JP2024544418A - グルカゴン様ペプチド２（ｇｌｐ－２）アナログを合成するためのプロセス - Google Patents

Abstract

本発明は、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）アナログ、例えばグレパグルチドを得るためのプロセスに関する。特に、本明細書に記載のプロセスは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成されるＧＬＰ－２アナログのマルチステップ精製方法を使用する。【選択図】図１

Description

本発明は、グルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）アナログを得るためのプロセスに関する。

ヒトＧＬＰ－２は、３３アミノ酸のペプチドであり、以下の配列：Ｈｙ－Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｓｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－ＯＨ（配列番号１０）（ここで、Ｈｙは水素である）を有する。これは、腸の腸内分泌Ｌ細胞および脳幹の特定領域における、プログルカゴンの特異的な翻訳後プロセシングに由来する。ＧＬＰ－２は、クラスＩＩグルカゴン・セクレチン・ファミリーに属する単一のＧタンパク質共役型受容体に結合する。

ＧＬＰ－２は、陰窩における幹細胞増殖の刺激、および絨毛におけるアポトーシスの抑制を介して、小腸粘膜上皮の著しい増殖を誘導することが報告されている（Ｄｒｕｃｋｅｒら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：７９１１～７９１６）。ＧＬＰ－２はまた、結腸を成長させる効果もある。さらに、ＧＬＰ－２は胃内容排出および胃酸分泌を抑制し（Ｗｏｊｄｅｍａｎｎら、１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８４：２５１３～２５１７）、腸管バリア機能を増強し（Ｂｅｎｊａｍｉｎら、２０００、Ｇｕｔ ４７：１１２～１１９）、グルコーストランスポーターのアップレギュレーションを介して腸管ヘキソース輸送を刺激し（Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒ１９６５～７１）、腸管血流を増加させる（Ｇｕａｎら、２００３、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１２５：１３６～１４７）。

グルカゴン様ペプチド－２受容体アナログが腸疾患の処置の治療可能性を有することは、当技術分野において認識されている。しかしながら、３３アミノ酸の消化管ペプチドである天然のｈＧＬＰ－２は、ヒトでの半減期が全長ＧＬＰ－２で約７分［１－３３］、切断型ＧＬＰ－２で約２７分［３－３３］と非常に短いため、臨床現場ではあまり有用でない。大部分では、半減期の短さは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）という酵素による分解によるものである。したがって、当技術分野では、より優れた薬物動態学的特性を有するＧＬＰ－２受容体アゴニストを開発すること、特にＧＬＰ－２分子の半減期を改善することが試みられてきた。例として、置換を有するＧＬＰ－２アナログは、例えば、半減期を７分（天然のＧＬＰ－２）から約２時間に延長する２位にＧｌｙ置換を含むＧＬＰ－２アナログ（［ｈＧｌｙ２］ＧＬＰ－２、テデュグルチド）などが示唆されている。脂肪酸鎖によるペプチド薬物のアシル化は、生物学的効力を破壊することなく、全身循環を延長するために、ならびに酵素的安定性を高めるために有益であることも証明されている。しかしながら、これらの試みはＧＬＰ－２アナログの薬物動態を改善し、当技術分野では「長時間作用性」と記述されることもあるが、これは半減期が数分ではなく数時間のオーダーである天然のｈＧＬＰ－２との比較であることを念頭に置く必要がある。このことは、ＧＬＰ－２アナログを依然として患者に１日あたり１回または複数回投与する必要があることを意味する。

ＷＯ２００６／１１７５６５には、［ｈＧｌｙ^２］ＧＬＰ－２と比較して１つまたは複数の置換を含み、インビボでの生物学的活性を改善し、および／または例えばインビトロ安定性アッセイで評価される化学的安定性を改善したＧＬＰ－２アナログが記載されている。特に、野生型ＧＬＰ－２配列の８位、１６位、２４位および／または２８位の１つまたは複数に置換を有し、場合により、２位ならびに３位、５位、７位、１０位および１１位の１つまたは複数にさらなる置換を組み合わせ、ならびに／またはアミノ酸３１～３３の１つまたは複数の欠失を有するＧＬＰ－２アナログが記載されている。これらの置換はまた、Ｎ末端またはＣ末端の安定化ペプチド配列の付加と組み合わせることもできる。

ＷＯ２００６／１１７５６５に開示されている分子の中には、化学的安定性および／または生物学的活性を改善するように設計されたＺＰ１８４８（グレパグルチドとも呼ばれる）がある。ＺＰ１８４８およびその代謝産物（すなわち、グレパグルチド）を含むＧＬＰ－２アナログの投与レジメは、ＷＯ２０１８／２２９２５２に記載されている。

広義には、本発明は、ＺＰ１８４８などのグルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）アナログを合成および精製するための改良された方法に関する。
したがって、本発明は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成されるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）アナログを生成する方法であって、ＧＬＰ－２アナログは、以下の式：
Ｒ^１－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｘ５－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｘ１１－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－ＩＩｅ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｚ^２－Ｒ^２（配列番号１１）
（式中、
Ｒ^１は、水素、Ｃ_１～４アルキル（例えば、メチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、またはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ５は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、
Ｘ１１は、ＡｌａまたはＳｅｒであり、
Ｒ^２は、ＮＨ_２またはＯＨであり、
Ｚ^２は、存在しないか、またはＬｙｓの１～６個のアミノ酸単位のペプチド配列である）
によって表されるか、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体である、方法に関する。

第１の態様では、本発明は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成されるＧＬＰ－２アナログを生成する方法であって、
ｉ）粗ＧＬＰ－２アナログをカラムに負荷するステップと、
ｉｉ）第１の緩衝系でカラムのｐＨを調整するステップとを含み、
ステップｉｉ）は、ペプチドがカラム上にある間にペプチドの等電点を通過させることを含む、方法を提供する。

本明細書の文脈では、図１に示すように、カラムのｐＨを調整するステップを「Ｐｒｅ－ＲＰＣ１」と呼ぶ。このＰｒｅ－ＲＰＣ１中に、Ｏ→Ｎアシル基転位が生じる。アシル基転位は、ペプチドがカラム上にある間に生じることが理解される。換言すれば、ステップｉｉ）は、ペプチドがカラム上にある間にペプチドの等電点を通過し、Ｏ→Ｎアシル基転位を行うことを含む。

より詳細には、公表されている方法ではＧＬＰ－２アナログのペプチド切断時にＮ→Ｏアシル基転位が生じる。このようなアシル基転位は当技術分野で認識されており、その後の精製ステップの前に溶液中のペプチドのｐＨを中性に調整し、酸性に戻すことでこれらの不純物が減少し、実質的にＯ→Ｎアシル基転位が行われることが知られている。

本発明以前は、このｐＨ調整は溶液中で行われていた。しかしながら、本発明のＧＬＰ－２アナログでは、望ましくない沈殿物が観察される。驚くべきことに、本発明者らは、このＯ→Ｎアシル基転位をカラム上で行うことで、沈殿物に起因する材料の損失および処理の煩雑さを回避できることを見出した。

カラム上でのペプチドの等電点通過は、本発明者らの知る限り、新しい一般的な方法論を構成し、事実上、溶液中ではなくカラム上でこの「変換」または「精製」ステップを実行する。

換言すれば、本発明は、ＧＬＰ－２アナログがカラム上にある間（Ｐｒｅ－ＲＰＣ１）、ＧＬＰ－２アナログに対して、Ｏ→Ｎアシル基転位を行う方法を提供する。
この種のペプチド合成にリン酸緩衝液を使用することは、不要なオリゴマーおよびＣ末端の脱アミド化生成物を効率よく除去できることが知られているため、望ましい。しかしながら、特許請求された構造のＧＬＰ－２アナログはリン酸緩衝液中で沈殿することが知られており、リン酸緩衝液の使用はＯ→Ｎアシル基転位にとって問題となる。したがって、本発明者らがリン酸緩衝液を使用することで、材料の損失を回避できることは、さらに驚くべきことである。ｐＨ調整ステップを使用したカラム上でのアシル基転位のこの性能は、プロセスステップ（溶液中での別個のｐＨ調整）を省くというさらなる利点をもたらす。

好適には、第１の緩衝系はリン酸緩衝系である。換言すれば、第１の緩衝系は、リン酸緩衝液／リン酸に基づく。
ペプチドの等電点ｐＨ（Ｉ）は、当技術分野で公知の方法を使用して計算することができ、または実験的に測定することもできる。分子全体の電荷がゼロ（中性電荷）であるか、または統計的平均で電気的に中性であるｐＨである。

本発明では、等電点の通過は、カラムのｐＨを酸性ｐＨから上昇させることを意味することが理解される。すなわち、ペプチドがカラム上にある間にペプチドの等電点を通過させることは、カラムの酸性ｐＨを中性ｐＨ（ｐＨ７）に、好適にはわずかに塩基性（アルカリ性）ｐＨ、例えば≧７．２、例えば約７．５に調整することを含むことができる。

したがって、いくつかの実施形態では、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成されるＧＬＰ－２アナログを精製するプロセスは、
ｉ）粗ＧＬＰ－２アナログをカラムに負荷するステップ、
ｉｉ）第１の緩衝系でカラムのｐＨを調整するステップを含み、
ステップｉｉ）は、カラムのｐＨを７．５より高くし、次いでカラムのｐＨを酸性ｐＨに下げるための緩衝液の連続使用を含む。［Ｐｒｅ－ＲＰＣ１］
酸性ｐＨとは、ｐＨ７未満、例えばｐＨ５未満、例えばｐＨ３未満のことである。

好適には、カラムのｐＨを≦２．５、すなわちｐＨ２．５以下に下げる。
好適には、ステップｉｉ）は、カラム上でＯ→Ｎアシル基転位を引き起こし、アセチル化およびトリフルオロアセチル化不純物を加水分解する。カラム上でこれを行うことで、所望の化学変換を達成しながら、望ましくない沈殿を防ぐことができる。

本明細書に記載の実施例では、カラムはＣ１８カラムであるが、本発明はそれほど限定されるものではない。好適なカラムは、当業者には明らかである。いくつかの実施形態では、カラムは、Ｃ１８カラムである。いくつかの実施形態では、カラムは、Ｃ８カラムである。

有利なことに、カラム上でのこのＯ→Ｎアシル基転位は、その後の精製ステップと同じカラム上で達成することができる。
本発明はさらに、ＳＰＰＳにより合成されるＧＬＰ－２アナログを４ステップのクロマトグラフィー精製プロセス（本明細書ではＲＰＣ１～４と呼ぶ）を介して精製する方法を提供する。上述したように、カラム上でのＯ→Ｎアシル基転位（Ｐｒｅ－ＲＰＣ１）は、第１の「精製」ステップ（ＲＰＣ１）と同じカラム上で行うことができる。あるいは、４ステップのクロマトグラフィー精製プロセスは、Ｏ→Ｎアシル基転位を行うために溶液中で既にｐＨ調整プロセスを行ったＳＰＰＳにより合成されるＧＬＰ－２アナログに対して行うこともできる。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＳＰＰＳにより合成されるＧＬＰ－２アナログを精製するための５ステップのクロマトグラフィー精製プロセスを提供することができ、本方法は、
（１）Ｐｒｅ－ＲＰＣ１
ｉ）ＧＬＰ－２アナログをカラムに負荷するステップと、
ｉｉ）第１の緩衝系でカラムのｐＨを調整するステップ、
ステップｉｉ）は、カラムのｐＨを７．５より高くし、次いでカラムのｐＨを酸性ｐＨに下げるための緩衝液の連続使用を含む、次いで
（２）ＲＰＣ１
ｉ）第１の緩衝系を使用してＧＬＰ－２アナログを含有するプールを溶出するステップ、次いで
（３）ＲＰＣ２
ｉ）ステップ（２）で得られたＧＬＰ－２アナログを含有するプールをカラムに負荷するステップと、
ｉｉ）トリフルオロ酢酸を含む第２の緩衝系でカラムを洗浄し、ＧＬＰ－２アナログを含有するプールを溶出するステップ、次いで
（４）ＲＰＣ３
ｉ）ステップ（３）で得られたＧＬＰ－２アナログを含有するプールをカラムに負荷するステップと、
ｉｉ）酢酸／酢酸アンモニウムを含む第３の緩衝系でカラムを洗浄し、ＧＬＰ－２アナログを含有するプールを溶出するステップ、次いで
（５）ＲＰＣ４
ｉ）ステップ（４）で得られたＧＬＰ－２アナログを含有するプールをカラムに負荷するステップと、
ｉｉ）酢酸／酢酸アンモニウムを含む第４の緩衝系でカラムを洗浄し、ＧＬＰ－２アナログを含有するプールを溶出するステップを含む。

