５～５５および８８～９６を含む。一部の例では、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である（配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む）および／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である（配列番号４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む）。

一部の態様では、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの配列は、ヒト化されている。一部の例では、ヒト化ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号８の残基１～１２３を含み、および／またはヒト化ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号８の残基１３９～２４４を含む；ヒト化ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２の残基１～１２２を含み、および／またはヒト化ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２の残基１３８～２４３を含む；ヒト化ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１６の残基１～１２２を含み、および／またはヒト化ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１６の残基１３８～２４４を含む；あるいはヒト化ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号２０の残基１～１２２を含み、および／またはヒト化ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号２０の残基１３８～２４３を含む。

一部の態様では、細胞外抗原結合ドメインのアミノ酸配列は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。一部の例では、抗原結合ドメインのアミノ酸配列は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。

一部の態様では、ＣＤ２８ヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。一部の例では、ＣＤ２８ヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。

一部の態様では、ＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。一部の例では、ＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。

一部の態様では、共刺激ドメインには、４－１ＢＢシグナル伝達部分が含まれる。一部の例では、４－１ＢＢシグナル伝達部分のアミノ酸配列は、配列番号２８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。具体的な例では、４－１ＢＢシグナル伝達部分のアミノ酸配列は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。

一部の態様では、シグナル伝達ドメインには、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが含まれる。一部の例では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。具体的な例では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３０を含むまたはそれからなる。

特定の態様では、ＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。具体的な例では、ＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号３８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。

代替的な態様では、ＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号３９または配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。具体的な例では、ＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号３９または配列番号４０のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。

本明細書で開示されるＣＡＲをコードする核酸分子が、本明細書でさらに提供される。一部の態様では、この核酸分子の配列は、配列番号３７のヌクレオチド７３～１４７０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。一部の例では、核酸分子の配列は、配列番号３７のヌクレオチド７３～１４７０を含むまたはそれからなる。具体的な非限定的な例では、核酸分子の配列は、配列番号３７を含むまたはそれからなる。

一部の態様では、核酸分子は、プロモーター（例えば、誘導性または構成的プロモーター）に作動可能に連結される。一部の例では、プロモーターは、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターである。

一部の態様では、核酸分子は、５’から３’の方向で、第１の顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体シグナル配列（ＧＭＣＳＦＲｓｓ）をコードする核酸；抗原結合ドメインをコードする核酸；ＣＤ２８ヒンジ領域をコードする核酸；ＣＤ２８膜貫通ドメインをコードする核酸；共刺激ドメインをコードする核酸；シグナル伝達ドメインをコードする核酸；自己切断性２Ａペプチドをコードする核酸；第２のＧＭＣＳＦＲｓｓをコードする核酸；および短縮型ヒト上皮増殖因子受容体（ｈＥＧＦＲｔ）をコードする核酸を含む。一部の例では、核酸分子は、第１のＧＭＣＳＦＲｓｓをコードする核酸の５’側に、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター配列をさらに含む（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ ２０１９／０９４４８２を参照されたい）。

本明細書で開示される核酸分子を含むベクターがさらに提供される。一部の例では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである。

本明細書で開示されるＣＡＲをコードする核酸分子（またはベクター）を含むおよび／または本明細書で開示されるＣＡＲを発現する単離された細胞もまた提供される。一部の態様では、細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージである。他の態様では、細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

薬学的に許容される担体（例えば、水または食塩水）と、本明細書で開示されるＣＡＲ、核酸分子、ベクターまたは細胞とを含む組成物が、さらに提供される。一部の例では、組成物は、凍結される。一部の例では、組成物は凍結され、細胞およびＤＭＳＯまたは別の凍結保護剤を含む。一部の例では、組成物は、凍結乾燥される。一部の例では、かかる組成物は、バイアル、例えば、ガラスまたはプラスチックバイアル中にある。開示された組成物は、キット、例えば、１つまたは複数の化学療法剤、シリンジ、細胞培養培地、薬学的に許容される担体またはそれらの組合せを含むキットの一部であり得る（キット中のさらなる薬剤は、別々の容器中にあり得る）。

対象においてＧＰＣ２陽性がんを処置する、またはＧＰＣ２陽性がんの腫瘍成長もしくは転移を阻害する方法もまた提供される。一部の態様では、これらの方法は、本明細書で開示されるＣＡＲ、核酸分子、ベクター、細胞または組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む。一部の例では、ＧＰＣ２陽性がんは、固形腫瘍である。一部の例では、ＧＰＣ２陽性がんは、小児がんである。特定の非限定的な例では、ＧＰＣ２陽性がんは、神経芽腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、急性リンパ芽球性白血病、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、神経膠腫または骨肉腫である。具体的な例では、ＧＰＣ２陽性がんは、神経芽腫である。一部の例では、これらの方法は、コンディショニング化学療法、例えば、フルダラビンおよびシクロホスファミドを対象に投与するステップをさらに含む。

ＩＶ． ＧＰＣ２特異的抗体配列
本明細書で開示されるＣＡＲは、ＧＰＣ２に特異的に結合する抗体（またはその抗原結合性断片）を含む。一部の態様では、抗体は、ｓｃＦｖ形式での、ＣＴ３マウスモノクローナル抗体、またはそのヒト化バージョン（例えば、ｈＣＴ３－１、ｈＣＴ３－２、ｈＣＴ３－３またはｈＣＴ３－４）である。これらの抗体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０２０／０３３４３０に記載されている。ＣＴ３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、以下に提供される。表１および２は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｐａｒａｔｏｍｅおよびそれらの組合せを使用して決定される、それぞれＶＨドメインおよびＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸位置を列挙している。ＣＤＲ境界は、代替的番号付けスキーム、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームを使用して定義することもできる。親ＣＴ３抗体、ならびに４つのそのヒト化バージョンのｓｃＦｖヌクレオチドおよびアミノ酸配列もまた、以下に列挙される。各ｓｃＦｖ配列において、ＶＨドメインとＶＬドメインとは、太字で示される（Ｇ_４Ｓ）_３リンカーによって分離されている。ヒト化抗体について、ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向およびＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のｓｃＦｖ配列が提供される。

Ｖ． ＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ配列
ＣＴ３ ｓｃＦｖ、およびＣＴ３のヒト化バージョン（ｈＣＴ３－１、ｈＣＴ３－２、ｈＣＴ３－３およびｈＣＴ３－４）のｓｃＦｖを使用して、ＧＰＣ２発現細胞を特異的に標的とするＣＡＲ構築物を生成した。本明細書で開示される場合、ＣＤ２８ヒンジ領域およびＣＤ２８膜貫通ドメインを有するＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ構築物は、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインのいずれかと対になったＣＤ８ヒンジ領域を有するＣＡＲ構築物よりも優れていた。ＣＡＲ成分のヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびに３つの特定のＣＡＲ構築物（ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ、ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢｚおよびＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚならびに）の完全なアミノ酸配列は、以下に提供される。

ＶＩ． キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
ＧＰＣ２特異的ＣＡＲ、およびＣＡＲを発現するように操作された細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよびｉＰＳＣ）が、本明細書で開示される。一般に、ＣＡＲは、結合性部分、細胞外ヒンジ／スペーサーエレメント、膜貫通領域、およびシグナル伝達機能を実行する細胞内ドメインを含む（Cartellieri et al., J Biomed Biotechnol 2010:956304, 2010；Dai et al., J Natl Cancer Inst 108(7):djv439, 2016）。多くの例では、結合性部分は、モノクローナル抗体、例えば、ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体の抗原結合性断片である。スペーサー／ヒンジ領域は、典型的には、ＩｇＧサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、およびＣＤ８ドメイン由来の配列を含む。本明細書の一部の態様では、ヒンジ領域は、ヒトＣＤ２８に由来する。具体的な例では、ヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号２４を含む（またはそれからなる）。膜貫通（ＴＭ）ドメインは、種々の異なるＴ細胞タンパク質、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８または誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）に由来し得る。本明細書の一部の態様では、ＴＭドメインは、ヒトＣＤ２８に由来する。具体的な例では、ＴＭドメインのアミノ酸配列は、配列番号２６を含む（またはそれからなる）。いくつかの異なるエンドドメインが、ＣＡＲを生成するために使用されてきた。例えば、エンドドメインは、ＩＴＡＭを有するシグナル伝達鎖、例えば、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγからなり得る。一部の例では、エンドドメインは、少なくとも１つのさらなる共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＭＹＤ８８－ＣＤ４０、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２（ＫＩＲ２ＤＳ２）および／またはＤＡＰ１０の細胞内部分をさらに含む。

ＣＡＲは、例えば、抗原結合ドメインに対してＮ末端側に、シグナルペプチド配列もまた含み得る。シグナルペプチド配列は、任意の適切なシグナルペプチド配列、例えば、顆粒球－マクロファージコロニー－刺激因子受容体（ＧＭＣＳＦＲ）、免疫グロブリン軽鎖カッパまたはＩＬ－２由来のシグナル配列であり得る。シグナルペプチド配列は、細胞の表面上でのＣＡＲの発現を促進し得るが、発現されたＣＡＲにおけるシグナルペプチド配列の存在は、ＣＡＲが機能するためには必要ない。細胞表面上でのＣＡＲの発現の際には、シグナルペプチド配列は、ＣＡＲから切断され得る。したがって、一部の態様では、ＣＡＲは、シグナルペプチド配列を欠如する。

一部の態様では、本明細書で開示されるＣＡＲは、短縮型バージョンのヒトＥＧＦＲ（ｈＥＧＦＲｔ；以下のセクションＶＩＩにおいてより詳細に議論される）もまた発現する構築物から（例えば、レンチウイルスベクターから）発現される。ＣＡＲおよびｈＥＧＦＲｔは、形質導入された細胞における発現の際に、ＣＡＲがｈＥＧＦＲｔから切断されるように、自己切断性ペプチド配列（例えば、Ｔ２Ａ）によって分離される（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ ２０１９／０９４４８２を参照されたい）。

本明細書で開示される一部の態様では、ＣＡＲ構築物は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下のアミノ酸配列をコードする：

本明細書で開示されるＣＡＲを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）またはｉＰＳＣは、特定の細胞型、例えば、腫瘍細胞、例えば、ＧＰＣ２陽性腫瘍細胞を標的とするために使用され得る。ＣＡＲを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の使用は、標準的なＣＴＬベースの免疫療法よりも汎用性が高いが、それは、ＣＡＲを発現する免疫細胞がＨＬＡ拘束されておらず、したがって、標的抗原を発現する腫瘍を有するいずれの患者にも使用することができるからである。

