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JP2025028860A - クリグラー－ナジャー症候群の治療のためのウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドａ１をコードするポリヌクレオチド - Google Patents

クリグラー－ナジャー症候群の治療のためのウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドａ１をコードするポリヌクレオチド Download PDF

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Abstract

【課題】１型クリグラー－ナジャール症候群（ＣＮ－１）の治療のためのｍＲＮＡを含む医薬組成物、およびｍＲＮＡ治療法を提供する。
【解決手段】特定の配列を有するｍＲＮＡを含む医薬組成物であって、前記ｍＲＮＡは、ヒトウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、組成物である。
【選択図】図１

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年９月１４日に出願した、米国仮出願第６２／７３１，４６７号の優先権利益を主張するものであって、本明細書の一部を構成するものとして、同出願の全内容を援用する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した、参照により、その全内容を本明細書で援用する配列表を含む。２０１９年９月１１日に作成した当該ＡＳＣＩＩコピーは、名称が４５８ｌ７－００５０ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが１１６，２０５バイトである。
１型クリグラー－ナジャー症候群（ＣＮ－１）とは、ビリルビンを、グルクロン酸にコンジュケートさせて、体外への排出が可能な水溶性複合体を生産すること（グルクロン酸化と称するプロセス）ができない、ことに起因する血中ビリルビンの異常な蓄積を特徴とする常染色体劣性代謝障害である。ＣＮ－１患者の総血清ビリルビンレベルは、一般的には、２０～４５ｍｇ／ｄＬの範囲である。乳児では、生後数日で強度黄疸が発生し、そして、その後も持続する。罹患した一部の乳児が、生後数週間または数ヶ月で核黄疸を起こして死亡する一方で、神経学的影響が軽微または皆無で、生存している者もいる。
ＣＮ－１の推定発生率は、１，０００，０００名に１名であり、男性と女性が等しく影響を受けている。現在のＣＮ－１の治療は、毎日実施する光線療法（例えば、１０時間／日）である。毎日実施する光線療法は、生後の最初の数年間は、高ビリルビン血症を効果的に抑制するが、人生の後半になると、その効果は低下してしまい、そして、肝移植が、完全に効果的な唯一の治療法となる。したがって、ＣＮ－１を治療するための改善した治療法が必要である。
ＣＮ－１に関連する主要な遺伝子は、ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ｕｇｔ１Ａ１）遺伝子（ＮＭ＿０００４６３．２；ＮＰ＿０００４５４．１）である。ｕｇｔ１ａ１遺伝子は、ビリルビンのグルクロン酸化に重要な役割を果たすＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド（別名、ビリルビンウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ）をコードする。ＵＧＴ１Ａ１の生物学的機能は、ビリルビンを、グルクロン酸にコンジュケートさせ、それにより、コンジュゲートしたビリルビンの体外への排出を可能ならしめる水溶性複合体を生産することである。ＵＧＴ１Ａ１は、小胞体に局在しており、主に、肝細胞に存在している。ヒトＵＧＴ１Ａ１の前駆体型は、長さが、５３３個のアミノ酸であり、成熟型は、長さが、５０８個のアミノ酸であるので、２５個のアミノ酸のシグナル配列を切断している。
ｕｇｔ１ａ１遺伝子内の変異は、ＵＧＴ１Ａ１機能の全部または一部の喪失を招いて、ビリルビンの異常蓄積と、それに伴う上記した兆候及び症状をもたらす。例えば、ＣＮ－１患者のｕｇｔｌａ遺伝子のバリアントは、ＵＧＴ１Ａ１活性の完全な喪失を招く。ＣＮ－１の既存の治療が抱えている問題点を考慮すると、ＵＧＴ１Ａ１関連障害の改善した治療に対して求められている要求に対処する必要がある。
本開示は、１型クリグラー－ナジャー症候群（ＣＮ－１）の治療のためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療法を提供する。この技術が、ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの細胞内送達と、それに続く、標的細胞内での機能的ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドのデノボ合成を提供するので、本発明のｍＲＮＡ治療法は、特に、ＣＮ－１の治療に好適である。本発明は、治療用ｍＲＮＡに修飾ヌクレオチドを組み込んで、（１）望ましくない免疫活性化（例えば、外来核酸のインビボ導入に関連する自然免疫応答）を最小化し、及び（２）ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳効率を最適化することを特徴とする。本開示の例示的な態様は、特に、タンパク質発現を強めるＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする治療用ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内で、自然免疫応答と、配列最適化とを抑制するヌクレオチド修飾の組合せを特徴とする。
さらなる実施形態では、本開示のｍＲＮＡ治療技術は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達システムを介して、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの送達も特徴とする。本開示は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡと組み合わせ、そして、インビボで投与した場合に改善した特性、例えば、細胞取り込み、細胞内輸送、及び／またはエンドソーム放出、またはエンドソームエスケープを有するイオン化可能な脂質をベースとしたＬＮＰを特徴とする。本開示のＬＮＰ製剤は、ＬＮＰのインビボ投与に関連する免疫原性の抑制も実証している。
特定の態様では、本開示は、ポリヌクレオチド、例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするリボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、ｍＲＮＡを含む組成物及び送達製剤、及びそれを投与することで、ＣＮ－１の治療を必要とするヒト対象でのＣＮ－１を治療する方法に関する。
本開示は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む脂質ナノ粒子カプセル化ｍＲＮＡを含む医薬組成物を提供しており、この組成物は、ＣＮ－１の治療を必要とするヒト対象への投与に好適である。
本開示は：（ａ）（ｉ）ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、ＯＲＦは、少なくとも１つの化学的に修飾した核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらのいずれかの組合せを含む、及び（ｉｉ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を含む非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡ；及び（ｂ）送達剤を含む医薬組成物をさらに提供しており、医薬組成物は、ＣＮ－１の治療を必要とするヒト対象への投与に好適である。
ある特定の実施形態では、医薬組成物、またはポリヌクレオチドを、静脈内に投与する。一部の事例では、医薬組成物、またはポリヌクレオチドを、０．１ｍｇ／ｋｇ～２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。一部の事例では、医薬組成物、またはポリヌクレオチドを、０．１ｍｇ／ｋｇ～１．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。一部の事例では、医薬組成物、またはポリヌクレオチドを、０．１ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。一部の事例では、医薬組成物、またはポリヌクレオチドを、０．１ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。
一態様では、本開示は、ｍＲＮＡを含む医薬組成物を特徴としており、ｍＲＮＡは、ヒトウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、組成物を、それを必要とするヒト対象に対する、単回静脈内投与での投与が：（ｉ）肝臓組織でのＵＧＴ１Ａ１活性のレベルを、投与した後の少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、正常なＵＧＴ１Ａ１活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％以内で引き上げる；（ｉｉ）肝臓組織でのＵＧＴ１Ａ１活性のレベルを、投与した後の少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、１型クリグラー－ナジャー症候群（ＣＮ－１）を有するヒト対象でのヒト対象のベースラインＵＧＴ１Ａ１活性レベル、または参照ＵＧＴ１Ａ１活性レベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍に引き上げる：（ｉｉｉ）ビリルビンの血中、血漿、及び／または血清レベルを、投与した後の少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、ＣＮ－１を有するヒト対象でのヒト対象のビリルビンのベースライン血中、血漿、及び／または血清レベル、または参照血中、血漿、及び／または血清ビリルビンレベルと比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％下げる；（ｉｖ）ビリルビンの血中、血漿、及び／または血清レベルを、投与した後の少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、ＣＮ－１を有する患者でのヒト対象のビリルビンのベースライン血中、血漿、及び／または血清レベル、または参照血中、血漿、及び／または血清ビリルビンレベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍下げる；及び／または（ｖ）ビリルビンの血中、血漿、及び／または血清レベルを、投与した後の少なくとも６時間、１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、ＣＮ－１を有するヒト患者において、０．１ｍｇ／ｄＬ、０．２ｍｇ／ｄＬ、０．３ｍｇ／ｄＬ、０．４ｍｇ／ｄＬ、０．５ｍｇ／ｄＬ、０．６ｍｇ／ｄＬ、０．７ｍｇ／ｄＬ、０．８ｍｇ／ｄＬ、０．９ｍｇ／ｄＬ、１．０ｍｇ／ｄＬ、１．５ｍｇ／ｄＬ、２．０ｍｇ／ｄＬ、２．５ｍｇ／ｄＬ、３．０ｍｇ／ｄＬ、４．０ｍｇ／ｄＬ、５．０ｍｇ／ｄＬ、７．５ｍｇ／ｄＬ、または１０．０ｍｇ／ｄＬ未満にまで下げる、には十分である。
一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の事例では、ＯＲＦは、配列番号２及び５～１２からなる群から選択する核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む。一部の事例では、マイクロＲＮＡは、造血系の免疫細胞、またはＴＬＲ７、及び／またはＴＬＲ８を発現し、かつ、炎症誘発性サイトカイン、及び／またはケモカインを分泌する細胞で発現する。一部の事例では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、ｍｉＲ－２６ａ、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロＲＮＡのためのものである。一部の事例では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロＲＮＡのためのものである。一部の事例では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位である。一部の事例では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにある。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲを含み、当該３’ＵＴＲは、配列番号１５０、１５１、または１７８の３’ＵＴＲ配列に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１９５、または配列番号１９６の３’ＵＴＲに対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲを含み、当該５’ＵＴＲは、配列番号３の５’ＵＴＲ配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲを含み、当該５’ＵＴＲは、配列番号３、配列番号３９、配列番号１９３、または配列番号１９４の５’ＵＴＲ配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’末端キャップを含む。一部の事例では、５’末端キャップは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む。一部の事例では、ｍＲＮＡは、ポリＡ領域を含む。一部の事例では、ポリＡ領域は、長さが、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０個のヌクレオチド、または長さが、少なくとも約１００個のヌクレオチドである。一部の事例では、ポリＡ領域は、長さが、約１０～約２００、約２０～約１８０、約５０～約１６０、約７０～約１４０、または約８０～約１２０個のヌクレオチドを有する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学的に修飾した核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらのいずれかの組合せを含む。一部の事例では、少なくとも１つの化学的に修飾した核酸塩基を、シュードウラシル（Ψ）、Ｎ１メチルシュードウラシル（ｍ１Ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する。一部の事例では、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のウラシルが、Ｎ１－メチルシュードウラシルに対して化学的に修飾している。
一部の実施形態では、請求項１～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物は、送達剤をさらに含む。一部の事例では、送達剤は：（ａ）（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；（ｂ）（ｉ）化合物ＶＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；（ｃ）（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；（ｄ）（ｉ）化合物ＶＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；（ｅ）（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）化合物Ｉ；または（ｆ）（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）化合物Ｉ、を含む脂質ナノ粒子を含む。
一部の実施形態では、ヒト対象は、１型クリグラー－ナジャー症候群（ＣＮ－１）を有する。
別の態様では、本開示は：（ｉ）５’ＵＴＲ；（ｉｉ）ヒトウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、当該ＯＲＦは、配列番号２及び５～１２からなる群から選択する核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、当該ＯＲＦ；（ｉｉｉ）終止コドン；及び（ｉｖ）３’ＵＴＲを含む、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むポリヌクレオチドを特徴とする。
一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む。一部の事例では、マイクロＲＮＡは、造血系の免疫細胞、またはＴＬＲ７、及び／またはＴＬＲ８を発現し、かつ、炎症誘発性サイトカイン、及び／またはケモカインを分泌する細胞で発現する。一部の事例では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、ｍｉＲ－２６ａ、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロＲＮＡのためのものである。一部の事例では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロＲＮＡのためのものである。一部の事例では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位である。一部の事例では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにある。
一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１５０、１５１、または１７８の３’ＵＴＲに対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１９５、または配列番号１９６の３’ＵＴＲに対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号３の５’ＵＴＲ配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号３、配列番号３９、配列番号１９３、または配列番号１９４の５’ＵＴＲ配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’末端キャップを含む。一部の事例では、５’末端キャップは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む。一部の事例では、ｍＲＮＡは、ポリＡ領域を含む。一部の事例では、ポリＡ領域は、長さが、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０個のヌクレオチド、または長さが、少なくとも約１００個のヌクレオチドである。一部の事例では、ポリＡ領域は、長さが、約１０～約２００、約２０～約１８０、約５０～約１６０、約７０～約１４０、または約８０～約１２０個のヌクレオチドを有する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学的に修飾した核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらのいずれかの組合せを含む。一部の事例では、少なくとも１つの化学的に修飾した核酸塩基を、シュードウラシル（Ψ）、Ｎ１メチルシュードウラシル（ｍ１Ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する。一部の事例では、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のウラシルが、Ｎ１－メチルシュードウラシルに対して化学的に修飾している。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４～２７からなる群から選択する核酸配列を含む。
別の態様では、本開示は：（ｉ）５’末端キャップ；（ｉｉ）配列番号３の核酸配列を含む５’ＵＴＲ；（ｉｉｉ）配列番号１のウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、当該ＯＲＦは、配列番号２及び５～１２からなる群から選択する配列を含む、当該ＯＲＦ；（ｉｖ）配列番号１１１、１５０、１５１、１７５、または１７８の核酸配列を含む３’ＵＴＲ；及び（ｖｉ）ポリＡ領域、を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むポリヌクレオチドを特徴とする。
別の態様では、本開示は：（ｉ）５’末端キャップ；（ｉｉ）配列番号３、３９、１９３、または１９４の核酸配列を含む５’ＵＴＲ；（ｉｉｉ）配列番号１のＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするＯＲＦであって、当該ＯＲＦは、配列番号２及び５～１２からなる群から選択する配列を含む、当該ＯＲＦ；（ｉｖ）配列番号４、１１１、１５０、１７５、１７７、１７８、１９５、または１９６の核酸配列を含む３’ＵＴＲ；及び（ｖｉ）ポリＡ領域、を含むｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを特徴とする。
一部の事例では、５’末端キャップは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む。
一部の事例では、ポリＡ領域は、長さが、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０個のヌクレオチド、または長さが、少なくとも約１００個のヌクレオチドである。一部の事例では、ポリＡ領域は、長さが、約１０～約２００、約２０～約１８０、約５０～約１６０、約７０～約１４０、または約８０～約１２０個のヌクレオチドを有する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学的に修飾した核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらのいずれかの組合せを含む。一部の事例では、少なくとも１つの化学的に修飾した核酸塩基を、シュードウラシル（Ψ）、Ｎ１メチルシュードウラシル（ｍ１Ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４～２７からなる群から選択する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、５’末端キャップは、Ｃａｐ１を含み、かつ、ポリヌクレオチドのすべてのウラシルは、Ｎ１－メチルシュードウラシルである。
一部の実施形態では、ポリＡ領域は、長さが、１００個のヌクレオチドである。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示したポリヌクレオチドと、送達剤を含む医薬組成物を特徴とする。一部の事例では、送達剤は：（ａ）（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；（ｂ）（ｉ）化合物ＶＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；（ｃ）（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；（ｄ）（ｉ）化合物ＶＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；（ｅ）（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）化合物Ｉ；または（ｆ）（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）化合物Ｉ、を含む脂質ナノ粒子を含む。
別の態様では、本開示は、ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドの発現を、それを必要とするヒト対象において行う方法を特徴としており、対象に対して、有効量の本明細書に記載した医薬組成物またはポリヌクレオチドを投与することを含む。
別の態様では、本開示は、１型クリグラー－ナジャー症候群（ＣＮ－１）の治療、予防、またはその発症、及び／または進行の遅延を必要とするヒト対象において、それを行う方法を特徴としており、対象に対して、有効量の本明細書に記載した医薬組成物またはポリヌクレオチドを投与することを含む。
別の態様では、本開示は、ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）活性を引き上げることを必要とするヒト対象において、それを行う方法を特徴としており、対象に対して、有効量の本明細書に記載した医薬組成物またはポリヌクレオチドを投与することを含む。
別の態様では、本開示は、ビリルビンレベルを下げることを必要とするヒト対象において、それを行う方法を特徴としており、対象に対して、有効量の本明細書に記載した医薬組成物またはポリヌクレオチドを投与することを含む。
上記方法のある特定の実施形態では、医薬組成物、またはポリヌクレオチドを対象に対して投与して２４時間後に、対象のビリルビンのレベルを、対象でのベースラインビリルビンと比較して、少なくとも約１００％、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約１０％下げる。
上記方法のある特定の実施形態では、医薬組成物、またはポリヌクレオチドを対象に対して投与して２４時間後に、対象のビリルビンのレベルが、０．１ｍｇ／ｄＬ未満、０．２ｍｇ／ｄＬ未満、０．３ｍｇ／ｄＬ未満、０．４ｍｇ／ｄＬ未満、０．５ｍｇ／ｄＬ未満、０．６ｍｇ／ｄＬ未満、０．７ｍｇ／ｄＬ未満、０．８ｍｇ／ｄＬ未満、０．９ｍｇ／ｄＬ未満、１．０ｍｇ／ｄＬ未満、１．５ｍｇ／ｄＬ未満、２．０ｍｇ／ｄＬ未満、２．５ｍｇ／ｄＬ未満、３．０ｍｇ／ｄＬ未満、４．０ｍｇ／ｄＬ未満、５．０ｍｇ／ｄＬ未満、７．５ｍｇ／ｄＬ未満、または１０．０ｍｇ／ｄＬ未満である。
上記方法のある特定の実施形態では、ビリルビンのレベルは、対象の血中で低下する。
上記方法のある特定の実施形態では、ビリルビンは、総ビリルビンである
上記方法のある特定の実施形態では、ビリルビンのレベルの低下が、医薬組成物、またはポリヌクレオチドを投与してから少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、９６時間、１２０時間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、または２１日間持続する。
上記方法のある特定の実施形態では、医薬組成物、またはポリヌクレオチドを対象に対して投与して２４時間後に、対象のＵＧＴ１Ａ１活性が、正常な個人のＵＧＴ１Ａ１活性の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％に増加する。ある特定の事例では、ＵＧＴ１Ａ１活性が、対象の心臓、肝臓、脳、または骨格筋で高まる。ある特定の事例では、高まったＵＧＴ１Ａ１活性が、医薬組成物、またはポリヌクレオチドを投与してから少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、９６時間、１２０時間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、または２１日間持続する。
上記方法のある特定の実施形態では、対象に対する投与が、週に約１回、２週間に約１回、または月に約１回である。
上記方法のある特定の実施形態では、医薬組成物、またはポリヌクレオチドを、静脈内投与する。
３’ＵＴＲ中のｍｉＲＮＡ－１４２標的部位を有する（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００３、配列番号２８（Ｇ５化学構造））、またはそれを有さない（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２、配列番号１８（Ｇ５化学構造））ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードする修飾したコドン最適化ｍＲＮＡ、またはヒトＵＧＴ１Ａ１をコードする修飾した非コドン最適化ｍＲＮＡ、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１、配列番号２９（Ｇ５化学構造））、またはコントロールとしてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した個々のラットの脾臓におけるヒトＵＧＴ１Ａ１のレベルを示すグラフである。 本明細書で示したコンストラクトを投与したガンラットから、本明細書で示した時点で採取した血漿に含まれる総ビリルビンのレベル（ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００３、及びｒＵＧＴ１Ａ１の説明については、後出の実施例１６を参照されたい。 本明細書で示したコンストラクトを投与したガンラットから、本明細書で示した時点で採取した血漿に含まれる総ビリルビンのレベル（ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００３、及びｒＵＧＴ１Ａ１の説明については、後出の実施例１６を参照されたい。 本明細書で示したコンストラクトを投与したガンラットから、本明細書で示した時点で採取した血漿に含まれる総ビリルビン（ｍｇ／ｄＬ）のレベルを示すグラフである。ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００４、及びｈＵＧＴ１Ａ１＿００７の説明については、後出の実施例１８を参照されたい。 本明細書で示したコンストラクトを投与したガンラットから、本明細書で示した時点で採取した血漿に含まれる総ビリルビンのレベル（ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００７、及びｈＵＧＴ１Ａ１＿００９の説明については、後出の実施例１８を参照されたい。 光線療法（１０時間／日）、または０．２ｍｇ／ｋｇのｈＵＧＴ１Ａ１＿００２（配列番号１８（Ｇ５化学構造））で治療したガンラットから、本明細書で示した時点で採取した血清に含まれる総ビリルビン（ｍｇ／ｄＬ）のレベルを示すグラフである；ＰＢＳ、及び治療をしていないラットを、コントロールとして使用した。治療をしていないラット、及び光線療法を行ったラットのデータは、ＰＢＳ、及びｈＵＧＴ１Ａ１＿００２で治療したラットのデータとは異なる実験から得た。
本開示は、１型クリグラー－ナジャー症候群（ＣＮ－１）の治療のためのｍＲＮＡ治療法を提供する。ＣＮ－１とは、ビリルビンを、グルクロン酸にコンジュケートさせて、体外への排出が可能な水溶性複合体を生産すること（グルクロン酸化と称するプロセス）ができない、ことに起因する血中ビリルビンの異常な蓄積を特徴とする常染色体劣性代謝障害である。このようなビリルビンの蓄積（一般的には、血清での２０～４５ｍｇ／ｄＬの範囲）は、様々な症状の間で神経学的損傷を招く。ＣＮ－１に関連する主要な遺伝子は、ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ｕｇｔ１Ａ１）であり、このものは、酵素ＵＧＴ１Ａ１をコードする。ＣＮ－１は、ｕｇｔ１Ａ１遺伝子の変異が引き起こす。この技術が、ＵＧＴ１Ａ１をコードするｍＲＮＡの細胞内送達と、それに続く、標的細胞内での機能的ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドのデノボ合成を提供するので、ｍＲＮＡ治療法は、特に、ＣＮ－１の治療に好適である。ｍＲＮＡが標的細胞に送達した後に、所望のＵＧＴ１Ａ１タンパク質は、細胞独自の翻訳機構によって発現するので、完全に機能するＵＧＴ１Ａ１タンパク質が、欠陥または欠損したタンパク質に取って代わる。
インビボで核酸ベースの治療薬（例えば、ｍＲＮＡ治療薬）を送達することに関連する困難の１つは、身体の免疫系が外来核酸に遭遇した場合に生じ得る先天免疫応答に由来する。外来ｍＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）により活性化されるｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、特に、ＴＬＲ７／８を介しての認識により免疫系を活性化することができる。非免疫細胞では、外来ｍＲＮＡの認識は、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）を介して起こり得る。外来ｍＲＮＡの免疫認識は、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）産生、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）分布、及び強力なＩ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）応答など、望ましくないサイトカイン作用をもたらす。本開示は、治療用ｍＲＮＡ内に種々の修飾ヌクレオチドを組み込むことで、免疫活性化を最小化し、かつ、タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳効率を最適化することを特徴とする。特定の態様は、先天免疫応答を減少させるためのヌクレオチド修飾と、タンパク質発現を増強するための、特に、ＵＧＴ１Ａ１をコードする治療用ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内での配列最適化との組合せを特徴とする。
また、本開示のｍＲＮＡ治療技術のある特定の実施形態は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達システムを介した、ＵＧＴ１Ａ１をコードするｍＲＮＡの送達を特徴とする。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ｍＲＮＡを標的細胞に安全かつ有効に送達するための理想的なプラットフォームである。ＬＮＰは、細胞取り込み、細胞内輸送、及びエンドソーム放出、またはエンドソームエスケープを伴う機構により核酸を送達する独自の能力を有する。本発明は、インビボで投与された場合に改善された特性を有するＵＧＴ１Ａ１をコードするｍＲＮＡと組み合わせたイオン性脂質ベースのＬＮＰを特徴とする。理論に束縛されることなく、本発明のイオン性脂質ベースのＬＮＰ製剤は、改善された特性、例えば、細胞取り込み、細胞内輸送、及び／またはエンドソーム放出またはエンドソームエスケープを有すると考えられる。例えば、第１の投与で全身経路（例えば、静脈内（ＩＶ）投与）により投与されたＬＮＰは、後で、例えば、さらなる投与において注射されたＬＮＰのクリアランスを加速し得る。この現象は、加速血液クリアランス（ＡＢＣ）として公知であり、特に、治療状況において、欠損酵素（例えば、ＵＧＴ１Ａ１）を置き換える場合に、重要な問題である。このことが、対象（例えば、ＣＮ－１に罹患している対象）において標的組織で必要なレベルの酵素を維持するためには、ｍＲＮＡ治療薬の反復投与が多くの場合に必須であることの理由である。反復投与の問題は、いくつかのレベルで対処することができる。ｍＲＮＡ操作、及び／またはＬＮＰによる効率的な送達が、第１の用量の投与後に発現されるタンパク質（例えば、ＵＧＴ１Ａ１）のレベルの上昇、及び／または持続期間の増強をもたらすことができ、次いで、このことが、第１の投与と、その後の投与との間の時間を延長することを可能にする。ＡＢＣ現象は、少なくとも一部では本質的に一過性であり、全身投与されてから十分な時間が経過した後に、ＡＢＣの根底にある免疫応答が解消することが公知である。したがって、一態様では、本開示のｍＲＮＡ治療薬が全身に送達された後のタンパク質発現、及び／または活性の持続時間を延長することで、ＡＢＣ現象に対抗する。さらに、ＬＮＰを、免疫感知、及び／または認識を回避するために操作することができ、したがって、その後の投与、または反復投与でのＡＢＣをさらに回避することができる。本開示の例示的な態様は、ＡＢＣが低下するように操作されているＬＮＰを特徴とする。
１．ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）
ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）は、ビリルビンのグルクロン酸化に重要な役割を果たす代謝酵素である。ＵＧＴ１Ａ１の生物学的機能は、ビリルビンをグルクロン酸にコンジュケートさせ、それにより、体外への排出を可能ならしめる水溶性複合体を生産すること（グルクロン酸化と称するプロセス）である。ＵＧＴ１Ａ１は、主に、肝細胞の小胞体に認められる。
ＵＧＴ１Ａ１が関係する最も深刻な健康問題は、１型クリグラー－ナジャー症候群（ＣＮ－１）であり、これは、患者の血中でのビリルビンの異常な蓄積を特徴とする常染色体劣性代謝障害である。ｕｇｔ１ａ１遺伝子内での変異は、ＵＧＴ１Ａ１機能の全部または一部の喪失を招き、それを放置すると、例えば、神経学的欠陥を含む取り返しのつかない結果を招きかねない。
野生型ｕｇｔ１ａ１標準ｍＲＮＡ配列でのコード配列（ＣＤＳ）は、ＮＣＢＩ参照配列データベース（ＲｅｆＳｅｑ）に、受託番号ＮＭ＿０００４６３．２（「ホモサピエンスＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼファミリー１メンバーＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）、ｍＲＮＡ」）で記載されている。野生型ＵＧＴ１Ａ１標準タンパク質配列は、ＲｅｆＳｅｑデータベースに、受託番号ＮＰ＿０００４５４．１（「ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ１－１前駆体［ホモサピエンス］」）で記載されている。ＵＧＴ１Ａ１タンパク質は、５３３アミノ酸長である。ＲｅｆＳｅｑ配列において参照タンパク質配列をコードする特異的核酸配列は、それぞれのＲｅｆＳｅｑデータベースエントリに示されているとおりのコード配列（ＣＤＳ）であることに注意する。
ある特定の態様では、本開示は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を提供する。一部の実施形態では、本発明のＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドは、野生型全長ヒトＵＧＴ１Ａ１タンパク質である。一部の実施形態では、本発明のＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドは、野生型ＵＧＴ１Ａ１配列に関して置換、及び挿入、及び／または付加、欠失、及び／または共有結合修飾を含むバリアント、ペプチド、またはポリペプチドである。一部の実施形態では、配列タグまたはアミノ酸を、例えば、位置限定のために、本発明のポリヌクレオチドがコードする配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）付加することができる。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドのカルボキシ、アミノ末端、または内部領域に位置するアミノ酸残基を、任意に、欠失させて、フラグメントを得ることができる。
一部の実施形態では、本発明のヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、１つ、２つ、３つ、または４つ以上の置換を含むことができる、ヒトＵＧＴ１Ａ１の置換バリアントをコードする。一部の実施形態では、置換バリアントは、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含むことができる。その他の実施形態では、バリアントは、挿入バリアントである。その他の実施形態では、バリアントは、欠失バリアントである。
ＵＧＴ１Ａ１タンパク質フラグメント、機能性タンパク質ドメイン、バリアント、及び相同タンパク質（オルソログ）も、本開示のＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドの範囲内である。本発明のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの例として、配列番号１に記載のものがあるが、これに限定されない。
２．ポリヌクレオチド、及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
本発明は、ＣＮ－１の処置または予防において使用するためのｍＲＮＡを特徴とする。本発明における使用を特徴とするｍＲＮＡを対象に投与すると、インビボでヒトＵＧＴ１Ａ１タンパク質をコードする。したがって、本発明は、ヒトＵＧＴ１Ａ１（配列番号１）、その機能性フラグメント、及びＵＧＴ１Ａ１を含む融合タンパク質をコードする連結したヌクレオシドのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡに関する。特に、本発明は、ヒトＵＧＴ１Ａ１のポリペプチド配列をコードするヌクレオチドを含む配列最適化ポリヌクレオチド、またはそれらの配列最適化ポリヌクレオチドと高い配列同一性を有する配列を提供する。
ある特定の態様では、本発明は、１つ以上のＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）を提供する。一部の実施形態では、本発明のコードされるＵＧＴ１Ａ１は：
（ｉ）完全長ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド（例えば、野生型ＵＧＴ１Ａ１と同じ、または本質的に同じ長さを有するもの；例えば、ヒトＵＧＴ１Ａ１）；
（ｉｉ）本明細書に記載したＵＧＴ１Ａ１の機能的フラグメント（例えば、ＵＧＴ１Ａ１よりも短い（例えば、カルボキシ、アミノ末端、または内部領域の欠失）配列；しかしながら、ＵＧＴ１Ａ１酵素活性をなおも保持している）；
（ｉｉｉ）そのバリアント（例えば、１つ以上のアミノ酸を置換した全長または短縮ＵＧＴ１Ａ１タンパク質、例えば、参照タンパク質に関してポリペプチドのＵＧＴ１Ａ１活性の全部または大半を保持しているバリアント（例えば、アスパラギン酸で置換した配列番号１のアミノ酸Ａｌａ４６（Ａ４６Ｄ）、グルタミン酸で置換した配列番号１のアミノ酸Ａｓｐ７０（Ｄ７０Ｅ）、グリシンで置換した配列番号１のアミノ酸Ｓｅｒ１５７（Ｓ１５７Ｇ）、及びグリシンで置換した配列番号１のアミノ酸Ｓｅｒ３８１（Ｓ３８１Ｇ）、または当該技術分野で公知のあらゆる天然または人工バリアント））；または
（ｉｖ）（ｉ）全長ＵＧＴ１Ａ１タンパク質を含む融合タンパク質（例えば、配列番号１）、またはそのバリアント、及び（ｉｉ）異種タンパク質、からなる群から選択することができる。
ある特定の実施形態では、コードしたＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドは、哺乳動物ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド、例えば、ヒトＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド、その機能性フラグメント、またはバリアントである。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、細胞に導入すると、その細胞におけるＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現レベル、及び／または検出可能なＵＧＴ１Ａ１酵素活性レベルを、本発明のポリヌクレオチの投与前の細胞におけるＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現レベル、及び／または検出可能なＵＧＴ１Ａ１酵素活性レベルと比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％上昇させる。ＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現レベル、及び／またはＵＧＴ１Ａ１酵素活性レベルは、当該技術分野で公知の方法に従って測定することができる。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドを、インビトロで細胞に導入する。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドを、インビボで細胞に導入する。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ヒトＵＧＴ１Ａ１、例えば、（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、コドン最適化核酸配列を含み、その際、コドン最適化核酸配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、野生型ＵＧＴ１Ａ１配列（例えば、野生型ヒトＵＧＴ１Ａ１）に由来する。例えば、ＵＧＴ１Ａ１をコードする配列最適化ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチドでは、対応する野生型配列は、天然ヒトＵＧＴ１Ａ１である。同様に、ヒトＵＧＴ１Ａ１の機能性フラグメントをコードする配列最適化ｍＲＮＡでは、対応する野生型配列は、ヒトＵＧＴ１Ａ１からの対応するフラグメントである。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＵＧＴ１Ａ１の全長配列を有する（すなわち、イニシエーターのメチオニン：アミノ酸１～５３３を含む）ＵＧＴ１Ａ１をコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、変異型ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＧＴ１Ａ１アミノ酸配列において少なくとも１つの点変異を含み、かつ、ＵＧＴ１Ａ１酵素活性を維持しているＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。一部の実施形態では、当該変異型ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドは、対応する野生型ＵＧＴ１Ａ１（配列番号１で示した）のＵＧＴ１Ａ１活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％のＵＧＴ１Ａ１活性を有する。一部の実施形態では、変異型ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化している。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＵＧＴ１Ａ１酵素活性を変更しない変異を含むＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。そのような変異型ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドは、機能的中立と称することができる。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、１つ以上の機能的中立の点変異を含む変異型ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
一部の実施形態では、当該変異型ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドは、対応する野生型ＵＧＴ１Ａ１よりも高いＵＧＴ１Ａ１酵素活性を有する。一部の実施形態では、当該変異型ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドは、対応する野生型ＵＧＴ１Ａ１（すなわち、変異（複数可）を伴わないことを除けば同じＵＧＴ１Ａ１タンパク質）の活性よりも、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％高いＵＧＴ１Ａ１活性をもたらす。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、機能性ＵＧＴ１Ａ１フラグメントをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、例えば、その際、１つ以上のフラグメントは、野生型ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドのポリペプチド部分配列に対応し、ＵＧＴ１Ａ１酵素活性を維持している。一部の実施形態では、当該ＵＧＴ１Ａ１フラグメントは、対応する全長ＵＧＴ１Ａ１のＵＧＴ１Ａ１酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％のＵＧＴ１Ａ１酵素活性を有する。一部の実施形態では、機能性ＵＧＴ１Ａ１フラグメントをコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化している。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、対応する全長ＵＧＴ１Ａ１よりも高いＵＧＴ１Ａ１酵素活性を有するＵＧＴ１Ａ１フラグメントをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。したがって、一部の実施形態では、当該ＵＧＴ１Ａ１フラグメントは、対応する全長ＵＧＴ１Ａ１のＵＧＴ１Ａ１活性よりも、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％高いＵＧＴ１Ａ１活性を有する。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ＵＧＴ１Ａ１よりも、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、または２５％短いＵＧＴ１Ａ１フラグメントをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド（例えば、配列番号１に示した配列、その機能的フラグメント、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、当該ヌクレオチド配列は、配列番号２または５～１２の配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一である。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性フラグメント、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、その際、当該ヌクレオチド配列は、配列番号２、及び５～１２からなる群から選択される配列と、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的フラグメント、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、当該ヌクレオチド配列は、配列番号２及び５～１２の配列からなる群から選択する配列と、７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～１００％、８５％～１００％、７０％～９５％、８０％～９５％、７０％～８５％、７５％～９０％、８０％～９５％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９５％、または９５％～１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性フラグメント、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、その際、当該ヌクレオチド配列は、配列番号２、または５～１２の配列と、７０％～９０％同一；７５％～８５％同一；７６％～８４％同一；７７％～８３％同一、７７％～８２％同一、または７８％～８１％同一である。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、約９００～約１００，０００ヌクレオチド（例えば、９００～１，０００、９００～１，１００、９００～１，２００、９００～１，３００、９００～１，４００、９００～１，５００、１，０００～１，１００、１，０００～１，１００、１，０００～１，２００、１，０００～１，３００、１，０００～１，４００、１，０００～１，５００、１，１８７～１，２００、１，１８７～１，４００、１，１８７～１，６００、１，１８７～１，８００、１，１８７～２，０００、１，１８７～３，０００、１，１８７～５，０００、１，１８７～７，０００、１，１８７～１０，０００、１，１８７～２５，０００、１，１８７～５０，０００、１，１８７～７０，０００、または１，１８７～１００，０００）を含む。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性フラグメント、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、その際、当該ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）の長さは、少なくとも５００ヌクレオチド長（例えば、少なくとも、約５００、６００、７００、８０、９００、１，０００、１，０５０、１，１００、１，１８７、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００，５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくはそれ以上、または最長で１００，０００ヌクレオチド長（及びこの値を含む））である。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的フラグメント、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、さらに、コードをしない少なくとも１つの核酸配列、例えば、マイクロＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、５’－ＵＴＲ（例えば、配列番号３、８８～１０２、及び１６５～１６７の配列から選択する、または配列番号３、配列番号３９、配列番号１９３、及び配列番号１９４の配列から選択する）、及び３’ＵＴＲ（例えば、配列番号１０４～１１２、１５０、１５１、及び１７８の配列から選択する、または配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１９５、及び配列番号１９６の配列から選択する）をさらに含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号２、及び５～１２からなる群から選択する配列を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、５’末端キャップ（例えば、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体）、及びポリＡ－尾部領域（例えば、長さが、約１００個のヌクレオチド）を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号１１１、１１２、１５０、１５１、及び１７８、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号４、１１１、１５０、１７５、１７７、１７８、１９５、及び１９６、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１１１の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１５１の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１５０の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１７５の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１７７の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１７８の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１９５の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１９６の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリＡ尾部を含む。一部の事例では、ポリＡ尾部は、長さが、５０～１５０（配列番号１９８）、７５～１５０（配列番号１９９）、８５～１５０（配列番号２００）、９０～１５０（配列番号２０１）、９０～１２０（配列番号２０２）、９０～１３０（配列番号２０３）、または９０～１５０（配列番号２０１）個のヌクレオチドである。一部の事例では、ポリＡ尾部は、長さが１００個のヌクレオチド（配列番号２０４）である。
一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、一本鎖または二本鎖である。
一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性フラグメント、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡであり、またはｍＲＮＡとして機能する。一部の実施形態では、当該ｍＲＮＡは、少なくとも１つのＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードし、かつ、インビトロ、インビボ、インサイチュ、またはエクスビボで翻訳して、コードしたＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドを産生することができるヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性フラグメント、またはバリアント、例えば、配列番号２、及び５～１２を参照されたい）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、その際、当該ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾核酸塩基、例えば、Ｎ１－メチルシュードウラシル、または５－メトキシウラシルを含む。ある特定の実施形態では、当該ポリヌクレオチドでのすべてのウラシルが、Ｎ１－メチルシュードウラシルである。その他の実施形態では、当該ポリヌクレオチドでのすべてのウラシルが、５－メトキシウラシルである。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位、及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示したポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～２３２のいずれか、例えば、化合物ＩＩ；式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは、（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３～３４２のいずれか、例えば、化合物ＶＩ；または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９～４２８のいずれか、例えば、化合物Ｉ、またはそれらのいずれかの組合せを含む送達剤と共に製剤化する。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、化合物ＩＩまたはＶＩ（または関連の適切なアミノ脂質）約３０～約６０モル％（例えば、化合物ＩＩまたはＶＩ（または関連の適切なアミノ脂質）３０～４０、４０～４５、４５～５０、５０～５５、または５５～６０モル％）、リン脂質（または関連の適切なリン脂質、または「ヘルパー脂質」）約５～約２０モル％（例えば、リン脂質（または関連の適切なリン脂質、または「ヘルパー脂質」）５～１０、１０～１５、または１５～２０モル％）、コレステロール（または関連ステロール、または「非陽イオン」脂質）約２０～約５０モル％（例えば、コレステロール（または関連ステロール、または「非陽イオン」脂質）約２０～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、または４５～５０モル％）、及びＰＥＧ脂質（またはその他の適切なＰＥＧ脂質）約０．０５～約１０モル％（例えば、ＰＥＧ脂質（またはその他の適切なＰＥＧ脂質）０．０５～１、１～２、２～３、３～４、４～５、５～７、または７～１０モル％）の範囲のモル比で含む。例示的な送達剤は、例えば、４７．５：１０．５：３９．０：３．０、または５０：１０：３８．５：１．５のモル比を含むことができる。ある特定の事例では、例示的な送達剤は、例えば、４７．５：１０．５：３９．０：３、４７．５：１０：３９．５：３、４７．５：１１：３９．５：２、４７．５：１０．５：３９．５：２．５、４７．５：１１：３９：２．５、４８．５：１０：３８．５：３、４８．５：１０．５：３９：２、４８．５：１０．５：３８．５：２．５、４８．５：１０．５：３９．５：１．５、４８．５：１０．５：３８．０：３、４７：１０．５：３９．５：３、４７：１０：４０．５：２．５、４７：１１：４０：２、４７：１０．５：３９．５：３、４８：１０．５：３８．５：３、４８：１０：３９．５：２．５、４８：１１：３９：２、または４８：１０．５：３８．５：３のモル比を含むことができる。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＩＩまたはＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０のモル比で含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＩＩまたはＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、５’末端キャップ（例えば、Ｃａｐ１）、５’ＵＴＲ（例えば、配列番号３）、配列番号２、及び５～１２からなる群から選択するＯＲＦ配列、３’ＵＴＲ（例えば、配列番号１１１、１５０、１５１、または１７８）、及びポリＡ尾部（例えば、約１００ヌクレオチド長）を含むｍＲＮＡであり、その際、当該ポリヌクレオチドでのすべてのウラシルが、Ｎ１－メチルシュードウラシルである。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＩＩまたは化合物ＶＩをイオン性脂質として、かつ、ＰＥＧ－ＤＭＧまたは化合物ＩをＰＥＧ脂質として含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、５’末端キャップ（例えば、キャップ１）、５’ＵＴＲ（例えば、配列番号３、配列番号３９、配列番号１９３、または配列番号１９４）、配列番号２、５～１１、及び２５からなる群から選択するＯＲＦ配列、３’ＵＴＲ（例えば、配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１９５、または配列番号１９６）、及びポリＡ尾部（例えば、長さが約１００個のヌクレオチドを含むｍＲＮＡであり、当該ポリヌクレオチドでのすべてのウラシルは、Ｎ１メチルシュードウラシル、または５－メトキシウラシルである。一部の実施形態では、送達剤は、イオン化可能な脂質として、化合物ＩＩまたは化合物ＶＩを、そして、ＰＥＧ脂質として、ＰＥＧ－ＤＭＧまたは化合物Ｉを含む。
３．シグナル配列
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、コードされたポリペプチドの治療的に関連する部位への輸送を促すさらなる特徴をコードするヌクレオチド配列も含むことができる。タンパク質輸送を補助するそのような特徴の１つは、シグナル配列、または標的配列である。これらのシグナル配列がコードするペプチドは、標的ペプチド、輸送ペプチド、及びシグナルペプチドなどの様々な名称で公知である。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、本明細書に記載したＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
一部の実施形態では、当該「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、任意に、それぞれコード領域またはポリペプチドの５’（またはＮ末端）で組み込まれた、それぞれ約３０～２１０、例えば、約４５～８０または１５～６０ヌクレオチド（例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、または７０アミノ酸）長であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加は、１つ以上の標的化経路を介した、コードされたポリペプチドの所望の部位、例えば、小胞体またはミトコンドリアへの輸送をもたらす。一部のシグナルペプチドは、タンパク質が所望の部位に輸送された後に、例えば、シグナルぺプチダーゼによりタンパク質から切断される。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、その際、当該ヌクレオチド配列は、異種シグナルペプチドをコードする５’核酸配列をさらに含む。
４．融合タンパク質
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、目的のポリペプチドをコードする２つ以上の核酸配列（例えば、ＯＲＦ）を含むことができる。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド、その機能性フラグメント、またはバリアントをコードする単一のＯＲＦを含む。しかしながら、一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、２つ以上のＯＲＦ、例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド（第１の目的のポリペプチド）、その機能性フラグメント、またはバリアントをコードする第１のＯＲＦと、第２の目的のポリペプチドを発現する第２のＯＲＦとを含み得る。一部の実施形態では、目的の２つ以上のポリペプチドは、遺伝子融合することができ、すなわち、２つ以上のポリペプチドは、同じＯＲＦでコードすることができる。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、２つ以上の目的のポリペプチドの間にリンカー（例えば、Ｇ４Ｓ（配列番号８６）ペプチドリンカー、または当該技術分野で公知の別のリンカー）をコードする核酸配列を含むことができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、それぞれが目的のポリペプチドを発現する２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のＯＲＦを含むことができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする第１の核酸配列（例えば、第１のＯＲＦ）と、第２の目的のポリペプチドをコードする第２の核酸配列（例えば、第２のＯＲＦ）を含むことができる。
リンカー、及び切断可能なペプチド
ある特定の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、２つ以上のＵＧＴ１Ａ１ドメイン、または異種ドメインをコードし、本明細書では多量体コンストラクトと称する。当該多量体コンストラクトのある特定の実施形態では、当該ｍＲＮＡは、それぞれのドメインの間に位置するリンカーをさらにコードする。当該リンカーを、例えば、切断可能なリンカーまたはプロテアーゼ感受性リンカーとすることができる。特定の実施形態では、当該リンカーを、Ｆ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、及びそれらの組合せからなる群から選択する。このファミリーの自己切断ペプチドリンカー、別名、２Ａペプチドは、当該技術分野で記載されている（例えば、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６：ｅ１８５５６を参照されたい）。ある特定の実施形態では、当該リンカーは、Ｆ２Ａリンカーである。ある特定の実施形態では、当該リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号１９７）リンカーである。ある特定の実施形態では、当該リンカーは（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１９０）リンカーであり、式中、ｎ＝２、３、４、または５である。ある特定の実施形態では、当該多量体コンストラクトは、３つのドメインを介在リンカーと共に含有し、構造：ドメイン－リンカー－ドメイン－リンカー－ドメイン、例えば、ＵＧＴ１Ａ１ドメイン－リンカー－ＵＧＴ１Ａ１ドメイン－リンカー－ＵＧＴ１Ａ１ドメインを有する。
一実施形態では、当該切断可能なリンカーは、Ｆ２Ａリンカー（例えば、アミノ酸配列ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１８６）を有する）である。その他の実施形態では、当該切断可能なリンカーは、Ｔ２Ａリンカー（例えば、アミノ酸配列ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８７）を有する）、Ｐ２Ａリンカー（例えば、アミノ酸配列ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８８）を有する）、またはＥ２Ａリンカー（例えば、アミノ酸配列ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１８９）を有する）である。当業者であれば、当該技術分野において承認されているその他のリンカーも、本発明のコンストラクトでの使用に適し得ることは理解する（例えば、本発明のポリヌクレオチドがコードする）。同様に当業者は、その他のマルチシストロニックコンストラクトも本発明において使用に適していることを理解する。例示的な実施形態では、当該コンストラクト設計は、本発明のコンストラクトがコードする、ほぼ等モル量の細胞内抗体、及び／またはそのドメインをもたらす。
一実施形態では、当該自己切断ペプチドとして、２Ａペプチドとし得るが、これに限定されない。様々な２Ａペプチドが、当該技術分野で公知であり、利用可能であり、例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、馬鼻炎Ａウイルス２Ａペプチド、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａペプチド、及び豚テシオウイルス－１ ２Ａペプチドなどを使用し得る。２Ａペプチドを、複数のウイルスに使用させて、リボソームスキッピングにより１つの転写物から２種のタンパク質を産生しており、正常なペプチド結合が２Ａペプチド配列では損なわれていて、２つの不連続のタンパク質が、１回の翻訳イベントから産生されるようになっている。例として、２Ａペプチドは、配列番号１８８のタンパク質配列、そのフラグメント、またはバリアントを有し得るが、これに限定されない。一実施形態では、当該２Ａペプチドは、最後のグリシンと最後のプロリンとの間で切断する。別の例として、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１８８のフラグメント、またはバリアントのタンパク質配列を有する２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み得るが、これに限定されない。２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の１つの例は：ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＵＡＣＵＡＡＣＵＵＣＡＧＣＣＵＧＣＵＧＡＡＧＣＡＧＧＣＵＧＧＡＧＡＣＧＵＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＵＧＧＡＣＣＵ（配列番号１９１）である。一例示的な実施形態では、２Ａペプチドは、次の配列：５’－ＵＣＣＧＧＡＣＵＣＡＧＡＵＣＣＧＧＧＧＡＵＣＵＣＡＡＡＡＵＵＧＵＣＧＣＵＣＣＵＧＵＣＡＡＡＣＡＡＡＣＵＣＵ ＵＡＡＣＵＵＵＧＡＵＵＵＡＣＵＣＡＡＡＣＵＧＧＣＴＧＧＧＧＡＵＧＵＡＧＡＡＡＧＣＡＡＵＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＵＣ－３’（配列番号１９２）によってコードされる。当該２Ａペプチドのポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載されている、及び／または当該技術分野で公知の方法によって、修飾またはコドン最適化し得る。
一実施形態では、この配列を使用して、２つ以上の目的のポリペプチドのコード領域を分離し得る。例として、当該Ｆ２Ａペプチドをコードする配列は、第１のコード領域Ａと第２のコード領域Ｂとの間とし得る（Ａ－Ｆ２Ａｐｅｐ－Ｂ）が、これに限定されない。Ｆ２Ａペプチドの存在は、Ｆ２Ａペプチド配列の末端でのグリシンとプロリンとの間での１つの長いタンパク質の切断をもたらして（ＮＰＧＰ（配列番号２０５）が切断してＮＰＧ及びＰが生じる）、その結果、分離したタンパク質Ａ（Ｆ２Ａペプチド結合から２１アミノ酸、ＮＰＧで終止）と、分離したタンパク質Ｂ（Ｆ２Ａペプチド結合から１アミノ酸、Ｐ）を生成する。同様に、その他の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、及びＥ２Ａ）では、長いタンパク質での当該ペプチドの存在が、２Ａペプチド配列（配列番号２０５）の末端でグリシンとプロリンとの間が切断して、ＮＰＧとＰをもたらす）。タンパク質Ａ及びタンパク質Ｂは、目的が同じである、または異なる、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、全長ヒトＵＧＴ１Ａ１などのＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド）とし得る。
５．ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列最適化
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、配列最適化する。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、任意に、目的の別のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、当該５’ＵＴＲ、または３’ＵＴＲは、任意に、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む、リンカーをコードする任意のヌクレオチド配列、ポリＡ尾部、またはそれらの任意の組合せ）を含み、ここで、当該ＯＲＦ（複数可）は配列最適化している。
ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列、例えば、コドン最適化ｍＲＮＡ配列は、参照配列（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする野生型ヌクレオチド配列）に関して、少なくとも１つの同義核酸塩基置換を含む配列である。
配列最適化ヌクレオチド配列は、参照配列とは、配列において部分的に、または完全に異なるものとすることができる。例えば、ＵＣＵコドンで一様にコードされているポリセリンをコードする参照配列は、その核酸塩基の１００％が置換されて（コドンごとに、１位のＵをＡで置換し、２位のＣをＧで置換し、かつ、３位のＵをＣで置換して）配列最適化すると、ＡＧＣコドンで一様にコードされるであろうポリセリンをコードする配列を得ることができる。参照ポリセリン核酸配列と、配列最適化ポリセリン核酸配列との間の全体的なペアワイズアライメントから得られる配列同一性のパーセンテージは０％である。しかしながら、両方の配列に由来するタンパク質産物の同一性は１００％である。
一部の配列最適化（時に、コドン最適化とも称する）方法は、当該技術分野で公知であり（かつ、詳細に後述する）、１つ以上の所望の結果を達成するために有用であり得る。これらの結果には、例えば、ある特定の組織標的、及び／または宿主生物におけるコドン頻度を一致させて、適切な折り畳みを確実にすること；Ｇ／Ｃ含有量をバイアスしてｍＲＮＡ安定性を上昇させること、または二次構造を減少させること；遺伝子コンストラクション、もしくは、遺伝子発現を損ない得るタンデムリピートコドン、またはベースランを最小化すること；転写及び翻訳制御領域をカスタマイズすること；タンパク質輸送配列を挿入または除去すること；コードしたタンパク質（例えば、グリコシル化部位）での翻訳後修飾部位を除去／付加すること；タンパク質ドメインを付加する、除去する、またはシャッフリングすること；制限部位を挿入する、または欠失させること；リボソーム結合部位、及びｍＲＮＡ分解部位を修飾すること；タンパク質の様々なドメインを適正に折り畳めるように翻訳速度を調整すること；及び／またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を軽減または排除すること、を含むことができる。配列最適化ツール、アルゴリズム、及びサービスは、当該技術分野において公知であり、例として、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）、及び／または特許権が及ぶ方法によるサービスがあるが、これらに限定されない。
表１に、それぞれのアミノ酸のコドン選択肢を示す。
表１．コドン選択肢
Figure 2025028860000002

