JP2025109839A - トランスジェニックブタ、その作製方法と用途、およびヒト免疫系マウスの作製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】異種移植用の改善されたブタ胸腺組織の提供。
【解決手段】ブタゲノムの１か所以上の天然のＳＬＡ遺伝子座に挿入した、１種類以上のＨＬＡ Ｉポリペプチドおよび／または１種類以上のＨＬＡ ＩＩポリペプチドをコードする１種類以上のヌクレオチド配列を含むトランスジェニックブタ、および当該トランスジェニックブタに由来する胸腺組織。
【選択図】図３

Description

他の出願の相互参照
本願は、２０１９年１０月２２日に出願された米国特許出願第６２／９２４，２２８号、および２０１９年１０月２５日に出願された米国特許出願第６２／９２５，８５９号の関連出願であり、これに基づく優先権を主張するものである。なお、上記二つの特許出願は参照としてその全体が本明細書中に組み入れられる。

政府の権利についての説明
本発明は米国国立衛生研究所により授与された助成金番号ＡＩ０４５８９７の下で政府援助によってなされた。連邦政府は本発明において一定の権利を有している。

本開示は、ブタゲノムの１か所以上の天然のＳＬＡ遺伝子座に挿入した、１種類以上のＨＬＡ Ｉポリペプチド および／または１種類以上のＨＬＡ ＩＩポリペプチドをコードする１種類以上のヌクレオチド配列を含むトランスジェニックブタ、その作製法および利用法を提供する。

また本開示は、ヒト免疫系マウスを作製する方法であって、改善された方法を提供する。

ヒト免疫系（ＨＩＳ）マウスは、ヒトの自己免疫疾患、移植および感染性疾患の研究に関して非常に大きな可能性を有している。免疫不全マウスにおいて安定なヒト免疫系を形成させるために必要とされる主要組織は、高度に機能的で多様なヒトＴ細胞レパートリーを作り出すヒト胎児胸腺組織である。出生後のヒト胸腺組織は、それをマウス腎被膜下に移植してもＴ細胞増殖能を欠如する（本来の増殖能であれば、その胸腺組織は数多くのヒトＴ細胞を生成して腎臓よりも大きくなり得るのであるが）。免疫不全マウスにおいて、ヒトＴ細胞はある程度、マウスの天然胸腺中で発生するが、その胸腺機能は異常で不全であり、またごく少数のヒトＴ細胞が生成するに過ぎず、適正な免疫寛容誘導に必要な正常な胸腺教育も起こらない。したがって、ＨＩＳマウスモデルにとっては、ヒト胎児胸腺組織が最適であると考えられるのである。しかし、研究用にヒト胎児組織を利用することはできない。したがって、別の組織供給源を必要とする。

ブタ胎仔胸腺組織が代替物となり得るのである。ブタ（ＳＷ）胎仔胸腺（ＴＨＹ）組織も、免疫不全マウスに移植した場合にヒト（ＨＵ）胎児ＴＨＹ組織と同様の増殖特性を有するものであり、ヒト胸腺細胞の安定増殖およびヒトＣＤ３４＋細胞の末梢免疫再構成を高度に支持する。しかし、ＳＷ胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）にはＨＬＡ 分子が存在しないので、通常型Ｔ細胞のネガティブ選択およびＴＥＣが産生するＨＬＡ拘束性抗原（ＴＲＡ）を認識する制御性Ｔ細胞のポジティブ選択は限定的となる。また、個体のＨＬＡとの関係において外来抗原を認識することのできるヒトＴ細胞のポジティブ選択も限定的となる。したがって、ＨＩＳマウスを作製するために胎児ブタ胸腺組織を利用する場合には、改善が必要である。さらに、他の適用（ヒトへの異種移植など）にブタ胸腺組織を用いる場合にも、改善が必要となる。

本明細書では、胎児ブタ胸腺組織を用いて改善した、ヒト免疫系マウスの作製法について説明する。また、本明細書ではトランスジェニックブタについても説明する。

本明細書においては、トランスジェニックブタ、そのようなブタを作製する方法、およびそのようなブタの用途を提供する。

一実施態様においては、該トランスジェニックブタは、ブタゲノムの１か所以上の天然のＳＬＡ遺伝子座に挿入した、１種類以上のＨＬＡ Ｉポリペプチドおよび／または１種類以上のＨＬＡ ＩＩポリペプチドをコードする１種類以上のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施態様においては、該ヒトＨＬＡは、ＨＬＡ ＩポリペプチドおよびＨＬＡ ＩＩポリペプチドから成る群から選択される。いくつかの実施態様においては、該ヒトＨＬＡ Ｉは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦおよびＨＬＡ－Ｇから成る群から選択される。いくつかの実施態様においては、該ＨＬＡ ＩポリペプチドはＨＬＡ－Ａ２である。

いくつかの実施態様においては、該ＨＬＡ ＩＩポリペプチドは、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲから成る群から選択される。いくつかの実施態様においては、該ＨＬＡ ＩＩポリペプチドはＨＬＡ－ＤＱ８またはＳＬＡ－Ｄｒａである。いくつかの実施態様においては、該ＨＬＡ－ＤＱ８ポリペプチドは、ＨＬＡ－ＤＱ８（ＨＬＡ－ＤＱＡｌ：０３：０１：０１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１：０３：０２：０１）をコードする２シストロン性ベクターによって、天然のＳＬＡ－ＤＱα遺伝子座を標的とする。

いくつかの実施態様においては、該天然のＳＬＡ遺伝子座は、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２またはＳＬＡ－３である。いくつかの実施態様においては、該ＳＬＡ遺伝子座はＳＬＡ－ＤＱαまたはＳＬＡ－ＤＲ遺伝子座である。いくつかの実施態様においては、該核酸を天然のＳＬＡプロモーターの後に挿入する、または組み込む。いくつかの実施態様においては、ＨＬＡポリペプチドをコードする該核酸を、天然のＳＬＡ遺伝子座のイントロン１／エクソン２接合部に挿入する、または組み込む。

いくつかの実施態様においては、標的ベクターを用いて、ＨＬＡポリペプチドをコードする該核酸を、天然のＳＬＡ遺伝子座に挿入または組み込む。いくつかの実施態様においては、該ベクターは２シストロン性である。いくつかの実施態様においては、該ベクターはプロモーター不含である。

いくつかの実施態様においては、該ベクターは高効率ＩＲＥＳ要素をさらに含む。

いくつかの実施態様においては、該ベクターはポリアデニル化部位をさらに含む。いくつかの実施態様においては、該ポリアデニル化部位はウサギβグロビンである。

また、本明細書においては、該トランスジェニックブタの作製方法、および用途（ヒト対象への異種移植を含むが、これのみに限定されるものではない）を提供する。

本明細書においては、ヒト免疫系マウスを作製するための方法であって、改良された方法を提供する。

いくつかの実施態様においては、該方法は、マウスの胸腺を摘出すること、および該マウスに、ブタ胎仔胸腺組織およびヒトＣＤ３４＋細胞を導入することを含む。いくつかの実施態様においては、該ヒトＣＤ３４＋細胞は臍帯血由来である。

いくつかの実施態様においては、該方法は、マウスの胸腺を摘出すること、および本明細書中に記載のようなトランスジェニックブタのブタ胎仔胸腺組織を導入することを含む。

本発明を具体的に説明する目的で、本発明の特定の実施態様を図面で示す。しかしながら、本発明は図面に示される実施態様の詳細な構成および手段に限定されるものではない。

ＳａｃｈｓミニブタのＧＧＴＡ１遺伝子座への多遺伝子挿入。図１Ａは、ＣＲＩＰＳＲ支援相同組み換えによって、同一のゲノム標的アームセグメント（青色）間に挿入した１０．５ｋｂｐの導入遺伝子カセットの模式図である。このカセットは、自己スプライシング２Ａ要素（黄色）によって連結された２つの２シストロン性単位を含む（これら２つはいずれも、偏在発現性ＣＡＧプロモーターの制御下にある）。図１Ｂは、クローン化トランスジェニックブタ（右側のピーク）および非トランスジェニック対照（左側のピーク）から取得した末梢血リンパ球のＦＣＭ分析の結果である。 ヒトＩＬ３受容体をコードする２シストロン性カセットを天然のブタＩＬＲａプロモーターの後に挿入した、標的挿入。図２Ａは、ＩＬ３Ｒａ遺伝子の下流ゲノム領域を示す（上）。ｐＡ部位を含むＩＬ３Ｒａ遺伝子のエクソン２を青色で示す。ｐＡ部位を含むＳＬＣ２５Ａ６遺伝子のエクソン２を赤色で示す。ヒトＩＬ３Ｒａ鎖およびＩＬ３Ｒｂ鎖を付加するための標的ベクターをその下に示す。同一ゲノム配列間（無地の青色および赤色）での相同組み換えによって、１５．７ｋｂｐの天然ゲノム配列が置換されるが、このゲノム配列は、７．１ｋｂｐのヒトＩＬ３Ｒ鎖コード配列を含む天然のＩＬ３Ｒａ遺伝子の大部分を含み、またＳＬＣ２５Ａ６遺伝子の末端には（Ｔ２Ａ要素を介して）ＧＦＰ ＣＤＳ（緑色）がタグ付される。図２Ｂは、プロモータートラップ・ベクターで形質転換した胎仔線維芽細胞の、第２巡目のフロー選別を示す。低ＧＦＰ蛍光細胞（白色）および高蛍光細胞（黄色）を別々に回収した。図２Ｃは、フロー選別集団の標的分析の結果である。プライマー対を用いてゲノムＤＮＡの上流末端および下流末端のＰＣＲを実施したのであるが、それらプライマー対は、ベクター配列の外側に位置する１つのプライマーを含み、それは低蛍光画分および高蛍光画分の両方において上流端を正確に標的化していることを示すバンドを生成し、また他方、下流端のＰＣＲでは、高蛍光集団においてのみ予想サイズのバンドを生成した。図２Ｄは、高蛍光選別集団の細胞のＳＣＮＴによって生成した８胎仔の３９日目に行ったゲノムＤＮＡの標的分析の結果を示す。８胎仔全てにおいて、上流端（ＵＳ）および下流端（ＤＳ）の両方で正確に標的化していることを示すバンドを生成した。図２Ｅは、８匹のトランスジェニック胎仔の肝細胞における遺伝子発現ＲＴ－ＰＣＲ分析の結果である。予想通り、８胎仔全てにおいて、組み換えＳＬＣ２５Ａ６－ＧＦＰ遺伝子の転写物が産生された。また、８胎仔全てにおいて、ヒトＩＬ３Ｒａ－ＩＲＥＳ－ＩＬ３Ｒｂカセットの転写物が適正なスプライシングで産生された。 ＳＬＡ Ｉ遺伝子を標的とするＨＬＡ－Ａ２を示す。上の模式図は天然の遺伝子である。下の模式図はプロモーター不含の標的ベクターである。プロモーター不含の標的ベクターを用いて、天然遺伝子座のＳＬＡイントロン１／エクソン２接合部付近のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ニック対によって促進された組み換えの結果として、ＨＬＡ－Ａ２の成熟コード配列（Ａ＊０２：０１）に融合したヒトＢ２ミクログロブリンの成熟型から成るカセットが付加される。融合蛋白質のリーダーペプチドはＳＬＡ１のエクソン１によって提供され、得られる転写物はウサギβグロビンのポリアデニル化部位で終結する。ベクター設計がプロモーター不含のものであるため、ヒトＢ２ｍ／ヒトＨＬＡ－Ａ２融合物を発現する細胞が非常に高い割合でＤＱＡ遺伝子を正確に標的化する。 ＩＦＮ－ｇ存在下（右側の曲線）またはＩＦＮ－ｇ非存在下（左側の曲線）で６日間培養後に、汎ハプロタイプ抗ブタＤＲまたは抗ブタＤＱ抗体で染色した細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。 ＳＬＡ－ＤＱＡ遺伝子を標的とするＨＬＡ－ＤＱ８を示す。上の模式図は天然の遺伝子である。下の模式図はプロモーター不含の標的ベクターである。プロモーター不含の標的ベクターを用いて、天然遺伝子座のＤＲＡイントロン１／エクソン２接合部付近のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ニック対によって促進された組み換えの結果として、ヒトＤＱ８α（ＤＱＡ＊０３：０１）、ＩＲＥＳ要素および前駆体型ＤＱ８β（ＤＱＢ１＊０３：０２）（ウサギβグロビンのポリアデニル化部位で終結する）の成熟型から成るカセットが付加される。ベクター設計がプロモーターを含まないものであるため、ヒトＤＱ８αおよびＤＱ８βを発現する細胞が非常に高い割合でＤＱＡ遺伝子を正確に標的化する。 ＨＩＳマウスにおけるヒトＴ細胞恒常性に関する、胸腺および末梢ＡＰＣ間のＨＬＡ共有の重要性を示す試験である。図６Ａは、実験設計の概要図である。図６Ｂは、養子免疫伝達から１０日後の各タイプのマウスにおける、増殖（Ｋｉ６７＋）Ｔ細胞の割合を示すグラフである。 各種ＨＩＳマウスにおけるヒト免疫再構成の比較を示す。図７Ａは、移植後の表記時間経過における表記マウスの末梢血中に存在するヒトＣＤ３＋細胞の数に関するグラフである。図７Ｂは、移植後１５週目の代表的マウスのＴ細胞の表現型を示すフローサイトメトリー分析である。 ＨＬＡ－Ａ２＋ヒト胸腺ではＭＡＲＴ１ ＴＣＲのポジティブ選択が起こるがブタ胸腺では起こらないことを示す。レンチウイルスを用いてＣＤ３４細胞にＧＦＰ－ＭＡＲＴＩ ＴＣＲを形質導入し、表記ＴＨＹ移植片を受容する胸腺摘出ＮＳＧマウスにその細胞を注入した。このグラフは、ＨＬＡ－Ａ２＋ ＨＵ ＴＨＹ移植片と比較して、ＳＷおよびＨＬＡ－Ａ２陰性ＨＵ ＴＨＹ移植片では、ＧＦＰ＋ＭＡＲＴ１＋ ＴＣＲ＋（ＭＡＲＴ１四量体で検出）である胸腺細胞の数が減少することを示している。 ＨＬＡ拘束性ＴＣＲ、クローン５（ＨＬＡ－ＤＱ８によって提示されるインスリンＢ９－２３に特異的）をヒト造血幹細胞に導入した場合には、ＨＩＳマウスのＨＬＡ－ＤＱ８ヒト胸腺においてポジティブ選択されるが、造血幹細胞がＨＬＡ－ＤＱ８を発現する場合にのみネガティブ選択されることの証拠を示している。ＨＬＡ－ＤＱ８ Ｔｇ ＮＳＧマウスは、ＨＬＡ－ＤＱ８＋ヒト胎児胸腺およびクローン５ＴＣＲで形質導入したＨＬＡ－ＤＱ８またはＤＱ８－胎児肝ＣＤ３４＋ ＨＳＣを受容した。図９Ａは、ＤＱ８－陰性ＨＳＣと比較して、ＤＱ８＋を受容するマウスの胸腺では、ＧＦＰ＋クローン５ＣＤ４／８ＤＰおよびＳＰ胸腺細胞の絶対数が減少したことを示す。図９Ｂは、ＤＱ８－ＨＳＣと比較して、ＤＱ８＋を受容するマウスの胸腺では、二重陰性胸腺細胞においてＴ細胞系譜に方向付けられた（ＣＤ１ａ＋）クローン５（ＧＦＰ＋）細胞の濃縮が起こることを示している。

本明細書中において、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが次いでペプチド、ポリペプチド、または蛋白質に翻訳されるプロセスを指す。該ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来するのであれば、発現は真核細胞におけるｍＲＮＡスプライシングを含むことがある。

本明細書中の用語「単離された」は、実質的に他の物質を含まない分子または生物学的製剤または細胞材料を指す。

本明細書中の用語「機能的」は、特定の特殊化した効果を達成することを目的として、分子、生物学的製剤、または細胞材料を改変することに関連して用いることもある。

本明細書中の用語「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さの多量体型ヌクレオチドと同義語として用いるものである。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、または多重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、もしくはプリンおよびピリミジン塩基またはその他の天然、化学的または生化学的に改変した、非天然、または誘導体であるヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むものであるが、これらのみに限定されるものではない。

用語「蛋白質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は互いに同義語であり、最も広義の意味においては、アミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣物の２つ以上のサブユニットの化合物を指す。そのサブユニットはペプチド結合で連結されるものであってもよい。他の一局面においては、該サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどで連結されるものであってもよい。１つの蛋白質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含むことが必須であるが、蛋白質配列またはペプチド配列が含み得るアミノ酸最大数には制限がない。本明細書中の用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然あるいは合成アミノ酸のいずれかを指し、グリシンおよびＤ光学異性体およびＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体およびペプチド模倣物をも含む。

本明細書中において、「標的とする」、「標的とする（三人称単数）」または「標的とすること」は、ポリヌクレオチドの共有結合骨格の部分的切断または非切断を意味する。一実施態様においては、不活性化Ｃａｓ蛋白質（またはｄＣａｓ）は、ガイドＲＮＡを伴うＤＮＡ結合複合体の形成後に、ヌクレオチド配列を標的化する。ｄＣａｓのヌクレアーゼ活性は完全または部分的に不活性化されているので、ｄＣａｓは該配列を開裂または完全開裂させることなく該配列に結合するのである。いくつかの実施態様においては、ｄＣａｓによる遺伝子配列またはそのプロモーターの標的化は、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の転写および／または発現を阻害または妨害する。