したがって、ＧＰＣ２特異的抗体（またはその結合性断片）を含むＣＡＲが、本明細書で提供される。ＣＡＲをコードする単離された核酸分子およびベクター、ならびにＣＡＲを発現する宿主細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージまたはｉＰＳＣもまた提供される。ＧＰＣ２特異的モノクローナル抗体から構成されるＣＡＲを発現する細胞は、ＧＰＣ２を発現するがん、例えば、神経芽腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、急性リンパ芽球性白血病、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、神経膠腫または骨肉腫の処置のために使用され得る。

ＶＩＩ． 短縮型ヒトＥＧＦＲ（ｈＥＧＦＲｔ）
ヒト上皮増殖因子受容体は、４つの細胞外ドメイン、１つの膜貫通ドメインおよび３つの細胞内ドメインから構成される。ＥＧＦＲドメインは、以下のＮ末端からＣ末端への順序で見出される：ドメインＩ－ドメインＩＩ－ドメインＩＩＩ－ドメインＩＶ－膜貫通（ＴＭ）ドメイン－膜近傍ドメイン－チロシンキナーゼドメイン－Ｃ末端テイル。ドメインＩおよびドメインＩＩＩは、リガンド結合に関与するロイシンリッチドメインである。ドメインＩＩおよびドメインＩＶは、システインリッチドメインであり、ＥＧＦＲリガンドと接触しない。ドメインＩＩは、他のＥＧＦＲファミリーメンバー由来の類似したドメインとのホモダイマーまたはヘテロダイマーの形成を媒介し、ドメインＩＶは、ドメインＩＩとジスルフィド結合を形成することができる。ＥＧＦＲ ＴＭドメインは、細胞膜を一回貫通し、タンパク質ダイマー化において役割を果たし得る。細胞内ドメインは、膜近傍ドメイン、チロシンキナーゼドメインおよびＣ末端テイルを含み、これらは、ＥＧＦＲシグナル伝達を媒介する（Wee and Wang, Cancers 9(52), doi:10.3390/cancers9050052；Ferguson, Annu Rev Biophys 37:353-373, 2008；Wang et al., Blood 118(5):1255-1263, 2011）。

本明細書で「ｈＥＧＦＲｔ」と呼ばれる短縮型バージョンのヒトＥＧＦＲは、ドメインＩＩＩ、ドメインＩＶおよびＴＭドメインのみを含む。したがって、ｈＥＧＦＲｔは、ドメインＩ、ドメインＩＩおよび３つ全ての細胞内ドメインを欠如する。ｈＥＧＦＲｔは、ＥＧＦに結合することが不可能であり、シグナル伝達活性を欠如する。しかし、この分子は、特定のＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体、例えば、ＦＤＡ承認されたセツキシマブに結合する能力を保持する（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０１１／０５６８９４）。

ｈＥＧＦＲｔおよび本明細書で開示されるＧＰＣ２特異的ＣＡＲの両方をコードする構築物（例えば、レンチウイルスベクター）による免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）またはｉＰＳＣの形質導入は、標識されたＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（商標））を使用した、形質導入された細胞の選択を可能にする。例えば、セツキシマブは、ビオチンで標識され得、形質導入された細胞は、（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから）市販されている抗ビオチン磁気ビーズを使用して選択され得る。ｈＥＧＦＲｔの共発現は、養子移入されたＣＡＲ発現細胞のｉｎ ｖｉｖｏ追跡もまた可能にする。さらに、ｈＥＧＦＲｔを発現する細胞へのセツキシマブの結合は、ＡＤＣＣエフェクター細胞の細胞傷害性を誘導し、それによって、例えば、治療の結論の時点で、形質導入された免疫細胞またはｉＰＳＣをｉｎ ｖｉｖｏで排除する機構を提供する（Wang et al., Blood 118(5):1255-1263, 2011）。

本明細書の一部の態様では、ｈＥＧＦＲｔのアミノ酸配列は、配列番号３６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。一部の例では、ｈＥＧＦＲｔのアミノ酸配列は、配列番号３６を含むまたはそれからなる。他の態様では、ｈＥＧＦＲｔのアミノ酸配列は、配列番号３６と比較して、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下のアミノ酸置換を含む。一部の例では、アミノ酸置換は、保存的置換である。

ＶＩＩＩ． ＣＡＲ発現細胞組成物およびその投与
１つまたは複数の薬学的または薬理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせてＣＡＲ発現細胞を含む組成物が提供される。ＣＡＲ発現細胞は、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ３^＋Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４^＋および／もしくはＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージまたは任意の他の適切な免疫細胞であり得る。かかる組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロース、デキストランまたはマンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含み得る。一部の例では、細胞含有組成物は、凍結保護剤、例えば、ＤＭＳＯまたはグリセロールを含む。一部の例では、細胞含有組成物は、培養培地、例えば、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩを含み、血清、例えば、ＦＢＳをさらに含み得る。一部の例では、細胞含有組成物は、凍結される、または液体形態である。細胞は、レシピエントにとって自家であり得る。しかし、細胞はまた、異種（同種）であり得る。

細胞に関して、細胞を導入するために、種々の水性担体、例えば、緩衝食塩水などが使用され得る。これらの溶液は、無菌であり、一般に、望ましくない物を含まない。これらの組成物は、従来の滅菌技法によって滅菌され得る。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの製剤中の濃度は、広く変動し得、選択された特定の投与様式および対象の要求に従って、流体体積、粘度、体重などに主に基づいて選択される。

投与される組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ／負荷、転移の程度、および状態における個々の差異を考慮して、医師によって決定され得る。本明細書に記載されるＣＡＲ発現免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび／またはＮＫ細胞）またはｉＰＳＣを含む医薬組成物は、それらの範囲内の全ての整数値を含めて、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重、例えば、１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重の投薬量で投与され得ると、一般に述べることができる。例示的な用量は、１０^６細胞／ｋｇ～約１０^８細胞／ｋｇ、例えば、約５×１０^６細胞／ｋｇ～約７．５×１０^７細胞／ｋｇ、例えば、約２．５×１０^７細胞／ｋｇ、または約５．０×１０^７細胞／ｋｇである。

組成物は、これらの投薬量で、一回または複数回、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０回投与され得る。組成物は、公知の免疫療法注入技法を使用して投与され得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照されたい）。組成物は、１日に１回、１週間に１回、１か月に２回または１か月に１回投与され得る。一部の非限定的な例では、組成物は、静脈内投与のために製剤化され、複数回投与される。投与の量および頻度は、対象の状態、ならびに対象の疾患の型および重症度等の因子によって決定され得るが、適切な投薬量は、臨床試験によって決定され得る。

一部の態様では、ＣＡＲをコードする核酸分子は、細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージまたはｉＰＳＣ中に導入され、対象は、細胞の初回投与、および細胞の１または複数回の引き続く投与を受け、１または複数回の引き続く投与は、前の投与の１５日未満後、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２日後に投与される。一態様では、１週間当たり、ＣＡＲ発現細胞の１回よりも多くの投与が対象に投与される、例えば、１週間当たり、本開示のＣＡＲ発現細胞の２、３または４回の投与が投与される。一態様では、対象は、１週間当たり、ＣＡＲ発現細胞の１回よりも多くの投与（例えば、１週間当たり２、３または４回の投与）（サイクルとも呼ばれる）を受け、その後に、ＣＡＲ発現細胞投与のない１週間が続き、次いで、ＣＡＲ発現細胞の１回または複数のさらなる投与（例えば、１週間当たり、ＣＡＲ発現細胞の１回よりも多くの投与）が、対象に投与される。別の態様では、対象（例えば、ヒト対象）は、１回よりも多くのサイクルのＣＡＲ発現細胞を受け、各サイクル間の時間は、１０、９、８、７、６、５、４または３日未満である。一態様では、ＣＡＲ発現細胞は、１日おきに１週間当たり３回の投与で投与される。別の態様では、ＣＡＲ発現細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間またはそれよりも長い期間にわたって投与される。患者に投与される上記処置の投薬量は、処置されている状態の正確な性質および処置のレシピエントによって変動する。ヒト投与のための投薬量の拡大縮小は、容認された実務に従って実施され得る。

一部の態様では、ＣＡＲ発現細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで複製することができ、持続性の腫瘍制御をもたらし得る長期持続を生じる。種々の態様では、対象に投与されるｉＰＳＣ、Ｔ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞もしくはＮＫ細胞、またはこれらの細胞の子孫は、対象への細胞の投与の後、少なくとも４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、２２か月、２３か月、または数年間にわたって、対象において持続する。他の態様では、細胞およびそれらの子孫は、対象へのＣＡＲ発現細胞の投与の後、６か月、５か月、４か月、３か月、２か月、または１か月未満、例えば、３週間、２週間、１週間にわたって存在する。

開示された組成物の投与は、注射、経口摂取、輸液、インプランテーションまたは移植によるものを含め、任意の簡便な様式で実施され得る。開示された組成物は、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、脳内、脳室内、頭蓋内、筋肉内、動脈内（肝動脈（例えば、ＨＡＩ）または大腿動脈中へが含まれる）で、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、前立腺内で（ｉｎｔｒａｐｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ）（例えば、前立腺がんのため）、骨内、硝子体内または腹腔内で、患者に投与され得る。一部の態様では、組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。他の態様では、本開示の組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与される。他の態様では、本開示の組成物は、動脈内注射によって投与される。組成物はまた、腫瘍またはリンパ節中に直接注射され得る。一例では、投与は骨内であり、処置されるがんは、骨のがん（例えば、骨肉腫）である。一例では、投与は、脳内、脳室内または頭蓋内であり、処置されるがんは、脳のがん（例えば、神経芽腫または髄芽腫）である。一例では、投与は、硝子体内であり、処置されるがんは、眼のがん（例えば、網膜芽細胞腫）である。

一部の態様では、対象は、目的の細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび／またはＮＫ細胞を選択および／または単離するために白血球がｅｘ ｖｉｖｏで収集、富化または枯渇される、白血球アフェレーシスを受けることができる。これらの細胞単離体は、公知の方法によって拡大増殖され得、１つまたは複数のＣＡＲ構築物が導入されて、それによって、ＣＡＲを発現する自家細胞を創出できるように、処置され得る。本明細書の一部の態様では、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲおよび短縮型形態のヒトＥＧＦＲ（ｈＥＧＦＲｔ）を発現するレンチウイルスベクターを使用して生成される。ｈＥＧＦＲｔの共発現は、セクションＶに上記される、ｈＥＧＦＲｔを認識する抗体（例えば、セツキシマブ、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０１１／０５６８９４を参照されたい）を使用した、ＣＡＲ発現免疫細胞の選択および精製を可能にする。