一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド、その機能性フラグメント、またはバリアントをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えばＯＲＦ）を含み、その際、当該配列最適化ヌクレオチド配列がコードされたＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド、その機能性フラグメント、またはバリアントは、（例えば、配列最適化していない参照ヌクレオチド配列でコードされたＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド、その機能性フラグメント、またはバリアントと比較して）改善された特性、例えば、インビボで投与した後の発現効率に関する特性が改善されている。そのような特性として、核酸安定性（例えば、ｍＲＮＡ安定性）の改善、標的組織内での翻訳効率の上昇、発現した切断タンパク質の数の減少、発現タンパク質の折り畳みの改善または折り畳み異常の防止、発現した産物の毒性の低下、発現した産物に起因する細胞死の減少、タンパク質凝集の増加、及び／または減少があるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、配列最適化したヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を、ヒト対象における発現のためにコドン最適化して、当該技術分野における１つ以上の問題を回避する構造的、及び／または化学的特徴、例えば、構造的、及び機能的完全性を保持しながら、核酸をベースとした治療薬の製剤化、及び送達を最適化するために有用な特徴を得て；発現閾値を克服し；発現速度を改善し；半減期、及び／またはタンパク質濃度を改善し；タンパク質局在を最適化し；及び免疫応答、及び／または分解経路などの有害な生体応答を回避する。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、目的の別のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、マイクロＲＮＡ結合部位、リンカーをコードする核酸配列、またはそれらのあらゆる組合せ）を含み、これは；
（ｉ）参照ヌクレオチド配列での少なくとも１つのコドン（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするＯＲＦ）を代替コドンで置換して、ウリジン含有量を増減させて、ウリジン修飾配列を生成する；
（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列での少なくとも１つのコドン（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするＯＲＦ）を、同義コドンセットにおいてコドン頻度が高い代替コドンで置換する；
（ｉｉｉ）参照ヌクレオチド配列での少なくとも１つのコドン（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするＯＲＦ）を、代替コドンで置換して、Ｇ／Ｃ含有量を増加させる；または
（ｉｖ）それらの組合せ、を含む方法に従って配列最適化する。
一部の実施形態では、当該配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするＯＲＦ）は、参照ヌクレオチド配列に関して、少なくとも１つの改善特性を有する。
一部の実施形態では、当該配列最適化方法は、多パラメーターを用いたものであり、本明細書に開示した１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは、それを超える数の方法、及び／または当該技術分野で公知のその他の最適化方法を含む。
本発明の一部の実施形態で有益であると考えられる特徴は、ポリヌクレオチドの領域のそばで、またはポリヌクレオチドの領域内でコードを受けることができるものであって、そのような領域は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする領域に対して上流（５’）に、下流（３’）に、またはその領域内に置くことができる。これらの領域は、タンパク質コード領域、もしくは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列最適化の前及び／または後に、ポリヌクレオチド内に組み込むことができる。そのような特徴の例として、非翻訳領域（ＵＴＲ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列、コザック配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ポリＡ尾部、及び検出可能なタグがあり、また、ＸｂａＩ認識を有し得る複数のクローニング部位とすることができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び／またはマイクロＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、同じ、もしくは、異なる配列とすることができる２つ以上の５’ＵＴＲ、及び／または３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、同じ、または異なる配列とすることができる２つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位を含む。５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び／またはマイクロＲＮＡ結合部位のいずれかの部分を配列最適化することができ（いずれも配列最適化をしないことを含む）、配列最適化の前及び／または後に、１つ以上の異なる構造的もしくは化学修飾を独立して含めることができる。
一部の実施形態では、最適化した後に、当該ポリヌクレオチドを、限定をするものではないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体などのベクターに再構成して形質転換する。例えば、高コピープラスミド様、または染色体構造が、本明細書に記載した方法で生じる場合、当該最適化したポリヌクレオチドを再構成して、化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ニューロスポラ、トウモロコシ、ショウジョウバエなどに形質転換することができる。
６．ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示したＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、その際、当該ＯＲＦは配列最適化されている。
ヒト全長ＵＴＧ１Ａ１をコードする例示的な配列最適化ヌクレオチド配列は、配列番号２、及び５～１２に記載のとおりである。一部の実施形態では、当該配列最適化ＵＧＴ１Ａ１配列、そのフラグメント、及びバリアントを使用して、本明細書に開示した方法を実施する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’から３’末端に向けて：
（ｉ）本明細書で提供する５’キャップ、例えば、Ｃａｐ１；
（ｉｉ）本明細書で提供する配列、例えば、配列番号３などの５’ＵＴＲ；
（ｉｉｉ）ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号２または５～１２に記載のＵＧＴ１Ａ１をコードする配列最適化核酸配列；
（ｉｖ）少なくとも１つの終止コドン（存在しない場合は、３’ＵＴＲの５’末端）；
（ｖ）本明細書で提供する配列、例えば、配列番号１５０、１５１、または１７８などの３’ＵＴＲ；及び
（ｖｉ）上記したポリＡ尾部、を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’から３’の末端に向けて：
（ｉ）本明細書で提供する５’キャップ、例えば、Ｃａｐ１；
（ｉｉ）本明細書で提供する配列、例えば、配列番号３、３９、１９３、または１９４などの５’ＵＴＲ；
（ｉｉｉ）ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号２または５～１２に記載のＵＧＴ１Ａ１をコードする配列最適化核酸配列；
（ｉｖ）少なくとも１つの終止コドン（存在しない場合は、３’ＵＴＲの５’末端）；
（ｖ）本明細書で提供する配列、例えば、配列番号４、１１１、１５０、１７５、１７７、１７８、１９５、または１９６などの３’ＵＴＲ；及び
（ｖｉ）上記したポリＡ尾部、を含む。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドでのすべてのウラシルは、Ｎ１－メチルシュードウラシル（Ｇ５）である。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドでのすべてのウラシルは、５－メトキシウラシル（Ｇ６）である。
本明細書に開示した配列最適化ヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列、及びその他の公知の配列最適化ヌクレオチド配列とは異なっており、例えば、これらの配列最適化核酸は、独自の組成特性を有する。
一部の実施形態では、参照野生型ヌクレオチド配列でのウラシルまたはチミン核酸塩基のパーセンテージに関して、配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド、その機能性フラグメント、またはバリアントをコードする）でのウラシルまたはチミン核酸塩基のパーセンテージは変化している（例えば、低下している）。そのような配列を、ウラシル修飾配列、またはチミン修飾配列と称する。ヌクレオチド配列でのウラシルもしくはチミン含有量のパーセンテージは、配列でのウラシルまたはチミンの数をヌクレオチドの総数で除算してから、１００で乗算して決定することができる。一部の実施形態では、当該配列最適化ヌクレオチド配列は、参照野生型配列でのウラシルまたはチミン含有量よりも低いウラシルもしくはチミン含有量を有する。一部の実施形態では、本発明の配列最適化ヌクレオチド配列でのウラシルまたはチミン含有量は、参照野生型配列でのウラシルもしくはチミン含有量よりも多く、参照野生型配列と比較して、有益効果、例えば、発現の増強、及び／またはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答の減少を依然として維持する。
コドン使用頻度を最適化する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、本明細書に示すいずれか１つ以上の配列のＯＲＦをコドン最適化し得る。一部の実施形態では、コドン最適化を使用して、標的及び宿主生体におけるコドン頻度を一致させて、適切な折り畳みを確実にすること；ＧＣ含有量をバイアスしてｍＲＮＡ安定性を上昇させること、または二次構造を減少させること；遺伝子コンストラクトもしくは発現を損ない得るタンデムリピートコドンまたはベースランを最小化すること；転写及び翻訳制御領域をカスタマイズすること；タンパク質輸送配列を挿入または除去すること；コードしたタンパク質（例えば、グリコシル化部位）での翻訳後修飾部位を除去／付加すること；タンパク質ドメインを付加する、除去する、またはシャッフリングすること；制限部位を挿入する、または欠失させること；リボソーム結合部位、及びｍＲＮＡ分解部位を修飾すること；タンパク質の様々なドメインを適正に折り畳めるように翻訳速度を調整すること；またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を軽減または排除すること、を行い得る。コドン最適化ツール、アルゴリズム、及びサービスは、当該技術分野において公知であり、例として、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）、及び／または特許権が及ぶ方法によるサービスがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、当該オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を、最適化アルゴリズムを使用して最適化する。
７．配列最適化核酸の特徴決定
本発明の一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする本明細書に開示した配列最適化核酸を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、少なくとも１つの核酸配列特性（例えば、ヌクレアーゼに曝露された場合の安定性）、または発現特性が、非配列最適化核酸に対して改善されているか否かを決定するために試験することができる。
本明細書で使用する「発現特性」は、インビボ（例えば、それを必要とする対象に投与した後の合成ｍＲＮＡの翻訳有効性）、またはインビトロ（例えば、インビトロモデルシステムで試験した合成ｍＲＮＡの翻訳有効性）のいずれかでの核酸配列の特性のことを指す。発現特性として、投与後にＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡが産生するタンパク質の量、及び産生される可溶性タンパク質、またはその他の機能性タンパク質の量があるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に開示した配列最適化核酸を、本明細書に開示したＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする配列最適化核酸配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）がコードするタンパク質を発現する細胞の生存率に従って評価することができる。
特定の実施形態では、非最適化参照核酸配列に関するコドン置換を含む本明細書に開示した複数の配列最適化核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を機能的に特徴決定をして、インビトロモデルシステムにおいて、またはインビボで標的組織もしくは細胞における目的の特性、例えば、発現特性を機能的に測定することができる。
ａ．核酸配列に固有の特性の最適化
本発明の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの所望の特性は、核酸配列に固有の特性である。例えば、ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、インビボまたはインビトロでの安定性のために、配列最適化することができる。一部の実施形態では、当該ヌクレオチド配列を、特定の標的組織または細胞での発現のために、配列最適化することができる。一部の実施形態では、当該核酸配列を配列最適化して、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによって、配列が分解することを防止することで、その血漿中半減期を延長する。
その他の実施形態では、当該核酸配列を、溶液中での加水分解に対する耐性を増強させるように配列最適化して、例えば、最小限の分解で、水性条件下で、配列最適化核酸、または配列最適化核酸を含む医薬組成物を保存できる時間を延長する。
その他の実施形態では、当該配列最適化核酸を、乾燥貯蔵条件における加水分解に対する耐性を増強させるように最適化して、例えば、最小限の分解で、凍結乾燥後に、配列最適化核酸を保存できる時間を延長することができる。
ｂ．タンパク質の発現のために最適化した核酸配列
本発明の一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドの所望の特性は、本明細書に開示した配列最適化配列がコードするＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドの発現レベルである。タンパク質の発現レベルは、１つ以上の発現系を用いて測定することができる。一部の実施形態では、発現を、細胞培養系、例えば、ＣＨＯ細胞、またはＨＥＫ２９３細胞で測定することができる。一部の実施形態では、例えば、ウサギ網状赤血球溶解産物のような生存細胞の抽出物から調製したインビトロ発現系を使用し、あるいは、精製した個々の成分を寄せ集めて調製したインビトロ発現系を使用して、発現を測定することができる。その他の実施形態では、タンパク質の発現を、インビボ系、例えば、マウス、ウサギ、サルなどにおいて測定する。
一部の実施形態では、溶液形態のタンパク質の発現を所望することができる。したがって、一部の実施形態では、参照配列を配列最適化すると、可溶性形態で発現したタンパク質の最適化レベルを有する配列最適化核酸配列を得ることができる。タンパク質発現のレベル、ならびに、その他の特性、例えば、溶解性、凝集レベル、及びトランケーション生成物の存在（すなわち、タンパク質分解、加水分解、または翻訳の欠損に起因するフラグメント）は、例えば、電気泳動（例えば、天然またはＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、またはクロマトグラフィー法（例えば、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィーなど）を用いて、当該技術分野で公知の方法に従って測定することができる。
ｃ．標的組織または標的細胞の生存率の最適化
一部の実施形態では、核酸配列がコードする異種治療用タンパク質の発現は、標的組織もしくは細胞において有害作用を示し、タンパク質収量を減少させる、または（例えば、封入体内にタンパク質フラグメントが存在する、または発現タンパク質が沈殿することで）発現産物の質を低下させ得る、あるいは、毒性を惹起し得る。
したがって、本発明の一部の実施形態では、本明細書に開示した核酸配列、例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする核酸配列の配列最適化を用いると、配列最適化核酸がコードするタンパク質を発現する標的細胞の生存率を上昇させることができる。
異種タンパク質の発現はまた、自己移植または異種移植のために核酸配列をトランスフェクトした細胞に対して有害となり得る。したがって、本開示の一部の実施形態では、本明細書に開示した核酸配列の配列最適化を使用して、配列最適化核酸がコードするタンパク質を発現する標的細胞の生存率を上昇させることができる。細胞または組織の生存率、毒性及びその他の生理学的反応における変化は、当該技術分野で公知の方法に従って、測定することができる。
ｄ．免疫、及び／または炎症応答の減少
一部の事例では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする配列最適化核酸、またはその機能性フラグメントの投与は、（ｉ）治療薬（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）、または（ｉｉ）そのような治療薬の発現産物（例えば、ｍＲＮＡがコードするＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド）、または（ｉｖ）その組合せに起因し得るであろう免疫応答を誘発することができる。したがって、本開示の一部の実施形態では、本明細書に開示した核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）の配列最適化を使用して、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする核酸の投与によって、あるいは、そのような核酸がコードするＵＧＴ１Ａ１の発現産物によって誘発される免疫応答または炎症応答を減少させることができる。
一部の態様では、炎症応答は、当該技術分野で公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて１つ以上の炎症性サイトカインのレベルの上昇を検出して測定することができる。用語「炎症性サイトカイン」とは、炎症応答において上昇するサイトカインのことを指す。炎症性サイトカインの例として、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１、別名：ＧＲＯα、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ誘発性タンパク質１０（ＩＰ－１０）、または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）がある。用語「炎症性サイトカイン」は、当該技術分野で公知である、炎症応答に関連するその他のサイトカイン、例えば、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（Ｉｌ－１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）なども含む。
８．ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする修飾ヌクレオチド配列
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、化学修飾した核酸塩基、例えば、化学修飾したウラシル、例えば、シュードウラシル、Ｎ１－メチルシュードウラシル、５－メトキシウラシルなどを含む。一部の実施形態では、当該ｍＲＮＡは、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むウラシル修飾配列であり、その際、当該ｍＲＮＡは、化学修飾した核酸塩基、例えば、化学修飾したウラシル、例えば、シュードウラシル、Ｎ１－メチルシュードウラシル、または５－メトキシウラシルを含む。
本発明のある特定の態様では、修飾ウラシル塩基が、リボース糖に結合している場合、ポリヌクレオチドの場合のように、得られた修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドを、修飾ウリジンと称する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドでのウラシルは、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％が修飾したウラシルである。一実施形態では、ポリヌクレオチドでのウラシルは、少なくとも９５％が修飾したウラシルである。別の実施形態では、ポリヌクレオチドでのウラシルは、１００％が修飾したウラシルである。
ポリヌクレオチドでのウラシルが、少なくとも９５％が修飾したウラシルである実施形態では、ｍＲＮＡが、免疫応答を殆ど、または全く誘発せずに、適切なタンパク質の発現レベルをもたらすように、全体のウラシル含有量を調節することができる。一部の実施形態では、ＯＲＦのウラシル含有量は、対応する野生型ＯＲＦでの理論的最小ウラシル含有量の約１００％、及び約１５０％、約１００％～約１１０％、約１０５％～約１１５％、約１１０％～約１２０％、約１１５％～約１２５％、約１２０％～約１３０％、約１２５％～約１３５％、約１３０％～約１４０％、約１３５％～約１４５％、約１４０％～約１５０％（ＵＴＭ％）である。その他の実施形態では、ＯＲＦのウラシル含有量は、ＵＴＭ％の約１２１％～約１３６％、または１２３％～１３４％である。一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするＯＲＦのウラシル含有量は、ＵＴＭ％の約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、または約１５０％である。これに関連して、用語「ウラシル」は、修飾したウラシル、及び／または天然に生じるウラシルのことを指すことができる。
一部の実施形態では、本発明のＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦでのウラシル含有量は、ＯＲＦでの総核酸塩基含有量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、または約１０％未満である。一部の実施形態では、ＯＲＦでのウラシル含有量は、ＯＲＦでの総核酸塩基含有量の約１０％～約２０％である。その他の実施形態では、ＯＲＦでのウラシル含有量は、ＯＲＦでの総核酸塩基含有量の約１０％～約２５％である。一実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦでのウラシル含有量は、オープンリーディングフレームでの総核酸塩基含有量の約２０％未満である。これに関連して、用語「ウラシル」は、修飾したウラシル、及び／または天然に生じるウラシルのことを指すことができる。
さらなる実施形態では、修飾ウラシルを有し、かつ、ウラシル含有量が調節されている、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含有量（絶対値または相対値）を増加させている。一部の実施形態では、ＯＲＦのＣ、Ｇ、またはＧ／Ｃ含有量（絶対値または相対値）の全体的な増加は、野生型ＯＲＦのＧ／Ｃ含有量（絶対値または相対値）に対して、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％である。一部の実施形態では、ＯＲＦでのＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含有量は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列の理論的最大Ｇ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含有量（ＧＴＭＸ％、ＣＴＭＸ％、もしくは、Ｇ／ＣＴＭＸ％）の約１００％未満、約９０％未満、約８５％未満、もしくは、約８０％未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載したＧ及び／またはＣ含有量（絶対値または相対値）の増加を、Ｇ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含有量の低い同義コドンをより高いＣ、Ｇ、またはＧ／Ｃ含有量のコドンで置換して行うことができる。その他の実施形態では、Ｇ、及び／またはＣ含有量（絶対値または相対値）の増加を、Ｕで終わるコドンを、ＧもしくはＣで終わる同義コドンで置換して行う。
さらなる実施形態では、本発明のＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、修飾ウラシルを含み、かつ、調節したウラシル含有量を有しており、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも少ないウラシルペア（ＵＵ）、及び／またはウラシルトリプレット（ＵＵＵ）、及び／またはウラシルクアドラプレット（ＵＵＵＵ）を含有する。一部の実施形態では、本発明のＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ウラシルペア、及び／またはウラシルトリプレット、及び／またはウラシルクアドラプレットを含まない。一部の実施形態では、ウラシルペア、及び／またはウラシルトリプレット、及び／またはウラシルクアドラプレットは、ある特定の閾値未満、例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦでの出現数を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０以下にまで減少する。特定の実施形態では、本発明のＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１未満の非フェニルアラニンウラシルペア、及び／またはトリプレットを含む。別の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、非フェニルアラニンウラシルペア、及び／またはトリプレットを含まない。
さらなる実施形態では、本発明のＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、修飾ウラシルを含み、かつ、調節したウラシル含有量を有しており、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも少ないウラシルリッチなクラスタを含有する。一部の実施形態では、本発明のＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列での対応するウラシルリッチなクラスタよりも長さが短いウラシルリッチなクラスタを含む。
さらなる実施形態では、より低頻度の代替コドンを用いる。修飾ウラシル含有ｍＲＮＡのＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするＯＲＦでのコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、同義コドンセットでの置換コドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有するそれぞれの代替コドンで、それぞれ置換される。また、ＯＲＦは、上記したとおり、調節したウラシル含有量を有する。一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦでの少なくとも１つのコドンは、同義コドンセットでの置換コドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替コドンで置換される。
一部の実施形態では、ウラシル含有量を調節すると、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする修飾ウラシル含有ｍＲＮＡのＯＲＦは、哺乳動物細胞に投与した場合、対応する野生型ｍＲＮＡからのＵＧＴ１Ａ１の発現レベルよりも高いＵＧＴ１Ａ１の発現レベルを示す。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、マウス細胞、ラット細胞、またはウサギ細胞である。その他の実施形態では、哺乳動物細胞は、サル細胞またはヒト細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＢＪ線維芽細胞、または末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１は、当該ｍＲＮＡを哺乳動物細胞にインビボで投与した場合、対応する野生型ｍＲＮＡからのＵＧＴ１Ａ１の発現レベルよりも高いレベルで発現する。一部の実施形態では、当該ｍＲＮＡを、マウス、ウサギ、ラット、サル、またはヒトに投与する。一実施形態では、マウスは、ヌルマウスである。一部の実施形態では、当該ｍＲＮＡを、マウスに対して、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇの量で投与する。一部の実施形態では、当該ｍＲＮＡを、静脈内または筋肉内投与する。その他の実施形態では、当該ｍＲＮＡを、インビトロで哺乳動物細胞に投与した場合に、当該ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドが発現する。一部の実施形態では、発現は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１５００倍、または少なくとも約３０００倍増加する。その他の実施形態では、発現は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％増加する。
一部の実施形態では、ウラシル含有量を調節すると、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする修飾ウラシル含有ｍＲＮＡのＯＲＦは、安定性の上昇を示す。一部の実施形態では、当該ｍＲＮＡは、同じ条件下にて、対応する野生型ｍＲＮＡの安定性と比べて、細胞内での安定性の上昇を示す。一部の実施形態では、当該ｍＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する耐性、熱安定性、及び／または二次構造の安定化の向上を含む安定性の上昇を示す。一部の実施形態では、当該ｍＲＮＡが示す安定性の上昇は、ｍＲＮＡの半減期（例えば、血漿、血清、細胞、または組織試料での）を決定し、及び／または経時的に（例えば、インビトロ、もしくは、インビボで）ｍＲＮＡによるタンパク質発現の曲線下面積（ＡＵＣ）を決定して測定する。同じ条件下で、半減期、及び／またはＡＵＣが、対応する野生型ｍＲＮＡの半減期、及び／またはＡＵＣを上回る場合に、ｍＲＮＡは、安定性が上昇していると同定する。
一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、同じ条件下で、対応する野生型ｍＲＮＡが誘発した免疫応答と比較して、検出可能な低い免疫応答（例えば、先天性もしくは後天性）を誘導する。その他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするが、同じ条件下で修飾ウラシルを含まないｍＲＮＡが誘導する免疫応答と比較して、あるいは、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードし、かつ、修飾ウラシルを含むが、同じ条件下でウラシル含有量が調節されていないｍＲＮＡが誘導する免疫応答と比較して、検出可能な低い免疫応答（例えば、先天性もしくは後天性）を誘発する。先天免疫応答は、炎症誘発性サイトカインの発現の増加、細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５など）の活性化、細胞死、及び／またはタンパク質翻訳の終結もしくは減少により顕在化する。一部の実施形態では、先天免疫応答の低下は、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－κ、ＩＦＮ－δ、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－τ、ＩＦＮ－ω、及びＩＦＮ－ζ）の発現もしくは活性レベル、またはｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８）などのインターフェロン調節遺伝子の発現によって、及び／または本発明のｍＲＮＡを細胞に１回以上投与した後の細胞死の減少によって、測定することができる。
一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡに応答する哺乳動物細胞による１型インターフェロンの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡ、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするが、修飾ウラシルを含まないｍＲＮＡ、またはＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードして修飾ウラシルを含むが、ウラシル含有量が調節されていないｍＲＮＡに対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または９９．９％超の減少を示す。一部の実施形態では、上記インターフェロンはＩＦＮ－βである。一部の実施形態では、哺乳動物細胞への本開示のｍＲＮＡの投与に起因する細胞死の頻度は、対応する野生型ｍＲＮＡ、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするが、修飾ウラシルを含まないｍＲＮＡ、またはＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードし、修飾ウラシルを含むが、ウラシル含有量が調節されていないｍＲＮＡで認められる細胞死の頻度よりも、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％超の減少を示す。一部の実施形態では、当該哺乳動物細胞は、ＢＪ線維芽細胞である。その他の実施形態では、哺乳動物細胞は、脾細胞である。一部の実施形態では、当該哺乳動物細胞は、マウスまたはラットの細胞である。その他の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒトの細胞である。一実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、そのｍＲＮＡを導入した哺乳動物細胞の先天免疫応答を実質的に誘発しない。
９．ポリヌクレオチドを修飾するための方法
本開示は、本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ）を含む修飾ポリヌクレオチドを含む。当該修飾ポリヌクレオチドは、化学修飾、及び／または構造修飾することができる。本発明のポリヌクレオチドが、化学修飾、及び／または構造修飾している場合、当該ポリヌクレオチドは、「修飾ポリヌクレオチド」と称することができる。
本開示は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾ヌクレオシド、及び修飾ヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）、またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）、またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも称する）との組合せで含有する化合物のことを指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドのことを指す。例えば、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるための化学的、酵素的、または組換えによる方法などのあらゆる有用な方法によって、修飾ヌクレオチドを合成することができる。ポリヌクレオチドは、結合したヌクレオシドの１つ以上の領域を含むことができる。そのような領域は、可変の骨格結合を持つことができる。その結合を、標準のホスホジエステル結合とすることができ、その場合、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含むであろう。
本明細書に開示した修飾ポリヌクレオチドは、様々な別個の修飾を含むことができる。一部の実施形態では、当該修飾ポリヌクレオチドは、１つ、２つ、もしくは、それより多くの（任意に異なる）ヌクレオシド修飾、またはヌクレオチド修飾を含む。一部の実施形態では、修飾ポリヌクレオチドは、細胞に導入すると、非修飾ポリヌクレオチドと比較して１つ以上の望ましい特性、例えば、細胞でのタンパク質発現の向上、免疫原性の低下、または分解の減少を示すことができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、構造修飾されている。本明細書で使用する「構造」修飾とは、２つ以上の結合したヌクレオシドを、ヌクレオチド自体に対して有意な化学修飾を施さずに、ポリヌクレオチドに対して、挿入、欠失、複製、逆位、または無作為化を行うことである。化学結合は必然的に破壊され、再編成されて構造修飾をもたらすことから、構造修飾は化学的性質のものであり、したがって、化学修飾である。しかしながら、構造修飾は、異なるヌクレオチド配列をもたらすこととなる。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ－５ｍｅＣ－Ｇ」に化学修飾することができる。その同じポリヌクレオチドを、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造修飾することもできる。この場合、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されて、ポリヌクレオチドに対して構造修飾が生じる。
本開示の治療用組成物は、一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１（例えば、配列番号２、または５～１２）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの核酸（例えば、ＲＮＡ）を含み、その際、当該核酸は、標準（非修飾）とすることができ、または当該技術分野で公知のとおりに修飾し得るヌクレオチド、及び／またはヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、本開示のヌクレオチド、及びヌクレオシドは、修飾ヌクレオチド、またはヌクレオシドを含む。そのような修飾ヌクレオチド、及びヌクレオシドは、天然に生じる修飾ヌクレオチド、及びヌクレオシド、または天然に存在しない修飾ヌクレオチド、及びヌクレオシドとすることができる。そのような修飾は、当該技術分野で認識されているヌクレオチド、及び／またはヌクレオシドの糖、骨格、または核酸塩基部分に修飾を含むことができる。
一部の実施形態では、本開示の天然に生じる修飾ヌクレオチド、またはヌクレオチドは、一般的に公知であるか、当該技術分野で認識されているとおりのものである。そのような天然に生じる修飾ヌクレオチド、及びヌクレオチドの例として、特に、広く認識されているＭＯＤＯＭＩＣＳデータベースにおいて認められるものがあるが、それらに限定されない。
一部の実施形態では、本開示の天然に存在しない修飾ヌクレオチド、またはヌクレオシドは、一般的に公知であるか、当該技術分野で認識されているとおりのものである。そのような天然に存在しない修飾ヌクレオチド、及びヌクレオシドの例は、特に、公開米国出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９；ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７５１７７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９１；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０４１３；ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７３；ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７５９；ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７１；またはＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５１３６７において認めることができるが、それらに限定されるものではなく、これらの全内容を参照により本明細書で援用する。
一部の実施形態では、本開示の少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、化学修飾されておらず、アデノシン、グアノシン、シトシン、及びウリジンからなる標準リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヌクレオチド、及びヌクレオシドは、転写したＲＮＡに存在するもの（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵ）などの標準ヌクレオシド残基を含む。一部の実施形態では、本開示のヌクレオチド、及びヌクレオシドは、ＤＮＡに存在するもの（例えば、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、またはｄＴ）などの標準的なデオキシリボヌクレオシドを含む。
したがって、本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸、及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、標準ヌクレオチド、及びヌクレオシド、天然に生じるヌクレオチド、及びヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオチド、及びヌクレオシド、またはそれらのいずれかの組合せを含むことができる。
本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸、及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、一部の実施形態では、様々な（２つ以上の）異なる種類の標準、及び／または修飾ヌクレオチド、及びヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、核酸の特定の領域は、１つ、２つ、または３つ以上の（任意に異なる）種類の標準、及び／または修飾ヌクレオチド、及びヌクレオシドを含む。
一部の実施形態では、修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、細胞または生体に導入すると、標準ヌクレオチド、及びヌクレオシドを含む非修飾の核酸と比べて、それぞれ、細胞または生体での分解が減少を示す。
一部の実施形態では、修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、細胞または生体に導入すると、標準ヌクレオチド、及びヌクレオシドを含む非修飾の核酸と比べて、それぞれ、細胞または生体での免疫原性が減少（例えば、先天応答の減少）を示し得る。
核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、一部の実施形態では、核酸の合成中または合成後に、所望の機能または特性を達成するために導入する非天然修飾ヌクレオチドを含む。当該修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンまたはピリミジン塩基、または糖の上に存在し得る。当該修飾は、化学合成を用いて、またはポリメラーゼ酵素を用いて、鎖の末端に、または鎖でのその他のあらゆる箇所に導入することができる。核酸のいずれの領域も、化学修飾し得る。
本開示は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）の修飾ヌクレオシド、及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子（例えば、ペントース、またはリボース）、またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリン、またはピリミジン）、またはその誘導体との組合せで含有する化合物（本明細書では「核酸塩基」とも称する）のことを指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドのことを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるためのあらゆる有用な方法、例えば、化学的、酵素的に、もしくは、組換え的に合成することができる。核酸は、結合したヌクレオシドの１つ以上の領域を含むことができる。そのような領域は、可変的な骨格結合を有し得る。結合は、標準のホスホジエステル結合とすることができ、その場合、核酸は、ヌクレオチドの領域を含むであろう。
修飾ヌクレオチド塩基対合は、標準アデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対のみならず、非標準もしくは修飾塩基を含むヌクレオチド、及び／または修飾ヌクレオチド間で形成する塩基対も含み、その際、水素結合供与体、及び水素結合受容体の配置が、例えば、少なくとも１つの化学修飾を有する核酸などで、非標準塩基と標準塩基との間、または２つの相補的非標準塩基構造どうしの間での水素結合を可能にする。そのような非標準的な塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーのあらゆる組合せを、本開示の核酸に組み込み得る。
一部の実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）での修飾核酸塩基は、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍｌΨ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅｌΨ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはシュードウリジン（Ψ）を含む。一部の実施形態では、核酸での修飾核酸塩基（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、５－メトキシメチルウリジン、５－メチルチオウリジン、１－メトキシメチルシュードウリジン、５－メチルシチジン、及び／または５－メトキシシチジンを含む。一部の実施形態では、当該ポリリボヌクレオチドは、化学修飾を含む前掲の修飾核酸塩基のいずれか少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ以上）の組合せを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上、またはすべてのウリジン位に、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１Ψ）置換を含む。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上、またはすべてのウリジン位置でのＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１Ψ）置換、及び核酸の１つ以上、またはすべてのシチジン位置での５－メチルシチジン置換を含む。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上、またはすべてのウリジン位置でのシュードウリジン（Ψ）置換を含む。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上、またはすべてのウリジン位置でのシュードウリジン（Ψ）置換、及び核酸の１つ以上、またはすべてのシチジン位置での５－メチルシチジン置換を含む。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上、またはすべてのウリジン位置にウリジンを含む。
一部の実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、特定の修飾について一様に修飾されている（例えば、完全に修飾され、配列全体で修飾されている）。例えば、核酸は、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで一様に修飾することができ、ｍＲＮＡ配列でのすべてのウリジン残基が、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで置換していることを意味する。同様に、核酸は、例えば、前述したものなどの修飾残基での置換により、配列に存在するあらゆる種類のヌクレオシド残基について一様に修飾することができる。
本開示の核酸は、分子の長さ全体で部分的に、または完全に修飾し得る。例えば、１つ以上、または全部の所与の種類のヌクレオチド（例えば、プリンまたはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上または全部）が、本開示の核酸において、またはその所定の配列領域において一様に修飾し得る（例えば、ポリＡ尾部を含む、または除くｍＲＮＡにおいて）。一部の実施形態では、本開示の核酸（またはその配列領域）でのすべてのヌクレオチドＸが修飾ヌクレオチドであり、その際、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ、または組合せＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣまたはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つとし得る。
当該核酸は、（総ヌクレオチド含有量に対して、またはヌクレオチドの１つ以上の種類、すなわち、Ａ、Ｇ、ＵまたはＣのいずれか１つ以上に対して）約１％～約１００％、または任意の中間のパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）の修飾ヌクレオチドを含み得る。あらゆる残りのパーセンテージが、非修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在が占めることが理解される。
当該核酸は、最低１％及び最大１００％の修飾ヌクレオチド、または任意の中間のパーセンテージ、例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、または少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを有し得る。例えば、当該核酸は、修飾ピリミジン、例えば、修飾ウラシルまたはシトシンを有し得る。一部の実施形態では、当該核酸でのウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５－置換ウラシル）で置換する。修飾ウラシルは、単一の独自の構造を有する化合物で置換し得る、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の独自の構造）を有する複数の化合物により置換し得る。一部の実施形態では、当該核酸でのシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾シトシン（例えば、５－置換シトシン）で置換している。修飾シトシンは、単一の独自の構造を有する化合物で置換し得る、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の独自の構造）を有する複数の化合物で置換し得る。
１０．非翻訳領域（ＵＴＲ）
ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドの翻訳は、様々なシス作用性核酸構造により与えられる様々な機構で調節及び制御することができる。例えば、ヘアピンまたはその他の高次（例えば、シュードノット）分子内ｍＲＮＡ二次構造を形成する天然に生じるシス作用性ＲＮＡエレメントは、翻訳制御活性をポリヌクレオチドに与えることができ、その際、特に、ＲＮＡエレメントが、５’キャップ構造に近似する５’ＵＴＲに位置している場合には、ＲＮＡエレメントは、ポリヌクレオチド翻訳の開始に影響を及ぼす、またはそれを調節する（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ（１９８５）Ｃｅｌｌ ４０（３）：５１５－５２６、Ｋｏｚａｋ（１９８６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８３：２８５０－２８５４）。
非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳されない開始コドン（５’ＵＴＲ）の前、及び終止コドン（３’ＵＴＲ）の後のポリヌクレオチドの核酸部分である。一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、さらに、ＵＴＲ（例えば、５’ＵＴＲもしくはその機能性フラグメント、３’ＵＴＲ、もしくは、その機能性フラグメント、またはその組合せ）を含む。
また、シス作用性ＲＮＡエレメントは、翻訳伸長に影響を及ぼすことができ、多数のフレームシフティングイベントに関係する（Ｎａｍｙ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １３（２）：１５７－１６８）。内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）は、別の種類のシス作用性ＲＮＡエレメントを表しており、このものは、一般的には、５’ＵＴＲに位置するが、天然に生じるｍＲＮＡのコード領域内でも認められることが報告されている（Ｈｏｌｃｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １６（１０）：４６９－４７３）。細胞ｍＲＮＡでは、ＩＲＥＳは、大抵の場合、５’－キャップ構造と共存し、ｍＲＮＡに、ｃａｐ依存的翻訳が損なわれている条件下で翻訳する機能的能力を与える（Ｇｅｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ４（７）：ａ０１２２４５）。別の種類の天然に生じるシス作用性ＲＮＡエレメントは、上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）を含む。天然に生じるｕＯＲＦは、多数のｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内に単独で、または複数で出現し、下流の主なＯＲＦの翻訳に、通常はマイナスの影響を及ぼす（酵母におけるＧＣＮ４ ｍＲＮＡ、及び哺乳動物におけるＡＴＦ４ ｍＲＮＡの注目すべき例外を伴い、その際、ｕＯＲＦは、ｅＩＦ２リン酸化増大の条件下で下流の主なＯＲＦの翻訳を促すように作用する（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ（２００５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５９：４０７－４５０））。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を構成する成分、構造、エレメント、モチーフ、及び／または特異的配列により与えられるさらなる例示的な翻訳制御活性として、ｍＲＮＡの安定化または不安定化（Ｂａｋｅｒ ＆ Ｐａｒｋｅｒ（２００４）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６（３）：２９３－２９９）、翻訳活性化（Ｖｉｌｌａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２１（４）：４５２－４５７）、及び翻訳抑制（Ｂｌｕｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｅｅｈ Ｄｅｖ １１０（１－２）：９７－１１２）があるが、これらに限定されない。研究は、天然に生じるシス作用性ＲＮＡエレメントが、導入により異種ポリヌクレオチドを修飾するために使用した場合、それらのそれぞれの機能を付与し得ることを示している（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ－Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（１６）：１３６３５－１３６４０）。
機能性ＲＮＡエレメントを含む修飾ポリヌクレオチド
本開示は、所望の翻訳制御活性を与える修飾を含む合成ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡエレメント）を提供する。一部の実施形態では、本開示は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、開始コドン、ポリペプチドをコードする全長オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、及び少なくとも１つの修飾を含むポリヌクレオチドを提供し、その際、当該少なくとも１つの修飾は、所望の翻訳制御活性、例えば、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実性を促進、及び／または増強する修飾を与える。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、シス作用性制御活性である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、開始コドンでの、またはその近位での４３Ｓ転写前複合体（ＰＩＣ）、またはリボソームの滞留時間の増大である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、開始コドンでの、またはそこからのポリペプチド合成の開始の増大である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、全長オープンリーディングフレームから翻訳するポリペプチドの量の増加である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、ＰＩＣまたはリボソームによる開始コドン解読の忠実性の上昇である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、ＰＩＣまたはリボソームによる読み漏らしの阻害または減少である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、ＰＩＣまたはリボソームによる開始コドンの解読速度の低下である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、開始コドン以外のｍＲＮＡでのあらゆるコドンでのポリペプチド合成の開始の阻害または減少である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、全長オープンリーディングフレーム以外のｍＲＮＡでのあらゆるオープンリーディングフレームから翻訳するポリペプチドの量の阻害または減少である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、異常な翻訳産物の産生の阻害または減少である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、前掲の翻訳制御活性のうちの１つ以上の組合せである。
したがって、本開示は、本明細書に記載したとおりの所望の翻訳制御活性を提供する配列、及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡエレメントを含むポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを提供する。一部の態様では、当該ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実性を促進及び／または増強する配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡエレメントを含む。一部の態様では、当該ｍＲＮＡは、読み漏らしの阻害または減少などの所望の翻訳制御活性を与える配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡエレメントを含む。一部の態様では、本開示は、読み漏らしを阻害及び／または減少させて、それにより、ｍＲＮＡの翻訳忠実性を促す配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡエレメントを含むｍＲＮＡを提供する。
一部の実施形態では、当該ＲＮＡエレメントは、天然及び／または修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、当該ＲＮＡエレメントは、本明細書に記載したような所望の翻訳制御活性を提供する結合ヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの配列からなる。一部の実施形態では、当該ＲＮＡエレメントは、安定なＲＮＡ二次構造を形成する、あるいは、そこに折り込まれる結合ヌクレオチド、またはその誘導体もしくアナログの配列を含み、その際、当該ＲＮＡ二次構造は、本明細書に記載したような所望の翻訳制御活性を提供する。ＲＮＡエレメントは、エレメントの一次配列（例えば、ＧＣリッチなエレメント）に基づいて、エレメントにより形成するＲＮＡ二次構造（例えば、ステムループ）により、ＲＮＡ分子内でのエレメントの位置（例えば、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内に位置）により、エレメントの生物学的機能、及び／または活性（例えば、「翻訳エンハンサーエレメント」）、及びそれらのあらゆる組合せによって、同定及び／または特徴決定することができる。
一部の態様では、本開示は、読み漏らしを阻害する、及び／またはｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実性を促す１つ以上の構造修飾を有するｍＲＮＡを提供し、その際、当該構造修飾の少なくとも１つは、ＧＣリッチなＲＮＡエレメントである。一部の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列の上流に結合ヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログである。一実施形態では、当該ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列から約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１個のヌクレオチド（複数可）上流に位置する。別の実施形態では、当該ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、コザックコンセンサス配列から１５～３０、１５～２０、１５～２５、１０～１５、または５～１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、当該ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列に直接隣接して位置する。
上記した態様または関連の態様のいずれかでは、本開示は、任意の順序で結合した３～３０、５～２５、１０～２０、１５～２０、約２０、約１５、約１２、約１０、約７、約６、または約３個のヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、その誘導体またはアナログを提供し、その際、当該配列組成は、シトシン７０～８０％、シトシン６０～７０％、シトシン５０％～６０％、シトシン４０～５０％、シトシン塩基３０～４０％である。上記した態様または関連の態様のいずれかでは、本開示は、任意の順序で結合した３～３０、５～２５、１０～２０、１５～２０、約２０、約１５、約１２、約１０、約７、約６、または約３個のヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、その誘導体またはアナログを提供し、その際、当該配列組成は、シトシン約８０％、シトシン約７０％、シトシン約６０％、シトシン約５０％、シトシン約４０％、またはシトシン約３０％である。
上記した態様または関連の態様のいずれかでは、本開示は、任意の順序で結合した２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、または３個のヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、その誘導体またはアナログを提供し、その際、当該配列組成は、シトシン７０～８０％、シトシン６０～７０％、シトシン５０％～６０％、シトシン４０～５０％、またはシトシン３０～４０％である。上記した態様または関連の態様のいずれかでは、本開示は、任意の順序で結合した２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、または３個のヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、その誘導体またはアナログを提供し、その際、当該配列組成は、シトシン約８０％、シトシン約７０％、シトシン約６０％、シトシン約５０％、シトシン約４０％、またはシトシン約３０％である。
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列の上流に結合ヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログであり、当該ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列から約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１個のヌクレオチド（複数可）上流に位置し、かつ、当該ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、任意の順序で結合した３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、その誘導体またはアナログを含み、その際、当該配列組成は、シトシン＞５０％である。一部の実施形態では、当該配列組成は、シトシン＞５５％、シトシン＞６０％、シトシン＞６５％、シトシン＞７０％、シトシン＞７５％、シトシン＞８０％、シトシン＞８５％、またはシトシン＞９０％である。
その他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列の上流の結合ヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログであり、当該ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列から約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１個のヌクレオチド（複数可）上流に位置し、かつ、当該ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、約３～３０、５～２５、１０～２０、１５～２０、または約２０、約１５、約１２、約１０、約６、または約３個のヌクレオチド、または誘導体もしくはアナログの配列を含み、当該配列は、繰り返しＧＣモチーフを含み、当該繰り返しＧＣモチーフは、［ＣＣＧ］ｎであり、ここで、ｎ＝１～１０（配列番号２０６）、ｎ＝２～８（配列番号２０７）、ｎ＝３～６（配列番号２０８）、またはｎ＝４～５（配列番号２０９）である。一部の実施形態では、当該配列は、繰り返しＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、式中、ｎ＝１、２、３、４、または５（配列番号２１０）である。一部の実施形態では、当該配列は、繰り返しＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、式中、ｎ＝１、２、または３である。一部の実施形態では、当該配列は、繰り返しＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、式中、ｎ＝１である。一部の実施形態では、当該配列は、繰り返しＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、式中、ｎ＝２である。一部の実施形態では、配列は、繰り返しのＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、式中、ｎ＝３である。一部の実施形態では、配列は、繰り返しＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、式中、ｎ＝４（配列番号２１１）である。一部の実施形態では、配列は、繰り返しＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、式中、ｎ＝５（配列番号２１２）である。
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列の上流の結合ヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログであり、当該ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、表２に記載の配列のいずれか１つを含む。一実施形態では、当該ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列から約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１個のヌクレオチド（複数可）上流に位置する。別の実施形態では、当該ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、コザックコンセンサス配列から１５～３０、１５～２０、１５～２５、１０～１５、または５～１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、当該ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列に直接隣接して位置する。
その他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列の上流に表２に記載の配列Ｖ１［ＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号４３）］を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログである。一部の実施形態では、当該ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列の上流に直接隣接して位置する表２に記載の配列Ｖ１を含む。一部の実施形態では、当該ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基上流に位置する表２に記載の配列Ｖ１を含む。その他の実施形態では、当該ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列から１～３、３～５、５～７、７～９、９～１２、または１２～１５塩基上流に位置する表２に記載の配列Ｖ１を含む。
その他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列の上流に表２に記載の配列Ｖ２［ＣＣＣＣＧＧＣ（配列番号４４）］を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログである。一部の実施形態では、当該ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列の上流に直接隣接して位置する表２に記載の配列Ｖ２を含む。一部の実施形態では、当該ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基上流に位置する表２に記載の配列Ｖ２を含む。その他の実施形態では、当該ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列から１～３、３～５、５～７、７～９、９～１２、または１２～１５塩基上流に位置する表２に記載の配列Ｖ２を含む。
その他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列の上流に表２に記載の配列ＥＫ［ＧＣＣＧＣＣ（配列番号４２）］を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログである。一部の実施形態では、当該ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列の上流に直接隣接して位置する表２に記載の配列ＥＫを含む。一部の実施形態では、当該ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基上流に位置する表２に記載の配列ＥＫを含む。その他の実施形態では、当該ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列から１～３、３～５、５～７、７～９、９～１２、または１２～１５塩基上流に位置する表２に記載の配列ＥＫを含む。
なおも別の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列の上流に表２に記載の配列Ｖ１［ＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号４３）］を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログであり、当該５’ＵＴＲは、表２に示されている次の配列：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡ（配列番号８５）を含む。当業者であれば、当然のことであるが、本明細書に記載したＲＮＡ配列でのすべてのＵが、本開示のｍＲＮＡが、例えば、ＩＶＴを介して転写する対応するテンプレートＤＮＡ配列、例えば、ＤＮＡテンプレートまたはコンストラクトではＴになる、ことを理解する。
一部の実施形態では、当該ＧＣリッチエレメントは、表２に記載の５’ＵＴＲ配列でのコザックコンセンサス配列の上流に直接隣接して位置する表２に記載の配列Ｖ１を含む。一部の実施形態では、当該ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基上流に位置する表２に示されている配列Ｖ１を含み、その際、当該５’ＵＴＲは、表２に示されている次の配列：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡ（配列番号８５）を含む。
その他の実施形態では、当該ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲでのコザックコンセンサス配列から１～３、３～５、５～７、７～９、９～１２、または１２～１５塩基上流に位置する表２に記載の配列Ｖ１を含み、その際、当該５’ＵＴＲは、表２に示されている次の配列：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡ（配列番号８５）を含む。
一部の実施形態では、当該５’ＵＴＲは、表２に示されている次の配列：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号３９）を含む。
表２
Figure 2025028860000003

別の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ヘアピンまたはステムループを形成する順序で結合したヌクレオチドの配列、またはその誘導体もしくはアナログを含む安定なＲＮＡ二次構造を含むＧＣリッチＲＮＡエレメントである。一実施形態では、当該安定なＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列の上流にある。別の実施形態では、当該安定なＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列から約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、または約５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、当該安定なＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列から約２０、約１５、約１０、または約５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、当該安定なＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列から約５、約４、約３、約２、約１ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、当該安定なＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列から約１５～３０、約１５～２０、約１５～２５、約１０～１５、または約５～１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、当該安定なＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列から１２～１５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、当該安定なＲＮＡ二次構造は、約－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約－２０～－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約－１０～－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約－５～－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌのデルタＧを有する。
別の実施形態では、当該修飾は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結しており、その際、当該修飾及び当該オープンリーディングフレームは異種である。
別の実施形態では、当該ＧＣリッチＲＮＡエレメントの配列は専ら、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）核酸塩基からなる。
本明細書に記載した所望の翻訳制御活性をもたらすＲＮＡエレメントは、リボソームプロファイリングなどの公知の技術を使用して同定、及び特徴決定することができる。リボソームプロファイリングは、ｍＲＮＡに結合したＰＩＣ、及び／またはリボソームの位置の決定を可能にする技術である（例えば、参照により本明細書で援用する、Ｉｎｇｏｌｉａ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４（５９２４）：２１８－２３を参照されたい）。この技術は、ＰＩＣ、及び／またはリボソームによる、ヌクレアーゼ消化からのｍＲＮＡの領域またはセグメントの保護に基づく。保護は、「フットプリント」と呼ばれるＲＮＡの３０ｂｐフラグメントの生成をもたらす。ＲＮＡフットプリントの配列及び頻度を、当該技術分野で公知の方法（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑ）により解析することができる。フットプリントは、リボソームのＡ部位にほぼ集中している。ＰＩＣまたはリボソームが、ｍＲＮＡに沿った特定の位置または箇所に存在するならば、これらの位置で生成したフットプリントは比較的共通するであろう。研究は、ＰＩＣ及び／またはリボソームが、加工性の低下を示す位置に、より多くのフットプリントを生成し、かつ、ＰＩＣ及び／またはリボソームが加工性の増大を示す位置に、より少ないフットプリントを生成することを示している（Ｇａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）ｅＬｉｆｅ ３：ｅ０３７３５）。一部の実施形態では、本明細書に記載したＲＮＡエレメントのいずれか１つ以上を含むポリヌクレオチドに沿った別個の位置または箇所でのＰＩＣ、またはリボソームの滞留時間または占有時間は、リボソームプロファイリングにより決定する。
ＵＴＲは、ポリヌクレオチドでのコード領域に対して相同または異種とすることができる。一部の実施形態では、ＵＴＲは、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするＯＲＦに対して相同である。一部の実施形態では、ＵＴＲは、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするＯＲＦに対して異種である。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、２つ以上の５’ＵＴＲ、またはそれらの機能性フラグメントを含み、それらの各々は、同じ、または異なるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、２つ以上の３’ＵＴＲ、またはそれらの機能性フラグメントを含み、それらの各々は、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
一部の実施形態では、当該５’ＵＴＲもしくはそれらの機能性フラグメント、３’ＵＴＲ、もしくは、それらの機能性フラグメント、またはそれらのあらゆる組合せは、配列最適化している。
一部の実施形態では、当該５’ＵＴＲもしくはその機能性フラグメント、３’ＵＴＲもしくはその機能性フラグメント、またはそれらのあらゆる組合せは、少なくとも１つの化学修飾した核酸塩基、例えば、Ｎ１－メチルシュードウラシル、または５－メトキシウラシルを含む。
ＵＴＲは、調節的役割、例えば、安定化、局在化、及び／または翻訳効率の増大または減少を提供する特徴を持つことができる。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドを、細胞、組織、または生物に投与することができ、ルーチン的な方法を用いて、１つ以上の調節的特徴を測定することができる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの機能性フラグメントは、それぞれ、全長５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの１つ以上の調節機能を含む。
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす特徴を有している。これらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般的に知られているコザック配列などのシグネチャを保持している。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号８７）を有しており、ここで、Ｒは、開始コドンから３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）（ＡＵＧ）であり、その後に別の「Ｇ」が続く。また、５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することが公知である。
特定の標的器官内に豊富に発現する遺伝子において一般的に認められる特徴を操作することにより、ポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質の産生を増大させることができる。例えば、肝臓で発現するｍＲＮＡの５’ＵＴＲ、例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポイエチン、または第ＶＩＩＩ因子の導入で、肝細胞系または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を増強することができる。同様に、筋肉（例えば、ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン）、内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ－１、ＣＤ３６）、骨髄系細胞（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ－１、ｉ－ＮＯＳ）、白血球（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）、及び肺上皮細胞（例えば、ＳＰ－Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）では、その他の組織特異的ｍＲＮＡからの５’ＵＴＲを用いて、その組織での発現を向上させることができる。
一部の実施形態では、ＵＴＲは、タンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する、転写物のファミリーから選択する。例えば、コードしたポリペプチドは、特定の細胞内、組織内または発達において、ある時期に発現する（すなわち、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在、起点、または発現パターンを共有する）タンパク質ファミリーに属することができる。遺伝子またはｍＲＮＡのいずれかに由来するＵＴＲを、同じ、または異なるファミリーのタンパク質のその他のあらゆるＵＴＲと交換して、新規のポリヌクレオチドを作成することができる。
一部の実施形態では、当該５’ＵＴＲ、及び３’ＵＴＲは異種とすることができる。一部の実施形態では、当該５’ＵＴＲは、３’ＵＴＲとは異なる種に由来することができる。一部の実施形態では、当該３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲとは異なる種に由来することができる。
共同所有の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２号（公開ＷＯ／２０１４／１６４２５３、その全内容を参照により本明細書で援用する）は、ＯＲＦに対する隣接領域として本発明のポリヌクレオチドで利用可能な例示的なＵＴＲのリストを提供している。
本出願の例示的なＵＴＲとして：グロビン、例えば、αまたはβグロビン（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ、マウス、ウサギ、またはヒトグロビン）；強力なコザック翻訳開始シグナル；ＣＹＢＡ（例えば、ヒトシトクロムｂ－２４５αポリペプチド）；アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）；ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７－β）脱水素酵素）；ウイルス（例えば、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶ即初期１（ＩＥ１））；肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス）；熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）；翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）；グルコース輸送体（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコース輸送体１））；アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）；ＧＡＰＤＨ；チューブリン；ヒストン；クエン酸サイクル酵素；トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰモチーフを欠くＴＯＰ遺伝子（オリゴピリミジン領域）の５’ＵＴＲ））；リボソーマルタンパク質Ｌａｒｇｅ ３２（Ｌ３２）；リボソーマルタンパク質（例えば、ｒｐｓ９などのヒトまたはマウスリボソーマルタンパク質）；ＡＴＰ合成酵素（例えば、ＡＴＰ５Ａ１またはミトコンドリアＨ＋－ＡＴＰ合成酵素のβサブユニット）；成長ホルモン（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））；伸長因子（例えば、伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１））；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）；筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）；β－Ｆ１－ＡＴＰアーゼ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；コラーゲン（例えば、コラーゲンＩ型、アルファ２（Ｃｏｌ１Ａ２）、コラーゲンＩ型、アルファ１（Ｃｏｌ１Ａ１）、コラーゲンＶＩ型、アルファ２（Ｃｏｌ６Ａ２）、コラーゲンＶＩ型、アルファ１（Ｃｏｌ６Ａ１））；リボフォリン（例えば、リボフォリンＩ（ＲＰＮＩ））、低密度リポタンパク質受容体関連のタンパク質（例えば、ＬＲＰ１）；カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）、カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）；プロコラーゲン－リシン；２－オキソグルタレート５－ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）；及びヌクレオビンジン（例えば、Ｎｕｃｂ１）の核酸配列に由来する１つ以上の５’ＵＴＲ、及び／または３’ＵＴＲがあるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、当該５’ＵＴＲは、β－グロビン５’ＵＴＲ；強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ；シトクロムｂ－２４５αポリペプチド（ＣＹＢＡ）５’ＵＴＲ；ヒドロキシステロイド（１７－β）脱水素酵素（ＨＳＤ１７Ｂ４）５’ＵＴＲ；タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ；ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）５’ＵＴＲ；非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレーム；デング熱ウイルス（ＤＥＮ）５’ＵＴＲ；ヒートショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）５’ＵＴＲ；ｅＩＦ４Ｇ５’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１５’ＵＴＲ；それらの機能性フラグメント、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する。
一部の実施形態では、当該３’ＵＴＲは、βグロビン３’ＵＴＲ；ＣＹＢＡ３’ＵＴＲ；アルブミン３’ＵＴＲ；成長ホルモン（ＧＨ）３’ＵＴＲ；ＶＥＥＶ３’ＵＴＲ；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）３’ＵＴＲ；α－グロビン３’ＵＴＲ；ＤＥＮ３’ＵＴＲ；ＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ－ＰＡＶ）３’ＵＴＲ；伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１）３’ＵＴＲ；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）３’ＵＴＲ；ミトコンドリアＨ（＋）－ＡＴＰ合成酵素（β－ｍＲＮＡ）３’ＵＴＲのβサブユニット；ＧＬＵＴ１ ３’ＵＴＲ；ＭＥＦ２Ａ ３’ＵＴＲ；β－Ｆ１－ＡＴＰアーゼ３’ＵＴＲ；それらの機能性フラグメント、及びそれらの組合せからなる群から選択する。
あらゆる遺伝子またはｍＲＮＡに由来する野生型ＵＴＲを、本発明のポリヌクレオチドに組み込むことができる。一部の実施形態では、ＵＴＲを、野生型もしくは天然のＵＴＲに対して変化させて、例えば、ＯＲＦに対するＵＴＲの配向または位置の変更により、あるいは、さらなるヌクレオチドの取り込み、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドのスワッピングもしくは転位により、バリアントＵＴＲを生成することができる。一部の実施形態では、５’もしくは３’ＵＴＲのバリアント、例えば、野生型ＵＴＲのバリアント、あるいは、１つ以上のヌクレオチドがＵＴＲの末端に付加されている、またはそのＵＴＲの末端から除去されているバリアントを利用することができる。
加えて、１つ以上の合成ＵＴＲを、１つ以上の非合成ＵＴＲと組み合わせて使用することができる。例えば、その全内容を参照により本明細書で援用する、Ｍａｎｄａｌ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ ８（３）：５６８－８２を参照されたい。
ＵＴＲまたはその一部を、その選択元となった転写物においてと同じ向きに配置することができ、または配向もしくは位置を変更することもできる。したがって、５’及び／または３’ＵＴＲを、反転、短縮、延長すること、または１つ以上のその他の５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲと併用することもできる。
一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ、例えば、二重、三重もしくは、四重５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。例えば、二重ＵＴＲは、直列、または実質的に直列のいずれかで、同じＵＴＲの２つのコピーを含む。例えば、二重ベータ－グロビン３’ＵＴＲを使用することができる（その全内容を参照により本明細書で援用する、ＵＳ２０１０／０１２９８７７を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示したＵＴＲのいずれかから選択する５’ＵＴＲ、及び／または３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは：
５’ＵＴＲ－００１（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号３）；
５’ＵＴＲ－００２（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＧＡＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号８９）；
５’ＵＴＲ－００３（上流ＵＴＲ）（ＷＯ２０１６／１００８１２を参照されたい）；
５’ＵＴＲ－００４（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＧＧＣＡＵＵＣＣＧＧＵＡＣＵＧＵＵＧＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９０）；
５’ＵＴＲ－００５（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＧＡＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９１）；
５’ＵＴＲ－００６（上流ＵＴＲ）（ＷＯ２０１６／１００８１２を参照されたい）；
５’ＵＴＲ－００７（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＧＧＣＡＵＵＣＣＧＧＵＡＣＵＧＵＵＧＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９２）；
５’ＵＴＲ－００８（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＵＵＡＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９３）；
５’ＵＴＲ－００９（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＵＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９４）；
５’ＵＴＲ－０１０、上流（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＵＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９５）；
５’ＵＴＲ－０１１（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９６）；
５’ＵＴＲ－０１２（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＵＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９７）；
５’ＵＴＲ－０１３（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９８）；
５’ＵＴＲ－０１４（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＵＡＧＡＧＡＧＵＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＡＧＵＡＧＡＡＵＵＡＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９９）；
５’ＵＴＲ－０１５（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号１００）；
５’ＵＴＲ－０１６（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＵＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号１０１）；
５’ＵＴＲ－０１７（上流ＵＴＲ）；または
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号１０２）；
５’ＵＴＲ－０１８（上流ＵＴＲ）５’ＵＴＲ
（ＵＣＡＡＧＣＵＵＵＵＧＧＡＣＣＣＵＣＧＵＡＣＡＧＡＡＧＣＵＡＡＵＡＣＧＡＣＵＣＡＣＵＡＵＡＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号８８）を含む。
一部の実施形態では、３’ＵＴＲは：
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０４）；

１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０５）；または

１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（Ｒ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０６）；

１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０７）；

１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０８）；

１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０９）；

１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１１０）；

３’ＵＴＲ－０１８（配列番号１５０を参照されたい）；

３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２及びｍｉＲ１２６結合部位バリアント１）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１１１）

３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２及びｍｉＲ１２６結合部位バリアント２）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１１２）；または

３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位バリアント３）
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１７６）、を含む。
ある特定の実施形態では、本発明の５’ＵＴＲ、及び／または３’ＵＴＲ配列は、配列番号３、８８～１０２、または１６５～１６７のいずれかを含む５’ＵＴＲ配列、及び／または配列番号１０４～１１２、１５０、１５１、または１７８のいずれかを含む３’ＵＴＲ配列、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、本発明の５’ＵＴＲ、及び／または３’ＵＴＲ配列は、配列番号３、配列番号３９、配列番号１９３、または配列番号１９４のいずれかを含む５’ＵＴＲ配列、及び／または配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１９５、または配列番号１９６のいずれかを含む３’ＵＴＲ配列、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、表４Ｂに記載のアミノ酸配列（配列番号３、配列番号３９、配列番号１９３、または配列番号１９４）を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、表４Ｂに記載のアミノ酸配列（配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１９５、または配列番号１９６）を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、表４Ｂに記載のアミノ酸配列（配列番号３、配列番号３９、配列番号１９３、または配列番号１９４）を含み、かつ、３’ＵＴＲは、表４Ｂに記載のアミノ酸配列（配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１９５、または配列番号１９６）を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、特徴の組合せを含むことができる。例えば、当該ＯＲＦは、ポリＡ尾部の鋳型付加のために、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ、及び／またはオリゴ（ｄＴ）配列を含む３’ＵＴＲに隣接することができる。５’ＵＴＲは、同じ、及び／または異なるＵＴＲに由来する、第１のポリヌクレオチドフラグメント、及び第２のポリヌクレオチドフラグメントを含むことができる（例えば、全内容を参照により本明細書で援用するＵＳ２０１０／０２９３６２５を参照されたい）。
その他の非ＵＴＲ配列は、本発明のポリヌクレオチド内部の領域またはサブ領域として使用することができる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部を、本発明のポリヌクレオチドに組み込むことができる。イントロン配列の組み込みで、タンパク質の産生、さらにはポリヌクレオチドの発現レベルを上昇させることができる。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりに、またはそれに加えて、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、全内容を参照により本明細書で援用するＹａｋｕｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０ ３９４（１）：１８９－１９３を参照されたい）。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、ＯＲＦ、及びウイルスカプシド配列を含む。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、合成５’ＵＴＲを、非合成３’ＵＴＲとの組合せで含む。
一部の実施形態では、当該ＵＴＲは、ポリヌクレオチドから産生するポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる核酸配列を指す、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳エンハンサーエレメント（複数可）（「ＴＥＥ」と総称する）も含むことができる。例として、ＴＥＥを、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置させることができるが、これに限定されない。一部の実施形態では、当該５’ＵＴＲは、ＴＥＥを含む。
一態様では、ＴＥＥは、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳などの核酸の翻訳活性を促すことができるＵＴＲ内の保存エレメントであるが、これに限定されない。
１１．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
本発明のポリヌクレオチドは、調節エレメント、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列、及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子の偽受容体として作用するように操作した人工結合部位、ならびに、それらの組合せを含むことができる。一部の実施形態では、そのような調節エレメントを含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むものと称する。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、かつ、さらに、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の取り込み、または組み込みにより、天然に生じるｍｉＲＮＡの組織特異的な発現、及び／または細胞型特異的な発現に基づいて、本発明のポリヌクレオチドを制御し、次いで、それからコードするポリペプチドを制御する。
本発明は、当該ポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物及び製剤も提供する。一部の実施形態では、当該組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
一部の実施形態では、当該組成物または製剤は、ポリペプチドをコードする本明細書に開示した配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを有することができる。一部の実施形態では、当該組成物または製剤は、ポリペプチドをコードする本明細書に開示した配列最適化核酸配列に対して顕著な配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を有することができる。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
ｍｉＲＮＡ、例えば、天然に生じるｍｉＲＮＡは、安定性を低下させる、またはポリヌクレオチドの翻訳を阻害することにより、ポリヌクレオチドに結合して遺伝子発現を下方制御する、１９～２５個のヌクレオチド長の非コードのＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの２～８位の領域の配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２～８位または２～７位を含むことができる。
マイクロＲＮＡは、プレｍｉＲＮＡ（前駆体ｍｉＲＮＡ）とよく称されている短いヘアピン構造を形成するように自身に折り畳まれたＲＮＡ転写物の領域から酵素的に誘発する。プレｍｉＲＮＡは、一般的に、その３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有し、３’ヒドロキシル基と５’ホスファート基とを有する。この前駆体ｍＲＮＡは、核内でプロセシングされ、続いて、細胞質に輸送され、ＤＩＣＥＲ（ＲＮアーゼＩＩＩ酵素）でさらに処理をされて、約２２個のヌクレオチドの成熟マイクロＲＮＡを形成する。次いで、成熟マイクロＲＮＡは、リボ核粒子に組み込まれて、遺伝子サイレンシングを媒介するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。成熟ｍｉＲＮＡについて当該技術分野において承認されている命名法は、一般的には、成熟ｍｉＲＮＡが由来するプレｍｉＲＮＡのアームを指定しており、「５ｐ」は、マイクロＲＮＡがプレｍｉＲＮＡヘアピンの５’アーム由来であることを意味しており、「３ｐ」は、マイクロＲＮＡがプレｍｉＲＮＡヘアピンの３’末端に由来することを意味している。本明細書において番号で指定するｍｉＲは、同じプレｍｉＲＮＡの反対のアーム（例えば、３ｐまたは５ｐマイクロＲＮＡのいずれか）に由来する２つの成熟マイクロＲＮＡのいずれかを指すことができる。本明細書において言及するすべてのｍｉＲは、特に、３ｐまたは５ｐの指定で特定されていない限りは、３ｐ及び５ｐアーム／配列の両方を含むことを意図している。
本明細書で使用する用語「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」とは、ｍｉＲＮＡと相互作用する、会合する、またはｍｉＲＮＡに結合するために十分なｍｉＲＮＡの全部もしくは一部の領域に対する相補性を有する、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む、例えば、ＤＮＡ内、もしくは、ＲＮＡ転写物内でのポリヌクレオチド内の配列のことを指す。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは目的のポリペプチドをコードするＯＲＦを含み、かつさらに、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。例示的な実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））の５’ＵＴＲ、及び／または３’ＵＴＲは、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介性調整、例えば、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介性翻訳の抑制または分解を促す上で相補性の度合いが十分である、ことを指す。本発明の例示的な態様では、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介分解、例えば、ｍｉＲＮＡガイド付きＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を媒介してｍＲＮＡの切断を促す上で、相補性の度合いが十分である、ことを指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９～２５個のヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列、１９～２３個のヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列、または２２個のヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を持つことができる。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部のみに対して、例えば、天然に生じるｍｉＲＮＡ配列の全長より１つ、２つ、３つ、または４つヌクレオチド少ない部分に対して、あるいは、天然に生じるｍｉＲＮＡ配列より１つ、２つ、３つ、または４つヌクレオチド短い部分に対して相補的とすることができる。所望の調節が、ｍＲＮＡの分解である場合、相補性が十分である、または完全である（例えば、天然に生じるｍｉＲＮＡの長さの全部、または有意な部分にわたって相補性が十分である、または完全である）ことが好ましい。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、１つ、２つ、もしくは、３つのヌクレオチド置換、末端付加、及び／または末端切断は除くが、ｍｉＲＮＡ配列との完全な相補性を有する。
一部の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと長さが同じである。その他の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、またはその両方で対応するｍｉＲＮＡよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは、１２ヌクレオチド（複数可）短い。さらにその他の実施形態では、当該マイクロＲＮＡ結合部位は、対応する５’末端、３’末端、またはその両方でマイクロＲＮＡよりも２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は、依然としてｍｉＲＮＡ結合部位のうちの１つ以上を組み込んだｍＲＮＡを分解することができる、またはｍＲＮＡの翻訳を妨げることができる。
一部の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ダイサーを含む活性ＲＩＳＣの一部である、対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位をＲＩＳＣでの対応するｍｉＲＮＡに結合することにより、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡを分解する、あるいは、ｍＲＮＡが翻訳することを防ぐ。一部の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体によりｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを分解する程度に、ｍｉＲＮＡに対する相補性が十分である。その他の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位の相補性が不完全なことに起因して、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体により、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドでの不安定性を誘発する。別の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位の相補性が不完全なことに起因して、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体により、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの転写を抑制する。
一部の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の不整合部（複数可）を有する。
一部の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１個の連続ヌクレオチドに対して相補的な、それぞれ、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１個の連続ヌクレオチドを有する。
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに操作することにより、該当するｍｉＲＮＡが利用可能な場合、そのポリヌクレオチドを分解または翻訳低下の標的とすることが可能となる。こうすることで、ポリヌクレオチドを送達する際に、オフターゲット効果を減少させることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、組織または細胞に送達することは意図していないが、最終的に上記した組織または細胞に帰結するものである場合、組織または細胞内に多く存在するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位を、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを操作することで、目的の遺伝子の発現を阻害することができる。したがって、一部の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のｍＲＮＡ内に組み込むことにより、核酸分子送達の際のオフターゲット作用の危険を低下し得る、及び／またはｍＲＮＡがコードするポリペプチドの発現の組織特異的制御が可能となり得る。なおもその他の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のｍＲＮＡ内に組み込むことにより、インビボでの核酸送達の際の免疫応答を調節することができる。さらなる実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のｍＲＮＡ内に組み込むことにより、本明細書に記載の脂質含有化合物、及び組成物の加速血クリアランス（ＡＢＣ）を調節することができる。
逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位を、天然に生じるポリヌクレオチド配列から除去することで、特定の組織におけるタンパク質の発現を増加させることができる。例えば、特定のｍｉＲＮＡ用の結合部位をポリヌクレオチドから除去することで、ｍｉＲＮＡを含む組織または細胞でのタンパク質の発現を改善することができる。
複数の組織における発現の調節は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、１つ以上の別個のｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去により達成することができる。発症及び／または疾患状態にある組織及び／または細胞でのｍｉＲＮＡ発現パターン及び／またはそのプロファイリングに基づいて、ｍｉＲＮＡ結合部位の除去または挿入の決定を行うことができる。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、及びそれらの発現パターンの同定、ならびに、生物学における役割が報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１０ １１：９４３－９４９；Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ａｎｄ Ｒａｏ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２ ２６：４０４－４１３（２０１１ Ｄｅｃ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；Ｂａｒｔｅｌ Ｃｅｌｌ ２００９ １３６：２１５－２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７ １２９：１４０１－１４１４；Ｇｅｎｔｎｅｒ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２ ８０：３９３－４０３；ならびに、前掲の論文でのすべての参照文献、これらそれぞれの文献の全内容を参照により本明細書で援用する）。
ｍｉＲＮＡが、ｍＲＮＡを調節することによりタンパク質の発現を調節することが公知である組織の例として、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄系細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－１ｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）があるが、これらに限定されない。
具体的には、ｍｉＲＮＡは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの免疫細胞（別名、造血細胞）（例えば、樹状細胞、及びマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などにおいて差次的に発現することが公知である。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、さらには遺伝子治療及び組織／器官移植後の望ましくない免疫応答に関与する。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、造血細胞（免疫細胞）の発達、増殖、分化、及びアポトーシスの局面の多くも調節する。例えば、ｍｉＲ－１４２、及びｍｉＲ－１４６は免疫細胞だけでのみ、特に、骨髄性樹状細胞で豊富に発現する。ポリヌクレオチドに対する免疫応答は、ｍｉＲ－１４２結合部位をポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに付加することで遮断することができ、組織及び細胞内での遺伝子導入の安定性向上を可能にすることが実証されている。ｍｉＲ－１４２は、抗原提示細胞内で外因性ポリヌクレオチドを効率的に分解し、形質導入細胞の細胞傷害性排除を抑制する（例えば、Ａｎｎｏｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２－５１６１；Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５－５９１；Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４－４１５２、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する）。
抗原媒介性免疫応答は、生物に進入する際に抗原提示細胞により処理され、抗原提示細胞の表面上に提示する、外来抗原が誘発する免疫応答を指すことができる。Ｔ細胞は、提示した抗原を認識して、抗原を発現する細胞の細胞傷害性排除を誘導することができる。本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲにｍｉＲ－１４２結合部位を導入し、ｍｉＲ－１４２媒介性分解を通じて抗原提示細胞での遺伝子発現を選択的に抑制することにより、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）内での抗原提示を制限し、それにより、ポリヌクレオチドを送達した後の抗原媒介性免疫応答を防ぐことができる。次いで、ポリヌクレオチドは、細胞傷害性排除を誘発することなく、標的組織または細胞で安定に発現する。
一実施形態では、免疫細胞、特に、抗原提示細胞で発現することが公知であるｍｉＲＮＡのための結合部位で、本発明のポリヌクレオチドを操作することで、ｍｉＲＮＡ介在性ＲＮＡの分解による抗原提示細胞でのポリヌクレオチドの発現を抑制し、抗原媒介性免疫応答を抑制することができる。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが発現しない非免疫細胞では、ポリヌクレオチドの発現を維持する。例えば、一部の実施形態では、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性反応を防ぐために、あらゆるｍｉＲ－１２２結合部位を除去し、ｍｉＲ－１４２（及び／またはｍｉｒＲ－１４６）結合部位で、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを操作することができる。
ＡＰＣ、及びマクロファージでの選択的な分解及び抑制をさらに駆動するために、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ内に、さらなる負の調節エレメントを、単独で、またはｍｉＲ－１４２及び／またはｍｉＲ－１４６結合部位と組み合わせて含むことができる。例として、さらなる負の調節エレメントは、構成的減衰エレメント（ＣＤＥ）であるが、これに限定されない。
免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡとして、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｈｓａ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１１８４、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－ｌ－－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－－２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７９、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４７ａ、ｍｉＲ－１４７ｂ、ｍｉＲ－１４８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ｂ、ｍｉＲ－１５５－３ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１６－１－３ｐ、ｍｉＲ－１６－２－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｍｉＲ－１９７－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｍｉＲ－２２３－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｍｉＲ－２８－５ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３３１－５ｐ、ｍｉＲ－３３９－３ｐ、ｍｉＲ－３３９－５ｐ、ｍｉＲ－３４５－３ｐ、ｍｉＲ－３４５－５ｐ、ｍｉＲ－３４６、ｍｉＲ－３４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７２、ｍｉＲ－３７７－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、ｍｉＲ－５４２、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｊ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５９８、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－９３５、ｍｉＲ－９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９９ｂ－５ｐがあるが、これらに限定されない。さらに、マイクロアレイハイブリダイゼーション、及びミクロトーム分析により、免疫細胞での新規のｍｉＲＮＡを同定することができる（例えば、Ｊｉｍａ ＤＤ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８－ｅ１２７、Ｖａｚ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する）。
肝臓で発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１０７、ｍｉＲ－１２２－３ｐ、ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｍｉＲ－１２２８－３ｐ、ｍｉＲ－１２２８－５ｐ、ｍｉＲ－１２４９、ｍｉＲ－１２９－５ｐ、ｍｉＲ－１３０３、ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５２、ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－５５７、ｍｉＲ－５８１、ｍｉＲ－９３９－３ｐ、及びｍｉＲ－９３９－５ｐがあるが、これらに限定されない。肝臓特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入する、またはそのポリヌクレオチドから除去すると、肝臓でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。肝臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を単独で、または本発明のポリヌクレオチドでの免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて、操作することもできる。
肺で発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－１２７－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１３４、ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－３２－３ｐ、ｍｉＲ－３３７－３ｐ、ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｍｉＲ－３８１－３ｐ、及びｍｉＲ－３８１－５ｐがあるが、これらに限定されない。肺特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入する、または除去することにより、肺でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。肺特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を単独で操作すること、または本発明のポリヌクレオチドでの免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて、組み込むこともできる。
心臓で発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｍｉＲ－１８６－３ｐ、ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－３２０、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－４５１ｂ、ｍｉＲ－４９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－４９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－７４４－３ｐ、ｍｉＲ－７４４－５ｐ、ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９２ｂ－５ｐがあるが、これらに限定されない。心臓特異的マイクロＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入する、または除去することで、心臓でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。心臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を単独で、または本発明のポリヌクレオチドでの免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて、操作することもできる。
神経系で発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１２４－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７１－３ｐ、ｍｉＲ－１２７１－５ｐ、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｍｉＲ－１５３、ｍｉＲ－１８１ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－３ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ａ、ｍｉＲ－１９０ｂ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－２－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３２９、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｍｉＲ－３６６５、ｍｉＲ－３６６６、ｍｉＲ－３８０－３ｐ、ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｍｉＲ－３８３、ｍｉＲ－４１０、ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｍｉＲ－４２５－５ｐ、ｍｉＲ－４５４－３ｐ、ｍｉＲ－４５４－５ｐ、ｍｉＲ－４８３、ｍｉＲ－５１０、ｍｉＲ－５１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－７－１－３ｐ、ｍｉＲ－７－２－３ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０２、ｍｉＲ－９２２、ｍｉＲ－９－３ｐ、及びｍｉＲ－９－５ｐがあるが、これらに限定されない。さらに、神経系内で豊富なｍｉＲＮＡには、ニューロンで特異的に発現するものとして、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１４８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、ｍｉＲ－３２０ｂ、ｍｉＲ－３２０ｅ、ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３２５、ｍｉＲ－３２６、ｍｉＲ－３２８、ｍｉＲ－９２２があるが、これらに限定されず、また、神経膠細胞で特異的に発現するものとして、ｍｉＲ－１２５０、ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０６５－３ｐ、ｍｉＲ－３０６５－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－３３８－５ｐ、及びｍｉＲ－６５７があるが、これらに限定されない。ＣＮＳ特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入する、またはそのポリヌクレオチドから除去することによって、神経系でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。神経系特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を単独で、または本発明のポリヌクレオチドでの免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて、操作することもできる。
膵臓で発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１０５－３ｐ、ｍｉＲ－１０５－５ｐ、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－７－１－３ｐ、ｍｉＲ－７－２－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、及びｍｉＲ－９４４があるが、これらに限定されない。膵臓特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチド内に導入する、またはそのポリヌクレオチドから除去することで、膵臓におけるポリヌクレオチドの発現を調節することができる。膵臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を単独で、または本発明のポリヌクレオチドでの免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて、操作することもできる。
腎臓で発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１２２－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－３ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ、ｍｉＲ－２０４－５ｐ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－２－３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｍｉＲ－３３５－３ｐ、ｍｉＲ－３３５－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、及びｍｉＲ－５６２があるが、これらに限定されない。腎臓特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチド内に導入する、またはそのポリヌクレオチドから除去することで、腎臓でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。腎臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を単独で、または本発明のポリヌクレオチドでの免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて、操作することもできる。
筋肉で発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１２８６、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４５－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１８８－３ｐ、ｍｉＲ－１８８－５ｐ、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、及びｍｉＲ－２５－５ｐがあるが、これらに限定されない。筋肉特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチド内に導入する、またはそのポリヌクレオチドから除去することで、筋肉でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。筋肉特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を単独で、または本発明のポリヌクレオチドでの免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて、操作することもできる。
ｍｉＲＮＡは、様々な種類の細胞でも差次的に発現し、同細胞として、例えば、内皮細胞、上皮細胞、及び脂肪細胞などがあるが、これらに限定されない。
内皮細胞で発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１００－３ｐ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｍｉＲ－１０１－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２３６－３ｐ、ｍｉＲ－１２３６－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｍｉＲ－２２２－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６１－５ｐ、ｍｉＲ－４２１、ｍｉＲ－４２４－３ｐ、ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９２ｂ－５ｐがあるが、これらに限定されない。ディープシーケンシング分析により、新規ｍｉＲＮＡの多くが内皮細胞で発見されている（例えば、その全内容を参照により本明細書で援用するＶｏｅｌｌｅｎｋｌｅ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，２０１２，１８，４７２－４８４）。内皮細胞特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチド内に導入する、またはそのポリヌクレオチドから除去することにより、内皮細胞でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。
上皮細胞で発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、呼吸繊毛上皮細胞において特異的なｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－４２９、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－４５１ｂ、ｍｉＲ－４９４、ｍｉＲ－８０２及びｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－３４ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－４４９ａ、ｍｉＲ－４４９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－４４９ｂ－５ｐ、肺上皮細胞において特異的なｌｅｔ－７ファミリー、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１２６、腎上皮細胞において特異的なｍｉＲ－３８２－３ｐ、ｍｉＲ－３８２－５ｐ、ならびに、角膜上皮細胞において特異的なｍｉＲ－７６２があるが、これらに限定されない。上皮細胞に特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入する、またはそのポリヌクレオチドから除去することにより、上皮細胞でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。
加えて、巨大なｍｉＲＮＡ群が胚性幹細胞内に豊富にあり、幹細胞の自己再生を制御すると共に、神経細胞、心臓、造血細胞、皮膚細胞、骨形成細胞、及び筋肉細胞などの様々な細胞系統の発達及び／または分化を制御している（例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ ＫＴ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２０１３，１３（５），７５７－７６４；Ｖｉｄｉｇａｌ ＪＡ ａｎｄ Ｖｅｎｔｕｒａ Ａ，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２０１２，２２（５－６），４２８－４３６；Ｇｏｆｆ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｍｏｒｉｎ ＲＤ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０－６２１；Ｙｏｏ ＪＫ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１２，２１（１１），２０４９－２０５７、これらのそれぞれの全内容を参照により本明細書で援用する）。胚性幹細胞に豊富なｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｌｅｔ－ａ－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ７ｄ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－１２７５、ｍｉＲ－１３８－１－３ｐ、ｍｉＲ－１３８－２－３ｐ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－１５４－３ｐ、ｍｉＲ－１５４－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－２９０、ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｄ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｅ、ｍｉＲ－３６７－３ｐ、ｍｉＲ－３６７－５ｐ、ｍｉＲ－３６９－３ｐ、ｍｉＲ－３６９－５ｐ、ｍｉＲ－３７０、ｍｉＲ－３７１、ｍｉＲ－３７３、ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｍｉＲ－４２３－３ｐ、ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｍｉＲ－５２０ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｅ、ｍｉＲ－５４８ｆ、ｍｉＲ－５４８ｇ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｋ、ｍｉＲ－５４８１、ｍｉＲ－５４８ｍ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５４８ｏ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｐ、ｍｉＲ－６６４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６６４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－６６４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－６６４ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－７６６－３ｐ、ｍｉＲ－７６６－５ｐ、ｍｉＲ－８８５－３ｐ、ｍｉＲ－８８５－５ｐ，ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｍｉＲ－９４１，ｍｉＲ－９６－３ｐ、ｍｉＲ－９６－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９９ｂ－５ｐがあるが、これらに限定されない。予測した新規のｍｉＲＮＡの多くは、ヒト胚性幹細胞におけるディープシークエンシングにより発見されている（例えば、Ｍｏｒｉｎ ＲＤ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０－６２１；Ｇｏｆｆ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｂａｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，２００８，２６，２４９６－２５０５；これらのそれぞれの全内容を参照により本明細書で援用する）。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、造血系統の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、ならびに、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８を発現する、及び／または内皮細胞及び血小板などのサイトカインを分泌できることが公知である細胞における発現及び存在量に基づいて選択する。したがって一部の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡセットは、これらの細胞の免疫原性の一部を担い得るｍｉＲを含み、そのため、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）内に対応するｍｉＲ部位の組み込みは、特異的細胞型におけるｍＲＮＡの不安定化、及び／またはこれらのｍＲＮＡからの翻訳の抑制につながり得る。代表例として、造血細胞の多くで特異的であるｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、及びｍｉＲ－２２３、Ｂ細胞で発現するｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６、及びｍｉＲ－２２３、前駆造血細胞で発現するｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１６、ならびに、形質細胞様樹状細胞、血小板、及び内皮細胞で発現するｍｉＲ－１２６があるが、これらに限定されない。ｍｉＲの組織発現に関するさらなる考察については、例えば、Ｔｅｒｕｅｌ－Ｍｏｎｔｏｙａ、Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅｌ０２２５９；Ｌａｎｄｇｒａｆ、Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ １２９：１４０１－１４１４；Ｂｉｓｓｅｌｓ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．（２００９）ＲＮＡ １５：２３７５－２３８４を参照されたい。３’ＵＴＲ、及び／または５’ＵＴＲでのいずれか１つのｍｉＲ部位（例えば、Ｂ細胞、及び樹状細胞の両方において多く存在するｍｉＲ－１４２）を組み込むことで、目的の複数の細胞型においてそのような効果を媒介し得る。
一部の実施形態では、複数のｍｉＲを有する同じ細胞型を標的とすること、ならびに、３ｐアーム及び５ｐアームの両方が多く存在する（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、及びｍｉＲ１４２－５ｐの両方が造血幹細胞内に多く存在する）場合、それら両方の各々に対し結合部位を組み込むことが有益とされ得る。したがって、ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは：（ｉ）ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、及びｍｉＲ－２２３（多くの造血細胞で発現するもの）からなる群；あるいは、（ｉｉ）ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６、及びｍｉＲ－２２３（Ｂ細胞で発現するもの）からなる群；あるいは、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１６（前駆造血細胞で発現するもの）からなる群からの２つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれより多く）のｍｉＲ結合部位を含む。
一部の実施形態では、様々なｍｉＲを組み合わせることにより、目的の複数の細胞型を同時に標的とする（例えば、造血系統、及び内皮細胞での多くの細胞を標的とするためにはｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１２６）ことも有益であり得る。したがって、例えば、ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、２つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれより多く）のｍｉＲＮＡ結合部位を含み、その際：（ｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは造血系統の細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、もしくは、ｍｉＲ－２２３）を標的とし、かつ、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは形質細胞様樹状細胞、血小板、または内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）を標的とする；または（ｉｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つはＢ細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６、もしくは、ｍｉＲ－２２３）を標的とし、かつ、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは形質細胞様樹状細胞、血小板、もしくは、内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）を標的とする；または（ｉｉｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは前駆造血細胞（例えば、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａ、もしくは、ｍｉＲ－１６）を標的とし、かつ、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは形質細胞様樹状細胞、血小板、もしくは、内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）を標的とする；または（ｉｖ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは造血系統の細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、もしくは、ｍｉＲ－２２３）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つはＢ細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６、もしくは、ｍｉＲ－２２３）を標的とし、かつ、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは形質細胞様樹状細胞、血小板、または内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）を標的とする、あるいは、当該４つのクラスのｍｉＲ結合部位のその他のあらゆる可能な組合せ（すなわち、造血系統を標的とするもの、Ｂ細胞を標的とするもの、前駆造血細胞を標的とするもの、及び／または形質細胞様樹状細胞／血小板／内皮細胞を標的とするもの）を含む。
一実施形態では、免疫応答を調節するために、本発明のポリヌクレオチドは、従来の免疫細胞、またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、かつ、炎症誘発性サイトカイン、及び／またはケモカインを分泌するあらゆる細胞（例えば、末梢リンパ器官、及び／または脾細胞、及び／または内皮細胞の免疫細胞）で発現する１つ以上のｍｉＲに結合する１つ以上のｍｉＲＮＡ結合配列を含むことができる。従来の免疫細胞、またはＴＬＲ７及びＴＬＲ８を発現し、かつ、炎症誘発性サイトカイン、及び／またはケモカインを分泌するあらゆる細胞（例えば、末梢リンパ器官の免疫細胞、及び／または脾細胞、及び／または内皮細胞）で発現する１つ以上のｍｉＲを、ｍＲＮＡに組み込むことにより、免疫細胞活性化（例えば、活性化Ｂ細胞の頻度により測定するようなＢ細胞活性化）、及び／またはサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、及び／またはＴＮＦαの産生）が減少する、または阻害することが、昨今になって発見されている。さらに昨今では、従来の免疫細胞、またはＴＬＲ７及びＴＬＲ８を発現し、かつ、炎症誘発性サイトカイン、及び／またはケモカインを分泌するあらゆる細胞（例えば、末梢リンパ器官の免疫細胞、及び／または脾細胞、及び／または内皮細胞）で発現する１つ以上のｍｉＲを、ｍＲＮＡに組み込むことにより、ｍＲＮＡがコードする目的のタンパク質に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を減少させる、または阻害することができることが発見されている。
別の実施形態では、脂質含有化合物または組成物で送達するポリヌクレオチドに対する加速血液クリアランスを調節するために、本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上のｍｉＲＮＡに結合する１つ以上のｍｉＲ結合配列を含むことができ、そのｍｉＲ結合配列は、従来の免疫細胞、またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、かつ、炎症誘発性サイトカイン、及び／またはケモカインを分泌するあらゆる細胞（例えば、末梢リンパ器官の免疫細胞、及び／または脾細胞、及び／または内皮細胞）で発現するものである。昨今では、１つ以上のｍｉＲ結合部位をｍＲＮＡ内に組み込むことにより、ｍＲＮＡを送達する際に使用する脂質含有化合物または組成物に対する加速血液クリアランス（ＡＢＣ）が減少する、または阻害することが発見されている。さらに昨今では、１つ以上のｍｉＲ結合部位をｍＲＮＡに組み込むことにより、抗ＰＥＧ抗ＩｇＭの血清レベルが低下し（例えば、Ｂ細胞によるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭの急性産生が減少する、または阻害する）、及び／または脂質含有化合物またはｍＲＮＡを含む組成物を投与した後に形質細胞様樹状細胞の増殖及び／または活性化が減少する、または阻害することが発見されている。
一部の実施形態では、ｍｉＲ配列を、免疫細胞で発現するあらゆる公知のマイクロＲＮＡに対応し得て、このｍｉＲ配列として、その全内容を参照により本明細書で援用する米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号、及び米国特許出願公開ＵＳ２００５／００５９００５号で教示されているが、これらに限定されない。免疫細胞で発現するｍｉＲの例として、脾臓細胞、骨髄系細胞、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び／またはマクロファージで発現するｍｉＲがあるが、これらに限定されない。例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、及びｍｉＲ－２７は骨髄系細胞で発現し、ｍｉＲ－１５５は、樹状細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞で発現し、ｍｉＲ－１４６は、ＴＬＲを刺激した際にマクロファージで上方制御され、ｍｉＲ－１２６は、形質細胞様樹状細胞で発現する。ある特定の実施形態では、当該ｍｉＲ（複数可）は、免疫細胞において豊富に、または優先的に発現する。例えば、ｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、及び／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ）、ｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐ、及び／またはｍｉＲ－１２６－５ｐ）、ｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐ、及び／またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、ならびに、ｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐ、及び／またはｍｉＲ１５５－５ｐ）は、免疫細胞において豊富に発現する。これらのマイクロＲＮＡ配列は、当該技術分野で公知であり、したがって、当業者であれば、これらのマイクロＲＮＡがワトソン－クリック相補性に基づいて結合する、結合配列または標的配列を容易に設計することができる。
したがって、様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、及びｍｉＲ－２７からなる群から選択するｍｉＲの少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態では、当該ｍＲＮＡは、免疫細胞で発現するマイクロＲＮＡに対して、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含む。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現するマイクロＲＮＡのための１つ～４つ（１、２、３、または４つ）のｍｉＲ結合部位を含む。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つのｍｉＲ結合部位を含む。これらのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、及びそれらの組合せからなる群から選択するマイクロＲＮＡに対応することができる。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現する同じｍｉＲ結合部位の２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ）のコピー、例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７からなるｍｉＲの群から選択するｍｉＲ結合部位の２つ以上のコピーを含む。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同じｍｉＲ結合部位の３つのコピーを含む。ある特定の実施形態では、同じｍｉＲ結合部位のコピーを３つ使用すれば、単一のｍｉＲ結合部位の使用と比較して有益な特性を示すことができる。３つのｍｉＲ結合部位を含む３’ＵＴＲの配列の例として、配列番号１５５（３つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）、及び配列番号１５７（３つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位）があるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現する少なくとも２つの異なるｍｉＲ結合部位２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ）のコピーを含む。２つ以上の異なるｍｉＲ結合部位を含む３’ＵＴＲ配列の例として、配列番号１５２（１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、及び１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位）、配列番号１５８（２つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、及び１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）、及び配列番号１６１（２つのｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位、及び１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）があるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、その際、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ－１４２－３ｐのためのものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、及びｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐ、またはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３、またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１４２－３ｐ、及びｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐ、またはｍｉＲ－１２６－５ｐ）のための結合部位を含む。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、その際、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ－１２６－３ｐのためのものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、及びｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐ、またはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐ、またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１２６－３ｐ、及びｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、またはｍｉＲ－１４２－５ｐ）のための結合部位を含む。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、その際、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ－１４２－５ｐのためのものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、及びｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐ、またはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３、またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１４２－５ｐ、及びｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐ、またはｍｉＲ－１２６－５ｐ）のための結合部位を含む。
なおも別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、その際、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ－１５５－５ｐのためのものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、及びｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、またはｍｉＲ－１４２－５ｐ）、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３、またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１５５－５ｐ、及びｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐ、またはｍｉＲ－１２６－５ｐ）のための結合部位を含む。
ｍｉＲＮＡは、血管新生（例えば、ｍｉＲ－１３２）のような複雑な生物学的過程を調節することもできる（Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６）。本発明のポリヌクレオチドにおいて、ポリヌクレオチドの発現を生物学的に関連する細胞型、または関連する生物学的プロセスに合わせてカスタマイズするために、そのようなプロセスに関与するｍｉＲＮＡ結合部位を除去または導入することができる。これに関連して、本発明のポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドと定義する。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、その際、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ結合部位配列のいずれか１つ以上の１つ以上のコピーを含む表３から選択する１つ以上のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはさらに、表３から選択する少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれより多くの同じ、または異なるｍｉＲＮＡ結合部位を、それらのあらゆる組合せを含めて、含む。
一部の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２に結合する、またはｍｉＲ－１４２に対して相補的である。一部の実施形態では、当該ｍｉＲ－１４２は、配列番号１１４を含む。一部の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、またはｍｉＲ－１４２－５ｐに結合する。一部の実施形態では、当該ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位は、配列番号１１６を含む。一部の実施形態では、当該ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位は、配列番号１１８を含む。一部の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号１１６または配列番号１１８と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは、１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６に結合する、またはｍｉＲ－１２６に対して相補的である。一部の実施形態では、当該ｍｉＲ－１２６は、配列番号１１９を含む。一部の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、またはｍｉＲ－１２６－５ｐに結合する。一部の実施形態では、当該ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位は、配列番号１２１を含む。一部の実施形態では、当該ｍｉＲ－１２６－５ｐ結合部位は、配列番号１２３を含む。一部の実施形態では、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号１２１または配列番号１２３と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、当該３’ＵＴＲは、２つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、その際、第１のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２に結合し、第２のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６に結合する。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１４２、及びｍｉＲ－１２６に結合する３’ＵＴＲは、配列番号１６３の配列を含むか、この配列からなるか、または本質的にこの配列からなる。
表３．ｍｉＲ－ｌ４２、ｍｉＲ－ｌ２６、及びｍｉＲ－ｌ４２、及びｍｉＲ－ｌ２６結合部位

