JP2024541976A

JP2024541976A - キメラアダプターポリペプチド

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Publication number: JP2024541976A
Application number: JP2024525309A
Authority: JP
Inventors: ブレークティー．アフタブ，; マリッサヘルマン，; ジェーソンロメロ，; ダウレットサトパエフ，; スチュワートアボット，; アルンバット，; ジョナサンウォン，
Original assignee: アディセットセラピューティクス，インク．
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2022-10-27
Publication date: 2024-11-13
Also published as: MX2024005058A; IL312395A; EP4423283A4; CA3236408A1; US20250108069A1; WO2023076523A1; AU2022379538A1; EP4423283A1; CN118510901A; KR20240111754A

Abstract

開示の態様は、操作宿主細胞を用いた多種多様な疾患／状態の処置のための組成物及び方法を含む。いくつかの実施形態では、操作宿主細胞が、ＤＡＰ１０を含むキメラアダプター（ＣＡＤ）ポリペプチドを含む。ＣＡＤポリペプチドは、関連受容体と連動して宿主細胞の細胞生存及び増殖を増強し、非宿主細胞の細胞殺傷活性を促進する置換変異及び／または追加のタンパク質ドメインを含む。【選択図】図１Ｄ

Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０２１年１０月２７日に提出された米国仮出願第６３／２７２，６１３号の優先権を主張する。

開示の分野
本開示は、一般的には、細胞免疫療法に関し、特に、細胞の生存、増殖、シグナル伝達などを改善するための、様々な細胞タイプの特定の受容体（複数可）に関連するキメラアダプターポリペプチドに関する。

養子細胞療法は、基本的なリンホカインの活性化及び／または腫瘍浸潤に焦点を当てた初期の頃から、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの遺伝子組み換え抗原受容体を発現するように免疫細胞を操作する最近の戦略まで、３０年超にわたってほぼ継続的に反復されている。しかし、これまでの様々なアプローチによる治療の可能性についてのいくつかのヒント及び指示があったが、依然として、無数の問題がある。

１つの問題は、養子細胞療法の標的の発現が低い、または失われている（つまり、抗原回避）という問題に関連する。具体的には、養子（または自然）細胞療法に対する耐性の一般的なメカニズムは、標的抗原の喪失または下方調節を伴う細胞型（例えば、腫瘍）の出現である。そのような喪失または下方調節は、養子（または自然）細胞応答の有効性の低減につながり得る（ＭａｊｚｎｅｒＲＧａｎｄＭａｃｋａｌｌ，ＣＬ．（２０１８）ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，８（１０）：１２１９－２６）。

もう１つの関連問題は、特定の疾患に関連する細胞に特異的に存在するリガンドを認識できる天然に存在する受容体（複数可）の下方調節であり、これも、様々な疾患状態に対する細胞応答の効果の無効につながり得る。代表例としては、ＮＫＧ２Ｄは、ヒトのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ８＋αβＴ細胞、及びγδＴ細胞に見出される活性化免疫受容体であり、これは、自然免疫応答及び養子免疫応答の両方を調節する。ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドは、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ、及びいくつかのＵＬ１６結合タンパク質を含む（ＢａｕｅｒＳ，ｅｔａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２８５５４２８：７２７－７２９；ＢｕｒｇｅｓｓＳ．Ｊ．，ｅｔａｌ．（２００８）ＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ，２００８，４０（１）：１８－３４）。ヒトでは、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、正常細胞では発現していないが、形質転換したまたはウイルス感染したがん細胞では、様々なレベルで広く発現している（例えば、以下を参照：ＢａｕｅｒＳ，ｅｔａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２８５５４２８：７２７－７２９；ＢｕｒｇｅｓｓＳ．Ｊ．，ｅｔａｌ．（２００８）ＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ，４０（１）：１８－３４；ＢａｕｇｈＲ，ｅｔａｌ．（２０２０）Ｃａｎｃｅｒｓ１２（１２）：３８２７）。腫瘍細胞表面でのＮＫＧ２Ｄリガンドの発現は、ＮＫＧ２Ｄを活性化して、ＮＫ細胞を活性化し、エフェクターＴ細胞を共刺激することにより、腫瘍細胞を免疫細胞媒介性破壊に対して感作させる。従って、ＮＫＧ２Ｄ受容体及びそのリガンドは、がん免疫療法の目的の標的である。

しかし、残念ながら、ＮＫＧ２Ｄは、最も必要とされる場合、下方調節することができる。例えば、腫瘍由来腫瘍成長因子β（ＴＧＦ－β）は、ＮＫＧ２Ｄを下方調節し、それにより、ＮＫ細胞及びＣＤ８^＋細胞による腫瘍細胞の殺傷を低減させ得る（例えば、以下を参照：Ｃｒａｎｅ，Ｃ．，ｅｔａｌ．（２０１０）Ｎｅｕｒｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１２（１）：７－１３，及びＤａｓｇｕｐｔａ，Ｓ．，ｅｔａｌ．（２００５）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌ，１７５：５５４１－５０）。次に、これは、腫瘍の処置の予後不良に関連する。

ＮＫＧ２Ｄは、とりわけ、例えば、免疫細胞の生存及び増殖を改善し、内因性受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）の下方調節を防ぎ、例えば、養子免疫療法アプローチの標的である抗原の免疫逃避を補い得る組成物及び方法が当該技術分野で必要とされていることを示すために、例として言及される。そのような組成物及び方法は、養子免疫療法を受けている患者の予後を改善するであろう。

開示の概要
本発明は、キメラアダプター（ＣＡＤ）コンストラクト及びヒトＤＡＰ１０を含むポリペプチド、ならびにそれらの使用方法により、従来技術の上述の欠点に対処する。本明細書で初めて明確に述べられ、示されるように、主題のＣＡＤコンストラクト及びポリペプチドは、様々な細胞表面上の標的抗原を認識可能な受容体の安定性を改善し、受容体－標的の結合時に細胞シグナル伝達経路（複数可）の好ましいバランスを促進し、及び／または受容体の様々なリガンド（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）との結合時に誘発される機能特性（例えば、細胞溶解、増殖、生存、及び／または共刺激特性の強化）を改善し得る。

一態様では、本発明は、キメラアダプター（ＣＡＤ）ポリペプチドをコードする単離核酸を提供し、ＣＡＤポリペプチドは、ＤＡＰ１０ドメイン及び少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含み、ＣＡＤポリペプチドは、機能的な細胞外受容体及び／またはリガンド結合ドメインを含む細胞外ドメインを特異的に欠いている。好ましい実施形態では、ＤＡＰ１０ドメインは、ヒトＤＡＰ１０アミノ酸配列を含む。

実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ３Ｃ、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＦｃＲ、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０、またはそれらの組み合わせを含むか、またはそれらからなる群より選択される。実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインは、４－１ＢＢである。実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＣＤ２８である。

実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、さらに、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２、ＬＦＡ－１、及びＣＤ３ｔ、またはそれらの組み合わせを含む群から選択されるか、またはそれからなる。実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζである。実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインは、４－１ＢＢであり、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζである。実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＤＡＰ１０ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、それに続く、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＤＡＰ１０ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ２８共刺激ドメインを含む。実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＤＡＰ１０ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、それに続くＣＤ２８共刺激ドメイン、次に、それに続く、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＤＡＰ１０ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、それに続くＣＤ２８共刺激ドメイン、次に、それに続く、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

実施形態では、ＤＡＰ１０ドメインは、配列番号１と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトＤＡＰ１０アミノ酸配列を含む。実施形態では、ヒトＤＡＰ１０アミノ酸配列は、変異ヒトＤＡＰ１０アミノ酸配列を含む。実施形態では、変異ヒトＤＡＰ１０アミノ酸配列は、Ｋ８４及び／またはＹ８６に対応する位置にアミノ酸置換を含む。実施形態では、位置Ｋ８４のアミノ酸置換は、Ｋ８４Ｒ置換を含む。実施形態では、位置Ｙ８６のアミノ酸置換は、Ｙ８６Ｆ置換を含む。

実施形態では、単離核酸は、配列番号６０、または配列番号６２、または配列番号６４、または配列番号６６、または配列番号６８、または配列番号７０、配列番号７２、配列番号８２、または配列番号９０に記載の核酸配列を含む。

実施形態では、単離核酸は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結されている。実施形態では、単離核酸は、さらに、サイトカインをコードする。実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３からなる群より選択される。実施形態では、単離核酸は、さらに、マーカータンパク質をコードする。実施形態では、マーカータンパク質は、切断型ＣＤ１９、ＣＤ２０（リツキシマブ認識ドメイン）、切断型ＥＧＦＲ、及びＬＮＧＦＲからなる群より選択される。

別の態様では、本発明は、上述の単離核酸のいずれかを含む発現ベクターを提供する。

別の態様では、本発明は、上述の単離核酸または発現ベクターのいずれかにコードされるキメラアダプター（ＣＡＤ）ポリペプチドを提供する。

別の態様では、本発明は、上述の発現ベクターまたはＣＡＤポリペプチドのいずれかを含む哺乳動物細胞を提供し、哺乳動物細胞は、ＤＡＰ１０に関連する少なくとも１つの受容体を発現する。実施形態では、ＤＡＰ１０に関連する少なくとも１つの受容体は、内因性、外因性、または過剰発現している。例示的な実施形態では、受容体は、ＮＫＧ２Ｄである。実施形態では、哺乳動物細胞は、免疫細胞であり、好ましくは、免疫細胞は、細胞傷害性細胞である。

別の態様では、本発明は、免疫細胞を活性化する方法を提供し、方法は、本発明のＣＡＤポリペプチドを免疫細胞内で発現することを含み、免疫細胞は、ＤＡＰ１０に関連する少なくとも１つの受容体を発現し、活性化は、対応する標的分子と結合する受容体に応答して生じる。実施形態では、受容体は、内因性、外因性、または過剰発現される。例示的な実施形態では、受容体は、ＮＫＧ２Ｄである。実施形態では、免疫細胞またはその複数が、それを必要とする対象に導入され、活性化が、対象内で生じる。

さらなる態様では、本発明は、本発明の哺乳動物細胞またはその複数を、対象における該状態の少なくとも１つの症状または徴候を低減する状態の対象を処置するための薬品の調製における、本発明の哺乳動物細胞またはその複数の使用を提供する。

さらに別の態様では、薬学的に許容される賦形剤及び本発明の複数の哺乳動物細胞を含む医薬組成物が提供される。
他の特徴、目的、及び利点は、以下の開示から明らかであろう。

参照による組み込み
本明細書に記載される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されているのと同じ範囲で、参照により本明細書に組み込まれる。

結合する受容体を組み合わせた、本開示の例示的なキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドを示す概略図である。示される図では、受容体は、ＮＫＧ２Ｄである。Ｋ８４Ｒ及びＹ８６Ｆ改変を有するキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドを示す。結合する受容体を組み合わせた、本開示の例示的なキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドを示す概略図である。示される図では、受容体は、ＮＫＧ２Ｄである。Ｋ８４Ｒ及びＹ８６Ｆ改変を有するキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチド、ならびにＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣ末端融合体を示す。結合する受容体を組み合わせた、本開示の例示的なキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドを示す概略図である。示される図では、受容体は、ＮＫＧ２Ｄである。Ｋ８４Ｒ及びＹ８６Ｆ改変を有するキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチド、ならびに４－１ＢＢ共刺激ドメインを含むＣ末端融合体を示す。結合する受容体を組み合わせた、本開示の例示的なキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドを示す概略図である。示される図では、受容体は、ＮＫＧ２Ｄである。Ｋ８４Ｒ及びＹ８６Ｆ改変を有するキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチド、ならびに４－１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの両方を含むＣ末端融合体を示す。腫瘍細胞単独及び同じくＶδ１細胞でも発現された対照キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトと比較して、Ｖδ１細胞で発現され、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞に対して試験された本開示の様々なキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドの細胞傷害性指数を示すグラフである。腫瘍細胞単独及び同じくＶδ１細胞でも発現された対照キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトと比較して、Ｖδ１細胞で発現され、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞に対して試験された本開示の様々なキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドの細胞傷害性指数を示すグラフである。腫瘍細胞単独及び同じくＶδ１細胞でも発現された対照キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトと比較して、Ｖδ１細胞で発現され、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞に対して試験された本開示の様々なキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドの細胞傷害性指数を示すグラフである。図２Ａ～２Ｃのアッセイで観察されたＶδ１細胞の増殖の程度を示すプロットである。図２Ａ～２Ｃのアッセイで観察されたＶδ１細胞の増殖の程度を示すプロットである。図２Ａ～２Ｃのアッセイで観察されたＶδ１細胞の増殖の程度を示すプロットである。腫瘍細胞単独及び同じくＶδ１細胞でも発現された対照ＣＡＲコンストラクトと比較して、Ｖδ１細胞で発現され、ＨｅｐＧ２細胞に対して試験された本開示の様々なキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドの細胞傷害性指数を示すグラフである。腫瘍細胞単独及び同じくＶδ１細胞でも発現された対照ＣＡＲコンストラクトと比較して、Ｖδ１細胞で発現され、ＨｅｐＧ２細胞に対して試験された本開示の様々なキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドの細胞傷害性指数を示すグラフである。腫瘍細胞単独及び同じくＶδ１細胞でも発現された対照ＣＡＲコンストラクトと比較して、Ｖδ１細胞で発現され、ＨｅｐＧ２細胞に対して試験された本開示の様々なキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドの細胞傷害性指数を示すグラフである。図３Ａ～３Ｃのアッセイで観察されたＶδ１細胞の増殖の程度を示すプロットである。図３Ａ～３Ｃのアッセイで観察されたＶδ１細胞の増殖の程度を示すプロットである。図３Ａ～３Ｃのアッセイで観察されたＶδ１細胞の増殖の程度を示すプロットである。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞と５日間共培養した後の、本開示の様々なキメラＤＡＰ１０アダプターコンストラクトで形質導入されたＶδ１細胞の生存率を示すグラフである。本開示の選択されたキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドで形質導入されたＶδ１細胞を介した強力なｉｎｖｉｖｏ腫瘍成長を示すグラフである。本開示の選択されたキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドで形質導入されたＶδ１細胞を介した強力なｉｎｖｉｖｏ腫瘍成長を示すグラフである。本開示の様々なＤＡＰ１０アダプターポリペプチドで形質導入されたＶδ１細胞と、形質導入された細胞をＰＬＣ細胞と共培養した後のＮＫＧ２Ｄ発現レベルを示すグラフである。最も高いＮＫＧ２Ｄの発現レベルは、Ｋ８４Ｒ、Ｙ８６Ｆ、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインをそれぞれ含んだＤＡＰ１０アダプターポリペプチドで形質導入された細胞で観察された。抗ＤＡＰ１０抗体及び抗ＣＤ３ζ抗体により視覚化されたＣＡＤタンパク質のウェスタンブロットであり、これは、ＤＡＰ１０ＣＡＤ発現がＶδ１細胞の異なるロット間で類似していることを示す。ＤＡＰ１０ＣＡＤの細胞傷害活性が、ＮＫＧ２Ｄにより媒介されることを示すグラフである。ＣＡＤ＋（図８Ａ－８Ｂ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）＋Ｖδ１細胞（図８Ｃ－８Ｄ）を、ルシフェラーゼ標識標的細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５またはＨＬ６０）と共培養する前に、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン１Ｄ１１）またはアイソタイプ対照（１μｇ／ｍｌ～０．０１ｎｇ／ｍｌ）の様々な希釈度でプレインキュベートした。標的細胞の死滅は、ルシフェラーゼシグナルを測定することにより１８時間後に評価された。ＮＫＧ２Ｄ媒介性細胞傷害性は、アイソタイププレインキュベーションによる細胞傷害性％を、ＮＫＧ２Ｄ抗体プレインキュベーションによる細胞傷害性％と比較することにより評価することができる。ＤＡＰ１０ＣＡＤの細胞傷害活性が、ＮＫＧ２Ｄにより媒介されることを示すグラフである。ＣＡＤ＋（図８Ａ－８Ｂ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）＋Ｖδ１細胞（図８Ｃ－８Ｄ）を、ルシフェラーゼ標識標的細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５またはＨＬ６０）と共培養する前に、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン１Ｄ１１）またはアイソタイプ対照（１μｇ／ｍｌ～０．０１ｎｇ／ｍｌ）の様々な希釈度でプレインキュベートした。標的細胞の死滅は、ルシフェラーゼシグナルを測定することにより１８時間後に評価された。ＮＫＧ２Ｄ媒介性細胞傷害性は、アイソタイププレインキュベーションによる細胞傷害性％を、ＮＫＧ２Ｄ抗体プレインキュベーションによる細胞傷害性％と比較することにより評価することができる。ＤＡＰ１０ＣＡＤの細胞傷害活性が、ＮＫＧ２Ｄにより媒介されることを示すグラフである。ＣＡＤ＋（図８Ａ－８Ｂ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）＋Ｖδ１細胞（図８Ｃ－８Ｄ）を、ルシフェラーゼ標識標的細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５またはＨＬ６０）と共培養する前に、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン１Ｄ１１）またはアイソタイプ対照（１μｇ／ｍｌ～０．０１ｎｇ／ｍｌ）の様々な希釈度でプレインキュベートした。標的細胞の死滅は、ルシフェラーゼシグナルを測定することにより１８時間後に評価された。ＮＫＧ２Ｄ媒介性細胞傷害性は、アイソタイププレインキュベーションによる細胞傷害性％を、ＮＫＧ２Ｄ抗体プレインキュベーションによる細胞傷害性％と比較することにより評価することができる。ＤＡＰ１０ＣＡＤの細胞傷害活性が、ＮＫＧ２Ｄにより媒介されることを示すグラフである。ＣＡＤ＋（図８Ａ－８Ｂ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）＋Ｖδ１細胞（図８Ｃ－８Ｄ）を、ルシフェラーゼ標識標的細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５またはＨＬ６０）と共培養する前に、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン１Ｄ１１）またはアイソタイプ対照（１μｇ／ｍｌ～０．０１ｎｇ／ｍｌ）の様々な希釈度でプレインキュベートした。標的細胞の死滅は、ルシフェラーゼシグナルを測定することにより１８時間後に評価された。ＮＫＧ２Ｄ媒介性細胞傷害性は、アイソタイププレインキュベーションによる細胞傷害性％を、ＮＫＧ２Ｄ抗体プレインキュベーションによる細胞傷害性％と比較することにより評価することができる。Ａ～Ｃは、本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤが、一貫した分子活性化シグネチャーを有することを示す。データは、複数のドナー及び細胞株からの刺激後のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析から取得された。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、１８時間のアッセイにおいて、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながんタイプに対して抗がん活性を示すことを示す。図１０Ａ～１０Ｇで示されるグラフは、ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害活性率（％）を表す。１８時間の短期細胞傷害性アッセイにおいて、ＤＡＰ１０ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞または対照を、様々なＥ：Ｔ比（１：６－１０：１）で様々なルシフェラーゼ発現標的細胞株と共培養した。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、１８時間のアッセイにおいて、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながんタイプに対して抗がん活性を示すことを示す。図１０Ａ～１０Ｇで示されるグラフは、ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害活性率（％）を表す。１８時間の短期細胞傷害性アッセイにおいて、ＤＡＰ１０ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞または対照を、様々なＥ：Ｔ比（１：６－１０：１）で様々なルシフェラーゼ発現標的細胞株と共培養した。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、１８時間のアッセイにおいて、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながんタイプに対して抗がん活性を示すことを示す。図１０Ａ～１０Ｇで示されるグラフは、ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害活性率（％）を表す。１８時間の短期細胞傷害性アッセイにおいて、ＤＡＰ１０ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞または対照を、様々なＥ：Ｔ比（１：６－１０：１）で様々なルシフェラーゼ発現標的細胞株と共培養した。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、１８時間のアッセイにおいて、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながんタイプに対して抗がん活性を示すことを示す。図１０Ａ～１０Ｇで示されるグラフは、ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害活性率（％）を表す。１８時間の短期細胞傷害性アッセイにおいて、ＤＡＰ１０ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞または対照を、様々なＥ：Ｔ比（１：６－１０：１）で様々なルシフェラーゼ発現標的細胞株と共培養した。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、１８時間のアッセイにおいて、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながんタイプに対して抗がん活性を示すことを示す。図１０Ａ～１０Ｇで示されるグラフは、ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害活性率（％）を表す。１８時間の短期細胞傷害性アッセイにおいて、ＤＡＰ１０ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞または対照を、様々なＥ：Ｔ比（１：６－１０：１）で様々なルシフェラーゼ発現標的細胞株と共培養した。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、１８時間のアッセイにおいて、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながんタイプに対して抗がん活性を示すことを示す。図１０Ａ～１０Ｇで示されるグラフは、ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害活性率（％）を表す。１８時間の短期細胞傷害性アッセイにおいて、ＤＡＰ１０ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞または対照を、様々なＥ：Ｔ比（１：６－１０：１）で様々なルシフェラーゼ発現標的細胞株と共培養した。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、１８時間のアッセイにおいて、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながんタイプに対して抗がん活性を示すことを示す。図１０Ａ～１０Ｇで示されるグラフは、ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害活性率（％）を表す。１８時間の短期細胞傷害性アッセイにおいて、ＤＡＰ１０ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞または対照を、様々なＥ：Ｔ比（１：６－１０：１）で様々なルシフェラーゼ発現標的細胞株と共培養した。試験された標的細胞株が、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド（ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２／５／６、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４）発現レベル／パターンを含むことを示す表である。データは、関連アイソタイプ対照に対するＮＫＧ２Ｄリガンドの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍数変化として表示される。図１０Ｈに示される表に投入するために使用された生データを示す一連のグラフである。図１０Ｈに示される表に投入するために使用された生データを示す一連のグラフである。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、１２０時間のアッセイにおいて、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながんタイプに対して抗がん活性を示すことを示す。対照と比較した異なるエフェクター：ターゲット比でＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害性指数を示すグラフである。試験された標的細胞株は、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド（ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２／５／６、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４）の発現レベル／パターンを含む（図１０Ｈ～１０Ｊを参照）。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、１２０時間のアッセイにおいて、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながんタイプに対して抗がん活性を示すことを示す。対照と比較した異なるエフェクター：ターゲット比でＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害性指数を示すグラフである。試験された標的細胞株は、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド（ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２／５／６、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４）の発現レベル／パターンを含む（図１０Ｈ～１０Ｊを参照）。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、１２０時間のアッセイにおいて、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながんタイプに対して抗がん活性を示すことを示す。対照と比較した異なるエフェクター：ターゲット比でＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害性指数を示すグラフである。試験された標的細胞株は、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド（ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２／５／６、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４）の発現レベル／パターンを含む（図１０Ｈ～１０Ｊを参照）。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、１２０時間のアッセイにおいて、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながんタイプに対して抗がん活性を示すことを示す。対照と比較した異なるエフェクター：ターゲット比でＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害性指数を示すグラフである。試験された標的細胞株は、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド（ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２／５／６、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４）の発現レベル／パターンを含む（図１０Ｈ～１０Ｊを参照）。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、１２０時間のアッセイにおいて、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながんタイプに対して抗がん活性を示すことを示す。対照と比較した異なるエフェクター：ターゲット比でＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害性指数を示すグラフである。試験された標的細胞株は、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド（ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２／５／６、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４）の発現レベル／パターンを含む（図１０Ｈ～１０Ｊを参照）。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、１２０時間のアッセイにおいて、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながんタイプに対して抗がん活性を示すことを示す。対照と比較した異なるエフェクター：ターゲット比でＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害性指数を示すグラフである。試験された標的細胞株は、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド（ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２／５／６、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４）の発現レベル／パターンを含む（図１０Ｈ～１０Ｊを参照）。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、１２０時間のアッセイにおいて、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながんタイプに対して抗がん活性を示すことを示す。対照と比較した異なるエフェクター：ターゲット比でＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害性指数を示すグラフである。試験された標的細胞株は、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド（ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２／５／６、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４）の発現レベル／パターンを含む（図１０Ｈ～１０Ｊを参照）。ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害活性が、異なるロットのＶδ１細胞及びＤＡＰ１０ＣＡＤ間で同等であることを示すグラフである。１２０時間の細胞傷害性アッセイは、図１２Ａに示され、標的細胞は、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞であった。図１２Ａのアッセイの最終時点を使用して処理された場合と比較した、腫瘍のみの細胞傷害性の減少率（％）が図１２Ｂに示される。ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害活性が、異なるロットのＶδ１細胞及びＤＡＰ１０ＣＡＤ間で同等であることを示すグラフである。１２０時間の細胞傷害性アッセイは、図１２Ａに示され、標的細胞は、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞であった。図１２Ａのアッセイの最終時点を使用して処理された場合と比較した、腫瘍のみの細胞傷害性の減少率（％）が図１２Ｂに示される。ＤＡＰ１０．６、ＤＡＰ１０．１６、またはＤＡＰ１０．１７コンストラクトのいずれかで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害性の比較を示すグラフである。各コンストラクトについて取得されたデータは、３人のドナーの集計である。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を、１２０時間の細胞傷害性アッセイの標的細胞として使用した。対照は、ＤＡＰ１０．０及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５のみを含んでいた。厳格なＥ：Ｔ比を使用した、この特定のアッセイでは、ＤＡＰ１０．６は、ＤＡＰ１０．１６及びＤＡＰ１０．１７と比較して、細胞傷害性が改善していることを示していた。１２０時間の共培養細胞傷害性アッセイにおける細胞傷害性指数により測定された３つの異なるＤＡＰ１０コンストラクト（ＤＡＰ１０．６、図１２Ｄ、ＤＡＰ１０．１６、図１２Ｅ、ＤＡＰ１０．１７、図１２Ｆ）のドナー依存性を示すグラフである。ＤＡＰ１０コンストラクトを、Ｖδ１細胞に形質導入し、標的細胞は、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞であった。対照は、同じ３人の異なるドナーからの未形質導入Ｖδ１細胞を含んでいた。１２０時間の共培養細胞傷害性アッセイにおける細胞傷害性指数により測定された３つの異なるＤＡＰ１０コンストラクト（ＤＡＰ１０．６、図１２Ｄ、ＤＡＰ１０．１６、図１２Ｅ、ＤＡＰ１０．１７、図１２Ｆ）のドナー依存性を示すグラフである。ＤＡＰ１０コンストラクトを、Ｖδ１細胞に形質導入し、標的細胞は、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞であった。対照は、同じ３人の異なるドナーからの未形質導入Ｖδ１細胞を含んでいた。１２０時間の共培養細胞傷害性アッセイにおける細胞傷害性指数により測定された３つの異なるＤＡＰ１０コンストラクト（ＤＡＰ１０．６、図１２Ｄ、ＤＡＰ１０．１６、図１２Ｅ、ＤＡＰ１０．１７、図１２Ｆ）のドナー依存性を示すグラフである。ＤＡＰ１０コンストラクトを、Ｖδ１細胞に形質導入し、標的細胞は、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞であった。対照は、同じ３人の異なるドナーからの未形質導入Ｖδ１細胞を含んでいた。ＤＡＰ１０ＣＡＤ刺激により、異なるＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクト及び標的細胞タイプの関数である多機能性サイトカインプロファイルがもたらされることを示す。ＤＡＰ１０ＣＡＤ及び標的細胞の関数としてのサイトカインプロファイルが図１３Ａに示される。ＤＡＰ１０ＣＡＤ刺激により、異なるＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクト及び標的細胞タイプの関数である多機能性サイトカインプロファイルがもたらされることを示す。ＤＡＰ１０ＣＡＤ及び標的細胞の関数としてのサイトカインプロファイルが図１３Ａに示される。ＤＡＰ１０ＣＡＤ及び標的細胞タイプの関数としてインターフェロンガンマ誘導を示すグラフである。ＤＡＰ１０ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞単独（エフェクター）及び様々な標的細胞との共培養後のインターフェロンガンマ分泌レベルを示すプロットである。ＤＡＰ１０ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞単独（エフェクター）及び様々な標的細胞との共培養後のインターフェロンガンマ分泌レベルを示すプロットである。ＤＡＰ１０ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞単独（エフェクター）及び様々な標的細胞との共培養後のインターフェロンガンマ分泌レベルを示すプロットである。ＤＡＰ１０ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞単独（エフェクター）及び様々な標的細胞との共培養後のインターフェロンガンマ分泌レベルを示すプロットである。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で形質導入されたＶδ１細胞のサイトカインプロファイルと比較した標的細胞の存在下または非存在下でのＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞のサイトカインプロファイルを示す。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤが、複数のドナーからのＶδ１細胞の増殖を促進することを示す。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞との共培養実験に基づいて、ＤＡＰ１０．６、ＤＡＰ１０．１６、またはＤＡＰ１０．１７のいずれかで形質導入された２つの異なるドナー（ＳＣＴ２９及びＳＣＴ４６）から得られたＶδ１細胞の増殖に対するドナー依存性を示すプロットを示す。対照は、異なるドナー（ＳＣＴ０６）から取得され、ＤＡＰ１０．６で形質導入された、以前に試験されたＶδ１細胞（陽性対照）と、２つの異なるドナー（ＳＣＴ２９及びＳＣＴ４６）から取得され、ＤＡＰ１０．０で形質導入されたＶδ１細胞（陰性対照）を含んでいた。ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞のマウスモデルにおけるｉｎｖｉｖｏ腫瘍制御を示す。ＤＡＰ１０．６及び改変された（「１ＸＸ」）ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含むＤＡＰ１０ＣＡＤ（ＤＡＰ１０．１６）のｉｎｖｉｖｏ腫瘍制御を比較したグラフである。実験手順の概略図は、図１６Ｂに示される。ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞のマウスモデルにおけるｉｎｖｉｖｏ腫瘍制御を示す。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の抗腫瘍活性が、ＣＡＲＶδ１細胞と同様の動態で抗腫瘍活性を示すことを示す。ＨＣＴ－１５マウス異種移植モデルのＣＡＲＶδ１細胞と比較した、ＤＡＰ１０ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞のｉｎｖｉｖｏ腫瘍成長動態の比較を示すグラフである。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の抗腫瘍活性が、ＣＡＲＶδ１細胞と同様の動態で抗腫瘍活性を示すことを示す。２７日目の腫瘍体積を定量化したグラフである。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の抗腫瘍活性が、ＣＡＲＶδ１細胞と同様の動態で抗腫瘍活性を示すことを示す。図１７Ａ～１７Ｂに示されるデータを取得するために使用された実験手順の概略図である。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、マウスモデルにおいてｉｎｖｉｖｏで腫瘍組織内で増殖することを示す。ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の増殖が、腫瘍組織に特異的であることを示すフローサイトメトリープロットである。本発明のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、マウスモデルにおいてｉｎｖｉｖｏで腫瘍組織内で増殖することを示す。腫瘍組織における増殖が１４日間にわたって進行することを示すグラフである。本発明のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、マウスモデルにおいてｉｎｖｉｖｏで腫瘍組織内で増殖することを示す。処置後４、７、及び１４日目に採取された腫瘍組織または他の組織におけるＶδ１細胞の定量を示すグラフである。本発明のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、マウスモデルにおいてｉｎｖｉｖｏで腫瘍組織内で増殖することを示す。図１８Ａ～１８Ｃに示されるデータを取得するために使用された実験手順は、図１８Ｄに概略的に示される。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞によるマウスの処置が、体重の有意な変化に関連していないことを示す。Ａ及びＢは、本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、非腫瘍細胞を容認しながら、腫瘍細胞を標的とすることを示す。本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞は、図２０Ａのグラフに示されるように、対照と比較して、ＴＨＰ１細胞の生存率を大幅に低減させ、図２０Ｂのグラフに示されるように、健康なＰＢＭＣを標的としない。６人の異なるドナーの小規模な振盪フラスコ拡張におけるＶδ１細胞の倍数増殖を示すグラフである。１４日目に、倍数増殖を測定した。データは、ＤＡＰ１０．６及びＤＡＰ１０．１６ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞を比較する。対照と比較した、本開示のリードＤＡＰ１０ＣＡＤ（ＤＡＰ１０．６、ＤＡＰ１０．１６、ＤＡＰ１０．１７）で形質導入されたＶδ１細胞の増殖速度を示すグラフである。図２２Ａのデータは、第１のドナー（ＳＣＴ０６）から得られたＶδ１細胞に対応し、図２２Ｂのデータは、第２のドナー（ＳＣＴ２９）から得られたＶδ１細胞に対応し、図２２Ｃのデータは、第３のドナー（ＳＣＴ４５）から得られたＶδ１細胞に対応する。図２２Ａ～２２Ｃのそれぞれについて、Ｖδ１細胞率（％）を、増殖時間（日数）の関数として測定した。対照と比較した、本開示のリードＤＡＰ１０ＣＡＤ（ＤＡＰ１０．６、ＤＡＰ１０．１６、ＤＡＰ１０．１７）で形質導入されたＶδ１細胞の増殖速度を示すグラフである。図２２Ａのデータは、第１のドナー（ＳＣＴ０６）から得られたＶδ１細胞に対応し、図２２Ｂのデータは、第２のドナー（ＳＣＴ２９）から得られたＶδ１細胞に対応し、図２２Ｃのデータは、第３のドナー（ＳＣＴ４５）から得られたＶδ１細胞に対応する。図２２Ａ～２２Ｃのそれぞれについて、Ｖδ１細胞率（％）を、増殖時間（日数）の関数として測定した。対照と比較した、本開示のリードＤＡＰ１０ＣＡＤ（ＤＡＰ１０．６、ＤＡＰ１０．１６、ＤＡＰ１０．１７）で形質導入されたＶδ１細胞の増殖速度を示すグラフである。図２２Ａのデータは、第１のドナー（ＳＣＴ０６）から得られたＶδ１細胞に対応し、図２２Ｂのデータは、第２のドナー（ＳＣＴ２９）から得られたＶδ１細胞に対応し、図２２Ｃのデータは、第３のドナー（ＳＣＴ４５）から得られたＶδ１細胞に対応する。図２２Ａ～２２Ｃのそれぞれについて、Ｖδ１細胞率（％）を、増殖時間（日数）の関数として測定した。「既製の」同種ＤＡＰ１０ＣＡＤＶδ１細胞を生成するプロセスを表す概略図を示す。本開示の好ましいＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトで形質導入されたＶδ１細胞の独立した増殖を示すグラフである。示される実験で使用されたＶδ１細胞は、それぞれ、３つの異なるドナー（ＳＣＴ０６、ＳＣＴ２９、ＳＣＴ４５）から取得された。本開示の好ましいＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトで形質導入されたＶδ１細胞の独立した増殖を示すグラフである。示される実験で使用されたＶδ１細胞は、それぞれ、３つの異なるドナー（ＳＣＴ０６、ＳＣＴ２９、ＳＣＴ４５）から取得された。本開示の好ましいＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトで形質導入されたＶδ１細胞の独立した増殖を示すグラフである。示される実験で使用されたＶδ１細胞は、それぞれ、３つの異なるドナー（ＳＣＴ０６、ＳＣＴ２９、ＳＣＴ４５）から取得された。Ｖδ１細胞のｅｘｖｉｖｏ培養が、大幅な倍数増殖（図２３Ｅ）及び強力なＤＡＰ１０ＣＡＤ形質導入（図２３Ｆ）をもたらすことを示すグラフである。図２３Ｅのデータは、Ｖδ１の倍数増殖として表され、図２３Ｆのデータは、Ｖδ１細胞の％ＤＡＰ１０ＣＡＤとして表される。Ｖδ１細胞のｅｘｖｉｖｏ培養が、大幅な倍数増殖（図２３Ｅ）及び強力なＤＡＰ１０ＣＡＤ形質導入（図２３Ｆ）をもたらすことを示すグラフである。図２３Ｅのデータは、Ｖδ１の倍数増殖として表され、図２３Ｆのデータは、Ｖδ１細胞の％ＤＡＰ１０ＣＡＤとして表される。培養率（％）として表される、時間の経過に伴うＶδ１細胞、Ｖδ２細胞、αβ細胞、及びＮＫ細胞の細胞組成を示すプロットを示す。

