JP2025500728A - 免疫細胞培養物を産生するための方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、完全閉鎖系を利用して免疫細胞培養物を産生する方法を提供する。【選択図】図１

Description

本開示は、完全閉鎖系において免疫細胞培養物を産生するための方法を提供する。特に、本開示は、免疫細胞培養物の上流の産生及び下流の処理のためのプロセスに関する。

免疫細胞療法は、遺伝子操作された免疫細胞を使用して、がん細胞を効率的に標的化し、破壊する疾患治療のクラスである。例えば、養子細胞療法は、がん細胞上のある特定のタンパク質に結合するように設計されたキメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を使用する。がんの治療におけるＣＡＲ Ｔ細胞の使用は、顕著な腫瘍特異性及び堅牢な抗腫瘍免疫応答を示し、完全な応答をもたらした。現在までに、ＦＤＡは、以下の４つの自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法製品を承認している：急性リンパ芽球性白血病のためのチサゲンレクルユーセル（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、２０１７）、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫のためのアキシカブタゲンシロルユーセル（Ｇｉｌｅａｄ、２０１７）、２０２０年にマントル細胞リンパ腫及び２０２１年に再発性又は難治性Ｂ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）のためのブレクスカブタジェンアウトルーセル（Ｇｉｌｅａｄ）、並びに再発性又は難治性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫のためのリソカブタゲンマラルユーセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、２０２１）（Ｙｏｕｎｇ，Ｃ．Ｍ．，Ｃ．Ｑｕｉｎｎ，ａｎｄ Ｍ．Ｒ．Ｔｒｕｓｈｅｉｍ，Ｄｕｒａｂｌｅ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐａｔｉｅｎｔ ａｎｄ ｆｉｎａｎｃｉａｌ ｉｍｐａｃｔ：ＵＳ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｐｐｒｏｖａｌｓ，ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ，ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｅｖｅｎｕｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２０２１）。

自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、顕著な有効性を示すが、いくつかの制限を受ける。自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、患者からのＴ細胞採取、続いて、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変及び増殖が必要であり、少なくとも２週間かかる可能性がある。このプロセス中、Ｔ細胞の増殖は、インプットの品質特性に依存し、患者のＴ細胞の品質を最適化することができないことが収率の低下につながる可能性があるため、侵襲性腫瘍の進行が、致命的となる可能性がある。腫瘍浸潤白血球の増殖は、リンパ球が複数の腫瘍関連抗原に対してプライミングされるため、魅力的な戦略を提供する。しかしながら、それらは表現型が枯渇し及び複製能力が限定されるために、それらのエクスビボでの増殖は、効果的ではない。上記に加えて、手術の法外なコストが、自家細胞療法にとって重大な課題となる。

対照的に、同種異系細胞療法は、自家細胞療法の課題に対処する「既製の」製品として利用可能であり得る。ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、及び－ＤＲの一致により、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）が潜在的に無効になる可能性があるため、選択された個体から生成された細胞療法産物は、より広範な集団に適用可能である可能性がある。したがって、細胞バンクは、健康な個体の最適なＴ細胞亜集団から生成されることができ、適用性及び有効性を増加させながら製造コストを減少させる。したがって、同種異系細胞療法は、自家細胞療法の制限を打破する可能性を有する。同種異系細胞療法の有望性により、様々な腫瘍関連抗原を標的とする、同種異系の「既製の」、ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を評価する臨床試験が進行中である。細胞療法、特に同種異系の前線の進歩を考慮すると、Ｔ細胞産物の工業スケールの産生の必要性は避けられない。

用量当たりのＣＡＲ Ｔ細胞の数は異なるが、推定は、血液悪性腫瘍を治療するために年当たり３兆個のＣＡＲ Ｔ細胞、及び固形腫瘍悪性腫瘍のための１５０兆個のＣＡＲ Ｔ細胞の必要性を示唆する。必要なバッチサイズを満たすために、静置の２Ｄフラスコベースの培養をスケールアップすると、追加の労働、実験室の設置面積、変動性、汚染のリスク、及び不十分なプロセス制御がもたらされるであろう。スケールアップ移行動力学は、撹拌タンクバイオリアクタ（ＳＴＲ）についてよく特徴付けられているため、需要を満たす優れたオプションを提供する。更に、ＳＴＲは、プロセス内制御を有する、閉鎖され、自動化されたＧＭＰ互換性のある系であるため、ＳＴＲにおけるＴ細胞製造は、労働、バッチ間の変動、及び汚染リスクを顕著に減少させる。Ｔ細胞は、非接着性であり、本質的に、単一細胞として懸濁液中で培養される。これにより、懸濁液ベースのバイオリアクタは、人工的にそれらを懸濁液培養条件に適合させ、凝集体で、又は担体に付着させて培養する必要なく、それらの増殖に適している。他の細胞型と同様に、Ｔ細胞の増殖は、培養培地中でのアンモニア及び乳酸塩などの細胞代謝産物の蓄積に感受性であり、したがって、培地の補充を必要とする。流加培養を使用して、新鮮な栄養素が供給され、代謝産物が除去されるにもかかわらず、阻害剤が、流加培地交換の間の間隔で蓄積し、成長を阻害する可能性があり、灌流を介して連続的な培地交換を保証している。Ｔ細胞を３Ｄベースの懸濁培養での増殖に好適にする特性もまた、自動化された連続的な培地交換の課題を提示している。Ｔ細胞の直径は、５～１０ｍｍの範囲であるため、Ｔ細胞培養の灌流は困難であり、主な要因は頻繁なフィルタの汚れ及び細胞の漏出である。したがって、Ｔ細胞増殖を可能にする連続的な培地灌流を備えたスケールアップ技術が緊急に必要とされている。

いくつかの実施形態では、完全閉鎖系において免疫細胞培養物を産生する方法であって、免疫細胞を得ることと、免疫細胞を、免疫細胞完全培地を含む撹拌タンクバイオリアクタに導入することと、撹拌タンクバイオリアクタにおいて、免疫細胞を活性化試薬で活性化して、活性化された免疫細胞を産生することと、撹拌タンクバイオリアクタにおいて、活性化された免疫細胞を増殖させて、増殖した免疫細胞培養物を産生することと、バイオリアクタに接続された交互接線流濾過（ＡＴＦ）を介して、定義された量の新鮮な培地を使用済み培地と交換することと、撹拌タンクバイオリアクタにおいて、増殖した免疫細胞培養物を枯渇させて、枯渇した免疫細胞培養物を産生することと、完全閉鎖系において、枯渇した免疫細胞培養物を採取して、採取された免疫細胞培養物を産生することと、完全閉鎖系において、採取された免疫細胞培養物を濃縮することと、を含み、方法が、免疫細胞培養物の１％未満の損失をもたらす、方法。

本明細書の実施形態による免疫細胞培養物の産生のためのフロー図を示す。 本明細書において実施形態に記載の２Ｄ静置培養と比較した、撹拌におけるＴ細胞の増殖を示す。 本明細書において実施形態に記載の２Ｄ静置培養と比較した、撹拌におけるＴ細胞の増殖を示す。 本明細書において実施形態に記載の２Ｄ静置培養と比較した、撹拌におけるＴ細胞の増殖を示す。 本明細書の実施形態に記載の撹拌タンクバイオリアクタ及び連続的な細胞培養培地灌流における活性化されたＴ細胞の増殖を示す。 本明細書の実施形態に記載の撹拌タンクバイオリアクタ及び連続的な細胞培養培地灌流における活性化されたＴ細胞の増殖を示す。 本明細書の実施形態に記載の撹拌タンクバイオリアクタ及び連続的な細胞培養培地灌流における活性化されたＴ細胞の増殖を示す。 本明細書の実施形態に記載の撹拌タンクバイオリアクタ及び連続的な細胞培養培地灌流における活性化されたＴ細胞の増殖を示す。 本明細書の実施形態に記載の撹拌タンクバイオリアクタ及び連続的な細胞培養培地灌流における活性化されたＴ細胞の増殖を示す。 本明細書の実施形態に記載のＡＴＦ媒介連続灌流を有する撹拌タンクバイオリアクタにおいて活性化されたＴ細胞の表現型特性を示す。 本明細書の実施形態に記載のＡＴＦ媒介連続灌流を有する撹拌タンクバイオリアクタにおいて活性化されたＴ細胞の表現型特性を示す。 本明細書の実施形態に記載のＡＴＦ媒介連続灌流を有する撹拌タンクバイオリアクタにおいて活性化されたＴ細胞の表現型特性を示す。 本明細書に記載のＡＴＦ媒介連続灌流を有する撹拌タンクバイオリアクタにおいて活性化されたＴ細胞の機能状態を示す。 本明細書に記載のＡＴＦ媒介連続灌流を有する撹拌タンクバイオリアクタにおいて活性化されたＴ細胞の機能状態を示す。 本明細書に記載のＡＴＦ媒介連続灌流を有する撹拌タンクバイオリアクタにおいて活性化されたＴ細胞の機能状態を示す。 本明細書に記載のＡＴＦ媒介連続灌流を有する撹拌タンクバイオリアクタにおいて活性化されたＴ細胞の機能状態を示す。 本明細書の実施形態による閉鎖系におけるＴ細胞の枯渇の効率を示す。 本明細書の実施形態による閉鎖系におけるＴ細胞の枯渇の効率を示す。