Figure 2025028860000004


一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位を、ポリヌクレオチドのあらゆる位置（例えば、５’ＵＴＲ、及び／または３’ＵＴＲ）で、本発明のポリヌクレオチドに挿入する。一部の実施形態では、当該５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、当該３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、当該５’ＵＴＲ、及び３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。当該ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入が、対応するｍｉＲＮＡの非存在下で機能性ポリペプチドの翻訳を妨げず；及びｍｉＲＮＡの存在下では、ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入と、ｍｉＲＮＡ結合部位の対応するｍｉＲＮＡへの結合とが、ポリヌクレオチドを劣化させる、またはポリヌクレオチドの翻訳を妨げることが可能である限りは、ポリヌクレオチド内の挿入は、ポリヌクレオチド内のいずれの部位でも行うことができる。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチドでのＯＲＦの終止コドンから少なくとも約３０ヌクレオチド下流に挿入する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドでのＯＲＦの終止コドンから少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド下流に挿入する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドでのＯＲＦの終止コドンから約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約６５ヌクレオチド下流に挿入する。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡでのコード領域の終止コドンの直後にある３’ＵＴＲに挿入する。一部の実施形態では、コンストラクト内に終止コドンのコピーが複数存在する場合、ｍｉＲＮＡ結合部位は、最後の終止コドンの直後に挿入する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、終止コドンのさらに下流に挿入され、その場合、終止コドンとｍｉＲ結合部位との間に３’ＵＴＲ塩基が存在する。一部の実施形態では、３’ＵＴＲでのｍｉＲのための可能な挿入部位の３つの例として、配列番号１６２、１６３、及び１６４があるが、これらに限定されるものではなく、それらは、それぞれ３’ＵＴＲでの３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つに、ｍｉＲ－１４２－３ｐ部位が挿入した３’ＵＴＲ配列を示す。
一部の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位は、５’ＵＴＲでの１つ以上の可能な挿入部位に位置させることができる。例えば、５’ＵＴＲでのｍｉＲのための可能な挿入部位の３つの例として、配列番号１６５、１６６、または１６７があるが、これらに限定されるものではなく、それらは、それぞれ５’ＵＴＲで３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つに、ｍｉＲ－１４２－３ｐ部位が挿入した５’ＵＴＲ配列を示す。
一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは終止コドンを含み、かつ、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンの後の３’ＵＴＲ１～１００ヌクレオチド以内に位置する。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは終止コドンを含み、かつ、免疫細胞で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンの後の３’ＵＴＲの３０～５０ヌクレオチド以内に位置する。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは終止コドンを含み、かつ、免疫細胞で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンの後の３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチド以内に位置する。その他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは終止コドンを含み、かつ、免疫細胞で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンの直後の３’ＵＴＲにおいて、終止コドンの後の３’ＵＴＲの１５～２０ヌクレオチド以内、または終止コドンの後の３’ＵＴＲの７０～８０ヌクレオチド以内に位置する。その他の実施形態では、３’ＵＴＲは、２つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２～４個のｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、それぞれのｍｉＲＮＡ結合部位間にスペーサ領域（例えば、１０～１００、２０～７０、または３０～５０ヌクレオチド長）が存在することができる。別の実施形態では、当該３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の末端と、ポリＡ尾部ヌクレオチドとの間にスペーサ領域を含む。例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の末端と、ポリＡ尾部の開始部との間には、１０～１００ヌクレオチド長、２０～７０ヌクレオチド長、または３０～５０ヌクレオチド長のスペーサ領域が存在することができる。
一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは開始コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンより１～１００ヌクレオチド前（上流）の５’ＵＴＲ内に位置する。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは開始コドンを含み、免疫細胞で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンより１０～５０ヌクレオチド前（上流）の５’ＵＴＲに位置する。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは開始コドンを含み、免疫細胞で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンより少なくとも２５ヌクレオチド前（上流）の５’ＵＴＲ内に位置する。その他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは開始コドンを含み、免疫細胞で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンの直前の５’ＵＴＲに、または開始コドンより１５～２０ヌクレオチド前の５’ＵＴＲに、または開始コドンより７０～８０ヌクレオチド前の５’ＵＴＲに位置する。その他の実施形態では、５’ＵＴＲは、２つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２～４個のｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、その際、それぞれのｍｉＲＮＡ結合部位間にスペーサ領域（例えば、１０～１００、２０～７０、または３０～５０ヌクレオチド長）が存在することができる。
一実施形態では、当該３’ＵＴＲは、２つ以上の終止コドンを含み、その際、終止コドンの下流には少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位が位置する。例えば、３’ＵＴＲは、１つ、２つ、または３つの終止コドンを含むことができる。使用することができる三連終止コドンの例として、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧ（配列番号１２４）、ＵＧＡＵＡＧＵＡＡ（配列番号１２５）、ＵＡＡＵＧＡＵＡＧ（配列番号１２６）、ＵＧＡＵＡＡＵＡＡ（配列番号１２７）、ＵＧＡＵＡＧＵＡＧ（配列番号１２８）、ＵＡＡＵＧＡＵＧＡ（配列番号１２９）、ＵＡＡＵＡＧＵＡＧ（配列番号１３０）、ＵＧＡＵＧＡＵＧＡ（配列番号１３１）、ＵＡＡＵＡＡＵＡＡ（配列番号１３２）、及びＵＡＧＵＡＧＵＡＧ（配列番号１３３）があるが、これらに限定されない。３’ＵＴＲ内部では、例えば、１つ、２つ、３つ、もしくは、４つのｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位は、終止コドン（複数可）に直接隣接して、または最後の終止コドンからあらゆる数のヌクレオチド下流に位置し得る。３’ＵＴＲは、複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含み、これらの結合部位は、コンストラクト内で互いに隣接して（すなわち、順番に）配置することができ、あるいは、別法では、スペーサヌクレオチドを、それぞれの結合部位の間に配置することができる。
一実施形態では、当該３’ＵＴＲは、第３の終止コドンより下流に位置する単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を有する３つの終止コドンを含む。３つの終止コドン、及び最後の終止コドンより下流の異なる位置に位置する単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を有する３’ＵＴＲ配列の例を、配列番号１５１、１６２、１６３、及び１６４に示すが、これらに限定されない。
表４Ａ．５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ｍｉＲ配列、及びｍｉＲ結合部位

Figure 2025028860000005



Figure 2025028860000006



Figure 2025028860000007



Figure 2025028860000008



Figure 2025028860000009



Figure 2025028860000010



終止コドン＝太字
ｍｉＲｌ４２－３ｐ結合部位＝下線
ｍｉＲｌ２６－３ｐ結合部位＝太字の下線
ｍｉＲｌ５５－５ｐ結合部位＝イタリック体
ｍｉＲｌ４２－５ｐ結合部位＝イタリック体で太字の下線

表４Ｂ．例示的な好ましいＵＴＲ



Figure 2025028860000012


一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞で発現したｍｉＲのための少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、及び結合ヌクレオシドの３’尾部領域を含む。様々な実施形態では、３’ＵＴＲは、免疫細胞で発現したｍｉＲ、好ましくは、免疫細胞で豊富に、または優先的に発現したｍｉＲのためのｍｉＲＮＡ結合部位を１つ～４つ、少なくとも２つ、１つ、２つ、３つ、または４つ含む。
一実施形態では、免疫細胞で発現する少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号１１６に示す配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号１３４に示す配列を含む。
一実施形態では、免疫細胞で発現する少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ－１２６結合部位は、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ－１２６－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号１２１に示す配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ－１２６－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含む本発明のｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号１４９に示す配列を含む。
本開示のマイクロＲＮＡ結合部位（複数可）に結合することができるｍｉＲの例示的な配列として：ｍｉＲ－１４２－３ｐ（配列番号１１５）、ｍｉＲ－１４２－５ｐ（配列番号１１７）、ｍｉＲ－１４６－３ｐ（配列番号１３５）、ｍｉＲ－１４６－５ｐ（配列番号１３６）、ｍｉＲ－１５５－３ｐ（配列番号１３７）、ｍｉＲ－１５５－５ｐ（配列番号１３８）、ｍｉＲ－１２６－３ｐ（配列番号１２０）、ｍｉＲ－１２６－５ｐ（配列番号１２２）、ｍｉＲ－１６－３ｐ（配列番号１３９）、ｍｉＲ－１６－５ｐ（配列番号１４０）、ｍｉＲ－２１－３ｐ（配列番号１４１）、ｍｉＲ－２１－５ｐ（配列番号１４２）、ｍｉＲ－２２３－３ｐ（配列番号１４３）、ｍｉＲ－２２３－５ｐ（配列番号１４４）、ｍｉＲ－２４－３ｐ（配列番号１４５）、ｍｉＲ－２４－５ｐ（配列番号１４６）、ｍｉＲ－２７－３ｐ（配列番号１４７）、及びｍｉＲ－２７－５ｐ（配列番号１４８）があるが、これらに限定されない。免疫細胞で発現するその他の適切なｍｉＲ配列（例えば、免疫細胞内に豊富に、または優先的に発現する）は、当該技術分野において、例えば、マンチェスター大学のマイクロＲＮＡデータベース、ｍｉＲＢａｓｅで公知であり、また、利用可能である。上記したｍｉＲのいずれかと結合する部位は、ｍｉＲに対するワトソン－クリック相補性、一般的には、ｍｉＲに対する１００％相補性に基づいて設計され、本明細書に記載したとおりに、本開示のｍＲＮＡコンストラクトに挿入することができる。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、及びｍＲＮＡ、例えば、その３’ＵＴＲ）は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができ、それにより、例えば、ＩｇＭの産生を減少させる、または阻害することにより、例えば、Ｂ細胞による、ＰＥＧに対する加速血液クリアランスを減少させる、または阻害する、及び／またはｐＤＣの増殖及び／または活性化を減少させる、または阻害することができ、目的のコードしたタンパク質の組織発現を調節するための、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができる。
ｍｉＲＮＡ遺伝子調節は、限定をするものではないが、周囲の配列の種、配列の型（異種、相同、外因性、内在性、もしくは、人工）、周囲の配列内の調節エレメント、及び／または周囲の配列内の構造エレメントなど、ｍｉＲＮＡを囲繞する配列による影響を受けることができる。ｍｉＲＮＡは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲによる影響を受けることができる。例として、限定をするものではないが、非ヒト３’ＵＴＲは、同じ配列型のヒト３’ＵＴＲと比較して、ｍｉＲＮＡ配列が目的のポリペプチドの発現に対して及ぼす調節効果を増大させることができる。
一実施形態では、５’ＵＴＲのその他の調節エレメント、及び／または構造エレメントは、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子調節に影響を及ぼすことができる。制御エレメント及び／または構造エレメントの一例は、５’ＵＴＲでの構造化ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）であり、これは、タンパク質翻訳を開始するに当たって、翻訳伸長因子の結合に必要である。５’ＵＴＲでのこの二次構造エレメントに対するＥＩＦ４Ａ２の結合は、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子の発現に必要である（その全内容を参照により本明細書で援用するＭｅｉｊｅｒ ＨＡ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４０，８２－８５）。マイクロＲＮＡ媒介性遺伝子調節を増強するために、本発明のポリヌクレオチドは、この構造化５’ＵＴＲをさらに含むことができる。
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作することができる。これに関連して、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、またはそれより多くのｍｉＲＮＡ結合部位で、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲを操作することができる。例えば、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、２つ、または１つのｍｉＲＮＡ結合部位で、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲを操作することができる。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれたｍｉＲＮＡ結合部位は、同じ、または異なるｍｉＲＮＡ部位とすることができる。本発明のポリヌクレオチドに組み込まれた種々のｍｉＲＮＡ結合部位の組合せには、異なるｍｉＲＮＡ部位のいずれかの、２つ以上のコピーが組み込まれている組合せが含むことができる。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、体内の同じ組織または異なる組織を標的とすることができる。例として、限定をするものではないが、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲ内に組織、細胞型または疾患特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を導入することにより、特異的細胞型（例えば、骨髄細胞、内皮細胞など）内での発現の度合いを減少させることができる。
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドでの３’ＵＴＲの５’末端付近に、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間の約半分のところに、及び／または３’ＵＴＲの３’末端の付近を操作することができる。例として、限定をするものではないが、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近に、及び３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間の約半分のところで操作することができる。別の例として、限定をするものではないが、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの３’末端付近に、及び３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間の約半分のところで操作することができる。さらに別の例として、限定をするものではないが、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近に、及び３’ＵＴＲの３’末端付近で操作することができる。
別の実施形態では、３’ＵＴＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個のｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができる。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、及び／またはシード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に対して相補的なものとすることができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの発現は、少なくとも１つのセンサー配列をポリヌクレオチドに組み込み、投与用にポリヌクレオチドを製剤することにより制御することができる。例として、限定をするものではないが、本発明のポリヌクレオチドに、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込み、本明細書に記載した脂質のいずれかを含むイオン性脂質を含む脂質ナノ粒子にポリヌクレオチドを配合することにより、組織または細胞を標的することができる。
本発明のポリヌクレオチドを、異なる組織、細胞型、または生物学的状態におけるｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞型もしくは生物学的状態において標的化を強化した発現用に操作することもできる。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を導入することにより、本発明のポリヌクレオチドを、組織もしくは細胞での最適なタンパク質発現のために、または生物学的状態という観点から設計することができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、公知のｍｉＲＮＡシード配列に対して１００％の同一性を有する、またはｍｉＲＮＡシード配列に対して１００％未満の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位が組み込まれるように設計することができる。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、公知のｍｉＲＮＡシード配列に対して少なくとも：６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位が組み込まれるように設計することができる。ｍｉＲＮＡシード配列は、ｍｉＲＮＡ結合親和性を低下させて、結果としてポリヌクレオチドの下方調節が減少するように、部分的に変異させることができる。本質的に、ｍｉＲＮＡ結合部位とｍｉＲＮＡシードとの間の一致または不一致の度合いは、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力をより細かく調整するための可変抵抗器として作用することができる。加えて、ｍｉＲＮＡ結合部位の非シード領域内での変異は、また、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力に影響を及ぼすことができる。
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列を、ステムループのループに組み込むことができる。
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡシード配列を、ステムループのループ内に組み込むことができ、ｍｉＲＮＡ結合部位を、ステムループの５’ステム内、または３’ステム内に組み込むことができる。
一実施形態では、５’ＵＴＲのｍｉＲＮＡ配列を使用して、本明細書に記載した本発明のポリヌクレオチドを安定化することができる。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲでのｍｉＲＮＡ配列を使用することで、限定をするものではないが、開始コドンなどの翻訳開始部位へのアクセスを行いにくくすることができる。例えば、その全内容を参照により本明細書で援用するＭａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０ １１（５）：ｅ１５０５７を参照されたい。これは、開始コドンの周りのアンチセンスロック核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド、及びエキソン接合部複合体（ＥＪＣ）を用いて（－４～＋３７、ＡＵＧコドンのＡは＋１）、最初の開始コドン（ＡＵＧ）へのアクセスを難しくした。Ｍａｔｓｕｄａは、ＬＮＡまたはＥＪＣを用いて開始コドン周辺の配列を変更すると、ポリヌクレオチドの効率、長さ、及び構造安定性に影響が及ぶことを示した。本発明のポリヌクレオチドは、Ｍａｔｓｕｄａらが記載したＬＮＡまたはＥＪＣ配列でなく、ｍｉＲＮＡ配列を翻訳開始部位の近くに含めることで、翻訳開始部位へのアクセスを難しくすることができる。翻訳開始部位は、ｍｉＲＮＡ配列の前、後、またはその中に存在することができる。例として、限定をするものではないが、翻訳開始部位は、ｍｉＲＮＡ配列、例えば、シード配列または結合部位の内部に位置することができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドには、抗原提示細胞による抗原提示を減少させるために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含むことができる。当該ｍｉＲＮＡは、完全なｍｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡシード配列、ｍｉＲＮＡ配列（シードなし）、またはそれらの組合せとすることができる。例として、限定をするものではないが、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、造血系に特異的なものとすることができる。別の例として、限定をするものではないが、抗原提示を減少させるために本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐである。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、目的の組織または細胞でのコードしたポリペプチドの発現を減少させるために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含むことができる。例として、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－３ｐシード配列、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位（シードなし）、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐシード配列、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位（シードなし）、ｍｉＲ－１４６結合部位、ｍｉＲ－１４６シード配列、及び／またはｍｉＲ－１４６結合部位（シード配列なし）を含むことができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞でのｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解するための少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を３’ＵＴＲに含むことで、治療的送達により引き起こす望ましくない免疫原性反応を抑制することができる。例として、限定をするものではないが、ｍｉＲＮＡ結合部位が、抗原提示細胞内の本発明のポリヌクレオチドの不安定度を高めることができる。これらのｍｉＲＮＡの例として、ｍｉｒ－１４２－５ｐ、ｍｉｒ－１４２－３ｐ、ｍｉｒ－１４６ａ－５ｐ、及びｍｉｒ－１４６－３ｐがあるが、これらに限定されない。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用することができるポリヌクレオチドの領域内に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、（ｉ）ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性フラグメント、またはバリアント）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、ならびに、（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位）、及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
１２．３’ＵＴＲ
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、３’ＵＴＲをさらに含む。
３’ＵＴＲは、翻訳終止コドンのすぐ後に続くｍＲＮＡのセクションであり、大抵の場合、転写後に遺伝子発現に対して影響を与える調節領域を含む。３’ＵＴＲ内の調節領域は、ｍＲＮＡのポリアデニル化、翻訳効率、局在化、及び安定性に影響を及ぼすことができる。一実施形態では、本発明に有用な３’ＵＴＲは、調節タンパク質またはマイクロＲＮＡに対する結合部位を含む。
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに有用な３’ＵＴＲは、配列番号１５１、及び１０４～１１２、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する３’ＵＴＲを含む。ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに有用な３’ＵＴＲは、配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１９５、及び配列番号１９６、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１１１、及び１１２、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する核酸配列を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号４の核酸配列を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１１１の核酸配列を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１１２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１５０の核酸配列を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１５１の核酸配列を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１７５の核酸配列を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１７７の核酸配列を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１７８の核酸配列を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１９５の核酸配列を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１９６の核酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、本発明に有用な３’ＵＴＲ配列は、配列番号１０４～１１２、１５０、１５１、及び１７８、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する３’ＵＴＲ配列からなる群から選択する配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、本発明に有用な３’ＵＴＲ配列は、配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１９５、または配列番号１９６、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する３’ＵＴＲ配列からなる群から選択する配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。
１３．５’キャップを有する領域
本発明は、５’キャップと、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含む、ポリヌクレオチドも含む。
天然ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡの安定性を上昇させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）とポリＡ結合タンパク質との会合を介して細胞内でのｍＲＮＡ安定性及び翻訳適格性を担うＣＢＰと結合することにより、成熟した環状ｍＲＮＡ種を形成する。当該キャップはさらに、ｍＲＮＡのスプライシング中に５’近位イントロンを除去する一助となる。
内因性ｍＲＮＡ分子に、５’末端キャッピングをして、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’－ｐｐｐ－５’－トリホスファート結合を生成することができる。次いで、この５’－グアニレートキャップがメチル化すると、Ｎ７－メチル－グアニレート残基を生成することができる。ｍＲＮＡの５’末端、及び／または末端前転写ヌクレオチドのリボース糖も任意に、２’－Ｏ－メチル化することができる。グアニレートキャップ構造の加水分解及び切断を介した５’デキャッピングは、分解のためにｍＲＮＡ分子などの核酸分子を標的とすることができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）には、キャップ部分が組み込まれている。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）が非加水分解性キャップ構造を含むと、デキャッピングが防止されて、ｍＲＮＡ半減期が延びる。キャップ構造の加水分解では５’－ｐｐｐ－５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするので、キャッピング反応の間に修飾ヌクレオチドを使用することができる。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）製のワクシニアキャッピング酵素を、製造業者の指示に従って、α－チオ－グアノシンヌクレオチドと併用することで、５’－ｐｐｐ－５’キャップ中にホスホロチオアート結合を生ずることができる。さらなる修飾グアノシンヌクレオチド、例えば、α－メチル－ホスホナート、及びセレノ－フォスファートヌクレオチドを使用することもできる。
さらなる修飾として、糖環の２’－ヒドロキシル基上での（上記した）ポリヌクレオチドの５’末端及び／または５’末端前ヌクレオチドのリボース糖の２’－Ｏ－メチル化があるが、これらに限定されない。複数の異なる５’キャップ構造を用いることにより、ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチドなどの、核酸分子の５’キャップを生成することができる。本明細書において、キャップアナログは、合成キャップアナログ、化学的キャップ、化学的キャップアナログ、または構造的もしくは機能性キャップアナログとも称しており、キャップ機能を保持しているが、その化学構造において天然の（すなわち、内因性、野生型、もしくは、生理学的）５’キャップとは異なる。キャップアナログを、本発明のポリヌクレオチドに化学的に（すなわち非酵素的に）または酵素的に合成し、及び／または本発明のポリヌクレオチドに結合することができる。
例えば、抗逆方向キャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－トリホスファート基により結合した２つのグアニンを含むことができ、その際、一方のグアニンには、Ｎ７メチル基と、３’－Ｏ－メチル基（すなわち、Ｎ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－トリフォスファート－５’－グアノシン（ｍ７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ）、等価的に３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと称することができる）とが含有されている。他方の修飾されていないグアニンの３’－Ｏ原子は、キャップ付きポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに結合するようになる。Ｎ７－及び３’－Ｏ－メチル化グアニンにより、キャップ付きポリヌクレオチドの末端部分が提供される。
別の例示的なキャップは、ｍＣＡＰであり、これは、ＡＲＣＡに類似しているが、グアノシン上に、２’－Ｏ－メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－トリホスファート－５’－グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）。
一部の実施形態では、当該キャップは、ジヌクレオチドキャップアナログである。例として、限定をするものではないが、ジヌクレオチドキャップアナログは、その全内容を参照により本明細書で援用する米国特許第８，５１９，１１０号において記載されているジヌクレオチドキャップアナログなど、ボラノホスファート基またはホスホロセレノアート基を用いて異なるホスファート位置で修飾することができる。
別の実施形態では、当該キャップは、キャップアナログであり、当該技術分野で公知の、及び／または本明細書に記載したキャップアナログのＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態である。Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態のキャップアナログの例として、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、及びＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログがある（例えば、その全内容を参照により本明細書に援用するＫｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３ ２１：４５７０－４５７４に記載されている種々のキャップアナログ、及びキャップアナログの合成方法を参照されたい）が、これらに限定されない。別の実施形態では、本発明のキャップアナログは、４－クロロ／ブロモフェノキシエチルアナログである。
キャップアナログは、ポリヌクレオチド、またはその領域に対する同時的キャッピングを可能にするが、インビトロ転写反応では、転写産物のうちの最高２０％が、キャップされていないまま維持することができる。このことと、さらには、内因性細胞転写機構を介して産生した核酸の内因性５’キャップ構造とのキャップアナログの構造上の相違が、翻訳適格性の低下、及び細胞安定性の低下も招くことができる。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）をまた、製造後（ＩＶＴ、化学合成を問わず）に酵素を使用してキャッピングして、高真正性５’キャップ構造を生成することができる。本明細書で使用する語句「高真正性」とは、内因性または野生型特徴を、構造的にもしくは機能的に、密接に反映する、あるいは、模倣する特徴のことを指す。すなわち、「高真正性」特徴とは、先行技術の合成の特徴またはアナログなどと比較して、内因性、野生型、天然もしくは生理学的な細胞機能及び／または構造に優れているか、あるいは、１つ以上の点で対応する内因性、野生型、天然もしくは生理学的特徴よりも優れているものの代表例である。本発明の高真正性５’キャップ構造の例として、特に、当該技術分野で公知の合成５’キャップ構造と比較して（または野性型、天然型または生理学的な５’キャップ構造と比較して）、キャップ結合タンパク質の結合が強化され、半減期が延び、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性が減少し、及び／または５’デキャッピングが減少しているものがあるが、これらに限定されない。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素、及び組換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、例えば、当該技術分野で公知の他の５’キャップアナログ構造に対して、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に標準５’－５’－トリホスファート結合を生成することができ、その際、キャップグアニンはＮ７メチル化を含み、ｍＲＮＡＮの５’末端ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルを含む。そのような構造を、キャップ１構造と称する。このキャップは、例えば、当該技術分野で公知のその他の５’キャップアナログ構造と比較して、翻訳適格性の向上、細胞安定性の増強、及び細胞性炎症性サイトカインの活性化の低下をもたらす。キャップ構造として、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１ｍｐＮｐ（キャップ１）、及び７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）Ｎ１ｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）があるが、これらに限定されない。
例として、限定をするものではないが、製造後のキメラポリヌクレオチドのキャッピングは、キメラポリヌクレオチドのほぼ１００％をキャップするほど、効率が高くなる。これとは対照的に、インビトロ転写反応の過程でキャップアナログがキメラポリヌクレオチドに結合する場合では、約８０％である。
本発明によれば、５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップアナログを含むことができる。本発明によれば、５’末端キャップは、グアニンアナログを含むことができる。有用なグアニンアナログとして、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、及び２－アジド－グアノシンがあるが、これらに限定されない。
１４．ポリＡ尾部
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ポリＡ尾部をさらに含む。さらなる実施形態では、安定化のために、ポリＡ尾部上に末端基を組み込むことができる。その他の実施形態では、ポリＡ尾部は、ｄｅｓ－３’ヒドロキシル尾部を含む。
安定性を上昇させるために、ＲＮＡプロセシングの間に、長鎖アデニンヌクレオチド（ポリＡ尾部）を、ｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドに付加することができる。転写直後に、転写物の３’末端が切断して、３’ヒドロキシルを遊離させることができる。次いで、ポリＡポリメラーゼにより、アデニンヌクレオチドの鎖がＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスにより、例えば、およそ８０～およそ２５０残基長（およそ８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０残基長を含む）のポリＡ尾部が付加される。一実施形態では、当該ポリＡ尾部は、１００ヌクレオチド長（配列番号２０４）である。
コンストラクトが核からエクスポートした後に、ポリＡ尾部を付加することもできる。
本発明によれば、安定化のために、ポリＡ尾部上に末端基を組み込むことができる。本発明のポリヌクレオチドは、ｄｅｓ－３’ヒドロキシル尾部を含むことができる。これらは、その全内容を参照により本明細書で援用するＪｕｎｊｉｅ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，１５０１－１５０７，Ａｕｇｕｓｔ ２３，２００５で教示されているような、構造的残基、または２’－Ｏ－メチル修飾も含むことができる。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含む代替のポリＡ尾部構造を有する転写物がコードするように、設計することができる。Ｎｏｒｂｕｒｙによれば、「また、末端ウリジル化は、ヒト複製依存性ヒストンｍＲＮＡ上でも検出されてきた。これらのｍＲＮＡのターンオーバーは、染色体ＤＮＡ複製が完了した、または阻害した後に有毒なヒストンが蓄積する可能性を未然に防止するうえで、重要であると考えられている。これらのｍＲＮＡは、３’ポリＡ尾部が欠如している点で判別され、代わりに、その機能は、安定なステムループ構造及びその同族のステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）により担われている；後者はポリアデニル化したｍＲＮＡのＰＡＢＰと同じ機能を遂行する」（Ｎｏｒｂｕｒｙ，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＲＮＡ：ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｉｌ ｗａｇｇｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＡＯＰ，オンライン公開２９ Ａｕｇｕｓｔ ２０１３、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）、この全内容を参照により本明細書で援用する。
独自のポリＡ尾部の長さは、本発明のポリヌクレオチドに、ある特定の利点をもたらす。一般的に、存在する場合、ポリＡ尾部の長さは、３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態では、当該ポリＡ尾部は、３５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチド長またはそれより長い）。
一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチド、またはその領域は、約３０～約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～７５０、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～２，０００、３０～２，５００、５０～１００、５０～２５０、５０～５００、５０～７５０、５０～１，０００、５０～１，５００、５０～２，０００、５０～２，５００、５０～３，０００、１００～５００、１００～７５０、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～２，０００、１００～２，５００、１００～３，０００、５００～７５０、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～２，５００、５００～３，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～２，５００、１，０００～３，０００、１，５００～２，０００、１，５００～２，５００、１，５００～３，０００、２，０００～３，０００、２，０００～２，５００、及び２，５００～３，０００）を含む。
一部の実施形態では、当該ポリＡ尾部は、ポリヌクレオチド全体の長さ、またはポリヌクレオチドの特定領域の長さに関連して設計する。この設計は、コーディング領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さに基づいて、またはポリヌクレオチドから発現する最終産物の長さに基づくことができる。
これに関連して、当該ポリＡ尾部は、ポリヌクレオチド、またはその特徴よりも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは、１００％長くすることができる。また、ポリＡ尾部を、そのポリＡ尾部の属するポリヌクレオチドの一部として設計することもできる。これに関連して、ポリＡ尾部は、コンストラクトの全長の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは、９０％、もしくは、それを超える長さとすることができ、あるいは、コンストラクト領域またはコンストラクトの全長からポリＡ尾部を減じた長さとすることもできる。さらに、ポリＡ結合タンパク質のために操作した結合部位、及びポリヌクレオチドの共役は、発現を増強することができる。
加えて、ポリＡ尾部の３’末端における修飾ヌクレオチドを使用して、ＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）を介して３’末端経由で、複数の異なるポリヌクレオチドを一体的に結合することができる。関連する細胞株においてトランスフェクション実験を行うことができ、タンパク質の産生を、トランスフェクション後の１２時間目、２４時間目、４８時間目、７２時間目、及び７日目にＥＬＩＳＡでアッセイすることができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリＡ－Ｇカルテット領域を含むように設計する。Ｇ－カルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方においてＧリッチな配列により形成する４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態では、Ｇ－カルテットは、ポリＡ尾部の末端内に組み込まれている。結果として得られたポリヌクレオチドを、安定性、タンパク質の産生、及び様々な時点における半減期を含むその他のパラメーターに関してアッセイする。ポリＡ－Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチド単独のポリＡ尾部（配列番号２１４）を用いて確認したｍＲＮＡの少なくとも７５％に相当するｍＲＮＡからのタンパク質の産生をもたらす、ことが発見されている。
１５．開始コドン領域
また、本発明は、開始コドン領域、及び本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似する領域、または開始コドン領域と同様に機能する領域を有することができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧ以外のコドン上で開始することができる。ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドン、例えば、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧ上で開始することができる（Ｔｏｕｒｉｏｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ９５（２００３）１６９－１７８、及びＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたい、これらのそれぞれの全内容を参照により本明細書で援用する）が、これらに限定されない。
例として、限定をするものではないが、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドンＡＣＧ上で開始する。別の例として、限定をするものではないが、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドンＣＴＧまたはＣＵＧ上で開始する。さらに別の例として、限定をするものではないが、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドンＧＴＧまたはＧＵＧ上で開始する。
翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチド、例えば、限定をするものではないが、開始コドンまたは代替の開始コドンなどは、ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ、及び／または構造に影響を及ぼすことが公知である。（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたい、この文献は、その全内容を参照により本明細書で援用する）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスキングすることにより、ポリヌクレオチドの翻訳開始位置、翻訳効率、長さ、及び／または構造を変更することができる。
一部の実施形態では、開始コドンまたは代替の開始コドン付近でマスキング剤を使用して、コドンをマスキングまたは隠蔽することにより、マスキングした開始コドンまたは代替の開始コドンの翻訳開始確率を低下させることができる。マスキング剤の例として、限定をするものではないが、アンチセンスロック核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチド、及びエキソン接合部複合体（ＥＪＣ）がある（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏによるマスキング剤ＬＮＡポリヌクレオチド及びＥＪＣに関する記述（ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１）を参照されたい、この文献の全内容を参照により本明細書で援用する）。
別の実施形態では、マスキング剤を使用して、ポリヌクレオチドの開始コドンをマスキングすることにより、翻訳が代替の開始コドン上で開始する可能性を高めることができる。一部の実施形態では、マスキング剤を使用して第１の開始コドン、または代替の開始コドンをマスキングして、マスキングした開始コドンまたは代替開始コドンより下流の開始コドン、または代替開始コドン上で翻訳が開始する可能性を高めることができる。
一部の実施形態では、開始コドンまたは代替の開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完全補完体の内部に位置させることができる。ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完全補完体は、マスキング剤と同様にポリヌクレオチドの翻訳、長さ、及び／または構造を制御する一助となることができる。例として、限定をするものではないが、開始コドンまたは代替の開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完全補完体の中央に位置することができる。開始コドンまたは代替開始コドンは、第１ヌクレオチド、第２ヌクレオチド、第３ヌクレオチド、第４ヌクレオチド、第５ヌクレオチド、第６ヌクレオチド、第７ヌクレオチド、第８ヌクレオチド、第９ヌクレオチド、第１０ヌクレオチド、第１１ヌクレオチド、第１２ヌクレオチド、第１３ヌクレオチド、第１４ヌクレオチド、第１５ヌクレオチド、第１６ヌクレオチド、第１７ヌクレオチド、第１８ヌクレオチド、第１９ヌクレオチド、第２０ヌクレオチド、または第２１ヌクレオチドの後に位置することができる。
別の実施形態では、当該開始コドン以外のコドン上で、ポリヌクレオチドの翻訳を開始させるために、ポリヌクレオチドの開始コドンをポリヌクレオチド配列から除去することができる。その除去した開始コドンの後に続くコドン上で、下流の開始コドン上で、または代替の開始コドン上で、ポリヌクレオチドの翻訳を開始することができる。例として、限定をするものではないが、下流の開始コドン上、または代替の開始コドン上で、翻訳を開始させるために、開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧをポリヌクレオチド配列の最初の３ヌクレオチドとして除去する。翻訳の開始、ポリヌクレオチドの長さ、及び／またはポリヌクレオチドの構造を制御する、あるいは、その制御を試みるために、開始コドンが除去したポリヌクレオチド配列は、下流の開始コドン及び／または代替の開始コドンのために、少なくとも１つのマスキング剤をさらに含むことができる。
１６．終止コドン領域
また、本発明は、終止コドン領域、及び本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に、少なくとも２つの終止コドンを含むことができる。ＤＮＡの場合は、ＴＧＡ、ＴＡＡ、及びＴＡＧからコドンを選択することができ、ＲＮＡの場合は、ＵＧＡ、ＵＡＡ、及びＵＡＧから終止コドンを選択することができる。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合は、終止コドンＴＧＡ、またはＲＮＡの場合は、終止コドンＵＧＡ、及び１つのさらなる終止コドンを含む。さらなる実施形態では、さらなる終止コドンは、ＴＡＡまたはＵＡＡとすることができる。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つの連続的終止コドン、４つの終止コドン、またはそれより多くの終止コドンを含む。
１７．ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’から３’に向けて：
（ｉ）上記した５’キャップ；
（ｉｉ）上記した配列などの５’ＵＴＲ；
（ｉｉｉ）ヒトＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするＯＲＦ、例えば、配列番号２及び５～１２からなる群から選択する核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する当該ＯＲＦ；
（ｉｖ）少なくとも１つの終止コドン；
（ｖ）上記した配列などの３’ＵＴＲ；及び
（ｖｉ）上記したポリＡ尾部、を含む。
一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲＮＡ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。一部の実施形態では、当該５’ＵＴＲは、当該ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、当該３’ＵＴＲは、当該ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、野生型ヒトＵＧＴ１Ａ１（配列番号１）のタンパク質配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、（１）上記した５’キャップ、例えば、ＣＡＰ１、（２）５’ＵＴＲ、（３）配列番号２、及び５～１２からなる群から選択するヌクレオチド配列ＯＲＦ、（３）終止コドン、（４）３’ＵＴＲ、及び（５）上記したポリＡ尾部、例えば、約１００残基のポリＡ尾部を含む。
例示的なＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドコンストラクトを、以下に記載する：
配列番号１４は、５’から３’末端に向けて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号２のＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１５１の３’ＵＴＲからなる。
配列番号１５は、５’から３’末端に向けて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号２のＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１５０の３’ＵＴＲからなる。
配列番号１６は、５’から３’末端に向けて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号２のＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１７８の３’ＵＴＲからなる。
配列番号１７は、５’から３’末端に向けて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号５のＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１５１の３’ＵＴＲからなる。
配列番号１８は、５’から３’末端に向けて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号５のＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１５０の３’ＵＴＲからなる。
配列番号１９は、５’から３’末端に向けて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号６のＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１５１の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２０は、５’から３’末端に向けて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号６のＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１５０の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２１は、５’から３’末端に向けて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号７のＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１５１の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２２は、５’から３’末端に向けて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号７のＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１５０の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２３は、５’から３’末端に向けて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号８のＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１５０の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２４は、５’から３’末端に向けて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号９のＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１５０の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２５は、５’から３’末端に向けて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１０のＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１５０の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２６は、５’から３’末端に向けて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１１のＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１５０の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２７は、５’から３’末端に向けて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１２のＵＧＴ１Ａ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１５０の３’ＵＴＲからなる。
ある特定の実施形態では、配列番号１４～２７を有するコンストラクトにおいて、そこでのすべてのウラシルが、Ｎ１－メチルシュードウラシルで置換している。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、（１）上記した５’キャップ、例えば、ＣＡＰ１、（２）配列番号１４～２７からなる群から選択するヌクレオチド配列、ならびに（３）上記したポリＡ尾部、例えば、約１００残基のポリＡ尾部を含む。ある特定の実施形態では、配列番号１４～２７を有するコンストラクトにおいて、そこでのすべてのウラシルが、Ｎ１－メチルシュードウラシルで置換している。

表５－ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードするＯＲＦを含む修飾ｍＲＮＡコンストラクト（コンストラクト＃１～＃１４のそれぞれは、Ｃａｐ１ ５’末端キャップと、３’末端ポリＡ領域を含む）
Figure 2025028860000013