一部の態様では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞および／またはマクロファージ）は、赤血球を溶解させることによって、および一部の例では、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心分離によってまたは向流遠心分離水簸によって単球を枯渇させることによって、末梢血から単離される。Ｔ細胞の特定の下位集団、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞は、陽性または陰性選択技法によってさらに単離され得る。例えば、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の陽性選択のために十分な期間にわたる、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）コンジュゲート化ビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔとのインキュベーションによって単離され得る。米国特許出願公開第２０１４０２７１６３５号を参照されたい。非限定的な例では、期間は、約３０分間である。他の非限定的な例では、期間は、３０分間から３６時間またはより長い時間までの範囲、およびそれらの間の全ての整数値である。さらなる非限定的な例では、期間は、少なくとも１、２、３、４、５または６時間、１０～２４時間、２４時間またはそれよりも長い時間である。他の細胞型と比較して少ないＴ細胞が存在する任意の状況、例えば、免疫無防備状態の個体からの単離では、Ｔ細胞を単離するために、より長いインキュベーション時間が使用され得る。さらに、より長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉の効率を増加させ得る。したがって、時間を単純に短縮および延長することによって、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合することが可能になり、ならびに／または、ビーズのＴ細胞に対する比を増加もしくは減少させることによって、Ｔ細胞の下位集団は、培養開始時もしくはプロセスの間の他の時点において、それについてもしくはそれに対して優先的に選択され得る。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることによって、Ｔ細胞の下位集団は、培養開始時または他の所望の時点において、それについてまたはそれに対して優先的に選択され得る。複数ラウンドの選択もまた使用され得る。

陰性選択による細胞集団の富化は、陰性選択された細胞に独自の表面マーカーに対する抗体の組合せを用いて達成され得る。１つの方法は、細胞選別、および／または陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫接着（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅｎｃｅ）もしくはフローサイトメトリーを介した選択である。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋Ｔ細胞について富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。１つまたは複数のサイトカインを発現するＴ細胞集団が選択され得る。細胞発現についてスクリーニングするための方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０１３／１２６７１２に開示されている。

陽性または陰性選択による細胞の所望の集団の単離のために、細胞および表面（例えば、粒子、例えば、ビーズ）の濃度は、細胞とビーズとの最大限の接触を確実にするために変動され得る。一部の態様では、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる態様では、１億細胞／ｍｌよりも高い濃度が使用される。他の態様では、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１億細胞／ｍｌの細胞の濃度が使用される。理論によって束縛されないが、高い濃度を使用することは、増加した細胞収量、細胞活性化および細胞拡大増殖を生じ得る。より低い濃度の細胞もまた使用され得る。理論によって束縛されないが、Ｔ細胞および表面（例えば、粒子、例えば、ビーズ）の混合物を大きく希釈することで、粒子と細胞との間の相互作用は最小化される。これにより、粒子に結合される所望の抗原を高い量で発現する細胞について選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高いレベルのＣＤ２８を発現し、薄い濃度のＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。一部の態様では、使用される細胞の濃度は、５×１０^６／ｍｌである。他の態様では、使用される濃度は、約１×１０^５／ｍｌ～１×１０^６／ｍｌ、およびそれらの間の任意の整数値であり得る。

ＩＸ． 処置の方法
本明細書で開示されるＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ発現免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）またはＣＡＲ発現ｉＰＳＣの治療有効量を対象に投与することによる、対象においてＧＰＣ２陽性がんを処置する方法が、本明細書で提供される。本明細書で開示されるＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ発現細胞の治療有効量を対象に投与することによる、対象において腫瘍成長または転移を阻害する方法もまた、本明細書で提供される。したがって、一部の例では、これらの方法は、例えば、処置前の腫瘍のサイズ、体積および／または重量と比較して、腫瘍のサイズ、体積および／または重量を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％減少させる。一部の例では、これらの方法は、例えば、処置前の転移のサイズ、体積および／または重量と比較して、転移のサイズ、体積および／または重量を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％減少させる。一部の例では、これらの方法は、例えば、本明細書で提供される処置の非存在下での生存時間と比較して、ＧＰＣ２陽性がんを有する対象の生存時間を、少なくとも３か月、少なくとも６か月、少なくとも９か月、少なくとも１２か月、少なくとも１８か月、少なくとも２４か月、少なくとも３６か月、少なくとも４８か月または少なくとも６０か月増加させる。一部の例では、これらの効果の組合せが達成される。

対象においてＧＰＣ２陽性がんを処置する方法が、具体的に提供される。一部の態様では、この方法は、ＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲおよびｈＥＧＦＲｔをコードする核酸分子を含む単離された免疫細胞もしくはｉＰＳＣの治療有効量を対象に投与するステップ、またはＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲおよびｈＥＧＦＲｔを共発現する単離された免疫細胞もしくはｉＰＳＣの治療有効量を投与するステップを含む。一部の態様では、ＧＰＣ２陽性がんは、固形腫瘍である。具体的な例では、ＧＰＣ２陽性がんは、神経芽腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、急性リンパ芽球性白血病、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、神経膠腫または骨肉腫である。一部の態様では、ＧＰＣ２陽性がんは、小児がんである。

本明細書で開示される方法の一部の態様では、単離された免疫細胞は、Ｔリンパ球である。一部の例では、Ｔリンパ球は、自家Ｔリンパ球である。他の態様では、単離された宿主細胞は、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージである。

ＣＡＲ発現免疫細胞またはｉＰＳＣの治療有効量は、疾患の重症度、疾患の型、および患者の健康の全般的状態に依存し得る。ＣＡＲ発現細胞およびその組成物の治療有効量は、症状（複数可）の主観的軽減、または臨床医もしくは他の有資格の観察者によって認められる客観的に同定可能な改善（例えば、腫瘍体積または転移における減少）のいずれかを提供する量である。

本明細書で開示されるＣＡＲ発現細胞および組成物の投与は、他の抗がん剤または治療的処置（例えば、腫瘍の外科的切除）の投与によっても達成され得る。任意の適切な抗がん剤が、本明細書で開示される組成物と組み合わせて投与され得る。例示的な抗がん剤には、化学療法剤、例えば、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、インターカレート抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物学的応答改変剤、抗ホルモン薬（例えば、抗アンドロゲン）および抗血管形成剤などが含まれるがこれらに限定されない。他の抗がん処置には、放射線療法およびがん細胞または他の細胞を特異的に標的とする抗体（例えば、ｍＡｂ）（例えば、抗ＰＤ－１、抗ＣＬＴＡ４、抗ＥＧＦＲまたは抗ＶＥＧＦ）が含まれる。一例では、がんは、本明細書で開示されるＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ免疫細胞（例えば、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）、および１つまたは複数の治療的ｍＡｂ、例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、デュルバルマブ、ＫＮ０３５、コシベリマブ（ｃｏｓｉｂｅｌｉｍａｂ）、ＢＭＳ－９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＰＤＬ－３２８０ＡまたはＭＥＤＩ－４７３７）またはＣＬＴＡ－４抗体（例えば、イピリムマブまたはトレメリムマブ）のうちの１つまたは複数を投与することによって処置される。一例では、がんは、本明細書で開示されるＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ発現細胞（例えば、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）および１つもしくは複数のｍＡｂ、例えば、３Ｆ８、アバゴボマブ（Ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アデカツムマブ（Ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ、アラシズマブ（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ、アルツモマブ・ペンテテート（Ａｌｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）、アナツモマブ・マフェナトックス（Ａｎａｔｕｍｏｍａｂ ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、アポリズマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ・メルタンシン（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、カンツズマブ・メルタンシン、カプロマブ・ペンデチド、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セツキシマブ、シタツズマブ・ボガトクス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇａｔｏｘ）、シクスツムマブ、クリバツズマブ・テトラキセタン（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、コナツムマブ、ダセツズマブ、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ、エドレコロマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エトラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ファーレツズマブ、フィギツムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ジレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブ・ベドチン（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、イブリツモマブ・チウキセタン、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムシロマブ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イノツズマブ・オゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ・メルタンシン（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルミリキシマブ、マパツズマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、ミラツズマブ、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、ナコロマブ・タフェナトクス（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ ｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナプツモマブ・エスタフェナトクス、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ・メルペンタン（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）、オファツムマブ、オララツマブ、オポルツズマブ・モナトクス（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｍｏｎａｔｏｘ）、オレゴボマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペルツズマブ、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、サツモマブ・ペンデチド（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）、タカツズマブ・テトラキセタン（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、タプリツモマブ・パプトクス（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ ｐａｐｔｏｘ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ＴＧＮ１４１２、ティシリムマブ（Ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）（トレメリムマブ）、ティガツズマブ、ＴＮＸ－６５０、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブ・セルモロイキン（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ、またはそれらの組合せを投与することによって処置される。

一例では、がんは、本明細書で開示されるＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ発現細胞（例えば、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）および１つまたは複数のアルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタードまたはクロラムブシル）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシンまたはダカルバジン）を投与することによって処置される。一例では、がんは、本明細書で開示されるＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ発現細胞（例えば、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）およびシクロホスファミドを投与することによって処置される。

一例では、がんは、本明細書で開示されるＧＰＣ３ターゲティングＣＡＲ発現細胞（例えば、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）ならびに１つまたは複数の代謝拮抗薬、例えば、葉酸アナログ（例えば、メトトレキサート）、ピリミジンアナログ（例えば、５－ＦＵまたはシタラビン）およびプリンアナログ、例えば、メルカプトプリンまたはチオグアニンを投与することによって処置される。

一例では、がんは、本明細書で開示されるＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ発現細胞（例えば、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）ならびに、例えば、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンデシン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドまたはテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシンまたはマイトマイシンＣ）および酵素（例えば、Ｌ－アスパラギナーゼ）が含まれる１つまたは複数の天然産物を投与することによって処置される。

一例では、がんは、本明細書で開示されるＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ発現細胞（例えば、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）ならびに１つまたは複数の白金配位錯体（例えば、シスプラチンとしても公知のシス－ジアミン－ジクロロ白金ＩＩ）、置換尿素（例えば、ヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン）および副腎皮質抑制薬（例えば、ミトタンおよびアミノグルテチミド）を投与することによって処置される。

一例では、がんは、本明細書で開示されるＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ発現細胞（例えば、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）ならびに１つまたは複数のホルモンまたはアンタゴニスト、例えば、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール（magestrol acetate））、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）およびアンドロゲン（例えば、プロピオン酸テステロン（testerone proprionate）およびフルオキシメステロン）を投与することによって処置される。