本発明は、キメラアダプター、すなわちＣＡＤを提供し、キメラアダプターは、一般に、ＤＡＰ１０ドメイン及び少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含み、さらに、任意で、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むが、具体的には、リガンド結合ドメインを含む細胞外ドメインを欠いている。従って、いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＤポリペプチドは、さらに、膜貫通ドメイン及び／または細胞外スペーサードメインも含んでもよいが、具体的には、機能的な細胞外受容体及び／またはリガンド結合ドメインを欠くことになる。対照的に、従来技術は、通常、ＣＡＲまたはＮＫＧ２Ｄ融合キメラの構成要素としてＤＡＰ１０を用いた。例えば、以下を参照：Ｚｈａｏｅｔａｌ．，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１９；８（１）：ｅ１５０９１７３；Ｌｙｎｃｈｅｔａｌ．，２０１７，Ｉｍｍｕｎｏｌ１５２：４７２；ＵＳ２０２０／０３０８２４８；ＷＯ／２０１８／１８３３８５；ＣＮ１０９０９６４０４；ＣＮ１１１９９５６８９。本発明のＣＡＤポリペプチドは、自然界で見られるものとは明らかに異なり、一般に、自然には互いに結合していない少なくとも２つのポリペプチドドメインを含み、さらに、任意に、さらに、本明細書で詳述する追加の有利なシグナル伝達ドメイン及び変異を含む。

本発明のＣＡＤポリペプチドは、好ましくは、ヒトＤＡＰ１０を含むＤＡＰ１０ドメインを含み、これは、任意に、１つ以上の置換変異、欠失変異、及び／または付加変異を含む。例えば、ＤＡＰ１０ドメインは、Ｙ８６Ｆ変異及び／またはＫ８４Ｒ変異を有し得る。

本開示のＣＡＤポリペプチドの文脈における「共刺激ドメイン」は、キメラアダプターを発現する細胞傷害性細胞の細胞増殖、細胞生存、及び記憶細胞の発達を促進する。本発明のＣＡＤポリペプチドは、ＴＮＦＲスーパーファミリー、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐｌ０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＰＤ－１、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、またはそれらの組み合わせのタンパク質の共刺激ドメインから選択される１つ以上の共刺激ドメインを含んでもよい。ＣＡＤは、複数の共刺激ドメインを含む場合、これらのドメインは、任意に、リンカーで隔てられて、縦一列に配置され得る。共刺激ドメインは、ＣＡＤ内のＤＡＰ１０ドメインと任意の細胞内シグナル伝達ドメインの間に位置し得る細胞内ドメインである。

実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、及びＣＤ４０Ｌの共刺激ドメインを含む。本明細書で使用される「共刺激ドメイン」という用語は、その任意の改変も包含し、この例は、米国特許出願第２０２００１２９５５４号、米国特許出願第２０２００３１７７７７号、ＷＯ２０１９０１０３８３号、Ｌｉ，Ｗ．，ｅｔａｌ．，（２０２０）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ５３：４５６－４７０号；及びＬｉ，Ｇ．，ｅｔａｌ．，（２０１７）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１９８（１Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：１９８．４に記載されており、それぞれの内容は、全体が本明細書に組み込まれている。

本開示のＣＡＤポリペプチドの文脈における「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞傷害性細胞にその特殊な機能、すなわち、標的細胞を損傷及び／または破壊すること、を実施するように指示する。好適な細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、例えば、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖またはその相同体、例えば、η鎖、ＦｃｓＲｌｙ鎖及びβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇａ）鎖、Ｂ２９（Ｉｇ）鎖など、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３ポリペプチド（Δ、δ、及びε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０など）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎなど）、ならびにＴ細胞伝達（例えば、ＣＤ２、ＣＤ５、及びＣＤ２８）に関与する他の分子が挙げられる。具体的には、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質テール、細胞質受容体を有する免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、及びそれらの組み合わせであってよい。

細胞内シグナル伝達ドメインは、様々な他の免疫シグナル伝達受容体のいくつかのタイプの細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよく、これは、第１、第２、及び第３世代のＴ細胞シグナル伝達タンパク質（ＣＤ３、Ｂ７ファミリー共刺激因子、及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリー受容体を含む）を含むが、これらに限定されない（Ｐａｒｋｅｔａｌ．，“Ａｒｅａｌｌｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓｃｒｅａｔｅｄｅｑｕａｌ？”ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．，ｖｏｌ．３３，ｐｐ．６５１－６５３，２０１５）。追加の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞により使用されるシグナル伝達ドメイン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ｅｔａｌ．，“Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓｔｏｄｉｒｅｃｔｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌａｃｔｉｖｉｔｙ，”ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．６，ｐ．１９５，２０１５）、例えば、ＮＫｐ３０のシグナル伝達ドメイン（Ｂ７－Ｈ６）（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，“ＡｎＮＫｐ３０－ｂａｓｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｐｒｏｍｏｔｅｓＴｃｅｌｌｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄａｎｔｉｔｕｍｏｒｅｆｆｉｃａｃｙｉｎｖｉｖｏ，”ＪＩｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１８９，ｐｐ．２２９０－２２９９，２０１２）、及びＤＡＰ１２（Ｔｏｐｆｅｒｅｔａｌ．，“ＤＡＰ１２－ｂａｓｅｄａｃｔｉｖａｔｉｎｇｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒＮＫｃｅｌｌｔｕｍｏｒｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，”ＪＩｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１９４，ｐｐ．３２０１－３２１２，２０１５）、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＡＰ１０、ならびにＣＤ３ｚを含む。さらに、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、例えば、ＦｃｇａｍｍａＲＩ、ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＡ、ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＣ、ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩＡ、ＦｃＲＬ５を含有するヒト免疫グロブリン受容体のシグナル伝達ドメインも含む（Ｇｉｌｌｉｓｅｔａｌ．，“ＣｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＦｃ．ｇａｍｍａ．ＲｓｔｏＤｉｓｅａｓｅｗｉｔｈＥｖｉｄｅｎｃｅｆｒｏｍＨｕｍａｎＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓａｎｄＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｎｉｍａｌＳｔｕｄｉｅｓ，”ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．５，ｐ．２５４，２０１４）。

実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはＣＤ６６ｄの細胞質シグナル伝達ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＣＡＤ内の細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、その任意の改変も包含し、この例は、以下に記載されている：米国特許出願第２０２０／０３１７７７７号、ならびにＣｏｍｂａｄｉｅｒｅ，Ｂ．，ｅｔａｌ．，（１９９６）ＪＥｘｐＭｅｄ１８３（５）：２１０９－１７；Ｌｏｗｉｎ－ＫｒｏｐｆＢ．，ｅｔａｌ．，（１９９８）ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ１４０（４）：８６１－８７１；ＡｒｄｏｕｉｎＬ．，ｅｔａｌ．，（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１０（４）：４０９－２０；ＬｉｕＨ．ａｎｄＶｉｇｎａｌｉＤＡＡ．，（１９９９）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１６３：５９９－６０２；ＫｅｒｓｈＥＮ．，ｅｔａｌ．，ＪＥｘｐＭｅｄ（１９９９）１９０（１１）：１６２７－３６；ＣｈａｅＷＪ．，ｅｔａｌ．，（２００４）ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｌ１６（９）：１２２５－３６；Ｂｅｃｋｅｒ，ＡＭ．，ｅｔａｌ．，（２００７）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７８（７）：４１２０－８；ＭｅｔｈｉＴ．，ｅｔａｌ．，（２００７）ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ３７（９）：２５３９－４８；ＢａｕｄｏｕｉｎＳＪ．，ｅｔａｌ．，（２００８）ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌ１９（６）：２４４４－５６；ＺｈａｏＹ．，ｅｔａｌ．，（２００９）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１８３（９）：５５６３－７４；ＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒＪＮ．，ｅｔａｌ．，（２０１０）Ｂｌｏｏｄ１１６（１９）：３８７５－８６；ＢｒｉｄｇｅｍａｎＪＳ．，ｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｌｉｎＥｘｐＩｍｍｕｎｏｌ１７５（２）：２５８－６７；ＬｏｎｇＡＨ．，ｅｔａｌ．，（２０１５）ＮａｔＭｅｄ２１（６）：５８１－９０；ＨｗａｎｇＳ．，ｅｔａｌ．，（２０１５）ＮａｔＣｏｍｍｕｎ６：６９８２；ＷＯ２０１９１２６７４８；ＦｅｕｃｈｔＪ．，ｅｔａｌ．，（２０１９）ＮａｔＭｅｄ２５（１）：８２－８８；Ｒｏｄａ－Ｎａｖａｒｒｏ，Ｐ．，ａｎｄＲｅｙｂｕｒｎ，ＨＴ．，（２００９）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８４（２４）：１６４６３－１６４７２；Ｇｉｕｒｉｓａｔｏ，Ｅ．，ｅｔａｌ．，（２００７）ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ２７（２４）：８５８３－８５９９；及びＷｕ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，（２０００）ＪＥｘｐＭｅｄ１９２（７）：１０５９－１０６８（これらのそれぞれの内容は、全体が本明細書に組み込まれる）。

実施形態では、本発明のＣＡＤの２つ以上の構成要素は、１つ以上のリンカーで隔てられていてもよい。リンカーは、長さが約１～１００アミノ酸のオリゴまたはポリペプチド領域である。いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば、５～１２アミノ酸長、５～１５アミノ酸長、または５～２０アミノ酸長であってよい。リンカーは、隣接タンパク質ドメインが互い連動して自由に移動するように、グリシン及びセリンなどの柔軟な残基で構成され得る。より長いリンカー、例えば、１００アミノ酸を超えるリンカーは、本発明の代替実施形態に関連して使用され得、例えば、隣接する２つのドメインが立体的に干渉しないように選択され得る。本発明で使用され得るリンカーの例としては、２Ａ様リンカー、またはそれらの機能的同等物を含む２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）が挙げられるが、これらに限定されない。

例示的な実施形態では、ＤＡＰ１０ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラＤＡＰ１０－４－１ＢＢアダプターポリペプチドが提供される。別の例示的な実施形態では、ＤＡＰ１０ドメイン及びＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラＤＡＰ１０－ＣＤ２８アダプターポリペプチドが提供される。別の例示的な実施形態では、ＤＡＰ１０ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラＤＡＰ１０－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζアダプターポリペプチドが提供される。別の例示的な実施形態では、ＤＡＰ１０ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラＤＡＰ１０－ＣＤ２８－ＣＤ３ζアダプターポリペプチドが提供される。さらに別の例示的な実施形態では、ＤＡＰ１０ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラＤＡＰ１０－４－１ＢＢ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζアダプターポリペプチドが提供される。

本発明のキメラアダプターポリペプチドは、任意に、さらに、膜貫通ドメインを含んでもよい。ＣＡＤの膜貫通ドメインは、細胞傷害性細胞の細胞膜に及ぶことが可能な領域である。膜貫通ドメインは、膜貫通タンパク質、例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質、人工疎水性配列、またはそれらの組み合わせの膜貫通領域から選択される。膜貫通ドメインの好適な例としては、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖の膜貫通領域、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４が挙げられる。合成膜貫通ドメインは、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンの３つ組を含み得る。任意に、短いオリゴまたはポリペプチドリンカー（好ましくは、長さが２～１０アミノ酸）が、ＣＡＤの膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン間の結合を形成し得る。グリシン－セリンのダブレットは、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン間に特に適したリンカーを提供する。

本発明のキメラアダプターポリペプチドは、任意に、さらに、細胞外スペーサードメインを含んでもよい。ＣＡＤの細胞外スペーサードメインは、通常、リガンド結合ドメイン（本発明には存在しない）及び膜貫通ドメイン間に位置する親水性領域である。いくつかの実施形態では、このドメインは、ＣＡＤの適切なタンパク質折り畳みを促進する。細胞外スペーサードメインは、抗体のＦｃフラグメント、抗体のヒンジ領域、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、またはそれらの組み合わせから選択されるドメインを含んでもよい。細胞外スペーサードメインの例としては、ＣＤ８ａヒンジ、３つのグリシン（Ｇｌｙ）、同じくらい小さい可能性のあるポリペプチドで構成される人工スペーサー、ならびにＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ４）のＣＨ１及びＣＨ３ドメインが挙げられる。

定義
この仕様を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合、単数形で使用される用語は、複数形も含まれ、その逆も同様である。記載される定義が参照により本書に組み込まれている文書と矛盾する場合は、以下に記載される定義が優先される。別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関係する技術分野の当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。

測定可能値、例えば、量、時間的持続時間などを指す場合に本明細書で使用される「約」は、開示された方法を実行するために適切であるため、指定値から±２０％または±１０％、より好ましくは、±５％、さらに好ましくは、±１％、さらに好ましくは、±０．１％の変動を包含することを意味する。

本明細書で使用される「任意の」または「任意に」は、特定の制限、イベント、状況などが生じ得るが、生じる必要がないこと、ならびに、該制限、イベント、または状況が生じる場合及び生じない場合を含むことを意味する。

本明細書で使用される場合、「ＤＡＰ１０」という用語は、哺乳動物のリンパ系細胞及び骨髄系細胞に存在する膜貫通アダプタータンパク質を指し、その正確な配列は、種、アイソフォーム、及び個体毎にわずかに異なる可能性がある。当該技術分野で認識されているＤＡＰ１０の別名は、造血細胞シグナル伝達物質（ＨＣＳＴ）、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０、膜タンパク質ＤＡＰ１０、膜貫通アダプタータンパク質ＫＡＰ１０（ＫＡＰ１０）、及びＰＩＫ３ＡＰを含む。例えば、ヒトでは、ＤＡＰ１０は、主要なポリペプチド配列ＵｎｉｔＰｒｏｔＱ９ＵＢＫ５及びＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０５５０８１．１及びＡＦ０７２８４５で表されるタンパク質を指すが、異なるアイソフォーム及びバリアントが存在し得る。ＤＡＰ１０という名称は、様々な種からの関連構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質、すなわち、ヒトＤＡＰ１０（配列番号１）と高い配列同一性を有するＤＡＰ１０タンパク質ファミリーのタンパク質メンバーを指し得るが、当業者であれば、本明細書で参照されている配列と異なっていても、哺乳動物におけるヒトＤＡＰ１０関連タンパク質を特定可能であろう。

本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、本開示のＣＡＤポリペプチドを発現するように選択された細胞型を指す。実施形態では、宿主細胞は、ＤＡＰ１０に関連する少なくとも１つの受容体を内因的に発現し、ひいては、本開示のキメラアダプターポリペプチドを発現する。実施形態では、宿主細胞は、ＤＡＰ１０に関連する少なくとも１つの受容体、ひいては、本開示のキメラアダプターポリペプチドを発現するように設計される。例示的な宿主細胞は、特に細胞傷害性細胞を含む多種多様な免疫細胞が含まれ得るが、これらに限定されず、その好ましい例は、本明細書に開示される（例えば、γδＴ細胞、αβＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、好中球、単球／マクロファージ）。「宿主細胞」は、非免疫細胞、例えば、限定されないが、幹細胞（例えば、胚性幹細胞、造血幹細胞、間質幹細胞、誘導多能性幹細胞など）を含み得ることも本開示の範囲内である。

本明細書で使用される「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ３（ＣＤ３＋）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ＋）を発現する、または発現している免疫細胞を指す。Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たす。ＣＤ３及びＴＣＲを「発現している」Ｔ細胞は、ＣＤ３及び／またはＴＣＲ細胞表面発現を除去するように設計されている。