同種異系Ｔ細胞は、がん及び他の臨床的適応症と戦うための重要な免疫治療細胞である。患者当たりの高いＴ細胞用量及び患者数の増加は、多数の同種異系Ｔ細胞の臨床的需要をもたらす。これには、細胞の品質を保持しながら、スケールアップされ得る製造プラットフォームが必要である。同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞は、「既製」の細胞療法として使用され得、細胞療法産物の集団への適用性をより広範囲で増加させることが期待される。現在の推定は、血液学的及び固形腫瘍悪性腫瘍に使用されるＣＡＲ Ｔ細胞の需要を満たすために、２０００Ｌのバッチサイズの必要性を示唆している。静置２Ｄ培養における大きな設置面積、汚染のリスク、変動性、及び不十分なプロセス制御を考慮すると、撹拌タンクバイオリアクタは、Ｔ細胞の細胞増殖のための優れたプラットフォームを提供し、十分に特徴付けられたスケールアップ動力学、プロセス中の制御、及び低い汚染のリスクを提供する。撹拌タンクバイオリアクタにおける２Ｄ増殖プロセスを３Ｄ増殖に変換することは、接着細胞の場合に成功裏に示された。しかしながら、ＳＴＲの固有の灌流能力の不在、及びＴ細胞の小さいサイズ（直径５～１０ｍＭ）は、ＳＴＲにおけるＴ細胞の高収率を達成するための厄介な障害であることが判明した。

本開示において提示されるのは、臨床的需要を満たすためのＴ細胞製造のための閉鎖されたスケーラブルなプラットフォームである。Ｔ細胞の活性化及び増殖の上流の製造ステップは、撹拌タンクバイオリアクタにおいて容器内で行われる。ＣＡＲ－Ｔベースの療法に必要であるＴ細胞の選択は、バイオリアクタ自体において行われ、したがって、選択ステップを介して最適な培養条件を維持する。プラットフォームの自動化の特性、並びに容器内でのＴ細胞の活性化、増殖、及び選択のステップを実行することは、プロセス制御の向上、細胞品質、並びに手作業及び汚染リスクの低減に大きく貢献する。加えて、閉鎖され、自動化された、細胞濃縮の下流プロセスを統合する実行可能性が実証される。提示されたＴ細胞製造プラットフォームは、細胞品質及びプロセス制御の重要な要因を保持しながら、スケールアップ能力を有する。本開示は、灌流可能なＳＴＲにおけるＴ細胞増殖のためのＧＭＰ互換性で、閉鎖された、スケーラブルなプラットフォームを提供する。加えて、本開示は、ユニット内及び潜在的にスケーラブルな細胞枯渇磁気技術を提供し、ユニット操作を回避し、汚染及び労働のリスクを低下させる。

本明細書で言及される公開特許、特許出願、ウェブサイト、会社名、及び科学文献は、各々が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される任意の参照と本明細書の特定の教示との間に任意の矛盾がある場合、後者のために解決されるものとする。同様に、本明細書で具体的に教示されている単語又は語句の技術分野の定義と単語又は語句の定義との間に任意の矛盾がある場合、後者のために解決されるものとする。

「ａ」又は「ａｎ」という単語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において「含む」という用語とともに使用される場合、「１つ」を意味してもよいが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又は１つ超」の意味とも一致してもよい。

本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、その値を決定するために用いられる方法／デバイスについての誤差の固有の変動を含むことを示すために使用される。典型的には、この用語は、状況に応じて、およそ１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、若しくは２０％、又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、若しくは２０％未満の変動を含むことを意味する。

特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されるか又はその代替物が互いに排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。

本明細書及び特許請求の範囲（複数可）で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの任意の形態の含む）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（並びに「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」などの任意の形態の有する）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの任意の形態の含む）又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（並びに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの任意の形態の含有する）という単語は、包括的又はオープンエンドであり、追加の、列挙されていない要素又は方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法、デバイス、系、及び／又は組成物に関して実装され得ることが企図される。

本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、別段定義されない限り、本出願に関連する当業者によって一般的に理解されている意味を有する。本明細書では、当業者に既知の種々の方法論及び材料が参照される。

実施形態では、完全閉鎖系において免疫細胞培養物を産生するための方法が本明細書で提供される。好適には、方法は、免疫細胞培養物の自動化された上流の産生及び下流の処理のためのものである。

実施形態では、本明細書には、免疫細胞を、免疫細胞完全培地を含む撹拌タンクバイオリアクタに導入するための方法が本明細書で提供される。

本明細書で言及される場合、「導入すること」という単語は、撹拌タンクバイオリアクタに免疫細胞を添加することを意味し得るか、又は方法を開始する前に、撹拌タンクバイオリアクタ内に免疫細胞が存在することを示し得る。

方法の上流の産生及び下流の処理によって産生及び処理される「免疫細胞」は、それぞれ、（例えば、抗原提示細胞との共培養を介して）改変又はプライミングされ、ヒトを含む動物における１つ以上の疾患の治療、予防、又は改善に有用な所望の表現型を有する細胞をもたらす免疫系の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「免疫細胞培養物」は、本明細書に記載の方法によって調製された細胞の収集物を指し、研究又は臨床試験における使用のため、及び医学療法のためにヒト患者を含む哺乳動物に投与するための細胞集団を含み得る。本明細書に記載の方法を使用して産生され得る遺伝子改変された免疫細胞培養物は、肥満細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｂ細胞、Ｔ細胞などを含み得る。

例示的な実施形態では、方法は、免疫細胞を活性化試薬で活性化して、活性化された免疫細胞を産生することと、免疫細胞を増殖させることと、バイオリアクタに接続された交互接線流濾過（ＡＴＦ）を介して、定義された量の新鮮な培地を使用済み培地と交換することと、撹拌タンクバイオリアクタにおいて、増殖した免疫細胞培養物を枯渇させて、枯渇した免疫細胞培養物を産生することと、完全閉鎖系において、枯渇した免疫細胞培養物を採取して、採取された免疫細胞培養物を産生することと、完全閉鎖系において、採取された免疫細胞培養物を濃縮することと、を含み、方法が、免疫細胞培養物の１％未満の損失をもたらす。

実施形態では、得られる免疫細胞培養物の損失は、０．９９％未満、０．９５％未満、０．９％、０．８５％未満、０．８０％未満、０．７５％未満、０．７０％未満、０．６５％未満、０．６０％未満、０．５５％未満、０．５０％未満、０．４５％未満、０．４０％未満、０．３５％未満、０．３０％未満、０．２５％未満、０．２０％未満、０．１５％未満、及び０．１０％未満である。

実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞を得る直前に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団から単離されるか、又はＰＢＭＣの集団から単離され、長期間保管され、次いで、免疫細胞を得る前に解凍される。

本明細書で言及される場合、免疫細胞を「単離する」ことは、産物が産生されるマトリックス（細胞、組織、流体など）から免疫細胞を分離することを意味する。好適には、免疫細胞の単離は、免疫細胞を、洗浄、磁気適用、カラム、濾過、膜、遠心分離機、及び当該技術分野で既知の他の単離プロセスを含むがこれらに限定されない一連のメカニズムに供することを含み得る。「単離する」という単語は、本出願において、「精製する」という単語と同義である。

実施形態では、免疫細胞は、多能性幹細胞の集団に由来する。更なる実施形態では、多能性幹細胞の集団は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚幹細胞（ＥＳＣ）、又はそれらの組み合わせの集団である。

本明細書で言及される場合、多能性幹細胞の集団から免疫細胞を「誘導する」ことは、骨髄内の造血帯に存在する造血前駆細胞からインビトロから免疫細胞を生成することを意味する。

実施形態では、０．２５×１０^６Ｔ細胞／ｍＬ～２×１０^６Ｔ細胞／ｍＬが、バイオリアクタに導入される。他の実施形態では、０．１×１０^６Ｔ細胞／ｍＬ～０．５×１０^６Ｔ細胞／ｍＬが、バイオリアクタに導入される。他の実施形態では、０．２×１０^６Ｔ細胞／ｍＬ～０．５×１０^６Ｔ細胞／ｍＬが、バイオリアクタに導入される。他の実施形態では、０．３×１０^６Ｔ細胞／ｍＬ～０．６×１０^６Ｔ細胞／ｍＬが、バイオリアクタに導入される。他の実施形態では、０．４×１０^６Ｔ細胞／ｍＬ～０．７×１０^６Ｔ細胞／ｍＬが、バイオリアクタに導入される。他の実施形態では、０．５×１０^６Ｔ細胞／ｍＬ～０．８×１０^６Ｔ細胞／ｍＬが、バイオリアクタに導入される。他の実施形態では、０．６×１０^６Ｔ細胞／ｍＬ～０．９×１０^６Ｔ細胞／ｍＬが、バイオリアクタに導入される。他の実施形態では、０．７×１０^６Ｔ細胞／ｍＬ～１．０×１０^６Ｔ細胞／ｍＬが、バイオリアクタに導入される。他の実施形態では、１．０×１０^６Ｔ細胞／ｍＬ～１．５×１０^６Ｔ細胞／ｍＬが、バイオリアクタに導入される。他の実施形態では、１．５×１０^６Ｔ細胞／ｍＬ～１．７×１０^６Ｔ細胞／ｍＬが、バイオリアクタに導入される。他の実施形態では、１．７×１０^６Ｔ細胞／ｍＬ～２．０×１０^６Ｔ細胞／ｍＬが、バイオリアクタに導入される。

実施形態では、方法は、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約９０×１０^６細胞／ｍＬの生存免疫細胞を含む免疫細胞培養物を産生する。実施形態では、方法は、約９０×１０^６細胞／ｍＬ～約１００×１０^６細胞／ｍＬの生存免疫細胞を含む免疫細胞培養物を産生する。実施形態では、方法は、約１００×１０^６細胞／ｍＬ～約２００×１０^６細胞／ｍＬの生存免疫細胞を含む免疫細胞培養物を産生する。実施形態では、方法は、約２００×１０^６細胞／ｍＬ～約３００×１０^６細胞／ｍＬの生存免疫細胞を含む免疫細胞培養物を産生する。実施形態では、方法は、約３００×１０^６細胞／ｍＬ～約４００×１０^６細胞／ｍＬの生存免疫細胞を含む免疫細胞培養物を産生する。実施形態では、方法は、約５００×１０^６細胞／ｍＬ～約６００×１０^６細胞／ｍＬの生存免疫細胞を含む免疫細胞培養物を産生する。実施形態では、方法は、約６００×１０^６細胞／ｍＬ～約７００×１０^６細胞／ｍＬの生存免疫細胞を含む免疫細胞培養物を産生する。実施形態では、方法は、約８００×１０^６細胞／ｍＬ～約９００×１０^６細胞／ｍＬの生存免疫細胞を含む免疫細胞培養物を産生する。実施形態では、方法は、約１．０×１０^７細胞／ｍＬ～約２．０×１０^７細胞／ｍＬの生存免疫細胞を含む免疫細胞培養物を産生する。

