JP2025504945A - アクチビン受容体ｉｉｂ型バリアント及びその使用 - Google Patents
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Abstract
アクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）エクトドメイン（ＥＣＤ）バリアントを含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、Ｆｃドメイン部分に融合したＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントを含む。本開示はまた、肺高血圧症、線維症、筋力低下及び萎縮、代謝性障害及び／または心臓代謝性疾患、骨損傷、及び／または低い赤血球レベル（貧血など）などのＴＧＦβスーパーファミリーリガンドシグナル伝達と関連する疾患及び状態を治療するために当該ポリペプチドを使用する薬学的組成物及び方法を提供する。
【選択図】図３６
【選択図】図３６
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年１月２８日に出願された米国仮出願第６３／３０４，４７８号、２０２２年８月１２日に出願された米国仮出願第６３／３９７，７７３号、２０２２年１０月１７日に出願された米国仮出願第６３／４１６，８５２号、及び２０２２年１０月３１日に出願された米国仮出願第６３／４２０，９９９号からの優先権の利益を主張する国際ＰＣＴ出願であり、これらの各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２２年１月２８日に出願された米国仮出願第６３／３０４，４７８号、２０２２年８月１２日に出願された米国仮出願第６３／３９７，７７３号、２０２２年１０月１７日に出願された米国仮出願第６３／４１６，８５２号、及び２０２２年１０月３１日に出願された米国仮出願第６３／４２０，９９９号からの優先権の利益を主張する国際ＰＣＴ出願であり、これらの各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
電子配列表の参照
電子配列表の内容（３５ＰＨ＿００２＿０４ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ、サイズ：４１７，１６４バイト、及び作成日：２０２３年１月２７日）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子配列表の内容（３５ＰＨ＿００２＿０４ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ、サイズ：４１７，１６４バイト、及び作成日：２０２３年１月２７日）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、アクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）エクトドメイン（ＥＣＤ）バリアントを含むポリペプチドと、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドを結合及び中和するための、特に、肺高血圧症、線維症、筋力低下及び萎縮、代謝障害及び心臓代謝性疾患、骨損傷、ならびに低い赤血球レベルなどのＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達と関連する疾患ならびに状態の治療のためのその使用と、に関する。
トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーは、細胞増殖、遊走及び分化、筋肉増殖、血管恒常性、ならびに骨発生を含む、いくつかの生理学的プロセスを調節する３５個のリガンドを含む。それらのレベル及び／またはシグナル伝達経路の乱れは、顕著な病理学的効果を生じる。例えば、ＴＧＦβ及びアクチビンリガンドは、複数のヒト疾患の病因に関与しており、多くの疾患において重要な病原性の役割を果たす。ＴＧＦβスーパーファミリー関連障害の例としては、肺高血圧症（肺動脈高血圧症を含む）、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、骨髄不全状態、筋力低下、ならびに肺線維症、肝線維症、腎線維症及び心線維症、ならびに全身性硬化症（ＳＳｃ、強皮症とも呼ばれる）などの制御不能な線維症を特徴とする多種多様な障害が挙げられる（Ｎａｎｔｈａｋｕｍａｒ，Ｄ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｍｅｎｇ，Ｘ．－Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）。当該技術分野では、ＴＧＦβスーパーファミリー関連障害の治療に有効な治療薬の必要性が残っている。
本明細書では、アクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）－エクトドメイン（ＥＣＤ）ベースのトラップであって、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの結合及び中和のために調整されたリガンド特異性プロファイルを有する、トラップ、ならびにＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達と関連するか、またはそれによって媒介された疾患及び状態の治療における薬学的組成物及びその使用方法が提供される。
本明細書で提供されるＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤトラップは、２つのポリペプチドを一緒に組み立てるように機能することができるＦｃドメイン単量体に融合したＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントを含む。本明細書で提供されるＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、有害作用を最小限に抑えながら、ある特定の疾患適応症における治療有効性を最大化するために、リガンド特異性を調整するように設計されている。本明細書で提供されるＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及び／またはＧＤＦ－１１などの他のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの中和を維持及び／または増加させながら、内因性ＢＭＰ－９シグナル伝達の中断を予防または低減することを目的として、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤに新規のアミノ酸置換を導入することによって構築される。理論に限定されることを望むものではないが、ＢＭＰ－９シグナル伝達を回避する目的は、ＢＭＰ－９が血管静止及び恒常性の維持に重要であるという発見に基づいている（Ｄｅｓｒｏｃｈｅｓ－Ｃａｓｔａｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０２２）。野生型ＡｃｔＲＩＩＢは、ＢＭＰ－９に結合し、したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤベースのトラップは、出血の懸念をもたらし得る血管恒常性を破壊する可能性を有する。この概念を支持するために、毛細血管拡張症、鼻出血及び歯肉出血が、非変異ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤトラップ（ＡＣＥ－０３１と呼ばれる）の臨床研究において観察された（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１７）。これらの血管作用は、ＢＭＰ－９経路の阻害に起因し得ることが示唆された。
本明細書で提供される好ましいＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、（１）野生型ＡｃｔＲＩＩＢと比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０と同様または改善された結合（リガンド結合について内因性アクチビン受容体と競合し、内因性リガンド刺激受容体シグナル伝達を低減または阻害することを可能にする）、（２）野生型ＡｃｔＲＩＩＢと比較して、ＢＭＰ－９との結合の低減または除去（恒常的ＢＭＰ－９シグナル伝達を維持することを可能にする）を示す。これらのバリアントは、肺高血圧症（ＰＨ）（例えば、ＰＡＨ、静脈ＰＨ、低酸素ＰＨ、血栓塞栓性ＰＨ、もしくは雑種ＰＨ）、代謝性疾患、骨疾患、筋疾患、線維症、及び／または低い赤血球レベル（例えば、貧血）などのアクチビン受容体シグナル伝達が上昇する疾患及び状態を治療するために使用することができる。バリアントは、例えば、ＰＨの症状または進行の低減（例えば、ＰＡＨ、静脈ＰＨ、低酸素ＰＨ、血栓塞栓性ＰＨ、もしくは雑種ＰＨ）、骨吸収または破骨細胞活性の低減、骨形成または骨ミネラル密度の増加、筋肉量または筋力の増加、線維症の低減（例えば、線維症の減少、または線維症の進行の遅延もしくは停止）、及び／または赤血球レベルの増加（例えば、ヘモグロビンレベル、ヘマトクリット、もしくは赤血球数の増加）をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）アクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）エクトドメイン（ＥＣＤ）バリアント、（ｂ）少なくとも１０個のアミノ酸を含むペプチドリンカー、及び（ｃ）Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号２のヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤと比較して、Ｇ２７、Ｑ２９、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｓ３８、Ｄ５７、Ｆ５８、Ｖ７５、及びＦ７７から選択される位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、アミノ酸置換Ｇ２７Ｄを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号２０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、アミノ酸置換Ｑ２９Ｙを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、アミノ酸置換Ｄ３０Ｑを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号１５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、アミノ酸置換Ｋ３１Ｙを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号１６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、アミノ酸置換Ｓ３８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号１７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、アミノ酸置換Ｄ５７Ｅを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、Ｆ５８Ｄ、Ｆ５８Ｅ、Ｆ５８Ｙ、Ｆ５８Ｋ、Ｆ５８Ｑ、Ｆ５８Ｎ、Ｆ５８Ｒ、Ｆ５８Ｈ、及びＦ５８Ｗから選択される位置Ｆ５８にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、アミノ酸置換Ｆ５８Ｄを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントは、アミノ酸置換Ｆ５８Ｅを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、アミノ酸置換Ｆ５８Ｙを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、アミノ酸置換Ｆ５８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、アミノ酸置換Ｆ５８Ｑを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、アミノ酸置換Ｆ５８Ｗを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、アミノ酸置換Ｆ５８Ｎを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号１１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、アミノ酸置換Ｆ５８Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、アミノ酸置換Ｆ５８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号１２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、アミノ酸置換Ｖ７５Ｑを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号１８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、アミノ酸置換Ｆ７７Ｄを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、配列番号１９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、１つ以上の追加のアミノ酸置換を更に含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｎ末端に以下のアミノ酸：ＧＲＧＥＡ（配列番号２３）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｃ末端にアラニン－プロリン－トレオニン（ＡＰＴ）の３－アミノ酸伸長を更に含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、以下の構造：ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ－ペプチドリンカー－Ｆｃドメイン単量体を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプである。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、ヒトＦｃドメイン単量体またはマウスＦｃドメイン単量体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、ポリペプチドの二量体の凝集を低減するか、またはその安定性を調節するように操作される。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、Ｍ２５２Ｙアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、３５６位にＤ、及び３５８位にＬ（ＤＬ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、３５６位にＥ、及び３５８位にＭ（ＥＭ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、Ｃ末端にリジン残基（Ｋ）を更に含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、配列番号１３４～１７３及び３３８のうちのいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、配列番号１３４～１７３及び３３８のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、（ａ）ＩｇＧ１アイソタイプであり、配列番号１３５または配列番号１３４に示されるアミノ酸配列を含むか、もしくはそれからなる、または（ｂ）ＩｇＧ２アイソタイプであり、配列番号１５７に示されるアミノ酸配列を含むか、もしくはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、二量体を形成する。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシンリッチである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１０～４０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１９アミノ酸長、または少なくとも３９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０アミノ酸長、１４アミノ酸長、１９アミノ酸長、または３９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３４、５４、５９、または６３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤは、配列番号４～２２、３３１、３３２、及び２４～３３のうちのいずれか１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤは、配列番号４～２２、３３１、３３２、及び２４～３３のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤは、配列番号５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤは、配列番号８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤは、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１７４～２５４、３３３、及び３３９～３４１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１７４～２５４、３３３、及び３３９～３４１から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１８６、１９０～１９４、２３２～２３３、及び２４７～２４８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１８６、１９０～１９４、２３２～２３３、及び２４７～２４８から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１８６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１３～２１６及び２４２～２４４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１３～２１６及び２４２～２４４から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２２０～２２３、２５３、及び２５４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２２０～２２３、２５３、及び２５４から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、リンカーを介して、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤのＮ末端またはＣ末端に融合したアルブミン結合ドメイン、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミンドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤのＮ末端に配列番号１のシグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、標的化剤、治療部分、検出可能部分、または診断部分とコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、標的化剤、治療部分、検出可能部分、または診断部分は、抗体またはその抗原結合断片、ＴＧＦβスーパーファミリーの別のメンバーに対して、もしくは別の治療標的に対して親和性を有する結合剤、放射線療法剤、イメージング剤、蛍光部分、細胞傷害性剤、抗有糸分裂薬、ナノ粒子ベースの担体、ポリマーコンジュゲート薬、ナノ担体、イメージング剤、安定化剤、薬物、ナノ担体、またはデンドリマーを含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第１のポリペプチドのＦｃドメイン単量体と第２のポリペプチドのＦｃドメイン単量体との間の少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む二量体を形成する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の第１のポリペプチド及び本明細書に記載の第２のポリペプチドを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を提供し、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、第１のポリペプチドのＦｃドメイン単量体と第２のポリペプチドのＦｃドメイン単量体との間の少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、配列番号１７４～２５４、３３３、及び３３９～３４１から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、配列番号１８６、１９０～１９４、２３２～２３３、及び２４７～２４８から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、配列番号１８６、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、配列番号２１３～２１６、及び２４２～２４４から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、配列番号２２０～２２３、２５３、及び２５４から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは結合剤は、ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／または骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）－１０に結合し、ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤのヒトＢＭＰ－９への結合と比較して、ヒトＢＭＰ－９への結合が低減している。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは結合剤は、ヒトＢＭＰ－９に実質的に結合しない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは結合剤は、ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上のシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは結合剤は、ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達を阻害しない。
いくつかの実施形態では、ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対するポリペプチドまたは結合剤の阻害効力は、ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対するヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの阻害効力と比較して約１００倍、約２００倍、または約３００倍低い。いくつかの実施形態では、ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上に対するポリペプチドまたは結合剤の阻害効力は、同じそれぞれのリガンド（複数可）に対するヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの阻害効力と実質的に同じであるか、またはそれと比較して増加している。いくつかの実施形態では、ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上に対するポリペプチドの阻害効力は、同じそれぞれのリガンド（複数可）に対するヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの阻害効力と比較して約２倍、約３倍、約４倍、または約５倍以上増加する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号２５６～３３０、３３４、または３４２～３４４のうちのいずれか１つと、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号２５６～３３０、３３４、または３４２～３４４のうちのいずれか１つの核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、核酸分子の５’末端に配列番号２５５に示される配列を更に含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供し、核酸分子またはベクターは、宿主細胞内で発現される。
いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書に記載の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供することと、（ｂ）ポリペプチドの発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、（ｃ）培養物から発現されたポリペプチドを回収することと、を含む、本明細書に記載のポリペプチドを調製する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、注射または注入による投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与用に製剤化される。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは結合剤は、対象において血管合併症を引き起こさず、及び／または対象において血管透過性もしくは漏出を増加させない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは結合剤は、赤血球質量を増加させず、ヘモグロビンを増加させず、血小板減少症を引き起こさず、及び／または対象において血液合併症を引き起こさない。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチドもしくは結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物、及び任意選択で、使用説明書を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドシグナル伝達と関連する疾患または状態の治療または予防を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、方法は、本明細書に記載のポリペプチド、結合剤、または薬学的組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上である。
いくつかの実施形態では、本開示は、対象におけるアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０と関連するか、またはそれによって媒介された疾患または状態を治療または予防する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のポリペプチド、結合剤、または薬学的組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、アクチビンＡ及び／またはアクチビンＢ及び／またはＧＤＦ－８及び／またはＧＤＦ－１１の過剰発現または過剰活性化を特徴とする。
いくつかの実施形態では、疾患または状態は、肺高血圧症（ＰＨ）、線維症、筋力低下または萎縮、代謝障害、心臓代謝性疾患、骨損傷、及び低い赤血球レベルから選択される。
いくつかの実施形態では、ＰＨは、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨは、感染症、先天性心臓異常、門脈高血圧症、肺静脈閉塞性疾患、肺毛細血管腫症、結合組織障害、慢性閉塞性肺疾患、自己免疫障害（例えば、強皮症もしくはループス）、または薬物使用（例えば、コカインもしくはメタンフェタミンの使用）と関連する特発性ＰＡＨ、遺伝性ＰＡＨ、またはＰＡＨである。
いくつかの実施形態では、線維症は、肺線維症、特発性肺線維症、腎線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝線維症、肺線維症、腎線維症（ｋｉｄｎｅｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、骨髄線維症、全身性硬化症、皮膚線維症、心臓線維症、骨髄線維症、角膜線維症、縦隔線維症、後腹膜線維症、骨関節線維症、関節線維症、組織線維症、線維腫増殖性障害、または結合組織障害である。
いくつかの実施形態では、筋力低下または萎縮疾患もしくは状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、サルコペニア、またはがん悪液質である。
いくつかの実施形態では、代謝障害は、肥満、１型糖尿病、２型糖尿病、または前糖尿病である。
いくつかの実施形態では、心臓代謝性疾患または状態は、駆出率低下を伴う心不全（ＨＦｒＥＦ）または駆出率維持を伴う心不全（ＨＦｐＥＦ）である。
いくつかの実施形態では、骨損傷は、骨脱塩、骨粗しょう症（例えば、原発性もしくは二次性）、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくはがん転移関連の骨損失、パジェット病、腎性骨ジストロフィー、治療関連の骨損失、食事関連の骨損失、肥満の治療に関連する骨損失、低重力関連の骨損失、または不動性関連の骨損失を含む。
いくつかの実施形態では、低い血球レベルの疾患または状態は、貧血または失血である。
いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＢＭＰ９シグナル伝達を実質的に低減または阻害することなく、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１及び／またはＢＭＰ１０シグナル伝達を低減または阻害することを必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、方法は、本明細書に記載のポリペプチド、結合剤、または薬学的組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳類である。いくつかの実施形態では、哺乳類は、ヒトである。
いくつかの実施形態では、方法は、対象において血管合併症を引き起こさず、対象において血管透過性もしくは漏出を増加させず、赤血球質量を増加させず、ヘモグロビンを増加させず、血小板減少を引き起こさず、及び／または対象において血液合併症を引き起こさない。
本技術の更なる範囲、適用可能性及び利点は、以下に与えられる非限定的な詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、この詳細な説明は、本技術の例示的な実施形態を示すが、添付の図面を参照して、単なる例として提供されることを理解されるべきである。
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開の複写は、要請かつ必要な料金の支払により特許庁より提供される。
技術のより良い理解のために、及び技術がどのように実施され得るかをより明確に示すために、ここでは、本技術の非限定的な実施形態による態様及び特徴を図示する添付の図面を例として参照する。
概要
アクチビンＩＩ型受容体は、ＴＧＦβスーパーファミリーにおけるリガンドのシグナルを調節する単一の膜貫通ドメイン受容体である。アクチビンＩＩ型受容体には、２つのタイプ：ＡｃｔＲＩＩＡ及びＡｃｔＲＩＩＢが存在する。ＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドの例としては、アクチビン（例えば、アクチビンＡ及びアクチビンＢ）、インヒビン、成長分化因子（ＧＤＦ）（例えば、ＧＤＦ－８、ミオスタチン及びＧＤＦ－１１としても知られる）、及び骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）（ＢＭＰ－９、ＢＭＰ－１０）が挙げられる。ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの活性は、肺高血圧症（ＰＨ）、線維症、筋疾患（筋ジストロフィーを含む）、代謝障害（ＩＩ型糖尿病を含む）、骨疾患、及び貧血を含む様々な疾患及び障害に関与している。
アクチビンＩＩ型受容体は、ＴＧＦβスーパーファミリーにおけるリガンドのシグナルを調節する単一の膜貫通ドメイン受容体である。アクチビンＩＩ型受容体には、２つのタイプ：ＡｃｔＲＩＩＡ及びＡｃｔＲＩＩＢが存在する。ＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドの例としては、アクチビン（例えば、アクチビンＡ及びアクチビンＢ）、インヒビン、成長分化因子（ＧＤＦ）（例えば、ＧＤＦ－８、ミオスタチン及びＧＤＦ－１１としても知られる）、及び骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）（ＢＭＰ－９、ＢＭＰ－１０）が挙げられる。ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの活性は、肺高血圧症（ＰＨ）、線維症、筋疾患（筋ジストロフィーを含む）、代謝障害（ＩＩ型糖尿病を含む）、骨疾患、及び貧血を含む様々な疾患及び障害に関与している。
ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド機能を阻害する治療薬を開発するための１つのアプローチは、可溶性デコイ受容体（受容体エクトドメイン（ＥＣＤ）ベースのリガンドトラップとも呼ばれる）を使用してリガンドに結合及び隔離し、それによって細胞表面受容体へのアクセスを遮断することであった。一般に、受容体ＥＣＤベースのトラップは、リガンドを選択的に隔離することができ、タンパク質操作アプローチを使用して最適化することができる治療剤のクラスである。例えば、ＴＧＦβ１及び／またはＴＧＦβ２及び／またはＴＧＦβ３リガンドアイソフォームに結合または「トラップ」するＴＧＦβ受容体エクトドメインに基づくポリペプチド融合物が、ＴＧＦβシグナル伝達を阻害するために使用されている（例えば、ＷＯ０１／８３５２５、ＷＯ２００５／０２８５１７、ＷＯ２００８／１１３１８５、ＷＯ２００８／１５７３６７、ＷＯ２０１０／００３１１６８、ＷＯ２０１０／０９９２１９、ＷＯ２０１２／０７１６４９、ＷＯ２０１２／１４２５１５、ＷＯ２０１３／０００２３４、ＷＯ２０１８／１５８７２７、ＵＳ５６９３６０７、ＵＳ２００５／０２０３０２２、ＵＳ２００７／０２４４０４２、ＵＳ８３１８１３５、ＵＳ８６５８１３５、ＵＳ８８１５２４７、ＵＳ２０１５／０２２５４８３、ＵＳ２０１５／００５６１９９、及びＷＯ２０１７／０３７６３４を参照）。
肺の内皮及び血管系において、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）及び内皮細胞（ＥＣ）の生存における抗増殖効果を誘導することができ、一方、アクチビン及び成長分化因子（ＧＤＦ）は、相反する効果、すなわち、ＳＭＣにおける増殖促進効果及びＥＣのアポトーシスを誘導することができる（Ｙｕｎｇ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０２０、Ｒｙａｎｔｏ，Ｇ．Ｒ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，２０２１）。生理学的条件下では、これらのリガンドは、恒常性を維持するために協調して作用する。しかしながら、ＰＡＨなどのある特定の疾患状態では、これらの経路が不均衡になる。例えば、ＰＡＨの家族性症例の約８０％及び特発性症例の約２０％は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）２型受容体（ＢＭＰＲ２）の変異によって引き起こされる（Ａｕｓｔｉｎ，Ｅ．Ｄ．ａｎｄ Ｌｏｙｄ，Ｊ．Ｅ．，２００７、Ｑｕａｒｃｋ，Ｒ．ａｎｄ Ｐｅｒｒｏｓ，Ｆ．，２０１７）。これは、アクチビン／ＧＤＦとＢＭＰシグナル伝達経路との間の不均衡をもたらす（Ｒｙａｎｔｏ，Ｇ．Ｒ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，２０２１）。したがって、経路を再バランスさせ、血管恒常性を再確立するために、ある特定のリガンドを中和することができ、他のリガンドを中和することができない受容体エクトドメインベースのトラップを提供することが望ましい。
いくつかのＥＣＤベースのトラップは、１つ以上のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドへの結合を改変するために、化合物のエクトドメイン部分にアミノ酸変異を含む。例えば、ＷＯ２０２１／１５８６７５、ＷＯ２０２２／１５０５９０、ＷＯ２０２１／１５８６７５、ＷＯ２０２２／０７２８８２、ＷＯ２０２１／１８９０１９、及びＷＯ２０２１／１８９０１０を参照されたい。ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤにおける点変異は、他のトラップベースの薬剤の文脈で説明されているが、本開示は、長いペプチドリンカーと組み合わせた場合のこれらの変異の効果を強調する。具体的には、本出願のデータは、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤのある特定の変異が、長いペプチドリンカー（すなわち、１０以上のアミノ酸）と組み合わせた場合、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合に予測不可能な効果を有することを実証する。
したがって、本出願は、改善されたリガンド結合プロファイル及び治療有効性を示すＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を提供する。ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤにおける点変異と本明細書に記載の長いリンカーとの組み合わせは、これらの点変異の有益なリガンド結合プロファイルが特定の長さのリンカーとの組み合わせによって更に増強され得る、プラットフォームを提供する。これらのプラットフォーム化合物は、肺高血圧症、筋肉疾患、代謝障害、骨疾患、貧血、及び線維症を含む、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドによって駆動される様々な疾患及び障害の治療に有用である。
本技術は、以下でより詳細に説明される。この説明は、技術が実装され得る全ての異なる方法、または本技術に追加され得る全ての特徴の詳細なカタログであることを意図するものではない。例えば、一実施形態に関して示される特徴は、他の実施形態に組み込まれてもよく、特定の実施形態に関して示される特徴は、その実施形態から削除されてもよい。加えて、本明細書に示唆される様々な実施形態に対する多数の変形及び追加は、本開示に照らして当業者には明らかであり、その変形及び追加は、本技術から逸脱しない。したがって、以下の説明は、本技術のいくつかの特定の実施形態を例示することを意図しており、その全ての順列、組み合わせ、及び変形を網羅的に指定することを意図していない。
定義
本明細書で使用される用語の明確で一貫した理解を提供するために、いくつかの定義を以下に提供する。更に、別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書で使用される用語の明確で一貫した理解を提供するために、いくつかの定義を以下に提供する。更に、別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。
特許請求の範囲及び／または明細書において「含む」という用語とともに使用されるときの「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」及び「１つまたは２つ以上」の意味とも一致する。同様に、「別の」という用語は、少なくとも第２のまたはそれ以上を意味し得る。これらの用語は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を網羅するように解釈されるべきである。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの任意の形態の含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ））、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」などの任意の形態の有する（ｈａｖｉｎｇ））、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」などの任意の形態の含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ））または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」などの任意の形態の含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ））という用語は、包括的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素またはプロセスステップを除外しない。「からなる」という用語は、クローズエンドとして解釈されるべきである。
「約」という用語は、値または量が、実際の所与の値、及びそのような所与の値に対する実験及び／または測定条件による等価及び近似を含む、当該技術分野における一般的な技術に基づいて合理的に推測されるであろうそのような所与の値の近似を指すことを示すために使用される。例えば、所与の値または範囲の文脈における「約」という用語は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１５％以内、より好ましくは１０％以内、より好ましくは９％以内、より好ましくは８％以内、より好ましくは７％以内、より好ましくは６％以内、及びより好ましくは５％以内の値または範囲を指す。
本明細書で使用される場合、「及び／または」という表現は、他のものの有無にかかわらず、指定された特徴または構成要素の各々の具体的な開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示として、あたかも各々が本明細書に個々に記載されているかのように解釈されるべきである。「または」という用語は、本明細書で使用される場合、具体的に記載されていないか、または文脈から明らかでない限り、包含的であると理解され、「または」及び「及び」の両方を包含する。例えば、「ＡまたはＢを含む組成物」の一実施形態は、典型的には、Ａ及びＢの両方を含む組成物を有する態様を提示するであろう。しかしながら、「または」は、矛盾なしに組み合わせることができないそれらの態様（例えば、９～１０または７～８の組成物ｐＨ）を除外すると解釈されるべきである。
本明細書では、「１～２０」などの用語が、１及び２０を含めてこれらの中に含まれる任意の個々の値を含むことを理解されたい。したがって、「１～２０」という用語は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び／または２０を含む。「１～２０」などの用語はまた、１及び２０を含めてこれらの中に含まれる任意の個々の部分範囲を含む。したがって、「１～２０」という用語はまた、「１～９」、「２～９」、「３～５」、「５～９」、「５～２０」、「８～２０」などの部分範囲を含む。同じことが、「１～１９」、「１～１８」、「１～１０」、「１～９」、「５～１５」などの類似の表現にも当てはまるが、これらに限定されない。
本明細書では、「約１５～約３５」などの用語が、１５及び３５を含めてこれらの中に含まれる任意の個々の値を含むことを理解されたい。したがって、「約１５～約３５」などの用語は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、及び／または３５などの１５及び３５を含めてこれらの間の任意の数を含む。「約１５～約３５」などの用語はまた、１５及び３５を含めてこれらの中に含まれる任意の個々の部分範囲、「約１６～約３４」、「約１６～約２４」、「約２４～約３４」などを含む。アミノ酸の数の文脈における「約」という用語は、特定の数のアミノ酸が特異的に包含され、アミノ酸残基の数の＋／－２の変動を可能にすることを意味する。したがって、「約１５～約３５」などの用語はまた、「１３～３７」、「１３～３５」、「１７～３７」、「１７～３５」などを含む。同じことは、「約１６～約３４」、「約１６～約２４」、約２４～約３４」などの同様の表現にも当てはまるが、これらに限定されない。
本明細書では、「少なくとも８０％同一」などの用語は、８０％及び１００％を含めてこれらの中に含まれ、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％を含む任意の個々の値を含むことを理解されたい。「少なくとも８０％同一」という用語はまた、例えば、「８５％～９９％」、「９７％～１００％」、「９０％～１００％」など、８０％及び１００％を含めてこれらの中に含まれる任意の個々の部分範囲を含む。同じことは、同様の表現、例えば、「少なくとも７０％同一」、「少なくとも９０％同一」などの表現にも当てはまるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ＩＣ５０」という用語は、半最大阻害濃度（すなわち、インビトロで５０％の阻害に必要な物質の濃度）を指す。それは、特定の生物学的または生化学的機能を阻害する物質の効力または有効性の尺度である。ＩＣ５０値は、典型的には、モル濃度として表される。阻害剤のＩＣ５０は、用量反応曲線を構築し、問題の特定の生物学的または生化学的機能に対する異なる濃度の阻害剤の効果を調べることによって決定することができる。
本明細書で使用される場合、「阻害効力」という用語は、限定されないが、タンパク質受容体とそのリガンドとの間の結合、またはそのリガンドによる細胞受容体の活性化などの特定の生物学的または生化学的機能を阻害する物質の有効性を指す。いくつかの実施形態では、阻害の効力は、特定のリガンドまたは物質に対する阻害剤のＩＣ５０を測定することによって決定される。その場合、異なる阻害剤及び／またはリガンドに対する相対阻害効力は、ＩＣ５０値を比較することによって評価され得る。例えば、３：１の相対阻害効力は、比較されている２つの物質のＩＣ５０値の比が３：１であることを意味し、第１の物質は、第２の物質よりも低い阻害効力（すなわち、より大きいＩＣ５０）を有する。１：３の相対阻害効力は、比較されている２つの物質のＩＣ５０値の比が１：３であることを意味し、第１の物質は、第２の物質よりも高い阻害効力（すなわち、より低いＩＣ５０）を有する。阻害剤のＩＣ５０は、アッセイ条件によって異なる可能性があるため、異なる阻害剤及び／またはリガンドに対する相対阻害効力は、一般に、同じアッセイ条件下で得られたＩＣ５０値を比較することによって決定される。「阻害効力（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｃｙ）」、「阻害効力（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｏｔｅｎｃｙ）」、「阻害の効力」、及び「中和効力」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、相対阻害効力に関して「実質的に同じ」という用語は、２つのタンパク質が、同じ実験条件、例えば、２つのタンパク質のＩＣ５０値の比が約２：１、１：２、または１：１である条件下で、ほぼ同じ、例えば、約２倍以下の異なる（＋／－２倍）相対阻害効力を有することを意味する。
本明細書で使用される場合、「機能的に同等の」という用語は、それが由来する元の配列と同じまたは実質的に同じ生物学的活性または機能、例えば、元の配列と比較して生理学的、化学的、理化学的または機能的特性に著しい変化がないバリアント配列を指す。「実質的に同一の」という用語は、元の配列または参照配列と機能的に等価であり、それに対して高度な配列同一性を有する配列を指す。一般に、実質的に同一の配列は、元の配列または参照配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり、同じ機能を有する。場合によっては、核酸配列を指すとき、実質的に同一の配列は、高いストリンジェンシー条件下、例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄の両方について、０．５Ｘ ＳＳＣ～約５Ｘ ＳＳＣ及び６５℃に実質的に等しい塩及び温度条件下で、元の配列にハイブリダイズする。
「二量体」という用語は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤（本明細書では「結合剤」とも称される）における本明細書に記載される２つのポリペプチドの存在を指す。「ホモ二量体」は、２つのポリペプチドが同じアミノ酸配列を有することを意味するが、「ヘテロ二量体」は、２つのポリペプチドが異なるアミノ酸配列を有することを意味する。
「二価」という用語は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤における２つのＴＧＦβＲスーパーファミリーリガンド結合領域（例えば、エクトドメイン）の存在を指す。
本明細書で使用される場合、「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ技術または遺伝子操作の使用を通じて作製されたポリペプチドである。本開示の文脈において、組換えポリペプチドは、しばしば「ポリペプチド構築物」または単に「ポリペプチド」と称される。
タンパク質（その断片、好ましくは生物学的に活性な断片、及び通常３０アミノ酸未満を有するペプチドを含む）は、共有結合ペプチド結合を介して互いにカップリングされた２つ以上のアミノ酸を含む（アミノ酸の鎖をもたらす）。本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、通常１０個より多くのアミノ酸からなる分子群を説明する。「ポリペプチド」、「ポリペプチド鎖」及び「鎖」という用語は、本明細書において互換的に使用される。ポリペプチドは、更に、二量体、三量体、及びより高いオリゴマーなどの多量体、すなわち、２つ以上のポリペプチド分子からなる多量体を形成し得る。そのような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一であっても非同一であってもよい。そのような多量体の対応する高次構造は、結果として、ホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体などと呼ばれる。ヘテロ多量体の例は、天然に存在する形態では、２つの同一の軽ポリペプチド鎖及び２つの同一の重ポリペプチド鎖からなる抗体分子である。「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語はまた、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの翻訳後修飾によって、修飾が行われる天然に修飾されたペプチド／ポリペプチド／タンパク質を指す。本明細書で言及される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」もまた、ペグ化など化学修飾され得る。そのような修飾は、当該技術分野において周知であり、本明細書に記載される。
本明細書で使用される場合、「（特異的に）に結合する」、「（特異的に）認識する」、「に特異的」、「（特異的に）向けられる」、及び「（特異的に）反応する」という用語は、ポリペプチドが、リガンドのＴＧＦβスーパーファミリーの特異的メンバー（複数可）などの所与の標的（複数可）と相互作用するか、または特異的に相互作用することを意味する。特異的結合は、ポリペプチドのアミノ酸配列における特異的モチーフによって影響を受けると考えられている。したがって、結合は、それらの一次、二次及び／または三次構造ならびに当該構造の二次修飾の結果として達成される。標的－相互作用部位とその特異的標的との特異的相互作用は、当該部位の標的への単純な結合をもたらし得る。更に、標的相互作用部位とその特異的標的との特異的相互作用は、代替的または追加的に、例えば、標的のコンフォメーションの変化の誘導、標的のオリゴマー化などに起因して、シグナルの開始をもたらし得るか、または内因性受容体への結合などの別の活性を標的が行うことを遮断し得る。
一般に、結合親和性が約１０－１２～１０－９Ｍ、１０－１２～１０－１９Ｍ、１０－１１～１０－９Ｍ、または約１０－１１～１０－９Ｍである場合、結合は特異的であると考えられる。ポリペプチドまたは結合剤が標的と特異的に反応するか、または標的に結合するかどうかは、とりわけ、ポリペプチドまたは結合剤と標的との反応を、ポリペプチドまたは結合剤と他のタンパク質との反応と比較することによって容易に試験することができる。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドまたは結合剤は、所望のリガンド以外に、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドに実質的に結合せず、例えば、ＢＭＰ－９に実質的に結合しない。
本明細書で使用される場合、「実質的に結合しない」または「結合することができない」という用語は、本開示のポリペプチドまたは結合剤が所与の標的に対する検出可能な結合を示していないこと、例えば、所与の標的と３０％以下、２０％以下、１０％以下、または９％、８％、７％、６％、５％、または３％以下の反応性を示していないことを意味する。
本明細書で使用される場合、「選択的に結合する」という用語は、ポリペプチドが他のタンパク質と共有されていない標的部位に結合することを意味するために使用される。一般に、選択的結合剤は、他のタンパク質と交差反応せず、指定された標的タンパク質（複数可）に排他的に結合する。本開示の文脈において、「アクチビンＡ及びＧＤＦ－８に対して選択的」とは、例えば、ＢＭＰ－９などの他のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドに実質的に結合または中和することなく、ポリペプチドまたは結合剤がアクチビンＡ及びＧＤＦ－８リガンドに独占的に結合または中和することを意味する。
「半減期」は、投与される薬物の５０％が、生物学的プロセス、例えば、代謝、排泄などを通じて排除される時間を意味する。
「肝臓ファーストパス代謝」とは、肝臓との最初の接触時、すなわち、肝臓を通過する最初のパス中に代謝される薬物の傾向を指す。
「分布体積」は、例えば、細胞内及び細胞外空間、組織及び臓器などの身体の様々な区画にわたる薬物の保持の程度、ならびにこれらの区画内の薬物の分布を指す。
「血清結合の程度」は、アルブミンなどの血清タンパク質と相互作用し、結合し、薬物の生物活性の低下または喪失をもたらす薬物の傾向を指す。
「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、典型的には、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＨｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロライン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、及びバリン（ＶａｌまたはＶ）からなる群から選択されるアミノ酸など、その当該技術分野で認識される定義を有するアミノ酸を指すが、修飾されたアミノ酸、合成アミノ酸、または希少アミノ酸が、所望に応じて使用されてもよい。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）、負荷電側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、正荷電側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）、または非荷電極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｉｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）を有するように分類することができる。
同様に、本明細書に特定されるポリペプチドまたは結合剤の核酸配列に対する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、ポリペプチドまたは結合剤のコード配列中のヌクレオチド残基と同一の候補配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。特定の方法は、デフォルトパラメータに設定されたＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用し、オーバーラップスパン及びオーバーラップ分数は、それぞれ１及び０．１２５に設定される。
ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤
いくつかの実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ領域、リンカー領域、及びＦｃドメイン（本明細書では「結合剤」または「ＴＧＦβリガンド結合剤」とも称される）を含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を提供する。本明細書に記載の結合剤の個々の構成要素については、以下の章に更に詳細に記載されている。しかしながら、一般に、本明細書に記載の結合剤は、各々がＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ、ペプチドリンカー、及びＦｃドメイン単量体を含む２つのポリペプチドを含む二量体タンパク質である。２つのポリペプチドは、Ｆｃドメイン単量体を介して組み立てられて、本明細書に記載の二量体結合剤を形成する。図３６の概略図を参照されたい。組み立てると、各ポリペプチドにおけるＦｃドメイン単量体は、一方の末端で二量体Ｆｃドメインを形成し、他方の末端で二価のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ領域を形成する。本開示の結合剤は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０から選択される１つ以上のリガンドに結合し、ＢＭＰ－９に実質的に結合することなく、及び／またはその受容体を通じたＢＭＰ－９シグナル伝達を阻害することなく、それぞれの受容体を通じた１つ以上のリガンドのシグナル伝達を阻害することができる。結合剤はまた、本明細書に更に記載されるように、他のリガンドまたは標的への結合などの更なる生物学的活性または機能を有し得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ領域、リンカー領域、及びＦｃドメイン（本明細書では「結合剤」または「ＴＧＦβリガンド結合剤」とも称される）を含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を提供する。本明細書に記載の結合剤の個々の構成要素については、以下の章に更に詳細に記載されている。しかしながら、一般に、本明細書に記載の結合剤は、各々がＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ、ペプチドリンカー、及びＦｃドメイン単量体を含む２つのポリペプチドを含む二量体タンパク質である。２つのポリペプチドは、Ｆｃドメイン単量体を介して組み立てられて、本明細書に記載の二量体結合剤を形成する。図３６の概略図を参照されたい。組み立てると、各ポリペプチドにおけるＦｃドメイン単量体は、一方の末端で二量体Ｆｃドメインを形成し、他方の末端で二価のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ領域を形成する。本開示の結合剤は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０から選択される１つ以上のリガンドに結合し、ＢＭＰ－９に実質的に結合することなく、及び／またはその受容体を通じたＢＭＰ－９シグナル伝達を阻害することなく、それぞれの受容体を通じた１つ以上のリガンドのシグナル伝達を阻害することができる。結合剤はまた、本明細書に更に記載されるように、他のリガンドまたは標的への結合などの更なる生物学的活性または機能を有し得る。
いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、抗体のＦｃドメイン単量体を介して、または定常ＣＨ２ドメイン、定常ＣＨ３ドメイン、及び／またはＣＨ２及びＣＨ３の組み合わせを介して会合する２つのポリペプチド鎖を含む。抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体由来であり得るか、またはそれらと実質的に同一であり得る。両方のポリペプチド鎖の会合は、一般に、タンパク質の発現及び分泌中に、例えば、哺乳動物細胞において生じる。Ｆｃドメイン単量体は、一般に、ヒト由来であり、典型的には一本鎖ポリペプチド間のジスルフィド架橋を提供する抗体重鎖由来のＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ２及びＣＨ３を含む。一実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、一本鎖ポリペプチド間に少なくとも１つのジスルフィド結合を提供する。別の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、一本鎖ポリペプチド間に少なくとも２つのジスルフィド結合を提供する。場合によっては、抗体重鎖は、例えば、宿主細胞での産生後、二量体ポリペプチドのプロテインＡベースの単離も提供する。
上述のように、ＥＣＤにおけるある特定のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤及び点変異は、当該技術分野において記載されている。例えば、ＷＯ２０２１／１５８６７５、ＷＯ２０２２／１５０５９０、ＷＯ２０２１／１５８６７５、ＷＯ２０２２／０７２８８２、ＷＯ２０２１／１８９０１９、及びＷＯ２０２１／１８９０１０を参照されたい。ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤにおける点変異は、他のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤の文脈で説明されているが、これらの前述の薬剤の文脈でのこれらの変異の効果は、本明細書に記載の結合剤の文脈でのこれらの同じ変異の効果を予測しない。具体的には、本出願のデータは、ＡｃｔＲＩＩＢにおけるある特定の変異が、可変長のペプチドリンカーと組み合わせた場合、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合に予測不可能な効果を有することを実証する。
例えば、Ｐ１２１、Ｐ６２２、Ｐ６２４、Ｐ６６６、及びＰ６６７は各々、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤにおけるＦ５８Ｅ変異を有する。Ｐ１２１及びＰ６２４は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤとＦｃドメインとを接続する３ａａリンカーを有し、Ｐ６２２は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤとＦｃドメインとを接続する１４ａａリンカーを有し、Ｐ６６６は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤとＦｃドメインとを接続する１９ａａリンカーを有し、Ｐ６６７は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤとＦｃドメインとを接続する３９ａａリンカーを有する。以下の表９に示されるように、Ｆ５８Ｅ変異とより長いリンカー（１４ａａ以上）との組み合わせは、短い（３ａａ）リンカーとの組み合わせにおける同じ変異と比較して、アクチビンＡ及びアクチビンＢに対するＰ６２２、Ｐ６６６、及びＰ６６７結合剤の阻害効力を増加させた。ＧＤＦ－８及びＧＤＦ－１１に対する阻害効力は、Ｆ５８Ｅ変異を含む短いリンカー結合剤と長いリンカー結合剤との間で類似したままであった。図１０Ｃ及び１０Ｄを参照されたい。より長いリンカー（１４ａａ）と組み合わせたＦ５８Ｅ変異はまた、ＰＡＨのラットモデルにおいて優れた治療効果を示した（実施例５を参照）。
同様に、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤへのＤ５７Ｅ変異の導入は、長いリンカー（１４ａａ）と組み合わせたときに融合タンパク質の阻害効力を増加させた。例えば、Ｐ７５９は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤとＦｃドメインとを接続する１４ａａリンカーを有し、Ｐ１２０は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤとＦｃドメインとを接続する３ａａリンカーを有する。Ｐ７５９及びＰ１２０の各々は、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤにおけるＤ５７Ｅ変異を含む。表９ならびに図１０Ｅ及び図１０Ｆに示されるように、Ｐ７５９は、短い（３ａａ）リンカーと組み合わせた同じ変異と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１の各々について増加した阻害効力を示した（Ｐ１２０）。
対照的に、Ｋ３１ＹまたはＧ２７Ｄ変異の導入は、短いリンカー及び長いリンカーと組み合わせたときに全く異なる効果を有した。Ｐ１２４結合剤及びＰ７６１結合剤の各々は、Ｋ３１Ｙ変異を含む。Ｐ７５８結合剤及びＰ１１９結合剤の各々は、Ｇ２７Ｄ変異を含む。より長いリンカー（１４ａａ以上）とのＫ３１ＹまたはＧ２７Ｄ変異のいずれかの組み合わせは、短い（３ａａ）リンカーと組み合わせた同じ変異と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１に対するＰ１２４結合剤及びＰ７５８結合剤の阻害効力を減少させた（Ｐ１１９及びＰ７６１）。図１０Ｇ～１０Ｊを参照されたい。