本明細書で使用される用語「γδＴ細胞（ガンマデルタＴ細胞）」という用語は、１つのγ鎖及び１つのδ鎖で構成される、明確なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、すなわち、γδＴＣＲを表面に発現するＴ細胞のサブセットを指す。「γδＴ細胞」という用語は、γδＴ細胞（限定されないが、Ｖδ１、Ｖδ２、及びＶδ３γδＴ細胞、ならびにナイーブ、エフェクターメモリ、セントラルメモリ、及び終末分化γδＴ細胞を含む）の全てのサブセットを具体的に含む。さらなる例として、「γδＴ細胞」という用語は、Ｖγ４、Ｖδ５、Ｖδ７、及びＶδ８ γδＴ細胞、ならびにＶγ２、Ｖγ３、Ｖγ５、Ｖγ８、Ｖγ９、Ｖγ１０、及びＶγ１１ γδＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞は、Ｖδ１^－、Ｖδ２^－、またはＶδ１^－及びＶδ２^－である。操作及び非操作γδＴ細胞及び／またはそのサブタイプを作製及び使用するための組成物及び方法は、以下に記載されるものを含むが、これらに限定されない：ＵＳ２０１６／０１７５３５８；ＷＯ２０１７／１９７３４７；ＵＳ９４９９７８８；ＵＳ２０１８／０１６９１４７；ＵＳ９９０７８２０；ＵＳ２０１８／０１２５８８９、及びＵＳ２０１７／０１９６９１０（これらのそれぞれの内容は、改変及び非改変γδＴ細胞及び／またはそのサブタイプを作製及び使用するための該組成物及び方法を含む、あらゆる目的のために参照により組み込まれる）。本出願は、さらに、１つのγ鎖または１つのδ鎖を発現し、任意に、第２のポリペプチドと組み合わせて、機能的なＴＣＲを形成するＴ細胞、または他の操作白血球またはリンパ球を企図する。１つのγ鎖または１つのδ鎖を発現する、そのような操作白血球またはリンパ球は、本明細書に記載の方法で使用されても、本明細書に記載の組成物に存在してもよい。

本明細書に記載のγδＴ細胞は、δ１、δ２、δ３、もしくはδ４γδＴ細胞、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの場合では、γδＴ細胞は、大部分は（５０％超）、ほとんどの場合は（９０％超）、基本的に全て、または完全にδ２γδＴ細胞である。いくつかの場合では、γδＴ細胞は、大部分は（５０％超）、大部分（９０％超）、本質的に全て、または完全にδ１γδＴ細胞である。いくつかの場合では、γδＴ細胞は、大部分は（５０％超）、大部分（９０％超）、本質的に全て、または完全にδ３γδＴ細胞である。

本明細書に記載される場合、γδの使用のためのＴ細胞は、同種または自己ドナーから得ることができる。γδＴ細胞は、部分的または完全に精製することも、または精製せずに、ｅｘｖｉｖｏで拡大させることもできる。ｅｘｖｉｖｏ増殖のための方法及び組成物としては、ＷＯ２０１７／１９７３４７に記載されているものが挙げられるが、これに限定されない。増殖は、本開示のキメラアダプターポリペプチドが、γδＴ細胞（複数可）に導入される前もしくは後または前後に実施され得る。他の追加的または代替的な増殖方法としては、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、アミノビスホスホネート、サイトカインカクテル、及びフィーダー細胞の使用が挙げられる（Ｃｏｒｔｅｓ－Ｓｅｌｖａ，Ｄｅｔａｌ．，（２０２１）ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉ．４２（１）：４５－５９）。

本明細書で使用される「αβＴ細胞」という用語は、ＣＤ３鎖分子との複合体の一部としてＴＣＲのα鎖及びβ鎖を発現するＴ細胞を指す。各α鎖及びβ鎖は、１つの可変ドメイン及び１つの定常ドメインを含有する。αβＴ細胞は、主に、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスＩＩ分子により提示されるペプチド抗原を認識し、受容体の多様性のほとんどは、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）内を含有される。

本明細書で使用される場合、「ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞」という用語は、ウイルスに対する免疫及び腫瘍の免疫監視において重要な役割を果たし、自然免疫系の重要な細胞サブセットを構成するＣＤ５６^＋ＣＤ３^－顆粒リンパ球を指す（ＧｏｄｆｒｅｙＪ，ｅｔａｌ．ＬｅｕｋＬｙｍｐｈｏｍａ２０１２５３：１６６６－１６７６）。ＮＫ細胞は、細胞表面に阻害性受容体及び活性化受容体の非常に多様なレパートリーを発現し、これは、免疫応答を制御する。ＮＫ細胞は、パーフォリン及びグランザイムの放出、または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリー（例えば、標的細胞でアポトーシスを誘導するＴＮＦ、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、及びＦａｓリガンド）のエフェクター分子を使用することにより、変異細胞及び感染細胞を殺傷し得る。さらに、活性化時に、ＮＫ細胞は、ケモカイン及びサイトカイン（例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＩＬ－１０）を迅速に生じ、これは、宿主の造血細胞及び非造血細胞を動員し、その機能に影響を与える。細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔリンパ球とは異なり、ＮＫ細胞は、事前の感作を必要とせずに腫瘍細胞に対して細胞傷害性を発揮し、ＭＨＣ－Ｉ陰性細胞を根絶することもできる（Ｎａｒｎｉ－ＭａｎｃｉｎｅｌｌｉＥ，ｅｔａｌ．ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｌ２０１１２３：４２７－４３１）。ＮＫ細胞は、サイトカインストーム（ＭｏｒｇａｎＲＡ，ｅｔａｌ．ＭｏｌＴｈｅｒ２０１０１８：８４３－８５１）、腫瘍崩壊症候群（ＰｏｒｔｅｒＤＬ，ｅｔａｌ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２０１１３６５：７２５－７３３）、及び標的外腫瘍効果の潜在的に致命的な合併症を回避し得るので、かなり安全なエフェクター細胞であると考えられる。

ＮＫ細胞は、同種または自己ドナーから取得することができる。ＮＫ細胞は、部分的または完全に精製することも、精製せずに体外で拡大させることもできる。ｅｘｖｉｖｏ増殖のための方法及び組成物としては、以下に記載されるものが挙げられるが、これらに限定される：Ｂｅｃｋｅｒｅｔａｌ．，（２０１６）ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６５（４）：４７７－８４。増殖は、キメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドが、ＮＫ細胞に導入される前もしくは後またはその前後に実施され得る。簡単に言えば、ＮＫ細胞の増殖は、改変されたフィーダー細胞、サイトカインカクテル（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５）、及び／またはａＡＰＣの使用を含み得る（Ｃｏｒｔｅｓ－Ｓｅｌｖａ，Ｄｅｔａｌ．，（２０２１）ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉ．４２（１）：４５－５９）。

いくつかの例では、胎盤造血幹細胞由来ナチュラルキラー（ＰＮＫ）細胞または不死化細胞株（例えば、ＮＫ－９２）を、本開示のキメラアダプターポリペプチドを発現するように改変され得る。他の例では、本明細書のキメラアダプターポリペプチドの発現を操作するために使用することができるＮＫ細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化させることができる。本明細書で使用される場合、「ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞」という用語は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方と形態学的及び機能的特徴を共有するＴ系統細胞である。ＮＫＴ細胞は、自然免疫システムの迅速な応答者であり、様々な疾患状況において強力な免疫調節機能及びエフェクター機能を媒介する。ＮＫＴ細胞におけるリガンドの認識は、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α）ならびに抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１３）が急速に分泌される。これは、例えば、腫瘍細胞を直接標的とすること、及び多様なサイトカインの放出を通じて抗腫瘍応答を間接的に調節すること、またはＴＭＥの変更により、がんなどに対する免疫応答を強化する。活性化後、ＮＫＴ細胞は、まずエフェクター細胞に分化することなく、すぐにサイトカインの分泌を開始し得る。ＮＫＴ細胞は、その応答の速さにより、いくつかのタイプの細菌及びウイルス感染に対する自然防御の最前線で重要な役割を果たす。さらに、ＮＫＴ細胞により分泌されるサイトカインの多くは、αβＴ細胞の分化及び機能に強力な影響を及ぼし、ＮＫＴ細胞を適応防御に結びつく。ＮＫＴ細胞は、適応免疫系を自然免疫系と橋渡しをする。主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子により提示されるペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子により提示される糖脂質抗原を認識する。ＮＫＴ細胞は、同種または自己ドナーから取得することができる。ＮＫＴ細胞は、部分的または完全に精製することも、精製せずに体外で拡大させることもできる。簡単に言えば、ＮＫＴ細胞は、ｅｘｖｉｖｏＩＬ－２、及び／またはＴＣＲα鎖ＣＤＲ３ループに特異的なモノクローナル抗体の使用により拡大させることができる（Ｃｏｒｔｅｓ－Ｓｅｌｖａ，Ｄｅｔａｌ．，（２０２１）ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉ．４２（１）：４５－５９）。

本明細書で使用される場合、「γδナチュラルキラーＴ細胞」または「γδＮＫＴ細胞」という用語は、γδＴＣＲ及びＮＫ受容体を発現するが、特徴的なγδＴ細胞マーカーの発現を欠くｉＰＳＣ由来細胞を指す（Ｃｏｒｔｅｓ－Ｓｅｌｖａ，Ｄｅｔａｌ．，（２０２１）ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉ．４２（１）：４５－５９）。これらの細胞は、正常細胞ではなく、多数のがん細胞株に対して抗腫瘍活性を有することが示されており、ドナー由来のγδＴ細胞またはドナー由来のＮＫ細胞よりも強力な殺傷力を示した（ＺｅｎｇＪｅｔａｌ．，（２０１９）ＰＬｏＳＯＮＥ１４（５）：ｅ０２１６８１５）。本明細書の実施形態では、キメラアダプターポリペプチドは、本明細書に開示された方法に従って使用される、γδＮＫＴ細胞で発現することができる。

本明細書で使用される場合、「骨髄細胞」という用語は、顆粒球、単球、マクロファージ、及び樹状細胞（ＤＣ）に代表される白血球のサブグループを指す。それらは、血液及びリンパ系を通して循環し、様々なケモカイン受容体を介して組織の損傷及び感染の部位に急速に動員される。組織内では、それらは、貪食作用と、炎症性サイトカインの分泌について活性化され、それにより、防御免疫において重要な役割を果たす。骨髄細胞は、定常状態の組織にも見出すことができ、それらは、発達、恒常性、及び組織修復を制御する。

本明細書で使用される場合、「マクロファージ」という用語は、様々な刺激に応じて成形することができる機能的及び表現型のシグネチャーを含む、非常に可塑性の高い自然細胞を指す。マクロファージの極性化は、リポ多糖類（ＬＰＳ）もしくはＩＦＮ－γなどの因子に応答するＭ１表現型（古典的に活性化）、または、ＩＬ－４、ＩＬ－５、及びＩＬ－１３などのサイトカインに応答するＭ２表現型の２つの異なる状態に大まかに分類される。Ｍ１様マクロファージの一例は、ｉＮＯＳ及びＴＮＦ－α、ＩＬ１－β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、及びＩＬ－２３などの炎症性サイトカインを発現する。Ｍ２マクロファージの一例は、ヒトにおいてＣＤ２０９、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ１ａ、及びＣＤ１ｂの発現の増加を示しており、創傷治癒及び抗腫瘍応答に関与していることを示唆する。マクロファージが、固形腫瘍に浸潤し、再プログラムされる能力、及びＭ１表現型への切り替えに関連する抗腫瘍効果は、マクロファージは、本明細書に記載のキメラアダプターポリペプチドを発現する操作マクロファージに関して本開示に関連するものとなる。例えば、マウスの卵巣癌モデルにおいて、ＮＫ－κＢシグナル伝達を阻害することにより、一酸化窒素を産生し、ＩＬ－１２依存性のＮＫ介在性抗腫瘍効果を誘導することが可能な抗腫瘍性Ｍ１表現型細胞に、マクロファージを再プログラムすることができることが示されている（ＺｈａｎｇＦｅｔａｌ．，（２０１９）ＮａｔＣｏｍｍｕｎ１０：３９７４）。

マクロファージは、同種または自己ドナーから取得／誘導することができる。マクロファージは、部分的または完全に精製することも、精製せずにｅｘｖｉｖｏで培養することもできる（例えば、以下を参照のこと：ＤａｖｉｅｓＪＱａｎｄＧｏｒｄｏｎＡ（２００５）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ２９０：１０５０１６）。いくつかの実施形態では、本開示は、ｈＥＳＣ由来のマクロファージ（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，ＫＲｅｔａｌ．，（２００８）ＥｘｐＨｅｍａｔｏｌ３６：１１６７－１１７５）、またはｉＰＳＣ由来のマクロファージ（ＴａｋａｔａＫ．ｅｔａｌ．，（２０１７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ４７：１８３－１９８）を包含する。

本明細書で使用される「ＮＫＧ２Ｄ受容体」という用語は、Ｃ型レクチン様受容体のＮＫＧ２ファミリーに属する膜貫通タンパク質を指す。ＮＫＧ２Ｄは、主要な活性化受容体として機能し、リガンド結合は、細胞傷害性及びサイトカイン産生を誘発する。ＮＫＧ２Ｄは、ホスファチジルイノシトール３キナーゼを動員する関連アダプター分子ＤＡＰ１０を介して共刺激を提供する。マウスでは、ＮＫＧ２Ｄは、タンパク質チロシンキナーゼを動員するＤＡＰ１２とも関連している。ＮＫＧ２Ｄは、マウスでは染色体６、ヒトでは染色体１２に位置するＮＫ遺伝子複合体（ＮＫＣ）にあるＫＬＲＫ１遺伝子にコードされる。ヒトでは、ＮＫＧ２Ｄは、特定の病理学的条件下で、ＮＫ細胞、γδＴ細胞及びＣＤ８＋αβＴ細胞、ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞により発現される（ＳｔａｎｊａｎｏｖｉｃＡ．，ｅｔａｌ．（２０１８）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１－１５）。マウスでは、ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞、ＮＫ１．１＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、活性化ＣＤ８＋αβＴ細胞、及び活性化マクロファージにより発現される。全長ヒトＮＫＧ２Ｇアミノ酸配列は、本明細書において配列番号９５として示され、ヒトＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号９６として記載され、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通及び細胞外リガンド結合ドメインのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号９７として記載される。

本明細書で使用される場合、「組み換え哺乳動物細胞」という用語は、遺伝子工学技術を使用してもたらされた少なくとも１つの変更を含む哺乳動物由来の細胞または細胞株を指す。いくつかの実施形態では、「組み換え哺乳動物細胞」は、キメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドをコードする核酸コンストラクトを含む、γδＴ細胞またはＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞またはαβＴ細胞などである。「組み換え哺乳動物細胞」は、例えば、ヒト、げっ歯類などの任意の哺乳動物から得ることができる。

本明細書で使用される「ＴＣＲ」または「Ｔ細胞受容体」という用語は、αβ受容体もしくはγδ受容体、またはそれらの組み合わせを形成する二量体の異種細胞表面シグナル伝達タンパク質を指す。αβＴＣＲは、ＭＨＣ分子により提示される抗原を認識するが、γδＴＣＲは、ＭＨＣの提示とは独立して抗原を認識することができる。

「ＭＨＣ」（主要組織適合遺伝子複合体）という用語は、細胞表面の抗原提示タンパク質をコードする遺伝子のサブセットを指す。ヒトでは、これらの遺伝子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と呼ばれる。本明細書では、ＭＨＣまたはＨＬＡの略語は、互換的に使用される。

本明細書で使用される「抗原」または「Ａｇ」という用語は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答は、抗体の産生もしくは特定の免疫能細胞の活性化、またはその両方が関与し得る。タンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として機能し得ることを、当業者は、理解するであろう。さらに、抗原は、組み換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから誘導することができる。免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡは、本明細書で使用されるその用語として「抗原」をコードすることを、当業者は、理解するであろう。さらに、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみにコード化される必要はないことを、当業者は理解するであろう。本開示は、複数の遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用を含むが、これらに限定されず、これらのヌクレオチド配列は、所望の免疫応答を誘発するために様々な組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、抗原が「遺伝子」にコードされる必要は全くないことを、当業者は理解するであろう。抗原が、生成、合成することができるか、または生物学的サンプルから誘導することができることは、容易に明らかである。そのような生物学的サンプルは、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞、または生物学的液体が挙げられ得るが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然供給源または組み換え供給源から得られた完全な免疫グロブリンであり得、インタクトな免疫グロブリンの免疫応答性部分であり得る。抗体は、通常、免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えば、以下を含む様々な形態で存在し得る：ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、全長または完全なモノクローナル抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多価抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限り二重特異性抗体）、ダイアボディ、所望の生物学的または免疫学的活性を示す限り単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）、ならびに単鎖抗体及びヒト化抗体（Ｈａｒｌｏｗｅｔａｈ，１９９９，Ｉｎ：ＵｓｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮＹ：Ｈａｒｌｏｗｅｔａｈ，１９８９，Ｉｎ；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｈｏｕｓｔｏｎｅｔａｈ，１９８８，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３：Ｂｉｒｄｅｔａｈ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６）。

「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたは受容体（例えば、Ｔ細胞受容体）に特異的に結合可能な任意のタンパク質決定因子、脂質または炭水化物決定因子を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸、脂質または糖側鎖などの分子の活性表面群で構成され、通常、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。

本明細書で使用されるアミノ酸残基／位置の「改変」は、出発アミノ酸配列と比較した一次アミノ酸配列の変化を指し、変化は、該アミノ酸残基／位置を含む配列の変更から生じる。アミノ酸残基／位置の「変更」は、アミノ酸残基／位置の「変異」と同義である。例えば、代表的な改変は、残基（または該位置）の別のアミノ酸による置換（例えば、保存的置換または非保存的置換）、１つ以上のアミノ酸の挿入、及び１つ以上のアミノ酸の削除を含む。「アミノ酸置換」またはその変形形態は、所定の（開始）アミノ酸配列内の既存のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置き換えることを指す。一般的に、好ましくは、改変は、出発（または「野生型」）アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較して、変異ポリペプチドの少なくとも１つの物理生化学的活性の変化をもたらす。従って、本明細書で言及される「改変」アミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸が変異されており、及び／または任意数のアミノ酸が挿入されており、及び／または任意数のアミノ酸が削除されているアミノ酸配列を含む。

本明細書で使用される「内因性」という用語は、限定されないが、生物、組織、または細胞を含むシステムの内部から発生する物質及び／またはプロセスを指す。例えば、本開示の文脈において、「内因性」は、通常細胞または組織内で発現される核酸分子またはポリペプチドを指す。

逆に、本明細書で使用される「外因性」という用語は、限定されないが、生物、組織、または細胞を含むシステムの外部から発生する物質及び／またはプロセスを指す。特に、本開示の文脈における「外因性」は、細胞内に天然に存在しない核酸分子またはポリペプチドを意味する。それ故、「外因性」という用語は、細胞内で発現した任意の外来または異種の組み換え核酸分子またはポリペプチドを包含し、これは、ナイーブ内因性対応物とは異なる配列を有する外因性核酸を含む。当該技術分野で周知のように、これらの外因性配列は、遺伝子工学により細胞自体またはその前駆細胞に導入され得、任意に、非ネイティブプロモーターまたは分泌配列などの代替制御配列に連結され得る。

本明細書で使用される「過剰発現」という用語は、細胞または組織における主題の核酸またはポリペプチドの内因性発現レベルを超えるレベルでの発現を指す。例示的な実施形態では、目的の受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）は、宿主細胞内で過剰発現させることができ、受容体の発現レベルは、同じ受容体の天然に存在する発現レベルよりも高い。目的の核酸またはポリペプチドを過剰発現させるための方法は、特に、限定されず、本明細書でより詳細に考察されており、例えば、ポリペプチド（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）は、ＣＡＤポリペプチドをコードするものと同じまたは異なる発現ベクターを使用して、対応する核酸を移入することにより過剰発現させることができる。発現ベクターは、特に、遺伝子工学に使用することができる限り制限されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、及び他の非プラスミドベクターのいずれかを使用することができる。

本明細書で使用される「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、またはがん状態に関連する様々な生理学的症状の改善により明示することができる生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」は、まず、腫瘍の発生の予防における本発明のポリヌクレオチド及び細胞の能力により、明示することもできる。

本明細書で使用される「自己」という用語は、個体に由来する任意の物質を指し、これは、後に同じ個体に再導入されることになる。

本明細書で使用される「同種異系」という用語は、動物に由来する物質を指し、これは、後に同じ種の別の動物に導入される。

本明細書で使用される「同系」という用語は、遺伝的に類似または同一であり、従って、免疫学的に適合し、移植が免疫応答が引き起こさない材料を指す。

本明細書で使用される場合、「薬剤」という用語は、任意のタンパク質、核酸分子（化学的に改変された核酸を含む）、化合物、抗体、小分子、有機化合物、無機化合物、他の目的の分子、または細胞（例えば、キメラアダプターポリペプチドを発現するように操作された細胞）を指す。薬剤は、治療薬、診断薬、または医薬品を含み得る。治療薬または医薬品は、単独で、または追加の薬剤と一緒に、所望の応答を誘導する（例えば、対象に投与された場合の治療効果または予防効果の誘導、例えば、がん、ウイルス感染（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、エプスタイン・バーウイルス、アデノウイルスなど）、細菌感染（例えば、大腸菌、結核菌など）、関節リウマチ（ＲＡ）、または他の疾患／状態に罹患している対象の処置）。本明細書で考察される薬剤は、調節剤と呼ばれることがある。

本明細書で使用される「診断」または「診断すること」という用語は、がんなどの疾患を、徴候、症状、及び／または様々な検査の結果により特定するプロセスを指す。そのようなプロセスを通じて到達した結論が診断である。一般的に行われる検査の形態は、血液検査、医療イメージング、尿検査、生検などを含む。

「治療的有効量」または単に「有効量」という用語は、研究者、獣医師、医師、または他の臨床医が求めている組織、システム、または対象の生物学的または医学的反応を引き起こす薬剤または組成物（例えば、薬剤を含む組成物）の量を指す。「治療的有効量」という用語は、投与された場合、処置される障害または疾患（例えば、血液腫瘍または固形腫瘍）の１つ以上の徴候または症状の発現を予防するか、またはある程度緩和するのに十分な薬剤または薬剤を含む組成物の量を含む。治療的有効量は、成分、疾患及びその重症度、ならびに処置されるべき対象の年齢、体重などに応じて変動するであろう。

本明細書で使用される用語としての疾患の「処置」は、対象が経験する疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度を減少または低減することを意味する。

本明細書で使用されている「減少」という用語は、何かの品質、量、または強度を低減させることを意味する。一例では、治療（例えば、本開示の治療薬の投与）は、例えば、治療がない場合の応答と比較して、疾患または状態に関連する１つ以上の徴候または症状を低減させる。例えば、治療薬の投与は、がんに関連する１つ以上の徴候または症状を減少させる抗腫瘍効果をもたらし得る。

本明細書で使用される場合、「投与」という用語は、対象に、任意の有効な経路により、１つ以上の薬剤、例えば、状態／障害または疾患（限定されないが、がん、ウイルス感染、細菌感染などを含む）に関連する１つ以上の徴候または症状を処置する薬剤を提供するか、または与えることを意味する。例示的な投与経路としては、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、及び静脈内）、経口、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、経膣、及び吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物学的活性または特性を阻害せず、比較的無毒である物質（限定されないが、塩、担体、または希釈剤を含む）を指す。すなわち、この物質は、望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく、または構成成分が含まれる組成物のいずれの成分とも有害な方法で相互作用することなく、個体に投与され得る。本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、従来のものである。Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（１９９５）によるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓは、１つ以上の薬剤、例えば、１つ以上の調節剤の薬剤送達に適する組成物及び製剤について記載する。一般に、キャリアの性質は、用いられる特定の投与様式により決まるであろう。例えば、非経口製剤は、薬学的及び生理学的に許容される液体（例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール）をビヒクルとして含む注射用液体を含み得る。生物学的に中性な担体に加えて、投与されるべき薬剤は、微量の非毒性の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、及びｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウラート、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及びトリエタノールアミンオレアート）を含有し得る。

本明細書で使用される「サイトカイン」という用語は、細胞から放出される可溶性タンパク質及びペプチドの多様な群を指し、これは、ナノモル～ピコモルの濃度で体液調節因子として機能し、正常または病的な状態において、個々の細胞及び組織の機能活動を調節する。これらのタンパク質は、細胞間の相互作用を直接仲介し、細胞外環境で発生するプロセスを制御する。多くの成長因子及びサイトカインは、プログラムされた細胞死を防ぐことにより細胞生存因子として機能する。サイトカインは、天然に存在するペプチドと、完全または部分的な生物学的活性を保持するバリアントの両方を含む。

「エンコーディング」は、定義されたヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸配列のいずれかと、そこから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成のテンプレートとして機能するポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ内）の特定のヌクレオチド配列の固有の特性を指す。従って、遺伝子は、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞または他の生物系内でタンパク質が生成される場合、タンパク質をコードする。コード鎖の双方は、これのヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常、配列表で提供され、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖が、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードするものと呼ぶことができる。

「分離」は、自然の状態から変更または除去されることを意味する。例えば、生きた動物に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離」されていないが、同じ核酸またはペプチドは、天然状態の既存物質から部分的または完全に単離されている場合は、「単離」される。単離核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または、非ネイティブな環境、例えば、宿主細胞に存在し得る。

別途明記のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及びＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。

「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、本明細書に記載の方法に適合する任意の動物を指す。特定の非限定的な実施形態では、患者、対象、または個体は、ヒトである。

細胞表面受容体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、特定の分子／リガンドを認識するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識または結合しない受容体を意味する。例えば、ある種の分子に特異的に結合する受容体は、１つ以上の種の分子にも結合し得る。しかし、そのような種間の反応性自体は、特定のものとしての分類を変更するものではない。別の例では、ある分子に特異的に結合する受容体は、分子の異なる対立遺伝子型にも結合し得る。しかし、そのような交差反応性自体は、特定のものとしての分類を変更するものではない。いくつかの場合では、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、タンパク質（またはペプチド）の第２の化学種との相互作用に関して使用することができ、相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、受容体は、一般的なタンパク質ではなく、特定の構造を認識して結合する。受容体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識「Ａ」及び受容体を含有する反応において、エピトープＡを含む分子（または不含、未標識Ａ）が存在すると、受容体に結合する標識Ａの量が低減するであろう。

