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JP2024536133A - 抗ｈｓｐ７０抗体およびその治療的使用 - Google Patents

抗ｈｓｐ７０抗体およびその治療的使用 Download PDF

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JP2024536133A JP2024519274A JP2024519274A JP2024536133A JP 2024536133 A JP2024536133 A JP 2024536133A JP 2024519274 A JP2024519274 A JP 2024519274A JP 2024519274 A JP2024519274 A JP 2024519274A JP 2024536133 A JP2024536133 A JP 2024536133A
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Abstract

Figure 2024536133000001
本発明は概して、医薬、免疫学、およびがん生物学の分野に関する。より詳細には、本発明はHSP70を標的とする抗体およびそれらの使用に関する。本明細書において、HSP70を標的とする抗体などの、作用物質が提供される。有効量の、HSP70を標的とする作用物質、例えばHSP70特異的抗体をその必要のある患者に投与する工程を含む、がんを処置する方法が提供される。HSP70特異的抗体は、抗原提示細胞によるHSP70の取り込みを増強し得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2021年9月29日に出願された仮特許出願第63/249,909号の恩典および米国優先権を主張し、その開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
配列表の参照
本出願は、電子的に提出された配列表XMLを含み、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。2022年9月27日に作成された前記配列表SMLは、UTFCP1512WO＿ST26.xmlと名付けられ、サイズが371,316バイトである。
1. 分野
本発明は、一般的には、医学、免疫学およびがん生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、HSP70を標的とする抗体およびその使用方法に関する。
2. 関連技術分野の説明
がん性細胞に対する免疫応答の発生は、がん免疫サイクルと呼ばれる一連の強化事象に依存すると考えられており（Chen＆Mellman, 2013）、これはがん細胞死のあいだのがん細胞抗原の放出から始まる。これらの腫瘍抗原を捕捉し、プロセシングし、次いで組織適合複合体（MHC）クラスIおよびII分子を通じた提示を介してT細胞に提示する能力のために、樹状細胞（DC）は、この応答の鍵となる初期の構成要素であると考えられており、次いで、エフェクターCD4＋およびCD8＋T細胞応答のプライミングおよび活性化がもたらされる。DCの重要な役割は、1つには、とりわけ、低酸素、アデノシン、乳酸、低pHならびにインターロイキン（IL）-10およびPD-L1の発現を含む、DC活性を抑制するために腫瘍によって利用される多くの機構によって実証されている（Veglia＆Gabrilovich, 2017）。
熱ショックタンパク質（HSP）全般、特にHSP70は、自然免疫応答と適応免疫応答を結び付ける能力のために、この過程において重要な役割を果たすと考えられている（Shevtsov＆Multhoff, 2016）。例えば、細胞外HSP70は、腫瘍抗原に結合およびシャペロンとして付き添い、次いで、とりわけCD91、酸化低密度リポタンパク質受容体1（OLR1）および内皮細胞によって発現されるスカベンジャー受容体（SREC）-1を含む異なる細胞表面受容体への結合を通じて、DCを含む抗原提示細胞を標的とし（McNulty et al., 2013）、それにより、結合した抗原をプロセシングのためにDCに送達する。さらに、腫瘍細胞から分泌された細胞外HSP70は、インターロイキン（IL）-6および腫瘍壊死因子（TNF）-αなどの炎症性サイトカインをマクロファージから誘導し（Vega et al., 2008）、それにより、それぞれ交差提示およびT細胞活性化を可能にする。したがって、放射線および様々な化学療法剤の両方を含む様々なストレス要因に直面した際にがん細胞の生存を促進する細胞保護的抗アポトーシス因子としてのその重要な細胞内での役割のために（Boudesco et al., 2018）、HSP70は、がん治療の魅力的な標的であると考えられている。さらに、HSP70は、DCだけでなく、おそらくはマクロファージ、NK細胞およびT細胞も介して免疫応答を刺激する能力のために（Shvetsov＆Multhoff,2016;Zininga et al., 2018）、がん治療の魅力的な標的であるとも考えられている。
HSP70-腫瘍抗原複合体のDCによる取り込みを増強するアプローチは、抗腫瘍免疫を増強し、耐性を破壊することが期待できる。放射線または化学療法に対する増感剤として作用し得る、細胞内HSP70を直接標的とするかまたは一部は細胞内HSP70のコシャペロンを標的とするいくつかの薬理学的阻害剤が開発されている（Boudesco et al., 2018）。また、膜結合型HSP70は、通常、正常細胞には存在しないか、または低レベルで見出されるに過ぎないが、腫瘍細胞の表面での増強された発現をしばしば示し、いくつかの悪性腫瘍では、より高侵襲性の表現型および不良な予後と関連している（Boudesco et al., 2018;Chatterjee＆Burns, 2017）。さらに、HSP70-/-腫瘍は、免疫原性がより低く、侵襲性がより高いことが明らかとなっている（Dodd et al., 2015）。これは、強磁性および金ナノ粒子に基づく治療、ワクチン戦略（Shvetsov＆Multhoff, 2016）ならびにcmHSP70.1などのモノクローナル抗体（Stangl et al., 2011）を含む、それらの活性についてHSP70の細胞表面発現に依存する様々なアプローチの開発および試験につながった。
近年、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）およびプログラム細胞死1（PD-1）およびそのリガンドPD-L1に対するモノクローナル抗体を含む免疫チェックポイント阻害剤（ICI）は、進行した悪性腫瘍においてさえ持続的な寛解を誘導する能力を通じて免疫療法に革命をもたらした。一般に、ICIに応答する腫瘍は、より高い免疫細胞浸潤および/もしくはインターフェロン遺伝子シグネチャ、またはより高い遺伝子変異量（TMB）を有する傾向があると考えられており、「ホットな」腫瘍と呼ばれることがある（Maleki Vareki, 2018）。対照的に、低い免疫細胞浸潤物または低いTMBを有するいわゆる「コールドな」腫瘍は、ICIに応答しない傾向があり、膵臓がんおよび前立腺がんを含む（Maleki Vareki, 2018）。様々な悪性腫瘍を処置する上での進歩にもかかわらず、コールドな腫瘍をより免疫原性の高い腫瘍に変換し、これらの腫瘍の処置のための代替的アプローチを提供し得る新しいアプローチが依然として必要とされている。
概要
本発明は、部分的には、抗HSP70抗体（例えば、抗HSP70モノクローナル抗体）またはその抗原結合断片の発見に基づく。特定の状況では、抗HSP70モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、例えば、腫瘍由来抗原に結合した細胞外または可溶性HSP70を免疫細胞（例えば、樹状細胞）に導き、それによってがんを処置し、および/またはがん療法（例えば、がん免疫療法）の有効性を増強し得る。特定の状況では、抗HSP70モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、例えば、HSP70との高次の（すなわち、1対1より多い）複合体を形成し得る。
本発明は、ヒトHSP70、例えば細胞外または可溶性ヒトHSP70に結合する抗体（例えば、単離された抗体）を提供する。
ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:242のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3）と、SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）とを含む。ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:243のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-GA）と、SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）とを含む。ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:244のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-GAALIE）と、SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）とを含む。ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:245のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-YTE）と、SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）とを含む。ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:246のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-LS）と、SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）とを含む。ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:247のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-DF215）と、SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）とを含む。ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:248のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-DF228）と、SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）とを含む。
ある局面において、抗体は、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定された場合に、50nM以下、10nM以下、5nM以下、1nM以下、0.75nM以下、0.5nM以下、0.1nM、0.075nMまたは0.05nM以下のKDでヒトHSP70に結合する。
ある局面において、抗体は、高次の抗体:HSP70複合体を形成することができる。抗体:HSP70複合体は、例えば、少なくとも約290kDa、少なくとも約300kDa、少なくとも約580kDa、少なくとも約1,450kDaもしくは少なくとも約1,750kDaの分子量または約290kDa、約580kDa、約1,450kDaもしくは約1,750kDaの分子量を有し得る。ある局面において、抗体:HSP70複合体は、少なくとも約300kDaまたは約300kDa超の分子量を有し得る。ある局面において、抗体:HSP70複合体中での抗体のHSP70に対する比は約1:2である。例えば、抗体:HSP70複合体は、（i）約1つの抗体分子および約2つのHSP70分子;（ii）約2つの抗体分子および約4つのHSP70分子;（iii）約5つの抗体分子および約10のHSP70分子;または（iv）約6つの抗体分子および約12のHSP70分子を含み得る。
ある局面において、抗体:HSP70複合体は、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定された場合に、10nM以下、5nM以下、1nM以下、0.75nM以下、0.5nM以下、0.1nM、0.075nMまたは0.05nM以下のKDでヒトFcγR（例えば、FcγR1、FcγR2a、FcγR2b、FcγR2c、FcγR3aおよび/またはFcγR3b）に結合する。
ある局面において、抗体は、免疫エフェクター細胞による腫瘍由来ADP-HSP70-ペプチド抗原複合体の取り込みを増強する。取り込みは、例えば、ヒトFcγR1、ヒトFcγR2a、ヒトFcγR2b、ヒトFcγR2c、ヒトFcγR3aおよび/またはヒトFcγR3bによって媒介され得る。
いくつかの局面において、抗体:HSP70複合体は、免疫エフェクター細胞、例えばCD8＋T細胞、CD4＋T細胞、NK細胞および樹状細胞、例えば未成熟な樹状細胞を活性化する。
別の態様において、本発明は、高次の（すなわち、1対1より多い）抗体:HSP70複合体を形成することができる抗体（例えば、単離された抗体）を提供する。ある態様において、抗体:HSP70複合体は、HSP70関連ペプチドをさらに含む。
抗体:HSP70複合体は、例えば、少なくとも約290kDa、少なくとも約300kDa、少なくとも約580kDa、少なくとも約1,450kDaもしくは少なくとも約1,750kDaの分子量または約290kDa、約580kDa、約1,450kDaもしくは約1,750kDaの分子量を有し得る。例えば、抗体:HSP70複合体は、少なくとも約300kDaまたは約300kDa超の分子量を有し得る。ある局面において、抗体:HSP70複合体中での抗体のHSP70に対する比は約1:2である。例えば、抗体:HSP70複合体は、（i）約1つの抗体分子および約2つのHSP70分子;（ii）約2つの抗体分子および約4つのHSP70分子;（iii）約5つの抗体分子および約10のHSP70分子;または（iv）約6つの抗体分子および約12のHSP70分子を含み得る。
ある局面において、抗体:HSP70複合体は、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定された場合に、10nM以下、5nM以下、1nM以下、0.75nM以下、0.5nM以下、0.1nM、0.075nMまたは0.05nM以下のKDでヒトFcγR（例えば、FcγR1、FcγR2a、FcγR2b、FcγR2c、FcγR3aおよび/またはFcγR3b）に結合する。
ある局面において、抗体は、免疫エフェクター細胞による腫瘍由来ADP-HSP70-ペプチド抗原複合体の取り込みを増強する。取り込みは、例えば、ヒトFcγR1、ヒトFcγR2a、ヒトFcγR2b、ヒトFcγR2c、ヒトFcγR3aおよび/またはヒトFcγR3bによって媒介され得る。
ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:11のK573～Q601を含むHSP70のエピトープに結合する。ある局面において、抗体は、以下の残基:SEQ ID NO:11のK573、E576、W580、H594、K595、R596、E598およびQ601のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは8つを含むHSP70のエピトープに結合する。ある局面において、抗体は、KEWHKREQ（SEQ ID NO:250）を含むHSP70のエピトープに結合する。
ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むVHCDR1と、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むVHCDR2と、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むVHCDR3とを含む、免疫グロブリン重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むVLCDR1と、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むVLCDR2と、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むVLCDR3とを含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（hVH-1）と、SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1）とを含む。
ある局面において、抗体は、免疫エフェクター細胞による腫瘍由来ADP-HSP70-ペプチド抗原複合体の取り込みを増強する。取り込みは、例えば、ヒトFcγR1、ヒトFcγR2a、ヒトFcγR2b、ヒトFcγR2c、ヒトFcγR3aおよび/またはヒトFcγR3bによって媒介され得る。
別の態様において、本発明は、抗体およびHSP70を含む高次の（すなわち、1対1より多い）複合体を提供する。
抗体:HSP70複合体は、例えば、少なくとも約290kDa、少なくとも約300kDa、少なくとも約580kDa、少なくとも約1,450kDaもしくは少なくとも約1,750kDaの分子量または約290kDa、約580kDa、約1,450kDaもしくは約1,750kDaの分子量を有し得る。ある局面において、抗体:HSP70複合体は、少なくとも約300kDaまたは約300kDa超の分子量を有し得る。ある局面において、抗体:HSP70複合体中での抗体のHSP70に対する比は約1:2である。例えば、抗体:HSP70複合体は、（i）約1つの抗体分子および約2つのHSP70分子;（ii）約2つの抗体分子および約4つのHSP70分子;（iii）約5つの抗体分子および約10のHSP70分子;または（iv）約6つの抗体分子および約12のHSP70分子を含み得る。
ある局面において、抗体:HSP70複合体は、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定された場合に、10nM以下、5nM以下、1nM以下、0.75nM以下、0.5nM以下、0.1nM、0.075nMまたは0.05nM以下のKDでヒトFcγR（例えば、FcγR1、FcγR2a、FcγR2b、FcγR2c、FcγR3aおよび/またはFcγR3b）に結合する。
ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:11のK573～Q601を含むHSP70のエピトープに結合する。ある局面において、抗体は、以下の残基:SEQ ID NO:11のK573、E576、W580、H594、K595、R596、E598およびQ601のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは8つを含むHSP70のエピトープに結合する。ある局面において、抗体は、KEWHKREQ（SEQ ID NO:250）を含むHSP70のエピトープに結合する。
ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むVHCDR1と、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むVHCDR2と、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むVHCDR3とを含む、免疫グロブリン重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むVLCDR1と、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むVLCDR2と、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むVLCDR3とを含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（hVH-1）と、SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1）とを含む。
ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:242のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3）と、SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）とを含む。ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:243のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-GA）と、SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）とを含む。ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:244のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-GAALIE）と、SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）とを含む。ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:245のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-YTE）と、SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）とを含む。ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:246のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-LS）と、SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）とを含む。ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:247のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-DF215）と、SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）とを含む。ある局面において、抗体は、SEQ ID NO:248のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-DF228）と、SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）とを含む。
別の態様において、本発明は、前述の抗体のいずれかの免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列、および/または前述の抗体のいずれか1つの免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸を提供する。別の態様において、本発明は、前述の核酸のいずれかを含む発現ベクターを提供する。別の態様において、本発明は、前述の発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。
別の態様において、本発明は、前述の抗体のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、その必要のある対象においてがんを処置する方法を提供する。この方法は、前述の抗体または薬学的組成物のいずれかを対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は放射線療法をさらに含む。ある態様において、放射線療法は、γ線照射、X線照射および放射性同位体療法から選択される。ある態様において、放射線療法はX線照射療法を含む。
ある局面において、がんは、多発性骨髄腫、乳がん、黒色腫、結腸がん、膵臓がんまたは前立腺がんである。ある局面において、対象（または対象からの試料）は、20ng/mLを超える血清HSP70レベルを有する。
別の態様において、本発明は、免疫エフェクター細胞による腫瘍由来ADP-HSP70-ペプチド抗原複合体の取り込みを増強する方法を提供する。この方法は、細胞を前述の抗体または薬学的組成物のいずれかと接触させる工程を含む。
別の態様において、対象におけるがんを処置する上で使用するための、本態様の任意の1つの抗体分子、薬学的組成物、細胞または薬学的組成物が本明細書において提供される。
別の態様において、対象におけるがんを処置するための医薬の製造における、本態様の任意の1つの抗体分子、薬学的組成物、細胞または薬学的組成物の使用が本明細書において提供される。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の図面および詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい態様を示しているが、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、例示としてのみ与えられていることを理解すべきである。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の局面をさらに実証するために含まれている。本発明は、本明細書に提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つまたは複数を参照することによってよりよく理解され得る。
MOPC315.BM-luc細胞を注射されたBALB/cマウスに、示されたHSP70mAb（四角）またはそれらのIgG2Bアイソタイプ対照（丸）の200μgの注射を1～3週目に週2回行った。動物全身のインビボ画像化を用いて疾患負荷をモニタリングし、血清軽鎖レベルによって確認した。 マウスHSP70（上のパネル）、大腸菌（E.coli）内で作製されたヒトHSP70（中央のパネル）およびSf9昆虫細胞内で作製されたヒトHSP70（下のパネル）に対する77Aの親和性を示すOctet分析（図2A）。 77Aは、ADP-HSP70複合体への優先的結合を示す（図2B）。 HSP70-GFPへの77Aの結合は、ADPおよびペプチド基質（NRL）が存在する場合に最大の親和性を示す（図2C）。（図2C）における各群の棒の中で、棒は、左から右に、緩衝液、ATP、ADP、ATP NRLおよびADP NRLを表す。 図3A～F。徐々に多くのC末端アミノ酸が除去された表記の長さの欠失変異体と共に、HSP70 KO 293T細胞中で、完全長（FL）HSP70をN末端GFP融合タンパク質として発現させた（図3A）。77Aによる細胞抽出物のIPの後に、抗GFP抗体によるウエスタンブロッティング（WB）によってタンパク質を検出した（図3B）。次いで、より精細なマッピングのためにより小さい欠失を作製し（図3C）、示されたIPを細胞溶解物（CL）または培養培地上清（CM）から行った。ローディングは、α軽鎖（LC）抗体を用いて確認した。77Aの推定結合ドメインが、タンパク質の関連領域を表すHSP70の分子モデルに示されている（図3D；示されているアミノ酸配列は、SEQ ID NO：11の位置595～614に対応する）。アラニンスキャニング分析を使用して、77Aエピトープを構成する正確なアミノ酸を決定し、結果が（図3E）に示されており、一次および二次重要部位を示すリボン図が（図3F）に示されている。 図3-1の説明を参照のこと。 図3-1の説明を参照のこと。 図4A～B。Luc標識されたMM1.Sヒト骨髄腫細胞をヌードマウス中に注射し、示された用量で、IgG2Bアイソタイプ対照mAbまたは77Aのいずれかで2～5週に週2回処置を施した。動物全身のライブイメージングデータが5週目で示されており（図4A）、背側（上のパネル）および腹側（下のパネル）の図は、IgG2B処置されたマウスでの著しい腫瘍増殖を示しているが、77Aで処置されたマウスでは、特により高い用量レベルにおいて著しい腫瘍増殖を示していない。その後、同じ実験をNSGマウスにおいて行い、イメージングによって（図4B）およびヒト軽鎖に対するELISAの両方によって腫瘍増殖を測定した。 示されるようにIgG2Bまたは77Aの存在下で、ビヒクル（左の2つのパネル）または6x-Hisタグ付きHSP70（右の2つのパネル）のいずれかと共に、未成熟マウスDC2.4細胞を37℃で6時間インキュベートした。次いで、対照IgG（左パネル）またはα-6x-HisタグmAb（右の3パネル）のいずれかで未成熟マウスDC2.4細胞を染色し、フローによってHSP70取り込みを決定した。HSP70の著しい取り込みは、77Aの存在下でのみ見られる（最も右側のパネル）。 細胞膜を染色するためのAlexa Fluor 594にコンジュゲートされたコムギ胚芽凝集素（WGA）、HSP70を検出するためのAlexa Fluor 488タグ付きα-6x-HisタグmAb、または核を染色するための4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）のいずれかで、アイソタイプ対照mAbまたは77AmAbのいずれかの存在下でSf9由来6x-Hisタグ付きヒトHSP70に曝露されたDC2.4細胞を染色し、個々の画像および統合した画像を得た。代表的な視野を200倍の倍率で示す。 HSP70および金標識された77Aに曝露されたDCの電子顕微鏡写真。示されている倍率は10万倍である。 図8A～C。PBSか、または高レベルのHSP70を発現するのでHSP70の優れた供給源であるA-375黒色腫細胞から精製された5μgのADP-HSP70のいずれかで、10μgのIgG2Bまたは77Aと組み合わせて48時間、マウスDC2.4細胞を処理した。RNAを採取し、明細書本文中に記載されているqPCRアレイにcDNAをハイブリダイズさせた。IgG2BとPBSの比較（図8A;上のパネル）および77AとPBSの比較（図8A;下のパネル）のために、2倍以上活性化されたまたは抑制された遺伝子が示されている。3つの生物学的反復からのデータが示されている。次いで、これらの変化によって影響され得る生物学的過程を特定するために、Ingenuity Pathway Analysisを行った（図8B）。次いで、BioRad Bio-Plex（商標）Pro Mouse Cytokine Arrayを用いて、成熟DCによって放出されたサイトカインを分析した。HSP70およびIgG2Bに曝露された細胞と比較したHSP70および77Aに曝露された細胞において誘導された顕著な変化が棒グラフで示されている（図8C）。（図8C）における各群の棒の中で、左の棒はIgG対照（CTRL）を表し、右の棒はHSP70刺激を表す。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図9A～G。BALB/cマウスの4番目の右乳腺中に7,500個のluc-4T1細胞を注射した。12日後、すべてのマウスが触知可能かつ測定可能な腫瘍を有した時点で、200μgのIgG2B（黒塗り四角）または77A（白抜き四角）のいずれかを3週間にわたって週に2回静脈内注射した。原発（図9A）についてはノギスおよび動物全身イメージングの両方を使用して腫瘍体積を測定したが、肺転移（図9B）を評価するためにはイメージングを使用した。末梢血を32日目に収集し、CD4＋およびCD8＋T細胞について評価し（図9C）、二重にCD11c＋/MHCクラスII＋細胞および総MHCクラスII＋細胞についても評価した（図9D）。77Aは、ヒト初代CD4＋およびCD8＋T細胞中へのHSP70の取り込みを誘導する（図9E）。77Aは、MHC非依存性細胞溶解性CD4 T細胞活性を刺激する（図9F）。ヌードマウスにおけるA375黒色腫モデルに対する77A活性（図9G）。 図9-1の説明を参照のこと。 図9-1の説明を参照のこと。 図9-1の説明を参照のこと。 ヌクレオチド結合ドメイン（NBD）においてATPに結合したHSP70は、基質結合ドメイン（SBD）との相互作用を可能にするために開放した立体構造を有する。SBDとの基質ペプチド相互作用は、Jタンパク質およびヌクレオチド交換因子（NEF）と協調して、HSP70ATPアーゼ活性を刺激し、蓋の閉鎖をもたらし、それによって基質とのHSP70の相互作用を安定化させる。出典（Craig＆Marszalek,2017）。HSP70モデル上での77A結合のおよその位置も右パネルに摸式図的に示されている。 図11A～C。HSP70-GFPを発現する4T1細胞の10mLペレットからのホモジネートをADP-アガロースカラムで精製してADP-HSP70-ペプチド複合体を単離し、-24日目にBALB/cマウスの腹腔内に10μgを注射し、-10日目に皮下に追加免疫した。次いで、これらに、図9A～図9Dの凡例のようにHSP70-GFPを発現する4T1-luc細胞を0日目に注射し、動物全身イメージングによって腫瘍増殖をモニターした（図11A）。37日目に、動物を安楽死させた時点で、脾臓細胞を単離し、その日に蛍光標識細胞分取（FACS）によって分析するか、またはHSP70-GFPを発現する放射線照射された4T1細胞の存在下で7日間培養し、次いでFACSによって分析した。脾臓単離時（0日目）および7日の培養後のCD4＋（図11B）およびCD8＋（図11C）T細胞含有量について比較を提供する（左パネル）。生きている野生型4T1細胞またはHSP70-GFPを発現する4T1細胞に表記の細胞画分を曝露した後、生存率研究を行うことによって、細胞傷害性T細胞活性も試験した（右パネル）。 図12A～B。上で詳述したように、4T1細胞またはHSP70-GFPを発現する4T1細胞のいずれかに曝露した後、マウス脾臓から単離されたCD4＋（図12A）およびCD8＋（図12B）T細胞に対してサイトカイン放出アッセイを行った。IFNγ分泌が各上のパネルに示され、IL-2分泌が下のパネルに示されている。 77Aは、FcγR2AおよびFcγR2Bを介したHSP70の取り込みを誘導する。上の列は、ヒトFcγR2Aを発現するHSP70ノックアウトHEK293T細胞を表す。下の列は、示されたヒトFcγ受容体を発現するHSP70ノックアウトHEK293T細胞を表す。 図14A～B。提案された77Aに対する結合部位におけるマウスHSP70の配列（SEQ ID NO：251；位置594～614）およびヒトHSP70の配列（SEQ ID NO：11；位置594～614）が強調表示されている（図14A）。アミノ酸の相違は枠で囲まれている。マウスHSP70における潜在的なリン酸化部位はK595にあり；ヒトHSP70における潜在的なリン酸化部位はK595およびK597にある。マウスHSP70における潜在的なユビキチン化部位はS604、S608、およびY611にあり；ヒトHSP70における潜在的なユビキチン化部位はS608およびY611にある。マウスバージョンを模倣するためのヒトHSP70中の3つのアミノ酸の変異は、ヒトHSP70を認識する77Aの能力を低下させる（図14B）。 図15A～B。77Aの腫瘍標的を示す。4T1細胞を同所性注射されたBALB/cマウスで（A）およびCT26ベースの免疫適格結腸癌モード（B）で、IgG2Bまたは77Aを加えたPLDを評価した。 表記された抗体とのHSP70タンパク質への結合における競合について、抗体77Aをエピトープビニング実験で試験した。図16中の数字は、潜在的に競合する抗体の存在下での最大結合のパーセントを反映している。 バイオレイヤー干渉法（BLI）によって測定された、ADP-HSP70（上）およびATP-HSP70（下）への抗体77Aの結合。 ELISAによって測定された抗体77AのADP-HSP70およびATP-HSP70への結合、ここで、No.1°およびNo.2°は、それぞれ一次抗体または二次抗体が存在しなかった陰性対照を表す。 CT-26腫瘍を有するマウスを表記された抗体で処置した後の腫瘍体積。枠で囲まれた日（14,17,21）は、マウスが処置を受けた日を示す。＊ダネットの多重比較t検定によって決定された場合、アイソタイプ対照（IgG2B）に対してp＝0.0023。 図20A～B。ヒト化バリアントhVH-1～hVH-5（図20A）およびhVL-1～hVL-5（図20B）の配列アラインメントを示す。 総MFI（左）および％GFP陽性細胞（右）によって測定された、HSP70GFP、GFP-Nanobody Alexa-488および示された抗体と共に、示されたヒトFcγ受容体を発現する細胞をインキュベートした後の、HSP70の取り込み。253-77A＝77A;HC1 LC12001＝h77A-1;HC2 LC1＝h77A-6;HC3 LC1＝h77A-11。 総MFI（左）および％GFP陽性細胞（右）によって測定された、HSP70GFP、GFP-Nanobody Alexa-488および示されたIgG2抗体と共に、示されたヒトFcγ受容体を発現する細胞をインキュベートした後の、HSP70の取り込み。253-77A＝77A;HC1 LC1＝h77A-1;HC2 LC1＝h77A-6;HC3 LC1＝h77A-11。 総MFI（左）および％GFP陽性細胞（右）によって測定された、HSP70GFP、GFP-Nanobody Alexa-488および示された抗体と共に、示されたマウスFcγ受容体を発現する細胞をインキュベートした後の、HSP70の取り込み。253-77A＝77A;HC1 LC1＝h77A-1;HC2 LC1＝h77A-6;HC3 LC1＝h77A-11。 総MFI（左）および％GFP陽性細胞（右）によって測定された、HSP70GFP、GFP-Nanobody Alexa-488および示されたIgG2抗体と共に、示されたマウスFcγ受容体を発現する細胞をインキュベートした後の、HSP70の取り込み。