１８．ポリヌクレオチドの作製方法
また、本開示は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、またはその相補体を作り出すための方法を提供する。
一部の態様では、本明細書に開示された、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、インビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して構築することができる。その他の態様では、本明細書に開示された、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用する化学合成により構築することができる。
その他の態様では、本明細書に開示された、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、宿主細胞を使用して作り出す。特定の態様では、本明細書に開示された、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＶＴ、化学合成、宿主細胞発現、または当該技術分野で公知のその他のあらゆる方法のうちの１つ以上の組合せにより作り出す。
天然に生じるヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオシド、またはそれらの組合せは、候補ヌクレオチド配列に存在する天然に生じるヌクレオシドを、全体的または部分的に置換することができ、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込むことができる。次いで、得られたポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを、タンパク質を産生する能力、及び／または治療成績を生じる能力について試験することができる。
ａ．インビトロ転写／酵素合成
本明細書に開示した本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、インビトロ転写（ＩＶＴ）系を使用して転写することができる。この系は、一般的には、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮアーゼ阻害剤、及びポリメラーゼを含む。ＮＴＰとして、限定をするものではないが、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰを含めて、本明細書に記載したものから選択することができる。当該ポリメラーゼとして、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、及び変異型ポリメラーゼがあるが、これらに限定されず、例えば、本明細書に開示したポリヌクレオチドを取り込むことができるポリメラーゼから選択することができるが、それらに限定されない。その全内容を参照により本明細書で援用する米国特許出願公開ＵＳ２０１３０２５９９２３号を参照されたい。
あらゆる数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントを、本発明のポリヌクレオチドの合成に使用することができる。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸を挿入または欠失させることにより、修飾することができる。例として、限定をするものではないが、当該ＲＮＡポリメラーゼを、非修飾ＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’－修飾ヌクレオチド三リン酸を取り込む能力の増加を示すように修飾することができる（国際公開ＷＯ２００８０７８１８０、及び米国特許第８，１０１，３８５号を参照されたい、それらの全内容を参照により本明細書で援用する）。
バリアントは、ＲＮＡポリメラーゼを進化させ、ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸、及び／または核酸配列を最適化することにより、及び／または当該技術分野で公知のその他の方法を使用することにより得ることができる。例として、限定をするものではないが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ４７２：４９９－５０３（２０１１）、その全内容を参照により本明細書で援用する）に記載されている連続指向性進化システムを使用して進化させることができる、その際、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、少なくとも１つの変異、例えば、限定をするものではないが、スレオニンと置換した９３位のリシン（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１Ｎ、またはＬ８６４Ｆなどの変異をコードすることができる。別の例として、限定をするものではないが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、それらの全内容を参照により本明細書で援用する米国特許出願公開第２０１００１２００２４号、及び同第２００７０１１７１１２号に記載された、少なくとも変異をコードすることができる。ＲＮＡポリメラーゼのバリアントとして、置換バリアント、保存的アミノ酸置換、挿入バリアント、及び／または欠失バリアントがあるが、これらに限定されない。
一態様では、当該ポリヌクレオチドは、野生型またはバリアントＲＮＡポリメラーゼが認識するように設計することができる。そうすることで、当該ポリヌクレオチドを、野生型または親キメラポリヌクレオチドからの配列変化の部位または領域を含有するように修飾することができる。
ポリヌクレオチドまたは核酸合成反応は、ポリメラーゼを利用する酵素的方法により実施することができる。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチド、または核酸鎖内のヌクレオチド間のホスホジエステル結合の生成を触媒する。現在公知のＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列比較及び結晶構造解析に基づいて異なるファミリーに分けることができ、Ｅ．ｃｏｌｉのクレノウフラグメント、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）、またはＡポリメラーゼファミリーは、最も研究が進んだこれらのファミリーの１つである。別の大きなファミリーは、すべての真核生物複製ＤＮＡポリメラーゼ、及びファージＴ４及びＲＢ６９由来のポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼα（ｐｏｌ α）、またはＢポリメラーゼファミリーである。それらは、同様の触媒機序を用いるが、ポリメラーゼのこれらのファミリーは、基質特異性、基質アナログ組み込み効率、プライマー伸長の程度及び速度、ＤＮＡ合成様式、エキソヌクレアーゼ活性、ならびに、阻害剤に対する感受性において異なる。
ＤＮＡポリメラーゼは、それらが必要とする最適な反応条件、例えば、反応温度、ｐＨ、ならびに、鋳型及びプライマー濃度に基づいても選択する。場合により、複数のＤＮＡポリメラーゼの組合せが、所望のＤＮＡフラグメントサイズ、及び合成効率を達成するために用いられる。例えば、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．は、ｐＨを上昇させ、グリセロール、及びジメチルスルホキシドを添加し、変性時間を減少させ、伸長時間を増加させ、クローニングしたインサート及びヒトゲノムＤＮＡの長い標的を効果的に増幅する３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する第２の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを利用する（その全内容を参照により本明細書で援用するＣｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９１：５６９５－５６９９（１９９４））。バクテリオファージＴ３、Ｔ７、及びＳＰ６由来のＲＮＡポリメラーゼは、生化学的、及び生物物理学的研究のためのＲＮＡを調製するために広く使用されている。ＲＮＡポリメラーゼ、キャッピング酵素、及びポリＡポリメラーゼは、同時係属の国際公開ＷＯ２０１４／０２８４２９に開示されており、その全内容を参照により本明細書で援用する。
一態様では、本発明のポリヌクレオチドの合成に使用することができるＲＮＡポリメラーゼは、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼである（その全内容を参照により本明細書で援用するＺｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１１９３を参照されたい）。Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼは、近年、Ｚｈｕらにより海洋シアノファージＳｙｎ５から特徴決定されており、その際、彼らは、プロモーター配列も同定した（その全内容を参照により本明細書で援用するＺｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３を参照されたい）。Ｚｈｕらは、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、より広い範囲の温度、及び塩分濃度にわたって、ＲＮＡ合成を触媒することを突き止めた。加えて、プロモーターでの開始ヌクレオチドに関する要件は、ＲＮＡ合成に有望なＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを作り出すＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼでは、あまり厳しくないことが判明した。
一態様では、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを、本明細書に記載したポリヌクレオチドの合成において使用することができる。例として、限定をするものではないが、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを、精密な３’末端を必要とするポリヌクレオチドの合成において使用することができる。
一態様では、Ｓｙｎ５プロモーターを、ポリヌクレオチドの合成において使用することができる。例として、限定をするものではないが、Ｓｙｎ５プロモーターは、５’－ＡＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＧ－３’（Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３）により記載されている配列番号１８５）とすることができる。
一態様では、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載した、及び／または当該技術分野で公知の少なくとも１つの化学修飾を含むポリヌクレオチドの合成に使用することができる（例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３に記載の偽ＵＴＰ、及び５Ｍｅ－ＣＴＰの組み込み、を参照されたい）。
一態様では、本明細書に記載したポリヌクレオチドを、Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３）に記載された修正及び改良した精製手順を使用して精製しているＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成することができる。
遺伝子工学での様々なツールは、鋳型として作用する標的遺伝子の酵素的増幅に基づいている。目的の個々の遺伝子または特定の領域の配列の研究、及びその他の研究ニーズでは、ポリヌクレオチドまたは核酸の少量の試料から標的遺伝子の複数のコピーを生成することが必要である。そのような方法を、本発明のポリヌクレオチドの製造に適用することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）とも称する核酸配列をベースとした増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び／またはローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）を、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上の領域の製造に利用することができる。リガーゼによるポリヌクレオチドまたは核酸のアセンブリングも、広く用いられている。
ｂ．化学合成
目的の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列、例えば、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を合成するための標準的な方法を適用することができる。例えば、特定の単離したポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含有する単一のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーを合成することができる。その他の態様では、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、ライゲートすることができる。一部の態様では、個々のオリゴヌクレオチドは、一般的には、相補的なアセンブリのために、５’または３’オーバーハングを含有する。
本明細書に開示したポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、当該技術分野で公知の化学合成方法、及び可能な核酸塩基置換を使用して、化学的に合成することができる。例えば、それらの全文献の全内容を参照により本明細書で援用する、国際公開ＷＯ２０１４０９３９２４、ＷＯ２０１３０５２５２３、ＷＯ２０１３０３９８５７、ＷＯ２０１２１３５８０５、ＷＯ２０１３１５１６７１、米国特許出願公開第２０１３０１１５２７２号、または米国特許第８９９９３８０号、もしくは、同第８７１０２００号を参照されたい。
ｃ．ＵＧＴ１Ａ１をコードするポリヌクレオチドの精製
本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製は、ポリヌクレオチドのクリーンアップ、品質保証、及び品質管理を含むことができるが、これらに限定されない。クリーンアップは、当該技術分野で公知の方法、例えば、限定をするものではないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ．，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、またはＨＰＬＣに基づく精製方法など、例えば、限定をするものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）などにより、実施することができる。
用語「精製した」とは、「精製したポリヌクレオチド」などのポリヌクレオチドに関して使用する場合、少なくとも１つの汚染物質から分離することを指す。本明細書で使用する「汚染物質」は、別のものを、不適当、不純、または粗悪にするあらゆる物質のことである。したがって、精製したポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、及びＲＮＡ）は、自然に認められるものとは異なる形態もしくは環境、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在していたものとは異なる形態もしくは環境で存在する。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製は、望ましくない免疫応答、例えば、サイトカイン活性の低下を減少させる、または除去することができる不純物を除去する。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、カラムクロマトグラフィー（例えば、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して、投与前に精製する。
一部の実施形態では、（カラムクロマトグラフィー（例えば、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して精製した本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、異なる精製方法で精製した本開示の同じポリヌクレオチドで得られた発現レベルと比較して、コードしたＵＧＴ１Ａ１タンパク質の発現の増加を示す。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））精製ポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知の点変異の１つ以上を含むＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞でのＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現レベルを、それらの細胞に導入した場合に、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入する前、または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入した後の細胞内のＵＧＴ１Ａ１タンパク質の発現レベルに対して、例えば、１０～１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％引き上げる。
一部の実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞内の機能性ＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現レベルを、それらの細胞に導入した場合に、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入する前、または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入した後の細胞内のＵＧＴ１Ａ１タンパク質の機能性発現レベルに対して、例えば、１０～１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％引き上げる。
一部の実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞内の検出可能なＵＧＴ１Ａ１活性を、それらの細胞に導入した場合に、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入する前、または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入した後の細胞内の機能性ＵＧＴ１Ａ１の活性レベルに対して、例えば、１０～１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％引き上げる。
一部の実施形態では、精製ポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％の純度、少なくとも約８５％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、少なくとも約９６％の純度、少なくとも約９７％の純度、少なくとも約９８％の純度、少なくとも約９９％の純度、または約１００％の純度である。
品質保証、及び／または品質管理チェックは、限定をするものではないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析用ＨＰＬＣなどの方法を使用して実施することができる。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、逆転写酵素ＰＣＲを含む方法で配列決定することができるが、これに限定されない。
ｄ．ＵＧＴ１Ａ１をコードする発現ポリヌクレオチドの定量
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、それらの発現産物、ならびに、分解産物及び代謝産物を、当該技術分野で公知の方法に従って定量することができる。
一部の実施形態では、エキソソーム内で、または１つ以上の体液から生じる場合に、本発明のポリヌクレオチドを定量することができる。本明細書で使用する「体液」は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、糞便、髪、涙、嚢胞液、胸膜及び腹腔液、心嚢液、リンパ液、消化粥、乳糜、胆汁、間質液、経血、膿、皮脂、嘔吐物、膣液、粘膜分泌液、糞便水、膵液、副鼻腔の洗浄液、気管支肺吸引液、胞胚腔液、及び臍帯血を含む。あるいは、エキソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択する器官から回収することができる。
エキソソーム定量法では、２ｍＬ以下の試料を対象から得て、エキソソームを、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組合せで単離する。この分析では、ポリヌクレオチドのレベルまたは濃度は、投与するコンストラクトの発現レベル、存在、不存在、切断、または変更とすることができる。レベルを、１つ以上の臨床表現型、またはヒト疾患バイオマーカーのアッセイと関連させることが有利である。
アッセイは、コンストラクト特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはそれらの組合せを使用して実施することができるが、エキソソームは、免疫組織化学的方法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を使用して単離することができる。エキソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組合せでも単離することができる。
これらの方法は、研究者に対して、残存する、または送達したポリヌクレオチドのレベルをリアルタイムでモニタリングする能力を提供する。これは、本発明のポリヌクレオチドが、構造的または化学修飾のために内因性形態と異なるので、可能となった。
一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、限定をするものではないが、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などの方法を使用して定量することができる。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の例として、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）があるが、これに限定されない。定量したポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを適切なサイズとすることの可否を決定するために分析することができ、ポリヌクレオチドの分解の有無を確認することができる。ポリヌクレオチドの分解は、限定をするものではないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣ系精製方法、例えば、限定をするものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ならびに、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法で確認することができる。
１９．医薬組成物及び製剤
本発明は、当該ポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物及び製剤を提供する。一部の実施形態では、当該組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
一部の実施形態では、当該組成物または製剤は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする本明細書に開示した配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、当該組成物または製剤は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする本明細書に開示した配列最適化核酸配列と有意な配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有することができる。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、及びｍｉＲ－２６ａに結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
医薬組成物または製剤は、１つ以上のさらなる活性物質、例えば、治療的、及び／または予防的活性物質を任意に含むことができる。本発明の医薬組成物または製剤は、滅菌、及び／または発熱性物質不含とすることができる。医薬品の製剤及び／または製造における一般的考察は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全内容を参照により本明細書で援用する）に認めることができる。一部の実施形態では、組成物を、ヒト、ヒト患者、または対象に投与する。本開示の目的のために、語句「活性成分」は、一般的に、本明細書に記載した送達するポリヌクレオチドのことを指す。
本明細書に記載した製剤及び医薬組成物は、薬理学の分野で公知の方法、または今後に開発されるあらゆる方法で調製することができる。一般的に、そのような調製方法は、活性成分を、添加剤、及び／または１つ以上のその他の補助成分と合わせるステップ、次いで、必要な場合には、及び／または望ましい場合、分割し、成形し、及び／または製品を所望の単回投与単位もしくは複数回投与単位にパッケージングするステップを含む。
本開示による医薬組成物または製剤は、バルクで、単回単位用量として、及び／または複数の単回単位用量として、調製、パッケージング、及び／または販売することができる。本明細書で使用する「単位用量」とは、所定量の活性成分を含む医薬組成物の別個の量のことを指す。活性成分の量は、一般的に、対象に投与する活性成分の投薬量、及び／またはそのような投薬量の好都合な分数、例えば、そのような投薬量の２分の１、または３分の１と等しい。
本開示による医薬組成物での活性成分、医薬として許容可能な添加剤、及び／またはあらゆるさらなる成分の相対量は、治療する対象に固有の特性、大きさ、及び／または状態に応じて、さらに、組成物を投与すべき経路に応じて、変動することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載した組成物及び製剤は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含有することができる。例として、限定をするものではないが、当該組成物または製剤は、本発明の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのポリヌクレオチドを含有することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載した組成物または製剤は、複数種のポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、当該組成物または製剤は、線状及び環状形態のポリヌクレオチドを含むことができる。別の実施形態では、当該組成物または製剤は、環状ポリヌクレオチド、及びインビトロ転写した（ＩＶＴ）ポリヌクレオチドを含むことができる。さらに別の実施形態では、当該組成物または製剤は、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド、及び環状ポリヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で提供する医薬組成物及び製剤の説明は、主に、ヒトへの投与に適する医薬組成物及び製剤に関するものであるが、当業者であれば、そのような組成物が、一般的には、その他のあらゆる動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に適することを理解する。
本発明は、本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む医薬製剤を提供する。本明細書に記載したポリヌクレオチドは：（１）安定性を高める；（２）細胞トランスフェクションを増加させる；（３）（例えば、ポリヌクレオチドのデポ製剤から）持続放出または遅延放出を可能にする；（４）生体内分布を変更する（例えば、ポリヌクレオチドを特定の組織または細胞型に標的化する）；（５）インビボで、コードしたタンパク質の翻訳を増加させる；及び／または（６）インビボで、コードしたタンパク質の放出プロフィールを変更するために、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化することができる。一部の実施形態では、当該医薬製剤は、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～２３２のいずれか、例えば、化合物ＩＩ；式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３～３４２のいずれか、例えば、化合物ＶＩ；または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９～４２８のいずれか、例えば、化合物Ｉ、あるいは、それらのいずれかの組合せを含む送達剤をさらに含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０のモル比で含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０のモル比で含む。
本明細書で使用する医薬として許容可能な賦形剤として、所望の特定の剤形に適する、あらゆる、及びすべての溶媒、分散媒、もしくは、その他の液体ビヒクル、分散剤もしくは懸濁助剤、希釈剤、造粒剤及び／または分散剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤もしくは油、着色剤、甘味剤もしくは香味剤、安定剤、酸化防止剤、抗菌剤もしくは抗真菌剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、キレート剤、凍結保護剤、及び／または増量剤があるが、これらに限定されない。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤及び組成物を調製するための技術は、当該技術分野で公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照されたい、その全内容を参照により本明細書で援用する）。
例示的な希釈剤として、炭酸カルシウムもしくは炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトールなど、及び／またはそれらの組合せがあるが、これらに限定されない。
例示的な造粒剤及び／または分散剤として、デンプン、プレゼラチン化デンプンもしくは微晶質デンプン、アルギン酸、グアーガム、アガー、ポリ（ビニルピロリドン）、（プロビドン）、架橋ポリ（ビニルピロリドン）（クロスポビドン）、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウムなど、及び／またはそれらの組合せがあるが、これらに限定されない。
例示的な界面活性剤及び／または乳化剤として、天然の乳化剤（例えば、アカシア、アガー、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、ツノマタ、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、及びレシチン）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミタート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、グリセリルモノオレアート、ポリオキシエチレンエステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８など、及び／またはそれらの組合せがあるが、これらに限定されない。
例示的な結合剤として、デンプン、ゼラチン、糖類（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、アミノ酸（例えば、グリシン）、天然及び合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム）、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど、及びそれらの組合せがあるが、これらに限定されない。
酸化は、ｍＲＮＡ、特に、液体ｍＲＮＡ製剤の潜在的な分解経路である。酸化を防止するために、酸化防止剤を配合物に添加することができる。例示的な酸化防止剤として、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ベンジルアルコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ｍ－クレゾール、メチオニン、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウムまたはカリウム、プロピオン酸、プロピルガラート、アスコルビン酸ナトリウムなど、及びそれらの組合せがあるが、これらに限定されない。
例示的なキレート剤として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、エデト酸三ナトリウムなど、及びそれらの組合せがあるが、これらに限定されない。
例示的な抗菌剤または抗真菌剤として、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウムまたはナトリウム、ソルビン酸カリウムまたはナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸など、及びそれらの組合せがあるが、これらに限定されない。
例示的な防腐剤として、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータカロテン、クエン酸、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）など、及びそれらの組合せがあるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド溶液のｐＨは、安定性を高めるためにｐＨ５～ｐＨ８に維持する。ｐＨを制御する例示的な緩衝剤として、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン（もしくは、ヒスチジン－ＨＣｌ）、リンゴ酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなど、及び／またはそれらの組合せがあるが、これらに限定されない。
例示的な潤沢剤として、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、水素添加植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムまたはマグネシウムなど、及びそれらの組合せがあるが、これらに限定されない。
本明細書に記載した医薬組成物または製剤は、凍結中に、本明細書に記載したポリヌクレオチドを安定化させる凍結防止剤を含有することができる。例示的な凍結防止剤として、マンニトール、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロースなど、及びそれらの組合せがあるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の医薬組成物または製剤は、「医薬的に洗練した」固形物を得るために、増量剤を凍結乾燥ポリヌクレオチド製剤に含有させることができ、凍結乾燥ポリヌクレオチドを、長期間（例えば、３６ヶ月）の保存の間に安定化させることができる。本発明の例示的な増量剤として、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、ラクトース、ラフィノース、及びそれらの組合せがあるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、当該医薬組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。本開示の送達剤として、リポソーム、脂質ナノ粒子、リピドイド、ポリマー、リポプレックス、マイクロベシクル、エキソソーム、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドでトランスフェクトした細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、ナノチューブ、コンジュゲート、及びそれらの組合せを含むことができるが、これらに限定されない。
２０．送達剤
ａ．脂質化合物
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。本明細書に記載した脂質組成物は、治療薬及び／または予防薬、例えば、ｍＲＮＡを哺乳動物細胞または器官に送達するための脂質ナノ粒子組成物において有利に使用し得る。例えば、本明細書に記載した脂質は、免疫原性が殆どなく、または全くない。例えば、本明細書に開示した脂質化合物は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）と比較して低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示した脂質及び治療薬または予防薬、例えば、ｍＲＮＡを含む製剤は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）、及び同じ治療薬または予防薬を含む対応する製剤と比較して、治療指数の増加を示す。
ある特定の実施形態では、本出願は：
（ａ）ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；及び
（ｂ）送達剤を含む、医薬組成物を提供する。
脂質ナノ粒子製剤
一部の実施形態では、本発明の核酸（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ）を、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で製剤する。脂質ナノ粒子は、一般的には、イオン性カチオン脂質、非カチオン脂質、ステロール、及びＰＥＧ脂質成分を、目的の核酸カーゴと共に含む。本発明の脂質ナノ粒子は、当該技術分野で一般的に知られている構成成分、組成、及び方法を使用して生成することができる。例えば、全文献の全内容を参照により本明細書で援用する、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６０００１２９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５２１１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１を参照されたい。
本開示の核酸（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ）を、一般的には、脂質ナノ粒子にて製剤する。一部の実施形態では、当該脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン性カチオン脂質、少なくとも１つの非カチオン脂質、少なくとも１つのステロール、及び／または少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。
一部の実施形態では、当該脂質ナノ粒子は、イオン性カチオン脂質を２０～６０％のモル比で含む。例えば、当該脂質ナノ粒子は、イオン性カチオン脂質を２０～５０％、２０～４０％、２０～３０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～６０％、４０～５０％、または５０～６０％のモル比で含み得る。一部の実施形態では、当該脂質ナノ粒子は、イオン性カチオン脂質を２０％、３０％、４０％、５０、または６０％のモル比で含む。
一部の実施形態では、当該脂質ナノ粒子は、非カチオン脂質を５～２５％のモル比で含む。例えば、当該脂質ナノ粒子は、非カチオン脂質を５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２５％、１５～２０％、または２０～２５％のモル比で含み得る。一部の実施形態では、当該脂質ナノ粒子は、非カチオン脂質を５％、１０％、１５％、２０％、または２５％のモル比で含む。
一部の実施形態では、当該脂質ナノ粒子は、ステロールを２５～５５％のモル比で含む。例えば、当該脂質ナノ粒子は、ステロールを２５～５０％、２５～４５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～５５％、３０～５０％、３０～４５％、３０～４０％、３０～３５％、３５～５５％、３５～５０％、３５～４５％、３５～４０％、４０～５５％、４０～５０％、４０～４５％、４５～５５％、４５～５０％、または５０～５５％のモル比で含み得る。一部の実施形態では、当該脂質ナノ粒子は、ステロールを２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５５％のモル比で含む。
一部の実施形態では、当該脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ修飾脂質を０．５～１５％のモル比で含む。例えば、当該脂質ナノ粒子は、０．５～１０％、０．５～５％、１～１５％、１～１０％、１～５％、２～１５％、２～１０％、２～５％、５～１５％、５～１０％、または１０～１５％のモル比で含み得る。一部の実施形態では、当該脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ修飾脂質を０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％のモル比で含む。
一部の実施形態では、当該脂質ナノ粒子は、イオン性カチオン脂質を２０～６０％、非カチオン脂質を５～２５％、ステロールを２５～５５％、及びＰＥＧ修飾脂質を０．５～１５％のモル比で含む。
イオン性脂質
一部の態様では、本開示のイオン性脂質は、式（Ｉ）の化合物：
Figure 2025028860000014
もしくは、そのＮ－オキシド、またはその塩、もしくは、異性体の１種以上であり、式中；
Ｒ１は、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択する；
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択する、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒に、複素環または炭素環を形成する；
Ｒ４は、水素、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択する、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択し、かつ各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択する；
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択する；
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択する；
Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択する、ここで、Ｍ”は、結合、Ｃ１－１３アルキルまたはＣ２－１３アルケニルである；
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択する；
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択する；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環、及び複素環からなる群から選択する；
各Ｒは、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択する；
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択する；
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１５アルキル、及びＣ３－１５アルケニルからなる群から選択する；
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択する；
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環である；
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択する、かつ、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択する、ここで、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４、または５である場合に、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２ではなく、または（ｉｉ）ｎが１または２である場合に、Ｑは、５員、６員、または７員ヘテロシクロアルキルではない。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとして、式（ＩＡ）の化合物：
Figure 2025028860000015
もしくは、そのＮ－オキシド、またはその塩、もしくは、異性体があり、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択する；ｍは、５、６、７、８、及び９から選択する；Ｍ１は、結合またはＭ’である；Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルである；Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択する；及びＲ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択する。例えば、ｍは、５、７、または９である。例えば、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。例えば、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとして、式（ＩＢ）の化合物：
Figure 2025028860000016
もしくは、そのＮ－オキシド、またはその塩、もしくは、異性体があり、式中、すべての変項は、本明細書で定義するとおりである。例えば、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択する；Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルである；Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択する；及びＲ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択する。例えば、ｍは、５、７、または９である。例えば、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。例えば、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとして、式（ＩＩ）の化合物：
Figure 2025028860000017
もしくは、そのＮ－オキシド、またはその塩、もしくは、異性体があり、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択する；Ｍ１は、結合またはＭ’である；Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１－アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、かつ、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルである；Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択する；及びＲ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択する。
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）の化合物、
Figure 2025028860000018
もしくは、そのＮ－オキシド、またはその塩、もしくは、異性体であり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載のとおりである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）の化合物、
Figure 2025028860000019
もしくは、そのＮ－オキシド、またはその塩、もしくは、異性体であり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載のとおりである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）の化合物：
Figure 2025028860000020
もしくは、そのＮ－オキシド、またはその塩、もしくは、異性体であり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載のとおりである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｆ）の化合物：
Figure 2025028860000021
もしくは、そのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－であり、Ｍ”は、Ｃ１－６アルキルまたはＣ２－６アルケニルであり、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ５－１４アルキル、及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、及び４から選択する］。
さらなる実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）の化合物：
Figure 2025028860000022
もしくは、そのＮ－オキシド、またはその塩、もしくは、異性体であり、式中、ｎは、２、３、または４であり、かつ、ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２～Ｒ６は、本明細書に記載のとおりである。例えば、Ｒ２及びＲ３のそれぞれは、独立して、Ｃ５－１４アルキル、及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択し得る。
さらなる実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｇ）の化合物：
Figure 2025028860000023
もしくは、そのＮ－オキシド、またはその塩、もしくは、異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択する；ｍは、５、６、７、８、及び９から選択する；Ｍ１は、結合またはＭ’である；Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択する；及びＲ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択する。例えば、Ｍ”は、Ｃ１－６アルキル（例えば、Ｃ１－４アルキル）、またはＣ２－６アルケニル（例えば、Ｃ２－４アルケニル）である。例えば、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ５―１４アルキル、及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択する。
一部の実施形態では、当該イオン性脂質は、米国特許出願第６２／２２０，０９１号、同第６２／２５２，３１６号、同第６２／２５３，４３３号、同第６２／２６６，４６０号、同第６２／３３３，５５７号、同第６２／３８２，７４０号、同第６２／３９３，９４０号、同第６２／４７１，９３７号、同第６２／４７１，９４９号、同第６２／４７５，１４０号、及び同第６２／４７５，１６６号、及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２に記載の化合物のうちの１種以上である。
一部の実施形態では、当該イオン性脂質は、米国特許出願第６２／４７５，１６６号に記載の化合物１～２８０から選択する。
一部の実施形態では、当該イオン性脂質は、
Figure 2025028860000024
（化合物ＩＩ）、またはその塩である。
一部の実施形態では、当該イオン性脂質は、
Figure 2025028860000025
（化合物ＩＩＩ）、またはその塩である。
一部の実施形態では、当該イオン性脂質は、
Figure 2025028860000026
（化合物ＩＶ）、またはその塩である。
一部の実施形態では、当該イオン性脂質は、
Figure 2025028860000027
（化合物Ｖ）、またはその塩である。
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、または（ＩＩｇ）による脂質の中心アミン部分は、生理学的ｐＨでプロトン化し得る。したがって、脂質は、生理学的ｐＨで正電荷または部分的正電荷を持ち得る。そのような脂質は、カチオンまたはイオン性（アミノ）脂質と称し得る。また、脂質は、双性イオン性、すなわち、正電荷及び負電荷の両方を有する中性分子とし得る。
一部の態様では、本開示のイオン性脂質は、式（ＩＩＩ）の化合物、
Figure 2025028860000028
またはその塩、もしくは、異性体のうちの１種以上であり、式中、
Ｗは、
Figure 2025028860000029
であり、
環Ａは、
Figure 2025028860000030
であり、
ｔは、１または２である；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ、独立して、ＣＨまたはＮから選択する；
Ｚは、ＣＨ２であるか、存在せず、その際、ＺがＣＨ２である場合には点線（１）及び（２）はそれぞれ、単結合を表し、かつ、Ｚが存在しない場合には、点線（１）及び（２）は両方とも存在しない；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択する；
Ｒｘ１及びＲｘ２は、それぞれ、独立して、ＨまたはＣ１－３アルキルである；
各Ｍは、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択する；
Ｍ＊は、Ｃ１－Ｃ６アルキルである；
Ｗ１及びＷ２は、それぞれ、独立して、－Ｏ－及び－Ｎ（Ｒ６）－からなる群から選択する；
各Ｒ６は、独立して、Ｈ、及びＣ１－５アルキルからなる群から選択する；
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、独立して、結合、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎ－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択する；
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環である；
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択する；
各Ｒは、独立して、Ｃ１－３アルキル、及びＣ３－６炭素環からなる群から選択する；
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択する、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１２アルキル、Ｃ３－１２アルケニル、及び－Ｒ＊ＭＲ’からなる群から選択する；及び
ｎは、１～６の整数である；
環Ａが、
Figure 2025028860000031
である場合、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではなく；及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。
一部の実施形態では、化合物は、式（ＩＩＩａ１）～（ＩＩＩａ８）のいずれかである：
Figure 2025028860000032
（ＩＩＩａ１）、
Figure 2025028860000033
（ＩＩＩａ２）、
Figure 2025028860000034
（ＩＩＩａ３）、
Figure 2025028860000035
（ＩＩＩａ４）、
Figure 2025028860000036
（ＩＩＩａ５’）、
Figure 2025028860000037
（ＩＩＩａ６）、
Figure 2025028860000038
（ＩＩＩａ７）、または
Figure 2025028860000039
（ＩＩＩａ８）。
一部の実施形態では、当該イオン性脂質は、米国特許出願第６２／２７１，１４６号、同第６２／３３８，４７４号、同第６２／４１３，３４５号、及び同第６２／５１９，８２６号、ならびに、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００に記載の化合物のうちの１つ以上である。
一部の実施形態では、当該イオン性脂質は、米国特許出願第６２／５１９，８２６号に記載の化合物１～１５６から選択する。
一部の実施形態では、当該イオン性脂質は、米国特許出願第６２／５１９，８２６号に記載の化合物１～１６、４２～６６、６８～７６、及び７８～１５６から選択する。
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、
Figure 2025028860000040
（化合物ＶＩ）、またはその塩である。
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、
（化合物ＶＩＩ）、またはその塩である。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、または（ＩＩＩａ８）による脂質の中心アミン部分は、生理学的ｐＨでプロトン化し得る。したがって、脂質は、生理学的ｐＨで正電荷または部分的正電荷を持つことができる。そのような脂質は、カチオンまたはイオン性（アミノ）脂質と称し得る。また、脂質を、双性イオン性とし得る、すなわち、正電荷及び負電荷の両方を有する中性分子とし得る。
リン脂質
本明細書に開示した脂質ナノ粒子組成物の脂質組成物は、１つ以上のリン脂質、例えば、１つ以上の飽和もしくは（ポリ）不飽和リン脂質、またはそれらの組合せを含むことができる。一般に、リン脂質は、リン脂質部分と、１つ以上の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる群から選択することができるが、これらに限定されない。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択することができるが、これらに限定されない。
特定のリン脂質は、膜への融合を容易にすることができる。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負荷電リン脂質と相互作用することができる。リン脂質の膜への融合は、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つ以上の要素（例えば、治療薬）が膜を通過することを可能にし、例えば、１つ以上の要素の標的組織への送達を可能にする。
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含む非天然リン脂質種も企図する。例えば、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合で置換したアルケニル基）で官能化または架橋することができる。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドへの曝露時に、銅触媒付加環化を受ける。そのような反応は、ナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化して、膜透過もしくは細胞認識を促す際に、またはナノ粒子組成物を、有用な構成成分、例えば、標的化もしくはイメージング部分（例えば、色素）にコンジュゲートさせる際に有用である。
リン脂質として、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸があるが、これらに限定されない。リン脂質として、スフィンゴミエリンなどのホスホスフィンゴ脂質もある。
一部の実施形態では、本発明のリン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ）、１－オレオイル－２コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物を含む。
ある特定の実施形態では、本発明で有用である、または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、ＤＳＰＣのアナログまたはバリアントである。特定の実施形態では、本発明で有用である、または潜在的に有用であるリン脂質は、式（ＩＶ）の化合物：
Figure 2025028860000041
またはその塩であり、式中：
それぞれのＲ１は、独立して、任意に置換したアルキルである；または任意に、２個のＲ１は、間にある原子と一緒になって結合して、任意に置換した単環式カルボシクリルもしくは任意に置換した単環式ヘテロシクリルを形成している；または任意に、３個のＲ１は、間にある原子と一緒になって結合して、任意に置換した二環式カルボシクリルまたは任意に置換した二環式ヘテロシクリルを形成している；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である；
Ａは、式：
Figure 2025028860000042
である；
Ｌ２のそれぞれの例は、独立して、結合または任意に置換したＣ１－６アルキレンであり、任意に置換したＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で任意に置換している；
Ｒ２のそれぞれの例は、独立して、任意に置換したＣ１－３０アルキル、任意に置換したＣ１－３０アルケニル、または任意に置換したＣ１－３０アルキニルである；任意に、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換したカルボシクリレン、任意に置換したヘテロシクリレン、任意に置換したアリーレン、任意に置換したヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、－Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置換している；
ＲＮのそれぞれの例は、独立して、水素、任意に置換したアルキル、または窒素保護基である；
環Ｂは、任意に置換したカルボシクリル、任意に置換したヘテロシクリル、任意に置換したアリール、または任意に置換したヘテロアリールである；
ｐは、１または２である；
ただし、当該化合物は、式：
Figure 2025028860000043
の化合物ではないことを条件とし、
ここで、Ｒ２のそれぞれの例は、独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである。
一部の実施形態では、当該リン脂質は、米国特許出願第６２／５２０，５３０号に記載されたリン脂質のうちの１つ以上とし得る。
ｉ）リン脂質ヘッド修飾
ある特定の実施形態では、本発明で有用である、または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、修飾リン脂質ヘッド（例えば、修飾コリン基）を含む。ある特定の実施形態では、修飾ヘッドを有するリン脂質は、修飾４級アミンを有するＤＳＰＣ、またはそのアナログである。例えば、式（ＩＶ）の実施形態では、Ｒ１のうちの少なくとも１つは、メチルではない。ある特定の実施形態では、Ｒ１のうちの少なくとも１つは、水素またはメチルではない。ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物：
Figure 2025028860000044
またはその塩であり、式中：
それぞれのｔは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である；
それぞれのｕは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である；及び
それぞれのｖは、独立して、１、２、または３である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＶ－ａ）の化合物：
Figure 2025028860000045
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本発明で有用である、または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を含む。ある特定の実施形態では、本発明で有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を有するＤＳＰＣまたはそのアナログである。ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＶ－ｂ）の化合物：
Figure 2025028860000046
またはその塩である。
リン脂質尾部修飾
ある特定の実施形態では、本発明で有用である、または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、修飾尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明で有用である、または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、修飾尾部を有するＤＳＰＣ、またはそのアナログである。本明細書に記載する「修飾尾部」とは、より短い、またはより長い脂肪族鎖、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、１つ以上のメチレンが環式もしくはヘテロ原子基により置き換えられている脂肪族鎖、またはそれらのあらゆる組合せを有する尾部のことを指し得る。例えば、ある特定の実施形態では、（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＶ－ａ）の化合物、またはその塩であり、式中、Ｒ２の少なくとも一例は、任意に置換したＣ１－３０アルキルであるＲ２のそれぞれの例であり、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換したカルボシクリレン、任意に置換したヘテロシクリレン、任意に置換したアリーレン、任意に置換したヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置換する。
ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＶ－ｃ）の化合物：
Figure 2025028860000047
またはその塩であり、式中：
それぞれのｘは、独立して、０及び３０を含む０～３０の整数である；及び
Ｇのそれぞれの例は、独立して、任意に置換しているカルボシクリレン、任意に置換しているヘテロシクリレン、任意に置換しているアリーレン、任意に置換しているヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、－Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏからなる群から選択する。それぞれの可能性は、別個の本発明の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、本発明で有用である、または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、修飾ホスホコリン部分を含み、式中、第四級アミンをホスホリル基に結合するアルキル鎖は、エチレンではない（例えば、ｎは、２ではない）。したがって、ある特定の実施形態では、本発明で有用である、または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、式中、ｎが１、３、４、５、６、７、８、９、または１０である式（ＩＶ）の化合物である。例えば、ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、次の式；
Figure 2025028860000048
のうちの１つの化合物、またはその塩である。
代替脂質
ある特定の実施形態では、本発明で有用である、または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、第四級アミンをホスホリル基に結合するアルキル鎖がエチレンではない（例えば、ｎは、２ではない）修飾ホスホコリン部分を含む。したがって、ある特定の実施形態では、リン脂質が有用である。
ある特定の実施形態では、代替の脂質を、本開示のリン脂質の代わりに使用する。
ある特定の実施形態では、本発明の代替の脂質は、オレイン酸である。
ある特定の実施形態では、当該代替の脂質は、以下のうちの１つである：
Figure 2025028860000049

Figure 2025028860000050
構造脂質
本明細書に開示した医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上の構造脂質を含むことができる。本明細書で使用する用語「構造脂質」とは、ステロール、さらに、ステロール部分を含有する脂質のことを指す。
脂質ナノ粒子での構造脂質の組み込みは、粒子でのその他の脂質の凝集を弱めるのに役立ち得る。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、アルファトコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含む群から選択することができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、当該構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義する「ステロール」とは、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。ある特定の実施形態では、当該構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、当該構造脂質は、コレステロールのアナログである。ある特定の実施形態では、当該構造脂質は、アルファトコフェロールである。
一部の実施形態では、当該構造脂質は、米国特許出願第６２／５２０，５３０号に記載の構造脂質のうちの１つ以上とし得る。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質
本明細書に開示した医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含むことができる。
本明細書で使用する用語「ＰＥＧ脂質」とは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質のことを指す。ＰＥＧ脂質の例として、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧセラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４、またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンがあるが、これらに限定されない。そのような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも称する。例えば、ＰＥＧ脂質を、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質とすることができる。
一部の実施形態では、当該ＰＥＧ脂質として、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステニルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）があるが、これらに限定されない。
一実施形態では、当該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択する。
一部の実施形態では、当該ＰＥＧ脂質の脂質部分は、約Ｃ１４～約Ｃ２２、好ましくは、約Ｃ１４～約Ｃ１６の長さを有するものを含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ－ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一実施形態では、当該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
一実施形態では、本明細書に記載した脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含むことができる。非拡散性ＰＥＧの例として、ＰＥＧ－ＤＳＧ、及びＰＥＧ－ＤＳＰＥがあるが、これらに限定されない。
ＰＥＧ脂質は、それらの全内容を参照により本明細書で援用する米国特許第８１５８６０１号、及び国際公開ＷＯ２０１５／１３０５８４Ａ２に記載のものなど、当該技術分野で公知である。
一般的に、本明細書に記載した種々の式のその他の脂質構成成分（例えば、ＰＥＧ脂質）の一部は、その全内容を参照により本明細書で援用する「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」の名称が付された、２０１６年１２月１０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号に記載されているようにして、合成し得る。
脂質ナノ粒子組成物の脂質構成成分は、ポリエチレングリコールを含む１つ以上の分子、例えば、ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を含むことができる。あるいは、そのような種は、ＰＥＧ化脂質と称し得る。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾されている脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む群から選択し得るが、それらに限定されない。例えば、ＰＥＧ脂質を、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質とし得る。
一部の実施形態では、当該ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ－ＤＭＧは、以下の構造を有する：
Figure 2025028860000051
一実施形態では、本発明で有用なＰＥＧ脂質は、その全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２０１２０９９７５５に記載されたＰＥＧ化脂質とすることができる。本明細書に記載したこれらの例示的なＰＥＧ脂質のいずれもが、ヒドロキシル基をＰＥＧ鎖に含むように修飾し得る。ある特定の実施形態では、当該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である。本明細書で一般的に定義するとおり、「ＰＥＧ－ＯＨ脂質」（本明細書では「ヒドロキシＰＥＧ化脂質」とも称する）は、１つ以上のヒドロキシル（－ＯＨ）基を脂質に有するＰＥＧ化脂質である。ある特定の実施形態では、当該ＰＥＧ－ＯＨ脂質は、１つ以上のヒドロキシル基をＰＥＧ鎖に含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨまたはヒドロキシＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に－ＯＨ基を含む。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、本発明で有用なＰＥＧ脂質は、式（Ｖ）の化合物である。本明細書では、式（Ｖ）の化合物：
Figure 2025028860000052
またはその塩を提供しており；式中：
Ｒ３は、－ＯＲＯである；
ＲＯは、水素、任意に置換したアルキル、または酸素保護基である；
ｒは、１及び１００を含む、１～１００の整数である；
Ｌ１は、任意に置換したＣ１～１０アルキレンであり、その際、任意に置換したＣ１－１０アルキレンのうちの少なくとも１つのメチレンは、独立して、任意に置換したカルボシクリレン、任意に置換したヘテロシクリレン、任意に置換したアリーレン、任意に置換したヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、－ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置換する；
Ｄは、クリックケミストリーにより得られる部分、または生理的条件下で切断可能な部分である；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である；
Ａは、式：
Figure 2025028860000053
である；
Ｌ２のそれぞれの例は、独立して、結合または任意に置換したＣ１－６アルキレンであり、その際、任意に置換したＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で任意に置換する；
Ｒ２のそれぞれの例は、独立して、任意に置換したＣ１－３０アルキル、任意に置換したＣ１－３０アルケニル、または任意に置換したＣ１－３０アルキニルである；任意に、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換したカルボシクリレン、任意に置換したヘテロシクリレン、任意に置換したアリーレン、任意に置換したヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、－Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置換する；
ＲＮのそれぞれの例は、独立して、水素、任意に置換したアルキル、または窒素保護基である；
環Ｂは、任意に置換したカルボシクリル、任意に置換したヘテロシクリル、任意に置換したアリール、または任意に置換したヘテロアリールである；及び
ｐは、１または２である。
ある特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質（すなわち、Ｒ３は、－ＯＲＯであり、ＲＯは、水素である）である。ある特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖ－ＯＨ）の化合物
Figure 2025028860000054
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本発明で有用なＰＥＧ脂質は、ペグ化脂肪酸である。ある特定の実施形態では、本発明で有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ）の化合物である。本明細書では、式（ＶＩ）の化合物：
Figure 2025028860000055
またはその塩を提供しており、式中：
Ｒ３は、－ＯＲＯである；
ＲＯは、水素、任意に置換しているアルキルまたは酸素保護基である；
ｒは、１及び１００を含む、１～１００の整数である；
Ｒ５は、任意に置換しているＣ１０－４０アルキル、任意に置換しているＣ１０－４０アルケニル、または任意に置換している１０－４０アルキニルであり；及び任意に、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、任意に置換しているカルボシクリレン、任意に置換しているヘテロシクリレン、任意に置換しているアリーレン、任意に置換しているヘテロアリーレン、Ｎ（ＲN）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲN）、ＮＲNＣ（Ｏ）、ＮＲNＣ（Ｏ）Ｎ（ＲN）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲN）、－ＮＲNＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲN）、Ｃ（＝ＮＲN）Ｎ（ＲN）、ＮＲNＣ（＝ＮＲN）、ＮＲNＣ（＝ＮＲN）Ｎ（ＲN）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲN）、ＮＲNＣ（Ｓ）、ＮＲNＣ（Ｓ）Ｎ（ＲN）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲN）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲN）、Ｎ（ＲN）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲN）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲN）、Ｎ（ＲN）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲN）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲN）、Ｎ（ＲN）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲN）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲN）、またはＮ（ＲN）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置換している；
ＲＮのそれぞれの例は、独立して、水素、任意に置換しているアルキル、または窒素保護基である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ－ＯＨ）：
Figure 2025028860000056
（ＶＩ－ＯＨ）
の化合物、またはその塩である。一実施形態では、ｒは、１～１００の整数であり、両端の数字を含む。一部の実施形態では、ｒは、４５である。
なおもその他の実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は：
Figure 2025028860000057
またはその塩である。
一実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は
Figure 2025028860000058
（化合物Ｉ）である。
一部の態様では、本明細書に開示した医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ脂質を含まない。
一部の実施形態では、当該ＰＥＧ脂質は、米国特許出願第６２／５２０，５３０号に記載のＰＥＧ脂質のうちの１つ以上とし得る。
一部の実施形態では、本発明のＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む。一部の実施形態では、当該ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（別名、ＰＥＧ－ＤＯＭＧ）、ＰＥＧ－ＤＳＧ、及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧである。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのいずれかのイオン性カチオン脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ－ＤＭＧを含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのいずれかのイオン性カチオン脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのイオン性カチオン脂質、式ＩＶを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶまたはＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのイオン性カチオン脂質、式ＩＶを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶまたはＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのイオン性カチオン脂質、式ＩＶを有するリン脂質、構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、
Figure 2025028860000059
のイオン性カチオン脂質、及び式ＶＩを含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、
Figure 2025028860000060
のイオン性カチオン脂質、及びオレイン酸を含む代替脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、
Figure 2025028860000061
のイオン性カチオン脂質、オレイン酸を含む代替脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、
Figure 2025028860000062
のイオン性カチオン脂質、ＤＯＰＥを含むリン脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、