用語「Ｃａｓ９」は、その名称が示すように、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを意味するものである。本明細書に記載するＣａｓ９の非限定的な例としては、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｇ３ＥＣＲ１（ＣＡＳ９＿ＳＴＲＴＲ）のＣａｓ９または黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９、ならびにヌクレアーゼ不活性型（ｄｅａｄ）Ｃａｓ９、それらのオルソログおよび生物学的同等物が挙げられる。オルソログとしては、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（「ｓｐＣａｓ９」）、サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）由来のＣａｓ９；および各種細菌種（アシッドアミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐｐ．およびフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２を含む）由来のＣｐｆ１（Ｃａｓ９に類似した切断機能を発揮する）が挙げられるが、それらのみに限定されるものではない。

本明細書中の用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、クラスター化規則性配置の短い回文繰り返し配列の経路に基づく配列特異的遺伝子操作技術を指す。ＣＲＩＳＰＲは、遺伝子編集および／または遺伝子制御を行う目的、ならびに単純に蛋白質を特定のゲノム位置に標的化する目的で用いることができる。遺伝子編集は、欠失、挿入、または塩基置換をポリヌクレオチド配列に導入することによって標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を変更する、遺伝子工学の１手法を指す。遺伝子制御は、特定の遺伝子産物（蛋白質またはＲＮＡなど）の産生を増加または減少させることを意味する。

本明細書中の用語「ｇＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」は、ＣＲＩＳＰＲ技術を利用して修正する目的で特異的遺伝子を標的とするために用いるガイドＲＮＡ配列を指す。標的特異性に関してｇＲＮＡおよびドナー治療ポリヌクレオチドを設計する技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｄｏｅｎｃｈら、２０１４、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（１２）：１２６２－７、Ｍｏｈｒら、２０１６、ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ３２３２－３８、およびＧｒａｈａｍら、２０１５、 Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． １６：２６０。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む融合ポリヌクレオチド；またはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むポリヌクレオチドを含む、あるいは本質的にそれからなる、またはさらにそれから成る。いくつかの局面においては、ｇＲＮＡは合成物である（Ｋｅｌｌｅｙら、２０１６、Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３３：７４－８３）。本明細書において記載するｇＲＮＡの生物学的同等物としては、Ｃａｓ９またはそれと同等物を、特定のヌクレオチド配列（細胞のゲノムの特定の領域など）へ導くことのできるポリヌクレオチドまたは標的化分子が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。

用語「胚」は、多細胞生物の発生初期を指す。一般に、有性生殖をする生物では、胚発生は、受精直後に開始し、身体構造（組織および臓器など）の形成を通じて継続するライフサイクルの一部を意味する。各胚は１個の接合体として発生を開始するが、これは配偶子の融合（すなわち、オスの精子細胞によるメスの卵細胞の受精）の結果得られる単一細胞である。胚発生の最初の段階で、単一細胞接合体は急速な多数回の細胞分裂（卵割とよぶ）を起こして胞胚を形成する。

本明細書に記載の「トランスジェニック」および文法上の同等物は、（もし存在するならば）相同型かつ内在型の遺伝子が全体としてあるいは部分的に残存するように、ドナー動物ゲノムの異種同一遺伝子部位ではなく内在性部位でもない部位において、異なる生物種由来の非天然遺伝子を導入するための改変が加えられているドナー動物のゲノムを含む。本明細書に記載の「導入遺伝子（トランスジーン）」、「トランスジェニック」、および文法上の同等物は、再プログラム化ゲノム、ノックアウトまたは本明細書に記載するような他の改変については含まない。

本明細書に記載の「免疫寛容」は、移植片レシピエントが、例えばドナー抗原に対して、免疫応答（あるいはそれ以外では、例えば、レシピエント内に非自己ＭＨＣ抗原が入り込んだときに応答することが想定される）を開始する能力の阻害または低下することを意味する。免疫寛容は、液性応答、細胞性応答、または液性応答と細胞性応答の両方を含み得る。免疫寛容の概念は、完全免疫寛容および部分的免疫寛容の両方を含む。言い換えれば、本明細書中の免疫寛容とは、移植片レシピエントが免疫応答、例えば、ドナー抗原に対する免疫応答を開始する能力を阻害する、任意の程度の阻害を含むものである。

本明細書に記載の「造血幹細胞」は、発生して成熟骨髄細胞および／またはリンパ系細胞になることのできる細胞を指す。造血幹細胞は骨髄系譜および／またはリンパ系譜の長期再増殖が可能であることが好ましい。レシピエントまたはドナーの臍帯血に由来する幹細胞は、本開示の方法に用いることができる。

本明細書に記載の「ミニブタ」は、完全にまたは部分的に近交系であるミニブタを指す。

本明細書に記載の「移植片」は、身体部分、臓器、組織、細胞、またはその部分を指す。

略語
ＳＷ－ブタ
ＨＵ－ヒト
ＴＥＣ－胸腺上皮細胞
ＴＭＣ－胸腺間葉細胞
ＷＢＣ－白血球
ＤＰ－二重陽性細胞（ＣＤ４＋かつＣＤ８＋）
ＳＰ－単一陽性細胞（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれか）
Ｔｒｅｇ－制御性Ｔ細胞
ＬＮ－リンパ節
ＴＲＡ－組織特異的自己抗原
ＨＳＣ－ヒト造血細胞
ＮＳＧ－ＮＯＤ ｓｃｉｄ共通γ鎖ノックアウト
ＳＣＮＴ－体細胞核移植

本開示は、ブタゲノムのＳＬＡ遺伝子座に挿入された、ＨＬＡ ＩまたはＨＬＡ ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むトランスジェニックブタ、そのようなトランスジェニックブタを作製する方法、およびそのようなトランスジェニックブタを用いる方法を提供する。

本開示はまた、トランスジェニックブタ胎仔の胸腺を用いて作製したヒト免疫系（ＨＩＳ）マウスならびにブタ胎仔の胸腺および臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞を用いて作製したヒト免疫化マウス、およびそのようなＨＩＳマウスを作製する方法を提供する。

トランスジェニックブタ
以前に本発明者らは、ブタ胸腺移植片においてヒト胸腺細胞の安定増殖が起こることを示している（Ｎｉｋｏｌｉｃら、１９９９； Ｓｈｉｍｉｚｕら、２００８； Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒら、２０１４）。しかし、ヒト胎児胸腺に比べて、ブタで生成させた末梢ヒトＴ細胞は、ＨＬＡ拘束性免疫機能および恒常性ならびに組織特異的自己抗原に対する免疫寛容においてわずかな低下を示す。ブタ胸腺組織にトランスジェニックＨＬＡ分子を付加することによって、これらの制限の大部分を克服できる可能性がある。したがって、本明細書では、一部のブタ白血球抗原（ブタにおいてＨＬＡに相当するＳＬＡ）分子の代わりに共通ＨＬＡ対立遺伝子を発現させたトランスジェニックブタの複数の系統について開示する。これらのトランスジェニックブタは、ＨＩＳマウスを作成することを含む複数の目的において胸腺組織の供給源として、およびドナー組織として利用することができる。共通ＨＬＡ分子の導入遺伝子発現によって、ＨＬＡ拘束性ヒトＴ細胞のポジティブ選択および末梢においてヒト抗原提示細胞（ＡＰＣ）と効率的に相互作用する機能的制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の生成が改善し、またヒトＴＲＡ反応性Ｔ細胞のネガティブ選択も改善して、自己免疫リスクを低減するであろう。

ブタ胸腺－腎臓移植片を受容するヒヒでは、ブタ胸腺移植片におけるデノボレシピエント（ヒヒ）胸腺細胞増殖、末梢における最近の胸腺移民の出現、およびＥｌｉｓｐｏｔアッセイおよびＭＬＲアッセイでのドナー特異的非応答性、ならびに非Ｇａｌ天然抗体低下の証拠が示されている。後者はブタ腎臓による吸収を反映している可能性があるが、これら異種移植片にはＩｇＭ結合が最低限しか検出されず、補体結合もなく有意な病変も認めなかった。したがって、このモデルによって得られた結果は、霊長類において免疫寛容を誘導する胸腺－腎臓複合異種移植片の潜在的可能性を実証するものである。

異種ブタ胸腺においてヒトＴ細胞レパートリーを生成させる限界としては、移植片を保護することにおいては有用であるが、宿主に感染する微生物病原体に対する保護を最適化しないブタＭＨＣ上での微生物抗原の選択的認識、ならびに通常型Ｔ細胞のネガティブ選択およびヒト組織特異的自己抗原（ＴＲＡ）を認識するＴｒｅｇのポジティブ選択を達成できないことが挙げられる。実際のところ、ヒト化マウスにおける研究からは、ヒトＴ細胞がヒト胸腺移植片ではなくブタで発生した場合には、免疫付与後にヒトＡＰＣが提示するペプチドに対する応答は低下することが分かっている。

この限界を克服するためのアプローチの一つとしては、胸腺摘出試料から得られる、または幹細胞から作製されるレシピエントの胸腺上皮細胞をブタ胸腺組織に注入する「ハイブリッド胸腺」の作成が挙げられる。出生後胸腺ドナーからハイブリッド胸腺が作成されており、このハイブリッド胸腺ではヒトＴ細胞のヒトＴＲＡに対する免疫寛容を促進する。

ブタ胸腺移植片は、正常で広範なマウスまたはヒトＴ細胞レパートリーの発生を支援することが示されており、これらＴ細胞は異種であるブタドナーに特異的に寛容である。しかし、末梢においてレシピエントＨＬＡ分子によって提示される外来抗原の認識は準最適なものでしかない。したがって、免疫機能が最適なレベルには達していない可能性がある。同一出願者による出願である国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／００５１８６５においてすでに示されているように、これは、ブタ・ヒトハイブリッド胸腺移植片にレシピエントＴＥＣを提供することによって克服することができる。その理由は、これらＴＥＣがポジティブ選択に関与し、その結果、末梢でレシピエントＨＬＡ分子が提示する外来抗原を、より容易に認識することのできるＴ細胞が得られるからである。ブタ胸腺移植片に関しては、末梢において「ポジティブ選択の」リガンドに遭遇しないＴ細胞の生存、恒常性および機能は準最適なものでしかない。ＭＨＣ／ペプチド複合体を認識する低親和性Ｔ細胞受容体を胸腺細胞が有している場合には、ポジティブ選択のリガンドは、プログラム細胞死から胸腺細胞を救済するＴＥＣの表面に存在する当該複合体である。ブタ・ヒトハイブリッド胸腺にレシピエントＴＥＣを提供することによって、末梢においてレシピエント細胞上の同一のリガンドを検出するＴ細胞のポジティブ選択が可能となり、正常な生存性、恒常性および機能が付与される。単純なブタ胸腺の代わりに、ハイブリッド胸腺をこのように利用することによって、ブタ胸腺で生成したヒトＴ細胞レパートリーの機能および自己免疫寛容を改善することが可能となり、かつブタに対する免疫寛容の発生も可能である。要するに、トランスジェニックブタ胸腺を利用することにより、ブタ胸腺で生成したヒトＴ細胞レパートリーの機能および自己免疫寛の改善も可能だということである。したがって、本開示のトランスジェニックブタは、ドナー胸腺組織の供給源として利用することもできる。

Ｓａｃｈｓミニブタコロニーは、１９７０年代にＤａｖｉｄ Ｓａｃｈｓ博士によって２種類の創始動物から確立された。これら動物のＭＨＣ（ブタ白血球抗原、ＳＬＡ）はＳａｃｈｓ博士によって血清学的に決められ、複数のＳＬＡ領域内組み換え体と共に、３種類のＳＬＡホモ接合の部分的近交系が維持されている。これらのブタは、本明細書に開示のトランスジェニックブタの動物供給源となり得る（米国特許第６，４６９，２２９号（Ｓａｃｈｓ）、第７，１４１，７１６号（Ｓａｃｈｓ）；これらの開示は、それぞれ参照として本明細書中に組み入れられる）。本明細書中に記載の方法によるそのようなブタの作出および／または作出後のこのようなブタおよびその子孫の利用は、本開示の実施に用いることが可能であり、その利用としては、このようなブタに由来する臓器、組織および／または細胞の利用が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。

いくつかの実施態様においては、該ブタ由来の細胞を出発材料とする。いくつかの実施態様においては、該細胞は線維芽細胞である。いくつかの実施態様においては、該細胞は、ＧＴＡ１ヌル、ＳＬＡハプロタイプｈホモ接合型Ｓａｃｈｓミニブタ（ＳＬＡ－１＊０２：０１、ＳＬＡ－１＊０７：０１、ＳＬＡ－２＊０２：０１、ＳＬＡ－３ヌルＳＬＡ－ＤＲＡ＊０１：０１：０２、ＳＬＡ－ＤＲＢ＊０２：０１、ＳＬＡ－ＤＱＡ＊０２：０２：０１、ＳＬＡＤＱＢ＊０４：０１：０１）に由来するものである。これら動物が部分的近交系であるという性質のため、子孫は遺伝的に高度の類似性を有するものであろう。

いくつかの実施態様においては、ＨＬＡポリペプチドをコードする核酸配列の、天然のＳＬＡ遺伝子座への挿入または組み込みによって既に改変されている細胞を出発材料とする。

ヒトにおいては、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子を、ヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ）の頭字語であるＨＬＡで表し、これらは染色体６ｐ２１．３に存在するＨＬＡ領域にコードされている。ＨＬＡセグメントは、３つの領域に分けられる（セントロメアからテロメアまで）；すなわち、クラスＩＩ、クラスＩＩＩおよびクラスＩである。これら細胞表面蛋白質は、ヒトにおける免疫系の制御に関係している。ＨＬＡ遺伝子は高度に多型であり、このことはこの遺伝子が多くの異なる対立遺伝子を有し、それによって適応免疫系の微調整が可能となることを意味している。臓器移植における因子としての歴史的発見の結果、特定の遺伝子がコードする蛋白質は抗原としても知られているのである。異なるクラスは異なる機能を有する。

ＭＨＣクラスＩ（Ａ、Ｂ、およびＣ）に対応するＨＬＡは、いずれもＨＬＡクラス１群であり、細胞内に由来するペプチドを提示する。通常、これら特定のペプチドは小型のポリマーであり、約９アミノ酸の長さである。ＭＨＣクラスＩが提示する外来抗原は、細胞を破壊するキラーＴ細胞を誘引する（ＣＤ８陽性または細胞傷害性Ｔ細胞ともよばれる）。ＭＨＣクラス１蛋白質はβ２ミクログロブリンと会合するが、β２ミクログロブリンはＨＬＡ蛋白質と異なり、１５番染色体上の遺伝子によってコードされる。

ＭＨＣクラスＩＩ（ＤＰ、ＤＭ、ＤＯ、ＤＱ、およびＤＲ）に対応するＨＬＡは、細胞外に由来する抗原をＴリンパ球に提示する。これら特定の抗原はＴヘルパー細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞と呼ぶこともある）の増殖を刺激し、そのことによって次に抗体産生Ｂ細胞を刺激し、その特異抗原に対する抗体産生を促す。自己抗原は制御性Ｔ細胞によって抑制される。その影響を受ける遺伝子は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の転写を制御する、異なる４種類の制御因子をコードすることが知られている。

ＭＨＣクラスＩＩＩに対応するＨＬＡは、補体系の成分をコードする。

主要な６種類の抗原提示蛋白質をコードする遺伝子の他にも、多数の遺伝子が存在して、その多くは免疫機能に関与するものであり、ＨＬＡ複合体に存在する。

ヒト集団におけるＨＬＡの多様性は疾病防御の一局面であり、その結果、無関係な２個体が全遺伝子座上で同一のＨＬＡ分子を有する確率は極めて低い。歴史的には、ＨＬＡ遺伝子の同定は、ＨＬＡが類似の個体間で臓器移植が成功する可能性が高いことに基づくものである。

各ヒト細胞は、６種類のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（二親のそれぞれから１つのＨＬＡ－Ａ、１つのＨＬＡ－Ｂ、および１つのＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子）および６種類～８種類のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（二親のそれぞれから１つのＨＬＡ－ＤＰおよびＨＬＡ－ＤＱ、ならびに１つまたは２つのＨＬＡ－ＤＲ、ならびにそれらの組み合わせ）を発現する。ヒト集団におけるのＭＨＣの多様性は高く、ＨＬＡ－Ａ遺伝子では少なくとも３５０対立遺伝子、ＨＬＡ－Ｂでは少なくとも６２０対立遺伝子、ＤＲでは少なくとも４００対立遺伝子、およびＤＱでは少なくとも９０対立遺伝子が存在する。ヒトにおいては、ＭＨＣクラスＩＩ分子は異なる３種類の遺伝子座、ＨＬＡ－ＤＲ、－ＤＱ、および－ＤＰによってコードされており、それらは互いに約７０％の類似性を示す。多型性はＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の顕著な特徴である。生着の成否と移植後生存を運命付けるレシピエントの免疫応答が、最も重要な因子である異種移植においては、この遺伝的多様性が問題となる。

いくつかの実施態様においては、本開示は、１種類以上のヒトＨＬＡポリペプチをコードする核酸を、ブタの１か所以上の天然のＳＬＡ遺伝子座に挿入または組み込むことによってブタを改変することを含む。

いくつかの実施態様においては、該ヒトＨＬＡは、ＨＬＡ ＩポリペプチドおよびＨＬＡ ＩＩポリペプチドから成る群から選択される。いくつかの実施態様においては、該ヒトＨＬＡ Ｉは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦおよびＨＬＡ－Ｇから成る群から選択される。いくつかの実施態様においては、ＨＬＡ ＩポリペプチドはＨＬＡ－Ａ２である。いくつかの実施態様においては、該ＨＬＡ ＩＩポリペプチドは、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲから成る群から選択される。いくつかの実施態様においては、該ＨＬＡ ＩＩポリペプチドはＨＬＡ－ＤＱ８である。

いくつかの実施態様においては、該ヒトＨＬＡは既知のＨＬＡポリペプチドである。そのようなＨＬＡ配列は、例えば、ＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／から利用可能）および国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システムＲＴＭ（ｉｍｇｔ．ｏｒｇから利用可能）から入手できる。例えば、ＨＬＡ－Ａ１、Ｂ８、ＤＲ１７は、白色人種に最も多いＨＬＡハプロタイプであり、その頻度は５％である。したがって、既知のＨＬＡ配列情報を本明細書中に記載の方法と組み合わせて用いることにより、本開示の方法を実施することができる。