一例では、がんは、本明細書で開示されるＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ発現細胞（例えば、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）ならびに１つまたは複数の化学療法薬物、例えば、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ－Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン（Carboplatinum）、シスプラチン（Cisplatinum）、シトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５－ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（または他のタキサン類、例えば、ドセタキセル）、ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）、ビンクリスチン、ＶＰ－１６、ゲムシタビン（ジェムザール）、ハーセプチン、イリノテカン（カンプトサール（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、ＣＰＴ－１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ－５７１、タキソテール、トポテカン（ハイカムチン）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼベリン（Ｚｅｖｅｌｉｎ）およびカルシトリオールを投与することによって処置される。一例では、がんは、本明細書で開示されるＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ発現細胞（例えば、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）、シクロホスファミドおよびフルダラビンを投与することによって処置される。一例では、がんは、本明細書で開示されるＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ発現細胞（例えば、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ）ならびに１つまたは複数の免疫調節薬、例えば、ＡＳ－１０１（Ｗｙｅｔｈ－Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ－２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ－ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｉｍｒｅｇ ｏｆ Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．から）、ＳＫ＆Ｆ １０６５２８およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子）を投与することによって処置される。本明細書で提供されるものと組み合わせて使用され得る別の処置は、がんまたはその一部分の外科的処置、例えば、外科的切除である。処置の別の例は、放射線治療、例えば、腫瘍を根絶するまたは外科的切除の前に腫瘍を収縮させるのを助けるための、腫瘍部位への放射性材料またはエネルギー（例えば、外部照射療法）の投与である。

具体的な例では、この方法は、（１）ＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲおよびｈＥＧＦＲｔをコードする核酸分子を含む単離された免疫細胞もしくはｉＰＳＣの治療有効量を対象に投与すること、またはＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲおよびｈＥＧＦＲｔを共発現する単離された免疫細胞もしくはｉＰＳＣの治療有効量を投与することによって、神経芽腫を処置することを含む。一部の例では、この方法は、１つまたは複数の他の化学療法剤または生物学的薬剤の治療有効量を対象に投与するステップをさらに含む。一部の態様では、１つまたは複数の他の化学療法剤または生物学的薬剤は、５－ＦＵ、シスプラチン、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、カペシタビン、フロクスウリジンまたはミトキサントロンのうちの１つまたは複数、例えば、ゲムシタビン＋オキサリプラチン（ＧＥＭＯＳ）、フロクスウリジン、シスプラチンおよびオキサリプラチン、または５－ＦＵ、オキサリプラチンおよびロイコボリン（ＦＯＬＦＯＸ）である。一部の態様では、１つまたは複数の他の化学療法剤または生物学的薬剤は、ソラフェニブ、レンバチニブ、レゴラフェニブ、カボザンチニブおよびラムシルマブのうちの１つまたは複数である。一部の態様では、１つまたは複数の他の化学療法剤または生物学的薬剤は、免疫療法薬物、例えば、ペムブロリズマブおよび／またはニボルマブである。一部の態様では、１つまたは複数の他の化学療法剤または生物学的薬剤は、シクロホスファミド、フルダラビン、またはその両方である。

以下の実施例は、本開示のある特定の態様の特定の特色を示すために提供されているが、特許請求の範囲は、例示された特色に限定されるべきではない。

（実施例１）
ＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ Ｔ細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞死滅
ＧＰＣ２ターゲティングＣＴ３．８Ｈ．ＢＢｚ（本明細書でＣＴ３．８Ｈ．ＢＢζとも呼ばれる）およびＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ（本明細書でＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζとも呼ばれる）ＣＡＲ（図１Ａ～１Ｂを参照されたい）を発現するＴ細胞によって媒介される細胞死滅を、ＧＰＣ２陽性ＩＭＲ５細胞およびＧＰＣ２ノックアウト（ＫＯ）ＩＭＲ５細胞を標的細胞として使用して評価した。図２Ａ～２Ｂに示されるように、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＩＭＲ５細胞を死滅させるにあたり、ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも強力であった。両方の型のＣＡＲ Ｔ細胞が、ＧＰＣ２ ＫＯ－ＩＭＲ５細胞に対して最小限の影響を有し、それらのＧＰＣ２特異性を実証した。

（実施例２）
神経芽腫転移の動物モデルにおけるＣＤ８ヒンジ含有ＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲおよびＣＤ２８ヒンジ含有ＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲの比較
ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢｚおよびＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞を、神経芽腫（ＩＭＲ５）転移のマウスモデルにおいて比較した。マウスに、１０００万個のＣＡＲ Ｔ細胞の注入の２８日前に、ＩＭＲ５－ｌｕｃをｉ．ｖ．接種し、注入後毎週イメージングした（図３Ａ）。Ｔ細胞注入の８週間後まで毎週撮影したモックおよびＣＡＲ Ｔ細胞処置したマウスの生物発光画像が、図３Ｂに示される。生物発光を、ＣＡＲ Ｔ細胞注入の２、４、６および８週間後に測定し、その結果は図３Ｃに示される。ＣＡＲ Ｔ細胞注入後のモックおよびＣＡＲ Ｔ細胞処置したマウスの生存は、図３Ｄに示される。結果は、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、マウスにおいて神経芽腫腫瘍を退縮させるにあたり、ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも有意に強力であったことを実証した。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ処置群中の全てのマウスが、この研究の最後まで生存した。

（実施例３）
同所ＩＭＲ５マウスモデルにおけるＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚおよびＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の比較
３人の異なるヒトドナー（Ａ２６Ｍ、Ａ５９ＦおよびＡ２５Ｆ）由来のＴ細胞をこの研究で使用した。中程度の腫瘍負荷を有するマウスに、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲまたはＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞５００万個を投与し、生物発光イメージングを、４（Ａ２６ＭおよびＡ５９Ｆ）または８（Ａ２５Ｆ）週間にわたって毎週実施した。図４Ａ～４Ｃに示されるように、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、３人全てのＴ細胞ドナーについて、腫瘍を低減させるにあたりＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも優れていた。モック処置したマウス、ならびにドナーＡ２６ＭおよびＡ５９Ｆに由来するＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚまたはＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスの生物発光画像は、それぞれ図４Ｄおよび４Ｅに示される。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、中程度のサイズのＩＭＲ５腫瘍を根絶するにあたり、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも強力であった。

解離させた脾臓試料のフローサイトメトリーを実施して、ＣＡＲ Ｔ細胞処置した動物におけるＣＡＲ発現の維持を評価した。生細胞を、ＣＤ３＋ヒト細胞についてゲートし、ＣＡＲ陽性細胞のパーセンテージを決定した（図４Ｆ）。図４Ｇに示されるように、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、試験した両方のドナー（Ａ２６ＭおよびＡ５９Ｆ）について、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも高いレベルのＣＡＲ発現を保持した。

（実施例４）
ＣＡＲの強壮性のシグナル伝達
ＣＡＲリン酸化を、ＣＡＲ活性化の尺度として評価した。ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢｚ、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚおよびＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞を、未刺激としたか、またはプロテインＬもしくはＧＰＣ２－Ｆｃで刺激し、ＣＡＲリン酸化を、ウエスタンブロットによって検出した（図５Ａ）。ＣＡＲリン酸化における変化倍数は、図５Ｂに示される。ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲは、刺激なしで試験した場合、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲよりも高いリン酸化レベルを有した。ＧＰＣ２刺激ありでは、両方のＣＡＲが、それらのリン酸化レベルを上方調節した。これらの結果は、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚが、ＣＡＲ消耗を引き起こすことが公知の、より強壮性のＣＡＲシグナル伝達（リン酸化）を有することを実証している。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、より低い強壮性のＣＡＲシグナル伝達を有するが、抗原提示（ＧＰＣ２－Ｆｃ）の際に、適切なＣＡＲ活性化を示す。

（実施例５）
同所ＩＭＲ５動物モデルにおける低用量または高用量化学療法を用いたＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の比較
大きいＩＭＲ５腫瘍負荷を有するマウスを、５００万個のＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚまたはＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の注入の前に１週間にわたって、化学療法なし、低用量化学療法または高用量化学療法（フルダラビン／シクロホスファミド）で処置した。この研究では、Ｔ細胞は、単一のドナー由来であった。生物発光によって測定した腫瘍サイズは、図６Ａに示される。化学療法およびＣＡＲ Ｔ細胞注入の１０週間後の腫瘍重量は、図６Ｂに示される。これらの結果は、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢｚが、高腫瘍負荷マウスにおいてコンディショニング化学療法を与えた場合、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢｚよりも性能が良かったことを実証している。

（実施例６）
ヒト化ＣＴ３抗体およびＣＡＲの特徴付け
マウス抗体ＣＴ３の４つのヒト化形態を生成した：ｈＣＴ３－１、ｈＣＴ３－２、ｈＣＴ３－３およびｈＣＴ３－４。ＧＰＣ２に対するヒト化ＣＴ３抗体の結合親和性を試験した。図７Ａ～７Ｂに示されるように、４つのヒト化ＣＴ３抗体の結合親和性（４．０ｎＭ、３．６ｎＭ、２．５ｎＭおよび３．３ｎＭ）は、親ＣＴ３抗体の結合親和性（２．２ｎＭ）と類似であった。さらに、４つ全てのヒト化抗体は、Ｇ１０およびＩＭＲ５細胞の細胞表面上のＧＰＣ２に結合する能力を保持したが、ＧＰＣ２－ＫＯ ＩＭＲ５細胞への結合は示さなかった（図８）。

ヒト化ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞による細胞死滅を試験した。結果は、ＣＴ３－８Ｈ－ＢＢｚ、ｈＣＴ３－１－８Ｈ－ＢＢｚ、ｈＣＴ３－２－８Ｈ－ＢＢｚ、ｈＣＴ３－３－８Ｈ－ＢＢｚおよびｈＣＴ３－４－８Ｈ－ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＧＰＣ２発現ＩＭＲ５細胞の特異的溶解を実証した（図９）。４つ全てのヒト化ＣＴ３－８Ｈ－ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＴ３－８Ｈ－ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＩＭＲ５細胞に対する改善された死滅活性を示した。

ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向またはＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれかのヒト化ＣＴ３ ｓｃＦｖを使用するＣＡＲ構築物を、ＣＤ２８ヒンジおよびＣＤ２８膜貫通ドメインを用いて生成した（図１０）。８つ全てのＣＡＲ構築物が、ＧＰＣ２陽性腫瘍を強力に低減させ、ＣＤ８ヒンジを有する対応するｈＣＴ３ ＣＡＲ構築物よりも大きい腫瘍低減を示すと期待される。