のイオン性カチオン脂質、ＤＯＰＥを含むリン脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式ＶＩＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約２：１～約３０：１のＮ：Ｐ比を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約６：１のＮ：Ｐ比を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約３：１のＮ：Ｐ比を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約１０：１～約１００：１のイオン性カチオン脂質構成成分とＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約２０：１のイオン性カチオン脂質構成成分とＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約１０：１のイオン性カチオン脂質構成成分とＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの平均直径を有する。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約７０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均直径を有する。
本明細書で使用する用語「アルキル」、「アルキル基」、または「アルキレン」とは、任意に置換している、１個以上の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれを超える個数の炭素原子）を含む直鎖状または分岐状の飽和炭化水素を意味する。表記「Ｃ１－１４アルキル」とは、１～１４個の炭素原子を含む、任意に置換している直鎖状または分枝状の飽和炭化水素を意味する。特に断りのない限り、本明細書に記載のアルキル基は、非置換及び置換アルキル基の両方を指す。
本明細書で使用する用語「アルケニル」、「アルケニル基」、または「アルケニレン」とは、任意に置換している、２個以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれを超える個数の炭素原子）、及び少なくとも１つの二重結合を含む直鎖状または分岐状の炭化水素を意味する。表記「Ｃ２－１４アルケニル」は、任意に置換している、２～１４個の炭素原子、及び少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を含む直鎖状または分枝状の炭化水素を意味する。アルケニル基は、１、２、３、４、またはそれを超える個数の炭素－炭素二重結合を含むことができる。例えば、Ｃ１８アルケニルは、１つ以上の二重結合を含み得る。２つの二重結合を含むＣ１８アルケニル基を、リノレイル基とし得る。特に断りのない限り、本明細書に記載のアルケニル基は、非置換及び置換アルケニル基の両方を指す。
本明細書で使用する用語「アルキニル」、「アルキニル基」、または「アルキニレン」とは、任意に置換している、２個以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれを超える個数の炭素原子）、及び少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を含む直鎖状または分岐状の炭化水素を意味する。表記「Ｃ２－１４アルキニル」とは、任意に置換している、２～１４個の炭素原子、及び少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を含む直鎖状または分枝状の炭化水素を意味する。アルキニル基は、１、２、３、４、またはそれを超える個数の炭素－炭素三重結合を含むことができる。例えば、Ｃ１８アルキニルは、１つ以上の炭素－炭素三重結合を含み得る。特に断りのない限り、本明細書に記載のアルキニル基は、非置換及び置換アルキニル基の両方を指す。
本明細書で使用する用語「炭素環」または「炭素環式基」とは、炭素原子の１つ以上の環を含む、任意に置換している単環または多環系を意味する。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０員環とし得る。表記「Ｃ３－６炭素環」とは、３～６個の炭素原子を有する単環を含む炭素環を意味する。炭素環は、１つ以上の炭素－炭素二重または三重結合を含み得るものであり、非芳香族または芳香族（例えば、シクロアルキルまたはアリール基）とし得る。炭素環の例として、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチル、及び１，２－ジヒドロナフチル基がある。本明細書で使用する用語「シクロアルキル」とは、非芳香族炭素環を意味し、あらゆる二重または三重結合を含み得る、または含み得ない。特に断りがない限り、本明細書に記載の炭素環は、非置換及び置換の両方の炭素環基、すなわち、任意に置換されている炭素環のことを指す。
本明細書で使用する用語「複素環」または「複素環基」とは、少なくとも１つの環が、少なくとも１個のヘテロ原子を含む１つ以上の環を含む、任意に置換している単環または多環系を意味する。ヘテロ原子は、例えば、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子とし得る。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４員環とし得る。複素環は、１つ以上の二重または三重結合を含み得るものであり、非芳香族または芳香族（例えば、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロアリール基）とし得る。複素環の例として、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、及びイソキノリル基がある。本明細書で使用する用語「ヘテロシクロアルキル」とは、非芳香族複素環を意味しており、あらゆる二重または三重結合を含み得る、または含み得ない。特に断りがない限り、本明細書に記載の複素環は、非置換及び置換の両方の複素環基、すなわち、任意に置換している複素環のことを指す。
本明細書で使用する用語「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、または「ヘテロアルキニル」は、それぞれ、１個以上（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）のヘテロ原子（例えば、酸素、硫黄、窒素、ホウ素、ケイ素、リン）をさらに含み、その１個以上のヘテロ原子が、親炭素鎖内の隣接する炭素原子の間に挿入されており、及び／または１個以上のヘテロ原子が、炭素原子と親分子との間、すなわち、結合点の間に挿入されている、本明細書で定義するアルキル、アルケニル、アルキニル基のことを指す。特に断りのない限り、本明細書に記載のヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルは、非置換及び置換の両方のヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニル、すなわち、任意に置換しているヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルのことを指す。
本明細書で使用する「生分解性基」とは、哺乳動物実体の脂質のさらに迅速な代謝を促すことができる基である。生分解性基は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択し得るが、これらに限定されない。本明細書で使用する「アリール基」とは、１つ以上の芳香環を含む任意に置換している炭素環式基である。アリール基の例として、フェニル及びナフチル基がある。本明細書で使用する「ヘテロアリール基」とは、１つ以上の芳香環を含む任意に置換している複素環基である。ヘテロアリール基の例として、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、及びチアゾリルがある。アリール基、及びヘテロアリール基の両方は、任意に置換し得る。例えば、Ｍ及びＭ’は、任意に置換したフェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる限定を意図していない基から選択することができる。本明細書の式では、Ｍ及びＭ’は、独立して、上記した生分解性基のリストから選択することができる。特に断りのない限り、本明細書に記載したアリールまたはヘテロアリール基は、非置換及び置換の両方の基、すなわち、任意に置換しているアリールまたはヘテロアリール基のことを指す。
アルキル、アルケニル、及びシクリル（例えば、カルボシクリル、及びヘテロシクリル）基は、特に断りのない限り、任意に置換し得る。任意の置換基は、ハロゲン原子（例えば、クロリド、ブロミド、フルオリド、またはヨージド基）、カルボン酸（例えば、Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、ＯＨ）、エステル（例えば、Ｃ（Ｏ）ＯＲ ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、Ｃ（Ｏ）Ｒ、あるいは、Ｃ＝Ｏで表す）、ハロゲン化アシル（例えば、Ｃ（Ｏ）Ｘ（式中、Ｘは、ブロミド、フルオリド、クロリド、及びヨージドから選択するハロゲン化物である））、カルボナート（例えば、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、ＯＲ）、アセタール（例えば、Ｃ（ＯＲ）２Ｒ””（式中、各ＯＲは、同じ、または異なる可能性があるアルコキシ基であり、Ｒ””は、アルキル基またはアルケニル基である）、ホスファート（例えば、Ｐ（Ｏ）４３－）、チオール（例えば、ＳＨ）、スルホキシド（例えば、Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（例えば、Ｃ（Ｓ）Ｈ）、スルファート（例えば、Ｓ（Ｏ）４２－）、スルホニル（例えば、Ｓ（Ｏ）２）、アミド（例えば、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、またはＮ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、Ｎ３）、ニトロ（例えば、ＮＯ２）、シアノ（例えば、ＣＮ）、イソシアノ（例えば、ＮＣ）、アシロキシ（例えば、ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、ＮＲ２、ＮＲＨ、またはＮＨ２）、カルバモイル（例えば、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨ、またはＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ、またはＮ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、及びシクリル（例えば、カルボシクリル、またはヘテロシクリル）基からなる群から選択し得るが、これらに限定されない。上記のいずれかでは、Ｒは、本明細書で定義するアルキルまたはアルケニル基である。一部の実施形態では、置換基自体が、例えば、本明細書で定義する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの置換基でさらに置換し得る。例えば、Ｃ１ ６アルキル基は、本明細書に記載したような１、２、３、４、５、または６の置換基でさらに置換し得る。
窒素を含有する本開示の化合物を、酸化剤（例えば、３－クロロペルオキシ安息香酸（ｍＣＰＢＡ）、及び／または過酸化水素）で処理してＮ－オキシドに変換すると、本開示のその他の化合物を得ることができる。したがって、開示している、及び特許請求する窒素含有化合物はすべて、原子価及び構造が許容する場合には、開示している化合物、及びそのＮ－オキシド誘導体（Ｎ ＯまたはＮ＋－Ｏ―と示すことができる）の両方を含むと判断する。さらに、その他の例では、本開示の化合物での窒素を、Ｎ－ヒドロキシ、またはＮ－アルコキシ化合物に変換することができる。例えば、Ｎ－ヒドロキシ化合物は、親アミンをｍＣＰＢＡなどの酸化剤で酸化させることにより調製することができる。開示している、及び特許請求する窒素含有化合物はすべて、原子価及び構造が許容する場合には、開示している化合物、ならびに、そのＮ－ヒドロキシ（すなわち、Ｎ－ＯＨ）、及びＮ－アルコキシ（すなわち、Ｎ－ＯＲ、ここで、Ｒは、置換または非置換Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルケニル、Ｃ１－Ｃ６アルキニル、３～１４員炭素環、または３～１４員複素環）誘導体の両方をカバーしているものと考えられる。
（ｖｉ）その他の脂質組成物構成成分
本明細書に開示した医薬組成物の脂質組成物は、前出のものに加えて、１つ以上の構成成分を含むことができる。例えば、当該脂質組成物は、１つ以上の透過促進分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤（例えば、界面活性剤）、またはその他の構成成分を含むことができる。例えば、透過促進分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載の分子とすることができる。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）、及び多糖（例えば、グリコーゲン、ならびに、その誘導体及びアナログ）を含むことができる。
ポリマーは、本明細書に開示した医薬組成物（例えば、脂質ナノ粒子形態の医薬組成物）に含めて、及び／またはそれを封入もしくは部分的に封入するために使用することができる。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性のものとすることができる。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバマート、ポリ尿素、ポリカルボナート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアナート、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリーラートから選択することができるが、これらに限定されない。
脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比の範囲は、約１０：１～約６０：１（ｗｔ／ｗｔ）とすることができる。
一部の実施形態では、脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比率は、約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、または６０：１（ｗｔ／ｗｔ）とすることができる。一部の実施形態では、脂質組成物対治療薬をコードするポリヌクレオチドのｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１または約１５：１である。
一部の実施形態では、本明細書に開示した医薬組成物は、複数のポリペプチドを含有することができる。例えば、本明細書に開示した医薬組成物は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有することができる。
一実施形態では、本明細書に記載した脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、もしくは、７０：１の脂質：ポリヌクレオチド重量比、またはこれらの比の範囲もしくはいずれか、例えば、５：１～約１０：１、約５：１～約１５：１、約５：１～約２０：１、約５：１～約２５：１、約５：１～約３０：１、約５：１～約３５：１、約５：１～約４０：１、約５：１～約４５：１、約５：１～約５０：１、約５：１～約５５：１、約５：１～約６０：１、約５：１～約７０：１、約１０：１～約１５：１、約１０：１～約２０：１、約１０：１～約２５：１、約１０：１～約３０：１、約１０：１～約３５：１、約１０：１～約４０：１、約１０：１～約４５：１、約１０：１～約５０：１、約１０：１～約５５：１、約１０：１～約６０：１、約１０：１～約７０：１、約１５：１～約２０：１、約１５：１～約２５：１，約１５：１～約３０：１、約１５：１～約３５：１、約１５：１～約４０：１、約１５：１～約４５：１、約１５：１～約５０：１、約１５：１～約５５：１、約１５：１～約６０：１、もしくは、約１５：１～約７０：１で含むことができるが、これらに限定されない。
一実施形態では、本明細書に記載した脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチドを、約０．１ｍｇ／ｍｌ～２ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、または２．０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で含むことができるが、これらに限定されない。
（ｖｉｉ）ナノ粒子組成物
一部の実施形態では、本明細書に開示した医薬組成物を、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤する。したがって、本開示は、（ｉ）本明細書に記載した化合物などの送達剤を含む脂質組成物、及び（ｉｉ）ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物も提供する。本開示は、（ｉ）本明細書に記載した化合物などの送達剤を含む脂質組成物、ならびに（ｉｉ）ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物も提供する。そのようなナノ粒子組成物では、本明細書に開示した脂質組成物は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを封入することができる。
ナノ粒子組成物は、通常、マイクロメートル台以下の大きさであり、脂質二重層を含むことができる。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質ベシクル）、及びリポプレックスを含む。例えば、ナノ粒子組成物は、５００ｎｍ以下の直径を有する脂質二重層を有するリポソームとすることができる。
ナノ粒子組成物は、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、及びリポプレックスを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、１つ以上の脂質二重層を含むベシクルである。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水性区画で隔てられた２つ以上の同心二重層を含む。脂質二重層は、官能化、及び／または互いに架橋することができる。脂質二重層は、１つ以上のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含むことができる。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン性脂質、構造脂質、リン脂質、及びｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、イオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び構造脂質を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約２０～６０％のイオン性脂質、約５～２５％の構造脂質、約２５～５５％のステロール、及び約０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を有する。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、０．４未満の多分散値を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、中性ｐＨで正味中性電荷を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、５０～１５０ｎｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、８０～１００ｎｍの平均直径を有する。
本明細書で一般的に定義している用語「脂質」とは、疎水性または両親媒性特性を有する小分子のことを指す。脂質は、天然に生じる脂質または合成脂質とし得る。脂質の部類の例として、脂肪、ワックス、ステロール含有代謝産物、ビタミン、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質、及びポリケチド、ならびに、プレノール脂質があるが、これらに限定されない。一部の例では、一部の脂質の両親媒性特性が故に、それらが水性媒体において、リポソーム、ベシクル、または膜を形成するようになる。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、イオン性脂質を含み得る。本明細書で使用する用語「イオン性脂質」とは、当該技術分野におけるその通常の意味を有しており、１つ以上の荷電部分を含む脂質を指し得る。一部の実施形態では、イオン性脂質は、正に荷電または負に荷電し得る。イオン性脂質は、正に荷電し得るものであり、この場合、それは、「カチオン脂質」と称し得る。ある特定の実施形態では、イオン性脂質分子は、アミン基を含み得るものであり、イオン性アミノ脂質と称し得る。本明細書で使用する「荷電部分」とは、形式電荷、例えば、一価（＋１または－１）、二価（＋２または－２）、三価（＋３または－３）などを有する化学的部分である。荷電部分は、アニオン性（すなわち、負に荷電）、またはカチオン性（すなわち、正に荷電）などとし得る。正荷電部分の例として、アミン基（例えば、１級アミン、２級アミン、及び／または３級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、及びイミジゾリウム基がある。特定の実施形態では、荷電部分は、アミン基を含む。負荷電基、またはその前駆体の例として、カルボキシラート基、スルホナート基、スルファート基、ホスホナート基、ホスファート基、ヒドロキシル基などがある。一部の事例では、荷電部分の電荷は、環境条件に伴い変動し得るものであり、例えば、ｐＨの変化は、部分の電荷を変化させ、及び／または部分を、荷電または非荷電にし得る。一般的に、分子の電荷密度は、要望に応じて選択し得る。
用語「荷電」または「荷電部分」が、分子上の「部分的負電荷」または「部分的正電荷」を指すものではない、ことを理解すべきである。用語「部分負電荷」及び「部分正電荷」には、当該技術分野での通常の意味が与えられる。電子密度が結合の一方の原子に向かって引っ張られて、官能基が、原子上に部分的な負電荷を生成するように分極化する結合を含むようになると、「部分負電荷」が発生し得る。当業者であれば、一般的に、このように分極することができる結合を認識する。
一部の実施形態では、イオン性脂質は、当該技術分野で「イオン性カチオン脂質」と称することがあるイオン性アミノ脂質である。一実施形態では、イオン性アミノ脂質は、リンカー構造を介して接続した正荷電親水性ヘッドと、疎水性尾部を有し得る。
これらに加えて、イオン性脂質は、環式アミン基を含む脂質とし得る。
一実施形態では、イオン性脂質は、全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２０１３０８６３５４、及びＷＯ２０１３１１６１２６に記載のイオン性脂質から選択し得るが、これらに限定されない。
なおも別の実施形態では、イオン性脂質は、文献の全内容を参照により本明細書で援用する米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩ－ＣＬＸＸＸＸＩＩから選択し得るが、これらに限定されない。
一実施形態では、脂質は、全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２０１２１７０８８９に記載のものなど、切断可能な脂質とし得る。ある実施形態では、脂質は、当該技術分野で公知の方法により、及び／または全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２０１３０８６３５４に記載のとおりに合成し得る。
ナノ粒子組成物は、様々な方法で特徴決定することができる。例えば、顕微鏡（例えば、透過型電子顕微鏡、または走査型電子顕微鏡）を、ナノ粒子組成物の形態、及びサイズ分布を調べるために使用することができる。動的光散乱法または電位差測定法（例えば、電位差滴定）を、ゼータ電位を測定するために使用することができる。動的光散乱法は、粒径を決定するために利用することもできる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）などの装置を、ナノ粒子組成物の複数の特徴、例えば、粒径、多分散指数、及びゼータ電位を測定するために使用することもできる。
ナノ粒子のサイズは、炎症などの生物学的反応の抑制を助長することができ、またはポリヌクレオチドの生物学的効果を増長させることができるが、これらに限定されない。
本明細書で使用するナノ粒子組成物の文脈における「サイズ」または「平均サイズ」とは、ナノ粒子組成物の平均直径のことを指す。
一実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、約１０～約１００ｎｍ、例えば、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍ、及び／または約９０～約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子で製剤するが、これらの直径に限定されない。
一実施形態では、当該ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍの直径を有する。ある実施形態では、当該ナノ粒子は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超、または１０００ｎｍ超の直径を有する。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物の最大寸法は、１μｍ以下（例えば、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ以下）である。
ナノ粒子組成物を、比較的均質なものとすることができる。多分散指数を、ナノ粒子組成物の均質性、例えば、ナノ粒子組成物の粒径分布を示すために使用することができる。小さな（例えば、０．３未満の）多分散指数は、一般的には、狭い粒径分布を示す。ナノ粒子組成物は、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５の多分散指数を有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示したナノ粒子組成物の多分散指数は、約０．１０～約０．２０とすることができる。
ナノ粒子組成物のゼータ電位を、組成物の界面動電電位を示すために使用することができる。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を表すことができる。より高い電荷種は、細胞、組織、及び体内のその他の要素と望ましくない相互作用をすることができるので、正または負の比較的少ない電荷を有するナノ粒子組成物が一般に望ましい。一部の実施形態では、本明細書に開示したナノ粒子組成物のゼータ電位を、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ～約＋１０ｍＶとすることができる。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位を、約０ｍＶ～約１００ｍＶ、約０ｍＶ～約９０ｍＶ、約０ｍＶ～約８０ｍＶ、約０ｍＶ～約７０ｍＶ、約０ｍＶ～約６０ｍＶ、約０ｍＶ～約５０ｍＶ、約０ｍＶ～約４０ｍＶ、約０ｍＶ～約３０ｍＶ、約０ｍＶ～約２０ｍＶ、約０ｍＶ～約１０ｍＶ、約１０ｍＶ～約１００ｍＶ、約１０ｍＶ～約９０ｍＶ、約１０ｍＶ～約８０ｍＶ、約１０ｍＶ～約７０ｍＶ、約１０ｍＶ～約６０ｍＶ、約１０ｍＶ～約５０ｍＶ、約１０ｍＶ～約４０ｍＶ、約１０ｍＶ～約３０ｍＶ、約１０ｍＶ～約２０ｍＶ、約２０ｍＶ～約１００ｍＶ、約２０ｍＶ～約９０ｍＶ、約２０ｍＶ～約８０ｍＶ、約２０ｍＶ～約７０ｍＶ、約２０ｍＶ～約６０ｍＶ、約２０ｍＶ～約５０ｍＶ、約２０ｍＶ～約４０ｍＶ、約２０ｍＶ～約３０ｍＶ、約３０ｍＶ～約１００ｍＶ、約３０ｍＶ～約９０ｍＶ、約３０ｍＶ～約８０ｍＶ、約３０ｍＶ～約７０ｍＶ、約３０ｍＶ～約６０ｍＶ、約３０ｍＶ～約５０ｍＶ、約３０ｍＶ～約４０ｍＶ、約４０ｍＶ～約１００ｍＶ、約４０ｍＶ～約９０ｍＶ、約４０ｍＶ～約８０ｍＶ、約４０ｍＶ～約７０ｍＶ、約４０ｍＶ～約６０ｍＶ，及び約４０ｍＶ～約５０ｍＶとすることができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位を、約１０ｍＶ～約５０ｍＶ、約１５ｍＶ～約４５ｍＶ、約２０ｍＶ～約４０ｍＶ、及び約２５ｍＶ～約３５ｍＶであり得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ、約２０ｍＶ、約３０ｍＶ、約４０ｍＶ、約５０ｍＶ、約６０ｍＶ、約７０ｍＶ、約８０ｍＶ、約９０ｍＶ、及び約１００ｍＶとすることができる。
ポリヌクレオチドの「封入効率」という用語は、提供した初期量に対する、調製後のナノ粒子組成物により封入する、または別の方法でこれと会合するポリヌクレオチドの量を表す。本明細書で使用する「封入」とは、完全な、実質的な、または部分的な閉じ込め、拘束、取り囲み、または内包を指すことができる。
封入効率は、高いことが望ましい（例えば、１００％に近い）。封入効率は、例えば、１つ以上の有機溶媒または界面活性剤でナノ粒子組成物を分解させた前後に、ナノ粒子組成物を含有する溶液でのポリヌクレオチドの量を比較して、測定することができる。
蛍光を使用して、溶液での遊離ポリヌクレオチドの量を測定することができる。本明細書に記載したナノ粒子組成物では、ポリヌクレオチドの封入効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％とすることができる。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％とすることができる。ある特定の実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％とすることができる。
本明細書に開示した医薬組成物中に存在するポリヌクレオチドの量は、複数の要因、例えば、ポリヌクレオチドのサイズ、所望の標的、及び／または用途、またはナノ粒子組成物のその他の特性、さらには、ポリヌクレオチドの特性によって定めることができる。
例えば、ナノ粒子組成物に有用なｍＲＮＡの量は、ｍＲＮＡのサイズ（長さまたは分子量として表する）、配列、及びその他の特徴によって定めることができる。ナノ粒子組成物でのポリヌクレオチドの相対量も変動することができる。
本開示の脂質組成物、及び脂質ナノ粒子組成物に存在するポリヌクレオチドの相対量は、有効性及び忍容性を考慮して最適化することができる。ポリヌクレオチドとしてｍＲＮＡを含む組成物では、Ｎ：Ｐ比は、有用なメトリックとして機能することができる。
ナノ粒子組成物のＮ：Ｐ比が、発現及び忍容性の両方を制御するので、低いＮ：Ｐ比、及び強い発現を有するナノ粒子組成物が望ましい。Ｎ：Ｐ比は、ナノ粒子組成物での脂質対ＲＮＡの比に従って変動する。
一般的に、より低いＮ：Ｐ比が、好ましい。１つ以上のＲＮＡ、脂質、及びその量は、約２：１～約３０：１、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、または３０：１のＮ：Ｐ比を提供するように選択することができる。ある特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１～約８：１とすることができる。その他の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５：１～約８：１である。特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、５：１～６：１である。特定の一態様では、Ｎ：Ｐ比は、約５．６７：１である。
ナノ粒子組成物を提供することに加えて、本開示は、ポリヌクレオチドを封入することを含む、脂質ナノ粒子を生成する方法も提供する。そのような方法は、本明細書に開示した医薬組成物のいずれかを使用すること、及び当該技術分野で公知の脂質ナノ粒子の生成方法に従って脂質ナノ粒子を生成することを含む。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ” Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．８７：６８－８０；Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｐａｒｔ Ｉ：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９４０－９５４；Ｎａｓｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｓｏｌｉｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５：３０５－１３；Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２９１－３０２、及びこれらの文献で引用されている参照文献を参照されたい。
２１．その他の送達剤
ａ．リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リポソーム、リオプレックス、脂質ナノ粒子、またはそれらのいずれかの組合せを含む。本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤することができる。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、これらの製剤が、ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増加させ、及び／またはコードしたタンパク質の翻訳を増加させるので、タンパク質産生を目的とするポリヌクレオチドの有効性を向上させるために使用することができる。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチドの安定性を上昇させるために使用することもできる。
リポソームは、主に脂質二重層で構成することができ、かつ、医薬製剤を投与するための送達ビヒクルとして使用することができる人工的に調製したベシクルである。リポソームは、種々のサイズとすることができる。マルチラメラベシクル（ＭＬＶ）は、直径が数百ナノメートルであり、狭い水性区画により隔てられた一連の同心二重層を含むことができる。スモールユニセルベシクル（ＳＵＶ）は、直径が５０ｎｍ未満であり、ラージユニラメラベシクル（ＬＵＶ）は、直径が５０～５００ｎｍのものとすることができる。リポソームの設計は、限定をするものではないが、不健康な組織へのリポソームの付着を向上させるための、または限定をするものではないが、エンドサイトーシスなどのイベントを活性化するためのオプソニンまたはリガンドを含むことができる。リポソームは、医薬製剤の送達を向上させるために、低いｐＨ値、または高いｐＨ値を含有することができる。
リポソームの形成は、封入した医薬製剤及びリポソーム成分、脂質ベシクルが分散されている媒体の性質、封入した物質の有効濃度及びその潜在的な毒性、ベシクルの適用及び／または送達中に関与するあらゆるさらなるプロセス、意図している用途のためのベシクルの最適なサイズ、多分散性及び貯蔵寿命、ならびに、バッチ間の再現性及び安全かつ効率的なリポソーム産物の生成のスケールアップなどに対応することができる。
例として、限定をするものではないが、合成膜ベシクルなどのリポソームを、米国特許出願公開第２０１３０１７７６３８号、同第２０１３０１７７６３７号、同第２０１３０１７７６３６号、同第２０１３０１７７６３５号、同第２０１３０１７７６３４号、同第２０１３０１７７６３３号、同第２０１３０１８３３７５号、同第２０１３０１８３３７３号、及び同第２０１３０１８３３７２号に記載の方法、装置、及びデバイスで調製することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、リポソームにより封入することができ、及び／またはそれは、例えば、国際公開ＷＯ２０１２０３１０４６、ＷＯ２０１２０３１０４３、ＷＯ２０１２０３０９０１、ＷＯ２０１２００６３７８、及びＷＯ２０１３０８６５２６、ならびに、米国特許出願公開第２０１３０１８９３５１号、同第２０１３０１９５９６９号、及び同第２０１３０２０２６８４号に記載のリポソームにより封入することができる水性コアに含有させることができる。それぞれの参照文献は、それらの全内容を参照により本明細書で援用する。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドを、カチオン性水中油型エマルションに製剤することができ、その際、エマルション粒子は、分子をエマルション粒子にアンカーするポリヌクレオチドと相互作用することができる油性コア及びカチオン脂質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、親水性相を分散させる連続疎水性相を含む油中水型エマルションで製剤することができる。例示的なエマルションは、全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２０１２００６３８０、及びＷＯ２０１０８７７９１に記載の方法によって作り出すことができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドを、脂質－ポリカチオン複合体中で製剤することができる。脂質－ポリカチオン複合体の形成は、例えば、米国特許出願公開第２０１２０１７８７０２号に記載された方法により達成することができる。例として、限定をするものではないが、ポリカチオンは、カチオン性ペプチド、またはポリペプチド、例えば、限定をするものではないが、ポリリシン、ポリオルニチン、及び／またはポリアルギニン、ならびに、国際公開ＷＯ２０１２０１３３２６、または米国特許出願公開第２０１３０１４２８１８号に記載のカチオン性ペプチドを含むことができる。それぞれの参照文献の全内容を参照により本明細書で援用する。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドを、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２０１３１２３５２３、ＷＯ２０１２１７０９３０、ＷＯ２０１１１２７２５５、及びＷＯ２００８１０３２７６、ならびに、米国特許出願公開第２０１３０１７１６４６号に記載された、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で製剤することができる。
脂質ナノ粒子製剤は、一般的には、１つ以上の脂質を含む。一部の実施形態では、脂質は、当該技術分野で「イオン性カチオン脂質」と称することもあるイオン性脂質（例えば、イオン性アミノ脂質）である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、リン脂質、構造脂質、及び粒子凝集を減少させることができる分子、例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質などのその他の構成成分をさらに含む。
例示的なイオン性脂質として、本明細書に開示した化合物１～３４２のうちのいずれか１つ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｄ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ４－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ、ＤＬｉｎ－ＤＡＣ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ、ＫＬ１０、ＫＬ２２、ＫＬ２５、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）、及びそれらのあらゆる組合せがあるが、これらに限定されない。その他の例示的なイオン性脂質として、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－９－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ５Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－８－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルドコサ－１３，１６－ジエン－５－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘニコサ－１２，１５－ジエン－４－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－６－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－７－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－１０－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－５－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－４－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－８－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－７－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－６－アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２，２５－ジエン－１０－アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリアコンタ－２１，２４－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７－エン－９－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－７－アミン、Ν，Ν－ジメチルヘプタコサン－１０－アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ－エチル－Ｎ－メチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－１－ノニリコサ－１１，１４－ジエン－１－イル］ピロリジン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－２０－エン－１０－アミン、（１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエプタコサ－１５－エン－１０－アミン、（１４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１４－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１７－エン－１０－アミン、（２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリトリアコンタ－２４－エン－１０－アミン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０－エン－１０－アミン、（２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２－エン－１０－アミン、（１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６－エン－８－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘニコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］エプタデカン－８－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヘキシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘニコサン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン－８－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン－５－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－｛７－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン－１－アミン、１－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヘプチルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタデカン－９－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－デシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタデカン－６－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ペンタデカン－８－アミン、Ｒ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、Ｓ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）－Ν，Ν－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－［（５Ｚ）－オクタ－５－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘプチルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－（ノニルオキシ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，９，１２－トリエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（ペンチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－３－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（９Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｈ（１－メトイルオクチル）オキシ］－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－１－［（３，７－ジメチルオクチル）オキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－（オクチルオキシ）－３－（｛８－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－｛［８－（２－オクリルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、及び（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１１，２０，２－トリエン－１０－アミン、ならびに、それらのあらゆる組合せがある。
リン脂質として、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロール及びホスファチジン酸があるが、これらに限定されない。リン脂質として、スフィンゴミエリンなどのホスホスフィンゴ脂質もある。一部の実施形態では、リン脂質は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＵＰＣ、１８：０ジエーテルＰＣ、ＤＬｎＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＨＡＰＣ、ＤＯＰＥ、４ＭＥ１６：０ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＬＰＥ，ＤＬｎＰＥ、ＤＡＰＥ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、及びそれらのあらゆる組合せである。一部の実施形態では、リン脂質は、ＭＰＰＣ、ＭＳＰＣ、ＰＭＰＣ、ＰＳＰＣ、ＳＭＰＣ、ＳＰＰＣ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、及びそれらのあらゆる組合せである。一部の実施形態では、脂質組成物でのリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）の量は、約１モル％～約２０モル％の範囲である。
構造脂質として、ステロール、及びステロール部分を含有する脂質がある。一部の実施形態では、構造脂質として、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、アルファトコフェロール、及びそれらの混合物がある。一部の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。一部の実施形態では、脂質組成物での構造脂質（例えば、コレステロール）の量は、約２０モル％～約６０モル％の範囲である。
ＰＥＧ修飾脂質として、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４、またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンがある。そのような脂質を、ＰＥＧ化脂質とも称する。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一部の実施形態では、脂質組成物でのＰＥＧ脂質の量は、約０モル％～約５モル％の範囲である。
一部の実施形態では、本明細書に記載したＬＮＰ製剤は、透過促進分子をさらに含むことができる。限定を意図していない透過促進分子は、全内容を参照により本明細書で援用する米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号に記載されている。
当該ＬＮＰ製剤は、ホスファートコンジュゲートをさらに含有することができる。ホスファートコンジュゲートは、インビボ循環時間を増加させ、及び／またはナノ粒子の標的送達を増加させることができる。ホスファートコンジュゲートは、例えば、国際公開ＷＯ２０１３０３３４３８、または米国特許出願公開第２０１３０１９６９４８号に記載の方法により作り出すことができる。ＬＮＰ製剤は、例えば、米国特許出願公開第２０１３００５９３６０号、同第２０１３０１９６９４８号、及び同第２０１３００７２７０９号に記載のポリマーコンジュゲート（例えば、水溶性コンジュゲート）も含有することができる。それぞれの参照文献の全内容を参照により本明細書で援用する。
当該ＬＮＰ製剤は、対象における本発明のナノ粒子の送達を増強するコンジュゲートを含むことができる。さらに、コンジュゲートは、対象におけるナノ粒子の貪食クリアランスを阻害することができる。一部の実施形態では、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７から設計する「自己」ペプチド（例えば、その全内容を参照により本明細書で援用するＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ ３３９，９７１－９７５により記載されている「自己」粒子）とすることができる。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらが示したとおり、自己ペプチドは、ナノ粒子のマクロファージ媒介クリアランスを遅延させて、ナノ粒子の送達を増強させた。
当該ＬＮＰ製剤は、炭水化物担体を含むことができる。例として、炭水化物担体として、限定をするものではないが、無水物修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型物質、フィトグリコーゲンオクテニルスクシナート、フィトグリコーゲンベータデキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンベータデキストリンがある（例えば、全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２０１２１０９１２１）。
当該ＬＮＰ製剤は、粒子の送達を向上させるために、界面活性剤またはポリマーでコーティングすることができる。一部の実施形態では、当該ＬＮＰを、親水性のコーティング、例えば、ＰＥＧコーティング、及び／または全内容を参照により本明細書で援用する米国特許出願公開第２０１３０１８３２４４号に記載された中性表面電荷を有するコーティング剤でコーティングすることができるが、これらに限定されない。
当該ＬＮＰ製剤は、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する米国特許第８，２４１，６７０号、または国際公開ＷＯ２０１３１１００２８に記載されているように、脂質ナノ粒子の粘膜バリアへの浸透を可能ならしめるべく、粒子の表面特性を変更するように操作することができる。
粘液に浸透するように操作したＬＮＰは、ポリマー材料（すなわち、ポリマーコア）、及び／またはポリマー－ビタミンコンジュゲート、及び／またはトリブロックコポリマーを含むことができる。ポリマー材料として、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバマート、ポリ尿素、ポリカルボナート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアナート、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートがあるが、これらに限定されない。
粘液に浸透するように操作したＬＮＰには、表面改質剤、例えば、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、例えば、ジメチルジオクタデシル－臭化アンモニウム）、糖類または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ－アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クサギ属の木、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）、ならびに、ｒｈＤＮアーゼを含む種々のＤＮアーゼを含めることができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、粘液浸透性ＬＮＰを、粘膜浸透促進コーティングを含む低張性製剤とすることができる。製剤は、それが送達する上皮に対して低張性とすることができる。低張性製剤の例として、例えば、全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２０１３１１００２８において認めることができるが、これに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドを、リポプレックス、例えば、限定をするものではないが、Ｓｉｌｅｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）製のＡＴＵＰＬＥＸ（商標）システム、ＤＡＣＣシステム、ＤＢＴＣシステム、及びその他のｓｉＲＮＡ－リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）製ＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）、ならびに、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、または核酸のプロタミンをベースとした標的化送達、及び非標的化送達として製剤する（Ａｌｅｋｕ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ ６８：９７８８－９７９８；Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２ ５０：７６－７８；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１２２２－１２３４；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１３６０－１３７０；Ｇｕｔｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０ ２３：３３４－３４４；Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０：２８６－２９３Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９ ３２：４９８－５０７；Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８ ３１：１８０－１８８；Ｐａｓｃｏｌｏ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５－１２９４；Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１－１５；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：７０９－７１７；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７ ６、１０４：４０９５－４１００、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ １９：１２５－１３２；これら全文献の全内容を参照により本明細書で援用する）。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、１０～１０００ｎｍの平均直径を有する球状とすることができる固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）として製剤する。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤、及び／または乳化剤で安定化することができる固体脂質コアマトリックスを有する。例示的なＳＬＮとして、全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２０１３１０５１０１に記載のものがある。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、徐放、及び／または標的送達のために製剤することができる。本明細書で使用する「徐放」とは、治療成績を達成する、特定の放出パターンに適合する医薬組成物または化合物放出プロファイルのことを指す。一実施形態では、当該ポリヌクレオチドを、徐放、及び／または標的送達のための、本明細書に記載した、及び／または当該技術分野で公知の送達剤に封入することができる。本明細書で使用する用語「封入」とは、閉じ込めること、取り囲むこと、または内包することを意味する。それが本発明の化合物の製剤に関連する場合、封入を、実質的、完全、または部分的とすることができる。用語「実質的に封入した」とは、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９超、または９９％超を、送達剤に閉じ込める、送達剤で取り囲む、または内包することができることを意味する。「部分的封入」は、本発明の医薬組成物または化合物の１０未満、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれ未満を、送達剤に閉じ込める、送達剤で取り囲む、または内包することができることを意味する。
有利なことに、封入は、蛍光顕微鏡写真、及び／または電子顕微鏡写真を使用して、本発明の医薬組成物または化合物の脱出または活性を測定して、決定することができる。例えば、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、または９９％超を、送達剤に封入する。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドを、本明細書で「治療的ナノ粒子ポリヌクレオチド」と称する治療的ナノ粒子内に封入することができる。治療的ナノ粒子を、例えば、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２０１０００５７４０、ＷＯ２０１００３０７６３、ＷＯ２０１０００５７２１、ＷＯ２０１０００５７２３、及びＷＯ２０１２０５４９２３、ならびに、米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号、同第２０１００１０４６４５号、同第２０１０００８７３３７号、同第２０１０００６８２８５号、同第２０１１０２７４７５９号、同第２０１０００６８２８６号、同第２０１２０２８８５４１号、同第２０１２０１４０７９０号、同第２０１３０１２３３５１号、及び同第２０１３０２３０５６７号、ならびに、米国特許第８，２０６，７４７号、同第８，２９３，２７６号、同第８，３１８，２０８号、及び同第８，３１８，２１１号に記載の方法で製剤することができる。
一部の実施形態では、当該治療的ナノ粒子ポリヌクレオチドを、持続放出のために製剤することができる。本明細書で使用する「持続放出」とは、ある特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物のことを指す。期間は、限定をするものではないが、時間、日、週、月、年を含むことができる。例として、本明細書に記載したポリヌクレオチドの持続放出ナノ粒子を、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２０１００７５０７２、及び米国特許出願公開第２０１００２１６８０４号、同第２０１１０２１７３７７号、同第２０１２０２０１８５９号、及び同第２０１３０１５０２９５に開示されたとおりに製剤することができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、当該治療的ナノ粒子ポリヌクレオチドを、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２００８１２１９４９、ＷＯ２０１０００５７２６、ＷＯ２０１０００５７２５、ＷＯ２０１１０８４５２１、及びＷＯ２０１１０８４５１８、ならびに、米国特許出願公開第２０１０００６９４２６号、同第２０１２０００４２９３号、及び同第２０１００１０４６５５号に記載のものなど、標的特異的になるように製剤することができる。
ＬＮＰを、マイクロ流体ミキサー、またはマイクロミキサーを使用して調製することができる。例示的マイクロ流体ミキサーとして、限定をするものではないが、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ ｂｅｉ Ｗｉｌｄｏｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）が製造するもの、及び／またはジグザグヘリンボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ）を含むスリットインターデジタルマイクロミキサーを含むことができる（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖｅｔ ａｌ．，“Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔ ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｉｘｉｎｇ，”Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２８：３６３３－４０（２０１２）；Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ｌｉｍｉｔ－ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１：ｅ３７（２０１２）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４（１６）：６９４８－５１（２０１２）を参照されたい、これらの文献の全内容を参照により本明細書で援用する）。例示的なマイクロミキサーとして、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ Ｍａｉｎｚ ＧｍｂＨ（Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のスリットインターデジタル微細構造ミキサー（ＳＩＭＭ－Ｖ２）、または標準スリットインターデジタルマイクロミキサー（ＳＳＩＭＭ）、またはキャタピラー（ＣＰＭＭ）、または衝突噴流（ＩＪＭＭ）がある。一部の実施形態では、ＳＨＭを使用してＬＮＰを作り出す方法は、少なくとも２つの入力ストリームを混合することをさらに含み、その際、混合は、微細構造誘導カオス移流（ＭＩＣＡ）で生じる。この方法によれば、流体ストリームは、ヘリンボーンパターンに存在するチャネルを通って流れて、回転流を引き起こし、流体を互いに混ぜる。この方法は、流体混合のための面を含むこともでき、その際、面は、流体循環している間に方向を変える。ＳＨＭを使用してＬＮＰを生成する方法として、米国特許出願公開第２００４０２６２２２３号、及び同第２０１２０２７６２０９号（これらの文献の全内容を参照により本明細書で援用する）に開示されたものがある。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドを、マイクロ流体技術を使用して、脂質ナノ粒子にて製剤することができる（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ．，“Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，”Ｎａｔｕｒｅ ４４２：３６８－３７３（２００６）；及びＡｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５：６４７－６５１（２００２）を参照されたい；これらの全内容を参照により本明細書で援用する）。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドを、マイクロミキサーチップ、例えば、限定をするものではないが、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、またはＤｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫ）製のものなどを使用して、脂質ナノ粒子にて製剤することができる。マイクロミキサーチップを、分割及び再結合機構を用いる２つ以上の流体ストリームの迅速な混合のために使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、例えば、限定をするものではないが、約１ｎｍ～約２０ｎｍ、約１ｎｍ～約３０ｎｍ、約１ｎｍ～約４０ｎｍ、約１ｎｍ～約５０ｎｍ、約１ｎｍ～約６０ｎｍ、約１ｎｍ～約７０ｎｍ、約１ｎｍ～約８０ｎｍ、約１ｎｍ～約９０ｎｍ、約５ｎｍ～約１００ｎｍ、約５ｎｍ～約１０ｎｍ、約５ｎｍ～約２０ｎｍ、約５ｎｍ～約３０ｎｍ、約５ｎｍ～約４０ｎｍ、約５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５ｎｍ～約６０ｎｍ、約５ｎｍ～約７０ｎｍ、約５ｎｍ～約８０ｎｍ、約５ｎｍ～約９０ｎｍ、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍ、及び／または約９０～約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子にて製剤することができる。
一部の実施形態では、当該脂質ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍの直径を有することができる。一実施形態では、当該脂質ナノ粒子は、１００ｎｍより大きい、１５０ｎｍより大きい、２００ｎｍより大きい、２５０ｎｍより大きい、３００ｎｍより大きい、３５０ｎｍより大きい、４００ｎｍより大きい、４５０ｎｍより大きい、５００ｎｍより大きい、５５０ｎｍより大きい、６００ｎｍより大きい、６５０ｎｍより大きい、７００ｎｍより大きい、７５０ｎｍより大きい、８００ｎｍより大きい、８５０ｎｍより大きい、９００ｎｍより大きい、９５０ｎｍより大きい、または１０００ｎｍより大きい直径を有することができる。
一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、より小さなＬＮＰを使用して送達することができる。そのような粒子は、０．１μｍ未満～１００ｎｍ、例えば、限定をするものではないが、０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、または９７５ｕｍ未満の直径を含むことができる。
本明細書に記載したナノ粒子及びマイクロ粒子は、マクロファージ及び／または免疫応答を調節するために幾何学的に操作することができる。幾何学的に操作した粒子は、標的送達、例えば、限定をするものではないが、経肺送達のために本明細書に記載したポリヌクレオチドを組み込む様々な形状、サイズ、及び／または表面電荷を有することができる（例えば、全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２０１３０８２１１１を参照されたい）。粒子を幾何学的に操作するその他の物理的特徴として、限定をするものではないが、細胞及び組織との相互作用を変更することができる開口、曲げられたアーム、非対称性、及び表面粗さ、電荷がある。
一部の実施形態では、本明細書に記載したナノ粒子は、限定をするものではないが、その全内容を参照により本明細書で援用する米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号に記載されたようなステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子である。ステルスまたは標的特異的ステルスナノ粒子は、限定をするものではないが、ポリエチレン、ポリカルボナート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマラート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリラート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリシアノアクリラート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリラート、ポリアクリラート、ポリシアノアクリラート、またはそれらの組合せなどの２つ以上のポリマーを含むことができるポリマーマトリックスを含むことができる。
ｂ．リピドイド
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リピドイドを含む。本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、リピドイドと共に製剤することができる。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム、または粒子を調製すると、局所投与経路及び／または全身投与経路を介するリピドイド製剤の注射後に、コードしたタンパク質の産生により判定される、ポリヌクレオチドの有効な送達を達成することができる。ポリヌクレオチドのリピドイド複合体は、限定をするものではないが、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含む種々の手段で投与することができる。
リピドイドの合成は、文献に記載されている（Ｍａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０ ２１：１４４８－１４５４；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２０１０ ２６７：９－２１；Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８ ２６：５６１－５６９；Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１０ １０７：１８６４－１８６９；Ｓｉｅｇｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１１ １０８：１２９９６－３００１を参照されたい；これら文献の全内容を参照により本明細書で援用する）。
限定をするものではないが、ペンタ［３－（１－ラウリルアミノプロピオニル）］－トリエチレンテトラミンヒドロクロリド（ＴＥＴＡ－５ＬＡＰ、９８Ｎ１２－５としても公知、Ｍｕｒｕｇａｉａｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０１：６１（２０１０）を参照されたい）、Ｃ１２－２００（誘導体、及びバリアントを含む）、ならびに、ＭＤ１を含む種々のリピドイドを有する製剤を、インビボ活性について試験することができる。リピドイド「９８Ｎ１２－５」は、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９ １７：８７２－８７９で開示されている。リピドイド「Ｃ１２－２００」は、Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１０ １０７：１８６４－１８６９、及びＬｉｕ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０ ６６９－６７０で開示されている。それぞれの参照文献の全内容を、参照により本明細書で援用する。
一実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、アミノアルコールリピドイドにて製剤することができる。アミノアルコールリピドイドは、米国特許第８，４５０，２９８号（その全内容を参照により本明細書で援用する）に記載の方法により調製することができる。
当該リピドイド製剤は、ポリヌクレオチドに加えて、３つまたは４つ以上の構成成分を含む粒子を含むことができる。リピドイド及びリピドイドを含むポリヌクレオチド製剤は、国際公開ＷＯ２０１５０５１２１４（その全内容を参照により本明細書で援用する）に記載されている。
ｃ．ヒアルロニダーゼ
一部の実施形態では、注射（例えば、筋肉内注射、または皮下注射）用の本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、及び注射（例えば、筋肉内、または皮下注射）用ヒアルロニダーゼ。ヒアルロニダーゼは、間質障壁の構成成分であるヒアルロナンの加水分解を触媒する。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それにより、組織透過性を増加させる（Ｆｒｏｓｔ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．（２００７）４：４２７－４４０）。あるいは、ヒアルロニダーゼを、筋肉内または皮下投与したポリヌクレオチドに曝露した細胞の数を増加させるために使用することができる。
ｄ．ナノ粒子模倣物
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ナノ粒子模倣物内に封入され、及び／またはナノ粒子模倣物に吸収される。ナノ粒子模倣物は、送達機能生体または粒子、例えば、限定をするものではないが、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、及び細胞を模倣することができる。例として、限定をするものではないが、本明細書に記載したポリヌクレオチドを、ウイルスの送達機能を模倣することができる非ビリオン粒子に封入することができる（例えば、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２０１２００６３７６、ならびに、米国特許出願公開第２０１３０１７１２４１号、及び同第２０１３０１９５９６８号を参照されたい）。
ｅ．自己組織化ナノ粒子または自己組織化巨大分子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を、送達のための自己組織化ナノ粒子または両親媒性巨大分子（ＡＭ）に含む。ＡＭは、アルキル化糖骨格が、ポリ（エチレングリコール）に共有結合した生体適合性の両親媒性ポリマーを含む。水溶液において、ＡＭは、自己組織化してミセルを形成する。核酸自己組織化ナノ粒子は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７号に記載されており、ＡＭ及びＡＭを形成する方法は、米国特許出願公開第２０１３０２１７７５３号に記載されており、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する。
ｆ．カチオン、及びアニオン
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、ならびに、カチオンまたはアニオン、例えば、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋、及びこれらの組合せを含む。例示的な製剤は、例えば、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する米国特許第６，２６５，３８９号、及び同第６，５５５，５２５号に記載されているように、金属カチオンと複合体を形成したポリマー及びポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、カチオンナノ粒子は、二価及び一価カチオンの組合せを含むことができる。カチオンナノ粒子またはカチオンナノ粒子を含む１つ以上のデポ剤でのポリヌクレオチドの送達は、長時間作用性デポ剤として作用すること、及び／またはヌクレアーゼによる分解の速度を低下させることによって、ポリヌクレオチドのバイオアベイラビリティを向上させることができる。
ｇ．アミノ酸脂質
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、アミノ酸脂質と共に製剤した、本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基、及び１つ以上の親油性尾部を含む親油性化合物である。アミノ酸脂質、及びアミノ酸脂質を製造する方法の例として、米国特許第８，５０１，８２４号に記載されているものがあるが、これに限定されない。アミノ酸脂質製剤は、ポリヌクレオチドに結合し、それを放出するアミノ酸脂質を含む放出可能な形態でポリヌクレオチドを送達することができる。例として、本明細書に記載したポリヌクレオチドの放出は、限定をするものではないが、例えば、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する米国特許第７，０９８，０３２号、同第６，８９７，１９６号、同第６，４２６，０８６号、同第７，１３８，３８２号、同第５，５６３，２５０号、及び同第５，５０５，９３１号に記載されているような酸不安定なリンカーにより提供することができる。
ｈ．高分子電解質間複合体
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、高分子電解質間複合体に、本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。高分子電解質間複合体は、電荷動的ポリマーが１つ以上のアニオン性分子と複合化するときに形成される。電荷動的ポリマー、及び高分子電解質間複合体、ならびに、高分子電解質間複合体を作り出す方法の例が、全内容を参照により本明細書で援用する米国特許第８，５２４，３６８号に記載されているが、これに限定されない。
ｉ．結晶性ポリマー系
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、結晶性ポリマー系に、本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。結晶性ポリマー系は、結晶性部分、及び／または結晶性部分を含む末端単位を有するポリマーである。例示的なポリマーは、米国特許第８，５２４，２５９号（その全内容を参照により本明細書で援用する）に記載されている。
ｊ．ポリマー、生分解性ナノ粒子、及びコアシェルナノ粒子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、ならびに、天然及び／または合成ポリマーを含む。ポリマーとして、限定をするものではないが、ポリエテン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ－リシン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフトしたＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分枝鎖ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、弾性生分解性ポリマー、生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、多元ブロックコポリマー、ポリ［α－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオンマルチブロックコポリマー、ポリカルボナート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマラート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリラート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リシン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体、またはそれらの組合せがある。
例示的なポリマーとして、ＤＹＮＡＭＩＣ ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）、ＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、及びＲｏｃｈｅ Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製の製剤、ＰＨＡＳＥＲＸ（商標）ポリマー製剤、例えば、限定をするものではないが、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）、Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製のＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）製のシクロデキストリン、デンドリマー、及びポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）、ならびに、ｐＨ応答性コブロックポリマー、例えば、ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）がある。
ポリマー製剤は、（例えば、筋肉内注射、または皮下注射した後の）ポリヌクレオチドの持続放出、または遅延放出を可能にする。ポリヌクレオチドの変更した放出プロファイルは、例えば、長期間にわたって、コードしたタンパク質の翻訳をもたらすことができる。ポリマー製剤は、ポリヌクレオチドの安定性を高めるために使用することもできる。持続放出製剤として、限定をするものではないが、ＰＬＧＡマイクロスフェア、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）、フィブリノゲンポリマーなどの外科用シーラント（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｅｌｉａ，ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、ＰＥＧベースのシーラント、及びＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）がある。
例として、限定をするものではないが、修飾ｍＲＮＡを、調整可能な放出速度（例えば、数日間、及び数週間）を有するＰＬＧＡミクロスフェアを調製すること、ならびに、封入プロセス中に修飾ｍＲＮＡの完全性を維持しながら、修飾ｍＲＮＡをＰＬＧＡミクロスフェアに封入することにより、ＰＬＧＡミクロスフェアで製剤することができる。ＥＶＡｃは、前臨床持続放出インプラント用途で広範に使用する非生分解性生体適合性ポリマーである（例えば、緑内障のためのピロカルピン眼内インサートである徐放性製品Ｏｃｕｓｅｒｔ、または持続放出プロゲステロン子宮内デバイスであるＰｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ、経皮送達系Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ、及びＳｅｌｅｇｉｌｉｎｅ、カテーテル）。ポロキサマーＦ－４０７ ＮＦは、５℃未満の温度で低粘度を示すポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンの親水性非イオン性界面活性三元ブロックコポリマーであり、１５℃を超える温度で、固体ゲルを形成する。
例として、限定をするものではないが、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、米国特許第６，１７７，２７４号に記載されたＰＬＬでグラフトしたＰＥＧのポリマー化合物と共に製剤することができる。別の例として、限定をするものではないが、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、ＰＬＧＡ－ＰＥＧブロックコポリマー（例えば、米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号、ならびに、米国特許第８，２３６，３３０号、及び同第８，２４６，９６８号を参照されたい）、またはＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡブロックコポリマー（例えば、米国特許第６，００４，５７３号を参照されたい）などのブロックコポリマーと共に製剤することができる。これら参照文献の全内容を参照により本明細書で援用する。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、限定をするものではないが、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（アミン－コ－エステル）、またはそれらの組合せなどの少なくとも１つのアミン含有ポリマーと共に製剤することができる。例示的なポリアミンポリマー、及び送達剤としてのそれらの使用は、例えば、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する米国特許第８，４６０，６９６号、同第８，２３６，２８０号に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、例えば、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する、米国特許第６，６９６，０３８号、同第６，５１７，８６９号、同第６，２６７，９８７号、同第６，２１７，９１２号、同第６，６５２，８８６号、同第８，０５７，８２１号、及び同第８，４４４，９９２号、米国特許出願公開第２００３００７３６１９号、同第２００４０１４２４７４号、同第２０１００００４３１５号、同第２０１２００９１４５号、及び同第２０１３０１９５９２０号、ならびに、国際公開ＷＯ２００６０６３２４９及びＷＯ２０１３０８６３２２に記載されたような生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ポリマー、もしくは、生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、直鎖生分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、またはそれらの組合せにおいて製剤することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、米国特許出願公開第２０１３０１８４４５３号に記載されたような少なくとも１つのシクロデキストリンポリマーにおいて、またはこれらと共に製剤することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、国際公開ＷＯ２０１３１０６０７２、ＷＯ２０１３１０６０７３、及びＷＯ２０１３１０６０８６に記載されたような少なくとも１つの架橋カチオン結合ポリマーにおいて、またはこれらと共に製剤することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、米国特許出願公開第２０１３０２３１２８７号に記載されたような少なくともＰＥＧ化アルブミンポリマーにおいて、またはこれらと共に製剤することができる。これら参照文献の全内容を参照により本明細書で援用する。
一部の実施形態では、本明細書に開示したポリヌクレオチドは、ポリマー、脂質、及び／または限定するものではないが、リン酸カルシウムなどのその他の生分解性薬の組合せを使用して、ナノ粒子として製剤することができる。構成成分を、コアシェル、ハイブリッド、及び／または層ごとの構造で組み合わせて、送達のためのナノ粒子の微調整を可能にすることができる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ．２００６ ５：７９１－７９６；Ｆｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００８ ２９：１５２６－１５３２；ＤｅＫｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１１ ６３：７４８－７６１；Ｅｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１ ３２：７７２１－７７３１；Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４－８７；それらの全内容を参照により本明細書で援用する）。例として、限定をするものではないが、ナノ粒子は、親水性－疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）、疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、及び／または親水性ポリマー（その全内容を参照により本明細書で援用する国際公開ＷＯ２０１２０２２５１２９）などの複数のポリマーがある。
コアシェルナノ粒子の使用は、カチオン性架橋ナノゲルコア及び種々のシェルを合成するハイスループットアプローチにさらに焦点を当てている（Ｓｉｅｇｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１１ １０８：１２９９６－１３００１；その全内容を参照により本明細書で援用する）。ポリマーナノ粒子の複合化、送達、及び内在化を、ナノ粒子のコア構成成分、及びシェル構成成分の両方における化学組成を変更することにより、正確に制御することができる。例えば、コアシェルナノ粒子を、コレステロールをナノ粒子に共有結合させた後に、ｓｉＲＮＡをマウス肝細胞に効率的に送達することができる。
一部の実施形態では、中間ＰＬＧＡ層を含む中空脂質コアと、ＰＥＧを含有する外側の中性脂質層を、本明細書に記載したようなポリヌクレオチドの送達に使用することができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に開示したポリヌクレオチドのコアと、コアでのポリヌクレオチドを保護するために使用するポリマーシェルを含むことができる。ポリマーシェルは、本明細書に記載したポリマーのいずれにすることもでき、当該技術分野で公知である。ポリマーシェルを、コアでのポリヌクレオチドを保護するために使用することができる。
本明細書に記載したポリヌクレオチドと共に使用するコアシェルナノ粒子は、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する米国特許第８，３１３，７７７号、または国際公開ＷＯ２０１３１２４８６７に記載されている。
ｋ．ペプチド、及びタンパク質
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増加させ、及び／または（例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とすることにより）ポリヌクレオチドの生体内分布を変更し、及び／またはコードしたタンパク質の翻訳を増加させるペプチド、及び／またはタンパク質（例えば、国際公開ＷＯ２０１２１１０６３６及びＷＯ２０１３１２３２９８と共に製剤している、本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、当該ペプチドは、米国特許出願公開第２０１３０１２９７２６号、同第２０１３０１３７６４４号、及び同第２０１３０１６４２１９号に記載のものとすることができる。これら参照文献の全内容を参照により本明細書で援用する。
ｌ．コンジュゲート
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、コンジュゲートとして、担体もしくは標的化基と共有結合している、または融合タンパク質を共に産生する２つのコード領域を含む（例えば、標的化基及び治療的タンパク質もしくはペプチドを持つ）、本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。当該コンジュゲートを、ナノ粒子を、組織もしくは生体内のニューロンに対して選択的に仕向ける、または血液脳関門を横断するうえで役立つペプチドとすることができる。
当該コンジュゲートとして、天然に生じる物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくは、グロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくは、ヒアルロン酸）；または脂質がある。リガンドを、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）とすることもできる。ポリアミノ酸の例として、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンであるポリアミノ酸がある。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはアルファらせんペプチドがある。
一部の実施形態では、当該コンジュゲートは、本明細書に開示したポリヌクレオチドのための担体として機能することができる。当該コンジュゲートは、限定をするものではないが、ポリ（エチレングリコール）でグラフトすることができるポリアミン、ポリリシン、ポリアルキレンイミン、及びポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを含むことができる。例示的なコンジュゲート及びそれらの調製物は、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する米国特許第６，５８６，５２４号、及び米国特許出願公開第２０１３０２１１２４９号に記載されている。
当該コンジュゲートは、腎臓細胞などのある特定の細胞型に結合する標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、抗体を含むこともできる。標的化基を、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣物、またはアプタマーとすることができる。
標的化基を、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、内皮細胞もしくは骨細胞などのある特定の細胞型に結合する抗体とすることができる。標的化基は、ホルモン、及びホルモン受容体を含むこともできる。それらは、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン多価マンノース、多価性フルクトース、またはアプタマーを含むこともできる。リガンドを、例えば、リポ多糖体、またはｐ３８ＭＡＰキナーゼのアクチベーターとすることができる。
標的化基を、特定の受容体を標的とすることができるあらゆるリガンドとすることができる。例として、限定をするものではないが、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース－６Ｐ、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、及びＨＤＬリガンドがある。特定の実施形態では、標的化基は、アプタマーである。アプタマーは、非修飾である、または本明細書に開示した修飾のあらゆる組合せを有することができる。例として、標的化基は、例えば、米国特許出願公開第２０１３０２１６６１０１２号（その全内容を参照により本明細書で援用する）に記載したような血液中枢神経系関門を越える標的化送達のためのグルタチオン受容体（ＧＲ）結合コンジュゲートとすることができるが、これに限定されない。
一部の実施形態では、当該コンジュゲートは、より大きな治療有効性を提供するために、長時間作用型連続放出系を含む相乗的生体分子－ポリマーコンジュゲートとすることができる。相乗的生体分子－ポリマーコンジュゲートを、米国特許出願公開第２０１３０１９５７９９号に記載のものとすることができる。一部の実施形態では、当該コンジュゲートは、国際特許公開ＷＯ２０１２０４０５２４に記載されているようなアプタマーコンジュゲートとすることができる。一部の実施形態では、当該コンジュゲートは、米国特許第８，５０７，６５３号に記載されているようなアミン含有ポリマーコンジュゲートとすることができ。これら参照文献の全内容を参照により本明細書で援用する。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドを、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（登録商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標），Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）にコンジュゲートすることができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドを、シグナル配列または標的化配列を含むこともできる細胞浸透性ポリペプチドに対して、共有結合的にコンジュゲートする。当該コンジュゲートを、安定性の増加、及び／または細胞トランスフェクションの増加；及び／または生体内分布の変更（例えば、ある特定の組織または細胞型を標的とする）を有するように設計することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドを、送達を増強するために、作用物質にコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、当該作用物質は、モノマーまたはポリマー、例えば、国際公開番号ＷＯ２０１１０６２９６５に記載されているような標的化ブロックを有する標的化モノマーまたはポリマーとすることができる。一部の実施形態では、当該作用物質は、例えば、米国特許第６，８３５．３９３号、及び同第７，３７４，７７８号に記載されたようなポリヌクレオチドと共有結合した輸送剤とすることができる。一部の実施形態では、当該作用物質は、米国特許第７，７３７，１０８号、及び同第８，００３，１２９号に記載されているような膜バリア輸送促進剤とすることができる。これらの参照文献の全内容を参照により本明細書で援用する。
２２．加速血液クリアランス
本開示は、生物学的に活性な薬剤などの反復投与する活性薬剤に対するＡＢＣの作用を低下させるための化合物、組成物、及びその使用方法を提供する。自明のことではあるが、投与した活性薬剤に対するＡＢＣの作用を全体的に低下させる、または排除することは、その半減期を延ばす、したがって、有効性を効果的に増加させる。
一部の実施形態では、ＡＢＣを低下させるとの用語は、ＭＣ３ ＬＮＰなどの正の参照コントロールＡＢＣ誘導ＬＮＰと比較した場合のＡＢＣのあらゆる低下のことを指す。ＡＢＣを誘導するＬＮＰは、所与の時間枠内の２回目、またはその後の投与時に、活性薬剤の循環レベルの低下を引き起こす。したがって、ＡＢＣの低下は、標準ＬＮＰと比較して、薬剤の２回目またはその後の投与時に、循環薬のクリアランスがより少ないことを指す。当該低下は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％とすることができる。一部の実施形態では、当該低下は、１０～１００％、１０～５０％、２０～１００％、２０～５０％、３０～１００％、３０～５０％、４０％～１００％、４０～８０％、５０～９０％、または５０～１００％である。あるいは、ＡＢＣの低下は、２回目またはその後の投与時に、循環薬剤が少なくとも検出可能なレベルであること、または標準ＬＮＰの投与後の循環薬剤と比較して、循環薬剤が少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍増加すること、として特徴決定し得る。一部の実施形態では、当該低下は、２～１００倍、２～５０倍、３～１００倍、３～５０倍、３～２０倍、４～１００倍、４～５０倍、４～４０倍、４～３０倍、４～２５倍、４～２０倍、４～１５倍、４～１０倍、４～５倍、５～１００倍、５～５０倍、５～４０倍、５～３０倍、５～２５倍、５～２０倍、５～１５倍、５～１０倍、６～１００倍、６～５０倍、６～４０倍、６～３０倍、６～２５倍、６～２０倍、６～１５倍、６～１０倍、８～１００倍、８～５０倍、８～４０倍、８～３０倍、８～２５倍、８～２０倍、８～１５倍、８～１０倍、１０～１００倍、１０～５０倍、１０～４０倍、１０～３０倍、１０～２５倍、１０～２０倍、１０～１５倍、２０～１００倍、２０～５０倍、２０～４０倍、２０～３０倍、または２０～２５倍である。
本開示は、クリアランスの影響をあまり受けず、したがって、インビボでより長い半減期を有する脂質含有化合物及び組成物を提供する。このことは、特に、組成物を、長期投与などの反復投与を意図している場合、及びさらにより詳細には、そのような反復投与が、数日間または数週間以内に発生する場合に該当する。
重大なことに、これらの組成物は、感受性が低く、または加速血液クリアランス（ＡＢＣ）を認める現象を完全に回避する。ＡＢＣは、特定の外因的に投与した作用物質が、２回目、及びその後の投与時に、血液から急速にクリアランスする現象である。この現象は、部分的には、限定をするものではないが、脂質化剤、リポソーム、またはその他の脂質ベースの送達ビヒクル、及び脂質封入剤を含む様々な脂質含有組成物で認められている。従来、ＡＢＣの基礎は、あまり理解されておらず、一部の事例では、体液性免疫応答に起因するとされており、したがって、インビボで、特に、臨床設定において、その影響を制限するための方策は依然として不明である。
本開示は、ＡＢＣの影響があったとしても、あまり影響が及ばない化合物及び組成物を提供する。一部の重要な態様では、そのような化合物及び組成物は、脂質含有化合物または組成物である。驚くべきことに、本開示の脂質含有化合物または組成物は、２回目、及びその後のインビボ投与時にＡＢＣを経験しない。ＡＢＣに対するこの耐性により、これらの化合物及び組成物は、数日間、または１～２週間を含む短期間での繰り返し使用を含む、インビボでの繰り返し使用に特に適している。この安定性、及び／または半減期の長期化は、部分的には、これらの組成物が、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞、及び／または従来のＢ細胞、ｐＤＣ及び／または血小板を活性化できないことに起因する。
したがって、本開示は、加速血液クリアランス（ＡＢＣ）の根底にある機序の解明を提供する。本開示及び本明細書に提示した本発明によれば、ＡＢＣ現象は、少なくとも脂質、及び脂質ナノ粒子に関する限りは、少なくとも部分的に、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞、ｐＤＣ、及び／または血小板を含む先天免疫応答に媒介することが認められている。Ｂ１ａ細胞は、通常、循環ＩｇＭの形態で天然抗体の分泌を担っている。このＩｇＭは、多反応性であり、それが、様々な抗原へ結合することができ、それぞれの抗原に対する親和性が比較的低いことを意味する。
本発明によれば、インビボで投与した脂質ナノ粒子などのいくつかの脂質化剤または脂質含有製剤が、ＡＢＣを誘発し、ＡＢＣの影響を受けることが認められている。本発明によれば、ＬＮＰの初回用量の投与時に、先天免疫応答の生成に関与する１つ以上の細胞（本明細書ではセンサーと称する）は、そのような作用物質に結合し、活性化され、次いで、ＡＢＣ及び毒性を促す免疫因子（本明細書ではエフェクターと称する）のカスケードを開始することが、今のところ、認められている。例えば、Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞は、ＬＮＰに結合し、（単独で、またはｐＤＣなどのその他のセンサー、及び／またはＩＬ６などのエフェクターの存在下で）活性化するようになり、ＬＮＰに結合する天然のＩｇＭを分泌することができる。対象での既存の天然ＩｇＭは、ＬＮＰも認識して結合し、それにより、補体結合を誘発することができる。初回用量を投与した後に、天然ＩｇＭの産生は、ＬＮＰの投与から１～２時間以内に始まる。一般的には、約２～３週間までに、天然ＩｇＭは、ＩｇＭの自然半減期に起因して、系からクリアランスする。天然ＩｇＧは、ＬＮＰの投与から約９６時間後から産生する。作用物質を、ナイーブな環境で投与した場合、Ｂ１ａ細胞またはＢ１ｂ細胞または天然ＩｇＧの活性化後に産生した天然ＩｇＭによって、比較的に妨げられない生物学的効果を発揮することができる。天然ＩｇＭ及び天然ＩｇＧは、非特異的であり、したがって、抗ＰＥＧ ＩｇＭ及び抗ＰＥＧ ＩｇＧとは異なる。
機序に拘束されるものではないが、本出願人は、ＬＮＰが、次の機序により、ＡＢＣ及び／または毒性を誘発することを提案する。ＬＮＰを対象に投与した際、ＬＮＰは、血液を介して脾臓に素早く輸送されると考えられる。ＬＮＰは、血液及び／または脾臓において、免疫細胞に遭遇することができる。血液及び／または脾臓でのＬＮＰの存在に応答して、迅速に先天免疫応答を誘発する。本明細書では、ＬＮＰの投与の数時間以内に、いくつかの免疫センサーが、ＬＮＰの存在に反応していることを、本出願人は示している。これらのセンサーとして、限定をするものではないが、免疫応答の生成に関与する免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、ｐＤＣ、及び血小板がある。センサーは、脾臓、例えば、脾臓の周辺領域及び／または血液に存在することができる。ＬＮＰは、１つ以上のセンサーと物理的に相互作用し得るものであり、その他のセンサーとも相互作用し得る。そのような事例では、ＬＮＰは、センサーと直接的または間接的に相互作用する。センサーは、ＬＮＰの認識に応答して、互いに直接に相互作用し得る。例えば、数多くのセンサーが、脾臓内に位置しており、容易に互いに相互作用することができる。あるいは、センサーのうちの１つ以上は、血液でのＬＮＰと相互作用して、活性化し得る。次いで、活性化したセンサーは、その他のセンサーと直接的に、または（例えば、サイトカイン、例えば、ＩＬ６などのメッセンジャーの刺激または産生を介して）間接的に相互作用し得る。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、以下のセンサー：ｐＤＣ、Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、及び血小板のそれぞれと直接的に相互作用して、これを活性化することができる。次いで、これらの細胞は、相互に直接的または間接的に相互作用して、最終的に、ＬＮＰの反復投与に伴うＡＢＣ、及び／または毒性をもたらすエフェクターの産生を開始することができる。例えば、本出願人は、ＬＮＰ投与が、ｐＤＣ活性化、血小板凝集、及び活性化、ならびに、Ｂ細胞活性化を招くことを明らかにしている。ＬＮＰに応答して、血小板も、凝集し、活性化し、Ｂ細胞と凝集する。ｐＤＣ細胞は、活性化する。ＬＮＰは、比較的迅速に血小板及びＢ細胞の表面と相互作用することが認められている。ＬＮＰに応答して、これらのセンサーのいずれか１つ、または組合せの活性化を遮断することは、通常生じる免疫応答を減衰させる上で有用である。免疫応答のこの減衰は、ＡＢＣ、及び／または毒性を回避する。
センサーは、一旦活性化すると、エフェクターを産生する。本明細書で使用するエフェクターは、Ｂ細胞などの免疫細胞により産生する免疫分子である。エフェクターとして、限定をするものではないが、天然ＩｇＭ、及び天然ＩｇＧなどの免疫グロブリン、ならびに、ＩＬ６などのサイトカインがある。Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞は、ＬＮＰの投与後の２～６時間以内に、天然ＩｇＭの産生を刺激する。天然ＩｇＧは、９６時間以内に検出することができる。ＩＬ６レベルは、数時間以内に増加する。天然ＩｇＭ及びＩｇＧは、体内を数日間から数週間循環する。この時間において、循環エフェクターは、新たに投与したＬＮＰと相互作用して、そのＬＮＰを身体によるクリアランスのために誘発することができる。例えば、エフェクターは、ＬＮＰを認識して、これに結合することができる。エフェクターのＦｃ領域は、マクロファージが認識し得るものであり、マクロファージによる装飾ＬＮＰの取り込みを誘発する。次いで、マクロファージは、脾臓に輸送される。免疫センサーによるエフェクターの産生は、ＡＢＣについて認められるタイミングと相関する過渡応答である。
投与量が、２回目またはその後に投与する用量であり、かつ、そのような２回目またはその後の用量を、以前に誘導した天然ＩｇＭ及び／またはＩｇＧが系からクリアランスする前に（例えば、２～３のウィンドウ期間の前に）投与する場合、そのような２回目またはその後の用量は、副補体経路の活性化を誘発し、それ自体が急速にクリアランスする循環天然ＩｇＭ、及び／または天然ＩｇＧ、もしくは、Ｆｃで標的とする。エフェクターが体内からクリアランスする、または数が減少した後に、ＬＮＰを投与する場合、ＡＢＣは認められない。
したがって、ＬＮＰと１つ以上のセンサーとの間の相互作用を阻害すること、（直接的または間接的な）ＬＮＰによる１つ以上のセンサーの活性化を阻害すること、１つ以上のエフェクターの産生を阻害すること、及び／または１つ以上のエフェクターの活性を阻害することは、本発明の態様では有用である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＬＮＰのセンサーとの相互作用を、制限またはブロックするように設計する。例えば、ＬＮＰは、センサーとの相互作用を防止するために、変更したＰＣ、及び／またはＰＥＧを有し得る。代替的または追加的に、ＬＮＰが誘導する免疫応答を阻害する作用物質は、これらの効果のうちのいずれか１つ以上を達成するために使用し得る。
さらに、従来のＢ細胞もＡＢＣに関与している、と決定されている。具体的には、作用物質の初回投与時に、本明細書では、ＣＤ１９（＋）と称する従来のＢ細胞は、作用物質に結合し、これに対して反応する。Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞とは異なるが、従来のＢ細胞は、（ＬＮＰ投与後の約９６時間後から）ＩｇＭ応答を最初に起こすことができ、続いて、（ＬＮＰ投与後の約１４日後から）記憶応答に付随するＩｇＭ応答を起こすことができる。したがって、従来のＢ細胞は、投与した作用物質と反応し、ＡＢＣを媒介するＩｇＭ（及び最終的にはＩｇＧ）に寄与する。ＩｇＭ及びＩｇＧは一般的には、抗ＰＥＧ ＩｇＭ及び抗ＰＥＧ ＩｇＧである。
一部の事例では、ＡＢＣ応答の大部分が、Ｂ１ａ細胞及びＢ１ａ媒介免疫応答を介して媒介すると想定する。一部の例では、従来のＢ細胞及びＢ１ａ細胞の両方がそのような作用を媒介しながら、ＡＢＣ応答が、ＩｇＭ及びＩｇＧの両方により媒介することをさらに想定する。さらにその他の事例では、ＡＢＣ応答は、天然ＩｇＭ分子により媒介され、これらのいくつかは、活性化したＢ１ａ細胞が産生し得る天然ＩｇＭに結合することができる。天然ＩｇＭは、ＬＮＰの１つ以上の構成成分に結合し、例えば、ＬＮＰのリン脂質構成成分に結合（例えば、リン脂質のＰＣ部分に結合）し、及び／またはＬＮＰのＰＥＧ脂質構成成分に結合（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧに結合、特に、ＰＥＧ－ＤＭＧのＰＥＧ部分に結合）することができる。Ｂ１ａは、ホスファチジルコリンがリガンドであるＣＤ３６を発現するので、ＣＤ３６受容体が、Ｂ１ａ細胞の活性化、したがって、天然ＩｇＭの産生を媒介することができると想定する。さらにその他の事例では、ＡＢＣ応答は、主に、従来のＢ細胞で媒介する。
本発明によれば、Ｂ１ａ細胞を活性化しない化合物及び組成物（例えば、作用物質、送達ビヒクル、及び製剤）を使用することで、ＡＢＣ現象を少なくとも部分的に低下させ、または排除することができることが認められている。Ｂ１ａ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書ではＢ１ａ不活性化合物及び組成物と称し得る。さらに、本発明によれば、従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物の使用により、ＡＢＣ現象を、少なくとも部分的に低下させ、または排除することができることが認められている。一部の実施形態では、従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書では、ＣＤ１９不活化合物及び組成物と称し得る。したがって、本明細書で提供する一部の実施形態では、当該化合物及び組成物は、Ｂ１ａ細胞を活性化せず、それらは、従来のＢ細胞を活性化しない。一部の実施形態では、Ｂ１ａ細胞及び従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書ではＢ１ａ／ＣＤ１９不活性化合物及び組成物と称し得る。
これらの根底にある機序は、これまで理解されておらず、この現象における、Ｂ１ａ及びＢ１ｂの細胞の役割、及びそれらの従来のＢ細胞との相互作用も認識されていなかった。
したがって、本開示は、ＡＢＣを促さない化合物及び組成物を提供する。これらは、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞、血小板及び／またはｐＤＣ、ならびに、任意に、従来のＢ細胞も活性化しないことで、さらに特徴決定し得る。これらの化合物（例えば、予防薬、治療薬、及び診断薬などの生物学的に活性な作用物質を含む薬剤、リポソーム、脂質ナノ粒子、及びその他の脂質ベースの封入構造体を含む送達ビヒクルなど）、ならびに、組成物（例えば、製剤など）は、特に、反復投与、特に、短期間（例えば、１～２週間以内）の内で生じる反復投与を必要とする用途に望ましい。例えば、このことは、薬剤を規則的で密接した間隔で対象に提供する核酸をベースとした治療薬である場合に当てはまる。本明細書で提供する知見は、同様に投与する、及び／またはＡＢＣを受けやすいこれらの薬剤、及びその他の薬剤に適用し得る。
ＡＢＣの影響を受けやすいことが公知であるために、脂質含有化合物、脂質含有粒子、及び脂質含有組成物が、特に興味深い。そのような脂質含有化合物粒子、及び組成物は、生物学的に活性な作用物質として、またはそのような作用物質の送達ビヒクルとして広範囲に使用されている。したがって、そのような作用物質の有効性を向上させる能力は、作用物質自体、またはその送達ビヒクルに対するＡＢＣの作用を低下させるか否かに関係なく、多種多様な活性薬剤にとって有益である。
１つ以上の生物学的に活性な薬剤の反復用量投与と関連する急性期応答（ＡＲＰ）を、刺激または増強しない組成物も、本明細書で提供する。
当該組成物は、一部の事例では、限定をするものではないが、天然ＩｇＭを含むＩｇＭに結合しないことがある。
当該組成物は、一部の事例では、限定をするものではないが、Ｃ反応性タンパク質などの急性期タンパク質に結合しないことがある。
当該組成物は、一部の事例では、ＣＤ５（＋）媒介免疫応答を誘発しないことがある。本明細書で使用するＣＤ５（＋）媒介免疫応答とは、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞が媒介する免疫応答である。そのような応答は、ＡＢＣ応答、急性期応答、天然ＩｇＭ、及び／またはＩｇＧの誘導などを含み得る。
当該組成物は、一部の事例では、ＣＤ１９（＋）媒介免疫応答を誘発しないことがある。本明細書で使用するＣＤ１９（＋）媒介免疫応答は、従来のＣＤ１９（＋）、ＣＤ５（－）Ｂ細胞が媒介する免疫応答である。そのような応答として、ＩｇＭの誘導、ＩｇＧの誘導、メモリーＢ細胞の誘導、ＡＢＣ応答、タンパク質をＬＮＰ内に封入し得る抗タンパク質応答を含む抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答などがある。
Ｂ１ａ細胞は、先天免疫に関与するＢ細胞のサブセットである。これらの細胞は、天然抗体または天然血清抗体と称する循環ＩｇＭの供給源である。天然ＩｇＭ抗体は、いくつかの抗原に対して弱い親和性を示すことで特徴決定されており、したがって、それらを、「ポリ特異的」または「ポリ反応性」と称しており、複数の抗原に結合する能力を示す。Ｂ１ａ細胞は、ＩｇＧを産生することができない。加えて、それらは、メモリー細胞に発展せず、したがって、適応免疫応答に寄与しない。しかしながら、それらは、活性化時に、ＩｇＭを分泌することができる。分泌したＩｇＭは、一般的には、約２～３週間以内にクリアランスされ、この時点で、免疫系は、以前に投与した抗原に対して比較的ナイーブになる。同じ抗原が、この期間後（例えば、最初の曝露の約３週間後）に提示した場合、抗原は、急速にはクリアランスされない。しかしながら、重大なことに、抗原を、その期間内（例えば、１週間以内などの２週間以内、または数日以内）に提示する場合、抗原は急速にクリアランスする。連続投与間でのこの遅延が故に、ある特定の脂質含有治療薬または診断薬が使用に適さなくなる。
ヒトでは、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ２０（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ４３（＋）、ＣＤ７０（－）、及びＣＤ５（＋）である。マウスでは、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ５（＋）、及びＣＤ４５Ｂ細胞アイソフォームＢ２２０（＋）である。Ｂ１ａ細胞を、その他の従来のＢ細胞と区別するのは、一般的には、ＣＤ５の発現である。Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ５を高レベルで発現し得るものであり、これに基づいて、ＣＤ５を低レベル、または検出不可能なレベルで発現するＢ－１ｂ細胞などのその他のＢ－１細胞と区別し得る。ＣＤ５は、汎Ｔ細胞表面糖タンパク質である。Ｂ１ａ細胞は、脂肪酸トランスロカーゼとしても公知のＣＤ３６を発現する。ＣＤ３６は、クラスＢスカベンジャー受容体ファミリーのメンバーである。ＣＤ３６は、酸化低密度リポタンパク質、天然リポタンパク質、酸化リン脂質、及び長鎖脂肪酸を含む多くのリガンドに結合することができる。
Ｂ１ｂ細胞は、先天免疫に関与するＢ細胞の別のサブセットである。これらの細胞は、循環天然ＩｇＭの別の供給源である。ＰＳを含むいくつかの抗原は、Ｂ１ｂ活性化を介してＴ細胞非依存の免疫を誘導することができる。ＣＤ２７は、一般的に、抗原活性化に応答して、Ｂ１ｂ細胞上で上方制御する。Ｂ１ａ細胞と同様に、Ｂ１ｂ細胞は、一般的に、脾臓及び腹膜腔などの特異的な身体の箇所に存在しており、血液中では非常に少ない。Ｂ１ｂ分泌型天然ＩｇＭは、一般的に、約２～３週間以内にクリアランスされ、その時点で、免疫系は、以前に投与した抗原に対して比較的ナイーブになる。同じ抗原を、この期間後（例えば、最初の曝露の約３週間後）に提示した場合、抗原は、急速にはクリアランスされない。しかし、重大なことに、抗原がその期間内（例えば、１週間などの２週間以内、または数日以内）に提示する場合、抗原は急速にクリアランスする。連続投与間のこの遅延が故に、ある特定の脂質含有治療薬または診断薬が使用に適さなくなる。
一部の実施形態では、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞活性化を遮断することが望ましい。Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞活性化を遮断するための１つの方策は、脂質ナノ粒子のどの構成成分がＢ細胞活性化を促すのかを決定し、それらの構成成分を中和することを含む。少なくともＰＥＧ、及びホスファチジルコリン（ＰＣ）が、Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞のその他の細胞との相互作用及び／または活性化に寄与することが、本明細書で発見されている。ＰＥＧは、活性化をもたらすことができるＢ１細胞及び血小板の間の凝集の促進において役割を果たすことができる。ＰＣ（ＬＮＰでのヘルパー脂質）は、おそらく、Ｂ細胞表面でのＣＤ３６受容体との相互作用により、Ｂ１細胞の活性化にも関与する。多数の粒子は、ＰＥＧ脂質代替物、ＰＥＧなし、及び／またはＰＣ置換脂質（例えば、オレイン酸、またはそのアナログ）が設計及び試験されている。置換しなければ反復投与時にＡＢＣを促すであろうＬＮＰでのこれらの１つ以上の構成成分の置換が、天然ＩｇＭの産生、及び／またはＢ細胞活性化を低下させて、ＡＢＣを予防するうえで有用であることを、本出願人は確立している。したがって、本発明は、Ｂ細胞トリガーの包含を排除する設計の結果として、ＡＢＣを低下させているＬＮＰを含む。
Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞活性化を遮断するための別の方策は、ＬＮＰが誘導する免疫応答を阻害する作用物質を使用することを含む。これらのタイプの作用物質は、以下で、さらに詳細に検討する。一部の実施形態では、これらの作用物質は、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞と、ＬＮＰまたは血小板またはｐＤＣとの間の相互作用を遮断する。例えば、作用物質を、抗体または相互作用を物理的に遮断するその他の結合剤とすることができる。この一例が、ＣＤ３６またはＣＤ６に結合する抗体である。作用物質は、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞が、一旦活性化するか、または活性化する前に、シグナル伝達することを防止または無効化する化合物とし得る。例えば、ＬＮＰまたはその他の免疫細胞とのＢ細胞の相互作用がもたらすＢ１ａ／Ｂ１ｂシグナル伝達カスケードでの１つ以上の構成成分を遮断することが可能である。その他の実施形態では、作用物質は、活性化後に、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞が産生する１つ以上のエフェクターに作用することができる。これらのエフェクターは、例えば、天然ＩｇＭ、及びサイトカインを含む。
本発明の態様によれば、ｐＤＣ細胞の活性化を遮断すると、ＬＮＰに応答するＢ細胞活性化が減少することが実証されている。したがって、ＡＢＣ及び／または毒性を回避するために、ｐＤＣ活性化を防止することが望ましいことがある。上記した方策と同様に、ｐＤＣ細胞活性化は、ｐＤＣと、ＬＮＰ及び／またはＢ細胞／血小板の間の相互作用を阻害する作用物質により遮断され得る。あるいは、ｐＤＣに作用して活性化する能力を抑制する、またはエフェクターに作用する作用物質を、ＬＮＰと共に使用してＡＢＣを回避することができる。
血小板は、ＡＢＣ及び毒性においても重要な役割を果たし得る。ＬＮＰの初回用量を対象に投与した後に、非常に迅速に、血小板は、ＬＮＰと会合し、凝集し、活性化する。一部の実施形態では、血小板凝集、及び／または活性化を遮断することが望ましい。血小板凝集、及び／または活性化を抑制するための１つの方策は、脂質ナノ粒子のいずれの構成成分が、血小板凝集及び／または活性化を促すのかを決定し、それらの構成成分を中和することを含む。本明細書では、少なくともＰＥＧは、血小板凝集、活性化、及び／またはその他の細胞との相互作用に寄与する、ことが発見されている。多数の粒子は、ＰＥＧ脂質代替物を有しており、ＰＥＧなしの場合については、設計及び試験が行われている。置換しなければ反復投与時にＡＢＣを促すであろうＬＮＰ内でのこれらの１つ以上の構成成分の置換が、天然ＩｇＭの産生、及び／または血小板凝集を減少させるので、ＡＢＣを予防するうえで有用である、ことを本出願人は確立している。したがって、本発明は、血小板トリガーの取り込みを排除する設計が故に、ＡＢＣを低下させているＬＮＰを含む。あるいは、活性化をすると、血小板に作用して活性を抑制する、またはエフェクターに作用する作用物質は、ＬＮＰと共に使用してＡＢＣを回避することができる。
（ｉ）ＡＢＣ活性、及び関連活性の測定
ＬＮＰを含む本明細書で提示する種々の化合物及び組成物は、インビボ投与時にＡＢＣ活性を促進しない。これらのＬＮＰは、多数のアッセイ、例えば、限定をするものではないが、以下に記載した内のいずれか、さらには、実施例の方法のサブセクションを含む実施例セクションに開示したアッセイのいずれかによって、特徴決定、及び／または同定することができる。
一部の実施形態では、当該方法は、ＡＢＣを促す免疫応答を招かずにＬＮＰを投与することを含む。ＡＢＣを促す免疫応答は、１つ以上のセンサー、例えば、Ｂ１細胞、ｐＤＣ、または血小板、及び１つ以上のエフェクター、例えば、天然ＩｇＭ、天然ＩｇＧ、またはＩＬ６などのサイトカインの活性化を含む。したがって、ＡＢＣを促す免疫応答を招かないＬＮＰの投与は、少なくとも１つ以上のセンサーの有意な活性化と、１つ以上のエフェクターの有意な産生を招かないＬＮＰの投与を最低限含む。この文脈で使用する有意な、とは、ＡＢＣ誘発ＬＮＰの２回目の投与の場合に予想される血液クリアランスのレベルに対して、２回目の用量の全部、または一部の血液クリアランスが加速するという生理学的結果をもたらす量のことを指す。例えば、２回目の投与後に認められるＡＢＣが、ＡＢＣ誘発ＬＮＰの場合に予想されているものよりも低くなるように、免疫応答を減衰すべきである。
（ｉｉ）Ｂ１ａまたはＢ１ｂ活性化アッセイ
本開示で提供する特定の組成物は、Ｂ細胞、例えば、Ｂ１ａまたはＢ１ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５＋）、及び／または従来のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５－）を活性化しない。Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、または従来のＢ細胞の活性化は、様々な方法で決定することができ、これらの一部を以下に示す。Ｂ細胞集団は、分別Ｂ細胞集団または脾細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の未分画集団として提供し得る。後者の場合、細胞集団を、一定の期間、選択すべきＬＮＰとインキュベーションし、次いで、さらなる分析のために回収し得る。あるいは、上清を、回収及び分析し得る。
（ｉｉｉ）活性化マーカー細胞表面発現の上方制御
Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、または従来のＢ細胞の活性化は、ＣＤ８６などの後期活性化マーカーを含むＢ細胞活性化マーカーの発現の増加として実証し得る。例示的なアッセイでは、限定をするものでないが、未分画Ｂ細胞は、脾細胞集団として、またはＰＢＭＣ集団として提供され、特定の期間、選択すべきＬＮＰと共にインキュベーションを行い、次いで、ＣＤ１９などの標準的なＢ細胞マーカー、及びＣＤ８６などの活性化マーカーについて染色を行い、例えば、フローサイトメトリーを使用して分析する。適切な陰性コントロールは、培地を用いて同じ集団をインキュベーションすること、次いで、同じ染色及び可視化のステップを実施することを含む。陰性コントロールと比較して、試験集団におけるＣＤ８６発現の増加は、Ｂ細胞活性化を示す。
（ｉｖ）炎症誘発性サイトカイン放出
Ｂ細胞活性化は、サイトカイン放出アッセイでも評価し得る。例えば、活性化は、目的のＬＮＰと共に曝露したときの、ＩＬ－６、及び／またはＴＮＦ－αなどのサイトカインの産生、及び／または分泌を介して評価し得る。
そのようなアッセイは、当該技術分野で周知のルーチン的なサイトカイン分泌アッセイを使用して実施し得る。サイトカイン分泌の増加は、Ｂ細胞活性化を示す。
（ｖ）Ｂ細胞によるＬＮＰ結合／会合及び／または取り込み
Ｂ細胞へのＬＮＰ会合または結合を使用して、目的のＬＮＰを評価し、さらに、そのようなＬＮＰを特徴決定もし得る。会合／結合及び／または取り込み／内在化を、検出可能に標識した、例えば、蛍光標識したＬＮＰを使用して、種々の期間のインキュベーションをした後のＢ細胞内またはＢ細胞上でのそのようなＬＮＰの箇所を追跡して評価し得る。
本明細書で提供する組成物が、認識または検出、及び任意に、循環ＩｇＭ及び／または急性期タンパク質（例えば、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ））などの急性期応答メディエーターなどのＡＢＣの下流のメディエーターによる結合を回避し得ることを、本発明はさらに企図する。
（ｖｉ）ＡＢＣを低下させるための使用の方法
ＡＢＣを促進せずに、対象に治療薬などの作用物質を封入することができるＬＮＰを送達するための方法も本明細書で提供する。
一部の実施形態では、当該方法は、ＡＢＣを促進せず、例えば、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭの産生を誘導せず、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞を活性化しない、本明細書に記載したＬＮＰのいずれかを投与することを含む。本明細書で使用する「ＡＢＣを促進しない」ＬＮＰとは、実質的なＡＢＣをもたらす免疫応答を誘導しない、または実質的なＡＢＣをもたらすには不十分な実質的に低レベルの免疫応答を誘導するＬＮＰのことを指す。ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭの産生を誘導しないＬＮＰは、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭを誘導しない、または実質的なＡＢＣをもたらすには不十分な実質的に低レベルの天然ＩｇＭ分子を誘導するＬＮＰのことを指す。Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞を活性化しないＬＮＰは、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭを産生するＢ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞の応答を誘導しない、または実質的なＡＢＣをもたらすには不十分な実施的に低レベルのＢ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞応答を誘導するＬＮＰのことを指す。
一部の実施形態では、産生を活性化しない、及び誘導しないという用語は、参照値または状態に対する相対的な低下である。一部の実施形態では、参照値または条件は、ＭＣ３ ＬＮＰなどの標準的なＬＮＰによるＩｇＭなどの分子の産生の活性化または誘導の量である。一部の実施形態では、相対的な低下は、少なくとも３０％、例えば、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の低下である。その他の実施形態では、Ｂ細胞などの細胞を活性化しない、及びＩｇＭなどのタンパク質の産生を誘導しないという用語は、検出不可能な量の活性細胞または特定のタンパク質を指し得る。
（ｖｉｉ）血小板の効果、及び毒性
本発明は、一部では、ＬＮＰ投与に関連する用量制限毒性の根底にある機序の解明をさらに前提とする。そのような毒性は、凝固障害、急性または慢性の別に関係なく、播種性血管内凝固（ＤＩＣ、別名、消耗性凝固障害）、及び／または血管血栓症を含み得る。一部の事例では、ＬＮＰに関連する用量制限毒性は、急性期応答（ＡＰＲ）、または補体活性化関連偽アレルギー（ＣＡＲＰＡ）である。
本明細書で使用する凝固障害とは、インビボでの凝固（血液凝固）の増加のことを指す。本開示で報告した知見は、そのような凝固の増加と一致し、根本的な機序についての洞察を重要なこととして提供する。凝固は、多数の異なる因子及び細胞型を含むプロセスであり、従来、ＬＮＰ及び血小板の間の関係及び相互作用は、この点に関しては理解がされていない。本開示は、そのような相互作用の証拠を提供し、血小板会合の減少、血小板凝集の減少、及び／または血小板凝集の減少を含む、血小板効果の低下を有するように改変した化合物及び組成物を提供する。そのような血小板効果を、好ましくは、下方調節する能力を含む調節する能力は、ＬＮＰ投与後の凝固障害の発生率及び／または重症度を低下させることができる。これは、順次、そのようなＬＮＰに関連する毒性を低下させ、それにより、より高用量のＬＮＰ、重要なことに、それらのカーゴが、それを必要とする患者に投与することが可能となる。
ＣＡＲＰＡは、ナノ医薬品及び生物製剤が誘発し得る、過敏反応（ＨＳＲ）に現れる急性免疫毒性のクラスである。アレルギー反応とは異なり、ＣＡＲＰＡは、一般的には、ＩｇＥを含まないが、病原体を除去する身体の能力を増強する先天免疫系の一部である補体系の活性化の結果として生じる。以下の経路、古典補体経路（ＣＰ）、副経路（ＡＰ）、及びレクチン経路（ＬＰ）のうちの１つ以上は、ＣＡＲＰＡに含まれ得る。Ｓｚｅｂｅｎｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６１：１６３－１７３（２０１４）。
古典経路は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、またはＣ１ｑｒ２ｓ２を含有するＣ１複合体の活性化により誘発される。Ｃ１複合体の活性化は、Ｃ１ｑが抗原と複合化したＩｇＭまたはＩｇＧに結合する場合、またはＣ１ｑが病原体の表面に直接結合する場合に生じる。そのような結合は、順次Ｃ１ｓを切断するＣ１ｒの活性化をもたらすＣ１ｑ分子の立体配座変化をもたらす。ここで、Ｃ１ｒ２ｓ２構成成分は、Ｃ４、次にＣ２を分解して、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ、及びＣ２ｂを生じる。Ｃ４ｂ及びＣ２ｂは結合して、Ｃ３のＣ３ａ及びＣ３ｂへの切断を促す古典経路Ｃ３転換酵素（Ｃ４ｂ２ｂ複合体）を形成する。次いで、Ｃ３ｂは、Ｃ３転換酵素に結合して、Ｃ５転換酵素（Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ複合体）を形成する。代替経路は、自発的なＣ３加水分解の結果として、連続的に活性化する。因子Ｐ（プロパージン）は、副経路の正の制御因子である。プロペルジンのオリゴマー化は、Ｃ３転換酵素を安定化させ、次いで、これは、より多くのＣ３を切断することができる。Ｃ３分子は、表面に結合し、より多くのＢ、Ｄ、及びＰ活性を増強して、補体活性化の増幅をもたらすることができる。
急性期反応（ＡＰＲ）は、感染の予防、及び潜在的な病原体のクリアランスのための複雑な全身先天免疫応答である。多数のタンパク質は、ＡＰＲに関与しており、Ｃ反応性タンパク質は、十分に特徴決定されたタンパク質である。
本発明によれば、ある特定のＬＮＰは、インビボ投与のほぼ直後に、血小板と物理的に会合することができるが、その他のＬＮＰは、血小板と全く会合しない、またはバックグラウンドレベルでしか会合しないことが認められている。重大なことに、血小板と会合するＬＮＰは、その後に形成する血小板凝集体も明らかに安定化させる。血小板のあるｓ特定のＬＮＰとの物理的接触は、そのような血小板が、凝集したままである、または投与した後の長期間にわたり凝集体を継続的に形成する能力と相関する。そのような凝集体は、活性化血小板、さらに、マクロファージ、及びＢ細胞などの先天免疫細胞も含む。
２３．使用方法
本明細書に記載したポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤は、ＵＧＴ１Ａ１関連疾患、障害、または状態を、処置及び／または予防するための調製、製造、及び治療用途に使用する。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、組成物、及び製剤は、ＣＮ－１を処置、及び／または予防するために使用する。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤を、ビリルビン、及び／またはビリルビン代謝産物のレベルを下げることを必要とする対象においてそれを行う方法で使用する。例えば、本発明の一態様は、対象におけるＣＮ－１の症状を軽減する方法を提供しており、その対象に対して、ＵＧＴ１Ａ１をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）を含む組成物、または製剤の投与を含む。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤を、ＵＧＴ１Ａ１のバイオマーカー（例えば、ＣＮ－１に関連する代謝産物、例えば、基質、または産物、すなわち、ビリルビン、及び／またはビリルビン代謝産物）のレベルを下げるために使用しており、当該方法は、有効量のＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、対象に対して投与することを含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤を投与して短時間の内（例えば、約６時間以内、約８時間以内、約１２時間以内、約１６時間以内、約２０時間以内、または約２４時間以内）に、ＣＮ－１のバイオマーカー、例えば、ビリルビン、またはビリルビン代謝産物のレベルを下げる。
補充療法は、ＣＮ－１のための有望な処置である。したがって、本発明のある特定の態様では、本明細書に開示したポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、ＣＮ－１のための遺伝子補充療法での使用に適している、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする１つ以上の配列を含む。一部の実施形態では、本開示は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを対象に提供することにより、対象におけるＵＧＴ１Ａ１、またはＵＧＴ１Ａ１活性の欠損、あるいは、低下した、または異常なＵＧＴ１Ａ１活性を処置する。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、配列最適化している。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、その際、核酸が、例えば、そのＧ／Ｃ、ウリジン、またはチミジン含有量を修飾することで配列最適化している、及び／またはポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲＮＡ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位、及び／またはｍｉＲＮＡ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを含む組成物または製剤、本発明の医薬組成物または製剤の対象への投与は、血中（例えば、血清中）のビリルビン、及び／またはビリルビン代謝産物を、組成物または製剤の投与前に認められたレベルよりも、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％低いレベルにまで低下する。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、対象の細胞におけるＵＧＴ１Ａ１の発現をもたらす。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、対象におけるＵＧＴ１Ａ１発現、及び／または酵素活性の増加をもたらす。例えば、一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物または製剤を対象に投与する方法において使用し、その際、その方法は、対象の少なくとも一部の細胞におけるＵＧＴ１Ａ１発現、及び／または酵素活性の増加をもたらす。
一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物または製剤の対象への投与は、正常な対象、例えば、ＣＮ－１に罹患していないヒトで予測する発現レベル、及び／または活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％以上のレベルまでの、対象の細胞におけるＵＧＴ１Ａ１発現、及び／または酵素活性の増加をもたらす。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、有意なビリルビン代謝（例えば、グルクロン酸化）を可能にするために十分な期間持続する、対象の細胞の少なくとも一部でのＵＧＴ１Ａ１タンパク質の発現をもたらす。
一部の実施形態では、コードしたポリペプチドの発現が増加する。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、細胞に導入した場合に、これらの細胞におけるＵＧＴ１Ａ１発現、及び／または酵素活性レベルを、当該ポリペプチドを細胞に導入する前の細胞におけるＵＧＴ１Ａ１発現レベル、及び／または酵素活性レベルに対して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％増加させる。
一部の実施形態では、当該方法または使用は、配列番号２、及び５～１２の群から選択するポリヌクレオチドと配列類似性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを投与することを含み、その際、当該ポリヌクレオチドは、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする。
本開示のその他の態様は、ポリヌクレオチドを含有する細胞の哺乳動物対象への移植に関する。細胞の哺乳動物対象への投与は、当業者に公知のものであり、限定をするものではないが、局所移植（例えば、局所もしくは皮下投与）、器官送達、または全身注射（例えば、静脈内注射もしくは吸入）、及び医薬として許容可能な担体での細胞の製剤がある。
本開示は、ＵＧＴ１Ａ１活性を高めることを必要とする対象、例えば、ＣＮ－１を有する対象においてそれを行う方法も提供しており、本明細書に開示したＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、例えば、ヒトＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド、その変異体、またはヒトＵＧＴ１Ａ１を含む融合タンパク質を含む治療有効量の組成物、または製剤を、対象に対して投与することを含む。
一部の態様では、投与を必要とする対象、例えば、ＣＮ－１を有する対象に対してそれを行った後に測定したＵＧＴ１Ａ１活性は、少なくとも、健康なヒト対象で認められる正常なＵＧＴ１Ａ１活性レベルである。一部の態様では、投与した後に測定したＵＧＴ１Ａ１活性は、ＣＮ－１患者、例えば、治療を受けていないＣＮ－１患者で認められるＵＧＴ１Ａ１活性レベルよりも高い。一部の態様では、それを必要とする対象、例えば、ＣＮ－１を有する対象では、本明細書に開示したＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療有効量の組成物、または製剤を対象に対して投与した後のＵＧＴ１Ａ１活性の高まりは、健康なヒト対象で認められた正常なＵＧＴ１Ａ１活性レベルの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００パーセントである、または１００パーセントを超える。一部の態様では、本明細書に開示したＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物、または製剤を対象に対して投与した後（例えば、単回投与した後）に、ＣＮ－１患者で認められるＵＧＴ１Ａ１活性レベルを超える高さのＵＧＴ１Ａ１活性は、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１２日間、１４日間、２１日間、または２８日間続く。
ビリルビン、またはビリルビン代謝産物レベルは、当該技術分野で公知の方法を使用して、血液（例えば、血清、または血漿）、または組織（例えば、心臓、肝臓、脳、または骨格筋組織）において測定することができる。本開示は、ビリルビン、またはビリルビン代謝産物レベルを下げることを必要とする対象、例えば、治療を受けていないＣＮ－１患者においてそれを行う方法も提供しており、本明細書に開示したＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療有効量の組成物、または製剤を、対象に対して投与することを含む。
本開示は、ＣＮ－１患者でのＣＮ－１の症状（例えば、高ビリルビン血症、黄疸、神経学的損傷（すなわち、核黄疸）、精神遅滞、麻痺、運動失調、痙縮、感覚神経聴力損失、または運動障害）を治療、予防、または改善する方法も提供しており、本明細書に開示したＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療有効量の組成物、または製剤を、対象に対して投与することを含む。一部の態様では、ＣＮ－１の治療を必要とする対象に対して、本明細書に開示したＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療有効量の組成物、または製剤を投与すると、ＣＮ－１の症状が軽減する。
一部の実施形態では、本発明の方法で使用するポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、医薬組成物、及び製剤は、本明細書に開示したＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするウラシル修飾配列、及び本明細書に開示したｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位、及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学修飾核酸塩基、例えば、Ｎ１－メチルシュードウラシル、または５－メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、本発明のＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするウラシル修飾配列での１種の核酸塩基（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％は、修飾核酸塩基である。一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするウラシル修飾配列でのウルシルの少なくとも９５％は、１－Ｎ－メチルシュードウリジン、または５－メトキシウリジンである。一部の実施形態では、本明細書に開示したポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～２３２のいずれか、例えば、化合物ＩＩ；式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３～３４２のいずれか、例えば、化合物ＶＩ；または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９～４２８のいずれか、例えば、化合物Ｉ、またはそれらのいずれかの組合せを含む送達剤と共に製剤する。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０、または約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約３０～約６０モル％化合物ＩＩまたはＶＩ（または関連の適切なアミノ脂質）（例えば、３０～４０、４０～４５、４５～５０、５０～５５、または５５～６０モル％化合物ＩＩまたはＶＩ（または関連の適切なアミノ脂質））、約５～約２０モル％リン脂質（または関連の適切なリン脂質または「ヘルパー脂質」）（例えば、５～１０、１０～１５、または１５～２０モル％リン脂質（または関連の適切なリン脂質または「ヘルパー脂質））、約２０～約５０モル％コレステロール（または関連ステロールまたは「非カチオン」脂質）（例えば、約２０～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、または４５～５０モル％コレステロール（または関連ステロールまたは「非カチオン」脂質））、及び約０．０５～約１０モル％ＰＥＧ脂質（またはその他の適切なＰＥＧ脂質）（例えば、０．０５～１、１～２、２～３、３～４、４～５、５～７、または７～１０モル％ＰＥＧ脂質（またはその他の適切なＰＥＧ脂質））の範囲のモル比で含む。例示的な送達剤は、例えば、４７．５：１０．５：３９．０：３．０、または５０：１０：３８．５：１．５のモル比を含むことができる。ある特定の例では、例示的な送達剤は、例えば、４７．５：１０．５：３９．０：３、４７．５：１０：３９．５：３、４７．５：１１：３９．５：２、４７．５：１０．５：３９．５：２．５、４７．５：１１：３９：２．５、４８．５：１０：３８．５：３、４８．５：１０．５：３９：２、４８．５：１０．５：３８．５：２．５、４８．５：１０．５：３９．５：１．５、４８．５：１０．５：３８．０：３、４７：１０．５：３９．５：３、４７：１０：４０．５：２．５、４７：１１：４０：２、４７：１０．５：３９．５：３、４８：１０．５：３８．５：３、４８：１０：３９．５：２．５、４８：１１：３９：２、または４８：１０．５：３８．５：３のモル比を含むことができる。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＩＩまたはＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０のモル比で含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＩＩまたはＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０または約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
当業者であれば、本発明の薬物または処置の治療有効性は、対象（例えば、前臨床試験対象（齧歯類、霊長類など）、または臨床対象（ヒト））から得た試料（複数可）でのコードしたタンパク質（例えば、酵素）の発現のレベルを測定することで特徴決定すること、または決定をすることができることを理解する。同様に、本発明の薬物または処置の治療有効性は、対象（例えば、前臨床試験対象（齧歯類、霊長類など）、または臨床対象（ヒト））から得た試料（複数可）でのコードしたタンパク質（例えば、酵素）の活性のレベルを測定することで特徴決定すること、または決定することができる。さらに、本発明の薬物または処置の治療有効性は、対象から得た試料（複数可）での適切なバイオマーカーのレベルを測定して特徴決定する、または決定することができる。タンパク質、及び／またはバイオマーカーのレベルは、本発明のｍＲＮＡ治療薬の単回投与で投与した後に、決定することができる、または単回用量で投与した後のいくつかの時点で、決定、及び／またはモニタリングすることができる、または処置、例えば、複数回投与の処置の経過を通して、決定、及び／またはモニタリングすることができる。
ＣＮ－１は、ビリルビンをグルクロン酸とコンジュケートする能力の障害に関連している。したがって、ＣＮ－１患者は、一般的に、コンジュケートしていないビリルビンを血中に高レベルで含む。
ＣＮ－１は、ビリルビンをグルクロン酸とコンジュケートさせる能力の障害と、患者の血中でのビリルビンの異常な蓄積を特徴とする、常染色体劣性代謝障害である。したがって、ＣＮ－１患者は、障害の無症候性キャリアであるか、または疾患に関連する様々な症状を示すことがある。ＣＮ－１患者は、一般的に、患者の血漿、血清、及び／または組織（例えば、肝臓）に、高レベルのビリルビンを含む。特に断りがない限り、本明細書に開示したＣＮ－１患者、またはヒト対象を治療する方法は、無症候性キャリア、及び異常なレベルのバイオマーカーを有する個体の両方の治療を含む。
ＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現レベル
本発明のある特定の態様は、対象、例えば、動物（例えば、齧歯類、霊長類など）、またはヒト対象におけるＵＧＴ１Ａ１タンパク質の発現レベル（複数可）の測定、決定、及び／またはモニタリングを特徴とする。動物として、正常な動物、健康な動物、または野生型動物、さらには、ＣＮ－１、及びその処置の理解において使用するための動物モデルがある。例示的な動物モデルとして、齧歯類モデル、例えば、ガンラット、及びＵＧＴ１Ａ１欠損マウス（別名、ＵＧＴ１Ａ１－／－マウス）がある。
ＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現レベルは、例えば、血液試料、または針生検由来の生物学的試料でのタンパク質レベルを決定するための当該技術分野で認識されているあらゆる方法で、測定または決定することができる。本明細書で使用する用語「レベル」、または「タンパク質のレベル」とは、好ましくは、試料、または対象でのタンパク質の重量、質量、または濃度のことを意味する。ある特定の実施形態では、当業者であれば、試料を、例えば：精製、沈殿、分離、例えば、遠心分離、及び／またはＨＰＬＣのいずれかに供して、その後、例えば、質量分析、及び／または分光分析を使用して、タンパク質のレベルの決定に供し得ることを理解する。例示的な実施形態では、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、タンパク質発現レベルを決定することができる。その他の例示的な実施形態では、タンパク質精製、分離、及びＬＣ－ＭＳを、本発明によるタンパク質のレベルを決定するための手段として使用することができる。一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法（例えば、単回静脈内投与）は、ｍＲＮＡ療法で単回投与した後の少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、少なくとも１０８、少なくとも１２２時間は、対象の組織（例えば、心臓、肝臓、脳、または骨格筋）においてＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現レベルの向上（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍の向上、及び／または正常レベルの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％までの向上）を招く。一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法（例えば、単回静脈内投与）は、ｍＲＮＡ療法で単回投与した後の少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、少なくとも１０８時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、対象の血液、血漿、または肝臓組織において、ビリルビンレベルの低下（例えば、約０．１ｍｇ／ｄＬ未満、約０．２ｍｇ／ｄＬ未満、約０．３ｍｇ／ｄＬ未満、約０．４ｍｇ／ｄＬ未満、約０．５ｍｇ／ｄＬ未満、約０．６ｍｇ／ｄＬ未満、約０．７ｍｇ／ｄＬ未満、約０．８ｍｇ／未満ｄＬ、約０．９ｍｇ／ｄＬ未満、約１．０ｍｇ／ｄＬ未満、約１．５ｍｇ／ｄＬ未満、約２．０ｍｇ／ｄＬ未満、約２．５ｍｇ／ｄＬ未満、約３．０ｍｇ／ｄＬ未満、約４．０ｍｇ／ｄＬ未満、約５．０ｍｇ／ｄＬ未満、約７．５ｍｇ／ｄＬ未満、または約１０．０ｍｇ／ｄＬ未満）を招く。一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法（例えば、単回静脈内投与）は、投与した後の少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、対象のベースラインレベル、または参照ビリルビン血中、血漿、または肝臓レベルと比較して、ビリルビンの血中、血漿、または肝臓レベルを、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％減少させる、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％）の低下を招く。一部の実施形態では、ビリルビンは、総ビリルビンである。
ＵＧＴ１Ａ１タンパク質活性
ＣＮ－１患者では、ＵＧＴ１Ａ１酵素活性は、正常な生理学的活性レベルと比べて減少している。本発明のさらなる態様は、対象、例えば、動物（例えば、齧歯類、霊長類など）、またはヒト対象でのＵＧＴ１Ａ１タンパク質の活性レベル（複数可）（すなわち、酵素活性レベル（複数可））の測定、決定、及び／またはモニタリングを特徴とする。活性レベルは、生物学的試料での酵素活性レベルを決定するための当該技術分野で認識されているあらゆる方法で、測定または決定することができる。本明細書で使用する用語「活性レベル」、または「酵素活性レベル」とは、好ましくは、試料、または試料内の総タンパク質の体積、質量、または重量当たりの酵素活性のことを意味する。例示的な実施形態では、「活性レベル」、または「酵素活性レベル」とは、流体（例えば、体液、例えば、血清、血漿、尿など）の１ミリリットル当たりの単位で説明する、または組織の重量当たり、または試料内のタンパク質（例えば、総タンパク質）の重量当たりの単位で説明する。酵素活性の単位（「Ｕ」）は、単位時間当たりに加水分解した基質の重量、または質量で表することができる。本発明のある特定の実施形態では、Ｕ／血漿ｍｌ、またはＵ／タンパク質（組織）ｍｇで表されるＵＧＴ１Ａ１活性を特徴としており、単位（「Ｕ」）は、１時間当たりに加水分解する基質のｎｍｏｌ（すなわちｎｍｏｌ／時）を表している。
ある特定の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法は、投与して６～１２時間後、または１２～２４、２４～４８、または４８～７２時間後（例えば、投与して４８または７２時間後）に、組織（例えば、肝臓）において、少なくとも５Ｕ／ｍｇ、少なくとも１０Ｕ／ｍｇ、少なくとも２０Ｕ／ｍｇ、少なくとも３０Ｕ／ｍｇ、少なくとも４０Ｕ／ｍｇ、少なくとも５０Ｕ／ｍｇ、少なくとも６０Ｕ／ｍｇ、少なくとも７０Ｕ／ｍｇ、少なくとも８０Ｕ／ｍｇ、少なくとも９０Ｕ／ｍｇ、少なくとも１００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも１５０Ｕ／ｍｇのＵＧＴ１Ａ１活性を得る上で有効な用量のｍＲＮＡを含む医薬組成物を特徴としている。
例示的な実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法は、上記したレベルの活性をもたらす単回静脈内投与量のｍＲＮＡを含む医薬組成物を特徴とする。別の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法は、単一単位静脈内投与量の複数回分のｍＲＮＡを投与して、上記したレベルの活性を維持することができる医薬組成物を特徴とする。
ＵＧＴ１Ａ１バイオマーカー
一部の実施形態では、有効量の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、ＵＧＴ１Ａ１のバイオマーカー、例えば、ビリルビン、またはビリルビン代謝産物のレベルを下げる。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤を投与すると、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤を投与して短期間の内に、ＵＧＴ１Ａ１のバイオマーカー、例えば、ビリルビン、またはビリルビン代謝産物の１つ以上のレベルを下げる。
一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１の１つ以上のバイオマーカー、例えば、ビリルビンのレベルを、血液において測定する。一部の実施形態では、バイオマーカーの１つ以上のレベルを、血液の成分、例えば、血漿、または血清において測定する。血液及び血液の成分を得る方法、ならびに、血液または血液成分でのバイオマーカーのレベルを測定する方法は、当該技術分野で公知である。一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１の１つ以上のバイオマーカー、例えば、ビリルビンのレベルを、乾燥血液スポットで測定する。ビリルビンなどのバイオマーカーのレベルを決定する方法は、当該技術分野で公知であり、ビリルビンのレベルの決定のために使用し得る。ビリルビンのレベルを乾燥血液スポットで決定する実施形態では、決定の方法は、当該技術分野で公知の質量分析法を使用することができ、例えば、質量分析を使用し得る。
一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１のバイオマーカーの１つ以上、例えば、ビリルビンのレベルは、尿において測定する。尿を得る方法、及び尿でのバイオマーカーのレベルを測定する方法は、当該技術分野で公知である。一部の実施形態では、ＣＮ－１の１つ以上のバイオマーカー、例えば、ビリルビンのレベルを、胆汁において測定する。胆汁を得る方法、及び胆汁でのバイオマーカーのレベルを測定する方法は、当該技術分野で公知である。一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１のバイオマーカーの１つ以上、例えば、ビリルビンのレベルは、肝臓組織において測定する。肝臓組織を得る方法、例えば、生検、及び肝臓組織におけるバイオマーカーのレベルを測定するための技術は、当該技術分野で公知である。
一部の実施形態では、ビリルビンの血中、血漿、または血清レベルは、本明細書に記載した医薬組成物、またはポリヌクレオチドを投与して、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、ＣＮ－１を有する対象において、約０．１ｍｇ／ｄＬ、約０．２ｍｇ／ｄＬ、約０．３ｍｇ／ｄＬ、約０．４ｍｇ／ｄＬ、約０．５ｍｇ／ｄＬ、約０．６ｍｇ／ｄＬ、約０．７ｍｇ／ｄＬ、約０．８ｍｇ／ｄＬ、約０．９ｍｇ／ｄＬ、約１．０ｍｇ／ｄＬ、約１．５ｍｇ／ｄＬ、約２．０ｍｇ／ｄＬ、約２．５ｍｇ／ｄＬ、約３．０ｍｇ／ｄＬ、約４．０ｍｇ／ｄＬ、約５．０ｍｇ／ｄＬ、約７．５ｍｇ／ｄＬ、または約１０．０ｍｇ／ｄＬ未満にまで下がる。ＣＮ－１を有する対象、及びＣＮ－１を有していない対象での血液、血漿、または血清に含まれるビリルビンの参照レベルは、当該技術分野から知見することができる。
測定するバイオマーカーがビリルビンである特定の実施形態では、測定したビリルビンは、コンジュケートしていないビリルビンである。測定するバイオマーカーがビリルビンである別の特定の実施形態では、測定するビリルビンは、コンジュケートしたビリルビンである。測定するバイオマーカーがビリルビンであるなおも別の実施形態では、測定するビリルビンは、総ビリルビンである。
本発明のさらなる態様は、例えば、同じ患者から得た、別の患者から得た、コントロールに由来する、及び／または同じ時点、または異なる時点に得た別の試料における同じ、または別のバイオマーカーのレベル（例えば、参照レベル）、及び／または生理学的レベル、及び／または上昇したレベル、及び／または超生理学的レベル、及び／またはコントロールのレベルと比較して、試料について決定をしたバイオマーカーのレベル（複数可）を決定する、ことを特徴としている。当業者であれば、バイオマーカーの生理学的レベル、例えば、通常の動物、または野生型動物、正常な対象、または健康な対象などでのレベル、特に、健康で、及び／または正常に機能している対象に特徴的なレベル（複数可）について精通している。本明細書で使用する句「上昇したレベル」とは、通常の前臨床動物、または野生型の前臨床動物、または正常な対象、または健康な対象、例えば、ヒト対象において一般的に認められる量よりも多量である、ことを意味する。本明細書で使用する用語「超生理学的」とは、任意に、顕著に大きな生理学的反応を示す、通常の前臨床動物、または野生型の前臨床動物、または正常な対象、または健康な対象、例えば、ヒト対象において一般的に認められる量よりも多量である、ことを意味する。本明細書で使用する用語「比較する」、または「比較した」とは、好ましくは、２つ以上の数値、例えば、バイオマーカー（複数可）のレベルの数学的比較のことを意味する。したがって、当業者であれば、そのような数値の少なくとも２つを互いに比較する場合には、数値の一方が、別の数値、または数値のグループよりも、大きい、小さい、または同一であるかに関しては容易に理解する。比較する、または～に対する比較は、例えば、コントロール値と比較する、例えば、投与前の当該対象（例えば、ＣＮ－１に罹患した方）、あるいは、正常な対象、または健康な対象での参照血液、血清、血漿、及び／または組織（例えば、肝臓）ビリルビンレベルと比較する、という文脈において使用することができる。比較する、または～に対する比較はまた、例えば、コントロール値と比較する、例えば、投与前の当該対象（例えば、ＣＮ－１に罹患した方）、あるいは、正常な対象、または健康な対象での参照血液、血清、血漿、及び／または組織（例えば、肝臓）ビリルビン、またはビリルビン代謝産物レベルと比較する、という文脈において使用することもできる。
本明細書で使用する用語「コントロール」は、好ましくは、対象由来の試料であり、当該対象のＣＮ－１病態は公知である。一実施形態では、コントロールは、健康な患者の試料である。別の実施形態では、コントロールは、公知のＣＮ－１病態、例えば、重度、軽度、または健康なＣＮ－１病態を有する少なくとも１名の対象、例えば、コントロール患者に由来する試料である。別の実施形態では、コントロールは、ＣＮ－１の治療を受けていない対象に由来する試料である。さらに別の実施形態では、コントロールは、単一の対象に由来する試料、または異なる対象に由来する試料のプール、及び／または異なる時点で対象（複数可）から採取した試料である。
本明細書で使用する「レベル」、または「バイオマーカーのレベル」とは、好ましくは、試料、または対象での本発明のバイオマーカーの質量、重量、または濃度のことを意味する。ある特定の実施形態では、当業者であれば、試料を、例えば：物質精製、沈殿、分離、例えば、遠心分離、及び／またはＨＰＬＣの１つ以上に供すること、続いて、質量分析を使用して、バイオマーカーのレベルの測定に供し得る、ことを理解する。ある特定の実施形態では、本発明によるバイオマーカーのレベルを決定するための手段として、ＬＣ－ＭＳを使用することができる。
本明細書で使用するバイオマーカーの「レベルを決定する」の用語は、対象由来の試料、例えば、対象由来の体液（例えば、血清、血漿、尿、リンパなど）、または対象の組織（例えば、肝臓など）での少なくとも１つの物質の量の定量を含む、方法のことを意味する。
本明細書で使用する用語「参照レベル」とは、本発明のｍＲＮＡ療法の投与を受ける前の対象（例えば、ＣＮ－１に罹患している方）、あるいは、正常な対象、または健康な対象での（例えば、バイオマーカーの）レベルを指すもの、とすることができる。
本明細書で使用する用語「正常な対象」または「健康な対象」とは、ＣＮ－１に関連する症状を示さない対象のことを指す。さらに、ＣＮ－１に関連する症状を招く、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の機能部分またはドメインに変異がなく、及び／または酵素ＵＧＴ１Ａ１またはその活性の低下または欠損を招くＵＧＴ１Ａ１遺伝子に変異が無ければ、対象を、正常（または健康）であると考える。そのようなＵＧＴ１Ａ１バリアントの遺伝子試験を行えば、対象由来の試料において、前出した変異が検出される。本発明のある特定の実施形態では、健康な対象由来の試料を、コントロール試料として使用する、あるいは、健康な対象、または正常な対象の試料に由来するバイオマーカーのレベルの公知の数値または標準値を、コントロールとして使用する。
一部の実施形態では、ＣＮ－１の治療を必要とする対象、またはＣＮ－１の治療を受けている対象に由来する試料でのバイオマーカーのレベルを、バイオマーカーのコントロールレベルと比較することは、対象（ＣＮ－１の治療が必要である、または治療を受けている）に由来する試料でのバイオマーカーのレベルを、ベースライン、または参照レベルと比較することを含み、対象（ＣＮ－１の治療が必要である、または治療を受けている）に由来する試料でのバイオマーカーのレベルが、ベースライン、または参照レベルと比較して、上昇し、高まり、または大きくなっている場合には、対象が、ＣＮ－１に罹患している、及び／または治療を必要としていることを示しており；及び／または対象（ＣＮ－１の治療が必要である、または治療を受けている）に由来する試料でのバイオマーカーのレベルが、ベースラインと比較して、減少、または低下している場合には、対象がＣＮ－１に罹患していない、ＣＮ－１の治療が成功している、またはＣＮ－１の治療を必要としない、ことを示している。ある特定の時間枠、例えば、６時間以内、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、または７２時間以内、及び／または特定の期間、例えば、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月などでのバイオマーカーのレベルの減少が顕著なほど（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍の減少、及び／または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の減少）、治療法、例えば、本発明のｍＲＮＡ療法（例えば、単回投与、または多数回レジメン）は、首尾良く行われている。
特に、体液（例えば、血漿、血清、尿、例えば、尿沈渣）、または対象の組織（複数可）（例えば、肝臓）において、投与した後の１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の日数までに、バイオマーカーのレベルの少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも１００％以上が減少することは、ＣＮ－１の治療を成功に導く好適な用量を示しており、本明細書で使用する減少とは、好ましくは、指定した期間の期末（例えば、単回静脈内投与を、例えば、行った後）に決定するバイオマーカーのレベルを、当該期間の期首（例えば、当該用量の事前投与）に決定した同じバイオマーカーのレベルと比較する。例示的な期間として、投与してから１２、２４、４８、７２、９６、１２０、または１４４時間、特に、投与してから２４、４８、７２、または９６時間がある。
基質レベル（例えば、バイオマーカー）の持続的な減少は、ＣＮ－１の治療に成功したｍＲＮＡ治療投与、及び／または投与レジメンを特に示している。このような持続的な減少は、本明細書では、効果の「持続時間」と証することができる。例示的な実施形態では、特に、体液（例えば、血漿、血清、尿、例えば、尿沈渣）、または対象の組織（複数可）（例えば、肝臓）において、投与した後の１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の日数までに、バイオマーカーのレベルの少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％以上が減少することは、治療手法が成功していることを示している。例示的な実施形態では、１つ以上の試料（例えば、流体、及び／または組織）での基質（例えば、バイオマーカー）レベルの持続的な減少が好ましい。例えば、バイオマーカーの持続的減少を招くｍＲＮＡ療法は、任意に、少なくとも１つの組織、好ましくは、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の個数の組織での当該バイオマーカーの持続的減少を伴って、治療の成功を示す。
一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法の単回投与量は、約０．２～約０．８ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）、約０．３～約０．７ｍｐｋ、約０．４～約０．８ｍｐｋ、または約０．５ｍｐｋである。別の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法の単回投与量は、１．５ｍｐｋ未満、１．２５ｍｐｋ未満、１ｍｐｋ未満、または０．７５ｍｐｋ未満である。
２４．使用のための組成物及び製剤
本発明のある特定の態様は、先に開示したポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物、または製剤に関する。
一部の実施形態では、当該組成物または製剤は：
（ｉ）ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）（例えば、野生型配列、その機能性フラグメント、またはバリアント）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）であって、その際、当該ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾核酸塩基、例えば、Ｎ１－メチルシュードウラシル、または５－メトキシウラシルを含み（例えば、ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、Ｎ１－メチルシュードウラシル、または５－メトキシウラシルである）、かつ、当該ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、またはｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位）、及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐ結合部位）をさらに含む、当該ポリヌクレオチド；及び
（ｉｉ）送達剤、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～２３２のいずれか、例えば、化合物ＩＩ；式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３～３４２のいずれか、例えば、化合物ＶＩ；または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９～４２８のいずれか、例えば、化合物Ｉ、またはそれらのいずれかの組合せを含む送達剤、を含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＩＩ、化合物ＶＩ、その塩もしくは立体異性体、またはそれらのいずれかの組合せを含む脂質ナノ粒子である。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０のモル比で含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ－ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０のモル比で含む。
一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論的最小ウラシル、またはチミン含有量に対するＯＲＦのウラシルまたはチミン含有量（ＵＴＭ％またはＴＴＭ％）は、約１００％～約１５０％である。
一部の実施形態では、当該のポリヌクレオチド、組成物、または製剤は、ＵＧＴ１Ａ１関連疾患、障害、または状態、例えば、ＣＮ－１を、処置及び／または予防するために使用する。
２５．投与の形態
上記した本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤は、治療上有効な結果をもたらすあらゆる経路で投与することができる。これらには、限定をするものではないが、経腸（腸内に）、胃腸内、硬膜外（硬膜内に）、経口（口から）、経皮、硬膜上、大脳内（大脳内に）、脳室内（脳室内に）、経皮（皮膚への適用）、皮内（皮膚自体に）、皮下（皮膚下に）、経鼻投与（鼻を通して）、静脈内（静脈内に）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈内に）、筋肉内（筋肉内に）、心臓内（心臓内に）、骨内注入（骨髄内に）、髄腔内（脊髄管内）、腹腔内、（腹膜への注入もしくは注射）、膀胱内注入、硝子体内、（眼を通して）、空洞内注射（病理学的空洞内に）、腔内（陰茎の付け根に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のためのインタクトな皮膚を通した拡散）、経粘膜（粘膜を通した拡散）、経膣、吹送法（鼻で吸う）、舌下、唇の下、浣腸、点眼（結膜上に）、点耳、耳介（耳の中もしくは耳から）、頬側（頬に向かって）、結膜、皮膚、歯科用（歯（複数可））、電気浸透、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹腔内、羊水内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨内に）、仙骨内（馬尾内に）、大槽内（脳延髄大槽内に）、角膜内（角膜内に）、歯科内膜、冠動脈内（冠動脈内に）、海綿体内（陰茎の陰核海綿体の拡張可能な空間内の）、椎間板内（椎間板内に）、管内（腺管内に）、十二指腸内（十二指腸内に）、硬膜内（硬膜内もしくは硬膜下に）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃内に）、歯肉内（歯肉内に）、回腸内（小腸の遠位部分内に）、病巣内（局所的な病変内もしくは局所的な病変に直接導入）、管腔内（管の管腔内に）、リンパ腺内（リンパ内に）、髄内（骨の髄腔内に）、髄膜内（髄膜内に）、眼内（眼内に）、卵巣内（卵巣内に）、心膜内（心膜内に）、胸膜腔内（胸膜内に）、前立腺内（前立腺内に）、肺内（肺もしくはその気管支内に）、副鼻腔内（鼻洞もしくは眼窩洞内に）、脊髄内（脊柱内に）、滑液嚢内（関節の滑液腔内に）、腱内（腱内に）、精巣内（精巣内に）髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルで脳脊髄液内に）、胸腔内（胸郭内に）、尿細管内（器官の尿細管内に）、鼓室内（中耳内に）、血管内（血管（複数可）内に）、脳室内（脳室内に）、イオントフォレーゼ（可溶性塩のイオンが身体の組織に移動する電流により）、潅注（開いた創傷もしくは体腔を浸し、もしくは洗浄する）、喉頭（喉頭に直接）、経鼻胃（鼻を通して、胃に）、閉塞性包帯技術（領域を閉塞する包帯剤で覆われる局所経路投与）、眼内（外眼部へ）、口咽頭（口及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜上、神経周囲、歯根膜、経直腸、呼吸器（局所的もしくは全身的効果のために経口的もしくは鼻的に吸入することにより気道内に）、眼球後（脳橋の後ろ、もしくは眼球の後ろ）、心筋内（心筋に入る）、軟組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所用、経胎盤（胎盤を通して、もしくは、胎盤を越えて）、経気管（気管の壁を通して）、経鼓室（鼓室を越えて、もしくは、通して）、尿管（尿管への）、尿道（尿道への）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆汁灌流、心臓灌流、フォトフェレシス、または脊髄がある。特定の実施形態では、組成物を、それらが、血液脳関門、血管関門、またはその他の上皮性関門を越えることができるように投与することができる。一部の実施形態では、投与経路のための製剤は、少なくとも１つの不活性成分を含むことができる。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド、またはその機能性フラグメント、もしくは、バリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を、裸の細胞に送達することができる。本明細書で使用する「裸の（ｎａｋｅｄ）」とは、トランスフェクションを促す作用物質を含まないポリヌクレオチドを送達する、ことを指す。裸のポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知の投与経路、及び本明細書に記載した投与経路を使用して、細胞に送達することができる。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド、またはその機能性フラグメント、もしくは、バリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、本明細書に記載した方法を使用して製剤することができる。当該製剤は、修飾及び／または非修飾のポリヌクレオチドを含有することができる。当該製剤は、限定をするものではないが、細胞浸透剤、医薬として許容可能な担体、送達剤、生体内分解性または生体適合性ポリマー、溶媒、及び徐放性送達デポ剤をさらに含むことができる。製剤したポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知の投与経路、及び本明細書に記載した投与経路を使用して細胞に送達することができる。
非経口投与のための医薬組成物は、少なくとも１つの不活性成分を含むことができる。使用した不活性成分のいずれかが、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されている、またはいずれもが承認されていない場合がある。非経口投与のための医薬組成物に使用する不活性成分の限定的なリストには、塩酸、マンニトール、窒素、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及び水酸化ナトリウムが掲載されている。
注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液を、適切な分散剤、湿潤剤、及び／または懸濁化剤を使用して、公知の技術に従って製剤することができる。滅菌注射用調製物は、例えば、１，３－ブタンジオール溶液として、非毒性の非経口用の許容可能な希釈剤及び／または溶媒を含む滅菌注射用溶液、懸濁液、及び／またはエマルションとすることができる。利用できる許容可能なビヒクル及び溶媒として、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。滅菌不揮発性油は、従来、溶媒または懸濁媒体として用いられていた。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含むあらゆる無刺激性不揮発性油を用いることができる。オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に使用することができる。滅菌製剤は、アジュバント、例えば、局所麻酔薬、防腐剤、及び緩衝剤を含むこともできる。
注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターに通した濾過により、及び／または使用前に滅菌水、またはその他の滅菌注射媒体に溶解または分散することができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を取り入れることで、滅菌することができる。
注射製剤は、組織、器官、及び／または対象の領域への直接注射用とすることができる。例として、限定をするものではないが、組織、器官、及び／または対象に、虚血領域への心筋内注射により、製剤を、直接に注射することができる（例えば、Ｚａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１３を参照されたい；この全内容を参照により本明細書で援用する）。
活性成分の効果を延長するために、大抵の場合、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性の低い結晶質または非晶質物質の液体懸濁液の使用により達成することができる。次いで、薬物の吸収速度は、溶解速度に依存しており、同様に、これは、結晶サイズ及び結晶形に依存することができる。あるいは、非経口投与した薬物形態の遅延吸収は、薬物を、油ビヒクルに溶解または懸濁させて達成する。注射用デポ形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマーでの薬物のマイクロ封入マトリックスを形成させて作る。薬物対ポリマーの比、及び用いる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。その他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）、及びポリ（無水物）がある。デポ注射製剤は、薬物を、身体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルションに封入して調製する。
２６．キット、及びデバイス
ａ．キット
本発明は、本発明の特許請求するヌクレオチドを、都合よく、及び／または効果的に使用するための様々なキットを提供する。一般的には、キットは、使用者が、対象（複数可）に複数の処置を実施し、及び／または複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量、及び／または数の構成成分を含む。
一態様では、本発明は、本発明の分子（ポリヌクレオチド）を含むキットを提供する。
当該キットは、翻訳可能領域を含む第１のポリヌクレオチドを含むタンパク質を産生するためのものとすることができる。当該キットは、製剤組成物を形成するためのパッケージ、及び使用説明書、及び／または送達剤をさらに含むことができる。送達剤は、本明細書に開示した生理食塩水、緩衝溶液、リピドイド、またはあらゆる送達剤を含むことができる。
一部の実施形態では、緩衝溶液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、ホスファート、及び／またはＥＤＴＡを含むことができる。別の実施形態では、緩衝溶液は、限定をするものではないが、生理食塩水、２ｍＭのカルシウムを含む生理食塩水、５％のスクロース、２ｍＭのカルシウムを含む５％のスクロース、５％のマンニトール、２ｍＭのカルシウムを含む５％のマンニトール、乳酸リンゲル液、塩化ナトリウム、２ｍＭのカルシウムを含む塩化ナトリウム、及びマンノースを含むことができる（例えば、米国特許出願公開第２０１２０２５８０４６号を参照されたい；その全内容を参照により本明細書で援用する）。さらなる実施形態では、緩衝溶液を、沈殿、または凍結乾燥させることができる。それぞれの構成成分の量は、均一な再現可能な高濃度の生理食塩水、または単純な緩衝液製剤を可能にするように変動させることができる。構成成分は、一定の期間を通して、及び／または様々な条件下で、緩衝溶液での修飾ＲＮＡの安定性を増大させるように変動させることもできる。一態様では、本発明は、標的細胞に導入した場合に、翻訳可能領域がコードする所望量のタンパク質を産生するうえで有効な量で提供する翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、細胞の先天免疫応答を実質的に阻害するうえで有効な量で提供する阻害性核酸を含む第２のポリヌクレオチド、ならびに、パッケージ及び使用説明書を含む、タンパク質を産生するためのキットを提供する。
一態様では、本発明は、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、ならびに、パッケージ、及び説明書を含む、タンパク質を産生するためのキットを提供しており、当該ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解が抑えられているものである。
一態様では、本発明は、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、及び第１の核酸の翻訳可能領域の翻訳に適する哺乳動物細胞を含む、タンパク質を産生するためのキットを提供しており、当該ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解が抑えられているものである。
ｂ．デバイス
本発明は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込むことができるデバイスを提供する。これらのデバイスは、ヒト患者など、それを必要とする対象に直ちに送達するために利用可能な製剤でポリヌクレオチドを合成する試薬を、安定的な剤形で含有する。
投与のためのデバイスは、本明細書で教示した単回投与、複数回投与、または分割投与レジメンに従って、本発明のポリヌクレオチドを送達するために用いることができる。そのようなデバイスは、例えば、国際出願公開ＷＯ２０１３１５１６６６で教示している；その全内容を参照により本明細書で援用する。
本発明の実施形態として、本明細書に開示した方法、及び組成物と組み合わせて使用するために、細胞、器官、及び組織への複数投与のための当該技術分野で公知の方法、及びデバイスを企図する。このようなものとして、例えば、複数のニードルを有する方法、及び装置、例えば、ルーメンまたはカテーテルを用いるハイブリッドデバイス、さらには、熱、電流、または放射線駆動機構を利用するデバイスがある。
本発明に従って、これらの複数投与デバイスを、本明細書で企図する単回用量、複数用量、または分割用量を送達するために利用することができる。そのようなデバイスは、例えば、国際出願公開ＷＯ２０１３１５１６６６で教示されており、その全内容を参照により本明細書で援用する。
一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、同時に、または６０分の時間内に、３つの異なる任意に隣接する部位に、少なくとも３本の針を介して、皮下投与または筋肉投与する（例えば、同時に、または６０分以内に、４、５、６、７、８、９、または１０箇所に投与する）。
ｃ．カテーテル、及び／またはルーメンを利用する方法、及びデバイス
カテーテルとルーメンを使用する方法、及びデバイスは、本発明のポリヌクレオチドを、単回投与、複数回投与、または分割投与スケジュールで投与するために用いることができる。そのような方法、及びデバイスは、国際出願公開ＷＯ２０１３１５１６６６に記載されており、その全内容を参照により本明細書で援用する。
ｄ．電流を利用する方法、及びデバイス
電流を利用する方法、及びデバイスは、本明細書で教示した単回投与、複数回投与、または分割投与レジメンに従って、本発明のポリヌクレオチドを送達するために用いることができる。そのような方法、及びデバイスは、国際出願公開ＷＯ２０１３１５１６６６に記載されており、その全内容を参照により本明細書で援用する。
２７．定義
本開示の理解を容易ならしめるために、特定の用語をまず定義する。本出願で使用する場合、本明細書に特に断りがない限り、以下の用語は、それぞれ、下記の意味を有するものとする。さらなる定義を、本出願の全体にわたって記載する。
本発明は、グループの厳密に１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスに存在する、そこで用いられる、または別の方法でこれらに関連する実施形態を含む。本発明は、複数またはすべてのグループメンバーが、所与の生成物またはプロセスに存在する、そこで用いられる、または別の方法でそれらに関連する実施形態を含む。
本明細書、及び添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈に特に断りがない限り、複数の指示対象を含む。用語「ａ」（または「ａｎ」）、ならびに、用語「１つ以上」及び「少なくとも１つ」は、本明細書では互換的に使用可能である。ある特定の態様では、用語「ａ」または「ａｎ」は、「１つ」を意味する。その他の態様では、用語「ａ」または「ａｎ」は、「２つ以上」または「複数」を含む。
さらに、本明細書で使用する「及び／または」は、その他の有無に関係なく、２つの特定の特徴または構成成分のそれぞれの特定の開示とみるべきである。したがって、「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用する用語「及び／または」は、本明細書では、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むものとする。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句で使用する用語「及び／または」は、以下の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ、Ａ、Ｂ、またはＣ、ＡまたはＣ、ＡまたはＢ、ＢまたはＣ、Ａ及びＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、ならびにＣ（単独）のそれぞれを含む、ものとする。
特に断りのない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する当業者により一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、当業者に、本開示で使用する多くの用語の一般的な辞書を提供する。
態様が「含む」という文言を用いて本明細書に記載されている場合は、「からなる」及び／または「から本質的になる」という用語で別途記載した類似の態様もまた提供する。
単位、接頭語、及び記号は、Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）に認められた形態で表示する。数値範囲は、範囲を定義する数字を含む。値の範囲が列挙する場合、その範囲の列挙した上限値と下限値の間の各介在整数値及びその各分率もまた、そのような値の間の各部分範囲に加えて、具体的に開示することを理解すべきである。あらゆる範囲の上限及び下限は、独立して、その範囲に含まれる、または範囲から除外でき、各範囲もまた、境界のいずれかが含まれる、いずれもが含まれない、または両方が含まれる場合を、本発明は含む。値が明示的に列挙されている場合、列挙した値とほぼ同じ数量または量である値もまた、本発明の範囲内にあることを理解すべきである。組合せを開示している場合、その組合せの要素の各サブコンビネーションもまた、具体的に開示され、本発明の範囲内にある。逆に、異なる要素または要素群を個々に開示している場合、それらの組合せもまた開示する。発明のあらゆる要素を、複数の代替物を有するものとして開示する場合、各代替物が単独でまたはその他の代替物とのあらゆる組合せで除外する本発明の例もまた、本明細書に開示しており、本発明の複数の要素は、そのような除外を有することができ、そのような除外を有する要素の全組合せを、本明細書で開示している。
ヌクレオチドは、一般に認められている一文字コードで表す。特に断りがない限り、核酸は、５’から３’に向けて、左から右に記述する。核酸塩基は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨している、一般に公知の一文字記号で表す。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。
アミノ酸は、本明細書では、一般に公知の３文字表記、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨している１文字表記のいずれかで表す。特に断りがない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で、左から右に向けて記述する。
約：
本明細書、及び特許請求の範囲を通じて数値と関連して使用する用語「約」とは、当業者によく知られており、認められている精度の間隔を示す。そのような精度の間隔は、±１０％である。
範囲が示されている場合は、端点を含む。さらに、特に断りのない限り、または文脈及び当業者の理解から別途自明でない限り、範囲として表す値は、文脈に特に断りがない限り、範囲の下限の単位の１０分の１までの、本発明の異なる実施形態の記載した範囲内のあらゆる特定の値または部分範囲とみなすることができる。
組み合わせて投与する：
本明細書中で使用する用語「組み合わせて投与する」または「組合せ投与」とは、２つ以上の作用物質を、同時に、または患者においてそれぞれの作用物質の効果の重複が認められる間隔の範囲内で、対象に対して投与することを意味する。一部の実施形態では、それらは、互いに約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与する。一部の実施形態では、作用物質の投与は、コンビナトリアル（例えば、相乗的）効果を達成するように、互いに十分に接近して配置する。
アミノ酸置換：
用語「アミノ酸置換」は、親配列または参照配列（例えば、野生型ＵＧＴ１Ａ１配列）に存在するアミノ酸残基を、別のアミノ酸残基で置換することを指す。アミノ酸は、親配列または参照配列（例えば、野生型ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチド配列）内で、例えば、化学的ペプチド合成、または当該技術分野で公知の組換え法により置換することができる。したがって、「位置Ｘでの置換」とは、Ｘ位に存在するアミノ酸を、代替アミノ酸残基で置換することを指す。一部の態様では、置換パターンは、スキーマＡｎＹに従って記載することができ、Ａは、ｎ位に天然に存在する、または元から存在するアミノ酸に対応する一文字コードであり、Ｙは、置換アミノ酸残基である。その他の態様では、置換パターンは、スキーマＡｎ（ＹＺ）に従って記載することができ、Ａは、Ｘ位に天然に存在する、または元から存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する一文字コードであり、Ｙ及びＺは、代替置換アミノ酸残基である。
本開示の文脈では、置換（それらが、アミノ酸置換と称する場合であっても）は、核酸レベルで行われ、すなわち、アミノ酸残基を代替アミノ酸残基で置換することは、第１のアミノ酸をコードするコドンを、第２のアミノ酸をコードするコドンと置換して行われる。
動物：
本明細書で使用する用語「動物」は、動物界のあらゆるメンバーのことを指す。一部の実施形態では、「動物」は、あらゆる発生期のヒトのことを指す。一部の実施形態では、「動物」は、あらゆる発生期の非ヒト動物のことを指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。一部の実施形態では、動物として、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び虫があるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作した動物、またはクローンである。
ほぼ：
本明細書で使用する場合、目的とする１つ以上の値に付する用語「ほぼ」とは、記載した参照値に類似する値のことを指す。ある特定の実施形態では、用語「ほぼ」とは、特に断りのない限り、または別途文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除き）、記載した参照値のいずれかの（より大きい、またはより小さい）方向に、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲に入る値のことを指す。
関連する：
疾患に対して本明細書で使用する用語「関連する」とは、問題の症状、測定値、特徴、または状態が、その疾患の診断、発症、存在、または進行に関連することを意味する。関連は、原因として疾患と関連する可能性はあるが、関連がある必要はない。例えば、症状、後遺症、またはＣＮ－１の患者の生活の質の減少を引き起こすあらゆる作用は、ＣＮ－１と関連すると考えられており、本発明の一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することにより、処置、改善、または予防することができる。
２つ以上の部分に対して使用する用語「会合する」「コンジュゲートする」、「連結する」、「結合する」、及び「拘束する」とは、２つ以上の部分に対して使用する場合は、構造が使用する条件、例えば、生理学的条件下で、部分を、直接的、または結合剤として機能する１つ以上のさらなる部分を介する媒介的のいずれかで、互いに物理的に会合する、または結合して、部分を物理的に会合したままにするのに十分な安定構造を形成する、ことを意味する。「会合」は、厳密に直接共有化学結合によるものである必要はない。そのことは、「会合する」実体が、物理的に会合したままにするのに十分な安定結合性に基づくイオン結合、または水素結合、またはハイブリダイゼーションも示唆することができる。
二機能性：
本明細書で使用する用語「二機能性」とは、少なくとも２つの機能の能力がある、または維持するあらゆる物質、分子、または部分のことを指す。機能は、同じ結果または異なる結果に影響を与える可能性がある。機能をもたらす構造は、同じまたは異なる可能性がある。例えば、本発明の二機能性修飾ＲＮＡは、ＵＧＴ１Ａ１ペプチドをコードすることができる（第１機能）が、コード化ＲＮＡを含むヌクレオシドは、それ自体として、ＲＮＡの半減期を延長することが可能である（第２機能）。この例では、二機能性修飾ＲＮＡを、タンパク質欠乏症に罹患している対象に送達すると、疾患または状態を改善または処置することができるペプチドまたはタンパク質分子を産生するだけでなく、長い期間にわたって対象に存在する集団修飾ＲＮＡも維持する。その他の態様では、二機能性修飾ｍＲＮＡは、例えば、ＵＧＴ１Ａ１ペプチドをコードするＲＮＡ（第１の機能）、及び第１のタンパク質に融合する、または第１のタンパク質と同時発現する第２のタンパク質を含むキメラ分子とすることができる。
生体適合性：
本明細書で使用する用語「生体適合性」とは、免疫系による傷害、毒性、または拒絶のリスクを殆ど、乃至は、全く有さない生細胞、組織、器官、または系と適合することを意味する。
生分解性：
本明細書で使用する用語「生分解性」とは、生物の作用による無害な産物への分解が可能であることを意味する。
生物学的に活性な：
本明細書で使用する語句「生物学的に活性な」とは、生物学的系、及び／または生体内で活性を有するあらゆる物質の特徴のことを指す。例えば、生体に投与した場合に、その生体に生物学的影響を有する物質は、生物学的に活性であると考えられる。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一部でも生物学的活性である、または生物学的に関連すると考えられる活性を模倣する場合、生物学的に活性であると考えることができる。
キメラ：
本明細書で使用する「キメラ」とは、２つ以上の不調和または異種の部分または領域を有する実体のことである。例えば、キメラ分子は、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドを含む第１の部分、及び第２の治療用タンパク質を含む（例えば、第１の部分と遺伝子融合した）第２の部分（例えば、別個の酵素活性を有するタンパク質、抗原結合部分、またはＵＧＴ１Ａ１の血漿中半減期を延長することが可能な部分、例えば、抗体のＦｃ領域）を含むことができる。
配列最適化：
用語「配列最適化」とは、参照核酸配列内の核酸塩基が代替核酸塩基で置換されて、特性の向上、例えば、タンパク質発現が向上した、または免疫原性が減少した核酸配列をもたらすプロセスまたは一連のプロセスのことを指す。
一般的に、配列最適化の目標は、参照ヌクレオチド配列がコードした同じポリペプチド配列をコードする同義ヌクレオチド配列を生成することである。したがって、参照ヌクレオチド配列がコードしたポリペプチドに対して、コドン最適化ヌクレオチド配列がコードしたポリペプチドに（コドン最適化の結果としての）アミノ酸置換は存在しない。
コドン置換：
配列最適化の文脈での用語「コドン置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」または「コドン置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」とは、参照核酸配列に存在するコドンを、別のコドンで置換することを指す。コドンは、例えば、化学的ペプチド合成を介して、または当該技術分野で公知の組換え方法により、参照核酸配列にて置換することができる。したがって、核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）での特定の箇所での、または核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）のある特定の領域もしくは部分配列内での「置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」または「置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」とは、そのような箇所または領域でのコドンの代替コドンによる置換のことを指す。
本明細書で使用する用語「コード領域」及び「領域コード化」、ならびに、その文法的変形形態は、発現時に、ポリペプチドまたはタンパク質を生じるポリヌクレオチドでのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のことを指す。
化合物：
本明細書で使用する用語「化合物」とは、示した構造のすべての立体異性体及び同位体を含むことを意味する。本明細書で使用する用語「立体異性体」とは、化合物のあらゆる幾何異性体（例えば、シス及びトランス異性体）、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。本開示は、立体的に純粋な（例えば、幾何学的に純粋な、エナンチオマー的に純粋な、またはジアステレオマー的に純粋な）形態を含む、本明細書に記載した化合物のありとあらゆる立体異性体、ならびに、エナンチオマー、及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ体を含む。化合物のエナンチオマー、及び立体的混合物、ならびに、それらを、構成成分であるエナンチオマーまたは立体異性体に分割する手段は、周知である。「同位体」は、細胞核内の異なる数の中性子の結果として生じる、原子番号が同じであるが、質量数が異なる原子のことを指す。例えば、水素の同位体は、三重水素及び重水素を含む。さらに、本開示の化合物、塩、または複合体は、ルーチン的な方法により溶媒和物及び水和物を形成するために、溶媒または水分子と組み合わせて調製することができる。
接触する：
本明細書で使用する用語「接触する」とは、２つ以上の実体間の物理的接続を確立することを意味する。例えば、哺乳動物細胞を、ナノ粒子組成物と接触させることは、哺乳動物細胞、及びナノ粒子が物理的接続を共有させられることを意味する。インビボ及びエクスビボの両方で、細胞を、外部実体と接触させる方法は、生物学的技術分野で周知である。例えば、ナノ粒子組成物と、哺乳動物体内の哺乳動物細胞との接触は、種々の投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下）で実施することができ、種々の量のナノ粒子組成物を関係させることができる。さらに、２つ以上の哺乳動物細胞を、ナノ粒子組成物と接触させることができる。
保存的アミノ酸置換：
「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質配列内のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することである。塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、またはグルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、またはシステイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、またはトリプトファン）、ベータ－分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術分野において規定されている。したがって、ポリペプチドでのアミノ酸を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸で置換する場合、そのアミノ酸置換は、保存的であると考えられる。別の態様では、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序、及び／または組成が異なる構造的に類似したストリングで保存的に置換することができる。
非保存的アミノ酸置換：
非保存的アミノ酸置換は、（ｉ）正電荷側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、もしくは、Ｌｙｓ）を有する残基が、負電荷残基（例えば、Ｇｌｕ、もしくは、Ａｓｐ）と置換され、もしくは、これにより、置換され、（ｉｉ）親水性残基（例えば、Ｓｅｒ、もしくは、Ｔｈｒ）が、疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、もしくは、Ｖａｌ）と置換され、もしくは、これにより置換され、（ｉｉｉ）システイン、もしくは、プロリンが、その他のあらゆる残基と置換され、もしくは、これにより置換され、または（ｉｖ）嵩高い疎水性もしくは芳香族側鎖（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、もしくは、Ｔｒｐ）を有する残基が、より小さい側鎖を有するもの（例えば、Ａｌａ、もしくは、Ｓｅｒ）、もしくは、側鎖を有さないもの（例えば、Ｇｌｙ）と置換され、もしくは、これにより置換するものを含む。
その他のアミノ酸置換は、当業者らが容易に同定することができる。例えば、アミノ酸アラニンの場合、置換は、Ｄ－アラニン、グリシン、ベータ－アラニン、Ｌ－システイン、及びＤ－システインのいずれか１つから行うことができる。リシンの場合、置換は、Ｄ－リシン、アルギニン、Ｄ－アルギニン、ホモアルギニン、メチオニン、Ｄ－メチオニン、オルニチン、またはＤ－オルニチンのいずれか１つで行うことができる。一般的に、単離ポリペプチドの特性の変化を誘導すると予想することができる機能上重要な領域での置換は、（ｉ）極性残基、例えば、セリン、もしくは、スレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、もしくは、アラニンと（もしくは、それで）置換するか、（ｉｉ）システイン残基が、その他のあらゆる残基と（もしくは、それで）置換するか、（ｉｉｉ）正電荷側鎖を有する残基、例えば、リシン、アルギニン、もしくは、ヒスチジンが、負電荷側鎖を有する残基、例えば、グルタミン酸、もしくは、アスパラギン酸と（もしくは、それで）置換するか、または（ｉｖ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、そのような側鎖を有しないもの、例えば、グリシンで（もしくは、それで）置換することになる。上記した非保存的置換の１つが、タンパク質の機能的特性を変更することができる可能性は、タンパク質の機能的に重要な領域に対する置換の位置とも関連しており：一部の非保存的置換は、それに応じて、生物学的特性に、殆ど、または全く影響を与えることができない。
保存した：
本明細書で使用する用語「保存した」とは、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列において、比較する２つ以上の配列の同じ位置で改変されていないヌクレオチドまたはアミノ酸残基のそれぞれのことを指す。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸とは、配列のその他の箇所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも、関連している配列の間において保存がされているヌクレオチドまたはアミノ酸のことである。
一部の実施形態では、２つ以上の配列が、互いに１００％が同一である場合、「完全に保存されている」と言う。一部の実施形態では、２つ以上の配列が、互いに、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存されている」と言う。一部の実施形態では、２つ以上の配列が、互いに、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合、「高度に保存されている」と言う。一部の実施形態では、２つ以上の配列が、互いに、少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「保存されている」と言う。一部の実施形態では、２つ以上の配列が、互いに、約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「保存されている」と言う。配列の保存は、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドの全長に適用することができ、またはそのある部分、領域、または機能に適用することができる。
徐放：
本明細書で使用する用語「徐放」とは、治療成績を達成する放出のある特定のパターンに適合する医薬組成物または化合物放出プロファイルのことを指す。
環状または環化：
本明細書で使用する用語「環状」とは、連続ループの存在のことを指す。環状分子は、サブユニットが破壊されていない鎖を形成するために、環状である必要はなく、単に結合する。本発明の操作したＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの環状分子は、単一単位もしくは多量体である、または複合体もしくは高次構造の１つ以上の構成成分を含むことができる。
細胞傷害性：
本明細書で使用する「細胞傷害性」とは、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プリオン、またはそれらの組合せを、死滅させること、または有害な、有毒な、もしくは、致命的な影響を引き起こすことを指す。
送達する：
本明細書で使用する用語「送達する」とは、実体を行き先に提供することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドを対象に送達することは、ポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物を、対象に対して（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路により）投与する、ことを含むことができる。ナノ粒子組成物の哺乳動物または哺乳動物細胞への投与は、１つ以上の細胞をナノ粒子組成物と接触させることを含むことができる。
送達剤：
本明細書で使用する「送達剤」とは、ポリヌクレオチドの標的細胞へのインビボ、インビトロ、またはエクスビボ送達を、少なくとも部分的に促すあらゆる物質のことを指す。
不安定化：
本明細書で使用する用語「不安定な（ｄｅｓｔａｂｌｅ）」、「不安定化する」、または「不安定化領域」とは、同じ領域または分子の出発分子、野生型分子、または天然形態分子よりも、安定性の低い領域または分子を意味する。
ジアステレオマー：
本明細書で使用する用語「ジアステレオマー」とは、互いの鏡像でなく、かつ、互いに重ね合わせることができない立体異性体のことを意味する。
消化：
本明細書で使用する用語「消化」とは、より小さなフラグメントまたは構成成分に分裂することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質の場合、消化は、ペプチドの産生をもたらす。
遠位：
本明細書で使用する用語「遠位」とは、中心から離れて、または目的の点もしくは領域から離れて位置することを意味する。
ドメイン：
本明細書で使用する用語「ドメイン」とは、ポリペプチドに言及する場合、１つ以上の同定可能な構造的または機能的特徴または特性（例えば、タンパク質－タンパク質相互作用の部位として作用する結合能力）を有するポリペプチドのモチーフのことを指す。
投与レジメン：
本明細書で使用する「投与レジメン（ｄｏｓｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅｎ）」または「投与レジメン（ｄｏｓｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅｎ）」は、投与スケジュール、または医師が決定した処置、予防、または対症ケアのレジメンのことである。
有効量：
本明細書で使用する薬剤の「有効量」という用語は、有益な結果、または所望の結果、例えば、臨床結果を達成するのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用する文脈によって定まる。例えば、タンパク質異常（例えば、ＵＧＴ１Ａ１異常）を処置する作用物質を投与する状況において、作用物質の有効量は、作用物質を投与しない場合に認められた症状の重症度と比較して、例えば、ＵＧＴ１Ａ１異常に関連する症状を改善、減少、排除、または予防するのに十分なＵＧＴ１Ａ１を発現するｍＲＮＡの量である。用語「有効量」とは、「有効用量」、「治療的有効量」、または「治療有効用量」と互換的に使用することができる。
エナンチオマー：
本明細書で使用する用語「エナンチオマー」とは、少なくとも８０％（すなわち、１つのエナンチオマーが少なくとも９０％、その他のエナンチオマーが多くとも１０％）、少なくとも９０％、または少なくとも９８％の（当該技術分野で標準的な方法により決定する）光学純度またはエナンチオマー過剰を有する本発明の化合物のそれぞれ個々の光学活性形態を意味する。
封入：
本明細書で使用する用語「封入」とは、閉じ込めること、取り囲むこと、または内包することを意味する。
封入効率：
本明細書で使用する「封入効率」とは、ナノ粒子組成物の調製に使用するポリヌクレオチドの初期総量に対する、ナノ粒子組成物の一部となるポリヌクレオチドの量のことを指す。例えば、組成物に最初に提供した合計１００ｍｇのポリヌクレオチドのうちの９７ｍｇのポリヌクレオチドが、ナノ粒子組成物に封入する場合、封入効率は９７％として与えることができる。本明細書で使用する「封入」とは、完全な、実質的な、または部分的な閉じ込め、拘束、取り囲み、または内包を指すことができる。
コードしたタンパク質切断シグナル：
本明細書で使用する「コードしたタンパク質切断シグナル」とは、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列のことを指す。
操作した：
本明細書で使用する場合、構造的または化学的に関係なく、出発点、野生型、または天然分子から変化する特徴または性質を有するように設計すれば、本発明の実施形態を「操作した」ことになる。
増強した送達：
本明細書で使用する用語「増強した送達」とは、ポリヌクレオチドのコントロールナノ粒子による目的の標的組織（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）への送達のレベルと比較して、より多く（例えば、少なくとも１．５倍多く、少なくとも２倍多く、少なくとも３倍多く、少なくとも４倍多く、少なくとも５倍多く、少なくとも６倍多く、少なくとも７倍多く、少なくとも８倍多く、少なくとも９倍多く、少なくとも１０倍多く）のポリヌクレオチドのナノ粒子による目的の標的組織（例えば、哺乳動物の肝臓）への送達のことを意味する。ナノ粒子の特定の組織への送達レベルは、組織中で産生したタンパク質の量を当該組織の重量と比較すること、組織でのポリヌクレオチドの量を該組織の重量と比較すること、組織中で産生したタンパク質の量を当該組織での総タンパク質の量と比較すること、または組織でのポリヌクレオチド量を、当該組織での総ポリヌクレオチドの量と比較することで、測定することができる。ナノ粒子の標的組織への送達の増強は、処置する対象において決定する必要はなく、それは、動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代用物で決定することができる、ことを理解されたい。
エキソソーム：
本明細書で使用する「エキソソーム」とは、哺乳動物細胞が分泌するベシクル、またはＲＮＡ分解に関与する複合体のことである。
発現：
本明細書で使用する核酸配列の「発現」とは、以下のイベント：（１）（例えば、転写による）ｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡ配列からの生成；（２）（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシングによる）ｍＲＮＡ転写のプロセシング；（３）ｍＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；及び（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾のうちの１つ以上のことを指す。
エクスビボ：
本明細書で使用する用語「エクスビボ」とは、生体（例えば、動物、植物、もしくは、微生物、またはその細胞、もしくは、組織）の外側で発生するイベントのことを指す。エクスビボイベントは、天然（例えば、インビボ）環境から最小限に変更した環境で行うことができる。
特徴：
本明細書で使用する「特徴」とは、特徴、特性、または特有の要素のことを指す。ポリペプチドの場合、「特徴」は、分子の異なるアミノ酸配列に基づく構成成分として定義する。本発明のポリヌクレオチドがコードしたポリペプチドの特徴は、表面症状発現、局所立体配座形状、フォールディング、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
製剤：
本明細書で使用する「製剤」は、少なくともポリヌクレオチド、ならびに、担体、賦形剤、及び送達剤のうちの１つ以上を含む。
フラグメント：
本明細書で使用する「フラグメント」は、部分を指す。例えば、タンパク質のフラグメントは、培養細胞から単離した全長タンパク質を消化して得られるポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、フラグメントは、Ｎ末端、及び／またはＣ末端、及び／または内部の部分配列が欠失している全長タンパク質（例えば、ＵＧＴ１Ａ１）の部分配列である。本発明の一部の好ましい態様では、本発明のタンパク質のフラグメントは、機能性フラグメントである。
機能性：
本明細書で使用する「機能性」生物学的分子とは、特徴となる特性、及び／または活性を示す形態の生物学的分子である。したがって、本発明のポリヌクレオチドの機能性フラグメントは、機能性ＵＧＴ１Ａ１フラグメントを発現することが可能なポリヌクレオチドである。本明細書で使用する場合、ＵＧＴ１Ａ１の機能性フラグメントは、野生型ＵＧＴ１Ａ１のフラグメント（すなわち、天然に生じるそのアイソフォームのいずれかのフラグメント）、またはその変異体もしくはバリアントのことを指し、そのフラグメントは、対応する全長タンパク質の生物学的活性の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を保持する。
ＵＧＴ１Ａ１関連疾患：
本明細書で使用する用語「ＵＧＴ１Ａ１関連疾患」、または「ＵＧＴ１Ａ１関連障害」とは、それぞれ、異常なＵＧＴ１Ａ１活性（例えば、活性の低下、または活性の増加）に起因する疾患、または障害のことを指す。ＣＮ－１は、ＵＧＴ１Ａ１関連疾患であるが、これに限定されない。数多くのＣＮ－１の臨床的バリアントが、当該技術分野で公知である。例えば、ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／２ｌ８８００を参照されたい。ＵＧＴ１Ａ１関連疾患のその他の例として、ＩＩ型クリグラー－ナジャー症候群（例えば、ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／６０６７８５を参照されたい）、ジルベール症候群（例えば、ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／ｌ４３５００を参照されたい）、及び一過性家族性新生児高ビリルビン血症（ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／２３７９００を参照されたい）があるが、これらに限定されない。
用語「ＵＧＴ１Ａ１酵素活性」及び「ＵＧＴ１Ａ１活性」は、本開示において互換可能に使用しており、ビリルビンをグルクロン酸とコンジュケートさせて（グルクロン酸化として公知のプロセス）、体外への排出を可能ならしめる水溶性複合体を生産するＵＧＴ１Ａ１の能力を指す。したがって、ＵＧＴ１Ａ１酵素活性、またはＵＧＴ１Ａ１活性を保持、または有するフラグメント、またはバリアントは、ビリルビンをグルクロン酸とコンジュケートさせる際に測定可能な酵素活性を有するフラグメント、またはバリアントのことを指す。
ヘルパー脂質：
本明細書で使用する用語「ヘルパー脂質」とは、（脂質層、例えば、脂質二重層に挿入するための）脂質部分、及び（脂質層の表面での生理学的溶液との相互作用のための）極性部分を含む化合物または分子のことを指す。一般的には、ヘルパー脂質は、リン脂質である。ヘルパー脂質の機能は、例えば、アミノ脂質を「補完」して二重層の融合性を増加させること、及び／または例えば、細胞に送達した核酸のエンドソーム脱出を促すことである。ヘルパー脂質は、ＬＮＰの表面の重要な構造構成成分であるとも考えられている。
相同性：
本明細書で使用する用語「相同性」とは、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子、及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／またはポリペプチド分子間の全体的な相関性のことを指す。一般に、用語「相同性」とは、２つの分子間の進化的関係を意味する。したがって、相同である２つの分子は、共通の進化的先祖を有する。本発明の文脈では、相同性という用語は、同一性及び類似性の両方を含む。
一部の実施形態では、ポリマー分子は、分子でのモノマーの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が同一であり（正確に同じモノマー）、または類似している（保存的置換の）場合、互いに「相同である」と考えられている。用語「相同である」とは、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）の間の比較のことを指す。
同一性：
本明細書で使用する用語「同一性」とは、ポリマー分子間の、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子、及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／またはポリペプチド分子間の全体的なモノマーの保存のことを指す。２つのポリヌクレオチド配列のパーセント同一性の計算は、例えば、最適な比較のために２つの配列をアラインする（例えば、最適なアラインメントのために、ギャップを第１及び第２の核酸配列のうちの一方または両方に導入することができ、同一でない配列は、比較のために無視してよい）ことで、実施することができる。ある特定の実施形態では、比較のためにアラインした配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列での位置が、第２の配列での対応する位置と同じヌクレオチドにより占有する場合、分子は、その位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有する同一位置の数の関数であり、その際、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップ数、及びそれぞれのギャップ長さを考慮に入れる。配列の比較、及び２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。ＤＮＡ及びＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は、同等と考えることができる。
適切なソフトウェアプログラムは、種々の供給源から、タンパク質及びヌクレオチド配列の両方のアラインメントのために、入手可能である。パーセント配列同一性を決定するための１つの適切なプログラムは、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴ ｓｕｉｔｅの一部であるｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２つの配列間の比較を実施する。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用する一方、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用する。その他の適切なプログラムは、生命情報科学プログラムのＥＭＢＯＳＳ ｓｕｉｔｅの一部、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒであり、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａで、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からも入手可能である。
配列アラインメントは、例えば、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、またはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどの当該技術分野で公知の方法を使用して行うことができる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列とアラインする単一ポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列と異なる領域は、それぞれ、それら自体のパーセント配列同一性を有することができる。パーセント配列同一性値は、小数第２位で四捨五入することに注意する。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り下げられる一方、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に切り上げられる。長さの値は常に、整数であることにも注意する。
ある特定の態様では、第１のアミノ酸配列（または核酸配列）対第２のアミノ酸配列（または核酸配列）のパーセンテージ同一性「ＩＤ％は」は、ＩＤ％＝１００×（Ｙ／Ｚ）（式中、Ｙは、（視覚検査または特定の配列アラインメントプログラムによりアラインした）第１及び第２の配列のアラインメントにおいて完全一致としてスコア化したアミノ酸残基（または核酸塩基）の数であり、Ｚは、第２の配列での残基の総数である）として計算する。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第１の配列対第２の配列のパーセント同一性は、第２の配列対第１の配列のパーセント同一性よりも高くなる。
当業者であれば、パーセント配列同一性の計算のための配列アラインメントの生成は、一次配列データだけで進行するバイナリー配列－配列比較に限定されないことを理解する。配列アラインメントは、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能性データ（例えば、変異の位置）、または系統発生データなどの異種供給源からのデータと統合することで生成することができることも理解する。多重配列アラインメントを生成するために、異種データを統合する適切なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能な、あるいは、例えば、ＥＢＩから入手可能なＴ－Ｃｏｆｆｅｅである。また、パーセント配列同一性を計算するために使用する最終的なアラインメントは、自動または手動のいずれかで管理することができることも理解されたい。
免疫応答：
用語「免疫応答」とは、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、貪食細胞、顆粒球、ならびに、当該細胞または肝臓が産生する可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用であって、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん細胞、または自己免疫もしくは病理学的炎症の場合には、正常なヒト細胞もしくは組織の選択的な損傷、破壊、または身体からの排除をもたらす作用のことを指す。一部の事例では、脂質構成成分、及び封入した治療薬を含むナノ粒子の投与は、（ｉ）封入した治療薬（例えば、ｍＲＮＡ）、（ｉｉ）そのような封入した治療薬（例えば、ｍＲＮＡがコードしたポリペプチド）の発現産物、（ｉｉｉ）ナノ粒子の脂質構成成分、または（ｉｖ）それらの組合せが引き起こすことができる免疫応答を誘発することができる。
炎症性応答：
「炎症性応答」は、特異的及び非特異的な防御系を含む免疫応答のことを指す。特定の防御系反応は、抗原に対する特異的な免疫系反応である。特異的防御系反応の例として、抗体応答がある。非特異的防御系反応は、免疫記憶が一般的に不可能な白血球、例えば、マクロファージ、好酸球、及び好中球が媒介する炎症応答である。一部の態様では、免疫応答は、炎症性サイトカインの分泌を含み、炎症性サイトカインレベルの上昇をもたらす。
炎症性サイトカイン：
用語「炎症性サイトカイン」とは、炎症応答において上昇するサイトカインのことを指す。炎症性サイトカインの例として、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１；別名、ＧＲＯα、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ誘導性タンパク質１０（ＩＰ－１０）、または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）がある。炎症性サイトカインの用語には、当該技術分野で公知の炎症性応答と関連するその他のサイトカイン、例えば、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）なども含まれる。
インビトロ：
本明細書で使用する用語「インビトロ」とは、生体（例えば、動物、植物、または微生物）内の代わりに、人工環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養、ペトリ皿などで生じるイベントのことを指す。
インビボ：
本明細書で使用する用語「インビボ」とは、生体（例えば、動物、植物、もしくは、微生物、またはその細胞もしくは組織）内で発生するイベントのことを指す。
挿入及び欠失バリアント：
ポリペプチドに言及する場合の「挿入バリアント」は、天然配列または出発配列での特定の位置のアミノ酸に対して、直接に隣接して挿入した１つ以上のアミノ酸を有する。アミノ酸に「直接に隣接する」は、アミノ酸のアルファ－カルボキシ、またはアルファ－アミノ官能基のいずれかに結合していることを意味する。ポリペプチドに言及する場合の「欠失バリアント」は、天然または出発アミノ酸配列での１つ以上のアミノ酸を除去したものである。通常、欠失バリアントは、分子の特定の領域で１つ以上のアミノ酸が欠失している。
インタクト：
本明細書で使用する用語「インタクト」は、ポリペプチドの文脈では、野生型タンパク質に対応するアミノ酸を保持すること、例えば、野生型アミノ酸を変異させない、または置換しないことを意味する。逆に、用語「インタクト」は、核酸との関連では、野生型核酸に対応する核酸塩基を保持すること、例えば、野生型核酸塩基を変異させない、または置換しないことを意味する。
イオン性アミノ脂質：
用語「イオン性アミノ脂質」は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の脂肪酸または脂肪アルキル鎖、及びｐＨ滴定可能なアミノヘッド基（例えば、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノヘッド基）を有する脂質を含む。イオン性アミノ脂質は、一般的には、アミノヘッド基のｐＫａ未満のｐＨでプロトン化され（すなわち、正に荷電し）、ｐＫａを上回るｐＨで、実質的に荷電していない。そのようなイオン性アミノ脂質として、限定をするものではないが、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、及び（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）がある。
単離した：
本明細書で使用する用語「単離した」とは、（天然または実験的設定に関係なく）関連した構成成分の少なくともいくつかから分離されている物質または実体のことを指す。単離した物質（例えば、ポリヌクレオチド、またはポリペプチド）は、それらが単離されている物質に関して、様々なレベルの純度を有することができる。単離した物質、及び／または実体は、最初に関連したその他の構成成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離することができる。一部の実施形態では、単離した物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％を超える、または約９９％を超える純度である。本明細書で使用する場合、その他の構成成分を実質的に含まない場合、その物質は、「純粋」である。
実質的に単離した：
「実質的に単離した」は、化合物を形成または検出した環境から実質的に分離することを意味する。部分的な分離は、例えば、本開示の化合物を豊富に含む組成物を含むことができる。実質的な分離は、本開示の化合物またはその塩の少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％を含有する組成物を含むことができる。
「単離した」ポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または本明細書に開示したあらゆる組成物は、天然には認められない形態のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または組成物である。単離したポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物は、もはや天然に生じる形態ではない程度に精製されているものを含む。一部の態様では、単離するポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物は、実質的に純粋である。
異性体：
本明細書で使用する用語「異性体」とは、本発明のあらゆる化合物でのあらゆる互変異性体、立体異性体、エナンチオマー、またはジアステレオマーのことを意味する。本発明の化合物は、１つ以上のキラル中心、及び／または二重結合を有することができ、したがって、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）などの立体異性体、あるいは、ジアステレオマー（例えば、エナンチオマー（すなわち、（＋）もしくは（－））、またはシス／トランス異性体）としての存在が認められる。本発明によれば、本明細書に記載した化学構造、したがって、本発明の化合物は、対応する立体異性体のすべて、つまり、立体的に純粋な（例えば、幾何学的に純粋な、鏡像異性的に純粋な、またはジアステレオマー的に純粋な）形態と、エナンチオマー及び立体異性体の混合物、例えば、ラセミ体との両方を含む。本発明の化合物のエナンチオマー混合物、及び立体異性体混合物は、一般的に、周知の方法、例えば、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩複合体として化合物を結晶化すること、またはキラル溶媒中で化合物を結晶化することで、それらの構成成分のエナンチオマーまたは立体異性体に分離させることができる。エナンチオマー、及び立体異性体は、周知の不斉合成法によって、立体異性または鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、及び触媒から得ることもできる。
リンカー：
本明細書で使用する「リンカー」は、原子の群、例えば、１０～１，０００の原子のことを指し、限定をするものではないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、及びイミンなどの原子または基からなることができる。リンカーは、第１の末端で、核酸塩基または糖部分での修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに、第２の末端で、ペイロード、例えば、検出可能な作用物質または治療薬に、結合させることができる。リンカーは、核酸配列への取り込みを阻害しない程度に十分な長さとすることができる。リンカーは、あらゆる有用な目的、例えば、（例えば、２つ以上のキメラポリヌクレオチド分子、またはＩＶＴポリヌクレオチドの結合により）ポリヌクレオチド多量体、またはポリヌクレオチドコンジュゲートを形成するために、かつ、本明細書に記載したように、ペイロードを投与するために使用することができる。リンカーに組み込むことができる化学基の例として、限定をするものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルがあり、これらは、それぞれ、本明細書に記載したように、任意に置換することができる。リンカーの例として、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレン、またはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、及びデキストランポリマー、ならびに、その誘導体があるが、これらに限定されない。その他の例として、限定をするものではないが、還元剤または光分解を使用して切断することができる、例えば、ジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）、またはアゾ結合（－Ｎ＝Ｎ－）などのリンカー内の切断可能な部分がある。選択的に切断が可能な結合の例として、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、もしくは、その他の還元剤の使用、及び／または光分解により切断できるアミド結合、ならびに、例えば、酸性または塩基性の加水分解により切断できるエステル結合があるが、これらに限定されない。
投与方法：
本明細書で使用する「投与方法」として、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または組成物を対象に送達するその他の方法がある。投与方法は、身体の特異的領域または系に標的送達するために（例えば、特異的に送達するために）、選択することができる。
修飾した：
本明細書で使用する「修飾した」は、本発明の分子の変化した状態または構造のことを指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的を含む、多くの方式で修飾することができる。一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ分子は、非天然ヌクレオシド、及び／またはヌクレオチドの導入により修飾されており、例えば、それが天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣに関連するような場合である。キャップ構造などの非標準ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なるが、「修飾した」とはみなされない。
粘液：
本明細書で使用する「粘液」は、粘性であり、かつ、ムチン糖タンパク質を含む天然物質のことを指す。
ナノ粒子組成物：
本明細書で使用する「ナノ粒子組成物」は、１つ以上の脂質を含む組成物である。ナノ粒子組成物は、一般的には、マイクロメートル台以下の大きさであり、脂質二重層を含むことができる。ナノ粒子組成物として、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質ベシクル）、及びリポプレックスがある。例えば、ナノ粒子組成物を、５００ｎｍ以下の直径を有する脂質二重層を有するリポソームとすることができる。
天然に生じる：
本明細書で使用する「天然に生じる」は、人工的な援助なしに、天然に存在することを意味する
非ヒト脊椎動物：
本明細書で使用する「非ヒト脊椎動物」として、野生種、及び家畜種を含む、ホモサピエンスを除くすべての脊椎動物がある。非ヒト脊椎動物の例として、哺乳動物、例えば、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤール、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、及びヤクがあるが、これらに限定されない。
核酸配列：
用語「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド配列」は、互換的に使用されるものであり、連続した核酸配列のことを指す。配列は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか、例えば、ｍＲＮＡとすることができる。
最も広い意味での用語「核酸」とは、ヌクレオチドのポリマーを含むあらゆる化合物、及び／または物質である。これらのポリマーは、大抵の場合、ポリヌクレオチドと称する。本発明の例示的な核酸またはポリヌクレオチドとして、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ、β－Ｄ－リボ配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含む）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、またはそれらのハイブリッドもしくは組合せがあるが、これらに限定されない。
語句「ヌクレオチド配列コード化」とは、ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子）コード配列のことを指す。コード配列は、核酸の投与を受ける個体または哺乳動物細胞において発現を導くことが可能なプロモーター、及びポリアデニル化シグナルを含む制御エレメントに作動可能に連結した開始シグナル、及び終結シグナルをさらに含むことができる。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含むことができる。
オフターゲット：
本明細書で使用する「オフターゲット」は、任意の１つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物に対する任意の意図しない作用のことを指す。
オープンリーディングフレーム：
本明細書で使用する「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、所与のリーディングフレームに終止コドンを付与していない配列のことを指す。
作動可能に連結した：
本明細書で使用する語句「作動可能に連結した」とは、２つ以上の分子、コンストラクト、転写物、実体、部分などの間の機能性結合のことを指す。
任意に置換した：
本明細書では、「任意に置換したＸ」（例えば、任意に置換したアルキル）という形態の語句は、「Ｘ（式中、Ｘは任意に置換している）」（例えば、「アルキル（式中、当該アルキルは、任意に置換している）」と同等であるものとする。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意にあることを意味するものではない。
一部：
本明細書で使用するポリヌクレオチドの「一部」または「領域」は、ポリヌクレオチドの全長よりも短いポリヌクレオチドのあらゆる部分として定義する。
患者：
本明細書で使用する「患者」は、処置を望む、もしくは、処置を必要とする可能性がある、処置を必要とする、処置を受けている、処置を受けることになっている対象、または特定の疾患もしくは状態のための、訓練を受けた専門家によるケアの下にある対象のことを指す。一部の実施形態では、急性疾患を発症するリスクを予防、または減少させる処置を必要としており、必ず必要としており、または施しており、すなわち、それは、予防的処置である。
医薬として許容可能な：
語句「医薬として許容可能な」は、適切な医学的判断の範囲内にあり、合理的な利益／リスク比に見合う、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題、もしくは、合併症を招かない、ヒト及び動物の組織との接触での使用に適した化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指すために、本明細書で使用している。
医薬として許容可能な賦形剤：
本明細書で使用する語句「医薬として許容可能な賦形剤」とは、本明細書に記載した化合物以外のあらゆる成分（例えば、活性化合物を懸濁または溶解することができるビヒクル）のことを指し、患者に対して実質的に非毒性及び非炎症性の特性を有する。賦形剤として、例えば：付着防止剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、染料（顔料）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤、またはコーティング剤、香味料、香料、流動促進剤（流動増進剤）、潤滑剤、防腐剤、印刷インキ、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、及び水和水があるが、これらに限定されない。例示的な賦形剤として、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微晶質セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、プレゼラチン化デンプン、プロピルパラベン、レチニルパルミタート、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールがあるが、これらに限定されない。
医薬として許容可能な塩：
本開示は、本明細書に記載した化合物の医薬として許容可能な塩も含む。本明細書で使用する「医薬として許容可能な塩」は、親化合物が、存在する酸または塩基部分を、その塩形態に変換して（例えば、遊離塩基基を、適切な有機酸と反応させて）修飾している開示した化合物の誘導体のことを指す。医薬として許容可能な塩の例として、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などがあるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸、パモ酸塩、ペクチナート（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などがある。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩として、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、さらには、非毒性アンモニウム、四級アンモニウム、及びアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むアミンカチオンがあるが、これらに限定されない。本開示の医薬として許容可能な塩は、例えば、非毒性無機または有機酸から形成する親化合物の従来の非毒性塩を含む。本開示の医薬として許容可能な塩は、従来の化学的方法により塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、水中もしくは有機溶媒中、またはその２つの混合物中で、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物を、化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることにより調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体を使用する。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８，及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）に認めることができ、これら文献の全内容を参照により本明細書で援用する。
医薬として許容可能な溶媒和物：
本明細書で使用する用語「医薬として許容可能な溶媒和物」とは、適切な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれている本発明の化合物のことを意味する。適切な溶媒は、投与した投薬量で生理学的に許容する。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿により調製することができる。適切な溶媒の例として、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジルなどがある。水が溶媒である場合、溶媒和物は、「水和物」と称する。
薬物動態学：
本明細書で使用する「薬物動態学」は、生体に投与する物質の結末の決定に関係する場合、分子または化合物のあらゆる１つ以上の特性のことを指す。薬物動態学は、吸収、分布、代謝、及び排泄の程度、及び速度を含むいくつかの領域に分けられる。これは、（Ａ）吸収が、血液循環に入る物質のプロセスであり、（Ｄ）分布が、身体の体液及び組織を通した物質の分散または拡散であり、（Ｍ）代謝（または生体内変換）が、親化合物の娘代謝物への不可逆的変換であり、及び（Ｅ）排泄（または除去）が、物質の身体からの除去を指す場合、ＡＤＭＥと一般に称する。稀な事例では、一部の薬物が、体内組織に不可逆的に蓄積する。
物理化学的：
本明細書で使用する「物理化学的」は、物理的、及び／または化学的特性を意味しており、またはそれに関連する。
ポリヌクレオチド：
本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらのアナログ、またはそれらの混合物を含む、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーのことを指す。この用語は、分子の一次構造を指す。したがって、この用語は、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。また、この用語は、例えば、アルキル化、及び／またはキャッピングによる修飾形態のポリヌクレオチド、ならびに、非修飾形態のポリヌクレオチドを含む。より詳細には、用語「ポリヌクレオチド」は、（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）ポリデオキシリボヌクレオチド、スプライシングまたは未スプライシングに関係なく、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｍＲＮＡを含む（Ｄ－リボースを含有する）ポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－グリコシドまたはＣ－グリコシドのであるその他のあらゆるタイプのポリヌクレオチド、ならびに、正常ヌクレオチド骨格を含有するその他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）、及びポリモルホリノポリマー、ならびに、その他の合成配列特異的核酸ポリマーを含むが、ただし、ポリマーは、ＤＮＡ及びＲＮＡに認められるような塩基対合、及び塩基スタッキングを可能にする立体配置の核酸塩基を含有する。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。その他の態様では、ｍＲＮＡは、合成ｍＲＮＡである。一部の態様では、合成ｍＲＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。一部の態様では、特定のクラスのすべての核酸塩基は、非天然核酸塩基で置換している（例えば、本明細書に開示したポリヌクレオチドでのすべてのウリジンは、非天然核酸塩基、例えば、５－メトキシウリジンで置換することができる）。一部の態様では、ポリヌクレオチド（例えば、合成ＲＮＡ、または合成ＤＮＡ）は、合成ＤＮＡの場合には、天然の核酸塩基、すなわち、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シチジン）、及びＴ（チミジン）だけを、または合成ＲＮＡの場合には、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵ（ウリジン）だけを含む。
当業者であれば、明細書に開示したコドンマップのＴ塩基が、ＤＮＡ中に存在するが、Ｔ塩基が、対応するＲＮＡ中ではＵ塩基で置換することになることを理解する。例えば、ＤＮＡ形態の本明細書に開示したコドン－ヌクレオチド配列、例えば、ベクター、またはインビトロ翻訳（ＩＶＴ）鋳型は、その対応する転写したｍＲＮＡでのＵ塩基として転写したＴ塩基を有する。この点では、（Ｔを含む）コドン最適化ＤＮＡ配列、及び（Ｕを含む）それらの対応するｍＲＮＡ配列の両方が、本発明のコドン最適化ヌクレオチド配列と考えられる。当業者であれば、等価コドンマップを、１つ以上の塩基を非天然塩基で置換して生成することができることも理解する。したがって、例えば、ＴＴＣコドン（ＤＮＡマップ）は、ＵＵＣコドン（ＲＮＡマップ）に対応することになり、それにより、これは、ΨΨＣコドン（Ｕがシュードウリジンで置換したＲＮＡマップ）に対応する。
標準Ａ－Ｔ及びＧ－Ｃ塩基対は、チミジンのＮ３－Ｈ及びＣ４－オキシの間の水素結合、ならびに、アデノシンのそれぞれＮ１及びＣ６－ＮＨ２の間の水素結合、ならびに、シチジンのＣ２－オキシ、Ｎ３、及びＣ４－ＮＨ２の間の水素結合、ならびに、グアノシンのそれぞれＣ２－ＮＨ２、Ｎ’－Ｈ、及びＣ６－オキシの間の水素結合の形成を可能にする条件下で形成する。したがって、例えば、グアノシン（２－アミノ－６－オキシ－９－β－Ｄ－リボフラノシルプリン）は、イソグアノシン（２－オキシ－６－アミノ－９－β－Ｄ－リボフラノシルプリン）を形成するために修飾することができる。そのような修飾は、もはや標準塩基対をシトシンと共に効果的に形成しないヌクレオシド塩基をもたらす。しかし、イソシトシン（１－β－Ｄ－リボフラノシル－２－アミノ－４－オキシ－ピリミジン－）を形成するための、シトシン（１－β－Ｄ－リボフラノシル－２－オキシ－４－アミノピリミジン）の修飾は、修飾ヌクレオチドをもたらし、これは、グアノシンと共に塩基対を効果的に形成しないが、イソグアノシンと共に塩基対を形成する（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．付与された米国特許第５，６８１，７０２号）。イソシトシンは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から入手可能であり、イソシチジンは、Ｓｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１０４８９－１０４９６、及び同文献で引用した参照文献に記載された方法で調製することができ、２’－デオキシ－５－メチルイソシチジンは、Ｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：４４６１－４４６７、及び同文献で引用した参照文献に記載された方法で調製することができ、イソグアニンヌクレオチドは、上掲のＳｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３、及びＭａｎｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５９３－５６０１に記載された方法を使用して、またはＣｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．付与された米国特許第５，７８０，６１０号に記載された方法で調製することができる。その他の非天然塩基対は、２，６－ジアミノピリミジン、及びその相補体（１－メチルピラゾロ－［４，３］ピリミジン－５，７－（４Ｈ，６Ｈ）－ジオン）の合成のために、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４３：３３－３７に記載された方法で合成することができる。独自の塩基対を形成するその他のかような修飾ヌクレオチド単位は、Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：３６７５－３６８３、及び上掲のＳｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．などに記載されており、公知である。
ポリペプチド：
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書では互換的に使用する。ポリマーは、修飾アミノ酸を含むことができる。この用語は、天然に修飾しているアミノ酸ポリマー、または介入的に修飾しているアミノ酸ポリマー：例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、またはその他のあらゆる操作もしくは修飾、例えば、標識構成成分と複合化して修飾しているアミノ酸ポリマーも含む。さらに、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸、例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、及びクレアチンなど）を含有するポリペプチド、ならびに、当該技術分野で公知のその他の修飾が、この定義に含まれる。
本明細書で使用する当該用語は、あらゆるサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドのことを指す。ポリペプチドは、コードしたポリヌクレオチド産物、天然に生じるポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、フラグメント、ならびに、上記したその他の等価物、バリアント、及びアナログを含む。ポリペプチドを、モノマーとすることができ、または二量体、三量体、もしくは、四量体などの多分子複合体とすることができる。それらは、一本鎖または多鎖ポリペプチドを含むこともできる。最も一般的には、ジスルフィド結合は、多鎖ポリペプチドに認められる。ポリペプチドという用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に生じるアミノ酸の人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマーに適用することもできる。一部の実施形態では、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長とすることができる。
ポリペプチドバリアント：
本明細書で使用する用語「ポリペプチドバリアント」とは、それらのアミノ酸配列が天然または参照配列と異なる分子のことを指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に、置換、欠失、及び／または挿入を有することができる。通常、バリアントは、天然配列または参照配列と、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、それらは、天然配列または参照配列と、少なくとも約８０％同一、または少なくとも約９０％同一である。
単位薬物当たり（ＰＵＤ）のポリペプチド：
本明細書で使用するＰＵＤ、すなわち、単位薬物当たりの産物は、体液または組織中で測定するような産物（例えば、ポリペプチド）の総１日用量、通常は、１ｍｇ、ｐｇ、ｋｇなどの細別した部分として定義しており、通常は、濃度、例えば、ｐｍｏｌ／ｍＬ、ｍｍｏｌ／ｍＬなどで定義され、体液中での測定値で分けられる。
予防する：
本明細書で使用する用語「予防する」とは、感染、疾患、障害、及び／または状態の発症を、部分的もしくは完全に遅延させること、特定の感染、疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状、特徴、もしくは、臨床症状発現の発症を、部分的にもしくは完全に遅延させること、特定の感染、疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状、特徴、もしくは、症状発現の発症を、部分的もしくは完全に遅延させること、感染、特定の疾患、障害、及び／または状態からの進行を、部分的もしくは完全に遅延させること、及び／または感染、疾患、障害、及び／または状態に関連する病状を発症するリスクを減少させることを指す。
増殖する：
本明細書で使用する用語「増殖する」とは、成長する、拡大する、または増加する、または急速に成長する、拡大する、または増加する、ことを意味する。「増殖性」とは、増殖する能力を有する、ことを意味する。「抗増殖性」とは、増殖特性に対抗する、または反対の特性を有する、ことを意味する。
予防的：
本明細書で使用する用語「予防的」とは、疾患の拡大を防ぐために使用する治療効果、または一連の効果のことを指す。
予防：
本明細書で使用する「予防」は、健康を維持し、疾患の拡大を防ぐための措置のことを指す。「免疫予防」は、疾患の拡大を予防するための能動免疫または受動免疫を生じる措置のことを指す。
タンパク質切断部位：
本明細書で使用する「タンパク質切断部位」は、化学的、酵素的、または光化学的手段により、アミノ酸鎖の制御した切断を達成することができる部位のことを指す。
タンパク質切断シグナル：
本明細書で使用する「タンパク質切断シグナル」は、切断のためにポリペプチドにフラグを立てる、またはマークする少なくとも１つのアミノ酸のことを指す。
目的のタンパク質：
本明細書で使用する用語「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」は、本明細書で提供するタンパク質、ならびに、そのフラグメント、変異体、バリアント、及び改変体を含む。
近位：
本明細書で使用する用語「近位」は、中心、または目的の点もしくは領域のより近くに位置することを意味する。
シュードウリジン：
本明細書で使用するシュードウリジン（Ψ）は、ヌクレオシドウリジンのＣ－グリコシド異性体のことを指す。「シュードウリジンアナログ」は、シュードウリジンのあらゆる改変体、バリアント、アイソフォーム、または誘導体である。例えば、シュードウリジンアナログとして、１－カルボキシメチルシュードウリジン、１－プロピニルシュードウリジン、１－タウリノメチルシュードウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）（Ｎ１－メチルシュードウリジンとしても公知である）、１－メチル－４－チオシュードウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３Ψ）、及び２’－Ｏ－メチルシュードウリジン（Ψｍ）があるが、これらに限定されない。
精製した：
本明細書で使用する「精製する」、「精製した」、「精製」は、望ましくない構成成分、材料汚染、混合物、または不完全性から実質的に純粋またはクリアにすることを意味する。
参照核酸配列：
用語「参照核酸配列」または「参照核酸」または「参照ヌクレオチド配列」または「参照配列」は、配列最適化することができる出発核酸配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ配列）のことを指す。一部の実施形態では、参照核酸配列は、野生型核酸配列、そのフラグメントまたはバリアントである。一部の実施形態では、参照核酸配列は、以前に配列最適化した核酸配列である。
塩：
一部の態様では、送達のための医薬組成物を、本明細書に開示しており、それらの脂質成分の一部の塩を含む。用語「塩」は、あらゆるアニオン性、及びカチオン性複合体を含む。アニオンの例として、無機、及び有機アニオン、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、シュウ酸塩（例えば、ヘミシュウ酸塩）、リン酸塩、ホスホン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、窒化物、亜硫酸水素塩、硫化物、亜硫酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、アクリル酸塩、ポリアクリル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、イタコン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、チグリン酸塩、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩、ポリメタクリル酸塩、過塩素酸塩、塩素酸塩、亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩、臭素酸塩、次亜臭素酸塩、ヨウ素酸塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、クロム酸塩、二クロム酸塩、シアン化物、シアン酸塩、チオシアン酸塩、水酸化物、過酸化物、過マンガン酸塩、及びそれらの混合物があるが、これらに限定されない。
試料：
本明細書で使用する用語「試料」または「生物学的試料」は、その組織、細胞、または構成成分部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液、及び精液などの体液があるが、これらに限定されない）のサブセットのことを指す。さらに、試料として、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器、腸、及び泌尿生殖路、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、または器官など、完全な生体もしくはその組織、細胞もしくは構成成分部分のサブセット、またはその画分もしくは一部から調製するホモジネート、溶解物、もしくは、抽出物もあるが、これらに限定されない。さらに、試料は、タンパク質または核酸分子などの細胞構成成分を含有することができる、栄養ブロスまたはゲルなどの培地のことを指す。
シグナル配列：
本明細書で使用する語句「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、及び「輸送ペプチド」は、互換的に使用され、ある特定の細胞小器官、細胞区画、または細胞外排出へのタンパク質の輸送または局在化を導くことができる配列のことを指す。この用語は、シグナル配列ポリペプチド及びシグナル配列をコードする核酸配列の両方を含む。したがって、核酸の文脈でのシグナル配列への言及は、実際には、シグナル配列ポリペプチドをコードする核酸配列のことを指す。
シグナル伝達経路：
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子の間の生化学的関係のことを指す。本明細書で使用する句「細胞表面受容体」は、例えば、シグナルを受信することができる分子と分子の複合体、ならびに、細胞の原形質膜を横断する、そのようなシグナルの伝達を含む。
類似性：
本明細書で使用する用語「類似性」は、ポリマー分子間の、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子、及び／またはＲＮＡ分子）間の、及び／またはポリペプチド分子間の、全体的な関連性を指す。ポリマー分子の相互のパーセント類似性の計算は、パーセント類似性の計算が、当該技術分野で理解するような保存的置換を考慮に入れていることを除いて、パーセント同一性の計算と同じ方法で実施することができる。
単回単位用量：
本明細書で使用する「単回単位用量」とは、１回の用量で／一度に／単一経路で／単一の接触点、すなわち、単回投与イベントで、投与するあらゆる治療薬の用量である。
分割用量：
本明細書で使用する「分割用量」は、単回単位用量、または総１日用量の２回以上の用量への分割である。
特異的送達：
本明細書で使用する用語「特異的送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」は、オフターゲットの組織（例えば、哺乳動物の脾臓）と比較して、より多く（例えば、少なくとも１．５倍多く、少なくとも２倍多く、少なくとも３倍多く、少なくとも４倍多く、少なくとも５倍多く、少なくとも６倍多く、少なくとも７倍多く、少なくとも８倍多く、少なくとも９倍多く、少なくとも１０倍多く）のポリヌクレオチドのナノ粒子による目的の標的組織（例えば、哺乳動物の肝臓）への送達を意味する。ナノ粒子の特定の組織への送達レベルは、組織内で産生したタンパク質の量を当該組織の重量と比較すること、組織でのポリヌクレオチドの量を当該組織の重量と比較すること、組織内で産生したタンパク質の量を当該組織での総タンパク質の量と比較すること、または組織でのポリヌクレオチド量を、当該組織での総ポリヌクレオチドの量と比較することにより測定することができる。例えば、腎血管の標的化では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの全身投与後に肝臓または脾臓に送達するものと比較して、組織１ｇ当たり、１．５、２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍多いポリヌクレオチドが腎臓に送達する場合に、肝臓及び脾臓と比較して、哺乳動物の腎臓に特異的に提供する。ナノ粒子が標的組織に特異的に送達する能力は、処置する対象において決定する必要はなく、動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代用物で決定することができる、と理解する。
安定性：
本明細書で使用する「安定性」は、反応混合物からの有用な程度の純度までの単離を耐え抜く十分な強さを有し、一部の事例では、有効な治療薬への製剤化が可能な化合物のことを指す。
安定化した：
本明細書で使用する用語「安定化する」、「安定化した」、「安定化した領域」は、安定にさせる、または安定になることを意味する。
立体異性体：
本明細書で使用する用語「立体異性体」は、化合物（例えば、本明細書に記載したあらゆる式の化合物）が有することができるすべての可能な異なる異性体形態、及び立体配座形態、特に、基本分子構造のすべての可能な立体化学的、及び立体配座的異性体形態、すべてのジアステレオマー、エナンチオマー、及び／または立体配座異性体のことを指す。本発明の一部の化合物は、異なる互変異性体形態で存在することができ、後者は、すべて本発明の範囲内に含まれる。
対象：
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後、または治療が望まれるあらゆる対象、特に、哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象として、ヒト、飼育動物、家畜、動物園動物、スポーツ動物、ペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシ；霊長類、例えば、類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジー；イヌ科動物、例えば、イヌ及びオオカミ；ネコ科動物、例えば、ネコ、ライオン、及びトラ；ウマ科動物、例えば、ウマ、ロバ、及びシマウマ；クマ、食用動物、例えば、雌ウシ、ブタ、及びヒツジ；有蹄動物、例えば、シカ、及びキリン；齧歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモットなどがあるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒト対象である。その他の実施形態では、対象は、ヒト患者である。特定の実施形態では、対象は、処置を必要とするヒト患者である。
実質的に：
本明細書で使用する用語「実質的に」とは、目的の特徴または特性の全体、またはほぼ全体の程度（ｅｘｔｅｎｔ）または程度（ｄｅｇｒｅｅ）を示す定性的条件のことを指す。生物学の当業者であれば、生物学的及び化学的特徴があるとしても、完結し、及び／または完全まで進行し、または絶対的な結果を達成もしくは回避することが殆どないことを理解する。したがって、用語「実質的に」とは、本明細書では、多くの生物学的及び化学的特徴に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために使用する。
実質的に同等：
用量間の時間差に関連して本明細書で使用する場合、この用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時：
本明細書で使用し、かつ、複数の用量に関連する場合、この用語は、２秒以内を意味する。
罹患している：
疾患、障害、及び／または病態に「罹患している」個人が、疾患、障害、及び／または病態であるとの診断を受けている、またはそれらの１つ以上の症状を示していること。
感受性：
疾患、障害、及び／または病態に「感受性」がある個人が、疾患、障害、及び／または病態であるとの診断を受けておらず、またはそれらの症状を示していないが、疾患、または症状を発症する傾向が見受けられること。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または病態（例えば、ＣＮ－１）に対して感受性のある個体は：（１）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する遺伝的変異、（２）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する遺伝的多型、（３）疾患、障害、及び／または状態に関連するタンパク質及び／または核酸の発現及び／または活性の増加及び／または減少、（４）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する習慣及び／または生活様式、（５）疾患、障害、及び／または状態の家族歴、ならびに、（６）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する微生物への曝露及び／または感染のうちの１つ以上で特徴決定することができる。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、及び／または状態を発症する。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、及び／または状態を発症しない。
持続放出：
本明細書で使用する用語「持続放出」とは、ある特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物の放出プロファイルのことを指す。
合成：
用語「合成」とは、ヒトの手により生成、調製、及び／または製造することを意味する。本発明のポリヌクレオチド、またはその他の分子の合成は、化学的または酵素的に行うことができる。
標的細胞：
本明細書で使用する「標的細胞」は、目的の１つ以上のあらゆる細胞のことを指す。細胞は、インビトロで、インビボ、インサイチュ、または生体の組織もしくは器官で認めることができる。生体は、動物、例えば、哺乳動物、ヒト、対象、または患者とすることができる。
標的組織：
本明細書で使用する「標的組織」とは、ポリヌクレオチドの送達が所望の生物学的、及び／または薬理学的効果をもたらす目的の１つ以上のあらゆる組織型のことを指す。目的の標的組織の例として、特定の組織、器官、及びそれらの系または群がある。特定の用途では、標的組織は、肝臓、腎臓、肺、脾臓、または血管内（例えば、冠動脈内または大腿内）の血管内皮とすることができる。「オフターゲットの組織」とは、コードしたタンパク質の発現が所望の生物学的、及び／または薬理学的効果をもたらさないあらゆる１つ以上の組織型のことを指す。
オフターゲット問題における治療薬の存在は、（ｉ）拡散による、もしくは、血流を通じた、ポリヌクレオチドの投与部位から末梢組織もしくは遠位の標的外の組織への漏れ（例えば、ある特定の組織内でポリペプチドを発現するように意図したポリヌクレオチドが、標的外の組織に到達し、ポリペプチドが、その標的外の組織内で発現する）、または（ｉｉ）拡散による、もしくは、血流を通じた、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与した後のそのようなポリペプチドの末梢組織もしくは離れた遠位の標的以外の組織への漏れ（例えば、ポリヌクレオチドが、ポリペプチドを標的組織内で発現し、そのポリペプチドが末梢神経へ拡散する）の結果である。
標的化配列：
本明細書で使用する語句「標的配列」とは、タンパク質、またはポリペプチドの輸送または局在化を導くことができる配列のことを指す。
末端：
本明細書で使用する用語、「末端（複数可）」とは、ポリペプチドに言及する場合、ペプチドまたはポリペプチドの末端のことを指す。そのような末端は、ペプチドまたはポリペプチドの最初の部位、または最終の部位だけに限定をするものではなく、末端領域にさらなるアミノ酸を含むことができる。本発明のポリペプチドをベースとする分子は、（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸で末端処理した）Ｎ末端、及び（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸で末端処理した）Ｃ末端の両方を有することで特徴決定することができる。本発明のタンパク質は、一部の事例では、ジスルフィド結合または非共有結合力によって１つにした、複数のポリペプチド鎖（多量体、オリゴマー）で構成されている。これらのタイプのタンパク質は、複数のＮ末端と、Ｃ末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端を、それらが、場合に応じて、有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドをベースとする部分で、開始または終了するように修飾することができる。
治療薬：
用語「治療薬」とは、対象に投与する場合、治療的、診断的、及び／または予防的効果を有し、及び／または所望の生物学的、及び／または薬理学的効果を誘発する作用物質のことを指す。例えば、一部の実施形態では、ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを、治療薬とすることができる。
治療有効量：
本明細書で使用する用語「治療的有効量」は、感染、疾患、障害、及び／または状態に罹患している、またはこれらに罹患しやすい対象に投与する場合、感染、疾患、障害、及び／または状態を処置し、これらの症状を改善し、診断し、予防し、及び／またはこれらの発症を遅延させるのに十分である送達すべき薬剤（例えば、核酸、薬物、治療薬、診断薬、予防薬など）の量を意味する。
治療上有効な結果：
本明細書で使用する用語「治療上有効な結果」は、感染、疾患、障害、及び／または状態に罹患している、またはこれらに罹患しやすい対象において、感染、疾患、障害、及び／または状態を処置し、これらの症状を改善し、診断し、予防し、及び／またはこれらの発症を遅延させるのに十分である結果を意味する。
総１日用量：
本明細書で使用する「総１日用量」とは、２４時間の期間に与えられる、または処方する量のことである。総１日用量を、単回単位用量または分割用量として投与することができる。
転写因子：
本明細書で使用する用語「転写因子」とは、例えば、転写の活性化または抑制により、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を制御するＤＮＡ結合タンパク質のことを指す。一部の転写因子は、単独で転写の制御を行うが、その他のものは、その他のタンパク質と協調して作用する。一部の転写因子は、特定の条件下で転写を活性化することも、抑制することもできる。一般的に、転写因子は、標的遺伝子の制御領域において特異的標的配列または特異的コンセンサス配列と高度に類似する配列に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独で、またはその他の分子との複合体において調節することができる。
転写：
本明細書で使用する用語「転写」とは、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ鋳型、または配列）からｍＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ配列、または鋳型）を産生する方法のことを指す。
トランスフェクション：
本明細書で使用する「トランスフェクション」は、ポリヌクレオチド（例えば、外因性核酸）の細胞への導入のことを指しており、ポリヌクレオチドがコードしたポリペプチドが発現する（例えば、ｍＲＮＡ）、またはポリペプチドが細胞機能を調節する（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）。本明細書で使用する核酸配列の「発現」は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳、及び／またはポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾のことを指す。トランスフェクションの方法として、化学的方法、物理的処理、及びカチオン脂質または混合物があるが、これらに限定されない。
処置すること、処置、治療：
本明細書で使用する用語「処置すること」または「処置」または「治療」は、疾患、例えば、ＣＮ－１の１つ以上の症状または特徴を、部分的または完全に緩和すること、改善すること、好転させること、軽減すること、これらの発症を遅延させること、これらの進行を阻害すること、これらの重症度を低下させること、及び／またはこれらの発生率を低下させることを指す。例えば、ＣＮ－１を「処置すること」は、疾患と関連する症状の減少、患者の寿命延長（生存率の増加）、疾患の重症度の低下、疾患の発症の予防または遅延などを指すことができる。処置は、疾患、障害、及び／または状態に関連する病状を発症するリスクを減少させるために、疾患、障害、及び／または状態の徴候を示していない対象、及び／または疾患、障害、及び／または状態の初期徴候だけを示している対象に投与することができる。
非修飾：
本明細書で使用する「非修飾」は、何らかの方法で変更する前のあらゆる物質、化合物、または分子のことを指す。非修飾は、必ずしも常にではないが、野生型または天然形態の生体分子を指すことができる。分子は、一連の修飾を受けることができ、それにより、それぞれの修飾分子は、その後の修飾のための「非修飾」出発分子として役立てることができる。
ウラシル：
ウラシルは、ＲＮＡの核酸の４つの核酸塩基のうちの１つであり、これは、文字Ｕで表す。ウラシルは、β－Ｎ１－グリコシド結合を介して、リボース環、またはより具体的には、リボフラノースと結合して、ヌクレオシドウリジンをもたらすることができる。また、ヌクレオシドウリジンは、一般的には、その核酸塩基の１文字コード、すなわち、Ｕに略記する。したがって、本開示の文脈では、ポリヌクレオチド配列でのモノマーがＵである場合、そのようなＵは、「ウラシル」または「ウリジン」として互換的に称する。
ウリジン含有量：
用語「ウリジン含有量」または「ウラシル含有量」は、互換的であり、特定の核酸配列中に存在するウラシルまたはウリジンの量のことを指す。ウリジン含有量またはウラシル含有量は、絶対値（配列でのウリジンまたはウラシルの総数）、または相対値（核酸配列での核酸塩基の総数に対するウリジンまたはウラシルのパーセンテージ）として表することができる。
ウリジン修飾配列：
用語「ウリジン修飾配列」とは、候補核酸配列のウリジン含有量、及び／またはウリジンパターンに対して、異なる全体的または局所的ウリジン含有量（より高い、またはより低いウリジン含有量）を有する、または異なるウリジンパターン（例えば、勾配分布、またはクラスタリング）を有する配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）のことを指す。本開示の記載内容では、用語「ウリジン修飾配列」及び「ウラシル修飾配列」は、同等であり、互換性があると考えられる。
「高ウリジンコドン」は、２つ、または３つのウリジンを含むコドンとして定義され、「低ウリジンコドン」は、１つのウリジンを含むコドンとして定義され、「無ウリジンコドン」は、いずれのウリジンもないコドンである。一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、高ウリジンコドンの低ウリジンコドンとの置換、高ウリジンコドンの無ウリジンコドンとの置換、低ウリジンコドンの高ウリジンコドンとの置換、低ウリジンコドンの無ウリジンコドンとの置換、無ウリジンコドンの低ウリジンコドンとの置換、無ウリジンコドンの高ウリジンコドンとの置換、及びそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、高ウリジンコドンは、別の高ウリジンコドンで置換することができる。一部の実施形態では、低ウリジンコドンは、別の低ウリジンコドンで置換することができる。一部の実施形態では、無ウリジンコドンは、別の無ウリジンコドンで置換することができる。ウリジン修飾配列は、ウリジン富化またはウリジン希薄化することができる。
ウリジン富化：
本明細書で使用する用語「ウリジン富化」、及び文法上の変形語は、対応する候補核酸配列のウリジン含有量に対する配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）での（絶対値で、またはパーセンテージ値として表す）ウリジン含有量の増加のことを指す。ウリジン富化は、候補核酸配列でのコドンを、より少ないウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換して実施することができる。ウリジン富化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対する）、または局所的（すなわち、候補核酸配列の部分配列もしくは領域に対する）とすることができる。
ウリジン希薄化：
本明細書で使用する用語「ウリジン希薄化」、及び文法上の変形語は、対応する候補核酸配列のウリジン含有量に対する配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）での（絶対値で、またはパーセンテージ値として表す）ウリジン含有量の減少のことを指す。ウリジン希薄化は、候補核酸配列でのコドンを、より少ないウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換して実施することができる。ウリジン希薄化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対する）、または局所的（すなわち、候補核酸配列の部分配列もしくは領域に対する）にすることができる。
バリアント：
本開示で使用するバリアントという用語は、天然バリアント（例えば、多型、アイソフォームなど）と、天然または出発配列（例えば、野生型配列）での少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されており、異なるアミノ酸が同じ箇所のその位置に挿入されている人工バリアントとの両方を指す。これらのバリアントは、「置換バリアント」として記載することができる。置換は、分子での１つのアミノ酸だけが置換している単一置換とすることができ、または２つ以上のアミノ酸が同じ分子中で置換している複数置換とすることもできる。アミノ酸を挿入する、または欠失させる場合、得られるバリアントは、それぞれ「挿入バリアント」または「欠失バリアント」である。
開始コドン：
本明細書で使用する用語「出発コドン」と互換的に使用する用語「開始コドン」は、リボソームが翻訳するオープンリーディングフレームの第１のコドンを指しており、結合したアデニン－ウラシル－グアニン核酸塩基の三重項からなる。開始コドンは、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、及びグアニン（Ｇ）の第１の１文字コードにより示され、大抵の場合は、「ＡＵＧ」と略記する。天然ｍＲＮＡは、開始コドンとして、本明細書では「代替開始コドン」と称するＡＵＧ以外のコドンを使用し得るが、本明細書に記載したポリヌクレオチドの開始コドンは、ＡＵＧコドンを用いる。翻訳開始のプロセスの間に、開始コドンを含む配列は、リボソームにより結合したイニシエーターｔＲＮＡ（Ｍｅｔ－ｔＲＮＡｉ Ｍｅｔ）のアンチコドンとの相補的塩基対合を介して認識する。オープンリーディングフレームは、２つ以上のＡＵＧ開始コドンを含み得るものであり、それらは本明細書では「交代用開始コドン」と称する。
開始コドンは、翻訳開始において重大な役割を果たす。開始コドンは、リボソームが翻訳するオープンリーディングフレームの第１のコドンである。一般的には、開始コドンは、ヌクレオチド三重項ＡＵＧを含むが、しかしながら、一部の例では、翻訳開始は、別個のヌクレオチドから構成するその他のコドンで生じる。真核生物における翻訳開始は、多数のタンパク質－タンパク質、タンパク質－ＲＮＡ、及びメッセンジャーＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）間のＲＮＡ－ＲＮＡ相互作用、４０Ｓリボソームサブユニット、翻訳機構のその他の構成成分（例えば、真核開始因子、ｅＩＦ）が関与するマルチステップ生化学プロセスである。ｍＲＮＡ翻訳開始の現行のモデルは、前開始複合体（あるいは、「４３Ｓ前開始複合体」、略して「ＰＩＣ」）が、５’から３’に向けてヌクレオチドをスキャニングすることにより、特異的な翻訳促進ヌクレオチドコンテキスト（コザック配列）内に存在する第１のＡＵＧコドンに遭遇するまで、ｍＲＮＡ（一般的には、５’キャップ）上の動員部位から、開始コドンへと移動することを仮定している（Ｋｏｚａｋ（１９８９）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０８：２２９－２４１）。ＰＩＣによるスキャニングは、イニシエーターＭｅｔ－ｔＲＮＡｉ ＭｅｔトランスファーＲＮＡのアンチコドンを含むヌクレオチドと、ｍＲＮＡの開始コドンを含むヌクレオチドとの間の相補的塩基対合で終了する。ＡＵＧコドンとＭｅｔ－ｔＲＮＡｉ Ｍｅｔアンチコドンとの間の生産的塩基対合は、大きな６０ＳリボソームサブユニットとＰＩＣとが一緒になって、翻訳伸長に適した活性なリボソームを形成すると最高潮に達する一連の構造的及び生化学的イベントを誘発する。
コザック配列：
用語「コザック配列」（別名、「コザックコンセンサス配列」）とは、遺伝子またはオープンリーディングフレームの発現を増強する翻訳開始エンハンサーエレメントのことを指すものであり、真核生物では、５’ＵＴＲに位置する。コザックコンセンサス配列は元々、プレプロインスリン遺伝子の翻訳に対する開始コドン（ＡＵＧ）周囲の単一変異の作用の解析に従って、配列ＧＣＣＲＣＣ（配列番号４１）として定義した（ここで、Ｒ＝プリン）（Ｋｏｚａｋ（１９８６）Ｃｅｌｌ ４４：２８３－２９２）。本明細書に開示したポリヌクレオチドは、コザックコンセンサス配列、またはその誘導体または変更形態を含む（翻訳エンハンサー組成、及びその使用方法の例については、全内容を参照により本明細書で援用する、Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．付与された米国特許第５，８０７，７０７号；全内容を参照により本明細書で援用する、Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ付与された米国特許第５，７２３，３３２号；全内容を参照により本明細書で援用する、Ｗｉｌｓｏｎ付与された米国特許第５，８９１，６６５号を参照されたい）。
修飾した：
本明細書で使用する「修飾した」または「修飾」は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の組成または構造が変化した状態、またはその変化のことを指す。ポリヌクレオチドを、化学的、構造的、及び／または機能的を含む様々な方式で修飾することができる。例えば、ポリヌクレオチドを、１つ以上のＲＮＡエレメントの組み込みにより構造的に修飾することができ、その際、ＲＮＡエレメントは、１つ以上の機能（例えば、翻訳制御活性）を与える配列、及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含む。したがって、本開示のポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾を含み得る（例えば、１つ以上の化学的、構造的、または機能的修飾を、それらのあらゆる組合せを含めて、含み得る）。
核酸塩基：
本明細書で使用する用語「核酸塩基」（あるいは、「ヌクレオチド塩基」または「窒素塩基」）とは、改良した特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ抵抗性、化学的安定性）を、核酸またはその部分もしくはセグメントに付与する、天然に生じるプリン及びピリミジンのあらゆる誘導体またはアナログを含む、核酸において認められるプリンまたはピリミジン複素環式化合物のことを指す。アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルが、天然核酸において主に認められる核酸塩基である。当該技術分野で公知である、及び／または本明細書に記載したその他の天然、非天然、及び／または合成核酸塩基を核酸に組み込むことができる。
ヌクレオシド／ヌクレオチド：
本明細書で使用する用語「ヌクレオシド」は、核酸塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）、またはその誘導体もしくはアナログ（別名、「核酸塩基」）に共有結合した糖分子（例えば、ＲＮＡでのリボース、またはＤＮＡでのデオキシリボース）、またはその誘導体もしくはアナログを含有するが、インターヌクレオシド結合基（例えば、リン酸基）が存在しない化合物のことを指す。本明細書で使用する用語「ヌクレオチド」は、改良した化学的、及び／または機能的特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ抵抗性、化学的安定性）を、核酸またはその部分もしくはセグメントに付与するインターヌクレオシド結合基（例えば、リン酸基）、またはあらゆるその誘導体、アナログ、もしくは、変更形態に共有結合したヌクレオシドのことを指す。
核酸：
本明細書で使用する用語「核酸」とは、その最も広い意味で使用しており、ヌクレオチドのポリマー、またはその誘導体もしくはアナログを含むあらゆる化合物及び／または物質を含む。これらのポリマーは、大抵の場合、「ポリヌクレオチド」と称する。したがって、本明細書で使用する用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、同等であり、互換的に使用する。本開示の例示的な核酸またはポリヌクレオチドとして、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡｉ誘発薬、ＲＮＡｉ薬、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘発するＲＮＡ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（β－Ｄ－リボ配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオ異性体）、２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含むＬＮＡ）、またはそれらのハイブリッドがあるが、これらに限定されない。
核酸構造：
本明細書で使用する用語「核酸構造」（「ポリヌクレオチド構造」と互換的に用いられる）は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を構成する結合したヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの原子、化学的構成成分、エレメント、モチーフ、及び／または配列の配置または組織化のことを指す。また、この用語は、核酸の二次元または三次元状態を指す。したがって、用語「ＲＮＡ構造」とは、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）を構成する結合したヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの原子、化学的構成成分、エレメント、モチーフ、及び／または配列の配置または編成のことを指し、及び／またはＲＮＡ分子の二次元または三次元状態のことを指す。核酸構造を、組織的複雑性の上昇に基づいて、本明細書では、「分子構造」、「一次構造」、「二次構造」、及び「三次構造」と称する４つの組織カテゴリーに、さらに区別することができる。
オープンリーディングフレーム：
本明細書で使用する用語「オープンリーディングフレーム」は、「ＯＲＦ」と略記されるものであって、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子のセグメントまたは領域のことを指す。ＯＲＦは、開始コドンから始まって終止コドンで終了する非重複インフレームコドンの連続ストレッチを含み、リボソームが翻訳する。
前開始複合体（ＰＩＣ）：
本明細書で使用する用語「前開始複合体」（あるいは、「４３Ｓ前開始複合体」；「ＰＩＣ」と略記する）は、４０Ｓリボソームサブユニット、真核開始ファクター（ｅＩＦｌ、ｅＩＦｌＡ、ｅＩＦ３、ｅＩＦ５）、及びｅＩＦ２－ＧＴＰ－Ｍｅｔ－ｔＲＮＡｉ Ｍｅｔ三元複合体を含むリボ核タンパク質複合体のことを指し、これは、内因的にｍＲＮＡ分子の５’キャップに結合することができ、結合した後に、５’ＵＴＲのリボソームスキャニングを行うことができる。
ＲＮＡエレメント：
本明細書で使用する用語「ＲＮＡエレメント」とは、生物学的機能を提供する、及び／または生物学的活性（例えば、翻訳調節活性）を有するＲＮＡ分子の一部、フラグメント、またはセグメントのことを指す。本明細書に記載したものなど、１つ以上のＲＮＡエレメントの取り込みによるポリヌクレオチドの修飾は、修飾したポリヌクレオチドに対して１つ以上の望ましい機能特性を提供する。本明細書に記載したようなＲＮＡエレメントは、天然に存在するもの、天然に存在しないもの、合成のもの、操作したもの、またはそれらのあらゆる組合せ、とし得る。例えば、制御活性を与える天然に生じるＲＮＡエレメントとして、ウイルス、原核及び真核生物（例えば、ヒト）のトランスクリプトームを通じて認められるエレメントがある。ＲＮＡエレメント、特に、真核ｍＲＮＡ及び翻訳ウイルスＲＮＡは、細胞における多くの機能の媒介に関与していることが示されている。例示的な天然ＲＮＡエレメントとして、翻訳開始エレメント（例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、Ｋｉｅｆｔ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＲＮＡ ７（２）：１９４－２０６を参照されたい）、翻訳エンハンサーエレメント（例えば、ＡＰＰ ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４（１０）：６４２１－６４３１を参照されたい）、ｍＲＮＡ安定性エレメント（例えば、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、Ｇａｍｅａｕ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８（２）：１１３－１２６を参照されたい）、翻訳抑制エレメント（例えば、Ｂｌｕｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｅｅｈ Ｄｅｖ １１０（１－２）：９７－１１２を参照されたい）、タンパク質結合ＲＮＡエレメント（例えば、鉄応答エレメント、Ｓｅｌｅｚｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２５（１８）：３３０１－３３１０を参照されたい）、細胞質ポリアデニル化エレメント（Ｖｉｌｌａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２１（４）：４５２－４５７）、及び触媒ＲＮＡエレメント（例えば、リボザイム、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７８９（９－１０）：６３４－６４１を参照されたい）があるが、これらに限定されない。
滞留時間：
本明細書で使用する用語「滞留時間」とは、ｍＲＮＡ分子に沿った別個の位置または箇所での前開始複合体（ＰＩＣ）またはリボソームの占有時間のことを指す。
翻訳制御活性：
本明細書で使用する用語「翻訳制御活性」（「翻訳制御機能」と互換的に用いられる）は、ＰＩＣ及び／またはリボソームの活性を含む翻訳装置の活性を調節する（例えば、制御する、影響を及ぼす、調節する、変化させる）生物学的機能、機構、またはプロセスのことを指す。一部の態様では、所望の翻訳制御活性は、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実性を促進及び／または増強する。一部の態様では、所望の翻訳制御活性は、読み漏らしを減少させる、及び／または阻害する。
２８．均等物及び範囲
当業者であれば、ルーチン的な実験だけを使用して、本明細書に記載した本発明による特定の実施形態に対する数多くの均等物を認識することができる、または確認することができる。本発明の範囲は、当該明細書に限定することは意図しておらず、むしろ、添付の特許請求の範囲に記載しているとおりである。
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示がない限り、または別途文脈から自明でない限り、１つ以上を意味することができる。反対の指示がなく、または文脈から別途自明でない限りは、グループメンバーのうちの１つ、複数、またはすべてが、所与の産物またはプロセスに存在しており、そこで使用されており、または別の方法でこれらに関連していれば、グループの１つ以上のメンバーの間に「または」を含んでいる特許請求の範囲または明細書は、要件を満たしているものと考えられる。本発明は、グループの厳密に１つのメンバーが、所与の産物またはプロセスに存在しており、そこで使用されており、または別の方法でこれらに関連している実施形態を含む。本発明は、グループメンバーの複数、またはすべてが、所与の産物またはプロセスに存在しており、そこで使用されており、または別の方法でこれらに関連している実施形態を含む。
用語「含む」は、オープンであることを意図しており、さらなる要素またはステップを含むことを許容するが、必要としないことにも留意されたい。用語「含む」を本明細書で使用する場合、用語「からなる」もまた、このように含み、かつ、開示する。
範囲が示されている場合は、端点も含む。さらに、特に断りのない限り、または文脈及び当業者の理解から別途自明でない限り、範囲として表する値は、文脈に特に断りがない限り、範囲の下限の単位の１０分の１までの、本発明の異なる実施形態の記載した範囲内のあらゆる特定の値または部分範囲とみなすることができる、ことを理解すべきである。
加えて、先行技術の範囲に属する本発明のあらゆる特定の実施形態は、請求項のうちのいずれか１つ以上から明白に除外することができることを理解すべきである。そのような実施形態は、当業者が公知とみなすので、除外が本明細書では明記されてないとしても、除外することができる。本発明の組成物のあらゆる特定の実施形態（例えば、それがコードしたあらゆる核酸またはタンパク質；あらゆる製造方法；あらゆる使用方法など）は、先行技術の存在との関連の有無に関係なく、あらゆる理由で、１つ以上のあらゆる請求項から除外することができる。
引用したすべての出典、例えば、本明細書で引用した参照文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、及び技術は、引用を明記していなくとも、参照により本出願で援用する。引用した出典と、本出願の記載とで矛盾がある場合、本出願での記載が優先する。
節と表の見出しは、限定を意図するものではない。
コンストラクト配列
「Ｇ５」とは、ｍＲＮＡでのすべてのウラシル（Ｕ）を、Ｎ１－メチルシュードウラシルで置き換えている、ことを意味する。
「Ｇ６」とは、ｍＲＮＡでのすべてのウラシル（Ｕ）を、５－メトキシウラシルで置き換えている、ことを意味する。