更に、Ｖ７５Ｑ変異の導入もまた、短いリンカー及び長いリンカーと組み合わせたときに予測不可能な効果を示した。Ｐ７６２結合剤及びＰ１２６結合剤の各々は、Ｖ７５Ｑ変異を含む。しかしながら、上述のＦ５８Ｅ、Ｋ３１Ｙ、及びＧ２７Ｄ変異とは対照的に、異なるリンカー長を有するＶ７５Ｑ変異の組み合わせは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、またはＢＭＰ－９のいずれかに対する阻害効力に影響を及ぼさなかった。各リガンドの阻害効力は、Ｖ７５Ｑ変異を含む短いリンカー剤と長いリンカー剤との間で類似したままであった。図１０Ｋ及び図１０Ｌを参照されたい。
したがって、本明細書に記載の特定の結合剤の有効性は、細胞外リガンド結合ドメインに含まれる変異だけでなく、使用されるリンカーの長さによっても決定される。上述したように、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤにおける点変異と、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤをＦｃドメインに接続するリンカーの長さとの組み合わせは、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドへの結合及びその阻害に予測不可能な効果を有する。
追加のＥＣＤベースのトラップ、例えば、ルスパテルセプト（ｌｕｓｐａｔｅｒｃｅｐｔ）及びソタテルセプト（ｓｏｔａｔｅｒｃｅｐｔ）などが、臨床的に評価されている。ルスパテルセプト（ＡＣＥ－５３６、ＲＥＢＬＯＺＹＬ（登録商標）としても知られる）は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）の細胞外ドメインの修飾形態で構成される可溶性融合タンパク質である。ルスパテルセプトは、いくつかの内因性ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドを阻害し、それによってＳｍａｄ２／３シグナル伝達を減少させる。ベータサラセミア及び骨髄異形成症候群における貧血の治療に使用される。ルスパテルセプト及び他の関連する融合タンパク質の説明については、例えば、米国特許第７，８４２，６６３号、同第８，０５８，２２９号、同第８，２１６，９９７号、同第８，２５２，９００号、同第８，３４３，９３３号、同第８，３６１，９５７号、同第８，７０３，９２７号、同第９，１３８，４５９号、同第９，３９９，６６９号、同第９，４３９，９４５号、同第９，９３２，３７９号、同第１０，１３１，７００号、同第１０，２５９，８６１号、同第１０，６８９，４２７号、及び同第１０，８２９，５３２号を参照されたい。
ソタテルセプト（ＡＣＥ－０１１としても知られる）は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたアクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）の細胞外ドメインで構成され、アクチビン及びＧＤＦに結合し、中和することができる可溶性デコイ受容体である。ソタテルセプトは、健康なボランティア、及び血液障害、骨損失、化学療法誘発性貧血、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、β－サラセミア、及び末期腎疾患を含む機能不全ＴＧＦ－βスーパーファミリーシグナル伝達を特徴とする状態を有する患者において評価されている（Ｒａｆｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ａｂｄｕｌｋａｄｙｒｏｖ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｒｕｃｋｌｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．２００９、Ｋｏｍｒｏｋｊｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｃａｐｐｅｌｌｉｎｉ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１９、Ｃｏｙｎｅ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，２０１９、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０１３）。最近では、ソタテルセプトは肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）の治療のために評価されている。
アクチビン及びＧＤＦのためのリガンドトラップとして作用することによって、ソタテルセプトは、成長促進アクチビン／成長分化因子経路と、ＰＡＨで生じる成長阻害ＢＭＰ経路との間の不均衡を修正し得る。ＰＡＨ患者における第２相治験では、ソタテルセプトは、肺血管抵抗を低減することが示された（Ｈｕｍｂｅｒｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０２１）。第３相治験を含む追加のＰＨ治験は、進行中または計画中である。ソタテルセプト及び他の関連する融合タンパク質の説明については、例えば、米国特許第７，６１２，０４１号、同第７，７０９，６０５号、同第７，９５１，７７１号、同第７，９８８，９７３号、同第８，００７，８０９号、同第８，６２９，１０９号、同第８，８９５，０１６号、及び９，１６３，０７５号を参照されたい。しかしながら、ソタテルセプトのいくつかの臨床研究では、血管及び血液学的副作用は、用量制限的であり、潜在的な治療有効性を制限することが見出されている。例えば、健康な閉経後女性を対象とした多重上昇用量研究では、０．１、０．３、１ｍｇ／ｋｇ、及び２ｍｇ／ｋｇの４つの用量を評価する予定であったが、ヘモグロビン、ヘマトクリット、及び赤血球数の増加が用量制限であることが判明したため、１ｍｇ／ｋｇレベルで早期に終了した（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＰＡＨ患者における第２相臨床治験では、血小板減少及びヘモグロビンレベルの増加が最も一般的な血液学的有害事象であり、０．７ｍｇ／ｋｇの用量を受けた患者の１７％がヘモグロビンの増加の有害事象を経験していた（Ｈｕｍｂｅｒｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０２１）。そのような血管及び血液学的副作用は、最大の有効性に必要な投与量の投与を可能にしない可能性があり、最大の治療効果を達成する可能性を制限するため、用量制限的である（Ｈｕｍｂｅｒｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０２１）。対照的に、本明細書で提供する結合剤（例えば、Ｐ６２２及びＰ６２４）は、非ヒト霊長類において血液学的効果を誘導せず、これらの薬剤がソタテルセプトよりも広い治療窓を有し得ることを示唆する。
いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、ホモ二量体、すなわち、配列番号１７４～２５４、３３３、もしくは３３９～３４１のうちのいずれか１つに示される配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列、またはその機能的に等価なバリアントを有するポリペプチドの二量体を含む。他の実施形態では、結合剤は、ヘテロ二量体、すなわち、２つの異なるポリペプチドの二量体、配列番号１７４～２５４、３３３、もしくは３３９～３４１のうちのいずれか１つに示される配列を有するポリペプチドのうちの少なくとも１つ、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列、もしくはその機能的に等価なバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、Ｆ５８Ｅ変異及び長いペプチドリンカーを含むＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤを含むポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１０アミノ酸長であるか、または少なくとも１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１４アミノ酸長であるか、または少なくとも１４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１９アミノ酸長であるか、または少なくとも１９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、３９アミノ酸長であるか、または少なくとも３９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号１８６、１９０～１９４、２３２～２３３、及び２４７～２４８から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号１８６またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号１９０またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号１９１またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号１９２またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号１９３またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号１９４またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２３２またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２３３またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２４７またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２４８またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、Ｆ５８Ｋ変異及び長いペプチドリンカーを含むＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤを含むポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１０アミノ酸長であるか、または少なくとも１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１４アミノ酸長であるか、または少なくとも１４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１９アミノ酸長であるか、または少なくとも１９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、３９アミノ酸長であるか、または少なくとも３９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２１３～２１６もしくは２４２～２４４から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２１３、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２１４またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２１５またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２１６またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２４２またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２４３またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２４４またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、Ｆ５８Ｑ変異及び長いペプチドリンカーを含むＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤを含むポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１０アミノ酸長であるか、または少なくとも１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１４アミノ酸長であるか、または少なくとも１４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１９アミノ酸長であるか、または少なくとも１９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、３９アミノ酸長であるか、または少なくとも３９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２２０～２２３、２５３、及び２５４から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２２０、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２２１、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２２２、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２２３、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２５３、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、配列番号２５４、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、またはその機能的に等価なバリアントを含むか、またはそれからなるポリペプチドの二量体を含む。
アクチビン受容体ＩＩＢ型エクトドメインバリアント
本明細書で使用される場合、「アクチビン受容体ＩＩＢ型エクトドメインバリアント」または「ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアント」という用語は、野生型細胞外ＡｃｔＲＩＩＢと少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、単一の膜貫通受容体、ＡｃｔＲＩＩＢの可溶性の細胞外部分を含むポリペプチドを指す。野生型ヒトＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの配列を、配列番号２（表１）に示す。別段明記しない限り、アミノ酸置換について示される位置は、配列番号２のアミノ酸配列に従って付番される。本開示の目的のために、「ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ」は、配列番号２を参照する。
本明細書で使用される場合、「アクチビン受容体ＩＩＢ型エクトドメインバリアント」または「ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアント」という用語は、野生型細胞外ＡｃｔＲＩＩＢと少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、単一の膜貫通受容体、ＡｃｔＲＩＩＢの可溶性の細胞外部分を含むポリペプチドを指す。野生型ヒトＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの配列を、配列番号２（表１）に示す。別段明記しない限り、アミノ酸置換について示される位置は、配列番号２のアミノ酸配列に従って付番される。本開示の目的のために、「ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ」は、配列番号２を参照する。
いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｇ２７、Ｑ２９、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｓ３８、Ｄ５７、Ｆ５８、Ｖ７５、及びＦ７７から選択される位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントポリペプチドは、Ｇ２７Ｄ、Ｑ２９Ｙ、Ｄ３０Ｑ、Ｋ３１Ｙ、Ｓ３８Ｒ、Ｄ５７Ｅ、Ｆ５８Ｅ、Ｆ５８Ｄ、Ｆ５８Ｙ、Ｆ５８Ｋ、Ｆ５８Ｑ、Ｆ５８Ｗ、Ｆ５８Ｎ、Ｆ５８Ｒ、Ｆ５８Ｈ、Ｖ７５Ｑ、及びＦ７７Ｄから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８Ｅ、Ｆ５８Ｄ、Ｆ５８Ｙ、Ｆ５８Ｋ、Ｆ５８Ｑ、Ｆ５８Ｗ、Ｆ５８Ｎ、Ｆ５８Ｒ、及びＦ５８Ｈから選択される位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８Ｅ、Ｆ５８Ｋ、及びＦ５８Ｑから選択された１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８Ｋのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８Ｑのアミノ酸置換を含む。ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤにおける他のアミノ酸置換は、当該技術分野において既知である（例えば、ＷＯ２０２１／１５８６７５、ＷＯ２０２２／１５０５９０、ＷＯ２０２１／１５８６７５、ＷＯ２０２２／０７２８８２、ＷＯ２０２１／１８９０１９、及びＷＯ２０２１／１８９０１０、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。これらの追加の変異は、本明細書に記載のリンカーと併用され、本明細書に記載の結合剤に組み込まれて、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤのリガンド結合特性を変化させることができる。
いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、配列番号４～２２、３３１、３３２、または２４～３３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、野生型ヒトＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの配列に対して、少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上）のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、配列番号２に示される配列に対して、少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上）のアミノ酸配列同一性を有し得る。
いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントのアミノ酸配列は、配列番号４～２２、３３１、３３２、または２４～３３のうちのいずれか１つに対して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８位にアミノ酸置換を含み、配列番号５～１３のうちのいずれか１つと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、位置Ｆ５８にアミノ酸置換を含み、配列番号５～１３から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８位にアミノ酸置換を含み、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８位にアミノ酸置換を含み、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８位にアミノ酸置換を含み、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８位にアミノ酸置換を含み、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８位にアミノ酸置換を含み、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８位にアミノ酸置換を含み、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８位にアミノ酸置換を含み、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８位にアミノ酸置換を含み、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｆ５８位にアミノ酸置換を含み、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｄ５７位にアミノ酸置換を含み、配列番号４に対して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｄ５７位にアミノ酸置換を含み、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
例示的なＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤを表１に提供する。アミノ酸置換は、太字及び拡大テキストで示される。
いくつかの実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｎ末端に最大５個のアミノ酸の伸長を更に含む。いくつかの実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｎ末端、例えば、ＧＲＧＥＡ（配列番号２３）の５アミノ酸の伸長を更に含む。いくつかの実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、または１アミノ酸、例えば、限定されないが、ＲＧＥＡ、ＧＥＡ、ＥＡ、またはＡのＮ末端における伸長を更に含む。Ｎ末端伸長を有する例示的なＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、表２に提供される。Ｎ末端伸長アミノ酸は、太字及び斜体のテキストで示される。アミノ酸置換は、太字及び拡大テキストで示される。
いくつかの実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、Ｃ末端にアラニン－プロリン－トレオニン（ＡＰＴ）の伸長を更に含む。図１０Ｏ～１０Ｐに示されるように、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤへのＣ末端伸長ＡＰＴの付加は、阻害効力に影響を与えない。したがって、いくつかの実施形態では、配列番号２～２２、３３１、３３２、及び２４～３３のうちのいずれか１つは、Ｃ末端でのＡＰＴの伸長を更に含むことができる。
本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、ある特定の疾患適応症における治療有効性を最大化しつつ、有害作用を最小化するように、具体的には、内因性ＢＭＰ－９シグナル伝達の阻害を防止または低減しつつ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０などの他のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドに対する中和効力を維持及び／または増加させるように設計されている。本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、以下を示す：（１）野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤと比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０への類似または改善された結合（リガンド結合について内因性受容体と競合し、内因性受容体シグナル伝達を低減または阻害することを可能にする）、ならびに（２）野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤと比較して、ＢＭＰ－９への低減または除去された結合（ＢＭＰ－９シグナル伝達の阻害と関連付けられた毒性を回避することを可能にする）。これらのバリアントは、本明細書に更に記載されるように、肺高血圧症（ＰＨ）（例えば、ＰＡＨ、静脈ＰＨ、低酸素ＰＨ、血栓塞栓性ＰＨ、または雑種ＰＨ）、代謝障害及び心臓代謝性疾患（例えば、肥満、１型糖尿病、２型糖尿病、前糖尿病、心不全）、骨疾患（例えば、骨損傷を伴う疾患または状態）、筋肉疾患、線維症、及び低い赤血球レベル（例えば、貧血、失血）などのアクチビン受容体シグナル伝達が上昇する広範な疾患及び状態を治療するために使用することができる。バリアントは、本明細書に更に記載されるように、例えば、限定されないが、ＰＨの症状または進行の低減（例えば、ＰＡＨ、静脈ＰＨ、低酸素ＰＨ、血栓塞栓性ＰＨ、もしくは雑種ＰＨ）、骨吸収または破骨細胞活性の低減、骨形成または骨ミネラル密度の増加、筋肉量または筋力の増加、線維症の低減（例えば、線維症の減少、または線維症の進行の遅延もしくは停止）、及び／または赤血球レベルの増加（例えば、ヘモグロビンレベル、ヘマトクリット、もしくは赤血球数の増加、例えば、赤血球産生の増加）をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０から選択される１つ以上のリガンドに結合し、ＢＭＰ－９に実質的に結合することなく、及び／またはその受容体を通じたＢＭＰ－９シグナル伝達を阻害することなく、１つ以上のリガンドのそれぞれの受容体を通じたシグナル伝達を阻害する。
いくつかの実施形態では、ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対する本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントの阻害効力は、ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対するヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの阻害効力と比較して約１００倍低減する。
いくつかの実施形態では、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０から選択される１つ以上のリガンドに対する本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントの阻害効力は、同じ１つ以上のリガンドに対するヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの阻害効力よりも増加するか、または実質的に同じである。
いくつかの実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤと比較して、アクチビンＡに対するより高い阻害効力及びＢＭＰ－９に対するより低い阻害効力を有する。
いくつかの実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、対象において血管合併症を引き起こさない。
いくつかの実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、対象において血管透過性または漏出を増加させない。
結果として、本開示によれば、アクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）エクトドメイン（ＥＣＤ）バリアントを含む新規のポリペプチドが本明細書に提供され、このバリアントは、ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの配列と比較して１つ以上のアミノ酸置換を有し、治療有効性を最大化しながら有害作用を最小限に抑えるために、具体的には、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０などの他のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの中和効力を維持及び／または増加させながら、内因性ＢＭＰ－９シグナル伝達の破壊を予防または低減することを目的として、調整されたＴＧＦβスーパーファミリーリガンド特異性を有する。
ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントを含むポリペプチド
いくつかの実施形態では、本開示は、リンカーを介して、Ｆｃドメイン単量体に融合した、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアント－ペプチドリンカー－Ｆｃドメイン単量体を含む。ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤを含むポリペプチドは、Ｆｃドメイン単量体間のシステイン結合を介して二量体化して、本明細書に記載のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を形成することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、リンカーを介して、Ｆｃドメイン単量体に融合した、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアント－ペプチドリンカー－Ｆｃドメイン単量体を含む。ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤを含むポリペプチドは、Ｆｃドメイン単量体間のシステイン結合を介して二量体化して、本明細書に記載のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を形成することができる。
リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントは、リンカーを介して異種ドメインに融合される。いくつかの実施形態では、異種ドメインは、ポリペプチドの安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、異種ドメインは、Ｆｃドメイン単量体（例えば、野生型Ｆｃドメイン単量体、１つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメイン単量体）、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミンドメインからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントは、リンカーを介して異種ドメインに融合される。いくつかの実施形態では、異種ドメインは、ポリペプチドの安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、異種ドメインは、Ｆｃドメイン単量体（例えば、野生型Ｆｃドメイン単量体、１つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメイン単量体）、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミンドメインからなる群から選択される。
本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」及び「リンカー」という用語は、ポリペプチド鎖内で２つの機能ドメインを一緒に接続するために使用されるアミノ酸の短いストレッチを指すために互換的に使用される。例えば、本開示のポリペプチドまたは結合剤のいくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアント及びＦｃドメイン単量体は、１つ以上のペプチドリンカーを介してポリペプチド鎖上で一緒に連結される。ペプチドリンカーを使用して、本開示のポリペプチドまたは結合剤に他のドメインまたはモジュールまたは領域（半減期延長ドメインなど）を結合することもできる。本明細書で使用される「ロングリンカー」という用語は、少なくとも１０アミノ酸長（すなわち、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸長）であるリンカーを指す。本明細書で使用される「短いリンカー」という用語は、１０アミノ酸未満の長さ（すなわち、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸の長さ）のリンカーを指す。
好適なペプチドリンカーは、当該技術分野で既知であり、例えば、グリシン、アラニン、及びセリンなどの可撓性アミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＡ、ＧＳ、ＧＧ、ＧＧＡ、ＧＧＳ、ＧＧＧ、ＧＧＧＡ（配列番号９２）、ＧＧＧＳ（配列番号９１）、ＧＧＧＧ（配列番号６９）、ＧＧＧＧＡ（配列番号９０）、ＧＧＧＧＳ（配列番号６８）、ＧＧＧＧＧ（配列番号８９）、ＧＧＡＧ（配列番号８８）、ＧＧＳＧ（配列番号８７）、ＡＧＧＧ（配列番号８６）、またはＳＧＧＧ（配列番号７６）のモチーフ、例えば、複数のまたは繰り返しのモチーフを含有し得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＡまたはＧＳ、例えば、ＧＡ、ＧＳ、ＧＡＧＡ（配列番号１０３）、ＧＳＧＳ（配列番号９５）、ＧＡＧＡＧＡ（配列番号９６）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号９７）、ＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号９８）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号９９）、ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号１００）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１０１）、ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号１０２）、及びＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１０４）のモチーフを含む、２～１２アミノ酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＡまたはＧＧＳ、例えば、ＧＧＡ、ＧＧＳ、ＧＧＡＧＧＡ（配列番号１０５）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０６）、ＧＧＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号１０７）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０８）、ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号１０９）、及びＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１１０）のモチーフを含む、３～１２アミノ酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＡＧ（配列番号１１１）、ＧＧＳＧ（配列番号１１２）、ＧＧＡＧＧＧＡＧ（配列番号１１３）、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１１４）、ＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧ（配列番号１１５）、及びＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１１６）のモチーフを含む、４～１２アミノ酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＡ（配列番号９０）またはＧＧＧＧＳ（配列番号６８）、例えば、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号１１７）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５８）のモチーフを含有し得る。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントと異種ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン単量体（例えば、野生型Ｆｃドメイン単量体、１つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメイン単量体）、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミンドメイン）との間のアミノ酸リンカーは、ＧＧＧ、ＧＧＧＡ（配列番号９２）、ＧＧＧＧ（配列番号６９）、ＧＧＧＡＧ（配列番号３３５）、ＧＧＧＡＧＧ（配列番号３３６）、またはＧＧＧＡＧＧＧ（配列番号３３７）であり得る。
リンカーが使用される場合、リンカーは、一般に、ドメインの各々が、互いに独立して、それらの差次的結合特異性及び／または機能を保持することができることを確実にするのに十分な長さ及び配列である。いくつかの実施形態では、いかなる二次構造も更に促進しないペプチドリンカーが選択される。当該ドメインの互いへの連結は、例えば、本明細書に記載されるように、遺伝子操作によって提供することができる。融合及び作動可能に連結されたポリペプチド構築物を調製し、それらを哺乳動物細胞または細菌中で発現させるための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、ＷＯ９９／５４４４０またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）。
いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙ及びＳｅｒを含有するアミノ酸配列の様々な順列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン及びセリンリッチリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン（例えば、２－１０、２－５、２－４、２－３グリシン残基）またはグリシン及びプロリン残基が豊富であってもよく、例えば、トレオニン／セリン及びグリシンの単一配列、トレオニン／セリン及び／またはグリシンの反復配列、例えば、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ（配列番号６９）、ＧＧＧＳ（配列番号９１）、ＴＧＧＧＧ（配列番号７４）、ＳＧＧＧＧ（配列番号７５）、ＴＧＧＧ（配列番号７３）、もしくはＳＧＧＧ（配列番号７６）の単一項または反復を含有してもよい。限定されないが、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ及びＡｌａなどの他の近中性アミノ酸も、リンカー配列で使用してもよい。
いくつかの実施形態では、リンカーは、１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０アミノ酸長を超える。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、４０、３５、３０、２５、２２、または２０アミノ酸未満である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２５、１０～２１、１０～１５、１０～１４、１２～１４、１５～２５、１７～２２、２０、または２１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１４～４０、１４～３９、１４～３５、１４～３０、１４～２５、または１４～２０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも３９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸長である。更なる実施形態では、リンカーは、少なくとも１２、１４、１５、２０、２１、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸の長さを有する。
いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号５９を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号５４を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号３４を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号６３を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号５９からなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号５４からなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号３４からなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号６３からなる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号３４～１３３及び３３５～３３７のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシンリッチ、多くの場合グリシン／セリンリッチ、最大４０アミノ酸、または１～４０アミノ酸、２～３９アミノ酸、３～３９アミノ酸、３～１４アミノ酸、３～１９アミノ酸、５～２５アミノ酸、５～２０アミノ酸、５～１５アミノ酸、または１５～２５アミノ酸のペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、比較的少数のアミノ酸残基、例えば、３９以下のアミノ酸、１９以下のアミノ酸、１４以下のアミノ酸、５以下のアミノ酸、または３以下のアミノ酸のみを含む。ある特定の実施形態では、Ｇｌｙリッチリンカーが使用される。一実施形態では、ペプチドリンカーは、単一のアミノ酸グリシン（Ｇｌｙ）からなり得る。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、すなわち、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ、またはそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含むか、またはそれからなり、ここで、ｎは、１またはそれよりも大きい整数であるか、またはｎは、１～８（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（ＧＧＧＧＳ）（配列番号６８）、またはその反復（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ｎ＞２である。特定の実施形態では、ｎ＞３、またはｎ＝３～１０である。いくつかの実施形態では、ｎ＞４、またはｎ＝４～１０である。いくつかの実施形態では、ｎは、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーにおいて４以下である。いくつかの実施形態では、ｎ＝４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～８、５～７、または５～６である。いくつかの実施形態では、ｎ＝３、４、５、６、または７である。いくつかの実施形態では、ｎ＝４である。いくつかの実施形態では、（ＧＧＧＧＳ）ｎ配列を含むリンカーは、Ｎ末端トレオニンも含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン、アラニン、及びセリン以外のアミノ酸、例えば、ＡＡＡＬ（配列番号１１８）、ＡＡＡＫ（配列番号１１９）、ＡＡＡＲ（配列番号１２０）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号１２１）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号１２２）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１２３）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号１２４）、ＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧ（配列番号１２５）、ＳＡＣＹＣＥＬＳ（配列番号１２６）、ＲＳＩＡＴ（配列番号１２７）、ＲＰＡＣＫＩＰＮＤＬＫＱＫＶＭＮＨ（配列番号１２８）、ＧＧＳＡＧＧＳＧＳＧＳＳＧＧＳＳＧＡＳＧＴＧＴＡＧＧＴＧＳＧＳＧＴＧＳＧ（配列番号１２９）、ＡＡＡＮＳＳＩＤＬＩＳＶＰＶＤＳＲ（配列番号１３０）、またはＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１３１）を含有し得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＥＡＡＡＫ（配列番号１３２）のモチーフ、例えば、複数のまたは反復するモチーフを含有し得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｘが任意のアミノ酸（例えば、Ａ、Ｋ、またはＥ）であってもよく、ｎが１～５、及びＰＡＰＡＰ（配列番号１３３）である、（ＸＰ）ｎなどのプラリンリッチ配列のモチーフ、例えば、複数または反復モチーフを含有し得る。
ペプチドリンカー及び使用されるアミノ酸の長さは、関与する２つのタンパク質及び最終的なタンパク質融合ポリペプチドで所望される可撓性の程度に応じて調整することができる。リンカーの長さを調整して、適切なタンパク質の折り畳みを確実にし、凝集体の形成を回避することができる。
リンカーの非限定的な例を表３に示す。ポリペプチドまたは結合剤の所望の機能（結合、中和など）が提供される限り、リンカーは特に限定されることを意図するものではなく、任意の好適なリンカーが使用され得ることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントポリペプチドまたは結合剤は、配列番号５９、５４、３４、または６３のうちのいずれか１つに示される配列を有する１つ以上のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントポリペプチドまたは結合剤は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントポリペプチドのＣ末端に、２、３、６、１０、１４、１９、または３９アミノ酸長のグリシンリッチリンカーを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントポリペプチドまたは結合剤は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントポリペプチドのＣ末端に配列番号５９のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントポリペプチドまたは結合剤は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントポリペプチドのＣ末端に配列番号５４のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントポリペプチドまたは結合剤は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントポリペプチドのＣ末端に配列番号３４のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントポリペプチドまたは結合剤は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤバリアントポリペプチドのＣ末端に配列番号６３のリンカーを含む。
Ｆｃドメイン単量体及びＦｃドメイン
いくつかの実施形態では、本開示は、リンカーを介して、Ｆｃドメイン単量体に融合した、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、リンカーを介して、Ｆｃドメイン単量体のＮ末端にＣ末端で融合している。
いくつかの実施形態では、本開示は、リンカーを介して、Ｆｃドメイン単量体に融合した、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントは、リンカーを介して、Ｆｃドメイン単量体のＮ末端にＣ末端で融合している。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン単量体」は、別のＦｃドメイン単量体と会合すると、機能的なＦｃドメインを形成する一本鎖タンパク質を説明する。２つのＦｃドメイン単量体の会合は、１つのＦｃドメインを作製する。本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に結合することができるか、またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって結合され得る最小領域（より大きなポリペプチドの文脈において）または最小のタンパク質折り畳み構造（単離されたタンパク質の文脈において）を説明する。２つのＦｃドメイン単量体が会合する場合、得られるＦｃドメインは、Ｆｃ受容体結合活性を有する。したがって、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に結合することができる二量体構造である。別段明記しない限り、本明細書における「バリアントＦｃドメイン」への全ての言及は、二量体Ｆｃドメインを指すと理解されるべきであり、各Ｆｃドメイン単量体は、言及された変異を含む。
本明細書で使用されるＦｃドメインは、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含むことが理解されるであろう。したがって、Ｆｃは、ＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３）、及び任意選択で、これらのドメインに対する可撓性ヒンジＮ末端を指す。Ｆｃドメイン単量体の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃドメイン単量体は、通常、そのカルボキシ末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義される。別段明記しない限り、Ｆｃドメイン及びＦｃドメイン単量体におけるアミノ酸位置への全ての言及は、Ｋａｂａｔ（１９９１，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖａ．）に示されるようなＥＵインデックスに従う。Ｆｃは、単離したこの領域、またはポリペプチド構築物の文脈におけるこの領域を指し得る。多形体は、限定されないが、Ｋａｂａｔ ２７０、２７２、３１２、３１５、３５６、及び３５８を含む多くのＦｃ位置で観察されており、したがって、本明細書で提供される配列と当該技術分野における配列との間にわずかな差異が存在し得ることに留意されたい。本開示のポリペプチドまたは結合剤に含まれるＦｃドメイン単量体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ドメインであり得る。
例示的な実施形態では、本開示のポリペプチドは、抗体の１つ以上の定常領域、例えば、抗体重鎖の第２の定常ドメイン（ＣＨ２）及び／または第３の定常ドメイン（ＣＨ３）、または抗体重鎖のＦｃドメイン単量体を含む。抗体は、例えば、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体などのＩｇＧ抗体であり得る。特定の実施形態では、抗体は、ヒト抗体であり、例えば、Ｆｃドメイン単量体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の重鎖の定常領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４定常領域との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃドメイン単量体を含むか、またはそれからなる。別の特定の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、ヒトＩｇＧ２抗体のＦｃドメイン単量体を含むか、またはそれからなる。別の特定の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、ヒトＩｇＧ４抗体のＦｃドメイン単量体を含むか、またはそれからなる。例示的なＦｃドメイン配列（野生型配列、その多形体、及びバリアント配列の両方を含む）を表４に提供する。
一般に、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドは、Ｆｃドメイン単量体がそのＮ末端でＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントのＣ末端に連結され、各ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドについて、構築物の配向が、Ｎ末端からＣ末端に、（ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアント）－（リンカー）－（Ｆｃドメイン単量体）の一本鎖であるように構成される。しかしながら、構築物の配向は特に限定されず、他の配向が考えられる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、そのＣ末端で、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントのＮ末端に連結されてもよい。
例示的な実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、例えば、システイン残基間のジスルフィド結合によって、共有結合で２つ以上のポリペプチド鎖のアセンブリを可能にする。このようにして、Ｆｃドメイン単量体は二量体化ドメインとして作用し、２つのＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド鎖のアセンブリが二量体を形成することを可能にする。本開示によれば、そのような二量体は、一般に２つのポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、本明細書に記載のＦｃドメイン単量体に連結されたＡｃｔＩＩＲＢ－ＥＣＤバリアントを含み、それによって二価ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を形成する。したがって、本明細書に記載の結合剤は、２つのＡｃｔＩＩＲＢ－ＥＣＤバリアント、リンカードメイン、及びＦｃドメインを含む。
Ｆｃドメイン単量体は、一般に、ホモ二量体構築物における第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの架橋のための１つ以上のシステイン残基を含む。例えば、Ｆｃドメイン単量体は、２つのポリペプチド間にジスルフィド架橋を形成し、それによって二量体を形成するための少なくとも２つのシステイン残基を含んでもよい。本技術のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、配列番号１３４～１７３及び３３８のうちのいずれか１つに示される配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、配列番号１３５に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、配列番号１３７に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、配列番号１３８に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、配列番号１５７に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示は、バリアントＦｃドメイン、すなわち、非天然存在するにＦｃドメイン、例えば、１つ以上の非天然に存在するアミノ酸残基、置換、付加、欠失などを含むＦｃドメインを含む結合剤を提供する。
本技術のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、天然に存在する（野生型）Ｆｃ配列と比較して、ポリペプチドまたは結合剤上に、半減期の増加などの望ましい特性を有するバリアントＦｃドメインを形成するバリアントＦｃドメインである。本明細書で使用される場合、「バリアントＦｃドメイン」は、非天然に存在するＦｃドメイン、例えば、１つ以上の非天然に存在するアミノ酸残基、野生型ヒト定常ドメインに対する１つ以上のアミノ酸置換、または１つ以上のアミノ酸欠失、付加及び／または修飾を含むＦｃドメインを指す。
「ＤＥＬ」多形体及び「ＥＥＭ」多形体を含む、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインについて多くの既知の多形体が存在する。ＤＥＬ多形体は、それぞれ、３５６位、３５７位、及び３５８位にアミノ酸Ｄ－Ｅ－Ｌを含む（本明細書では「Ｆｃ－ＤＬ」、例えば、配列番号１３５とも称される）。ＥＥＭ多形体は、それぞれ、３５６位、３５７位、及び３５８位にアミノ酸Ｅ－Ｅ－Ｍを含む（本明細書では「Ｆｃ－ＥＭ」、例えば、配列番号１３４とも称される）。ＤＥＬ ＦｃドメインまたはＥＥＭ Ｆｃドメインの存在を除いて、そうでなければ同一である２つの結合剤は、リガンド結合及び治療有効性の観点から同様の特性を示すことが予想される。本技術のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＤＥＬ Ｆｃドメイン（「ＤＬ」）である。本技術のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＥＥＭ Ｆｃドメイン（「ＥＭ」）である。他の多形体、例えば、配列番号１３４～１３５及び１３９～１４７のＩｇＧ１多形体、配列番号１４８～１５７のＩｇＧ２多形体、配列番号１５８～１６４のＩｇＧ３多形体、及び配列番号１６５～１７３のＩｇＧ４多形体も使用され得る。
いくつかの実施形態では、２つのバリアントＦｃドメイン単量体によって形成されたバリアントＦｃドメインは、同等の分子（例えば、野生型Ｆｃドメイン単量体を有することを除いて同じアミノ酸配列を有するタンパク質）と比較して、ＦｃＲｎなどのＦｃ受容体に対する結合特性が変化している。Ｆｃドメインを含むタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの結合親和性を増加させることによって増加され得る。一実施形態では、Ｆｃドメインバリアントは、同等の分子に対して増強された血清半減期を有する。特定の実施形態では、Ｆｃドメインバリアントは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６（本明細書では「ＹＴＥ」と称される；例えば、配列番号１３７）からなる群から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインバリアントは、２５２位にＹ（例えば、本明細書で「Ｆｃ－Ｙ」と称される配列番号１３８）を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインバリアントは、２５４位にＴを含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインバリアントは、２５６位にＥを含む。
したがって、本技術のいくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドは、同等の分子と比較して増加したインビボ半減期を有するＦｃドメインを形成するバリアントＦｃドメイン単量体を含む。いくつかのそのような実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドのＦｃドメイン単量体は、残基２５２、２５４、及び２５６からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含むバリアントＦｃドメイン単量体を含む。そのような実施形態では、バリアントＦｃドメイン単量体は、限定されないが、Ｅ３５６Ｄ及びＭ３５８Ｌなどの１つ以上の追加のアミノ酸置換（複数可）を更に含み得る。
いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（本明細書では「ＦｃＹＴＥ」または「ＹＴＥ」と称される）を含むバリアントＦｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＹＴＥドメイン単量体は、ＤＥＬ多形体（本明細書ではＹＴＥ－ＤＬ、例えば、配列番号１３７と称される）である。いくつかの実施形態では、ＦｃＹＴＥドメイン単量体は、ＥＥＭ多形体（本明細書ではＹＴＥ－ＥＭ、例えば、配列番号１３６と称される）である。
いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｍ２５２Ｙ（本明細書では「ＦｃＹ」と称される）を含むバリアントＦｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＹドメイン単量体は、ＤＥＬ多形体（本明細書ではＹ－ＤＬ、例えば、配列番号１３８と称される）である。いくつかの実施形態では、ＦｃＹドメイン単量体は、ＥＥＭ多形体（本明細書ではＹ－ＥＭ、例えば、配列番号３３８と称される）である。
いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドは、Ｃ末端にリジン残基（Ｋ）を含むＦｃドメイン単量体を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドで使用するためのバリアントＦｃドメイン（例えば、２つのバリアントＦｃドメイン単量体によって形成されるＦｃドメイン）は、天然に存在するＦｃ配列と比較して、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドの凝集を低減する、及び／または安定性を増加させる、及び／または半減期を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体活性化（補体依存性細胞傷害性またはＣＤＣ）、オプソン化などの１つ以上のエフェクター機能を提供するように選択される。一実施形態では、バリアントＦｃドメインは、同等の分子と比較して、Ｆｃ受容体への結合が強化されている。特定の実施形態では、バリアントＦｃドメインは、新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎへの強化された結合を有する。別の実施形態では、バリアントＦｃドメイン及び／またはバリアントＦｃドメインを含有するポリペプチドもしくは結合剤は、ＦｃＲｎに対する結合親和性が、同等の分子のそれよりも少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍、または少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも６０倍、または少なくとも７０倍、または少なくとも８０倍、または少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも２００倍大きい。Ｆｃドメインを含むタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎに対するＦｃドメイン単量体の結合親和性を増加させることによって増加され得る。したがって、一実施形態では、バリアントＦｃドメインを含むポリペプチドまたは結合剤は、同等の分子と比較して、強化された血清半減期を有する。
本開示のポリペプチド及び結合剤の血清半減期を延長する手段の例としては、ポリペプチド及び結合剤に融合されているか、または他の方法で結合されている、ペプチド、タンパク質、またはタンパク質のドメインが挙げられる。ペプチド、タンパク質、またはタンパク質ドメインの群には、血清アルブミンなどの人体における好ましい薬物動態プロファイルを有する他のタンパク質に結合するペプチドが含まれる（ＷＯ２００９／１２７６９１を参照）。そのような半減期延長ペプチドの代替概念には、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ、ＷＯ２００７／０９８４２０を参照）に結合するペプチドが含まれ、これはまた、本開示のポリペプチド及び結合剤に使用することができる。タンパク質または完全タンパク質のより大きなドメインを付着させるという概念は、例えば、本明細書に記載の、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのバリアントまたは変異体（ＷＯ２０１１／０５１４８９、ＷＯ２０１２／０５９４８６、ＷＯ２０１２／１５０３１９、ＷＯ２０１３／１３５８９６、ＷＯ２０１４／０７２４８１、ＷＯ２０１３／０７５０６６）またはそのドメインの融合、ならびに免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃドメイン）及びそのバリアントの融合を含む。Ｆｃドメインのそのようなバリアントは、二量体または多量体の所望の対合を可能にするために、Ｆｃ受容体結合（例えば、Ｆｃｇ受容体）を除去するために、ＦｃＲｎへの結合を強化するために、または他の理由で最適化／修飾され得る。人体における小タンパク質化合物の半減期を延長するための当該技術分野で既知の更なる概念は、本開示のポリペプチドまたは結合剤などのそれらの化合物のペグ化である。