実施形態では、免疫細胞は、撹拌タンクバイオリアクタにおいて活性化試薬で活性化され、活性化された免疫細胞を産生する。更なる実施形態では、免疫細胞を活性化することは、３７℃で約７２時間の期間、活性化試薬とともに培地を撹拌することを含む。実施形態では、免疫細胞培養物は、０．１５～０．５回転／分（ＲＰＭ）の先端速度で撹拌される。実施形態では、免疫細胞培養物は、０．６～０．８回転／分（ＲＰＭ）の先端速度で撹拌される。実施形態では、免疫細胞培養物は、０．８～１．０回転／分（ＲＰＭ）の先端速度で撹拌される。

実施形態では、免疫細胞培養培地は、活性化期間中、約ｐＨ５．０～約ｐＨ７．５のｐＨを有する。実施形態では、免疫細胞培養培地は、活性化期間中、約ｐＨ５．０～約ｐＨ５．５のｐＨを有する。実施形態では、免疫細胞培養培地は、活性化期間中、約ｐＨ５．５～約ｐＨ６．０のｐＨを有する。実施形態では、免疫細胞培養培地は、活性化期間中、約ｐＨ６．０～約ｐＨ６．５のｐＨを有する。実施形態では、免疫細胞培養培地は、活性化期間中、約ｐＨ６．５～約ｐＨ７．０のｐＨを有する。実施形態では、免疫細胞培養培地は、活性化期間中、約ｐＨ７．０～約ｐＨ７．５のｐＨを有する。

好適には、活性化試薬は、可溶性抗体複合体を含む。実施形態では、活性化試薬は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体のうちの少なくとも１つを含む、可溶性抗体である抗体を含む。例示的な抗体には、ＯＫＴ３が挙げられる。

他の実施形態では、活性化試薬は、抗体又は樹状細胞を含む。実施形態では、抗体は、ポリスチレンプラスチック、シリコーン、又は例えば、ビーズの表面を含む他の表面を含み得る表面上に固定化される。

実施形態では、撹拌タンクバイオリアクタにおいて、活性化された免疫細胞を増殖して、増殖した免疫細胞培養物を産生する。本明細書に記載のように、細胞を増殖する方法は、好適には、バイオリアクタに新鮮な培地を添加すること、供給すること、洗浄すること、監視すること、及び免疫細胞培養物の条件を調整することのうちの少なくとも１つ以上を含む。更なる実施形態では、増殖させることは、増殖する免疫細胞培養物を試料採取することと、増殖するＴ細胞培養物の細胞成長及び増殖倍率を決定することと、細胞成長及び増殖倍率に基づいて、定義された量の新鮮な培地を使用済み培地と交換することと、を更に含む。例示的な条件としては、温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、及び光学密度が挙げられる。

本明細書に記載の様々な方法は、増殖免疫細胞培養物の酸素レベルが免疫細胞培養物に対して最適化されるような方法で実施される。この最適化は、本明細書に記載のように、所望の細胞表現型の促進を含む、所望の表現型特性を有する多数の生存細胞の産生を可能にする。実施形態では、酸素レベル又は濃度は、ステップ（ｄ）～（ｆ）のうちの１つ以上の間に、酸素化構成要素を介してＴ細胞完全培地を再循環させる交互接線流濾過系によって最適化される。

更なる実施形態では、交互接線流濾過系は、様々な方法プロセス中に、栄養素、老廃物、放出サイトカイン、及び／又は溶解ガスを再循環させる。この再循環は、所望の表現型（複数可）を有する多数の生存細胞の産生を補助する。

細胞の増殖条件を最適化するための他のメカニズムとして、細胞に提供される培地の流量を改変及び制御することが含まれる。細胞が成長し始めるにつれて、提供される培地の循環速度が増加し、ガス交換が改善され、条件に応じて酸素及び二酸化炭素が細胞培養物に出入りできるようになる。

実施形態では、系は、供給、洗浄、及び監視、並びに実施形態では、増殖した免疫細胞培養物の選択のうちの１つ以上の数回のラウンドを実施するように構成される。これらの様々な作業は、任意の順序で実施され得、単独で実施され得るか、又は別の行動と組み合わせて実施され得る。実施形態では、細胞の濃縮には、遠心分離、沈殿後の上清除去、又は濾過が含まれる。好適には、最適化プロセスは、自己調整プロセスにおいて好適に遠心分離又は濾過のパラメータを調整することを更に含む。増殖した細胞培養物の枯渇は、例えば、磁気分離、濾過、ビーズ、プラスチック、又は他の基質への接着などによって行われ得る。

実施形態では、新鮮な培地は、増殖する免疫細胞培養物の生存細胞密度が１．５×１０^６細胞／ｍＬよりも大きい場合に、１容器体積／日（ＶＶＤ）の速度で使用済み培地と交換される。実施形態では、新鮮な培地は、増殖する免疫細胞培養物の生存細胞密度が１．４×１０^６細胞／ｍＬよりも大きい場合に、１容器体積／日（ＶＶＤ）の速度で使用済み培地と交換される。実施形態では、新鮮な培地は、増殖する免疫細胞培養物の生存細胞密度が１．３×１０^６細胞／ｍＬよりも大きい場合に、１容器体積／日（ＶＶＤ）の速度で使用済み培地と交換される。実施形態では、新鮮な培地は、増殖する免疫細胞培養物の生存細胞密度が１．２×１０^６細胞／ｍＬよりも大きい場合に、１容器体積／日（ＶＶＤ）の速度で使用済み培地と交換される。実施形態では、新鮮な培地は、増殖する免疫細胞培養物の生存細胞密度が１．０×１０^６細胞／ｍＬよりも大きい場合に、１容器体積／日（ＶＶＤ）の速度で使用済み培地と交換される。

実施形態では、免疫細胞培養物を枯渇させることは、増殖後に表面活性化された磁気ビーズを免疫細胞培養物に添加すること、増殖した免疫細胞培養物及びビーズを約３０分間撹拌すること、標的細胞の集団を増殖した免疫細胞培養物から磁石で単離することを含む。他の実施形態では、免疫細胞培養物を枯渇させることは、対向流遠心溶出、密度勾配での分画、又はレクチンによる分別凝集、続く羊の赤血球でのリセットを使用すること含む、当該技術分野で既知の物理的分離方法を含む。他の実施形態では、免疫細胞培養物を枯渇させることは、単独で、Ｔ細胞に対して指向される相同、異種、又はウサギ補体因子と併せのいずれかで、抗体を利用する当該技術分野で既知の免疫学的方法を含む。他の実施形態では、免疫細胞培養物を枯渇させることは、本明細書に記載の物理的分離方法及び免疫学的方法の組み合わせを使用することを含む。

例示的な実施形態では、撹拌タンクバイオリアクタは、方法を開始する前に免疫細胞培養培地を含有する。他の実施形態では、新鮮な免疫細胞培養培地は、産生方法の開始後、又はプロセス中の任意の好適な時間に、別々に添加され得る。

他の実施形態では、免疫細胞培養物の好ましい表現型を促進するための方法であって、方法は、撹拌タンクバイオリアクタにおいて、免疫細胞培養物を活性化して、活性化された免疫細胞培養物を産生することと、撹拌タンクバイオリアクタにおいて、活性化された免疫細胞を増殖させて、増殖した免疫細胞培養物を産生することと、を含み、活性化及び増殖条件は、免疫細胞培養物の表現型及び機能状態を促進する、方法が本明細書で提供される。例示的な表現型としては、幹性、サイトカインを産生する能力、中央記憶、エフェクター記憶、及びナイーブ／幹記憶が挙げられる。例示的な機能状態としては、サイトカイン産生が挙げられる。本明細書に記載のように、方法は、完全閉鎖自動化細胞工学系によって好適に実施される。

実施形態では、活性化条件は、活性化試薬と免疫細胞培養物との間の安定した接触を可能にする実質的にかき乱されない免疫細胞培養物を提供する。本明細書に記載のように、撹拌タンクバイオリアクタの使用を介して、細胞を実質的にかき乱されない条件下で活性化することを可能にすることは、細胞が活性化試薬と均質に接触されることができ、及び所望の促進された表現型を達成するために、必要な栄養素、溶解ガスなどと相互作用することができる環境を提供することが見出されている。

本明細書に記載の方法は、好ましい表現型を提供するために適切な活性化方法を選択することによって、最終的な免疫細胞培養産物の特性に影響を与えることができる。例えば、本明細書に記載のビーズベースのプロセスを利用する活性化は、よりバランスのとれたＣＤ４：ＣＤ８比を促進するが、可溶性抗ＣＤ３の使用は、ＣＤ４よりも高いＣＤ８の集団を促進する。他のレベルのＣＤ８及びＣＤ４もまた、本明細書に記載の方法を使用して提供し得る。例示的な実施形態では、本明細書に記載のように、方法を利用して、ＣＡＲ Ｔ細胞を調製し得る。好適には、本方法を利用して、約０．５：１～約５：１、約０．８：～約３：１、又は約１：１、約２：１などのＣＤ８＋細胞対ＣＤ４＋細胞の比率を含む、約０．１：１～約１０：１のＣＤ８＋細胞対ＣＤ４＋細胞の比を有するＣＡＲ Ｔ細胞の表現型を促進し得る。