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実施例１
キメラポリヌクレオチド合成
Ａ．三リン酸経路
三リン酸化学構造を用いて、キメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分を接合する、またはライゲートすることができる。この方法により、１００ヌクレオチド以下の第１の領域または部分は、５’一リン酸、及び末端の３’ｄｅｓＯＨまたはブロックしたＯＨを用いて、化学的に合成することができる。この領域が８０ヌクレオチドよりも長い場合、このものは、ライゲーション用の２本鎖として合成することができる。
第１の領域または部分を、インビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して、非位置的に修飾した領域または部分として合成する場合、５’一リン酸の変換と、その後の３’末端のキャッピングとを続けることができる。一リン酸保護基は、当該技術分野で公知のあらゆる一リン酸保護基から選択することができる。
キメラポリヌクレオチドの第２の領域または部分は、化学合成法またはＩＶＴ法のいずれを用いて合成することができる。ＩＶＴ法は、修飾キャップを有するプライマーを利用することができるＲＮＡポリメラーゼを含むことができる。あるいは、最大８０ヌクレオチドのキャップを化学的に合成し、ＩＶＴ領域または部分に結合することができる。
ライゲーション方法については、ＤＮＡ Ｔ４リガーゼでのライゲーション、続く、ＤＮアーゼでの処理で、鎖状体形成は容易に回避される、ことに留意されたい。
キメラポリヌクレオチド全体を、リン酸－糖骨格で製造する必要はない。領域または部分の１つがポリペプチドをコードする場合、そのような領域または部分は、リン酸－糖骨格を含むことができる。
次いで、ライゲーションを、任意の公知のクリックケミストリー、オルソクリックケミストリー、ソルリンク、または当業者に公知のその他のバイオコンジュゲートケミストリーを使用して行うことができる。
Ｂ．合成経路
キメラポリヌクレオチドは、一連の出発セグメントを用いて作り出することができる。そのようなセグメントとして、以下のものがある：
（ａ）通常の３’ＯＨを含む、キャップして保護された５’セグメント（ＳＥＧ．１）
（ｂ）ポリペプチドのコード領域を含むことができ、かつ、正常な３’ＯＨを含む、５’三リン酸セグメント（ＳＥＧ．２）
（ｃ）コルジセピンを含む、または３’ＯＨを含まない、キメラポリヌクレオチドの３’末端（例えば、テイル）のための５’一リン酸セグメント（ＳＥＧ．３）。
合成（化学的、またはＩＶＴ）後に、セグメント３（ＳＥＧ．３）を、コルジセピンで処理し、次いで、ピロホスファターゼで処理して、５’一リン酸を生成することができる。
次いで、セグメント２（ＳＥＧ．２）を、ＲＮＡリガーゼを使用して、ＳＥＧ．３にライゲートすることができる。次いで、ライゲートしたポリヌクレオチドを精製し、ピロホスファターゼで処理して、二リン酸を切断することができる。次いで、処理したＳＥＧ．２－ＳＥＧ．３コンストラクトを精製し、ＳＥＧ．１を、５’末端にライゲートする。キメラポリヌクレオチドのさらなる精製ステップを行うことができる。
キメラポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、ライゲートした、または接続したセグメントは、５’ＵＴＲ（ＳＥＧ．１）、オープンリーディングフレーム、またはＯＲＦ（ＳＥＧ．２）、及び３’ＵＴＲ＋ポリＡ（ＳＥＧ．３）として表することができる。
それぞれのステップの収率を、９０～９５％程度とすることができる。
実施例２
ｃＤＮＡ生成のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡの調製のためのＰＣＲ手順は、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）の２×ＫＡＰＡ ＨＩＦＩ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘを使用して行うことができる。このシステムは、２×ＫＡＰＡ ＲｅａｄｙＭｉｘ１２．５μｌ；フォワードプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ；リバースプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ；鋳型ｃＤＮＡ１００ｎｇ；及び２５．０μｌに希釈したｄＨ２Ｏを含む。このＰＣＲ反応条件は；９５℃で５分間、及び９８℃で２０秒間、次いで、５８℃で１５秒間、次いで、７２℃で４５秒間、次いで、７２℃で５分間、次いで、終了まで４℃からなるサイクルを２５回行うことができる。
本発明のリバースプライマーは、ポリＡ１２０（配列番号２１４）の代わりに、ポリ－Ｔ１２０（配列番号２１５）を、ｍＲＮＡに組み込むことができる。さらに長い、またはさらに短いポリ（Ｔ）トラクトを有するその他のリバースプライマーを使用して、ポリヌクレオチドｍＲＮＡでのポリ（Ａ）尾部の長さを調整することができる。
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、製造業者の指示に従って（最大５μｇ）使用して、反応液をクリーンアップすることができる。より大きな反応は、より大きな対応能力を有する製品を使用するクリーンアップを必要とする。クリーンアップ後に、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用して、ｃＤＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動で分析して、ｃＤＮＡが予想されるサイズであることを確認することができる。次いで、インビトロ転写反応に進む前に、ｃＤＮＡを配列決定分析にかけることができる。
実施例３
インビトロ転写（ＩＶＴ）
インビトロ転写反応は、均一に修飾したポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを生成することができる。そのような均一に修飾したポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの領域または部分を含むことができる。インプットヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスは、天然及び非天然のＮＴＰを使用して作り出することができる。
一般的なインビトロ転写反応は、以下のもの：
１ 鋳型ｃＤＮＡ：１．０μｇ
２ １０×転写緩衝液（４００ｍＭのトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１９０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのスペルミジン）：２．０μｌ
３ 特注ＮＴＰ（各２５ｍＭ）：７．２μｌ
４ ＲＮアーゼ阻害剤：２０Ｕ
５ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ：３０００Ｕ
６ ｄＨ２Ｏ：最高２０．０μｌ、及び
７ ３７℃で３時間～５時間のインキュベーション、を含む。
粗ＩＶＴ混合物を、翌日のクリーンアップのために、４℃で、一晩、保存することができる。次いで、１ＵのＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼを、元の鋳型を消化するために使用することができる。３７℃で、１５分間にわたってインキュベーションした後に、ｍＲＮＡを、製造業者の指示に従って、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して精製することができる。このキットは、最高５００μｇのＲＮＡを精製することができる。クリーンアップした後に、ＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して定量し、アガロースゲル電気泳動で分析して、ＲＮＡが適切なサイズであり、ＲＮＡの分解が起こっていないことを確認することができる。
実施例４
酵素的キャッピング
ポリヌクレオチドのキャッピングを、ＩＶＴ ＲＮＡ ６０μｇ～１８０μｇ、及びｄＨ２Ｏを最高７２μｌを含む混合物を使用して行うことができる。混合物を、６５℃で、５分間にわたってインキュベーションして、ＲＮＡを変性させ、次いで、直ちに氷に移することができる。
次いで、プロトコルは、１０×キャッピング緩衝剤（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＫＣｌ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）；２０ｍＭ ＧＴＰ（５．０μｌ）；２０ｍＭ Ｓ－アデノシルメチオニン（２．５μｌ）；ＲＮアーゼ阻害剤（１００Ｕ）；２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）；ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ（最高２８μｌ）の混合；及び６０μｇのＲＮＡでは、３７℃で、３０分間のインキュベーション、または１８０μｇのＲＮＡでは、最高２時間のインキュベーションを含むことができる。
次いで、ポリヌクレオチドを、製造業者の指示に従って、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して、精製することができる。クリーンアップした後に、ＲＮＡを、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して定量し、アガロースゲル電気泳動で分析することで、ＲＮＡが適切なサイズであり、ＲＮＡの分解が起こっていないことを確認することができる。ＲＮＡ産物を、配列決定のためのｃＤＮＡを生成するために、逆転写ＰＣＲを実行することにより、配列決定することもできる。
実施例５
ポリＡ尾部反応
ｃＤＮＡがポリＴを含んでいなければ、ポリＡ尾部反応は、最終産物を洗浄する前に実施しなければならない。この反応は、キャップ化ＩＶＴ ＲＮＡ（１００μｌ）；ＲＮアーゼ阻害剤（２０Ｕ）；１０×尾部緩衝剤（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）；２０ｍＭ ＡＴＰ（６．０μｌ）；ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）；最高１２３．５μＬのｄＨ２Ｏを混合することと、３７℃で、３０分間のインキュベーションをして行うことができる。ポリＡ尾部が転写物に既に存在する場合、尾部反応をスキップし、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）（最大５００μｇ）を使用するクリーンアップに直接進むことができる。ポリＡポリメラーゼは、一部の事例では、酵母で発現する組換え酵素である。
ポリＡ尾部反応の進行性または完全性は、正確なサイズのポリＡ尾部を常にもたらすわけではない、ことを理解すべきである。したがって、概ね４０～２００ヌクレオチド、例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１５０～１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、または１６５のポリＡ尾部は、本発明の範囲内である。
実施例６
天然５’キャップ、及び５’キャップアナログ
ポリヌクレオチドの５’キャッピングを、製造業者のプロトコルに従って、５’－グアノシンキャップ構造を生成するために、以下の化学的ＲＮＡキャップアナログを使用して、インビトロ転写反応中に付随して完了させることができる：３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。修飾ＲＮＡの５’－キャッピングは、「Ｃａｐ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を生成するために、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して転写後に完了させることができる。Ｃａｐ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素、及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼの両方を使用して、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成することができる。Ｃａｐ２構造を、Ｃａｐ１構造から生成し、続いて、２’－Ｏ メチルトランスフェラーゼを使用して、５’末端から３番目のヌクレオチドを、２’－Ｏ－メチル化することができる。Ｃａｐ３構造を、Ｃａｐ２構造から生成し、続いて、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼを使用して、５’末端から４番目のヌクレオチドを、２’－Ｏ－メチル化することができる。酵素は、組換え供給源に由来するものとすることができる。
哺乳動物細胞にトランスフェクトする場合、修飾ｍＲＮＡは、１２～１８時間、または１８時間を超える、例えば、２４、３６、４８、６０、７２、または７２時間を超える安定性を有することができる。
実施例７
キャッピングアッセイ
Ａ．タンパク質発現アッセイ
本明細書で教示したキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、等濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクションをした後の６、１２、２４、及び／または３６時間目に、培養培地に分泌されたタンパク質の量を、ＥＬＩＳＡでアッセイすることができる。より高レベルのタンパク質を培地に分泌する合成ポリヌクレオチドは、より高い翻訳能力を有するＣａｐ構造を有する合成ポリヌクレオチドに対応するであろう。
Ｂ．純度分析合成
本明細書で教示したキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、変性アガロース－尿素ゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析を使用して、純度について比較することができる。電気泳動による単一のまとまったバンドを有するポリヌクレオチドは、複数のバンドまたはストリーキングバンドを有するポリヌクレオチドと比較して、より高純度の産物に対応する。単一のＨＰＬＣピークを有する合成ポリヌクレオチドは、より高純度の産物にも対応する。より高い効率でのキャッピング反応は、より純粋なポリヌクレオチド集団を提供するであろう。
Ｃ．サイトカイン分析
本明細書で教示したキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、複数の濃度で、細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクションした後の６、１２、２４、及び／または３６時間目に、培地に分泌されたＴＮＦ－アルファ、及びＩＦＮ－ベータなどの炎症誘発性サイトカインの量を、ＥＬＩＳＡでアッセイすることができる。より高レベルの炎症誘発性サイトカインの培地への分泌をもたらすポリヌクレオチドは、免疫活性化キャップ構造を含有するポリヌクレオチドに対応するであろう。
Ｄ．キャッピング反応効率
本明細書で教示したキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ヌクレアーゼ処理した後に、ＬＣ－ＭＳにより、キャッピング反応効率について分析することができる。キャップ化ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理は、遊離ヌクレオチド、及びＬＣ－ＭＳで検出可能なキャップ化５’－５－トリホスファートキャップ構造体の混合物をもたらすであろう。ＬＣ－ＭＳスペクトルでのキャップ化産物の量は、反応由来の総ポリヌクレオチドのパーセントとして表することができ、キャッピング反応効率に対応するであろう。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造は、ＬＣ－ＭＳによると、より多量のキャップ化産物を有するであろう。
実施例８
修飾ＲＮＡ、またはＲＴ ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
個々のポリヌクレオチド（２０μｌの体積に２００～４００ｎｇ）、または逆転写ＰＣＲ産物（２００～４００ｎｇ）を、ウェルでの非変性１．２％のアガロースＥ－Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に加えて、製造業者のプロトコルに従って、１２～１５分間にわたって実行することができる。
実施例９
ナノドロップ修飾ＲＮＡ定量、及びＵＶスペクトルデータ
修飾ポリヌクレオチドを含むＴＥ緩衝剤（１μｌ）を使用して、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＵＶ吸光度読み取りを行うことで、化学合成またはインビトロ転写反応でのそれぞれのポリヌクレオチドの収率を定量することができる。
実施例１０
リピドイドを使用した修飾ｍＲＮＡの製剤
ポリヌクレオチドを、細胞に添加する前に、ポリヌクレオチドを、リピドイドと規定の比で混合することにより、インビトロ実験のために製剤することができる。インビボ製剤は、身体全体での循環を促すために特別な成分の添加を必要とすることができる。これらのリピドイドについて、インビボ研究に適した粒子の形成能力を試験するために、ｓｉＲＮＡ－リピドイド製剤に使用する標準的な製剤プロセスを、出発点として使用することができる。粒子を形成した後に、ポリヌクレオチドを、添加し、複合体を一体化させることができる。封入効率は、標準的な色素排除アッセイを使用して決定することができる。
実施例１１
タンパク質発現のスクリーニング方法
Ａ．エレクトロスプレーイオン化
対象に対して投与したポリヌクレオチドがコードするタンパク質を含むことができる生物学的試料は、１つ、２つ、３つ、または４つの質量分析計を使用したエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のための製造業者のプロトコルに従って、調製及び分析することができる。生物学的試料は、タンデムＥＳＩ質量分析システムを使用して、分析することもできる。
タンパク質フラグメント、またはタンパク質全体のパターンを、所定のタンパク質の公知のコントロールと比較することができ、また、比較によって同一性を決定することができる。
Ｂ．マトリックス支援レーザー脱離／イオン化
対象に対して投与した１つ以上のポリヌクレオチドがコードするタンパク質を含むことができる生物学的試料を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）の製造業者のプロトコルに従って、調製及び分析することができる。
タンパク質フラグメント、またはタンパク質全体のパターンを、所定のタンパク質の公知のコントロールと比較することができ、また、比較によって同一性を決定することができる。
Ｃ．液体クロマトグラフィー－質量分析－質量分析
１つ以上のポリヌクレオチドがコードするタンパク質を含むことができる生物学的試料を、トリプシン酵素で処理して、そこに含まれるタンパク質を消化することができる。得られたペプチドは、液体クロマトグラフィー－質量分析－質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）で分析できる。それらのペプチドを、質量分析計で断片化して、コンピューターアルゴリズムを介してタンパク質配列データベースと照合することができる診断パターンを生成できる。消化した試料は、所定のタンパク質の出発物質が１ｎｇ以下になるまで希釈することができる。単純なバッファーバックグラウンド（例えば、水、または揮発性塩）を含む生物学的試料は、溶液での直接消化に適している；より複雑なバックグラウンド（例えば、界面活性剤、不揮発性塩、グリセロール）では、試料分析を促すためのさらなるクリーンアップステップが必要である。
タンパク質フラグメント、またはタンパク質全体のパターンを、所定のタンパク質の公知のコントロールと比較することができ、また、比較によって同一性を決定することができる。
実施例１２
ＵＧＴ１Ａ１をコードするｍＲＮＡの合成
ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする配列最適化ｍＲＮＡを、後述する実施例のために調製し、そして、実施例１～１１に記載するようにして合成と、特徴決定を行った。
ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードするｍＲＮＡは、例えば、配列番号１に示したＯＲＦ配列（アミノ酸）を使用して構築することができる。このｍＲＮＡ配列は、ＯＲＦ配列（ヌクレオチド）に隣接する５’及び３’ＵＴＲ領域の両方を含む。例示的なコンストラクトにおいて、５’ＵＴＲ、及び３’ＵＴＲ配列は、それぞれ、配列番号３、及び１５１である。
５’ＵＴＲ：
ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３）
３’ＵＴＲ：
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１５１）
別の例示的なコンストラクトでは、５’ＵＴＲ、及び３’ＵＴＲ配列は、それぞれ、配列番号３、及び１５０である（以下を参照されたい）：
５’ＵＴＲ：
ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３）
３’ＵＴＲ：
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１５０）
別の例示的なコンストラクトでは、５’ＵＴＲ、及び３’ＵＴＲ配列は、それぞれ、配列番号３、及び１７８である（以下を参照されたい）：
５’ＵＴＲ：
ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３）
３’ＵＴＲ：
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１７８）
ＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ配列を、修飾ｍＲＮＡとして調製する。具体的には、インビトロ転写の間に、修飾したｍＲＮＡを、Ｎ１－メチルシュードウリジン－５’－三リン酸を使用して生成して、ｍＲＮＡが、ウリジンの代わりに１００％のＮ１－メチルシュードウリジンを含むことを確実にすることができる。あるいは、インビトロ転写の間に、修飾したｍＲＮＡを、Ｎ１－メトキシウリジン－５’－三リン酸を使用して生成して、ｍＲＮＡが、ウリジンの代わりに１００％の５－メトキシウリジンを含むことを確実にすることができる。さらに、ＵＧＴ１Ａ１－ｍＲＮＡを、ポリＡ尾部を導入するプライマーで合成することができ、また、ワクシニアウイルスキャッピング酵素と、２’－Ｏメチル－トランスフェラーゼを使用して、両方のｍＲＮＡにキャップ１構造；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成する。
実施例１３
インビトロでの内因性ＵＧＴ１Ａ１発現の検出
ＵＧＴ１Ａ１の発現は、マウスとヒトの両方に由来する様々な細胞株で特徴決定している。細胞を、標準的な条件で培養し、そして、細胞抽出物は、細胞を溶解緩衝剤に入れて得ることができる。比較のために、適切なコントロールも準備する。ＵＧＴ１Ａ１の発現を分析するために、溶解物試料を、試験細胞から調製し、そして、ドデシル硫酸リチウム試料ローディング緩衝剤と混合し、そして、標準的なウエスタンブロット分析に供する。ＵＧＴ１Ａ１の検出に使用する抗体は、市販の抗ＵＧＴ１Ａ１抗体である。ロードコントロールの検出に使用する抗体は、抗グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）抗体である。
内因性ＵＧＴ１Ａ１発現は、ＵＧＴ１Ａ１をコードする核酸を含むｍＲＮＡによるトランスフェクションに起因するＵＧＴ１Ａ１発現の変化を決定するためのベースラインとして使用できる。
実施例１４
ヒトＵＧＴ１Ａ１変異体及びキメラコンストラクト
本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードする連結したヌクレオシドの少なくとも第１の領域を含むことができ、このものは、上記実施例に従って構築、発現、及び特徴決定することができる。同様に、ポリヌクレオチド配列は、増大した活性、または減少した活性を有するヒトＵＧＴ１Ａ１の発現を招く１つ以上の変異を含むことができる。さらに、ＵＧＴ１Ａ１をコードするポリヌクレオチド配列は、キメラ融合タンパク質をコードするコンストラクトの一部とすることができる。
実施例１５
ナノ粒子組成物の製造
Ａ．ナノ粒子組成物の製造
ナノ粒子は、マイクロ流体技術、及び一方にポリヌクレオチド、他方に脂質成分を含む、２つの流体のＴ字ジャンクションでの混合などの混合プロセスで作り出することができる。
脂質組成物は、本明細書で開示したイオン化可能なアミノ脂質：例えば、化合物ＩＩなどの式（Ｉ）による脂質、または化合物ＶＩなどの式（ＩＩＩ）による脂質、リン脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬから入手可能なＤＯＰＥ、またはＤＳＰＣなど）、ＰＥＧ脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬから入手可能な１，２ジミリストイルｓｎグリセロールメトキシポリエチレングリコール、別名、ＰＥＧ－ＤＭＧ）、及び構造脂質（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能なコレステロール、またはコルチコステロイド（プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、及びヒドロコルチゾン）、またはそれらの組合せ）を、エタノールにおいて約５０ｍＭの濃度で、組み合わせて調製する。溶液は、例えば－２０℃で保存するために冷蔵すべきである。脂質を組み合わせて所望のモル比を生成し、そして、水及びエタノールで希釈して、最終脂質濃度を、約５．５ｍＭ～約２５ｍＭにする。
ポリヌクレオチドと、脂質組成物を含むナノ粒子組成物は、脂質溶液を、脂質組成物対ポリヌクレオチドの重量：重量比が、約５：１～約５０：１であるポリヌクレオチドを含む溶液と組み合わせて調製する。脂質溶液は、ナノアセンブリマイクロ流体をベースとしたシステムを使用して、約１０ｍｌ／分から約１８ｍｌ／分の流量で、ポリヌクレオチド溶液に迅速に注入して、水対エタノール比が、約１：１～約４：１の懸濁液を生成する。
ＲＮＡを含むナノ粒子組成物については、脱イオン水での０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＮＡの溶液を、ｐＨ３～４の５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤で希釈して、原液を形成する。
ナノ粒子組成物は、エタノールを除去し、そして、緩衝液交換を達成するための透析によって処理することができる。製剤を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に対して、分子量カットオフ１０ｋＤのＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、一次産物の２００倍の体積で２回透析する。最初の透析は、室温で、３時間行う。次に、製剤を、４℃で、一晩透析する。得られたナノ粒子懸濁液を、０．２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で濾過してガラスバイアルに入れ、そして、クリンプクロージャーで密封する。一般的に、０．０１ｍｇ／ｍｌ～０．１０ｍｇ／ｍｌのナノ粒子組成溶液が得られる。
上記した方法は、ナノ沈殿と粒子形成を誘発する。Ｔ字ジャンクションや直接注入などの代替プロセスを使用して、同じナノ沈殿を達成することができるが、これらのプロセスに限定されない。
Ｂ．ナノ粒子組成物の特徴決定
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａ１ｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、ナノ粒子組成物の粒子サイズ、多分散度指数（ＰＤＩ）、及びゼータ電位を決定することができ、粒子サイズの決定には１×ＰＢＳ、及びゼータ電位の決定には１５ｍＭ ＰＢＳでのナノ粒子組成物を使用する。
紫外可視分光法を使用して、ナノ粒子組成物でのポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）の濃度を決定することができる。１×ＰＢＳで希釈した製剤１００μＬを、メタノールとクロロホルムの４：１（ｖ／ｖ）混合物の９００μＬに加える。混合した後の、溶液の吸光度スペクトルを、例えば、ＤＵ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）で、２３０ｎｍ～３３０ｎｍで記録する。ナノ粒子組成物でのポリヌクレオチドの濃度は、組成物で使用するポリヌクレオチドの吸光係数、及び例えば、２６０ｎｍの波長での吸光度と、例えば、３３０ｎｍの波長でのベースライン値との間の差異に基づいて計算することができる。
ＲＮＡを含むナノ粒子組成物については、ＱＵＡＮＴ－ＩＴ（商標）ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ナノ粒子組成によるＲＮＡのカプセル化を評価できる。試料を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で、約５μｇ／ｍＬの濃度に希釈する。５０μＬの希釈試料を、ポリスチレン９６ウェルプレートに移し、そして、５０μＬのＴＥ緩衝剤、または５０μＬの２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液のいずれかを、ウェルに加える。プレートを、３７℃の温度で、１５分間インキュベーションする。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）試薬を、ＴＥ緩衝剤で、１：１００に希釈し、この溶液の１００μＬを、それぞれのウェルに加える。蛍光強度は、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、例えば、約４８０ｎｍの励起波長、及び例えば、約５２０ｎｍの発光波長で測定することができる。試薬ブランクの蛍光値を、それぞれの試料の蛍光値から控除し、そして、インタクトの試料（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加していない）の蛍光強度を、（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を加えて）攪乱させた試料の蛍光値で割ることで、遊離ＲＮＡのパーセンテージを決定する。
ナノ粒子組成物の例示的な組成を、以下の表６に示す。用語「化合物」は、ＭＣ３、化合物ＩＩ、または化合物ＶＩなどのイオン化可能な脂質のことを指す。「リン脂質」は、ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥとすることができる。「ＰＥＧ－脂質」は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉとすることができる。
表６．ナノ粒子の例示的な組成
Figure 2025028860000099