いくつかの実施形態では、特異的結合は、少なくとも約１×１０^－８Ｍ以下の平衡解離定数により特徴付けることができる（例えば、ＫＤが小さいほど、結合が強いことを示す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを判定する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。

本明細書で使用される「がん」という用語は、細胞集団が無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指す。腫瘍形成、悪性腫瘍、がん、及び腫瘍は、互換的に使用され得、過剰な細胞分裂をもたらす組織または細胞の異常増殖を指す。個体における腫瘍の量は、腫瘍数、体積、または重量として測定することができる「腫瘍量」である。転移しない腫瘍は「良性」と呼ばれる。周囲の組織を侵襲し、及び／または転移し得る腫瘍は、「悪性」と呼ばれる。「非がん性組織」は、悪性腫瘍が形成した同じ臓器からの組織であるが、腫瘍の特徴的な病理を有さない。一般的に、非がん性組織は、組織学的には正常に見える。「正常組織」は、臓器が、がんまたはその臓器の別の疾患または障害の影響を受けていない臓器由来の組織である。「がんのない」対象は、その臓器のがんと診断されておらず、検出可能ながんを有さない。

がんの症状は、とりわけ、持続的な咳または血の混じった唾液、排便習慣の変化、血便、原因不明の貧血（血球数の低下）、乳房のしこりまたは乳房分泌物、精巣のしこり、排尿の変化、血尿、嗄声、持続的なしこりまたは腫れた腺、イボまたはホクロの明らかな変化、消化不良、嚥下困難、異常な膣出血または分泌物、予期せぬ体重減少、寝汗または発熱、肛門または生殖器周辺の持続的なかゆみ、治らない傷、頭痛、背痛、骨盤痛、及び膨満を含むが、これらに限定されない。

血液がんは、血液または骨髄に発生するがんである。血液がん（または血行性がん）の例としては、白血病、例えば、急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、及び赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度及び高悪性度）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、骨髄異形成が挙げられる。

固形腫瘍は、少なくとも約１０個または少なくとも約１００個の腫瘍細胞由来の腫瘍塊を含む腫瘍である。固形腫瘍は、軟部組織腫瘍、原発性固形腫瘍、または転移性病変であり得る。

固形腫瘍の例としては、例えば、様々な臓器系、例えば、肝臓、肺、乳房、リンパ、胃腸（例えば、結腸）、泌尿生殖器（例えば、腎臓、尿路上皮細胞）、膵臓、前立腺、及び咽頭に影響するものの肉腫、腺がん、及びがん腫が挙げられる。腺がんは、悪性腫瘍、例えば、ほとんどの大腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸癌、及び食道癌を含む。一実施形態では、がんは、黒色腫、例えば、進行期黒色腫である。別の実施形態では、がんは、神経膠腫である。上述のがんの転移性病変は、本発明の方法及び組成物を使用して処置または予防することもできる。

「発現カセット」は、発現されるべき転写産物またはポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されている発現制御配列を含む核酸を指す。発現カセットは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞またはｉｎｖｉｔｒｏ発現系により供給することができる。発現カセットは、ベクター、例えば、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッド、もしくはリポソームに含有）、またはウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）の構成要素であり得る。発現カセットは、宿主細胞、例えば、免疫細胞（例えば、γδＴ細胞）内にあり得る。範囲：本開示の全体にわたって、開示の様々な態様が、範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は、単に、便宜上及び簡潔にするためのものであり、開示の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。従って、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値だけでなく、全ての可能なサブ範囲を具体的に開示しているものと考えられるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、部分範囲、例えば、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６など、ならびに、その範囲内の個々の数字、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６が具体的に開示されていると考えられる。これは、範囲の広さに関係なく適用される。

核酸またはそのフラグメントを指す場合の「実質的同一性」または「実質的に同一」という用語は、別の核酸（または他の核酸の相補鎖）と最適にアラインした場合、ヌクレオチド塩基のヌクレオチド配列同一性（％）、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％（以下で検討される周知の任意の配列同一性アルゴリズム、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧＡＰで決定される）があることを指す。参照核酸分子と実質的に同一性を有する核酸分子は、特定の場合では、参照核酸分子にコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。

ポリペプチドに適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似する」という用語は、デフォルトのギャップ重みを使用するＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどで最適にアラインした場合、２つのペプチド配列が、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を共有することを意味する。いくつかの態様では、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されるものである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させないであろう。２つ以上のアミノ酸配列が、保存的置換により互いに異なる場合、置換の保存的性質を補正するために類似性のパーセントまたは程度が上方調整され得る。この調整を行う手段は、当業者らには周知である。例えば、以下を参照のこと：Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１（参照により本明細書に組み込まれる）。類似した化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、以下が挙げられる：１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン、及びトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸；ならびに、７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニン。好ましい保存的アミノ酸置換基群は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、及びアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換は、以下に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列を有する任意の変化である：Ｇｏｎｎｅｔｅｔａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１４４３－４５（参照により本明細書に組み込まれる）。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列で負でない値を有する任意の変化である。

ポリペプチドの配列同一性及び／または類似性は、通常、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、及び他の改変に割り当てられた類似性の尺度を使用して、類似の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、プログラム、例えば、ＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴを含有し、これは、密接に関連したポリペプチド、例えば、異なる生物種由来の相同ポリペプチド間の、または野生型タンパク質及びその変異タンパク質間の配列相同性または配列同一性を判定するために、デフォルトパラメータで使用することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦＡＳＴＡをデフォルトまたは推奨パラメータを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列及び検索配列の間で最も重複する領域のアラインメント及び配列同一性のパーセントを提供する（上掲のＰｅａｒｓｏｎ（２０００））。ギャップオープンペナルティが１２、ギャップ拡張ペナルティが２、ＢＬＯＳＵＭマトリックスが６２のアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して、配列を比較することもできる。異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと、本明細書に開示された配列を比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトのパラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特に、ＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、以下を参照のこと：Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０ａｎｄ（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９－３４０２（これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）。

Ｉ．緒言
１０ｋＤａのＤＮＡＸ活性化タンパク質（ＤＡＰ１０）は、細胞表面の細胞傷害性受容体ナチュラルキラー群２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）に関連するアダプター分子である。ＮＫＧ２Ｄ受容体は、ＩＩ型膜貫通アンカー型Ｃ型レクチン様タンパク質であり、これは、Ｃ型レクチン様受容体のＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリーに属する（Ｈｏｕｃｈｉｎｓｅｔａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１０１７－１０２０）。ＮＫＧ２Ｄは、多数の非常に多様なＭＨＣクラスＩ様自己分子に結合することが可能である。これらのリガンドは、多くの場合、正常細胞上で、ほとんど発現しないが、損傷を受けた細胞、形質転換した細胞、または感染細胞では、誘導することができる（Ｚｉｎｇｏｎｉ，Ａｅｔａｌ．（２０１８）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（４７６）：１－１２）。該リガンドは、マウスではＨ６０（ａ－ｃ）、ＲＡＥ（α－ε）、及びＭＵＬＴ１ファミリーに属し、ヒトでは、ＭＩＣ（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）ならびにＵＬＢＰ（ＵＬＢＰ１－ＵＬＢＰ６）ファミリーに属し、そのレパートリーは、他の種よりも複雑である。実際には、ＭＩＣ分子は、古典的なＨＬＡ分子に次いで最も高度に多型性ヒト遺伝子にコードされる（Ｅａｇｌｅ，ＲＡａｎｄＴｒｏｗｓｄａｌｅ，Ｊ．（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００７）７（９）：７３７－４４）。

ＮＫＧ２Ｄは、自然免疫応答及び養子免疫応答の両方を調節する活性化免疫受容体である。ＮＫＧ２Ｄは、全てのＮＫ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、γδＴ細胞のサブセット、及び一部の自己反応性ＣＤ４Ｔ細胞に豊富に存在する。ＮＫＧ２Ｄは、ＤＡＰ１０などの他の共刺激分子と共に作用して、Ｔ細胞受容体を介した抗原特異的応答の強度及び持続時間を変更し、Ｔリンパ球による抗腫瘍反応のパターンに影響を与える（例えば、以下を参照のこと：ＭａｃｃａｌｌｉＣ，ｅｔａｌ．（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３（７）：２０３３－４３）。

ＮＫＧ２Ｄは、細胞質ドメインにシグナル伝達モチーフを欠いている。従って、リガンド結合後、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達及び細胞活性化は、ＮＫＧ２ＤをＤＡＰ１０アダプター分子との会合に依存し、これは、ＮＫＧ２Ｄ表面膜発現を促進し、安定化する（Ｗｕ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：７３０－７３２）。しかし、例えば、ＴＧＦ－βは、ＮＫＧ２Ｄ（及びＮＫＧ２ＤＬ）表面発現の下方調節が可能であること（ＬａｚａｒｏｖａＭａｎｄＳｔｅｉｎｌｅ（２０１９）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１０（２６８９）：１－１１）、ならびに、ＴＧＦ－βは、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方でＤＡＰ１０発現を大幅に減少させ得ることが知られている（Ｐａｒｋ，ＹＰｅｔａｌ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ．１１８：３０１９－２７；Ｌｅｅ，ＪＣｅｔａｌ．（２０１１）Ｔｕｍｏｒｉ９７：３５０－７）。従って、ＮＫＧ２Ｄ及び／またはＤＡＰ１０の発現及び／または関連シグナル伝達経路を調節することが可能な方法論が治療上の目的であることが本明細書では認識されている。

ＮＫＧ２Ｄに加えて、ＤＡＰ１０は、他の多くの受容体に関連することが知られている。例えば、Ｌｙ４９Ｈ及びＬｙ４９Ｄは、マウスＮＫ細胞からＤＡＰ１０と共免疫沈降され、２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトされた場合、ＤＡＰ１０に関連することが示される（ＣｏｕｄｅｒｔＪＤｅｔａｌ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ１１１：３５７１－３５７８）。同時トランスフェクション研究により、ＤＡＰ１０は、トランスフェクトされたラットＲＢＬ－２Ｈ３細胞においてヒトＳｉｒｐ－ｂ１に関連することも示されている（ＡｎｆｏｓｓｉＮｅｔａｌ．（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：３５１４－３５２２）。同様に、ヒト及びマウスＳｉｇｌｅｃ－１５（ＡｎｇａｔａＴｅｔａｌ．（２００７）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１７：８３８－８４６）及びＣｄ３００ｌｂ（ＹａｍａｎｉｓｈｉＹｅｔａｌ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ１１１：６８８－６９８）は、同時トランスフェクション及び共免疫沈降によりＤＡＰ１０と対になることが示されている。上述のように、特定のＤＡＰ１０関連受容体（すなわち、ＮＫＧ２Ｄ）は、宿主にコードされた分子、例えば、炭水化物及びタンパク質リガンドを認識するようであるが、他のＤＡＰ１０関連受容体は、微生物リガンドを直接認識し得る。一例として、マウスＣＭＶにコードされた糖タンパク質ｍ１５７が、Ｌｙ４９Ｈによって認識されることが挙げられる（ＬａｎｉｅｒＬＬ（２００８）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（４）：２５９－６８；ＳｍｉｔｈＨＲｅｔａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９（１３）：８８２６－３１）。ｍ１５７は、ＭＨＣクラスＩと相同性を有するＧＰＩアンカー型糖タンパク質であり、これは、マウスＣＭＶ感染細胞の表面に提示され、Ｌｙ４９Ｈ＋ＮＫ細胞媒介性細胞傷害及びサイトカイン産生の活性化をもたらす。

上述の受容体は、ＮＫＧ２Ｄに加えて多数の受容体と対になって、それにより、シグナル伝達を調節するＤＡＰ１０の能力を例示することを意図するものであって、網羅的なものではない。本開示に関して、核酸、それにコードされるポリペプチド、細胞、組成物、及び方法は、ＤＡＰ１０がパートナーとなることが可能なありとあらゆる受容体に適用されることが理解されるべきである。

ＩＩ．一般的な方法
別途記載のない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。特に、本開示は、組み換え遺伝学、免疫学、及び生化学の分野における日常的手法を利用する。分子生物学及び遺伝学の一般用語を開示する基本的なテキストとしては、例えば、以下が挙げられる：Ｌａｃｋｉｅ，ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（５ｔｈｅｄ．２０１３）。組み換え遺伝学及び分子生物学の方法を開示する基本的なテキストは、例えば、以下が挙げられる：Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ－ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ４ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２０１２）及びＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＶｏｌｕｍｅｓ１－３，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４－１９９８）及びＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ１－１１５（１９８７－２０１６）。生化学の一般的な方法及び用語を開示する基本的なテキストとしては、例えば、以下が挙げられる：ＬｅｈｎｉｎｇｅｒＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｉｘｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，ＤａｖｉｄＬ．ＮｅｌｓｏｎａｎｄＭｉｃｈａｅｌＭ．Ｃｏｘｅｄｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ（２０１２）。免疫学の一般的な方法及び用語を開示する基本的なテキストは、以下が挙げられる：Ｊａｎｅｗａｙ’ｓＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（ＮｉｎｔｈＥｄｉｔｉｏｎ）ｂｙＫｅｎｎｅｔｈＭ．ＭｕｒｐｈｙａｎｄＣａｓｅｙＷｅａｖｅｒ（２０１７）ＧａｒｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ；ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＳｅｖｅｎｔｈＥｄｉｔｉｏｎ）ｂｙＷｉｌｌｉａｍＥ．Ｐａｕｌ（２０１３）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＷｉｌｌｉａｍｓａｎｄＷｉｌｋｉｎｓ。

ＤＡＰ１０
上述のように、ＮＫＧ２Ｄ受容体は、例えば、細胞質ドメインでシグナル伝達モチーフを欠いている。従って、ＮＫＧ２Ｄ受容体のシグナル伝達機能は、とりわけ、アダプター分子であるＤＡＰ１０との関連に密接に結びついている。ＤＡＰ１０に関する以下の言及は、提示を明瞭且つ簡単にするために、ＮＫＧ２Ｄ受容体に関して提示されているが、その教示が、ＤＡＰ１０がパートナーとなり得る他の受容体にも幅広く適用できることを理解されるべきである。

ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体は、ＤＡＰ１０シグナル伝達二量体と共に組み立てられ、保存された膜貫通（ＴＭ）アルギニン残基間の２つの塩橋の形成により、１つのＮＫＧ２Ｄホモ二量体がＤＡＰ１０二量体と対になっている（Ｇａｒｒｉｔｙ，Ｄ．ｅｔａｌ．（２００５）ＰＮＡＳＵＳＡ１０２（２１）：７６４１－７６４６）。ＤＡＰ１０二量体は、膜貫通（ＴＭ）ドメインの中心近くに一対のアスパラギン酸残基を有し、これらの残基は、ＤＡＰ１０二量体と組み立てるために、ＮＫＧ２ＤのＴＭ配列内の保存されたアルギニンと相互作用する。従って、ＮＫＧ２Ｄホモ二量体は、その膜貫通ドメイン内のＤＡＰ１０アダプター分子と会合して、シグナル伝達カスケードを開始し得る六量体構造体を形成する（例えば、以下を参照のこと：上掲のＧａｒｒｉｔｙｅｔａｌ（２００５））。

上述のように、ＤＡＰ１０二量体は、ジスルフィド結合したホモ二量体である。野生型ヒトＤＡＰ１０ポリペプチドのアミノ酸配列が、以下に配列番号１として示される：ＭＩＨＬＧＨＩＬＦＬＬＬＬＰＶＡＡＡＱＴＴＰＧＥＲＳＳＬＰＡＦＹＰＧＴＳＧＳＣＳＧＣＧＳＬＳＬＰＬＬＡＧＬＶＡＡＤＡＶＡＳＬＬＩＶＧＡＶＦＬＣＡＲＰＲＲＳＰＡＱＥＤＧＫＶＹＩＮＭＰＧＲＧ（配列番号１）。本開示に関連する多数の配列を列挙する表２も参照のこと。

ＤＡＰ１０細胞質ドメインは、配列番号１の残基８６～８９を含むチロシンベースのモチーフ（ＹＩＮＭ）を含む。チロシン（Ｙ８６）リン酸化時に、ＤＡＰ１０は、ホスファチジルイノシトール３キナーゼのｐ８５サブユニット（ＰＩ３Ｋ、ＹＸＸＭ経由）またはアダプターＧｒｂ２（ＹＸＮＸ経由）のいずれかに結合することが可能である。これら２つの結合部位が重複しているので、単一のＤＡＰ１０鎖は、ｐ８５またはＧｒｂ２のいずれかに結合するが、両方には結合しない（ＬａｎｉｅｒＬＬ．（２００８）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（５）：４９５－５０２）。このＹＩＮＭモチーフは、ＣＤ２８のモチーフと同様であり、これは、Ｔ細胞内の免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）ベースのＴＣＲ／ＣＤ３複合体と連動して共刺激シグナル伝達を提供する。

ＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニットまたはアダプタータンパク質Ｇｒｂ２の両方の動員は、どちらもＶａｖ１及びＰＬＣ－γ２を活性化し得、それにより、Ｃａ^２＋可動化及び細胞に対する細胞傷害性の活性化に不可欠である（ＵｐｓｈａｗＪＬｅｔａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（５）：５２４－３２）。

ＤＡＰ１０は、さらに、ＤＡＰ１０タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８４のリジンを包含するユビキチン化部位を含む。ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄのリガンド刺激は、ＮＫＧ２Ｄ－ＤＡＰ１０複合体のエンドサイトーシス及び分解に必要なＤＡＰ１０のユビキチン化をもたらす（例えば、以下を参照のこと：Ｍｏｌｆｅｔｔａ，Ｒ．，ｅｔａｌ．（２０１４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４，２７６１－２７７０）。さらに、ユビキチン依存性受容体エンドサイトーシスは、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）の活性化、ならびに、ＮＫ細胞機能、例えば、細胞傷害性顆粒及び炎症性サイトカインインターフェロン－γの分泌、に必要となることが示されている。従って、ＮＫＧ２Ｄ－ＤＡＰ１０エンドサイトーシスは、細胞表面受容体の存在量を減少させ、細胞傷害性リンパ球におけるシグナル伝達を制御する手段である。

キメラアダプターコンストラクト
本開示の態様は、キメラアダプターポリペプチドをコードする核酸を含むコンストラクトを含む。実施形態では、核酸は、ｉ）ヒトＤＡＰ１０アミノ酸配列、及び、ｉｉ）１つ以上の共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８）を含むキメラアダプターポリペプチドをコードし、ＣＡＤポリペプチドは、具体的には、細胞外ドメインを欠いている。実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、さらに、本明細書に記載の１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を含み得る。実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、１つ以上の変異、例えば、ＤＡＰ１０における１つ以上の変異ならびに／または共刺激ドメイン（複数可）及び／または細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）における１つ以上の改変（例えば、１つ以上の変異、追加、または欠失）も含み得る。

実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、それらが関連する１つ以上の受容体を介してシグナル伝達を調節及び／または抑制するように機能する。実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、調節／抑制された属性（例えば、１つ以上の変異による）及び／または追加されたシグナル伝達属性（例えば、Ｃ末端融合体による）で設計され、宿主細胞で発現され、受容体－標的結合（例えば、細胞外標的リガンドのＮＫＧ２Ｄ結合）時にシグナル伝達経路の好ましいバランスを促進し、これは、一次ＴＣＲの標的の発現が低い、または失われる（すなわち、抗原エスケープ）という問題に対処するのに役立ち得る。「好ましいバランス」という用語は、所望の方法で主要なＤＡＰ１０シグナル伝達カスケードと相補的であるか、代替的であるか、またはそれを調節するように作用するシグナル伝達カスケードの導入を幅広く指す。従って、本明細書に開示のＣＡＤポリペプチドは、限定されないが、ＤＡＰ１０とパートナーになる受容体のリガンド（例えば、ＮＫＧ２Ｄの広く発現しているリガンド）との結合により誘発される変更された（例えば、強化された）細胞溶解、増殖、生存、及び／または共刺激特性を含む、変更された（例えば、改善された）機能特性を提供する。ＣＡＤポリペプチドの正確な組成は、所与の疾患の兆候に、いくつかの実施例では、同じ細胞上に存在する他の受容体（複数可）（例えば、ＴＣＲ受容体（複数可））の特異性及びシグナル伝達構成要素との組み合わせに基づいて設計することができる。一例として、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内の免疫抑制シグナルは、Ｔ細胞上の阻害性受容体を介して抗腫瘍Ｔ細胞応答を阻害し得、ＣＡＤポリペプチドの使用を介して、そのような阻害出力を免疫刺激出力に切り替え得ることは、本開示の範囲内である。他の関連する実施例は、例えば、以下に見出され得る：Ｇｕｏ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，（２０２１）ＪｏｕｒｎａｌｆｏｒＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙｏｆＣａｎｃｅｒ９：ｅ００２６２８。

実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、少なくとも部分的に、それらが会合する細胞表面受容体（複数可）（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）を安定化するように機能し得る。本明細書に開示される細胞表面受容体（複数可）を「安定化する」ことは、本明細書に記載のＣＡＤポリペプチドの不存在下の同様の状況下で、該細胞表面受容体が別の方法で除去される速度と比較して、該細胞表面受容体に取り込まれるか、または別の方法で該細胞表面から除去される速度を減少させることを意味する。本明細書で記載されている受容体安定化の範囲内に包含されると、ＣＡＤポリペプチドシグナル伝達が内因性ＤＡＰ１０及びＣＡＤポリペプチドが関連する内因性受容体（複数可）（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）の細胞表面発現の増加をもたらす正のフィードバック機構が含まれる（Ｗｕ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，（２０００）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐＭｅｄ１９２（７）：１０５９－１０６８）。

実施形態では、細胞の生存及び増殖に影響を及ぼす異種シグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＬ２Ｒ、４－１ＢＢ、ＣＤ２７など）を含むＣＡＤポリペプチドの発現は、正常組織において低レベルの発現を有する標的に関与する同じ宿主細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）上の内因性受容体（例えば、内因性ＴＣＲ）と組み合わせた場合に、標的攻撃の厳密性及び／または効力を増加させ得る論理ゲーティング戦略（例えば、「ＡＮＤ」ゲーティング）を可能にする。従って、主要な標的（例えば、主要ながん標的）を認識する受容体と適切なＣＡＤポリペプチドの両方を有する宿主細胞は、主要な標的とＤＡＰ１０に関連する受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）のリガンドの両方を発現する標的細胞の持続的な生存、増殖及び殺傷を促進し得る。本開示に適用可能なロジックゲーティング戦略の例は、例えば、以下に判明することができる：ＷＯ２０１９１１８５１８、ＷＯ２０２０１５４６３５、ＷＯ２０２０２２３４４５、ＷＯ２０２１０３５０９３、ＷＯ２０１９２２２６４２Ａ１、ＷＯ２０１８２３６８２５Ａ１、ＷＯ２０１９１６４９７９、ならびにＣｈａｎｇ，ＺＬ、及びＣｈｅｎＹＹ（２０１７）ＴｒｅｎｄｓＭｏｌＭｅｄ２３（５）：４３０－４５０。

本発明は、安定的に発現されるＣＡＤポリペプチドも提供する。実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、内因性ＤＡＰ１０が目的の宿主細胞内で発現されるレベルと実質的に同様のレベルで発現される。実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、内因性ＤＡＰ１０が目的の宿主細胞内で発現されるレベルよりも高いレベルで発現される。例えば、ＣＡＤポリペプチドは、内因性ＤＡＰ１０が発現される対応するレベルよりも１０％高い、もしくは１０～２０％高い、もしくは２０～３０％高い、もしくは３０～４０％高い、もしくは４０～５０％高い、もしくは５０～６０％高い、もしくは６０～７０％高い、もしくは７０～８０％高い、もしくは８０～９０％高い、もしくは９０～１００％高い、またはさらに高い、例えば、２倍高い、もしくは３倍高い、もしくは４倍高い、もしくは５倍高い、もしくは６倍高い、もしくは７倍高い、もしくは８倍高い、もしくは９倍高い、もしくは１０倍高い、もしくは２０倍高い、もしくは３０倍高い、もしくは４０倍高い、もしくは５０倍高い、もしくは１００倍高いレベルで発現され得る。従って、実施形態では、本発明のＣＡＤポリペプチドは、特定の宿主細胞の種類に応じて、受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）に結合する内因性ＤＡＰ１０と競合し得ると理解され得る。

本開示の態様は、ＣＡＤポリペプチドをコードする核酸、及びそのような核酸を含有するコンストラクト／ベクターを含む。それ故、所望の特性（例えば、限定されないが、該ＣＡＤポリペプチドを発現する宿主細胞における持続的な生存、増殖、及び／または殺傷を含む）を付与するシグナル伝達特性を調節及び／または追加する選択変異及びシグナル伝達ドメインを組み込むＣＡＤポリペプチドをコードする核酸が、本明細書に記載される。

Ａ．変異
実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、配列番号１の位置Ｋ８４及び／または位置Ｙ８６にアミノ酸改変の１つまたは両方を有する。実施形態では、Ｋ８４は、別の正荷電アミノ酸、例えば、Ｋ８４ＲまたはＫ８４Ｈを含むように改変される。但し、Ｋ８４における改変が他のアミノ酸置換を含み得ることも本開示の範囲内である。一実施形態では、改変は、Ｋ８４Ｒ改変である。実施形態では、Ｋ８４Ｒ改変を有するＣＡＤポリペプチドは、配列番号１８を含む。実施形態では、Ｙ８６は、別の芳香族アミノ酸、例えば、Ｙ８６ＦまたはＹ８６Ｗに改変される。但し、Ｙ８６の改変が他のアミノ酸置換を含み得ることは、本開示の範囲内である。一実施形態では、改変は、Ｙ８６Ｆ改変である。実施形態では、Ｙ８６Ｆ改変を有するＣＡＤポリペプチドは、配列番号１９を含む。実施形態では、Ｋ８４Ｒ改変及びＹ８６Ｆ改変の両方を有するＣＡＤポリペプチドは、配列番号２０を含む。