本明細書に記載のように、驚くべきことに、細胞が震盪されない（すなわち、細胞が互いの上を流れるように回転又は震盪されない）条件下で細胞を増殖させることを可能にすることで、方法が、高い生存細胞収率及び所望の表現型を含む最適な細胞特性を提供することが見出されている。大型の震盪しない細胞培養チャンバは、細胞の老廃物を除去しながら、所望の結果を達成するために細胞を震盪又はかき乱す必要なしに、必要な試薬、栄養素、ガス交換などへの細胞の均質なアクセスを提供することができることが確定されている。実際、本明細書に記載のように、遺伝子改変された免疫細胞の自動化産生のためのそのような方法は、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，”米国特許第８，７２７，１３２号に記載のような、細胞震盪を利用する方法と比較して、より多くの生存細胞、より多くの数／比率の所望の細胞型、及びより堅牢な細胞特性を生成することが見出された。

実施形態では、本方法の様々なステップは、完全閉鎖系によって実施され、免疫細胞培養物を産生するプロセスを介して最適化される。

好適には、本明細書に記載の方法は、以下、免疫細胞培養物の温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、及び光学密度のうちの１つ以上を検出及び／又は調整するための１つ以上のセンサ及び／又はメカニズムを含む。

本明細書で使用される場合、「バイオリアクタ」は、発酵器若しくは発酵ユニット、又は任意の他の反応容器を含み得る。例えば、いくつかの態様では、例示的なバイオリアクタユニットは、以下、栄養素及び／又は炭素源の供給、好適な気体（例えば、酸素）の注入、発酵又は細胞培養培地の流入及び流出、気相及び液相の分離、温度の維持、酸素及びＣＯ_２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、撹拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）（例えば、撹拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ））、並びに／又は洗浄／滅菌のうちの１つ以上又は全てを実施し得る。本明細書に記載の方法は、撹拌タンク、気泡ポンプ、繊維、マイクロ繊維、中空繊維、セラミックマトリックス、流動床、固定床、及び／又は噴流床バイオリアクタを含むが、これらに限定されない、任意の好適なバイオリアクタと併せて利用され得る。任意の好適なリアクタ直径が使用され得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、その中での連続的で反復的な移動による液体培地の撹拌又は混合を可能にする。

実施形態では、バイオリアクタは、約１Ｌ～約２０００Ｌの体積容量を有し得る。非限定的な例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、及び／又は５０，０００リットルの体積容量が挙げられる。更に、好適なリアクタは、多回使用、単回試用、使い捨て、又は非使い捨てであり得、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌ又は任意の他の好適なステンレス鋼）及びインコネルなどの金属合金、プラスチック、並びに／又はガラスを含む任意の好適な材料で形成され得る。

撹拌タンクバイオリアクタは、ガス及び栄養素の均一な分布を確保するメカニズムとして撹拌を利用する。Ｔ細胞が撹拌で増殖し得るかどうかを決定するために、スピナーフラスコにおいて異なる撹拌速度で活性化及び培養されたＴ細胞を、２Ｄ静置フラスコにおいて増殖した細胞と比較した。実行全体を通して様々な時点で実施された細胞計数は、２Ｄ静置培養物中の生存細胞密度（ＶＣＤ）及びＴ細胞の総数が撹拌条件よりも一貫して低いことを示した（図２Ａ及び２Ｂ）。一定の７５ＲＰＭでの撹拌は、撹拌が５０ＲＰＭで開始され、５日目に１００ＲＰＭに増加した場合のＶＣＤと比較して、Ｔ細胞のより高いＶＣＤをもたらした（図２Ａ）。更に、７５ＲＰＭでの撹拌は、撹拌が５０ＲＰＭで開始され、１００ＲＰＭに増加した場合に観察された１０倍の細胞増殖と比較して、１５倍のＴ細胞増殖をもたらした（図２Ｂ）。流加培地交換レジーム及びスピナーフラスコにおいて試験された先端速度の範囲を維持して、１Ｌ撹拌タンクバイオリアクタ（ＳＴＲ）におけるＴ細胞の増殖を２つの異なる撹拌速度で評価した。図２Ｃに示されるように、８８ＲＰＭでの撹拌は、６５ＲＰＭでの撹拌と比較して、Ｔ細胞のより高い生存細胞密度をもたらした。

細胞密度の増加は、栄養素の枯渇及び阻害代謝産物の蓄積を伴う。連続的な培地灌流は、最適な培養条件を提供し、細胞の増殖を可能にする。細胞損失なしに交互接線流（ＡＴＦ）を使用して連続培地灌流が実施され得るかどうかを評価するために、３ＬのＳＴＲにおける２Ｌの培養培地中に３．０×１０^６細胞／ｍＬで接種されたＴ細胞に対するＡＴＦによる２４時間培地灌流の効果を試験した。表１に示されるように、Ｔ細胞のＶＣＤの顕著な減少は、灌流の２４時間後には観察されなかった。これは、廃棄物バッグ中のＴ細胞の非存在を伴い、ＡＴＦ媒介性培地交換が細胞損失をもたらさなかったことを示した。更に、灌流の２４時間後の廃棄物バッグの重量の評価は、フィルタの汚れなく、１容器体積／日（１ＶＶＤ）の連続的な培地灌流が達成されたことを示した。連続的な培地灌流でＳＴＲにおいてＴ細胞の増殖が達成され得るかどうかを評価するために、ＣＤ３＋Ｔ細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）から単離し、撹拌タンクバイオリアクタに接種し、材料及び方法に記載のとおりに活性化した。単離後の細胞の表現型評価は、細胞の９８％がＣＤ３＋であり（図３Ａ）、生存率が９８％超である（データは示さず）ことを示した。ＳＴＲにおける接種及び活性化後、１４日間にわたるＴ細胞の増殖を監視し、８日目にＴ細胞ＶＣＤが２．０×１０^６細胞／ｍＬに達することを示した（図３Ｂ）。細胞密度の増加とともに、乳酸塩レベルの同時増加が観察された（図３Ｃ）。１ＶＶＤでのＡＴＦを使用した細胞保持及び培地交換は、乳酸塩蓄積を抑制し、生存細胞密度が１４日目に３３．５×１０^６細胞／ｍＬに達することを可能にした（図３Ｃ）。比較すると、同じドナーから単離され、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）において静置モードで培養されたＴ細胞は、１４日目に３．４×１０^６細胞／ｍＬのＶＣＤをもたらした（図３Ｂ）。図３Ｄの細胞増殖中の安定したグルコースレベルによって示されるように、乳酸塩蓄積を回避することに加えて、１ＶＶＤでのＡＴＦ媒介灌流は、栄養補充を可能にした。更に、ＡＴＦ媒介細胞移動と組み合わせた撹拌タンクバイオリアクタ内の撹拌は、細胞死をもたらさず、安定した９６％超の細胞生存率を介して実証された（図３Ｅ）。

高い細胞増殖倍率を達成することは、プロセスのスケールアップの鍵である。しかし、この特性は、細胞の品質が最適でない場合にパフォーマンスを達成することを約束するものではない。撹拌タンクバイオリアクタにおいて増殖したＴ細胞のＣＤ４：ＣＤ８Ｔ細胞比率の評価は、接種時のＣＤ４：ＣＤ８Ｔ細胞比が、経時的にＣＤ８＋Ｔ細胞に向かって徐々にシフトしながら増殖中に維持されたことを示した（図４Ａ）。撹拌タンクバイオリアクタにおける増殖のＴ細胞の表現型に対する影響を決定するために、増殖中及び増殖後のＴ細胞表現型を、接種前のＴ細胞表現型と比較して評価した。図４Ｂに示されるように、Ｔ細胞の増殖は、約８０％の中央記憶Ｔ細胞、１０％未満のエフェクター記憶サブセット、及び約１５％のナイーブ／幹記憶サブセットをもたらした。更に、増殖は、末端分化Ｔ細胞（図４Ｂ）、老化Ｔ細胞、又は消耗Ｔ細胞の蓄積をもたらさなかった（図４Ｃ）。

撹拌タンクバイオリアクタにおける増殖後のＴ細胞の機能状態を評価するために、刺激後にサイトカインを産生するＴ細胞の能力を評価した。０日目及び１４日目に得られたＴ細胞試料からのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の単離により、９８％超の純粋な集団が得られた（図５Ａ）。細胞を、材料及び方法に記載のように、刺激し、染色し、サイトカイン産生について評価した。図５Ｂに示されるように、多機能性を示す複数のサイトカインを産生する細胞の数は、増殖全体を通して維持されている。０日目と比較して、１４日目の試料は、５個超のサイトカインを産生する細胞の数の増加を示した。低頻度であるが、１４日目のＴ細胞は、最も多くのサイトカインを産生し、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、１１個のサイトカインを産生し、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、９個のサイトカインを産生した（図５Ｃ）。更に、細胞型のサイトカインシグネチャベースの分類は、刺激性シグネチャを保持しながら、エフェクター多機能強度指数の増加を示唆する（図５Ｄ）。

上で言及されるように、ＴＣＲ陽性細胞の枯渇は、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞ベースの療法を可能にするために必要である。望ましくないＴ細胞の濃度は、細胞編集技術及び送達プラットフォームに基づいて変化し、増殖後に低又は高濃度をもたらし得る。概念の証明として、低濃度（１７％）及び高濃度（５２％）でのＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇を評価した。独自の磁気技術を使用した３０分のＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇は、より低い細胞濃度で９９％超の枯渇及びより高い濃度で約９７％の枯渇をもたらした（表２及び図６Ａ）。より高い密度で、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びビーズを枯渇させるのに必要な時間を評価するために、ビーズの枯渇の時間経過を実施した。図５Ｂに示されるように、９０分間の磁場の印加は、試料採取後、視覚的なビーズ数によって示されるように、ビーズを枯渇させる。残存ビーズパーセンテージの評価は、細胞生存率及びＣＤ８＋Ｔ細胞の損失なしに、磁石を用いたビーズの枯渇の１２０分後に、０．００１％未満のビーズの存在をもたらすことを示した（表３及び図６Ｂ）。