任意のステップで得られたＧＬＰ－２アナログを含むプールは、次のステップのためにカラム上に直接負荷してもよいし、蒸発により濃縮してもよいことが理解される。
いくつかの実施形態では、本方法は、ステップ（５）で得られたＧＬＰ－２アナログをカラムに負荷し、１０ｍＭ ＡｃＯＨおよびアセトニトリルを含む緩衝系で洗浄する脱塩ステップをさらに含む。

さらなる一態様では、本発明は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によりＧＬＰ－２アナログを合成する方法に関し、Ｚ^２は、Ｌｙｓの１～６個のアミノ酸単位のペプチド配列であり、Ｚ^２中のＬｙｓ単位の少なくとも１つは、合成中にトリチル保護基で保護される。

トリチル基は、

である。
好適には、Ｚ^２はＬｙｓの２～６個のアミノ酸単位のペプチド配列であり、本方法は、以下のステップ：
ｉ）リンカーを用いて、第１のＰ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを固体ペプチドレジンに結合させるステップと、
ｉｉ）Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）アミノ酸単位からＰ基を除去するステップと、
ｉｉｉ）リンカーを用いて、第２のＰ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを固体ペプチドレジンに結合したＬｙｓ（Ｔｒｔ）アミノ酸単位に結合させるステップと、
ｉｖ）第２のＬｙｓ（Ｔｒｔ）アミノ酸単位からＰ基を除去するステップと、
ｖ）ＧＬＰ－２アナログが合成されるまで、後続のアミノ酸単位を結合させるステップと、
ｖｉ）固体ペプチドレジンからＧＬＰ－２アナログを切断するステップと、
ｖｉｉ）ＧＬＰ－２アナログを精製するステップとを含み、
各Ｐは、保護基、例えばＦｍｏｃである。

ＳＰＰＳ中にこのＬｙｓ（Ｔｒｔ）戦略を用いると、相対保持時間１．１に存在する最も問題のあるピークを含め、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）粗生成物に存在する全てのＬｙｓ（Ｂｏｃ）→Ｌｙｓ（ｔ－Ｂｕ）付加ｔ－Ｂｕピークの消失をもたらす。

いくつかの実施形態では、Ｚ^２は、Ｌｙｓの６個のアミノ酸単位のペプチド配列であり、Ｌｙｓ^３９およびＬｙｓ^３８は、Ｐ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとして結合している。いくつかの実施形態では、Ｚ^２の残りのＬｙｓアミノ酸単位は、Ｐ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨとして結合している。すなわち、合成中のリジンテールは［Ｋ（Ｂｏｃ）］_４［Ｋ（Ｔｒｔ）］_２である。

驚くべきことに、本発明者らは、Ｌｙｓの６個のアミノ酸単位のうち２個をトリチル保護すること、例えばＬｙｓ^３９およびＬｙｓ^３８を保護することで、粗生成物からｔ－Ｂｕ不純物の形成を防ぐのに十分であることを見出した。理論に束縛されることを望まないが、Ｌｙｓ^３９およびＬｙｓ^３８にＬｙｓ（Ｔｒｔ）を使用する根拠は、ｉ）Ｆｍｏｃ／ｔ－Ｂｕ ＳＰＰＳにおいてＬｙｓ（Ｂｏｃ）を使用すると、Ｌｙｓ－ｔ－Ｂｕ付加物が形成すること（Ｐａｗｌａｓら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、２０１４、１０８）、およびｉｉ）Ｃ末端に最も近いＬｙｓ（Ｂｏｃ）側鎖（すなわち、本明細書に記載のペプチドではＬｙｓ^３９およびＬｙｓ^３８）が、メインピークに最も近くから溶出する付加的なｔ－Ｂｕ不純物が形成すること関与することが、ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ Ｇｒｏｕｐによる未発表の研究で明らかになったことである。本発明者らは、Ｃ末端からさらに離れたＬｙｓ（Ｂｏｃ）残基は、さらに溶出する＋５６Ｄａ付加物の形成を引き起こし、その意味で下流の処理中に問題が少ないことを観察した。したがって、これらの理由から、重要なＬｙｓ－ｔ－Ｂｕ付加物の形成に関係すると理解されているこれらのＬｙｓの位置、すなわちＬｙｓ^３８とＬｙｓ^３９とにのみＬｙｓ（Ｔｒｔ）を使用するのは合理的である。

ここで、本発明の実施形態を、添付の図を参照しながら、限定ではなく例として以下で説明する。しかしながら、本発明の様々なさらなる態様および実施形態は、本開示の観点から当業者には明らかである。

本明細書において使用される「および／または」は、２つの指定された特徴または構成要素の各々について、他方の特徴または構成要素を有するかまたは有さない具体的な開示とみなされる。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの具体的な開示とみなされ、あたかもそれぞれが本明細書に個別に記載されているかのように解釈される。

文脈上そうでない場合を除いて、上記に記載された特徴の説明および定義は、本発明のいかなる特定の態様または実施形態に限定されるものではなく、記載された全ての態様および実施形態に等しく適用される。

ＳＰＰＳにより合成されるＧＬＰ－２アナログを精製するためのＯ→Ｎアシル基転位（Ｐｒｅ－ＲＰＣ１）および４ステップ（ＲＰＣ１～４）クロマトグラフィー精製プロセスの概要を示す図である。 ＋５６Ｄａ ＥＩＣ ＭＳによるＺＰ１８４８の３つの合成を示すグラフである。約２８分にメインピーク。上部パネル：［Ｋ（Ｂｏｃ）］_６を用いた合成からの精製ＺＰ１８４８。残存する＋５６Ｄａの不純物に注意。中段パネル：［Ｋ（Ｂｏｃ）］_６を用いた合成の粗生成物。底部パネル：［Ｋ（Ｔｒｔ）］_６を用いた合成の粗生成物。 ＋５６Ｄａ ＥＩＣ ＭＳによる２つのＦｍｏｃ－Ｋ_６－ＮＨ_２粗生成物を示すグラフである。上部パネル：［Ｋ（Ｂｏｃ）］_６レジンからの粗生成物。底部パネル［Ｋ（Ｂｏｃ）］_４［Ｋ（Ｔｒｔ）］_２レジンからの粗生成物。 ＺＰ１８４８の切断後を示すグラフである。上部グラフ：切断溶液中で１時間半後（実施例１．１１と同じ手順）。底部グラフ：ＲＰＣ１でｐＨ処理後（実施例１．１２と同様の手順）。

本発明は、ＧＬＰ－２アナログの精製のための方法を提供する。本明細書に記載されるように、精製ステップ（別段の記載がある場合を除く）はカラムで行われる。好適には、カラムは、Ｃ１８カラムである。

クロマトグラフィーによる精製方法は当技術分野で周知である。一態様では、本発明は、化学修飾（すなわち、アシル基転位）を含む精製ステップを、溶液中ではなくカラム上で行うことができるという驚くべき洞察に関する。本発明は、ＧＬＰ－２アナログの４ステップのクロマトグラフィー精製プロセスをさらに提供する。本明細書に記載されるように、この４ステップのクロマトグラフィー精製プロセスにより、不純物のレベルが低いＧＬＰ－２が高収率で生成される。

したがって、ＧＬＰ－２アナログを精製するための本発明のプロセスは、好適には、一連のカラムベースのプロセスを含む。これらのプロセスは、ＧＬＰ－２アナログを含有する溶液をカラムに負荷した後、洗浄し、緩衝系で溶出するステップを含み、いずれの場合もＧＬＰ－２アナログを含むプールを得る。各洗浄プロセスは、２つ以上のステップを含む。クロマトグラフィー精製では通常、溶離液（緩衝液）の変更はグラジエントを適用することによって達成されることが理解される。

いくつかの実施形態では、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成されるＧＬＰ－２アナログを精製するためのプロセスは、以下のステップ：
ｉ）ＧＬＰ－２アナログをカラムに負荷するステップ、
ｉｉ）第１の緩衝系で洗浄することにより、カラムのｐＨを調整するステップを含み、
第１の緩衝系は、
緩衝液Ａ：０．１％ Ｈ_３ＰＯ_４と、
緩衝液Ｂ：ＭｅＣＮと、
緩衝液Ｃ：４５ｍＭ Ｈ_３ＰＯ_４、ｐＨ２．２＋１００ｍＭ ＮａＣｌと、
緩衝液Ｄ：４５ｍＭ Ｈ_３ＰＯ_４、ｐＨ７．５～８．０＋１００ｍＭ ＮａＣｌとを含み、
カラムは、９５％緩衝液Ｃおよび５％緩衝液Ｂの混合物で予め平衡化されており、
洗浄は、以下の順序である：
ステップ１：９５％緩衝液Ｃおよび５％緩衝液Ｂの混合物、
ステップ２：ｐＨが７．５より高くなるまで、９５％緩衝液Ｄおよび５％緩衝液Ｂの混合物、
ステップ３：ｐＨが２．５未満になるまで、９５％緩衝液Ｃおよび５％緩衝液Ｂの混合物。

ステップ１では、カラムベースの精製で一般的なように、カラムを均質化、または平衡化する。
ステップ２および３は、本明細書では「Ｐｒｅ－ＲＰＣ１」と呼ぶことがある。本明細書に記載されるように、有利なことに、Ｐｒｅ－ＲＰＣ１におけるｐＨ調整は、合成中の不要なＮ→Ｏアシル基転位から生じる不純物を除去するために、溶液中で従来行われてきたＯ→Ｎアシル基転位を引き起こす。

ステップ３の後、カラムを９３％ Ａおよび７％ Ｂを含有する溶液で洗浄してもよい。好適には、洗浄はさらに、
ステップ４：緩衝液Ｂの含有量を７％から２２％まで（緩衝液Ａは９３％から７８％まで）、好適には１２カラム容量にわたって直線的に増加させること、および
ステップ５：好適には溶出が完了するまで、２２％緩衝液Ｂおよび７８％緩衝液Ａの混合物であり、ＧＬＰ－２アナログを含有するプールを得ることを含む。

ステップ４および５はＧＬＰ－２アナログの溶出であり、本明細書では「ＲＰＣ１」またはペプチドの「一次元」クロマトグラフィー精製と呼ばれる。この精製は、ペプチドおよび不純物と、カラム媒体および溶出媒体との間の相互作用の違いの結果である。

いくつかの実施形態では、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成されるＧＬＰ－２アナログを精製するプロセスは、以下のステップ：
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られたＧＬＰ－２アナログを含有するプールをカラムに負荷するステップと、
ｉｖ）カラムを第２の緩衝系で洗浄するステップとをさらに含み、
第２の緩衝系は、
緩衝液Ａ：０．１％ ＴＦＡと、
緩衝液Ｂ：ＭｅＣＮとを含み、
カラムは、９０％緩衝液Ａおよび１０％緩衝液Ｂの混合物で予め平衡化されており、
洗浄は、以下の順序である：
ステップ１：９０％緩衝液Ａおよび１０％緩衝液Ｂの混合物、
ステップ２：緩衝液Ｂの含有量を１０％から１９％まで（緩衝液Ａは９０％から８１％まで）、好適には１カラム容量にわたって直線的に増加させること、および
ステップ３：緩衝液Ｂの含有量を１９％から３０％まで（緩衝液Ａは８１％から７０％まで）、好適には１２カラム容量にわたって直線的に増加させ、次いで、カラムの洗浄を継続してＧＬＰ－２アナログを含有するプールを溶出すること。