（実施例７）
材料および方法
この実施例は、実施例８～１１に記載された研究において使用した材料および実験手順を記載する。

細胞系
薬物耐性患者由来異種移植片（ＰＤＸ）ＳＪＮＢＬ０１２４０７＿Ｘ１（ＭＹＣＮが増幅されている）は、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｔｗｏｒｋによって提供された。ＩＭＲ－５、ＣＨＰ－２１２、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ２Ｃ、Ｋｅｌｌｙ（これもまたＭＹＣＮが増幅されている）およびＳＨＩＮ、ＳＫ－Ｎ－ＦＩ、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ、ＳＨ－ＳＨＥＰおよびＳＨ－ＳＹ５Ｙ（ＭＹＣＮ－野生型（ＷＴ））は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｒａｎｃｈ細胞系リポジトリから取得した。ＮＧＰ－ＧＰＣ２^ｈｉ、ＮＢＳＤ－ＧＰＣ２^ｍｏｄおよびＳＭＳ－ＳＡＮ^ｌｏ（全てＭＹＣＮが増幅されている）は、Ｓｔａｎｆｏｒｄにより提供された。全ての系のＧＰＣ２発現を決定した（表３）。全ての細胞が、マイコプラズマなしであることが確認された。細胞の正体を、ショートタンデムリピートＤＮＡプロファイリングによって決定した。安定なルシフェラーゼ（ｆｆＬＵＣ）－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現細胞を、レンチウイルス形質導入および０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による引き続く選択によって産生した。ＰＤＸ細胞を、マウス中で継代した。ＮＢ細胞系を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）および１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地中で成長させた。

ＣＡＲ構築物
以前に記載されたように（Li et al., STAR Protoc 2:100942, 2021）、ＣＴ３ ｓｃＦｖを、レンチウイルスベクター、ｐＷＰＴ（Ａｄｄｇｅｎｅ 番号１２２５５）中にクローニングし、異なるヒンジおよびＴＭドメイン（ＣＤ８またはＣＤ２８のいずれか）ならびに共刺激ドメイン（４－１ＢＢζおよび／またはＣＤ２８）を追加して、ＣＡＲ Ｔ細胞構築物のバリエーションを生成した。ＧＤ２ ＣＡＲ配列を、公に利用可能な供給源から取得し（Straathof et al., Sci Transl Med 12:eabd6169, 2020；Pule et al., Nat Med 14:1264-1270, 2008）、ＣＤ８またはＣＤ２８ヒンジおよびＴＭならびに４－１ＢＢ共刺激ドメインを含有するｐＷＰＴベクター中にクローニングした。ヒト短縮型細胞外上皮増殖因子受容体ドメイン（ｈＥＧＦＲｔ）を、タグとして含め、セツキシマブによって認識する。

ヒトＴ細胞およびＣＡＲ形質導入
健康なボランティアドナーの凍結保存したヒトＴ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ）を、以前に記載されたように（Li et al., STAR Protoc 2:100942, 2021）、ＣＡＲ Ｔ細胞産生に使用した。簡潔に述べると、０日目に、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞を、ポリ－Ｄ－リシンコーティングした１５ｃｍディッシュ１枚当たり２×１０^７細胞の密度でプレートし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、４：１：３の比のＣＴ３ ＣＡＲプラスミド、エンベローププラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ）およびパッケージングプラスミド（ｐｓＰＡＸ２）で引き続いてトランスフェクトした。Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ培養物のレンチウイルス含有上清を、トランスフェクションの４８～７２時間後に収集し、ヒトＴ細胞をスピン－形質導入するために使用した。凍結保存したヒトＴ細胞を解凍し、１０％ＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、１×非必須アミノ酸、０．２ｍＭ Ｌ－ＧｌｕｔａＭＡＸ、０．１ｍＭピルビン酸ナトリウム（全てＧｉｂｃｏ）、ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（１：１のビーズ対細胞比、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および４０ＩＵ／ｍＬインターロイキン（ＩＬ）－２（ＮＣＩ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ ＢＲＢ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）を補充したＡＩＭ－Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させた。ＩＬ－２濃度を、４８時間後に、レンチウイルス形質導入の時点で、１００ＩＵ／ｍＬまで増加させた。Ｔ細胞培養の５日目に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去し、形質導入されたＣＡＲ Ｔ細胞を、引き続く下流のアッセイのために、８～１０日目まで、培養物中で拡大増殖させた。

ＣＡＲウエスタンブロットアッセイ
製造されたＣＡＲ Ｔ細胞を、ＩＬ－２を奪いつつ３～５時間にわたって培養物中で成長させた。ＣＡＲを活性化するために、１．７μｇのＧＰＣ２－Ｆｃまたは１μｇのプロテインＬ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを、９６ウェル丸底プレート中の２～３×１０^６細胞に添加し、引き続いて、変動する時間にわたって、３７℃で架橋させた。次いで、細胞を、Ｈａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液を使用して溶解させた。Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、タンパク質収量を定量化した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有緩衝液中の試料を、１０分間変性させた。合計で５～１０μｇのタンパク質を、４～２０％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分解し、ポリ二フッ化ビニリデンメンブレン上にエレクトロブロットした。表４に列挙される一次抗体は、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０（ＴＢＳＴ）および０．０２％アジ化ナトリウムを含有するＴｒｉｓ－緩衝食塩水中５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で４℃で一晩インキュベートした。二次抗体を、ＴＢＳＴ中５％の無脂肪粉乳中で室温で１時間インキュベートした。タンパク質バンドを、ヤギ抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体（２００μｇ／ｍＬ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して可視化した。増強化学発光（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用してバンドを可視化し、ＩｍａｇｅＪを用いてこれを定量化した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ
ＣＡＲ Ｔ細胞およびｆｆＬＵＣ－ＧＦＰ発現ＮＢ腫瘍細胞を、以前に記載されたように（Nguyen et al., Cancer Immunol Immunother 67:615-626, 2018）、変動するエフェクター対腫瘍（Ｅ：Ｔ）比で共培養した。その後２４時間毎に、出発数の腫瘍細胞を各ウェルに添加して、ＣＡＲ Ｔ細胞を再チャレンジした。腫瘍細胞の特異的溶解を、ＯＮＥ－Ｇｌｏアッセイを使用して測定した。結果を、形質導入なし（ＵＴ）のモックＴ細胞を用いた条件に対して正規化した。

マウス
全ての研究のために、４～６週齢雌性ＮＯＤ－ＳＣＩＤ（ＮＳＧ）マウスを、ＮＣＩ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｒｏｇｒａｍから得た。

生物発光イメージング
ｆｆＬＵＣの安定な発現を有するＩＭＲ－５を、生物発光イメージング（ＢＬＩ）に使用した。腫瘍保有マウスに、ｄ－ルシフェリンカリウム塩（１５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ＩＰ））を注射し、ｄ－ルシフェリン注射の５分後に、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上でイメージングした（１分間の取得時間）。関心領域分析を、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｖ．４．３．１）を使用して実施した。

ｉｎ ｖｉｖｏ治療モデル
ＰＤＸ細胞またはＩＭＲ－５のいずれかを、ＮＳＧマウス中に同所インプラントした（２．５×１０^５）（Li et al., STAR Protoc 2:100942, 2021）。典型的には、腫瘍インプランテーション手術の３週間後に、ＢＬＩによる登録基準（＞１０^７光量子／ｓ）を満たす動物を、ＵＴモック対照Ｔ細胞またはＧＰＣターゲティングＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを受けるようにランダム化した。Ｔ細胞を注射した尾部静脈の数は、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞に基づいた。モック群における総Ｔ細胞数を、ＣＡＲ群における総Ｔ細胞数と一致するように調整した。ＰＤＸ研究のために、実験を、腫瘍注射の５０日後に終結させた。ＢＬＩシグナルは、大きい腫瘍負荷とは相関しなかったので、腫瘍重量を、研究の最後に記録して、処置有効性を決定した。ＩＭＲ－５を用いた実験のために、腫瘍保有動物を、ＢＬＩを介してモニタリングした。処置マウスの生存を、８０日目（腫瘍インプランテーションの約１１週間後）までモニタリングした。生存エンドポイントは、研究に関して盲検であった動物世話人が決定した、死亡、ベースラインからの＞２０％の体重減少、または重症瀕死状態であった。

ｉｎ ｖｉｖｏホーミング研究
ＩＭＲ－５ ＷＴ ＮＢを有するマウスに、ｆｆＬＵＣ－ＧＦＰ発現ＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ Ｔ細胞またはＵＴモックＴ細胞を注射した。Ｔ細胞の尾部静脈注射後、動物を、ＢＬＩを介して連続的にモニタリングして、Ｔ細胞のホーミングおよび拡大増殖をｉｎ ｖｉｖｏで評価した。実験の最後に、ルシフェリン注射マウスの臓器を、５分の時点で取り出し、６ウェルＰｅｔｒｉディッシュ中でイメージングした。

フローサイトメトリー
試料を、１×１０^６細胞を使用して染色した。ゲートを、蛍光マイナス・ワン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｍｉｎｕｓ－ｏｎｅ）対照を用いて描画した。補償および電圧を、シングルカラー対照を用いて設定した。以下の抗体を、表面エピトープの検出に使用した：ＣＤ４５（クローンＨＩ－３０によって検出される）、ＣＤ３（ＯＫＴ３）、ＣＤ４（ＯＫＴ４）およびＣＤ８（ＨＩＴ８ａ）。ＧＰＣ２－Ｆ_Ｃおよび抗ヒトＦ_Ｃ（Ｍ１３１０Ｇ０５）または抗ＥＧＦＲ抗体（ＡＹ１３）を使用して、ＣＡＲ形質導入効率を測定した。ＣＴ３抗体および抗マウスＩｇＧ１（ＲＭＧ１－１）を使用して、腫瘍細胞におけるＧＰＣ２発現を検出した。ＰＥ Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ）を、製造業者の使用説明書に従って使用して、ＧＰＣ２発現の密度を決定した。データを、Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ機械で収集した。データ分析を、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ．１０を用いて実施した。

サイトカインビーズアッセイ
サイトカインビーズアッセイ（ＣＢＡ）を、製造業者の使用説明書（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に従って実施して、Ｔおよび腫瘍共培養物の上清中の分泌されたサイトカインを定量化した。

単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ
２人のドナーを使用してＣＡＲ Ｔ細胞を製造し、本発明者らはこれを、細胞製造の８日目にＩＭＲ－５保有マウス中に注射した。注射細胞産物を、ＣＤ８を標的とするＴｏｔａｌＳｅｑ－Ｃ抗体（カタログ番号３４４７５２）およびＣＤ４を標的とするＴｏｔａｌＳｅｑ－Ｃ抗体（カタログ番号３００５６７）で染色し、ライブラリー生成のために１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５’ Ｖ．３．１ケミストリーキットに供した。マウス中へのＴ細胞注射の８日後、腫瘍を、生存度＞８０％を有する単一細胞懸濁物へと加工した。処置群１つ当たり３つの腫瘍試料をプールした。１群当たり約１０，０００細胞をロードして、６０００細胞を捕捉した。相補的ＤＮＡライブラリーを、１細胞当たりおよそ５０，０００読み取りの標的深度でＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ２０００およびＮｏｖａＳｅｑ ６０００上で配列決定した。