253-77A＝77A;HC1 LC1＝h77A-1;HC2 LC1＝h77A-6;HC3 LC1＝h77A-11。 MFI（左）および％GFP陽性細胞（右）によって測定された、HSP70GFP、GFP-Nanobody Alexa-488および示された抗体と共にDCをインキュベートした後の、HSP70の取り込み。結果は、HSP70GFPに対してゲートされた全細胞について示されている。253-77A＝77A;HC1 LC1＝h77A-1;HC2 LC1＝h77A-6;HC3 LC1＝h77A-11。 ％GFP陽性細胞（左）およびMFI（右）によって測定された、HSP70GFP、GFP-Nanobody Alexa-488および示された抗体と共にDCをインキュベートした後の、HSP70の取り込み。結果は、形質細胞様DC、CD303＋ve、CD1C-ve細胞について示されている。253-77A＝77A;HC1 LC1＝h77A-1;HC2 LC1＝h77A-6;HC3 LC1＝h77A-11。 ％GFP陽性細胞（左）およびMFI（右）によって測定された、HSP70GFP、GFP-Nanobody Alexa-488および示された抗体と共にDCをインキュベートした後の、HSP70の取り込み。結果は、1型DC、CD141＋ve、CD1c-ve細胞について示されている。253-77A＝77A;HC1 LC1＝h77A-1;HC2 LC1＝h77A-6;HC3 LC1＝h77A-11。 ％GFP陽性細胞（左）およびMFI（右）によって測定された、HSP70GFP、GFP-Nanobody Alexa-488および示された抗体と共にDCをインキュベートした後の、HSP70の取り込み。結果は、2型DC、CD1C＋ve、CD303-ve細胞について示されている。253-77A＝77A;HC1 LC1＝h77A-1;HC2 LC1＝h77A-6;HC3 LC1＝h77A-11。 図29A～J。ヒト化バリアントhVH-1.1～hVH-1.78（図29A～図29F）およびhVL-1.1～hVL-1.53（図29G～図29J）の配列アラインメントを示す。 図29Aの説明を参照のこと。 図29Aの説明を参照のこと。 図29Aの説明を参照のこと。 図29Aの説明を参照のこと。 図29Aの説明を参照のこと。 図29Aの説明を参照のこと。 図29Aの説明を参照のこと。 図29Aの説明を参照のこと。 図29Aの説明を参照のこと。 CF647色素で標識されたh77A-1-G1m3（「G1m3-CF647」）およびGFPに融合されたHSP70（「HSP70-GFP」）に対するサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）のトレースであり、それぞれ単独で実行し、対応する蛍光チャネルを使用して検出した。ピーク、対応する保持時間および計算されたおよその分子量（＊MW）が示されている。各ピークの分子量は、MW標準曲線から計算された。 抗体およびHSP70の同時インキュベーション後の、CF647色素で標識されたh77A-1-G1m3（「G1m3」）およびGFPに融合されたHSP70（「HSP70-GFP」）のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）トレース。同じ試料を2回走行させ、最初にGFPからの蛍光（左）を検出し、次いで再びCF647からの蛍光（右）を検出した。ピーク、対応する保持時間および計算されたおよその分子量（＊MW）が示されている。各ピークの分子量は、MW標準曲線から計算された。結果は、検出された高分子量ピークにおける抗体およびHSP70の共局在化を示す。 示されたモル比での同時インキュベーション後の、CF647色素で標識されたh77A-1-G1m3（「G1m3-CF647」）およびGFPに融合されたHSP70（「HSP70-GFP」）のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）トレース。CF647からの蛍光の検出についての結果が示されている。ピーク、対応する保持時間および計算されたおよその分子量（＊MW）が示されている。各ピークの分子量は、MW標準曲線から計算された。 示されたモル比での同時インキュベーション後の、CF647色素で標識されたh77A-1-G1m3（「G1m3-CF647」）およびGFPに融合されたHSP70（「HSP70-GFP」）のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）トレース。GFPからの蛍光の検出についての結果が示されている。ピーク、対応する保持時間および計算されたおよその分子量（＊MW）が示されている。各ピークの分子量は、MW標準曲線から計算された。 h77A-1-G1m3およびHSP70を含む高分子量複合体の予測される組成。 図35A～C。ELISAによって測定された、マウスIgG1（「mIgG1」;図35A）、マウスIgG2a（「mIgG2a」;図35B）およびマウスIgG2b（「mIgG2b」;図35C）フォーマットのマウス77A抗体の、単独またはヒトHSP70（「huHSP70」）との複合体でのマウスFcγR3への結合。EC50が示されている。 図35Aの説明を参照のこと。 図35Aの説明を参照のこと。 ELISAによって測定された、ヒト化h77A-1-G1m3抗体（「G1m（3）」）の、単独またはHSP70との複合体でのヒトFcγR2Aへの結合。EC50が示されている。 図37A～C。バイオレイヤー干渉法（BLI）によって測定された、それぞれ単独（「抗体のみ」）またはHSP70との複合体（「複合体」）での、マウス77A抗体のマウスFcγR3への結合（図37A）およびヒト化h77A-1-G1m3抗体のヒトFcγR2aへの結合（図37B）。バイオレイヤー干渉法（BLI）によって測定された、単独（「G1m（3）」）またはHSP70との複合体（「G1m（3）複合体」）での、ヒトFcγR2Aへのh77A-1-G1m3結合の動態（図37C）。 図37Aの説明を参照のこと。 図37Aの説明を参照のこと。 バイオレイヤー干渉法（BLI）によって測定された、市販のCM710.1およびN15F2-5抗体の、それぞれ単独（上のトレース）またはHSP70との複合体（下のトレース）でのマウスFcγR3への結合。 抗体およびHSP70の同時インキュベーション後の、（i）それぞれがCF647色素で標識された、マウスIgG1フォーマット（「mou IgG1」）のN15F2-5（「N15」）またはマウス77A、および（ii）GFPに融合されたHSP70（「HSP70-GFP」）の、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）トレース。同じ試料を2回走行させ、最初にGFPからの蛍光（左）を検出し、次いで再びCF647からの蛍光（右）を検出した。ピーク、対応する保持時間および計算されたおよその分子量（＊MW）が示されている。各ピークの分子量は、MW標準曲線から計算された。 抗体およびHSP70の同時インキュベーション後の、（i）それぞれがCF647色素で標識された、マウスIgG1フォーマット（「mou IgG1」）のCM710.1またはマウス77A、および（ii）GFPに融合されたHSP70（「HSP70-GFP」）の、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）トレース。同じ試料を2回走行させ、最初にGFPからの蛍光（左）を検出し、次いで再びCF647からの蛍光（右）を検出した。ピーク、対応する保持時間および計算されたおよその分子量（＊MW）が示されている。各ピークの分子量は、MW標準曲線から計算された。 FACSによって測定された、ヒトFcγR2Aを形質移入された293細胞における抗体:HSP70-GFP複合体の取り込み。試験された抗体は、ヒトIgG2フォーマットのヒト化h77A-1（「HC1-LC1」）、およびマウスIgG2bLALAPGフォーマットのマウス77A（「LALAPG」;還元型Fc受容体結合変異体）であった。HEL:アイソタイプ対照抗体。y軸:GFP陽性細胞のパーセント、x軸:抗体濃度。ヒトIgG2フォーマットのヒト化h77A-1（「HC1-LC1」）のEC50が示されている。 FACSによって測定された、単球性THP-1細胞における抗体:HSP70-GFP複合体の取り込み。試験された抗体は、ヒトIgG2フォーマットのヒト化h77A-1（「HC1-LC1」）およびIgG1 G1m3フォーマットのヒト化h77A-1（「G1m（3）」）であった。HEL:アイソタイプ対照抗体。y軸:GFP陽性細胞のパーセント、x軸:抗体濃度。 FACSによって測定された、単球性THP-1細胞における抗体:HSP70-GFP複合体の取り込み。試験された抗体は、ヒトIgG1 G1m3-GAフォーマットのh77A-1（「GA」）、ヒトIgG1 G1m3-GAALIEフォーマットのh77A-1（「GAALIE」）、ヒトIgG2フォーマットのh77A-1（「HC1-LC1」）、ヒトIgG1 G1m3フォーマットのh77A-1（「G1m（3）」）およびマウスIgG2bLALAPGフォーマットのマウス77A（「LALAPG」）であった。HEL:アイソタイプ対照抗体。y軸:GFP陽性細胞のパーセント、x軸:抗体濃度。 FACSによって測定された、マウスRAW264.7細胞における抗体:HSP70-GFP複合体の取り込み。試験された抗体は、マウスIgG1（「mIgG1」）、IgG2a（「mIgG2a」）、IgG2b（「mIgG2b」）およびIgG2bLALAPG（「LALAPG」）フォーマットのマウス77Aであった。HEL:アイソタイプ対照抗体。y軸:生きたGFP陽性細胞のパーセント、x軸:抗体濃度。 図44A～B。FACSによって測定された、マウスDC3.2（図44A）およびDC2.4（図44B）細胞における抗体:HSP70-GFP複合体の取り込み。試験された抗体は、マウスIgG1（「mIgG1」）、IgG2a（「mIgG2a」）、IgG2B（「mIgG2b」）およびIgG2bLALAPG（「LALAPG」）フォーマットのマウス77Aであった。HEL:アイソタイプ対照抗体。Y軸:生きたGFP陽性細胞のパーセント、x軸:抗体濃度。 FACSによって測定された、骨髄細胞に由来する初代マウス単球における抗体:HSP70-GFP複合体の取り込み。試験された抗体は、マウスIgG1（「mIgG1」）、IgG2a（「mIgG2a」）、IgG2B（「mIgG2b」）およびIgG2bLALAPG（「LALAPG」）フォーマットのマウス77Aであった。HEL:アイソタイプ対照抗体。Y軸:生きたGFP陽性細胞のパーセント、x軸:抗体濃度。 図46A～C。FACSによって測定された、ヒトマクロファージ細胞（図46A）、単球細胞（図46B）およびマクロファージ細胞（図46C）における抗体:HSP70-GFP複合体の取り込み。試験された抗体は、ヒトIgG1 G1m3（「G1m（3）」）、IgG1 G1m3-GA（「GA」）およびIgG1 G1m3-GAALIEフォーマットのh77A-1であった。HEL:アイソタイプ対照抗体。Y軸:生きたGFP陽性細胞のパーセント、x軸:抗体濃度。 図46Aの説明を参照のこと。 図46Aの説明を参照のこと。 FACSによって測定された、マウスDC3.2樹状細胞における抗体:HSP70-GFP複合体の取り込み。試験された抗体は、マウスIgG1、IgG2aおよびIgG2bフォーマットのN15F2-5、CM170.1およびマウス77A（「253-77A」）であった。HEL:アイソタイプ対照抗体。X軸:GFPを検出するためのAlexa Flour 488-A、y軸:生きた細胞を検出するためのFSC-A。生きたGFP陽性細胞のパーセントが示されている。 FACSによって測定された、マウスMH-Sマクロファージ細胞における抗体:HSP70-GFP複合体の取り込み。試験された抗体は、マウスIgG1、IgG2aおよびIgG2bフォーマットのN15F2-5、CM170.1およびマウス77A（「253-77A」）であった。HEL:アイソタイプ対照抗体。X軸:GFPを検出するためのAlexa Flour 488-A、y軸:生きた細胞を検出するためのFSC-A。生きたGFP陽性細胞のパーセントが示されている。 図49A～C。抗体によるヒトFcγR2Aとの結合。単量体抗体による、または抗原と既に複合体化された抗体によるFcγR2Aとの結合について、操作されたFcバリアントを用量応答滴定で評価した。 図49Aの説明を参照のこと。 図49Aの説明を参照のこと。 初代ヒト単球による、操作されたFcバリアントと複合体化されたHSP70-GFPの取り込み。GFPについて陽性の細胞の数をゲートオンして、生きた集団における陽性細胞の百分率をプロットした。 初代ヒトマクロファージによる、操作されたFcバリアントと複合体化されたHSP70-GFPの取り込み。GFPについて陽性の細胞の数をゲートオンして、生きた集団における陽性細胞の百分率をプロットした。 初代ヒト樹状細胞による、操作されたFcバリアントと複合体化されたHSP70-GFPの取り込み。GFPについて陽性の細胞の数をゲートオンして、生きた集団における陽性細胞の百分率をプロットした。 77A複合体とのインキュベーション後にFACSによって決定されたCD8＋T細胞の増殖。 77A複合体とのインキュベーション後のCD8＋T細胞上のCD25およびHLA＿DR活性化マーカーのFACS分析。77A Fcバリアントと形成されたHSP70の複合体は、同時培養後にCD8＋T細胞における活性化の表現型マーカーの発現を誘導する。 活性化マーカーについての未成熟樹状細胞のFACS分析。77A Fcバリアントと形成されたHSP70の複合体は、77A複合体とのインキュベーション後に、未成熟樹状細胞における活性化の表現型マーカーであるCD83の発現を誘導する。 ヒトFcγRを遺伝子導入した雌C57BL/6マウスに、EG 7-luc腫瘍株を接種した。ルシフェラーゼシグナルについてのイメージングによって腫瘍増殖をモニターした。HSP70-OVA融合タンパク質を、対照アイソタイプ（IsoPAL）、野生型77A IgG1（77AWT）または操作されたFc変異体（77AGA、77AGAALIE）のそれぞれと同時インキュベートし、複合体を形成させた。次いで、マウスを免疫し、タンパク質/複合体で追加免疫した。 処置群別の雌C57BL/6 FcγRトランスジェニック（Tg）マウスの生存曲線。 ヒトFcγRを遺伝子導入した雌C57BL/6マウスに、E0771腫瘍株を接種した。野生型ヒト化77A IgG1抗体または操作されたFcバリアントのそれぞれによる処置前および処置中に腫瘍増殖をモニターした。処置を受けている間、腫瘍増殖をアイソタイプヒトIgG1対照と比較した。「On Tx」領域は、処置を受けている期間を示す。 処置群別の雌C57BL/6 FcγR Tgマウスの生存曲線。「On Tx」領域は、処置を受けている期間を示す。 ヒトFcγRを遺伝子導入した雄C57BL/6マウスに、PANO2-CRE2腫瘍株を接種した。腫瘍増殖（体積）をノギスによって測定した。次いで、処置開始前に10Gyの直接腫瘍X線照射で、マウスにプレコンディショニングを行った。翌日、対照アイソタイプまたは操作されたFc変異体77A抗体のそれぞれによる処置をマウスに開始した。
詳細な説明
本発明は、一部には、ある特定の適応症、例えばがんの処置において有用である抗HSP抗体またはその抗原結合断片の開発に基づく。特定の状況では、抗HSP70抗体（例えば、抗HSP70モノクローナル抗体）またはその抗体断片は、例えば、腫瘍由来抗原に結合した細胞外または可溶性HSP70を免疫細胞（例えば、樹状細胞）に導き、それによってがんを処置し、および/またはがん療法（例えば、がん免疫療法）の有効性を増強し得る。特定の状況では、抗HSP70抗体またはその抗体断片は、例えば、HSP70との高次の（すなわち、1対1より多い）複合体を形成し得る。
本明細書で提供されるデータは、抗HSP70抗体（mAb;クローン77Aと表示される）が表面HSP70発現とは無関係に活性を示し、腫瘍由来抗原を伴う細胞外HSP70をDCに導くことを示す。この抗体は、免疫におけるHSP70の役割をよりよく理解するために、さらには、がん免疫療法の有効性を増強するための治療薬としても、使用することができる。特に、クローン77Aは、免疫適格マウスおよびヌードマウスにおける血液悪性腫瘍および固形腫瘍の両方のモデルにおいて抗腫瘍効果を示すがSCIDマウスとしても知られる自発的プロテインキナーゼDNA活性化触媒サブユニット（PRKDCSCID）変異を有する免疫不全マウスでは示さない、高親和性HSP70 mAbである。本抗体は、インビトロアッセイにおいてDCによるHSP70の細胞内取り込みを増強し、DC成熟に関連する遺伝子の上方制御をもたらす。ICIに対して応答しないマウストリプルネガティブ乳がんの免疫学的にコールドなモデルである同所移植された4T1細胞に対して試験した場合、77Aは、原発性腫瘍増殖を低減させ、肺および肝転移の発生を阻害した。免疫原性細胞死（ICD）を引き起こし、HSP70-腫瘍ペプチド複合体の放出を増強する作用物質であるペグ化リポソームドキソルビシン（PLD）と組み合わせて、77Aは、4T1モデルおよび結腸直腸がんのモデルの両方において一部のマウスを治癒させた。最後に、4T1細胞から精製されたADP-HSP70複合体を77Aとともにワクチンとして使用すると、その後の生きた4T1細胞負荷後の腫瘍増殖は、mAbアイソタイプ対照と比較して阻害され、4T1特異的な細胞溶解性CD4＋およびCD8＋T細胞活性の存在量が増強された。したがって、クローン77A mAbを使用して免疫細胞によるHSP70の取り込みを増強することは、単独で、およびいくつかの合理的に設計された併用レジメンで、抗腫瘍免疫を増強する。
本明細書で提供されるデータはまた、77A抗体およびそのバリアントは、HSP70に結合すると高分子量免疫複合体を形成することを示す。これらの高分子量免疫複合体は、抗体単独よりも強くFc受容体に結合し、抗体単独と比較して、HSP70の細胞取り込みの顕著な増強を示す。他の市販の抗HSP70抗体はこのような高分子量免疫複合体を形成するようには見えないので、高分子量免疫複合体を形成する能力は、単にHSP70結合の機能ではない。したがって、HSP70に結合すると高分子量免疫複合体を形成することができる抗体（例えば、77Aおよびそのバリアント）は、特定の適応症、例えばがんの処置において特に有用であると考えられる。
I. 定義
本明細書で使用される「核酸」、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」または他の文法上の等価物は、互いに共有結合された少なくとも2つのヌクレオチド、すなわちデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかまたはそれらの類似体を意味する。ポリヌクレオチドは、例えば、20、50、100、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000などを含む、任意の長さのポリマーである。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、一般に、ホスホジエステル結合を含有するが、いくつかの事例では、少なくとも1つの異なる結合、例えば、ホスホルアミダート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートまたはO-メチルホスホロアミダイト結合、ならびにペプチド核酸骨格および結合を有し得る核酸類似体が含まれる。天然に存在するポリヌクレオチドおよび類似体の混合物を作製することができ、あるいは、異なるポリヌクレオチド類似体の混合物、ならびに天然に存在するポリヌクレオチドおよび類似体の混合物が作製され得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である:遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA（mRNA）、転移RNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、cRNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに修飾され得る。本用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を含む。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドという用語は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが知られているかまたは予測される2つの相補的な一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。ポリヌクレオチドがRNAである場合、ポリヌクレオチドは、4つのヌクレオチド塩基:アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、チミン（T）、およびチミンに代わるウラシル（U）の特定の配列から構成される。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。別段示されない限り、特定のポリヌクレオチド配列は、明示的に示された配列のみならず、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る。
本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語はまた、天然に存在するアミノ酸ポリマー、修飾残基を含有するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーのみならず、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーにも適用される。本事例では、「ポリペプチド」という用語は、抗体またはその断片を包含する。
本明細書で使用される組換え核酸技術、微生物学、免疫学、抗体工学ならびに分子および細胞生物学の分野で使用される他の用語は、当業者によって一般に理解されるであろう。
本明細書で使用される「1つの（a）」および「1つの（an）」という用語は、「1つまたは複数の（one or more）」を意味し、文脈が不適切でない限り、複数を含む。
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみを指すことが明示的に示されていなければ、またはその選択肢が相互に排他的でなければ、「および/または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢のみおよび「および/または」を指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第2のまたはそれより多くの、を意味し得る。
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者/患畜」という用語は互換的に使用され、本明細書に記載されている方法および組成物によって処置される生物を指す。このような生物には、好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれるが、これらに限定されず、より好ましくはヒトが含まれる。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な化合物（例えば、本開示の化合物）の量を指す。有効量は、1つまたは複数の投与、適用または投与量で投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図しない。
「処置」および「処置すること」という用語は、疾患または健康関連状態の治療的利益を得る目的での対象への治療剤の投与もしくは適用または対象に対する手順もしくはモダリティの実行を指す。これらの用語はまた、症状、疾患、障害などの改善またはそれらの症候の改善をもたらす任意の効果、例えば、軽減、低減、調節、改善または排除を付与する工程を含む。例えば、処置は、HSP70を標的とする抗体の薬学的有効量の投与を、単独で、または化学療法、免疫療法もしくは放射線療法の投与、手術の実施、またはこれらの任意の組み合わせと、組み合わせて含み得る。
「治療上の利益」または「治療上有効な」という用語は、この症状の医学的処置に関して対象の福利を促進または増強する任意のものを指す。これには、疾患の徴候または症候の頻度または重症度の低下が含まれるが、これらに限定されない。例えば、がんの処置は、例えば、腫瘍のサイズの縮小、腫瘍の侵襲性の低下、がんの増殖速度の低下または転移の予防を含み得る。がんの処置はまた、がんを有する対象の生存を延長することを指し得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、組成物をインビボまたはエクスビボでの診断的または治療的使用に特に適したものにする、活性因子と薬学的に許容され得る担体（不活性または活性）との組み合わせを指す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン（例えば、油/水または水/油エマルジョンなど）、および様々な種類の湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれをも指す。組成物はまた、安定剤および保存剤を含むことができる。担体、安定剤および補助剤の例については、例えば、Adeboye Adejare,Remington:The Science and Practice of Pharmacy（23d ed.2020）を参照されたい。
本出願を通じて、「約」という用語は、ある値が、装置に関する誤差の固有の変動、その値を決定するために使用されている方法、研究対象間に存在する変動または表記されている値の10％以内である値を含むことを示すために使用される。
本明細書で使用される場合、指定された成分に関する用語「本質的に含まない」とは、本明細書では、指定された成分のいずれもが意図的に組成物中に調合されておらず、および/または夾雑物としてもしくは微量でのみ存在することを意味するために使用される。したがって、組成物の意図しない汚染に起因する指定された成分の総量は、0.5％を下回り、0.1％を下回り、または0.05％を下回り、好ましくは0.01％を下回る。最も好ましいのは、指定された成分の量が標準的な分析方法では検出できない組成物である。
本明細書の全体を通じて、組成物が特定の成分を有する、含む（including）、もしくは含む（comprising）と記載されている場合、またはプロセスおよび方法が特定の工程を有する、含む（including）、もしくは含む（comprising）と記載されている場合、さらに、列挙された成分から本質的になるか、または列挙された成分からなる本発明の組成物が存在すること、ならびに列挙された処理工程から本質的になるか、または列挙された処理工程からなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが企図される。
本出願においては、要素または構成要素が、列挙された要素もしくは構成要素のリストに含まれるおよび/または列挙された要素もしくは構成要素のリストから選択されると述べられている場合には、要素もしくは構成要素は列挙された要素もしくは構成要素の任意の1つであり得るか、または要素もしくは構成要素は列挙された要素もしくは構成要素の2つ以上からなる群より選択され得ることを理解されたい。
さらに、本明細書に記載されている組成物または方法の要素および/または特徴は、本明細書において明示的または黙示的であるかを問わず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な方法で組み合わせることができることを理解されたい。例えば、特定の化合物に言及が為されている場合、その化合物は、文脈から特に理解されない限り、本発明の組成物の、および/または本発明の方法における様々な態様において使用することができる。換言すれば、本出願内では、態様は、明確かつ簡潔な適用が記述され、描かれることを可能にするように記載および図示されてきたが、態様は、本教示および本発明から逸脱することなく、様々に組み合わされ得るか、または分離され得ることが意図されており、そのように理解されるであろう。例えば、本明細書に記載および図示されているすべての特徴は、本明細書に記載および図示されている本発明のすべての局面に対して適用可能であり得ることが理解されよう。
本発明がなお実施可能である限り、工程の順序または特定の動作を実行するための順序は重要ではないことを理解されたい。さらに、2つ以上の工程または動作は同時に行われてもよい。
本明細書におけるあらゆる例、または例示的な言語、例えば「など」または「含む」の使用は、単に本発明をよりよく例示することを意図しており、特許請求されていなければ、本発明の範囲に対して限定を加えるものではない。本明細書中のいかなる言語も、特許請求されていない要素を本発明の実施に不可欠なものとして示すと解釈されるべきではない。
用語「含む（include）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（have）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contain）」、「含有する（contains）」または「含有する（containing）」の使用は、これらの文法上の等価物を含めて、一般に、制限のない、非限定的なものとして理解されるべきであり、例えば、特に明記しない限り、または文脈から理解されない限り、列挙されていないさらなる要素または工程を除外しない。
II. 抗体および抗体の修飾
表1、6、10および11に例示される重鎖および軽鎖由来のクローンと対のCDRを有するモノクローナル抗体が本明細書において提供される。このような抗体は、本明細書中に記載される方法を使用して作製され得る。
本発明のモノクローナル抗体は、HSP70を検出する上で使用するための、およびHSP70の増加したレベルを伴う疾患を処置するための診断キットの製造を含む、いくつかの用途を有する。これらの文脈においては、このような抗体を診断剤もしくは治療剤に連結させ得るか、このような抗体を競合アッセイにおいて捕捉剤または競合剤として使用し得るか、またはこのような抗体に追加の作用物質を付着させることなくこのような抗体を個別に使用し得る。抗体は、以下でさらに論じるように、変異され得るか、または修飾され得る。抗体を調製し、性質を決定するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988;米国特許第4,196,265号参照）。
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも1つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、この用語は、完全な状態のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、その断片（Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv、Fd、Fd'、単鎖抗体（ScFv）、ダイアボディ、直鎖抗体など）、その変異体、天然に存在するバリアント、必要とされる特異性の抗原認識部位を有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成も包含する。
「単離された抗体」は、その自然環境の成分から分離および/または回収された抗体である。その自然環境の夾雑成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨げる材料であり、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。特定の例では、抗体は、（1）Lowry法によって決定された場合に、重量基準で95％超、最も具体的には重量基準で99％超の抗体になるように、または（2）クーマシーブルーもしくは銀染色を使用した還元もしくは非還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性になるように精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないので、組換え細胞内のインサイチューでの抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程によって調製される。
基本的な4本鎖抗体単位は、2つの同一の軽（L）鎖および2つの同一の重（H）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。本明細書で使用される「重鎖」という用語は、そのアミノ末端領域を介して免疫グロブリン軽鎖と会合するより大きな免疫グロブリンサブユニットを指す。重鎖は、可変領域（VH）および定常領域（CH）を含む。定常領域は、CH1、ヒンジ、CH2およびCH3ドメインをさらに含む。IgE、IgMおよびIgYの場合には、重鎖はCH4ドメインを含むが、ヒンジドメインを有しない。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、それらの中にいくつかのサブクラスがある（例えば、γ1～γ4、α1～α2）ことを理解するであろう。抗体の「クラス」をそれぞれIgG、IgM、IgA IgDまたはIgEとして決定することは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1などは、十分に特徴付けられており、機能的特殊化を付与することが知られている。
本明細書で使用される「軽鎖」という用語は、重鎖のアミノ末端領域と会合するより小さな免疫グロブリンサブユニットを指す。重鎖と同様に、軽鎖は可変領域（VL）および定常領域（CL）を含む。軽鎖は、その定常ドメイン（CL）のアミノ酸配列に基づいて、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。これらの対は、様々な重鎖のいずれかの対と会合して免疫グロブリン分子を形成することができる。カッパ定常領域（C-カッパ）に連結されたラムダ可変領域（V-ラムダ）またはラムダ定常領域（C-ラムダ）に連結されたカッパ可変領域（V-カッパ）を有する軽鎖も軽鎖の意義に包含される。
IgM抗体は、例えば、J鎖と呼ばれるさらなるポリペプチドと共に5個の基本的ヘテロ四量体単位からなり、したがって10個の抗原結合部位を含有するのに対して、分泌されるIgA抗体は重合して、J鎖と共に2～5個の基本的4鎖単位を含む多価集合体を形成することができる。IgGの場合には、4鎖単位は一般に約15万ダルトンである。各L鎖は、1つの共有ジスルフィド結合によってH鎖に連結され、2つのH鎖は、H鎖アイソタイプに応じて1つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに連結される。各H鎖およびL鎖はまた、規則的に間隔を置いて配置された鎖内ジスルフィド架橋を有する。各H鎖は、N末端に可変領域（VH）を有し、その後にアルファ鎖およびガンマ鎖のそれぞれについては3つの定常ドメイン（CH）が続き、ミューおよびアイソタイプについては4つのCHドメインが続く。各L鎖は、N末端に可変領域（VL）を有し、続いて、その他端に定常ドメイン（CL）を有する。VLはVHと整列し、CLは重鎖の第1の定常ドメイン（CH1）と整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域の間に界面を形成すると考えられている。VHとVLの対形成は、一緒に、単一の抗原結合部位を形成する。様々なクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology,8th edition,Daniel P.Stites,Abba I.Terr and Tristram G.Parslow（eds.）,Appleton＆Lange,Norwalk,Conn.,1994,page 71,and Chapter 6を参照されたい。
抗体の「可変領域」とは、単独でまたは組み合わせて、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。「可変」という用語は、可変領域のある特定のセグメントの配列が抗体間で大きく異なるという事実を指す。軽鎖部分（VL）および重鎖部分（VH）の両方の可変領域は、抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変領域の全体にわたって均等に分布していない。代わりに、可変領域は、相補性決定領域（CDR）または超可変領域と呼ばれる極端な可変性のより短い領域によって隔てられたフレームワーク領域（FR）と呼ばれる比較的不変の連なりからなる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、主にベータシート立体構造を採る4つのFRを含み、4つのFRは、ベータシート構造を接続するループ、いくつかの事例ではベータシート構造の一部を形成するループを形成する3つのCDRによって接続されている。CDRは、抗原の形状を相補し、抗原に対する抗体の親和性および特異性を決定する。VLおよびVHの両方に6つのCDRが存在する。各鎖中のCDRは、FRによって近接してまとめられ、他方の鎖のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.（1991）を参照）。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「CDR」からのアミノ酸残基（例えば、Kabat付番システムに従って付番した場合、VL中の概ね残基24～34（L1）、50～56（L2）および89～97（L3）、ならびにVH中の概ね31～35（H1）、50～65（H2）および95～102（H3）;Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.（1991））;および/または「超可変ループ」からの残基（例えば、Chothia付番システムに従って付番した場合、VL中の残基24～34（L1）、50～56（L2）および89～97（L3）、ならびにVH中の26～32（H1）、52～56（H2）および95～101（H3）;Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917（1987））;および/または「超可変ループ」/CDRからの残基（例えば、IMGT付番システムに従って付番した場合、VL中の残基27～38（L1）、56～65（L2）および105～120（L3）、ならびにVH中の27～38（H1）、56～65（H2）および105～120（H3）;Lefranc,M.P.et al.Nucl.Acids Res.27:209-212（1999）,Ruiz,M.et al.Nucl.Acids Res.28:219-221（2000））を含む。任意で、抗体は、AHoに従って付番された場合、VL中の以下の点28、36（L1）、63、74～75（L2）および123（L3）、ならびにVH中の28、36（H1）、63、74～75（H2）および123（H3）の1つまたは複数に対称的な挿入を有する;Honneger,A.and Plunkthun,A.J.Mol.Biol.309:657-670（2001））。本明細書で使用される場合、CDRは、これらの付番アプローチのいずれかによって、またはアプローチの組み合わせによって、または他の望ましいアプローチによって定義されるCDRを指し得る。さらに、高度に保存されたコア、境界および超可変領域の新しい定義を使用することができる。