ステップｉｉｉ）およびｉｖ）は、本明細書では「ＲＰＣ２」または「二次元」と呼ばれることがある。
いくつかの実施形態では、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成されるＧＬＰ－２アナログを精製するためのプロセスは、以下のステップ：
ｖ）ステップｉｖ）で得られたＧＬＰ－２アナログを含有するプールをカラムに負荷するステップと、
ｉｖ）カラムを第３の緩衝系で洗浄するステップとをさらに含み、
カラムは、８５％緩衝液Ａおよび１５％緩衝液Ｂの混合物で予め平衡化されており、
第３の緩衝系は、
緩衝液Ａ：１００ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ＋０．５％ＡｃＯＨと、
緩衝液Ｂ：ＭｅＣＮとを含み、
洗浄は、以下の順序である：
ステップ１：８５％緩衝液Ａおよび１５％緩衝液Ｂの混合物、
ステップ２：緩衝液Ｂの含有量を１５％から２９％まで（緩衝液Ａは８５％から７１％まで）、好適には１カラム容量にわたって直線的に増加させること、
ステップ３：緩衝液Ｂの含有量を２９％から３７％まで（緩衝液Ａは７１％から６３％まで）、好適には１０カラム容量にわたって直線的に増加させること、および
ステップ４：３０％緩衝液Ａおよび７０％緩衝液Ｂの混合物で、ＧＬＰ－２アナログを含有するプールを溶出すること。

ステップｖ）およびｖｉ）は、本明細書では「ＲＰＣ３」または「三次元」と呼ばれることがある。
いくつかの実施形態では、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成されるＧＬＰ－２アナログを精製するためのプロセスは、以下のステップ：
ｖｉｉ）ステップｖｉ）で得られたＧＬＰ－２アナログを含有するプールをカラムに負荷するステップと、
ｖｉｉｉ）カラムを第４の緩衝系で洗浄するステップとをさらに含み、
第４の緩衝系は、
緩衝液Ａ：５ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ＋０．１％ＡｃＯＨと、
緩衝液Ｂ：ＭｅＣＮと、
緩衝液Ｃ：１００ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ＋０．５％ＡｃＯＨとを含み、
カラムは、９０％緩衝液Ｃおよび１０％緩衝液Ｂの混合物で予め平衡化されており、
洗浄は、以下の順序である：
ステップ１：好適には１カラム容量で、９０％緩衝液Ｃおよび１０％緩衝液Ｂの混合物、
ステップ２：好適には１カラム容量で、９０％緩衝液Ａおよび１０％緩衝液Ｂの混合物、
ステップ３：緩衝液Ｂの含有量を１０％から１３％まで（緩衝液Ａは９０％から８７％まで）、好適には１カラム容量にわたって直線的に増加させること、および
ステップ４：緩衝液Ｂの含有量を１３％から２５％まで（緩衝液Ａは８７％から７５％まで）、好適には１２カラム容量にわたって直線的に増加させ、ＧＬＰ－２アナログを含有するプールを溶出すること。

ステップｖｉｉ）およびｖｉｉｉ）は、本明細書では「ＲＰＣ４」または「四次元」と呼ばれることがある。
いくつかの実施形態では、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成されるＧＬＰ－２アナログを精製するためのプロセスは、以下のステップ：
ｉｘ）ステップｖｉｉｉ）で得られたＧＬＰ－２アナログを含有するプールをカラムに負荷するステップと、
ｘ）カラムを脱塩緩衝系で洗浄するステップとをさらに含み、
脱塩緩衝系は、
緩衝液Ａ：１０ｍＭ ＡｃＯＨと、
緩衝液Ｂ：ＭｅＣＮとを含み、
カラムは、９５％ Ａおよび５％ Ｂの混合物で予め平衡化されており、
洗浄は、以下の順序である：
ステップ１：９５％ Ａおよび５％ Ｂの混合物、および
ステップ２：緩衝液Ｂの含有量を５％から５０％まで（緩衝液Ａは９５％から５０％まで）、好適には１カラム容量にわたって直線的に増加させること。

ステップｉｘ）およびｘ）は、「脱塩」または「ＳＰＥ」と呼ばれることがある。
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成されるＧＬＰ－２アナログを精製するためのプロセスは、凍結乾燥ステップをさらに含むことができる。

好適には、カラムはＣ１８カラムであるが、本発明はそれほど限定されるものではない。任意の好適なカラムを使用することができる。
さらなる一態様では、本発明は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によりＧＬＰ－２アナログを合成する方法に関し、Ｚ^２は、Ｌｙｓの１～６個のアミノ酸単位のペプチド配列であり、Ｚ^２中のＬｙｓ単位の少なくとも１つは、合成中にトリチル保護基で保護される。

Ｚ^２がＬｙｓの１～６個のアミノ酸単位のペプチド配列であるいくつかの実施形態では、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によりＧＬＰ－２アナログを合成する方法は、以下のステップ：
ｉ）リンカーを用いて、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを固体ペプチドレジンに結合させるステップと、
ｉｉ）Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）アミノ酸単位からＦｍｏｃ基を除去するステップと、
ｉｉｉ）ＧＬＰ－２アナログが合成されるまで、後続のアミノ酸単位を結合させるステップと、
ｉｖ）固体ペプチドレジンからＧＬＰ－２アナログを切断するステップと、
ｖ）ＧＬＰ－２アナログを精製するステップとを含む。

Ｚ^２がＬｙｓの２～６個のアミノ酸単位のペプチド配列であるいくつかの実施形態では、ＧＬＰ－２アナログを合成する方法は、以下のステップ：
ｉ）リンカーを用いて、第１のＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを固体ペプチドレジンに結合させるステップと、
ｉｉ）Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）アミノ酸単位からＦｍｏｃ基を除去するステップと、
ｉｉｉ）リンカーを用いて、第２のＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを固体ペプチドレジンに結合したＬｙｓ（Ｔｒｔ）アミノ酸単位を結合させるステップと、
ｉｖ）第２のＬｙｓ（Ｔｒｔ）アミノ酸単位からＦｍｏｃ基を除去するステップと、
ｖ）ＧＬＰ－２アナログが合成されるまで、後続のアミノ酸単位を結合させるステップと、
ｖｉ）固体ペプチドレジンからＧＬＰ－２アナログを切断するステップと、
ｖｉｉ）ＧＬＰ－２アナログを精製するステップとを含む。

したがって、Ｚ^２がＬｙｓの６個のアミノ酸単位のペプチド配列である場合、モチーフは［Ｋ（Ｂｏｃ）］_４［Ｋ（Ｔｒｔ）］_２であってもよい。他の実施形態では、モチーフは、［Ｋ（Ｂｏｃ）］_４［Ｋ（Ｔｒｔ）］_２、［Ｋ（Ｂｏｃ）］_３［Ｋ（Ｔｒｔ）］_３、［Ｋ（Ｂｏｃ）］_２［Ｋ（Ｔｒｔ）］_４、［Ｋ（Ｂｏｃ）］_１［Ｋ（Ｔｒｔ）］_５、または［Ｋ（Ｔｒｔ）］_６であってもよい。すなわち、（ｖ）で結合したＬｙｓアミノ酸単位の後続ステップは、ＴｒｔまたはＢｏｃで保護されていてもよい。

いくつかの実施形態では、モチーフは、［Ｋ（Ｂｏｃ）］_４［Ｋ（Ｔｒｔ）］_２または［Ｋ（Ｔｒｔ）］_６である。いくつかの実施形態では、モチーフは、［Ｋ（Ｂｏｃ）］_４［Ｋ（Ｔｒｔ）］_２である。
定義
別段の定めがない限り、以下の定義は、上記の記述で使用されている特定の用語について示されている。

本明細書および特許請求の範囲を通して、天然アミノ酸の従来の１文字コードおよび３文字コードが使用される。本発明のペプチド中の全てのアミノ酸残基は、好ましくはＬ－配置のものである。
ＧＬＰ－２アナログ
本発明のグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）アナログは、以下の式：
Ｒ^１－Ｚ^１－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｘ５－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｘ１１－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－ＩＩｅ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｚ^２－Ｒ^２
（式中、
Ｒ^１は、水素、Ｃ_１～４アルキル（例えば、メチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、またはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ５は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、
Ｘ１１は、ＡｌａまたはＳｅｒであり、
Ｒ^２は、ＮＨ_２またはＯＨであり、
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、存在しないか、またはＬｙｓの１～６個のアミノ酸単位のペプチド配列である）、
またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体によって表される。

Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、存在する、および／もしくは存在しないか、またはＬｙｓの１～６個のアミノ酸単位、すなわち１、２、３、４、５または６個のＬｙｓ残基のペプチド配列である。Ｌｙｓ残基は、Ｄ－配置またはＬ－配置のいずれを有してもよいが、好ましくはＬ－配置を有する。特に好ましい配列Ｚは、４、５または６個の連続したリジン残基、特に６個の連続したリジン残基の配列である。例示的な配列ＺはＷＯ０１／０４１５６に示されている。

いくつかの実施形態では、Ｒ^１は水素である。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＴｈｒである。いくつかの実施形態では、Ｘ１１はＡｌａである。いくつかの実施形態では、Ｒ^２はＮＨ_２である。

いくつかの実施形態では、Ｚ^１は存在しない。
いくつかの実施形態では、Ｚ^２は、Ｌｙｓの１～６個のアミノ酸単位のペプチド配列である。いくつかの実施形態では、Ｚ^２は、Ｌｙｓの２～６個のアミノ酸単位のペプチド配列である。いくつかの実施形態では、Ｚ^２は、Ｌｙｓの３～６個のアミノ酸単位のペプチド配列である。いくつかの実施形態では、Ｚ^２は、Ｌｙｓの４～６個のアミノ酸単位のペプチド配列である。いくつかの実施形態では、Ｚ^２は、Ｌｙｓの５～６個のアミノ酸単位のペプチド配列である。いくつかの実施形態では、Ｚ^２は、Ｌｙｓの６個のアミノ酸単位のペプチド配列である。いくつかの実施形態では、Ｚ^２は、Ｌｙｓの１～２個のアミノ酸単位のペプチド配列である。

いくつかの実施形態では、本発明のグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）アナログは、以下の式：
Ｒ^１－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｘ５－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｘ１１－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－ＩＩｅ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｚ^２－Ｒ^２
（式中、
Ｒ^１は、水素、Ｃ_１～４アルキル（例えば、メチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、またはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ５は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、
Ｘ１１は、ＡｌａまたはＳｅｒであり、
Ｒ^２は、ＮＨ_２またはＯＨであり、
Ｚ^２は、存在しないか、またはＬｙｓの１～６個のアミノ酸単位のペプチド配列である）
またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体によって表される。

いくつかの実施形態では、Ｚ^２は、Ｌｙｓの１～６個のアミノ酸単位のペプチド配列である。
本発明のいくつかの実施形態では、上記の式において、Ｘ５はＴｈｒであり、および／またはＸ１１はＡｌａである。これらのグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）アナログの例は、
ＺＰ１８４８ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ－ＮＨ_２（配列番号１）
ＺＰ２９４９ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫ－ＯＨ（配列番号２）；
ＺＰ２７１１ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫ－ＯＨ（配列番号３）；
ＺＰ２４６９ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ－ＯＨ（配列番号４）；
ＺＰ１８５７ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ－ＮＨ_２（配列番号５）；または
ＺＰ２５３０ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ－ＯＨ（配列番号６）
を含む。