計算分析
単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ ＦＡＳＴＱファイルを、対応するヒトＧＲＣｈ３８ゲノム参照と共にＣｅｌｌＲａｎｇｅｒソフトウェアスイート（Ｖ．６．１．２、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して処理した。カスタム参照（ＧＲＣｈ３８＋ＧＦＰ）を使用して、ＧＦＰ配列がアノテーションした腫瘍細胞において検出されたかどうかを調べた。細胞バーコードを、固有分子識別子（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）（ＵＭＩ）計数の分布に基づいて決定し、フィルタリングされた遺伝子－バーコードマトリックスを、Ｓｅｕｒａｔ（Ｖ．４．０．１、Ｒパッケージ）における下流の分析のためにＣｅｌｌＲａｎｇｅｒによって生成した（Wolock et al., Cell Syst 8:281-291, 2019；Stuart et al., Cell 177:1888-1902, 2019）。低い（＜２００遺伝子）、およびミトコンドリア遺伝子にマッピングされたＵＭＩのうちの１０％よりも多くを有する細胞を除去した。異なる試料および処置群にわたるデータ統合を、Ｓｅｕｒａｔに実装されたレシプロカル（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）主成分分析（Hao et al., Cell 184:3573-3587, 2021）を用いて実施した。以下のパラメーターを用いた「ＮｏｒｍａｌｉｚｅＤａｔａ」関数：ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ．ｍｅｔｈｏｄ＝「ＬｏｇＮｏｒｍａｌｉｚｅ」およびｓｃａｌｅ．ｆａｃｔｏｒ＝１０，０００を適用して、各細胞における遺伝子の発現レベルを正規化した。「ｖｓｔ」法を用いた「ＦｉｎｄＶａｒｉａｂｌｅＦｅａｔｕｒｅｓ」関数を使用して、２０００個の高度に可変性の遺伝子を同定した。デフォルトパラメーターを用いた「ＳｃａｌｅＤａｔａ」関数を使用して、遺伝子発現マトリックスをスケーリング（ｓｃａｌｅ）およびセンタリング（ｃｅｎｔｅｒ）した。クラスタリングを実施するために、ＰＣＡ次元削減を、「ＲｕｎＰＣＡ」関数を用いて最初に実施した。最初の２０個の主成分を選択して、「ＦｉｎｄＮｅｉｇｈｂｏｒｓ」関数を用いて共有最近傍グラフを構築した。クラスターを、「ＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓ」関数を用いるＬｏｕｖａｉｎアルゴリズムを使用して決定した。ＳｉｎｇｌｅＲ（Ｖ．１．８．１、Ｒパッケージ；Aran et al., Nat Immunol 20:163-172, 2019）を使用して、Ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ／ＥＮＣＯＤＥ参照およびＤａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎからの既知の細胞型標識を用いて初期自動細胞型アノテーションを実施して、細胞クラスターの正体を予測した。次いで、デフォルトパラメーターを用いるが、設定されたｍｉｎ．ｐｃｔ＝０．２５を用いて「ＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ」関数によって得た、各クラスターのトップランクの発現変動遺伝子を試験することによって、アノテーションに信頼性があったかどうかを手動でチェックした。一様多様体の近似と投影（ｕｎｉｆｏｒｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）（ＵＭＡＰ）を最後に適用して、単一細胞転写プロファイルを２次元空間で可視化した。腫瘍細胞を、ｉｎｆｅｒｃｎｖ（Ｖ．１．１０．１、Ｒパッケージ；Tickle et al., inferCNV of the Trinity of CTAT project, Cambridge, MA, USA: Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, 2019）を用いたＧＦＰ配列およびコピー数変異分析によって確認した。ＣＤ４５^＋免疫細胞を、カノニカル遺伝子マーカーを使用してアノテーションした。リンパ系細胞を腫瘍およびマウス細胞から分離し、再クラスタリングして、より精緻化された細胞クラスターを得た。変動遺伝子発現を、クラスターおよび治療群の全ての対について計算した。処置群にわたる試料統合を、Ｓｅｕｒａｔにおいて標準的なアンカーベースのワークフローを用いて実施した。最初のクラスタリングおよびアノテーションについて、ｋ－最近傍（ＫＮＮ）グラフベースのクラスタリングを、重み付けＲＮＡ類似性に適用して、クラスターの高い解像度および結合で、細胞の全ての対間のＪａｃｃａｒｄ係数（近傍重複（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｏｖｅｒｌａｐ））を計算した。ＵＭＡＰプロットを使用して、Ｓｅｕｒａｔパッケージを使用して結果を可視化した。腫瘍細胞を、緑色蛍光タンパク質配列およびコピー数変異分析によって確認した。ＣＤ４５^＋免疫細胞を、カノニカル遺伝子マーカーを使用してアノテーションした。ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓを、経路富化分析（ｐａｔｈｗａｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）に使用した（ＱＩＡＧＥＮ）（Kramer et al., Bioinformatics 30:523-530, 2014）。

統計分析
スチューデントｔ検定（正規分布したデータ）またはマン－ホイットニーＵ検定（歪みのあるデータ）を使用して、２つの群を比較し、２つよりも多くの群での比較のためには、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ、正規分布したデータ）とその後のテューキー事後比較検定、またはランクに対する一元配置ＡＮＯＶＡ（歪みのあるデータ）とその後のダン検定を使用した。生存分析のために、カプラン・マイヤー曲線を生成し、両側ログランク検定を使用して、群間で生存を比較した。全ての実験を、少なくとも２人のドナーを用いる生物学的再現で実施した。

（実施例８）
ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ、ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢζおよびＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢζのｉｎ ｖｉｔｒｏ比較
臨床移転のための最も有効なＧＰＣ２－ＣＡＲ構築物を同定するために、直接比較を、３つの異なるＣＡＲ骨格構築物のＣＴ３（図１１Ａ）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで最初に実施した：（１）ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ８ ＴＭおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを有するＣＴ３（ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢζ、公開されたＣＡＲ；Li et al., Cell Rep Med 2:100297, 2021）、（２）ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ２８ ＴＭおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを有するＣＴ３（ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ）、ならびに（３）ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ２８ ＴＭおよびＣＤ２８－４－１ＢＢ共刺激ドメインを有するＣＴ３（ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢζ）。ＧＰＣ２－ＷＴまたはＧＰＣ２－ノックアウト（ＫＯ）ＩＭＲ－５腫瘍細胞との共培養において、３つ全ての構築物が、ＣＡＲ抗原ＧＰＣ２の存在下で、上清中の増加したレベルのインターフェロン－γ、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）および可溶性Ｆａｓリガンドを示した（図１１Ｂ）。サイトカインレベルは、ＧＰＣ２－ＫＯ細胞を含有する条件において背景レベルに近づき、ＣＡＲの特異性が示された。しかし、３つの構築物のうち、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζは、休止時のＣＡＲおよび下流の分子、例えば、ＺＡＰ７０またはＥＲＫの低いリン酸化レベルによって示される最も低い強壮性のシグナル伝達を実証したが（図１１Ｃ～１１Ｄ）、ＣＡＲ架橋の際にｉｎ ｖｉｔｒｏでその適切な増加を実証した。ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢζもまた、休止時に低い強壮性のシグナル伝達を示したが、ＣＡＲ活性化は、抗原特異的架橋後には、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζほどロバストではなかった。さらに、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζは、特に、より低いＥ：Ｔ比において、ならびに腫瘍再チャレンジによってより低い抗原密度ならびにより良い細胞拡大増殖およびＣＡＲ持続でＮＢ系に対して、本発明のＣＡＲ骨格中の別のＧＰＣ２ ｓｃＦｖであるＧＰＣ２．１９（Heitzeneder et al., Cancer Cell 32:295-309, 2022）よりも良好に機能した。これらのデータは、３つ全てのＣＡＲ構築物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで同等な機能を有するが、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζは強壮性のシグナル伝達を欠如し、これが、持続性の腫瘍曝露に関して、抗腫瘍活性に正に影響を与え得ることを示している。

（実施例９）
ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζは、ｉｎ ｖｉｖｏで高度に有効な抗ＮＢ活性を実証する
３つのＧＰＣ２－ＣＡＲ構築物のうちのどれがＮＢに対してｉｎ ｖｉｖｏで最良の抗腫瘍活性を有するかを決定するために、同所ＰＤＸモデルを利用した。４～６週齢ＮＳＧマウスに、ＳＪＮＢＬ０１２４０７＿Ｘ１を同所注射した。このＰＤＸ系は、高リスクＮＢの分子特色（ＭＹＣＮ増幅）を有し、従来の化学療法および／または免疫療法で処置したほとんどの腫瘍保有マウスは、治癒できない（Nguyen et al., Neoplasia 26:100776, 2022；Nguyen et al., Clin Cancer Res 28:3785-3796, 2022）。腫瘍インプランテーションの３週間後、マウスを、ＵＴモックＴ細胞または２．５×１０^６のＣＡＲ^＋Ｔ細胞のいずれかを受けるようにランダム化した。ＣＡＲ Ｔ細胞注入の４週間後（腫瘍インプランテーションの５０日後）、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζは、３つ全てのＣＡＲ構築物を比較して、最も有意な腫瘍退縮を誘導した（図１２Ａ）。ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢζは以前に公開されており（Li et al., Cell Rep Med 2:100297, 2021；Tian et al., J Clin Invest 132:e155621, 2022）、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢζと同等な活性を有したので、引き続く研究は、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζおよびＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢζに焦点を当てた。生存研究を実施し、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長動態学を、ＧＰＣ２－ＣＡＲ Ｔ細胞注射後に評価した。同所ＩＭＲ－５．ｆｆＬＵＣ－ＧＦＰ腫瘍を有する４～６週齢ＮＳＧマウスを、高用量（５×１０^６）または低用量（２．５×１０^６）のＣＡＲ Ｔ細胞で処置した（図１２Ｂ）。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζによる高用量処置の後、全ての動物が、最終的には背景レベルに近づく、それらのＢＬＩシグナルにおける急勾配の減少を実証した（図１２Ｃ）。高用量ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢζで処置したマウスは、一時的に応答したが、腫瘍制御を維持することはできなかった。２．５×１０^６のＣＡＲ Ｔ細胞で処置した両方のＧＰＣ２－ＣＡＲ Ｔ細胞群中の全てのマウスは、それらのＢＬＩにおいて初期の減少を実証したが、再発した腫瘍におけるＧＰＣ２の下方調節を伴って、最終的には進行した。高用量およびより低い用量のＣＡＲ Ｔ細胞を受けているマウス間での腫瘍成長動態学における差異は、これらの動物の生存研究においてミラーリングされた。高用量ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置した腫瘍保有マウスは、最も長い生存（図１２Ｄ）およびフローサイトメトリー分析によるより高いレベルの腫瘍浸潤ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（図１２Ｅ）を示した。ＣＡＲ群間での生存は、より低い用量レベルでは統計的に異ならなかった。しかし、６匹のマウスのうち６匹は、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置した場合には研究エンドポイントを決して満たさなかったが、ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置した５匹のマウスのうち２匹は、腫瘍に起因して死亡した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験は、３つの異なるＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲの類似の機能を実証したが、引き続くｉｎ ｖｉｖｏ研究は、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζを最も強力な構築物として同定した。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζの優れた性能は、より強壮性が低いシグナル伝達、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中のより高いレベルのＣＡＲ^＋エフェクター細胞、および／または抗原逃避（ａｎｔｉｇｅｎ ｅｓｃａｐｅ）に起因し得る。３つのＣＡＲ構築物にわたって分子的差異をさらに評価するために、腫瘍浸潤Ｔ細胞を、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑによって分析した。