実施形態では、配列番号１の位置８６における改変は、ｐ８５／ＰＩ３ＫのＣＡＤポリペプチドへの結合を減少または除去し、次に、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＰＫＣθシグナル伝達を減少または除去する。従って、位置８６での改変は、共刺激、カルシウム流入、及び／または脱顆粒の１つ以上を機能的に低減または除去するのに役立ち得る。好ましい実施形態では、改変は、Ｙ８６Ｆである。

追加的または代替的な実施形態では、配列番号１の位置８６における改変は、Ｇｒｂ２のＣＡＤポリペプチドへの結合が低減または除去し、次に、Ｖａｖ１／ＳＬＰ－７６／ＰＬＣγシグナル伝達が低減または除去する。従って、位置８６での改変は、カルシウム流入及び／または脱顆粒の１つ以上を低減または除去するのに役立ち得る。好ましい実施形態では、改変は、Ｙ８６Ｆである。

追加的または代替的な実施形態では、配列番号１の位置８４における改変は、ＣＡＤポリペプチドのユビキチン化を低減させるか、または完全に阻害し、次に、特定の宿主細胞の細胞膜におけるキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチド－内因性受容体複合体の内在化を低減させるか、または完全に防止する（例えば、Ｑｕａｔｒｉｎｉ，Ｌ．，ｅｔａｌ．，（２０１５）ＳｃｉＳｉｇｎａｌ８（４００）：ｒａ１０８を参照）。このようにして、少なくともＫ８４改変（例えば、Ｋ８４Ｒ）を有するＣＡＤポリペプチドに依存することにより、ＤＡＰ１０に関連する内因性受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）を細胞表面で安定化することができる。さらに、Ｋ８４の改変（例えば、Ｋ８４Ｒ）は、リソソーム分解の途中で生じるシグナル伝達（例えば、ＥＲＫ１／２）を低減または除去し得る。シグナル伝達（例えば、ＥＲＫ１／２）の低減または除去は、疲弊、活性化誘導性細胞死、及び／または過剰活性化時の細胞周期停止の誘導のうちの１つ以上を低減または除去するのに役立ち得、そうでなければ、これらのうちの１つ以上はＫ８４改変（例えば、Ｋ８４Ｒ）を有するＣＡＤポリペプチドの非存在下で生じ得る。

追加的または代替的な実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、配列番号１の位置５７に改変、例えば、Ｄ５７Ａ改変、を含んでもよいが、アラニン以外のアミノ酸改変は、本開示の範囲内にある。実施形態では、Ｄ５７Ａ改変を有するキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドは、配列番号３７を含む。Ｄ５７での改変は、実施形態では、ＫＬＲＫ１との安定した相互作用を改変（例えば、低減または廃止）するのに役立ち得る（Ｗｕ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５（５４２８）：７３０－２）。

追加的または代替的な実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、配列番号１の位置８８に改変、例えば、Ｎ８８Ｑ改変、を含んでもよいが、グルタミン以外のアミノ酸改変は、本開示の範囲内である。実施形態では、Ｎ８８Ｑ改変を有するＣＡＤポリペプチドは、配列番号３８を含む。Ｎ８８の改変は、実施形態では、ＰＩＫ３Ｒ１との相互作用に、最小限の影響～全く影響を与えず、細胞殺傷活性及び／またはＧＲＢ２との相互作用を改変（例えば、低減）するのに役立ち得る（Ｕｐｓｈａｗ，ＪＬ．，（２００６）ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ７：５２４－５３２）。

追加的または代替的な実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、配列番号１の位置８９に改変、例えば、Ｍ８９Ｑ改変、を含んでもよいが、グルタミン以外のアミノ酸改変は、本開示の範囲内である。実施形態では、Ｍ８９Ｑ改変を有するＣＡＤポリペプチドは、配列番号３９を含む。Ｍ８９Ｑの改変は、実施形態では、ＧＲＢ２との相互作用に、最小限の影響～全く影響を与えず、細胞殺傷活性及び／またはＰＩＫ３Ｒ１との相互作用を改変（例えば、低減）するのに役立ち得る（Ｕｐｓｈａｗ，ＪＬ．，（２００６）ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ７：５２４－５３２）。

本開示は、上記の改変のうちの１つ以上またはそれぞれを有するキメラアダプターポリペプチドを包含することが理解され得る。

Ｂ．共刺激及びシグナル伝達ドメイン
実施形態では、本開示のキメラアダプターポリペプチドのエンドドメインは、１つ以上の共刺激ドメインを含み、共刺激ドメインは、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体などに由来する機能的共刺激シグナル伝達ドメインを含む。例えば、開示のＣＡＤポリペプチドのエンドドメインが、２、３、４またはそれ以上の共刺激ドメインを含み得ることは、本開示の範囲内である。複数の共刺激ドメインが含まれる場合、共刺激ドメインは、同じであっても、異なっていてもよいことも、本開示の範囲内である。実施形態では、共刺激ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ３Ｃ、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２γ、ＩＬ７Ｒα、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１６２（ＳＥＬＰＬＧ）、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ２２９（Ｌｙ９）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＦｃＲ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＩＡ４、ＶＬＡ－１、ＶＬＡ－６、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＳＬＡＭＦ４、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＡＭＦ８（ＢＬＡＭＥ）、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＢＴＬＡ、ＪＡＭＬ、ＣＤ１５０、ＰＳＧＬ１、ＴＳＬＰ、ＴＮＦＲ２、及びＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬのうちの１つ以上、またはその一部、及びそれらの組み合わせから誘導される。

いくつかの実施形態では、ＣＡＤコンストラクトは、少なくとも１つの４－１ＢＢ共刺激ドメインをコードし、任意に、４－１ＢＢ、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、及びＣＤ２７共刺激ドメイン、または上述の共刺激ドメインのいずれかから選択される第２の共刺激ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、少なくとも２つの４－１ＢＢ共刺激ドメイン、または、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、及びＣＤ２７、から選択される１つ、２つ、３つ、もしくは４つ以上の共刺激ドメインと組み合わせた少なくとも２つの４－１ＢＢ共刺激ドメイン、あるいは上述の共刺激ドメインのいずれかをコードする。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２（ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ）を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つ以上の改変を有するアミノ酸配列を含む。実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２を含む４－１ＢＢ共刺激ドメインと実質的に同様である。

いくつかの実施形態では、ＣＡＤコンストラクトは、少なくとも１つのＣＤ２７共刺激ドメインをコードし、任意に、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、２Ｂ４、及びＣＤ２７共刺激ドメイン、または上述の共刺激ドメインのいずれかから選択される少なくとも１つの第２の共刺激ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、少なくとも１つのＣＤ２７共刺激ドメイン及び４－ＩＢＢ共刺激ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、２つのＣＤ２７共刺激ドメインと、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、及びＣＤ２７から選択される少なくとも１つの第２の共刺激ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、ＣＤ２７共刺激ドメインは、配列番号５（ＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＨＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２７共刺激ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、またはそれ以上の改変を有するアミノ酸配列を含む。実施形態では、ＣＤ２７共刺激ドメインは、配列番号５を含むＣＤ２７共刺激ドメインと実質的に同様である。

いくつかの実施形態では、ＣＡＤコンストラクトは、少なくとも１つのＣＤ２８共刺激ドメインをコードし、任意に、４－１ＢＢ、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、及びＣＤ２７共刺激ドメイン、または上述の共刺激ドメインのいずれかから選択される第２の共刺激ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、ＣＡＤコンストラクトは、少なくとも２つのＣＤ２８共刺激ドメイン、または、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、及びＣＤ２７、から選択される１つ、２つ、３つ、もしくは４つ以上の共刺激ドメインと組み合わせた少なくとも２つのＣＤ２８共刺激ドメイン、あるいは上述の共刺激ドメインのいずれかをコードする。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号４０（ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ）を含む。実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号４１（ＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ）を含む。配列番号４０及び配列番号４１は、シグナル伝達経路を調節できる３つのサブドメインであるＹＭＮＭ、ＰＲＲＰ、及びＰＹＡＰを含む。実施形態では、開示されるＣＡＤポリペプチドは、該サブドメインの１つ以上の変異または欠失を含む（例えば、以下を参照、ＷＯ２０１９０１０３８３）。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列、または配列番号４１のアミノ酸配列の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、またはそれ以上の改変を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号４０を含むＣＤ２８共刺激ドメインと実質的に同様である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号４１を含むＣＤ２８共刺激ドメインと実質的に同様である。

いくつかの実施形態では、ＣＡＤコンストラクトは、少なくとも１つのＩＣＯＳ共刺激ドメインをコードし、任意に、４－１ＢＢ、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、及びＣＤ２７共刺激ドメイン、または上述の共刺激ドメインのいずれかから選択される第２の共刺激ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、ＣＡＤコンストラクトは、少なくとも２つのＩＣＯＳ共刺激ドメイン、または、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、及びＣＤ２７、から選択される１つ、２つ、３つ、もしくは４つ以上の共刺激ドメインと組み合わせた少なくとも２つのＩＣＯＳ共刺激ドメイン、あるいは上述の共刺激ドメインのいずれかをコードする。いくつかの実施形態では、ＩＣＯＳ共刺激ドメインは、配列番号４２を含む。いくつかの実施形態では、ＩＣＯＳ共刺激ドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、またはそれ以上の改変を有するアミノ酸配列を含む（例えば、以下を参照、ＵＳ２０１７０２０９４９２）。いくつかの実施形態では、ＩＣＯＳ共刺激ドメインは、配列番号４２を含むＩＣＯＳ共刺激ドメインと実質的に同様である。

いくつかの実施形態では、ＣＡＤコンストラクトは、少なくとも１つのＯＸ４０共刺激ドメインをコードし、任意に、４－１ＢＢ、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、及びＣＤ２７共刺激ドメイン、または上述の共刺激ドメインのいずれかから選択される第２の共刺激ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、ＣＡＤコンストラクトは、少なくとも２つのＯＸ４０共刺激ドメイン、または、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、及びＣＤ２７、から選択される１つ、２つ、３つ、もしくは４つ以上の共刺激ドメインと組み合わせた少なくとも２つのＯＸ４０共刺激ドメイン、あるいは上述の共刺激ドメインのいずれかをコードする。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０共刺激ドメインは、配列番号４３（ＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ）を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０共刺激ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、またはそれ以上の改変を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０共刺激ドメインは、配列番号４３を含むＯＸ４０共刺激ドメインと実質的に同様である。

実施形態では、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、発明のキメラアダプターポリペプチドに含まれる。実施形態では、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激ドメインに追加される。実施形態では、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書に開示されるＣＡＤポリペプチドを有する宿主細胞（例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδ細胞など）の増殖、持続性、及び／または細胞傷害活性を増加させるために含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）は、ＣＤ３ζ、反復（例えば、２～５）ＤＡＰ１０ＹＩＮＭモチーフ、シグナル伝達ドメイン（ＬＦＡ－１、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄなどに由来）を含む。開示されるキメラアダプターポリペプチドのエンドドメインが、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得ることは、本開示の範囲内である。複数の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、同じであっても、異なっていてもよい。

いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号３）、またはＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号４）、またはＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＦＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号７６）（本明細書では「１ＸＸ」とも呼ばれる）を含む（例えば、以下を参照：ＵＳ２０２０／０３１７７７７、この内容は、全体が本明細書に参照により組み込まれる）。理論に束縛されることなく、いくつかの実施形態では、１ＸＸシグナル伝達ドメインを含むと、過剰活性化を制限することにより、本開示の改変免疫細胞の活性化及び／または生存が改善され得る。

いくつかの実施形態では、ＣＡＤコンストラクトは、１つ以上の共刺激ドメイン（複数可）（例えば、４－１ＢＢ共刺激ドメイン）、及び１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＡＤコンストラクトは、少なくとも１つの４－１ＢＢ共刺激ドメイン、少なくとも１つのＣＤ２８ドメイン、及び少なくとも１つのＣＤ３ζシグナル伝達ドメインをコードする。他の実施形態では、ＣＡＤコンストラクトは、１つ以上の第１の共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ）及び１つ以上の第２の共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ）、ならびに１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）をコードする。実施形態では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン（複数可）（例えば、４－１ＢＢ）の下流（Ｃ末端）にある。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン（複数可）（例えば、４－１ＢＢ）の上流（Ｎ末端）にある。

Ｃ．サイトカイン共発現
追加の実施形態では、本発明のＣＡＤコンストラクトは、ＣＡＤポリペプチド及び１つ以上の可溶性共通ガンマ鎖サイトカインを別々のポリペプチドとして翻訳することを容易にするように構成された１つ以上のマルチシストロニックリンカー領域（複数可）もコードし得る。実施形態では、サイトカインをコードする核酸及び関連リンカー領域は、単離核酸の３’末端、または単離核酸の５’末端、または、いくつかの例では、単離核酸の５’末端と３’末端の両方に配置することができる。１つ以上の可溶性共通ガンマ鎖サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３を含むが、これらに限定されない。実施形態では、リンカー領域（複数可）は、自己切断及び／または切断ポリペプチド配列をコードし得る。いくつかの例では、自己切断配列は、キメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドの翻訳中にリボソームスキッピングを誘導し得る２Ａ自己切断配列（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ）である。実施形態では、切断配列は、フーリン配列である。いくつかの例では、切断配列（例えば、フーリン切断配列）は、自己切断配列のアミノ末端にある。いくつかの実施形態では、マルチシストロニックリンカー領域は、内部リボソーム進入部位をコードする。いくつかの実施形態では、マルチシストロニックリンカー領域は、配列番号９～１５のいずれか１つ、または配列番号４４の配列を含む。実施形態では、任意のリンカー「ＧＳＧ」または「ＳＧＳＧ」などを付加すると、切断効率を向上させ得る。このようにして、含まれる１つ以上のガンマ鎖サイトカインが、キメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドから放出され、宿主細胞により分泌され得る。

例えば、いくつかの実施形態では、切断配列は、ＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号９）のＰ２Ａ切断配列である。いくつかの実施形態では、Ｐ２Ａ切断配列は、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号４４）のＰ２Ａ切断配列である。いくつかの実施形態では、切断配列は、ＲＡＫＲのフーリン切断配列（配列番号１０）である。いくつかの実施形態では、切断配列は、ＲＡＫＲＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１１）のＰ２Ａ＋フーリン切断（ＦＰ２Ａ）配列である。

いくつかの実施形態では、切断配列は、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１２）のＰ２Ａ切断配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、切断配列は、ＶＫＱＴＬＮＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１３）のＦ２Ａ切断配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、切断配列は、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１４）のＥ２Ａ切断配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、切断配列は、ＥＧＲＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１５）のＴ２Ａ切断配列であるか、またはそれを含む。特定の態様では、複数の自己切断配列は、シグナル伝達及び／または共刺激ドメインのカルボキシ末端、及びコードされた分泌サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５などの共通ガンマ鎖サイトカイン）のアミノ末端にコードすることができ、好ましくは、複数の自己切断配列は、独立して、Ｐ２Ａ切断配列、Ｔ２Ａ切断配列、Ｅ２Ａ切断配列、及びＦ２Ａ切断配列からなる群より選択される。特定の態様では、１つ以上の自己切断配列及び内因性プロテアーゼにより切断される１つ以上の配列が、本明細書に記載されるコンストラクトにコードされる。特定の実施形態では、内因性プロテアーゼ認識部位は、自己切断配列のアミノ末端にコードされる。

いくつかの実施形態では、マルチシストロニックリンカー領域は、内部リボソーム進入部位をコードする。例示的な内部リボソーム進入部位は、以下にコードされる：ＣＴＡＡＣＧＴＴＡＣＴＧＧＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＴＴＧＧＡＡＴＡＡＧＧＣＣＧＧＴＧＴＧＣＧＴＴＴＧＴＣＴＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧＣＣＧＴＣＴＴＴＴＧＧＣＡＡＴＧＴＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＴＣＣＴＡＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＧＧＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＣＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＡＧＴＴＧＧＡＴＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＡＡＧＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＧＴＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＴＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡ（配列番号１６）。

別の例示的な内部リボソーム進入部位は、以下にコードされる：ＡＧＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＧＴＧＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＣＴＣＣＧＣＣＴＧＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧＴＡＡＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＴＧＣＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣＧＣＴＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＧＡＧＴＧＴＴＡＧＴＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＴＧＣＴＴＣＧＴＡＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＡＣＧＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＧＴＡＡＣＡＡＧＧＡＣＣＣＡＣＧＧＧＧＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＡＣＧＧＧＣＣＣＧＴＣＡＴＧＴＧＴＧＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＴＴＡＣＴＧＣＧＡＡＡＣＣＣＡＣＴＴＴＡＡＡＧＴＧＡＣＡＴＴＧＡＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＣＡＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＧＣＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＡＡＣＡＣＧＣＧＡＣＡＣＴＣＧＧＧＡＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＴＡＴＡＡＡＡＧＣＧＣＴＣＧＧＴＴＴＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＧＣＣＴＧＡＡＴＡＧＧＴＧＡＣＣＧＧＡＧＧＴＣＧＧＣＡＣＣＴＴＴＣＣＴＴＴＧＣＡＡＴＴＡＣＴＧＡＣＣＡＣ（配列番号１７）。

さらに好適な内部リボソーム進入部位としては、例えば、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０１０Ｊａｎ；３８（Ｄａｔａｂａｓｅｉｓｓｕｅ）：Ｄ１３１－６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｐ９８１．Ｅｐｕｂ２００９Ｎｏｖ１６に開示のもの；ｉｒｅｓｉｔｅ．ｏｒｇに記載のもの；ＷＯ２０１８／２１５７８７に記載のもの；ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＫＰ０１９３８２．１に記載の配列；及びＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＬＴ７２７３３９．１に記載のＩＲＥＳエレメント。切断自己切断及びＩＲＥＳエレメントを含む追加のマルチシストロンリンカー領域は、ＵＳ２０１８／０３６０９９２及びＵＳ８，８６５，４６７に開示される。

いくつかの実施形態では、コンストラクトは、Ｃ末端ポリペプチドの分泌を促進するために作動可能に連結された分泌シグナル（例えば、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号６））例えば、サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡＧＩＨＶＦＩＬＧＣＦＳＡＧＬＰＫＴＥＡ（配列番号７）の分泌シグナルである。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、共通ガンマ鎖サイトカイン、例えば、ＩＬ－１５またはその活性フラグメント、例えば、ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＥＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ（配列番号８）の分泌を促進するために作動可能に連結された分泌シグナルをコードし；ｓＩＬ１５をコードするコドン最適化核酸配列を含む他のＩＬ－１５配列は、ＷＯ２００７／０３７７８０に開示される。一般的なガンマ鎖サイトカインの例としては、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３が挙げられる。いくつかの実施形態では、共通ガンマ鎖サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５から選択される。いくつかの実施形態では、共通のガンマ鎖サイトカインは、ＩＬ－１５である。ｓＩＬ１５をコードするコドン最適化核酸配列を含むＩＬ－１５配列は、本明細書及びＷＯ２００７／０３７７８０に開示される。

従って、本開示のＣＡＤコンストラクトは、少なくとも１つの共刺激ドメインと、任意に、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＤポリペプチドをコードする。実施形態では、ＣＡＤコンストラクトは、（例えば、翻訳中に）ＣＡＤポリペプチドから放出される１つ以上の共通ガンマ鎖サイトカインをコードし得る。いくつかの実施形態において上で検討されるように、本開示のＣＡＤコンストラクトは、さらに、変異ＤＡＰ１０、例えば、特に、配列番号１の、Ｋ８４及び／またはＹ８６などで変異したＤＡＰ１０を含んでもよい。

実施形態では、１つ以上の共刺激ドメインは、１つ以上のシグナル伝達ドメインの５’に位置し得る。実施形態では、１つ以上の共刺激ドメインは、１つ以上のシグナル伝達ドメインの３’に位置し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激ドメインは、１つ以上のシグナル伝達ドメインの５’に位置し得、さらに、１つ以上の共刺激ドメインは、１つ以上のシグナル伝達ドメインの３’に位置し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のシグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激ドメインの５’に位置し、さらに、１つ以上のシグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激ドメインの３’に位置し得る。いくつかの実施形態では、Ｃ末端融合体は、１つ以上の共刺激ドメイン及び１つ以上のシグナル伝達ドメインを交互することを含んでもよい。

参考までに、図１Ａ～１Ｄは、様々なキメラアダプターポリペプチド及びそれらの受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄとして図示）との関連性の例示的な図を示す。これらの表現は、例示目的のみであり、本明細書に開示されたキメラアダプターポリペプチドの様々な順列の全てを代表するものではない。図１Ａは、Ｋ８４Ｒ及びＹ８６Ｆの両方の改変を含むキメラアダプターポリペプチドを例示的に示す。図１Ｂは、ＣＤ３ζを含むＣ末端融合体に加えて、Ｋ８４Ｒ及びＹ８６Ｆの両方の改変を含むキメラアダプターポリペプチドを例示的に示す。図１Ｃ、４－１ＢＢを含むＣ末端融合体に加えて、Ｋ８４Ｒ及びＹ８６Ｆの両方の改変を含むキメラアダプターポリペプチドを例示的に示す。図１Ｄは、４－１ＢＢとＣＤ３ζの両方を含むＣ末端融合体に加えて、Ｋ８４ＲとＹ８６Ｆの両方の改変を含むキメラアダプターポリペプチドを示す。

Ｄ．マーカー共発現
追加の実施形態では、本発明のＣＡＤコンストラクトは、例えば、ＣＡＤ発現レベルを監視する能力を促進するために、１つ以上のラベルまたはマーカーをエンコードし得、内部対照として機能する。いくつかの実施形態では、ＣＡＤコンストラクトは、蛍光タンパク質をコードし得、この例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、強化シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）などが挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、β－ラクタマーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。

他の実施形態では、ＣＡＤコンストラクトは、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、該タンパク質を発現する細胞の検出及び／または単離を促進するために；または、コードされたタンパク質に特異的な抗体を使用する正の選択（例えば、カラムもしくは装置上で細胞産物を精製もしくは濃縮する抗体の使用）により濃縮するために；または、活性を増強または除去するように、例えば、安全性の考慮事項として患者においてタンパク質を発現する細胞の除去を促進するように、抗体をタンパク質にｉｎｖｉｖｏ結合させるために、細胞表面で発現するタンパク質をコードし得る。これらの目的に有用な例示的なタンパク質としては、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０（リツキシマブ認識ドメイン）、ＬＮＧＦＲ（配列番号１００に記載のアミノ酸配列、配列番号１０１でコードされる）、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）の切断型（配列番号７４で示されるアミノ酸配列、配列番号７５でコードされる）などが挙げられる。一例として、実施形態では、マーカータンパク質は、臨床段階の抗体に標的とされ得、該抗体を用いる患者のそのような処置は、本明細書に開示されるＣＡＤポリペプチドをコードする単離核酸を含有する細胞の除去をもたらす（ＰｈｉｌｉｐＢ，ｅｔａｌ．，（２０１４）Ｂｌｏｏｄ，１２４（８）：１２７７－１２８７；ＷａｎｇＸ，ｅｔａｌ．，（２０１１）Ｂｌｏｏｄ，１１８（５）：１２５５－１２６３；ＳｍｉｔｈＪ，ｅｔａｌ．，（２０１５）ＭｅｅｔｉｎｇＡｂｓｔｒａｃｔ，ＡＳＣＯＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇＩ；３０６９；ＧｏｕｂｌｅＡ，ｅｔａｌ．，（２０１４）Ｂｌｏｏｄ，１２４（２１）：４６８９）。

実施形態では、例が本明細書に記載されているリンカー領域は、ＣＡＤポリペプチド及び所望のマーカーの翻訳を促進するために使用することができる。例えば、ＣＡＤ発現及び所望のマーカーを促進するフーリン及びＰ２Ａリンカー遺伝子は、本開示の単離核酸コンストラクトに含まれ得る。実施例１に関して以下に検討されると、フーリン及びＰ２Ａリンカー遺伝子は、マーカーとして機能する切断型ＣＤ１９と共に、所望のＣＡＤポリペプチドを発現するために使用することができる。また、本明細書では、他のマーカー（例えば、ＥＧＦＲｔ）を含むＣＡＤポリペプチドも例示されている。そのような例は、例示的で、非限定であることが意図される。

キメラアダプター発現
本明細書で使用される場合、単離核酸は、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞など）に形質転換または導入し、生成物（例えば、本明細書に記載のキメラアダプターポリペプチド）を生成するために転写及び翻訳することができるＤＮＡ分子を意図するものとする。本発明の単離核酸では、プロモーターは、本発明のキメラアダプターポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されており、すなわち、キメラアダプターポリペプチドをコードするＤＮＡからのメッセンジャーＲＮＡの転写を促進するために配置される。「作動可能に連結された」という用語は、そのように記載された構成要素が、意図された方法で機能することを可能になる関係にある並置を指す。

プロモーターは、ゲノム由来または合成で生成されたものであり得る。本開示に関連する宿主細胞で使用される様々なプロモーターは、当該技術分野で周知である（例えば、以下で開示されるＣＤ４プロモーター；Ｍａｒｏｄｏｎ，ｅｔａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ１０１（９）：３４１６－２３）。プロモーターは、構成的または誘導的であり得、誘導は、特定の細胞タイプまたは特定の成熟レベルに関連する。あるいは、多数の周知のウイルスプロモーターも、好適であり得る。目的のプロモーターは、β－アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、及びフレンド脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーターを含む。プロモーターは、エンハンサーと関連していても、関連していなくてもよく、エンハンサーは、特定のプロモーターと自然に関連していても、異なるプロモーターに関連していてもよい。実施形態では、キメラアダプターポリペプチドの発現は、誘導性プロモーター、例えば、腫瘍微小環境に存在する分子（例えば、ＴＧＦβ）により誘導可能なプロモーター、の制御下にある。