本発明のいくつかの実施形態では、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）アナログは、
ＺＰ１８４８ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ－ＮＨ_２（配列番号１）である。

すなわち、ＧＬＰ－２アナログは、以下の式：
Ｈ－Ｈｉｓ^１－Ｇｌｙ^２－Ｇｌｕ^３－Ｇｌｙ^４－Ｔｈｒ^５－Ｐｈｅ^６－Ｓｅｒ^７－Ｓｅｒ^８－Ｇｌｕ^９－Ｌｅｕ^１０－Ａｌａ^１１－Ｔｈｒ^１２－Ｉｌｅ^１３－Ｌｅｕ^１４－Ａｓｐ^１５－Ａｌａ^１６－Ｌｅｕ^１７－Ａｌａ^１８－Ａｌａ^１９－Ａｒｇ^２０－Ａｓｐ^２１－Ｐｈｅ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ａｌａ^２４－Ｔｒｐ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ｉｌｅ^２７－Ａｌａ^２８－Ｔｈｒ^２９－Ｌｙｓ^３０－Ｉｌｅ^３１－Ｔｈｒ^３２－Ａｓｐ^３３－Ｌｙｓ^３４－Ｌｙｓ^３５－Ｌｙｓ^３６－Ｌｙｓ^３７－Ｌｙｓ^３８－Ｌｙｓ^３９－ＮＨ_２
で表される。

本発明のいくつかの実施形態では、上記の式において、Ｘ５はＳｅｒであり、および／またはＸ１１はＳｅｒである。これらのグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）アナログの例は、
ＺＰ１８４６ Ｈ－ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ－ＮＨ_２（配列番号７）；
ＺＰ１８５５ Ｈ－ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ－ＮＨ_２（配列番号８）；または
ＺＰ２２４２ Ｈ－ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ－ＯＨ（配列番号９）
を含む。

本発明の一実施形態では、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）アナログは、ＺＰ１８４６ Ｈ－ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ－ＮＨ_２（配列番号７）である。

すなわち、ＧＬＰ－２アナログは、以下の式：
Ｈ－Ｈｉｓ^１－Ｇｌｙ^２－Ｇｌｕ^３－Ｇｌｙ^４－Ｓｅｒ^５－Ｐｈｅ^６－Ｓｅｒ^７－Ｓｅｒ^８－Ｇｌｕ^９－Ｌｅｕ^１０－Ｓｅｒ^１１－Ｔｈｒ^１２－Ｉｌｅ^１３－Ｌｅｕ^１４－Ａｓｐ^１５－Ａｌａ^１６－Ｌｅｕ^１７－Ａｌａ^１８－Ａｌａ^１９－Ａｒｇ^２０－Ａｓｐ^２１－Ｐｈｅ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ａｌａ^２４－Ｔｒｐ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ｉｌｅ^２７－Ａｌａ^２８－Ｔｈｒ^２９－Ｌｙｓ^３０－Ｉｌｅ^３１－Ｔｈｒ^３２－Ａｓｐ^３３－Ｌｙｓ^３４－Ｌｙｓ^３５－Ｌｙｓ^３６－Ｌｙｓ^３７－Ｌｙｓ^３８－Ｌｙｓ^３９－ＮＨ_２
で表される。

いくつかの実施形態では、ＧＬＰ－アナログは、以下：
ＺＰ１８４８ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ－ＮＨ_２（配列番号１）
ＺＰ２９４９ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫ－ＯＨ（配列番号２）；
ＺＰ２７１１ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫ－ＯＨ（配列番号３）；
ＺＰ２４６９ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ－ＯＨ（配列番号４）；
ＺＰ１８４６ Ｈ－ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ－ＮＨ_２（配列番号７）；
ＺＰ１８５５ Ｈ－ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ－ＮＨ_２（配列番号８）；または
ＺＰ２２４２ Ｈ－ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ－ＯＨ（配列番号９）
から選択される。

本発明は、ＧＬＰ２アナログを作製および精製する方法に関する。これらのペプチドは原薬として使用されることを意図している。本発明は、本発明の方法により得られるＧＬＰアナログを含む。

本発明のペプチド（原薬）は、塩または他の誘導体の形態で提供され得ることが理解されるべきである。したがって、精製および任意のさらなるステップの後、ペプチドは最終的に塩または他の誘導体として得ることができることが理解される。塩には、酸付加塩および塩基性塩などの薬学的に許容される塩が含まれる。酸付加塩の例としては、塩酸塩、クエン酸塩、塩化物塩および酢酸塩が挙げられる。好ましくは、塩は、酢酸塩である。一般に、塩は塩化物塩でないことが好ましい。塩基性塩の例としては、カチオンがナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属、カルシウムなどのアルカリ土類金属、ならびにアンモニウムイオン^＋Ｎ（Ｒ^３）_３（Ｒ^４）（ここで、Ｒ^３およびＲ^４がそれぞれ独立して、任意に置換されたＣ_１～６－アルキル、任意に置換されたＣ_２～６－アルケニル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールを指定する）から選択される塩が挙げられる。薬学的に許容される塩の他の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１７版、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９８５およびより最新の版、ならびにｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに記載される。

好ましくは、塩は酢酸塩であり、これは、本明細書に記載されているように、ステップＲＰＣ１～ＲＰＣ４およびその後の脱塩の後に得ることができる。
好ましい実施形態では、本発明のＧＬＰ－２アナログの酢酸塩は、ＺＰ１８４８－酢酸塩、ＺＰ２９４９－酢酸塩、ＺＰ２７１１－酢酸塩、ＺＰ２４６９－酢酸塩、ＺＰ１８５７－酢酸塩、ＺＰ２５３０－酢酸塩、ＺＰ１８４６－酢酸塩、ＺＰ１８５５－酢酸塩およびＺＰ２２４２－酢酸塩からなる群から選択される。本明細書の文脈では、「ＺＰ１８４８－酢酸塩」という用語は、酢酸塩の形態でのＺＰ１８４８分子を指す。ＧＬＰ－２アナログの酢酸塩は、式（ＧＬＰ－２アナログ），ｘ（ＣＨ３ＣＯＯＨ）（式中、ｘは、１．０～８．０、すなわち、ｘは、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０または８．０である）で表すことができる。ＧＬＰ－２アナログの酢酸塩の任意の組成では、酢酸分子の数が異なる分子が存在してもよく、したがって、ｘは必ずしも整数ではない。場合によっては、ｘは４．０～８．０であるか、ｘは６．０～８．０であるか、またはｘは４．０～６．５である。場合によっては、ｘは４．０～６．０であるか、ｘは２．０～７．０であるか、ｘは３．０～６．０であるか、ｘは４．０～６．０であるか、またはｘは４．０～８．０である。本発明で定義されるＧＬＰ－２アナログの酢酸塩に関するさらなる考察は、ＷＯ２０２０／２６５０６４に見出され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

好ましい一実施形態では、ＧＬＰ－２アナログは、最終的に、ＺＰ１８４８－酢酸塩またはＨ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ－ＮＨ_２酢酸塩（配列番号１）もしくは（Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ－ＮＨ_２），ｘ（ＣＨ３ＣＯＯＨ）（式中、ｘは１．０～８．０である）として得られる。

グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）アナログの酢酸塩を含む固形組成物は、例えば凍結乾燥により得ることができる。固形組成物は、液体製剤の作製に使用される賦形剤との製剤化に有用である。例えば、以下の式：
（Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ－ＮＨ２），ｘ（ＣＨ３ＣＯＯＨ）（式中、ｘは１．０～８．０）
を有するグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）アナログの酢酸塩を含む固形組成物を得ることができる。

ＧＬＰ－２アナログあたり８．０個の酢酸分子を上限とすると、酢酸含量は酢酸１１％未満に相当し、２５℃で測定した粘度が０．８～２．０ｍＰａ／秒の間となるように製剤化することができる。

ＧＬＰ－２アナログの各分子に関連する酢酸分子の数の範囲は、製剤のこの成分の分子量範囲を規定する。例えば、ＺＰ１８４８の酢酸塩の場合、ＧＬＰ－２アナログの各分子に関連する酢酸分子の数の範囲は、ＺＰ１８４８－酢酸塩の分子量範囲を規定する。例として、ＺＰ１８４８の各分子に酢酸１当量で分子量＝４３１６＋６０＝４３７６Ｄａが得られる。したがって、ＺＰ１８４８で酢酸当量を増加させた場合の分子量は、以下：酢酸１当量＝４３７６Ｄａ；酢酸２当量＝４４３６Ｄａ；酢酸３当量＝４４９６Ｄａ；酢酸４当量＝４５５６Ｄａ；酢酸５当量＝４６１６Ｄａ；酢酸６当量＝４６７６Ｄａ；酢酸７当量＝４７３６Ｄａおよび酢酸８当量＝４７９６Ｄａである。その結果、分子量範囲は、以下：酢酸１～８当量＝４３７６Ｄａ～４７９６Ｄａ、酢酸４～８当量＝４５５６Ｄａ～４７９６Ｄａ、および酢酸６～８当量＝４６７６Ｄａ～４７９６Ｄａと規定される。本発明で定義されるＧＬＰ－２アナログの酢酸塩に関するさらなる考察は、ＷＯ２０２０／２６５０６４に見出され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明のＧＬＰ－２アナログの他の誘導体としては、Ｍｎ^２＋およびＺｎ^２＋などの金属イオンとの配位錯体、インビボで加水分解可能なエステルなどのエステル、遊離酸もしくは遊離塩基、水和物、または脂質が挙げられる。エステルは、化合物中に存在するヒドロキシル基またはカルボン酸基と、適切なカルボン酸またはアルコールの反応相手との間で、当技術分野で周知の技術を使用して形成することができる。
医学的状態
本発明のＧＬＰ－２アナログ製剤は、例えば、ＷＯ２０２０／０６５０６４の２６ページ（「医学的状態」）に記載されているように医薬品として有用であり、この内容は参照によりその全体が組み込まれる。

材料および方法
当技術分野で知られている治療用ペプチドの医薬品を製造する、製造および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）を満たすための標準的な装置および原料は、全体を通して使用されている。

実施例１
一般的なペプチド合成
１．１ Ｒａｍａｇｅリンカーの付加および準化学量論的ダウンロードを介した第１段階のダウンロード
ＤＥＧＡＭ－レジン（６．１８ｋｇ、４．２０モル、１．０当量、０．６８ｍｍｏｌ／ｇ）を反応器に添加した。次いで、ＤＭＦ（２５Ｌ、５０～５８℃）を添加した。２０分以上撹拌した後、レジンを排出し、追加のＤＭＦ（２５Ｌ、５０～５８℃）を反応器に添加し、混合物を撹拌した。レジンの脱プロトン化のために、ピペリジン（２．５Ｌ）を添加し、混合物を１５分間撹拌した。追加のＤＭＦを添加し、反応器を排水した。レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄した。次いで、洗浄液がクロラニル試験陰性（洗浄液中にピペリジンがないことを示す）を示すまでＤＭＦで連続的に洗浄した。最後に、レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄した。

Ｆｍｏｃ－Ｒａｍａｇｅ－ＯＨリンカーおよびＯｘｙｍａ（各０．９当量、３．７８モル）をＤＭＦ（８Ｌ）に５０～５８℃で溶解した。この溶液を、脱プロトン化レジンを含む反応器に添加した。追加のＤＭＦ（１７Ｌ）を添加した。次いで、温度を５０～５８℃に維持しながら、ＤＩＣ（２．２５当量）を５分間隔で４回に分けて反応器に添加し、合計添加時間は１５分とした。最初の３回には、添加する全ＤＩＣの各１３％が含まれ、最後の回には６１％が含まれた。最初の回のＤＩＣの添加後、混合物を合計４５分間撹拌した。次いで、余分のＤＭＦを添加し、反応器を排水した。最後に、レジンをＤＭＦでバッチ式に２回洗浄した。