一実施形態では、本開示は、結合剤を提供し、Ｆｃドメインは、Ｋａｂａｔに示されているＥＵインデックスによって付番された２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７９、２８０、２８４、２９２、２９６、２９７、２９８、２９９、３０５、３１３、３１６、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３２、３３３、３３４、３３９、３４１、３４３、３７０、３７３、３７８、３９２、４１６、４１９、４２１、４４０及び４４３からなる群から選択される１つ以上の位置に非天然に存在するアミノ酸残基を含む。任意選択で、Ｆｃドメインは、当業者に既知の追加の位置及び／または代替の位置に非天然に存在するアミノ酸残基を含んでよい（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号、同第６，２７７，３７５号、同第６，７３７，０５６号、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ０１／５８９５７号、同第ＷＯ０２／０６９１９号、同第ＷＯ０４／０１６７５０号、同第ＷＯ０４／０２９２０７号、同第ＷＯ０４／０３５７５２号、同第ＷＯ０４／０７４４５５号、同第ＷＯ０４／０９９２４９号、同第ＷＯ０４／０６３３５１号、同第ＷＯ０５／０７０９６３号、同第ＷＯ０５／０４０２１７号、同第ＷＯ０５／０９２９２５号、及び同第ＷＯ０６／０２０１１４号を参照）。特定の実施形態では、本開示は、Ｆｃバリアントタンパク質組成物を提供し、Ｆｃドメインは、Ｋａｂａｔに示されているＥＵインデックスによって付番された２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｎ、２３４Ｑ、２３４Ｔ、２３４Ｈ、２３４Ｙ、２３４１、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３５Ａ、２３５Ｄ、２３５Ｒ、２３５Ｗ、２３５Ｐ、２３５Ｓ、２３５Ｎ、２３５Ｑ、２３５Ｔ、２３５Ｈ、２３５Ｙ、２３５１、２３５Ｖ、２３５Ｆ、２３６Ｅ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２３９Ｎ、２３９Ｑ、２３９Ｆ、２３９Ｔ、２３９Ｈ、２３９Ｙ、２４０Ｉ、２４０Ａ、２４０Ｔ、２４０Ｍ、２４１Ｗ、２４１Ｌ、２４１Ｙ、２４１Ｅ、２４１Ｒ、２４３Ｗ、２４３Ｌ、２４３Ｙ、２４３Ｒ、２４３Ｑ、２４４Ｈ、２４５Ａ、２４７Ｌ、２４７Ｖ、２４７Ｇ、２５１Ｆ、２５２Ｙ、２５４Ｔ、２５５Ｌ、２５６Ｅ、２５６Ｍ、２６２Ｉ、２６２Ａ、２６２Ｔ、２６２Ｅ、２６３１、２６３Ａ、２６３Ｔ、２６３Ｍ、２６４Ｌ、２６４１、２６４Ｗ、２６４Ｔ、２６４Ｒ、２６４Ｆ、２６４Ｍ、２６４Ｙ、２６４Ｅ、２６５Ｇ、２６５Ｎ、２６５Ｑ、２６５Ｙ、２６５Ｆ、２６５Ｖ、２６５Ｉ、２６５Ｌ、２６５Ｈ、２６５Ｔ、２６６Ｉ、２６６Ａ、２６６Ｔ、２６６Ｍ、２６７Ｑ、２６７Ｌ、２６８Ｅ、２６９Ｈ、２６９Ｙ、２６９Ｆ、２６９Ｒ、２７０Ｅ、２８０Ａ、２８４Ｍ、２９２Ｐ、２９２Ｌ、２９６Ｅ、２９６Ｑ、２９６Ｄ、２９６Ｎ、２９６Ｓ、２９６Ｔ、２９６Ｌ、２９６Ｉ、２９６Ｈ、２６９Ｇ、２９７Ｓ、２９７Ｄ、２９７Ｅ、２９８Ｈ、２９８Ｉ、２９８Ｔ、２９８Ｆ、２９９Ｉ、２９９Ｌ、２９９Ａ、２９９Ｓ、２９９Ｖ、２９９Ｈ、２９９Ｆ、２９９Ｅ、３０５Ｉ、３１３Ｆ、３１６Ｄ、３２５Ｑ、３２５Ｌ、３２５Ｉ、３２５Ｄ、３２５Ｅ、３２５Ａ、３２５Ｔ、３２５Ｖ、３２５Ｈ、３２７Ｇ、３２７Ｗ、３２７Ｎ、３２７Ｌ、３２８Ｓ、３２８Ｍ、３２８Ｄ、３２８Ｅ、３２８Ｎ、３２８Ｑ、３２８Ｆ、３２８１、３２８Ｖ、３２８Ｔ、３２８Ｈ、３２８Ａ、３２９Ｆ、３２９Ｈ、３２９Ｑ、３３０Ｋ、３３０Ｇ、３３０Ｔ、３３０Ｃ、３３０Ｌ、３３０Ｙ、３３０Ｖ、３３０Ｉ、３３０Ｆ、３３０Ｒ、３３０Ｈ、３３２Ｄ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３２Ｆ、３３２Ｅ、３３２Ｎ、３３２Ｑ、３３２Ｔ、３３２Ｈ、３３２Ｙ、３３２Ａ、３３９Ｔ、３７０Ｅ、３７０Ｎ、３７８Ｄ、３９２Ｔ、３９６Ｌ、４１６Ｇ、４１９Ｈ、４２１Ｋ、４４０Ｙ及び４３４Ｗからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。任意選択で、Ｆｃドメインは、当業者に既知の追加及び／または代替のアミノ酸置換を含んでよい（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号、同第６，２７７，３７５号、同第６，７３７，０５６号、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ０１／５８９５７号、同第ＷＯ０２／０６９１９号、同第ＷＯ０４／０１６７５０号、同第ＷＯ０４／０２９２０７号、同第ＷＯ０４／０３５７５２号、及び同第ＷＯ０５／０４０２１７号を参照）。
追加のドメイン
本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド及び／または結合剤は、指定されたように標的ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド（複数可）に結合するその機能に加えて、更なる結合特異性または更なる機能を有し得ることが想定される。本技術のいくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたは結合剤は、標的化剤、治療部分、検出可能部分、及び／または診断部分とコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＮＫ細胞のようなエフェクター細胞の動員を通じて、標識（蛍光など）を提供することによって、毒素または放射性核種などの治療剤を提供することによって、及び／または血清半減期を増強する手段を提供することなどによって、抗体依存性細胞傷害性を媒介する完全機能性Ｆｃ定常ドメインなどの更なる機能を有し得る。
本開示のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド及び／または結合剤は、指定されたように標的ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド（複数可）に結合するその機能に加えて、更なる結合特異性または更なる機能を有し得ることが想定される。本技術のいくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたは結合剤は、標的化剤、治療部分、検出可能部分、及び／または診断部分とコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＮＫ細胞のようなエフェクター細胞の動員を通じて、標識（蛍光など）を提供することによって、毒素または放射性核種などの治療剤を提供することによって、及び／または血清半減期を増強する手段を提供することなどによって、抗体依存性細胞傷害性を媒介する完全機能性Ｆｃ定常ドメインなどの更なる機能を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ、リンカー、Ｆｃドメイン単量体、及び１つ以上の追加のドメインを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加のドメインは、フィブロネクチンドメイン、ヒト血清アルブミンドメインから選択される。本明細書で使用される場合、「フィブロネクチンドメイン」という用語は、例えば、インテグリンなどの膜スパニング受容体タンパク質、及びコラーゲン及びフィブリンなどの細胞外マトリックス構成要素に結合する、細胞外マトリックスの高分子量糖タンパク質、またはその断片を指す。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ０２７５１の配列のアミノ酸６１０～７０２を有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインである。他の実施形態では、フィブロネクチンドメインは、アドネクチンタンパク質である。
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドまたは結合剤は、１つ以上のフィブロネクチンドメインに融合されたＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントを含む。フィブロネクチンドメインへの結合は、タンパク質医薬品の薬物動態を改善することができる。フィブロネクチンドメインは、例えば、インテグリンなどの膜スパニング受容体タンパク質、ならびにコラーゲン及びフィブリンなどの細胞外マトリックス構成要素に結合する、細胞外マトリックスの高分子量糖タンパク質、またはその断片である。本発明のいくつかの実施形態では、フィブロネクチンドメインは、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアント（例えば、配列番号４～２２、３３１～３３２、及び２４～３３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアント）のＮ末端またはＣ末端（例えば、Ｃ末端）に接合され、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントの血清半減期を増加させる。フィブロネクチンドメインは、直接的に、またはリンカーを通じて、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアント、またはそのポリペプチド、またはその結合剤のＮ末端もしくはＣ末端に接合され得る。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドまたは結合剤は、例えば、従来の遺伝的または化学的手段、例えば、化学的コンジュゲーションを通じて、フィブロネクチンドメインのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。所望される場合、リンカー（例えば、スペーサー）は、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントとフィブロネクチンドメインとの間に挿入され得る。理論に縛られることなく、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントにフィブロネクチンドメインを含めることは、インテグリン、ならびにコラーゲン及びフィブリンなどの細胞外マトリックス構成要素への結合を通じて治療用タンパク質の長期保持をもたらし得ることが予想される。
一例として、本開示の方法及び組成物及びポリペプチドで使用され得るフィブロネクチンドメインは、一般に、当該技術分野で知られている。一実施形態では、フィブロネクチンドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ０２７５１の配列のアミノ酸６１０～７０２を有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインである。別の実施形態では、フィブロネクチンドメインは、アドネクチンタンパク質である。
本明細書で使用される場合、「ヒト血清アルブミン」という用語は、ヒト血漿中に存在するアルブミンタンパク質を指す。ヒト血清アルブミンは、血中で最も豊富なタンパク質である。これは、血清タンパク質の約半分を構成する。いくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミンは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ０２７６８の配列を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢバリアントまたはポリペプチドまたは結合剤は、血清アルブミンに融合され得る。血清アルブミンへの結合は、タンパク質医薬品の薬物動態を改善することができる。血清アルブミンは、哺乳類で最も豊富な血液タンパク質である球状タンパク質である。血清アルブミンは、肝臓で産生され、血清タンパク質の約半分を構成する。それは単量体であり、血液中に可溶性である。血清アルブミンの最も重要な機能のうちのいくつかは、体内のホルモン、脂肪酸、及び他のタンパク質を輸送すること、ｐＨを緩衝すること、ならびに血管と体組織との間の体液の適切な分布に必要な浸透圧を維持することを含む。いくつかの実施形態では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。いくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミンは、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアント（例えば、配列番号４～２２、３３１～３３２、及び２４～３３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアント）のＮ末端またはＣ末端（例えば、Ｃ末端）に接合され、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントの血清半減期を増加させる。ヒト血清アルブミンは、直接的に、またはリンカーを通じて、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントのＮ末端またはＣ末端に接合され得る。
一例として、本明細書に記載のポリペプチド及び方法及び組成物に使用することができる血清アルブミンは、当該技術分野で一般に知られている。一実施形態では、血清アルブミンは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ０２７６８の配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドまたは結合剤は、例えば、従来の遺伝的または化学的手段、例えば、化学的コンジュゲーションを通じて、ヒト血清アルブミンのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。所望される場合、リンカー（例えば、スペーサー）は、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントとヒト血清アルブミンとの間に挿入され得る。理論に縛られることなく、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントにヒト血清アルブミンを含めることは、治療用タンパク質の長期保持をもたらし得ることが予想される。
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドまたは結合剤は、部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、野生型Ｆｃドメイン、アミノ酸置換（例えば、二量体化を低減する１つ以上の置換、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミン）を有するＦｃドメインを更に含み、これは、リンカーまたは他の共有結合を介して、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアント、ポリペプチド、または結合剤のＮ末端またはＣ末端（例えば、Ｃ末端）に融合され得る。Ｆｃドメイン単量体に融合されたＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントを含むポリペプチドは、２つのＦｃドメイン単量体間の相互作用を通じて二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）を形成してもよく、これは、二量体においてＦｃドメインを形成するために結合する。更に、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、ヒトにおいて少なくとも７日間の血清半減期を有する。
例示的なＴＧＦβスーパーファミリー結合剤
本明細書に記載の例示的な結合剤の全体的な構造を表５に提供する。各結合剤のアミノ酸配列を表６に提供する。
本明細書に記載の例示的な結合剤の全体的な構造を表５に提供する。各結合剤のアミノ酸配列を表６に提供する。
いくつかの実施形態では、結合剤は、Ｎ末端からＣ末端に、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、ペプチドリンカー、及びＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤは、１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、Ｇ２７、Ｑ２９、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｓ３８、Ｄ５７、Ｆ５８、Ｖ７５、及びＦ７７から選択される位置での置換であり、ここで、アミノ酸の付番は、配列番号２に基づく。いくつかの実施形態では、Ｇ２７位におけるアミノ酸置換は、Ｇ２７Ｄである。いくつかの実施形態では、Ｑ２９位におけるアミノ酸置換は、Ｑ２９Ｙである。いくつかの実施形態では、Ｄ３０位におけるアミノ酸置換は、Ｄ３０Ｑである。いくつかの実施形態では、Ｋ３１位におけるアミノ酸置換は、Ｋ３１Ｙである。いくつかの実施形態では、Ｓ３８位におけるアミノ酸置換は、Ｓ３８Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｄ５７位におけるアミノ酸置換は、Ｄ５７Ｅである。いくつかの実施形態では、Ｆ５８位におけるアミノ酸置換は、Ｆ５８Ｄ、Ｆ５８Ｅ、Ｆ５８Ｋ、Ｆ５８Ｑ、Ｆ５８Ｗ、Ｆ５８Ｎ、Ｆ５８Ｒ、Ｆ５８Ｈ、及びＦ５８Ｙから選択される。いくつかの実施形態では、Ｆ５８位におけるアミノ酸置換は、Ｆ５８Ｅである。いくつかの実施形態では、Ｆ５８位におけるアミノ酸置換は、Ｆ５８Ｋである。いくつかの実施形態では、Ｆ５８位におけるアミノ酸置換は、Ｆ５８Ｑである。いくつかの実施形態では、Ｖ７５位におけるアミノ酸置換は、Ｖ７５Ｑである。いくつかの実施形態では、Ｆ７７位におけるアミノ酸置換は、Ｆ７７Ｄである。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｇ２７Ｄのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号２０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号２０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１７７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１１９）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１１９）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｄ５７Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１７８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１２０）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１２０）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１７９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１２１）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１７９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１２１）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｑ２９Ｙのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１２２）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１２２）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｄ３０Ｑのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１２３）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１２３）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｋ３１Ｙのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１２４）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１２４）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｓ３８Ｒのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１２５）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１２５）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ７５Ｑのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１２６）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１２６）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ７７Ｄのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１２７）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１２７）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６２２）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６２２）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６２４）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６２４）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＹ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＹ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６２５）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６２５）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＹＴＥ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＹＴＥ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６２６）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１８９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６２６）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６６６）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６６６）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６６７）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６６７）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６７１）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６７１）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１９ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１９ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６７２）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６７２）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６７３）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６７３）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６７４）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６７４）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｄのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６８３）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６８３）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｄのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６８４）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６８４）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｄのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６８５）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６８５）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｄのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６８６）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号１９９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６８６）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｄのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２００と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６８７）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２００のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６８７）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｄのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６８８）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６８８）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｄのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６８９）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６８９）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｙのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６９０）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６９０）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｙのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６９１）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６９１）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｙのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６９２）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６９２）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｙのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６９３）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６９３）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｙのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６９４）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６９４）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｙのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６９５）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６９５）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｙのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６９６）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２０９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６９６）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｋのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６９７）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６９７）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｋのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６９８）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６９８）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｋのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ６９９）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ６９９）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｋのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７００）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７００）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｋのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７０１）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７０１）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｋのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７０２）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７０２）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｋのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７０３）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７０３）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｑのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７０４）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７０４）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｑのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７０５）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７０５）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｑのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７０６）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２１９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７０６）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｑのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７０７）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７０７）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｑのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７０８）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７０８）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｑのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７０９）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７０９）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｑのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７１０）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７１０）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｗのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７１１）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７１１）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｗのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７１２）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７１２）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｗのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７１３）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７１３）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｗのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＥＭ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７１４）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７１４）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｗのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７１５）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７１５）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｗのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７１６）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２２９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７１６）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｗのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及び配列番号１５７のＩｇＧ２ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２３０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７１７）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２３０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７１７）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｇ２７Ｄのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号２０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７５８）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７５８）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｋのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、６ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、６ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、６ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１１５３）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１１５３）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｋのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１０ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１０ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１０ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１１５４）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１１５４）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｋのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１１５５）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１１５５）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｋのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１１５６）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１１５６）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、６ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、６ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、６ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１１６３）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１１６３）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１０ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１０ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１０ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１１６４）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１１６４）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ及びＣ末端ＡＰＴ配列、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、ならびにＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ及びＣ末端ＡＰＴ配列、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、ならびにＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ及びＣ末端ＡＰＴ配列、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、ならびにＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１１６８）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１１６８）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｎのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１２１３）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２４９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１２１３）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｒのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２５０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１２１５）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２５０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１２１５）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｈのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２５１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１２１７）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２５１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１２１７）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｑのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、６ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、６ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、６ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２５２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１２１８）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２５２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１２１８）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｑのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１０ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１０ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１０ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２５３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１２１９）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２５３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１２１９）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆ５８Ｑのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１９ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ ＦｃＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２５４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ１２２０）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２５４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ１２２０）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｄ５７Ｅ及びＦ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号２１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号２１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２３１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７１８）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２３１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７１８）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｑ２９Ｙ及びＦ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号２２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号２２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２３２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７１９）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７１９）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｄ３０Ｑ及びＦ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号３３１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号３３１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２３３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７２０）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２３３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７２０）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｇ２７Ｄ及びＦ５８Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号３３２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号３３２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、３ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２３５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ４４１）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号２３５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ４４１）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｄ５７Ｅのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号３３３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７５９）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号３３３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７５９）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｋ３１Ｙのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号３３９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７６１）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７６１）。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ７５Ｑのアミノ酸置換を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ、１４ａａの長さであるペプチドリンカー、及びＩｇＧ１ Ｆｃ－ＤＬ Ｆｃドメイン単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号３４０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（Ｐ７６２）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、ホモ二量体ポリペプチドであり、各ポリペプチド鎖は、配列番号３４０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる（Ｐ７６２）。
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドまたは結合剤は、「単離された」または「実質的に純粋」である。本明細書に開示されるポリペプチドまたは結合剤を説明するために使用される場合、「単離された」または「実質的に純粋」とは、その産生環境の構成要素から特定、分離及び／または回収されたポリペプチドまたは結合剤を意味する。好ましくは、ポリペプチドまたは結合剤は、その産生環境からの他の全ての構成要素と会合しないか、または実質的に会合しない。その産生環境の汚染構成要素、例えば、組換えトランスフェクトされた細胞から生じる汚染構成要素は、典型的には、ポリペプチドの診断または治療用途を妨げるであろう物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。ポリペプチドまたは結合剤は、例えば、所与の試料中の総タンパク質の少なくとも約５重量％、または少なくとも約５０重量％を構成し得る。単離されたタンパク質は、状況に応じて、総タンパク質含有量の５重量％～９９．９％を構成し得ることが理解される。ポリペプチドまたは結合剤は、それが増加した濃度レベルで作製されるように、誘導的プロモーターまたは高発現プロモーターの使用を通じて、著しく高い濃度で作製され得る。この定義は、当該技術分野で既知の多種多様な生物及び／または宿主細胞におけるポリペプチドまたは結合剤の産生を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドまたは結合剤は、（１）スピニングカップ配列決定装置を使用して、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を取得するのに十分な程度まで、または（２）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用した非還元もしくは還元条件下で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製されるであろう。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドまたは結合剤は、少なくとも１つの精製ステップ、例えば、限定されないが、親和性及び／またはイオン交換クロマトグラフィー、例えば、プロテインＡカラムへの結合によって調製されるであろう。
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチド及び結合剤は、例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上に対する特に高い親和性、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上に対する高い中和効力（低ＩＣ５０値）、ＢＭＰ－９に対する特に低いまたは検出できない親和性、ＢＭＰ－９に対する低いまたは検出できない中和効力（高いＩＣ５０値）、高い熱安定性、高い血漿安定性、長いまたは延長された半減期、低濁度、高いタンパク質均一性、及び／または高い製造性のうちの１つ以上を特徴とする。
本開示のポリペプチドもしくは結合剤、またはそれらの薬学的組成物の生物活性は、例えば、細胞中和アッセイ、結合アッセイ、競合アッセイなどによって決定することができる。本明細書で使用される「有効性」または「インビボ有効性」は、本開示のポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物を使用した療法に対する応答を指す。本開示のポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物を使用する療法の成功またはインビボでの有効性は、ポリペプチドまたは結合剤または組成物の、その意図された目的、例えば、ポリペプチドまたは結合剤または組成物が、所望の効果、すなわち、本明細書に定義されるＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患または障害の治療、改善、または予防を引き起こす能力に対する有効性を指す。インビボ有効性は、それぞれの疾患エンティティについて確立された標準的な方法によってモニタリングされてもよい。加えて、様々な疾患特異的臨床化学パラメータ及び他の確立された標準方法を使用してもよい。
本開示の薬学的組成物などの薬物の開発における別の主要な課題は、薬物動態特性の予測可能な調節である。この目的のために、薬物候補の薬物動態プロファイル、すなわち、所与の状態を治療する特定の薬物の能力に影響を与える薬物動態パラメータのプロファイルを確立することができる。ある特定の疾患エンティティを治療するための薬物の能力に影響を与える薬物の薬物動態パラメータとしては、半減期、分布体積、肝臓のファーストパス代謝、及び血清結合の程度が挙げられるが、これらに限定されない。所与の薬剤の有効性は、上述のパラメータの各々によって影響され得る。
薬物動態パラメータはまた、所与の量の投与される薬物についてのバイオアベイラビリティ、ラグタイム（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、より多くの発症及び／またはＣｍａｘを含む。「バイオアベイラビリティ」は、血液区画内の薬物の量を意味する。「ラグタイム」とは、薬物の投与と、血液または血漿中でのその検出及び測定可能性との間の時間遅延を意味する。「Ｔｍａｘ」は、薬物の最大血中濃度に達した後の時間であり、「Ｃｍａｘ」は、所与の薬物で最大限に得られる血中濃度である。その生物学的効果に必要な薬物の血中または組織濃度に達するまでの時間は、全てのパラメータによって影響される。
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドまたは結合剤は、約３日以上、約５日以上、約１週間以上、約２週間以上、約３週間以上、約４週間以上、約５週間以上、約６週間以上、または約２ヶ月以上の半減期を有する。
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドまたは結合剤は、約４５℃以上、約４５～約５０℃、約５２～約５４℃、約５６～約６０℃、または約６０℃以上の凝集温度で好ましい熱安定性を示し得る。熱安定性パラメータは、以下のようにポリペプチド凝集温度の観点から決定することができる。試験濃度（例えば、１００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ）のタンパク質溶液を単回使用キュベットに移し、動的光散乱（ＤＬＳ）デバイスに配置する。試料を４０℃から７０℃まで０．５℃／分の加熱速度で加熱し、測定された半径を一定に取得する。タンパク質の融解及び凝集を示す半径の増加を使用して、ポリペプチドの凝集温度を算出する。当該技術分野で既知の他の方法が使用され得る。
一実施形態では、本開示によるポリペプチドまたは結合剤は、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月間、２～８℃で安定である。一実施形態では、本開示によるポリペプチドまたは結合剤は、少なくとも４週間、２５～４０℃で安定である。一実施形態では、本開示によるポリペプチドまたは結合剤は、３回の凍結／解凍サイクルを受けた後で安定である。一実施形態では、本開示によるポリペプチドまたは結合剤は、－２０℃で１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月以上安定である。
あるいは、温度融解曲線は、ポリペプチドまたは結合剤の固有の生物物理学的タンパク質安定性を決定するために、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって決定することができる。これらの実験は、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）ＶＰ－ＤＳＣデバイスを使用して行われ得る。ポリペプチドまたは結合剤を含む試料のエネルギー取り込みは、製剤緩衝液のみを含む試料と比較して、２０℃～９０℃で記録される。それぞれの融解曲線の記録のために、全体的な試料温度は段階的に増加する。各温度で、試料及び製剤緩衝液基準のＴエネルギー取り込みが記録される。試料のエネルギー取り込みＣｐ（ｋｃａｌ／モル／℃）の差から基準を引いたものを、それぞれの温度に対してプロットする。融解温度は、エネルギー取り込みの最初の最大値における温度として定義される。
更なる実施形態では、本開示によるポリペプチドまたは結合剤は、酸性ｐＨで安定である。ポリペプチドまたは結合剤が、ｐＨ５．５（例えば、カチオン交換クロマトグラフィーを実行するために必要なｐＨ）などの非生理学的ｐＨでより寛容に振る舞うほど、充填されたタンパク質の総量に対して、イオン交換カラムから溶出されたポリペプチドまたは結合剤の回収率が高い。ＰＨ５．５のイオン（例えば、カチオン）交換カラムからのポリペプチドまたは結合剤の回収は、５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７２％以上、７４％以上、７６％以上、７８％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上であり得る。
アミノ酸配列修飾
本明細書に記載のポリペプチド及び結合剤のアミノ酸配列修飾が企図される。例えば、ポリペプチドまたは結合剤の結合親和性、エフェクター機能、半減期、及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。ポリペプチド及び結合剤のアミノ酸配列修飾／バリアントは、一般に、コード核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。以下に記載されるアミノ酸配列修飾の全ては、修飾されていない親分子の所望の生物学的活性（例えば、ＢＭＰ－９への実質的な結合なしに、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上に結合する）を依然として保持するポリペプチドまたは結合剤をもたらすべきである。
本明細書に記載のポリペプチド及び結合剤のアミノ酸配列修飾が企図される。例えば、ポリペプチドまたは結合剤の結合親和性、エフェクター機能、半減期、及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。ポリペプチド及び結合剤のアミノ酸配列修飾／バリアントは、一般に、コード核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。以下に記載されるアミノ酸配列修飾の全ては、修飾されていない親分子の所望の生物学的活性（例えば、ＢＭＰ－９への実質的な結合なしに、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上に結合する）を依然として保持するポリペプチドまたは結合剤をもたらすべきである。
本明細書で使用される場合、「機能的に同等の」という用語は、それが由来する元の配列と同じまたは実質的に同じ生物学的活性または機能、例えば、元の配列と比較して生理学的、化学的、理化学的または機能的特性に著しい変化がない修飾された配列を指す。「実質的に同一の」という用語は、元の配列または参照配列と機能的に等価であり、それに対して高度な配列同一性を有する配列を指す。一般に、実質的に同一の配列は、元の配列または参照配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり、同じ機能を有する。場合によっては、核酸配列を指すとき、実質的に同一の配列は、高いストリンジェンシー条件下、例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄の両方について、０．５Ｘ ＳＳＣ～約５Ｘ ＳＳＣ及び６５℃に実質的に等しい塩及び温度条件下で、元の配列にハイブリダイズする。一般に、本開示に従って提供される配列と実質的に同一または機能的に同等である修飾配列は、包含されることになっている。
アミノ酸修飾には、例えば、ポリペプチドまたは結合剤のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／または挿入、及び／または置換が含まれる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達するためになされるが、ただし、最終構築物が所望の特徴を有することを条件とする。アミノ酸の変化はまた、グリコシル化部位の数または位置を変化させるなど、ポリペプチドまたは結合剤の翻訳後プロセスを変化させ得る。特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、グリコシル化部位を改変するように変更される。