抗体の「定常領域」とは、単独でまたは組み合わせて、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。軽鎖（CL）および重鎖（IgMおよびIgEの場合には、CH1、CH2またはCH3またはCH4）の定常領域は、分泌、経胎盤移動、Fc受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの付番は、定常領域ドメインが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて増加する。定常領域は、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ADCC）、抗体依存性細胞食作用（ADCP）、抗体依存性好中球食作用（ADNP）および抗体依存性補体沈着（ADCD）における抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。
抗体は抗体断片であり得る。「抗体断片」は、完全な状態の抗体の一部のみを含み、一般に、完全な状態の抗体の抗原結合部位を含み、したがって抗原に結合する能力を保持する。本定義によって包含される抗体断片の例としては、（i）VL、CL、VHおよびCH1ドメインを有するFab断片;（ii）CH1ドメインのC末端に1つまたは複数のシステイン残基を有するFab断片である、Fab'断片;（iii）VHおよびCH1ドメインを有するFd断片;（iv）VHおよびCH1ドメインならびにCH1ドメインのC末端に1つまたは複数のシステイン残基を有するFd'断片;（v）単一抗体のVLおよびVHドメインを有するFv断片;（vi）VHドメインからなるdAb断片;（vii）単離されたCDR領域;（viii）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab'断片を含む二価断片であるF（ab'）2断片;（ix）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Fv;scFv）;（x）同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（VL）に連結された重鎖可変ドメイン（VH）を含む、2つの抗原結合部位を有する「ダイアボディ」;（xi）相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって抗原結合領域の対を形成する直列Fdセグメント（VH-CH1-VH-CH1）の対を含む「直鎖抗体」が挙げられる。
抗体は、キメラ抗体であり得る。「キメラ抗体」は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの1つの部分が、特定の種に由来する抗体または特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に相同であるが、鎖の残りのセグメントが別の抗体中の対応する配列に相同である抗体を指す。例えば、キメラ抗体は、異種の非ヒト、ヒトまたはヒト化配列（例えば、フレームワークおよび/または定常ドメイン配列）に移植された非ヒトドナー由来の抗原結合配列を含む抗体であり得る。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖および重鎖の両方の可変領域が、1つの種の哺乳動物に由来する抗体の可変領域を模倣するが、定常部分は、別の種に由来する抗体中の配列と相同である。例えば、モノクローナル抗体の軽鎖定常ドメインおよび重鎖定常ドメインをヒト起源の類似ドメインで置き換え、外来抗体の可変領域を無傷の状態に保つ方法が開発されている。あるいは、「完全ヒト」モノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子について遺伝子導入されたマウス中で産生され得る。げっ歯類、例えばマウスおよびヒトの両方のアミノ酸配列を有する抗体可変ドメインを組換え的に構築することによって、モノクローナル抗体の可変ドメインをよりヒト型に変換するための方法も開発されている。「ヒト化」モノクローナル抗体では、超可変CDRのみがマウスモノクローナル抗体に由来し、フレームワークおよび定常領域はヒトアミノ酸配列に由来する（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,091,513号および同第6,881,557号を参照）。げっ歯類に特徴的な抗体中のアミノ酸配列をヒト抗体の対応する位置に見出されるアミノ酸配列で置き換えることにより、治療的使用中の有害免疫反応の可能性が低減すると考えられる。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞はまた、ハイブリドーマによって産生される抗体の結合特異性を変化させ得るかまたは変化させ得ない遺伝子変異またはその他の変化も受け得る。
A. モノクローナル抗体
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して作られる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して作られた異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して作られている。モノクローナル抗体の特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって夾雑されずに合成され得るという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本開示において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495（1975）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって調製され得るか、または抗原特異的B細胞、感染症もしくは免疫化に応答する抗原特異的形質芽細胞の単一細胞選別、もしくはバルク選別された抗原特異的収集物中の単一細胞からの連結された重鎖および軽鎖の捕捉後に、細菌、真核生物の動物もしくは植物細胞における組換えDNA法（例えば、米国特許第4,816,567号）を使用して作製され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628（1991）およびMarks et al., J.Mol.Biol. 222:581-597（1991）に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
ヒト化、キメラおよび完全ヒトを含む様々なタイプのモノクローナル抗体を生産するための方法は、当技術分野で周知であり、高度に予測可能である。例えば、以下の米国特許および特許出願は、そのような方法の実施可能な記載を提供する:米国特許出願第2004/0126828号および同第2002/0172677号;ならびに米国特許第3,817,837号;同第3,850,752号;同第3,939,350号;同第3,996,345号;同第4,196,265号;同第4,275,149号;同第4,277,437号;同第4,366,241号;同第4,469,797号;同第4,472,509号;同第4,606,855号;同第4,703,003号;同第4,742,159号;同第4,767,720号;同第4,816,567号;同第4,867,973号;同第4,938,948号;同第4,946,778号;同第5,021,236号;同第5,164,296号;同第5,196,066号;同第5,223,409号;同第5,403,484号;同第5,420,253号;同第5,565,332号;同第5,571,698号;同第5,627,052号;同第5,656,434号;同第5,770,376号;同第5,789,208号;同第5,821,337号;同第5,844,091号;同第5,858,657号;同第5,861,155号;同第5,871,907号;同第5,969,108号;同第6,054,297号;同第6,165,464号;同第6,365,157号;同第6,406,867号;同第6,709,659号;同第6,709,873号;同第6,753,407号;同第6,814,965号;同第6,849,259号;同第6,861,572号;同第6,875,434号;同第6,891,024号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
B. 単鎖抗体
単鎖可変断片（scFv）は、短いリンカーで一緒に連結された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合物である。このキメラ分子は、定常領域の除去およびリンカーペプチドの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。この修飾は通常、特異性を変化させないままに保つ。scFvは、ハイブリドーマまたはB細胞に由来するサブクローニングされた重鎖および軽鎖から直接作製することができる。単鎖可変断片は、完全な抗体分子中に見られる定常Fc領域を欠き、したがって抗体を精製するために使用される共通の結合部位（例えば、タンパク質A/G）を欠く。プロテインLはカッパ軽鎖の可変領域と相互作用するので、これらの断片は、しばしば、プロテインLを使用して精製/固定化することができる。
フレキシブルリンカーは、一般に、アラニン、セリンおよびグリシンなどの、ヘリックスおよびターン促進アミノ酸残基から構成される。しかしながら、他の残基も同様に機能することができる。例えば、リンカーは、VHC末端の2残基後にプロリン残基を有し、他の位置に豊富なアルギニンおよびプロリンを有し得る。
単鎖抗体はまた、非ペプチドリンカーまたは化学単位を使用して受容体軽鎖および重鎖を連結することによって作製され得る。一般に、軽鎖および重鎖は、別個の細胞中で産生され、精製され、続いて適切な様式で一緒に連結される（すなわち、重鎖のN末端は、適切な化学架橋を介して軽鎖のC末端に付着されている）。
2つの異なる分子、例えば、安定化剤と凝固剤の官能基を結合する分子架橋を形成するために、架橋試薬が使用される。しかしながら、同じ類似体の二量体もしくは多量体または異なる類似体から構成されるヘテロマー複合体を作製することができると考えられる。2つの異なる化合物を段階的に連結するために、望ましくないホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤を使用することができる。
例示的なヘテロ二官能性架橋剤は、2つの反応性基を含有し、一方は第一級アミン基と反応し（例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド）、他方はチオール基と反応する（例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）。第1級アミン反応性基を介して、架橋剤は、1つのタンパク質（例えば、選択された抗体または断片）のリジン残基と反応し得、既に第1のタンパク質に結合されている架橋剤は、チオール反応性基を介して、他のタンパク質（例えば、選択剤）のシステイン残基（遊離のスルフヒドリル基）と反応する。
血液中で合理的な安定性を有する架橋剤が使用されることが好ましい。標的化剤および治療/予防剤をコンジュゲートするために首尾よく使用することができる多くの種類のジスルフィド結合含有リンカーが公知である。立体的に妨害されたジスルフィド結合を含有するリンカーは、インビボでより大きな安定性を与え、作用部位に到達する前に標的化ペプチドの放出を妨げることが判明し得る。したがって、これらのリンカーは連結剤の1つの群である。
例えば、SMPTは、隣接するベンゼン環およびメチル基によって「立体的に妨害された」ジスルフィド結合を含有する二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体的妨害は、組織および血液中に存在し得るグルタチオンなどのチオラートアニオンによる攻撃から結合を保護する機能を果たし、それにより、結合された作用物質を標的部位に送達する前にコンジュゲートの分離を防止するのに役立つと考えられる。SMPT架橋試薬は、多くの他の公知の架橋試薬と同様に、システインのSHまたは第一級アミン（例えば、リジンのεアミノ基）などの官能基を架橋する能力を付与する。別の可能な種類の架橋剤としては、スルホスクシンイミジル-2-（p-アジドサリチルアミド）エチル-1,3'-ジチオプロピオナートなどの切断可能なジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性光反応性フェニルアジドが挙げられる。N-ヒドロキシ-スクシンイミジル基は第一級アミノ基と反応し、フェニルアジド（光分解時）は任意のアミノ酸残基と非選択的に反応する。
妨害された架橋剤に加えて、妨害されていないリンカーも本明細書に従って使用することができる。保護されたジスルフィドを含有または生成するとは考えられない他の有用な架橋剤としては、SATA、SPDPおよび2-イミノチオランが挙げられる。このような架橋剤の使用は、当技術分野で十分に理解されている。フレキシブルリンカーも使用され得る。
米国特許第4,680,338号は、アミン含有ポリマーおよび/またはタンパク質とのリガンドのコンジュゲートを生成するために、特にキレート剤、薬物、酵素、検出可能な標識などとの抗体コンジュゲートを形成するために有用な二官能性リンカーを記載している。米国特許第5,141,648号および同第5,563,250号は、様々な穏やかな条件下で切断可能である不安定な結合を含有する切断可能なコンジュゲートを開示している。関心対象の作用物質がリンカーに直接結合され得、切断が活性な作用物質の放出をもたらす点で、このリンカーは特に有用である。特定の用途には、遊離アミノまたは遊離スルフヒドリル基を抗体などのタンパク質または薬物に付加することが含まれる。
米国特許第5,856,456号は、融合タンパク質、例えば単鎖抗体を作製するためにポリペプチド構成成分を連結する際に使用するためのペプチドリンカーを提供する。該リンカーは、最大約50アミノ酸長であり、荷電アミノ酸（好ましくは、アルギニンまたはリジン）に続くプロリンの少なくとも1つの存在を含有し、より大きな安定性および低下した凝集を特徴とする。米国特許第5,880,270号は、様々な免疫診断および分離技術において有用なアミノオキシ含有リンカーを開示している。
C. 二重特異性および多重特異性抗体
抗体は、二重特異性または多重特異性であり得る。「二重特異性抗体」は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、単一抗原の2つの異なるエピトープに結合し得る。他のそのような抗体は、第1の抗原結合部位を第2の抗原に対する結合部位と組み合わせ得る。あるいは、感染細胞に細胞防御機構を集中させ、局在化させるために、抗原特異的アームは、白血球上のトリガー分子、例えばT細胞受容体分子（例えば、CD3）、またはIgGに対するFc受容体（FcγR）、例えばFcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）およびFcγRIII（CD16）に結合するアームと組み合わされ得る。二重特異性抗体はまた、感染細胞に細胞傷害剤を局在化させるために使用され得る。これらの抗体は、抗原結合アームと、細胞傷害剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームとを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、F（ab'）2二重特異性抗体）として調製することができる。Taki et al.（2015）は、二重特異性抗HSP70/抗CD3抗体を記載している。
二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な作製は、2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の共発現に基づいており、2つの鎖は異なる特異性を有する。免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、10個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、そのうちの1つのみが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって行われる正しい分子の精製は、かなり面倒であり、生成物の収率は低い。
異なるアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変領域（抗体-抗原結合部位）が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。好ましくは、融合は、ヒンジ、CH2およびCH3領域の少なくとも一部を含むIg重鎖定常ドメインとの融合である。融合物の少なくとも1つ中に存在する、軽鎖結合のために必要な部位を含有する第1の重鎖定常領域（CH1）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および所望であれば免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを別々の発現ベクター中に挿入し、適切な宿主細胞中に同時形質移入する。構築において使用される3つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率を与える場合に、これは、3つのポリペプチド断片の相互割合を調整する上でより大きな柔軟性を提供する。しかしながら、等しい比率での少なくとも2つのポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合、または比率が所望の鎖の組み合わせの収率に対して著しい影響を及ぼさない場合には、2つのまたは3つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を単一の発現ベクター中に挿入することが可能である。
二重特異性抗体は、一方のアーム中の第1の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対（第2の結合特異性を与える）とから構成され得る。二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在すると容易な分離方法が提供されるので、この非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にする。このアプローチは、国際公開第94/04690号に開示されている。二重特異性抗体の作製のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210（1986）を参照のこと。
米国特許第5,731,168号に記載されている別のアプローチによれば、抗体分子の対間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化するように操作することができる。好ましい界面は、CH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1の抗体分子の界面からの1つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって、大きい側鎖と同一または類似のサイズの代償的な「空洞」が第2の抗体分子の界面上に作り出される。これは、ホモ二量体などの他の望ましくない最終生成物よりもヘテロ二量体の収率を増加させる機構を提供する。
二重特異性抗体には、架橋された抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方をアビジンに、他方をビオチンに結合させることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に向かわせることが企図されている（米国特許第4,676,980号）。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋方法を用いて作製され得る。適切な架橋剤は当技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術と共に、米国特許第4,676,980号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を作製するための技術も文献に記載されている。例えば、化学結合を用いて二重特異性抗体を調製することができる。Brennan et al., Science, 229:81（1985）は、完全な状態の抗体をタンパク質分解的に切断してF（ab'）2断片を生成する手順を記載している。近接するジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止するために、これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。次いで、生成されたFab'断片は、チオニトロベンゾアート（TNB）誘導体に変換される。次いで、メルカプトエチルアミンでの還元によってFab'-TNB誘導体の一方をFab'-チオールに再変換し、等モル量の他方のFab'-TNB誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための作用物質として使用することができる。
二重特異性抗体を形成するために化学的に結合されることができるFab'-SH断片の大腸菌からの直接的回収を容易にする技術が存在する。Shalaby et al., J.Exp. Med., 175:217-225（1992）は、ヒト化二重特異性抗体F（ab'）2分子の作製を記載している。各Fab'断片を大腸菌から別々に分泌し、インビトロでの指向性化学結合に供して二重特異性抗体を形成させた。このようにして形成された二重特異性抗体は、ErbB2受容体を過剰発現する細胞および正常なヒトT細胞に結合することができる他、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性の引き金を引くことができた。
組換え細胞培養から直接二重特異性抗体断片を作製および単離するための様々な技術も記載されている（Merchant et al., Nat.Biotechnol. 16,677-681（1998））。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて作製されている（Kostelny et al., J.Immunol., 148（5）:1547-1553,1992）。遺伝子融合によって、FosおよびJunタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを2つの異なる抗体のFab'部分に連結した。抗体ホモ二量体をヒンジ領域において還元してモノマーを形成し、次いで再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の作製にも利用することができる。Hollinger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:6444-6448（1993）によって記載された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替の機構を提供した。この断片は、同じ鎖上の2つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーによってVLに接続されたVHを含む。したがって、1つの断片のVHおよびVLドメインは、別の断片の相補的なVLおよびVHドメインと対形成させられ、それにより、2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv（sFv）二量体の使用によって二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Gruber et al., J.Immunol., 152:5368（1994）を参照されたい。
二重特異性または多重特異性抗体は、DOCK-AND-LOCK（商標）（DNL（商標））複合体として形成され得る（例えば、米国特許第7,521,056号;同第7,527,787号;同第7,534,866号;同第7,550,143号および同第7,666,400号を参照）。一般に、この技術は、cAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）の調節（R）サブユニットの二量体化およびドッキングドメイン（DDD）配列と、種々のAKAPタンパク質のいずれかに由来するアンカードメイン（AD）配列との間で生じる特異的かつ高親和性の結合相互作用を利用する（Baillie et al., FEBS Letters. 2005;579:3264;Wong and Scott, Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 2004;5:959）。DDDおよびADペプチドは、任意のタンパク質、ペプチドまたはその他の分子に結合され得る。DDD配列は自発的に二量体化してAD配列に結合するので、この技術は、DDDまたはAD配列に結合され得る任意の選択された分子間での複合体の形成を可能にする。
2つより多くの結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Tutt et al., J.Immunol. 147:60,1991;Xu et al., Science,358（6359）:85-90,2017）。これらの抗体はまた、受容体の二量体化または多量体化を可能にする配列または部分を含み得る。このような配列には、J鎖と共に多量体の形成を可能にする、IgAに由来する配列が含まれる。別の多量体化ドメインは、Gal4二量体化ドメインである。
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速く内部移行（および/または異化）され得る。本開示の抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に産生され得る、3つまたはそれより多くの抗原結合部位（例えば、四価抗体）を有する多価抗体であり得る。多価抗体は、二量体化ドメインおよび3つまたはそれより多くの抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体化ドメインは、Fc領域またはヒンジ領域を含む（またはそれからなる）。このシナリオでは、抗体は、Fc領域と、Fc領域に対してアミノ末端にある3つまたはそれより多くの抗原結合部位とを含む。多価抗体は、3～約8個、例えば4個の抗原結合部位を含み得る（またはそれらからなり得る）。多価抗体は、少なくとも1つのポリペプチド鎖（好ましくは2つのポリペプチド鎖）を含み、ポリペプチド鎖は2つまたはそれより多くの可変領域を含む。例えば、ポリペプチド鎖は、VD1-（X1）n-VD2-（X2）n-Fcを含み得、VD1は第1の可変領域であり、VD2は第2の可変領域であり、FcはFc領域の1つのポリペプチド鎖であり、X1およびX2はアミノ酸またはポリペプチドを表し、nは0または1である。例えば、ポリペプチド鎖は、VH-CH1-フレキシブルリンカー-VH-CH1-Fc領域鎖またはVH-CH1-VH-CH1-Fc領域鎖を含み得る。本明細書における多価抗体は、少なくとも2つ（好ましくは4つ）の軽鎖可変領域ポリペプチドをさらに含み得る。本明細書における多価抗体は、例えば、約2～約8個の軽鎖可変領域ポリペプチドを含み得る。本明細書で企図される軽鎖可変領域ポリペプチドは、軽鎖可変領域を含み、任意でCLドメインをさらに含む。
電荷修飾は、多重特異性抗体の状況において特に有用であり、Fab分子におけるアミノ酸置換は、Fabをベースとする二重/多重特異性抗原結合分子の結合アームの1つ（2つより多くの抗原結合Fab分子を含む分子の場合には、1つより多く）におけるVH/VL交換を伴うFabをベースとする二重/多重特異的抗原結合分子の作製において生じ得る合致しない重鎖との軽鎖の誤対合（ベンス・ジョーンズ型副生成物）の低下をもたらす（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる国際公開第2015/150447号、特にその中の実施例も参照されたい。）。
D. 抗体コンジュゲート
本開示の抗体は、抗体コンジュゲートを形成するために少なくとも1つの作用物質に連結され得る。コンジュゲートは、例えば、別のタンパク質性分子、炭水化物分子、脂質分子または混合部分分子にコンジュゲートされた抗体であり得る。このような抗体コンジュゲートには、抗体を1つまたは複数のポリマーに連結することを含む修飾が含まれるが、これらに限定されない。例えば、抗体は、1つまたは複数の水溶性ポリマーに連結され得る。水溶性ポリマーへの結合は、抗体が生理学的環境などの水性環境中で沈殿する可能性を低下させる。当業者は、ポリマー/抗体コンジュゲートが患者の処置において使用されるかどうか、使用される場合には、抗体の薬理学的プロファイル（例えば、半減期、投与量、活性、抗原性および/または他の因子）を含むがこれらに限定されない考慮事項に基づいて、適切な水溶性ポリマーを選択することができる。
診断剤または治療剤としての抗体分子の有効性を増加させるために、少なくとも1つの所望の分子または部分を連結または共有結合または複合体化することが従来から行われている。このような分子または部分は、少なくとも1つのエフェクターまたはレポーター分子であり得るが、これらに限定されない。エフェクター分子は、所望の活性、例えば細胞傷害活性を有する分子を含む。抗体に結合されてきたエフェクター分子の非限定的な例としては、毒素、抗腫瘍剤、治療用酵素、放射性核種、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、成長因子、およびオリゴまたはポリヌクレオチドが挙げられる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを使用して検出され得る任意の部分として定義される。抗体にコンジュゲートされてきたレポーター分子の非限定的な例としては、酵素、放射性標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、光親和性分子、着色された粒子またはリガンド、（例えば、比色または蛍光定量反応を触媒する）酵素、基質、固体マトリックス、例えばビオチンが挙げられる。抗体は、これらの標識のいずれかの1つ、2つまたはそれより多くを含み得る。
抗体コンジュゲートは、細胞傷害剤を標的細胞に送達するために使用され得る。このタイプの細胞傷害剤は、抗体媒介性細胞傷害性を改善し得、細胞死を直接的または間接的に刺激するサイトカイン、放射性同位元素、化学療法薬（プロドラッグを含む）、細菌性毒素（例えば、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素など）、植物毒素（例えば、リシン、ゲロニンなど）、化学的コンジュゲート（例えば、メイタンシノイド毒素、アウリスタチン、α-アマニチン、アントラサイクリン、カリケアマイシンなど）、放射性コンジュゲート、酵素コンジュゲート（例えば、RNaseコンジュゲート、グランザイム抗体指向性酵素/プロドラッグ療法）などの部分を含み得る。
抗体コンジュゲートは診断剤としても使用される。抗体診断は、一般に、2つのクラス、様々なイムノアッセイなどのインビトロ診断において使用するためのもの、および一般に「抗体指向性イメージング」として知られるインビボ診断プロトコルにおいて使用するためのものに属する。抗体へのイメージング剤の結合のための方法と同様に、多くの適切なイメージング剤が当技術分野で公知である（例えば、米国特許第5,021,236号、同第4,938,948号および同第4,472,509号を参照）。使用されるイメージング部分は、常磁性イオン、放射性同位体、蛍光色素、NMR検出可能な物質およびX線イメージング剤であり得る。
コンジュゲートとしての使用が想定される常磁性イオンには、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）および/またはエルビウム（III）が含まれ、ガドリニウムが特に好ましい。X線イメージングなどの他の状況で有用なイオンには、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）およびビスマス（III）が含まれるが、これらに限定されない。
コンジュゲートとしての使用が想定される放射性同位体としては、アスタチン211、14炭素、51クロム、36塩素、57コバルト、58コバルト、銅67、152Eu、ガリウム67、3水素、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、59鉄、32リン、レニウム186、レニウム188、75セレン、35硫黄、テクネチウム99mおよび/またはイットリウム90が挙げられる。125Iがしばしば好ましい。テクネチウム99mおよび/またはインジウム111も、エネルギーが低く、長距離検出に適しているため、しばしば好ましい。本開示の放射性標識されたモノクローナル抗体は、当技術分野で周知の方法に従って製造され得る。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウムおよび/またはヨウ化カリウムおよび次亜塩素酸ナトリウムなどの化学的酸化剤またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素的酸化剤との接触によってヨウ素化することができる。本開示によるモノクローナル抗体は、例えば、パーテクナートをスズ溶液で還元し、還元されたテクネチウムをSephadexカラム上にキレート化し、抗体をこのカラムに適用することによるリガンド交換過程によってテクネチウム99mで標識され得る。あるいは、例えば、パーテクナート、SNCl2などの還元剤、フタル酸ナトリウム-カリウム溶液などの緩衝液および抗体をインキュベートすることによって、直接標識技術が使用され得る。金属イオンとして存在する放射性同位体を抗体に結合するためにしばしば使用される中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）である。
コンジュゲートとしての使用が想定される蛍光標識としては、Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5,6-FAM、フルオレセインイソチオシアネート、HEX、6-JOE、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、Pacific Blue、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、Renographin、ROX、TAMRA、TET、テトラメチルローダミンおよび/またはテキサスレッドが挙げられる。
本開示において想定されるさらなる種類の抗体は、主にインビトロでの使用を意図した抗体であり、抗体は、発色性基質と接触すると呈色した生成物を生成する二次結合リガンドにおよび/または酵素（酵素タグ）に連結されている。好適な酵素の例としては、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋ワサビ）水素ペルオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼが挙げられる。好ましい二次結合リガンドは、ビオチンおよびアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。
抗体をそのコンジュゲート部分に結合またはコンジュゲートするためのいくつかの方法が当技術分野で公知である。いくつかの結合方法は、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸無水物（DTPA）;エチレントリアミン四酢酸;N-クロロ-p-トルエンスルホンアミド;および/または抗体に結合されたテトラクロロ-3α-6α-ジフェニルグリコウリル-3（米国特許第4,472,509号および同第4,938,948号）などの有機キレート剤を使用する金属キレート錯体の使用を含む。モノクローナル抗体は、グルタルアルデヒドまたはパーイオダートなどのカップリング剤の存在下で酵素と反応させることもできる。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアナートとの反応によって調製される。米国特許第4,938,948号では、乳房腫瘍のイメージングはモノクローナル抗体を使用して達成され、検出可能なイメージング部分は、メチル-p-ヒドロキシベンズイミダートまたはN-スクシンイミジル-3-（4-ヒドロキシフェニル）プロピオナートなどのリンカーを使用して抗体に結合される。