ＡｃＯＨおよびＯｘｙｍａ（各２当量、８．４０モル）を８ＬのＤＭＦに５０～５８℃で溶解し、反応器に添加した。追加のＤＭＦ（１７Ｌ）を添加し、次いで、ＤＩＣ（５．０当量）を撹拌下、３分間隔で４回に分けて合計９分間添加し、その他の条件は、リンカーのカップリングについて前述したとおりである。最後の回のＤＩＣの添加後、反応混合物を６分間撹拌した。余分のＤＭＦを添加し、反応器を排水した。最後に、レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄した。
１．２ Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ^３９（Ｔｒｔ）－ＯＨの付加および競合的共キャッピングを介した第２段階のダウンロード
前のステップで得られたレジンに、ＤＭＦ（２５Ｌ、５０～５８℃）を撹拌しながら添加した。次いで、ピペリジン（２．５Ｌ）を反応器に添加し、混合物を２０分間撹拌した。反応器を排水した。同量のＤＭＦを添加し、ピペリジンでの処理を繰り返した。次いで、余分のＤＭＦを添加し、反応器を排水した。レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄した。次いで、クロラニル試験陰性が得られるまでＤＭＦで連続的に洗浄した。次いで、ＤＭＦによるレジンのバッチ式洗浄を１回行った。

Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ^３９（Ｔｒｔ）－ＯＨおよびＯｘｙｍａ（各１．５当量、６．３０モル）を８ＬのＤＭＦに５０～５８℃で溶解し、脱保護レジンを含む反応器に添加した。追加のＤＭＦ（１７Ｌ）およびＡｃＯＨ（２．７０当量、１１．３４モル）を反応器に添加した。次いで、温度を５０～５８℃に維持しながら、撹拌下、ＤＩＣ（３．７５当量）を５分間隔で４回に分けて添加した。最初の３回には、全ＤＩＣの各１３％が含まれ、最後の回には６１％が含まれた。最後の回のＤＩＣの添加後、混合物を３０分間撹拌した（合計撹拌時間４５分）。カイザーテストでカップリングを確認し（陰性試験はレジンに遊離アミノ基がないことを示す）、追加のＤＭＦを反応器に添加した。次いで、反応器を排水し、レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄し、排水した。
１．３ Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ^３８（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ^３７（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ^３６（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ^３５（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ^３４（Ｂｏｃ）－ＯＨの付加
前のステップで得られたレジンに、ＤＭＦ（２５Ｌ、５３℃）を撹拌しながら添加した。次いで、ピペリジン（６２５ｍｌ）を反応器に添加し、混合物を１０分間撹拌した。その後、ピペリジン（１８７５ｍｌ）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。次いで、反応器を排水した。ピペリジンによる脱保護を含むステップを２回繰り返した。最後の脱保護ステップの後、混合物をＤＭＦで希釈した。次いで、反応器を排水し、レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄した。クロラニル試験陰性が得られるまでレジンをＤＭＦで連続的に洗浄した。次いで、ＤＭＦによるレジンのバッチ式洗浄を１回行った。

Ｆｍｏｃ保護アミノ酸およびＯｘｙｍａ（各２．０当量、４．２０モル）をＤＭＦ（８Ｌ）に５０～５８℃で溶解し、脱保護レジンを含む反応器に添加した。追加のＤＭＦ（１７Ｌ）を添加し、次いで、ＤＩＣ（５．０当量）をＲａｍａｇｅリンカー（実施例１．１）の付加について記載したように少しずつ添加した。最初の部分のＤＩＣの添加後、５０～５８℃で合計３５～４０分間撹拌しながらカップリングさせた。カイザーテストでカップリングを確認した。次いで、反応物にＡｃＯＨ（２当量、５モル）を添加し、２分間撹拌することにより、レジンをキャッピングに供した。余分のＤＭＦを添加し、反応器を排水した。最後に、レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄した。
１．４ Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ^３３（ＯｔＢｕ）－ＯＨの付加
前のステップで得られたレジンに、ＤＭＦ（２５Ｌ、５３℃）を撹拌しながら添加した。次いで、ピペリジン（６２５ｍｌ）を反応器に添加し、混合物を５分間撹拌した。その後、ピペリジン（１８７５ｍｌ）を反応器に添加し、混合物を５分間撹拌した。次いで、反応器を排水した。２段階の脱保護を繰り返したが、各ピペリジン添加後に１０分間撹拌した。ピペリジンによる最後の脱保護ステップの後、混合物をＤＭＦで希釈した。次いで、反応器を排水し、レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄した。クロラニル試験陰性が得られるまでレジンをＤＭＦで連続的に洗浄した。次いで、ＤＭＦによるレジンのバッチ式洗浄を１回行った。

Ｆｍｏｃ保護アミノ酸およびＯｘｙｍａ（各２．０当量、４．２０モル）をＤＭＦ（８Ｌ）に５０～５８℃で溶解し、脱保護レジンを含む反応器に添加した。追加のＤＭＦ（１７Ｌ）を添加した。次いで、ＤＩＣ（５．０当量）を実施例１．１に記載したように反応器に少しずつ添加した。最初の部分のＤＩＣの添加後、５０～５８℃で３５～４０分間撹拌しながらカップリングさせた。カイザーテストでカップリングを確認し、実施例１．３に記載したように、レジンをＡｃＯＨ（２当量）で２分間キャッピングに供し、ＤＭＦで洗浄した。
１．５ Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ^３２（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ^２９（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ^２８－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ^２６－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ^２３－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ^２０（Ｐｂｆ）－ＯＨの付加
Ｏｘｙｍａ（７１１ｇ）をＤＭＦ（８Ｌ）に５０～５８℃で溶解し、レジンを含む反応器に添加し、続いてＤＭＦ（１７Ｌ）を添加した。Ｆｍｏｃ脱保護は、Ｏｘｙｍａ／ＤＭＦおよびレジンを含む反応器にピペリジン（６２５ｍｌ）を添加し、混合物を５分間撹拌することにより行った。次いで、ピペリジン（１８７５ｍｌ）を反応器に添加し、混合物を５分間撹拌した。反応器を排水した。２段階の脱保護を繰り返した。ピペリジンによる最後の脱保護ステップの後、混合物をＤＭＦで希釈した。次いで、反応器を排水し、レジンをバッチ式に１回洗浄した。クロラニル試験陰性が得られるまでレジンをＤＭＦで連続的に洗浄した。次いで、ＤＭＦによるレジンのバッチ式洗浄を１回行った。

Ｆｍｏｃ保護アミノ酸およびＯｘｙｍａ（各２．０当量、４．２０モル）をＤＭＦ（８Ｌ）に５０～５８℃で溶解し、脱保護レジンを含む反応器に添加した。追加のＤＭＦ（１７Ｌ）を添加し、ＤＩＣ（５．０当量）を実施例１．１に記載したように反応器に少しずつ添加した。最初の部分のＤＩＣの添加後、混合物を５０～５８℃で３０分間撹拌しながら反応させた。追加のＤＭＦを添加し、次いで、反応器を排水した。ＤＭＦによるレジンのバッチ式洗浄を１回行った。

カップリングステップを上記のように繰り返した。ただし、最初の部分のＤＩＣの添加から３５～４０分間反応させた。Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ^２０（Ｐｂｆ）－ＯＨを、各１当量のアミノ酸、ＯｘｙｍａおよびＤＩＣを使用して３回目のカップリングを行った。カイザーテストでカップリングを確認し、実施例１．３に記載したように、レジンをＡｃＯＨ（２当量）で２分間キャッピングに供した。余分のＤＭＦを添加し、反応器を排水した。最後に、レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄した。
１．６ Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ^３０（Ｂｏｃ）－ＯＨの付加
ピペリジンの１回目の添加後１０分間、およびピペリジンの２回目の添加後１９分間撹拌しながら２段階の脱保護を行ったことを除いて、ペプチドレジンを実施例１．４に記載したようにＯｘｙｍａおよびピペリジンで処理した。

Ｏｘｙｍａの添加を繰り返し、ピペリジンを添加するたびにレジンを１０分間撹拌することにより、ピペリジンによる２段階の脱保護を行った。追加のＤＭＦを添加し、次いで、反応器を排水した。ＤＭＦによるレジンのバッチ式洗浄を１回行った。クロラニル試験陰性が得られるまでレジンをＤＭＦで連続的に洗浄した。次いで、ＤＭＦによるレジンのバッチ式洗浄を１回行った。

Ｆｍｏｃ保護アミノ酸およびＯｘｙｍａ（各２．０当量、４．２モル）をＤＭＦ（８Ｌ）に５０～５８℃で溶解し、脱保護レジンを含む反応器に添加した。追加のＤＭＦ（１７Ｌ）を添加した。次いで、ＤＩＣ（５．０当量）を実施例１．１に記載したように反応器に少しずつ添加した。最初の部分のＤＩＣの添加後、５０～５８℃で３５～４０分間撹拌しながらカップリングさせた。次いで、カイザーテストでカップリングを確認し、レジンをＡｃＯＨ（２当量）で２分間キャッピングに供した。余分のＤＭＦを添加し、反応器を排水した。最後に、レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄した。
１．７ Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ^８（ｔＢｕ）－ＯＨおよびＦｍｏｃ－Ｔｈｒ^５（ｔＢｕ）－ＯＨの付加
Ｏｘｙｍａを実施例１．５に記載したように反応器に添加した。Ｆｍｏｃ脱保護は、Ｏｘｙｍａ／ＤＭＦおよびレジンを含む反応器にピペリジン（６２５ｍｌ）を添加し、混合物を１０分間撹拌することにより行った。次いで、ピペリジン（１８７５ｍｌ）を反応器に添加し、混合物を１０分間撹拌した。反応器を排水した。２段階の脱保護を２回繰り返した。脱保護の後、混合物をＤＭＦで希釈した。次いで、反応器を排水し、レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄した。クロラニル試験陰性が得られるまでレジンをＤＭＦで連続的に洗浄した。次いで、ＤＭＦによるレジンのバッチ式洗浄を１回行った。

Ｆｍｏｃ保護アミノ酸およびＯｘｙｍａ（各２．０当量、４．２０モル）をＤＭＦ（８Ｌ）に５０～５８℃で溶解し、脱保護レジンを含む反応器に添加した。追加のＤＭＦ（１７Ｌ）を添加し、ＤＩＣ（５．０当量）を実施例１．１に記載したように反応器に少しずつ添加した。最初の部分のＤＩＣの添加後、５０～５８℃で３５～４０分間撹拌しながらカップリングさせた。カイザーテストでカップリングを確認し、レジンをＡｃＯＨ（２当量）で２分間キャッピングに供した。余分のＤＭＦを添加し、反応器を排水した。最後に、レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄した。
１．８ Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ４－ＯＨの付加
Ｏｘｙｍａを反応器に添加し、ピペリジン処理によるＦｍｏｃ基の脱保護を、クロラニル試験の適用を含め、実施例１．７に記載したように行った。

Ｆｍｏｃ保護アミノ酸およびＯｘｙｍａ（各２．０当量、４．２０モル）をＤＭＦ（８Ｌ）に５０～５８℃で溶解し、脱保護レジンを含む反応器に添加した。追加のＤＭＦ（１７Ｌ）を添加し、ＤＩＣ（５．０当量）を実施例１．１に記載したように反応器に少しずつ添加した。最初の部分のＤＩＣの添加後、３０分間撹拌しながらカップリングを行った。追加のＤＭＦを添加し、次いで、反応器を排水した。ＤＭＦによるレジンのバッチ式洗浄を１回行った。