例えば、１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸を、ポリペプチドまたは結合剤に挿入または欠失させてもよい。好ましくは、アミノ酸配列挿入は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さのアミノ及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。本開示のポリペプチドまたは結合剤の挿入バリアントは、酵素のポリペプチドもしくは結合剤のＮ末端もしくはＣ末端への融合、ポリペプチドもしくは結合剤の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤の修飾も包含されることが想定される。本開示に包含される修飾としては、ポリペプチドまたは結合剤のアミノ酸配列における変形を有するものが挙げられる。ポリペプチドまたは結合剤の修飾には、例えば、本明細書に開示されるポリペプチドまたは結合剤と比較して、類似または改善された結合親和性、親和性、リガンド特異性、阻害効力、安定性、製造可能性、半減期、及び／または低減された凝集を有するものが含まれる。
置換変異誘発の目的の１つの部位には、本明細書で上述したＦｃドメイン単量体が含まれる。本開示の修飾ポリペプチドまたは結合剤の例示的な実施形態は、修飾ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４定常領域またはその一部を有するものを含み得る。一実施形態では、ポリペプチドまたは結合剤は、ＩｇＧ１定常領域（修飾または非修飾）を含む。一実施形態では、ポリペプチドまたは結合剤は、ＩｇＧ２定常領域（修飾または非修飾）を含む。一実施形態では、ポリペプチドまたは結合剤は、ＩｇＧ３定常領域（修飾または非修飾）を含む。一実施形態では、ポリペプチドまたは結合剤は、ＩｇＧ４定常領域（修飾または非修飾）を含む。
本開示に包含される修飾には、挿入、欠失、またはアミノ酸置換（保存的または非保存的）を含み得る修飾が含まれる。これらの修飾は、そのアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入され得る。所望の結合または生物学的活性が維持される限り、変異がポリペプチドまたは結合剤の複数の領域に生じ得ることを理解されたい。
修飾及びバリアントは、置換変異誘発によって生成され得、本開示のポリペプチドの生物学的活性（すなわち、機能的等価性）を保持し得ることが当該技術分野で知られている。これらの修飾またはバリアントは、除去されたアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基と、その代わりに挿入された異なる残基、例えば、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する。一般に、保存的アミノ酸置換は、類似の化学的特性（例えば、サイズ、電荷、または極性）を備えた別のアミノ酸残基に対するアミノ酸残基の置換である。
一般に、バリアントポリペプチド鎖間の類似性及び同一性の程度は、デフォルト設定、すなわち、ｂｌａｓｔｐプログラム、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（開放ギャップ１１及び伸長ギャップペナルティ１；ｇａｐｘドロップオフ５０、期待１０．０、ワードサイズ３）、及び活性化フィルターを使用して、Ｂｌａｓｔ２配列プログラム（Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔ．Ａ．及びＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，１９９９）を使用して本明細書で決定される。
しかしながら、同一性のレベルは、所与の配列の全長にわたって決定されてもよい。したがって、パーセント同一性は、元のペプチドと比較して同一であり、同じまたは同様の位置を占め得るアミノ酸を示す。パーセント類似性は、同一であるアミノ酸と、同じまたは類似の位置にある元のペプチドと比較して、保存的アミノ酸置換で置換されているアミノ酸とを示す。
いくつかの実施形態では、したがって、本開示のポリペプチドまたは結合剤の修飾は、元の配列または元の配列の一部と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、置換は、保存的置換である。しかしながら、任意の置換（非保存的置換を含む）は、ポリペプチドまたは結合剤が、ＢＭＰ－９に実質的に結合または阻害することなく、所望のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドに結合及び／または阻害する能力を保持する限り、想定される。
一般に、本開示のポリペプチドまたは結合剤をコードするヌクレオチド配列と本明細書に示されるヌクレオチド配列との間の核酸配列の相同性、類似性、または同一性は、少なくとも６０％であり、より典型的には、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、及びほぼ１００％の漸増する相同性または同一性を有する。
核酸ならびにポリペプチド及び結合剤の産生
本開示は、本明細書で提供されるＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを更に提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２５６～３３０、３３４、または３４２～３４４のうちの１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２５６～３３０、３３４、または３４２～３４４のうちのいずれか１つを含むか、またはそれらからなる。
本開示は、本明細書で提供されるＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを更に提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２５６～３３０、３３４、または３４２～３４４のうちの１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２５６～３３０、３３４、または３４２～３４４のうちのいずれか１つを含むか、またはそれらからなる。
ポリヌクレオチドは、鎖に共有結合したヌクレオチド単量体からなるバイオポリマーである。ＤＮＡ（ｃＤＮＡなど）及びＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸分子の単量体またはサブユニットとして機能する有機分子である。核酸分子またはポリヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖、直鎖または環状であり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子またはポリヌクレオチドは、ベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターは宿主細胞に含まれる。宿主細胞は、例えば、本開示のベクターまたはポリヌクレオチドによる形質転換またはトランスフェクション後に、ポリペプチドまたは結合剤を発現することができる。その目的のために、ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、通常、制御配列と作動可能に連結される。
更に、本開示は、本明細書に提供されるポリペプチドまたは結合剤をコードするポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターを提供する。
ベクターは、（外来）遺伝物質を細胞に導入するためのビヒクルとして使用される核酸分子である。「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体を包含するが、これらに限定されない。一般に、操作されたベクターは、複製起点、マルチクローニング部位、及び選択可能なマーカーを含む。ベクター自体は、一般に、インサート（導入遺伝子）及びベクターの「骨格」として機能するより大きな配列を含むヌクレオチド配列、一般的にＤＮＡ配列である。現代のベクターは、導入遺伝子インサート及び骨格以外の追加の特徴：プロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的化配列、タンパク質精製タグを包含し得る。発現ベクター（発現コンストラクト）と呼ばれるベクターは、具体的には、標的細胞における導入遺伝子の発現のためのものであり、一般に、制御配列を有する。
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な制御配列には、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを用いることで知られている。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、「作動可能に連結される」。例えば、前配列または分泌リーダー（シグナル配列）のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるか、またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように位置づけられる場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」は、連結されるＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合には、連続的であり、かつリーディングフェーズにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続していなくてもよい。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。かかる部位が存在していない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣例に従って使用される。
「トランスフェクション」は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞に意図的に導入するプロセスである。この用語は、主に真核細胞における非ウイルス方法について使用される。形質導入は、核酸分子またはポリヌクレオチドのウイルス媒介性導入を説明するためにしばしば使用される。動物細胞のトランスフェクションは、典型的には、材料の取り込みを可能にするために、細胞膜内に一過性の孔または「穴」を開けることを伴う。トランスフェクションは、リン酸カルシウムを使用して、エレクトロポレーションによって、細胞絞りによって、またはカチオン性脂質を材料と混合してリポソームを生成することによって実行され得、リポソームは、細胞膜と融合し、内部に貨物を堆積させる。
「形質転換」という用語は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）の、細菌への、及びまた、植物細胞を含む非動物真核細胞への非ウイルス導入を記載するために使用される。したがって、形質転換は、その周囲から細胞膜（複数可）を通って直接取り込まれ、その後の外因性遺伝物質（核酸分子）の組み込みに起因する細菌または非動物真核細胞の遺伝的変化である。形質転換は、人工的な手段によってもたらされ得る。形質転換が起こるためには、細胞または細菌は能力状態になければならず、これは飢餓や細胞密度などの環境条件に対する時間制限された応答として起こり得る。
更に、本開示は、ポリヌクレオチド／核酸分子または技術のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」及び「レシピエント細胞」という用語は、本開示のポリペプチドまたは結合剤をコードするベクター、外因性核酸分子、及びポリヌクレオチドのレシピエント、及び／またはポリペプチドまたは結合剤自体のレシピエントであり得るか、またはこれらのレシピエントである任意の個々の細胞または細胞培養を含むことが意図される。細胞へのそれぞれの物質の導入は、形質転換、トランスフェクションなどによって実行される。「宿主細胞」という用語はまた、単一細胞の子孫または潜在的な子孫を含むことが意図される。ある特定の修飾は、自然、偶発的、もしくは意図的変異のいずれかにより、または環境影響により後の世代で生じ得るため、そのような子孫は実際には親細胞と完全に同一ではない場合があるが（形態学的に、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体において）、依然として本明細書で使用される本用語の範囲内に含まれる。好適な宿主細胞としては、原核細胞または真核細胞が挙げられ、細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、ならびに昆虫細胞及び哺乳類細胞などの動物細胞、例えば、マウス細胞、ラット細胞、マカク細胞またはヒト細胞も挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のポリペプチドまたは結合剤は、細菌中で産生され得る。発現後、ポリペプチドまたは結合剤は、可溶性画分で大腸菌細胞ペーストから単離され、例えば、親和性クロマトグラフィー及び／またはサイズ排除を通じて精製され得る。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現されるタンパク質を精製するためのプロセスと同様に実行することができる。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、ポリペプチドまたは結合剤のための適切なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン酵母が、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されているものである。しかしながら、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ １２４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ １６０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ ２４１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ ５６５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ ３６９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ ４０２ ２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ １８３０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ ２４４２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；ならびにｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒなどのいくつかの他の属、種、及び株は、一般的に利用可能であり、本明細書で有用である。
本開示のグリコシル化ポリペプチドまたは結合剤の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株及びバリアント、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（芋虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（カ）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕ（カ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉなどの宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ－１バリアント及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ－５株は、公的に利用可能であり、そのようなウイルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、本開示による本明細書のウイルスとして使用され得る。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、イソギンチャク、及びタバコの植物細胞培養物を、宿主として使用することもできる。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生に有用なクローニング及び発現ベクターは、当業者に既知である。例えば、Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：７６－７８、Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９０－７９４、Ａｒｔｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ ８：７４５－７５０、及びＦｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２：９７９－９８６を参照されたい。
しかしながら、脊椎動物細胞が最も注目されており、培養下での脊椎動物細胞の増殖（組織培養）が日常的な手段となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（浮遊培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカ緑サル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、１４１３ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５ １）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）３８３：４４～６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝腫株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
更なる実施形態では、本開示は、ポリペプチドまたは結合剤の産生のためのプロセスを提供し、当該プロセスは、ポリペプチドまたは結合剤の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、産生されたポリペプチドまたは結合剤を培養物から回収することと、を含む。
本明細書で使用される場合、「培養」という用語は、培地中での好適な条件下での細胞のインビトロ維持、分化、成長、増殖、及び／または伝播を指す。「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むが、これらに限定されない、本開示のポリペプチドまたは結合剤の産生に関与する任意のステップを含む。
組換え技法を使用する場合、ポリペプチドまたは結合剤は、細胞内で、膜周囲空間で、または培地に直接分泌されることができる。ポリペプチドまたは結合剤が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、例えば、遠心分離または限外濾過によって、宿主細胞または溶解断片のいずれかの粒子デブリを除去する。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２）は、大腸菌の細胞膜腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。要するに、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて解凍する。細胞片は遠心分離によって除去され得る。抗体が培地に分泌される場合、かかる発現系の上清は、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して最初に濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために前述のステップのうちのいずれかに含まれ得、抗生物質は、外来性混入物質の成長を阻止するために含まれ得る。
宿主細胞から調製された本開示のポリペプチドまたは結合剤は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して回収または精製することができる。イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上のクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技法もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。本開示のポリペプチドまたは結合剤がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）は、精製に有用であり得る。
親和性クロマトグラフィーは、一般的な精製技法である。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成することができるよりも速い流量及び短い処理時間を可能にする。
本明細書に開示されるポリペプチドまたは結合剤は、組換えＤＮＡ法を含む、当業者によく知られている様々な方法によって作製され得る。
ポリペプチドまたは結合剤を発現するために、本明細書に記載のポリペプチド鎖をコードすることができるヌクレオチド配列を、発現ベクター、すなわち、特定の宿主における挿入されたコード配列の転写及び翻訳制御のための要素を含むベクターに挿入し得る。これらの要素は、調節配列、例えば、エンハンサー、構成的及び誘導的プロモーター、ならびに５’及び３’非翻訳領域を含み得る。当業者に周知の方法を使用して、そのような発現ベクターを構築してもよい。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技法、合成技法、インビボ遺伝子組換えなどが含まれる。
当業者に既知の様々な発現ベクター及び宿主細胞系を使用して、本明細書に記載のポリペプチド鎖を発現してもよい。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；バキュロウイルスベクターで感染された昆虫細胞系；ウイルスまたは細菌発現ベクターで形質転換された植物細胞系；及び動物細胞系などの微生物が含まれるが、これらに限定されない。哺乳類系における組換えタンパク質の長期産生のために、哺乳類細胞株における安定した発現が使用され得る。例えば、本明細書に記載のポリペプチド鎖のうちのいずれか１つをコードすることができるヌクレオチド配列は、ウイルス複製起点及び／または内因性発現エレメントと、同じまたは別個のベクター上の選択可能または可視マーカー遺伝子とを含み得る発現ベクターを使用して細胞株に変換され得る。本開示は、用いられるベクターまたは宿主細胞によって限定されるものではない。本明細書に開示されるある特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド鎖をコードすることができる核酸は、発現ベクターにライゲーションされ得る。結合剤が別個のポリペプチド鎖で構成される場合（すなわち、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが同一でない場合）、そのようなポリペプチド鎖の各々は、別個のベクターに、または同じベクターにライゲーションされてもよい。本開示によれば、結合剤のポリペプチド鎖は、単一のベクターまたは別個のベクター（例えば、ベクターセット）によってコードされ得る。細胞は、所望のベクターまたはベクターセットで変換される。
あるいは、ポリペプチド鎖は、それぞれ、インビトロ転写系またはカップリングされたインビトロ転写／翻訳系、または任意のそのような無細胞系から発現され得る。
ヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、対応するＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）の転写及び／または細胞培養物からのポリペプチド（複数可）の発現及び分泌のための条件下で培養され得る。例示的な実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド鎖をコードすることができるヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通じてポリペプチドの分泌を指示するシグナル配列を含むように設計され得る。
遺伝コードの固有の縮重性に起因して、同一の、実質的に同一の、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が、産生及び使用されてもよい。本開示のヌクレオチド配列は、遺伝子産物のクローニング、処理、及び／または発現の修飾を含むがこれらに限定されない様々な目的のためにヌクレオチド配列を変更するために、当該技術分野で一般に既知の方法を使用して操作され得る。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダム断片化及びＰＣＲ再構成によるＤＮＡシャッフリングを使用して、ヌクレオチド配列を操作することができる。例えば、オリゴヌクレオチド媒介部位特異的変異誘発を使用して、新しい制限部位を作製する変異、グリコシル化パターンを変化させる変異、コドン選好を変化させる変異、スプライスバリアントを産生する変異などを導入することができる。本明細書に記載のポリペプチド鎖をコードするコドン最適化された核酸は、本開示によって包含される。
加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する能力、または発現されたポリペプチドを所望の様式で処理する能力のために選択されてもよい。翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的な機構を有する異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、及びＷ１３８）は、商業的に、及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能であり、発現したポリペプチドの正しい修飾及び処理を確実にするために選択することができる。
当業者はまた、核酸及びポリペプチド配列が、当該技術分野で周知の化学的または酵素的方法を使用して、全体的または部分的に合成され得ることを容易に認識するであろう。例えば、ペプチド合成は、様々な固相技法を使用して行われてもよく、ＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの機械を使用して、合成を自動化してもよい。所望される場合、アミノ酸配列は、合成中に改変されてもよく、及び／または他のタンパク質由来の配列と組み合わされて、バリアントタンパク質を産生してもよい。
医薬組成物
本明細書に開示されるポリペプチドまたはＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を含む薬学的組成物が、本開示によって提供される。薬学的組成物は、一般に、本明細書に開示されるポリペプチドまたは結合剤と薬学的に許容される担体とを含む。
本明細書に開示されるポリペプチドまたはＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を含む薬学的組成物が、本開示によって提供される。薬学的組成物は、一般に、本明細書に開示されるポリペプチドまたは結合剤と薬学的に許容される担体とを含む。
薬学的組成物の調製は、当該技術分野で知られているように実行することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００を参照）。例えば、治療用化合物及び／または組成物は、１つ以上の固体または液体の薬学的担体物質及び／または添加物（もしくは補助物質）とともに、及び必要に応じて、治療または予防作用を有する他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて、好適な投与形態または剤形にされ、その後、ヒトまたは獣医学において薬剤として使用され得る。薬学的製剤はまた、その多くが当該技術分野で既知である添加剤、例えば、充填剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、分散剤、防腐剤、甘味料、着色剤、香料、芳香剤、増粘剤、希釈剤、緩衝物質、溶媒、可溶化剤、デポ効果を達成するための薬剤、浸透圧を変更するための塩、コーティング剤または酸化防止剤を含有することができる。
「薬学的組成物」という用語は、投与様式及び剤形の性質に応じて、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤、ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクル、例えば、保存剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、抗菌剤、抗真菌剤、潤滑剤、及び分注剤を含む少なくとも１つの構成要素を含む組成物を意味する。
「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で既知である任意の担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを意味するために使用される。懸濁剤の例としては、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント、またはこれらの物質の混合物が挙げられる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実にすることができる。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことも望ましい場合がある。注入可能な薬学的形態の長期吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。好適な担体、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの非限定的な例には、水、塩溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ゼラチン、油、アルコール、ポリオール、それらの好適な混合物、植物油（オリーブ油など）、及びオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが含まれる。賦形剤の非限定的な例としては、ラクトース、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、及びリン酸二カルシウムが挙げられる。崩壊剤の非限定的な例としては、デンプン、アルギン酸、及びある特定の複合体ケイ酸塩が挙げられる。潤滑剤の非限定的な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、ならびに高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。
「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などを伴わずに、対象、例えば、ヒト及び動物の細胞と接触する使用に好適であり、合理的な利益／リスク比に見合うものであることを意味する。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「薬学的担体」は、当該技術分野で既知であり、０．０１～０．１Ｍまたは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％の生理食塩水を含むが、これらに限定されない。更に、そのような薬学的に許容される担体は、水性または非水性溶液、懸濁液、及び乳液であり得る。非水性溶液の例は、グリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水性溶液、乳液または懸濁液が挙げられ、生理食塩水及び緩衝媒体を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンガー油、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養補充剤、リンガーデキストロースに基づくものなどの電解質補充剤などが含まれる。保存剤及び他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、照合剤、不活性ガスなども存在し得る。
薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性のある、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含み得る。一実施形態では、担体は、非経口投与に好適である。担体は、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与に好適であり得る。あるいは、担体は、舌下投与または経口投与に好適であり得る。他の実施形態では、担体は、局所投与または吸入による投与に好適である。薬学的に許容される担体には、注入可能な滅菌溶液または滅菌分散液を即時調製するための滅菌水溶液または滅菌分散液及び滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である限りを除いて、本明細書に提供される薬学的組成物におけるそれらの使用が企図される。補助的活性化合物を組成物に組み込むこともできる。例えば、本明細書で提供される薬学的組成物は、以下で更に説明されるように、少なくとも１つの追加の治療剤を更に含み得る。
本明細書に記載の薬学的組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、経腸、局所、舌下、または直腸手段を含むがこれらに限定されない任意の数の経路によって投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される薬学的組成物は、例えば、丸薬、錠剤、ラッカー錠、糖衣錠、顆粒、硬質及び軟質ゼラチンカプセル、水性、アルコール性もしくは油性溶液、シロップ、乳液もしくは懸濁液の形態で経口投与され得るか、または例えば、坐剤の形態で直腸投与され得る。
他の実施形態では、本明細書で提供される薬学的組成物は、注射または注入のための溶液の形態で、非経口的に、例えば、皮下的に、筋肉内に、または静脈内に投与することができる。他の好適な投与形態は、例えば、軟膏、クリーム、チンキ剤、スプレーもしくは経皮治療系の形態での経皮もしくは局所投与、または鼻スプレーもしくはエアロゾル混合物の形態での吸入投与、または例えば、マイクロカプセル、インプラントもしくはウェハである。
薬学的組成物は、典型的に、製造及び保管の条件下で無菌及び安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に好適な他の規則構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注入可能な組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアレート塩及びゼラチンを含めることによってもたらすことができる。更に、化合物は、時間放出製剤、例えば、徐放性ポリマーを含む組成物中で投与することができる。化合物は、急速放出から保護する担体、例えば、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤とともに調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、及びポリ乳酸、ポリグリコールコポリマー（ＰＬＧ）などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。
そのような製剤を調製するための多くの方法は、当業者には一般に既知である。滅菌注入可能な溶液は、本明細書で提供されるポリペプチドまたは結合剤などの活性化合物を、必要に応じて、上に列挙される成分の１つまたはその組み合わせを含む適切な溶媒に、必要とされる量で組み込み、その後で濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒及び上で列挙されたものからの必要とされる他の原料を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって、調製される。滅菌注入可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合、一般的な調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末を得る。化合物はまた、それらの溶解性を向上させる１つ以上の追加の化合物と製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物は、滅菌注入可能な溶液を含む。いくつかの実施形態では、無菌注入可能な溶液は、許容される溶液（例えば、水）で再構成される無菌粉末を含む。
組成物（非経口組成物など）を、投与の容易さ及び投与量の均一性のために単位剤形に製剤化することがしばしば有利である。「単位剤形」という用語は、ヒト対象及び他の動物の単位投与量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、好適な薬学的担体と関連して、所望の治療効果がもたらされるように算出された所定の量の活性物質を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）治療用化合物の独特の特徴及び達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）ＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患または状態の予防または治療のためにそのような治療用化合物を調合する技術分野に固有の制限によって異なり、左右され、かつそれらに直接依存し得る。投与量については、以下で更に論じられる。
投与量レジメンは、主治医及び臨床要因によって決定される。医学分野で周知であるように、任意の１人の患者の投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、一般的な健康状態、及び同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。
任意の化合物について、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイにおいて、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、もしくはブタなどの動物モデルにおいて、最初に推定され得る。また、動物モデルを使用して、濃度範囲及び投与経路を決定し得る。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける投与のための有用な用量及び経路を決定してもよい。これらの技法は、当業者に周知であり、治療上有効な用量は、症状または状態を改善する活性成分の量を指す。治療有効性及び毒性は、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に対して治療的に有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）を算出及び対照化することによって、細胞培養物中または実験動物の標準的な薬学的手順によって決定され得る。本明細書に記載される薬学的組成物のうちのいずれかは、治療を必要とする任意の対象、例えば、限定するものではないが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及び特にヒトなどの哺乳類に適用され得る。
「有効用量」、「有効投与量」及び「有効量」という用語は、所望の効果を達成するか、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指すために互換的に使用される。「治療上有効な」用量または量という用語は、すでに疾患に罹患している患者における疾患及びその合併症を治療するか、改善するか、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量として定義される。治療有効量の本開示のポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物は、概して、疾患症状の重症度の減少、無疾患症状期間の頻度または期間の増加、または疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは身体障害の予防をもたらす。いくつかの実施形態では、治療有効量は、本明細書に記載されるように、対象におけるＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患または障害を予防または治療するポリペプチドまたは結合剤または組成物の量または用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、本明細書に記載される、対象におけるアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上を阻害するポリペプチドまたは結合剤または組成物の量または用量である。
この使用に有効な量または用量は、治療される障害（適応症）、送達されるポリペプチドまたは結合剤、治療文脈及び目的、疾患の重症度、以前の療法、患者の臨床歴及び治療剤に対する応答、投与経路、患者のサイズ（体重、体表面もしくは臓器サイズ）及び／または状態（年齢及び一般的な健康状態）、ならびに患者自身の免疫系の一般的な状態に依存する。適切な用量は、最適な治療効果を得るために、１回または一連の投与にわたって患者に投与することができるように、主治医の判断に従って調整することができる。
典型的な投与量は、上述の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ～最大約３０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であってもよい。特定の実施形態では、投与量は、１．０μｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、任意選択で１０μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または１００μｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。投与量については、以下で更に論じられる。
使用方法
本明細書に記載される製剤は、疾患／障害の治療、緩和及び／または予防を必要とする対象においてそれを行うことにおいて薬学的組成物として有用である。用語「治療」は、治療的処置及び予防的もしくは予防性手段の両方を指す。治療には、疾患／障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害に向かう素因を有する患者の身体、単離された組織、または細胞への本製剤の適用または投与が含まれ、その目的は、疾患、疾患の症状、または疾患に向かう素因を治癒する（ｃｕｒｅ）、治癒する（ｈｅａｌ）、緩和する（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）、緩和する（ｒｅｌｉｅｖｅ）、改変する、修復する、寛解する、改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）、または影響を与えることである。
本明細書に記載される製剤は、疾患／障害の治療、緩和及び／または予防を必要とする対象においてそれを行うことにおいて薬学的組成物として有用である。用語「治療」は、治療的処置及び予防的もしくは予防性手段の両方を指す。治療には、疾患／障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害に向かう素因を有する患者の身体、単離された組織、または細胞への本製剤の適用または投与が含まれ、その目的は、疾患、疾患の症状、または疾患に向かう素因を治癒する（ｃｕｒｅ）、治癒する（ｈｅａｌ）、緩和する（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）、緩和する（ｒｅｌｉｅｖｅ）、改変する、修復する、寛解する、改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）、または影響を与えることである。
本明細書で使用される「寛解」という用語は、本明細書で以下に指定される疾患／障害を有する患者の疾患状態の、本開示によるポリペプチドもしくは結合剤または薬学的組成物の対象への投与による任意の改善を指す。例えば、「寛解」という用語は、疾患の発症または進行を、減少、抑制、減弱化、停止、または安定させることを意味する。そのような改善はまた、患者の疾患／障害の進行の遅延または停止として見られてもよい。本明細書で使用される「予防」という用語は、それを必要とする対象に、本開示によるポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物を投与することによって、本明細書で以下に指定される疾患／障害を有する患者の発生または再発を回避することを意味する。
「疾患または状態」（または「疾患／状態」）という用語は、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物での治療から利益を受け得る任意の病理学的医学的状態を指す。これは、哺乳動物を問題の疾患／障害にかかりやすくする病理学的状態を含む、慢性及び急性の疾患または状態を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドまたは結合剤及びその組成物は、ＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患または状態の予防、治療または寛解に有用である。したがって、対象におけるＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患または状態の予防または治療のための方法が提供され、方法は、治療有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物を投与することを含む。ポリペプチド及び結合剤は、一般に、薬学的組成物の形態で投与される。対象は、そのような治療を必要としていてもよく、すなわち、本明細書に記載されるように、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達に関連する、またはＴＧＦβスーパーファミリーの１つ以上のメンバーによって媒介された疾患または状態を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある。
「阻害」または「阻害すること」という用語は、本明細書では、一般に、疾患または状態の進行、成長、または拡大を低減または遅延させるなどのプロセスを低減、遅延、制限、遅延、抑制、遮断、中和、妨害、または予防することを指すために使用されるが、これらに限定されない。
本開示のいくつかの実施形態では、「治療すること」は、過剰なアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０の生物学的活性を中和することを指す。それは、改善の好適な臨床変数、疾患または状態に対する効果の病理学的評価、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０シグナル伝達の直接阻害（ＢＭＰ－９を実質的に阻害することなく）、または治療されている疾患または状態に好適な別の尺度によって決定され得る。
いくつかの実施形態では、改善は、臨床変数を治療前に行われた測定値と比較することによって、または代替的に健康な成人で測定された典型的な値と比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、治療または予防は、本明細書に提供されるポリペプチド、結合剤、組成物、及び方法を使用して治療される対象のパフォーマンスが、プラセボ群のメンバーと比較して、過去の対照と比較して、または同じ対象に与えられる後続の試験との間に測定可能な差異がある場合、本開示の文脈内にある。
「対象」という用語は、ＴＧＦβスーパーファミリーに関連する疾患もしくは状態を有する、またはその影響を受けやすい、またはそのリスクがある生体生物を含む。対象の例には、哺乳動物、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、及びそれらのトランスジェニック種が含まれる。「対象」という用語は、一般に、肺高血圧症、線維症、筋力低下及び萎縮、代謝障害及び／または心臓代謝性疾患、骨損傷、または低い赤血球レベルなどのＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患または状態を特徴とする状態に感受性のある動物、例えば、哺乳類、例えば、霊長類、例えば、ヒトを含む。動物はまた、障害、例えば、マウスモデル、異種移植片レシピエントなどの動物モデルであってもよい。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
本開示の組成物及び方法で使用するためのポリペプチドまたは結合剤の用量に特定の制限はない。例示的な用量には、対象または試料の重量１キログラム当たりのポリペプチドまたは結合剤のミリグラムまたはマイクログラム量（例えば、１キログラム当たり約５０マイクログラム～約５００ミリグラム、１キログラム当たり約１ミリグラム～約１００ミリグラム、１キログラム当たり約１ミリグラム～約５０ミリグラム、１キログラム当たり約１ミリグラム～約１０ミリグラム、または１キログラム当たり約３ミリグラム～約５ミリグラム）が含まれる。追加の例示的な用量には、約５～約５００ｍｇ、約２５～約３００ｍｇ、約２５～約２００ｍｇ、約５０～約１５０ｍｇ、または約５０、約１００、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇもしくは約２５０ｍｇ、及び例えば、１日１回もしくは１日２回、またはより低いもしくはより高い量が含まれる。
いくつかの実施形態では、成人ヒトの用量範囲は、概して、０．００５ｍｇ～１０ｇ／日である。ポリペプチドまたは結合剤及びその組成物は、単位剤形で、例えば、そのような投与量で有効である単位で、または同じもの、例えば、５ｍｇ～５００ｍｇ、通常は約１０ｍｇ～２００ｍｇを含む単位の倍数として提供され得る。投与量単位は、例えば、１～３０ｍｇ、１～４０ｍｇ、１～１００ｍｇ、１～３００ｍｇ、１～５００ｍｇ、２～５００ｍｇ、３～１００ｍｇ、５～２０ｍｇ、５～１００ｍｇ（例えば、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、または５００ｍｇ）の本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤または組成物を含む。
疾患または状態の治療的処置のためのポリペプチドまたは結合剤の有効量は、投与様式、対象の年齢、体重、及び一般的な健康状態に応じて変化することを理解されたい。最終的には、担当医師または獣医が適切な量及び投与量レジメンを決定する。単独で、または投与される１つ以上の活性化合物と組み合わせて使用されるポリペプチドまたは結合剤の投与量または量は、個々の症例に依存し、慣習的に、最適な効果を達成するために個々の状況に適合されることが理解されるべきである。投薬及び投与レジメンは、当業者の範囲内であり、適切な用量は、通常、当業者の医師、獣医師、または研究者の知識内のいくつかの因子に依存する（例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（２０００）、ＰＤＲ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｏｃｋｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ Ｌｉｎｄａ，Ｃａｌｉｆ．（２０００）を参照）。例えば、投薬及び投与レジメンは、治療される疾患または状態の性質及び重症度、ならびに治療されるヒトまたは動物の性別、年齢、体重、及び個体応答性、使用される化合物の有効性及び作用期間、治療が急性であるか慢性であるか予防的であるか、及び／または治療分子（複数可）に加えて他の活性化合物が投与されるかどうかにも依存する。
本明細書で提供されるポリペプチドまたは結合剤または組成物の投与は、所望の目的を達成するのに有効な投与量及び期間で、既知の手順を使用して実行され得る。投与量レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整することができる。例えば、いくつかの分割用量が、１日１回、週１回、２週間に１回、または月１回投与され得るか、または用量が、治療状況の緊急事態によって示されるように比例的に低減され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは結合剤または組成物は、対象において、ＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患または状態、例えば、肺高血圧症、線維症、筋力低下及び萎縮、代謝障害及び／または心臓代謝性疾患、骨損傷、及び／または低い赤血球レベルを予防または治療するのに十分な治療上有効な投与量で投与される。
いくつかの実施形態では、本開示の方法によれば、ＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患または状態の発症または進行の１つ以上の症状は、対象において、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％低減する。
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは結合剤は、１つ以上の追加の療法または治療剤と組み合わせて投与される。追加の療法または治療剤は、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤または組成物の投与の前、後、または同時に投与することができる。いくつかの実施形態では、追加の療法または治療剤は、同じ組成物中のポリペプチドまたは結合剤とともに製剤化される。他の実施形態では、追加の療法または治療剤は、別々に投与される。追加の療法及び治療剤の例としては、限定されないが、抗線維化剤、抗がん剤、抗炎症剤、抗肥満剤、抗糖尿病剤、別のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤または阻害剤、例えば、抗体、抗体断片、抗原結合断片、可溶性ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドトラップなど、１つ以上の追加の標的に結合または阻害する別の薬剤などが挙げられる。
あるいは、いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは結合剤は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド及び／または別の標的を発現するポリペプチドまたは結合剤または細胞もしくは組織を追跡するのに有用な検出可能部分または診断部分とコンジュゲートされ得る。いくつかのそのような実施形態では、検出可能な部分または診断部分とコンジュゲートされた本開示のポリペプチドまたは結合剤を対象に投与することと、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達と関連付けられた疾患または障害（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、またはＢＭＰ－１０の過剰発現）が診断されるようにポリペプチドまたは結合剤を検出することと、を含む、ＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患または状態の診断方法が提供される。
ＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患及び状態
本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤、及びその薬学的組成物は、ＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患及び状態の予防または治療に有用である。したがって、対象におけるＴＧＦβスーパーファミリーリガンドシグナル伝達と関連付けられた疾患または状態の予防または治療のための方法であって、治療有効量の本明細書に記載のポリペプチド、結合剤、または薬学的組成物を投与することを含む、方法が提供される。ポリペプチド及び結合剤は、一般に、薬学的組成物の形態で投与される。対象は、そのような治療を必要としていてもよく、すなわち、本明細書に記載されるように、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達と関連付けられた疾患または状態を有するか、または発症するリスクがある。
本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤、及びその薬学的組成物は、ＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患及び状態の予防または治療に有用である。したがって、対象におけるＴＧＦβスーパーファミリーリガンドシグナル伝達と関連付けられた疾患または状態の予防または治療のための方法であって、治療有効量の本明細書に記載のポリペプチド、結合剤、または薬学的組成物を投与することを含む、方法が提供される。ポリペプチド及び結合剤は、一般に、薬学的組成物の形態で投与される。対象は、そのような治療を必要としていてもよく、すなわち、本明細書に記載されるように、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達と関連付けられた疾患または状態を有するか、または発症するリスクがある。
本明細書で使用される場合、「ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドシグナル伝達関連疾患または状態」という用語は、１つ以上のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド、特にアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０活性の阻害を通じて改善され得る疾患及び状態を指す。ＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患または状態には、限定されないが、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド、特にアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０の過剰発現または過剰活性化と関連付けられた疾患及び状態が含まれる。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患または状態は、アクチビンＡ及び／またはアクチビンＢによって媒介される。一実施形態では、治療される疾患または状態は、アクチビンＡによって媒介される。一実施形態では、治療される疾患または状態は、アクチビンＢによって媒介される。一実施形態では、治療される疾患または状態は、ＧＤＦ－８によって媒介される。一実施形態では、治療される疾患または状態は、ＧＤＦ－１１によって媒介される。一実施形態では、治療される疾患または状態は、ＢＭＰ－１０によって媒介される。別の実施形態では、治療される疾患または状態は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１の組み合わせによって媒介される。
本開示に従って予防または治療され得るＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患または状態の例としては、限定されないが、肺高血圧症、線維症、筋力低下及び萎縮、代謝障害及び／または心臓代謝性疾患、骨損傷、及び／または低い赤血球レベル、ならびに血管疾患及び血管障害が挙げられる。
肺高血圧症
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、肺高血圧症（ＰＨ）の治療または予防のために使用される。例えば、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、限定されないが、肺血管リモデリング、肺線維症、及び右心室肥大を含む様々な状態、または１つ以上のＰＨ関連合併症の進行速度及び／または重症度を治療、予防または低減するために、例えば、右心室収縮期圧を低減する必要がある対象においてそれを行うために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、肺高血圧症（ＰＨ）の治療または予防のために使用される。例えば、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、限定されないが、肺血管リモデリング、肺線維症、及び右心室肥大を含む様々な状態、または１つ以上のＰＨ関連合併症の進行速度及び／または重症度を治療、予防または低減するために、例えば、右心室収縮期圧を低減する必要がある対象においてそれを行うために使用され得る。
肺高血圧症は、高い肺動脈圧をもたらす肺血管リモデリングを特徴とする疾患である。成長促進アクチビン／成長分化因子経路と成長阻害ＢＭＰ経路との間の不均衡は、この疾患で観察される血管リモデリングを促進する。例えば、アクチビンＡの上昇は、臨床的及び実験的肺高血圧で観察されている。ミオスタチン及びアクチビンは、骨格筋の成長の調節において役割を果たすことが知られている。例えば、ミオスタチンのないマウスは、骨格筋質量の大幅な増加を示す。ミオスタチンはまた、線維症の促進にも関与している。例えば、ミオスタチンのないマウスは、筋線維症の低減を示す。アクチビンＡを過剰発現するマウスもまた、線維症の増加を示す。加えて、アクチビンは骨組織中で豊富に発現し、骨芽細胞及び破骨細胞機能の両方を制御することによって骨形成を調節する。アクチビンは、骨疾患において上方制御されることが報告されている。ミオスタチンはまた、骨発生を増加させ、骨芽細胞活性を阻害することを通じて、骨ホメオスタシスに関与している。したがって、アクチビン及び／またはＧＤＦシグナル伝達を低減または阻害する方法は、肺高血圧症（例えば、ＰＡＨ、静脈ＰＨ、低酸素ＰＨ、血栓塞栓性ＰＨ、または雑種ＰＨ）、筋萎縮もしくは衰弱、線維症、骨損傷、または低い赤血球レベル（例えば、貧血）などの疾患及び状態の治療に有用であり得る。
ＰＨは、５つの主要なタイプ：動脈性（ＰＡＨ）、静脈性（左側心疾患に続発するＰＨ）、低酸素性（肺疾患によって引き起こされるＰＨ）、血栓塞栓性（慢性動脈閉塞、例えば、血栓によって引き起こされるＰＨ）、または雑種（不明瞭または多因子機構を伴うＰＨ）に分類することができ、ＷＨＯ群１－Ｖとしても知られている。ＰＡＨは、リモデリングによる小血管の閉塞または狭窄によって引き起こされる肺の血管内の圧力の増加を特徴とする。これにより、肺を通る血流に対する抵抗が増加し、心臓の右側がより懸命に働くようになり、心不全につながる可能性がある。ＰＡＨは、特発性、遺伝性であり得るか、または薬物使用、感染症、肝硬変、先天性心臓異常、または結合組織／自己免疫疾患（例えば、強皮症もしくは狼瘡）に関連し得る。ＰＨの治療には、血管拡張剤、抗凝固剤、及び補助酸素が含まれるが、これらの治療は、疾患を引き起こす生物学的機構を標的とするのではなく、疾患の症状を管理する。
肺高血圧症（ＰＨ）は、肺動脈、肺静脈、及び肺毛細血管を含む肺血管系における高血圧を特徴とする疾患である。一般に、ＰＨは、安静時の平均肺動脈圧（ＰＡ）≧２５ｍｍＨｇまたは運動による≧３０ｍｍＨｇとして定義される（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００９）。主なＰＨ症状は、呼吸困難または息切れであり、他の症状には、疲労、めまい、失神、末梢浮腫（足、脚、または足首の腫れ）、青みがかった唇及び皮膚、胸痛、狭心症、運動中の立ちくらみ、非生産的な咳、脈拍異常及び動悸が含まれる。ＰＨは、肺高血圧症を有する人々の最も一般的な死因のうちの１つである、心不全を引き起こす重篤な疾患であり得る。術後の肺高血圧症は、多くの種類の手術または処置を複雑にし、高死亡率に関連する課題を提示する可能性がある。
ＰＨは、病態生理学的メカニズム、臨床的提示、及び治療アプローチにおける疾患共有の類似性の異なる症状に基づいてグループ化され得る（Ｓｉｍｏｎｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＰＨの臨床分類は、１９７３年に最初に提案され、最近更新された臨床分類は、２００８年に世界保健機関（ＷＨＯ）によって承認された。更新されたＰＨ臨床分類によれば、ＰＨの５つの主要な群が存在する：ＰＡ楔入圧が≦１５ｍｍＨｇであることを特徴とする肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）、ＰＡ楔入圧が＞１５ｍｍＨｇであることを特徴とする左心疾患（肺静脈高血圧症またはうっ血性心不全としても知られる）に起因するＰＨ、肺疾患及び／または低酸素症に起因するＰＨ、慢性血栓塞栓症ＰＨ、ならびに不明瞭または多因子病因を有するＰＨ（Ｓｉｍｏｎｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＰＡＨは更に、ＰＡＨの家族歴も特定された危険因子もない散発性疾患である特発性ＰＡＨ（ＩＰＡＨ）、遺伝性ＰＡＨ、薬物及び毒素によって誘発されるＰＡＨ、結合組織疾患、ＨＩＶ感染症、門脈高血圧症、先天性心疾患、血吸虫病、及び慢性溶血性貧血と関連付けられたＰＡＨ、ならびに新生児の持続性ＰＨに分類される（Ｓｉｍｏｎｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）。様々なタイプのＰＨの診断は、一連の検査を必要とする。