抗体への分子の部位特異的結合の別の公知の方法は、ハプテンをベースとする親和性標識との抗体の反応を含む。本質的に、ハプテンをベースとする親和性標識は、抗原結合部位中のアミノ酸と反応し、それによってこの部位を破壊し、特異的抗原反応を遮断する。しかしながら、これは、抗体コンジュゲートによる抗原結合の喪失をもたらすので、有利でないことがあり得る。
低強度紫外光によって生成される反応性ニトレン中間体を介してタンパク質に共有結合を形成するために、アジド基を含有する分子も使用され得る。特に、粗細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質を同定するための部位特異的光プローブとして、プリンヌクレオチドの2-および8-アジド類似体が使用されてきた。2-および8-アジドヌクレオチドはまた、精製されたタンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマッピングするために使用されており、抗体結合剤として使用され得る。
抗体結合部位を変化させない反応条件を使用して、免疫グロブリンのFc領域にスルフヒドリル基を選択的に導入することによる免疫グロブリンの誘導体化も想定される。この方法論に従って作製された抗体コンジュゲートは、改善された寿命、特異性および感度を示すことが開示されている（米国特許第5,196,066号）。レポーターまたはエフェクター分子がFc領域中の炭水化物残基にコンジュゲートされている、エフェクターまたはレポーター分子の部位特異的結合も文献に開示されている。このアプローチは、現在臨床評価中の診断的および治療的に有望な抗体を産生することが報告されている。
E. 抗体薬物複合体
抗体薬物複合体またはADCは、疾患を有する人々を処置するための標的療法として設計されたあるクラスの非常に強力な生物医薬品である。ADCは、不安定な結合を有する安定な化学リンカーを介して、生物学的に活性な細胞傷害性/抗ウイルス性ペイロードまたは薬物に連結された抗体（mAb全体またはscFvなどの抗体断片）から構成される複合体分子である。抗体薬物複合体は、バイオコンジュゲートおよびイムノコンジュゲートの例である。
モノクローナル抗体の独特の標的化能力を細胞傷害性薬物のがん殺傷能力と組み合わせることによって、抗体-薬物複合体は、健康な組織と患部組織との間の高感度の識別を可能にする。これは、従来の全身的アプローチとは対照的に、健康な細胞はあまり激しく影響を受けないように、抗体-薬物複合体が患部細胞を標的とし、攻撃することを意味する。
ADCベースの抗腫瘍療法の開発では、抗がん剤（例えば、細胞毒素または細胞毒素）は、ある特定の細胞マーカー（例えば、理想的には、患部細胞中または患部細胞上にのみ見出されるタンパク質）を特異的に標的とする抗体に結合される。抗体は、これらのタンパク質を体内で追跡し、患部細胞の表面に付着する。抗体と標的タンパク質（抗原）の間での生化学的反応は、標的とされる細胞中でシグナルを誘発し、次いで、標的細胞は、細胞毒素と共に抗体を吸収するか、または内部移行させる。ADCが内部移行された後、細胞傷害性薬物は放出され、細胞を死滅させるか、または細胞複製を損なう。この標的化のために、理想的には、薬物は他の作用物質より低い副作用を有し、より広い治療域を与える。
抗体と細胞傷害剤の間での安定な連結は、ADCの重要な側面である。リンカーは、ジスルフィド、ヒドラゾンもしくはペプチド（切断可能）またはチオエーテル（非切断可能）を含む化学モチーフに基づき、標的細胞への細胞傷害剤の分布および送達を制御する。切断可能型および非切断可能型のリンカーは、前臨床試験および臨床試験において安全であることが証明されている。ブレンツキシマブベドチンは、合成抗新生物剤である強力かつ高度に毒性の抗微小管剤モノメチルアウリスタチンEまたはMMAEをヒト特異的CD30陽性悪性細胞に送達する酵素感受性切断可能リンカーを含む。その高い毒性のために、チューブリンの重合を遮断することによって細胞分裂を阻害するMMAEは、単剤化学療法薬として使用することはできない。しかしながら、抗CD30モノクローナル抗体（cAC10、腫瘍壊死因子またはTNF受容体の細胞膜タンパク質）に連結されたMMAEの組み合わせは、細胞外液中で安定であり、カテプシンによって切断可能であり、治療に安全であることが証明された。他の承認済みADCであるトラスツズマブエムタンシンは、メイタンシンの誘導体である微小管形成阻害剤メルタンシン（DM-1）および安定な非切断可能リンカーによって結合された抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）/Genentech/Roche）の組み合わせである。
より優れたより安定なリンカーの利用可能性は、化学結合の機能を変化させた。切断可能または非切断可能リンカーの種類は、細胞傷害性（例えば、抗がん）薬物に特異的特性を付与する。例えば、非切断可能なリンカーは、薬物を細胞内に保持する。結果として、抗体全体、リンカーおよび細胞傷害剤が標的とされる細胞に入り、抗体は細胞でアミノ酸のレベルまで分解される。得られた複合体-アミノ酸、リンカーおよび細胞傷害剤-は、この時点で活性薬物となる。対照的に、切断可能なリンカーは、宿主細胞中の酵素によって触媒され、それによって細胞傷害剤を放出する。
別のタイプの切断可能なリンカーは、細胞傷害性薬物と切断部位との間に追加の分子を付加する。このリンカー技術は、切断速度論を変化させることについて心配することなく、研究者がより柔軟性のあるADCを作製することを可能にする。研究者らはまた、エドマン分解に基づくペプチド切断の新しい方法を開発している。ADCの開発における将来の方向には、安定性および治療指数をさらに改善するための部位特異的コンジュゲーション（TDC）ならびにα放出免疫コンジュゲートおよび抗体コンジュゲートナノ粒子の開発も含まれる。抗体の作製および精製
モノクローナル抗体を作製するための方法は、一般に、ポリクローナル抗体を調製するための方法と同じように開始する。これらの方法の両方の第1の工程は、適切な宿主の免疫化である。当技術分野で周知のように、免疫化のための所与の組成物の免疫原性は異なり得る。したがって、ペプチドまたはポリペプチド免疫原を担体に結合することによって達成され得るように、宿主免疫系を増強することがしばしば必要である。例示的かつ好ましい担体は、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）およびウシ血清アルブミン（BSA）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンも担体として使用することができる。ポリペプチドを担体タンパク質にコンジュゲートさせるための手段は当技術分野で周知であり、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンコイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビス-ビアゾ化ベンジジンが挙げられる。また、当技術分野で周知であるように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる、免疫応答の非特異的刺激剤の使用によって増強することができる。動物における例示的かつ好ましいアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死滅した結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を含有する免疫応答の非特異的刺激剤）、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられ、ヒトにおいてはミョウバン、CpG、MFP59および免疫刺激分子の組み合わせ（AS01またはAS03などの「アジュバント系」）が挙げられる。ナノ粒子ワクチン、または物理的送達システム（脂質ナノ粒子または金微粒子銃ビーズ上など）においてDNAまたはRNA遺伝子として送達される遺伝子でコードされた抗原などの、抗原特異的B細胞を誘導するためのさらなる実験的形態の接種が可能であり、針、遺伝子銃または経皮的電気穿孔装置を用いて送達される。抗原遺伝子はまた、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスもしくはアルファウイルスレプリコン、またはウイルス様粒子などの、複製能を有するまたは複製欠損のウイルスベクターによってコードされるように運搬され得る。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞のハイブリッドを作製するための方法は、通常、細胞膜の融合を促進する1つまたは複数の作用因子（化学的または電気的）の存在下で、体細胞を骨髄腫細胞と2:1の比率で混合することを含むが、この比率は、約20:1から約1:1まで変動し得る。いくつかの事例では、最初の工程としてのエプスタイン・バーウイルス（EBV）によるヒトB細胞の形質転換は、B細胞のサイズを増加させ、比較的大きなサイズの骨髄腫細胞との融合を増強する。EBVによる形質転換効率は、形質転換培地中でCpGおよびChk2阻害薬を使用することによって増強される。あるいは、ヒトB細胞は、IL-21およびTNFスーパーファミリーのII型メンバーであるヒトB細胞活性化因子（BAFF）などのさらなる可溶性因子を含有する培地中で、CD40リガンド（CD154）を発現する形質移入された細胞株と共培養することによって活性化され得る。センダイウイルスまたはポリエチレングリコール（PEG）を用いた融合法も知られている。電気的に誘導される融合法の使用も適切である。融合手順は、通常、約1×10-6～約1×10-8の低頻度で生きたハイブリッドを産生するが、最適化された手順では、200分の1に近い融合効率を達成することができる。しかしながら、生きた融合されたハイブリッドは、選択培地中で培養することによって、注入された親細胞（特に、通常は無期限に分裂し続ける注入された骨髄腫細胞）から分化するので、融合の比較的低い効率は問題を引き起こさない。選択培地は、一般に、組織培養培地中のヌクレオチドのデノボ合成を遮断する作用物質を含有するものである。例示的かつ好ましい作用物質は、アミノプテリン、メトトレキサートおよびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートはプリンおよびピリミジンの両方のデノボ合成を遮断するが、アザセリンはプリン合成のみを遮断する。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、培地には、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチンおよびチミジンが補充される（HAT培地）。アザセリンが使用される場合、培地にヒポキサンチンが補充される。B細胞源がEBVで形質転換されたヒトB細胞株である場合、骨髄腫に融合していないEBV形質転換株を排除するために、ウアバインが添加される。
好ましい選択培地は、HATまたはウアバインを含むHATである。ヌクレオチドサルベージ経路を作動することができる細胞のみが、HAT培地中で生存することができる。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の鍵となる酵素、例えばヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）を欠損しており、生存することができない。B細胞はこの経路を作動させることができるが、培養中での寿命は限られており、一般に約2週間以内に死亡する。したがって、選択培地中で生存することができる唯一の細胞は、骨髄腫およびB細胞から形成されたハイブリッドである。融合のために使用されるB細胞の供給源が、ここでのように、EBVで形質転換されたB細胞の株である場合、EBVで形質転換されたB細胞は薬物殺傷に対して感受性であるのに対して、使用される骨髄腫パートナーはウアバイン耐性であるように選択されるので、ウアバインはハイブリッドの薬物選択のためにも使用され得る。
培養は、特異的ハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団を提供する。典型的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中での単一クローン希釈によって細胞を培養した後、（約2～3週間後に）個々のクローン上清を所望の反応性について試験することによって行われる。アッセイは、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなどのように、高感度で、単純かつ迅速であるべきである。次いで、選択されたハイブリドーマは段階希釈されるか、またはフローサイトメトリー選別によって単一細胞選別され、個々の抗体産生細胞株中にクローニングされ、次いで、そのクローンはモノクローナル抗体を提供するために無制限に増殖させることができる。細胞株は、2つの基本的な方法でモノクローナル抗体産生のために利用され得る。ハイブリドーマの試料は、動物（例えば、マウス）に（多くの場合、腹膜腔内に）注射することができる。任意で、動物は、注射前に炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）などの油で刺激される。ヒトハイブリドーマがこのように使用される場合、腫瘍拒絶を防ぐために、SCIDマウスなどの免疫無防備状態のマウスに注射することが最適である。注射された動物は、融合細胞ハイブリッドによって産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発症する。次いで、モノクローナル抗体を高濃度で提供するために、血清または腹水などの動物の体液を抜き取ることができる。個々の細胞株をインビトロで培養することもでき、モノクローナル抗体は培養培地中に自然に分泌されて、培養培地から高濃度で容易に取得することができる。あるいは、細胞上清中に免疫グロブリンを産生するために、ヒトハイブリドーマ細胞株をインビトロで使用することができる。高純度のヒトモノクローナル免疫グロブリンを回収する能力を最適化するために、細胞株は、無血清培地中での増殖に対して適合させることができる。
ハイブリドーマを培養し、次いで細胞を溶解し、全RNAを抽出し得る。ランダムヘキサマーをRTと共に使用してRNAのcDNAコピーを生成し、次いで、すべてのヒト可変遺伝子配列を増幅すると予想されるPCRプライマーの多重混合物を使用してPCRを行い得る。PCR産物をpGEM-T Easyベクター中にクローニングし、次いで、標準的なベクタープライマーを使用した自動DNA配列決定によって配列決定することができる。結合および中和のアッセイは、ハイブリドーマ上清から収集され、プロテインGカラムを使用してFPLCによって精製された抗体を使用して実施され得る。
組換え完全長IgG抗体は、クローニングベクターからの重鎖および軽鎖FvDNAをIgGプラスミドベクター中にサブクローニングし、293（例えば、Freestyle）細胞またはCHO細胞中にトランスフェクトすることによって作製することができ、293またはCHO細胞上清から抗体を収集および精製することができる。他の適切な宿主細胞系としては、大腸菌などの細菌、昆虫細胞（S2,Sf9,Sf29,High Five）、植物細胞（例えば、タバコ、ヒト様グリカンのための操作ありまたはなし）、藻類、またはマウス、ラット、ヤギもしくはウシなどの種々の非ヒトトランスジェニック状況が挙げられる。
抗体をコードする核酸の発現も、その後の抗体精製の目的と宿主の免疫化の両方のために企図される。抗体コード配列は、天然のRNAまたは修飾されたRNAなどのRNAであり得る。修飾されたRNAは、増加した安定性および低い免疫原性をmRNAに付与し、それによって治療上重要なタンパク質の発現を促進するある特定の化学的修飾を企図する。例えば、N1-メチル-プソイドウリジン（N1mΨ）は、翻訳能力に関していくつかの他のヌクレオシド修飾およびそれらの組み合わせよりも優れている。翻訳の免疫/eIF2αリン酸化依存的な阻害を停止させることに加えて、組み込まれたN1mΨヌクレオチドは、mRNA上でのリボソーム休止および密度を増加させることによって翻訳過程の動態を劇的に変化させる。修飾されたmRNAのリボソームへの搭載が増加することにより、同じmRNA上でのリボソームリサイクルまたはデノボリボソーム動員のいずれかを好むことによって、修飾されたmRNAはより開始されやすくなる。このような修飾は、RNAの接種後にインビボで抗体発現を増強するために使用され得る。RNAは、天然であるかまたは修飾されているかを問わず、裸のRNAとして、または脂質ナノ粒子などの送達ビヒクルに入れて送達され得る。
あるいは、抗体をコードするDNAは同じ目的のために使用され得る。DNAは、発現カセットがそれに向けて設計されている宿主細胞において活性なプロモーターを含む発現カセット中に含まれる。発現カセットは、有利には、従来のプラスミドまたはミニベクターなどの複製可能なベクター中に含まれる。ベクターはウイルスベクターを含み、例えば、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルスが想定される。VEEウイルスまたはシンドビスウイルスに基づくアルファウイルスレプリコンなどの、抗体遺伝子をコードするレプリコンも想定される。このようなベクターの送達は、筋肉内、皮下もしくは皮内経路を介して針によって、またはインビボ発現が所望される場合、経皮的電気穿孔によって行うことができる。
あるいは、モノクローナル抗体を作製するために分子クローニングアプローチが使用され得る。関心対象の抗原で標識された単一B細胞は、常磁性ビーズ選択またはフローサイトメトリー選別を使用して物理的に選別することができ、次いで、単一細胞およびRT-PCRによって増幅された抗体遺伝子からRNAを単離することができる。あるいは、バルク選別された抗原特異的細胞集団を微小胞に分離し、重鎖アンプリコンと軽鎖アンプリコンの物理的連結、または小胞からの重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子の共通バーコード化を使用して、一致した重鎖可変遺伝子と軽鎖可変遺伝子を単一細胞から回収することができる。単一細胞からの一致した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子は、細胞あたり1つのバーコードで転写物をマーキングするためのRT-PCRプライマーおよびバーコードを有する細胞透過性ナノ粒子で細胞を処理することによって、抗原特異的B細胞の集団から得ることもできる。抗体可変遺伝子はまた、ハイブリドーマ株のRNA抽出によって単離することができ、抗体遺伝子はRT-PCRによって取得され、免疫グロブリン発現ベクターにクローニングすることができる。あるいは、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーは、細胞株から単離されたRNAから調製され、適切な抗体を発現するファージミドは、ウイルス抗原を使用したパニングによって選択される。従来のハイブリドーマ技術に対するこのアプローチの利点は、約104倍多くの抗体を単一ラウンドで作製およびスクリーニングすることができること、ならびにH鎖とL鎖の組み合わせによって新しい特異性が生成され、これにより適切な抗体を見出す可能性がさらに増大することである。
それぞれ参照により本明細書に組み入れられる本開示において有用な抗体の作製を教示する他の米国特許には、コンビナトリアルアプローチを使用したキメラ抗体の作製を記載する米国特許第5,565,332号;組換え免疫グロブリン調製物を記載する米国特許第4,816,567号;および抗体-治療剤コンジュゲートを記載する米国特許第4,867,973号が含まれる。
任意の手段によって作製されたモノクローナル抗体は、所望であれば、濾過、遠心分離、およびFPLCまたはアフィニティークロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー法を使用して精製され得る。本開示のモノクローナル抗体の断片は、ペプシンまたはパパインなどの酵素による消化を含む方法によって、および/または化学的還元によるジスルフィド結合の切断によって、精製されたモノクローナル抗体から得ることができる。あるいは、本開示によって包含されるモノクローナル抗体断片は、自動ペプチド合成装置を使用して合成することができる。
本明細書に開示される抗体は単離または精製され得る。本明細書で使用される「単離された」および「精製された」という用語は、他の成分から単離可能な組成物を指すことを意図し、タンパク質は、その天然に取得可能な状態と比較して任意の程度に精製される。したがって、精製されたタンパク質はまた、そのタンパク質が天然に存在し得る環境から脱しているタンパク質を指す。「実質的に精製された」という用語が使用される場合、この表記は、組成物中のタンパク質の約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％またはそれより多くを構成するなど、タンパク質またはペプチドが組成物の主成分を形成する組成物を指す。
タンパク質精製技術は、当業者に周知である。これらの技術は、1つのレベルでは、ポリペプチドおよび非ポリペプチド画分への細胞環境の粗分画を含む。ポリペプチドを他のタンパク質から分離した後、部分的または完全な精製（または均一性までの精製）を達成するために、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を使用して関心対象のポリペプチドをさらに精製し得る。純粋なペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー;ポリアクリルアミドゲル電気泳動;等電点電気泳動である。タンパク質精製のための他の方法としては、硫酸アンモニウム、PEG、抗体などによる沈殿または熱変性後の遠心分離;ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィー;ならびにこのような技術と他の技術との組み合わせが挙げられる。
本開示の抗体の精製を精製する際には、原核生物または真核生物の発現系中でポリペプチドを発現させ、変性条件を使用してタンパク質を抽出することが望ましいことがあり得る。ポリペプチドは、ポリペプチドのタグ付加された部分に結合するアフィニティーカラムを使用して他の細胞成分から精製され得る。当技術分野で一般的に知られているように、様々な精製工程を行う順序は変更され得るか、またはある特定の工程は省略され得、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製のための適切な方法をなおもたらすと考えられる。
一般に、完全な抗体は、抗体のFc部分に結合する作用物質（すなわち、タンパク質A）を利用して分画される。あるいは、適切な抗体を同時に精製および選択するために、抗原が使用され得る。このような方法は、多くの場合、カラム、フィルターまたはビーズなどの支持体に結合された選択剤を利用する。抗体は支持体に結合され、夾雑物が除去され（例えば、洗い流される）、条件（塩、熱など）を適用することによって抗体が遊離される。
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量するための様々な方法は、本開示に照らして当業者に公知であろう。これらには、例えば、活性画分の比活性を決定すること、またはSDS/PAGE分析によって画分内のポリペプチドの量を評価することが含まれる。画分の純度を評価するための別の方法は、画分の比活性を計算し、画分の比活性を初期抽出物の比活性と比較し、これにより純度を計算することである。活性の量を表すために使用される実際の単位は、もちろん、精製に後続するように選択された特定のアッセイ技術、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存する。
ポリペプチドの移動は、SDS/PAGEの異なる条件によって、時には著しく、変動し得ることが知られている。したがって、異なる電気泳動条件下では、精製または部分的に精製された発現産物の見かけの分子量は変化し得ることが理解されよう。
F. 抗体の改変
改善された発現、改善された交差反応性、または減弱されたオフターゲット結合などの様々な理由のために、抗体の配列は改変され得る。改変された抗体は、標準的な分子生物学的技術を通じた発現、またはポリペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技術によって作製され得る。
例えば、抗体分子中に保存的変化を導入するなどの改変を施すことを望むことがあり得る。このような変化を施す際には、アミノ酸のヒドロパシー指標が考慮され得る。タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を付与する上でのヒドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当技術分野で一般的に理解されている（Kyte and Doolittle,1982）。アミノ酸の相対的なヒドロパシー特性が、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、次いで、これが他の分子、例えば酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとのタンパク質の相互作用を規定することが認められている。
類似するアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行うことができる。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,554,101号は、その隣接するアミノ酸の親水性によって規律されるタンパク質の最大局所平均親水性がタンパク質の生物学的特性と相関することを述べる。米国特許第4,554,101号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている:塩基性アミノ酸:アルギニン（＋3.0）、リジン（＋3.0）およびヒスチジン（-0.5）;酸性アミノ酸:アスパラギン酸（＋3.0±1）、グルタミン酸（＋3.0±1）、アスパラギン（＋0.2）およびグルタミン（＋0.2）;親水性非イオン性アミノ酸:セリン（＋0.3）、アスパラギン（＋0.2）、グルタミン（＋0.2）およびトレオニン（-0.4）、硫黄含有アミノ酸:システイン（-1.0）およびメチオニン（-1.3）;疎水性非芳香族アミノ酸:バリン（-1.5）、ロイシン（-1.8）、イソロイシン（-1.8）、プロリン（-0.5±1）、アラニン（-0.5）およびグリシン（0）;疎水性芳香族アミノ酸:トリプトファン（-3.4）、フェニルアラニン（-2.5）およびチロシン（-2.3）。
アミノ酸は、類似の親水性を有する別のアミノ酸に置換することができ、生物学的または免疫学的に改変されたタンパク質を産生することができる。かかる変化では、その親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、±0.5以内であるアミノ酸の置換がさらに特に好ましい。
アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。様々な前述の特徴を考慮に入れた例示的な置換は当業者に周知であり、アルギニンおよびリジン;グルタミン酸およびアスパラギン酸;セリンおよびトレオニン;グルタミンおよびアスパラギン;バリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
本開示は、アイソタイプ改変も想定する。異なるアイソタイプを有するようにFc領域を改変することにより、異なる機能性を達成することができる。例えば、IgG1への変更は抗体依存性細胞傷害性を増加させることができ、クラスAへの切り替えは組織分布を改善することができ、クラスMへの切り替えは結合価を改善することができる。
例えば、C1q結合および/またはFcγR結合を改変し、それによってCDC活性および/またはADCC活性を変化させることによって、変化したエフェクター機能を有する抗体のFc領域を設計することができる。「エフェクター機能」は、（例えば、対象における）生物学的活性を活性化または減弱させる役割を果たす。エフェクター機能の例としては、C1q結合;補体依存性細胞傷害（CDC）;Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）;食作用;細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体;BCR）の下方制御が挙げられるが、これらに限定されない。このようなエフェクター機能は、Fc領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることを必要とし得、様々なアッセイ（例えば、Fc結合アッセイ、ADCCアッセイ、CDCアッセイなど）を使用して評価することができる。
例えば、改善されたC1q結合および改善されたFcγRIII結合を有する（例えば、改善されたADCC活性および改善されたCDC活性の両方を有する）抗体のバリアントFc領域を作製することができる。あるいは、エフェクター機能を低減または消失させることが望まれる場合、バリアントFc領域は、低下したCDC活性および/または低下したADCC活性を有するように操作することができる。他の態様では、（例えば、改善されたADCC活性を有するが、低下したCDC活性を有するおよびその逆のFc領域バリアントを作製するために）これらの活性の一方のみを増加させ得、任意で、他の活性も低下させ得る。
ある態様において、Fcドメインは、Fcポリペプチド鎖のいずれかまたは両方に、Fcγ受容体（例えば、FcγRI/CD64、FcγRIIA/CD32A、FcγRIIB/CD32B、FcγRIIIIA/CD16またはFcγRIIIB）への結合を変化させる1つまたは複数の変異または修飾を含有し得る。いくつかの態様において、修飾された重鎖定常領域は、IgGアイソタイプ（例えばIgG1）の野生型CH2ドメインであるCH2ドメインを含む。本明細書で使用されるCH2ドメインはまた、野生型CH2ドメインのバリアント、例えば野生型IgG1 CH2ドメインのバリアントであり得る。CH2ドメインの例示的なバリアントには、ADCCもしくはCDCなどの抗体のFc領域の生物学的活性を調節する、または抗体の半減期/抗体安定性を調節するバリアントが含まれる。CH2ドメインは、増強されたエフェクター機能を有し得る。CH2ドメインは、以下のアミノ酸:E233、G236、G237、P238、H268、P271、L328、A330およびI332に1つまたは複数の変異を含み得る。
ある態様において、抗体は、FcγR2aおよび/またはFcγR3aへの結合を増加させるように修飾され得る。FcγR2aへの結合を増加させる例示的な修飾としては、G236、例えばG236Aでの置換が挙げられる。FcγR3aへの結合を増加させる例示的な修飾としては、G236、例えばG236Aでの置換、A330、例えばA330Lにおける置換、およびI332、例えばI332Eにおける置換、が挙げられる。
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、シアル酸、ガラクトースまたはフコースのない実質的に均一なグリカンを含有し得る。上述の実質的に均一なグリカンは、重鎖定常領域に共有結合され得る。
モノクローナル抗体は、新規なFcグリコシル化パターンを有し得る。Fc領域のグリコシル化は、典型的には、N結合型またはO結合型のいずれかである。N結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。O結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの糖N-アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの1つの付着を指すが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジンも使用され得る。アスパラギン側鎖ペプチド配列への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列は、アスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-トレオニンであり、Xはプロリンを除く任意のアミノ酸である。したがって、ポリペプチド中でのこれらのペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作出する。
グリコシル化パターンは、例えば、ポリペプチド中に見出される1つもしくは複数のグリコシル化部位を欠失させること、および/またはポリペプチド中に存在しない1つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することによって変更され得る。抗体のFc領域へのグリコシル化部位の付加は、上記トリペプチド配列の1つまたは複数を含有するようにアミノ酸配列を変更することによって都合よく達成される（N結合型グリコシル化部位の場合）。例示的なグリコシル化バリアントは、重鎖の残基Asn297のアミノ酸置換を有する。改変はまた、元のポリペプチドの配列への1つもしくは複数のセリンもしくはトレオニン残基の付加または1つもしくは複数のセリンもしくはトレオニン残基による置換によって行われ得る（O結合型グリコシル化部位の場合）。さらに、Asn297のAlaへの変化は、グリコシル化部位のうちの1つを除去することができる。
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、GNGNまたはG1/G2グリコフォームによって表される実質的に均一な組成物で存在し得、実質的に均一なGNGNグリコフォームを有さず、G0、G1F、G2F、GNF、GNGNFまたはGNGNFXを含有するグリコフォームを有する同じ抗体と比較して、FcγRIおよびFcγRIIIに対して増加した結合親和性を示す。Fcグリコシル化は、治療用mAbの抗ウイルス特性および抗がん特性において重要な役割を果たす。コアフコースの除去は、ナチュラルキラー（NK）細胞によって媒介されるmAbのADCC活性を劇的に改善するが、多形核細胞（PMN）のADCC活性に対しては反対の効果を有するようである。
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、GnTIIIが抗体にGlcNAcを付加するように、β（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（GnTIII）を発現する細胞中で発現され得る。このような様式で抗体を作製するための方法は、国際公開第9954342号および国際公開第03011878号に提供されている。細胞株は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（CRISPR）などのゲノム編集技術を使用して、グリコシル化などのある特定の翻訳後修飾を増強または低減または排除するように変更することができる。例えば、モノクローナル抗体を発現させるために使用される293細胞またはCHO細胞中のグリコシル化酵素をコードする遺伝子を排除するために、CRISPR技術を使用することができる。
ヒトB細胞から得られた抗体可変遺伝子配列を操作して、それらの製造可能性および安全性を高めることが可能である。潜在的なタンパク質配列ライアビリティ（liability）は、以下を含有する部位を伴う配列モチーフを検索することによって特定することができる。
1）不対のCys残基、
2）N結合型グリコシル化、
3）Asn脱アミド化、
4）Asp異性化、
5）SYE切断、
6）Met酸化、
7）Trp酸化、
8）N末端グルタミン酸、
9）インテグリン結合、
10）CD11c/CD18結合、または
11）断片化
このようなモチーフは、抗体をコードするcDNAを含む合成遺伝子を改変することによって排除することができる。
抗体は、溶解性を高めるように操作することができる。例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸およびセリンなどのいくつかの親水性残基は、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、リジンおよびアルギニンなどの他の親水性残基よりタンパク質溶解性に対して著しく有利に寄与する。
血液ドナー由来のヒトB細胞のB細胞レパートリーのディープシーケンシングは、広範に行われてきた。ヒト抗体レパートリーの有意な部分に関する配列情報は、健康なヒトにおいて一般的な抗体配列特徴の統計的評価を容易にする。ヒト組換え抗体可変遺伝子参照データベースにおける抗体配列特徴に関する知識を用いて、抗体配列の「ヒト類似性」（HL）の位置特異的度合いを推定することができる。治療用抗体またはワクチンとしての抗体のように、HLは、臨床使用における抗体の開発に有用であることが示されている。最終目標は、抗体薬物の著しく減少した有効性をもたらすか、または重大な健康上の影響を誘発し得る潜在的な有害作用および抗抗体免疫応答を低減させるために抗体のヒト類似性を増大させることである。合計約4億の配列の3人の健康なヒト血液ドナーの組み合わされた抗体レパートリーの抗体特性を評価することができ、抗体の超可変領域に焦点を合わせる新規な「相対的ヒト類似性」（rHL）スコアを作り出した。rHLスコアは、ヒト配列（正のスコア）と非ヒト配列（負のスコア）とを容易に区別することを可能にする。抗体は、ヒトレパートリーでは一般的ではない残基を排除するように操作することができる。