２つの相互に排他的な系、ｅｋｋｏＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）及びｋＳｅｐ４００（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を、閉鎖された採取後の細胞濃度について評価した。ＳＴＲから採取バッグへの閉鎖された細胞採取を、材料及び方法に記載のように行った。バッグからの細胞を閉鎖された方法で濃縮装置の各々に移した。表４に示されるように、ｅｋｋｏＴＭを使用した細胞濃度は、７倍の濃度、細胞生存率の０％の損失をもたらし、最終的な細胞生存率は９８．５％、細胞回収率は７９％であった。同様に、ｋＳｅｐ ４００を使用した細胞濃度は、７．６５倍の濃度、細胞生存率の６％の損失をもたらし、最終的な細胞生存率は８９．４％、細胞回収率は６９％であった。

ＰＢＭＣからのＴ細胞の単離
ヒトＰＢＭＣ（Ｌｏｎｚａカタログ番号４Ｗ－２７０Ｃ）を、バイアル内に少量の氷を残すまで、３７℃の水浴中で迅速に解凍した。解凍した細胞をＥａｓｙＳｅｐＴＭ緩衝液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号２０１４４）に滴加した。細胞を室温（ＲＴ）で５分間、３００ＲＣＦで遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を５０ｍＬのＥａｓｙＳｅｐＴＭ緩衝液中で再構成した。細胞濃度及び生存率をＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して評価した。細胞を再びＲＴで５分間、３００ＲＣＦで遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を、Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５無血清造血細胞培地（Ｌｏｎｚａカタログ番号０４－４１８Ｑ）中で、５０×１０６細胞／ｍＬで再構成した。試料を免疫表現型染色のためにアリコートした。Ｔ細胞を、Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１７９５１）を使用して、製造業者のプロトコルに従って単離した。Ｔ細胞単離後、細胞濃度及び生存率を、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して評価し、試料を、免疫表現型染色のためにアリコートした。

スピナーフラスコにおけるＴ細胞の活性化及び増殖
Ｔ細胞完全培地を、ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ４５２２）を５％の最終濃度に、及び組換えヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００－０２）を５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度になるように、Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５（Ｌｏｎｚａカタログ番号０４－４１８Ｑ）に添加することによって調製した。Ｔ細胞単離後（４．１に記載のように）、細胞を、スピナーフラスコにおいて、４０ｍＬのＴ細胞完全培地中で１×１０６細胞／ｍＬで播種した。細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔＴＭ ヒトＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞活性化剤（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１０９９１）で、製造業者の指示に従って３日間刺激した。細胞密度を１×１０６細胞／ｍＬに調節するために、培地を５日目に添加し、培地を８日目に２倍にした。スピナーフラスコの一方の条件における撹拌を、１１日間全体で７５ＲＰＭで維持し、他方の条件における撹拌を、５０ＲＰＭで開始して、１～４日目まで、続いて５～１１日目まで１００ＲＰＭで行った。培養４、７、８、及び１１日目に試料採取することによって、細胞数及び生存率を決定した。

Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）におけるＴ細胞の活性化及び増殖
Ｔ細胞完全培地を、ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ４５２２）を５％の最終濃度に、及び組換えヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００－０２）を５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度になるように、Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５（Ｌｏｎｚａカタログ番号０４－４１８Ｑ）に添加することによって調製した。Ｔ細胞の単離（４．１に記載）後、１ＬのＧ－Ｒｅｘ（登録商標）（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆカタログ番号Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ－ＣＳ）を、３００ｍＬのＴ細胞完全培地中の０．５×１０６細胞／ｍＬのＴ細胞で接種した。Ｔ細胞活性化を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔＴＭ ヒトＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞活性化剤（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１０９９１）を使用して、製造業者の指示に従って、３日間、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）において実施した。Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）におけるＴ細胞培養物を、３７℃、５％のＣＯ２加湿雰囲気で維持した。Ｔ細胞を３日間活性化した後、７００ｍＬのＴ細胞完全培地を添加し、１４日目まで培養した。

撹拌タンクバイオリアクタにおけるＴ細胞の活性化及び増殖
ＢｉｏＢｌｕ単回使用バイオリアクタ容器を、製造業者の指示に従って構成した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、１３８６０００３００）。簡潔に述べると、１Ｌの容器には、溶解酸素（ＤＯ）のパーセンテージ、ｐＨ、及び温度を含む重要なパラメータのオンライン監視のために必要なプローブ（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）が装備された。バイオリアクタを、Ｇ３Ｌａｂユニバーサル制御装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して制御した。Ｔ細胞完全培地を、ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ４５２２）を５％の最終濃度に、及び組換えヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００－０２）を５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度になるように、Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５（Ｌｏｎｚａカタログ番号０４－４１８Ｑ）に添加することによって調製した。接種前に、４００ｍＬのＴ細胞完全培地をバイオリアクタに導入し、空気で平衡化した。Ｔ細胞単離後、バイオリアクタを、０．５×１０６細胞／ｍＬの播種密度で２００×１０６個のＴ細胞と接種させた。Ｔ細胞活性化を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔＴＭ ヒトＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞活性化剤（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１０９９１）を使用して、製造業者の指示に従って、３日間、バイオリアクタにおいて実施した。バイオリアクタにおけるＴ細胞培養物を、３７℃、８８ＲＰＭ撹拌（別段の言及を除く）、及びｐＨ＜７．２で維持した。Ｔ細胞を３日間活性化した後、６００ｍＬのＴ細胞完全培地を添加した。細胞成長及び増殖倍率を決定するために、１５ｍＬの試料を、実行に沿った様々な時点で二重に採取し、Ｎｕｃｌｅ－ｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、細胞数及び生存率を測定した。Ｔ細胞の生存細胞密度が２．０×１０６細胞／ｍＬに達したとき、新鮮なＴ細胞完全培地での灌流を、１容器体積／日（ＶＶＤ）の速度で開始した。示された日に、試料を、免疫表現型分析、及び単一細胞セクレトーム分析に使用した。主要代謝産物の変化を監視するために、５ｍＬの試料を、実行に沿って様々な時点でバイオリアクタから採取した。ｐＨ及び主要な栄養素などのパラメータの変化を決定するためのオフライン監視は、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ＦＬＥＸ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して実施された。表１に示されるように、細胞濃度、生存率、廃棄物バッグ中の細胞の存在、及びバイオリアクタ内外の体積を評価した。

連続培地灌流
細胞保持及び連続培地灌流を、ＸｃｅｌｌＴＭ ＡＴＦ ２単回使用デバイス（Ｒｅｐｌｉｇｅｎカタログ番号ｓｕＡＴＦ２－Ｓ０２ＰＥＳ）を使用して実施した。ＡＴＦを０日目にバイオリアクタに無菌的に接続し、ＡＴＦカラムを、Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ１５無血清造血細胞培地（Ｌｏｎｚａカタログ番号０４－４１８Ｑ）を使用して湿潤させた。８日目に、細胞が２．０×１０６細胞／ｍＬに達したとき、０．５リットル／分（ＬＰＭ）のＡＴＦ速度で灌流を可能にした。培地入及び培地出を０．７ｍＬ／分に設定し、１ＶＶＤを維持した。

ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇
細胞増殖後、１４日目に、灌流を停止し、必要数のＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ ＣＤ４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号１１１４５Ｄ）を、製造業者の指示に従って、単離緩衝液（０．１％のヒトＡＢ血清及び２ｍＭのＥＤＴＡを補充したＤＰＢＳ）中で洗浄した。ビーズをバイオリアクタに添加し、撹拌しながら３０分間インキュベーションした。必要な期間、磁石でのインキュベーションを実施した。示された時間に、１０ｍＬの試料を、Ｒｅｂｅｌ光学顕微鏡（Ｅｃｈｏ、ＵＳＡ）の２０×倍率下での写真撮影、残存ビーズ濃度の計算（４．９を参照されたい）、免疫表現型分析のための染色（４．８を参照されたい）、生存細胞濃度及び細胞生存率の評価（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００）のために、バイオリアクタから抜き取った。表２に見られるように、低濃度及び高濃度での３０分間のＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇の効率を評価した。

表３は、ビーズの枯渇の効率を示す。残存ビーズのパーセンテージ、細胞生存率の損失、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の時間経過を評価した。

撹拌タンクバイオリアクタからのＴ細胞の採取
１Ｌのバイオリアクタ内のＴ細胞を、全細胞培養の１４日目に収集した。バイオリアクタとＡＴＦとの間の接続を閉じ、連続撹拌しながら、バイオリアクタ内の細胞溶液を滅菌された１Ｌのバッグ内にポンプ輸送した。同じ１ＬのバッグをＡＴＦの採取ラインに接続し、ＡＴＦに存在する細胞溶液を採取した。採取バッグ中の１５ｍＬの細胞溶液を、免疫表現型分析（４．８を参照されたい）、生存細胞濃度及び細胞生存率の評価（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００）のために試料採取した。

下流の処理
バイオリアクタから採取されたＴ細胞懸濁液を含有するバッグを三重に試料採取し、次いでＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００を使用して生存率及び細胞密度を決定した。平均生存細胞密度（ＶＣＤ）を使用して、ｋＳｅｐによって採取されるであろう濃縮体積を計算した（式１、付録Ａを参照されたい）。ｋＳｅｐ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）には、４００．５０ローターが取り付けられており、ｋＳｅｐ４００の１／３．５スケールダウンモデルとして機能する。次いで、関連する４００．５０の単回使用キット（チャンバセット及びバルブセット）を取り付けた。ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ－Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）及び（０．２５％）ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ４５２２）の溶液を使用して、系をプライミングした。１０００ｇの静的遠心分離速度を使用した。流動床を２４ｍＬ／分の流速で６０分間確立し、１２０ｍＬ／分で採取バッグに採取した。濃縮プロセス全体で、ｋＳｅｐチャンバを出る流れから５ｍＬの試料を引き出し、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して試験して、流動床から漏れ出る細胞の量を監視した。１Ｌの細胞懸濁液を処理した後、濃縮された細胞を採取した。濃縮物の体積を検証し、試料を採取して生存率及び細胞密度を決定した。残りの濃縮物を凍結保存した。