一般に、ＰＨの治療は、ＰＨの原因または分類に依存する。ＰＨが既知の医薬品または医学的状態によって引き起こされる場合、それは二次ＰＨとして知られており、その治療は通常、基礎疾患に向けられている。肺静脈高血圧症の治療は、一般に、利尿薬、ベータ遮断薬、及びＡＣＥ阻害剤を投与すること、または僧帽弁もしくは大動脈弁を修復もしくは交換することによって左心室機能を最適化することを伴う。ＰＡＨ療法には、肺血管拡張薬、ジゴキシン、利尿薬、抗凝固薬、及び酸素療法が含まれる。肺血管拡張薬は、プロスタシクリン経路（例えば、静脈内エポプロステノール、皮下もしくは静脈内トレプロスチニル、及び吸入イロプロストを含むプロスタシクリン）、一酸化窒素経路（例えば、シルデナフィル及びタダラフィルを含むホスホジエステラーゼ－５阻害剤）、ならびにエンドセリン－１経路（例えば、経口ボセンタン及び経口アンブリセンタンを含むエンドセリン受容体拮抗剤）を含む、異なる経路を標的とする（Ｈｕｍｂｅｒｔ，Ｍ．，２００９、Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００９）。しかしながら、現在利用可能な療法は、ＰＨの治療を提供せず、それらは、多くのＰＨ患者において観察される血管の基礎となる血管リモデリング及び筋肉化を直接治療しない。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＨを治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＨを予防する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＨの進行速度を低減する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法に関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、間質性肺疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含み、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上を阻害する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、限定されないが、ＧＤＦ－３、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－１５、ＡＬＫ－４、ＡＬＫ－５、及びＡＬＫ－７などの１つ以上の追加のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドもまた、阻害され得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、間質性肺疾患の１つ以上の合併症の進行率及び／または重症度を治療、予防、または低減する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含み、ポリペプチドまたは結合剤は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上を阻害する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、間質性肺疾患は、特発性肺線維症である。いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＨの重症度を低減する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症の１つ以上の合併症（例えば、肺動脈における平滑筋及び／または内皮細胞増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右心室肥大、及び肺線維症）を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤を投与することを含む、方法に関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＰＨ（例えば、肺動脈における平滑筋及び／または内皮細胞増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右心室肥大、及び肺線維症）の１つ以上の合併症を予防する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法に関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＰＨ（例えば、肺動脈における平滑筋及び／または内皮細胞増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右心室肥大、及び肺線維症）の１つ以上の合併症の進行速度を低減する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤を投与することを含む、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症（例えば、肺動脈における平滑筋及び／または内皮細胞増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右心室肥大、及び肺線維症）の１つ以上の合併症の重症度を低減する方法であって、それを必要としている患者に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法に関する。
ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法は、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を有する対象に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも２５ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０ｍｍＨｇ）の静止肺動脈圧（ＰＡＰ）を有する対象に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、肺高血圧症を有する対象におけるＰＡＰを低減する。例えば、方法は、肺高血圧症を有する対象において、ＰＡＰを少なくとも３ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５ｍｍＨｇ）低減し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、肺高血圧症を有する対象における肺血管抵抗性を低減する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、肺高血圧症を有する対象における肺毛細血管楔入圧を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、肺高血圧症を有する対象における左心室拡張末期圧を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、肺高血圧症を有する対象における運動能力（能力、耐性）を増加させる（改善する）。例えば、方法は、肺高血圧症を有する対象において６分間の歩行距離を増加させ、任意選択で、６分間の歩行距離を少なくとも１０メートル（例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、またはそれ以上のメートル）増加させることができる。加えて、方法は、対象のＢｏｒｇ呼吸困難指数（ＢＤＩ）を低減し得、これは、任意選択で、６分間の歩行試験の後に評価され得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象のＢｏｒｇ呼吸困難指数（ＢＤＩ）を少なくとも０．５指数ポイント（例えば、少なくとも０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０指数ポイント）低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、世界保健機関によって認識されるクラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ、またはクラスＩＶの肺高血圧症を有する対象に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、肺高血圧症の臨床的進行（悪化）の遅延（例えば、世界保健機関の標準によって測定される進行）に関する。いくつかの実施形態では、方法は、肺高血圧症のクラス進行を予防または遅延させる（例えば、世界保健機関によって認識されるように、クラスＩからクラスＩＩ、クラスＩＩからクラスＩＩＩ、またはクラスＩＩＩからクラスＩＶへの進行を予防または遅延させる）。いくつかの実施形態では、方法は、肺高血圧クラスの退縮を促進または増加させる（例えば、世界保健機関によって認識されるように、クラスＩＶからクラスＩＩＩ、クラスＩＩＩからクラスＩＩ、またはクラスＩＩからクラスＩの退縮を促進または増加させる）。
いくつかの実施形態では、対象は、開示の１つ以上のポリペプチドまたは結合剤に加えて、肺高血圧症を治療するための１つ以上の支持療法または活性剤を更に投与される。例えば、対象はまた、プロスタシクリン及びその誘導体（例えば、エポプロステノール、トレプロスチニル、及びイロプロスト）；プロスタシクリン受容体アゴニスト（例えば、セレキシパグ）；エンドセリン受容体アンタゴニスト（例えば、テリン、アンブリセンタン、マシテンタン、及びボセンタン）；カルシウムチャネル遮断薬（例えば、アムロジピン、ジルチアゼム、及びニフェジピン）；抗凝固剤（例えば、ワルファリン）；利尿剤；酸素療法；心房隔離術；肺血栓形成術；ホスホジエステラーゼ５型阻害剤（例えば、シルデナフィル及びタダラフィル）；可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化剤（例えば、シナシグアト及びリオシグアト）；ＡＳＫ－１阻害剤（例えば、ＣＩＩＡ；ＳＣＨ７９７９７；ＧＳ－４９９７；ＭＳＣ２０３２９６４Ａ；３Ｈ－ナフト［１，２，３－ｄｅ］キニリン－２，７－ジオン、ＮＱＤＩ－１；２－チオキソ－チアゾリジン、５－ブロモ－３－（４－オキソ－２－チオキソ－チアゾリジン－５－イリデン）－１，３－ジヒドロ－インドール－２－オン－）；ＮＦ－κＢアンタゴニスト（例えば、ｄｈ４０４、ＣＤＤＯ－エポキシド；２．２－ジフルオロプロピオンアミド；Ｃ２８イミダゾール（ＣＤＤＯ－Ｉｍ）；２－シアノ－３，１２－ジオキソオレアン－１，９－ジエン－２８－オイ酸（ＣＤＤＯ）；３－アセチルオレアノール酸；３－トリフルオロアセチルオレアノール酸；２８－メチル－３－アセチルオレアナン；２８－メチル－３－トリフルオロアセチルオレアナン；２８－メチルオキシオレアノール酸；ＳＺＣＯ１４；ＳＣＺ０１５；ＳＺＣＯ１７；オレアノール酸のＰＥＧ化誘導体；３－Ｏ－（β－Ｄ－グルコピラノシル）オレアノール酸；３－Ｏ－［β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→３）－β－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→２）－β－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→３）－β－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸２８－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシルエステル；３－Ｏ－［β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→２）－β－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸２８－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシルエステル；３－Ｏ－［ａ－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－β－Ｄ－グルクロノピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－β－Ｄ－グルクロノピラノシル－］オレアノール酸２８－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシルエステル；２８－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－オレアノール酸；３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル（１→３）－β－Ｄ－グルコピラノシズロン酸（ＣＳ１）；オレアノール酸３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル（１→３）－β－Ｄ－グルコピラノシズロン酸（ＣＳ２）；メチル３，１１－ジオキソオレアン－１２－ｅｎ－２８－オラート（ジオキソール）；ＺＣＶＩ４－２；ベンジル３－デヒドロキシ－１，２，５－オキサジアゾロ［３’，４’，２，３］オレアノレート）肺移植及び／または心臓移植からなる群から選択される１つ以上の支持療法または活性剤を投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、対象はまた、ＢＭＰ－９ポリペプチドを投与され得る。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ－９ポリペプチドは、成熟ＢＭＰ－９ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ－９ポリペプチドは、ＢＭＰ－９プロドメインポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ－９ポリペプチドは、薬学的調製物中で投与され、これは、任意選択でＢＭＰ－９プロドメインポリペプチドを含んでもよい。ＢＭＰ－９プロドメインポリペプチドを含むそのようなＢＭＰ－９薬学的調製物において、ＢＭＰ－９ポリペプチドは、ＢＭＰ－９プロドメインポリペプチドと非共有結合的に会合してもよい。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ－９薬学的調製物は、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドを実質的に含まないか、または含まない。いくつかの実施形態では、対象はまた、オレアノール酸またはその誘導体を投与され得る。
線維化
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、線維症の治療または予防のために使用される。例えば、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を使用して、組織及び／または臓器の線維性疾患、線維性瘢痕化、ならびに線維腫増殖性障害を含むがこれらに限定されない様々な状態の進行速度及び／または重症度を治療、予防、または低減する必要がある対象においてそれを行うことができる。線維性疾患または状態の非限定的な例としては、肺線維症（例えば、特発性肺線維症）、腎線維症、肝線維症（例えば、肝硬変）、全身性硬化症、強皮症、皮膚線維症、心臓線維症、骨髄線維症、眼線維症、及び骨髄線維症が挙げられる。１つの特定の実施形態では、全身性硬化症（ＳＳｃ）が治療または予防される。別の特定の実施形態では、強皮症が治療または予防される。別の特定の実施形態では、骨髄線維症（ＭＦ）が治療または予防される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、線維症の治療または予防のために使用される。例えば、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を使用して、組織及び／または臓器の線維性疾患、線維性瘢痕化、ならびに線維腫増殖性障害を含むがこれらに限定されない様々な状態の進行速度及び／または重症度を治療、予防、または低減する必要がある対象においてそれを行うことができる。線維性疾患または状態の非限定的な例としては、肺線維症（例えば、特発性肺線維症）、腎線維症、肝線維症（例えば、肝硬変）、全身性硬化症、強皮症、皮膚線維症、心臓線維症、骨髄線維症、眼線維症、及び骨髄線維症が挙げられる。１つの特定の実施形態では、全身性硬化症（ＳＳｃ）が治療または予防される。別の特定の実施形態では、強皮症が治療または予防される。別の特定の実施形態では、骨髄線維症（ＭＦ）が治療または予防される。
線維症は、臓器または組織における過剰な結合組織の形成である。損傷（例えば、傷害）に応答して、または免疫応答（例えば、炎症応答）の一部として形成され得る結合組織は、それが形成される臓器または組織の構造及び機能を破壊し、組織剛性の増加をもたらし得る。線維症は、とりわけ、肺（例えば、肺線維症、嚢胞性線維症）、肝臓（例えば、肝硬変）、心臓（例えば、心筋梗塞後の心内膜心筋線維症または線維症）、脳（例えば、グリア瘢痕形成）、皮膚（例えば、ケロイドの形成）、腎臓（例えば、腎線維症）、及び眼（例えば、角膜線維症）を含む、体内の多くの臓器及び組織で発生することができ、ある特定の医学的治療（例えば、化学療法、放射線療法、及び手術）と関連付けられていることが知られている。しかしながら、線維症の対象に現在利用可能な治療選択肢は限られており、利用可能なほとんどの治療は、生活の質の改善または疾患進行の一時的な遅延に焦点を当てている。
予防または治療され得る線維症の他の例示的な実施形態には、例えば、限定されないが、間質性肺疾患、ヒト線維性肺疾患（例えば、閉塞性細気管支炎、特発性肺線維症、既知の病因による肺線維症、肺疾患における腫瘍間質、肺に影響を及ぼす全身性硬化症、ヘルマンスキー・パドラク症候群、石炭労働者の塵肺症、アスベスト症、珪炭症、慢性肺高血圧症）、肺線維症、嚢胞性線維症、肝線維症、心線維症、縦隔線維症、後腹膜線維症、骨髄線維症、皮膚線維症を含むＡＩＤＳ関連の治療可能な線維症；強皮症；及び全身性硬化症が含まれる。治療または予防することができる特定の形態の線維症としては、ヒトテノン線維芽細胞、腎臓、肺、腸、肝臓、心臓、骨髄、性器、皮膚、及び眼など、体の任意の臓器または組織または細胞に影響を及ぼすものが挙げられる。これらの疾患には、嚢胞性線維症、全身性硬化症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、デュピュイトラン拘縮、糸球体腎炎、肝線維症、梗塞後心線維症、再狭窄、眼手術誘発性線維症、及び瘢痕化が含まれるが、これらに限定されない。結合組織の遺伝的障害を治療することもでき、限定されないが、マルファン症候群（ＭＦＳ）及び骨発生不全症が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を阻害するために使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、線維腫増殖性障害の治療または予防のために使用される。線維腫増殖性障害は、線維芽細胞の増殖に加えて、フィブロネクチン、ラミニン、及びコラーゲンなどの細胞外マトリックスの対応する過剰発現を特徴とする。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することによって、線維症を減少または予防する必要がある対象においてそれを行う方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することによって、線維症を遅らせるか、または阻害する必要がある対象においてそれを行う方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、または本明細書に記載のそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することによって、線維症を発症するリスクを低減することを必要とする対象においてそれを行う方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドもしくは結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することによって、線維症を有するか、または線維症を発症するリスクがある対象を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、線維症は、化学療法薬物誘発性線維症、放射線誘発性線維症、肺線維症、肝線維症、腎線維症（例えば、慢性腎疾患に関連する線維症）、角膜線維症、心臓線維症、骨髄線維症、縦隔線維症、後腹膜線維症、関節線維症、骨関節線維症、組織線維症、腫瘍間質、脱形成腫瘍、外科的接着、肥大性瘢痕、またはケロイドである。
いくつかの実施形態では、線維症は、創傷、火傷、Ｂ型またはＣ型肝炎感染症、脂肪性肝疾患、血吸虫感染症、腎疾患（例えば、慢性腎疾患）、心疾患、黄斑変性症、クローン病、網膜もしくは硝子体網膜症、全身性もしくは局所性強皮症、アテローム性動脈硬化症、または再狭窄と関連付けられた線維症である。いくつかの実施形態では、線維症は、慢性腎疾患に起因する。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、化学療法薬物誘発性線維症、放射線誘発性線維症、肺線維症、肝線維症、腎線維症（例えば、慢性腎疾患に関連する線維症）、角膜線維症、心臓線維症、骨髄線維症、縦隔線維症、後腹膜線維症、関節線維症、骨関節線維症、組織線維症、腫瘍間質、脱形成腫瘍、外科的接着、肥大性瘢痕、またはケロイドである。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、創傷、火傷、Ｂ型またはＣ型肝炎感染症、脂肪性肝疾患、血吸虫感染症、腎疾患（例えば、慢性腎疾患）、心疾患、黄斑変性症、クローン病、網膜もしくは硝子体網膜症、全身性もしくは局所性強皮症、アテローム性動脈硬化症、または再狭窄と関連付けられた線維症である。いくつかの実施形態では、線維症は、慢性腎疾患に起因する。
いくつかの実施形態では、組織線維症は、筋肉組織、皮膚表皮、皮膚真皮、腱、軟骨、膵臓組織、子宮組織、神経組織、心臓組織、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、小腸、大腸、胆道、及び腸からなる群から選択される組織に影響を与える線維症である。
いくつかの実施形態では、本開示は、線維性組織または臓器の機能を改善する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、線維症の進行を遅らせるか、または阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、線維症の１つ以上の症状を低減する、例えば、線維症の１つ以上の症状の頻度または重症度を低減する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、線維症疾患を有するか、または発症するリスクのある対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかのそのような実施形態では、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０シグナル伝達は、対象において阻害される。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、線維症を伴う疾患または状態を有するか、または発症するリスクがある対象における、それらの内因性受容体へのアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０の結合を低減または阻害する方法に関し、方法は、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、または本明細書に記載のそれまたは薬学的組成物を含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の方法に従って、線維症症状は、対象において低減される。例えば、ポリペプチドまたは結合剤または組成物は、対象における線維化、線維性瘢痕化、または皮膚肥厚を少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％低減し得る。
いくつかの実施形態では、本開示の方法に従って、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化は、対象において、例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％阻害される。
いくつかの実施形態では、本開示の方法に従って、腫瘍増殖及び／または転移は、対象において、例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％阻害される。
いくつかの実施形態では、本開示の方法に従って、骨髄造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）における造血コロニー形成及び／または造血は、対象の骨髄において、例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または、１００％増加する。
いくつかの実施形態では、本開示の方法に従って、肺線維症における陽性応答は、強制肺活量によって測定される肺機能の低下速度の一貫した減速として明らかにされる。
いくつかの実施形態では、本開示の方法に従って、全身性硬化症と関連付けられた皮膚線維症に対する陽性応答は、修正ロドナン皮膚スコア（ＭＲＳＳ）の改善によって決定される。例えば、ＭＲＳＳは、対象において少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％改善し得る。
筋力低下及び萎縮
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、限定されないが、筋力低下及び萎縮などの筋肉障害を伴う疾患及び状態の治療または予防のために使用される。例えば、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたは本明細書に記載のそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、サルコペニア、またはがん悪液質を含むがこれらに限定されない様々な状態の進行速度及び／または重症度を治療、予防または低減するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、限定されないが、筋力低下及び萎縮などの筋肉障害を伴う疾患及び状態の治療または予防のために使用される。例えば、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたは本明細書に記載のそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、サルコペニア、またはがん悪液質を含むがこれらに限定されない様々な状態の進行速度及び／または重症度を治療、予防または低減するために使用され得る。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、任意の筋肉運動を制御する筋肉及び／または運動ニューロンの衰弱及び萎縮を伴う筋肉疾患の例である。ＤＭＤは、Ｘ連鎖ジストロフィン遺伝子の変異によって引き起こされ、進行性筋変性及び全ての骨格筋の衰弱を特徴とする。ＦＳＨＤは、特に顔、肩、上腕、及び下肢の骨格筋に影響を与える。ＩＢＭは、主に太ももの筋肉及び指と手首の屈曲を制御する腕の筋肉に影響を与える炎症性筋肉疾患である。ＡＬＳは、筋肉の硬直、筋肉の痙攣、及び運動ニューロンの変性に起因する全身の筋萎縮を特徴とする運動ニューロン疾患である。しかしながら、これらの壊滅的な筋肉疾患に対して利用可能な治療選択肢はほとんどない。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＭＤを治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＳＨＤを予防する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＩＢＭを治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＬＳを治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、サルコペニアを治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、がん悪液質を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法に関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、筋肉量及び／または筋力を増加させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、除脂肪量を増加させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において筋肉量を増加させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載の ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、筋疾患を有するか、または発症するリスクのある対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、筋疾患は、ＤＭＤ、ＦＳＨＤ、ＩＢＭ、ＡＬＳ、サルコペニア、またはがん悪液質である。いくつかのそのような実施形態では、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０シグナル伝達は、対象において阻害される。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、筋肉の衰弱及び萎縮を伴う疾患または状態を有するか、または発症するリスクがある対象における、それらの内因性受容体へのアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０の結合を低減または阻害する方法に関し、方法は、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、または本明細書に記載のそれまたは薬学的組成物を含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、疾患または不使用に起因する筋肉消耗などの筋肉障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法に関する。筋肉障害は、筋肉萎縮などの筋骨格系疾患または障害であり得る。コルチゾール、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、またはプレドニゾロンなどのグルココルチコイドによる治療の結果を含む、筋肉萎縮の多くの原因がある。筋萎縮はまた、神経外傷による脱神経の結果、または変性、代謝性、もしくは炎症性ニューロパシー（例えば、ギリアンバレー症候群、末梢性ニューロパシー、または環境毒素もしくは薬物への曝露）の結果であり得る。
加えて、筋萎縮は、筋緊張症などのミオパチー；ネマレンミオパチー、マルチ／ミニコアミオパチー、及び筋細管（中心核）ミオパチーを含む先天性ミオパチー；ミトコンドリアミオパチー；家族性周期性麻痺；炎症性ミオパチー；グリコーゲンまたは脂質貯蔵疾患によって引き起こされるなどの代謝性ミオパチー；皮膚筋炎；多発性筋炎；封入体筋炎；骨化性筋炎；横紋筋溶解症及びミオグロビン尿症の結果であり得る。
ミオパチーは、デュシェンヌ症候群、ベッカー症候群、筋緊張症候群、筋膜肩甲上腕症候群、エメリー・ドライフス症候群、眼咽頭症候群、肩甲上腕症候群、四肢帯症候群、福山症候群、先天性筋ジストロフィー症候群、または遺伝性遠位性ミオパチーなどの筋ジストロフィー症候群によって引き起こされ得る。筋骨格系疾患は、骨粗しょう症、骨折、低身長、または小人症でもあり得る。
加えて、筋萎縮は、成人運動ニューロン疾患、乳児脊髄筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、若年性脊髄筋萎縮症、多焦点導体ブロックを伴う自己免疫運動ニューロパシー、脳卒中もしくは脊髄損傷による麻痺、外傷による骨格固定、長時間のベッドレスト、自発的不活動、不随意的不活動、代謝ストレスもしくは栄養不足、がん、ＡＩＤＳ、断食、甲状腺障害、糖尿病、良性先天性低血圧症、中枢性コア疾患、火傷、慢性閉塞性肺疾患、肝疾患（線維症、肝硬変などの例）、敗血症、腎不全、うっ血性心不全、老化、宇宙旅行、または無重力環境で過ごした時間の結果であり得る。
加えて、筋肉萎縮は、限定されないが、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖、及び肥満を含む代謝障害と関連付けられ得る。
代謝障害及び心臓代謝障害
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、代謝障害及び／または心臓代謝性疾患の治療または予防のために使用される。代謝障害の非限定的な例としては、１型糖尿病、２型糖尿病、糖尿病合併症（例えば、網膜症、腎障害または神経障害、糖尿病性足、潰瘍、大血管障害など）、代謝性アシドーシスまたはケトーシス、高血糖、反応性低血糖、高インスリン血症、グルコース代謝障害、インスリン抵抗性、代謝症候群、脂質異常血症、アテローム性動脈硬化症及び関連疾患、肥満、糖尿病前症、高血圧、慢性心不全、急性腎不全、浮腫、及び高尿酸血症が挙げられる。心臓代謝性疾患の非限定的な例としては、心臓発作、脳卒中、糖尿病、インスリン抵抗性、非アルコール性脂肪性肝疾患、慢性腎不全、心不全及び／または低駆出率が挙げられ、駆出率が低減した心不全（ＨＦｒＥＦ）及び駆出率が維持された心不全（ＨＦｐＥＦ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、代謝障害及び／または心臓代謝性疾患の治療または予防のために使用される。代謝障害の非限定的な例としては、１型糖尿病、２型糖尿病、糖尿病合併症（例えば、網膜症、腎障害または神経障害、糖尿病性足、潰瘍、大血管障害など）、代謝性アシドーシスまたはケトーシス、高血糖、反応性低血糖、高インスリン血症、グルコース代謝障害、インスリン抵抗性、代謝症候群、脂質異常血症、アテローム性動脈硬化症及び関連疾患、肥満、糖尿病前症、高血圧、慢性心不全、急性腎不全、浮腫、及び高尿酸血症が挙げられる。心臓代謝性疾患の非限定的な例としては、心臓発作、脳卒中、糖尿病、インスリン抵抗性、非アルコール性脂肪性肝疾患、慢性腎不全、心不全及び／または低駆出率が挙げられ、駆出率が低減した心不全（ＨＦｒＥＦ）及び駆出率が維持された心不全（ＨＦｐＥＦ）が挙げられる。
肥満または過体重状態の治療、ならびにＩＩ型糖尿病、脂質異常、高血糖、心血管疾患、及び他の代謝障害などのそれらの関連する併存疾患は、実質的で満たされていない医療ニーズを表す。肥満は全死亡率の危険因子であり、２０１０年に世界中で３４０万人の死亡を引き起こしたと推定されている（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ ２０１２）。肥満、糖尿病、高血糖及び関連する状態は、心疾患、脳卒中、腎臓の問題、神経損傷、及び眼障害などの重篤なまたは生命を脅かす合併症の危険因子である。特に、脳卒中、心臓発作、ならびに心臓及び血管疾患などの心臓代謝性疾患は、血糖レベルを低下させることによって、または２型糖尿病もしくは肥満を有する患者において体重減少を達成することによって改善され得る。除脂肪量対脂肪量の比を変化させることによって、体組成を改善し、それによって体重減少または中枢性肥満の減少を達成し、患者の血糖状態を改善することができる薬物療法が強く求められている。駆出率（ＨＦｐＥＦ）を維持した心不全など、左心室機能不全と関連付けられた心不全に対処する治療法の必要性も存在する。ＨＦｐＥＦは、世界中の心不全症例の半分以上を表し、ＨＦｐＥＦ及び肥満などの関連する危険因子に対処するための治療が非常に望ましい。
除脂肪量対脂肪量の比を変化させることによって、体組成を改善し、それによって体重減少または中枢性肥満の減少を達成し、患者の血糖状態を改善することができる薬物療法の必要性がある。ミオスタチンノックアウトマウス及びミオスタチンが可溶性のＡｃｔＲＩＩＢによって隔離される野生型マウスにおける筋肉量の増加が報告されており、この増加は、全身のインスリン感受性の改善、ならびに食事誘発性及び遺伝的肥満に対する耐性と関連付けられる（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ，２００９、Ａｋｐａｎ ｅｔ ａｌ，２００９）。抗体によるＡｃｔＲＩＩＢの阻害は、骨格筋質量を増加させながら、正常または高脂肪食でマウスにおける白色脂肪組織を低減することが示されている（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１２）。
いくつかの実施形態では、本開示は、代謝障害を有する対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。例えば、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖症、及び肥満を治療する方法が提供される。したがって、いくつかの実施形態では、限定されないが、１型糖尿病、２型糖尿病、糖尿病合併症（例えば、網膜症、腎症もしくは神経障害、糖尿病性足、潰瘍、大血管症など）、代謝性アシドーシスもしくはケトーシス、反応性低血糖症、高インスリン血症、グルコース代謝障害、インスリン抵抗性、代謝症候群、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症及び関連疾患、肥満、前糖尿病、高血圧症、慢性心不全、急性腎不全、浮腫、または高尿酸血症などの代謝障害または状態を予防または治療する方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本開示は、代謝障害を有する対象において除脂肪量を増加させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、代謝障害を有する対象において筋肉量を増加させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、白色脂肪を減少させる及び／または褐色脂肪を増加させることを必要とする対象、例えば、代謝性障害を有する対象においてそれを行う方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、総体脂肪量（ＦＭ）を減少させることを必要とする対象、例えば、代謝性障害を有する対象においてそれを行う方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、総体脂肪量（ＦＭ）を減少させると同時に、筋肉量を増加させることを必要とする対象、例えば、代謝性障害、例えば、肥満を有する対象においてそれを行う方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、インスリン感受性を改善することを必要とする対象、例えば、代謝性障害を有する対象においてそれを行う方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、エネルギー消費を増加させることを必要とする対象、例えば、代謝性障害を有する対象においてそれを行う方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、心臓代謝性疾患を有する対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。心臓代謝性疾患の非限定的な例としては、心臓発作、脳卒中、糖尿病、インスリン抵抗性、非アルコール性脂肪性肝疾患、及び慢性腎不全が挙げられる。いくつかのそのような実施形態では、本開示は、２型糖尿病及び確立された心血管疾患を有する対象における心血管死亡のリスクを低減する方法を提供する。いくつかのかかる実施形態では、本開示は、心不全及び／または低駆出率を有する人々の死亡及び／または入院のリスクを低減する方法を提供する。いくつかのかかる実施形態では、本開示は、駆出率（ＨＦｒＥＦ）が低減した心不全を有する人々、または駆出率（ＨＦｐＥＦ）が維持された心不全を有する人々の死亡及び／または入院のリスクを低減する方法を提供する。いくつかのかかる実施形態では、本開示は、成人における心不全の心血管死及び／または入院のリスクを低減する方法を提供する。いくつかのかかる実施形態では、本開示は、２型糖尿病を有する対象におけるグルコースレベルを低減する方法を提供する。いくつかのかかる実施形態では、本開示は、中等度の腎機能障害またはステージ３の慢性腎疾患を有する対象において、糖尿病などの代謝性障害を治療もしくは予防する方法、及び／または血糖制御を改善する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、体組成物を改善する方法、例えば、中枢性肥満、肥満または過体重状態、ならびに関連する併存症の治療のための方法であって、本明細書に記載の有効量のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、例えば、血糖制御を改善することまたはインスリン感受性を増加させることによって、ＩＩ型糖尿病を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、対象の体組成を改善する方法を提供し、改善は、除脂肪量の増加及び脂肪量の減少を含み、有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤を対象に投与することを含む。体組成は、例えば、体格指数（ＢＭＩ）、体形指数（ＡＢＳＩ）、二重エネルギー吸収法（ＤＸＡ）、磁気共鳴画像法（ＭＭ）、及び／または生体電気インピーダンス技法によって決定され得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、例えば、除脂肪量が増加し、脂肪量が低減する体組成物を改善することによって、肥満または過体重障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、肥満または過体重状態に関連する併存症を治療、予防、または低減する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤を投与することを含む、方法を提供する。「肥満または過体重状態に関連する併存疾患」とは、肥満と関連付けられた重篤な慢性疾患を指し、これらに限定されないが、２型糖尿病またはグルコース不耐症、前糖尿病、高トリグリセリド、身体障害、骨粗しょう症、腎臓病、閉塞性睡眠時無呼吸、性ホルモン障害、多嚢胞性卵巣症候群または男性性腺機能低下症などの内分泌生殖障害、変形性関節症、胃腸癌、脂質異常血症、高血圧症、心不全、冠動脈性心疾患及び脳卒中、胆石、高血圧、ならびに性腺ホルモンプロファイルの変化を含む。いくつかのかかる実施形態では、本開示は、例えば、インスリン感受性を増加させることによって、例えば、ＩＩ型糖尿病に罹患している患者において、血糖制御を改善する方法を提供する。
骨の損傷
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、骨損傷及び関連する状態の治療または予防のために使用される。例えば、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤を使用して、原発性骨粗しょう症、二次性骨粗しょう症、骨減少症、骨硬化症、骨折、骨癌またはがん転移関連の骨喪失、パジェット病、腎性骨ジストロフィー、治療関連の骨喪失、食事関連の骨喪失、肥満の治療と関連付けられた骨喪失、低重力関連の骨喪失、または不動性を含むがこれらに限定されない、骨損傷を伴う様々な疾患及び状態の進行率及び／または重症度を治療、予防、または低減することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、骨損傷及び関連する状態の治療または予防のために使用される。例えば、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤を使用して、原発性骨粗しょう症、二次性骨粗しょう症、骨減少症、骨硬化症、骨折、骨癌またはがん転移関連の骨喪失、パジェット病、腎性骨ジストロフィー、治療関連の骨喪失、食事関連の骨喪失、肥満の治療と関連付けられた骨喪失、低重力関連の骨喪失、または不動性を含むがこれらに限定されない、骨損傷を伴う様々な疾患及び状態の進行率及び／または重症度を治療、予防、または低減することができる。
健康な骨は、骨破壊及び骨成長の両方を伴う絶え間ないリモデリングを受ける。骨成長は、骨芽細胞型によって媒介されるが、破骨細胞は、骨を再吸収する。病理学は、これらの系が、同化プログラムの下方制御、分解代謝系の上方制御、またはその両方の組み合わせのいずれかを通じてバランスが崩れ、正味の骨損失をもたらすときに起こり得る。したがって、骨リモデリングのバランスを制御することは、骨への損傷の治癒、ならびに骨量の喪失及び骨脱塩と関連付けられた骨粗しょう症などの障害の治療を促進するために有用であり得る。
骨の損傷は、加齢またはがんに関連する骨の喪失、遺伝的状態、または薬物治療の有害な副作用を含む、様々な根本原因から生じる可能性がある。世界保健機関は、骨粗しょう症だけで米国、欧州、及び日本で７５００万人が罹患しており、骨損傷の重要な危険因子であると推定している。一般に、骨損失の全体は、効果的な治療法がほとんどない病理学的状態を表す。利用可能な治療法は、骨成長を直接促進し、骨密度を増加させる薬剤ではなく、固定化、運動、及び食事の変更に焦点を当てている。骨粗しょう症に関しては、エストロゲン、カルシトニン、ビタミンＫを含むオステオカルシン、または高用量の食事性カルシウムが全て治療介入として使用される。骨粗しょう症に対する他の治療アプローチとしては、ビスホスホネート、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）、カルシミメティクス、スタチン、アナボリックステロイド、ランタン及びストロンチウム塩、ならびにフッ化ナトリウムが挙げられるが、これらはしばしば望ましくない副作用と関連付けられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、骨損傷を伴う疾患または状態を有するか、または発症するリスクがある対象の骨量または骨ミネラル密度を増加させるために使用される。
いくつかの実施形態では、本開示は、骨ミネラル密度を増加させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、骨再吸収を低減することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、骨形成を増加させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、骨強度を増加させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、骨折を低減することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、骨疾患を有するか、または発症するリスクのある対象を治療する方法であって、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。本方法に従って治療され得る骨疾患の非限定的な例としては、原発性骨粗しょう症、二次性骨粗しょう症、骨減少症、骨粗しょう症、骨折、骨癌またはがん転移関連骨損失、パジェット病、腎性骨ジストロフィー、治療関連骨損失、食事関連骨損失、肥満の治療と関連付けられた骨損失、低重力関連骨損失、または不動性関連骨損失が挙げられる。いくつかの実施形態では、骨疾患は、骨粗しょう症である。いくつかの実施形態では、原発性骨粗しょう症は、加齢性骨粗しょう症またはホルモン関連骨粗しょう症である。上記の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、二次性骨粗しょう症は、固定化誘発性骨粗しょう症またはグルココルチコイド誘発性骨粗しょう症である。いくつかの実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、治療関連の骨損失は、ＦＧＦ－２１による治療に起因して、ＧＬＰ－１による治療に起因して、がん療法、例えば、化学療法もしくは放射線療法に起因して、または肥満もしくは２型糖尿病に対する治療に起因して生じる。いくつかの実施形態では、食事関連骨損失は、くる病、例えば、ビタミンＤ欠乏症である。いくつかの実施形態では、低重力関連骨損失は、負荷関連骨損失の欠如である。いくつかの実施形態では、対象は、骨折のリスクがある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、対象におけるアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上を、例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０のそれらの受容体への結合を低減もしくは阻害するか、またはそれらの受容体を通じたシグナル伝達を阻害することによって阻害する。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、対象における骨形成を増加させる。本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、対象における骨吸収を減少させる。本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、対象における骨損失を減少させる。本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、対象における骨芽細胞活性または骨芽細胞発生を増加させる。本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、対象における破骨細胞活性を減少させるか、または破骨細胞発生を減少させる。本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、対象における骨折のリスクを減少させる。本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、対象における骨強度を増加させる。本開示の方法のいくつかの実施形態では、骨は、皮質骨である。本開示の方法のいくつかの実施形態では、骨は、小梁骨である。
本明細書で使用される場合、「骨ミネラル密度（ＢＭＤ）」、「骨密度」、及び「骨量」という用語は、骨組織中の骨ミネラル（例えば、カルシウム）の量の尺度を指す。ＢＭＤは、当業者に知られている十分に確立された臨床技法（例えば、単一または二重エネルギー光子またはＸ線吸収測定）によって測定され得る。ＢＭＤの概念は、骨の体積当たりのミネラルの質量に関連しているが、臨床的には、イメージング時の骨表面の平方センチメートル当たりの光学密度に従ってプロキシにより測定される。ＢＭＤ測定は、骨粗しょう症及び骨折リスクの間接的な指標として臨床医学で使用されている。いくつかの実施形態では、ＢＭＤ試験結果は、Ｔスコアとして提供され、Ｔスコアは、健康な３０歳の成人の理想的またはピークの骨ミネラル密度と比較した、対象のＢＭＤを表す。Ｏのスコアは、ＢＭＤが健康な若年成人の通常の基準値に等しいことを示す。対象の測定されたＢＭＤと健康な若年成人の基準値との間の差は、標準偏差単位（ＳＤ）で測定される。したがって、＋１ＳＤ～－１ＳＤのＴスコアは、正常なＢＭＤを示し得、－１ＳＤ～－２．５ＳＤのＴスコアは、低い骨量（例えば、骨減少症）を示し得、－２．５ＳＤよりも低いＴスコアは、骨粗しょう症または重度の骨粗しょう症を示し得る。開示の方法のいくつかの実施形態では、対象は、低い骨量（例えば、－１ＳＤ～－２．５ＳＤのＴスコア）を有する。開示の方法のいくつかの実施形態では、対象は、骨粗しょう症（例えば、－２．５ＳＤ未満のＴスコア）を有する。開示の方法のいくつかの実施形態では、対象のＢＭＤは、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物の投与によって増加する。例えば、本開示の方法による治療は、対象のＴスコアを、例えば、０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、１．０以上、または２．０以上増加させることができる。
いくつかの実施形態では、例えば、骨髄線維症を含む骨髄不全疾患では、陽性応答は、貧血の改善によって明らかにされる（例えば、ヘモグロビンレベルの増加を示す輸血非依存性患者、輸血依存性患者は、輸血非依存性になる）。
本明細書で使用される場合、「骨強度」という用語は、骨ミネラル密度に加えて骨の質によって決定される骨の測定値を指す。骨の質は、骨の形状、マイクロアーキテクチャ、及び構成組織の特性によって影響を受ける。骨強度は、骨折のリスクを評価するために使用することができる。
本明細書で使用される場合、「骨疾患」という用語は、骨損傷（例えば、骨ミネラル密度の減少、骨強度の減少、及び／または骨損失）を特徴とする状態を指す。かかる疾患または状態は、骨芽細胞及び／または破骨細胞活性の不均衡（例えば、骨吸収の増加または骨形成の低減）によって引き起こされ得る。骨疾患としては、限定されないが、原発性骨粗しょう症、二次性骨粗しょう症、骨減少症、骨形成症、骨折、骨癌またはがん転移関連骨損失（例えば、多発性骨髄腫と関連付けられた骨損失）、パジェット病、腎性骨ジストロフィー、治療関連骨損失、食事関連骨損失、肥満の治療に関連する骨損失、低重力関連骨損失、及び不動性関連骨損失が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「骨リモデリング」または「骨代謝」という用語は、古い骨の別個の部分を新しく合成されたタンパク質性マトリックスのパケットに置き換えることによって、骨の強度及びイオン恒常性を維持するためのプロセスを指す。骨は破骨細胞によって再吸収され、骨化と呼ばれるプロセスで骨芽細胞によって沈着される。骨細胞の活性は、このプロセスにおいて重要な役割を果たしている。骨量の減少をもたらす状態は、吸収の増加または骨化の減少のいずれかによって引き起こされ得る。健康な個人では、小児期に骨形成が吸収を上回る。老化プロセスが発生するにつれて、再吸収が形成を上回る。骨吸収率はまた、典型的には、閉経後の高齢女性では、閉経に関連するエストロゲン欠乏症に起因してはるかに高い。
本明細書で使用される場合、「骨吸収」または「骨異化活性」という用語は、破骨細胞が骨内の組織を分解し、ミネラルを放出し、結果としてミネラル（例えば、カルシウム）を骨組織から血液に移すプロセスを指す。増加した骨吸収率は、閉経後の女性を含めて加齢と関連付けられる。高い骨吸収率、または骨化率を超える骨吸収率は、骨減少症及び骨粗しょう症を含む骨ミネラル密度の低下などの骨障害と関連付けられ、骨喪失をもたらす可能性がある。本開示の方法のいくつかの実施形態では、骨吸収は、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物の投与によって、対象において減少し、例えば、骨損失は、対象において減少する。
本明細書で使用される場合、「骨形成」、「骨化」、「骨発生」、または「骨同化活性」という用語は、骨芽細胞によって新しい骨組織を形成するプロセスを指す。骨形成速度の低減、または骨吸収率によって超過される骨形成速度は、骨損失をもたらす可能性がある。本開示の方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物の投与によって、対象における骨形成が増加し、例えば、対象における骨形成または骨発生の量または速度が増加する。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物の投与は、治療前に得られた測定値と比較して、または未治療の対象で典型的に観察される測定値と比較して、対象における骨ミネラル密度の増加、骨形成の増加、骨強度の増加、骨折のリスクの低減、及び／または骨吸収の低減に作用する。
低い赤血球レベル
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、貧血または失血などの低い赤血球レベルと関連付けられた疾患または状態の治療または予防のために使用される。例えば、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、例えば、赤血球レベルを増加させることによって（例えば、ヘモグロビンレベルを増加させることによって、赤血球数を増加させることによって、ヘマトクリットを増加させることによって、もしくは赤血球の形成もしくは産生を増加させることによって）、貧血または失血を含むがこれらに限定されない、低い赤血球レベルを伴う様々な疾患及び状態の進行速度及び／または重症度を治療、予防または低減するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、貧血または失血などの低い赤血球レベルと関連付けられた疾患または状態の治療または予防のために使用される。例えば、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、例えば、赤血球レベルを増加させることによって（例えば、ヘモグロビンレベルを増加させることによって、赤血球数を増加させることによって、ヘマトクリットを増加させることによって、もしくは赤血球の形成もしくは産生を増加させることによって）、貧血または失血を含むがこれらに限定されない、低い赤血球レベルを伴う様々な疾患及び状態の進行速度及び／または重症度を治療、予防または低減するために使用され得る。
貧血は、罹患率と死亡率の両方に影響を与える健康への影響を伴う世界的な健康問題である。米国だけでも、貧血の罹患率は、２００３年から２０１２年にかけてほぼ２倍になった。貧血の症状には、疲労、脱力感、息切れ、心臓動悸、及び認知能力の低減が含まれ、小児、妊婦、生殖年齢の女性、及び高齢者は、貧血を発症するリスクが最も高いことが見出されている。貧血の最も一般的な形態は、鉄欠乏性貧血であるが、貧血は、慢性疾患、失血、及び赤血球破壊によっても引き起こされる可能性がある。鉄欠乏性貧血は、鉄サプリメントで治療することができるが、再生不良性貧血、慢性疾患の貧血、及び溶血性貧血などの他の多くの形態の貧血は、輸血を必要とし得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、低い赤血球レベルを治療することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、本明細書に記載の有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたは本明細書に記載の同じ組成物または薬学的組成物を含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、貧血を治療することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、失血を治療することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、赤血球レベルを増加させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、本明細書に記載の有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたは本明細書に記載の同じ組成物または薬学的組成物を含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ヘモグロビンレベルを増加させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、赤血球数を増加させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、本明細書に記載の有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたは本明細書に記載の同じ組成物または薬学的組成物を含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ヘマトクリットを増加させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、赤血球形成を増加させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、本明細書に記載の有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドまたは本明細書に記載の同じ組成物または薬学的組成物を含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
開示の方法のいくつかの実施形態では、対象は、貧血または失血を有するか、または発症するリスクがあり得る。いくつかの実施形態では、貧血は、慢性腎疾患、関節リウマチ、がん、または炎症性疾患（例えば、クローン病、ＳＬＥ、もしくは潰瘍性大腸炎）などの他の疾患または状態、あるいは化学療法、放射線療法、または手術などの医学的治療に起因する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤は、対象におけるアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上を、例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０のそれらの受容体への結合を低減もしくは阻害するか、またはそれらの受容体を通じたシグナル伝達を阻害することによって阻害する。
いくつかの実施形態では、本開示は、赤血球を増加させる（例えば、ヘモグロビンレベル、赤血球数、またはヘマトクリットを増加させる）ことを必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療前に得られた測定値と比較して、赤血球が増加する（例えば、ヘモグロビンレベル、赤血球数、またはヘマトクリットが増加する）治療有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、貧血または失血を有するか、または発症するリスクがある対象において赤血球レベルを増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、貧血または失血は、がん、がん治療、腎疾患または腎不全（例えば、慢性腎疾患もしくは急性腎疾患もしくは不全）、骨髄異形成症候群、サラセミア、栄養不足、薬物に対する有害反応、炎症性または自己免疫疾患、脾腫、ポルフィリン症、血管炎、溶血、骨髄欠損、骨髄移植、糖尿病、肝疾患（例えば、急性肝疾患または慢性肝疾患）、出血（例えば、急性または慢性出血）、感染症、ヘモグロビン異常、薬物使用、アルコール乱用、高齢者、チャーグ・ストラウス症候群、フェルティ症候群、移植片対宿主病、造血幹細胞移植、骨髄線維症、汎血球減少症、純粋な赤血球再形成、紫斑病、シェーンライン・ヘノッホ症候群、シュワッハマン症候群（例えば、シュワッハマン・ダイアモンド症候群）、輸血の禁忌、手術、外傷、創傷、潰瘍、尿路出血、消化管出血、頻繁な献血、または大量の月経出血と関連付けられる。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、貧血は、再生不良性貧血、鉄欠乏性貧血、ビタミン欠乏性貧血、慢性疾患の貧血、骨髄疾患と関連する貧血、溶血性貧血、鎌状赤血球貧血、小赤血球性貧血、低色素性貧血、鉄芽球性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ファンコーニ貧血、または過剰な芽球を有する難治性貧血である。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、治療を必要とする対象は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）による治療に十分に応答しないか、またはＥＰＯの有害作用を受けやすい対象である。
本明細書で使用される場合、「赤血球レベルを増加させる」及び「赤血球形成を促進する」という用語は、ヘマトクリット、赤血球数、及びヘモグロビン測定などの臨床的に観察可能な測定基準を指し、かかる変化が生じる機構に関して中立であることが意図される。本明細書で使用される「低い赤血球レベル」という用語は、対象の年齢及び性別に対して正常とみなされる値の範囲を下回る赤血球数、ヘマトクリット、及びヘモグロビン測定値を指す。
本明細書で使用される場合、「赤血球形成」及び「赤血球産生」という用語は、赤血球が骨髄で産生される赤血球産生のプロセスなどの赤血球の生成を指す。
本明細書で使用される場合、「貧血」という用語は、血液中の酸素レベルの低減をもたらすヘモグロビンまたは赤血球における任意の異常を指す。貧血は、赤血球及び／またはヘモグロビンの異常な産生、処理、または性能と関連付けられ得る。貧血という用語は、正常な血液レベルと比較した、血液中の赤血球の数及び／またはヘモグロビンのレベルの任意の低減を指す。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物の投与は、例えば、治療前に得られた測定値と比較して、対象における赤血球形成、赤血球数、ヘモグロビンレベル、またはヘマトクリットを増加させるように作用する。本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドまたは結合剤の投与は、対象の輸血の必要性を低減する。
いくつかの実施形態では、本開示は、血管疾患または血管障害を治療することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド、またはそれを含むＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤、または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。血管疾患または血管障害の非限定的な例としては、血管炎、動脈硬化症、大動脈瘤、及び血管石灰化が挙げられ、これらは、単独で、または例えば、限定されないが、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、糖尿病、または鎌状赤血球貧血及び川崎病などのまれな疾患などの他の疾患と関連して存在し得る。
キット
本開示によれば、本明細書に記載のポリペプチド、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤及び薬学的組成物は、ＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患または状態の治療または予防に使用するためのキットまたは製剤系に組み立てられてもよい。キットまたは製剤系は、ポリペプチド、結合剤または薬学的組成物を含有するバイアル、チューブ、アンプル、ボトルなどの１つ以上の容器をその中に密閉する容器（例えば、包装、箱、カートン、バイアルなど）を含んでもよい。追加のキット構成要素は、酸、塩基、緩衝剤、無機塩、溶媒、抗酸化剤、防腐剤、または金属キレート剤を含み得る。追加のキット構成要素は、純粋な組成物として、または１つ以上の追加のキット構成要素を組み込む水性もしくは有機溶液として存在し得る。キット構成要素のうちのいずれかまたは全ては、任意選択で、緩衝液を更に含む。キットはまた、針、シリンジなどの投与用ツールを含み得る。キットは、本明細書に記載される方法に従って使用され得、かかる方法で使用するための指示書を含み得る。キットはまた、ポリペプチド、結合剤、または薬学的組成物の投与及び使用のための指示書を含み得る。
本開示によれば、本明細書に記載のポリペプチド、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤及び薬学的組成物は、ＴＧＦβスーパーファミリー関連疾患または状態の治療または予防に使用するためのキットまたは製剤系に組み立てられてもよい。キットまたは製剤系は、ポリペプチド、結合剤または薬学的組成物を含有するバイアル、チューブ、アンプル、ボトルなどの１つ以上の容器をその中に密閉する容器（例えば、包装、箱、カートン、バイアルなど）を含んでもよい。追加のキット構成要素は、酸、塩基、緩衝剤、無機塩、溶媒、抗酸化剤、防腐剤、または金属キレート剤を含み得る。追加のキット構成要素は、純粋な組成物として、または１つ以上の追加のキット構成要素を組み込む水性もしくは有機溶液として存在し得る。キット構成要素のうちのいずれかまたは全ては、任意選択で、緩衝液を更に含む。キットはまた、針、シリンジなどの投与用ツールを含み得る。キットは、本明細書に記載される方法に従って使用され得、かかる方法で使用するための指示書を含み得る。キットはまた、ポリペプチド、結合剤、または薬学的組成物の投与及び使用のための指示書を含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、（上述のように）投与のための適切な用量で、本開示のポリペプチドまたは結合剤または薬学的組成物を含む任意の適切な形状、サイズ及び材料（好ましくは防水、例えば、プラスチックまたはガラス）の１つ以上のレシピエント（バイアル、アンプル、容器、シリンジ、ボトル、バッグなど）を含む。キットは、（例えば、リーフレットまたは取扱説明書の形態で）使用説明書、シリンジ、ポンプ、注入器などの本開示のポリペプチドまたは結合剤を投与するための手段、本開示のポリペプチドまたは結合剤を再構成するための手段、及び／または本開示のポリペプチドまたは結合剤を希釈するための手段を更に含んでもよい。