抗体および抗体断片の抗原性を低減または排除するための方法は、当技術分野で公知である。抗体がヒトに投与される場合には、抗体は、好ましくは、ヒトにおける抗原性を低減または排除するために「ヒト化」される。好ましくは、各ヒト化抗体は、各ヒト化抗体が由来する非ヒト化マウス抗体と同じまたは実質的に同じ抗原に対する親和性を有する。
1つのヒト化アプローチでは、マウス免疫グロブリン定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域で置き換えられたキメラタンパク質が作製される。例えば、Morrison et al., 1984, PROC.NAT.ACAD.SCI. 81:6851-6855,Neuberger et al., 1984,Nature 312:604-608;米国特許第6,893,625号（Robinson）;同第5,500,362号（Robinson）;および同第4,816,567号（Cabilly）を参照されたい。
CDR移植として知られるアプローチでは、軽鎖可変領域および重鎖可変領域のCDRが別の種由来のフレームワークに移植される。例えば、マウスCDRをヒトFRに移植することができる。いくつかの態様では、抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のCDRは、ヒトFRまたはコンセンサスヒトFRに移植される。コンセンサスなヒトFRを作製するために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列からのFRが整列され、コンセンサスなアミノ酸配列を同定する。CDR移植は、米国特許第7,022,500号（Queen）;同第6,982,321号（Winter）;同第6,180,370号（Queen）;同第6,054,297号（Carter）;同第5,693,762号（Queen）;同第5,859,205号（Adair）;同第5,693,761号（Queen）;同第5,565,332号（Hoogenboom）;同第5,585,089号（Queen）;同第5,530,101号（Queen）;Jones et al.（1986）Nature 321:522-525;Riechmann et al.（1988）Nature 332:323-327;Verhoeyen et al.（1988）Science 239:1534-1536;およびWinter（1998）Febs Lett 430:92-94に記載されている。
「SUPERHUMANIZATION（商標）」と呼ばれるアプローチでは、ヒトCDR配列は、ヒト化されるマウス抗体のCDRに対するヒトCDRの構造的類似性に基づいて、ヒト生殖細胞系列遺伝子から選択される。例えば、米国特許第6,881,557号（Foote）およびTan et al., 2002, J.Immunol. 169:1119-1125を参照されたい。
免疫原性を低下させるための他の方法には、「再形成」、「高キメラ化」および「ベニアリング/リサーフェシング」が含まれる。例えば、Vaswami et al., 1998, Annals Of Allergy,Asthma,＆Immunol. 81:105;Roguska et al., 1996,Prot.Engineer 9:895-904および米国特許第6,072,035（Hardman）を参照されたい。ベニアリング/リサーフェシングアプローチでは、マウス抗体中の表面にアクセス可能なアミノ酸残基は、ヒト抗体中の同じ位置により頻繁に見られるアミノ酸残基によって置き換えられる。このタイプの抗体リサーフェシングは、例えば、米国特許第5,639,641号（Pedersen）に記載されている。
マウス抗体をヒトにおける医学的使用に適した形態に変換するための別のアプローチは、ACTIVMAB（商標）技術（Vaccinex,Inc.,Rochester,NY）として知られており、これは、哺乳動物細胞において抗体を発現するためのワクシニアウイルスベースのベクターを含む。IgG重鎖およびIgG軽鎖の高いレベルの組み合わせの多様性を生成することができる。例えば、米国特許第6,706,477号（Zauderer）;同第6,800,442号（Zauderer）;および同第6,872,518号（Zauderer）を参照されたい。マウス抗体をヒトでの使用に適した形態に変換するための別のアプローチは、KaloBios Pharmaceuticals,Inc.（PaloAlto,CA）によって商業的に実施されている技術である。この技術は、抗体選択のための「エピトープに焦点を合わせた」ライブラリーを作製するための独自のヒト「アクセプタ」ライブラリーの使用を含む。マウス抗体をヒトにおける医学的使用に適した形態に改変するための別のアプローチは、HUMAN ENGINEERING（商標）技術であり、これはXOMA（US）LLCによって商業的に実施されている。例えば、国際公開第93/11794号および米国特許第5,766,886号（Studnicka）;同第5,770,196号（Studnicka）;同第5,821,123号（Studnicka）;および同第5,869,619号（Studnicka）を参照されたい。
抗体のヒト免疫原性を低減または排除するために、上記のアプローチのいずれをも含む任意の適切なアプローチを使用することができる。
G. 抗体の性質決定
本開示による抗体は、第1の例では、それらの結合特異性によって定義され得る。当業者に周知の技術を使用して所与の抗体の結合特異性/親和性を評価することによって、当業者は、そのような抗体が本特許請求の範囲内に入るかどうかを決定することができる。例えば、所与の抗体が結合するエピトープは、抗原分子内に位置する3またはそれより多く（例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20）のアミノ酸の単一の連続する配列（例えば、ドメイン中の直鎖エピトープ）からなり得る。あるいは、エピトープは、抗原分子内に位置する複数の非連続的アミノ酸（またはアミノ酸配列）（例えば、立体構造エピトープ）からなり得る。
抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の「1つまたは複数のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定するために、当業者に公知の様々な技術を使用することができる。例示的な技術としては、例えば、Antibodies,Harlow and Lane（Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.）に記載されているものなどの日常的なクロスブロッキングアッセイが挙げられる。クロスブロッキングは、ELISA、バイオレイヤー干渉法、または表面プラズモン共鳴などの様々な結合アッセイで測定することができる。他の方法としては、アラニンスキャニング変異解析、ペプチドブロット分析（Reineke（2004）Methods Mol.Biol.248:443-63）、ペプチド切断分析、単一粒子再構成を使用する高分解能電子顕微鏡法技術、cryoEM、またはトモグラフィ、結晶学的研究およびNMR分析が挙げられる。さらに、エピトープ切除、エピトープ抽出および抗原の化学修飾などの方法を使用することができる（Tomer（2000）Prot.Sci.9:487-496）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析によって検出される水素/重水素交換である。一般的に言えば、水素/重水素交換法は、関心対象のタンパク質を重水素標識した後、重水素標識されたタンパク質に抗体を結合させることを含む。次に、タンパク質/抗体複合体が水に移され、抗体複合体によって保護されているアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素から水素への逆交換を受ける。その結果、タンパク質/抗体界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持し得、したがって、界面に含まれないアミノ酸と比較して相対的に高い質量を示し得る。抗体の解離後、標的タンパク質はプロテアーゼ切断および質量分析に供され、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識された残基を明らかにする。例えば、Ehring（1999）Analytical Biochemistry 267:252-259;Engen and Smith（2001）Anal.Chem.73:256A-265Aを参照されたい。
「エピトープ」という用語は、B細胞および/またはT細胞が応答する抗原上の部位を指す。B細胞エピトープは、連続するアミノ酸またはタンパク質の三次折り畳みによって並置された非連続的なアミノ酸の両方から形成され得る。隣接するアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露に際して保持されるのに対して、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理時に失われる。エピトープは、典型的には、特有の空間的立体構造で少なくとも3個、より一般的には少なくとも5個または8～10個のアミノ酸を含む。
抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ASAP）としても知られる改変支援プロファイリング（MAP）は、化学的または酵素的に改変された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原に対して作られた多数のモノクローナル抗体を分類する方法である（参照によりその全体が本明細書に具体的に組み入れられる米国特許出願公開第2004/0101920号を参照されたい。）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表されるエピトープとは明確に異なるか、または部分的に重複する特有のエピトープを反映し得る。この技術は、性質決定を遺伝的に異なる抗体に対して焦点を当てることができるように、遺伝的に同一の抗体の迅速なフィルタリングを可能にする。ハイブリドーマスクリーニングに適用されると、MAPは、所望の特徴を有するモノクローナル抗体を産生する稀少ハイブリドーマクローンの同定を容易にし得る。MAPは、本開示の抗体を、異なるエピトープに結合する抗体の群に選別するために使用され得る。
本開示は、同じエピトープまたは同じエピトープの一部に結合し得る抗体を含む。当技術分野で公知の日常的な方法を使用することによって、抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するか、または参照抗体と結合について競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和条件下で標的分子に結合させる。次に、標的分子に結合する試験抗体の能力を評価する。参照抗体との飽和結合後に試験抗体が標的分子に結合することができれば、試験抗体は参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方、参照抗体との飽和結合後に試験抗体が標的分子に結合することができなければ、試験抗体は、参照抗体によって結合されたエピトープと同じエピトープに結合し得る。
ある抗体が結合について例えば77A抗体と競合するかどうかを決定するために、上記の結合方法論は2つの方向性で行われる:第1の方向性では、77A抗体を飽和条件下でHSP70タンパク質に結合させた後に、HSP70タンパク質への試験抗体の結合を評価する。第2の方向性では、試験抗体を飽和条件下でHSP70タンパク質に結合させた後に、HSP70タンパク質への77A抗体の結合を評価する。両方の方向性において、第1の（飽和）抗体のみがHSP70分子に結合することができれば、試験抗体および77A抗体はHSP70への結合について競合すると結論付けられる。当業者には理解されるように、参照抗体と結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合するとは限らないが、重複または隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
各々が抗原への他方の結合を競合的に阻害（遮断）すれば、2つの抗体は同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、競合結合アッセイで測定した場合に、1倍、5倍、10倍、20倍または100倍過剰の一方の抗体は、他方の結合を少なくとも50％、但し好ましくは75％、90％またはさらには99％阻害する（例えば、Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502を参照）。あるいは、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸変異が他方の結合を低減または排除すれば、2つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減または排除するいくつかのアミノ酸変異が他方の結合を低減または排除すれば、2つの抗体は重複するエピトープを有する。
次いで、試験抗体の結合の観察された欠如が実際に参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるかどうか、または、立体的遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠如の原因であるかどうかを確認するために、さらなる日常的な実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を行うことができる。この種の実験は、ELISA、RIA、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当技術分野で利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを使用して行うことができる。
別の局面において、抗体は、追加の「フレームワーク」領域を含む抗体の可変配列によって定義され得る。これらは、完全な可変領域を表す表2、3、6、9および10に提供されている。さらに、抗体配列は、以下でさらに詳細に論述されている方法を任意で使用して、これらの配列と異なり得る。例えば、核酸配列は、（a）可変領域が軽鎖および重鎖の定常ドメインから分離され得る、（b）核酸がそれによってコードされる残基に影響を及ぼさずに上記核酸から変化し得る、（c）核酸が、所与の百分率、例えば70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の相同性で上記核酸から変化し得る、（d）核酸が、約50℃～約70℃の温度で約0.02M～約0.15MのNaClによって提供されるような、低塩および/または高温条件によって例示されるような高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする能力のために上記核酸から変化し得る、（e）アミノ酸が、所与の百分率、例えば80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％の相同性で上記アミノ酸から変化し得る、または（f）アミノ酸は、保存的置換を許容することによって上記アミノ酸と異なり得る点で、上記核酸配列から変化し得る。
ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を比較する場合、以下に記載されるように、最大の一致が得られるように整列されたときに2つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じであれば、2つの配列は「同一」であると言われる。2つの配列間の比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を同定し、比較するために、比較ウィンドウにわたって配列を比較することによって行われる。本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、2つの配列が最適に整列された後に、配列が同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る少なくとも約20の連続する位置、通常は30～約75、40～約50のセグメントを指す。
比較のための配列の最適なアラインメントは、初期設定パラメータを使用して、バイオインフォマティクスソフトウェアのLasergene suite（DNASTAR,Inc.,Madison,Wis.）中のMegalignプログラムを使用して行われ得る。あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、Smith and Waterman（1981）Add.APL.Math 2:482の局所同一性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch（1970）J.Mol.Biol.48:443の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって（Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group（GCG）,575 Science Dr.,Madison,Wis.中のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTA）によって、または検査によって行われ得る。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの1つの具体例は、BLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムであり、それぞれ、Altschul et al.（1977）Nucl.Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al.（1990）J.Mol.Biol. 215:403-410に記載されている。BLASTおよびBLAST2.0は、本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対してパーセント配列同一性を決定するために、例えば本明細書に記載されるパラメータと共に使用することができる。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通じて公に入手可能である。抗体配列の再編成される性質および各遺伝子の可変的長さのために、単一の抗体配列に対して複数回のBLAST検索が必要となる。また、異なる遺伝子の手作業での組み立ては困難であり、誤りが生じやすい。配列分析ツールIgBLAST（ワールドワイドウェブncbi.nlm.nih.gov/igblast/）は、生殖細胞系列V、DおよびJ遺伝子に対する一致、再編成接合部における詳細、IgVドメインフレームワーク領域および相補性決定領域の描写を同定する。IgBLASTは、ヌクレオチドまたはタンパク質配列を分析することができ、配列をバッチで処理することができ、生殖細胞系列遺伝子データベースおよびその他の配列データベースに対する検索を同時に可能にして、最もよく一致する可能性がある生殖細胞系列V遺伝子を見逃す可能性を最小限に抑える。
1つのアプローチでは、「配列同一性の百分率」は、少なくとも20の位置の比較ウィンドウにわたって2つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、2つの配列の最適な整列のための（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して、20％またはそれより少ない、通常は5～15％、または10～12％の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。百分率は、両配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除算し、結果に100を乗じて配列同一性の百分率を得ることによって計算される。
抗体を定義するさらに別の方法は、本明細書で提供される抗体およびそれらの抗原結合断片のいずれかの「誘導体」としてである。誘導体抗体または抗体断片は、特異的な化学的切断、アセチル化、製剤化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがこれらに限定されない当業者に公知の技術を使用する化学修飾によって修飾され得る。一態様において、抗体誘導体は、親抗体と類似または同一の機能を有する。別の態様において、抗体誘導体は、親抗体と比較して変化した活性を示す。例えば、誘導体抗体（またはその断片）は、親抗体より強固にそのエピトープに結合することができるか、またはタンパク質分解に対してより耐性であり得る。
「誘導体」という用語は、抗原に免疫特異的に結合するが、「親」（または野生型）分子と比較して1、2、3、4、5またはそれより多くのアミノ酸置換、付加、欠失または修飾を含む抗体またはその抗原結合断片を指す。このようなアミノ酸の置換または付加は、天然に存在するアミノ酸残基（すなわち、DNAによってコードされる）または天然に存在しないアミノ酸残基を導入し得る。「誘導体」という用語は、例えば、増強されたまたは損なわれたエフェクターまたは結合特性を示すバリアントFc領域を有する例えば抗体などを形成するように、変化したCH1、ヒンジ、CH2、CH3またはCH4領域を有するバリアントを包含する。「誘導体」という用語は、非アミノ酸修飾、例えば、グリコシル化（例えば、変化したマンノース、2-N-アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコース、グルコース、シアル酸、5-N-アセチルノイラミン酸、5-グリコールノイラミン酸などの含有量を有する）、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護/ブロッキング基によって誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質に連結され得るなどのアミノ酸をさらに包含する。いくつかの態様において、変化した炭水化物修飾は、以下のうちの1つまたは複数を調節する:抗体の可溶化、抗体の細胞内輸送および分泌の促進、抗体構築の促進、立体構造の完全性および抗体媒介性エフェクター機能。特定の態様において、変更された炭水化物修飾は、炭水化物修飾を欠く抗体と比較して抗体媒介性エフェクター機能を増強する。変化した抗体媒介性エフェクター機能をもたらす炭水化物修飾は、当技術分野で周知である。
抗体の生物物理学的特性を決定することができる。抗体の折り畳みをほどいて、平均見かけ融解温度を使用して相対的安定性を決定するために高温を使用することができる。示差走査熱量測定（DSC）は、温度の関数として分子の熱容量Cp（1度当たり分子を温めるために必要とされる熱）を測定する。抗体の熱安定性を研究するためにDSCを使用することができる。mAbに対するDSCデータは、mAb構造内の個々のドメインのアンフォールディングを分解し、サーモグラム中に（Fab、CH2およびCH3ドメインのアンフォールディングからの）最大3つのピークを生成することがあるため、特に興味深い。典型的には、Fabドメインのアンフォールディングが最も強いピークをもたらす。Fc部分のDSCプロフィールおよび相対的安定性は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4サブクラスについて特徴的な差を示す（Garber and Demarest, Biochem.Biophys.Res.Commun. 355,751-757, 2007）。CD分光計で実行される円二色性（CD）を使用して、平均見かけの融解温度を決定することもできる。Far-UV CDスペクトルは、抗体に対して200nm～260nmの範囲で、0.5nmの増分で測定される。最終スペクトルは、20の累積の平均として決定することができる。残余楕円率値は、バックグラウンド減算後に計算することができる。抗体（0.1mg/mL）の熱的アンフォールディングは、25～95℃および1℃/分の加熱速度、235nmで監視することができる。凝集の傾向を評価するために動的光散乱（DLS）を使用することができる。DLSは、タンパク質を含む様々な粒子のサイズを特徴付けるために使用される。系のサイズが分散していなければ、粒子の平均有効径を決定することができる。この測定は、粒子コアのサイズ、表面構造のサイズおよび粒子濃度に依存する。DLSは、本質的には、粒子による散乱光強度の変動を測定するので、粒子の拡散係数を決定することができる。市販のDLA機器中のDLSソフトウェアは、異なる直径の粒子集団を示す。安定性研究は、DLSを用いて都合よく行うことができる。試料のDLS測定は、粒子の流体力学的半径が増加するかどうかを判定することによって、粒子が時間と共に凝集するか、または温度変動と共に凝集するかどうかを示すことができる。粒子が凝集すれば、より大きな半径を有する粒子のより大きな集団を見ることができる。温度に依存する安定性は、インサイチューで温度を制御することによって分析することができる。キャピラリー電気泳動（CE）技術には、抗体安定性の特徴を決定するための実証された方法論が含まれる。脱アミド化、C末端リジン、シアリル化、酸化、グリコシル化、およびタンパク質のpIの変化をもたらし得るタンパク質に対する任意の他の変化に起因する抗体タンパク質電荷バリアントを分離するために、iCEアプローチを使用することができる。発現された抗体タンパク質のそれぞれは、Protein Simple Maurice装置を使用して、キャピラリーカラム中でのハイスループット自由溶液等電点電気泳動（IEF）（cIEF）によって評価することができる。等電点（pI）で集中する分子のリアルタイム監視のために、全カラムUV吸収検出を30秒ごとに実行することができる。このアプローチは、従来のゲルIEFの高分解能と、カラムベースの分離において見られる定量化および自動化の利点とを組み合わせながら、移動工程の必要性を除去する。この技術は、発現された抗体の同一性、純度および不均一性プロファイルの再現性のある定量的分析をもたらす。結果は、吸光度および固有蛍光検出モードの両方で、ならびに0.7μg/mLまでの検出感度で、抗体上の電荷不均一性および分子サイズを同定する。
抗体配列の固有の溶解度スコアを決定することができる。固有の溶解度スコアは、CamSol Intrinsic（Sormanni et al., J Mol Biol 427,478-490,2015）を使用して計算することができる。scFvなどの各抗体断片のHCDR3中の残基95～102（Kabatナンバリング）のアミノ酸配列は、溶解度スコアを計算するためにオンラインプログラムを介して評価することができる。実験室技術を使用して溶解度を決定することもできる。溶液が飽和し、溶解限界に達するまで凍結乾燥されたタンパク質を溶液に添加すること、または適切な分子量カットオフを有するマイクロコンセントレータ中での限外濾過による濃縮を含む、様々な技術が存在する。最も簡単な方法は非晶質沈殿の誘導であり、これは硫酸アンモニウムを使用するタンパク質沈殿を含む方法を使用してタンパク質溶解度を測定する（Trevino et al., J Mol Biol, 366:449-460,2007）。硫酸アンモニウム沈殿は、相対溶解度値に関する迅速かつ正確な情報を与える。硫酸アンモニウム沈殿は、明確に区切られた水相と固相を有する沈殿溶液を生成し、比較的少量のタンパク質を必要とする。硫酸アンモニウムによる非晶質沈殿の誘導を使用して実施される溶解度測定はまた、異なるpH値で容易に行うことができる。タンパク質の溶解度は高度にpH依存性であり、pHは溶解度に影響を及ぼす最も重要な外因性因子と考えられている。
H. 特定の態様
一態様において、GYX1FTX2YG（SEQ ID NO:214）のVHCDR1アミノ酸配列であって、X1がT、SもしくはIであり、X2がNもしくはKである、VHCDR1アミノ酸配列と、INTYTGEX1（SEQ ID NO:215）のVHCDR2アミノ酸配列であって、X1がP、S、TもしくはAである、VHCDR2アミノ酸配列と、X1RYDHX2MDY（SEQ ID NO:216）のVHCDR3アミノ酸配列であって、X1がA、T、VもしくはGであり、X2がA、R、F、T、P、V、S、D、N、H、L、YもしくはGである、VHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/またはQSLX1NSGTRKNY（SEQ ID NO:212）のVLCDR1アミノ酸配列であって、X1がL、FもしくはVである、VLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、KQSYX1LYT（SEQ ID NO:213）のVLCDR3アミノ酸配列であって、X1がT、NもしくはSである、VLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）を含むモノクローナル抗体または抗体断片が、本明細書において提供される。
一態様において、SEQ ID NO:1および164～166からなる群から選択されるVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2および167～169からなる群から選択されるVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3および170～185からなる群から選択されるVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;ならびに/またはSEQ ID NO:4および159～161からなる群から選択されるVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6、162および163からなる群から選択されるVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）を含む、抗体または抗体断片が、本明細書において提供される。
一態様において、抗体または抗体断片が本明細書において提供され、前記抗体または抗体断片は、以下を含む：
（i）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（ii）SEQ ID NO:164のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（iii）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:170のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（iv）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:162のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（v）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:171のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（vi）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:172のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（vii）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:159のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（viii）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:173のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（ix）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:174のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（x）SEQ ID NO:164のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:175のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xi）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:163のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xii）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:176のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xiii）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:171のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:159のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xiv）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:177のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xv）SEQ ID NO:164のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:178のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xvi）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:179のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xvii）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:179のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:159のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xviii）SEQ ID NO:164のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:167のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:174のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xix）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:180のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xx）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:181のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:162のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxi）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:182のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxii）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:183のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxiii）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:181のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxiv）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:168のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:184のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxv）SEQ ID NO:165のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:185のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxvi）SEQ ID NO:166のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:170のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xvii）SEQ ID NO:164のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:170のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxviii）SEQ ID NO:165のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxix）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:169のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:174のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:160のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxx）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:184のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxi）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:175のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxii）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:167のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxiii）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:169のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxiv）SEQ ID NO:166のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:167のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxv）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:168のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxvi）SEQ ID NO:166のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:168のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxvii）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:161のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxviii）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:168のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:161のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxix）SEQ ID NO:166のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:184のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xl）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:178のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:163のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xli）SEQ ID NO:164のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:170のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:162のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xlii）SEQ ID NO:166のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:183のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:161のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xliii）SEQ ID NO:165のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:183のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xliv）SEQ ID NO:166のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:183のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xlv）SEQ ID NO:165のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:2のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:161のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:162のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;または