いくつかの実施態様においては、該ヒトＨＬＡポリペプチドをコードする核酸は特定のヒト個体に由来する。いくつかの実施態様においては、特定のヒト個体に由来するヒトＨＬＡポリペプチドをコードする核酸および胸腺組織または他の細胞を用いて、トランスジェニックブタを作成し、そのトランスジェニックブタの組織または臓器を同一の特定のヒト個体に導入する。これらの実施態様においては、トランスジェニックブタから異種移植を受容する特定のヒト個体に由来するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子を同定し配列決定を行う。特定のＨＬＡ対立遺伝子の同定および配列決定は当該技術分野において公知の方法で実施可能であることは理解されるであろう。

特定のヒト個体に由来する、既知のヒトＨＬＡ配列または同定、配列決定済みのＨＬＡ配列を、ベクターのＳＬＡプロモーターの制御下に導入するのであってもよい（例えば、ＨＬＡ配列に対して９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列相同性を有するもの）。

いくつかの実施態様においては、該ＨＬＡポリペプチドをコードする核酸を最適化して、それが該ＨＬＡポリペプチド配列を有するように、あるいはレシピエント哺乳動物のＨＬＡ対立遺伝子を模倣するように改変できる。

いくつかの実施態様においては、該ＨＬＡポリペプチドを他の蛋白質に融合する。いくつかの実施態様においては、該蛋白質はヒトβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）である。いくつかの実施態様においては、ＨＬＡ－Ａ２をＢ２Ｍに融合する。ＨＬＡ－Ａ２およびヒトＢ２ｍを融合蛋白質として導入することは、ＨＬＡ－Ａ２とブタＢ２ｍとの間の異型相互作用がＨＬＡ－Ａ２表面発現に干渉しないことを保証するであろう。

いくつかの実施態様においては、該天然のＳＬＡ遺伝子座はＳＬＡ Ｉである。いくつかの実施態様においては、該天然のＳＬＡ遺伝子座はＳＬＡ－１またはＳＬＡ－２である。いくつかの実施態様においては、該ＳＬＡ遺伝子座はＳＬＡ－ＤＱα遺伝子座である。いくつかの実施態様においては、該核酸を天然のＳＬＡプロモーターの後ろに挿入する、または組み込む。いくつかの実施態様においては、該ＨＬＡポリペプチドをコードする核酸を天然のＳＬＡ遺伝子座のイントロン１／エクソン２接合部に挿入する、または組み込む。

いくつかの実施態様においては、標的ベクターを用いて該ＨＬＡポリペプチドをコードする核酸を天然のＳＬＡ遺伝子座に挿入する、または組み込む。いくつかの実施態様においては、該ベクターは２シストロン性である。いくつかの実施態様においては、該ベクターはプロモーター不含である。プロモーター不含のベクター設計を用いることは、ヒトＢ２ｍ／ＨＬＡ－Ａ２融合物を発現する細胞が非常に高い割合で適正にＤＱＡ遺伝子を標的とすることを保証するものである。

いくつかの実施態様においては、該ベクターは高効率ＩＲＥＳ要素をさらに含む。

いくつかの実施態様においては、該ベクターはポリアデニル化部位をさらに含む。いくつかの実施態様においては、該ポリアデニル化部位はウサギβグロビンである。

ＨＬＡポリペプチドをコードする核酸の組み込みまたは挿入によってＳＬＡ遺伝子座を改変する方法は、後述する部位特異的ヌクレアーゼの利用を含む。

このように、本明細書においてはトランスジェニックブタを作成する方法を提供する。一局面においては、特定のヒト個体レシピエントのＨＬＡ遺伝子を配列決定し、ブタ細胞に導入する標的ベクターの構築に利用する。別の一局面においては、ＷＨＯデータベースにおいて既知のヒトＨＬＡ遺伝子型を、ブタ細胞に導入する標的ベクターの構築に利用してもよい。本明細書中に記載のような標的ベクターは、該ＨＬＡポリペプチドをコードする核酸を用いて構築する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９プラスミドは調製可能である。ブタ細胞において、ＳＬＡ／ＭＨＣ遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ開裂部位を特定し、設計した該開裂部位を標的とするｇＲＮＡ配列を１種類以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９プラスミドにクローン化する。次いで、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９プラスミドを標的ベクターと共にブタ細胞中に導入する。

改変が完了したら、当該技術分野において公知の方法を用いて、細胞を所望の改変に関してスクリーニングする。核移植／胚移植およびトランスジェニックブタ胎仔および子ブタの産出を目的として、所望の改変を有する細胞を体細胞核移植（ＳＣＮＴ）のドナー細胞として利用することができるが、これについても当該技術分野において公知の方法によって実施することができる。

おおよそ４０週の時点で、トランスジェニックブタ胎仔を回収する。該所望のＨＬＡ遺伝子の発現および適正な組み込みに関して、これら胎児を分析する。組み込みが適正であることが判明した胎仔は、さらに胎仔および子ブタを作出するためのＳＣＮＴクローニング用の細胞株供給源として利用する。おおよそ５６～７０週の時点で、胸腺単離を目的として胎仔を回収する。

また、トランスジェニック創始ブタ（ｂｏａｒ）を作製するためにこれらの胎仔を利用する。

トランスジェニックブタ胎仔の胸腺組織には多くの用途があり、その用途としては、後述する改変ヒト免疫系（ＨＩＳ）マウスの作製が挙げられるが、それのみに限定されるものではない。

トランスジェニックブタ胎仔の細胞、組織および／または臓器（胸腺組織を含む）は、異種移植に利用することができ、また対象において胸腺および再構成Ｔ細胞の機能低下を正常化または回復する目的で利用することができる。いくつかの実施態様においては、該対象は哺乳動物である。いくつかの実施態様においては、該対象はヒトである。

異種移植を目的とする、トランスジェニックブタ由来の細胞、組織、および臓器は、野生型ブタに由来する細胞、組織、および臓器と比較して、拒絶反応が低減するであろう。

さらに本開示に含まれるのは、第１の生物種であるレシピエント哺乳動物における異種移植の方法であり、該方法はレシピエント哺乳動物に胸腺組織を移植することを含むものであるが、胸腺組織は本明細書に記載のトランスジェニックブタに由来する。

また本開示は、第１の生物種であるレシピエント哺乳動物において免疫能力を回復または誘導する方法を提供するが、該方法はレシピエント哺乳動物に胸腺組織を導入する工程を含むものであり、胸腺組織は本明細書に記載のトランスジェニックブタに由来する。

また本開示は、第１の生物種であるレシピエント哺乳動物においてＴ細胞前駆細胞が成熟した機能的Ｔ細胞へと発生する、胸腺依存性の能力を回復または促進する方法を提供するが、該方法は第１の生物種であるレシピエント哺乳動物に胸腺組織を導入することを含むものであり、胸腺組織は本明細書に記載のトランスジェニックブタに由来する。

一実施態様において、胸腺組織の導入前には該レシピエント哺乳動物に胸腺機能が本質的に存在しない。別の一実施態様において、胸腺組織の導入前に該レシピエント哺乳動物の胸腺を摘出する。さらに別の一実施態様においては、該レシピエント哺乳動物は免疫障害を有する。

第２の生物種はブタ（トランスジェニックブタなど）であってもよい。

第１の生物種は霊長類（非ヒト霊長類またはヒトなど）であってもよい。

一実施態様においては、該レシピエント哺乳動物はヒトであり、該ドナー哺乳動物は本明細書中に記載のトランスジェニックブタである。いくつかの実施態様においては、該レシピエントヒトは、トランスジェニックブタを作成するためにブタに導入する、ＨＬＡポリペプチドをコードする核酸の供給源である。いくつかの実施態様においては、該ＨＬＡポリペプチドをコードする核酸は、当該技術分野において公知のものである。

一実施態様においては、該胸腺組織をレシピエント哺乳動物に移植する。例えば、該胸腺組織は主に血管新生の起こっている胸腺葉として移植してもよく、あるいは胸腺－腎臓複合移植片として移植してもよい。該胸腺組織はレシピエントの筋肉内に移植してもよい。該胸腺組織はレシピエントの大腿四頭筋のみに移植してもよく、あるいは大腿四頭筋に加えて別の移植部位（例えば、腎被膜および大網）に移植してよい。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよびその他のエンドヌクレアーゼ
トランスジェニックブタを作製する本方法には、いずれの好適なヌクレアーゼを用いてもよい。ヌクレアーゼは核酸を加水分解する酵素である。ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼに分類することもできる。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の内部にある核酸間の結合の加水分解を触媒する酵素群に属するものである。エクソヌクレアーゼは、ＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖の末端から単一ヌクレオチドを加水分解する反応を触媒する酵素群に属するものである。ヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれを特異的に消化するのかということに基づいて分類されることもある。ＤＮＡの加水分解を特異的に触媒するヌクレアーゼをデオキシリボヌクレアーゼまたはＤＮａｓｅとよぶこともあり、一方、ＲＮＡの加水分解を特異的に触媒するヌクレアーゼをリボヌクレアーゼまたはＲＮａｓｅとよぶこともある。一本鎖または二本鎖核酸配列のいずれかに特異的なヌクレアーゼが存在する。エクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの両方の性質を有する酵素もある。さらに、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の両方を消化することのできる酵素も存在する。

エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、ジンクフィンガーニッカーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）が挙げられる。メガヌクレアーゼは、長いＤＮＡ配列（１２塩基対以上）を認識して切断する能力を特徴とするエンドヌクレアーゼである。宿主ゲノムの二本鎖切断を行う本方法においては、好適なものであればいかなるメガヌクレアーゼも利用することができ、そのようなメガヌクレアーゼとしてはＬＡＧＬＩＤＡＤＧおよびＰＩ－Ｓｃｅファミリーのエンドヌクレアーゼが挙げられる。

本開示の一局面では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを提供する。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはまた、少なくとも１種類のヌクレアーゼドメインおよびガイドＲＮＡと相互作用する少なくとも１種類のドメインを含む。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはガイドＲＮＡによって特異的核酸配列（または標的部位）に誘導される。ガイドＲＮＡはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼならびに標的部位と相互作用し、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが標的部位に誘導されれば、標的部位核酸配列に二本鎖切断を導入することができる。ガイドＲＮＡが標的開裂に特異性を付与するので、該ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼは一般的なものであり、異なるガイドＲＮＡと共に用いて異なる標的核酸配列を開裂させることができる。

本明細書に記載する方法および組成物と共に用いることのできるＲＮＡ誘導型配列特異的ヌクレアーゼシステムの一例としては、ＣＲＩＳＰＲシステム（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔら、２０１２ Ｎａｔｕｒｅ ４８２：３３１－３３８；Ｊｉｎｅｋら、２０１２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１；Ｍａｌｉら、２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３－８２６；Ｃｏｎｇら、２０１３． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３）が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化規則性配置の短い回文繰り返し配列）システムでは、標的ＤＮＡの配列特異的開裂であってＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合性開裂を活用する。ガイドＲＮＡ／Ｃａｓの組み合わせは、ヌクレアーゼに部位特異性を付与する。一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は約２０ヌクレオチドを含むが、これはゲノムＰＡＭ（プロトスペーサーの隣接モチーフ）部位（例えば、ＮＧＧ）およびＲＮＡ定常足場領域の上流に位置する標的ゲノムＤＮＡ配列に対して相補的である。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ結合性）蛋白質は、ｓｇＲＮＡおよびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡに結合し、ＰＡＭ部位上流の特定部位に二本鎖切断を導入する。Ｃａｓ９は、ＨＮＨエンドヌクレアーゼおよびＲｕｖＣエンドヌクレアーゼに相同な独立した２種類のヌクレアーゼドメインを有しているが、この２種類のドメインのいずれかに変異を導入することにより、Ｃａｓ９蛋白質を、一本鎖切断を導入するニッカーゼに変換することができる（Ｃｏｎｇら、２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３）。本開示の方法および組成物を一本鎖誘導性型または二本鎖誘導性型Ｃａｓ９と共に用いることが可能であり、またその他のＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ（その他の細菌Ｃａｓ９様システムなど）と共に用いることも可能であることは、特に意図されるものである。本明細書中に記載の方法および組成物の配列特異的ヌクレアーゼは、任意の生物から工学的に取得することができ、キメラであってもよく、あるいは単離することができる。該ヌクレアーゼはＤＮＡ、ｍＲＮＡおよび蛋白質の形態で細胞に導入することができる。

特定の遺伝子を標的とする標的特異性、任意選択的に疾患、障害、または病態に関連する遺伝子を標的とする標的特異性に関して、ｇＲＮＡを作製し得ることは、当業者であれば理解する。したがって、Ｃａｓ９と併用する場合に、ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの標的特異性を高めるものである。プロモーターの選択などのさらなる局面においては、標的特異性を達成するさらなる機構（例えば、特定の臓器または組織における発現を促進するガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに関するプロモーター選択）を提供することもできる。したがって、特定の疾患、障害、または病態に関する好適なｇＲＮＡの選択が本明細書において意図されるものである。一実施態様においては、該ｇＲＮＡは、単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）を含む遺伝子または対立遺伝子に対してハイブリダイズする。

好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ蛋白質の非限定的な例としては、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６が挙げられる。

一実施態様においては、該ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。特定の実施態様においては、該ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ９蛋白質に由来する。Ｃａｓ９蛋白質は以下の菌に由来するものであってもよい：
化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、レンサ球菌属の細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ノカルディオプシス・ダッソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ストレプトミセス・プリスチナエスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランジウム・ロゼウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ストレプトスポランジウム・ロゼウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルス・シュードマイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・セレニティレドセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、エクシグオバクテリウム・シビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、ラクトバチルス・デルブリッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ミクロシラ・マリナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ）、バークホルデリア目の細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ポラロモナス属の細菌（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、クロコスフェラ・ワツゥオニ（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノセカ属の細菌（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．）、ミクロキスティス・エルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス属の細菌（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、アセトハロビウム・アラバチカム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ）、アンモニフェクス・デゲンジイ（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルディセルロシルプター・ベシー（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ）、カンジダトゥス・デスルホルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）、ナトラナエロビウス・テルモフィルス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、アシドチオバシラス・カルダス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ）、アシドチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマチウム・ビノスム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター属の細菌（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワッソニ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、クテドノバクテル・ラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスチガタム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノジュラリア・スプミゲナ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ）、ノストック属の細菌（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．）、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ属の細菌（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、リングビア属の細菌（Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．）、ミクロコレス・クソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オシラトリア属の細菌（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．）、ペトロトガ・モビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、サーモシホ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、またはアカリオクロリス・マリーナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）。

いくつかの実施態様においては、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を改変してその蛋白質活性を変化させる。いくつかの実施態様においては、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）である（あるいは触媒的に不活性化された／欠損性のＣａｓ９またはｄＣａｓ９である）。一実施態様においては、ｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）は、野生型Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）のエンドヌクレアーゼ触媒部位（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ）の一方または両方に存在する点突然変異のために、エンドヌクレアーゼ活性が欠如したＣａｓ蛋白質（例えば、Ｃａｓ９）である。例えば、ｄＣａｓ９は触媒的に活性な残基（Ｄ１０およびＨ８４０）に突然変異を含むのでヌクレアーゼ活性がない。いくつかの場合においては、該ｄＣａｓは標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の両方に関して切断能が低下している。いくつかの場合においては、該ｄＣａｓ９は化膿連鎖球菌Ｃａｓ９のアミノ酸配列にＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａの２種類の突然変異を有している。いくつかの実施態様においては、ｄＣａｓ９の触媒活性が低下または欠損している場合に（例えば、Ｃａｓ９蛋白質が、Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７突然変異、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、および／またはＤ９８６Ａを有する場合に）、該Ｃａｓ蛋白質は、それでもなお部位特異的に標的ＤＮＡに結合することができるが、その理由は、対象ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）のＣａｓ結合配列と相互作用する能力を保持している限り、依然として対象ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）のＤＮＡ標的化配列により標的ポリヌクレオチド配列に誘導されるためである。

Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性の不活性化によって、触媒的に不活性化されたＣａｓ（ｄＣａｓ、例えば、ｄＣａｓ９）が得られる。ｄＣａｓはＤＮＡに結合することはできるが切断はできないので、転写因子の作用に対する物理的障壁を築くことによって標的遺伝子の転写を阻害する。このＣＲＩＳＰＲの作用は転写レベルで可逆的に働く。この方略をＣＲＩＳＰＲ干渉またはＣＲＩＳＰＲｉとよんでいる。ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）では、ｄＣａｓ融合蛋白質（例えば、他の蛋白質またはその一部に融合したｄＣａｓ）を本開示の方法に用いることもできる。いくつかの実施態様においては、ｄＣａｓを（転写）リプレッサードメインまたは転写サイレンサーに融合する。転写抑制ドメインの非限定的な例としては、クルッペル会合ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）ドメイン、ＳＩＤ（例えば、ＳＩＤ４Ｘ）のコンカテマー、またはそれらの相同体が挙げられる。転写サイレンサーの非限定的な例としては、ヘテロクロマチン蛋白質１（ＨＰ１）が挙げられる。Ｃａｓの抑制効果を増強するクルッペル会合ボックス抑制ドメイン（ＫＲＡＢ）にＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ）を融合することによって、ＣＲＩＳＰＲｉに変更を加えてもよい。Ｇｉｌｂｅｒｔら、２０１３． Ｃｅｌｌ １５４（２）：４４２－５１。