（実施例１０）
ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＭＥ中のエフェクター分子を上方調節する
注入の前ならびにｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍に遭遇した後の、異なるＧＰＣ２－ＣＡＲ Ｔ構築物を発現するＴ細胞の性質を理解するために、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを、製造されたＧＰＣ２－ＣＡＲ Ｔに対して、ならびに腫瘍退縮（典型的には、１０日目に生じる）の前の時点である８日目に収集した腫瘍浸潤Ｔ細胞に対して、実施した。

２人のドナー由来のＣＡＲ Ｔ細胞を製造し、それらのトランスクリプトームを、液滴ベースの１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓプラットフォームを使用して、マウスへの注射の前に分析した。品質制御およびフィルタリングの後に、合計で１４，１６９個の単一細胞トランスクリプトームがドナー１について得られ、１３，５１５個の単一細胞トランスクリプトームがドナー２について得られた（図１３Ａ）。各サブグループは、ドナー１については均等に示されたが、より多くのＣＴ３．８Ｈ．ＢＢζ細胞およびより少ないＵＴモック細胞が、ドナー２について捕捉された。細胞サブセットを手動でアノテーションするために、以前に公開されたアノテーション戦略に従った（Wilson et al., Cancer Discov 12:2098-2119, 2022；Patil et al., Sci Immunol 3:eaan8664, 2018）。グラフベースの教師なしクラスタリングを実施し、ＣＤ８およびＣＤ４タンパク質発現ならびに従来の遺伝子を使用して、Ｔ（ＣＤ８Ａ、ＣＤ４）、ＮＫ（ＮＫＧ７、ＧＮＬＹ）およびＢ細胞（ＭＳ４Ａ１）を定義した。Ｔ細胞サブセットを、ＰＲＦ１および種々のグランザイムコード遺伝子のロバストな発現によって細胞傷害性エフェクター細胞として、ＳＥＬＬ、ＩＬ７Ｒ、ＣＤ２７およびＬＥＦ１の発現によってメモリー細胞として、さらに定義した。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、ＩＬ２ＲＡおよびＦＯＸＰ３によって同定した。古典的増殖および細胞周期関連遺伝子（例えば、ＴＯＰ２Ａ、ＭＫＩ６７、ＣＣＮＢ１／２、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）複合体またはヒストン遺伝子）を発現した場合、細胞クラスターを増殖性と定義した。ドナー１のＴ細胞注射産物は、１２個の細胞クラスターからなり（図１３Ｂ）、これらは、それらのＣＤ８（２２．３％）およびＣＤ４（７７．７％）タンパク質発現によってはっきりと分離された（図１３Ｃ）。複合遺伝子シグネチャーを使用することによって、このドナーが、ＣＡＲ Ｔ製造プロセスの最後に、増殖性ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞（７２．８％）ならびにＣＤ８^＋細胞傷害性エフェクター細胞（３３．１％）を優勢に含有したことが見出された（図１３Ｄ～１３Ｅ）。ＣＤ８^＋細胞の一部は、消耗した細胞傷害性エフェクター細胞であった（図１３Ｄ～１３Ｅ）。ドナー２は、１５個の独立した細胞クラスターからなった（図１３Ｆ）。ドナー１と同様、総細胞集団は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（６２．１％；図１３Ｇ）よりも少ないＣＤ８^＋（３７．９％）を含有し、そのうち２５．６％は細胞傷害性Ｔ細胞であり、１．７％はＴｒｅｇであった（図１３Ｈ～１３Ｉ）。

マウス中へのＴ細胞注射後のＴＭＥの単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ分析のための理想的な時点を決定するために、ＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの分布および拡大増殖を評価した。細胞を追跡するために、ＧＰＣ２－ＣＡＲ Ｔ細胞を、ホタルルシフェラーゼ－ＧＦＰ（ｆｆＬＵＣ－ＧＦＰ）を発現するように形質導入した。右副腎脂肪体中への腫瘍インプランテーションの３週間後、ＧＰＣ２－ＣＡＲ－ｆｆＬＵＣ－ＧＦＰ Ｔ細胞を注射し、連続ＢＬＩを実施した。４つ全ての試験群中のＴ細胞は、肺および大腿骨中に最初に蓄積し、次の４８時間にわたって徐々に拡大増殖した（図１４Ａ）。７日目までに、ＢＬＩシグナル全体は、ＵＴモックＴ群では衰えたが、３つ全てのＧＰＣ２－ＣＡＲ群が、局所的Ｔ細胞拡大増殖と一致する、腫瘍および脾臓に限定されたシグナルにおける増加を実証した（図１４Ｂ～１４Ｃ）。

ＣＡＲ Ｔ細胞注射の後、ＩＭＲ－５保有マウスからの腫瘍（８日目）は、ＴＭＥからの細胞のおよそ５０％またはそれよりも多くを構成するＣＤ８およびＣＤ４エフェクターＴ細胞の大きい割合を含有することが見出された（図１４Ｄ～１４Ｇ）。対照的に、ＵＴモック細胞は、ＴＭＥ中の細胞の＜３％を占めた。これは、ＵＴモックＴ細胞が拡大増殖できず生着できなかった、ｉｎ ｖｉｖｏ追跡実験からの結果と一致している（図１４Ａ）。この群中の残りの細胞は、ほとんど排他的にＭ２腫瘍関連マクロファージであった。腫瘍細胞を、それらの遺伝子発現およびコピー数変異プロファイルによって、免疫細胞から識別した。

ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫細胞の軌道分析により、注射の時点で存在する抗原提示細胞の僅かな数が、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞によってすぐに数で凌駕されたことが明らかになった。これらの細胞は、高い増殖能の状態（ＭＫＩ６７の発現によって示される）から、最終分化した機能不全性のＣＤ６９発現性ＥＯＭＥＳ発現性およびＴＯＸ発現性のエフェクター細胞へと発生した、またはＩＬ７ＲＡ、ＬＥＦ１およびＣＣＬ５の発現存在量によって明らかなメモリー段階へと移行した。ＧＰＣ２－ＣＡＲ Ｔ細胞群にわたって腫瘍浸潤ＣＤ８^＋エフェクター細胞のトランスクリプトームをより良く特徴付けるために、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζの遺伝子発現プロファイルを、２つの他のＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲのものと比較した（図１４Ｈ）。ドナー１では、両方の分析によって共有された、３３個の発現変動遺伝子（ＤＥＧ）が見出された（ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ 対 ＣＴ３．８Ｈ．ＢＢζおよびＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ 対 ＣＴ３．８Ｈ．２８ＢＢζ；図１４Ｉ）。ドナー２では、１６個のＤＥＧが共有された（図１４Ｉ）。他の２つのＣＡＲ Ｔ細胞群と比較して、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＸＣＲ４、ＡＲＨＧＥＦ１およびＬＩＭＥ１の上方調節を示し、これらは、ケモカイン関連Ｔ細胞遊走およびＴ細胞再生に関与する（Bouafia et al., J Clin Invest 129:1047-1060, 2019；Chaix et al., J Immunol 193:1013-1016, 2014；Park et al., Mol Cells 43:921-934, 2020）。他のＤＥＧには、ＩＬ７Ｒ、ＪＵＮＤ、ＺＦＰ３６ＬおよびＴＸＮＩＰが含まれ、これらは、Ｔ細胞恒常性および記憶形成において重要である（Schluns et al., Nat Immunol 1:426-432, 2000；Meixner et al., Embo J 23:1325-1335, 2004；Ruppert et al., PLoS One 7:e32262, 2012；Muri et al., Eur J Immunol 51:115-124, 2021；Petkau et al., Nat Commun 13(1):2274, 2022）。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、エフェクター分子（例えば、ＧＮＬＹ、ＧＺＭＢ、ＺＮＦ６８３およびＨＭＧＮ２）および細胞周期成分（例えば、ＳＴＭＮ１、ＭＣＭ５、ＭＣＭ７およびＰＴＴＧ１）をコードする、上方調節された遺伝子もまた有した。最後に、経路分析は、これらの知見を裏付け、グランザイムＡ経路の活性化を実証した（ｚ－スコア：４．５４；ｐ値＝１．１６Ｅ－３５）。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＥＩＦ２（ｚ－スコア：－３．６２８；ｐ値＝６．１９Ｅ－５４）および酸化的リン酸化経路（ｚ－スコア：－５．５３；ｐ値＝１．８５Ｅ－５６；図１４Ｊ）の下方調節もまた示した。ペアワイズＤＥＧ分析により、他の２つのＣＡＲと比較して、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζが、Ｔ細胞消耗の経路の調節において重要な遺伝子（例えば、ＮＦＫＢＩＡ、ＣＩＳＨ）、Ｔ細胞活性化および増殖を促進する遺伝子（例えば、ＣＤ８３、ＴＸＮＩＰ、ＬＤＨＡ）、ならびにアポトーシスを防止し得る遺伝子（例えば、ＭＴＲＮＲ２Ｌ１２；図１４Ｊ～１４Ｋ）を既に発現していたことが明らかになった。これらの知見は、これらの細胞を製造した時点では、細胞の異なる細胞傷害性活性および生存にｉｎ ｖｉｖｏで影響し得るトランスクリプトーム上の差異が既に存在することを示している。