ｅｋｋｏＴＭによる濃縮のために、ｅｋｋｏＴＭ単回使用カートリッジを取り付け、チャンバを１００ｍＬの洗浄緩衝液（ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ－Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）及び（０．２５％）ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ４５２２）の溶液でプライミングした。供給物を、１２０Ｗ及び７０ｍＬ／分の流量で音響流体床からに再循環させた。１Ｌの細胞懸濁液を処理した後、濃縮細胞を２サイクルで採取した。濃縮物の体積を検証し、試料を採取して生存率及び細胞密度を決定した。残りの濃縮物を凍結保存した。
表４は、閉鎖系を使用した細胞の濃度を示す。濃度倍率、細胞生存率、及び回収％を評価した。

凍結保存
ヒトＴ細胞を凍結保存液（ＣＳ１０、Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ、２１０１０２））に懸濁した。凍結バイアルを、Ｃｒｙｏｍｅｄ（商標）制御定格冷凍庫（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、モデル７４５６）によって凍結保存し、続いて使用するまで液体窒素中に保存した。

フローサイトメトリー
フローサイトメトリーを使用して、Ｔ細胞分化、老化、及び消耗状態の定量的検出を行った。簡潔に述べると、３００，０００個の細胞を、以下の細胞表面マーカーについて生染色した：ＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０４８０６）、ＣＤ４５ＲＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０４１０８）、ＣＤ４５ＲＯ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０４２１８）、ＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５６４７１３）、ＣＤ４（ＣＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５６０１５８）、ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０１０２８）、ＫＬＲＧ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３６７７１６）、ＣＴＬＡ４（ＢＤ Ｂｉｏ－ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５６３９３１）、ＰＤ－１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５６４３２４）、ＣＤ５７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３９３３０４）、及びＺＯＭＢＩＥ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４２３１１４）。試料をＦＡＣＳ ＣｅｌｅｓｔａＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して処理し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用してデータを取得し、続いて、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を使用して分析した。

残存ビーズのパーセンテージ
各試料から、１ｍｌを３つのチューブの各々に分配した。チューブを室温で５分間、７００ＲＣＦで遠心分離した。細胞ペレットを１ｍＬのＤＰＢＳに再懸濁した。細胞溶液に、４ｍＬの溶解緩衝液（１：１の比のＤＰＢＳ及び次亜塩素酸ナトリウム）を添加し、混合し、室温で５分間放置した。チューブを室温で５分間、７００ＲＣＦで遠心分離し、４．９５ｍＬの上清を除去した。残りの５０μＬをよく混合し、１０μＬを血球計の各側面に分配した。４つの角の正方形中のビーズの数を計数した。血球計の第２の側面について、計数を繰り返した。チューブ内の残りの溶液をよく混合し、チューブ内の溶液が完全に計数されるまで計数を行った。残存ビーズ数を、式２を使用して計算し、付録Ａを参照されたい。試料の生存細胞密度に対する残存ビーズのパーセンテージを、式３を使用して計算し、付録Ａを参照されたい。

Ｉｓｏｐｌｅｘｉｓを試用したＴ細胞多機能性分析
バイオリアクタの実行中に、多数の分析のために１５ｍｌの試料を採取した。示された時点で、１ｍＬの溶液を、室温で５分間、５００ＲＣＦで遠心分離した。上清を新しい無菌の１．５ｍＬの無菌チューブに移し、ペレットをセクション４．７に記載のように凍結保存した。細胞を４．１に記載のように解凍し、１０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＩＬ－２を補充したＴ細胞完全培地中で、５％ＣＯ_２及び３７℃で一晩回収した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞濃縮を、４．１３に記載されているように実施した。２つの特徴的なＴ細胞集団を、５０ｎｇ／ｍＬのホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｐ８１３９）及び１ｕｇ／ｍＬのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｉ０６３４）中で５時間刺激した。細胞を、単一細胞セクレトームバーコードチップ（Ｉｓｏｐｌｅｘｉｓカタログ番号ＰＡＮＥＬ－１００１－８）に担持して、単一細胞セクレトミクス評価を行った。各Ｔ細胞型について、単一の細胞機能プロファイルを決定した。プロファイルを、エフェクター（グランザイムＢ、ＩＦＮ－ｇ、ＭＩＰ－１ａ、パーフォリン、ＴＮＦ－ａ、ＴＮＦ－ｂ）、刺激性（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１）、調節性（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－２２、ＴＧＦ－ｂ１、ｓＣＤ１３７、ｓＣＤ４０Ｌ）、化学誘引性（ＣＣＬ－１１、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ）、及び炎症性（ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－４）群に分類した。

ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の単離
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋マイクロビーズ、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０４５－１０１）及びＣＤ８＋マイクロビーズ、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０４５－２０１）を使用して、ＣＤ３＋Ｔ細胞から単離した。簡潔に述べると、細胞を特定の微粒子で標識し、ｍｉ－ｄｉＭＡＣＳ分離機（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０４２－４０１）及びＭＡＣＳマルチスタンド（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０４２－３０２）上に配置したＭＡＣＳ ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０４２－３０３）を通過させた。カラムに捕捉された濃縮された細胞を新鮮な収集チューブに投入し、洗浄し、Ｔ細胞完全培地中に再懸濁した。４．１０に記載のように、フローサイトメトリー分析のために、分離の前後に試料を収集した。

スピナーフラスコにおける撹拌条件下でのＴ細胞の増殖は、静置２Ｄ培養と比較して高いことがわかった（図２Ａ及び２Ｂ）。Ｃｏｓｔａｒｉｏｌらは、自動化ＳＴＲにおいて、初代Ｔ細胞の増殖が撹拌速度とともに増加することを示した。一致して、ＳＴＲにおいて、より高い撹拌速度でのＴ細胞増殖収率の増加が観察された（図２Ｃ）。栄養素の摂取を伴う細胞成長は、細胞培養物中の乳酸塩の蓄積をもたらし、効率的な細胞成長及び最終的な細胞療法産物の品質を阻害する。連続的な培地灌流は、細胞を保持しながら、栄養素の新鮮な供給及び有害な代謝産物の除去を可能にする。しかしながら、Ｔ細胞の５～１０ｍｍの直径のため、細胞の漏出及びフィルタの汚れが、Ｔ細胞培養培地灌流に関連する主要な問題である。接線流濾過系は、細胞保持系として魅力的な解決策を提供し、流体の動きが、汚れなしで培地灌流を可能にする。更に、ＡＴＦは、交互流のバックフラッシュによって誘導される自己クリーニングの追加の利点を提供する。ＲｅｐｌｉｇｅｎのＡＴＦにおける中空繊維の孔径が０．２ｍｍであるため、ＡＴＦは、ＳＴＲにおける連続培地灌流のための細胞保持デバイスとして用いられた。細胞保持及び培地交換のためのＡＴＦの初期試験は、フィルタの汚れ及び細胞損失を伴わない１ＶＶＤの灌流の成功をもたらした（表１）。０．５×１０^６細胞／ｍＬのＴ細胞でのＳＴＲの接種後、Ｔ細胞を、組換えヒトＩＬ－２の存在下でＣＤ３＋２８で３日間活性化した。３日間の活性化後、細胞を、組換えヒトＩＬ－２を含有するＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で増殖させた。乳酸塩レベルを監視すると、７日目～８日目までの乳酸塩レベルの３倍の増加が観察された（図３Ｃ）。これは、生細胞密度の２．１×１０^６細胞／ｍＬへの増加（図３Ｂ）、及び７日目の６．３ｍＭから８日目の５．４ｍＭへのグルコース濃度の低下（図３Ｄ）を伴い、培地灌流を保証する。８日目に培地灌流を可能にすることは、グルコース及び乳酸塩の定常状態レベルをもたらした（図３Ｃ及び３Ｄ）。更に、連続的な培地灌流は、Ｔ細胞の指数関数的成長を可能にし、最終的なＶＣＤとして約３５×１０^６細胞／ｍＬが得られた。対照的に、１ＬのＧ－Ｒｅｘ（登録商標）において、同じドナー由来のＴ細胞を活性化させ、増殖させた。Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）におけるＴ細胞の増殖は、１４日目に３．４×１０^６細胞／ｍＬのＶＣＤをもたらし、Ｔ細胞の２８倍の増殖が得られた。ＡＴＦ媒介灌流を有するＳＴＲにおける１４日間の培養は、Ｔ細胞の１６７倍の増殖をもたらした（図３Ｂ）。加えて、ＡＴＦ媒介細胞移動と組み合わせたＳＴＲにおける撹拌は、細胞生存率又は細胞増殖を減少させないことが観察された（図３Ｅ）。