第二世代ＣＲＩＳＰＲｉは、ＰＵＦ－ＫＲＡＢリプレッサーを介して強力に抑制する。ＰＵＦ蛋白質（ショウジョウバエのＰｕｍｉｌｉｏおよび線虫のｆｅｍ－３結合因子に因んでこのように命名された）は、ｍＲＮＡの安定性と翻訳の調節に関与することが知られている。これらの蛋白質は、ＰＵＦドメインとして知られる固有のＲＮＡ結合ドメインを含んでいる。ＲＮＡ結合性ＰＵＦドメイン（ヒトＰｕｍｉｌｉｏ １蛋白質の当該ドメイン（本明細書中ではＰＵＭとも称する）など）は、逆平行の様式で連続する塩基に結合する８回の繰り返し配列（各繰り返しはＰＵＦモチーフまたはＰＵＦリピートとよばれる）を含み、各リピートはそれぞれ単一塩基を認識する；すなわち、ＰＵＦリピートＲ１～Ｒ８がそれぞれヌクレオチドＮ８～Ｎ１を認識する。例えば、ＰＵＭは直列８回の反復配列でできており、各リピートはアルファヘリックスから成る、高密度のドメインに折れたたまれる３４アミノ酸によって構成されている。ＰＵＦおよびその誘導体または機能的変異体は、本方法およびシステムに利用することのできるプログラム可能ＲＮＡ結合ドメインであり、エフェクタードメインを対象ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）上の特定のＰＵＦ結合配列に導くＰＵＦドメイン融合物の一部分として利用することができる。

本方法はＣＲＩＳＰＲ欠失（ＣＲＩＳＰＲｄ）を利用してもよい。ＣＲＩＳＰＲｄでは、ＤＮＡ修復方略が既定である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）へと向かう傾向を利用するものであり、開裂鎖の修復にドナーテンプレートを必要としない。その代わりに、Ｃａｓはまず突然変異を含む遺伝子中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入し、次いで非相同末端結合が起こりる；挿入および／または欠失（ＩＮＤＥＬ）が導入されることにより当該配列が破損するため、遺伝子の発現が阻害されるか、あるいは適正な蛋白質折れたたみが起こらなくなる。変異した優性対立遺伝子の破壊と無損傷野生型対立遺伝子の保持によって表現型を野生型へと回復させることが充分可能であるような優性病態に対しては、本方略は特に応用可能であるといえる。

特定の実施態様においては、該Ｃａｓ酵素は、触媒的に欠損性のＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）またはｄＣａｓ、あるいはＣａｓニッカーゼまたはニッカーゼであってもよい。

該Ｃａｓ酵素（例えば、Ｃａｓ９）は、ニッカーゼ（二本鎖切断の代わりに一本鎖切断を誘導することによってＤＮＡに「ニック」を導入するので、そのように命名された）として機能するように改変してもよい。本明細書中の用語「Ｃａｓニッカーゼ」または「ニッカーゼ」は、二本鎖核酸分子（例えば、二本鎖ＤＮＡ分子）の一方の鎖のみを切断することのできるＣａｓ蛋白質を意味する。いくつかの実施態様においては、Ｃａｓニッカーゼは、米国特許第１０，１６７，４５７号に開示されるニッカーゼのいずれであってもよい（本参考文献の内容は、参照としてその全体が本明細書中に組み入れられる）。一実施態様においては、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ニッカーゼは活性のあるＨＮＨヌクレアーゼドメインを有しており、ＤＮＡの非標的鎖（すなわち、ｇＲＮＡが結合している鎖）を切断することができる。一実施態様においては、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ニッカーゼは不活性ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを有しており、ＤＮＡの標的鎖（すなわち、塩基編集の対象である鎖）を切断することができない。いくつかの実施態様においては、該Ｃａｓニッカーゼは二本鎖核酸分子の標的鎖を切断するが、これはＣａｓに結合しているｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）に対して塩基対形成する（に対して相補的である）鎖を、該Ｃａｓニッカーゼが切断することを意味している。いくつかの実施態様においては、該Ｃａｓニッカーゼは二本鎖核酸分子の塩基編集対象でない非標的鎖を切断するが、これはＣａｓに結合しているｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）に対して塩基対形成しない鎖を、該Ｃａｓニッカーゼが切断することを意味している。その他の好適なＣａｓ９ニッカーゼについては、本開示および当該技術分野の知見に基づけば当業者には明白であろう；また、それらは本発明の範囲に含まれるものである。

ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）では、ｄＣａｓを活性化ドメイン（ＶＰ６４またはＶＰＲなど）に融合してもよい。そのようなｄＣａｓ融合蛋白質を、遺伝子活性化のために本明細書中に記載の構築物と共に用いてもよい。いくつかの実施態様においては、ｄＣａｓを後成調節ドメイン（ヒストン脱メチル化酵素ドメインまたはヒストンアセチル基転移酵素ドメインなど）と融合する。いくつかの実施態様においては、ｄＣａｓをＬＳＤ１またはｐ３００、あるいはその部分と融合する。いくつかの実施態様においては、ＣＲＩＳＰＲを基盤とする後成調節に、該ｄＣａｓ融合物を用いる。いくつかの実施態様においては、ｄＣａｓまたはＣａｓをＦｏｋｌヌクレアーゼドメインに融合する。いくつかの実施態様においては、Ｆｏｋｌヌクレアーゼドメインに融合したＣａｓまたはｄＣａｓをゲノム編集に利用する。いくつかの実施態様においては、ＣａｓまたはｄＣａｓを蛍光性蛋白質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）に融合する。いくつかの実施態様においては、蛍光性蛋白質に融合したＣａｓ／ｄＣａｓ蛋白質を、ゲノム遺伝子座の標識および／または可視化あるいは該Ｃａｓエンドヌクレアーゼを発現する細胞の同定に用いる。一般に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ蛋白質は少なくとも１種類のＲＮＡ認識ドメインおよび／またはＲＮＡ結合ドメインを含む。ＲＮＡ認識ドメインおよび／またはＲＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡと相互作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ蛋白質は、ヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＤＮａｓｅドメインまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮＡｓｅドメイン、蛋白質－蛋白質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、ならびにその他のドメインを含むこともできる。

詳細に特徴付けの行われたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに加えて、Ｃｐｆ１（亜型であるＰｒｅＦｒａｎのＣａｓ蛋白質１）とよばれる新規のＣＲＩＳＰＲ酵素も本方法およびシステムにおいて利用することができる（Ｚｅｔｓｃｈｅら、２０１５、Ｃｅｌｌ）。Ｃｐｆ１はｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり、Ｔリッチなプロトスペーサーの隣接モチーフを利用する。著者らは、Ｃｐｆ１がＣａｓ９の性質とは異なる性質を有しており、強力なＤＮＡ干渉を媒介することを実証した。したがって、本発明の一実施態様においては、標的遺伝子内の所望の領域を切断するためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１システムを利用することができる。

さらなる実施態様においては、該ヌクレアーゼは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬＥＮは、特定のヌクレオチド配列に結合するＴＡＬエフェクタードメインおよび標的部位における二本鎖切断を触媒するエンドヌクレアーゼ・ドメインを含む（国際出願番号ＷＯ２０１１０７２２４６； Ｍｉｌｌｅｒら，２０１１ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２９：１４３－１４８； Ｃｅｒｍａｋら、２０１１ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ３９：ｅ８２）。配列特異的エンドヌクレアーゼは本来、モジュール式であってもよいので、１種類以上のモジュールを配置することによって、ＤＮＡ結合特異性を得る。Ｂｉｂｉｋｏｖａら、２００１ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２１：２８９－２９７； Ｂｏｃｈら、２００９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１５１２。

ＺＦＮは、エフェクター・エンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ）に融合した２種類以上（例えば、２～８種類、３～６種類、６～８種類以上）の配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガードメイン）を含むことができる。Ｐｏｒｔｅｕｓら、２００５ Ｎａｔ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ ２３：９６７－９７３； Ｋｉｍら、２００７ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ＵＳＡ、９３：１１５６－１１６０； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，８２４，９７８； 国際公開番号ＷＯ１９９５／０９２３３およびＷＯ１９９４０１８３１３。

一実施態様においては、該ヌクレアーゼは、オメガ、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓから成る群の、あるいはその群から選択される部位特異的ヌクレアーゼである。

本明細書中に記載の方法および組成物の配列特異的エンドヌクレアーゼは、任意の生物から工学的に取得することができ、キメラであってもよく、あるいは単離することができる。エンドヌクレアーゼは、例えば、突然変異誘発によって、特定のＤＮＡ配列を認識するように工学的に改変することができる。Ｓｅｌｉｇｍａｎら、２００２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３８７０－３８７９。組み合わせアセンブリは、異なる酵素に由来する蛋白質サブユニットを会合または融合させることの可能な方法である。Ａｒｎｏｕｌｄら、２００６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３５５：４４３－４５８。特定の実施態様においては、これら２種類のアプローチ（突然変異誘発および組み合わせアセンブリ）を組み合わせることによって、所望のＤＮＡ配列を認識するように工学的に改変したエンドヌクレアーゼを作成することができる。

該配列特異的ヌクレアーゼを、蛋白質の形態または該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸（ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡなど）の形態で細胞に導入することができる。核酸は、それよりも大きな構築物（プラスミドまたはウイルスベクターなど）の一部として、あるいは直接的に、例えば、エレクトロポレーション、脂質小胞、ウイルス輸送体、マイクロインジェクション、および遺伝子銃によって導入することができる。同様に、核酸の細胞導入に適した方法によって、１種類以上の導入遺伝子を含む該構築物を導入することができる。

ガイドＲＮＡの誘導によって、Ｃａｓ－ｇＲＮＡ複合体をゲノム中の所定の開裂部位に結合するように、本開示の方法に用いる該ガイドＲＮＡを設計することができる。一実施態様においては、フレームシフト突然変異の領域を含む断片または配列を切り離すように、該開裂部位を選択してもよい。さらなる実施態様においては、過剰染色体を含む断片または配列を切り離すように、該開裂部位を選択してもよい。

ＤＮＡに良好に結合するＣａｓファミリー酵素（Ｃａｓ９など）に関しては、ゲノムＤＮＡ中の該標的配列は、ｇＲＮＡ配列に対して相補的となり得るものであり、その直後に正しいプロトスペーサーの隣接モチーフまたは「ＰＡＭ」配列が位置するものであってもよい。「相補性」は、核酸が他の核酸配列と、従来のワトソン・クリック型またはその他の非従来型のいずれかの水素結合を形成する能力を指す。相補性の割合（％）とは、第２の核酸配列と水素結合を形成（例えば、ワトソン・クリック塩基対形成）することのできる、核酸分子中の残基の割合（％）のことである。ハイブリダイゼーションを引き起こしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに充分な相補性があれば、必ずしも完全な相補性は必要ではない。標的配列は、いかなるポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドなど）を含むものであってもよい。Ｃａｓ９蛋白質にとっては、ＰＡＭから遠位に位置するミスマッチは許容可能である。Ｃａｓ９の由来する細菌の種に応じて、ＰＡＭ配列は異なる。最も広く用いられているＣＲＩＳＰＲシステムは化膿連鎖球菌に由来するものであり、そのＰＡＭ配列はｓｇＲＮＡ認識配列の直ぐ３’端に位置するＮＧＧである。例示的細菌種に由来するＣＲＩＳＰＲシステムのＰＡＭ配列としては、化膿連鎖球菌（ＮＧＧ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、サーモフィルス菌（ＮＮＡＧＡＡ）およびトレポネーマ・デンティコラ（ＮＡＡＡＡＣ）が挙げられる。

本開示に利用されるｇＲＮＡは、約５～１００ヌクレオチドの長さ、あるいはそれ以上の長さ（長さが、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ヌクレオチド以上）である。一実施態様においては、ｇＲＮＡは、約１５～約３０ヌクレオチドの長さ（長さが、例えば、約１５～２９、１５～２６、１５～２５；１６～３０、１６～２９、１６～２６、１６～２５、または約１８～３０、１８～２９、１８～２６、または１８～２５ヌクレオチド）である。

ｇＲＮＡの設計を支援する多くの計算ツールが開発されている（Ｐｒｙｋｈｏｚｈｉｊら、２０１５ ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（３）； Ｚｈｕら、２０１４ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（９）； Ｘｉａら、２０１４ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．Ｊａｎ ２１（２０１４））； Ｈｅｉｇｗｅｒら、２０１４ Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１（２）：１２２－１２３を参照のこと）。ガイドＲＮＡ設計法およびツールについては、Ｚｈｕ ２０１５ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０（４）：２８９－２９６に詳述されており、本文献は参照として本明細書中に組み入れられる。また、ｇＲＮＡの設計支援に利用し得る公開ソフトウエアツールも存在する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｇＲＮＡ－ｄｅｓｉｇｎ－ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ）。

ヒト免疫系（ＨＩＳ）マウス
マウスＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞が欠如しており、重度の免疫不全であるＮＯＤ－ｓｃｉｄ共通ガンマ鎖欠損（ＮＳＧ）マウスを利用できることは、ヒト免疫系（ＨＩＳ）マウス作成の可能性を大幅に増大させるものであった。最適免疫機能を有するＨＩＳマウスを作成するための主要な要件の一つは、ヒト胸腺組織の可用性である。ヒト胎児胸腺組織は、注入した胎児または成人ＣＤ３４＋細胞に由来するヒト胸腺細胞の安定増殖を助ける；注入細胞は胸腺へのＴ細胞前駆細胞の安定供給を維持し、骨髄においては、Ｂ細胞、ＤＣおよび単球を生成し、生成したこれらの細胞は末梢に分布しヒト胎児胸腺移植片内で発生するＴ細胞に対して抗原提示細胞（ＡＰＣ）として働く（Ｌａｎら、２００４； Ｌａｎら、２００６； Ｍｅｌｋｕｓら、２００６）。ヒト胸腺移植片においてデノボで発生するＴ細胞はネズミ宿主に寛容であり、これは当該移植片に検出可能なマウスＡＰＣによる除去の結果であると推定される（Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒら、１９９９）。天然のマウス胸腺はヒトＴ細胞を低レベルには生成することができるが、マウス胸腺の異常構造のために正常なネガティブ選択が起こらない（Ｋｈｏｓｒａｖｉ Ｍａｈａｒｌｏｏｅｉら、２０１９）。このことと、緩徐な末梢Ｔ細胞再構成およびその結果起こる高度のリンパ球減少症誘導性増殖（ＬＩＰ）が組み合わさって、天然のマウス胸腺を摘出することによっては予防可能である、重度の自己免疫症候群を引き起こす（Ｋｈｏｓｒａｖｉ Ｍａｈａｒｌｏｏｅｉら、２０１９）。対照的に、ＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）を受容するＨＩＳマウスへのヒト胎児胸腺組織移植では、容易に識別可能な皮質、髄質およびハッサル小体を含む正常構造のヒト胸腺となる。このヒト胸腺では、末梢においてナイーブヒトＴ細胞の較的迅速な再構成が起こるので、ＬＩＰが顕著に減少し、また天然のＮＳＧマウス胸腺に発生するＴ細胞に見られるものと比較して自己免疫も少ない。

ヒト胎児組織に利用可能性および利用における問題を考慮するならば、ヒト胎児に由来するものと同様に機能し得る胸腺組織の他の供給源を見つけることが望ましい。本発明者らは以前に、ヒトＨＳＰＣを受容する免疫不全マウスに移植したブタ胸腺移植片においてヒト胸腺細胞の安定増殖が起こることを明らかにしている（Ｎｉｋｏｌｉｃら、１９９９； Ｓｈｉｍｉｚｕら、２００８； Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒら、２０１４）。ブタ胎仔胸腺組織の利用は、広範なＴＣＲレパートリーを有する、正常で機能的なヒトＴ細胞（Ｔｒｅｇを含む）を生成するヒト胎児胸腺組織の代替を提供するものである。しかし、免疫付与に対する応答に示唆されるように、またＨＬＡ拘束性トランスジェニックＴＣＲ２０を発現する胸腺細胞のポジティブ選択がブタ胸腺では不全であることの所見（図６および８）に示唆されるように、ブタ胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）上にはＨＬＡ分子がないために、末梢で最適ＨＬＡ拘束性免疫機能を媒介するヒトＴ細胞の選択は限定的となるようだ。さらに、ＴＥＣが産生するヒト組織特異的自己抗原（ＴＲＡ）を認識するＨＬＡ拘束性Ｔｒｅｇのポジティブ選択能、およびこれらのＴＲＡ／ＨＬＡ複合体を認識するエフェクターＴ細胞のネガティブ選択も、ブタ胸腺においては限定的であるようだ。ヒト胎児胸腺に比べて、ブタで生成させた末梢ヒトＴ細胞は、ＨＬＡ拘束性免疫機能および恒常性ならびに組織特異的自己抗原に対する免疫寛容においてわずかに障害を示す（Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒら、２０１２）。ブタ胸腺組織にトランスジェニックＨＬＡ分子を付与することによって、これらの制限の大部分を克服し得るであろう。

本明細書では、ヒト胎児組織の利用に基づかない、ＨＩＳマウス取得法の改良法を２種類示す。

一実施態様においては、ブタ由来の胎児胸腺組織およびヒトＣＤ３４＋細胞をマウスに導入することによってＨＩＳマウスを作製する。いくつかの実施態様においては、該ヒトＣＤ３４＋細胞は臍帯血に由来する。いくつかの実施態様においては、該ヒトＣＤ３４＋細胞は成人組織に由来する。いくつかの実施態様においては、該成人組織は骨髄である。いくつかの実施態様においては、該ＣＤ３４＋細胞は動員末梢血造血幹細胞に由来する。

さらなる一実施態様においては、本明細書中に記載のトランスジェニックブタに由来する胎児胸腺組織を導入することによってＨＩＳマウスを作製する。

いくつかの実施態様においては、最近報告（Ｋｈｏｓｒａｖｉ Ｍａｈａｒｌｏｏｅｉら、２０１９）されているように、胸腺組織導入前に該マウスの胸腺摘出を行う。いくつかの実施態様においてはまた、該マウスに放射線照射を行う。いくつかの実施態様においては、該マウスはＮＯＤ ｓｃｉｄ共通ガンマ鎖ノックアウト（ＮＳＧ）マウスである。