合わせると、これらの知見は、全てのＧＰＣ２ターゲティングＣＡＲ Ｔ細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞傷害性エフェクター集団に向かって実質的に拡大増殖することを実証している。さらに、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、エフェクター分子ならびにＴ細胞遊走および記憶恒常性に関与する遺伝子を上方調節する。これらの知見は、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスにおいて観察された、他のＣＡＲ治療群と比較して優れた抗腫瘍細胞傷害性の原因であり得る。

（実施例１１）
ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζは、ＧＤ２^＋ＧＰＣ２^低ＮＢに対する優れた抗腫瘍活性で、Ｋ６６６．２８Ｈ．ＢＢζよりも性能が良い
ＮＢにおける以前のＣＡＲ Ｔ細胞試験を、Ｋ６６６ベースのＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞および１４．１８－ｓｃＦｖベースのＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞を用いて実施した（Straathof et al., Sci Transl Med 12:eabd6169, 2020；Heczey et al., Mol Ther 25:2214-2224, 2017；Louis et al., Blood 118:6050-6056, 2011；Pule et al., Nat Med 14:1264-1270, 2008）。これらの試験は忍容性（ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ）を報告したが、処置された患者で客観的応答を達成した者はほとんどいなかった。次に、研究を実施して、ＧＤ２を標的とする既存のＣＡＲ Ｔ細胞療法に対して、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζが機能においてどの程度匹敵したかを評価した。目的は、Ｋ６６６ベースのＧＤ２ターゲティングＣＡＲおよび１４．Ｇ２ａベースのＧＤ２ターゲティングＣＡＲ（Straathof et al., Sci Transl Med 12:eabd6169, 2020）の前臨床活性を、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζのものと比較することであった。同等な試験条件を創出するために、ｓｃＦｖを、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζおよびＣＴ３．８Ｈ．ＢＢζに使用したものと同一なＣＡＲ構築物中にクローニングし、連続腫瘍再チャレンジによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの直接比較を実施した。引き続いて、Ｋ６６６．２８Ｈ．ＢＢζを選択し、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζの抗ＮＢ活性を、Ｋ６６６．２８Ｈ．ＢＢζのものとｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでさらに比較した。ＣＡＲ Ｔ細胞は、同等な形質導入効率を実証した（図１５Ａ）。ｆｆＬＵＣ－ＧＦＰ発現ＳＪＮＢＬ０１２４０７＿Ｘ１、ＩＭＲ－５（共にＭＹＣＮが増幅されている）、およびＳＨ－ＳＹ５Ｙ（ＭＹＣＮ－ＷＴ）を、変動するＥ：Ｔ比で、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζまたはＫ６６６．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞と共にインキュベートした。これらのＮＢ細胞は、異なる発現レベルのＧＰＣ２およびＧＤ２を有する。４８時間後、腫瘍細胞溶解を、ルシフェラーゼレポーターアッセイを適用することによって決定した（図１５Ｂ）。１：１のＥ：Ｔ比では、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＧＤ２^中等度ＧＰＣ２^低ＰＤＸおよびＧＤ２^低ＧＰＣ２^低ＳＨ－ＳＹ５Ｙに対して、Ｋ６６６．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、優れた抗ＮＢ細胞傷害性を示した。腫瘍溶解は、両方の群において、ＧＤ２^高ＧＰＣ２^高ＩＭＲ－５において同等であった。次に、試験を、ＳＪＮＢＬ０１２４０７＿Ｘ１によるｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍再チャレンジモデルに拡大した。２つのＣＡＲの細胞傷害能を、毎日の腫瘍再チャレンジの２４時間後、４日後および７日後に測定した。ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、最初はより良い抗ＮＢ細胞傷害性を示したが、それらの活性は、経時的に徐々に減少し、７日目にはＫ６６６．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の方が優れていた（図１５Ｃ）。次に、２つのＣＡＲの抗腫瘍活性を、ｉｎ ｖｉｖｏで比較した。ＳＪＮＢＬ０１２４０７＿Ｘ１保有マウスに、腫瘍接種の２１日後に、５×１０^６のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を注射した。腫瘍注射の５０日後に、原発腫瘍を計量し、骨髄を、残留ＮＢ細胞について分析した。腫瘍重量は、Ｋ６６６．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔと比較して、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞による治療の後に、より小さかった（図１５Ｄ～１５Ｅ）。さらに、Ｋ６６６．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を有する５匹のマウスのうち３匹は、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置した全てのマウスよりも、それらの骨髄中により高いレベルの検出可能な腫瘍細胞を有した（図１５Ｆ）。Ｋ６６６．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ治療後の治療抵抗性の可能性のある原因は、原発腫瘍におけるＧＤ２の下方調節であり得る。これらの知見は、ＣＴ３．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏの初期ウインドウ内で、ならびに同所ＮＢ－ＰＤＸ ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、Ｋ６６６．２８Ｈ．ＢＢζ ＣＡＲ Ｔよりも性能が良く、原発腫瘍のより良い腫瘍制御、および骨髄中の転移性疾患負荷のより良い制御に向かう傾向をもたらしたことを実証している。

記載される方法または組成物の正確な詳細は、本開示の記載された態様の精神から逸脱することなしに変動または改変され得ることが明らかである。本発明者らは、以下の請求項の範囲および精神内に入る全てのかかる改変およびバリエーションを特許請求する。

Claims (34)

1. 可変重（ＶＨ）ドメインおよび可変軽（ＶＬ）ドメインを含む、グリピカン－２（ＧＰＣ２）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインであって、前記ＶＨドメインが、配列番号２の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、細胞外抗原結合ドメイン；
   ＣＤ２８ヒンジ領域；
   ＣＤ２８膜貫通ドメイン；
   細胞内共刺激ドメイン；ならびに
   細胞内シグナル伝達ドメイン
   を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
2. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列が、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴもしくはＰａｒａｔｏｍｅ番号付けスキーム、またはＫａｂａｔ、ＩＭＧＴおよびＰａｒａｔｏｍｅ番号付けスキームの組合せを使用して定義される、請求項１に記載のＣＡＲ。
3. 前記ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列がそれぞれ、配列番号２の残基３１～３５、５０～６６および９９～１１２を含み、前記ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列がそれぞれ、配列番号４の残基２４～３３、４９～５５および８８～９６を含む；
   前記ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列がそれぞれ、配列番号２の残基２６～３３、５１～５８および９７～１１２を含み、前記ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列がそれぞれ、配列番号４の残基２７～３１、４９～５１および８８～９６を含む；
   前記ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列がそれぞれ、配列番号２の残基２６～３５、４７～６１および９７～１１２を含み、前記ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列がそれぞれ、配列番号４の残基２７～３３、４５～５５および８８～９５を含む；または
   前記ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列がそれぞれ、配列番号２の残基２６～３５、４７～６６および９７～１１２を含み、前記ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列がそれぞれ、配列番号４の残基２４～３３、４５～５５および８８～９６を含む、
   請求項１または請求項２に記載のＣＡＲ。
4. 前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも９０％同一であり、配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み；
   前記ＶＬドメインのアミノ酸配列が、配列番号４と少なくとも９０％同一であり、配列番号４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、
   請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
5. 前記ＶＨドメインおよび前記ＶＬドメインの配列が、ヒト化されている、請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
6. 前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号８の残基１～１２３を含み、前記ＶＬドメインのアミノ酸配列が、配列番号８の残基１３９～２４４を含む；
   前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号１２の残基１～１２２を含み、前記ＶＬドメインのアミノ酸配列が、配列番号１２の残基１３８～２４３を含む；
   前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号１６の残基１～１２２を含み、前記ＶＬドメインのアミノ酸配列が、配列番号１６の残基１３８～２４４を含む；または
   前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号２０の残基１～１２２を含み、前記ＶＬドメインのアミノ酸配列が、配列番号２０の残基１３８～２４３を含む、
   請求項５に記載のＣＡＲ。
7. 前記細胞外抗原結合ドメインが、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１から６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
8. 前記ＣＤ２８ヒンジ領域が、配列番号２４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１から７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
9. 前記ＣＤ２８膜貫通ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１から８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
10. 前記共刺激ドメインが、４－１ＢＢシグナル伝達部分を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
11. 前記４－１ＢＢシグナル伝達部分のアミノ酸配列が、配列番号２８を含むまたはそれからなる、請求項１０に記載のＣＡＲ。
12. 前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
13. 前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列が、配列番号３０を含むまたはそれからなる、請求項１２に記載のＣＡＲ。
14. 前記ＣＡＲのアミノ酸配列が、配列番号３８を含むまたはそれからなる、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
15. 請求項１から１４のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現する単離された細胞。
16. 免疫細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１５に記載の単離された細胞。
17. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはマクロファージである、請求項１６に記載の単離された細胞。
18. 請求項１から１４のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする、単離された核酸分子。
19. 配列番号３７のヌクレオチド７３～１４７０を含むまたはそれからなる、請求項１８に記載の単離された核酸分子。
20. 配列番号３７を含むまたはそれからなる、請求項１８に記載の単離された核酸分子。
21. プロモーターに作動可能に連結された、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
22. 前記プロモーターが、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターである、請求項２１に記載の単離された核酸分子。
23. 請求項１８から２２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
24. レンチウイルスベクターである、請求項２３に記載のベクター。
25. 請求項１８から２２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子または請求項２３もしくは請求項２４に記載のベクターを含む、単離された細胞。
26. 免疫細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項２０に記載の単離された細胞。
27. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはマクロファージである、請求項２６に記載の単離された細胞。
28. 薬学的に許容される担体と、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１５から１７および２５から２７のいずれか一項に記載の単離された細胞、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子、または請求項２３もしくは請求項２４に記載のベクターとを含む、組成物。
29. 対象においてＧＰＣ２陽性がんを処置する方法であって、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１５から１７および２５から２７のいずれか一項に記載の単離された細胞、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子、請求項２３もしくは請求項２４に記載のベクター、または請求項２８に記載の組成物の治療有効量を、前記対象に投与するステップを含む、方法。
30. 対象においてＧＰＣ２陽性がんの腫瘍成長または転移を阻害する方法であって、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１５から１７および２５から２７のいずれか一項に記載の単離された細胞、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子、請求項２３もしくは請求項２４に記載のベクター、または請求項２８に記載の組成物の治療有効量を、前記対象に投与するステップを含む、方法。
31. 前記ＧＰＣ２陽性がんが固形腫瘍である、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
32. 前記ＧＰＣ２陽性がんが小児がんである、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記ＧＰＣ２陽性がんが、神経芽腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、急性リンパ芽球性白血病、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、神経膠腫または骨肉腫である、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 化学療法を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。