（xlvi）SEQ ID NO:1のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:168のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:183のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）。
一態様において、SEQ ID NO:192～195からなる群から選択されるVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196～211からなる群から選択されるVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3および170～185からなる群から選択されるVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）、ならびに/またはSEQ ID NO:186～190からなる群から選択されるVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6、162および163からなる群から選択されるVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）を含む、抗体または抗体断片が、本明細書において提供される。
一態様において、抗体または抗体断片が本明細書において提供され、前記抗体または抗体断片は、以下を含む：
（i）SEQ ID NO:192のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（ii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:197のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（iii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:170のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（iv）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:198のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（v）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:162のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（vi）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（vii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:171のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（viii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:172のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（ix）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:187のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（x）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:173のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xi）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:199のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:174のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xiii）SEQ ID NO:192のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:175のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xiv）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:200のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xv）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:201のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xvi）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:201のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:187のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xvii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:188のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:163のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xviii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:170のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:189のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xix）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:176のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xx）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:171のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:187のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxi）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:173のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:197のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:177のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxiii）SEQ ID NO:192のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:178のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxiv）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:179のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxv）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:179のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:187のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxvi）SEQ ID NO:192のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:202のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:174のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxvii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:180のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxviii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:201のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:162のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxix）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:181のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:162のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxx）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:182のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxi）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:183のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:163のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxiii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:181のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxiv）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:203のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:184のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxv）SEQ ID NO:194のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:185のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:189のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxvi）SEQ ID NO:195のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:197のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:170のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxvii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:204のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxviii）SEQ ID NO:192のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:205のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:170のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xxxix）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:206のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:171のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xl）SEQ ID NO:194のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xli）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:207のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:174のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:190のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xlii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:184のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xliii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:206のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:184のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xliv）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:175のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xlv）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:189のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xlvi）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:202のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xlvii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:207のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xlviii）SEQ ID NO:195のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:202のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（xlix）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:208のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（l）SEQ ID NO:195のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:209のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（li）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:209のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:187のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（lii）SEQ ID NO:195のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:206のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:184のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（liii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:210のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:178のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:163のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（liv）SEQ ID NO:192のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:197のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:170のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:162のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（lv）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:210のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:174のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:188のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（lvi）SEQ ID NO:195のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:183のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:187のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（lvii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:209のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（lviii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:184のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:188のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（lix）SEQ ID NO:194のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:183のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（lx）SEQ ID NO:195のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:183のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:188のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（lxi）SEQ ID NO:192のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:211のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:170のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（lxii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:210のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:172のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:189のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（lxiii）SEQ ID NO:195のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:196のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:183のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:187のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（lxiv）SEQ ID NO:194のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:206のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:187のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:162のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（lxv）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:208のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:183のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;
（lxvi）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:199のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:3のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/もしくはSEQ ID NO:187のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）;または
（lxvii）SEQ ID NO:193のVHCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:199のVHCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:184のVHCDR3アミノ酸配列とを含む重鎖可変領域（VH）;および/またはSEQ ID NO:186のVLCDR1アミノ酸配列と、SEQ ID NO:191のVLCDR2アミノ酸配列と、SEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列とを含む軽鎖可変領域（VL）。
いくつかの局面において、前記抗体または抗体断片は、
Figure 2024536133000002
の配列を有する重鎖可変配列であって、X1はQもしくはEであり、X2はIもしくはVであり、X3はVもしくはQであり、X4はQもしくはEであり、X5はA、PもしくはGであり、X6はEもしくはGであり、X7はVもしくはLであり、X8はVもしくはKであり、X9はA、E、GもしくはSであり、X10はVもしくはLであり、X11はKもしくはRであり、X12はV、LもしくはIであり、X13はAもしくはTであり、X14はKもしくはQであり、X15はEもしくはKであり、X16はMもしくはVであり、X17はFもしくはVであり、X18はF、MもしくはIであり、X19はTもしくはSであり、X20はT、RもしくはAであり、X21はT、DもしくはEであり、X22はT、AもしくはKであり、X23はSもしくはNであり、X24はLもしくはAであり、X25はMもしくはLであり、X26はEもしくはQであり、X27はLもしくはMであり、X28はR、S、TもしくはNであり、X29はSもしくはGであり、X30はR、KもしくはMであり、X31はSもしくはTであり、X32はDもしくはEであり、X33はL、SもしくはTである、前記重鎖可変配列、
および/または
Figure 2024536133000003
の配列を有する軽鎖可変配列であって、X1はEもしくはDであり、X2はIもしくはVであり、X3はVもしくはQであり、X4はLもしくはMであり、X5はDもしくはSであり、X6はAもしくはSであり、X7はVもしくはAであり、X8はLもしくはVであり、X9はEもしくはDであり、X10はAもしくはVであり、X11はNもしくはTであり、X12はAもしくはPであり、X13はQもしくはKであり、X14はS、VもしくはPであり、X15はKもしくはRであり、X16はDもしくはSであり、X17はS、DもしくはNであり、X18はSもしくはTであり、X19はAもしくはPであり、X20はVもしくはTであり、X21はQもしくはGであり、X22はLもしくはVである、前記軽鎖可変配列
を含む。
いくつかの局面において、前記抗体または抗体断片は、
Figure 2024536133000004
の配列を有する重鎖可変配列であって、X1はQもしくはHであり、X2はA、D、T、V、SもしくはPであり、X3はT、SもしくはIであり、X4はNもしくはKであり、X5はP、S、TもしくはAであり、X6はT、R、KもしくはIであり、X7はA、T、V、SもしくはGであり、X8はS、RもしくはTであり、X9はA、VもしくはGであり、X10はEもしくはDであり、X11はLもしくはVであり、X12はA、T、VもしくはGであり、X13はA、R、F、T、P、V、S、D、N、H、L、YもしくはGであり、X14はTもしくはSである、前記重鎖可変配列、
および/または
Figure 2024536133000005
の配列を有する軽鎖可変配列であって、X1はA、TもしくはSであり、X2はNもしくはKであり、X3はL、FもしくはVであり、X4はA、SもしくはTであり、X5はQもしくはKであり、X6はA、PもしくはSであり、X7はKもしくはNであり、X8はL、VもしくはIであり、X9はGもしくはAであり、X10はTもしくはSであり、X11はSもしくはRであり、X12はAもしくはTであり、X13はV、IもしくはLであり、X14はT、NもしくはSである、前記軽鎖可変配列
を含む。
いくつかの局面において、前記抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:7、12～17、26～103および225～229からなる群から選択される配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:7、12～17、26～103および225～229の任意の1つと少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;ならびに/またはSEQ ID NO:8、19～24、105～157および230～234からなる群から選択される配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:8、19～24、105～157および230～234の任意の1つと少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列を含む。
いくつかの局面において、前記抗体または抗体断片は、以下を含む：