ブタ胎仔胸腺は該マウスの腎被膜下に移植することができる。ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞を該マウスに注入する場合には、胸腺移植の前、後、または同時に該細胞を注入することができる。

ＨＩＳマウスモデルは、Ｔ細胞が重要な役割を果たす研究領域において広範に応用することができる。そのような領域としては、以下の領域が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない：

・ＨＩＶ感染およびその他の感染。ヒト胎児胸腺組織と比較してブタ胸腺がＨＩＶ感染に対する抵抗性を付与することを、このモデルを用いて実証している（Ｈｏｎｇｏら、２００７）。

・Ｔｒｅｇの生物学（胸腺における発生、末梢組織における輸送と恒常性を含む）。ブタ胸腺においてＴｒｅｇを生成させた場合には、Ｔｒｅｇの発生および機能は良好ではあるが、異なる末梢恒常性に起因する表現型の微妙な相違が存在し、これは胸腺組織にＨＬＡ分子を付与することによって改善が見込まれることが、このモデルの利用によって示されている。さらに、このモデルによって、注入後にエクスビボで増殖したＴｒｅｇの分布、生存性および活性（例えば、移植片拒絶反応を抑制する活性）の判定が可能となるので、本モデルはＴｒｅｇ療法の研究にとって有用であろう。

・移植免疫。ヒト胎児胸腺組織またはブタ胎仔胸腺組織ならびにヒト胎児または成人のＣＤ３４＋細胞で作成したＨＩＳマウスは、ヒトおよびブタの皮膚および膵島同種移植片および異種移植片を拒絶可能であることが示されている（Ｌａｎら、２００４； Ｓｈｉｍｉｚｕら、２００８； Ｚｈａｏら、１９９７； Ｚｈａｏら，１９９８）。一方、ブタ胎仔胸腺組織で作成したものでは、胸腺ドナーのＳＬＡを共有する皮膚移植片を特異的に許容する（Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒら、２０１４）。本明細書に記載の方法で作成したマウスは、同種異系ヒト皮膚移植片を拒絶するように用いることもできる。移植免疫および同種移植片および異種移植片に対して免疫寛容を誘導するアプローチを調べる前臨床試験にとっては、このモデルが有益となることを、前記のデータは示唆している。また、現在研究が進行中の異種移植片免疫寛容に対する、混合キメラおよびブタ胸腺胸腺移植によるアプローチは、このモデルによって最適化されるであろう。

・自己免疫。膵島自己抗原を認識するＴＣＲでＣＤ３４＋細胞の形質導入を行えば、胸腺における自己反応性Ｔ細胞の発生ならびに胸腺および末梢の両方で自己抗原に対する免疫寛容が如何にして制御されるかについての研究が、このモデルによって促進されるであろう。高再現性の胸腺ＨＬＡ遺伝子型を有するこの明確なモデルによって、付加的な自己抗原に特異的なＴＣＲを容易に研究し得る。

・ＣＯＶＩＤ－１９などの感染症。ＣＯＶＩＤ－１９の病理に対するヒト免疫系の効果を調べるための、ヒト免疫系を含むモデルが非常に必要とされている。ヒト胎児組織が利用不可であることは、そのような研究にとって大きな課題となっている。ヒト胎児胸腺の代替として、ＨＬＡ－トランスジェニックブタ胎仔胸腺組織を用いることによって、この問題を克服することができるであろう。

ＨＩＳマウスの作製にトランスジェニックブタを利用することによって、ヒト胎児胸腺を利用して作製するＨＩＳマウスよりも良好なモデルを得ることができる。その理由は、各ドナーについて背景となるＭＨＣ（ＳＬＡ）およびＨＬＡ導入遺伝子が同一であり、そのブタが全体としてかなり近交系であることである。ヒト胎児組織を用いることの難問の一つは、ＨＬＡおよび全体の遺伝的背景がドナー毎に異なっており、これがＨＩＳマウス研究の再現性を妨げる変数となるということである。

実施例
以下に記載の実験の詳細によって、本発明がより詳細に理解されるであろう。しかし、そこで考察する特定の方法と結果は、実施例の後に記載する特許請求項においてより詳細に説明するような本発明の単なる例示であることは、当業者であれば容易に理解するであろう。

実施例１：ＣＲＩＳＰＲ支援相同組み換えを用いたブタの遺伝子改変
正確に標的化が達成された細胞について適切である選択方略と組み合わせた場合には、ＣＲＩＳＰＲ支援相同組み換えによって、ブタにおける遺伝子改変が可能となることを具体的に示す目的で、ブタ遺伝子改変を２種類作成した。

第１の改変では、ＣＲＩＳＰ支援相同組み換えを用いて４種類のヒト遺伝子のコード配列をＳａｃｈｓミニブタのＧＧＴＡ１遺伝子座に導入した（図１）。この場合には、ＧＧＴＡ１遺伝子座に標的導入することは導入遺伝子発現に関する「セーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）」であったが、その理由は、このゲノム領域が厳密な時間的転写抑制または系譜依存性転写抑制を受けるものではないことである。２Ａ自己スプライシング要素を用いて、２つの群で４種類の導入遺伝子を遍在ＣＡＧプロモーターから発現させた。正確に標的化が達成された細胞の非クローン性選択は、この場合、直接的であったが、それはつまり導入遺伝子の発現を正のマーカーとして利用できること、ならびにヌルＧＧＴＡ１対立遺伝子に関してヘテロ接合性である細胞をベクターで形質転換した（ＧＧＴＡ１発現消失）ことによる。集団ベースの迅速細胞選択によって、クローン化胎仔および子ブタの産生において効率のよい体細胞核移植（ＳＣＮＴ）ドナー集団が得られた。

次いで、第１の改変を有するクローン化胎児から得られた線維芽細胞に、第２の改変を導入したが、これはかなり複雑であった。この場合には、天然のＩＬ－３受容体アルファ鎖プロモーターの制御下にある、ヒトＩＬ－３受容体の両方の鎖をコードする配列を、ヒトＩＬ３Ｒ発現の適切な系譜特異性および時間的特異性を達成するような導入が必要であった。この場合の標的達成細胞の選択についての主要な障害は、ＳＣＮＴクローニングに必要な線維芽細胞におけるＩＬ３Ｒ発現欠如であった。さらに、挿入欠失導入の標的組み込みに起因する内在性ＩＬＲ３発現の破壊的消失は、致死的でない場合でも、非常に有害であると予想されるので、天然のＩＬＲａ遺伝子座の一方の対立遺伝子のみに、遺伝子改変を限定した。クローニングの観点から望ましいことは、可能な限り集団倍加を抑えて、正確に標的化が達成された細胞が充分濃縮された非クローン性ドナー細胞集団を得ることであった。

この試験の方略および結果を図２に示す。

倍加を最少とした高度濃縮ＳＣＮＴドナー細胞集団を必要としたので、選択マーカー・プロモーター不含のベクターを用いることにした。線維芽細胞はＩＬ３Ｒａを発現しないので、近傍の遺伝子（ＳＬＣ２５Ａ６、ミトコンドリア・ヌクレオチド輸送体）の偏在性発現を適正標的達成のマーカーとして利用できるか否かについて調べることにした。２Ａ自己開裂性ペプチドを介して連結したＧＦＰコード配列を用いて、ＳＬＣ２５Ａ６転写ユニットをタグ付けすることにより、高信頼性の選択方略が提供されるが、そのような複雑な改変（１５ｋｂｐ超のゲノム配列を７ｋｂｐ超のベクター配列で置換）を充分効率のよいドナー細胞選択で達成できるか否かについては不明であった。

既に改変している胎仔細胞においてＩＬ３Ｒａ遺伝子の一方の対立遺伝子を切断すると予想されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを選択し、例示したベクターと共に試験した。予備的形質転換においては、対合したガイドＲＮＡを「ニッカーゼ」型のＣａｓ９と組み合わせて用いる場合には、かなり離散的な高ＧＦＰ亜集団および低ＧＦＰ亜集団を含む集団が得られることが明らかになった。そのような組み合わせの１つで得られた集団のフロー分析を図２Ｂに示す。選別された高ＧＦＰ亜集団の細胞は、ベクターの両末端で適正組み込みが成された細胞を含むことが、ＰＣＲ分析によって示された（図２Ｃ）。この集団の細胞を、おおよそ２４回の倍加（３２回の倍加時の平均的クローン性老化よりもかなり前である）の時点でＳＣＮＴに用いたところ、３匹の未経産の胚レシピエントブタから８匹の生存胎仔が得られた。ゲノム解析およびＲＴ－ＰＣＲ分析によって、８胎仔全てが意図した遺伝子改変を有していることが明らかになった（図２Ｄおよび２Ｅ）。このドナー細胞集団を用いた別の妊娠を出産まで継続し、当該導入遺伝子を発現する生仔出生を得た。

合わせて、上記の改変は、複数の遺伝子改変を有するブタを迅速に作成するための非クローン性ドナー細胞選択方略を用いて、多シストロン性標的改変をブタに逐次導入することが可能であることを実証した。

実施例２：ＨＬＡ－Ａ２形質導入：ｄ４０トランスジェニックブタ胎仔の作出と遺伝子型／表現型評価
出発材料
ＧＧＴＡ１ヌル、ＳＬＡハプロタイプｈホモ接合Ｓａｃｈｓミニブタ（ＳＬＡ－ｌ＊０２：０１、ＳＬＡ－２＊０２：０１、ＳＬＡ－３ヌル、ＳＬＡ－ＤＲＡ＊０１：０１：０２、ＳＬＡ－ＤＲＢ＊０２：０１、ＳＬＡ－ＤＱＡ＊０２：０２：０１、ＳＬＡＤＱＢ＊０４：０１：０１）の線維芽細胞を遺伝子改変の出発材料として利用した。以前のトランスジェニック・プロジェクトにおいてこの系統の細胞は良好にクローン化されており、また異種移植研究のために大規模飼育集団がＣＣＴＩによって維持されている。このことは、研究コミュニティへ胸腺組織を供給するＨＬＡ遺伝子導入研究の拡大を促進するものである。この動物が部分的に近交系であるという特徴のために、子孫は遺伝的類似性が非常に高いものとなるであろう。

全体的方略
全てのトランスジェニック改変は、天然のＳＬＡプロモーターの後ろに標的挿入することによって成される。これによって適切な系譜および時間的発現パターンが保証される。発生中における胎盤での不適切なＨＬＡ発現に関連する潜在的な問題も、これによって回避される。両方のトランスジェニック分子の鎖を同時に導入する。最初にＨＬＡ－Ａ２トランスジェニック胸腺材料、次いでＨＬＡ－Ａ２／ＨＬＡ－ＤＱ８トランスジェニック胸腺材料を迅速に作製するために、胎仔段階で逐次改変を用いる。

両ＨＬＡ改変を導入するために、プロモーター不含の遺伝子標的ベクターを用いるが、これによって、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）に利用する前の細胞分裂数が最小であり、適正に標的導入された細胞について高度濃縮された非クローン性細胞集団の選択が可能になる。これは実施例１で用いた、ＩＬ３受容体鎖を伴うプロモーター標的化改変アプローチに類似するものであるが、ＳＣＮＴクローニングに必要な線維芽細胞においてクラスＩおよびクラスＩＩ分子の両方が正常にあるいは誘導性に発現するので、ベクター設計のプロセスはかなり単純化される。

ｄ４０クローン化トランスジェニック胎仔の作製
ＨＬＡ－Ａ２のコード配列を、ＳＬＡ－１プロモーターまたはＳＬＡ－２クラスＩプロモーターいずれかの後に導入する。これらの遺伝子座は意図する改変に関して互いに代替的であり、双方のイントロン１の配列決定および最適なＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ部位についての評価に基づいて、いずれを選択するか決める。

ＨＬＡ－Ａ２は、ヒトベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とＨＬＡ－Ａ２アルファ鎖との融合物として発現させる。そのような融合物のトランスジェニック発現に関しては、マウスで以前に報告があり（Ｋｏｔｓｉｏｕら、２０１１； Ｐａｓｃｏｌｏら、１９９７）、本明細書の用途でそれを用いることにより、ＨＬＡ－Ａ２とブタＢ２ｍとの間の異型相互作用がＨＬＡ－Ａ２の表面発現に干渉しないことが保証される。

融合カセットの標的化にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援相同組み換えを用いる。ＨＬＡ－Ａ２の標的化をＳＬＡ Ｉ遺伝子の一方の対立遺伝子に限定し、他の対立遺伝子はヌルの状態でよい；第２対立遺伝子の突然変異はブタの免疫に影響を及ぼさないと思われるが、内在性クラスＩアルファ鎖の発現低下によってＨＬＡ－Ａ２発現が増加することもある。

ＨＬＡ－Ａ２組み込みのためのベクター構築
ＨＬＡ－Ａ２組み込みの標的ベクターについて、模式図を図３に示す。天然遺伝子のもの（白色および青色のセグメント）と配列が同一である、ベクターの相同性アーム間の相同組み換えによって、イントロン１／エクソン２接合部にヒトＢ２Ｍ－ＨＬＡ－Ａ２カセットが導入される。この部位に成熟型のヒトＢ２Ｍが導入されるのだが、これはエクソン１によって提供されるシグナルペプチドを伴う；このシグナルペプチドはスプライス部位から１ｂｐのところで終了するので、Ｂ２Ｍ蛋白質配列に変更を生じることなく融合蛋白質が作られる。イントロン１の終わりでかつエクソン２の始まり付近の適切な配列部位に対合ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを選択して、Ｃａｓ９ニッカーゼ活性を発現するプラスミドに挿入する。

ＳＣＮＴのための改変線維芽細胞の選択
標的プラスミドおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドプラスミドを線維芽細胞にヌクレオフェクションで導入し、３～５日後に１巡目の選択に供する。選択は、ＨＬＡ－Ａ２特異抗体（クローンＢＢ７．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した細胞のフロー選別による。ＨＬＡ－Ａ２発現に基づいて最高標的率の得られる対を判定するために、選択したガイド対で予備的な単一ソート分析を実施する。ＳＣＮＴドナー細胞選択では、２回の同様な選択を用いて発現細胞を最大濃縮する。次いで、この集団をゲノム解析およびＲＴ－ＰＣＲ分析に供して、トランスジェニック遺伝子座が予想される構造であるのか、またＲＮＡレベルでの発現があるのかについて確認し、この工程で第２のＳＬＡ遺伝子座が変化しているか否かを判定する。

ｄ４０トランスジェニック胎仔の作製と特徴付け
選択ＳＣＮＴドナー細胞を核移植／胚移植に用い、得られた胎仔をおおよそ妊娠４０日目に回収する。ブタの工学的プロジェクトではいずれの場合にも２段階クローニングの工程を用いる。妊娠４０日目に回収することによって、クローンをさらに産出するための系統を決定する前に、遺伝子構造の確認、また多くの場合、導入遺伝子発現の確認がクローンのレベルで可能となる。さらに、早期胎仔由来の最小限の培養を行った細胞は、インビトロ選択プロセスで拡大培養した後のものよりもクローニング率がかなり高い傾向がある。最後に、これにより、加算的な遺伝子改変（例えば、ＨＬＡＤＱ８の逐次導入）に必須のインビトロ生存期間に関する系統「更新」を可能にする。

ＨＬＡ－Ａ２トランスジェニック胎仔の特徴付けについては、予想される組み込み部位の構造確認にはゲノムＰＣＲを用い、適正ＲＮＡ発現の確認にはＲＴ－ＰＣＲを用い、また細胞表面の発現確認にはフローサイトメトリー分析を用いる。

実施例３：ＨＬＡ－Ａ２／ＨＬＡ－ＤＱ８形質導入：ｄ４０トランスジェニックブタ胎仔の作製と遺伝子型／表現型評価
同様の全体的方略および天然のプロモーターを標的とするプロモーター不含のベクターによる標的発現を用い、実施例２に記載のＨＬＡ－ＤＱ８発現に基づく細胞選択を実施することにより、トランスジェニックブタ（ＨＬＡ－Ａ２／ＨＬＡ－ＤＱ８）を作製する。ＳＬＡクラスＩとは対照的に、ＳＬＡクラスＩＩは通常、線維芽細胞上には発現しない。ヒトおよびマウス線維芽細胞に見られるような、インターフェロンガンマによるクラスＩＩの発現誘導が、ブタ胎仔線維芽細胞においても、可能であるか否かを判定するために、初代胎仔線維芽細胞をブタＩＦＮ－ｇ（８０ｎｇ／ｍｌ）に曝露し、次いでブタＤＲおよびＤＱ汎対立遺伝子表面発現をフローサイトメトリーで観察した。ＦＮ－ｇによる６日処理後に、ほぼ全細胞においてＤＲおよびＤＱ両方の表面発現が強く誘導されることが明らかになった（図４）；ほとんどの細胞が３日間の誘導後に両者を高発現した。重要なことに、このような処理はこれら細胞の形態または増殖には何らの影響も及ぼさないようであった。したがって、クラスＩＩの誘導発現は、ＳＣＮＴクローニングに必要な細胞における、天然のクラスＩＩプロモーターによるトランスジェニックＨＬＡ－ＤＱ８発現についての実施可能な選択手段である。

適正なクラスＩＩ発現は、アクセサリー分子（ＣＤ７４を含む；また、ヒトにおいてはＨＬＡ－ＤＭ）の機能に依存する。トランスジェニックマウスにおけるＨＬＡ－ＤＱ８の発現から、ブタもまたＨＬＡ－ＤＱ８発現に関して適切な活性を全て備えている可能性が高いのである（Ｃｈｅｎｇら、１９９６）。マウスの研究では、内在性ＭＨＣ－ＩＩ分子の発現が外来性ＭＨＣ－ＩＩ発現を、おそらく競合によって、制限し得ることを示唆した。ＨＬＡ－ＤＱ８発現は天然のＳＬＡ－ＤＱＡ遺伝子座を標的とする。この標的化事象自体が、一方のＳＬＡ－ＤＱＡ対立遺伝子の機能を消失させる。ＣＲＩＳＰＲ媒介性改変の性質ゆえに、挿入欠失に関連する機能消失は、大部分の細胞において同様に非標的対立遺伝子に起こる。