本開示のキメラアダプターポリペプチドの様々なセグメントをコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ供給源、ｃＤＮＡ供給源から取得することができるか、または、（例えば、ＰＣＲ経由で）合成することができるか、またはそれらの組み合わせである。

実施形態では、本発明のキメラアダプターポリペプチドの発現のために、ＤＡＰ１０のＮ末端の構成要素をコードする核酸配列の天然に存在するまたは内因性の転写開始領域は、宿主細胞内でキメラアダプターポリペプチドを生成するために使用することができる。あるいは、構成的または誘導的発現を可能にする外因性転写開始領域を使用することができ、発現は、任意に、宿主細胞、所望の発現レベル、宿主細胞の性質などに応じて制御することができる。

キメラアダプターポリペプチドのＣ末端の構成要素をコードする終結領域が含まれ得る。一般的に言えば、終結領域の供給源は、組み換えタンパク質の発現にとって重要ではないと考えられており、発現に悪影響を与えることなく、様々な終結領域を使用することができる。

本発明によるキメラアダプターポリペプチドをコードする単離核酸は、従来の方法で調製することができる。配列（天然または合成）は、様々な構成要素を適切に結合できるように、必要に応じて、分離及び操作される。従って、キメラアダプターポリペプチドの様々なセグメントをコードする様々な核酸配列は、適切なプライマーを使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用することにより単離することができる。必要に応じて、テンプレートとして使用される核酸配列の不要な部分の欠失をもたらす特定のプライマーを設計することができる。追加的または代替的に、クローン化された遺伝子の制限消化物は、本開示の単離核酸コンストラクトを生成するために使用することができる。どちらの場合でも、様々なベクターへの組み込みを促進するために、平滑末端の制限部位を提供するか、または相補的な重複を有するように、配列を選択することができる。例では、核酸配列の改変（例えば、１つ以上の点変異、挿入、または欠失を導入するように）が実施される。改変は、例えば、配列番号１の位置Ｙ８６及び／またはＫ８４にアミノ酸変化を含み得る。核酸配列に改変を導入するための方法は、当該技術分野で既知であり、購入可能な様々なキット（例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＳｉｔｅＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ，Ａｇｉｌｅｎｔ、カリフォルニア州サンタクララ）の使用を含み得る。

本開示のキメラアダプターポリペプチドをコードする単離核酸を調製するための様々な操作は、ｉｎｖｉｔｒｏで行うことができる。特定の実施形態では、キメラアダプターポリペプチドをコードする配列が、標準的な形質転換法またはトランスフェクション法を使用して適切な宿主細胞でクローニング及び発現するためのベクターに導入される。従って、各操作の後に、ＤＮＡ配列の結合から得られるコンストラクトがクローン化され、ベクターが、分離され、配列が、所望のキメラアダプターポリペプチドをコードすることを確認するために配列がスクリーニングされる。配列は、制限分析、配列決定などによりスクリーニングすることができる。

単離核酸は、ネイキッドＤＮＡとして、または好適なベクターで宿主細胞に導入することができると考えられる。多くの好適なベクターは、分子生物学の当業者らに知られており、この選択は、所望の機能に依存し、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び遺伝子工学で従来使用される他のベクターを含む。当業者らに周知の方法は、様々なプラスミド及びベクターを構築するために使用することができ、例えば、以下に記載される手法を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（１９８９）ａｎｄＡｕｓｕｂｅｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），（１９９４）。あるいは、本開示のポリヌクレオチド及びベクターは、標的細胞への送達のためにリポソームに再構成することができる。

ネイキッドＤＮＡを使用した電気穿孔法により宿主細胞を安定的にトランスフェクトする方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｔ細胞のトランスフェクションを開示する米国特許第６，４１０，３１９号を参照）。ネイキッドＤＮＡは、一般に、発現のために適切な方向でプラスミド発現ベクター内に含有される、本発明のキメラアダプターをコードするＤＮＡを指す。有利なことに、ネイキッドＤＮＡを使用すると、本発明のキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドを発現する宿主細胞を生成するために必要な時間が短縮される。

あるいは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）は、本発明のキメラアダプターポリペプチドをコードする単離核酸を宿主細胞に導入するために使用することができる。本発明の方法に従って使用するのに適したベクターは、Ｔ細胞内で複製されないものである。ウイルスをベースにした多数のベクターは、既知であり、細胞内に維持されるウイルスのコピー数は、細胞の生存能力を維持するのに十分低い。例示的なベクターとしては、ｐＦＢ－ｎｅｏベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標））と、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ、またはＢＰＶに基づくベクターが挙げられる。

従って、いくつかの実施形態では、単離核酸は、環状核酸であることが理解され得る。いくつかの実施形態では、単離核酸は、ベクター、例えば、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルスベクター）、またはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、単離核酸、または、例えば、ＤＡＰ１０配列（例えば、配列番号１の少なくとも一部、改変済または未改変）、ならびに１つ以上のシグナル伝達ドメイン及び／または共刺激ドメインを含有する、その連続した部分が、宿主γδＴ宿主細胞のゲノムに組み込まれる。例示的な実施形態では、単離核酸は、レトロウイルスベクターである。

宿主細胞
本開示のキメラアダプターポリペプチドは、対応するキメラ核酸コンストラクトを介して、多種多様な宿主細胞内で発現され得る。実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、ＤＡＰ１０に関連する受容体の内因性発現を示す宿主細胞型で発現される。例えば、ＣＡＤポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄを発現した宿主細胞内で発現され得る。実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、ＤＡＰ１０に関連する受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）のある程度の内因性発現を示す宿主細胞型で発現される。実施形態では、宿主細胞型は、同じ受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）を発現するように、例えば、受容体の発現レベルを自然に発生する内因性発現レベルよりも増加させるように、操作することもできる。実施形態では、ＣＡＤポリペプチドは、ＤＡＰ１０に関連する受容体の内因性発現を示さない細胞型で発現され、この場合、宿主細胞は、そのような受容体を発現するように設計される（例えば、別途ＮＫＧ２Ｄを発現しない細胞型におけるＮＫＧ２Ｄの発現）。

実施形態では、本開示のＣＡＤポリペプチドを宿主細胞で発現させると、ＣＡＤポリペプチドが内因性細胞ＤＡＰ１０（例えば、ＷＴＤＡＰ１０）と競合することになる。競合により、ＤＡＰ１０に関連する受容体を介した細胞内シグナル伝達は、キメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドを介してリダイレクトされ得る。望ましい結果（例えば、腫瘍細胞の殺傷）に効果的であるためには、シグナル伝達は、ＣＡＤポリペプチドを介して１００％リダイレクトする必要はないが、そのような割合は、本開示の範囲内である。ＣＡＤポリペプチドを介したシグナル伝達は、ＤＡＰ１０を介したシグナル伝達の２０％～１００％、例えば９０～１００％、８０～１００％、７０～１００％、６０～１００％、５０～１００％などの範囲を含んでもよい。説明目的の代表例として、ＤＡＰ１０に関連する受容体を介したシグナル伝達の８０％がＣＡＤポリペプチドを介して再ルーティングされる宿主細胞は、そのようなシグナル伝達の２０％のみが依然として内因性ＤＡＰ１０を介するが、シグナル伝達の８０％がＣＡＤポリペプチドを介して行われることを意味する。

本明細書に記載の宿主細胞は、養子細胞移入で使用される、例えば、凍結保存して保存することができる。実施形態では、宿主細胞は、キメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドを発現するように細胞を操作する前に保存される。実施形態では、細胞は、キメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドを発現するように操作され、次に、細胞が保存される。

本開示のキメラＤＡＰ１０アダプターポリペプチドと共に使用される好ましい宿主細胞は、免疫細胞を含む。そのような細胞は、処置されるべき対象とから得られ得る（すなわち、自己由来である）か、または、免疫細胞株もしくはドナー免疫細胞（同種、同系）を使用することができる。免疫細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。免疫細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離など、当業者に既知の任意数の手法を使用して、対象から採取した血液から得ることができる。例えば、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスにより得られ得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離または向流遠心分離により、赤血球を溶解させ、単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離される。免疫細胞の特定のサブ集団は、正または負の選択手法により、さらに分離することができる。例えば、免疫細胞は、例えば、所望の免疫細胞の正の選択に十分な時間、抗体結合ビーズと共にインキュベートすることにより、正の選択された細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを使用して、単離することができる。あるいは、免疫細胞集団の濃縮は、負に選択された細胞に固有の表面マーカーを標的とする抗体の組み合わせを使用した負の選択により達成することができる。分離及び／または濃縮の他の具体的な方法は、本明細書に開示される。

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、感染症及び外来物質から身体の防御に関与する任意の白血球を含む。例えば、免疫細胞は、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。例えば、本開示に関連する免疫細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、自然リンパ球細胞（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、制御性Ｔ細胞などを含み得るが、これらに限定されない。実施形態では、好ましい免疫細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＮＫＴ細胞、及び、いくつかの例では、マクロファージを含む。実施形態では、本開示に関連する免疫細胞は、同種細胞、自己細胞、または同系細胞を含む。

本開示の態様は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の細胞表面発現を示す血液または固形腫瘍細胞、ウイルス由来抗原を提示するウイルス感染細胞、細菌細胞などに対して、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで細胞傷害活性を有する免疫細胞を含む。実施形態では、細胞傷害活性は、自然活性である。実施形態では、ＣＡＤポリペプチドを機能的に発現する免疫細胞は、本開示のＣＡＤポリペプチドを含まない対照免疫細胞におけるｉｎｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎｖｉｖｏ細胞殺傷活性のレベルよりも高い細胞殺傷活性を示す。

実施形態では、細胞傷害性は、ＣＡＤポリペプチドの非存在下の細胞傷害性と比較して、ＣＡＤポリペプチドの存在により大幅に（約２５％超）増強または改善される。いくつかの場合では、細胞傷害性は、少なくとも部分的に、大幅に（約２５％超）、または完全に、ＣＡＤポリペプチドの存在によるものである。

実施形態では、本開示に関連する改変免疫細胞は、直接的及び／または間接的な機序を通じて、強力且つ／または持続的な細胞殺傷活性（例えば、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞）を示し得る。いくつかの場合では、細胞殺傷活性は、標的細胞との最初の接触から少なくとも約６日～１２０日間、または少なくとも約６日～１８０日間持続する。いくつかの場合では、ＣＡＤポリペプチドを発現するように操作された本明細書に開示される免疫細胞またはその子孫の細胞殺傷活性は、標的細胞との最初の接触から、または本明細書に開示される操作免疫細胞の投与から、少なくとも約６日間～１２０日間、または少なくとも約６日間～１８０日間持続する。この持続的な細胞殺傷活性は、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏ、またはｉｎｖｉｔｒｏとｉｎｖｉｖｏの両方で発揮され得る。

実施形態では、本開示の態様は、ＤＡＰ１０に関連し、具体的には、本開示のＣＡＤポリペプチドに関連する受容体に認識されるリガンドの細胞表面発現を示す細胞との接触に応じて増殖する免疫細胞を含む。そのような受容体の一例は、ＮＫＧ２Ｄであるが、本開示は、ＮＫＧ２Ｄと相互作用するＣＡＤポリペプチドに限定されず、ＤＡＰ１０にも関連する他の受容体（複数可）も含み得る。実施形態では、増殖は、少なくとも部分的に、大幅に（約２０％超、または約２５％超、または約５０％超、または約８０％超）、または完全に（例えば、１００％）、宿主細胞上で発現される受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）に関連するＣＡＤポリペプチドコンストラクトの存在に起因する。いくつかの場合では、免疫細胞は、ＣＡＤポリペプチドを含まない対照免疫細胞（例えば、同じタイプの免疫細胞）と比較して、ｉｎｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎｖｉｖｏでの増殖のより高いレベルを示す。増殖のより高いレベルは、本明細書に記載のＣＡＤポリペプチドを欠く対照免疫細胞と比較して、２０～５０％の増加、５０～８０％の増加、８０～１００％の増加、または２倍の増加、３倍の増加、４倍の増加、５倍の増加、５～１０倍の増加、１０～２０倍の増加、または２０倍を超える増加、例えば、５０～１００倍以上の増加を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＤポリペプチドを含むように操作された免疫細胞は、例えば、ＤＡＰ１０に関連する免疫細胞上の細胞表面受容体により認識されるリガンド（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）を発現する細胞と接触した後、１つ以上の炎症誘発性サイトカインを発現及び分泌するか、または持続的に発現及び分泌する。実施形態では、ＣＡＤポリペプチドを発現するように操作された免疫細胞に関連する発現及び分泌は、少なくとも部分的に、大幅に（約２０％超、もしくは約２５％超、もしくは約５０％超、もしくは約８０％超）、または完全にＣＡＤポリペプチドによるものである。実施形態では、発現及び／または分泌は、ＣＡＤポリペプチドの発現を欠く対照免疫細胞（例えば、同じタイプの免疫細胞）で別の方法で観察される発現及び／または分泌と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１００％以上、例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、５～１０倍、１０～２０倍、または２０倍以上、例えば、５０～１００倍以上高い。

実施形態では、本開示の改変免疫細胞は、例えば、抗腫瘍応答に有利となるように、細胞微小環境（例えば、ＴＭＥ）を変更するように機能し得る。例えば、固形腫瘍は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）などの抑制細胞を動員し得、これは、抑制性ＴＭＥを強化し得る。循環または腫瘍内のＭＤＳＣの頻度は、がんステージ、疾患進行、ならびに標準的な化学療法及び放射線療法に対する抵抗性と相関する。特定のリガンド（例えば、ＮＫＧ２Ｄリガンド）は、いくつかの固形腫瘍及び腫瘍浸潤ＭＤＳＣ上で高レベルで発現しているので、実施形態では、本開示の改変免疫細胞は、ＴＭＥの抑制分子（例えば、ＴＧＦ－β）を低減または除去することにより、抗腫瘍応答に有利となるようにＴＭＥを変更するために使用され得る。実施形態では、本開示の改変免疫細胞は、ＭＤＳＣに対して細胞傷害性であるが、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する正常組織に対して危害を加えない（すなわち、無毒性である）（例えば、以下を参照のこと：Ｐａｒｉｈａｒ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，（２０１９）ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ７（３）：３６３－３７５）。いくつかの実施形態では、本開示の操作宿主細胞による、例えば、ＭＤＳＣの殺傷に関連する細胞殺傷活性は、ＴＭＥの抑制効果を減少させる。例えば、抑制効果は、本明細書に記載のＣＡＤポリペプチドを発現するように設計された宿主細胞の非存在下でのＴＭＥの抑制効果と比較して、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上減少させ得る。

実施形態では、本開示の改変免疫細胞は、標的細胞の成長及び／または増殖を減少させるように機能し得る。例えば、本明細書に記載のＣＡＤポリペプチドを発現するように操作された免疫細胞は、操作免疫細胞の非存在下での標的細胞の成長及び／または増殖と比較して、標的細胞の成長及び／または増殖を、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、もしくは約１００％、またはそれらの間の任意のパーセンテージ減少させ得る。実施形態では、標的細胞は、改変免疫細胞の細胞表面上の受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）により認識される細胞表面リガンドを発現し、該受容体は、少なくとも部分的に、ＣＡＤポリペプチドと会合する。

従って、実施形態では、ＣＡＤポリペプチドを含む細胞に導入する方法が提供され、細胞がＣＡＤポリペプチドを発現するようにＣＡＤポリペプチドをコードする単離核酸を細胞に導入することを含む。実施形態では、細胞は、本明細書に記載の免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞、αβＴ細胞、またはγδＮＫＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞を作製する方法は、さらに、ＣＡＤポリペプチドと会合可能な受容体をコードする別の単離核酸を細胞に導入することを含む。

使用の方法
一態様では、本開示は、宿主細胞の受容体を介して伝達されるシグナルを調節する方法を提供し、宿主細胞は、受容体に関連する本明細書に記載のＣＡＤポリペプチドを発現するように操作された免疫細胞を含み、好ましくは、免疫細胞は、細胞傷害性である。実施形態では、受容体は、免疫細胞に内因性であり、その中で内因的に発現される。追加的または代替的な実施形態では、受容体は、受容体をコードする単離核酸を免疫細胞に導入することにより発現される。

実施形態では、受容体を介して伝達されるシグナルを調節する方法は、免疫細胞の刺激及び／または免疫細胞の活性化をもたらす。

実施形態では、受容体を介して伝達されるシグナルを調節する方法は、ＣＡＤポリペプチドを欠く対照免疫細胞の増殖レベルと比較して、免疫細胞の増殖レベルの増加をもたらす。

実施形態では、受容体を介して伝達されるシグナルを調節する方法は、ＣＡＤポリペプチドを欠く対照免疫細胞における１つ以上のサイトカインの発現及び分泌のレベルと比較して、１つ以上のサイトカインの発現及び分泌の増加をもたらす。

実施形態では、受容体を介して伝達されるシグナルを調節することは、内因性ＤＡＰ１０ではなく、少なくとも一部のシグナルをＣＡＤポリペプチドを介してルーティングすることを含む。実施形態では、ＣＡＤポリペプチドを介してルーティングされる信号の部分は、８０％以上、例えば、９０～９５％以上、例えば、９９％または１００％である。

処置の方法
本明細書に記載のように、ＣＡＤポリペプチドを発現する操作宿主細胞、及び／またはその混合物を含む医薬組成物は、予防的及び／または治療的処置のために投与され得る。混合物は、本明細書に記載されるように、同じまたは異なるＣＡＤポリペプチドを発現するように操作された異なるタイプの宿主細胞を含んでもよい。例えば、限定されないが、混合物は、第１のＣＡＤポリペプチドを発現するＮＫ細胞の集団と、第２のＣＡＤポリペプチドを発現するように操作されたγδ細胞の集団を含んでもよい。別の例として、限定されないが、混合物は、それぞれが同じＣＡＤポリペプチドを発現するように設計されたＮＫ細胞の集団及びγδ細胞の集団を含んでもよい。さらに別の例として、混合物は、操作宿主細胞の集団を含んでもよく、さらに、非操作細胞集団を含んでもよい。例えば、限定されないが、混合物は、本明細書に記載のＣＡＤポリペプチドを発現するように操作されたＮＫ細胞の集団と、別の非操作細胞集団、例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδ細胞、αβ細胞などを含んでもよい。治療用途では、組成物は、疾患または状態に関連する少なくとも１つの徴候または症状を軽減するのに十分な量で、すでに疾患または状態に罹患している対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、量は、疾患または状態を治癒するのに十分である。

遺伝子操作宿主細胞集団及び／またはその混合物は、状態の発症、罹患、または悪化の可能性を軽減するために投与することもできる。治療用途のための、操作宿主細胞、非操作宿主細胞、及び／またはそれらの混合物の集団の有効量は、疾患または状態の重症度及び経過、以前の治療、対象の健康状態、体重、及び／または様々な薬剤に対する応答、及び／または処置医の判断に基づいて変動し得る。

実施形態では、本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞及び／またはそれらの混合物は、状態の処置を必要とする対象を処置するために使用することができる。そのような疾患の例としては、がん、感染症、及び自己免疫疾患が挙げられますが、これらに限定されない。対象は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、及び他の類人猿及びサル種）；家畜（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イノシシ）；飼育動物（例えば、ウサギ、イヌ、及び猫）；実験動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラット、マウス、及びモルモットなど）であり得る。対象は、任意の年齢のものであり得る。対象は、例えば、高齢者、成人、青年、思春期前、子供、幼児、乳児であり得る。

対象の状態（例えば、病気）を処置する方法は、治療的有効量の１つ以上の操作宿主細胞集団（例えば、ＣＡＤポリペプチドを発現するような）、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物を対象に投与することを含んでもよい。１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物は、様々なレジメン（例えば、タイミング、濃度、投薬量、処置間の間隔、及び／または製剤）で投与することができる。対象は、治療的有効量の１つまたは複数の黄砂宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物を投与される前に、例えば、化学療法、放射線療法、または両方の組み合わせを用いる前提条件でもあり得る。処置の一部として、１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物は、第１のレジメンで対象に投与され得、対象は、第１のレジメンでの処置が所定の治療有効性レベルを満たすかどうかを判定するために監視され得る。いくつかの場合では、１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物は、対象への第１レジメンの提供から収集された情報に基づいて、第２のレジメンで対象に投与され得る。

実施形態では、ＣＡＤポリペプチドを発現するように操作された少なくとも１つの宿主細胞を含む医薬組成物は、第１のレジメンで投与され得る。対象は、例えば、医療提供者（例えば、処置医または看護師）により監視され得る。いくつかの例では、対象は、対象の状態の処置における操作宿主細胞の有効性を決定または測定するために監視される。一部の状況では、対象は、対象内での操作宿主細胞集団のｉｎｖｉｖｏ増殖を判定するためにも監視され得る。ＣＡＤポリペプチドを発現するように操作された少なくとも１つの宿主細胞を含む別の医薬組成物は、第２のレジメンで対象に投与され得る。第２のレジメンで投与される医薬組成物は、第１のレジメンで対象に投与されるものと同じＣＡＤポリペプチドを発現する同じタイプの宿主細胞を含んでもよい。しかし、第２のレジメンで投与される医薬組成物は、任意に、異なるＣＡＤポリペプチド（例えば、異なる変異及び／または共刺激ドメインまたはシグナル伝達ドメインを有するＣＡＤポリペプチド）を発現する、異なるタイプの宿主細胞を含んでもよいことは、本開示の範囲内である。いくつかの例では、例えば、第１のレジメンが有効であると判明した場合、第２のレジメンは、実施される（例えば、１回の投与は、状態を処置するのに十分であり得る）。いくつかの実施形態では、操作宿主細胞の集団は、様々な対象に投与することができる（例えば、宿主細胞が普遍的なドナー特性を有する）。

治療的有効量の１つまたは複数の操作宿主細胞集団（例えば、ＣＡＤポリペプチドを発現）、非操作細胞及び／またはそれらの混合物は、様々な状態を処置するために使用され得る。いくつかの場合では、治療的有効量の１つまたは複数の操作宿主細胞集団（例えば、ＣＡＤポリペプチドを発現）、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物が、固形腫瘍及び血液悪性腫瘍を含むがんの処置で使用され得る。いくつかの場合では、１つまたは複数の操作宿主細胞集団（例えば、ＣＡＤポリペプチドを発現）、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の治療的有効量は、例えば、病原細菌またはウイルスにより引き起こされる感染症を処置するために使用され得る。

本発明の１つまたは複数の操作宿主細胞集団（ＣＡＤポリペプチドを発現）、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物による処置は、状態の臨床的発症前、発症中、及び発症後に対象に提供され得る。処置は、疾患の臨床発症後１日、１週間、６ヶ月、１２ヶ月、または２年以上の後に、対象に提供され得る。処置は、疾患の臨床発症後の、１日、１週間、１ヶ月間、６ヶ月、１２ヶ月間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、１０年間を超えて、対象に提供され得る。処置は、疾患の臨床発症後の、１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、または２年未満で、対象に提供され得る。処置は、臨床試験でヒトを処置することも含んでもよい。処置は、本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団（例えば、ＣＡＤポリペプチドを発現）、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物を含む医薬組成物を対象に投与することを含み得る。

いくつかの場合では、本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団（例えば、ＣＡＤポリペプチドを発現）、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の投与は、対象の体内の内因性リンパ球の活性を調節する。いくつかの場合では、本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団（例えば、ＣＡＤポリペプチドを発現）、非操作細胞及び／またはそれらの混合物の投与は、別の免疫細胞の細胞傷害性の活性化をもたらす。いくつかの場合では、他の免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの場合では、他の免疫細胞は、ナチュラルキラーＴ細胞である。他の免疫細胞の他の例も本開示に含まれる。いくつかの場合では、本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団（例えば、ＣＡＤポリペプチドを発現）、非操作細胞及び／またはそれらの混合物の投与は、制御性Ｔ細胞を抑制する。いくつかの場合では、制御性Ｔ細胞は、Ｆｏｘ３＋Ｔｒｅｇ細胞である。いくつかの場合では、制御性Ｔ細胞は、Ｆｏｘ３－Ｔｒｅｇ細胞である。本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団（例えば、ＣＡＤポリペプチドを発現）、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の投与により活性が調節することができる細胞の非限定例としては、造血幹細胞；Ｂ細胞；ＣＤ４＋細胞；ＣＤ８＋細胞；赤血球；白血球；樹状細胞（例えば、樹状抗原提示細胞）；白血球；マクロファージ；記憶Ｂ細胞；記憶Ｔ細胞；単球；ナチュラルキラー細胞；好中球顆粒球；Ｔヘルパー細胞；及びＴキラー細胞が挙げられる。

例えば、限定されないが、血液もしくは固形腫瘍細胞、またはウイルス感染細胞、または細菌細胞、に対して細胞傷害活性を有する、１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物は、任意の順序でまたは同時に対象に投与することができる。同時に、本開示の操作宿主細胞（複数可）及び／またはその混合物は、静脈内注射などの単一の統一形態で、または複数の形態で、例えば、複数の静脈内注入、皮下注射、または錠剤として、提供することができる。本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物は、単一のパッケージまたは複数のパッケージで、一緒または別々にパッケージ化することができる。本発明の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物のうちの１つまたは全ては、複数回に分けて投与することができる。同時でない場合、複数回投与の間隔は、約１週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、または約１年まで変動し得る。いくつかの場合では、本開示の操作宿主細胞は、対象に投与された後、対象の体内で、ｉｎｖｉｖｏで増殖し得る。本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物は、同じ細胞調製物による複数の処置のための細胞を提供ために凍結することができる。１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物、ならびにそれらを含む医薬組成物は、キットとしてパッケージ化することができる。キットは、１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作改変細胞、及び／またはそれらの混合物、ならびに、それらを含む組成物の使用に関する使用説明書（例えば、書面による使用説明書）を含んでもよい。