本開示はまた、単回投与単位のためのキットを提供する。本開示のキットはまた、乾燥／凍結乾燥ポリペプチドまたは結合剤を含む第１のレシピエントと、水性製剤を含む第２のレシピエントとを含み得る。ある特定の実施形態では、単一チャンバ及び多チャンバのプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジ及び凍結乾燥シリンジ）を含むキットが提供される。
更に付番した実施形態
本発明はまた、例えば、限定されないが、その範囲をいかなる方法でも限定するものとして解釈されるべきではない、以下の番号付けされた実施形態にも記載されている。
本発明はまた、例えば、限定されないが、その範囲をいかなる方法でも限定するものとして解釈されるべきではない、以下の番号付けされた実施形態にも記載されている。
実施形態１．アクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）エクトドメイン（ＥＣＤ）バリアントを含むポリペプチドであって、前記バリアントが、ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの配列に対して１つ以上のアミノ酸置換を有し、任意選択で、前記バリアントが、Ｆ５８ＩではないＦ５８の置換を含む、前記ポリペプチド。
実施形態２．前記バリアントが、ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの配列に対して１つのアミノ酸置換を有し、１つのアミノ酸置換が、Ｆ５８ＩではないＦ５８の置換である、実施形態１に記載のポリペプチド。
実施形態３．前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｄ、Ｆ５８Ｅ、Ｆ５８Ｙ、Ｆ５８Ｋ、Ｆ５８Ｑ、Ｆ５８Ｎ、Ｆ５８Ｒ、Ｆ５８Ｈ、またはＦ５８Ｗを含む、実施形態１または２に記載のポリペプチド。
実施形態４．前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｄを含む、実施形態３に記載のポリペプチド。
実施形態５．前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｅを含む、実施形態３に記載のポリペプチド。
実施形態６．前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｙを含む、実施形態３に記載のポリペプチド。
実施形態７．前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｋを含む、実施形態３に記載のポリペプチド。
実施形態８．前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｑを含む、実施形態３に記載のポリペプチド。
実施形態９．前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｗを含むか、または前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｎを含むか、または前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｒを含むか、または前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｈを含む、実施形態３に記載のポリペプチド。
実施形態１０．前記バリアントが、１つ以上の追加のアミノ酸置換を更に含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態１１．前記ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤが、配列ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴ（配列番号２）を有する、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態１２．前記ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤが、１つ以上の追加のアミノ酸を更に含む、実施形態１１のポリペプチド。
実施形態１３．前記ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤが、Ｎ末端に以下のアミノ酸：ＧＲＧＥＡ（配列番号２３）を更に含む、実施形態１２に記載のポリペプチド。
実施形態１４．前記バリアントが、配列番号５に示される配列を有する、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態１５．前記バリアントが、配列番号６に示される配列を有する、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態１６．前記バリアントが、配列番号７に示される配列を有する、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態１７．前記バリアントが、配列番号８に示される配列を有する、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態１８．前記バリアントが、配列番号９に示される配列を有する、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態１９．前記バリアントが、配列番号１０に示される配列を有する、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態１９Ａ．前記バリアントが、配列番号１１に示される配列を有する、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態１９Ｂ．前記バリアントが、配列番号１２に示される配列を有する、実施形態１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
実施形態１９Ｃ．前記バリアントが、配列番号１３に示される配列を有する、実施形態１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
実施形態２０．前記バリアントが、１つ以上の追加のアミノ酸置換を更に含む、実施形態１４～１９Ｃのいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態２１．前記バリアントが、Ｎ末端に以下のアミノ酸：ＧＲＧＥＡ（配列番号２３）を更に含み、任意選択で、前記バリアントが、Ｃ末端にアミノ酸ＡＰＴを更に含む、実施形態２０に記載のポリペプチド。
実施形態２２．リンカーを介して前記バリアントの前記Ｃ末端に融合したＦｃドメイン単量体を更に含む、実施形態１～２１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態２３．前記Ｆｃドメイン単量体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、実施形態２２に記載のポリペプチド。
実施形態２４．前記Ｆｃドメイン単量体が、ヒトＦｃドメイン単量体である、実施形態２２または２３に記載のポリペプチド。
実施形態２５．前記Ｆｃドメイン単量体が、マウスＦｃドメイン単量体である、実施形態２２または２３に記載のポリペプチド。
実施形態２６．前記Ｆｃドメイン単量体が、前記ポリペプチドの二量体の凝集を低減するか、またはその安定性を調節するように操作される、実施形態２２～２５のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態２７．前記Ｆｃドメイン単量体が、以下の３つの変異：Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）を有する、実施形態２２～２６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態２８．前記Ｆｃドメイン単量体が、Ｍ２５２Ｙ変異を有する、実施形態２２～２７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態２９．前記Ｆｃドメイン単量体が、３５６位にＤ、及び３５８位にＬ（ＤＬ）を含む、実施形態２２～２８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態３０．前記Ｆｃドメイン単量体が、３５６位にＥ、及び３５８位にＭ（ＥＭ）を含む、実施形態２２～２８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態３１．前記Ｆｃドメイン単量体が、ＩｇＧ１である、実施形態２２～３０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態３２．前記Ｆｃドメイン単量体が、Ｃ末端にリジン残基（Ｋ）を含む、実施形態３１に記載のポリペプチド。
実施形態３３．前記Ｆｃドメイン単量体が、配列番号１３４～１４７及び３３８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有する、実施形態３１に記載のポリペプチド。
実施形態３４．前記Ｆｃドメイン単量体が、配列番号１３４～１４７及び３３８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、実施形態３１～３３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態３５．前記Ｆｃドメイン単量体が、配列番号１３４、１３５、１３７、１３８、及び１５７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、実施形態３１～３３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態３６．前記Ｆｃドメイン単量体が、配列番号１３５に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、実施形態３１～３３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
実施形態３７．前記Ｆｃドメイン単量体が、前記Ｃ末端にリジン残基（Ｋ）を更に含む、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態３８．前記Ｆｃドメイン単量体が、ＩｇＧ２である、実施形態２２～３０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態３９．前記Ｆｃドメイン単量体が、配列番号１４８～１５７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有する、実施形態３８に記載のポリペプチド。
実施形態４０．前記Ｆｃドメイン単量体が、配列番号１４８～１５７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、実施形態１０～１７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態４１．前記Ｆｃドメイン単量体が、配列番号１５７に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、実施形態３８～４０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態４２．前記Ｆｃドメイン単量体が、配列番号１３４～１７３及び３３８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有する、実施形態２２～３０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態４３．前記Ｆｃドメイン単量体が、配列番号１３４～１７３及び３３８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、実施形態２２～３０及び４２のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態４４．前記Ｆｃドメイン単量体が、Ｃ末端にリジン残基（Ｋ）を更に含む、実施形態４２または４３に記載のポリペプチド。
実施形態４５．前記Ｆｃドメイン単量体が、二量体を形成する、実施形態２２～４４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態４６．前記リンカーが、アミノ酸スペーサーである、実施形態２２～４５のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態４７．前記リンカーが、グリシンリッチである、実施形態２２～４６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態４８．前記リンカーが、２～４０アミノ酸長であるか、または前記リンカーが、１０～４０アミノ酸長である、実施形態２２～４７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態４９．前記リンカーが、３～３９アミノ酸長であるか、または３～１４アミノ酸長であるか、または１０～３９アミノ酸長であるか、または１０～１４アミノ酸長であるか、または３アミノ酸長、１０アミノ酸長、１４アミノ酸長、１９アミノ酸長、もしくは３９アミノ酸長である、実施形態４８に記載のポリペプチド。
実施形態５０．前記リンカーが、１４アミノ酸長であるか、または前記リンカーが、少なくとも１４アミノ酸長である、実施形態４９に記載のポリペプチド。
実施形態５１．前記リンカーが、１０アミノ酸長であるか、または前記リンカーが、少なくとも１０アミノ酸長である、実施形態４６～５１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態５２．前記リンカーが、配列番号５９、５４、３４、または６３に示されるアミノ酸配列を有する、実施形態４６～５１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態５３．前記リンカーが、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを有し、ここで、ｎが、１～８の整数である、実施形態１～５２のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態５４．前記リンカーが、配列番号３４～１３３及び３３５～３３７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、実施形態２２～５３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態５５．前記リンカーが、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有する、実施形態２２～５４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態５６．前記ポリペプチドが、配列番号１７４～２５４、３３３、もしくは３３９～３４１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはそれからなる、実施形態１～５５のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態５７．前記ポリペプチドが、配列番号１８６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む、実施形態５６に記載のポリペプチド。
実施形態５８．前記ポリペプチドが、配列番号１８６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはそれからなる、実施形態５６に記載のポリペプチド。
実施形態５９．前記ポリペプチドが、配列番号１８６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、実施形態５７に記載のポリペプチド。
実施形態６０．前記ポリペプチドが、配列番号１８６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる、実施形態５８に記載のポリペプチド。
実施形態６１．配列番号１８６に示されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
実施形態６２．前記ポリペプチドが、配列番号１７４～２５４、３３３、または３３９～３４１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそれからなる、実施形態５６に記載のポリペプチド。
実施形態６３．リンカーを介して前記ポリペプチドの前記Ｎ末端またはＣ末端に融合したアルブミン結合ドメインを更に含む、実施形態１～６２のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態６４．リンカーを介して前記ポリペプチドの前記Ｎ末端またはＣ末端に融合したフィブロネクチンドメインを更に含む、実施形態１～６３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態６５．リンカーを介して前記ポリペプチドの前記Ｎ末端またはＣ末端に融合したヒト血清アルブミンを更に含む、実施形態１～６４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態６６．前記ポリペプチドの発現、検出及び／または精製に好適なアミノ酸配列を更に含む、実施形態１～６５のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態６７．配列番号１に示される配列を有するシグナルペプチド、またはそれと実質的に同一の配列を更に含む、実施形態１～６６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態６８．前記ポリペプチドが、標的化剤、治療部分、検出可能部分、または診断部分とコンジュゲートされている、実施形態１～６７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
実施形態６９．前記標的化剤、前記治療部分、前記検出可能部分、または前記診断部分が、抗体またはその抗原結合断片、前記ＴＧＦβスーパーファミリーの別のメンバーに対して、もしくは別の治療標的に対して親和性を有する結合剤、放射線療法剤、イメージング剤、蛍光部分、細胞傷害性剤、抗有糸分裂薬、ナノ粒子ベースの担体、ポリマーコンジュゲート薬、ナノ担体、イメージング剤、安定化剤、薬物、ナノ担体、またはデンドリマーを含む、実施形態６８に記載のポリペプチド。
実施形態７０．２つ以上のポリペプチドが、それぞれのＦｃドメイン単量体間の少なくとも１つのジスルフィド架橋によって共有結合している、実施形態１～６９のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態７１．前記ポリペプチドが、ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／または骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）－１０に結合し、ヒトＢＭＰ－９への結合の低減または弱い結合を有する、実施形態１～７０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態７２．前記ポリペプチドが、ヒトＢＭＰ－９に実質的に結合しない、実施形態７１に記載のポリペプチド。
実施形態７３．前記ポリペプチドが、それらの受容体を通じて、ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上のシグナル伝達を阻害する、実施形態７１または７２に記載のポリペプチド。
実施形態７４．前記ポリペプチドが、ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達を実質的に阻害しない、実施形態７１～７３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態７５．ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対する前記ポリペプチドの前記阻害効力が、ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対するヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの前記阻害効力と比較して約１００倍以上低減する、実施形態１～７４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態７６．ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対するポリペプチドの前記阻害効力が、ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対するヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの前記阻害効力と比較して、約２００倍、約３００倍、またはそれ以上低減する、実施形態７５に記載のポリペプチド。
実施形態７７．ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対する前記ポリペプチドの阻害効力が、ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対する配列番号１７４に示されるアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドの阻害効力と比較して約１００倍以上低減する、実施形態１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
実施形態７８．ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対する前記ポリペプチドの前記阻害効力が、配列番号１７４に示されるアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドの阻害効力と比較して、約２００倍、約３００倍、またはそれ以上低減する、実施形態７７に記載のポリペプチド。
実施形態７９．ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上に対する前記ポリペプチドの阻害効力が、同じそれぞれのリガンド（複数可）に対するヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの前記阻害効力と同じまたは実質的に同じである、実施形態１～７８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態８０．ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上に対する前記ポリペプチドの阻害効力が、同じそれぞれのリガンド（複数可）に対する配列番号１７４に示されるアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドの前記阻害効力と同じまたは実質的に同じである、実施形態１～７８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
実施形態８１．ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上に対する相対阻害効力が、同じそれぞれのリガンド（複数可）に対するヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの前記阻害効力と比較して増加する、実施形態１～７８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態８２．ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上に対する前記相対阻害効力が、同じそれぞれのリガンド（複数可）に対する、配列番号１７４に示されるアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドの前記阻害効力と比較して増加している、実施形態１～７８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態８３．ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上に対する前記相対阻害効力が、同じそれぞれのリガンド（複数可）に対する、ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤまたは配列番号１７４に示されるアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドの前記阻害効力と比較して、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、または約５倍以上増加する、実施形態８１または８２に記載のポリペプチド。
実施形態８４．アクチビンＡに対する前記ポリペプチドの阻害効力が、配列番号１７４に示されるアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドの阻害効力よりも少なくとも約２倍高く、ＢＭＰ－９に対する前記ポリペプチドの阻害効力が、配列番号１７４に示されるアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドの阻害効力よりも少なくとも約１００倍低い、実施形態１～７８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態８５．アクチビンＡに対する前記ポリペプチドの阻害効力が、配列番号１７４に示されるアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドの阻害効力よりも少なくとも約５倍高く、ＢＭＰ－９に対する前記ポリペプチドの阻害効力が、配列番号１７４に示されるアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドの阻害効力よりも少なくとも約３００倍低い、実施形態８４に記載のポリペプチド。
実施形態８６．実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
実施形態８７．前記核酸分子が、選択された発現宿主によって分泌可能な形態で前記ポリペプチドをコードする、実施形態８６に記載の核酸分子。
実施形態８８．配列番号１７４～２５４、３３３、もしくは３３９～３４１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の配列を有する、少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸分子。
実施形態８９．配列番号１８６に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有するポリペプチドをコードする、核酸分子。
実施形態９０．配列番号１８６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸分子。
実施形態９１．配列番号２５６～３３０、３３４、もしくは３４２～３４４のうちのいずれか１つに示される配列、またはそれと実質的に同一の配列を有する、核酸分子。
実施形態９２．配列番号２６８に示される配列、またはそれと実質的に同一の配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有する、核酸分子。
実施形態９３．配列番号２６８に示される配列を有する、核酸分子。
実施形態９４．配列番号２６８に示される配列、またはそれと実質的に同一の配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む、核酸分子。
実施形態９５．配列番号２６８に示される配列を含む、核酸分子。
実施形態９６．５’末端に、配列番号２５５に示される配列、またはそれと実質的に同一の配列を更に含む、実施形態８６～９５のいずれか１つに記載の核酸分子。
実施形態９７．実施形態８６～９６のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
実施形態９８．配列番号２６８に示される配列、またはそれと実質的に同一の配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはそれからなる核酸分子を含む、ベクター。
実施形態９９．配列番号２６８に示される配列を含む核酸分子を含む、ベクター。
実施形態１００．配列番号２６８に示される配列からなる核酸分子を含む、ベクター。
実施形態１０１．実施形態８６～９６のいずれか１つに記載の核酸分子または実施形態９７～１００のいずれか１つに記載のベクターを含む、細胞宿主であって、前記核酸分子または前記ベクターが、前記細胞宿主内で発現される、前記細胞宿主。
実施形態１０２．実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチドを調製する方法であって、ａ）実施形態８６～９６のいずれか１つに記載の核酸分子または実施形態９７～１００のいずれか１つに記載のベクターを含む宿主細胞を提供することと、ｂ）前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養することと、ｃ）発現されたポリペプチドを培養物から回収することと、を含む、前記方法。
実施形態１０３．実施形態１～８５のいずれか１つに定義されるような第１のポリペプチドと、実施形態１～８５のいずれか１つに定義されるような第２のポリペプチドと、を含む、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤であって、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、それぞれのＦｃドメイン単量体を通じて一緒に会合している、前記ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤。
実施形態１０４．前記結合剤が、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０から選択される１つ以上のリガンドに結合し、それらのそれぞれの受容体を通じた１つ以上のリガンドのシグナル伝達を阻害し、前記結合剤が、ＢＭＰ－９に実質的に結合しないか、またはその受容体を通じたＢＭＰ－９シグナル伝達を実質的に阻害する、実施形態１０３に記載の結合剤。
実施形態１０５．ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対する前記結合剤の前記阻害効力が、ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対するヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤを含む第２の結合剤の阻害効力と比較して約１００倍低減する、実施形態１０３～１０４に記載の結合剤。
実施形態１０６．アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０から選択される１つ以上のリガンドに対する前記結合剤の前記阻害効力が、同じ１つ以上のリガンドに対する前記第２の結合剤の前記阻害効力と実質的に同じである、実施形態１０３～１０５のいずれか１つに記載の結合剤。
実施形態１０７．アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０から選択される１つ以上のリガンドに対する前記結合剤の前記阻害効力が、同じ１つ以上のリガンドに対する前記第２の結合剤の前記阻害効力と比較して増加する、実施形態１０３～１０５のいずれか１つに記載の結合剤。
実施形態１０８．前記結合剤が、ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤを含む第２の結合剤と比較して、アクチビンＡに対するより高い阻害効力及びＢＭＰ－９に対するより低い阻害効力を有する、実施形態１０３～１０５及び１０７のいずれか１つに記載の結合剤。
実施形態１０９．アクチビンＡに対する前記結合剤の阻害効力が、それぞれ、アクチビンＡ及びＢＭＰ－９に対する前記第２の結合剤の前記阻害効力よりも少なくとも約２倍高く、ＢＭＰ－９に対する前記結合剤の阻害効力が、少なくとも約１００倍低い、実施形態１０８に記載の結合剤。
実施形態１１０．アクチビンＡに対する前記結合剤の阻害効力が、それぞれ、アクチビンＡ及びＢＭＰ－９に対する前記第２の結合剤の前記阻害効力よりも少なくとも約５倍高く、ＢＭＰ－９に対する前記結合剤の阻害効力が、少なくとも約３００倍低い、実施形態１０９に記載の結合剤。
実施形態１１１．アクチビンＡに対する前記結合剤の阻害効力が、それぞれ、アクチビンＡ及びＢＭＰ－９に対する前記第２の結合剤の前記阻害効力よりも少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍高く、ＢＭＰ－９に対する前記結合剤の阻害効力が、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、または少なくとも約３００倍低い、実施形態１０９に記載の結合剤。
実施形態１１２．前記結合剤が、配列番号１８６、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列に示されるポリペプチドのホモ二量体である、実施形態１０３～１１１のいずれか１つに記載の結合剤。
実施形態１１３．前記結合剤が、配列番号１８６に示されるポリペプチドのホモ二量体である、実施形態１１２に記載の結合剤。
実施形態１１４．前記第２の結合剤が、配列番号１８６に示されるポリペプチドのホモ二量体である、実施形態１０５～１１３のいずれか１つに記載の結合剤。
実施形態１１５．前記結合剤が、対象において血管合併症を引き起こさず、及び／または対象において血管透過性もしくは漏出を増加させない、実施形態１０３～１１４のいずれか１つに記載の結合剤。
実施形態１１６．前記結合剤が、赤血球質量を増加させず、ヘモグロビンを増加させず、血小板減少症を引き起こさず、及び／または対象において血液合併症を引き起こさない、実施形態１０３～１１５のいずれか１つに記載の結合剤。
実施形態１１７．前記結合剤が、ホモ二量体であり、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、同じであるか、または実質的に同じである、実施形態１０３～１１６のいずれか１つに記載の結合剤。
実施形態１１８．前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、配列番号１７４～２５４、３３３、もしくは３３９～３４１のうちのいずれか１つに示される配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはそれからなる、実施形態１１７に記載の結合剤。
実施形態１１９．前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、配列番号１７４～２５４、３３３、または３３９～３４１のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれらからなる、実施形態１１８に記載の結合剤。
実施形態１２０．前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、配列番号１８６に示される配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む、実施形態１１７に記載の結合剤。
実施形態１２１．前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、配列番号１８６に示される配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列からなる、実施形態１１７に記載の結合剤。
実施形態１２２．前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、配列番号１８６に示される配列を含む、実施形態１２０に記載の結合剤。
実施形態１２３．前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、配列番号１８６に示される配列からなる、実施形態１２１に記載の結合剤。
実施形態１２４．前記結合剤が、配列番号１８６に示される配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有するポリペプチドのホモ二量体である、実施形態１０３～１２３のいずれか１つに記載の結合剤。
実施形態１２５．前記結合剤が、配列番号１８６に示される配列を有するポリペプチドのホモ二量体である、実施形態１２４に記載の結合剤。
実施形態１２６．前記結合剤が、ヘテロ二量体であり、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を含む、実施形態１０３～１２３のいずれか１つに記載の結合剤。
実施形態１２７．前記第１のポリペプチドが、配列番号１８６に示される配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはそれからなる、実施形態１２６に記載の結合剤。
実施形態１２８．前記第１のポリペプチドが、配列番号１８６に示される配列を含むか、またはそれからなる、実施形態１２７に記載の結合剤。
実施形態１２９．実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
実施形態１３０．前記組成物が、注射または注入による投与用に製剤化される、実施形態１２９に記載の薬学的組成物。
実施形態１３１．前記組成物が、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与用に製剤化されている、実施形態１３０に記載の薬学的組成物。
実施形態１３２．実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド及びレシピエントと、任意選択で使用説明書と、を含む、キット。
実施形態１３３．実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤を製造する方法であって、前記第１のポリペプチド及び／または前記第２のポリペプチドを細胞内で発現させることを含む、前記方法。
実施形態１３４．前記細胞を培養することと、前記細胞内で発現された前記ポリペプチドまたは前記結合剤を単離及び／または精製することと、を更に含む、実施形態１３３に記載の方法。
実施形態１３５．前記ポリペプチド及び／または前記結合剤が、前記細胞によって分泌され、前記ポリペプチド及び／または前記結合剤が、前記細胞が培養される培地から得られる、実施形態１３４に記載の方法。
実施形態１３６．ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達と関連する疾患または状態を治療または予防することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記方法が、実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含み、その結果、前記疾患または状態が、前記対象において治療または予防される、前記方法。
実施形態１３７．前記対象が、哺乳類である、実施形態１３６に記載の方法。
実施形態１３８．前記哺乳類が、ヒトである、実施形態１３７に記載の方法。
実施形態１３９．前記対象が、１つ以上のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドによって媒介された疾患または状態を有するか、または有することが疑われる、実施形態１３６～１３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４０．前記対象が、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０によって媒介された疾患または状態を有するか、または有することが疑われる、実施形態１３６～１３９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４１．前記ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドが、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上である、実施形態１３６～１４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４２．対象においてアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０によって媒介された疾患または状態を治療または予防する方法であって、実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含み、その結果、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０によって媒介された前記疾患または状態が、前記対象において治療または予防される、前記方法。
実施形態１４３．前記疾患が、アクチビンＡによって媒介される、実施形態１４２に記載の方法。
実施形態１４４．前記疾患が、アクチビンＢによって媒介される、実施形態１４２または１４３に記載の方法。
実施形態１４５．前記疾患が、ＧＤＦ－８によって媒介される、実施形態１４２～１４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４６．前記疾患が、ＧＤＦ－１１によって媒介される、実施形態１４２～１４５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４７．前記疾患が、ＢＭＰ－１０によって媒介される、実施形態１４２～１４６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４８．前記疾患または状態が、アクチビンＡ及び／またはアクチビンＢ及び／またはＧＤＦ－８及び／またはＧＤＦ－１１の過剰発現または過剰活性化を特徴とする、実施形態１４２～１４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４９．前記疾患または状態が、肺高血圧症、線維症、筋力低下または萎縮、代謝障害、心臓代謝性疾患、骨損傷、及び低い赤血球レベルから選択される、実施形態１３６～１４８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５０．前記疾患または状態が、肺高血圧症（ＰＨ）である、実施形態１３６～１４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５１．前記ＰＨが、動脈ＰＨ、静脈ＰＨ、低酸素ＰＨ、血栓塞栓性ＰＨ、または雑種ＰＨ（ＷＨＯ群１－Ｖとしても知られる）である、実施形態１５０に記載の方法。
実施形態１５２．前記ＰＨが、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）である、実施形態１５０または１５１に記載の方法。
実施形態１５３．前記ＰＡＨが、感染症、先天性心臓異常、門脈高血圧症、肺静脈閉塞性疾患、肺毛細血管腫症、結合組織障害、慢性閉塞性肺疾患、自己免疫障害（例えば、強皮症もしくはループス）、または薬物使用（例えば、コカインもしくはメタンフェタミンの使用）と関連する特発性ＰＡＨ、遺伝性ＰＡＨ、またはＰＡＨである、実施形態１５２に記載の方法。
実施形態１５４．前記疾患または状態が、線維症である、実施形態１３６～１４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５５．前記線維症が、肺線維症、特発性肺線維症、腎線維症、肝線維症、肺線維症、腎線維症、骨髄線維症、全身性硬化症、皮膚線維症、心臓線維症、骨髄線維症、角膜線維症、縦隔線維症、後腹膜線維症、骨関節線維症、関節線維症、組織線維症、線維腫増殖性障害、または結合組織障害である、実施形態１５４に記載の方法。
実施形態１５６．前記疾患または状態が、筋力低下または萎縮である、実施形態１３６～１４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５７．前記疾患または状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、サルコペニア、またはがん悪液質である、実施形態１５６に記載の方法。
実施形態１５８．前記疾患または状態が、代謝障害である、実施形態１３６～１４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５９．前記代謝障害が、肥満、１型糖尿病、２型糖尿病、または前糖尿病である、実施形態１５８に記載の方法。
実施形態１６０．前記疾患または状態が、心臓代謝性疾患である、実施形態１３６～１４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６１．前記疾患または状態が、駆出率低下を伴う心不全（ＨＦｒＥＦ）または駆出率維持を伴う心不全（ＨＦｐＥＦ）である、実施形態１６０に記載の方法。
実施形態１６２．前記疾患または状態が、骨損傷である、実施形態１３６～１４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６３．前記骨損傷が、骨脱塩、骨粗しょう症（例えば、原発性もしくは二次性）、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくはがん転移関連の骨損失、パジェット病、腎性骨ジストロフィー、治療関連の骨損失、食事関連の骨損失、肥満の治療に関連する骨損失、低重力関連の骨損失、または不動性関連の骨損失を含む、実施形態１６２に記載の方法。
実施形態１６４．前記疾患または状態が、低い赤血球レベルである、実施形態１３６～１４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６５．前記疾患または状態が、貧血または失血である、実施形態１６４に記載の方法。
実施形態１６６．除脂肪量を増加させることを必要とする対象において除脂肪量を増加させる方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のうちのいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含み、その結果、対象において除脂肪量が増加する、前記方法。
実施形態１６７．筋肉量を増加させることを必要とする対象において筋肉量を増加させる方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含み、その結果、前記対象において除脂肪量が増加する、前記方法。
実施形態１６８．前記対象が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、封入体筋炎、筋萎縮性側索硬化症、サルコペニア、またはがん悪液質を有する、実施形態１６７に記載の方法。
実施形態１６９．デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、封入体筋炎、筋萎縮性側索硬化症、サルコペニア、またはがん悪液質を有するか、または発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態１７０．骨ミネラル密度を増加させることを必要とする対象において骨ミネラル密度を増加させる方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含み、その結果、前記対象において骨ミネラル密度が増加する、前記方法。
実施形態１７１．骨吸収を低減することを必要とする対象において骨吸収を低減する方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のうちのいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含み、その結果、対象において骨吸収が低減する、前記方法。
実施形態１７２．骨形成を増加させることを必要とする対象において骨形成を増加させる方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態８８～９０のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含み、その結果、前記対象において骨形成が増加する、前記方法。
実施形態１７３．骨強度を増加させることを必要とする対象において骨強度を増加させる方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のうちのいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含み、その結果、対象において骨強度が増加する、前記方法。
実施形態１７４．骨折のリスクを低減することを必要とする対象において骨折のリスクを低減する方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のうちのいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含み、その結果、対象において骨折のリスクが低減する、前記方法。
実施形態１７５．前記対象が、原発性骨粗しょう症、二次性骨粗しょう症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくはがん転移関連骨損失、多発性骨髄腫、パジェット病、腎性骨ジストロフィー、治療関連骨損失、食事関連骨損失、肥満の治療に関連する骨損失、低重力関連骨損失、または不動性関連骨損失を有する、実施形態１７０～１７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７６．骨疾患を有するか、または発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態１７７．前記骨疾患が、原発性骨粗しょう症、二次性骨粗しょう症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくはがん転移関連の骨損失、パジェット病、腎性骨ジストロフィー、治療関連の骨損失、食事関連の骨損失、肥満の治療に関連する骨損失、低重力関連の骨損失、または不動性関連の骨損失を含む、実施形態１７６に記載の方法。
実施形態１７８．原発性骨粗しょう症（例えば、加齢性骨粗しょう症、ホルモン関連骨粗しょう症）、二次性骨粗しょう症（例えば、固定化誘発性骨粗しょう症、グルココルチコイド誘発性骨粗しょう症）、骨減少症、パジェット病、腎性骨ジストロフィー、治療関連の骨損失（例えば、ＦＧＦ－２１治療、ＧＬＰ－１治療、がん治療、肥満の治療、２型糖尿病の治療）、食事関連の骨損失（例えば、くる病）、低重力関連の骨損失、不動性関連の骨損失、または骨折を有するか、または発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態１７９．前記骨が、皮質骨または小梁骨である、実施形態１７０～１７８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８０．線維症を治療することを必要とする対象において線維症を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態１８１．前記線維症が、肺線維症、特発性肺線維症、腎線維症、肝線維症、肺線維症、腎線維症、骨髄線維症、全身性硬化症、皮膚線維症、心臓線維症、骨髄線維症、角膜線維症、縦隔線維症、後腹膜線維症、骨関節線維症、関節線維症、組織線維症、線維腫増殖性障害、または結合組織障害である、実施形態１８０に記載の方法。
実施形態１８２．前記線維症が、化学療法薬物誘発性線維症、放射線誘発性線維症、腫瘍間質、デスモプラスチック腫瘍、外科的接着、肥大性瘢痕、またはケロイドである、実施形態１８０または１８１に記載の方法。
実施形態１８３．組織線維症が、筋肉組織、皮膚上皮、皮膚真皮、腱、軟骨、膵臓組織、子宮組織、神経組織、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、小腸、大腸、胆道、及び腸からなる群から選択される組織に影響を与える線維症である、実施形態１８１に記載の方法。
実施形態１８４．前記線維症が、創傷、火傷、Ｂ型またはＣ型肝炎感染症、脂肪性肝疾患、血吸虫感染症、腎疾患、慢性腎疾患、心疾患、黄斑変性、網膜もしくは硝子体網膜症、クローン病、全身性もしくは局所性強皮症、アテローム性動脈硬化症、または再狭窄と関連する線維症である、実施形態１４９、１５４、１５５、及び１８０～１８３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８５．前記方法が、対象において血管合併症を引き起こさず、対象において血管透過性もしくは漏出を増加させず、赤血球質量を増加させず、ヘモグロビンを増加させず、血小板減少を引き起こさず、及び／または対象において血液合併症を引き起こさない、実施形態１３６～１８４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８６．赤血球レベルを増加させることを必要とする対象において赤血球レベルを増加させる方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のうちのいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含み、その結果、対象において赤血球レベルが増加する、前記方法。
実施形態１８７．赤血球形成を促進または増加させることを必要とする対象において赤血球形成を促進または増加させる方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含み、その結果、前記対象において赤血球形成が増加する、前記方法。
実施形態１８８．貧血または失血を有するか、または発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態１８９．前記貧血または失血が、がん、がん治療、慢性腎疾患、急性腎疾患もしくは急性腎不全、慢性腎疾患もしくは慢性腎不全、骨髄異形成症候群、サラセミア、栄養不足、薬物に対する有害反応、炎症性疾患もしくは自己免疫疾患、脾腫大、ポルフィリン症、血管炎、溶血、骨髄欠損、骨髄移植、急性肝疾患、慢性肝疾患、急性出血、慢性出血、感染症、ヘモグロビン異常症、薬物使用、アルコール乱用、チャーグ・ストラウス症候群、フェルティ症候群、移植片対宿主病、造血幹細胞移植、骨髄線維症、汎血球減少症、純粋な赤血球再形成不全、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、シュワッハマン症候群、高齢、輸血の禁忌、手術、外傷、創傷、潰瘍、尿路出血、消化管出血、頻繁な献血、または激しい月経出血と関連する、実施形態１８８に記載の方法。
実施形態１９０．前記貧血が、再生不良性貧血、鉄欠乏性貧血、ビタミン欠乏性貧血、慢性疾患の貧血、骨髄疾患と関連する貧血、溶血性貧血、鎌状赤血球貧血、小赤血球性貧血、低色素性貧血、鉄芽球性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ファンコーニ貧血、または過剰な芽球を有する難治性貧血である、実施形態１８８または１８９に記載の方法。
実施形態１９１．前記対象が、シュワッハマン・ボディアン・ダイアモンド症候群を有するか、または発症するリスクがある、実施形態１８６～１９０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９２．前記対象が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）による治療に十分に応答しないか、またはＥＰＯの有害作用を受けやすい、実施形態１８６～１９１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９３．肺高血圧症（ＰＨ）を治療または予防することを必要とする対象において肺高血圧症を治療または予防する方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態１９４．前記ＰＨが、動脈ＰＨ、静脈ＰＨ、低酸素ＰＨ、血栓塞栓性ＰＨ、または雑種ＰＨである、実施形態１９３に記載の方法。
実施形態１９５．前記ＰＨが、突発性または遺伝性である、実施形態１９３または１９４に記載の方法。
実施形態１９６．前記ＰＨが、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）である、実施形態１９３または１９５に記載の方法。
実施形態１９７．前記ＰＡＨが、先天性心疾患、門脈高血圧症、肺静脈閉塞性疾患、肺毛細血管腫症、肝硬変、先天性心疾患、結合組織障害、慢性閉塞性肺疾患、自己免疫疾患（例えば、強皮症もしくはループス）、または薬物使用（例えば、コカインもしくはメタンフェタミンの使用）と関連する、特発性ＰＡＨ、遺伝性ＰＡＨ、感染症と関連するＰＡＨ、またはＰＡＨである、実施形態１９６に記載の方法。
実施形態１９８．前記感染症が、ＨＩＶ感染症または住血吸虫症である、実施形態１９７に記載の方法。
実施形態１９９．前記ＰＨが、左心室収縮機能不全、左心室拡張機能不全、弁膜症、先天性心筋症、または先天性もしくは後天性肺静脈狭窄症と関連する静脈ＰＨである、実施形態１９８に記載の方法。
実施形態２００．前記ＰＨが、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、睡眠呼吸障害、肺線維症、肺胞低換気障害、高地への慢性曝露、または発達異常と関連する低酸素ＰＨである、実施形態１９４に記載の方法。
実施形態２０１．前記ＰＨが、慢性血栓塞栓性肺高血圧症、肺塞栓症、血管肉腫、動脈炎、先天性肺動脈狭窄症、または寄生虫感染症と関連する血栓塞栓性ＰＨである、実施形態１９４に記載の方法。
実施形態２０２．前記ＰＨが、血液疾患、全身疾患、代謝障害、肺腫瘍性血栓性微小血管症、線維性縦隔炎、慢性腎不全、または区分性肺高血圧症と関連する雑種ＰＨである、実施形態１９４に記載の方法。
実施形態２０３．血管疾患または血管障害を治療または予防することを必要とする対象において血管疾患または血管障害を治療または予防する方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態２０４．前記血管疾患または血管障害が、血管炎、動脈硬化、大動脈瘤もしくは血管石灰化である、及び／または前記対象が、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、糖尿病、鎌状赤血球貧血、もしくは川崎病を有する、実施形態２０３に記載の方法。
実施形態２０５．代謝障害を治療または予防することを必要とする対象において代謝障害を治療または予防する方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態２０６．前記代謝障害が、年齢関連代謝障害である、実施形態２０５に記載の方法。
実施形態２０７．前記代謝障害が、治療関連代謝障害である、実施形態２０５に記載の方法。
実施形態２０８．前記治療が、グルココルチコイド（例えば、プレドニゾンなどのコルチコステロイド）、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ、例えば、パロキセチン、ミルタザピン、フルオキセチン、エスシタロプラム、もしくはセルトラリン）、セロトニン－ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）、三環系抗うつ剤（例えば、アミトリプチリン）、気分安定剤（例えば、バルプロ酸もしくはリチウム）、抗精神病薬（例えば、オランザピン、クロルプロマジン、もしくはクロザピン）、または抗糖尿病薬（例えば、インスリン、クロルプロパミド）による治療である、実施形態２０７に記載の方法。
実施形態２０９．前記代謝障害が、肥満、１型糖尿病、２型糖尿病、または前糖尿病である、実施形態２０５～２０８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１０．体脂肪を低減することを必要とする対象において体脂肪を低減する方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態２１１．体重を低減することを必要とする対象において体重を低減する方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態２１２．血糖を低減することを必要とする対象において血糖を低減する方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態２１３．インスリン感受性を増加させることを必要とする対象においてインスリン感受性を増加させる方法であって、前記対象に、治療有効量の実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態２１４．前記対象が、代謝性障害を有するか、または発症するリスクがある、実施形態２０５～２１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１５．前記代謝障害が、肥満、１型糖尿病、２型糖尿病、または前糖尿病である、実施形態２１４に記載の方法。
実施形態２１６．前記ポリペプチドまたは前記結合剤または前記薬学的組成物が、以下：前記対象の体重及び／または体重増加のパーセンテージを低減すること；前記対象の体脂肪の量及び／または体脂肪のパーセンテージを低減すること；前記対象の肥満度を低減すること；前記対象の附睾及び腎周脂肪パッドの重量を低減すること；前記対象の皮下、内臓、及び／または肝脂肪の量を低減すること；前記対象の空腹時インスリンのレベルを下げること；前記対象の血糖値を低減すること；前記対象のインスリン感受性を高めること；空腹時インスリンレベルを低減すること；前記対象のグルコースクリアランス率を上げること；前記対象の血清脂質プロファイルを改善すること；前記対象のインスリン治療の必要性を遅らせる、低減する、もしくは排除すること；前記対象の除脂肪量を増加させること；前記対象の体重増加のパーセンテージを低減すること；前記対象の脂肪細胞の増殖を低減すること；前記対象のＬＤＬレベルを低減すること；前記対象におけるトリグリセリドレベルを低減すること；前記対象の血清脂質プロファイルを改善すること；前記対象における膵β細胞からのインスリン生合成及び／または分泌を調節すること；前記対象におけるグルコースクリアランスを増加させること；前記対象の筋肉量及び／または筋力を増加させること；及び／または前記対象の除脂肪量を増加させることのうちの１つ以上をもたらすのに十分な量で投与される、実施形態２０５～２１５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１７．前記方法が、前記対象の食物摂取に対する食欲に影響を及ぼさない、実施形態１９３～２１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１８．前記方法が、前記対象において除脂肪量を低減しない、実施形態１９３～２１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１９．前記方法が、対象において血管合併症を引き起こさず、対象において血管透過性もしくは漏出を増加させず、赤血球質量を増加させず、ヘモグロビンを増加させず、血小板減少を引き起こさず、及び／または対象において血液合併症を引き起こさない、実施形態１９３～２１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２０．対象においてＢＭＰ９シグナル伝達を実質的に低減または阻害することなく、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１及び／またはＢＭＰ１０シグナル伝達を低減または阻害することを必要とする前記対象においてそれを行う方法であって、実施形態１～８５のいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態１０３～１２８のいずれか１つに記載の結合剤、または実施形態１２９～１３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
実施形態２２１．アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ１０の、それぞれの内因性受容体への結合が、対象において低減または阻害される、実施形態２２０に記載の方法。
実施形態２２２．ＢＭＰ９の、その内因性受容体への結合が、前記対象において実質的に低減または阻害されない、実施形態２２０または２２１に記載の方法。
実施形態２２３．前記対象が、哺乳類である、実施形態２２０～２２２に記載の方法。
実施形態２２４．前記哺乳類が、ヒトである、実施形態２２３に記載の方法。
実施形態２２５．前記対象が、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０によって媒介された疾患または状態を有するか、または発症するリスクがある、実施形態２２０～２２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２６．アクチビンＡシグナル伝達が、前記対象において低減または阻害される、実施形態２２０～２２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２７．アクチビンＢシグナル伝達が、前記対象において低減または阻害される、実施形態２２０～２２６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２８．ＧＤＦ－８シグナル伝達が、前記対象において低減または阻害される、実施形態２２０～２２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２９．ＧＤＦ－１１シグナル伝達が、前記対象において低減または阻害される、実施形態２２０～２２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３０．ＢＭＰ１０シグナル伝達が、前記対象において低減または阻害される、実施形態２２０～２２９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３１．前記疾患または状態が、アクチビンＡ及び／またはアクチビンＢ及び／またはＧＤＦ－８及び／またはＧＤＦ－１１の過剰発現または過剰活性化を特徴とする、実施形態２２０～２３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３２．前記疾患または状態が、肺高血圧症、線維症、筋力低下または萎縮、代謝障害、心臓代謝性疾患、骨損傷、及び低い赤血球レベルから選択される、実施形態２２０～２３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３３．前記疾患または状態が、肺高血圧症（ＰＨ）である、実施形態２２０～２３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３４．前記ＰＨが、動脈ＰＨ、静脈ＰＨ、低酸素ＰＨ、血栓塞栓性ＰＨ、または雑種ＰＨ（ＷＨＯ群１－Ｖとしても知られる）である、実施形態２３３に記載の方法。