ベクター構築
ＨＬＡ－ＤＱ８組み込みのための標的ベクターの模式図を図５に示す。

ＨＬＡ－Ａ２形質導入に関しては、アルファおよびベータ鎖の両方を単一の導入工程で導入する。ＤＱ８について、２種類の鎖のコード配列を、他の２シストロン性発現ベクターにおいて良好に用いられている高効率ＩＲＥＳ要素に連結する。ＨＬＡ－ＤＱアルファ鎖へのアミノ酸付加の機能的影響は未知であるため、この場合にはＩＲＥＳの連結については自己スプライシング要素に対する連結であることが好ましい。ＨＬＡ－Ａ２での付加と同様に、ＨＬＡ－ＤＱ８においてもリーダー配列を付与するために天然遺伝子座のエクソン１を用いるが、その結果としてＮ末端に単一アミノ酸の付加が起こる。

ＳＣＮＴ用改変線維芽細胞の選択
実施例２の記載のように作成されたＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックｄ４０胎仔細胞が、ＨＬＡ－ＤＱ８の改変導入の出発材料となる。予備的なＳＣＮＴドナー細胞形質転換を、実施例２に記載の方法で行う。数多くの抗汎ハプロタイプヒトＤＱ抗体が市販されている。まず、ブタＤＱ二量体には結合しない候補を判別する目的で、ＩＦＮ－ｇ誘導ブタ線維芽細胞をスクリーニングして選択候補を得る。次に、これらの候補を対象として第２スクリーニングを実施するが、これは種間二量体を認識する抗体を除去する目的で、ＨＬＡ－ＤＱＡ＊０３：０１およびＨＬＡＤＱＢ１＊０３：０２の発現構築物で個々に形質転換したＩＦＮｇ－誘導ブタ線維芽細胞を用いて実施する。これらの基準を満たす候補細胞の選択は、実施例２に記載の方法で実施する。予想される構造およびトランスジェニック遺伝子座のＲＮＡ発現について確認するために、実施例２と同様に、このフロー選別集団もゲノム解析およびＲＴ－ＰＣＲ分析に供する。

ｄ４０トランスジェニック胎児の作製と特徴付け
ゲノム解析およびＲＮＡ分析は、実施例２に記載するＨＬＡ－Ａ２改変の場合と同様の方法で実施する。

実施例４：ＨＬＡ－Ａ２およびＨＬＡ－Ａ２／ＨＬＡ－ＤＱ８を発現するｄ５６－７０胸腺組織の調製
実施例２および３に記載の方法で作成し、遺伝子型および表現型によって確認した早期胎仔細胞株を、細胞培養、卵成熟および胚再構成に関する実験室を備える施設に輸送し、また胚移植および胎児および子ブタの出産に関する外科施設にも輸送する。５６～７０日目の胎仔を得るためにＳＣＮＴクローニングを実施する。胎児のコンフォメーション遺伝型判定および表現型判定後に、当該技術分野において公知の方法により胸腺単離を行う。

実施例５：ＨＬＡ－Ａ２／ＨＬＡ－ＤＱ８トランスジェニック創始ブタ（Ｆｏｕｎｄｅｒ Ｂｏａｒ）の繁殖
創始ブタ（ｆｏｕｎｄｅｒ ｂｏａｒ）を作製するためのＳＣＮＴでは、実施例２および３に記載のように作製した、遺伝型／表現型の確認済みのｄ４０胎児細胞を利用する。トランスジェニック子ブタを移送可能週齢（８～１６週）になるまで育て、大規模動物繁殖、飼育およびさらなる畜産処置を行う最先端の畜産農業施設に移送する。

実施例６：ＨＩＳマウスにおけるヒトＴ細胞恒常性に関する、胸腺と末梢ＡＰＣ間のＨＬＡ共有の重要性
方法
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した６～８週齢のメスＮＯＤ ｓｃｉｄ共通ガンマ鎖ノックアウト（ＮＳＧ）マウスを、以前に報告した方法（Ｋｈｏｓｒａｖｉ Ｍａｈａｒｌｏｏｅｉら、２０１９）で胸腺摘出した。２週間後に、これらのマウスに亜致死的全身放射線照射（１Ｇｙ）を実施した後、１ｍｍ^３のブタ胎仔胸腺組織断片またはヒト胸腺組織断片を腎被膜下に外科移植した。

次いで、ＨＬＡを共有しない２種類の同種異系ＣＤ３４＋細胞（＃１と＃２）およびドナー＃１の自家胎仔胸腺を胸腺摘出ＮＳＧマウスに移植することにより、混合キメラドナーＨＩＳマウスを作成した。胸腺摘出ＮＳＧマウス（無胸腺）にＣＤ３４＋細胞＃１または＃２を注入することにより、２群の養子先レシピエント（ＡＲ）マウスを作成した。移植後２０週経て、混合キメラのＴ細胞をＡＲ１およびＡＲ２マウスに静注した。図６Ａを参照のこと。

結果
養子免疫伝達後１０日目に、Ｔ細胞選択をしたドナー胸腺に対してＡＰＣがＨＬＡ自己性であるＡＲ１マウスでは、増殖（Ｋｉ６７＋）Ｔ細胞の割合は同種異系ＨＬＡのみを含むＡＲ２マウスよりも有意に高かった。図６Ｂを参照のこと。

これらの研究は、末梢ヒトＴ細胞の増殖を支持するリンパ球減少症誘導性を最大化するためには、末梢ＡＰＣ上に胸腺ＨＬＡが必要であることを示しており、正常な免疫恒常性を達成するため、ブタ胸腺にヒト胸腺上皮細胞またはＨＬＡ分子を付与する研究の重要性を強調するものである。

実施例７：ＨＩＳマウスにおけるヒト免疫再構成の比較
方法
実施例６に記載の方法で、胸腺摘出し、放射線照射したＮＯＤ ｓｃｉｄ共通γ鎖ノックアウト（ＮＳＧ）マウスの腎被膜下にブタ胎仔胸腺を移植することによって、ヒト化マウスを作製した。

次いで、これらのマウスにヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞を注入した。同一のブタ胎仔胸腺および異なる臍帯血ＣＤ３４＋細胞を用いて、２バッチのヒト化マウスを作成した。ヒトＣＤ３４ミクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いることによって、ＣＤ３４＋細胞を単離する。移植片由来の既存ヒト胸腺細胞が起こす拒絶反応であって、ブタ胸腺組織に対する拒絶反応および／または注入した同種異系ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞に対する拒絶反応を予防するために、ＣＤ３４＋細胞接種物中の残存Ｔ細胞を枯渇させる、およびヒト胎児胸腺組織から遊離する残存胸腺細胞を枯渇させる目的で、抗ＣＤ２ｍＡｂ ＬｏＣＤ２ｂ（４００ｇμ／マウス）を週１回、２週間（０日目、７日目および１４日目）腹腔内注入した。

ヒト胎児胸腺組織および自家胎児肝由来ＣＤ３４＋細胞を用いた異なる実験において作製したヒト化マウスの再構成を、比較のために含めた。

マウスの末梢血採取を４週目に開始し、血液中のヒトＣＤ３細胞濃度を測定した。

１５週目に末梢血のフローサイトメトリー分析を実施して細胞集団の数を調べた；その細胞集団は以下である：ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞、ナイーブおよびメモリーＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および濾胞ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）；Ｂ細胞サブセット、単球および樹状細胞（ＤＣ）（古典的ＤＣ（ｃＤＣｌおよびｃＤＣ２）および形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）を含む）を含む、Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞集団。

結果
図７Ａに示すように、マウスの末梢血中のヒト細胞に基づけば、ブタ胎仔胸腺およびヒトＣＤ３４＋細胞で作製した２バッチのマウスにおけるヒトＴ細胞再構成は、ヒト胎児胸腺で作製したものと同程度であった。

図７Ｂに示すように、高低検出によって、ＣＤ４およびＣＤ８サブセットにナイーブＴ細胞が高い割合（％）で存在することが分かった。ＣＤ４＋ＣＤ２５^ｈｉｇｈＣＤ１２７^ｌｏｗ制御性Ｔ細胞の生成もまた実証された。

実施例８：ＨＩＳマウスの継続的なモニタリングおよび分析
実施例７の記述の方法で作製したマウスを、以下のようにさらにモニターする。

血漿免疫グロブリン（ＩｇＭおよびＩｇＧ）レベルを、移植後４週毎にＥＬＩＳＡで追跡して比較する。

移植後１４～１６週の、ＨＩＳマウスにおけるヒト細胞の再構成が完了したと予想される時に、各群の動物の半数を安楽死させて末梢血、リンパ節、脾臓および胸腺中の組織サイズ、組織構造、細胞充実性および細胞集団について全群を比較する。免疫細胞集団を調べるためのフローサイトメトリーパネルは、表１に示すものである。各リンパ系組織（脾臓、リンパ節および胸腺を含む）の小片を用いて組織学試験を実施し、これら組織の構造を比較する。全ＨＩＳマウスについて、血清免疫グロブリン（ＩｇＭおよびＩｇＧ）レベルをＥＬＩＳＡで測定する。さらに、汎ＴＣＲ刺激（抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ）、アロ抗原刺激、異種抗原刺激および破傷風トキソイド新抗原刺激に応答する増殖、サイトカイン産生および細胞傷害性のインビトロアッセイを用いて、マウス各群の末梢におけるヒトＴ細胞の機能を比較する。増殖をＣＦＳＥ細胞内色素希釈で判定する。ＩＬ－２およびＩＦＮ－γを含むサイトカイン産生を細胞内染色でアッセイする。アロ抗原および異種抗原刺激については、同種異系ヒトＰＢＭＣおよび第三者ブタＰＢＭＣを刺激因子として用いる。ＨＩＳマウスの単離脾臓Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、放射線照射した刺激因子と共に１：１の比で６日間共培養する。ヒトＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のＣＦＳＥ希釈はフローサイトメトリーで判定する。破傷風トキソイド新抗原刺激については、ＨＩＳマウス作成に用いる臍帯血由来または胎児肝由来ＣＤ３４＋細胞を利用してＤＣを生成させる。樹状細胞へ分化させるために、ＣＤ３４＋細胞をヒトサイトカイン（幹細胞因子、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を含む）の存在下で１３日間培養する。ＣＤ３４由来ＤＣを破傷風トキソイド新抗原でパルスし、次いでＴＮＦ－αおよびＰＧＥ２で成熟させてから、ＣＦＳＥ標識した単離脾臓Ｔ細胞と共に７日間共培養する。増殖Ｔ細胞の判定はフローサイトメトリーで行う。単球をＬＰＳで刺激し、上清中のＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１０産生をＥＬＩＳＡで判定する。

残りのＨＩＳマウスを最長３０週目までモニターして、各系譜の再構成持続について調べ、また移植片対宿主病／自己免疫疾患の発症について調べる。４週毎にマウスの採血を行い、ヒト細胞生着について判定する。移植片対宿主病／自己免疫についてマウスの評価を移植後２０週目から開始し、週２回、３０週目まで下記の評価システムを用いて評価する。いずれの分析も上記のものと同様に行う。

評価システム：
体重減少（％）：
＜１０％、０；＜１０～１５％、１；＜１５～２０％、２；＞２０％、３
姿勢：
正常、０；休息時に軽度の円背、１；中程度の円背、正常に歩き回ることができる、２；重度の円背、運動および歩行の低下、３
被毛状態：
正常、０；軽度の被毛の荒れ、１；中程度の被毛の荒れ、２；重度の被毛の荒れ、頭部または前肢のポルフィリンによる汚れ、３
活動性：
正常、０；軽度から中程度の低下、１；食餌または飲水または刺激時のみ活動、２；起き上がり困難、刺激時に動くことができない、３

ＧＶＨＤの何らかの徴候（２超のスコア）のある動物は、毎日モニターし一日おきに体重計測する。総スコアが６以上の動物は、毎日モニターし毎日体重計測する。総スコアが９以上の動物、またはいずれか１カテゴリーのスコアが３である動物は、安楽死させる。

これらの試験では、ブタ胎仔胸腺および臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の移植後のヒト再構成を、ヒト胎児胸腺および胎児ＣＤ３４＋細胞の移植後のヒト再構成と比較する。その結果は、ブタ胎仔胸腺および臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞で作成したＨＩＳマウスのヒト再構成は、ヒト胎児胸腺および胎児ＣＤ３４＋細胞で作成したＨＩＳマウスのヒト再構成と類似していることを示す。末梢血におけるヒト細胞再構成が確認されれば（移植後約４ヶ月経て）試験を開始して、下記のように、特定の拘束を伴うトランスジェニックヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の胸腺選択およびヒト同種異系皮膚移植片に対する拒絶反応を判定することによってこれらマウスのインビボ免疫機能を調べる。

実施例９：ＨＩＳマウスにおけるＨＬＡ－Ａ２拘束性ＴＣＲの選択についての比較
胸腺摘出ＮＳＧマウスにおいて、臍帯血ＣＤ３４＋細胞から再構成させた時のＨＬＡ－Ａ２拘束性ＴＣＲの選択について、ＳＬＡで規定される胎仔胸腺組織とＨＬＡ－Ａ２＋ヒト胎児胸腺組織とを比較する。ＨＵ／ＨＵマウスにおいてヒトＣＤ３４＋細胞にレンチウイルス形質導入を用いた場合には、ＨＬＡ－Ａ２＋ヒト胸腺ではヒトＨＬＡ－Ａ２拘束性ＴＣＲ ＭＡＲＴＩのポジティブ選択が起こるが、ＳＬＡｋｍブタ胸腺では起こらないということが明らかになった（図８）。本試験によって、このＴＣＲはやはりホモ接合ＳＬＡｈｈブタ胎仔胸腺でもポジティブ選択されないことが示されたが、その理由は、これが実施例２および３のトランスジェニックブタにおいてＨＬＡ導入遺伝子導入に利用するブタＳＬＡだからである。

実施例７において概説する方法で、ブタ胎仔胸腺（ＳＬＡｈｈ）またはヒト胎児胸腺およびＭＡＲＴ－１－ＴＣＲ－形質導入胎児肝由来または臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞（表２）を用いて３群のマウスを作製する。ＣＤ３４＋細胞の形質導入に関しては、レトロネクチンをコーティングしたプレートを用い、１０μｇ／ｍＬ硫酸プロタミンおよび６０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬおよび３００ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－３、Ｆｌｔ３リガンド、および幹細胞因子を含むＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地中でそれぞれ、３時間インキュベートすることによりヒト胎児肝由来または臍帯血ＣＤ３４＋細胞を前刺激する。感染の多重度３０で一晩、細胞に形質導入した後、回収して脛骨内注入用に調製する。少数の形質導入ＣＤ３４＋細胞を硫酸プロタミン不含幹細胞培地で４日間培養し、次いでフローサイトメトリーによって形質導入効率を評価する。ＨＬＡ－Ａ２によって選択されるヒトＴ細胞の最適恒常性にとっては、末梢におけるＨＬＡ－Ａ２＋ ＡＰＣの存在を必要とする可能性があるので、ＨＩＳマウスの作製にはＨＬＡ－Ａ２＋胎児肝ＣＤ３４＋細胞または臍帯血ＣＤ３４＋細胞を用いる。ＨＬＡ型検査について、ＣＤ３４陰性胎児肝または臍帯血細胞からＣＤ３４＋細胞を単離した後、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出する。Ｓａｎｇｅｒ法による対立遺伝子レベルでのＨＬＡ型検査を実施して、組織のＨＬＡ型を判定する。組織タイピングの検査中は、ヒト胎児ＣＤ３４＋細胞および臍帯血ＣＤ３４＋細胞を凍結しておく。

移植後１４～１６週に、ＨＩＳマウスにおいてヒト細胞再構成が完了してから、マウスを安楽死させて分析する。二重陰性（ＣＤｌａ＋）（ＣＤ７＋早期胸腺細胞を含む）、二重陽性、ＣＤ４単一陽性およびＣＤ８単一陽性サブセット中のＭＡＲＴ－１＋胸腺細胞の割合（％）および絶対数を選択マーカー（ＣＤ６９、ＰＤ１、ＣＣＲ７）で調べる。ＨＬＡクラスＩ拘束性ＴＣＲ ＭＡＲＴ１のポジティブ選択不全がブタ胎仔胸腺において観察される。

トランスジェニックＴ細胞を同定するために、蛍光色素標識ＭＡＲＴ１四量体を用いるが、ＧＦＰは遺伝子導入ＨＳＰＣの起源を表すマーカーとして利用する。胸腺発生の各段階のＧＦＰ＋およびＧＦＰ－胸腺細胞によって、各マウス個体におけるトランスジェニックＴ細胞および非トランスジェニックＴ細胞の選択レベルに関して内部的に整合性のある比較が得られる。トランスジェニックブタの作製（実施例３および４）中に実施するこれらの試験は、ブタ胸腺におけるＨＬＡ－Ａ２拘束性ヒトＴ細胞選択に及ぼすブタ胎仔胸腺中のＨＬＡ－Ａ２導入遺伝子の効果を評価する際の基準となるベースラインを提供する。その詳細なパネルを下の表３に示す。分析はＡｕｒｏｒａスペクトルフローサイトメトリーによって実施する。