上記のカップリングステップを繰り返し、最初の部分のＤＩＣの添加後、３５～４０分間行った。次いで、カイザーテストでカップリングを確認し、レジンをＡｃＯＨ（２当量）で２分間キャッピングに供した。余分のＤＭＦを添加し、反応器を排水した。最後に、レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄した。
１．９ Ｂｏｃ－Ｈｉｓ^１（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ^２－ＯＨの付加
Ｏｘｙｍａ（７１１ｇ）をＤＭＦ（８Ｌ）に５０～５８℃で溶解し、レジンを含む反応器に添加した。追加のＤＭＦ（１７Ｌ）を添加した。Ｆｍｏｃ脱保護は、Ｏｘｙｍａ／ＤＭＦおよびレジンを含む反応器にピペリジン（６２５ｍｌ）を添加し、混合物を５分間撹拌することにより行った。次いで、ピペリジン（１８７５ｍｌ）を反応器に添加し、混合物を５分間撹拌した。反応器を排水した。

Ｏｘｙｍａの添加を繰り返し、ピペリジンを添加するたびにレジンを１０分間撹拌し、ピペリジンによる２段階の脱保護を行った。追加のＤＭＦを添加し、次いで、反応器を排水した。ＤＭＦによるレジンのバッチ式洗浄を１回行った。クロラニル試験陰性が得られるまでレジンをＤＭＦで連続的に洗浄した。次いで、ＤＭＦによるレジンのバッチ式洗浄を１回行った。

Ｂｏｃ－Ｈｉｓ^１（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ^２－ＯＨおよびＯｘｙｍａ（各１．５当量、３．１５モル）をＤＭＦ（８Ｌ）に５０～５８℃で溶解し、脱保護レジンを含む反応器に添加した。追加のＤＭＦ（１７Ｌ）を添加した。次いで、ＤＩＣ（３．７５当量）を実施例１．１に記載したように反応器に少しずつ添加した。最初の部分のＤＩＣの添加後、５０～５８℃で６０分間撹拌しながらカップリングさせた。次いで、カイザーテストでカップリングを確認した。余分のＤＭＦを反応器に添加し、反応器を排水した。最後に、レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄した。
１．１０ 残りのアミノ酸：Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ^３（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ^６－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ^９（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ^１０－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ^１１－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ^１２（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ^１３－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ^１４－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ^１５（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ^１６－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ^１７－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ^１８－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ^１９－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ^２１（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ^２２－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ^２４－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ^２５（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ^２７－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ^３１－ＯＨの付加
ピペリジンによるＯｘｙｍａ処理および脱保護は、実施例１．９に記載したように行った。脱保護後、追加のＤＭＦを添加した。次いで、反応器を排水した。ＤＭＦによるレジンのバッチ式洗浄を１回行った。クロラニル試験陰性が得られるまでレジンをＤＭＦで連続的に洗浄した。次いで、ＤＭＦによるレジンのバッチ式洗浄を１回行った。

Ｆｍｏｃアミノ酸およびＯｘｙｍａ（各２．０当量、４．２０モル）をＤＭＦ（８Ｌ）に５０～５８℃で溶解し、脱保護レジンを含む反応器に添加した。追加のＤＭＦ（１７Ｌ）を反応器に添加し、実施例１．１に記載したようにＤＩＣ（５．０当量）を添加した。最初の部分のＤＩＣの添加後、５０～５８℃で３５～４０分間撹拌しながらカップリングさせた。次いで、カイザーテストでカップリングを確認し、レジンをＡｃＯＨ（２当量）で２分間キャッピングに供した。余分のＤＭＦを添加し、反応器を排水した。最後に、レジンをＤＭＦでバッチ式に１回洗浄した。
１．１１ ペプチドの脱保護およびレジンからの切断
合成が完了した後、保護ペプチドレジンをＤＭＦでバッチ式に３回、５０～５８℃のＤＭＦで２回、室温のＤＭＦで１回洗浄した。次いで、ペプチドレジンをイソプロパノールで５回洗浄した。ペプチドレジンを最終的に２５～３５℃で乾燥させ、２～８℃で保存した。

ＴＦＡ（６８．１ｋｇ）、ＤＴＴ（１．７５Ｌ）、ＴＩＳ（１．２５Ｌ）および水（１．２５Ｌ）を反応器に添加した。実施例１．１～１．１０に記載したように調製したペプチドレジン（０．８モルに相当する１０ｋｇ）を溶液に添加した。得られた混合物を２５℃で１３５分間撹拌しながら放置した。次いで、温度を０℃未満に下げ、冷（０℃未満）のＭＴＢＥ（１５０Ｌ）をゆっくりと反応器に添加した。ＭＴＢＥの添加中、レジンから切断されたペプチドが沈殿する間、温度は１０℃以下に維持された。完全に沈殿した後、混合物を１０℃未満で４５±１５分間撹拌下に放置した。次いで、混合物を濾過し、ＭＴＢＥで２回、ＭＴＢＥ（３容量）およびアセトニトリル（１容量）の混合物を含む溶液で１回洗浄した。濾過後、得られた濾過ケークを真空下で１～３時間乾燥させた。
１．１２ ＰｒｅＲＰＣ１（Ｏ→Ｎアシル基転位）
従来、Ｏ→Ｎアシル基転位は、以下の手順を使用して溶液中で行われる。乾燥したレジンに、ＡｃＯＨ／ＭｅＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋１％ＮＨ_４ＯＡｃ（ｗ／ｗ）（１０％／５０％／４０％）を含む溶液を添加した。混合物を一晩撹拌しながら放置した。次いで、混合物を濾過し、濾過ケークを同じ溶液で洗浄した。２回の切断からの粗ペプチドを含む組み合わせた濾液（最大３６００ｇ、約０．８モルのペプチドに相当）を５℃で保存した。

本発明の方法によれば、Ｏ→Ｎアシル基転位は、本明細書、特に実施例３に記載されるように、カラム上で行われる。
１．１３ 精製ＲＰＣ１（一次元）
ＲＰＣ１で使用した緩衝液：
・緩衝液Ａ：０．１％Ｈ_３ＰＯ_４
・緩衝液Ｂ：ＭｅＣＮ
・緩衝液Ｃ：４５ｍＭ Ｈ_３ＰＯ_４、ｐＨ２．２＋１００ｍＭ ＮａＣｌ
・緩衝液Ｄ：４５ｍＭ Ｈ_３ＰＯ_４、ｐＨ７．７～８．０＋１００ｍＭ ＮａＣｌ
脱保護および切断ステップからの溶液を、０．２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液で５倍の容量に希釈した。溶液を濾過し、Ｃ１８シリカゲルを充填したカラム（カラム寸法４５ｘ（５０－４５ｃｍ））に最大１５ｇ／Ｌのカラム容量を適用し、９５％ Ｃおよび５％ Ｂを含む溶液で予め平衡化した。ペプチド溶液の適用後、カラムを平衡化溶液で洗浄し、次いで、９５％ Ｄおよび５％ Ｂを含む溶液で、溶出液のｐＨが７．５を超えるまで洗浄した。溶出の前に、ｐＨが２．５未満になるまで、９５％ Ｃおよび５％ Ｂを含む溶液でカラムを洗浄した。（Ｐｒｅ－ＲＰＣ１）
次いで、９３％ Ａおよび７％ Ｂを含む溶液でカラムを洗浄した。吸着したペプチドは、１２カラム容量で移動相を７％ Ｂ（９３％ Ａ）から２２％ Ｂ（７８％ Ａ）に変更するグラジエントを適用して溶出した。グラジエントは２２％ Ｂ（７８％ Ａ）に保った。その後、溶出したピークのＵＶが４０～４５％に達するまで、２２％ Ｂで定組成溶出を行った。溶出を２８０ｎｍでモニタリングし、回収した画分をＲＰ－ＨＰＬＣで分析した。脱保護および切断のステップから残りのプールを精製するためにこのプロセスを繰り返し、８５％以上のペプチド純度を示す画分をプールした。純度５５％以上８５％以下の画分は、合わせた画分を水で２倍容量に希釈した後、Ｃ１８カラムに最大１５ｇ／Ｌのカラム容量を適用することによって再クロマトグラフィーを行った。メインピークの前に回収されたプライマリーランからの画分は、１カラム容量中に移動相を１０％ Ｂ（９０％ Ａ）から１４％ Ｂ（８６％ Ａ）に変更し、次いで９カラム容量で１４％ Ｂ（８６％ Ａ）から２３％ Ｂ（７７％ Ａ）に変更するグラジエントを適用し、その後、溶出したピークのＵＶが９５％に達するまで２３％ Ｂ（７７％ Ａ）で均一濃度の溶出により溶出した。

メインピークの後に回収されたプライマリーランからの画分は、１カラム容量中に移動相を１０％ Ｂ（９０％ Ａ）から１４％ Ｂ（８６％ Ａ）に変更し、次いで９カラム容量で１４％ Ｂ（８６％ Ａ）から２２％ Ｂ（７８％ Ａ）に変更するグラジエントを適用し、その後、溶出したピークのＵＶが９０％に達するまで２２％ Ｂ（７８％ Ａ）で均一濃度の溶出により溶出した。純度８５％以上の再クロマトグラフィー後の画分をメインプールと混合し、ＲＰＣ１の最終プールを得た。したがって、３．６ｋｇの粗ペプチドを精製するために、３回のプライマリーランならびに１回のフロント・リランおよび１回のバック・リランを含むプロセスが記載され、最終的なＲＰＣ１プールを得た。
１．１４ 精製ＲＰＣ２（二次元）
ＲＰＣ２で使用した緩衝液：
・緩衝液Ａ：０．１％ ＴＦＡ
・緩衝液Ｂ：ＭｅＣＮ
ＲＰＣ１からの最終プールを水で２倍容量に希釈し、Ｃ１８シリカゲルを充填したＲＰＣカラム（カラム寸法：４５ｘ（５０－４５ｃｍ））に最大１３ｇ／Ｌのカラム容量を適用し、９０％ Ａおよび１０％ Ｂを含む溶液で予め平衡化した。ペプチドの適用後、５カラム容量の平衡化溶液でカラムを洗浄した。吸着したペプチドは、１カラム容量中に移動相を１０％ Ｂ（９０％ Ａ）から１９％ Ｂ（８１％ Ａ）に変更し、次いで、１２カラム容量中に１９％ Ｂ（８１％ Ａ）から３０％ Ｂ（７０％ Ａ）に変更するグラジエントで溶出した。その後、溶出したピークのＵＶが最大値の４０～４５％に達するまで均一濃度の溶出を行った。次いで、グラジエントを６０％ Ｂ（４０％ Ａ）に変更し、全てのペプチドが溶出するまでこの値を保持した。溶出を２８０ｎｍでモニタリングし、回収した画分をＲＰ－ＨＰＬＣで分析した。ＲＰＣ１からの残りのプールを精製するためにこのプロセスを繰り返し、純度９２以上、不純物ｄｅｓ－Ｉｌｅ^２７－Ａｌａ^２８が０．５％未満を示す画分をプールした。水で希釈した後、純度５０％超で９２％未満および／または不純物ｄｅｓ－Ｉｌｅ^２７－Ａｌａ^２８が０．５％超で１．５％未満を示すメインピークの前に回収した画分ならびに純度５０％超で９２％未満を示すメインピークの後に回収した画分を、Ｃ１８カラムに最大２０ｇ／Ｌのカラム容量の適用によって再クロマトグラフィーし、１カラム容量中に移動相を１０％ Ｂ（９０％ Ａ）から２０％ Ｂ（８０％ Ａ）に変更し、次いで、９カラム容量で２０％ Ｂ（８０％ Ａ）から３０％ Ｂ（７０％ Ａ）に変更するグラジエントの適用によって溶出し、その後、溶出したピークのＵＶが４５％に達するまで３０％ Ｂ（７０％ Ａ）で均一濃度の溶出を行った。