実施形態２３５．前記ＰＨが、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）である、実施形態２３３または２３４に記載の方法。
実施形態２３６．前記ＰＡＨが、感染症、先天性心臓異常、門脈高血圧症、肺静脈閉塞性疾患、肺毛細血管腫症、結合組織障害、慢性閉塞性肺疾患、自己免疫障害（例えば、強皮症もしくはループス）、または薬物使用（例えば、コカインもしくはメタンフェタミンの使用）と関連する特発性ＰＡＨ、遺伝性ＰＡＨ、またはＰＡＨである、実施形態２３５に記載の方法。
実施形態２３７．前記疾患または状態が、線維症である、実施形態２２０～２３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３８．前記線維症が、肺線維症、特発性肺線維症、腎線維症、肝線維症、肺線維症、腎線維症、骨髄線維症、全身性硬化症、皮膚線維症、心臓線維症、骨髄線維症、角膜線維症、縦隔線維症、後腹膜線維症、骨関節線維症、関節線維症、組織線維症、線維腫増殖性障害、または結合組織障害である、実施形態２３７に記載の方法。
実施形態２３９．前記疾患または状態が、筋力低下または萎縮である、実施形態２２０～２３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４０．前記疾患または状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、サルコペニア、またはがん悪液質である、実施形態２３９に記載の方法。
実施形態２４１．前記疾患または状態が、代謝障害である、実施形態２２０～２３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４２．前記代謝障害が、肥満、１型糖尿病、２型糖尿病、または前糖尿病である、実施形態２４１に記載の方法。
実施形態２４３．前記疾患または状態が、心臓代謝性疾患である、実施形態２２０～２３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４４．前記疾患または状態が、駆出率低下を伴う心不全（ＨＦｒＥＦ）または駆出率維持を伴う心不全（ＨＦｐＥＦ）である、実施形態２４３に記載の方法。
実施形態２４５．前記疾患または状態が、骨損傷である、実施形態２２０～２３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４６．前記骨損傷が、骨脱塩、骨粗しょう症（例えば、原発性もしくは二次性）、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくはがん転移関連の骨損失、パジェット病、腎性骨ジストロフィー、治療関連の骨損失、食事関連の骨損失、肥満の治療に関連する骨損失、低重力関連の骨損失、または不動性関連の骨損失を含む、実施形態２４５に記載の方法。
実施形態２４７．前記疾患または状態が、低い赤血球レベルである、実施形態２２０～２３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４８．前記疾患または状態が、貧血または失血である、実施形態２４７に記載の方法。
実施形態２４９．前記方法が、対象において血管合併症を引き起こさず、対象において血管透過性もしくは漏出を増加させず、赤血球質量を増加させず、ヘモグロビンを増加させず、血小板減少を引き起こさず、及び／または対象において血液合併症を引き起こさない、実施形態２２０～２４８のいずれか１つに記載の方法。
本発明は、本発明を例示するために提供される以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、その範囲をいかなる方法でも限定するものとして解釈されるべきではない。
別段定義されない限り、または文脈が別段明確に指示しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料を本発明の実施または試験において使用することができることを理解されたい。
実施例１．アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１を中和するが、ＢＭＰ－９シグナル伝達を中和しないＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド構築物の設計及び特徴付け。
一連のＴＧＦβスーパーファミリー結合剤を調査して、ホメオスタシスに必要なリガンドに低い効力を有しながら、疾患駆動リガンドに高い効力を示したものを同定した。異なる位置におけるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤにおけるアミノ酸置換、ならびにＥＣＤとＦｃドメインとの間の様々なリンカー長を含有するポリペプチドバリアントで構成された薬剤を調べた。これらのＴＧＦβスーパーファミリー結合剤の試験の結果は、以下に記載され、所望のリガンド特異性プロファイルを有するものを強調する。
一連のＴＧＦβスーパーファミリー結合剤を調査して、ホメオスタシスに必要なリガンドに低い効力を有しながら、疾患駆動リガンドに高い効力を示したものを同定した。異なる位置におけるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤにおけるアミノ酸置換、ならびにＥＣＤとＦｃドメインとの間の様々なリンカー長を含有するポリペプチドバリアントで構成された薬剤を調べた。これらのＴＧＦβスーパーファミリー結合剤の試験の結果は、以下に記載され、所望のリガンド特異性プロファイルを有するものを強調する。
例示的な野生型ヒトアクチビン受容体エクトドメイン－Ｆｃ融合分子を産生し、特徴付け、ベンチマークタンパク質として使用した。ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ－Ｆｃ（「ＡＣＶＲ２Ｂ－Ｆｃ」とも称される）及びＡｃｔＲＩＩＡ－ＥＣＤ－Ｆｃ（「ＡＣＶＲ２Ａ－Ｆｃ」とも称される）は、本明細書では、それぞれ、Ｐ７５（配列番号１７４）及びＰ４４４（配列番号１７６）と称される。Ｐ７５は、トリプルグリシンリンカーによってヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに連結されたヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ（ＡＣＶＲ２Ｂエクトドメインとも称される）（配列番号２）で構成される。Ｐ４４４も同様に組み立てられたが、エクトドメインは、ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＡ ＥＣＤ（ＡＣＶＲ２Ａエクトドメインとも称される）である（配列番号３）。Ｐ４４４（配列番号１７６）は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたアクチビン受容体ＩＩＡ（ＡｃｔＲＩＩＡ）受容体の細胞外ドメインで構成される治験薬候補であるソタテルセプトの配列に対応することに留意されたい（例えば、米国特許第７，６１２，０４１号を参照）。Ｐ７５及びＰ４４４のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を図１に示す。観察された分子量及び純度は、予想通りであり、タンパク質のジスルフィド結合ホモ二量体性質は、還元対非還元条件下でのサイズの差によって確認された。
ベンチマーク剤Ｐ７５（野生型ＡｃｔＲＩＩＢ）及びＰ４４４（野生型ＡｃｔＲＩＩＡ（ソタテルセプト））のアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１阻害効力（ＩＣ５０）を、以下に記載のＴＧＦβ－レポーターＨＥＫ２９３細胞ベースのアッセイを使用して決定した。Ｐ７５及びＰ４４４は、試験した４つ全てのサイトカイン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１）を用量依存的様態で効率的に中和した。ＩＣ５０値は、平均値を表す。アクチビンＡ ＩＣ５０値：Ｐ７５及びＰ４４４については、それぞれ２．３ｎＭ及び２．７ｎＭ（図２Ａ）。アクチビンＢ ＩＣ５０値：Ｐ７５及びＰ４４４については、それぞれ１．４ｎＭ及び０．９５ｎＭ（図２Ｂ）。ＧＤＦ－８ ＩＣ５０値：Ｐ７５及びＰ４４４については、それぞれ０．６７ｎＭ及び３．０６ｎＭ（図２Ｃ）。ＧＤＦ－１１ ＩＣ５０値：Ｐ７５及びＰ４４４については、それぞれ０．７６ｎＭ及び１．６ｎＭ（図２Ｄ）。ＩＣ５０値±ＳＥＭを表７に報告する。
ベンチマーク剤Ｐ７５及びＰ４４４のＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０阻害効力（ＩＣ５０）を、以下に記載されるＢＭＰ－レポーターＨｅｐＧ２細胞ベースのアッセイを使用して決定した。Ｐ７５は、平均ＩＣ５０値が２．７ｎＭで、用量依存的様態でＢＭＰ－９を中和したが、Ｐ４４４は、ＢＭＰ－９に対してはるかに少ない中和活性を示し、ＩＣ５０値は１００ｎＭ超であった（図３Ａ）。Ｐ７５及びＰ４４４は、用量依存的様態でＢＭＰ－１０を効率的に中和し、Ｐ７５及びＰ４４４の平均ＩＣ５０値はそれぞれ２．０及び３．７ｎＭであった（図３Ｂ）。ＩＣ５０値を表８に報告する。
疾患の駆動に重要であることが知られているＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの高い効力阻害を有する薬剤を生成するために、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチドバリアントをＴＧＦβ－レポーターＨＥＫ２９３細胞で試験した。ＥＣＤ構築物の群全体についてのこのアッセイで得られたＩＣ５０値を表９に示し、例示的なＥＣＤ構築物の代表的な結果を図４～７及び図１１～１４に示す。これらの実施例の中で、Ｐ１２２及びＰ１２３は、Ｐ７５（野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ）と比較して同一またはわずかに低い効力を有し、すなわち、アクチビンＡ上のＰ１２２及びＰ１２３のＩＣ５０値は、それぞれ、２．４ｎＭ及び５．０ｎＭであり（図４Ｂ）、アクチビンＢ上のＩＣ５０値は、２．５ｎＭ及び２．８ｎＭであり（図５Ｂ）、ＧＤＦ－８上のＩＣ５０値は、０．６２及び１．１ｎＭであり（図６Ｂ）、ＧＤＦ－１１上のＩＣ５０値は、０．７１及び１．２ｎＭであった（図７Ｂ）。Ｐ１１９、Ｐ１２１、及びＰ１２６などの他の例は、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ（Ｐ７５）と比較して、複数のリガンド上でわずかに増加した中和プロファイルを有し、例えば、Ｐ１２１の効力は、Ｐ７５と比較して、アクチビンＡ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１でそれぞれ１．７倍、２．３倍、及び１．９倍向上したが（図４Ａ、６Ａ、７Ａ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ）、アクチビンＢでは、Ｐ１１９及びＰ１２１の中和効力は、Ｐ７５と比較してわずかに低かった（図５Ａ及び１２Ｃを参照）。Ｐ１２６の場合、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ（Ｐ７５）と比較して、４つ全てのリガンド上の中和効力が著しく減少した（図４～７、パネルＣを参照）。アクチビンＡ上のＰ１１９、Ｐ１２１、及びＰ１２６のＩＣ５０値は、それぞれ、０．９８、１．３、及び＞１，０００ｎＭであり、アクチビンＢ上のＩＣ５０値は、１．８、２．５、及び＞１，０００ｎＭであり、ＧＤＦ－８上のＩＣ５０値は、０．６４、０．２９、及び６５ｎＭであり、ＧＤＦ－１１上のＩＣ５０値は、０．９７、０．４０、及び２３ｎＭであった。いくつかの試験構築物、特にＰ１２０、Ｐ１２５、及びＰ１２７は、４つ全てのリガンドを中和する能力を失った（図４～７）。
リンカー長の効果は、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤの文脈で、ならびにＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤの一連の異なる変異の文脈で調べた。例示的なヒトアクチビン受容体エクトドメイン－Ｆｃ融合分子を産生し、以下に記載されるように特徴付けた。薬剤Ｐ７５及びＰ７５７は、それぞれ３アミノ酸または１４アミノ酸のリンカーを通じてＦｃに融合した野生型ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤを含有する。ＩＣ５０値を表９に報告し、図１０Ａ～Ｂに示す。代表的な中和曲線を図１１Ａ、１２Ａ、１３Ａ、及び１４Ａに示す。Ｐ７５７の効力は、Ｐ７５と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１に対して著しく高く（表９及び図１０Ａ）、それぞれ３８９％、１５５％、１１６％、及び１２４％の増加であった（図１０Ｂ）。
ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤにおける異なる変異の文脈におけるリンカー長の効果を調べるために、一連の比較を行った。１つの例示的な薬剤の対（Ｐ６２４及びＰ６２２）は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤの５８位にＦ－Ｅ置換を含有し、３アミノ酸または１４アミノ酸リンカーを含有する。これらの薬剤のアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１阻害効力（ＩＣ５０）を、ＴＧＦβ－レポーター細胞ベースのアッセイを使用して決定した。ＩＣ５０値を表９に報告し、図１０Ｃ～Ｄに示す。代表的な中和曲線を図４Ｄ、５Ｄ、６Ｄ、及び７Ｄに示す。アクチビンＡ及びアクチビンＢに対するＰ６２２の効力は、低いＩＣ５０値によって実証されるように、Ｐ６２４と比較して高いことが見出され（表９及び図１０Ｃ）、すなわち、アクチビンＡ及びアクチビンＢに対するＰ６２２の効力は、Ｐ６２４と比較してそれぞれ２９５％及び１２９％増加した（図１０Ｄ）。興味深いことに、ＧＤＦ－８及びＧＤＦ－１１に対するＰ６２２及びＰ６２４のＩＣ５０値は同じであった（表９及び図１０Ｃ～Ｄ）。同じ傾向が、Ｐ６２２（Ｆ５８Ｅ＋１４ａａリンカー＋ＩｇＧ１ ＤＬ Ｆｃ）及びＰ１２１（Ｆ５８Ｅ＋３ａａリンカー＋ＩｇＧ１ ＥＭ Ｆｃ）のリガンド結合活性を比較したときに観察され、ＤＬ及びＥＭ Ｆｃ多型が、本明細書に記載の融合タンパク質の活性に実質的に影響を及ぼさないことが実証された（表９を参照）。
異なるリンカー長を有する別の例示的な薬剤対は、Ｐ１２０（３アミノ酸リンカー）及びＰ７５９（１４アミノ酸リンカー）であり、各々がＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤの５７位にＤ～Ｅ置換を有する。ＩＣ５０値を表９に報告し、図１０Ｅ～Ｆに示す。代表的な中和曲線を図４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、１１Ａ、１２Ａ、１３Ａ、及び１４Ａに示す。Ｐ７５９は、Ｐ１２０と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８及びＧＤＦ－１１に対して増加した効力を有することが見出され（表９及び図１０Ｅ）、すなわち、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１に対するＰ７５９の効力は、Ｐ１２０と比較して、それぞれ７３％、７７％、６０％、及び８６％増加した（図１０Ｆ）。
異なるリンカー長を有する別の例示的な薬剤対は、Ｐ１２４及びＰ７６１であり、各々がＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤの３１位にＫ－Ｙ置換を有し、それぞれ、３アミノ酸または１４アミノ酸リンカーを有する。ＩＣ５０値を表９に報告し、図１０Ｇ～Ｈに示す。代表的な中和曲線を図１１Ａ及びＣ、１２Ａ及びＣ、１３Ａ及びＣ、ならびに１４Ａ及びＣに示す。驚くべきことに、上に提示されたリンカー長を増加させる効果とは対照的に、より長い１４アミノ酸リンカーを有する例示的な薬剤Ｐ７６１は、両方のアクチビン及び両方のＧＤＦに対して減少した効力を示し（より高いＩＣ５０値を示した）（表９及び図１０Ｇ）、すなわち、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１に対するＰ７６１の効力は、Ｐ１２４と比較して、それぞれ５８％、８８％、６４％及び６１％減少した（図１０Ｈ）。
異なるリンカー長を有する別の例示的な薬剤対は、Ｐ１１９及びＰ７５８であり、各々がＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤの２７位にＧ－Ｄ置換を有し、それぞれ、３アミノ酸または１４アミノ酸リンカーを有する。ＩＣ５０値を表９に報告し、図１０Ｉ～Ｊに示す。代表的な中和曲線を図１１Ａ及びＣ、１２Ａ及びＣ、１３Ａ及びＣ、ならびに１４Ａ及びＣに示す。予想外に、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１の効力は全て、より長い１４アミノ酸リンカーを有する薬剤では低下し（表９及び図１０Ｇ）、ＧＤＦ－８の効力はより顕著に減少し（表９及び図１０Ｉ）、すなわち、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１に対するＰ７５８の効力は、Ｐ１１９（図１０Ｊ）と比較して、それぞれ１１％、３５％、９９％、及び４４％減少した。
異なるリンカー長を有する別の例示的な薬剤対は、Ｐ１２６（３アミノ酸リンカー）及びＰ７６２（１４アミノ酸リンカー）であり、各々がＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤの７５位にＶ－Ｑ置換を有する。ＩＣ５０値を表９に報告し、図１０Ｋ～Ｌに示す。代表的な中和曲線を図４Ｃ、５Ｃ、６Ｃ、７Ｃ、１１Ａ、１２Ａ、１３Ａ、及び１４Ａに示す。予想外に、この変異の状況において、リンカー長の変化は、効力に影響を与えず、すなわち、Ｐ１２６及びＰ７６２は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８及びＧＤＦ－１１に対して同じ効力を示した（表９及び図１０Ｋ～Ｌ）。
要約すると、Ｆｃドメインに融合したＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤからなる例示的な薬剤は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤにおけるアミノ酸置換の組成及び位置、ならびにＥＣＤとＦｃドメインとの間のリンカーの長さに応じて異なる効力プロファイルを示した。いくつかの事例において、リンカー長が増加し、減少し、またはリンカー長が増加するにつれて変化しないままであったため、予想外に、リンカー長は、効力プロファイルに差異効果を有した。
中和効力に対するリンカーの延長の予測不可能な効果を更に実証するために、他のリンカー長を、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤにおける異なるアミノ酸置換との関連で調べた。まず、５８位におけるＦ－Ｅ置換を、３アミノ酸（Ｐ６２４）、１４アミノ酸（Ｐ６２２及びＰ１１６８）、１９アミノ酸（Ｐ６６６）、及び３９アミノ酸（Ｐ６６７）のリンカー長で調べた。リンカー長を３アミノ酸から１４、１９、または３９アミノ酸に増加させると、アクチビンＡの効力が、それぞれ、１．７ｎＭ（Ｐ６２４）から０．４３（Ｐ６２２）、０．３５（Ｐ１１６８）、０．３３（Ｐ６６６）、及び０．４８（Ｐ６６７）ｎＭに増加した（表９及び図１０Ｍ）。リンカー長を３アミノ酸から１４、１９、または３９アミノ酸に増加させると、アクチビンＢの効力が、それぞれ、２．７（Ｐ６２４）から１．２（Ｐ６２２）、１．１（Ｐ６６６）及び１．７（Ｐ６６７）ｎＭに増加した（表９及び図１０Ｎ）。これらの結果は、この置換との関連で、リンカーを３から１４アミノ酸に増加させたときに両方のアクチビンの効力が増加し、この効力の増加は、より長いリンカー長（１９、３９アミノ酸）でも維持されたことを示している。ＧＤＦ－８及びＧＤＦ－１１の効力を、１４、１９、及び３９アミノ酸のリンカー長で維持した（表９及び図１０Ｏ～Ｐ）。２つの例示的な薬剤Ｐ６２２とＰ１１６８との間の唯一の違いは、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ配列のＣ末端における「ＡＰＴ」の存在または非存在であることに留意されたい。これらのデータは、効力がＡＣＴＲＩＩＢ ＥＣＤ配列のＣ末端におけるＡＰＴ配列の存在によって影響されなかったことを確認する。
５８位におけるＦ－Ｑ置換を、６アミノ酸（Ｐ１２１８）、１０アミノ酸（Ｐ１２１９）、１４アミノ酸（Ｐ７０８）、１９アミノ酸（Ｐ１２２０）、及び３９アミノ酸（Ｐ７０９）のリンカー長で調べた。この置換の文脈において、リンカー長を増加させることは、アクチビンＡに対する効力を段階的に改善した（表９及び図１０Ｓ）。驚くべきことに、５８位のＦ－Ｅ置換とは対照的に、ＧＤＦ－８に対する効力は、０．８０ｎＭ（６アミノ酸）から０．７２ｎＭ（１０アミノ酸）、０．５５ｎＭ（１４アミノ酸）、０．５５ｎＭ（１９アミノ酸）、及び０．２９ｎＭ（３９アミノ酸）へのリンカー長の増加とともにも改善した（表９及び図１０Ｔ）。
５８位におけるＦ－Ｋ置換を、３アミノ酸（Ｐ６９８）、６アミノ酸（Ｐ１１５３）、１０アミノ酸（Ｐ１１５４）、１４アミノ酸（Ｐ７０１）、１９アミノ酸（Ｐ１１５５）、及び３９アミノ酸（Ｐ１１５６）のリンカー長で調べた。この置換の文脈において、Ｑ置換に関しては、リンカー長を増加させることにより、アクチビンＡに対する効力が、主に段階的に改善され（表９及び図１０Ｖ）、ＧＤＦ－８に関しては、リンカー長を増加させることにより、効力が、２．１ｎＭ（３アミノ酸）から１．５ｎＭ（６アミノ酸）及び１．０ｎＭ（１０アミノ酸）に改善された（表９及び図１０Ｗ）。興味深いことに、３アミノ酸リンカーによるＦ－Ｋ置換は、野生型と比較してアクチビンＡに対して減少した効力を示したが、より長いリンカー長を有するＦ－Ｋ置換は、野生型と比較して増加した効力を示した。
これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤにおける単一点アミノ酸置換及びリンカー長の変化の両方が、リガンド阻害効力を調節することができることを実証する。特に、リンカー長の効果は予測不可能であり、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤにおけるアミノ酸変異の位置及び所与の位置における特定の置換に応じて、異なるリガンドに対して異なる効果を有した。
ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤとＦｃドメインとの間の１４アミノ酸リンカー配列に関連して、５８位での追加のアミノ酸置換の効果も調査した。Ｆ－Ｙ（Ｐ６９４）またはＷ（Ｐ７１５）の置換を含む例示的な薬剤は、両方とも、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１の効力を維持しながら、野生型（Ｐ７５、２．３ｎＭ）と比較してアクチビンＡの効力の向上（それぞれ、０．７９及び０．９０ｎＭのＩＣ５０値）をもたらした（表９及び図１１Ｂ、１２Ｂ、１３Ｂ、及び１４Ｂ）。Ｆ－Ｄ（Ｐ６８７）、Ｆ－Ｎ（Ｐ１２１３）、Ｆ－Ｒ（Ｐ１２１５）及びＦ－Ｈ（Ｐ１２１７）の置換を含む例示的な薬剤もまた調査した。アクチビンＡ上のＩＣ５０値は、Ｐ６８７、Ｐ１２１３、Ｐ１２１５、及びＰ１２１７がそれぞれ２．０、１．５、０．５８、及び０．５９ｎＭであった（表９及び図１１Ｄ）。アクチビンＢ上のＩＣ５０値は、Ｐ６８７について８．８ｎＭであった（表９及び図１２Ｄ）。ＧＤＦ－８上のＩＣ５０値は、Ｐ６８７、Ｐ１２１３、Ｐ１２１５、及びＰ１２１７についてそれぞれ１．４、１．１、０．９９、０．５６ｎＭであった（表９及び図１３Ｄ）。ＧＤＦ－１１上のＩＣ５０値は、Ｐ６８７について０．８５ｎＭであった（図１４Ｄ）。これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤにおける変異の位置に加えて、特定の位置におけるアミノ酸置換の性質が、選択されたリガンドに対する効力を減少、増加させるか、または変化させないことを実証する。
次に、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤにおける異なる変異を組み合わせた効果を調査した。例示的な薬剤としては、Ｐ４４１（Ｐ１２１配列と組み合わせたＰ１１９からの点変異）、Ｐ７１８（Ｐ６２４配列と組み合わせたＰ１２０からの点変異）、Ｐ７１９（Ｐ６２２配列と組み合わせたＰ１２２からの点変異）、及びＰ７２０（Ｐ６２２配列と組み合わせたＰ１２３からの点変異）が挙げられる。アクチビンＡ上のＩＣ５０値は、Ｐ４４１、Ｐ７１８、Ｐ７１９、及びＰ７２０について、それぞれ０．６７、＞１，０００、０．６３、及び０．９７ｎＭであった（図１１Ｂ～Ｃ）。アクチビンＢ上のＩＣ５０値は、Ｐ４４１、Ｐ７１８、Ｐ７１９、及びＰ７２０について、それぞれ２８、＞１，０００、２．３、及び２．７ｎＭであった（図１２Ｂ～Ｃ）。ＧＤＦ－８上のＩＣ５０値は、Ｐ４４１、Ｐ７１８、Ｐ７１９、及びＰ７２０について、それぞれ０．６０、＞１，０００、０．６１、及び０．７７ｎＭであった（図１３Ｂ～Ｃ）。ＧＤＦ－１１上のＩＣ５０値は、Ｐ４４１、Ｐ７１８、Ｐ７１９、及びＰ７２０について、それぞれ０．７３、＞１，０００、０．５８、及び０．５４ｎＭであった（図１４Ｂ～Ｃ）。これらの結果は、５８位の変異によって得られたリガンド阻害効力の変化が、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤにおける他の変異に感受性であり得ることを実証する。
まとめると、これらの結果は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの阻害効力に対するＥＣＤとＦｃドメインとの間のリンカーの異なる長さと組み合わせたＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤにおける異なる点変異の異なる効果を示す。ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤにおけるいくつかの点変異は、いずれのリガンドの阻害効力にも影響しなかったが、他の点変異は、選択されたリガンドにおける阻害効力を著しく変化させた。更に他の点変異は、試験した全てのリガンドについて、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの中和活性を無効にした。注目すべきことに、Ｐ１１９、Ｐ１２１、及びＰ６２４は、試験した両方のベンチマークタンパク質（ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ及びＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃ）と比較して、アクチビンＡ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１について改善された中和（阻害効力）を示した。他の例示的な薬剤Ｐ６２２、Ｐ６６６、Ｐ６６７、Ｐ７０８、Ｐ７０９、Ｐ１１６８、及びＰ１２２０は、ベンチマークタンパク質と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及び／またはＧＤＦ－１１の優れたまたは等しい中和を示した。更に他の例示的な薬剤（Ｐ７０１、Ｐ１１５５、及びＰ１１５６）について、アクチビンＡ及びアクチビンＢに対する効力は改善されたが、ＧＤＦ－８及びＧＤＦ－１１に対する効力は適度に影響された。アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１は、ＰＡＨの病態生理学において重要な役割を果たすと考えられているため、これらの結果は、Ｐ１１９、Ｐ１２１、Ｐ６２２、Ｐ６２４、Ｐ６６６、Ｐ６６７、Ｐ７０１、Ｐ７０８、Ｐ７０９、Ｐ１１５５、Ｐ１１５６、Ｐ１１６８、及びＰ１２２０によって例示されるようなかかる改善された薬剤が、ＰＡＨ及び関連する状態の治療に特に有用であり得ることを示唆する。注目すべきことに、例えば、ＦからＥ、Ｋ、及びＱに置換された５８位を有するものなどのある特定の例示的な薬剤は、より長いリンカー長（例えば、１０以上のアミノ酸）の文脈で、アクチビンＡ及びアクチビンＢに対して高い中和効力を示し、かかる改善された薬剤は、ＰＡＨ及び関連する状態の治療に特に有用であり得ることを強調する。
結果はまた、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤとＦｃドメインとの間のリンカー配列を延長することが、いくつかのリガンドでは選択的に効力を増加させたが、他のリガンドでは増加させなかったことを示す。例えば、Ｐ６２２、Ｐ１１６８、Ｐ６６６、及びＰ６６７（１４アミノ酸～３９アミノ酸のリンカーによるＦ５８Ｅ置換）は、Ｐ６２４（３アミノ酸リンカーによるＦ５８Ｅ置換）と比較して、アクチビンＡ及びアクチビンＢに対する効力の増加を示したが、ＧＤＦ－８及びＧＤＦ－１１に対する効力の検出可能な差はなかった。特に、このシリーズでは、試験した任意のリガンドについて、リンカー長を１４から３９アミノ酸に増加させた場合、効力は更に増加しなかったが、Ｐ１１５６及びＰ７０９（それぞれ、Ｆ５８Ｋ及びＱ置換を有する３９アミノ酸リンカー）については、アクチビンＡに対する効力は、それぞれＰ７０１及びＰ７０８（１４アミノ酸リンカー）と比較して増加した。これらの結果は、リンカー長の変化が、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤにおける特定の変異及び特定のリガンドに応じて、阻害効力に予測不可能な効果を有することを示す。
最後に、これらのデータはまた、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ内の他の変異をＦ５８での置換と組み合わせる効果が予測不可能であることを示す。特に、Ｐ７１９及びＰ７２０は、対応する単一変異体のものに対して中間のアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１に対する効力を有した（対応する単一変異体は、Ｐ７１９についてＰ１２２及びＰ６２２、ならびにＰ７２０についてＰ１２３及びＰ６２２である）。しかしながら、Ｐ４４１は、対応する単一変異体（Ｐ１１９及びＰ１２１）のいずれかよりも、アクチビンＢに対して低い効力を示し、その特定のサイトカインに対する両方の変異の複合効果を示した。また、Ｐ７１８（Ｐ１２０からの点変異を有するＰ６２２）は、試験したサイトカインのうちのいずれにも活性を示さず、Ｆ５８Ｅ変異がＰ１２０で観察された効力の喪失を救うことができなかったことを示唆した。
薬剤のＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０中和活性の特徴付け。アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１中和について評価した例示的な結合剤もまた、ＢＭＰレポーターアッセイで試験した。結合剤の群全体についてのこれらのアッセイで得られたＩＣ５０値を表１０に提示し、結果を図８～９に示す。これらの実施例の中で、Ｐ１２２及びＰ１２３は、Ｐ７５に対して効力の適度な変化を有した。ＢＭＰ－９上のＩＣ５０値は、Ｐ１２２及びＰ１２３についてそれぞれ２．７ｎＭ及び８．４ｎＭであった（図８Ｂ）。ＢＭＰ－１０上のＩＣ５０値は、Ｐ１２２及びＰ１２３についてそれぞれ２．７ｎＭ及び３．９ｎＭであった（図９Ｂ）。例示的な薬剤Ｐ１２１は、ＢＭＰ－９（図８Ａ）上のＰ７５と比較して、阻害効力を著しく低減したが、ＢＭＰ－１０（図９Ａ）上の阻害効力は低減しなかった。別の薬剤、Ｐ１１９は、ＢＭＰ－１０（図１６Ｃ）ではなく、ＢＭＰ－９（図１５Ｃ）に対する阻害を著しく増加させた。ＢＭＰ－９上のＩＣ５０値は、Ｐ１１９及びＰ１２１についてそれぞれ１．３及び８６８であったが、ＢＭＰ－１０上のＩＣ５０値は、Ｐ１１９及びＰ１２１についてそれぞれ２．１及び１．０であった（表１０）。Ｐ１２０、Ｐ１２５、Ｐ１２６、及びＰ１２７などの他の例示的な薬剤は、ＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０の両方を中和する能力を失った。
アクチビン及びＧＤＦについて行われたように、ＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０の効力に対するリンカー長の効果を、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤにおける一連の異なる変異について調べた。まず、野生型エクトドメインを、例示的な薬剤Ｐ７５（３アミノ酸リンカー）及びＰ７５７（１４アミノ酸リンカー）を使用して検査した。ＩＣ５０値を表１０に報告し、図１０Ａ～Ｂに示す。代表的な中和曲線を図１５Ａ及び１６Ａに示す。Ｐ７５７の効力は、ＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０に対してＰ７５と比較してより高く（表９及び図１０Ａ）、それぞれ９００％及び６７％の増加であった（図１０Ｂ）。ＢＭＰ９阻害は患者における毒性と関連付けられるため、この結果は、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤの文脈におけるリンカー長の増加が望ましくない効果をもたらしたことを示す。
次の薬剤対（それぞれ、Ｐ６２４及びＰ６２２、３及び１４アミノ酸リンカー）について、ＩＣ５０値を表１０に報告し、図１０Ｃ～Ｄに示す。代表的な中和曲線を図８Ｄ及び９Ｄに示す。この場合、ＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０に対するＰ６２２の効力は、Ｐ６２４（図１０Ｃ）と比較して高いことを見出した（それぞれ１５３％及び７７％増加した；図１０Ｄ）。特に、ＢＭＰ－９に対する効力のこの増加パーセントは、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ（Ｐ７５７、上述）の文脈におけるよりもはるかに小さく、ＢＭＰ－９に対する効力の増加の望ましくない効果が、Ｐ６２４／Ｐ６２２におけるＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤの変異の文脈において低減されたことを示す。
次の例示的な薬剤対（Ｐ１２０及びＰ７５９、それぞれ３及び１４アミノ酸リンカー）のＩＣ５０値を表１０に報告し、図１０Ｅ～Ｆに示す。代表的な中和曲線を図８Ａ、９Ａ、１５Ａ、及び１６Ａに示す。予想外に、この例では、Ｐ７５９は、ＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０において、Ｐ１２０と同じ効力を有することが見出された（図１０Ｅ～Ｆ）。他の２つの例示的な３及び１４アミノ酸リンカー対、すなわち、Ｐ１１９及びＰ７５８（表１０、図１０Ｉ～Ｊ、図１５Ａ及びＣ、ならびに１６Ａ及びＣ）、ならびにＰ１２６及びＰ７６２（表１０、図１０Ｋ～Ｌ、図８Ｃ及び９Ｃ、１５Ａ、ならびに１６Ａ）もまた、ＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０に対して同じ効力を示した。
次の対（それぞれ、Ｐ１２４及びＰ７６１、３及び１４アミノ酸リンカー）について、ＩＣ５０値を表１０に報告し、図１０Ｇ～Ｈに示す。代表的な中和曲線を図１５Ａ及びＣ、ならびに１６Ａ及びＣに示す。驚くべきことに、この例では、例示的な薬剤Ｐ７６１（より長いリンカー）は、Ｐ１２４（短いリンカー）と比較してＢＭＰ－１０に対して変化を示さず、Ｐ１２４と比較してＢＭＰ－９に対して８３％の効力の増加を示す（図１０Ｇ～Ｈ）。
要約すると、アクチビン及びＧＤＦリガンドの場合と同様に、Ｆｃドメインに融合したＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤを含む例示的な薬剤は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤにおけるアミノ酸置換の位置及び性質に応じて、ＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０リガンドの効力プロファイルに対するリンカー長の異なる効果を示した。上記のように、いくつかの事例において、効力は影響を受けなかったが、他の場合では効力が増加した。
リンカーを延長する効果を更に調べるために、他のリンカー長をＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０の効力に対するそれらの効果についても試験した。５８位でのＦ－Ｅ置換の文脈において、リンカー長を３アミノ酸から１４、１９、または３９アミノ酸に増加させることは、ＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０に対する効力の適度な増加を示した（表１０及び図１０Ｑ～Ｒ）。上述のように、この増加は、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤの文脈で見られたものよりもかなり少なかった。５８位におけるＦ－Ｑ置換の文脈において、リンカー長を増加させることは、ＢＭＰ－９効力に対する最小限の効果を有した（表１０及び図１０Ｕ）。５８位におけるＦ－Ｋ置換の文脈において、リンカー長を増加させることは、ＢＭＰ－９の効力が６５７ｎＭ（Ｐ６９８）から１７０ｎＭ（Ｐ１１５３）に増加した（表１０及び図１０Ｘ）。
ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの５８位における追加のアミノ酸置換の効果もまた、ＢＭＰ－レポーターアッセイで調査した。上記のＦ－Ｅ（Ｐ６２２）、Ｋ（Ｐ７０１）、及びＱ（Ｐ７０８）からの置換に加えて、Ｆ－Ｙ（Ｐ６９４）、Ｗ（Ｐ７１５）、Ｄ（Ｐ６８７）、Ｎ（Ｐ１２１３）、Ｒ（Ｐ１２１５）、及びＨ（Ｐ１２１７）からの置換を、１４アミノ酸リンカーの文脈において調査した。これらの置換は全て、Ｐ６２２、Ｐ７０１、及びＰ７０８（それぞれ、Ｆ－Ｅ、Ｋ、またはＱ）で観察されたように、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤと比較して、ＢＭＰ－９（表１０及び図１５Ｂ、１５Ｄ、及び１６Ｂ）の効力の著しい減少を示した。これらの結果は、５８位のアミノ酸置換に応じて変化するＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０の効力を示すが、野生型と比較してＢＭＰ－９の効力の著しい低減は、全ての場合において維持された。
最後に、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤにおける異なる変異を組み合わせる効果を調査した（例示的な薬剤Ｐ４４１、Ｐ７１８、Ｐ７１９、及びＰ７２０）。ＢＭＰ－９上のＩＣ５０値は、Ｐ４４１、Ｐ７１８、Ｐ７１９、及びＰ７２０について、それぞれ３６２、＞１，０００、＞１００、及び９１４ｎＭであった（図１５Ｂ～Ｃ）。ＢＭＰ－１０上のＩＣ５０値は、Ｐ４４１、Ｐ７１８、Ｐ７１９、及びＰ７２０について、それぞれ１．０、＞１，０００、１．７、及び２．３ｎＭであった（図１６Ｂ～Ｃ）。これらの結果は、アクチビン及びＧＤＦリガンドに関して、５８位での変異によって得られたＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０の阻害効力の変化が、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤにおける他の変異に感受性があることを実証する。
総合すると、これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤの効力プロファイルに対する様々な点変異の異なる効果を示す。いくつかの点変異は、試験したリガンドの阻害効力に影響を及ぼさなかった。いくつかの点変異は、いくつかのリガンドの阻害効力を変化させたが、他のリガンドは変化させなかった。またいくつかの点変異は、試験した全てのＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの阻害効力を変化させた。注目すべきことに、Ｐ１２１、Ｐ４４１、Ｐ６２２、Ｐ６２４、Ｐ６６６、Ｐ６６７、Ｐ６８７、Ｐ７０１、Ｐ７０８、Ｐ７０９、Ｐ７１９、Ｐ７２０、Ｐ１１５５、Ｐ１１５６、Ｐ１１６８、Ｐ１２１３、Ｐ１２１５、Ｐ１２１７、及びＰ１２１８は、Ｐ７５（野生型ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ）と比較してＢＭＰ－９の著しく減少した中和を示した。ＢＭＰ－９に対するこの減少した効力は、ＢＭＰ－９阻害と関連付けられた毒性を回避するために望ましいため、結果は、かかる薬剤が治療上特に有用であり得ることを示唆する。
要約すると、我々の結果は、特定のリンカー長の文脈におけるＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤにおけるある特定の点変異が、ある特定のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド、特にＰＡＨ病態生理学に関与するもの、すなわち、アクチビンＡ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１の阻害効力の著しい増加をもたらしたことを示す。
結果はまた、Ｐ１２１、Ｐ６９８、及びＰ１２１８における単一点変異が、野生型ＡｃｔＲＩＩＡ（Ｐ４４４、ソタテルセプト）と比較して、アクチビンＡ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１に対してより高い中和効力もたらしたことを示す。具体的には、Ｐ１２１単一点変異は、Ｐ４４４と比較して、アクチビンＡ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１の２．１倍、１１倍、及び４．０倍高い阻害効力をもたらした。Ｐ６９８単一点変異は、Ｐ４４４と比較して、ＧＤＦ－８の１．５倍高い阻害効力をもたらした。Ｐ１２１８単一点変異は、Ｐ４４４と比較して、アクチビンＡ及びＧＤＦ－８の２．５倍及び１．５倍高い阻害効力をもたらした。重要なことに、Ｐ１２１、Ｐ６８７、Ｐ６９８、Ｐ１２１３、Ｐ１２１５、Ｐ１２１７、及びＰ１２１８における単一点変異はまた、非変異（野生型）ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤと比較して、ＢＭＰ－９に対する阻害効力の著しい減少につながった。これにより、Ｐ４４４と比較して、ＢＭＰ－９に対するＰ１２１及びＰ６９８の中和効力が低くなり、すなわち、ＢＭＰ－９阻害効力は、Ｐ４４４と比較して、Ｐ１２１及びＰ６９８に対してそれぞれ３．５倍及び２．６倍低かった。まとめると、これらの結果は、Ｐ４４４（ソタテルセプト）と比較して、これらの例示的な薬剤のための潜在的により広い治療期間を示唆し、すなわち、それらは、アクチビンＡ、ＧＤＦ－８及び／またはＧＤＦ－１１に対するそれらのより高い効力に起因するある特定の疾患の治療のための優れた治療有効性を有する一方で、ＢＭＰ－９に対するそれらのより低い効力に起因するより良い安全性プロファイルを有し得る。
更に、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤとＦｃドメインとの間のリンカーの長さを増加させると、ある特定のリガンドに対する中和効力が増加した。驚くべきことに、Ｐ６２２及びＰ１１６８（１４アミノ酸リンカー）は、Ｐ６２４（３アミノ酸リンカー）と比較して、アクチビンＡではそれぞれ４．０倍及び４．９倍、アクチビンＢでは２．３倍の阻害効力を示した（表９及び図１０Ｃ）。別の例示的な薬剤であるＰ１１５６（３９アミノ酸リンカー）は、Ｐ６９８（３アミノ酸リンカー）と比較して、アクチビンＡ及びＧＤＦ－８で１３倍及び１．６倍増加した阻害効力を示した。最後に、Ｐ７０９（３９アミノ酸リンカー）は、Ｐ１２１８（６アミノ酸リンカー）と比較して、アクチビンＡ及びＧＤＦ－８で２．６倍及び２．８倍増加した阻害効力を示した。これらの例示的な薬剤の対はリンカー長だけが異なるため、これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤのある特定の変異の文脈における特定のリガンドの効力に対するリンカー長の驚くべき影響を強調する。
特に、効力の結果はまた、リンカーの長さを増加させることは、選択された病理学的リガンドの効力を増加させるのに有益であり得るが、このアプローチは、それ自体では、望ましい治療窓を有する薬剤、すなわち、ＢＭＰ－９の効力が著しく低減した薬剤、及び病理学的リガンドの効力が高い薬剤を得るのに十分ではなかったことを実証する。これは、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ（例えば、Ｐ６２２、Ｐ６２４、Ｐ６６６、Ｐ６６７、Ｐ１１６８のようなＦ５８Ｅ；Ｐ６９８、Ｐ７０１、Ｐ１１５３、Ｐ１１５４、Ｐ１１５５、Ｐ１１５６のようなＦ５８Ｋ；またはＰ７０８、Ｐ７０９、Ｐ１２１８、Ｐ１２１９、Ｐ１２２０のようなＦ５８Ｑ）における特定の変異を、より長いリンカー長（例えば、少なくとも１０アミノ酸）と組み合わせることによってのみ達成された。この点は、Ｐ６２２、Ｐ７０１、及びＰ７０８をＰ７５７（野生型エクトドメイン）と比較することによって示され、これらは全て１４アミノ酸リンカーを有する。Ｐ７５７は、病理学的リガンドに対して高い効力を有したが、試験した任意の構築物のＢＭＰ－９に対しても最も高い効力を有した。したがって、Ｐ７５７は、ＢＭＰ－９阻害と関連付けられた毒性を促進すると予想される。
実施例１のための実験手順。
ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドを中和するＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ融合タンパク質の産生、精製、及び特徴付け。
全ての構築物は、発現時にＮ末端に分泌シグナル配列（配列番号１）を含んだ。構築物をコードする相補的ｃＤＮＡを合成的に調製した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。ｃＤＮＡを、ｐＴＴ５哺乳動物発現プラスミドベクター（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）のＥｃｏＲ１（５’末端）及びＢａｍＨ１（３’末端）にクローニングした。シグナルペプチドは、発現中に細胞内で切断され、精製された融合タンパク質に含まれなかった。融合タンパク質の発現に使用される代表的なｃＤＮＡ配列を以下に要約する。
ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドを中和するＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ融合タンパク質の産生、精製、及び特徴付け。
全ての構築物は、発現時にＮ末端に分泌シグナル配列（配列番号１）を含んだ。構築物をコードする相補的ｃＤＮＡを合成的に調製した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。ｃＤＮＡを、ｐＴＴ５哺乳動物発現プラスミドベクター（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）のＥｃｏＲ１（５’末端）及びＢａｍＨ１（３’末端）にクローニングした。シグナルペプチドは、発現中に細胞内で切断され、精製された融合タンパク質に含まれなかった。融合タンパク質の発現に使用される代表的なｃＤＮＡ配列を以下に要約する。
ＣＨＯ及び／または２９全て３細胞で効率的に発現されたのタンパク質、ならびにプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用した各タンパク質の精製は類似していた。多くの特性は、バリアント間で非常に類似していたが、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定され、不適切な折り畳みを示す凝集の可能性は、いくつかの区別を明らかにした。ベンチマークタンパク質（すなわち、野生型ＡｃｔＲＩＩＡ－ＥＣＤ－Ｆｃ（Ｐ４４４）及び野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ－Ｆｃ（Ｐ７５））について、純度（すなわち、単量体含有率）は、それぞれ、Ｐ４４４及びＰ７５について、９９％及び８５％の単量体含有率であった。いくつかの例示的な薬剤、すなわちＰ１２２、Ｐ１２５、Ｐ１２６、Ｐ１２７、及びＰ６８７は、それぞれ８２、８１、８５、８６、及び８８％の単量体含有量を有するＰ７５のものと同等の凝集レベルを有した。他の薬剤は、それぞれ７８％及び７３％の単量体含有量でＰ１２０及びＰ１２３に例示されるように、Ｐ７５と比較してわずかに低い単量体含有量を示した。驚くべきことに、いくつかのバリアントＰ１２１、Ｐ６２２、Ｐ６２４、Ｐ６６６、Ｐ６６７、Ｐ６９４、Ｐ７０１、Ｐ７０８、Ｐ７１５、Ｐ７１８、Ｐ７１９、及びＰ７２０は、全てＰ７５と比較してＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの同じ位置に変異を含有し、それぞれ９６、９５、９９、９８、９９、９１、９７、９８、９１、９６、９６、及び９４％の単量体含有量で、著しく高い単量体含有量を示した。
図１Ａ及び１Ｂは、非還元（図１Ａ）及び還元（図１Ｂ）の両方の条件下での、例示的な精製タンパク質（Ｐ）１２０、１２１、１２３、及び１２５（それぞれ、Ｐ１２０、Ｐ１２１、Ｐ１２３、及びＰ１２５として示されるレーンを参照）のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。観察された各タンパク質の分子量及び純度は、予想通りであり、タンパク質のジスルフィド結合ホモ二量体性質は、還元対非還元条件下でのサイズの差によって確認された。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果と一致して、いくつかの薬剤、例えば、Ｐ１２０及びＰ１２３は、凝集を表す可能性が高い高分子量バンドを示した。逆に、他の薬剤は、非常に低い高分子量バンドを有した。
これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＢエクトドメインにおける点変異が、構築物の製造可能性プロファイルに予測不可能かつ予期せぬ結果をもたらしたことを実証する。特に、Ｐ１２１、Ｐ６２２、Ｐ６２４、Ｐ６６６、及びＰ６６７（配列番号５のＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントを含む）は、野生型受容体エクトドメインを含むＦｃ融合体と比較して優れた単量体含有量を示した（Ｐ７５）。
細胞ベースのアッセイにおけるＴＧＦβスーパーファミリーリガンドを中和するＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ融合タンパク質の分析。
融合タンパク質のアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１阻害効力（ＩＣ５０）の特徴付けを、細胞ベースのレポーターアッセイを使用して行った。ＴＧＦβレポーターＨＥＫ２９３細胞をＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、カタログ番号ｈｋｂ－ｔｇｆｂ）から入手し、製造業者の指示に従って維持した。手短に言えば、細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ、３０μｇ／ｍＬのブラスチシジン、２５０μｇ／ｍＬのヒグロマイシンＢ、及び１００μｇ／ｍＬのゼオシン（以下、「成長培地」）を含有する高グルコースＤＭＥＭで成長させた。細胞が７０～８０％のコンフルエンスに達すると、フラスコを穏やかにタップすることによって、細胞を成長培地中で分離した。全てのアッセイについて、細胞を、成長培地中の１ウェル当たり２０，０００個の細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。細胞を室温（ＲＴ）で１０分間付着させた後、３７℃のインキュベーター（５％ ＣＯ２）に一晩移した。翌日、適切な濃度の薬剤とアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、またはＧＤＦ－１１を室温で３０分間組み合わせることによって処理を調製した（１５０ｒｐｍで振盪）。処理は、高グルコースＤＭＥＭ（無血清かつ選択剤なし）で実施し、サイトカイン（リガンド）の最終濃度は０．３ｎＭであった。成長培地を培養プレートから除去し、細胞を、融合タンパク質及びサイトカインの適切な混合物で処理した。処理期間は、３７℃で１８～２２時間であった（５％ ＣＯ２）。全ての処理は、技術的に複製して行い、各サイトカインについて少なくとも２つの独立した実験を実施した。処理期間の終了時に、上清を新しいプレートに移し、３００ｒｐｍで３分間遠心分離した。各条件からの４０μＬの上清を新しいプレートに移し、そこに１８０μＬのＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｒｅｐ－ｑｂｓ）を添加した。Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ試薬を、製造業者の指示に従って調製した。試料を３７℃で４５分間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、吸光度を６５０ｎｍで読み取った。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいてプロットし、これを使用して、非線形回帰としてＩＣ５０値を算出した。
融合タンパク質のアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、及びＧＤＦ－１１阻害効力（ＩＣ５０）の特徴付けを、細胞ベースのレポーターアッセイを使用して行った。ＴＧＦβレポーターＨＥＫ２９３細胞をＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、カタログ番号ｈｋｂ－ｔｇｆｂ）から入手し、製造業者の指示に従って維持した。手短に言えば、細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ、３０μｇ／ｍＬのブラスチシジン、２５０μｇ／ｍＬのヒグロマイシンＢ、及び１００μｇ／ｍＬのゼオシン（以下、「成長培地」）を含有する高グルコースＤＭＥＭで成長させた。細胞が７０～８０％のコンフルエンスに達すると、フラスコを穏やかにタップすることによって、細胞を成長培地中で分離した。全てのアッセイについて、細胞を、成長培地中の１ウェル当たり２０，０００個の細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。細胞を室温（ＲＴ）で１０分間付着させた後、３７℃のインキュベーター（５％ ＣＯ２）に一晩移した。翌日、適切な濃度の薬剤とアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、またはＧＤＦ－１１を室温で３０分間組み合わせることによって処理を調製した（１５０ｒｐｍで振盪）。処理は、高グルコースＤＭＥＭ（無血清かつ選択剤なし）で実施し、サイトカイン（リガンド）の最終濃度は０．３ｎＭであった。成長培地を培養プレートから除去し、細胞を、融合タンパク質及びサイトカインの適切な混合物で処理した。処理期間は、３７℃で１８～２２時間であった（５％ ＣＯ２）。全ての処理は、技術的に複製して行い、各サイトカインについて少なくとも２つの独立した実験を実施した。処理期間の終了時に、上清を新しいプレートに移し、３００ｒｐｍで３分間遠心分離した。各条件からの４０μＬの上清を新しいプレートに移し、そこに１８０μＬのＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｒｅｐ－ｑｂｓ）を添加した。Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ試薬を、製造業者の指示に従って調製した。試料を３７℃で４５分間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、吸光度を６５０ｎｍで読み取った。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいてプロットし、これを使用して、非線形回帰としてＩＣ５０値を算出した。
融合タンパク質のＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０阻害効力（ＩＣ５０）の特徴付けを、第２の細胞ベースのレポーターアッセイを使用して行った。ヒト肝臓ＨｅｐＧ２細胞を、ＳＥＡＰコードプラスミドでトランスフェクトし、ここで、ＳＥＡＰの発現は、マウスＩｄ１プロモーターの制御下にある。このトランスフェクションから安定なプールを生成した。細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ及び２００μｇ／ｍＬのゼオシン（以下、「ＨｅｐＧ２成長培地」）を含有するＥＭＥＭ中で成長させた。細胞が７０％コンフルエンスに達すると、それらをＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシンを使用して分離した。全てのアッセイについて、細胞を、ＨｅｐＧ２成長培地中の１ウェル当たり１００，０００細胞のコンフルエンスで９６ウェルプレートに播種した。細胞を室温で１０分間付着させた後、３７℃のインキュベーター（５％ ＣＯ２）に一晩移した。翌日、適切な濃度の薬剤をＢＭＰ－９またはＢＭＰ－１０と室温で３０分間組み合わせることによって（１５０ｒｐｍで振盪）、ＥＭＥＭ（２．５％の熱不活化ＦＢＳ及び選択剤なし）で処理を調製した。処理をＥＭＥＭ（２．５％熱不活性化ＦＢＳ及び選択剤なし）で実施し、ＢＭＰ－９及びＢＭＰ－１０の最終濃度は、それぞれ２ｎｇ／ｍＬ及び４０ｎｇ／ｍＬであった。ＨｅｐＧ２成長培地を培養プレートから除去し、細胞を、融合タンパク質及びサイトカインの適切な混合物で処理した。処理期間は、３７℃で２２～２４時間であった（５％ ＣＯ２）。全ての処理は、技術的に複製して行い、各サイトカインについて少なくとも２つの独立した実験を実施した。処理期間の終了時に、上清を新しいプレートに移し、３００ｒｐｍで３分間遠心分離した。各条件からの４０μＬの上清を新しいプレートに移し、そこに１８０μＬのＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ試薬を添加した。Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ試薬を、製造業者の指示に従って調製した。試料を、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ試薬を用いて３７℃で５時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、吸光度を６５０ｎｍで読み取った。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいてプロットし、これを使用して、非線形回帰としてＩＣ５０値を算出した。
実施例２：薬物動態（ＰＫ）特性が改善されたＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド構築物。
選択されたＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤及び中和剤のＰＫ特性を調べて、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤの変異がインビボでの曝露に影響を及ぼし得るかを決定した。例示的な薬剤Ｐ１２１を１０ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇの用量で野生型（ＷＴ）マウスに腹腔内注射し、血清調製のために注射後３時間及び９６時間に血液を採取した。比較のために、ベンチマーク剤野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ－Ｆｃ（Ｐ７５）をＷＴマウスの第２の群に注入した。血清中の各タンパク質の濃度は、以下に記載のＥＬＩＳＡベースの方法を使用して決定した。９６ウェルプレートを、炭酸塩－重炭酸塩緩衝液中で１／６，０００の希釈で、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ ＃Ｉ２１３６）の１００μＬ／ウェル溶液で４℃で一晩コーティングした。緩衝液で３回洗浄した後、３００μＬの遮断緩衝液（ＰＢＳ中の１％ ＢＳＡ）を各ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。各薬剤の標準曲線を、１２連続希釈液（３倍）を調製した薬剤の９００ｎｇ／ｍｌストックを調製することによって調製した。１００μＬの各希釈液を、９６ウェルプレートに二重に添加した。血清試料について、これらを氷上で解凍し、アッセイ希釈液（ＰＢＳ中０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で適切に希釈し、各希釈液１００μＬを、９６ウェルプレートに二重に添加した。室温で１．５時間インキュベートした後、プレートをアッセイ希釈液で３回洗浄した。結合剤の検出のために、アッセイ希釈液中１／６，０００の希釈でビオチンにコンジュゲートされた第２の抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ａ１８８２１）の１００μＬ／ウェル溶液を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、標準熱量測定法を使用して、ストレプトアビジン－ＨＲＰを使用して結合を明らかにした。
選択されたＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤及び中和剤のＰＫ特性を調べて、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤの変異がインビボでの曝露に影響を及ぼし得るかを決定した。例示的な薬剤Ｐ１２１を１０ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇの用量で野生型（ＷＴ）マウスに腹腔内注射し、血清調製のために注射後３時間及び９６時間に血液を採取した。比較のために、ベンチマーク剤野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ－Ｆｃ（Ｐ７５）をＷＴマウスの第２の群に注入した。血清中の各タンパク質の濃度は、以下に記載のＥＬＩＳＡベースの方法を使用して決定した。９６ウェルプレートを、炭酸塩－重炭酸塩緩衝液中で１／６，０００の希釈で、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ ＃Ｉ２１３６）の１００μＬ／ウェル溶液で４℃で一晩コーティングした。緩衝液で３回洗浄した後、３００μＬの遮断緩衝液（ＰＢＳ中の１％ ＢＳＡ）を各ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。各薬剤の標準曲線を、１２連続希釈液（３倍）を調製した薬剤の９００ｎｇ／ｍｌストックを調製することによって調製した。１００μＬの各希釈液を、９６ウェルプレートに二重に添加した。血清試料について、これらを氷上で解凍し、アッセイ希釈液（ＰＢＳ中０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で適切に希釈し、各希釈液１００μＬを、９６ウェルプレートに二重に添加した。室温で１．５時間インキュベートした後、プレートをアッセイ希釈液で３回洗浄した。結合剤の検出のために、アッセイ希釈液中１／６，０００の希釈でビオチンにコンジュゲートされた第２の抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ａ１８８２１）の１００μＬ／ウェル溶液を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、標準熱量測定法を使用して、ストレプトアビジン－ＨＲＰを使用して結合を明らかにした。
結果を図１７Ａに示し、１０ｍｇ／ｋｇの注射後のＰ７５及びＰ１２１の両方の平均血清濃度が３時間時点で同等であったことを示す。同様に、５０ｍｇ／ｋｇの注射後の薬剤の濃度もまた、３時間後に同等であった。注射の９６時間後に、薬剤間の血清濃度の顕著な差が観察された。例えば、３時間から９６時間の時点までに１０ｍｇ／ｋｇで投与されたＰ７５の濃度の減少は５１．１％であったが、Ｐ１２１の濃度は３９．９％のみ減少した。Ｐ７５とＰ１２１との間の減少の同様の差は、５０ｍｇ／ｋｇの注射後にも見られ、Ｐ７５は、Ｐ１２１の５７．２％と比較して７３．３％減少した。
別の研究では、８～１０週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスを計量し、所与の用量レベル（１、３、１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝試験薬剤当たりの用量当たり６）のビヒクル（ｎ＝６）または試験薬剤処置群（Ｐ６２２またはＰ７５）のいずれかに無作為に割り当てた。次いで、マウスを、０、３、７、１０、１４、１７、及び２１日目に対応して、週２回、２１日間、皮下的に処置した。各治療日に、体重を記録し、それに応じて用量を調整した。生存中の全血試料を、指定された時点で顔面静脈から収集し、血清に処理した。試験薬剤の血清濃度は、上で概説したように決定した。
Ｐ６２２及びＰ７５の血清濃度を、３週間の過程にわたって（最初の注射の３時間後、その後の各注射の直前、及び寿命の終わりに）測定した。推定曝露は、研究の過程にわたって各試験薬剤及び用量レベルのＰＫプロファイルから算出した。薬剤濃度は、各投薬サイクルの終わりに、すなわち、次の注射の直前の最小試験薬剤濃度（トラフ濃度）で測定されたため、曝露推定値は、ＡＵＣ（トラフ下）と称される。図１７Ｂに示されるように、Ｐ６２２の曝露は、全ての用量レベルでＰ７５の曝露よりも高く、すなわち、ＡＵＣ（トラフ下）は、Ｐ７５よりもＰ６２２について平均で２倍高かった。これらの結果は、野生型ｈＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ－Ｆｃ（Ｐ７５）が、Ｐ６２２よりもマウスにおいて高いクリアランス及び／または低いバイオアベイラビリティを有することを示す。これらの結果は、野生型と比較して同じまたはより悪いＰＫ特性を示す以前の変異したＡｃｔＲＩＩＢエクトドメインとは対照的に（Ａｔｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１９を参照）、例示的な薬剤Ｐ６２２における変異したエクトドメインは、予想外に改善された曝露をもたらしたことを示す。
これらの結果は、改善された治療有効性プロファイル（上記の実施例を参照）を有することに加えて、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤにおける単一のアミノ酸変異を有するＰ１２１及びＰ６２２によって例示されるような薬剤がインビボで改善されたＰＫ特性を示したことを実証する。