Ｔｕｒｔｌｅらは、１：１のＣＤ４：ＣＤ８Ｔ細胞比でのＣＡＲ Ｔ細胞療法は、患者の９３％の骨髄寛解の達成をもたらしたことを臨床試験で報告した［１８］。図４Ａは、１４日間の増殖にわたるＳＴＲにおけるＣＤ４：ＣＤ８Ｔ細胞比の維持を示し、１：１の播種比が採取まで維持されることを示唆する。証拠の増加は、より高いパーセンテージのエフェクター記憶サブセットを含有するＣＡＲ Ｔ細胞産物において観察されたより低い有効性と比較して、最終的なＣＡＲ Ｔ細胞療法産物における多くのナイーブ、幹細胞記憶、及びセントラル記憶Ｔ細胞の存在が再発のない寛解をもたらしたことを示唆している。試験された条件でのＴ細胞の増殖は、約８０％の中央記憶サブセット、約１５％のナイーブ及び幹細胞記憶サブセット、１０％未満のエフェクター記憶及び末端分化サブセットを含有する最終的なＴ細胞亜型組成物をもたらすことが示されている（図４Ｂ）。この表現型は、活性化時に複製及び分化するナイーブＴ細胞及び幹細胞記憶Ｔ細胞のより高い複製能によって説明することができる。中央記憶Ｔ細胞のより高い複製能と組み合わせたナイーブ及びＴ記憶幹細胞（Ｔｓｃｍ）からのより高い分化は、中央記憶Ｔ細胞のより高いパーセンテージをもたらし得る。最終的なＴ細胞亜型の濃度は、最初のＴ細胞組成に依存するが、量子におけるＴ細胞の増殖は、同様の表現型の結果をもたらした。最終的な医薬品中の老化及び疲弊したＴ細胞の存在は、それぞれ、複製能の低下及びＴ細胞の機能不全状態によって説明される低い有効性をもたらす。ＳＴＲにおけるＴ細胞の増殖は、５％超の老化（ＣＤ５７＋ＫＬＲＧ１＋）又は枯渇Ｔ細胞（ＣＴＬＡ４＋／ＰＤ－１＋）をもたらすことが示された（図４Ｃ）。Ｔ細胞の多機能強度指数（商標）（ＰＳＩ）は、急性骨髄性白血病における臨床応答の予測であり、免疫療法においてバイオマーカーとして使用される可能性があった。免疫細胞のＰＳＩは、各細胞によって産生されるサイトカインの数に、各サイトカインの量を乗じて計算される。５時間の刺激後のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のＰＳＩの評価は、０日目～１４日目のエフェクターＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を示唆した。エフェクターシグネチャの増加に加えて、特にＣＤ８＋Ｔ細胞における刺激性シグネチャの増加が観察された（図５Ｄ）。多機能性Ｔ細胞は、抗原での刺激時に２＋のサイトカインを産生することが可能であり、重要な機能的特徴とみなされる。複数のサイトカインを産生する細胞の割合の評価は、複数のサイトカイン、具体的には５＋のサイトカインを産生するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの増加を示唆した（図５Ｂ）。更に、約１％のＣＤ４＋Ｔ細胞が１１個のサイトカインを産生し、約１％のＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化時に９つのサイトカインを産生した（図５Ｃ）。Ｔ細胞の表現型特性によって評価されるように、中央記憶表現型の増加は、複数のサイトカインを産生する細胞の数の増加に翻訳される可能性があった。

同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の生成は、ＴＣＲアルファコードＴＲＡＣ遺伝子座の欠失を必要とする。ＴＲＡＣ遺伝子座を削除するために種々の戦略が用いられ、それらは、効率が大きく異なる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、７０～８０％の効率を示し、ＴＡＬＥＮ－６０～８０％、ジンクフィンガーヌクレアーゼ－２０～４０％であり、及びｍｅｇａＴＡＬは、７５％の効率を示す。同種異系細胞療法産物中のＴＣＲ陽性Ｔ細胞の存在は、ＧＶＨＤをもたらし、濃縮及び製剤化の前に枯渇させる必要がある。ＴＣＲ陽性Ｔ細胞の枯渇は、ＳＴＲからＴ細胞を採取し、排他的なユニットを介して処理することを必要とし、これは、最適化されていない条件下での細胞の汚染及びインキュベーションの可能性を増加させる。最適化された条件を維持しながら、ＳＴＲにおける細胞の枯渇を促進する独自の磁気技術が開発された。加えて、ＳＴＲにおける細胞の枯渇は、追加の単位操作の必要性を回避し、汚染の可能性を減少させる。原理の証明として、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖後に枯渇した。図６Ａ及び表２に示されるように、３０分間の磁気細胞枯渇は、より低いパーセンテージ（＞９９％）及びより高いパーセンテージ（９７％）でＣＤ４＋Ｔ細胞を効果的に枯渇させる。ＦＤＡガイドラインは、系におけるビーズの効果を最小限に抑えることを確実にする、最終的な細胞療法産物中、０．００３％未満の残存ビーズのパーセンテージを要求している。磁気枯渇を１２０分間使用すると、細胞損失及び生存率の顕著な低下なしで、残存ビーズのパーセンテージの０．００１％への減少が示されている（図６Ｂ及び表３）。更に、独自の磁気技術は、異なるスケールで同様の結果を得るために潜在的にスケーリングされることができた。

望ましくないＴ細胞の枯渇後、濃縮及び製剤化を実施して、治療的使用に友好的な体積まで減少させる。細胞処理及び濃縮のための２つの自動化され、相互に排他的な閉鎖系を評価した。ｅｋｋｏ（商標）は、音響技術を使用して濃縮を実施し、ｋＳｅｐは、遠心力を使用した流動床形成によって細胞を濃縮する。表４に示されるように、細胞を少なくとも７倍濃縮し、細胞生存率を有意に低下させることなく７０％超の細胞を回収した。

これまでのところ、これは、Ｔ細胞製造における細胞保持及び培地灌流のためのＡＴＦの成功した応用を説明する最初の研究である。まとめると、このデータは、Ｔ細胞を臨床的に関連する用量に増殖すること、細胞培養物を精製すること、細胞産物の濃度及び製剤化における、閉鎖ＧＭＰ適合性のエンドツーエンドプラットフォームの能力を実証している（図１）。

追加の例示的な実施形態
実施形態１は、完全閉鎖系において免疫細胞培養物を産生する方法であって、免疫細胞を得ることと、免疫細胞を、免疫細胞完全培地を含む撹拌タンクバイオリアクタに導入することと、撹拌タンクバイオリアクタにおいて、免疫細胞を活性化試薬で活性化して、活性化された免疫細胞を産生することと、撹拌タンクバイオリアクタにおいて、活性化された免疫細胞を増殖させて、増殖した免疫細胞培養物を産生することと、バイオリアクタに接続された交互接線流濾過（ＡＴＦ）を介して、定義された量の新鮮な培地を使用済み培地と交換することと、撹拌タンクバイオリアクタにおいて、増殖した免疫細胞培養物を枯渇させて、枯渇した免疫細胞培養物を産生することと、完全閉鎖系において、その枯渇した免疫細胞培養物を採取して、採取された免疫細胞培養物を産生することと、完全閉鎖系において、（ｇ）の採取された免疫細胞培養物を濃縮することと、を含み、方法が、免疫細胞培養物の１％未満の損失をもたらす、方法である。

実施形態２は、免疫細胞完全培地が、緩衝剤、アミノ酸、微量元素、ビタミン、無機塩、グルコース、及び血清を含む、実施形態１の方法を含む。

実施形態３は、撹拌タンクバイオリアクタが、約１Ｌ～約２０００Ｌの体積容量を有する、実施形態１の方法を含む。

実施形態４は、免疫細胞が、免疫細胞を得る直前に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団から単離されるか、又はＰＢＭＣの集団から単離され、長期間保管され、次いで、免疫細胞を得る前に解凍される、実施形態１の方法を含む。

実施形態５は、免疫細胞が、多能性幹細胞の集団に由来する、実施形態１の方法を含む。

実施形態６は、多能性幹細胞の集団が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚幹細胞（ＥＳＣ）、又はそれらの組み合わせの集団である、実施形態５の方法を含む。

実施形態７は、免疫細胞を単離することが、ＰＢＭＣを、抗体複合体及び磁性粒子を含む溶液で洗浄して、ＰＢＭＣ及び単離されたＴ細胞を含む溶液を生成することと、単離されたＴ細胞を溶液から磁石で分離することと、を含む、実施形態４の方法を含む

実施形態８は、０．２５×１０^６Ｔ細胞／ｍＬ～２×１０^６Ｔ細胞／ｍＬが、バイオリアクタに導入される、実施形態１の方法を含む。

実施形態９は、方法が、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約９０×１０^６細胞／ｍＬの生存免疫細胞を含む免疫細胞培養物を産生する、実施形態１の方法を含む。

実施形態１０は、方法が、少なくとも約１億個の生存免疫細胞を含む免疫細胞培養物を産生する、実施形態１の方法を含む。

実施形態１１は、活性化試薬が、可溶性抗体複合体を含む、実施形態１の方法を含む。

実施形態１２は、免疫細胞を活性化することが、培地を活性化試薬とともに約７２時間の期間、３７℃で撹拌することを含む、実施形態１の方法を含む。

実施形態１３は、免疫細胞培養物が、０．１５～０．５回転／分（ＲＰＭ）の先端速度で撹拌される、実施形態１２の方法を含む。

実施形態１４は、培地が、活性化期間中、約ｐＨ５．０～約ｐＨ７．５のｐＨを有する、実施形態１の方法を含む。

実施形態１５は、増殖させることが、活性化期間後に新鮮な培地をバイオリアクタに添加することと、免疫細胞培養物の温度センサ、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、及び光学密度センサのうちの１つ以上を監視することと、監視に基づいて、免疫細胞培養物の温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、及び光学密度のうちの１つ以上を調整することと、を含む、実施形態１の方法を含む。

実施形態１６は、増殖させることが、増殖する免疫細胞培養物を試料採取することと、増殖するＴ細胞培養物の細胞成長及び増殖倍率を決定することと、細胞成長及び増殖倍率に基づいて、定義された量の新鮮な培地を使用済み培地と交換することと、を更に含む、実施形態１５の方法を含む。

実施形態１７は、新鮮な培地が、増殖する免疫細胞培養物の生存細胞密度が１．５×１０６細胞／ｍＬよりも大きい場合に、１容器体積／日（ＶＶＤ）の速度で使用済み培地と交換される、実施形態１６の方法を含む。

実施形態１８は、免疫細胞培養物を枯渇させることが、増殖後に表面活性化された磁気ビーズを免疫細胞培養物に添加することと、増殖した免疫細胞培養物及びビーズを約３０分間撹拌することと、標的細胞の集団を増殖した免疫細胞培養物から磁石で単離することと、を含む、実施形態１のうちのいずれかの方法を含む。

実施形態１９は、ビーズが、１：１のビーズ対細胞の比でバイオリアクタに添加される、実施形態１８の方法を含む。

実施形態２０は、採取することが、免疫細胞培養物を、撹拌感謝バイオリアクタから、撹拌タンクバイオリアクタに接続された滅菌容器にポンプ輸送することと、免疫細胞培養物を、ＡＴＦから、ＡＴＦの採取ラインに接続された滅菌容器中にポンプ輸送することと、を含む、実施形態１の方法を含む。