再クロマトグラフィー後に得られた純度９２％以上、および不純物ｄｅｓ－Ｉｌｅ^２７－Ａｌａ^２８が０．５％未満の画分をメインプールと混合し、ＲＰＣ２の最終プールを得た。
１．１５ 精製ＲＰＣ３（三次元）
ＲＰＣ３で使用した緩衝液：
・緩衝液Ａ：１００ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ＋０．５％ ＡｃＯＨ
・緩衝液Ｂ：ＭｅＣＮ
ＲＰＣ２からの最終プールを水で２倍の容量に希釈し、Ｃ１８シリカゲルを充填したＲＰＣカラム（カラム寸法：４５ｘ（５０－４５ｃｍ））に最大１３ｇ／Ｌのカラム容量を適用し、８５％ Ａおよび１５％ Ｂを含む溶液で予め平衡化した。ペプチドの適用後、平衡化溶液でカラムを洗浄した。吸着したペプチドは、１カラム容量中に移動相を１５％ Ｂ（８５％ Ａ）から２９％Ｂ（７１％Ａ）に変更し、次いで、１０カラム容量中に２９％ Ｂ（７１％ Ａ）から３７％ Ｂ（６３％ Ａ）に変更するグラジエントで溶出した。その後、ＵＶシグナルが最大値の３０％に達するまで均一濃度の溶出を行った。次いで、グラジエントを７０％ Ｂ（３０％ Ａ）に変更し、ＵＶシグナルがベースラインに達するまでこの値を保持した。溶出を２８０ｎｍでモニタリングし、回収した画分のｐＨをアンモニア水で５．８～６．０に調整した。回収した画分をＲＰ－ＨＰＬＣで分析し、ペプチド純度が９６．５％以上で、メインピークの前に０．５％を超える不純物が１つもない画分をプールし、ＲＰＣ３の最終メインプールを得た。ＲＰＣ２からの残りのプールを精製するために、このプロセスを繰り返した。
１．１６ 精製ＲＰＣ４（四次元）
ＲＰＣ４で使用した緩衝液：
・緩衝液Ａ：５ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ＋０．１％ ＡｃＯＨ
・緩衝液Ｂ：ＭｅＣＮ
・緩衝液Ｃ：１００ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ＋０．５％ ＡｃＯＨ
ＲＰＣ３からの最終プールを水で２倍の容量に希釈し、得られた溶液に酢酸アンモニウムを添加し、プール中の最終濃度、約１００ｍＭの酢酸アンモニウムを得た。Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＸＴ２０を充填したＲＰＣカラム（カラム寸法：４５ｘ（４０－３５ｃｍ））に最大１５ｇ／Ｌのカラム容量を適用し、９０％ Ｃおよび１０％ Ｂで予め平衡化した。ペプチドの適用後、１カラム容量の平衡化溶液ならびに１カラム容量の９０％ Ａおよび１０％ Ｂでカラムを洗浄した。吸着したペプチドは、１カラム容量中に移動相を１０％ Ｂ（９０％ Ａ）から１３％ Ｂ（８７％ Ａ）に変更し、次いで、１２カラム容量中に１３％ Ｂ（８７％ Ａ）から２５％ Ｂ（７５％ Ａ）に変更するグラジエントで溶出した。ＵＶシグナルが最大値の４０％に達した時点で、グラジエントを６０％ Ｂ（４０％ Ａ）に変更し、全てのペプチドが溶出するまでこの値を保持した。溶出を２８０ｎｍでモニタリングし、回収した画分のｐＨをアンモニア水で５．８～６．０に調整した。ＲＰＣ３からの残りのプールを精製するために、プロセスを繰り返した。回収した画分をＲＰ－ＨＰＬＣで分析し、ペプチド純度が９８．０％以上で、０．５％を超える不純物が１つもない画分をプールした。水で希釈した後、純度８０．０％以上で９８．０％未満および／または不純物Ｄｅｓ－Ｓｅｒ^７／８／アスパルチミドが０．５％超を示すメインピークの前に回収した画分ならびに純度８０．０％超で９８．０％未満および／または不純物Ｄｅｓ－Ｓｅｒ^７／８／アスパルチミドが０．５％超を示すメインピークの後に回収した画分を、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＸＴ２０カラムに最大１５ｇ／Ｌのカラム容量を適用して再クロマトグラフィーした。生成物は、１カラム容量中に移動相を１０％ Ｂ（９０％ Ａ）から１３％ Ｂ（８７％ Ａ）に変更し、次いで９カラム容量で１３％ Ｂ（８７％ Ａ）から２５％ Ｂ（７５％ Ａ）に変更するグラジエントの適用によって溶出し、その後、溶出したピークのＵＶが３０％に達するまで２５％ Ｂ（７５％ Ａ）で均一濃度の溶出を行った。画分をアンモニア水でｐＨ５．８～６．０に調整し、ＲＰ－ＨＰＬＣで分析した。再クロマトグラフィー後に得られた純度９８．０％以上、０．５％を超える不純物が１つもないプールをメインプールと混合し、ＲＰＣ４の最終プールを得た。
１．１７ 脱塩（ＳＰＥ）
脱塩に使用した緩衝液：
・緩衝液Ａ：１０ｍＭ ＡｃＯＨ
・緩衝液Ｂ：ＭｅＣＮ
ＲＰＣ４からの最終プールを、水を添加して２倍の容量に希釈し、次いで、酢酸アンモニウムを添加してプール中の最終濃度、約１００ｍＭを得た。Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＸＴ２０（カラム寸法：４５ｘ４０ｃｍ）を充填したカラムにプールを適用し、９５％ Ａおよび５％ Ｂで予め平衡化した。ペプチドの適用後、平衡化溶液でカラムを洗浄した。吸着したペプチドは、１カラム容量中に移動相を５％ Ｂ（９５％ Ａ）から５０％ Ｂに変更するグラジエントで溶出した。全てのペプチドが溶出されるまで、グラジエントをこの値に保持した。溶出を２８０ｎｍでモニタリングし、回収した画分をＲＰ－ＨＰＬＣで分析した。
１．１８ 精製したペプチドの単離
脱塩ステップからの生成物を減圧下、４０℃以下での蒸発に供した。この処理で、ＭｅＣＮを蒸発させ、ペプチド溶液を最初の容量のおよそ３０％まで減少させ、次いで、水で希釈して最終ペプチド濃度を約２５ｇ／Ｌを得た。濃縮したペプチドを０．４５／０．２２μｍのフィルターで濾過し、次いで、凍結乾燥により単離し、ＲＰ－ＨＰＬＣによる純度９７．７５％以上で、０．５％を超える不純物が１つもないことを示す約１．３ｋｇの精製ペプチド（総精製収率３５％以上）を得た。

実施例２
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用することによる粗ペプチドの最適化
ＺＰ１８４８合成の開発中、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）_６の存在により、予想されるように、いくつかのｔｅｒｔ－ブチル化副生成物（＋５６Ｄａ）がもたらされることに留意されたい。特にこれらのいくつかはメインピークの近くに溶出したため、精製した溶液中にも見出すことができた（図２、上部パネル）。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、この＋５６不純物はｔｅｒｔ－ブチル基の切断に関連しており、したがって＋５６部分はリジンテールのどこか、最も可能性の高い３７または３８に位置していると考えている。

［Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）］_６を用いてＺＰ１８４８の合成を行うと、ｔｅｒｔ－ブチル化副生成物は高度に除去されたが（図２、底部パネル）、それにもかかわらず、合成の他の場所で保護基から移行した結果として、いくつかのブチル化副生成物が観察されることがある。

テールの各リジン残基にＬｙｓ（Ｔｒｔ）を使用する必要はないが、使用することもできる。Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨは、特にモルベースで、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨよりも高価なビルディングブロックであるため、コスト効率の高いプロセスでは、このビルディングブロックを一部のみのアミノ酸カップリングにのみ適用することができる。

さらに、本発明者らは、Ｌｙｓ^３９（Ｂｏｃ）およびＬｙｓ^３８（Ｂｏｃ）残基を使用することから生じるｔｅｒｔ－ブチル化副生成物Ｌｙｓ^３９－ｔ－ＢｕおよびＬｙｓ^３８－ｔ－Ｂｕが、所望のペプチドを得るために粗ペプチドから除去するのが最も困難な不純物であることを観察した。これら２つの残基の保護基をＢｏｃからＴｒｔに変えると、Ｌｙｓ^３９－ｔ－ＢｕおよびＬｙｓ^３８－ｔ－Ｂｕのｔｅｒｔ－ブチル化副生成物の形成を防ぐ。したがって、本発明者らは、最初の２つのカップリング（すなわち、Ｌｙｓ^３９およびＬｙｓ^３８残基）のみにＬｙｓ（Ｔｒｔ）を使用し、［Ｋ（Ｂｏｃ）］_４［Ｋ（Ｔｒｔ）］_２モチーフを得ることにより、メインピーク（図３、９．４８７のピーク）に最も近い位置から溶出するｔｅｒｔ－ブチル化副生成物の除去が容易になり、したがって、より純粋な粗生成物を得ることができると判定した。この結果として、よりクリーンな精製プロセスが可能となり、高い収率およびより純粋な最終生成物が得られる。

実施例３
Ｐｒｅ－ＲＰＣ１のカラムにおけるＯからＮへのアシル基転位
ＺＰ１８４８の切断の際（実施例１．１１）、Ｎ→Ｏアシル基転位が生じる。粗沈殿生成物をＡｃＯＨ／ＭｅＣＮ／１％水性ＮＨ_４ＯＡｃの１：５：４混合物に溶解し、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）の脱炭酸のために一晩放置すると、アセチル化（すなわち、ペプチド鎖のトランケーション）およびトリフルオロアセチル化不純物（すなわち、ペプチド鎖のトリフルオロアセチルエステル）も見出される。

精製ステップの前にｐＨを中性に調整し、酸性条件に戻すことでこれらの不純物が減少し、Ｏ→Ｎアシル基転位が行われることが知られている。例えば、（ａ）Ｂｅｒｇｍａｎｎ Ｍ、Ｂｒａｎｄ Ｅ、Ｗｅｉｍａｎｎ Ｆ．Ｚ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９２３；１３１：１～１７、（ｂ）Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＡＰ、Ｂａｌｔｚｌｙ Ｒ、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１９４７；６９：２００～２０４を参照されたい。

Ｏ→Ｎアシル基転位は通常、ペプチド生成物をカラムに添加する前に溶液中で行われる。転位を行うために、通常はリン酸緩衝液／リン酸を使用してｐＨを低下させる。
しかしながら、ペプチド生成物溶液にリン酸緩衝液／リン酸を使用すると、ＺＰ１８４８は中性ｐＨで沈殿することが見出された（リン酸緩衝液の不相溶性に関するさらなる詳細については、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０／０６５０６４の実施例４を参照されたい）。さらに、精製前のペプチド生成物溶液中の酢酸含量が高いため、沈殿を起こさずにｐＨを中性ｐＨまで上昇させることは、非常に大量のＮａＯＨを必要とし、現実的ではなく、実行可能ではないことが見出された。

さらに、ＺＰ１８４８はＮａＣｌ、リン酸、ＮａＯＨおよび高イオン強度を含む溶液中では中性ｐＨで沈殿する。
この実施例の目的は、溶液中およびカラム上でＯ→Ｎアシル基転位を行った場合の結果を比較することである。

以下の表４．１では、ＲＰＣ１下のカラムに存在する条件と同じ条件を溶液中に反映させるために、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび４５ｍＭリン酸（緩衝液は実施例１．１２に記載されている）中で、異なるｐＨおよび／または濃度でＺＰ１８４８の様々な製剤を調製した。

表４．１のデータは、ＲＰＣ１の際にカラムで使用した条件と同じ条件を溶液中で使用すると、ＺＰ１８４８が沈殿することを明確に示している。沈殿は試料調製後、数分以内に生じる。さらに、ＺＰ１８４８はｐＨ７．５の低濃度（０．２および０．５ｍｇ／ｍＬ）でも沈殿することが示された。