いくつかの場合では、方法を必要とする対象を処置する方法は、本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の治療的有効量を対象に投与することを含み、投与が、特定の状態（例えば、がん、ウイルス、または細菌感染、自己炎症性疾患）を処置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の治療的有効量は、少なくとも約１０秒、３０秒、１分、１０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、または１年間投与される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の治療的有効量が、少なくとも１週間投与される。いくつかの実施形態では、本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の治療的有効量が、少なくとも２週間投与される。

本明細書に記載の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物は、疾患または状態の発生前、発生中、または発生後に投与することができ、操作宿主細胞集団を含有する医薬組成物を投与するタイミングは、変動し得る。例えば、１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物は、予防薬として使用することができ、疾患または状態の発症の可能性を低下させるために、状態または疾患の傾向のある対象に継続的に投与することができる。最初の投与は、本明細書に記載の任意の製剤を使用して、本明細書に記載の任意の経路などの実用的な任意の経路を介するものであり得る。いくつかの例では、本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の投与は、静脈内投与である。１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の１回または複数回の投与は、特定の状態（例えば、血液がんまたは固形癌、ウイルス感染、細菌感染、自己免疫疾患など）の発症後に可能な限り早く、疾患／状態の処置に必要な期間、例えば、約２４時間～約４８時間、約４８時間～約１週間、約１週間～約２週間、約２週間～約１ヶ月間、約１ヶ月間～約３ヶ月間に投与することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の１回または複数回の投与は、疾患／状態（例えば、がん）の発症から数年後、及び他の処置前または処置後に投与することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物は、共通のガンマ鎖サイトカイン（複数可）を上昇させるための１つ以上の方法と同時にまたは逐次的に投与される。本明細書で使用される場合、「共通ガンマ鎖サイトカイン（複数可）を高める１つ以上の方法」は、対象において、少なくとも１つの共通ガンマ鎖サイトカインレベルを上昇させるように、対象の生理学的状態を変更する方法、または方法の組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、方法は、対象における、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５からなる群より選択される１つ以上の共通ガンマ鎖サイトカイン（複数可）のレベルを上昇させる。いくつかの実施形態では、方法は、リンパ枯渇を含む。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の共通ガンマ鎖サイトカイン（複数可）を対象に投与することを含む。いくつかの場合では、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、及び／またはＩＬ－１５が投与される。いくつかの実施形態では、方法は、投与された操作宿主細胞から共通のガンマ鎖サイトカイン（複数可）を分泌することを含む。いくつかの場合では、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、及び／またはＩＬ－１５が分泌される。

いくつかの実施形態では、共通ガンマ鎖サイトカイン（複数可）を上昇させるための１つ以上の方法の投与は、本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物を導入する前のリンパ球枯渇を含む。いくつかの実施形態では、共通ガンマ鎖サイトカイン（複数可）を上昇させるための１つ以上の方法の投与は、１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の導入と同時に、または逐次的に、導入された１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の増殖、細胞傷害活性、持続性、またはそれらの組み合わせを増加させるのに有効な量の共通ガンマ鎖サイトカイン（複数可）を投与することを含む。投与される共通ガンマ鎖サイトカイン（複数可）の量は、１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の増殖、細胞傷害活性、持続性、またはそれらの組み合わせを増加させるのに有効な量であり得る。ＩＬ－１５の例示的な量としては、２４時間毎にＩＬ－１５に対して０．０１～１０μｇ／ｋｇ／用量が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＬ－２の例示的な量としては、８～４８時間毎に約３×１０^６～約２２×１０^６単位が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＲＣＣにおけるＩＬ２の投与レジメンは、６００，０００国際単位／ｋｇ（０．０３７ｍｇ／ｋｇ）を最大１４回１５分かけて４８時間静脈注入した。

いくつかの実施形態では、共通ガンマ鎖サイトカイン（複数可）を上昇させる１つ以上の方法の投与は、１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物を投与する前のリンパ球枯渇、ならびに、１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の導入と同時に、または順次、導入された１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の増殖、細胞傷害活性、持続性、またはそれらの組み合わせを増加させるのに有効な量の共通ガンマ鎖サイトカイン（複数可）を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、共通ガンマ鎖サイトカイン（複数可）の上昇は、少なくとも部分的に、操作宿主細胞（複数可）を介して達成され、共通ガンマ鎖サイトカイン（複数可）は、本明細書に開示されるようなＣＡＤコンストラクトから発現される。そのような例では、１つ以上の追加のガンマ鎖サイトカイン（複数可）が、該追加のガンマ鎖サイトカインを上昇させる方法で、追加的に投与されることは、本開示の範囲内である。

投薬量
本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物は、正確な投薬量の単回投与に適した単位投薬形態で製剤化され得る。いくつかの場合では、単位投薬形態は、追加のリンパ球を含む。単位投与形態では、製剤は、１つ以上の化合物の適切な量を含有する単位用量に分割される。単位投薬量は、製剤の別個の量を含有するパッケージの形態をとることができる。非限定例は、パッケージ化された錠剤またはカプセル、及びバイアルまたはアンプル中の粉末である。水性懸濁液組成物は、再密閉不可能な単回投与容器に包装することができる。複数回投与の再封可能な容器は、例えば、防腐剤と組み合わせて、または防腐剤なしで使用することができる。いくつかの例では、医薬組成物は、防腐剤を含まない。非経口注射用の製剤は、例えば、アンプル中の、単位剤形、または防腐剤を含む複数投与容器で提供することができる。

本開示の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物は、以下の量で、組成物中に存在し得る：少なくとも５細胞、少なくとも１０細胞、少なくとも２０細胞、少なくとも３０細胞、少なくとも４０細胞、少なくとも５０細胞、少なくとも６０細胞、少なくとも７０細胞、少なくとも８０細胞、少なくとも９０細胞、少なくとも１００細胞、少なくとも２００細胞、少なくとも３００細胞、少なくとも４００細胞、少なくとも５００細胞、少なくとも６００細胞、少なくとも７００細胞、少なくとも８００細胞、少なくとも９００細胞、少なくとも１×１０^３細胞、少なくとも２×１０^３細胞、少なくとも３×１０^３細胞、少なくとも４×１０^３細胞、少なくとも５×１０^３細胞、少なくとも６×１０^３細胞、少なくとも７×１０^３細胞、少なくとも８×１０^３細胞、少なくとも９×１０^３細胞、少なくとも１×１０^４細胞、少なくとも２×１０^４細胞、少なくとも３×１０^４細胞、少なくとも４×１０^４細胞、少なくとも５×１０^４細胞、少なくとも６×１０^４細胞、少なくとも７×１０^４細胞、少なくとも８×１０^４細胞、少なくとも９×１０^４細胞、少なくとも１×１０^５細胞、少なくとも２×１０^５細胞、少なくとも３×１０^５細胞、少なくとも４×１０^５細胞、少なくとも５×１０^５細胞、少なくとも６×１０^５細胞、少なくとも７×１０^５細胞、少なくとも８×１０^５細胞、少なくとも９×１０^５細胞、少なくとも１×１０^６細胞、少なくとも２×１０^６細胞、少なくとも３×１０^６細胞、少なくとも４×１０^６細胞、少なくとも５×１０^６細胞、少なくとも６×１０^６細胞、少なくとも７×１０^６細胞、少なくとも８×１０^６細胞、少なくとも９×１０^６細胞、少なくとも１×１０^７細胞、少なくとも２×１０^７細胞、少なくとも３×１０^７細胞、少なくとも４×１０^７細胞、少なくとも５×１０^７細胞、少なくとも６×１０^７細胞、少なくとも７×１０^７細胞、少なくとも８×１０^７細胞、少なくとも９×１０^７細胞、少なくとも１×１０^８細胞、少なくとも２×１０^８細胞、少なくとも３×１０^８細胞、少なくとも４×１０^８細胞、少なくとも５×１０^８細胞、少なくとも６×１０^８細胞、少なくとも７×１０^８細胞、少なくとも８×１０^８細胞、少なくとも９×１０^８細胞、少なくとも１×１０^９細胞、またはそれ以上。

本発明の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の治療的有効量は、以下であり得る：約１細胞～約１０細胞、約１細胞～約１００細胞、約１細胞～約１０細胞、約１細胞～約２０細胞、約１細胞～約３０細胞、約１細胞～約４０細胞、約１細胞～約５０細胞、約１細胞～約６０細胞、約１細胞～約７０細胞、約１細胞～約８０細胞、約１細胞～約９０細胞、約１細胞～約１００細胞、約１細胞～約１×１０^３細胞、約１細胞～約２×１０^３細胞、約１細胞～約３×１０^３細胞、約１細胞～約４×１０^３細胞、約１細胞～約５×１０^３細胞、約１細胞～約６×１０^３細胞、約１細胞～約７×１０^３細胞、約１細胞～約８×１０^３細胞、約１細胞～約９×１０^３細胞、約１細胞～約１×１０^４細胞、約１細胞～約２×１０^４細胞、約１細胞～約３×１０^４細胞、約１細胞～約４×１０^４細胞、約１細胞～約５×１０^４細胞、約１細胞～約６×１０^４細胞、約１細胞～約７×１０^４細胞、約１細胞～約８×１０^４細胞、約１細胞～約９×１０^４細胞、約１細胞～約１×１０^５細胞、約１細胞～約２×１０^５細胞、約１細胞～約３×１０^５細胞、約１細胞～約４×１０^５細胞、約１細胞～約５×１０^５細胞、約１細胞～約６×１０^５細胞、約１細胞～約７×１０^５細胞、約１細胞～約８×１０^５細胞、約１細胞～約９×１０^５細胞、約１細胞～約１×１０^６細胞、約１細胞～約２×１０^６細胞、約１細胞～約３×１０^６細胞、約１細胞～約４×１０^６細胞、約１細胞～約５×１０^６細胞、約１細胞～約６×１０^６細胞、約１細胞～約７×１０^６細胞、約１細胞～約８×１０^６細胞、約１細胞～約９×１０^６細胞、約１細胞～約１×１０^７細胞、約１細胞～約２×１０^７細胞、約１細胞～約３×１０^７細胞、約１細胞～約４×１０^７細胞、約１細胞～約５×１０^７細胞、約１細胞～約６×１０^７細胞、約１細胞～約７×１０^７細胞、約１細胞～約８×１０^７細胞、約１細胞～約９×１０^７細胞、約１細胞～約１×１０^８細胞、約１細胞～約２×１０^８細胞、約１細胞～約３×１０^８細胞、約１細胞～約４×１０^８細胞、約１細胞～約５×１０^８細胞、約１細胞～約６×１０^８細胞、約１細胞～約７×１０^８細胞、約１細胞～約８×１０^８細胞、約１細胞～約９×１０^８細胞、または約１細胞～約１×１０^９細胞。

いくつかの場合では、本発明の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の治療的有効用量は、以下であり得る：約１×１０^３細胞～約２×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約３×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約４×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約５×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約６×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約７×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約８×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約９×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約１×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約２×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約３×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約４×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約５×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約６×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約７×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約８×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約９×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約１×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約２×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約３×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約４×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約５×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約６×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約７×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約８×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約９×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約１×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約２×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約３×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約４×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約５×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約６×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約７×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約８×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約９×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約１×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約２×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約３×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約４×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約５×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約６×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約７×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約８×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約９×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約１×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約２×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約３×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約４×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約５×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約６×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約７×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約８×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約９×１０^８細胞、または約１×１０^３細胞～約１×１０^９細胞。

いくつかの場合では、本発明の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物の治療的有効用量は、以下であり得る：約１×１０^６細胞～約２×１０^６細胞、約１×１０^６細胞～約３×１０^６細胞、約１×１０^６細胞～約４×１０^６細胞、約１×１０^６細胞～約５×１０^６細胞、約１×１０^６細胞～約６×１０^６細胞、約１×１０^６細胞～約７×１０^６細胞、約１×１０^６細胞～約８×１０^６細胞、約１×１０^６細胞～約９×１０^６細胞、約１×１０^６細胞～約１×１０^７細胞、約１×１０^６細胞～約２×１０^７細胞、約１×１０^６細胞～約３×１０^７細胞、約１×１０^６細胞～約４×１０^７細胞、約１×１０^６細胞～約５×１０^７細胞、約１×１０^６細胞～約６×１０^７細胞、約１×１０^６細胞～約７×１０^７細胞、約１×１０^６細胞～約８×１０^７細胞、約１×１０^６細胞～約９×１０^７細胞、約１×１０^６細胞～約１×１０^８細胞、約１×１０^６細胞～約２×１０^８細胞、約１×１０^６細胞～約３×１０^８細胞、約１×１０^６細胞～約４×１０^８細胞、約１×１０^６細胞～約５×１０^８細胞、約１×１０^６細胞～約６×１０^８細胞、約１×１０^６細胞～約７×１０^８細胞、約１×１０^６細胞～約８×１０^８細胞、約１×１０^６細胞～約９×１０^８細胞、約１×１０^６細胞～約１×１０^９細胞、約１×１０^６細胞～約２×１０^９細胞、約１×１０^６細胞～約３×１０^９細胞、約１×１０^６細胞～約４×１０^９細胞、約１×１０^６細胞～約５×１０^９細胞、約１×１０^６細胞～約６×１０^９細胞、約１×１０^６細胞～約７×１０^９細胞、約１×１０^６細胞～約８×１０^９細胞、約１×１０^６細胞～約９×１０^９細胞、約１×１０^７細胞～約１×１０^９細胞、約１×１０^７細胞～約２×１０^９細胞、約１×１０^７細胞～約３×１０^９細胞、約１×１０^７細胞～約４×１０^９細胞、約１×１０^７細胞～約５×１０^９細胞、約１×１０^７細胞～約６×１０^９細胞、約１×１０^７細胞～約７×１０^９細胞、約１×１０^７細胞～約８×１０^９細胞、約１×１０^７細胞～約９×１０^９細胞、約１×１０^８細胞～約１×１０^９細胞、約１×１０^８細胞～約２×１０^９細胞、約１×１０^８細胞～約３×１０^９細胞、約１×１０^８細胞～約４×１０^９細胞、約１×１０^８細胞～約５×１０^９細胞、約１×１０^８細胞～約６×１０^９細胞、約１×１０^８細胞～約７×１０^９細胞、約１×１０^８細胞～約８×１０^９細胞、約１×１０^８細胞～約９×１０^９細胞、または約１×１０^８細胞～約１×１０^１０細胞。

保存
いくつかの実施形態では、本発明の１つまたは複数の操作宿主細胞集団、非操作細胞、及び／またはそれらの混合物は、凍結培地中で製剤化され、少なくとも約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、または少なくとも５年の長期保存のために、液体窒素冷凍庫（－１９５℃）または超低温冷凍庫（－６５℃、－８０℃、または－１２０℃）などの極低温保存ユニットに静置され得る。凍結媒体は、ｐＨを約６．０～約６．５、約６．５～約７．０、約７．０～約７．５、約７．５～約８．０、または約６．５～約７．５に維持するために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び／または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及び／またはデキストロース、及び／またはデキストラン硫酸及び／またはヒドロエチルデンプン（ＨＥＳ）を、生理学的ｐＨ緩衝剤と共に含有し得る。実施形態では、凍結保存細胞は、解凍し、例えば、本明細書で言及される抗体、タンパク質、ペプチド、及び／またはサイトカインによる刺激により、さらに処理することができる。凍結保存細胞は、解凍し、本明細書に記載のようにウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター）または非ウイルス手段（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質）で遺伝子改変することができる。あるいは、本明細書に記載の宿主細胞は、例えば、任意に、本明細書に記載の方法により拡大させ、遺伝子改変し、次に、凍結保存することができる。

従って、本明細書に開示される遺伝子操作細胞及び／または非遺伝子操作細胞は、凍結培地中１ｍＬ当たり少なくとも約１、５、１０、１００、１５０、２００、５００バイアル、少なくとも約１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、または少なくとも約１０^１０の細胞の量で、細胞バンクを生じるために、凍結保存することができる。凍結保存細胞バンクは、機能性を保持し得、解凍して、任意に、活性化／刺激及び／または拡大させることができる。いくつかの態様では、解凍細胞は、同種細胞製品として多量の細胞を生成するために、細胞培養バッグ及び／またはバイオリアクターなどの好適な密閉容器内で刺激及び拡大させることができる。他の例では、凍結保存細胞は、自己細胞製品を含む。凍結保存細胞は、極低温保存条件下で、少なくとも約６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月、２０ヶ月、２４ヶ月、３０ヶ月、３６ヶ月、４０ヶ月、５０ヶ月、または少なくとも約６０ヶ月間、生物学的機能を維持し得る。いくつかの態様では、防腐剤は、製剤中で使用されない。いくつかの実施形態では、凍結保存細胞を解凍し、同種異系の既製細胞製品として複数の患者に注入することができる。

以下の実施例は、本発明の方法及び組成物の製造方法及び使用方法の完全な開示及び記載を当業者らに提供するために提示されており、発明者らが発明とみなす範囲を制限することが意図されない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関しては正確性を確保する取り組みがなされているが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途指示のない限り、部は、重量部であり、分子量は、平均分子量、温度は、摂氏度であり、圧力は、大気圧または大気圧付近である。

実施例１．ＤＡＰ１０コンストラクトの構築
Ｙ８６Ｆ変異、Ｋ８４Ｒ変異、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインから選択された０～４つのエレメントで、ＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトを構築した。構築では、ｐＳＩＮベクター（Ｈａｒｉｈａｒａｎ，ＭＪｅｔａｌ．，（１９９８）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ７２（２）：９５０－９５８）を使用した。簡単に言うと、ＢｉｏＮＴｅｃｈ（ドイツ）の子会社であるＥＵＦＥＴＳ（ドイツ）により提供された配列からＧｅｎｅｗｉｚ（登録商標）（ニュージャージー州サウスプレインフィールド）により、ｐＳＩＮベクターバックボーンを完全に合成した。全てのコンストラクトで使用される基本プラスミドは、ｐＬ０７７ｐＲｅｔｒｏＳＩＮ－ＧＦＰと呼ばれ、これは、目的の遺伝子に置き換えられる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）カセットを有する。様々なコンストラクトが以下の表１に示される。以下のコンストラクトに関して、ＦＰ２Ａは、フーリン及びＰ２Ａリンカー遺伝子を指し、ＣＤ１９ｔは、切断型ＣＤ１９マーカーを指す。配列番号は、アミノ酸配列に対応する。以下の表３～１５は、表１で示されるコンストラクトのアミノ酸配列をコードする核酸配列と、表２の選択配列に注釈をつける。表１は、ＣＤ１９ｔを含むＤＡＰ１０コンストラクトを示すが、他のバリエーション、例えば、ＥＧＦＲｔを組み込んだ同様のＤＡＰ１０コンストラクトなども本開示の範囲内にある。そのような配列の例は、表２に示される。

実施例２．ＰＬＣ／ＰＲＦ／５アッセイにおける様々なＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトの腫瘍制御
上記の表１の様々なＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトをＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞溶解アッセイで試験した。図２Ａは、ＤＡＰ１０．０（ＤＡＰ１０野生型）及びＤＡＰ１０．１３（ＤＡＰ１０－Ｋ８４Ｒ）がＰＬＣ／ＰＲＦ／５アッセイで良好な腫瘍制御を示さないことを示す。図２Ｂは、ＤＡＰ１０．３（ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ）及びＤＡＰ１０．１４（ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ－Ｋ８４Ｒ）コンストラクトによるある程度の腫瘍制御を示す。図２Ｃは、４－１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの両方を含むＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトが、追加の変異がない場合（すなわち、ＤＡＰ１０．４）に良好な腫瘍制御を示し、Ｙ８６Ｆ変異のみ（すなわち、ＤＡＰ１０．５）またはＫ８４Ｒ変異のみ（すなわち、ＤＡＰ１０．１５）を追加しても、ＤＡＰ１０．４コンストラクトよりも腫瘍制御が大幅に改善されないことを示す。しかし、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及び両方の変異（すなわち、Ｙ８６Ｆ及びＫ８４Ｒ）をそれぞれ組み込んだＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトＤＡＰ１０．６では、腫瘍制御が大幅に改善された（図２Ｃ）。図２Ａ～２Ｃは、それぞれは、陽性対照ＣＡＲで試験された腫瘍制御と、腫瘍細胞単独の細胞傷害性指数を示すプロットも示していた。

Ｖδ１γδ細胞の増殖も、図２Ａ～２Ｃに対応する試験条件で試験し、その結果は、それぞれ図２Ｄ～２Ｆに示される。示されるように、ほとんどのＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトで良好な増殖が観察された。

実施例３．ＨｅｐＧ２アッセイにおける様々なＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトの腫瘍制御
上記の表１の様々なＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトを、ＨｅｐＧ２アッセイで試験した。図３Ａは、ＤＡＰ１０．０（ＤＡＰ１０野生型）及びＤＡＰ１０．１３（ＤＡＰ１０－Ｋ８４Ｒ）コンストラクトを使用して得られたデータを示し、図３Ｂは、ＤＡＰ１０．３（ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ）及びＤＡＰ１０．１４（ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ－Ｋ８４Ｒ）コンストラクトを使用して得られたデータを示し、図３Ｃは、ＤＡＰ１０．４、ＤＡＰ１０．５、ＤＡＰ１０．６、及びＤＡＰ１０．１５コンストラクトを使用して得られたデータを示す。図３Ａ～３Ｃは、それぞれは、陽性対照ＣＡＲで試験された腫瘍制御と、腫瘍細胞単独の細胞傷害性指数を示すプロットも示していた。

Ｖδ１γδ細胞の増殖も、図３Ａ～３Ｃに対応する試験条件で試験し、その結果は、それぞれ図３Ｄ～３Ｆに示される。Ｈｅｐ２Ｇアッセイでは、ＣＤ３ζドメインと４－１ＢＢドメインの両方、ならびに少なくともＹ８６Ｆ変異（すなわち、ＤＡＰ１０．１５及びＤＡＰ１０．６）を含むコンストラクトで良好な増殖及び細胞傷害性が観察され、これは、ＤＡＰ１０．６コンストラクト（ＣＤ３ζ、４－１ＢＢ、Ｙ８６Ｆ、及びＫ８４Ｒをそれぞれ含む）は、細胞傷害性及びＶδ１γδ細胞増殖に関して最高のパフォーマンスを示した。

実施例４．腫瘍共培養後のＤＡＰ１０コンストラクトで形質導入されたＶδ１細胞の生存
この実施例では、表１の様々なＤＡＰ１０コンストラクトで形質導入されたＶδ１細胞の生存を評価した。具体的には、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５共培養の５日後に生存を評価した。図４に示されるように、ＤＡＰ１０．６で形質導入された細胞は、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５との５日間の共培養後に最高のＶδ１生存を示した。

実施例５．マウスモデルにおけるＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトのｉｎＶｉｖｏ腫瘍制御
この実施例では、ＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクト（ＤＡＰ１０．６及びＤＡＰ１０．１５、表１を参照）を、マウスモデルでＰＬＣ／ＰＲＦ／５腫瘍の成長を制御する有効性について試験した。図５Ａに示されるように、腫瘍のみを有するマウス（Ａ群）において、平均腫瘍体積が３５日間にわたって着実に増加した。腫瘍を有し、５ｅ^６Ｖδ１Ｔ細胞を注射されたマウス（未形質導入、Ｂ群）において、同様の結果が観察された。ＤＡＰ１０．６（Ｃ群）またはＤＡＰ１０．１５（Ｄ群）で形質導入されたＶδ１Ｔ細胞をマウスに注入した場合、腫瘍成長が、大幅に低減し、腫瘍制御に関して最も強力な有効性がＤＡＰ１０．６ＣＡＤについて観察された。図５Ｂは、Ｄｕｎｎの多重比較によるＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定で分析され、示されるような腫瘍体積の関数としてプロットされた、３５日目の図５Ａで得られるデータを示す。図５Ａ及び図５Ｂの各Ａ～Ｄ群では、Ｎ＝５であり、投与された腫瘍細胞数は、４ｅ^６であった。

実施例６．ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ発現
この実施例では、特定のＤＡＰ１０ＣＡＤ（例えば、ＤＡＰ１０．６、表１を参照）で形質導入された細胞におけるＮＫＧ２Ｄ発現レベルの増加を示す。簡単に説明すると、Ｖδ１Ｔ細胞に、ＤＡＰ１０．６、ＤＡＰ１０．１３、ＤＡＰ１０．１５、ＤＡＰ１０．５、及び対照ＣＡＲのいずれかを形質導入し、次に、形質導入細胞をＰＬＣ細胞と共培養した。ＮＫＧ２Ｄの蛍光標識とＦＡＣＳ分析を組み合わせて、Ｖδ１ＮＫＧ２Ｄ発現レベルを評価した。図６では、異なるＤＡＰ１０ＣＡＤまたはＣＡＲ対照を含有する細胞の発現レベルが、幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）としてプロットされており、これは、Ｖδ１Ｔ細胞で発現されたＤＡＰ１０．６ＣＡＤコンストラクトが、他のＤＡＰ１０ＣＡＤ（１０．１３、１０．１５、１０．５）及びＣＡＲ対照と比較して大幅に高いＮＫＧ２Ｄ発現レベルがもたらされることを示す。特に、ＤＡＰ１０．６ＣＡＤコンストラクトは、Ｋ８４Ｒ変異、Ｙ８６Ｆ変異、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインがそれぞれを含む。ＤＡＰ１０．１５（Ｋ８４Ｒ＋４－１ＢＢ＋ＣＤ３ζ）及びＤＡＰ１０．５（Ｙ８６Ｆ＋４－１ＢＢ＋ＣＤ３ζ）では、ＣＡＲ対照を超えるＮＫＧ２Ｄ発現が少ないが、さらに統計的に有意に増加が、観察された。