Figure 2025028860000100


実施例１６
コドン最適化、ｍｉＲＮＡを標的としたＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現と、インビボでの有効性
コドン最適化の影響と、ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードする修飾ｍＲＮＡの３’ＵＴＲへのｍｉＲＮＡ－１４２標的部位の取り込みの影響を評価するために、ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードするバリアントｍＲＮＡ（配列番号１８、２８、及び２９（Ｇ５化学構造））を、ガンラットに対して投与した。使用したコンストラクトは、次のとおりである。
ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードする修飾したｍＲＮＡである、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１（配列番号２９（Ｇ５化学構造））。
ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードする修飾したコドン最適化ｍＲＮＡである、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２（配列番号１８（Ｇ５化学構造））。
ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードし、かつ、３’ＵＴＲにｍｉＲＮＡ－１４２標的部位を含む、修飾したコドン最適化ｍＲＮＡである、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００３（配列番号２８（Ｇ５化学構造））。
これらのｍＲＮＡを、０．２ｍｇ／ｋｇの用量で脂質ナノ粒子（ＭＣ３を含む）に取り込んで製剤したものを、ガンラットの尾静脈を介して、０日目に静脈内注射した。コントロールとして、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または０．２ｍｇ／ｋｇの用量で脂質ナノ粒子（ＭＣ３を含む）に取り込んで製剤したルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ、またはラットＵＧＴ１Ａ１をコードするｍＲＮＡを、尾静脈を介して、０日目に、ラットに対して静脈内注射した。ラットでのＵＧＴ１Ａ１活性の持続時間を評価するために、ｍＲＮＡの投与前、そして、ｍＲＮＡを投与して１、７、１１、１４、２１、及び２８日後にラットから採血した。血漿を血液から回収し、そして、血漿での総ビリルビンレベルを、ＵＶ検出を備えたＨＰＬＣ法で決定した。ラットを屠殺し、それらの脾臓を回収した。タンパク質試料を、脾臓ホモジネートから調製し、そして、脾臓のＵＧＴ１Ａ１のレベルを、キャピラリー電気泳動で決定した；ＥＲＰ７２を、定量時に正規化するためのハウスキーピングタンパク質として使用した。
図１は、３’ＵＴＲ中の修飾ｍｉＲＮＡ－１４２標的部位を有する（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００３、配列番号２８（Ｇ５化学構造））、またはそれを有さない（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２、配列番号１８（Ｇ５化学構造））ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードする修飾ｍＲＮＡ、またはヒトＵＧＴ１Ａ１をコードする修飾した非コドン最適化ｍＲＮＡ（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１、配列番号２９（Ｇ５化学構造））、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ、またはコントロールとしてのリン酸緩衝生理食塩水を投与した個々のラットの脾臓におけるヒトＵＧＴ１Ａ１のレベルを示す。ヒトＵＧＴ１Ａ１は、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２、及びｈＵＧＴ１Ａ１＿００３で治療したラットの脾臓で検出した。しかしながら、ヒトＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲへのｍｉＲＮＡ－１４２標的部位の取り込みは、脾臓ホモジネートにおけるヒトＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現を有意に減少させた（図１のｈＵＧＴ１Ａ１＿００３を参照されたい）。
図２は、示した時点で採取した血漿での総ビリルビンのレベル（ｍｇ／ｄＬ）を示している。ヒト、またはラットＵＧＴ１Ａ１をコードするｍＲＮＡを投与したラットは、ｍＲＮＡの単回投与後に、血漿総ビリルビンレベルの低下を示した。修飾したコドン最適化ヒトＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２（配列番号１８（Ｇ５化学構造））を単回投与したラットは、修飾した非コドン最適化ヒトＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ（ｈＵＧＴ１０１（配列番号２９（Ｇ５化学構造））を単回投与したラットと比較して、血漿総ビリルビンレベルに関して、より長い効果期間を示した。さらに、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１（配列番号２９（Ｇ５化学構造））と比較して、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２（配列番号１８（Ｇ５化学構造））では、３０％のＡＵＥＣ０－２８日の減少が認められた。さらに、野生型コントロール（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１（配列番号２９（配列番号２９））と比較して、ｍＲＮＡ（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００３（配列番号２８（Ｇ５化学構造））を含むｍｉＲ１４２．３ｐ標的部位の抗ＵＧＴ１Ａ１シグナルに関して、有意な減少が認められた（データ示さず）。
実施例１７
ＣＮ－１モデルラットにおけるヒトＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡコンストラクトの複数回投与の効果
ＣＮ－１のラットモデルにおけるＵＧＴ１Ａ１の複数回投与の効果の持続時間を評価するために、実施例１６に記載した実験でのラットに、ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードする修飾ｍＲＮＡ、またはコントロールとしてＰＢＳ、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ、またはラットＵＧＴ１Ａ１をコードするｍＲＮＡの追加用量を注射した。さらなる注射は、最初の注射の３５、４９、及び６３日後に実施した。３６、４２、４８、５０、５６、６２、及び６４日目にラットから採血し、そして、血漿を回収した。採取した血漿での総ビリルビンレベルを、実施例１６に記載したようにして決定した。
図３は、示した時点で採取した血漿での総ビリルビンのレベル（ｍｇ／ｄＬ）を示している。単回投与試験（実施例１６、図２を参照されたい）と同様に、ヒトＵＧＴ１Ａ１（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１（配列番号２９（Ｇ５化学構造））、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２（配列番号１８（Ｇ５化学構造））、及び（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００３、配列番号２８（Ｇ５化学構造）））、またはラットＵＧＴ１Ａ１（ｒＵＧｔ１Ａ１）をコードするｍＲＮＡを投与したラットは、血漿総ビリルビンレベルの低下を示した。修飾したコドン最適化ヒトＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ（ｈＵＧＴ１Ａ１００２（配列番号１８（Ｇ５化学構造）））を複数回投与したラットは、修飾した非コドン最適化ヒトＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１（配列番号２９（Ｇ５化学構造）））を複数回投与したラットと比較して、複数回投与治療の間、総ビリルビンのレベルの減少において改善した効率を示した。さらに、修飾したコドン最適化ヒトＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２（配列番号１８（Ｇ５化学構造）））コンストラクトは、複数回のｍＲＮＡ投与（３回投与）をした後の修飾した非コドン最適化ヒトＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１（配列番号２９（Ｇ５化学構造）））コンストラクトと比較して、４６％のＡＵＥＣ３５－６４日の減少が認められた。
実施例１８
ＣＮ－１モデルラットにおけるポリＡ、及びポリＡ／ＵバリアントヒトＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ
ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードする修飾したｍＲＮＡでのポリＡ、及びポリＡ／Ｕトラクトの影響を評価するために、ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードするバリアントｍＲＮＡ（配列番号１４、１５、１８～２２、及び２９（Ｇ５化学構造））をガンラットに投与した。使用するコンストラクトは、次のとおりである：
ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１（上記実施例１６で説明したもの）；
ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２（上記実施例１６で説明したもの）；
ｈＵＧＴ１Ａ１＿００４（配列番号２０（Ｇ５化学構造））であり、これは、ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードし、かつ、ｍＲＮＡにポリＡトラクトを欠いている、修飾したコドン最適化ｍＲＮＡである；
ｈＵＧＴ１Ａ１＿００５（配列番号２２（Ｇ５化学構造））であり、これは、ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードし、かつ、ｍＲＮＡにポリＡ／Ｕトラクトを欠いている、修飾したコドン最適化ｍＲＮＡである；
ｈＵＧＴ１Ａ１＿００６（配列番号１９（Ｇ５化学構造））であり、これは、ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードし、ｍＲＮＡにポリＡトラクトを欠いており、そして、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにｍｉＲ－１４２標的部位を含む、修飾したコドン最適化ｍＲＮＡである；
ｈＵＧＴ１Ａ１＿００７（配列番号２ｌ（Ｇ５化学構造））であり、これは、ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードし、ｍＲＮＡにポリＡ／Ｕトラクトを欠いており、そして、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにｍｉＲ－１４２標的部位を含む、修飾したコドン最適化ｍＲＮＡである；
ｈＵＧＴ１Ａ１＿００８（配列番号１５（Ｇ５化学構造））であり、これは、ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードし、かつ、ｍＲＮＡにポリＡトラクトを欠いている、修飾したコドン最適化ｍＲＮＡである；及び
ｈＵＧＴ１Ａ１＿００９（配列番号１４（Ｇ５化学構造））であり、これは、ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードし、ｍＲＮＡにポリＡ／Ｕトラクトを欠いており、そして、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにｍｉＲ－１４２標的部位を含む、修飾したコドン最適化ｍＲＮＡである。
これらのｍＲＮＡを、０．２ｍｇ／ｋｇの用量で脂質ナノ粒子（ＭＣ３を含む）に取り込んで製剤したものを、ガンラットの尾静脈を介して、静脈内注射した。コントロールとして、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、尾静脈を介して、ラットに対して静脈内注射した。ラットでのＵＧＴ１Ａ１活性の持続時間を評価するために、ｍＲＮＡの投与前、そして、ｍＲＮＡを投与して１、４、７、１１、１４、１８、２１、及び２５日後にラットから採血した。血漿を血液から回収し、そして、血漿での総ビリルビンレベルを、実施例１６に記載しているようにして決定した。
図４は、示した時点で採取した血漿中の総ビリルビンのレベル（ｍｇ／ｄＬ）を示している。
図５は、示した時点で採取した血漿中の総ビリルビンのレベル（ｍｇ／ｄＬ）を示している。
単回投与試験（実施例１６、図２を参照されたい）と同様に、ヒトＵＧＴ１Ａ１をコードするｍＲＮＡ（ｈＵＧＴ１Ａ１＿００１、ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２、及びｈＵＧＴ１Ａ１＿００４－ｈＵＧＴ１Ａ１＿００９（それぞれ、配列番号２９、１８、２０、２２、１９、２１、１５、及び１４（Ｇ５化学構造））の投与を受けたラットは、血漿総ビリルビンレベルの低下を示した。ポリＡ／Ｕを欠いており、かつ、３’ＵＴＲにｍｉＲＮＡ－１４２標的部位を含むヒトＵＧＴ１Ａ１をコードする修飾したｍＲＮＡの投与を受けたラットの総ビリルビンレベルの低下に関して、有効性の改善が認められた（図４）。
実施例１９
ＣＮ－１モデルラットにおけるヒトＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡによる治療と、光線療法による治療との比較
ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２（配列番号１８（Ｇ５化学構造））の有効性を、ＣＮ－１の標準治療と比較するために、ガンラットに対して、毎日、１０時間／日の光線療法による治療、または０．２ｍｇ／ｋｇのｈＵＧＴ１Ａ１＿００２（配列番号１８（Ｇ５化学構造））の尾静脈を介した単回静脈内への投与のいずれかを行った。ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＭＣ３を含む）で製剤した。コントロールとして、ガンラットに対して、リン酸緩衝生理食塩水の注射を行うか、あるいは、処置を行わなかった。治療して０、１、７、１４、２１、及び／または２８日後に、ラットの採血を行った。血清を回収し、血清に含まれる総ビリルビンレベルを、実施例１６に記載したようにして決定した。
図６は、示した時点で採取した血清に含まれる総ビリルビンのレベル（ｍｇ／ｄＬ）を示している。ｈＵＧＴ１Ａ１＿００２（配列番号１８（Ｇ５化学構造））の単回投与は、光線療法を毎日受けているガンラットと比較して、ガンラットの総血清ビリルビンを減少させる上でより効率的であった。
発明を実施するための形態の節は、特許請求の範囲の解釈のために使用することを目的としているが、発明の概要及び要約の節には、そのような目的はないことを理解されたい。概要及び要約の節では、本発明者（複数可）が企図する本発明の全部ではなく、１つ以上の例示的な実施形態を説明しており、したがって、本発明及び添付した特許請求の範囲の限定を決して意図するものではない。
本発明は、特定の機能、及び関係する実施態様を例示している機能的構成要素を利用して、上記したとおりに説明している。これらの機能的構成要素の境界を、説明の便宜のために、本明細書で任意に定義している。特定の機能と、その関係が適切なものである限りは、代替の境界を定義することができる。
上記した特定の実施形態の説明は、本発明の一般的な性質を十分に解明しているので、その他の者は、当該技術分野での技術の範囲内の知識を適用することで、本発明の一般的な概念を逸脱せずに、過度な実験を行うまでもなく、様々な用途に向けて、そのような特定の実施形態を容易に修正し、及び／またはこれらに適合させることができる。したがって、そのような適応及び修正は、本明細書に提示した教示及び指導に基づいて、開示した実施形態の意味の範囲、及びその均等物の範囲内にあるものとする。本明細書の語法または用語は、本明細書の用語または語法が、それら教示及び指導に照らして当業者が解釈するうえでの説明のためのものであり、制限を意図するものではない、ことを理解すべきである。
本発明の広さ、及び範囲は、上記した例示的な実施形態のいずれによっても制限されることはなく、以下の特許請求の範囲、及びそれらの等価物に従ってのみ定義されるべきである。
本明細書に記載したすべての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参照文献を、その全内容を参照により本明細書で援用する。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が優先するものとする。
本開示は、１型クリグラー－ナジャー症候群（ＣＮ－１）の治療のためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療法を提供する。この技術が、ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの細胞内送達と、それに続く、標的細胞内での機能的ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドのデノボ合成を提供するので、本発明のｍＲＮＡ治療法は、特に、ＣＮ－１の治療に好適である。本発明は、治療用ｍＲＮＡに修飾ヌクレオチドを組み込んで、（１）望ましくない免疫活性化（例えば、外来核酸のインビボ導入に関連する自然免疫応答）を最小化し、及び（２）ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳効率を最適化することを特徴とする。本開示の例示的な態様は、特に、タンパク質発現を強めるＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドをコードする治療用ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内で、自然免疫応答と、配列最適化とを抑制するヌクレオチド修飾の組合せを特徴とする。
本開示は、以下の態様を提供し得る。
［項１］
ｍＲＮＡを含む医薬組成物であって、前記ｍＲＮＡは、ヒトウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、前記組成物の、それを必要とするヒト対象に対する、単回静脈内投与での投与が：
（ｉ）肝臓組織でのＵＧＴ１Ａ１活性のレベルを、投与した後の少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、正常なＵＧＴ１Ａ１活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％以内で引き上げる；
（ｉｉ）肝臓組織でのＵＧＴ１Ａ１活性のレベルを、投与した後の少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、１型クリグラー－ナジャー症候群（ＣＮ－１）を有するヒト対象でのヒト対象のベースラインＵＧＴ１Ａ１活性レベル、または参照ＵＧＴ１Ａ１活性レベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍に引き上げる：
（ｉｉｉ）ビリルビンの血中、血漿、及び／または血清レベルを、投与した後の少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、ＣＮ－１を有するヒト対象でのヒト対象のビリルビンのベースライン血中、血漿、及び／または血清レベル、または参照血中、血漿、及び／または血清ビリルビンレベルと比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％下げる；
（ｉｖ）ビリルビンの血中、血漿、及び／または血清レベルを、投与した後の少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、ＣＮ－１を有する患者でのヒト対象のビリルビンのベースライン血中、血漿、及び／または血清レベル、または参照血中、血漿、及び／または血清ビリルビンレベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍下げる；及び／または
（ｖ）ビリルビンの血中、血漿、及び／または血清レベルを、投与した後の少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、ＣＮ－１を有する患者において、０．１ｍｇ／ｄＬ、０．２ｍｇ／ｄＬ、０．３ｍｇ／ｄＬ、０．４ｍｇ／ｄＬ、０．５ｍｇ／ｄＬ、０．６ｍｇ／ｄＬ、０．７ｍｇ／ｄＬ、０．８ｍｇ／ｄＬ、０．９ｍｇ／ｄＬ、１．０ｍｇ／ｄＬ、１．５ｍｇ／ｄＬ、２．０ｍｇ／ｄＬ、２．５ｍｇ／ｄＬ、３．０ｍｇ／ｄＬ、４．０ｍｇ／ｄＬ、５．０ｍｇ／ｄＬ、７．５ｍｇ／ｄＬ、または１０．０ｍｇ／ｄＬ未満にまで下げる、には十分である、前記医薬組成物。
［項２］
前記ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、項１に記載の医薬組成物。
［項３］
前記ＯＲＦが、配列番号２、及び５～１２からなる群から選択する核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、項１または２に記載の医薬組成物。
［項４］
前記ｍＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む、先行項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［項５］
前記マイクロＲＮＡが、造血系免疫細胞、またはＴＬＲ７、及び／またはＴＬＲ８を発現し、かつ、炎症誘発性サイトカイン、及び／またはケモカインを分泌する細胞で発現する、項４に記載の医薬組成物。
［項６］
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２ｌ、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、ｍｉＲ－２６ａ、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロＲＮＡのためのものである、項４に記載の医薬組成物。
［項７］
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロＲＮＡのためのものである、項４に記載の医薬組成物。
［項８］
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位である、項４に記載の医薬組成物。
［項９］
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、前記ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、項４～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［項１０］
前記ｍＲＮＡが、３’ＵＴＲを含み、前記３’ＵＴＲが、配列番号４、１１１、１５０、１５１、１７５、１７７、１７８、１９５、または１９６の３’ＵＴＲ配列と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％が同一である核酸配列を含む、先行項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［項１１］
前記ｍＲＮＡが、５’ＵＴＲを含み、前記５’ＵＴＲが、配列番号３、３９、１９３、または１９４の５’ＵＴＲ配列と、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％が同一である核酸配列を含む、先行項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［項１２］
前記ｍＲＮＡが、５’末端キャップを含む、先行項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［項１３］
前記５’末端キャップが、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む、項１２に記載の医薬組成物。
［項１４］
前記ｍＲＮＡが、ポリＡ領域を含む、先行項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［項１５］
前記ポリＡ領域が、長さが、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０個のヌクレオチド、または長さが、少なくとも約１００個のヌクレオチドである、項１４に記載の医薬組成物。
［項１６］
前記ポリＡ領域が、長さが、約１０～約２００、約２０～約１８０、約５０～約１６０、約７０～約１４０、または約８０～約１２０個のヌクレオチドである、項１４に記載の医薬組成物。
［項１７］
前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学的に修飾した核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらのいずれかの組合せを含む、先行項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［項１８］
少なくとも１つの化学的に修飾した前記核酸塩基を、シュードウラシル（Ψ）、Ｎ１メチルシュードウラシル（ｍ１Ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する、項１７に記載の医薬組成物。
［項１９］
前記ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％を、Ｎ１－メチルシュードウラシルに対して化学的に修飾している、項１７または１８に記載の医薬組成物。
［項２０］
送達剤をさらに含む、項１～１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［項２１］
前記送達剤が：
（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；
（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；
（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）化合物Ｉ；または
（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）化合物Ｉ、
を含む脂質ナノ粒子を含む、項２０に記載の医薬組成物。
［項２２］
前記ヒト対象が、１型クリグラー－ナジャー症候群（ＣＮ－１）を有する、項１～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［項２３］
（ｉ）５’ＵＴＲ；
（ｉｉ）ヒトウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、前記ＯＲＦは、配列番号２、及び５～１２からなる群から選択する核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、前記ＯＲＦ；
（ｉｉｉ）終止コドン；及び
（ｉｖ）３’ＵＴＲ。
を含む、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むポリヌクレオチド。
［項２４］
前記ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなる、項２３に記載のポリヌクレオチド。
［項２５］
前記ｍＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む、項２３または２４に記載のポリヌクレオチド。
［項２６］
前記マイクロＲＮＡが、造血系免疫細胞、またはＴＬＲ７、及び／またはＴＬＲ８を発現し、かつ、炎症誘発性サイトカイン、及び／またはケモカインを分泌する細胞で発現する、項２５に記載のポリヌクレオチド。
［項２７］
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２ｌ、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、ｍｉＲ－２６ａ、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロＲＮＡのためのものである、項２５に記載のポリヌクレオチド。
［項２８］
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロＲＮＡのためのものである、項２５に記載のポリヌクレオチド。
［項２９］
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位である、項２５に記載のポリヌクレオチド。
［項３０］
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、前記ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、項２５～２９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
［項３１］
前記３’ＵＴＲが、配列番号４、１１１、１５０、１５１、１７５、１７７、１７８、１９５、または１９６の３’ＵＴＲと、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％が同一である核酸配列を含む、項２３～３０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
［項３２］
前記５’ＵＴＲが、配列番号３、３９、１９３、１９４の５’ＵＴＲ配列と、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％が同一である核酸配列を含む、項２３～３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
［項３３］
前記ｍＲＮＡが、５’末端キャップを含む、項２３～３２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
［項３４］
前記５’末端キャップが、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む、項３３に記載のポリヌクレオチド。
［項３５］
前記ｍＲＮＡが、ポリＡ領域を含む、項２３～３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
［項３６］
前記ポリＡ領域が、長さが、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０個のヌクレオチド、または長さが、少なくとも約１００個のヌクレオチドである、項３５に記載のポリヌクレオチド。
［項３７］
前記ポリＡ領域が、長さが、約１０～約２００、約２０～約１８０、約５０～約１６０、約７０～約１４０、または約８０～約１２０個のヌクレオチドである、項３５に記載のポリヌクレオチド。
［項３８］
前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学的に修飾した核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらのいずれかの組合せを含む、項２３～３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
［項３９］
少なくとも１つの化学的に修飾した前記核酸塩基を、シュードウラシル（Ψ）、Ｎ１メチルシュードウラシル（ｍ１Ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する、項３８に記載のポリヌクレオチド。
［項４０］
前記ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％を、Ｎ１－メチルシュードウラシルに対して化学的に修飾している、項３８または３９に記載のポリヌクレオチド。
［項４１］
配列番号１４～２７からなる群から選択する核酸配列を含む、項２３に記載のポリヌクレオチド。
［項４２］
（ｉ）５’末端キャップ；
（ｉｉ）配列番号３、３９、１９３、または１９４の核酸配列を含む５’ＵＴＲ；
（ｉｉｉ）配列番号１のウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、前記ＯＲＦは、配列番号２、及び５～１２からなる群から選択する配列を含む、前記ＯＲＦ；
（ｉｖ）配列番号４、１１１、１５０、１５１、１７５、１７７、１７８、１９５、または１９６の核酸配列を含む３’ＵＴＲ；及び
（ｖｉ）ポリＡ領域、
を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むポリヌクレオチド。
［項４３］
前記５’末端キャップが、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む、項４２に記載のポリヌクレオチド。
［項４４］
前記ポリＡ領域が、長さが、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０個のヌクレオチド、または長さが、少なくとも約１００個のヌクレオチドである、項４２または４３に記載のポリヌクレオチド。
［項４５］
前記ポリＡ領域が、長さが、約１０～約２００、約２０～約１８０、約５０～約１６０、約７０～約１４０、または約８０～約１２０個のヌクレオチドである、項４２または４３に記載のポリヌクレオチド。
［項４６］
前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学的に修飾した核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらのいずれかの組合せを含む、項４２～４５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
［項４７］
少なくとも１つの化学的に修飾した前記核酸塩基を、シュードウラシル（Ψ）、Ｎ１メチルシュードウラシル（ｍ１Ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する、項４６に記載のポリヌクレオチド。
［項４８］
配列番号１４～２７からなる群から選択する核酸配列を含む、項４２に記載のポリヌクレオチド。
［項４９］
前記５’末端キャップが、Ｃａｐ１を含み、かつ、前記ポリヌクレオチドのすべてのウラシルが、Ｎ１－メチルシュードウラシルである、項４８に記載のポリヌクレオチド。
［項５０］
前記ポリＡ領域が、長さが、１００個のヌクレオチドである、項４９に記載のポリヌクレオチド。
［項５１］
項２３～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、送達剤を含む医薬組成物。
［項５２］
前記送達剤が：
（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；
（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；
（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）化合物Ｉ；または
（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）化合物Ｉ、
を含む脂質ナノ粒子を含む、項５１に記載の医薬組成物。
［項５３］
ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドの発現を、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に対して、有効量の項１～２２、５１、及び５２のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項２３～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与する、ことを含む前記方法。
［項５４］
１型クリグラー－ナジャー症候群（ＣＮ－１）の発症、及び／または進行の治療、予防、または遅延を、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に対して、有効量の項１～２２、５１、及び５２のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項２３～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与する、ことを含む前記方法。
［項５５］
ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドの活性を高めることを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に対して、有効量の項１～２２、５１、及び５２のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項２３～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与する、ことを含む前記方法。
［項５６］
ビリルビンレベルを下げることを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に対して、有効量の項１～２２、５１、及び５２のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項２３～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与する、ことを含む前記方法。
［項５７］
前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを対象に対して投与して２４時間後に、前記対象のビリルビンのレベルを、前記対象でのベースラインビリルビンと比較して、少なくとも約１００％、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約１０％下げる、項５３～５６のいずれか１項に記載の方法。
［項５８］
前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを前記対象に対して投与して２４時間後に、前記対象のビリルビンのレベルが、０．１ｍｇ／ｄＬ未満、０．２ｍｇ／ｄＬ未満、０．３ｍｇ／ｄＬ未満、０．４ｍｇ／ｄＬ未満、０．５ｍｇ／ｄＬ未満、０．６ｍｇ／ｄＬ未満、０．７ｍｇ／ｄＬ未満、０．８ｍｇ／ｄＬ未満、０．９ｍｇ／ｄＬ未満、１．０ｍｇ／ｄＬ未満、１．５ｍｇ／ｄＬ未満、２．０ｍｇ／ｄＬ未満、２．５ｍｇ／ｄＬ未満、３．０ｍｇ／ｄＬ未満、４．０ｍｇ／ｄＬ未満、５．０ｍｇ／ｄＬ未満、７．５ｍｇ／ｄＬ未満、または１０．０ｍｇ／ｄＬ未満である、項５６に記載の方法。
［項５９］
前記ビリルビンのレベルが、前記対象の血中で減少する、項５６～５８のいずれか１項に記載の方法。
［項６０］
前記ビリルビンが、総ビリルビンである、項５６～５９のいずれか１項に記載の方法。
［項６１］
ビリルビンのレベルの低下が、前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを投与してから少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、９６時間、１２０時間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、または２１日間持続する、項５６～６０のいずれか１項に記載の方法。
［項６２］
前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを前記対象に対して投与して２４時間後に、前記対象のＵＧＴ１Ａ１活性が、正常な個人のＵＧＴ１Ａ１活性の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％に増加する、項５３～６１のいずれか１項に記載の方法。
［項６３］
前記ＵＧＴ１Ａ１活性が、前記対象の心臓、肝臓、脳、または骨格筋で高まる、項６２に記載の方法。
［項６４］
高まった前記ＵＧＴ１Ａ１活性が、前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを対象に対して投与してから少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、９６時間、１２０時間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、または２１日間持続する、項６２または６３に記載の方法。
［項６５］
前記対象に対する前記投与が、週に約１回、２週間に約１回、または月に約１回である、項５３～６４のいずれか１項に記載の方法。
［項６６］
前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを、静脈内投与する、項５３～６５のいずれか１項に記載の方法。

Claims (66)

  1. ｍＲＮＡを含む医薬組成物であって、前記ｍＲＮＡは、ヒトウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、前記組成物の、それを必要とするヒト対象に対する、単回静脈内投与での投与が：
    （ｉ）肝臓組織でのＵＧＴ１Ａ１活性のレベルを、投与した後の少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、正常なＵＧＴ１Ａ１活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％以内で引き上げる；
    （ｉｉ）肝臓組織でのＵＧＴ１Ａ１活性のレベルを、投与した後の少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、１型クリグラー－ナジャー症候群（ＣＮ－１）を有するヒト対象でのヒト対象のベースラインＵＧＴ１Ａ１活性レベル、または参照ＵＧＴ１Ａ１活性レベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍に引き上げる：
    （ｉｉｉ）ビリルビンの血中、血漿、及び／または血清レベルを、投与した後の少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、ＣＮ－１を有するヒト対象でのヒト対象のビリルビンのベースライン血中、血漿、及び／または血清レベル、または参照血中、血漿、及び／または血清ビリルビンレベルと比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％下げる；
    （ｉｖ）ビリルビンの血中、血漿、及び／または血清レベルを、投与した後の少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、ＣＮ－１を有する患者でのヒト対象のビリルビンのベースライン血中、血漿、及び／または血清レベル、または参照血中、血漿、及び／または血清ビリルビンレベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍下げる；及び／または
    （ｖ）ビリルビンの血中、血漿、及び／または血清レベルを、投与した後の少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、または少なくとも２１日間は、ＣＮ－１を有する患者において、０．１ｍｇ／ｄＬ、０．２ｍｇ／ｄＬ、０．３ｍｇ／ｄＬ、０．４ｍｇ／ｄＬ、０．５ｍｇ／ｄＬ、０．６ｍｇ／ｄＬ、０．７ｍｇ／ｄＬ、０．８ｍｇ／ｄＬ、０．９ｍｇ／ｄＬ、１．０ｍｇ／ｄＬ、１．５ｍｇ／ｄＬ、２．０ｍｇ／ｄＬ、２．５ｍｇ／ｄＬ、３．０ｍｇ／ｄＬ、４．０ｍｇ／ｄＬ、５．０ｍｇ／ｄＬ、７．５ｍｇ／ｄＬ、または１０．０ｍｇ／ｄＬ未満にまで下げる、には十分である、前記医薬組成物。
  2. 前記ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記ＯＲＦが、配列番号２、及び５～１２からなる群から選択する核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 前記ｍＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 前記マイクロＲＮＡが、造血系免疫細胞、またはＴＬＲ７、及び／またはＴＬＲ８を発現し、かつ、炎症誘発性サイトカイン、及び／またはケモカインを分泌する細胞で発現する、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２ｌ、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、ｍｉＲ－２６ａ、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロＲＮＡのためのものである、請求項４に記載の医薬組成物。
  7. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロＲＮＡのためのものである、請求項４に記載の医薬組成物。
  8. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位である、請求項４に記載の医薬組成物。
  9. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、前記ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、請求項４～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. 前記ｍＲＮＡが、３’ＵＴＲを含み、前記３’ＵＴＲが、配列番号４、１１１、１５０、１５１、１７５、１７７、１７８、１９５、または１９６の３’ＵＴＲ配列と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％が同一である核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. 前記ｍＲＮＡが、５’ＵＴＲを含み、前記５’ＵＴＲが、配列番号３、３９、１９３、または１９４の５’ＵＴＲ配列と、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％が同一である核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  12. 前記ｍＲＮＡが、５’末端キャップを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  13. 前記５’末端キャップが、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 前記ｍＲＮＡが、ポリＡ領域を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  15. 前記ポリＡ領域が、長さが、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０個のヌクレオチド、または長さが、少なくとも約１００個のヌクレオチドである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記ポリＡ領域が、長さが、約１０～約２００、約２０～約１８０、約５０～約１６０、約７０～約１４０、または約８０～約１２０個のヌクレオチドである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  17. 前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学的に修飾した核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらのいずれかの組合せを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  18. 少なくとも１つの化学的に修飾した前記核酸塩基を、シュードウラシル（Ψ）、Ｎ１メチルシュードウラシル（ｍ１Ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 前記ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％を、Ｎ１－メチルシュードウラシルに対して化学的に修飾している、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
  20. 送達剤をさらに含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  21. 前記送達剤が：
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）化合物Ｉ；または
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）化合物Ｉ、
    を含む脂質ナノ粒子を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 前記ヒト対象が、１型クリグラー－ナジャー症候群（ＣＮ－１）を有する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  23. （ｉ）５’ＵＴＲ；
    （ｉｉ）ヒトウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、前記ＯＲＦは、配列番号２、及び５～１２からなる群から選択する核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、前記ＯＲＦ；
    （ｉｉｉ）終止コドン；及び
    （ｉｖ）３’ＵＴＲ。
    を含む、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むポリヌクレオチド。
  24. 前記ＵＧＴ１Ａ１ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
  25. 前記ｍＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む、請求項２３または２４に記載のポリヌクレオチド。
  26. 前記マイクロＲＮＡが、造血系免疫細胞、またはＴＬＲ７、及び／またはＴＬＲ８を発現し、かつ、炎症誘発性サイトカイン、及び／またはケモカインを分泌する細胞で発現する、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
  27. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２ｌ、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、ｍｉＲ－２６ａ、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロＲＮＡのためのものである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
  28. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロＲＮＡのためのものである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
  29. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位である、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
  30. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、前記ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、請求項２５～２９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  31. 前記３’ＵＴＲが、配列番号４、１１１、１５０、１５１、１７５、１７７、１７８、１９５、または１９６の３’ＵＴＲと、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％が同一である核酸配列を含む、請求項２３～３０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  32. 前記５’ＵＴＲが、配列番号３、３９、１９３、１９４の５’ＵＴＲ配列と、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％が同一である核酸配列を含む、請求項２３～３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  33. 前記ｍＲＮＡが、５’末端キャップを含む、請求項２３～３２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  34. 前記５’末端キャップが、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む、請求項３３に記載のポリヌクレオチド。
  35. 前記ｍＲＮＡが、ポリＡ領域を含む、請求項２３～３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  36. 前記ポリＡ領域が、長さが、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０個のヌクレオチド、または長さが、少なくとも約１００個のヌクレオチドである、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
  37. 前記ポリＡ領域が、長さが、約１０～約２００、約２０～約１８０、約５０～約１６０、約７０～約１４０、または約８０～約１２０個のヌクレオチドである、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
  38. 前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学的に修飾した核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項２３～３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  39. 少なくとも１つの化学的に修飾した前記核酸塩基を、シュードウラシル（Ψ）、Ｎ１メチルシュードウラシル（ｍ１Ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
  40. 前記ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％を、Ｎ１－メチルシュードウラシルに対して化学的に修飾している、請求項３８または３９に記載のポリヌクレオチド。
  41. 配列番号１４～２７からなる群から選択する核酸配列を含む、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
  42. （ｉ）５’末端キャップ；
    （ｉｉ）配列番号３、３９、１９３、または１９４の核酸配列を含む５’ＵＴＲ；
    （ｉｉｉ）配列番号１のウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、前記ＯＲＦは、配列番号２、及び５～１２からなる群から選択する配列を含む、前記ＯＲＦ；
    （ｉｖ）配列番号４、１１１、１５０、１５１、１７５、１７７、１７８、１９５、または１９６の核酸配列を含む３’ＵＴＲ；及び
    （ｖｉ）ポリＡ領域、
    を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むポリヌクレオチド。
  43. 前記５’末端キャップが、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
  44. 前記ポリＡ領域が、長さが、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０個のヌクレオチド、または長さが、少なくとも約１００個のヌクレオチドである、請求項４２または４３に記載のポリヌクレオチド。
  45. 前記ポリＡ領域が、長さが、約１０～約２００、約２０～約１８０、約５０～約１６０、約７０～約１４０、または約８０～約１２０個のヌクレオチドである、請求項４２または４３に記載のポリヌクレオチド。
  46. 前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学的に修飾した核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項４２～４５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  47. 少なくとも１つの化学的に修飾した前記核酸塩基を、シュードウラシル（Ψ）、Ｎ１メチルシュードウラシル（ｍ１Ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する、請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  48. 配列番号１４～２７からなる群から選択する核酸配列を含む、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
  49. 前記５’末端キャップが、Ｃａｐ１を含み、かつ、前記ポリヌクレオチドのすべてのウラシルが、Ｎ１－メチルシュードウラシルである、請求項４８に記載のポリヌクレオチド。
  50. 前記ポリＡ領域が、長さが、１００個のヌクレオチドである、請求項４９に記載のポリヌクレオチド。
  51. 請求項２３～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、送達剤を含む医薬組成物。
  52. 前記送達剤が：
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ－ＤＭＧ、または化合物Ｉ；
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）化合物Ｉ；または
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）化合物Ｉ、
    を含む脂質ナノ粒子を含む、請求項５１に記載の医薬組成物。
  53. ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドの発現を、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に対して、有効量の請求項１～２２、５１、及び５２のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２３～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与する、ことを含む前記方法。
  54. １型クリグラー－ナジャー症候群（ＣＮ－１）の発症、及び／または進行の治療、予防、または遅延を、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に対して、有効量の請求項１～２２、５１、及び５２のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２３～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与する、ことを含む前記方法。
  55. ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）ポリペプチドの活性を高めることを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に対して、有効量の請求項１～２２、５１、及び５２のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２３～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与する、ことを含む前記方法。
  56. ビリルビンレベルを下げることを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に対して、有効量の請求項１～２２、５１、及び５２のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２３～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与する、ことを含む前記方法。
  57. 前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを対象に対して投与して２４時間後に、前記対象のビリルビンのレベルを、前記対象でのベースラインビリルビンと比較して、少なくとも約１００％、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約１０％下げる、請求項５３～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを前記対象に対して投与して２４時間後に、前記対象のビリルビンのレベルが、０．１ｍｇ／ｄＬ未満、０．２ｍｇ／ｄＬ未満、０．３ｍｇ／ｄＬ未満、０．４ｍｇ／ｄＬ未満、０．５ｍｇ／ｄＬ未満、０．６ｍｇ／ｄＬ未満、０．７ｍｇ／ｄＬ未満、０．８ｍｇ／ｄＬ未満、０．９ｍｇ／ｄＬ未満、１．０ｍｇ／ｄＬ未満、１．５ｍｇ／ｄＬ未満、２．０ｍｇ／ｄＬ未満、２．５ｍｇ／ｄＬ未満、３．０ｍｇ／ｄＬ未満、４．０ｍｇ／ｄＬ未満、５．０ｍｇ／ｄＬ未満、７．５ｍｇ／ｄＬ未満、または１０．０ｍｇ／ｄＬ未満である、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記ビリルビンのレベルが、前記対象の血中で減少する、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記ビリルビンが、総ビリルビンである、請求項５６～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. ビリルビンのレベルの低下が、前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを投与してから少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、９６時間、１２０時間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、または２１日間持続する、請求項５６～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを前記対象に対して投与して２４時間後に、前記対象のＵＧＴ１Ａ１活性が、正常な個人のＵＧＴ１Ａ１活性の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％に増加する、請求項５３～６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記ＵＧＴ１Ａ１活性が、前記対象の心臓、肝臓、脳、または骨格筋で高まる、請求項６２に記載の方法。
  64. 高まった前記ＵＧＴ１Ａ１活性が、前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを対象に対して投与してから少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、９６時間、１２０時間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、または２１日間持続する、請求項６２または６３に記載の方法。
  65. 前記対象に対する前記投与が、週に約１回、２週間に約１回、または月に約１回である、請求項５３～６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを、静脈内投与する、請求項５３～６５のいずれか１項に記載の方法。
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