実施例１０：ＨＩＳマウスにおけるＨＬＡ－ＤＱ８拘束性膵島自己抗原特異的ＴＣＲの選択の比較
次に、胸腺摘出ＮＳＧマウスにおいて、ＨＬＡ－ＤＱ８＋臍帯血ＣＤ３４＋細胞から再構成させた時のＨＬＡ－ＤＱ８拘束性膵島自己抗原特異的ＴＣＲ、クローン５の選択について、ＳＬＡで規定される胎仔胸腺組織とヒト胎児胸腺組織（各ＴＣＲに関連するＨＬＡ対立遺伝子を含む）とを比較する。ヒト胎児胸腺組織を用いて、ＨＬＡＤＱ８ヒト胎児胸腺においてクローン５ＴＣＲ＋ Ｔ細胞がポジティブ選択され、ＨＳＰＣがＨＬＡ－ＤＱ８を発現する場合にはネガティブ選択されることが示されている（図９）。実施例７において概説する方法で、ブタ胎仔胸腺（ＳＬＡｈｈ）またはヒト胎児胸腺およびクローン５ＴＣＲ形質導入胎児肝由来または臍帯血由来ＨＬＡ－ＤＱ８＋ＣＤ３４＋細胞を用いて３群のＨＩＳマウス（表４）を作成する。

ＨＬＡ型検査について、ＣＤ３４陰性胎児肝または臍帯血細胞からＣＤ３４＋細胞を単離した後、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出する。Ｓａｎｇｅｒ法による対立遺伝子レベルでのＨＬＡ型検査を実施して、組織のＨＬＡ型を判定する。組織タイピングの検査中は、ヒト胎児ＣＤ３４＋細胞および臍帯血ＣＤ３４＋細胞を凍結しておく。

移植後１４～１６週にＨＩＳマウスにおいてヒト細胞再構成が完了してから、マウスを安楽死させて分析する。二重陰性（ＣＤｌａ＋）（ＣＤ７＋早期胸腺細胞を含む）、ＣＤ６９＋およびＣＤ６９－の二重陽性、ＣＤ４単一陽性およびＣＤ８単一陽性サブセット中のクローン５＋胸腺細胞の割合（％）および絶対数をネガティブ選択マーカー（ＰＤ１、ＣＣＲ７）で調べる。ＨＬＡ－ＤＱ８＋胸腺において、このＴＣＲを伴う胸腺細胞のＴｒｅｇ系譜分化を検出するために、分析にはＴｒｅｇマーカー（ＣＤ２５およびＣＤ１２７）も含める。その詳細なパネルを下の表５に示す。分析はＡｕｒｏｒａスペクトルフローサイトメトリーによって実施する。

このＴＣＲが認識するインスリンペプチドは、髄質ＴＥＣ（ｍＴＥＣ）によって産生されると予想されるので、このＴＣＲのポジティブ選択は胸腺上皮によるＨＬＡ－ＤＱ８発現に依存する。したがって、ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＴＣＲクローン５のポジティブ選択不全がブタ胎仔胸腺において観察される。

しかし、交差反応性決定因子が存在して、このＴＣＲのポジティブ選択が可能となるＳＬＡｈｈブタ胸腺においてその因子が産生されることもある。この場合には、ＨＬＡ－ＤＱ８＋ ＣＤ３４＋細胞を含む再構成ブタ胸腺において、このＴＣＲを有する胸腺細胞のネガティブ選択が起こるか否かを判定する。

ＨＬＡ－ＤＱ８＋ヒト胸腺における予備的データは、このＴＣＲのネガティブ選択にはＣＤ３４細胞由来ＡＰＣ上にＨＬＡ－ＤＱ８が必要であることを示唆する（図８を参照のこと）。これは、ヒトＨＬＡ－ＤＱ８＋ ＡＰＣを含むブタ胸腺においても依然として起こることがある。その理由は、インスリンＢ（９－２３）ペプチドがブタインスリン分子とヒトインスリン分子で同一であり、ブタ胸腺移植片においてヒトＡＰＣがこれを捕捉して提示するからである。トランスジェニックＴ細胞を同定するために、蛍光色素標識クローン５Ｖβ特異的ｍＡｈ（Ｖβ２１．３）を用いるが、ＧＦＰは遺伝子導入ＨＳＰＣの起源を表すマーカーとして利用する。胸腺発生の各段階のＧＦＰ＋およびＧＦＰ－胸腺細胞によって、各マウス個体におけるＴｇおよび非ＴｇのＴ細胞の選択レベルに関して内部的に整合性のある比較が得られる。トランスジェニックブタの作成（実施例３および４）中に実施するこれらの試験は、ブタ胸腺におけるＨＬＡ ＤＱ８拘束性ヒトＴ細胞選択に及ぼすブタ胎仔胸腺中のＨＬＡ－ＤＱ８導入遺伝子の効果を評価する際の基準となるベースラインを提供する。

実施例１１：ＨＩＳマウスの同種異系ヒト皮膚移植片拒絶反応の比較
異なる胸腺およびＣＤ３４＋細胞で作成したＨＩＳマウスにおけるヒト免疫系機能を調べるために、それらの同種異系皮膚移植片拒絶能を比較した。この目的において、実施例７において概説する方法で、ブタ胎仔またはヒトの胸腺およびＣＢ由来または胎児肝由来のＣＤ３４＋細胞（表６）を移植することによってＨＩＳマウスを作製した。

移植後１４～１６週に、同種異系ヒトドナーから得た分層（２．３ｍｍ）皮膚試料を外側胸壁に移植する。皮膚移植片は、７日目から４週間、毎日評価した後、少なくとも３日に１回検査する。移植片の生存状態が１０％未満である場合に、その移植片は拒絶されたと定義する。２種類の胸腺およびＣＤ３４＋細胞で作製したＨＩＳマウスはいずれも、同種異系皮膚移植片を拒絶することができる。

実施例１２：ヒト細胞再構成についての、非トランスジェニックブタ胸腺とＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックブタ胸腺との間の比較
実施例７に示すように、ブタ胎仔胸腺および臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞で作成したＨＩＳマウスは、胎児胸腺および自家胎児肝由来ＣＤ３４＋細胞で作成したＨＩＳマウスと比較してＴ細胞に軽微な機能的欠損（ＨＬＡ拘束性抗原応答の低下およびＴＣＲ－形質導入Ｔ細胞の胸腺における選択など）がある。その主な理由は、以下である；ブタ胸腺においてＨＬＡ分子よりも、むしろブタ白血球抗原（ＳＬＡ）分子が胸腺細胞のポジティブ選択を媒介し、これら選択されるＴ細胞のうち、ごく一部のサブセットのみがヒトＨＬＡに対して充分な交差反応性を示して、ＣＤ３４細胞ドナー由来ＤＣのＨＬＡによって提示されるペプチド抗原を認識する。共通のＨＬＡ分子（ＨＬＡ－Ａ２およびＨＬＡ－ＤＱ８を含む）を発現するトランスジェニック（Ｔｇ）ブタ胎仔胸腺を用いて、このモデルを最適化する。

実施例３のＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックブタ胎仔胸腺を用いて、免疫再構成および免疫機能を、非トランスジェニック胎仔胸腺で作製したＨＩＳマウスとＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックブタ胎仔胸腺で作製したＨＩＳマウスとの間で比較する。

胸腺摘出ＮＳＧマウスを用いて、実施例７において概説する方法、および表７に説明のような方法で、トランスジェニックおよび非トランスジェニックブタ胎仔胸腺とＣＢ ＣＤ３４＋細胞を用いた２種類のＨＩＳマウスを作製する。

これらＨＩＳマウスの作製後に、該マウスを以下のようにモニターする。

再増殖速度およびＴ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞集団（ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞、ナイーブおよびメモリーＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および濾胞ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）；Ｂ細胞サブセット、単球およびＤＣ（古典的ＤＣ（ｃＤＣｌおよびｃＤＣ２）および形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）を含む）の末梢血中濃度を測定することにより、ヒト免疫細胞再構成についてモニターし、２種類のＨＩＳマウスを比較する。移植後４週毎に、ＨＩＳマウスから末梢血を採取して赤血球をＡＣＫ緩衝液で溶血させる。末梢血のフローサイトメトリー分析を実施して、各集団の割合（％）と絶対数を決定する。各集団の絶対数は、ビーズを計数することによって算出する。各群のＨＩＳマウスにおいて再構成を達成するマウスの割合（％）も調べる。免疫細胞集団を調べるために利用するパネルを表１に示す。

３種類のＨＩＳマウスにおいて、移植後４週毎に血漿免疫グロブリン（ＩｇＭおよびＩｇＧ）レベルをＥＬＩＳＡでモニターし比較する。

移植後１４～１６週の、ＨＩＳマウスにおけるヒト細胞の再構成が完了したと予想される時に、各群の動物の半数を安楽死させて末梢血、リンパ節、脾臓および胸腺中の組織サイズ、組織構造、細胞充実性および細胞集団について比較する。免疫細胞集団を試験するためのフローサイトメトリーパネルは、表１のものと同一である。各リンパ系組織（脾臓、リンパ節および胸腺を含む）の小片を用いて組織学試験を実施し、これら組織の構造を比較する。全ＨＩＳマウスについて、血清免疫グロブリン（ＩｇＭおよびＩｇＧ）レベルをＥＬＩＳＡで測定する。さらに、汎ＴＣＲ刺激（抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ）、アロ抗原刺激、異種抗原刺激および破傷風トキソイド新抗原刺激に応答する増殖、サイトカイン産生および細胞傷害性のインビトロアッセイを用いて、マウス各群の末梢におけるヒトＴ細胞の機能を比較する。増殖をＣＦＳＥ細胞内色素希釈で判定する。ＩＬ－２およびＩＦＮ－γを含むサイトカイン産生を細胞内染色でアッセイする。アロ抗原および異種抗原刺激については、同種異系ヒトＰＢＭＣおよび第三者ブタＰＢＭＣを刺激因子として用いる。ＨＩＳマウスの単離脾臓Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、放射線照射した刺激因子と共に１：１の比で６日間共培養する。ヒトＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のＣＦＳＥ希釈はフローサイトメトリーで判定する。破傷風トキソイド新抗原刺激については、ＨＩＳマウス作製に用いるＣＢ ＣＤ３４＋細胞を利用してＤＣを生成させる。樹状細胞へ分化させるために、ＣＤ３４＋細胞をヒトサイトカイン（幹細胞因子、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を含む）の存在下で１３日間培養する。ＣＤ３４由来ＤＣを破傷風トキソイド新抗原でパルスし、次いでＴＮＦ－αおよびＰＧＥ２で成熟させてから、ＣＦＳＥ標識した単離脾臓Ｔ細胞と共に７日間共培養する。増殖Ｔ細胞の判定はフローサイトメトリーで行う。単球をＬＰＳで刺激し、上清中のＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１０産生をＥＬＩＳＡで判定する。

残りのＨＩＳマウスを最長３０週目までモニターして、各系譜の再構成持続について調べ、また移植片対宿主病／自己免疫疾患の発症について調べる。４週毎にマウスの採血を行い、ヒト細胞生着について判定する。移植片対宿主病についてマウスの評価を移植後２０週目から開始し、週２回、３０週目まで、実施例６に記載の評価システムを用いて評価する。この時点で実施するいずれの分析も、１４～１６週の分析と同一である。

これらの群間で類似した骨髄再構成が認められる。ＨＬＡトランスジェニックブタ胸腺のレシピエントにおいて、免疫再構成および免疫機能が促進され得る。

実施例１３：ＨＬＡ－Ａ２－トランスジェニックブタ胎仔胸腺に発生するヒトＴ細胞の、ＨＬＡ－Ａ２分子に対する免疫寛容を比較する
ＨＬＡ－Ａ２－トランスジェニックブタ胎仔胸腺で作製したＨＩＳにおいて発生するヒトＴ細胞の主要な一特徴は、ＨＬＡ－Ａ２に対する免疫寛容であると予想されるが、その理由は、ＨＬＡ－Ａ２を発現する胸腺上皮細胞によるネガティブ選択でＨＬＡ－Ａ２反応性Ｔ細胞が除去される、および／またはＨＬＡ－Ａ２を発現するＴＥＣによって選択されるＴｒｅｇによりＨＬＡ－Ａ２反応性Ｔ細胞が抑制されることによる。この目的において、ＨＬＡ－Ａ２－Ｔｇで発生するＴ細胞のヒトＴｇ ＨＬＡ分子に対する免疫寛容を非Ｔｇブタ胎仔胸腺のそれと比較する。ＣＤ３４＋細胞由来ＡＰＣによるＨＬＡ－Ａ２反応性Ｔ細胞のネガティブ選択を除去するために、ＨＬＡ－Ａ２－ＣＢ由来のＣＤ３４＋細胞を用いてＨＩＳマウスを作製した。作製したＨＩＳマウス群を表８に示す。移植後１４～１６週に、脾臓Ｔ細胞および成熟胸腺Ｔ細胞を単離し、ドナーブタ由来のＤＣを用いてＨＬＡ－Ａ２に対する免疫寛容（ＨＬＡ－Ａ２－Ｔｇブタ胎仔胸腺のレシピエントのみに観察されることが予想される）をインビトロで試験する。ブタ胎仔肝白血球からＤＣを調製し、胎仔胸腺回収時にそれを回収して使用まで凍結する。ブタ幹細胞因子、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４存在下で胎仔肝白血球を１３日間培養して、ＤＣに分化させる。ＨＬＡ－Ａ２応答のＴｒｅｇ抑制に対する、ＨＬＡ－Ａ２トランスジェニック発現の影響を判定するために、これら試験にはＴｒｅｇ枯渇を含める。

実施例１４：ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＴＣＲの選択について、対照で作製したＨＩＳマウスとＨＬＡ－Ａ２－Ｔｇブタ胎仔胸腺で作製したＨＩＳマウスとを比較する
ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＴＣＲ、ＭＡＲＴ１の選択について、非Ｔｇ対照で作製したＨＩＳマウスとＨＬＡ－Ａ２－Ｔｇブタ胎仔胸腺で作製したＨＩＳマウスとを比較する。亜致死的に放射線照射した胸腺摘出ＮＳＧマウスに、ＭＡＲＴ－１形質導入ＨＬＡ－Ａ２＋ＣＢ ＣＤ３４＋細胞を注入した後、非Ｔｇ対照またはＨＬＡ－Ａ２－Ｔｇブタ胎仔胸腺を移植する（表９）。

移植後１４～１６週に、ＨＩＳマウスにおいてヒト細胞再構成が完了してから、マウスを安楽死させて分析する。二重陰性（ＣＤｌａ＋）（ＣＤ７＋早期胸腺細胞を含む）、二重陽性、ＣＤ４単一陽性およびＣＤ８単一陽性サブセット中のＭＡＲＴ－１＋胸腺細胞の割合（％）および絶対数を他のネガティブ選択マーカー（ＣＤ６９、ＰＤ１、ＣＣＲ７）で調べる。ＨＬＡ－Ａ２＋ Ｔｇブタ胎仔胸腺においてＨＬＡクラスＩ拘束性ＴＣＲ ＭＡＲＴ１のポジティブ選択亢進が見られることが予想される。トランスジェニックＴ細胞を同定するために、蛍光色素標識ＭＡＲＴ１四量体を用いるが、ＧＦＰは遺伝子導入ＨＳＰＣの起源を表すマーカーとして利用する。胸腺発生の各段階のＧＦＰ＋およびＧＦＰ－胸腺細胞によって、各マウス個体におけるＴｇおよび非Ｔｇ Ｔ細胞の選択レベルに関して内部的に整合性のある比較が得られる。その詳細なパネルを下の表４に示す。分析はＡｕｒｏｒａスペクトルフローサイトメトリーによって実施する。

ＨＬＡ－Ａ２はブタ胸腺におけるポジティブ選択を亢進させ、それによってさらに多数のＭＡＲＴ１＋ Ｔ細胞が末梢に輸送されることになるという仮説の下に、各マウスの末梢（血液、脾臓、リンパ節）におけるＭＡＲＴ１＋および陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞を列挙する。ＭＡＲＴ１＋細胞を細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ４５０で標識し、自家ＤＣおよび段階的な量で添加したＭＡＲＴ１ペプチドと共に該細胞をインキュベートし、増殖を測定すること、およびＧＦＰ＋Ｔ細胞の活性化について他のマーカーを測定することにより、末梢ＭＡＲＴ１＋細胞の機能を調べる。

実施例１５：ＨＬＡ－Ａ２－Ｔｇブタ胎仔胸腺で作製したＨＩＳマウスによる同種異系皮膚移植片拒絶反応の比較
ＨＬＡ－Ａ２－Ｔｇ胸腺およびＣＤ３４＋細胞で作製したＨＩＳマウスにおける免疫系機能を調べるために、ＨＩＳマウスの同種異系皮膚移植片拒絶能を比較する。この目的において、亜致死的に放射線照射した胸腺摘出ＮＳＧマウスにＨＬＡ－Ａ２－Ｔｇまたは非Ｔｇ対照ブタ胎仔胸腺およびＣＢ ＣＤ３４＋細胞を移植することにより、ＨＩＳマウスを作製する（表１０）。移植後１４～１６週に、同種異系ヒトドナーの分層（２．３ｍｍ）皮膚試料を胸壁に移植する。皮膚移植片は、７日目から４週間、毎日評価した後、少なくとも３日に１回検査する。移植片の生存状態が１０％未満である場合に、その移植片は拒絶されたと定義する。胸腺および末梢ヒトＡＰＣがＨＬＡ分子を共有するときには、末梢Ｔ細胞機能はより安定であり、対照ブタ胸腺移植片のレシピエントよりもＨＬＡ－Ａ２－Ｔｇレシピエントにおいてより急激な移植片拒絶反応が起こる。