実施形態２１は、撹拌タンクバイオリアクタとＡＴＦとの間の接続が閉鎖されている、実施形態２０の方法を含む。

実施形態２２は、撹拌タンクバイオリアクタから滅菌容器への細胞培養物のポンプ輸送が、免疫細胞培養物が、撹拌タンクバイオリアクタにおいて連続的に撹拌されながら、実施される、実施形態２０の方法を含む。

実施形態２３は、採取することが、約１４日の全細胞培養の後に生じる、実施形態１の方法を含む。

実施形態２４は、濃縮することが、採取された細胞培養物の遠心分離、沈殿後の上清除去、濾過、音響細胞処理、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態１の方法を含む。

実施形態２５は、採取された細胞培養物が、約２５０Ｇ～３，０００Ｇで約６０分間、遠心分離される、実施形態２４の方法を含む。

実施形態２６は、採取された細胞培養物の遠心分離が、約２０ｍＬ／分～約３０ｍＬ／分の流速で所望の細胞のバイオマスを含む流動床を生成する、実施形態２５の方法を含む。

実施形態２７は、流動床が、採取及び／又は保管のために、滅菌及び密閉された容器にポンプ輸送される、実施形態２６の方法を含む。

実施形態２８は、音響細胞処理が、採取された細胞培養物を、１２０ワット及び約５０ｍＬ／分～約８０ｍＬ／分の流速で音響流動床を通して循環させることを含む、実施形態２４の方法を含む。

実施形態２９は、撹拌タンクバイオリアクタにおいて免疫細胞の活性化及び増殖が、５つ超のサイトカインを産生し、かつ７５％超の中央記憶Ｔ細胞、１０％未満のエフェクター記憶Ｔ細胞、及び１０％超のナイーブ／幹記憶Ｔ細胞を有するＴ細胞培養物をもたらす、実施形態１の方法を含む。

実施形態３０は、濃縮されたＴ細胞が、凍結保存される、実施形態１のうちのいずれかの方法を含む。

実施形態３１は、実施形態１の方法によって産生されたＴ細胞の集団である。

実施形態３２は、実施形態１の方法によって産生されたＴ細胞を含む、Ｔ細胞ベースの療法である。

本明細書では特定の実施形態を例示及び記載しているが、特許請求の範囲は、記載及び図示される部分の特定の形態又はアレンジメントに限定されるべきではないことが理解されるべきである。本明細書では、例示的な実施形態が開示され、特定の用語が用いられるが、それらは、限定の目的ではなく、一般的かつ説明的な意味でのみ使用される。上記の教示に照らして、実施形態の修正及び変形が可能である。したがって、実施形態は、具体的に記載される以外の方法で実施され得ると理解されるべきである。

本明細書中に言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されるのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (32)

1. 完全閉鎖系において免疫細胞培養物を産生する方法であって、
   ａ）免疫細胞を得ることと、
   ｂ）前記免疫細胞を、免疫細胞完全培地を含む撹拌タンクバイオリアクタに導入することと、
   ｃ）前記撹拌タンクバイオリアクタにおいて、前記免疫細胞を活性化試薬で活性化して、活性化された免疫細胞を産生することと、
   ｄ）前記撹拌タンクバイオリアクタにおいて、前記活性化された免疫細胞を増殖させて、増殖した免疫細胞培養物を産生することと、
   ｅ）前記バイオリアクタに接続された交互接線流濾過（ＡＴＦ）を介して、定義された量の新鮮な培地を使用済み培地と交換することと、
   ｆ）前記撹拌タンクバイオリアクタにおいて、前記（ｄ）の増殖した免疫細胞培養物を枯渇させて、枯渇した免疫細胞培養物を産生することと、
   ｇ）前記完全閉鎖系において、前記（ｆ）の枯渇した免疫細胞培養物を採取して、採取された免疫細胞培養物を産生することと、
   ｈ）前記完全閉鎖系において、前記（ｇ）の採取された免疫細胞培養物を濃縮することと、を含み、
   前記方法が、前記免疫細胞培養物の１％未満の損失をもたらす、方法。
2. 前記免疫細胞完全培地が、緩衝剤、アミノ酸、微量元素、ビタミン、無機塩、グルコース、及び血清を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記撹拌タンクバイオリアクタが、約１Ｌ～約２０００Ｌの体積容量を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記免疫細胞が、ａ）において前記免疫細胞を得る直前に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団から単離されるか、又はＰＢＭＣの集団から単離され、長期間保管され、次いで、ａ）において前記免疫細胞を得る前に解凍される、請求項１に記載の方法。
5. 前記免疫細胞が、多能性幹細胞の集団に由来する、請求項１に記載の方法。
6. 前記多能性幹細胞の集団が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚幹細胞（ＥＳＣ）、又はそれらの組み合わせの集団である、請求項６に記載の方法。
7. 前記免疫細胞を単離することが、ａ）前記ＰＢＭＣを、抗体複合体及び磁性粒子を含む溶液で洗浄して、前記ＰＢＭＣ及び単離されたＴ細胞を含む溶液を生成することと、ｂ）前記単離されたＴ細胞を前記溶液から磁石で分離することと、を含む、請求項４に記載の方法。
8. ０．２５×１０^６Ｔ細胞／ｍＬ～２×１０^６Ｔ細胞／ｍＬが、前記バイオリアクタに導入される、請求項１に記載の方法。
9. 前記方法が、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約９０×１０^６細胞／ｍＬの生存免疫細胞を含む免疫細胞培養物を産生する、請求項１に記載の方法。
10. 前記方法が、少なくとも約１億個の生存免疫細胞を含む免疫細胞培養物を産生する、請求項１に記載の方法。
11. 前記活性化試薬が、可溶性抗体複合体を含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記免疫細胞を活性化することが、前記培地を前記活性化試薬とともに約７２時間の期間、３７℃で撹拌することを含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記免疫細胞培養物が、０．１５～０．５回転／分（ＲＰＭ）の先端速度で撹拌される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記培地が、前記活性化期間中、約ｐＨ５．０～約ｐＨ７．５のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
15. 前記増殖させることが、
    ｉ）（ｃ）における活性化期間の後で、新鮮な培地を前記バイオリアクタに添加することと、
    ｉｉ）前記免疫細胞培養物の温度センサ、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、及び光学密度センサのうちの１つ以上を監視することと、
    ｉｉｉ）前記監視に基づいて、前記免疫細胞培養物の温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、及び光学密度のうちの１つ以上を調整することと、を含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記増殖させることが、ｉｖ）増殖する前記免疫細胞培養物を試料採取することと、ｖ）増殖するＴ細胞培養物の細胞成長及び増殖倍率を決定することと、ｖｉ）前記細胞成長及び増殖倍率に基づいて、定義された量の新鮮な培地を使用済み培地と交換することと、を更に含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記新鮮な培地が、前記増殖する免疫細胞培養物の生存細胞密度が１．５×１０^６細胞／ｍＬよりも大きい場合に、１容器体積／日（ＶＶＤ）の速度で使用済み培地と交換される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記枯渇させることが、
    ｉ）ｄ）における前記増殖後に、表面活性化された磁気ビーズを前記免疫細胞培養物に添加することと、
    ｉｉ）前記増殖した免疫細胞培養物及びビーズを約３０分間撹拌することと、
    ｉｉｉ）磁石を用いて、前記増殖した免疫細胞培養物から標的細胞の集団を単離することと、を含む、請求項１に記載の方法。
19. 前記ビーズが、１：１のビーズ対細胞の比で前記バイオリアクタに添加される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記採取することが、ｉ）前記免疫細胞培養物を、前記撹拌感謝バイオリアクタから、前記撹拌タンクバイオリアクタに接続された滅菌容器にポンプ輸送することと、ｉｉ）前記免疫細胞培養物を、前記ＡＴＦから、前記ＡＴＦの採取ラインに接続された前記滅菌容器中にポンプ輸送することと、を含む、請求項１に記載の方法。
21. 前記撹拌タンクバイオリアクタと前記ＡＴＦとの間の前記接続が閉鎖されている、請求項２０に記載の方法。
22. 前記撹拌タンクバイオリアクタから前記滅菌容器への前記細胞培養物の前記ポンプ輸送が、前記免疫細胞培養物が、前記撹拌タンクバイオリアクタにおいて連続的に撹拌されながら、実施される、請求項２０に記載の方法。
23. 前記採取することが、約１４日の全細胞培養の後に生じる、請求項１に記載の方法。
24. 前記濃縮することが、前記採取された細胞培養物の遠心分離、沈殿後の上清除去、濾過、音響細胞処理、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
25. 前記採取された細胞培養物が、約２５０Ｇ～３，０００Ｇで約６０分間、遠心分離される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記採取された細胞培養物の遠心分離が、約２０ｍＬ／分～約３０ｍＬ／分の流速で所望の細胞のバイオマスを含む流動床を生成する、請求項２５に記載の方法。
27. 前記流動床が、採取及び／又は保管のために、滅菌及び密閉された容器中にポンプ輸送される、請求項２６に記載の方法。
28. 前記音響細胞処理が、前記採取された細胞培養物を、１２０ワット及び約５０ｍＬ／分～約８０ｍＬ／分の流速で音響流動床を通して循環させることを含む、請求項２４に記載の方法。
29. 前記撹拌タンクバイオリアクタにおける前記免疫細胞の前記活性化及び前記増殖が、５つ超のサイトカインを産生し、かつ７５％超の中央記憶Ｔ細胞、１０％未満のエフェクター記憶Ｔ細胞、及び１０％超のナイーブ／幹記憶Ｔ細胞を有するＴ細胞培養物をもたらす、請求項１に記載の方法。
30. 濃縮されたＴ細胞が、凍結保存される、請求項１に記載の方法。
31. 請求項１に記載の方法によって産生されたＴ細胞の集団。
32. 請求項１に記載の方法によって産生されたＴ細胞を含む、Ｔ細胞ベースの療法。