実施例３：ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド構築物は、体重及び筋肉量を増加させることができる。
選択された薬剤を試験して、体重及び筋肉量に対するそれらの効果を調べ、それらがインビボでＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ（Ｐ７５）とどのように比較されたかを調べた。２つの例示的な薬剤、Ｐ６２２及びＰ６２４を、４ｍｇ／ｋｇまたは１６ｍｇ／ｋｇの用量で、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（８～１０週間）に２週間、週２回腹腔内に注射した。対照剤Ｐ７５を、１６ｍｇ／ｋｇのみで同様に注射した。全ての動物の体重を週２回記録し、研究の終了時に５つの異なる筋肉群（骨格筋：腓腹筋、大腿四頭筋、胸筋、及び上腕三頭筋；ならびに心筋：心臓）を収集した。
選択された薬剤を試験して、体重及び筋肉量に対するそれらの効果を調べ、それらがインビボでＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ（Ｐ７５）とどのように比較されたかを調べた。２つの例示的な薬剤、Ｐ６２２及びＰ６２４を、４ｍｇ／ｋｇまたは１６ｍｇ／ｋｇの用量で、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（８～１０週間）に２週間、週２回腹腔内に注射した。対照剤Ｐ７５を、１６ｍｇ／ｋｇのみで同様に注射した。全ての動物の体重を週２回記録し、研究の終了時に５つの異なる筋肉群（骨格筋：腓腹筋、大腿四頭筋、胸筋、及び上腕三頭筋；ならびに心筋：心臓）を収集した。
４ｍｇ／ｋｇで、Ｐ６２２及びＰ６２４は、ビヒクル処置マウスと比較して、全体重において同様の増加を示した（図１８）。１６ｍｇ／ｋｇでは、Ｐ６２４は、（４ｍｇ／ｋｇでのＰ６２４と比較して）全体重の更なる増加を引き起こし、この増加は、１６ｍｇ／ｋｇでのＰ７５によって引き起こされるものと同様であった。対照的に、研究の全期間を通して１６ｍｇ／ｋｇのＰ６２２は、一貫して、他の全ての群と比較して体重のより大きな増加を誘導した。これらのデータは、Ｐ６２４（短いリンカー）と比較したＰ６２２（長いリンカー）の改善された効力プロファイルが、体重に関してより良いインビボの有効性に翻訳されたことを強調する。
本研究では、筋肉量に対する効果も検討した。４ｍｇ／ｋｇで投与された場合、Ｐ６２２及びＰ６２４の両方が、分析された全ての骨格筋群において同様の増加を生じた（図１９）。これらの増加は、１６ｍｇ／ｋｇで投与されたＰ７５と比較してわずかに低く、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃと比較して低用量レベルで投与された場合でも、Ｐ６２２及びＰ６２４が筋肉成長にほぼ同じ効果を有することを実証した（Ｐ７５）。１６ｍｇ／ｋｇで、Ｐ６２４は、４ｍｇ／ｋｇで注射されたときと比較して、骨格筋成長のわずかな追加の増加のみを引き起こした。対照的に、Ｐ６２２は、４ｍｇ／ｋｇと比較して、１６ｍｇ／ｋｇで全ての筋肉群にわたって非常に高く著しい追加の増加を誘導し、Ｐ６２４に対してその優れた有効性を示した。これらのデータは、Ｐ６２２におけるＰ６２４と比較したリンカー長の増加の有益な影響を実証し、Ｐ６２４の効力プロファイルが筋肉肥大を最大限に誘導するのに十分ではないことを示す。これらの結果は、ＧＤＦ－８がげっ歯類において筋肉量の主要な調節因子であると考えられ、ＧＤＦ－８に対するＰ６２２及びＰ６２４の効力がほぼ同じであることを考慮すると、特に驚くべきものである。
筋肉遺伝子発現に対する例示的な薬剤の効果も調べた。大腿四頭筋において、全ての用量（４または１６ｍｇ／ｋｇ）でＰ７５、Ｐ６２２、及びＰ６２４は、Ｍｓｓ５１ ｍＲＮＡレベルを著しく減少させ（図１９Ｅ）、Ｉｇｆ２遺伝子発現レベルを著しく増加させた（図１９Ｆ）。Ｍｓｓ５１は、ＧＤＦ－８阻害によって下方制御され、Ｍｓｓ５１の機能喪失は、マウスにおける骨格筋脂肪酸の酸化、解糖、及び酸化リン酸化の増加、ならびに食事誘導性体重増加に対する耐性をもたらす（Ｍｏｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，２０１５、Ｙａｚｍｉｎ，２０１９）。ＩＧＦ－２及びそのシグナル伝達エフェクターは、骨格筋成長の正の調節因子である（Ｔｏｒｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。
まとめると、筋肉量及び遺伝子発現に対するこれらの効果は、Ｐ７５、Ｐ６２２、及びＰ６２４の体組成に対するプラスの効果を支持し、Ｐ６２２は、Ｐ７５またはＰ６２４と比較して全体的により優れた有効性を示す。全体として、これらのデータは、１）Ｐ６２２及びＰ６２４で使用される変異が、筋肉肥大効果によって証明されるように、インビボでトラップの有効性を改善すること、ならびに２）Ｐ６２２で使用されるより長いリンカーが、筋肉同化効果を誘導する上でＰ６２４よりも有利であることを示している。
観察された同化効果は、試験した薬剤がどれもビヒクルに対する心臓重量の有意な変化を誘導しなかったため、骨格筋に特異的であった（図２０）。
実施例４：例示的なＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド構築物は、血液学的効果を実証しなかった。
２つの例示的な薬剤、Ｐ６２２及びＰ６２４を試験して、血液学的パラメータに対するそれらの効果を調べた。Ｐ６２２及びＰ６２４を、雌カニクイザルに、３ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射した（１群当たりｎ＝３）。Ｐ６２２を１回注射し、血液学的パラメータをベースライン時及び注射の１４日後の試験終了時に評価した。Ｐ６２４を２週間ごとに４週間（合計２回の注射）注射し、血液学的パラメータをベースライン時、２回目の注射前、及び研究終了時に評価した。
２つの例示的な薬剤、Ｐ６２２及びＰ６２４を試験して、血液学的パラメータに対するそれらの効果を調べた。Ｐ６２２及びＰ６２４を、雌カニクイザルに、３ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射した（１群当たりｎ＝３）。Ｐ６２２を１回注射し、血液学的パラメータをベースライン時及び注射の１４日後の試験終了時に評価した。Ｐ６２４を２週間ごとに４週間（合計２回の注射）注射し、血液学的パラメータをベースライン時、２回目の注射前、及び研究終了時に評価した。
Ｐ６２２もＰ６２４も、研究を通して赤血球（ＲＢＣ）数（図２１Ａ及び２１Ｄ）、ヘモグロビン（図２１Ｂ及び２１Ｅ）、またはヘマトクリット（図２１Ｃ及び２１Ｆ）の著しい増加を誘導しなかった。各グラフの灰色の領域は、このタイプのカニクイザルの各パラメータの正常範囲を示す。結果は、Ｐ６２２及びＰ６２４で処置されたサルにおける血液学的パラメータが、投薬期間中、概して正常な範囲内に留まったことを示す。顕著な臨床徴候または有害事象は報告されなかった。これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤに単一のアミノ酸変異を有するＰ６２２及びＰ６２４によって例示されるような薬剤が、インビボで赤血球量の増加を誘導しなかったことを実証する。結果は、薬剤が非ヒト霊長類において血液学的効果を誘導しなかったことを示し、これらの薬剤のためにヒトでの投薬が、ＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃポリペプチド（例えば、ソタテルセプト）で観察されたように、望ましくない血液学的効果によって制限されない場合があることを示唆する。
実施例５：例示的なＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド構築物は、ラットＰＡＨモデルにおける有効性を示す。
ラットにおける３つの例示的な薬剤、Ｐ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４の有効性を試験するために、それらの対応するヒトＥＣＤ配列を（ヒトＦｃの代わりに）マウスＦｃに融合させて、Ｐ６７０、Ｐ６７１、及びＰ６７４を生成した（Ｐ６７０、Ｐ６７１、及びＰ６７４は、それぞれＰ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４に対応する）。Ｐ６７０、Ｐ６７１、及びＰ６７４のリガンド阻害効力を、アクチビンＡ（図２２Ａ）、アクチビンＢ（図２２Ｂ）、ＧＤＦ－８（図２２Ｃ）、ＧＤＦ－１１（図２２Ｄ）、ＢＭＰ－９（図２２Ｅ）、及びＢＭＰ－１０（図２２Ｆ）に対する細胞ベースのアッセイを使用して試験した。結果は、Ｐ６７０、Ｐ６７１、及びＰ６７４の効力が、それぞれ、それらのヒトＦｃ融合対応物、Ｐ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４の効力と同等であることを確認した。
ラットにおける３つの例示的な薬剤、Ｐ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４の有効性を試験するために、それらの対応するヒトＥＣＤ配列を（ヒトＦｃの代わりに）マウスＦｃに融合させて、Ｐ６７０、Ｐ６７１、及びＰ６７４を生成した（Ｐ６７０、Ｐ６７１、及びＰ６７４は、それぞれＰ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４に対応する）。Ｐ６７０、Ｐ６７１、及びＰ６７４のリガンド阻害効力を、アクチビンＡ（図２２Ａ）、アクチビンＢ（図２２Ｂ）、ＧＤＦ－８（図２２Ｃ）、ＧＤＦ－１１（図２２Ｄ）、ＢＭＰ－９（図２２Ｅ）、及びＢＭＰ－１０（図２２Ｆ）に対する細胞ベースのアッセイを使用して試験した。結果は、Ｐ６７０、Ｐ６７１、及びＰ６７４の効力が、それぞれ、それらのヒトＦｃ融合対応物、Ｐ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４の効力と同等であることを確認した。
次いで、Ｐ６７０、Ｐ６７１、及びＰ６７４を、ラットＰＡＨモデルにおけるＰＡＨ様表現型の救出に対するそれらの効果について試験した。雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（７～９週齢、２２５～２７５ｇ）に、０日目にモノクロタリン（ＭＣＴ；６０ｍｇ／ｋｇ）を注射した。翌日、動物を、Ｐ６７０、Ｐ６７１、及びＰ６７４（１、４、及び１６ｍｇ／ｋｇ；１群当たりｎ＝１６）を用いて処置群間にランダムに分布させ、週２回腹腔内注射した。一部の動物には、ＭＣＴ及びビヒクルが注入され、他の動物は、ナイーブのままであった（ＭＣＴなし）。研究の終了時（２９日目、最初の注射の４週間後）に、全ての動物について心エコー及び血行動態評価を行った。フルトン指数（図２３Ａ～２４Ａ）、平均肺動脈圧（ｍＰＡＰ；図２３Ｂ～２４Ｂ）、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ；図２３Ｃ～２４Ｃ）、右心室自由壁厚さ（ＲＶＦＷＴ；図２３Ｄ～２４Ｄ）、速度時間積分（図２３Ｅ～２４Ｅ）、及び肺動脈加速時間（図２３Ｆ～２４Ｆ）を評価した。
ＭＣＴは、このモデルにおけるＰＡＨの予想される特徴：右心室肥大（フルトン指数［図２３Ａ～２４Ａ］及びＲＶＦＷＴ［図２３Ｄ～２４Ｄ］によって測定される）、ならびに増加したｍＰＡＰ（図２３Ｂ～２４Ｂ）及びＲＶＳＰ（図２３Ｃ～２４Ｃ）を誘導した。ＶＴＩ（図２３Ｅ～２４Ｅ）及びＰＡＡＴ（図２３Ｆ～２４Ｆ）によって評価したように、心臓収縮性も影響を受けた。Ｐ６７０は、１、４、及び１６ｍｇ／ｋｇでのフルトン指数、４及び１６ｍｇ／ｋｇでのｍＰＡＰ、及びＲＶＳＰ、４ｍｇ／ｋｇでのＲＶＦＷＴを著しく減少させた（図２３Ａ～Ｄ）。Ｐ６７０は、ＭＣＴ単独に曝露した動物と比較してＶＴＩに著しく影響を与えず（図２３Ｅ）、４ｍｇ／ｋｇ及び１６ｍｇ／ｋｇでＰＡＡＴを部分的に救出した（図２３Ｆ）。Ｐ６７１（変異したＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ、長いリンカー）は、１６ｍｇ／ｋｇでフルトン指数、ｍＰＡＰ、ＲＶＳＰ、及びＲＶＦＷＴを著しく減少させた（図２３Ａ～Ｄ）。Ｐ６７０とは対照的に、Ｐ６７１はまた、１６ｍｇ／ｋｇでＶＴＩを著しく増加させた（図２３Ｅ）。また、Ｐ６７１は、Ｐ６７０（図２３Ｆ）よりも１６ｍｇ／ｋｇでＰＡＡＴを著しく増加させた。驚くべきことに、Ｐ６７４（変異したＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ、短いリンカー）は、調査した血行動態または心エコー検査パラメータのうちのいずれにも著しい影響を及ぼさなかった（図２３Ａ～Ｆ）。
１６ｍｇ／ｋｇのＰ６７０、Ｐ６７１、またはＰ６７４を注射した動物を、試験薬剤への曝露に基づいて下位分類した。曝露を、７日目～２９日目の各動物についてのＰＫプロファイルの曲線下面積（ＡＵＣ）を算出することによって評価した。この曝露分析に基づいて、動物を三分位数に下位分類した。三分位数１（Ｔ１）は、曝露が最も低い動物を表し、三分位数２（Ｔ２）は、曝露が中程度の動物を表し、三分位数３（Ｔ３）は、曝露が最も高い動物を表した。動物が所与の試験薬剤に対して均等に分布するように、三分位を確立した。
この層別化に基づいて、Ｐ６７０及びＰ６７１は、いくつかの顕著な例外を除いて、２つの群にわたるＴ１、Ｔ２、及びＴ３の間で同等の応答を示した（図２４Ａ～Ｆ）。まず、Ｐ６７１－Ｔ３由来のラットにおけるフルトン指数は、ナイーブ動物と同等であった（図２４Ａ）。第二に、Ｐ６７０－Ｔ３ラットと比較して、ＰＡＡＴの増加は、Ｐ６７１－Ｔ３ラットにおいてより強力であった。両方の観察は、Ｐ６７１からの最大の可能な応答がＰ６７０からのものよりも大きいことを示唆している。驚くべきことに、Ｐ６７４に関しては、曝露三分位数間に明らかな有効性の差はなく、これらの下位群のいずれも、評価されたパラメータにおいて著しい改善を示さなかった（図２４Ａ～Ｆ）。
全体として、これらのデータは、例示的な薬剤Ｐ６７０及びＰ６７１が前臨床ＰＡＨラットモデルにおいて有効であり、Ｐ６７１はいくつかのパラメータをナイーブレベルに回復させることを示唆する。これは、全体として、例示的な薬剤Ｐ６７１がＰ６７０よりも有効であったことを示す。予想外に、Ｐ６７４は、調査したパラメータのいずれに対しても著しい影響を示さなかった。Ｐ６７１とＰ６７４との唯一の違いは、エクトドメインとＦｃとの間のリンカーの長さであることを考えると、これらの結果は、このリンカーの重要性を強調する。
ＰＡＨの特徴は肺血管の筋化であり、これは管腔のサイズを縮小する（平均内側壁厚さ（ＭＴＩ）によって測定される）。ＭＣＴは、ラットにおいて血管筋化を著しく誘導し（図２５Ａ～Ｂ）、この効果は、１６ｍｇ／ｋｇでＰ６７０及びＰ６７１によって低減した（図２５Ａ）。曝露によって層別化した場合、Ｐ６７１は、最も高い曝露三分位においてＰ６７０よりも筋化レベルを低減するように思われたが、この差は統計的に有意ではなかった（図２５Ｂ）。ＭＴＩもまた、ＭＣＴによって増加し（図２５Ｃ～Ｄ）、この効果は、曝露によって動物を層別化した場合でさえ、Ｐ６７１によって著しく低減したが（図２５Ｄ）、Ｐ６７０によっては著しく低減しなかった（図２５Ｃ）。最後に、間質、肺胞出血、及び細胞浸潤におけるフィブリンレベルに基づいて、個々のラットに組織病理学的スコアを与えた。ＭＣＴは、このスコアを著しく増加させ（図２５Ｅ～Ｆ）、この増加は、１６ｍｇ／ｋｇでＰ６７０またはＰ６７１のいずれによっても著しく変化しなかった（図２５Ｅ）。層別化に基づいて、Ｐ６７０ではなくＰ６７１の最も高い曝露三分位数は、組織病理学的スコアを著しく低減した（図２５Ｆ）。
ＰＡＨ関連遺伝子発現変化に対するＰ６７０及びＰ６７１の効果も調べた。ＭＣＴ誘導は、肺におけるＩｎｈｂａ（アクチビンＡをコードする）及びＣｔｇｆ（ＣＴＧＦをコードする）遺伝子発現（図２５Ｇ～Ｈ）、ならびに右心室におけるＮｐｐｂ（ＢＮＰをコードする）及びＣｔｇｆ遺伝子発現（図２５Ｉ～Ｊ）を著しく増加させた。Ｐ６７０は、肺におけるＩｎｈｂａ及びＣｔｇｆの発現には影響を及ぼさず、右心室におけるＮｐｐｂ及びＣｔｇｆの発現にはわずかな影響しか及ぼさなかった（図２５Ｇ～Ｊ）。Ｐ６７１は、肺におけるＣｔｇｆ発現レベルに著しい影響を与えなかった（図２５Ｈ）が、肺におけるＩｎｈｂａの発現レベル、及び右心室におけるＮｐｐｂ及びＣｔｇｆの発現レベルは著しく減少した（図２５Ｇ～Ｊ）。右心室におけるＮｐｐｂの場合、これらのレベルをＰ６７１でナイーブレベルに戻した（図２５Ｉ）。Ｎｐｐａ発現も調査し、Ｐ６７０及びＰ６７１の両方が、ＭＣＴ誘導Ｎｐｐａ発現を著しく比較可能に減少させたことが観察された（図２５Ｋ）。Ｐ６７４に関しても、再び予期せぬことに、肺におけるＩｎｈｂａまたはＣｔｇｆの発現（図２５Ｇ～Ｈ）にも、右心室におけるＣｔｇｆまたはＮｐｐａの発現にも影響を及ぼさなかった（図２５Ｊ～Ｋ）。Ｐ６７４は、右心室におけるＮｐｐｂ ｍＲＮＡレベルを著しく減少させた（図２５Ｉ）。
これらの結果は、より長いリンカー長に加えて、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤに単一のアミノ酸変異を有する、Ｐ６７１によって例示されるものなどの薬剤が、動物モデルにおいてインビボでＰＡＨ様表現型を救助することができることを実証する。この結果は、肺高血圧症の治療におけるかかる薬剤の潜在的な治療的使用を強く支持する。
このげっ歯類ＰＡＨモデルにおける例示的な薬剤Ｐ６７０及びＰ６７１の効果を更に比較するために、右心室（ＲＶ）からの試料に対してＲＮＡシーケンシングを行った。１群当たり３匹の動物（ナイーブ、ＭＣＴ単独、ＭＣＴ＋Ｐ６７０［１６ｍｇ／ｋｇ］、及びＭＣＴ＋Ｐ６７１［１６ｍｇ／ｋｇ］）を選択した。ＭＣＴ単独群では、最悪の疾患状態を有した動物（ｍＰＡＰ及びＲＶＳＰによって評価される）、ならびにＰ６７０及びＰ６７１群では、薬剤への曝露が最も高かった動物を選択した。ＲＮＡをＲＶから抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳとのペアエンド１５０ｂｐ配列決定によって配列決定した。ＦａｓｔＱＣ（ｖ０．１１．９）を使用して、生データの品質を検証した。全ての塩基は、少なくともＱ３４の品質スコアを有していた。リードを、ＨＩＳＡＴ２（ｖ．２．２．１）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５）を使用して参照ゲノムｒｎ６に整列させた後、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ（ｖ２．０．３）で要約した（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＤＥＳｅｑ２（バージョン１．３６．０）を使用して、差次的発現分析を行った（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ｐ値が０．０５未満の調節された遺伝子（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法）を、差次的に発現された遺伝子（ＤＥＧ）として分類した。
全てのＤＥＧ（ナイーブとＭＣＴビヒクル群との間、図２５Ｌ）を見ると、偏りのないクラスタリングは、Ｐ６７１処置群がナイーブ群に近いクラスタリングを示し、Ｐ６７０処置群はＭＣＴビヒクル処置群に近いクラスタリングを示した。これらのデータにより、Ｐ６７１が、Ｐ６７０と比較して、遺伝子発現レベルでより顕著な逆リモデリング効果を有していたことが示唆される。更に、ＰＡＨ病態生理学に関連する所与のＫＥＧＧ経路（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ、経路マッピングのための参照データベース）（図２５Ｍ）を具体的に見ると、同様の観察がなされ得る。Ｐ６７１処置動物は、ナイーブ動物と同等のヒートマップ署名を有し、一方、Ｐ６７０処置動物は、よりＭＣＴビヒクル動物に似ていた。
更に、ナイーブ動物を参照群として使用する場合、ＭＣＴ処置動物は、ＲＶにおいて２，０６８個の上方制御遺伝子及び１，６８７個の下方制御遺伝子を示した（図２５Ｎ）。Ｐ６７０は、ナイーブ動物に対して１，７２０個の上方制御遺伝子及び１，１０３個の下方制御遺伝子を有する、このプロファイルに対して適度な効果を有した（図２５Ｎ）。Ｐ６７１は、ナイーブ動物と比較してわずか５８個の上方制御された遺伝子及び６０個の下方制御された遺伝子を有する、ＭＣＴ処置動物の遺伝子発現シグネチャのほぼ完全な救出を示した（図２５Ｎ）。ＭＣＴビヒクル群を参照として使用する場合、同様の結論が得られ（図２５Ｏ）、ナイーブ及びＰ６７１処置動物は、ＭＣＴビヒクル動物との最大の差を示した。
まとめると、これらの遺伝子発現結果は、ＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃ（Ｐ６７０、Ｐ４４４のマウスバリアント）と比較した例示的な薬剤Ｐ６７１（Ｐ６２２のマウスバリアント）の優れたインビボ有効性を再び示す。結果は、かかる例示的な薬剤が、患者において増加した治療上の利益を提供し得ることを示唆する。
ＭＣＴ表現型を駆動するシグナル伝達経路に対する例示的な薬剤Ｐ６７０、Ｐ６７１、及びＰ６７４の効果を更に理解するために、ＭＣＴ処置動物において調節解除されることが知られている上位８つのＫＥＧＧ用語と関連付けられた遺伝子を示す火山プロットを生成した（すなわち、ナイーブと比較して著しく上方制御または下方制御された）。図３５に示されるように、Ｐ６７０及びＰ６７４は、ＭＣＴ駆動遺伝子、特にＴＧＦ－β経路（例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、Ｉｎｈｂｂ）に関連する遺伝子、及び心不全に関連する遺伝子経路（例えば、Ｎｐｐａ、Ｎｐｐｂ、Ｓｐｐ１）にわずかな効果しか有しなかった。逆に、Ｐ６７１は、これらの経路の発現レベルをほぼナイーブレベルに正規化した。これらのデータは、Ｐ６７４と比較したＰ６７１の優れたインビトロ効力プロファイルが、驚くほど異なるインビボ薬理学的プロファイル、すなわち、Ｐ６７１及びＰ６７４が、ＴＧＦ－βスーパーファミリーシグナル伝達及びＰＨ及び心不全などの病理学的状態に関連する異なる影響を受けた経路に翻訳されたことを示す。これらの結果は、リガンドの改善された阻害及び増加したインビボの有効性の達成に関して、本開示の例示的な薬剤の潜在的な治療上の利益を更に強調する。
実施例６：例示的なＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド構築物は、ＰＡＨ関連インビトロモデルにおけるサイトカイン誘導性の遺伝子発現の変化を効率的に防止する。
例示的な薬剤Ｐ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４を、ＰＡＨ関連細胞モデルの文脈で調べた。初代ヒト肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ；Ｌｏｎｚａ ＣＣ－２５８１）を培養中に維持し、Ｐ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４の存在下または非存在下でサイトカインで処理した。翌日、ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを生成した。ＡＣＴＡ２、ＣＴＧＦ、及びＩＮＨＢＡ（二量体アクチビン及び阻害タンパク質複合体のアクチビンＡサブユニットをコードする）のｍＲＮＡ発現レベルを、ＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子である）と比較して評価した。
例示的な薬剤Ｐ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４を、ＰＡＨ関連細胞モデルの文脈で調べた。初代ヒト肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ；Ｌｏｎｚａ ＣＣ－２５８１）を培養中に維持し、Ｐ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４の存在下または非存在下でサイトカインで処理した。翌日、ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを生成した。ＡＣＴＡ２、ＣＴＧＦ、及びＩＮＨＢＡ（二量体アクチビン及び阻害タンパク質複合体のアクチビンＡサブユニットをコードする）のｍＲＮＡ発現レベルを、ＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子である）と比較して評価した。
ＡＣＴＡ２及びＣＴＧＦは、インビトロでヒトＰＡＳＭＣにおいてアクチビン及びＧＤＦによって高度に誘導されることが報告されている２つの重要な遺伝子である（Ｙｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。両方の遺伝子は、前臨床ＰＡＨモデル及びＰＡＨ患者において上方制御されるため、ＰＡＨに関連する（Ｃａｌｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｐｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｓｅｖｉｌｌａ－Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。
試験した全てのサイトカイン（アクチビンＡ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びアクチビンＡＢ）は、ＰＡＳＭＣにおけるＡＣＴＡ２及びＣＴＧＦの発現を著しく誘導した（図２６Ａ～Ｄ）。（アクチビンＡＢは、２つのインヒビンβＡサブユニット［ＩＮＨＢＡ］のホモ二量体であるアクチビンＡ、及び２つのインヒビンβＢサブユニット［ＩＮＨＢＢ］のホモ二量体であるアクチビンＢと比較して、インヒビンβＡ及びインヒビンβＢサブユニットで構成されるヘテロ二量体である）。ＩＮＨＢＡの誘導は、観察された適度な誘導に起因して、これらの実験において一貫して評価されなかった（データは図示せず）。Ｐ４４４（３．７ｎＭ）は、ＧＤＦ－８－、ＧＤＦ－１１、及びアクチビンＡＢ誘導ＡＣＴＡ２及びＣＴＧＦ ｍＲＮＡレベルを著しく低減したが、それらは依然としてビヒクルと比較して高かった（図２６Ｂ～Ｄ）。Ｐ４４４は、アクチビンＡ誘導遺伝子発現に著しく影響しなかった（図２６Ａ）。他方では、Ｐ６２２（３．７ｎＭ）は、アクチビンＡ－、ＧＤＦ－８－、ＧＤＦ－１１－、及びアクチビンＡＢ誘導ＡＣＴＡ２及びＣＴＧＦ ｍＲＮＡレベルを著しく阻害したが、これはビヒクル（図２６Ａ～Ｄ）（アクチビンＡ誘導ＣＴＧＦ発現、これはＰ６２２によって部分的にのみ阻害された）（図２６Ａ）とは著しく異なるものではなかった。Ｐ６２４は、Ｐ６２２と比較して、アクチビンＡ誘導遺伝子発現に対してそれほど有効ではなかったが（図２６Ａ）、ＧＤＦ－８及びＧＤＦ－１１誘導遺伝子発現に対して同等の効果を有した（図２６Ｂ～Ｃ）。これらの結果は、細胞ベースのレポーターアッセイからのものと一致する（実施例１を参照）。これらのデータは、（Ｐ６２４と比較して）Ｐ６２２で使用されるより長いリンカーが、アクチビンＡなどのある特定のリガンドに対する効力を最大化するために必要であることを更に示す。
同様の実験を、サイトカインの組み合わせ：ａ）アクチビンＡ＋ＧＤＦ－８（図２７Ａ～Ｃ）、ｂ）アクチビンＡ＋ＧＤＦ－１１（図２７Ｄ～Ｆ）、ｃ）ＧＤＦ－８＋ＧＤＦ－１１（図２８Ａ～Ｃ）、及びｄ）アクチビンＢ＋ＧＤＦ－８（図２８Ｄ～Ｆ）を使用して実施した。これらの実験には、２つの異なる濃度のＰ４４４及びＰ６２２を使用した（３．７及び３３．３ｎＭ）。平均して、３．７ｎＭのＰ６２２は、試験したサイトカインの任意の組み合わせについて、同じ濃度のＰ４４４よりもＡＣＴＡ２、ＣＴＧＦ、及びＩＮＨＢＡの誘導を一貫して低減した（図２７及び２８）。３３．３ｎＭで、２つの薬剤は互いに同等であり、誘導を著しく低減し、ビヒクル処理条件と同様の発現レベルをもたらした。
これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤに単一のアミノ酸変異を有するＰ６２２が、インビトロで、関連するＰＡＨ関連細胞系における疾患関連遺伝子標的の誘導を阻害するのに有効であったことを実証する。これらのデータはまた、サイトカインが単独で使用されたか、または併用で使用されたかにかかわらず、この文脈におけるＰ６２２のＰ４４４に対する優位性を示す。
実施例７：例示的なＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド構築物は、ＳＭＡＤリン酸化及びＴＧＦ－β関連遺伝子発現レベルを低下させる。
ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド構築物が関連する組織（例えば、肺）にそれらの標的を係合させることができるかどうかを試験するために、例示的な薬剤Ｐ７５、Ｐ１２１、Ｐ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４を、３０ｍｇ／ｋｇ及び／または５０ｍｇ／ｋｇの濃度でマウスに注射した。単回注射の４日後、リン酸化ＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２；図２９Ａ）及びＳＭＡＤ３（ｐＳＭＡＤ３；図２９Ｂ－Ｃ）レベルの両方における用量依存的減少が、マウス肺において観察された。驚くべきことに、３０ｍｇ／ｋｇのｐＳＭＡＤ３上のＰ６２４を除いて、各々のそれぞれの用量で、全ての試験薬剤は同等であった（図２９Ｂ）。これらのデータは、Ｐ６２４と比較してＰ６２２によって示される優れた効力プロファイルが、インビボで最大の標的関与を行うために必要であることを更に示す。
ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド構築物が関連する組織（例えば、肺）にそれらの標的を係合させることができるかどうかを試験するために、例示的な薬剤Ｐ７５、Ｐ１２１、Ｐ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４を、３０ｍｇ／ｋｇ及び／または５０ｍｇ／ｋｇの濃度でマウスに注射した。単回注射の４日後、リン酸化ＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２；図２９Ａ）及びＳＭＡＤ３（ｐＳＭＡＤ３；図２９Ｂ－Ｃ）レベルの両方における用量依存的減少が、マウス肺において観察された。驚くべきことに、３０ｍｇ／ｋｇのｐＳＭＡＤ３上のＰ６２４を除いて、各々のそれぞれの用量で、全ての試験薬剤は同等であった（図２９Ｂ）。これらのデータは、Ｐ６２４と比較してＰ６２２によって示される優れた効力プロファイルが、インビボで最大の標的関与を行うために必要であることを更に示す。
加えて、３０ｍｇ／ｋｇの例示的な薬剤Ｐ７５、Ｐ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４の注射の４日後に、マウス肺における遺伝子発現レベルを評価した（図３０）。Ｐ６２２及びＰ６２４の両方が、Ｐ７５もＰ４４４も、ビヒクルと比較してＩｎｈｂａ遺伝子発現レベルを著しく低減した（図３０Ａ）。更に、Ｐ６２４は、ビヒクルと比較してＧｄｆ１１遺伝子発現レベルを著しく減少させ（図３０Ｂ）、Ｐ６２２は、同様の傾向を示した。例示的な薬剤のいずれも、ビヒクルと比較してＳｅｒｐｉｎｅ１ ｍＲＮＡレベルに著しい影響を及ぼさなかった（図３０Ｃ）。
これらの結果は、変異したＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤを含むＰ１２１、Ｐ６２２、及びＰ６２４が、疾患関連組織（肺）における標的関与の徴候を示したことを実証する。特に、Ｐ６２２及びＰ６２４は、Ｉｎｈｂａ遺伝子発現の阻害において、Ｐ７５及びＰ４４４よりも優れていた。この結果は、アクチビンＡリガンドをＰ７５及びＰ４４よりも強力に中和することに加えて、Ｐ６２２及びＰ６２４がインビボでの内因性アクチビンＡ遺伝子発現をＰ７５及びＰ４４４よりもより効果的に低減することを示す。
実施例８：例示的なＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤポリペプチド構築物は、インビボでアクチビン及びＧＤＦとの係合に成功し、優れた効力を示す。
野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（８～１０週齢）に、１、３、１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇの用量で、例示的な試験薬剤Ｐ７５、Ｐ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４を週２回、３週間にわたって皮下的に注射した。全ての動物の体重を週２回記録し、研究の終了時に筋肉（腓腹筋及び前脛骨筋）、血漿、及び下垂体を収集した。
野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（８～１０週齢）に、１、３、１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇの用量で、例示的な試験薬剤Ｐ７５、Ｐ４４４、Ｐ６２２、及びＰ６２４を週２回、３週間にわたって皮下的に注射した。全ての動物の体重を週２回記録し、研究の終了時に筋肉（腓腹筋及び前脛骨筋）、血漿、及び下垂体を収集した。
Ｐ７５は、３ｍｇ／ｋｇ以上の用量で、全体重の増加（図３１Ａ）及び誘導性筋肥大（図３１Ｂ～Ｃ）を引き起こした。Ｐ４４４（ＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃ）は、２５及び５０ｍｇ／ｋｇの用量で筋肉肥大を著しく誘導したが（図３１Ｂ～Ｃ）、最大５０ｍｇ／ｋｇの全体重には著しい影響をもたらさなかった（図３１Ａ）。Ｐ６２２及びＰ６２４の両方が、試験した最低用量（１ｍｇ／ｋｇ；図３１Ａ）を含む全身重量、ならびに３ｍｇ／ｋｇ以上の筋肉重量に著しい影響を有した（図３１Ｂ～Ｃ）。他のインビボ有効性研究で観察されたように、Ｐ６２２は、Ｐ７５及びＰ６２４と比較して、全身重量（図３１Ａ）及び腓腹筋肥大（図３１Ｂ）に対して全体的により大きな有効性を示した。これらのデータは、例示的な薬剤Ｐ６２２のように、ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤとＦｃドメインとの間のより長いリンカー配列の利点を確認する。
アクチビンシグナル伝達の阻害に関連している、ヒトにおけるＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃ、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ及びビマグルマブの投与後に、血漿卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）レベルの低減が観察されている（Ｇａｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｒｕｃｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ａｔｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。血漿ＦＳＨレベルへの影響を、例示的な薬剤の投与後のマウスにおいて調べた。Ｐ７５は、血漿ＦＳＨレベル（図３１Ｄ）または下垂体Ｆｓｈｂ（ＦＳＨβサブユニットをコードする）ｍＲＮＡレベル（図３１Ｅ）に著しい影響を有しなかった。Ｐ４４４は、５０ｍｇ／ｋｇで血漿ＦＳＨレベルを著しく減少させたが（約５０％減少、図３１Ｄ）、Ｆｓｈｂ ｍＲＮＡレベルに著しい影響はなかった（図３１Ｅ）。Ｐ６２２は、３ｍｇ／ｋｇ以上の用量で血漿ＦＳＨレベルを有意に減少させ（図３１Ｄ）、対照と比較して５０ｍｇ／ｋｇでＦＳＨレベルを約９３％低下させた。Ｐ６２２はまた、１ｍｇ／ｋｇの用量で下垂体Ｆｓｈｂ ｍＲＮＡレベルを低下させた（図３１Ｅ）。
Ｐ６２２、Ｐ７５、及びＰ４４４の曝露－標的係合関係を、血漿ＦＳＨ及び下垂体Ｆｓｈｂ発現の低減を、対応する曝露（各動物におけるそれぞれの薬剤の曲線下面積（ＡＵＣ））と相関させることによって更に調査した。曝露解析は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（Ｃｅｔｅｒａ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）を使用した非コンパートメント解析（ＮＣＡ）によって行った。曝露は、研究の過程にわたる各被験試料及び用量レベルの完全なＰＫプロファイルから算出した。全ての動物をこの分析に含めた。
各例示的な薬剤について、赤池情報基準（ＡＩＣｃ）を使用して、線形回帰と４パラメータ対数回帰との間のモデル比較分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９．０）を実施した。ビヒクル群を１（ｘ＝０で±ＳＥＭ）に設定し、各回帰をその点を横切るように拘束した。データに最も適合するモデルを、所与の読み出しのために選択した。
Ｐ７５及びＰ４４４への同様の曝露でのＰ６２２は、ＦＳＨレベル及びＦｓｈｂ ｍＲＮＡレベルのより大きな減少を誘導し、血漿タンパク質及び遺伝子発現レベルの両方でのＦＳＨのほぼ完全な抑制に対応する全体的な下部プラトーに達した（図３２Ａ～Ｂ）。
全体として、これらのデータは、Ｐ６２２がインビボで用量依存的な様式で関連するＴＧＦ－βスーパーファミリーメンバーとの係合に成功し、Ｐ７５及びＰ４４４と比較して優れた効力を示したことを示す。
腓腹筋におけるＭｓｓ５１及びＩｇｆ２遺伝子発現に対する例示的な薬剤Ｐ４４４及びＰ６２２の効果について更に分析を実施した（図３３）。Ｐ４４４は、Ｍｓｓ５１（図３３Ａ）またはＩｇｆ２（図３３Ｂ）のいずれにも影響を及ぼさなかった。一方、Ｐ６２２は、Ｍｓｓ５１遺伝子発現レベルを著しく用量依存的に低下させ（図３３Ａ）、これは、以前に大腿四頭筋（図１９Ｅ）で観察されたものと同等であった。腓腹筋において、Ｐ６２２は、Ｉｇｆ２ ｍＲＮＡレベルに対して中程度の影響を及ぼした（図３３Ｂ）。
Ｐ６２２及びＰ４４４の曝露－標的係合関係を、（上述のように）Ｍｓｓ５１遺伝子発現の変化を各動物におけるそれぞれの薬剤の対応する曝露（ＡＵＣ）と相関させることによって更に調査した。Ｐ４４４への同様の曝露でのＰ６２２は、Ｍｓｓ５１の発現のほぼ完全な抑制に対応する全体的により低いプラトーに達するＭｓｓ５１ ｍＲＮＡレベルのより大きな減少を誘導した（図３４）。これらのＭｓｓ５１及びＩｇｆ２遺伝子発現データは、Ｐ４４４と比較して、Ｐ６２２の優れた効力を更に実証する。
本発明は、その実施形態を参照して詳細に説明されるが、これらの実施形態は、本発明を例示するために提供されるが、本発明を限定するものではない。本発明の原理を採用し、本明細書に添付の特許請求の範囲によって定義されるその趣旨及び範囲内に入る他の実施形態を作成することが可能である。
Claims (122)
- ポリペプチドであって、
ａ．アクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）エクトドメイン（ＥＣＤ）バリアントと、
ｂ．少なくとも１０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーと、
ｃ．Ｆｃドメイン単量体と、
を含む、前記ポリペプチド。 - 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号２のヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤと比較して、Ｇ２７、Ｑ２９、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｓ３８、Ｄ５７、Ｆ５８、Ｖ７５、及びＦ７７から選択される位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、アミノ酸置換Ｇ２７Ｄを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号２０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、アミノ酸置換Ｑ２９Ｙを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、アミノ酸置換Ｄ３０Ｑを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号１５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、アミノ酸置換Ｋ３１Ｙを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号１６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、アミノ酸置換Ｓ３８Ｒを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号１７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、アミノ酸置換Ｄ５７Ｅを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、Ｆ５８Ｄ、Ｆ５８Ｅ、Ｆ５８Ｙ、Ｆ５８Ｋ、Ｆ５８Ｑ、Ｆ５８Ｎ、Ｆ５８Ｒ、Ｆ５８Ｈ、及びＦ５８Ｗから選択される、位置Ｆ５８のアミノ酸置換を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｄを含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｅを含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
- 前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｙを含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のポリペプチド。
- 前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｋを含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のポリペプチド。
- 前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｑを含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
- 前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｗを含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
- 前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｎを含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号１１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のポリペプチド。
- 前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｈを含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載のポリペプチド。
- 前記バリアントが、アミノ酸置換Ｆ５８Ｒを含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号１２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、アミノ酸置換Ｖ７５Ｑを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号１８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、アミノ酸置換Ｆ７７Ｄを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤが、配列番号１９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントが、１つ以上の追加のアミノ酸置換を更に含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤバリアントが、Ｎ末端に以下のアミノ酸：ＧＲＧＥＡ（配列番号２３）を更に含む、請求項１～３８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｎ末端からＣ末端に、以下の構造：ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤ－ペプチドリンカー－Ｆｃドメイン単量体を含む、請求項１～３９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃドメイン単量体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１～４０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃドメイン単量体が、ヒトＦｃドメイン単量体またはマウスＦｃドメイン単量体である、請求項１～４１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃドメイン単量体が、前記ポリペプチドの二量体の凝集を低減するか、またはその安定性を調節するように操作される、請求項１～４２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃドメイン単量体が、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）のアミノ酸置換を含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃドメイン単量体が、前記Ｍ２５２Ｙアミノ酸置換を含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃドメイン単量体が、３５６位にＤ、及び３５８位にＬ（ＤＬ）を含む、請求項４１～４５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃドメイン単量体が、３５６位にＥ、及び３５８位にＭ（ＥＭ）を含む、請求項４１～４５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃドメイン単量体が、前記Ｃ末端にリジン残基（Ｋ）を更に含む、請求項４１～４７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃドメイン単量体が、配列番号１３４～１７３及び３３８のうちのいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～４８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃドメイン単量体が、配列番号１３４～１７３及び３３８のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項４９に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃドメイン単量体が、
ａ．ＩｇＧ１アイソタイプであり、配列番号１３５もしくは配列番号１３４に示されるアミノ酸配列を含むか、もしくはそれからなる、または
ｂ．ＩｇＧ２アイソタイプであり、配列番号１５７に示されるアミノ酸配列を含むか、もしくはそれからなる、請求項４９または５０に記載のポリペプチド。 - 前記Ｆｃドメイン単量体が、前記Ｃ末端にリジン残基（Ｋ）を更に含む、請求項４９～５１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃドメイン単量体が、二量体を形成する、請求項１～５２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ペプチドリンカーが、グリシンリッチである、請求項１～５３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ペプチドリンカーが、１０～４０アミノ酸長である、請求項１～５４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記リンカーが、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１９アミノ酸長、または少なくとも３９アミノ酸長である、請求項５５に記載のポリペプチド。
- 前記リンカーが、１０アミノ酸長、１４アミノ酸長、１９アミノ酸長、または３９アミノ酸長である、請求項５５に記載のポリペプチド。
- 前記リンカーが、１４アミノ酸長である、請求項５５に記載のポリペプチド。
- 前記ペプチドリンカーが、配列番号３４、５４、５９、または６３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項５４～５８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤが、配列番号４～２２、３３１、３３２、及び２４～３３のうちのいずれか１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～５９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤが、配列番号４～２２、３３１、３３２、及び２４～３３のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～５９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤが、配列番号５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはそれからなる、請求項６０に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤが、配列番号８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはそれからなる、請求項６０に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤが、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはそれからなる、請求項６０に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号１７４～２５４、３３３、及び３３９～３４１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号１７４～２５４、３３３、及び３３９～３４１から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号１８６、１９０～１９４、２３２～２３３、及び２４７～２４８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号１８６、１９０～１９４、２３２～２３３、及び２４７～２４８から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号１８６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号２１３～２１６及び２４２～２４４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号２１３～２１６及び２４２～２４４から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号２２０～２２３、２５３、及び２５４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号２２０～２２３、２５３、及び２５４から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- リンカーを介して、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤのＮ末端またはＣ末端に融合したアルブミン結合ドメイン、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミンドメインを更に含む、請求項１～７３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの前記Ｎ末端に配列番号１のシグナルペプチドを更に含む、請求項１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、標的化剤、治療部分、検出可能部分、または診断部分とコンジュゲートされている、請求項１～７５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記標的化剤、前記治療部分、前記検出可能部分、または前記診断部分が、抗体またはその抗原結合断片、前記ＴＧＦβスーパーファミリーの別のメンバーに対して、もしくは別の治療標的に対して親和性を有する結合剤、放射線療法剤、イメージング剤、蛍光部分、細胞傷害性剤、抗有糸分裂薬、ナノ粒子ベースの担体、ポリマーコンジュゲート薬、ナノ担体、イメージング剤、安定化剤、薬物、ナノ担体、またはデンドリマーを含む、請求項７６に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、前記第１のポリペプチドの前記Ｆｃドメイン単量体と前記第２のポリペプチドの前記Ｆｃドメイン単量体との間の少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む二量体を形成する、請求項１～７７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、前記第１のポリペプチドの前記Ｆｃドメイン単量体と前記第２のポリペプチドの前記Ｆｃドメイン単量体との間の少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結される、請求項１～７７のいずれか１項に記載の第１のポリペプチド及び請求項１～７７のいずれか１項に記載の第２のポリペプチドを含む、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合剤。
- 前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、配列番号１７４～２５４、３３３、及び３３９～３４１から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７９に記載の結合剤。
- 前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、配列番号１８６、１９０～１９４、２３２～２３３、及び２４７～２４８から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７９に記載の結合剤。
- 前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、配列番号１８６、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７９に記載の結合剤。
- 前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、配列番号２１３～２１６及び２４２～２４４から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７９に記載の結合剤。
- 前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、配列番号２２０～２２３、２５３、及び２５４から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７９に記載の結合剤。
- 前記ポリペプチドが、ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／または骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）－１０に結合し、ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤのヒトＢＭＰ－９への結合と比較して、ヒトＢＭＰ－９への結合が低減している、請求項１～７８のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項７９～８４のいずれか１項に記載の結合剤。
- 前記ポリペプチドが、ヒトＢＭＰ－９に実質的に結合しない、請求項８５に記載のポリペプチドまたは結合剤。
- 前記ポリペプチドが、ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上のシグナル伝達を阻害する、請求項８５または８６に記載のポリペプチドまたは結合剤。
- 前記ポリペプチドが、ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達を阻害しない、請求項８５～８７のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは結合剤。
- ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対する前記ポリペプチドの阻害効力が、ヒトＢＭＰ－９シグナル伝達に対するヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの阻害効力と比較して約１００倍、約２００倍、または約３００倍低い、請求項８５～８８のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは結合剤。
- ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上に対する前記ポリペプチドの前記阻害効力が、同じそれぞれのリガンド（複数可）に対するヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの前記阻害効力と実質的に同じであるか、またはそれと比較して増加している、請求項８５～８９のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは結合剤。
- ヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上に対する前記ポリペプチドの前記阻害効力が、同じそれぞれのリガンド（複数可）に対する前記ヒト野生型ＡｃｔＲＩＩＢ－ＥＣＤの前記阻害効力と比較して約２倍、約３倍、約４倍、または約５倍以上増加する、請求項９０に記載のポリペプチドまたは結合剤。
- 請求項１～７８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
- 配列番号２５６～３３０、３３４、または３４２～３４４のうちのいずれか１つと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項９２に記載の核酸分子。
- 配列番号２５６～３３０、３３４、または３４２～３４４のうちのいずれか１つの核酸配列を含むか、またはそれからなる、核酸分子。
- 配列番号２５５に示される配列を、前記核酸分子の５’末端に更に含む、請求項９２～９４のいずれか１項に記載の核酸分子。
- 請求項９２～９５のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 前記核酸分子または前記ベクターが、前記宿主細胞内で発現される、請求項９２～９５のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項９６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- ａ．請求項９２～９５のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項９６に記載のベクターを含む、宿主細胞を提供することと、
ｂ．前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養することと、
ｃ．発現されたポリペプチドを培養物から回収することと、を含む、請求項１～７８のいずれか１項に記載のポリペプチドを調製する、方法。 - 請求項１～７８のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項７９～９１のいずれか１項に記載の結合剤、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
- 前記組成物が、注射または注入による投与用に製剤化される、請求項９９に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物が、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与用に製剤化されている、請求項１００に記載の薬学的組成物。
- 前記ポリペプチドまたは結合剤が、対象において血管合併症を引き起こさず、及び／または前記対象において血管透過性もしくは漏出を増加させない、請求項９９～１０１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
- 前記ポリペプチドまたは結合剤が、赤血球質量を増加させず、ヘモグロビンを増加させず、血小板減少症を引き起こさず、及び／または対象において血液合併症を引き起こさない、請求項９９～１０２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
- 請求項１～７８のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７９～９１のいずれか１項に記載の結合剤、または請求項９９～１０３のいずれか１項に記載の薬学的組成物、及び任意選択で、使用説明書を含む、キット。
- ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達と関連する疾患または状態を治療または予防することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、請求項１～７８のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７９～９１のいずれか１項に記載の結合剤、または請求項９９～１０３のいずれか１項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項１０５に記載の方法。
- 前記ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドが、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及びＢＭＰ－１０のうちの１つ以上である、請求項１０５または１０６に記載の方法。
- 対象においてアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１、及び／またはＢＭＰ－１０によって媒介された疾患または状態を治療または予防する方法であって、請求項１～７８のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７９～９１のいずれか１項に記載の結合剤、または請求項９９～１０３のいずれか１項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
- 前記疾患または前記状態が、アクチビンＡ及び／またはアクチビンＢ及び／またはＧＤＦ－８及び／またはＧＤＦ－１１の過剰発現または過剰活性化を特徴とする、請求項１０８に記載の方法。
- 前記疾患または前記状態が、肺高血圧症（ＰＨ）、線維症、筋力低下または萎縮、代謝障害、心臓代謝性疾患、骨損傷、及び低い赤血球レベルから選択される、請求項１０５～１０９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＰＨが、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）である、請求項１１０に記載の方法。
- 前記ＰＡＨが、感染症、先天性心臓異常、門脈高血圧症、肺静脈閉塞性疾患、肺毛細血管腫症、結合組織障害、慢性閉塞性肺疾患、自己免疫障害（例えば、強皮症もしくはループス）、または薬物使用（例えば、コカインもしくはメタンフェタミンの使用）と関連する特発性ＰＡＨ、遺伝性ＰＡＨ、またはＰＡＨである、請求項１１１に記載の方法。
- 前記線維症が、肺線維症、特発性肺線維症、腎線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝線維症、肺線維症、腎線維症（ｋｉｄｎｅｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、骨髄線維症、全身性硬化症、皮膚線維症、心臓線維症、骨髄線維症、角膜線維症、縦隔線維症、後腹膜線維症、骨関節線維症、関節線維症、組織線維症、線維腫増殖性障害、または結合組織障害である、請求項１１０に記載の方法。
- 前記筋力低下または萎縮疾患もしくは状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、サルコペニア、またはがん悪液質である、請求項１１０に記載の方法。
- 前記代謝障害が、肥満、１型糖尿病、２型糖尿病、または前糖尿病である、請求項１１０に記載の方法。
- 前記心臓代謝性疾患または状態が、駆出率低下を伴う心不全（ＨＦｒＥＦ）または駆出率維持を伴う心不全（ＨＦｐＥＦ）である、請求項１１０に記載の方法。
- 前記骨損傷が、骨脱塩、骨粗しょう症（例えば、原発性もしくは二次性）、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくはがん転移関連の骨損失、パジェット病、腎性骨ジストロフィー、治療関連の骨損失、食事関連の骨損失、肥満の治療に関連する骨損失、低重力関連の骨損失、または不動性関連の骨損失を含む、請求項１１０に記載の方法。
- 低い血球レベルの疾患または状態が、貧血または失血である、請求項１１０に記載の方法。
- 対象においてＢＭＰ９シグナル伝達を実質的に低減または阻害することなく、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１及び／またはＢＭＰ１０シグナル伝達を低減または阻害することを必要とする前記対象においてそれを行う方法であって、請求項１～７８のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７９～９１のいずれか１項に記載の結合剤、または請求項９９～１０３のいずれか１項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
- 前記対象が、哺乳類である、請求項１１９に記載の方法。
- 前記哺乳類が、ヒトである、請求項１２０に記載の方法。
- 前記方法が、対象において血管合併症を引き起こさず、対象において血管透過性もしくは漏出を増加させず、赤血球質量を増加させず、ヘモグロビンを増加させず、血小板減少を引き起こさず、及び／または対象において血液合併症を引き起こさない、請求項１０５～１２１のいずれか１項に記載の方法。
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