驚くべきことに、最初の精製ステップの前に、精製に使用するＣ１８カラムでこのｐＨ処理を行うことが可能であることが見出された。特に、リン酸緩衝液を材料の損失なしに使用できることは驚きである。実際には、Ｐｒｅ－ＲＰＣ１およびＲＰＣ１は同じカラムで実施されるため、精製順序から処理ステップが除去される。

切断において、図４のデータは、ＴＦＡおよびアシル不純物、ならびにアシル基転位がカラム上でｐＨ処理後に低下していることを示している。さらに、ペプチドが中性ｐＨのリン酸緩衝液と不相溶である（沈殿の可能性がある）ためにカラムで失われる可能性のある収量も評価した。図４の実験では、１００ｍｇをｐＨ処理前およびｐＨ処理後に使用し、ＺＰ１８４８の量は８９ｍｇと定量された（約１０ｍｇの損失は、切断／沈殿中の生成物の取り扱いによって説明できる）。したがって、カラムでの損失は無視できると考えられ、カラムでのｐＨ処理による収量の損失は観察されなかった。結論として、カラム上でＯ→Ｎアシル基転位を行うことで、所望の化学変換を達成しながら、望ましくない沈殿を防ぐ。さらに、ｐＨを中性に上昇させることで、Ｏ→Ｎアシル基転位と、アセチル化およびトリフルオロアセチル化不純物の加水分解により、収率が約５％増加する。すなわち、ＲＰＣ１ステップから溶出する生成物の定量した量は、負荷量中の定量した量より約５％高い。

実施例４
粗ペプチドの精製および不要な成分の除去
実施例１で概説したように、Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳの５段階（「前」段階と４つの「次元」）クロマトグラフィー精製プロセス（Ｐｒｅ ＲＰＣ１＋ＲＰＣ１～ＲＰＣ４）を使用すると、純度９８．２％のＺＰ１８４８生成物が得られた。ＵＶまたはＭＳ検出器付き分析ＨＰＬＣで評価した際に、ＺＰ１８４８生成物には０．５％以下の不純物が含まれることが見出された。精製プロセスの各ステップは、ペプチドの不純物（すなわち高分子量（ＨＭＷ）トランケーション、欠失、またはその他の望ましくない誘導体）などの特定の不要な成分を除去するため、または最終物質の純度を向上させるために開発された。これらの不要な成分は、共有結合または非共有結合の不純物で構成されている可能性があり、生理活性が変化したり、不活性化されたり、または未知の副作用があったりするため、可能な限り低減する必要がある。ＺＰ１８４８生成物では、少なくとも１つの種のＣ末端脱アミド化、ＨＭＷ化合物、およびアスパラギン酸からのアスパラギン酸関連不純物（Ｉｓｏ－Ａｓｐ／Ｂｅｔａ－Ａｓｐおよびアスパルチミドの形成など）の形成が、特に望ましくない不純物である。
特定の不純物の除去－Ｃ末端脱アミド化生成物、Ｌｙｓ^３９－ＯＨ不純物およびアスパラギン酸関連不純物
ＲＰＣステップの順序は、ＲＰＣ１がＲＰＣ２および３よりも先に実行される必要があるという点で、極めて重要であり、なぜなら、ＲＰＣ１は不純物を除去するため、そうでなければ、この２つのステップで見られる不可欠な詳細が不明瞭になるためである。

一次元（ＲＰＣ－１）ではリン酸緩衝液を使用し、二次元ではＴＦＡを使用し、三次元および四次元では酢酸アンモニウムを使用した。全ての精製ステップでアセトニトリル（ＭｅＣＮ）を有機修飾剤として使用した。精製の有効性を評価するため、各ステップ後の主成分の画分をＨＰＬＣまたはＬＣ－ＭＳで分析した。得られた純度、主な望ましくない不純物、特に除去しにくい不純物の結果を以下の表４．１に示す。連続的な精製ステップを経て、アスパラギン酸関連不純物（Ｉｓｏ－Ａｓｐ／Ｂｅｔａ－Ａｓｐおよびアスパルチミドの形成）が減少し、純度９８％以上の最終生成物を達成することを見出すことができる。

第１のＲＰＣは、主成分の単離と、特定の不純物、すなわちアスパラギン酸関連不純物およびＣ末端脱アミド化不純物との除去に使用される。ほとんどの切断型末端アミノ酸部分もこのステップで除去される。ＲＰＣ１前の粗生成物では、Ｃ末端の脱アミド化生成物であるＬｙｓ^３９－ＯＨ不純物のレベルが２．９％と比較的高く、ＲＰＣ１を実行した後では最後の画分にのみ溶出するため、この不純物の除去にはこの精製ステップが非常に効率的である。Ｃ末端の脱アミド化生成物の代わりにＲＰＣ２を使用した場合、Ｌｙｓ^３９－ＯＨ不純物も同様に、５０％超のＺＰ１８４８を含む５つの画分にわたり溶出する。これは、ＲＰＣ１と、リン酸緩衝液の使用とが、この不純物を非常に効率的に減少させることができ、一方、ＲＰＣ２は失敗し、全体の収率および純度を損なうことを示す。

ＴＦＡおよび酢酸アンモニウムは、Ｃ末端の脱アミド化生成物と主生成物との分離に失敗するのに対し、リン酸緩衝液の使用はこの目的に使用するのに特に適していた。第２、第３、第４のステップは純度を向上させるが、アスパラギン酸関連不純物の除去にも使用される。
オリゴマーの除去
オリゴマーは主に精製前に生成され、粗溶液（切断酸性条件）で観察される。表４．２は、ＺＰ１８４８の精製を通してのオリゴマーの含有量を示している。共有結合したオリゴマー生成物のレベルは、粗溶液中では１．８％であるが、Ｏ→Ｎアシル基転位後は２．４％にわずかに増加する。オリゴマーは主にＲＰＣ１で、一部はＲＰＣ２で除去され、最終生成物中のレベルは０．１％未満である。データはまた、精製プロセスを通して、オリゴマーのさらなる生成がないことを示している。

表４．２からわかるように、ＲＰＣ１後ではオリゴマーは強く減少し、ＲＰＣ２後では微量（すなわち少量）しか存在しない。オリゴマーの量は、カラムでのｐＨ処理中に増加しないと予想される。

Claims (15)

1. 固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成されるＧＬＰ－２アナログを生成する方法であって、ＧＬＰ－２アナログは、以下の式：
   Ｒ^１－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｘ５－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｘ１１－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－ＩＩｅ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｚ^２－Ｒ^２
   （式中、
   Ｒ^１は、水素、Ｃ_１～４アルキル（例えば、メチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、またはトリフルオロアセチルであり、
   Ｘ５は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、
   Ｘ１１は、ＡｌａまたはＳｅｒであり、
   Ｒ^２は、ＮＨ_２またはＯＨであり、
   Ｚ^２は、存在しないか、またはＬｙｓの１～６個のアミノ酸単位のペプチド配列である）、
   によって表されるか、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体であり、
   方法は、以下のステップ：
   ｉ）粗ＧＬＰ－２アナログをカラムに負荷するステップと、
   ｉｉ）第１の緩衝系でカラムのｐＨを調整するステップとを含み、
   ステップｉｉ）は、カラムのｐＨを酸性ｐＨから中性またはわずかに塩基性ｐＨに上昇させることにより、ペプチドがカラム上にある間にペプチドの等電点を通過させることを含む、方法。
2. 第１の緩衝系はリン酸緩衝系である、請求項１に記載の方法。
3. Ｚ^２は、Ｌｙｓの１～６個のアミノ酸単位のペプチド配列である、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. カラムの酸性ｐＨを上昇させるステップは、ｐＨを中性ｐＨ（ｐＨ７）に上昇させるステップを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. カラムの酸性ｐＨを上昇させるステップは、ｐＨをｐＨ≧７．２、例えば約７．５のｐＨに上昇させるステップを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
6. （１）ｉ）ＧＬＰ－２アナログをカラムに負荷するステップ、
   ｉｉ）リン酸塩緩衝液／リン酸を含む第１の緩衝系でカラムのｐＨを調整するステップ、次いで、
   ｉｉｉ）ＧＬＰ－２アナログを含有するプールを溶出するステップ、次いで
   （２）ｉ）ステップ（１）で得られたＧＬＰ－２アナログを含有するプールをカラムに負荷するステップと、
   ｉｉ）トリフルオロ酢酸を含む第２の緩衝系でカラムを洗浄し、ＧＬＰ－２アナログを含有するプールを溶出するステップ、次いで
   （３）ｉ）ステップ（２）で得られたＧＬＰ－２アナログを含有するプールをカラムに負荷するステップと、
   ｉｉ）酢酸／酢酸アンモニウムを含む第３の緩衝系でカラムを洗浄し、ＧＬＰ－２アナログを含有するプールを溶出するステップ、次いで、
   （４）ｉ）ステップ（３）で得られたＧＬＰ－２アナログを含有するプールをカラムに負荷するステップと、
   ｉｉ）酢酸／酢酸アンモニウムを含む第４の緩衝系でカラムを洗浄し、ＧＬＰ－２アナログを含有するプールを溶出するステップ
   を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. Ｚ^２中の少なくとも１つのＬｙｓ単位は、合成中にトリチル保護基で保護される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. Ｚ^２は、Ｌｙｓの２～６個のアミノ酸単位のペプチド配列であり、方法は、
   ｉ）リンカーを用いて、第１のＰ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを固体ペプチドレジンに結合させるステップと、
   ｉｉ）Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）アミノ酸単位からＰ基を除去するステップと、
   ｉｉｉ）リンカーを用いて、第２のＰ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを固体ペプチドレジンに結合したＬｙｓ（Ｔｒｔ）アミノ酸単位に結合させるステップと、
   ｉｖ）第２のＬｙｓ（Ｔｒｔ）アミノ酸単位からＰ基を除去するステップと、
   ｖ）ＧＬＰ－２アナログが合成されるまで、後続のアミノ酸単位を結合させるステップと、
   ｖｉ）固体ペプチドレジンからＧＬＰ－２アナログを切断するステップと、
   ｖｉｉ）ＧＬＰ－２アナログを精製するステップを含み、
   各Ｐは、保護基である、請求項７に記載の方法。
9. Ｘ５はＴｈｒであり、および／またはＸ１１はＡｌａである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. ＧＬＰ－２アナログは以下：
    ＺＰ１８４８ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ－ＮＨ_２（配列番号１）
    ＺＰ２９４９ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫ－ＯＨ（配列番号２）；
    ＺＰ２７１１ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫ－ＯＨ（配列番号３）；
    ＺＰ２４６９ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ－ＯＨ（配列番号４）；
    ＺＰ１８５７ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ－ＮＨ_２（配列番号５）；および
    ＺＰ２５３０ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ－ＯＨ（配列番号６）
    から選択される、請求項９に記載の方法。
11. ＧＬＰ－２アナログは以下：
    ＺＰ１８４８ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ－ＮＨ_２（配列番号１）
    ＺＰ２９４９ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫ－ＯＨ（配列番号２）；
    ＺＰ２７１１ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫ－ＯＨ（配列番号３）；および
    ＺＰ２４６９ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ－ＯＨ（配列番号４）
    から選択される、請求項９に記載の方法。
12. ＧＬＰ－２アナログは：
    ＺＰ１８４８ Ｈ－ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ－ＮＨ_２（配列番号１）である、請求項９に記載の方法。
13. Ｘ５はＳｅｒであり、および／またはＸ１１はＳｅｒである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
14. ＧＬＰ－２アナログは以下：
    ＺＰ１８４６ Ｈ－ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ－ＮＨ_２（配列番号７）；
    ＺＰ１８５５ Ｈ－ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ－ＮＨ_２（配列番号８）；および
    ＺＰ２２４２ Ｈ－ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ－ＯＨ（配列番号９）
    から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. ＧＬＰ－２アナログは：
    ＺＰ１８４６ Ｈ－ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ－ＮＨ_２（配列番号７）である、請求項１３に記載の方法。