実施例１６：ヒト細胞再構成についての、非Ｔｇブタ胸腺とＨＬＡ－Ａ２／ＤＱ８－Ｔｇブタ胸腺との比較
ＨＬＡ－Ａ２／ＤＱ８－Ｔｇブタ胎仔胸腺が利用可能である場合には、非Ｔｇブタ胎仔胸腺で作製したＨＩＳマウスにおける免疫再構成および免疫機能を、ＨＬＡ－Ａ２／ＤＱ８－Ｔｇブタ胎仔胸腺で作製したＨＩＳマウスのものと比較する。胸腺摘出ＮＳＧマウスを利用して、表１１に説明するような方法で、ＨＬＡ－Ａ２－ＴｇおよびＨＬＡ－Ａ２／ＤＱ８－Ｔｇブタ胎仔胸腺ならびにＨＬＡ－ＤＱ８＋ ＣＢ由来のＣＤ３４＋細胞を用いて、２種類のＨＩＳマウスを作製する。ＨＬＡ－ＤＱ８によって選択されるヒトＴ細胞の最適恒常性にとっては、末梢におけるＨＬＡ－ＤＱ８＋ ＡＰＣの存在を必要とするので、ＨＩＳマウスの作成にはＨＬＡ－ＤＱ８＋ＣＢ由来のＣＤ３４＋細胞を用いる。胸腺および末梢ＡＰＣが共有するクラスＩおよびクラスＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子の両方を保持することにより、免疫機能を最適化する目的で、ＨＬＡ－Ａ２＋ＤＱ８＋のＣＤ３４＋細胞を用いる。

これらＨＩＳマウスの作製後に、該マウスを以下のようにモニターする。

再増殖速度およびＴ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞集団（ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞、ナイーブおよびメモリーＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および濾胞ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）；Ｂ細胞サブセット、単球およびＤＣ（古典的ＤＣ（ｃＤＣｌおよびｃＤＣ２）および形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）を含む）の末梢血中濃度を測定することにより、ヒト免疫細胞再構成についてモニターし、２種類のＨＩＳマウスを比較する。移植後４週毎に、ＨＩＳマウスから末梢血を採取して赤血球をＡＣＫ緩衝液で溶血させる。末梢血のフローサイトメトリー分析を実施して、各集団の割合（％）と絶対数を決定する。各集団の絶対数は、ビーズを計数することによって算出する。各群のＨＩＳマウスにおいて再構成を達成するマウスの割合（％）も調べる。免疫細胞集団を調べるために利用するパネルを表２に示す。

３種類のＨＩＳマウスにおいて、移植後４週毎に血清免疫グロブリン（ＩｇＭおよびＩｇＧ）レベルをＥＬＩＳＡでモニターし、比較する。

移植後１４～１６週の、ＨＩＳマウスにおけるヒト細胞の再構成が完了したと予想される時に、各群の動物の半数を安楽死させて末梢血、リンパ節、脾臓および胸腺中の組織サイズ、組織構造、細胞充実性および細胞集団について比較する。免疫細胞集団を試験するためのフローサイトメトリーパネルは、表２のものと同一である。各リンパ系組織（脾臓、リンパ節および胸腺を含む）の小片を用いて組織学試験を実施し、これら組織の構造を比較する。全ＨＩＳマウスについて、血清免疫グロブリン（ＩｇＭおよびＩｇＧ）レベルをＥＬＩＳＡで測定する。さらに、汎ＴＣＲ刺激（抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ）、アロ抗原刺激、異種抗原刺激および破傷風トキソイド新抗原刺激に応答する増殖、サイトカイン産生および細胞傷害性のインビトロアッセイを用いて、マウス各群の末梢におけるヒトＴ細胞の機能を比較する。増殖をＣＦＳＥ細胞内色素希釈で判定する。ＩＬ－２およびＩＦＮ－γを含むサイトカイン産生を細胞内染色でアッセイする。

アロ抗原および異種抗原刺激については、同種異系ヒトＰＢＭＣおよび第三者ブタＰＢＭＣを刺激因子として用いる。ＨＩＳマウスの単離脾臓Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、放射線照射した刺激因子と共に１：１の比で６日間共培養する。ヒトＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のＣＦＳＥ希釈はフローサイトメトリーで判定する。破傷風トキソイド新抗原刺激については、ＨＩＳマウス作成に用いるＣＢ ＣＤ３４＋細胞を利用してＤＣを生成させる。樹状細胞へ分化させるために、ＣＤ３４＋細胞をヒトサイトカイン（幹細胞因子、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を含む）の存在下で１３日間培養する。ＣＤ３４由来ＤＣを破傷風トキソイド新抗原でパルスし、次いでＴＮＦ－αおよびＰＧＥ２で成熟させてから、ＣＦＳＥ標識した単離脾臓Ｔ細胞と共に７日間共培養する。増殖Ｔ細胞の判定はフローサイトメトリーで行う。単球をＬＰＳで刺激し、上清中のＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１０産生をＥＬＩＳＡで判定する。

残りのＨＩＳマウスを最長３０週目までモニターして、各系譜の再構成持続について調べ、また移植片対宿主病／自己免疫疾患の発症について調べる。４週毎にマウスの採血を行い、ヒト細胞生着について判定する。移植片対宿主病についてマウスの評価を移植後２０週目から開始し、週２回、３０週目まで、実施例８に記載の評価システムを用いて評価する。この時点で実施するいずれの分析も、１４～１６週の分析と同一である。

実施例１７：ＨＬＡ－ＤＱ８に対する免疫寛容についての、ＨＬＡ－Ａ２／ＤＱ８－Ｔｇブタ胎仔胸腺において発生するＴ細胞とＨＬＡ－Ａ２－Ｔｇブタ胎仔胸腺において発生するＴ細胞との比較
ヒトＴｇ ＨＬＡ－ＤＱ８分子に対する免疫寛容について、ＨＬＡ－Ａ２／ＤＱ８－Ｔｇにおいて発生するＴ細胞と非Ｔｇブタ胎仔胸腺において発生するＴ細胞とを比較する。ＣＤ３４＋細胞由来ＡＰＣによるＨＬＡ－ＤＱ８反応性Ｔ細胞のネガティブ選択を除去するために、ＨＬＡ－ＤＱ８－ＣＢ ＣＤ３４＋細胞を用いてＨＩＳマウスを作製した。この課題のために作成したＨＩＳマウス群を表１２に示す。移植後１４～１６週に、脾臓Ｔ細胞および成熟胸腺Ｔ細胞を単離し、ドナーブタ由来のＤＣを用いてＨＬＡ－ＤＱ８に対する免疫寛容（ＨＬＡ－Ａ２／ＤＱ８－Ｔｇブタ胎仔胸腺のレシピエントのみに観察されることが予想される）をインビトロで試験する。ブタ胎仔肝白血球からＤＣを調製し、胎仔胸腺回収時にそれを回収して使用まで凍結する。ブタ幹細胞因子、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４存在下で胎仔肝白血球を１３日間培養して、ＤＣに分化させる。ＴＥＣ上にＨＬＡＤＱ８が存在することによって、これらの特異性を有するＴｒｅｇのポジティブ選択が可能になると思われるため、これら試験にはＴｒｅｇ枯渇を含める。

実施例１８：ＨＬＡ－ＤＱ８拘束性ＴＣＲの選択について、対照で作製したＨＩＳマウスとＨＬＡ－Ａ２／ＤＱ８－Ｔｇブタ胎仔胸腺で作製したＨＩＳマウスとを比較する
ＨＬＡ－ＤＱ８拘束性ＴＣＲ（クローン５）の選択について、非Ｔｇ対照で作成したＨＩＳマウスとＨＬＡ－Ａ２／ＤＱ８－Ｔｇブタ胎仔胸腺で作成したＨＩＳマウスとを比較する。亜致死的に放射線照射した胸腺摘出ＮＳＧマウスに、クローン５形質導入ＣＢ ＣＤ３４＋細胞を注入した後、非Ｔｇ対照またはＨＬＡ－Ａ２／ＤＱ８－Ｔｇブタ胎仔胸腺を移植する（表１３）。

移植後１４～１６週に、ＨＩＳマウスにおいてヒト細胞再構成が完了してから分析のためにＨＩＳマウスを安楽死させる。二重陰性（ＣＤｌａ＋）（ＣＤ７＋早期胸腺細胞を含む）、ＣＤ６９＋およびＣＤ６９－の二重陽性、ＣＤ４単一陽性およびＣＤ８単一陽性サブセット中のクローン５＋胸腺細胞の割合（％）および絶対数をネガティブ選択マーカー（ＰＤ１、ＣＣＲ７）で調べる。ＨＬＡ－ＤＱ８＋胸腺において、このＴＣＲを伴う胸腺細胞のＴｒｅｇ系譜分化を検出するために、Ｔｒｅｇマーカー（ＣＤ２５およびＣＤ１２７）も評価する。その詳細なパネルを下の表５に示す。分析はＡｕｒｏｒａスペクトルフローサイトメトリーによって実施する。このＴＣＲが認識するインスリンペプチドは、髄質ＴＥＣ（ｍＴＥＣ）によって産生されると予想されるので、このＴＣＲのネガティブ選択は胸腺上皮によるＨＬＡ－ＤＱ８発現に依存すると予想される。非Ｔｇブタ胸腺と比較して、ＨＬＡ－Ａ２／ＤＱ８－Ｔｇブタ胎仔胸腺においてＨＬＡクラスＩｌ拘束性ＴＣＲクローン５のポジティブ選択亢進が見られることが予想される。ＨＬＡ－ＤＱ８＋ヒト胸腺における予備的データは、このＴＣＲのネガティブ選択には、ＴＥＣ上での発現に加えて、ＣＤ３４細胞由来ＡＰＣ上にもＨＬＡ－ＤＱ８が必要であることを示唆する（図９を参照のこと）。したがって、ＨＩＳマウスの作成にＨＬＡ－ＤＱ８＋ＣＢ ＣＤ３４＋細胞を利用することによって、クローン５＋Ｔ細胞のネガティブ選択を試験することも可能となるであろう。トランスジェニックＴ細胞を同定するために、蛍光色素標識クローン５Ｖβ特異的ｍＡｈ（Ｖβ２１．３）を用いるが、ＧＦＰは遺伝子導入ＨＳＰＣの起源を表すマーカーとして利用する。胸腺発生の各段階のＧＦＰ＋およびＧＦＰ－胸腺細胞によって、各マウス個体におけるＴｇおよび非Ｔｇ Ｔ細胞の選択レベルに関して内部的に整合性のある比較が得られる。

実施例１９：ＨＬＡ－Ａ２／ＤＱ８ Ｔｇブタ胎仔胸腺で製したＨＩＳマウスによる同種異系皮膚移植片拒絶反応を比較する
ＨＬＡ－Ａ２／ＤＱ８－Ｔｇ胸腺およびＣＤ３４＋細胞で作製したＨＩＳマウスにおける免疫系機能を調べるために、ＨＩＳマウスの同種異系皮膚移植片拒絶能を比較する。この目的において、ＨＬＡ－Ａ２／ＤＱ８－Ｔｇまたは非Ｔｇ対照ブタ胎仔胸腺およびＣＢ ＣＤ３４＋細胞を移植することにより、ＨＩＳマウスを作成した（表１０）。移植後１４～１６週に、同種異系ヒトドナーの分層（２．３ｍｍ）皮膚試料を外側胸壁に移植した。皮膚移植片は、７日目から４週間、毎日評価した後、少なくとも３日に１回検査する。移植片の生存状態が１０％未満である場合に、その移植片は拒絶されたと定義する。

参考文献
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Ｐａｓｃｏｌｏ， ｅｔ ａｌ． ＨＬＡ－Ａ２．１－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＤ８（＋） Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｂｅｔａ２ ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ （ｂｅｔａ２ｍ） ＨＬＡＡ２．１ ｍｏｎｏｃｈａｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｈ－２Ｄｂ ｂｅｔａ２ｍ ｄｏｕｂｌｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １９９７；１８５（１２）：２０４３－２０５１．

Ｓｈｉｍｉｚｕ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｉｎ ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｐｏｒｃｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｔｈｙｍｕｓ ｇｒａｆｔｓ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． ２００８；８６（４）：６０１－６１０．

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Ｚｈａｏ， ｅｔ ａｌ． Ｐｉｇ ＭＨＣ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｕｓｅ ＭＨＣ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＴＣＲ ｉｎ ｐｉｇ ｔｈｙｍｕｓ ｇｒａｆｔｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８；１６１：１３２０－１３２６．

Claims (25)

1. ブタゲノムの１か所以上の天然のＳＬＡ遺伝子座に挿入した、１種類以上のＨＬＡ Ｉポリペプチドおよび／または１種類以上のＨＬＡ ＩＩポリペプチドをコードする１種類以上のヌクレオチド配列を含むトランスジェニックブタ。
2. 請求項１のトランスジェニックブタであって、ここで該１種類以上のヌクレオチド配列がＨＬＡ Ｉポリペプチドをコードし、天然のＳＬＡ Ｉ遺伝子座に挿入されたものである、トランスジェニックブタ。
3. 請求項２のトランスジェニックブタであって、ここで該ＳＬＡ Ｉ遺伝子座がＳＬＡ－１およびＳＬＡ－２から成る群から選択される、トランスジェニックブタ。
4. 請求項２のトランスジェニックブタであって、ここで該ＨＬＡ Ｉポリペプチドが、ヒトベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）に融合したＨＬＡ－Ａ２を含む、トランスジェニックブタ。
5. 請求項２～４のトランスジェニックブタであって、ここで該１種類以上のヌクレオチド配列が天然のＳＬＡ Ｉプロモーターの後ろに挿入されている、トランスジェニックブタ。
6. 請求項２～４のトランスジェニックブタであって、ここで該１種類以上のヌクレオチド配列が、ＳＬＡ Ｉ遺伝子座のイントロン１／エクソン２接合部に挿入されている、トランスジェニックブタ。
7. 請求項２～６のトランスジェニックブタであって、ここで該１種類以上のヌクレオチド配列がＨＬＡ ＩＩポリペプチドをさらにコードし、天然のＳＬＡ－ＤＱα遺伝子座に挿入されているものである、トランスジェニックブタ。
8. 請求項１のトランスジェニックブタであって、ここで該１種類以上のヌクレオチド配列がＨＬＡ ＩＩポリペプチドをコードし、天然のＳＬＡ－ＤＱα遺伝子座に挿入されているものである、トランスジェニックブタ。
9. 請求項７～８のトランスジェニックブタであって、ここで該ＨＬＡ ＩＩポリペプチドがＨＬＡ－ＤＱ８ポリペプチドを含む、トランスジェニックブタ。
10. 請求項１０のトランスジェニックブタであって、ここで該ＨＬＡ－ＤＱ８ポリペプチドが、ＨＬＡ－ＤＱ８（ＨＬＡ－ＤＱＡ１：０３：０１：０１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１：０３：０２：０１）をコードする２シストロン性ベクターによって、天然のＳＬＡ－ＤＱα遺伝子座に標的化されている、トランスジェニックブタ。
11. 請求項１０のトランスジェニックブタであって、ここで該２シストロン性ベクターが高効率ＩＲＥＳ要素をさらに含む、トランスジェニックブタ。
12. 請求項７～１１のトランスジェニックブタであって、ここでＨＬＡ ＩＩポリペプチドをコードする該１種類以上のヌクレオチド配列が天然のＳＬＡ ＤＱαプロモーターの後ろに挿入されている、トランスジェニックブタ。
13. 請求項７～１１のトランスジェニックブタであって、ここでＨＬＡ ＩＩポリペプチドをコードする該１種類以上のヌクレオチド配列が、ＳＬＡ ＤＱα遺伝子座のイントロン１／エクソン２接合部に挿入されている、トランスジェニックブタ。
14. 請求項１のトランスジェニックブタであって、ここで該ＨＬＡ ＩポリペプチドがＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦおよびＨＬＡ－Ｇから成る群から選択され、ここで該ＨＬＡ ＩＩポリペプチドがＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲから成る群から選択される、トランスジェニックブタ。
15. 胸腺組織を、それを必要とする対象に異種移植する方法であって、請求項１～１４のいずれかに記載されるトランスジェニックブタに由来する胸腺組織を該対象に導入することを含む、方法。
16. それを必要とする対象において、胸腺機能を不全から正常にもどす、あるいは回復させる方法であって、請求項１～１４のいずれかに記載されるトランスジェニックブタに由来する胸腺組織を該対象に導入することを含む、方法。
17. それを必要とする対象において、Ｔ細胞を再構成させる方法であって、請求項１～１３のいずれかに記載されるトランスジェニックブタに由来する胸腺組織を該対象に導入することを含む、方法。
18. 請求項１５～１７の方法であって、ここで該対象がヒトである、方法。
19. 請求項１５～１８の方法であって、ここで該トランスジェニックブタが対象に由来するＨＬＡポリペプチドを含む、方法。
20. 請求項１～１４のいずれかのトランスジェニックブタを作製する方法であって、ここで該方法が少なくとも１種類の標的ベクターおよび少なくとも１種類のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９プラスミドをブタ細胞に導入することを含み、ここで該標的ベクターが、１種類以上のＨＬＡ Ｉポリペプチドおよび／または１種類以上のＨＬＡ ＩＩポリペプチドをコードする１種類以上のヌクレオチド配列を含む、方法。
21. 請求項２０の方法であって、ここで１種類以上のＨＬＡ Ｉポリペプチドおよび／または１種類以上のＨＬＡ ＩＩポリペプチドをコードする該１種類以上のヌクレオチド配列が特定の対象個体に由来する、方法。
22. ヒト免疫系（ＨＩＳ）マウスを作製する方法であって、ここで該方法が、マウスの胸腺摘出を行うこと、およびブタ胎仔胸腺組織およびヒトＣＤ３４＋細胞を該マウスに導入することを含む、方法。
23. 請求項２２の方法であって、ここで該ヒトＣＤ３４＋細胞が胎児または成人の細胞である、方法。
24. 請求項２２の方法であって、ここで該ヒトＣＤ３４＋細胞が臍帯血に由来する、方法。
25. ヒト免疫系（ＨＩＳ）マウスを作製する方法であって、ここで該方法が、マウスの胸腺摘出を行うこと、およびブタ胎仔胸腺組織を導入することを含み、ここで該胎仔胸腺組織が請求項１～１４のトランスジェニックブタに由来する、方法。