（i）SEQ ID NO:7に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:7と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:8に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:8と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（ii）SEQ ID NO:12に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:12と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:19に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:19と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（iii）SEQ ID NO:12に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:12と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:20に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:20と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（iv）SEQ ID NO:12に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:12と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:21に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:21と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（v）SEQ ID NO:12に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:12と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:22に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:22と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（vi）SEQ ID NO:12に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:12と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:23に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:23と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（vii）SEQ ID NO:12に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:12と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:24に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:24と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（viii）SEQ ID NO:13に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:13と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:19に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:19と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（ix）SEQ ID NO:13に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:13と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:20に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:20と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（x）SEQ ID NO:13に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:13と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:21に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:21と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xi）SEQ ID NO:13に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:13と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:22に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:22と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xii）SEQ ID NO:13に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:13と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:23に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:23と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xiii）SEQ ID NO:13に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:13と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:24に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:24と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xiv）SEQ ID NO:14に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:14と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:19に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:19と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xv）SEQ ID NO:14に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:14と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:20に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:20と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xvi）SEQ ID NO:14に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:14と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:21に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:21と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xvii）SEQ ID NO:14に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:14と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:22に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:22と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xviii）SEQ ID NO:14に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:14と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:23に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:23と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xix）SEQ ID NO:14に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:14と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:24に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:24と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xx）SEQ ID NO:15に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:15と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:19に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:19と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxi）SEQ ID NO:15に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:15と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:20に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:20と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxii）SEQ ID NO:15に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:15と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:21に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:21と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxiii）SEQ ID NO:15に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:15と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:22に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:22と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxiv）SEQ ID NO:15に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:15と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:23に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:23と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxv）SEQ ID NO:15に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:15と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:24に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:24と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxvi）SEQ ID NO:16に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:16と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:19に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:19と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxvii）SEQ ID NO:16に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:16と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:20に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:20と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxviii）SEQ ID NO:16に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:16と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:21に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:21と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxix）SEQ ID NO:16に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:16と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:22に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:22と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxx）SEQ ID NO:16に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:16と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:23に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:23と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxxi）SEQ ID NO:16に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:16と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:24に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:24と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxxii）SEQ ID NO:17に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:17と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:19に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:19と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxxiii）SEQ ID NO:17に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:17と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:20に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:20と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxxiv）SEQ ID NO:17に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:17と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:21に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:21と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxxv）SEQ ID NO:17に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:17と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:22に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:22と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxxvi）SEQ ID NO:17に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:17と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:23に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:23と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxxvii）SEQ ID NO:17に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:17と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:24に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:24と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxxviii）SEQ ID NO:26に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:26と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xxxix）SEQ ID NO:27に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:27と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xl）SEQ ID NO:28に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:28と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xli）SEQ ID NO:29に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:29と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xlii）SEQ ID NO:30に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:30と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:106に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:106と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xliii）SEQ ID NO:31に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:31と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xliv）SEQ ID NO:32に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:32と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xlv）SEQ ID NO:30に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:30と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:107に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:107と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xlvi）SEQ ID NO:33に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:33と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xlvii）SEQ ID NO:34に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:34と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xlviii）SEQ ID NO:30に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:30と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:108に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:108と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xlix）SEQ ID NO:30に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:30と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:109に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:109と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（l）SEQ ID NO:35に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:35と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（li）SEQ ID NO:36に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:36と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lii）SEQ ID NO:37に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:37と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（liii）SEQ ID NO:26に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:26と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:107に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:107と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（liv）SEQ ID NO:38に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:38と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lv）SEQ ID NO:31に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:31と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:110に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:110と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lvi）SEQ ID NO:39に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:39と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lvii）SEQ ID NO:40に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:40と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lviii）SEQ ID NO:34に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:34と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:111に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:111と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lix）SEQ ID NO:41に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:41と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:109に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:109と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lx）SEQ ID NO:30に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:30と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:112に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:112と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxi）SEQ ID NO:28に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:28と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:113に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:113と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;または
（lxii）SEQ ID NO:32に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:32と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:114に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:114と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxiii）SEQ ID NO:42に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:42と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxiv）SEQ ID NO:36に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:36と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:115に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:115と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxv）SEQ ID NO:43に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:43と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxvi）SEQ ID NO:32に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:32と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:109に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:109と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxvii）SEQ ID NO:44に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:44と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:116に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:116と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxviii）SEQ ID NO:35に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:35と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:117に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:117と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxix）SEQ ID NO:45に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:45と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxx）SEQ ID NO:46に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:46と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxi）SEQ ID NO:36に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:36と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:118に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:118と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxii）SEQ ID NO:47に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:47と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:115に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:115と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxiii）SEQ ID NO:48に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:48と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:109に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:109と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxiv）SEQ ID NO:49に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:49と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxv）SEQ ID NO:50に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:50と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxvi）SEQ ID NO:51に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:51と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:106に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:106と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxvii）SEQ ID NO:52に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:52と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:119に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:119と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxviii）SEQ ID NO:53に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:53と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:108に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:108と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxix）SEQ ID NO:54に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:54と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxx）SEQ ID NO:55に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:55と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:116に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:116と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxxi）SEQ ID NO:56に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:56と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:116に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:116と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxxii）SEQ ID NO:57に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:57と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:120に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:120と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxxiii）SEQ ID NO:58に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:58と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:121に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:121と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxxiv）SEQ ID NO:59に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:59と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:122に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:122と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxxv）SEQ ID NO:60に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:60と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:108に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:108と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxxvi）SEQ ID NO:61に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:61と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:123に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:123と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxxvii）SEQ ID NO:62に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:62と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:114に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:114と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxxviii）SEQ ID