実施例７．ＤＡＰ１０ＣＡＤ発現
この例では、ＤＡＰ１０ＣＡＤの発現が、Ｖδ１細胞の異なるロット間で類似していることを示す。

ＤＡＰ１０．６．３コンストラクト（配列番号７５）は、例えば、ＣＤ１９を含むＤＡＰ１０．６コンストラクト（配列番号２９）と比較して、切断型ＥＧＦＲをマーカーとして含む。本明細書でＤＡＰ１０．１６（配列番号：７７）と呼ばれるＤＡＰ１０コンストラクトは、ＤＡＰ１０．６．３コンストラクトと同じであるが、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに１ＸＸ変異を含む。ＤＡＰ１０．６またはＤＡＰ１０．１６コンストラクトをトランスフェクトされたＶδ１細胞は、実質的に同様の発現レベルを示すことが判明した。ＣＡＤタンパク質は、抗ＤＡＰ１０抗体及び抗ＣＤ３ζ抗体を使用した、ウェスタンブロット分析により直接検出された（ｎ＝２ドナー）（図７）。

実施例８．ＤＡＰ１０ＣＡＤの細胞傷害活性は、ＮＫＧ２Ｄにより媒介される
ＮＫＧ２Ｄをブロックすると、細胞傷害活性が除去されることを、本実施例は示す。具体的に、ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体の使用によりＮＫＧ２Ｄを遮断することは、２つの細胞株にわたる３人のドナーにおけるＤＡＰ１０ＣＡＤ発現Ｖδ１細胞の細胞傷害性活性が除去された（図８Ａ～８Ｂ）。ＣＡＲでトランスフェクトされた対照Ｖδ１細胞の細胞傷害活性は、影響を受けなかった（図８Ｃ～８Ｄ）。図８Ａ、８Ｃでは、ＰＬＣ標的細胞（Ｅ：Ｔ比５：１）を使用した。図８Ｂ、８Ｄでは、ＨＬ６０標的細胞（Ｅ：Ｔ比２．５：１）を使用した。ＮＫＧ２Ｄ阻害抗体は、ＤＡＰ１０．０コンストラクト（すなわち、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを欠く）を発現する細胞にも影響を与えなかった（データは示さず）。
実施例９．ＤＡＰ１０ＣＡＤ分子活性化シグネチャー

本実施例は、複数のドナー及び細胞株にわたって一貫したＤＡＰ１０ＣＡＤ活性化シグネチャーを示す。本実施例では、分子活性化シグネチャーを評価するために、刺激後に、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析（ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ワシントン州シアトル）を実施した。刺激に使用された細胞株は、ＰＬＣ（ＨＣＣ）、ＨＬ６０、ＴＨＰ１（ＡＭＬ）、及びＨＣＴ１５（ＣＲＣ）を含んでいた。データは、インターフェロンガンマ、４－１ＢＢ、及びグランザイムＢを介して投薬される一貫した活性化シグネチャーを示す。図９Ａは、ＤＡＰ１０．６対自然対照（ＤＡＰ１０．０）のデータを示し、図９Ｂは、ＤＡＰ１０．１６対自然対照（ＤＡＰ１０．０）のデータを示す。ＤＡＰ１０．６及びＤＡＰ１０．１６間には、一貫して検出可能な差異は観察されなかった（図９Ｃ）。

実施例１０．ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の幅広い抗がん活性
本実施例は、本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞が、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを有する様々ながん種に対して抗がん活性を示すことを示す。

図１０Ａ～１０Ｅは、１８時間アッセイにおいて、ＤＡＰ１０．６で形質導入されたＶδ１細胞、またはＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されていない細胞と比較した、ＤＡＰ１０．０で形質導入されたＶδ１細胞に対するＥ：Ｔ比の関数としての％細胞傷害活性を示すグラフである。標的細胞株は、ＨＣＴ１１６（図１０Ａ）、ＳＫＭＥＬ５（図１０Ｂ）、ＭｉｎｏＤ２（図１０Ｃ）、ＳｃａＢＥＲ（図１０Ｄ）、及びＲａｊｉＢ４（図１０Ｅ）を含んでいた。図１０Ｆ～１０Ｇは、１８時間のアッセイにおいて、自然対照（ＤＡＰ１０．０で形質導入されたＶδ１細胞）または無関係なＣＡＲ対照と比較した、ＤＡＰ１０．６で形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害性率を示すグラフである。図１０Ｆ～１０Ｇの標的細胞株は、それぞれ、ＮＣＩ－Ｈ１５８１及びＮＣＩ－Ｈ２１７２であった。示されているように、細胞傷害効力は、対照と比較して大幅に増加した。図１０Ｈは、アッセイで使用された選択された細胞株が、広範囲のＮＫＧ２Ｄリガンド発現レベル／パターンを表すことを示す。図１０Ｈのデータを取得するために、様々な血液腫瘍及び固形腫瘍に由来する、示されている様々ながん細胞株を、フローサイトメトリーでＮＫＧ２Ｄリガンドについて評価した。染色で使用された５つの抗体は、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２／５／６、ＵＬＢＰ３、及びＵＬＢＰ４を検出していた。データは、関連アイソタイプ対照に対するＮＫＧ２Ｄリガンドの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍数変化として表示される。生データは、図１０Ｉ－１０Ｊに示されている（がん細胞株は、３回染色されていた）。

図１１Ａ～１１Ｇは、標的及びエフェクターの共培養時間の関数としての細胞傷害性指数を示すグラフである。標的細胞は、２２Ｒｖ１、Ｍｉｎｏ、ＨＣＴ１１６、及びＨＣＴ－１５を含んでいた。エフェクターは、ＤＡＰ１０ＣＡＲ、ＣＡＲ対照で形質導入されたＶδ１細胞、または非形質導入Ｖδ１細胞を含んでいた。対照と比較して、Ｖδ１細胞が本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入された場合、細胞傷害性の増強が観察された。細胞傷害性の程度は、細胞株及びＥ：Ｔ比に依存することが判明した。試験された細胞株は、ＮＫＧ２Ｄリガンド発現の様々なレベル／パターンを表す（図１０Ｈ－１０Ｊを参照）。細胞株に応じて５：１または１．５：１の最大下のＥ：Ｔ比でＮｕｃＲｅｄ発現標的細胞で、エフェクター細胞を共培養した。細胞傷害性指数は、各時点のＮｕｃＲｅｄオブジェクトの総面積（ｍｍ^２／ウェル）を時間＝０の値で除することにより計算された。

実施例１１．ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の複数ロットにわたる同等の細胞傷害活性
本実施例は、ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の細胞傷害活性が、異なるロットのＶδ１細胞及びＤＡＰ１０ＣＡＤについて同等であることを示す。図１２Ａは、代表的な１２０時間の細胞傷害性アッセイのデータを示すグラフである。標的細胞は、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５であった。アッセイに使用されたＶδ１細胞を、ＤＡＰ１０．６、ＤＡＰ１０．１６、ＤＡＰ１０参照ロット（すなわち、拡大Ｖδ１細胞の陽性対照バッチ）、及びＤＡＰ１０．０（対照）で形質導入した。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞単独（つまり、Ｖδ１細胞との共培養なし）のデータも示されている。図１２Ｂは、１２０時間アッセイの最終時点を使用して、ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞で処置された腫瘍と比較した、腫瘍単独の細胞傷害性の減少率（％）を示すグラフである。

Ｖδ１細胞に組み込まれたＤＡＰ１０．６対ＤＡＰ１０．１６対ＤＡＰ１０．１７構造の細胞傷害性を１２０時間の細胞傷害性アッセイで試験した。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５標的細胞を使用して、３人のドナー由来のＶδ１細胞をＤＡＰ１０コンストラクトで試験した。図１２Ｃに示されている各コンストラクトは、３人のドナー全ての集計である。厳格なＥ：Ｔ比を使用した、このアッセイでは、ＤＡＰ１０．６コンストラクトは、ＤＡＰ１０．１６及びＤＡＰ１０．１７よりもわずかに優れた平均細胞傷害性を示した。

ＤＡＰ１０．６対ＤＡＰ１０．１６対ＤＡＰ１０．１７の有効性は、若干のドナー依存性を示した。細胞傷害性指数は、ＤＡＰ１０．６、ＤＡＰ１０．１６、もしくはＤＡＰ１０．１７で形質導入された３つの異なるドナー（ＳＣＴ０６、ＳＣＴ２９、ＳＣＴ４６）のＶδ１細胞、または同じドナーの非形質導入細胞を用いる共培養実験で測定された。共培養実験の標的細胞は、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞であった。共培養時間は、１２０時間であった。図１２Ｄ～１２Ｅに示されるように、ＤＡＰ１０．６及びＤＡＰ１０．１６は、非常に類似したプロファイルを示す。ＤＡＰ１０．１７は、最もドナー依存性が高いことが判明した（図１２Ｆ）。ＤＡＰ１０．６で形質導入されたＶδ１細胞の参照ロットを、全てのアッセイで使用し、再現性のある対照として機能した（データは示されず）。

実施例１２．ＤＡＰ１０ＣＡＤ刺激に対応するサイトカインプロファイル
本実施例は、ＤＡＰ１０ＣＡＤ刺激が、多機能性サイトカインプロファイルをもたらすことを示す。

図１３Ａは、本開示の異なるＤＡＰ１０コンストラクトの関数としてのサイトカインプロファイルを示す。図に示されるように、サイトカイン活性化の程度は、細胞株特異的であった。試験された細胞株は、ＰＬＣ、Ｍｉｎｏ、及びＴ細胞のみを含んでいた。重要なことに、潜在的に問題となるサイトカイン（例えば、ＩＬ－６及びＩＬ－１７）が検出されなかった。図１３Ｂは、様々なＤＡＰ１０ＣＡＤ（様々なドナー、例えば、ＳＣＴ０６、ＳＣＴ４６由来）について、ＰＬＣ、Ｍｉｎｏ、及びＴ細胞単独におけるインターフェロンガンマ誘導（ｐｇ／ｍｌ／１Ｅ^６ＣＡＤ＋細胞）を示すグラフである。図１３Ｃ～１３Ｆは、ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞単独の、ならびに最大下のＥ：Ｔ比のＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＨＬ６０、ＴＨＰ１、及びＰＣ３標的細胞との約１８時間後の共培養後の、インターフェロンガンマ分泌を示す代表的実験である。

実施例１３．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と比較したＤＡＰ１０ＣＡＤのサイトカインプロファイル
この実施例は、ＣＡＲと比較して、本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤからのサイトカインプロファイルの類似性が高いことを示す（図１４）。試験された条件は、ＤＡＰ１０ＣＡＤ及びＰＬＣ細胞または単独（つまり、標的細胞なし）で形質導入されたＶδ１細胞と、ＣＡＲ及び標的細胞（ＨｅｐＧ２、ＰＬＣ、Ｒａｊｉ）または単独（つまり、標的細胞なし）で形質導入されたＶδ１細胞、を含んでいた。注目すべきことに、標的細胞の非存在下でＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞は、標的細胞の非存在下でＣＡＲで形質導入されたＶδ１細胞よりもバックグラウンドサイトカイン分泌が少ないことを示す。

実施例１４．ＤＡＰ１０ＣＡＤ刺激は、複数のドナー間で増殖を促進する
本実施例は、ＤＡＰ１０ＣＡＤ刺激が、試験された全てのドナーでＶδ１細胞の増殖を促進することを示す。具体的には、本実施例では、本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクト（ＤＡＰ１０．６、ＤＡＰ１０．１６、ＤＡＰ１０．１７）で形質導入された後、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（Ｅ：Ｔ比５：１）との共培養により、Ｖδ１細胞の増殖を評価した。対照は、ＤＡＰ１０対照バッチ（またはＤＡＰ１０．０）で形質導入されたＶδ１細胞を含んでいた。ＤＡＰ１０．１６で形質導入されたＶδ１細胞の増殖が少ない／遅いのは、１ＸＸＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの結果である可能性である。この点に関しては、活性化／増殖の増強された調節は、過剰刺激／消耗の低減により、操作Ｖδ１細胞の長期的な有効性／生存に有益であり得る。

共培養実験では、２つの異なるドナー（ＳＣＴ２９及びＳＣＴ４６）から得られたＶδ１細胞を使用した。図１５に示されるように、ＤＡＰ１０．６及びＤＡＰ１０．１６で形質導入されたＶδ１細胞の強力な増殖は、両方のドナーについて観察されたが、ＤＡＰ１０．１７で形質導入されたＶδ１細胞についての増殖は、ドナーに多少依存していた。

実施例１５．１ＸＸＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞によるｉｎｖｉｖｏ腫瘍制御
本実施例は、１ＸＸＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを組み込むと、ｉｎｖｉｖｏで腫瘍制御が改善され得ることを示す。

本実施例では、ＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトＤＡＰ１０．６及びＤＡＰ１０．１６を、マウスモデルで成長したＰＬＣ／ＰＲＦ／５腫瘍を調節する有効性について試験した。図１６Ａに示されるように、ＤＡＰ１０．１６ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞（ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインに１ＸＸ変異が含まれる）で処置されたマウスの腫瘍制御は、ＤＡＰ１０．６ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞で処置されたマウスと直接比較すると改善されている（ｐ＝０．００７９、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（両側））。本実施例で使用された実験手順の概略図が図１６Ｂに示される。

実施例１６．ＤＡＰ１０ＣＡＤＶδ１細胞とＣＡＲＶδ１細胞とのｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍活性の比較
本実施例は、ＤＡＰ１０ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞が、ＣＡＲＶδ１細胞と同様の動態で抗腫瘍活性を示すことを示す。

ＨＣＴ－１５マウス異種移植モデルにおける、対照ＣＡＲＶδ１細胞及び腫瘍単独の条件と比較したＤＡＰ１０ＣＡＤ＋Ｖδ１細胞（５ｅ^６細胞／用量及び１５ｅ^６細胞／用量）のｉｎｖｉｖｏ腫瘍成長動態が図１７Ａに示される。２７日目に定量化された腫瘍体積が図１７Ｂに示される。本実施例で使用された実験手順の概略図が図１７Ｃに示される。データは、５匹のマウス／群の平均±ＳＥＭとして示される。各処置の完全なコホート間の最終的な統計的有意性を評価するために、Ｄｕｎｎの多重比較によるＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を使用した（ｎｓ＝有意ではない）。

実施例１７．操作Ｖδ１細胞のｉｎｖｉｖｏ増殖、持続、及び標的化
本実施例は、本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞がマウスモデルにおいてｉｎｖｉｖｏ腫瘍内で増殖するが、他の臓器では増殖しないことを示す。本実施例では、２つの別個の研究を実施した。図１８Ａに示されるように、ＤＡＰ１０．６で形質導入されたＶδ１細胞の増殖は、処置後７日目に腫瘍組織（皮下ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞）で観察されたが、脾臓、肺、肝臓、骨髄、または血液では観察されなかった。研究１で使用されたＶδ１細胞を、研究２で使用されたＶδ１細胞とは異なるドナーから取得した。図１８Ａでは、ＨｕＣＤ４５＋、Ｖδ１＋集団が示されている。図１８Ｂは、４日目、７日目、及び１４日目（研究１）、ならびに、７日目及び１４日目（研究２）の各研究における腫瘍組織１ｍｇ当たりの操作Ｖδ１細胞を定量したグラフである。各研究では、５ｅ^６の操作Ｖδ１細胞を使用した。注目すべきことに、各研究を通じて、腫瘍内の総Ｖδ１細胞の増加が観察された。図１８Ｃは、フローサイトメトリーで評価された処置後４、７、または１４日に採取された腫瘍組織または他の組織（肺、肝臓、脾臓、骨髄、血液）中のＶδ１細胞の定量を示すグラフであり、本実施例で提示された２つの独立した研究にわたる累積分析を表す。図１８Ｄは、参考のために本実施例に対応する実験手順を示す概略図である。処置されたマウスでは、体重の有意な変化または毒性もしくは異種移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の急性臨床徴候は観察されなかった（図１９）。図１９に示されるデータは、ｎ＝４の独立した有効性研究に関するものである。

本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞は、正常細胞（すなわち、非腫瘍細胞）を保護しながら、腫瘍細胞を効率的に標的とすることが判明した。具体的には、短期細胞傷害性アッセイを、一次細胞標的の分析のためのアネキシン／ＤＡＰＩフローベースの方法に適合させた。図２０Ａは、本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤ（ＤＡＰ１０．６、ＤＡＰ１０．１６）で形質導入されたＶδ１細胞と、ＮＫＧ２ＤＣＡＲで形質導入されたＶδ１細胞の両方が、ＴＨＰ１単独及び自然対照（ＤＡＰ１０．０）で形質導入されたＶδ１細胞と比較して、ＴＨＰ１細胞の生存率を大幅に低減させたことを示すグラフである。図２０Ｂは、自然対照（ＤＡＰ１０．０で形質導入されたＶδ１細胞）と同様に、本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤ（ＤＡＰ１０．６、ＤＡＰ１０．１６）で形質導入されたＶδ１細胞による健常ＰＢＭＣの標的化の実質的欠如を示すグラフである。注目すべきことに、ＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞は、一貫してＮＫＧ２ＤＣＡＲ参照よりも低いＰＢＭＣ標的化を示した（図２０Ｂ）。

実施例１８．小規模ドナースクリーニング
本実施例は、ＣＤ３ζ １ＸＸ改変を含むＤＡＰ１０ＣＡＤで形質導入されたＶδ１細胞の拡大が、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインに１ＸＸが含まれない同様のコンストラクトよりも改善され得ることを示す。

本実施例では、６つのドナー（ＳＥ００１、ＡＲＣ００７、ＨＣ４５、ＤＬＳ００３、ＳＥ０１５、及びＳＣＴ０２９）からのＶδ１細胞を、小規模な振盪フラスコ拡大の２つの実験で試験した。具体的には、異なるドナー由来のＶδ１細胞を、ＤＡＰ１０．６またはＤＡＰ１０．１６のいずれかで形質導入した。全てのドナーにわたり、ＤＡＰ１０．６形質導入細胞と比較して、５０～１３５％以上のＶδ１細胞（ＤＡＰ１０．１６形質導入細胞由来）を測定した（図２１）。拡大を、１４日目及び１５日目に測定した。

実施例１９．ＤＡＰ１０ＣＡＤＶδ１細胞成長速度
本実施例は、対照（ＤＡＰ１０．０、ＣＡＲ対照）と比較して、リードＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクト（ＤＡＰ１０．６、ＤＡＰ１０．１６、ＤＡＰ１０．１７）で形質導入された培養物中で、高いＶδ１細胞率（％）への明らかなシフトがある。

本実施例では、３つの異なるドナー（ＳＣＴ０６、図２２Ａ、ＳＣＴ２９、図２２Ｂ、ＳＣＴ４５、図２２Ｃ）由来のＶδ１細胞を、リードＤＡＰ１０コンストラクトまたは対照で形質導入し、全細胞の％Ｖδ１を、拡大時間の関数として拡大させた。図２２Ａ～２２Ｃのそれぞれに示されるように、リードＤＡＰ１０コンストラクトでは、対照と比較して、より高いＶδ１パーセンテージへの明確なシフトが観察された。

実施例２０．ＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトで形質導入された細胞の拡大
本実施例は、Ｖδ１細胞を、本開示のＤＡＰ１０ＣＡＤで効率的に拡大させ、形質導入することができることを示す。図２３Ａは、「既製の」同種ＣＡＤＶδ１細胞を生成するプロセスを表す概略図を示す。３つの異なるドナー（ＳＣＴ０６、ＳＣＴ２９、ＳＣＴ４５）から得られたＶδ１細胞に形質導入されたリードＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクト（ＤＡＰ１０．６、ＤＡＰ１０．１６、ＤＡＰ１０．１７）の独立した拡張を示すデータは、それぞれ図２３Ｂ、２３Ｃ、２３Ｄに示されている。独立した拡大（青対赤）は、ＤＡＰ１０ＣＡＤコンストラクトの成長プロファイルにおいて同様の傾向を示す。３人のドナーのうち２人では、成長が、コンストラクトに依存していることがわかった。

代表的な実験は、Ｖδ１細胞のｅｘｖｉｖｏ培養が、大幅な倍数拡大（図２３Ｅ）及び強力なＤＡＰ１０ＣＡＤの形質導入（図２３Ｆ）Ｖδ１細胞をもたらすことを示す。図２３Ｅ～２３Ｆのデータは、７人の異なるドナー由来のＰＢＭＣを使用した、１２の独立した培養から得られた。培養率（％）として表された経時的（０日目、αβＴ細胞枯渇前、及びαβＴ細胞枯渇後）の細胞組成（Ｖδ１細胞、Ｖδ２細胞、αβ細胞、及びＮＫ細胞）を示す一連のグラフが、図２３Ｇに示されている。上述の記載を読めば、特定の改変及び改良が当業者らに想起されるであろう。簡潔性及び読みやすさを考慮して、そのような変更及び改良は全て、本明細書では削除されているが、以下の特許請求の範囲内に適切に含まれることが理解されるべきである。

Claims

キメラアダプター（ＣＡＤ）ポリペプチドをコードする単離核酸であって、前記ＣＡＤポリペプチドが、ヒトＤＡＰ１０アミノ酸配列を含むＤＡＰ１０ドメイン及び少なくとも１つの共刺激ドメインを含み、前記ＣＡＤポリペプチドが、機能的な細胞外受容体及び／またはリガンド結合ドメインを含む細胞外ドメインを具体的に欠いている、前記単離核酸。
前記共刺激ドメインが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ３Ｃ、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＦｃＲ、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の単離核酸。
前記少なくとも１つの共刺激ドメインが、４－１ＢＢである、請求項２に記載の単離核酸。
前記少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＣＤ２８である、請求項２に記載の単離核酸。
前記ＣＡＤポリペプチドが、さらに、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２、ＬＦＡ－１、及びＣＤ３ｔから選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離核酸。
前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζであり、任意に、ＣＤ３ζが、配列番号７６として記載されるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の単離核酸。
前記少なくとも１つの共刺激ドメインが、４－１ＢＢであり、前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζである、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離核酸。
前記ＣＡＤポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へ、前記ＤＡＰ１０ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、それに続く、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項７に記載の単離核酸。
前記ＣＡＤポリペプチドが、４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ２８共刺激ドメインを含む、請求項１に記載の単離核酸。
前記ＣＡＤポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へ、前記ＤＡＰ１０ドメイン、前記４－１ＢＢ共刺激ドメイン、それに続く、前記ＣＤ２８共刺激ドメイン、さらに、それに続く、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含み、任意に、ＣＤ３ζが、配列番号７６に記載のアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の単離核酸。
前記ＣＡＤポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へ、前記ＤＡＰ１０ドメイン、前記ＣＤ２８共刺激ドメイン、それに続く、前記４－１ＢＢ共刺激ドメイン、さらに、それに続く、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、任意に、ＣＤ３ζが、配列番号７６として記載されるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の単離核酸。
前記ヒトＤＡＰ１０アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の単離核酸。
前記ヒトＤＡＰ１０アミノ酸配列が、変異ヒトＤＡＰ１０アミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の単離核酸。
前記変異ヒトＤＡＰ１０アミノ酸配列が、Ｋ８４及び／またはＹ８６に対応する位置でアミノ酸置換を含む、請求項１３に記載の単離核酸。
位置Ｋ８４の前記アミノ酸置換が、Ｋ８４Ｒ置換を含む、請求項１４に記載の単離核酸。
位置Ｙ８６の前記アミノ酸置換が、Ｙ８６Ｆ置換を含む、請求項１４または請求項１５に記載の単離核酸。
前記単離核酸が、調節可能なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１～１６のいずれか１項に記載の単離核酸。
前記単離核酸が、さらに、サイトカインをコードする、請求項１～１７のいずれか１項に記載の単離核酸。
前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３からなる群より選択される、請求項１８に記載の単離核酸。
請求項１～１９のいずれか１項に記載の単離核酸を含む、発現ベクター。
請求項１～１９のいずれか１項に記載の単離核酸、または請求項２０に記載の発現ベクターによりコードされるキメラアダプター（ＣＡＤ）ポリペプチド。
請求項２０に記載の発現ベクター、または請求項２１に記載のＣＡＤポリペプチドを含む哺乳動物細胞であって、前記哺乳動物細胞が、ＤＡＰ１０に関連する少なくとも１つの受容体を発現する、前記哺乳動物細胞。
ＤＡＰ１０に関連する前記少なくとも１つの受容体が、内因性である、請求項２２に記載の哺乳動物細胞。
ＤＡＰ１０に関連する前記少なくとも１つの受容体が、過剰発現する、請求項２２に記載の哺乳動物細胞。
ＤＡＰ１０に関連する前記少なくとも１つの受容体が、外因性である、請求項２２に記載の哺乳動物細胞。
前記受容体が、ＮＫＧ２Ｄである、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞。
前記哺乳動物細胞が、免疫細胞であり、好ましくは、前記免疫細胞が、細胞傷害性細胞である、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞。
免疫細胞を活性化するための方法であって、
前記免疫細胞において、請求項２１に記載のＣＡＤポリペプチドを発現すること、を含み、前記免疫細胞が、ＤＡＰ１０に関連する少なくとも１つの受容体を発現し、
前記活性化が、対応する標的分子に関与する前記受容体に応答して生じる、前記方法。
前記受容体が、内因性である、請求項２８に記載の方法。
前記受容体が、外因性である、請求項２８に記載の方法。
前記受容体が、過剰発現する、請求項２８に記載の方法。
前記受容体が、ＮＫＧ２Ｄである、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫細胞またはその複数が、それを必要とする対象に導入され、
前記活性化が、前記対象で生じる、請求項２８～３２のいずれか１項に記載の方法。
前記哺乳動物細胞またはその複数が対象における状態の少なくとも１つの症状または徴候を低減する前記状態の前記対象を処置するための薬剤の調節における、請求項２２～２７のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞またはその複数の使用。
請求項２２～２７のいずれか１項に記載の薬学的に許容される賦形剤及び複数の哺乳動物細胞を含む、医薬組成物。