NO:63に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:63と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:124に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:124と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（lxxxix）SEQ ID NO:64に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:64と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xc）SEQ ID NO:65に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:65と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:125に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:125と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xci）SEQ ID NO:66に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:66と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xcii）SEQ ID NO:67に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:67と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:125に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:125と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xciii）SEQ ID NO:68に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:68と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:126に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:126と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xciv）SEQ ID NO:69に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:69と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:127に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:127と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xcv）SEQ ID NO:70に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:70と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:128に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:128と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xcvi）SEQ ID NO:71に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:71と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:117に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:117と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xcvii）SEQ ID NO:72に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:72と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:129に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:129と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xcviii）SEQ ID NO:73に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:73と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:130に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:130と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（xcix）SEQ ID NO:74に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:74と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:131に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:131と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（c）SEQ ID NO:73に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:73と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:132に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:132と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（ci）SEQ ID NO:75に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:75と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:133に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:133と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cii）SEQ ID NO:76に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:76と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:134に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:134と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（ciii）SEQ ID NO:77に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:77と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:107に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:107と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（civ）SEQ ID NO:78に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:78と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:135に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:135と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cv）SEQ ID NO:79に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:79と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:136に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:136と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cvi）SEQ ID NO:80に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:80と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:137に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:137と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cvii）SEQ ID NO:41に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:41と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:138に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:138と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cviii）SEQ ID NO:81に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:31と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:139に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:139と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cix）SEQ ID NO:82に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:82と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:105に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:105と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cx）SEQ ID NO:83に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:83と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:126に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:126と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxi）SEQ ID NO:84に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:84と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:140に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:140と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxii）SEQ ID NO:85に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:85と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:141に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:141と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxiii）SEQ ID NO:86に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:86と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:141に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:141と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxiv）SEQ ID NO:87に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:87と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:117に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:117と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxv）SEQ ID NO:88に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:88と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:142に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:142と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxvi）SEQ ID NO:89に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:89と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:143に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:143と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxvii）SEQ ID NO:90に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:90と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:144に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:144と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxviii）SEQ ID NO:91に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:91と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:109に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:109と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxix）SEQ ID NO:92に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:92と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:145に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:145と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxx）SEQ ID NO:93に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:93と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:146に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:146と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxxi）SEQ ID NO:94に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:94と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:147に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:147と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxxii）SEQ ID NO:95に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:95と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:148に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:148と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxxiii）SEQ ID NO:96に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:96と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:149に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:149と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxxiv）SEQ ID NO:97に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:97と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:150に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:150と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxxv）SEQ ID NO:98に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:98と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:151に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:151と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxxvi）SEQ ID NO:99に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:99と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:152に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:152と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxxvii）SEQ ID NO:100に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:100と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:136に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:136と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxxviii）SEQ ID NO:91に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:91と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:153に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:153と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxxix）SEQ ID NO:101に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:101と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:154に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:154と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxxx）SEQ ID NO:102に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:102と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:155に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:155と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;
（cxxxi）SEQ ID NO:36に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:36と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:156に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:156と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列;または
（cxxxii）SEQ ID NO:103に記載の配列を有する重鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:103と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖可変配列;および/もしくはSEQ ID NO:157に記載の配列を有する軽鎖可変配列、もしくはSEQ ID NO:157と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖可変配列。
いくつかの局面において、抗体または抗体断片は、
（a）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むVHCDR1、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むVHCDR2およびSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含み、SEQ ID NO:12と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％の同一性を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域と;
（b）SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むVLCDR1、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むVLCDR2およびSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含み、SEQ ID NO:19と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％の同一性を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域と
を含む。
一態様において、本態様の任意の1つによる抗体または抗体断片と同じHSP70上のエピトープへの結合について競合する抗体または抗体断片が本明細書において提供される。一態様において、本態様の任意の1つの抗体または抗体断片によって認識されるHSP70上のエピトープに結合する、または結合することができる抗体または抗体断片が、本明細書において提供される。
一態様において、抗体または抗体断片が本明細書において提供され、前記抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:11のK573～Q601に対応するペプチドによって定義されるHSP70のエピトープに結合する。いくつかの局面において、HSP70に結合されたときに、前記抗体または抗体断片は、以下の残基:SEQ ID NO:11のH594、K595およびQ601のうちの1つまたは2つに結合する。いくつかの局面において、HSP70に結合されたときに、前記抗体または抗体断片は、以下の残基:SEQ ID NO:11のH594、K595およびQ601のすべてに結合する。いくつかの局面において、HSP70に結合されたときに、前記抗体または抗体断片は、以下の残基:SEQ ID NO:11のK573、E576、W580、R596およびE598のうちの少なくとも1つにさらに結合する。いくつかの局面において、HSP70に結合されたときに、前記抗体または抗体断片は、以下の残基:SEQ ID NO:11のK573、E576、W580、R596およびE598のうちの少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つまたは少なくとも5つにさらに結合する。いくつかの局面において、HSP70に結合されたときに、前記抗体または抗体断片は、以下の残基:SEQ ID NO:11のK573、E576、W580、H594、K595、R596、E598およびQ601のすべてに結合する。いくつかの局面において、HSP70に結合すされたときに、前記抗体または抗体断片は、KEWHKREQ（SEQ ID NO:250）を含むHSP70のエピトープに結合する。
本態様のいずれかのいくつかの局面において、抗体はHSP70に結合するか、または結合することができる。本態様のいずれかのいくつかの局面において、抗体は、ADPが結合した形態のHSP70に結合するか、または結合することができる。本態様のいずれかのいくつかの局面において、抗体は、ペプチドが結合した形態のHSP70に結合するか、または結合することができる。本態様のいずれかのいくつかの局面において、抗体は、ADPが結合したおよびペプチドが結合した形態のHSP70に結合するか、または結合することができる。本態様のいずれかのいくつかの局面において、抗体は、変化した、例えば、増強された抗体依存性細胞傷害を示す。本態様のいずれかのいくつかの局面において、抗体は、変化した、例えば、増強された補体依存性細胞傷害を示す。本態様のいずれかのいくつかの局面において、抗体は、例えば単球/マクロファージおよび樹状細胞などの免疫エフェクター細胞によるHSP70取り込みを増強する。いくつかの局面において、取り込みは、ヒトFcγR1、ヒトFcγR2a、ヒトFcγR2b、ヒトFcγR2c、ヒトFcγR3aおよび/またはヒトFcγR3bによって媒介される。いくつかの局面において、抗体はHSP70に結合するか、または結合することができる。いくつかの局面において、抗体は、表面プラズモン共鳴またはOctetバイオレイヤー干渉法（BLI）分析によって決定された場合に、約50nM未満、約40nM未満、約30nM未満、約20nM未満、約10nM未満、約9nM未満、約8nM未満、約7nM未満、約6nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1nM未満、約0.9nM未満、約0.85nM未満、約0.8nM未満、約0.75nM未満、約0.7nM未満、約0.6nM未満、約0.5nM未満、約0.1nM未満、約0.05nMまたは約20pM未満、約10pM未満、約9pM未満、約8pM未満、約7pM未満、約6pM未満、約5pM未満、約4pM未満、約3pM未満、約2pM未満、約1pM未満、約0.9pM未満、約0.85pM未満、約0.8pM未満、約0.75pM未満、約0.7pM未満、約0.6pM未満、約0.5pM未満、約0.1pM未満または約0.05pM未満のKDで、ヒトHSP70（例えば、ADPが結合したおよび/またはペプチドが結合した形態のHSP70）に結合する。いくつかの局面において、抗体は、表面プラズモン共鳴またはOctetバイオレイヤー干渉法（BLI）分析によって決定された場合に、約50nM～約0.05nM、約50nM～約0.075nM、約50nM～約0.1nM、約50nM～約0.5nM、約50nM～約1nM、約40nM～約0.05nM、約40nM～約0.075nM、約40nM～約0.1nM、約40nM～約0.5nM、約40nM～約1nM、約30nM～約0.05nM、約30nM～約0.075nM、約30nM～約0.1nM、約30nM～約0.5nM、約30nM～約1nM、約20nM～約0.05nM、約20nM～約0.075nM、約20nM～約0.1nM、約20nM～約0.5nM、約20nM～約1nM、約10nM～約0.05nM、約10nM～約0.075nM、約10nM～約0.1nM、約10nM～約0.5nM、約10nM～約1nM、約5nM～約0.05nM、約5nM～約0.075nM、約5nM～約0.1nM、約5nM～約0.5nM、約5nM～約1nM、約3nM～約0.05nM、約3nM～約0.075nM、約3nM～約0.1nM、約3nM～約0.5nM、約3nM～約1nM、約3nM～約2nM、約2nM～約0.05nM、約2nM～約0.075nM、約2nM～約0.1nM、約2nM～約0.5nM、約2nM～約1nM、約1nM～約0.05nM、約1nM～約0.075nM、約1nM～約0.1nM、約1nM～約0.5nM、約0.5nM～約0.05nM、約0.5nM～約0.075nM、約0.5nM～約0.1nM、約0.1nM～約0.05nM、約0.1nM～約0.075nMまたは約0.075nM～約0.05nMのKDで、ヒトHSP70（例えば、ADPが結合したおよび/またはペプチドが結合した形態のHSP70）に結合する。いくつかの局面において、抗体は、表面プラズモン共鳴またはOctetバイオレイヤー干渉法（BLI）分析によって決定された場合に、約20pM～約0.05pM、約20pM～約0.075pM、約20pM～約0.1pM、約20pM～約0.5pM、約20pM～約1pM、約10pM～約0.05pM、約10pM～約0.075pM、約10pM～約0.1pM、約10pM～約0.5pM、約10pM～約1pM、約5pM～約0.05pM、約5pM～約0.075pM、約5pM～約0.1pM、約5pM～約0.5pM、約5pM～約1pM、約3pM～約0.05pM、約3pM～約0.075pM、約3pM～約0.1pM、約3pM～約0.5pM、約3pM～約1pM、約3pM～約2pM、約2pM～約0.05pM、約2pM～約0.075pM、約2pM～約0.1pM、約2pM～約0.5pM、約2pM～約1pM、約1pM～約0.05pM、約1pM～約0.075pM、約1pM～約0.1pM、約1pM～約0.5pM、約0.5pM～約0.05pM、約0.5pM～約0.075pM、約0.5pM～約0.1pM、約0.1pM～約0.05pM、約0.1pM～約0.075pMまたは約0.075pM～約0.05pMのKDで、ヒトHSP70（例えば、ADPが結合したおよび/またはペプチドが結合した形態のHSP70）に結合する。
いくつかの局面において、抗体は、HSP70に結合すると、高次の複合体を形成するか、または形成することができる。本明細書で使用される場合、「高次の複合体」という用語は、1:1の抗体:HSP70複合体以外の任意の複合体（例えば、1:2、2:1、2:2、2:4、5:10、または6:12の複合体）を指す。抗体:HSP70複合体は、例えば、少なくとも約250kDa（または約250kDa超）、少なくとも約290kDa（または約290kDa超）、少なくとも約300kDa（または約300kDa超）、少なくとも約400kDa（または約400kDa超）、少なくとも約500kDa（または約500kDa超）、少なくとも約580kDa（または約580kDa超）、少なくとも約600kDa（または約600kDa超）、少なくとも約700kDa（または約700kDa超）、少なくとも約800kDa（または約800kDa超）、少なくとも約900kDa（または約900kDa超）、少なくとも約1,000kDa（または約1,000kDa超）、少なくとも約1,100kDa（または約1,100kDa超）、少なくとも約1,200kDa（または約1,200kDa超）、少なくとも約1,300kDa（または約1,300kDa超）、少なくとも約1,400kDa（または約1,400kDa超）、少なくとも約1,450kDa（または約1,450kDa超）、少なくとも約1,500kDa（または約1,500kDa超）、少なくとも約1,600kDa（または約1,600kDa超）、少なくとも約1,700kDa（または約1,700kDa超）、少なくとも約1,750kDa（または約1,750kDa超）、少なくとも約1,800kDa（または約1,800kDa超）、少なくとも約1,900kDa（または約1,900kDa超）、または少なくとも約2,000kDa（または約2,000kDa超）の分子量を有し得る。抗体:HSP70複合体は、例えば、約250kDa、約290kDa、約300kDa、約400kDa、約500kDa、約580kDa、約600kDa、約700kDa、約800kDa、約900kDa、約1,000kDa、約1,100kDa、約1,200kDa、約1,300kDa、約1,400kDa、約1,450kDa、約1,500kDa、約1,600kDa、約1,700kDa、約1,750kDa、約1,800kDa、約1,900kDaまたは約2,000kDaの分子量を有し得る。ある局面において、抗体:HSP70複合体中での抗体のHSP70に対する比は約1:2である。例えば、抗体:HSP70複合体は、約1つの抗体分子および約2つのHSP70分子;約2つの抗体分子および約4つのHSP70分子;約3つの抗体分子および約6つのHSP70分子;約4つの抗体分子および約8つのHSP70分子;約5つの抗体分子および約10のHSP70分子;または約6つの抗体分子および約12のHSP70分子を含み得る。高次の複合体の形成は、例えば、本明細書の実施例18に記載されているサイズ排除クロマトグラフィーを含む、当技術分野で公知の任意の方法によって測定され得る。
いくつかの局面において、本明細書で提供される抗体:HSP70複合体（例えば、77AまたはそのFcバリアントを含む複合体）は、免疫エフェクター細胞、例えばヒト免疫エフェクター細胞を活性化する。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞、例えばヒト免疫エフェクター細胞は、CD8＋T細胞、CD4＋T細胞、NK細胞および樹状細胞、例えば未成熟樹状細胞を含む。
いくつかの態様において、本明細書において提供される抗体:HSP70複合体（例えば、77AまたはそのFcバリアントを含む複合体）は、CD8＋T細胞を活性化する。ある態様において、CD8＋T細胞のそのような活性化は、対照発現（例えば、処理されていないT細胞）と比較して、複合体で処理されたCD8＋T細胞における、活性化Th-1に偏ったサイトカイン、例えば表18のサイトカインのサイトカイン合成および分泌を増加させる。ある態様において、CD8＋T細胞のそのような活性化は、対照発現（例えば、処理されていないT細胞）と比較して、複合体で処理されたCD8＋T細胞における、活性化Th-1に偏ったサイトカイン、例えば、IL-12、IFB-γ、IFN-α、IL-8、G-CSF、GM-CSF、IFN-α2およびTNF-αのサイトカイン合成および分泌を増加させる。ある態様において、サイトカイン分泌は、対照（例えば、処理されていない細胞）と比較して少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％または少なくとも500％増加される。サイトカイン分泌を定量する方法は当技術分野で公知であり、例えば、限定されないが、サイトカインアレイを含む。
いくつかの態様において、本明細書において提供される抗体:HSP70複合体（例えば、77AまたはそのFcバリアントを含む複合体）は、CD4＋T細胞を活性化する。ある態様において、CD4＋T細胞のそのような活性化は、対照発現（例えば、処理されていないT細胞）と比較して、複合体で処理されたCD4＋T細胞における活性化サイトカイン、例えば表20のサイトカインのサイトカイン合成および分泌を増加させる。ある態様において、CD4＋T細胞のそのような活性化は、対照発現（例えば、処理されていないT細胞）と比較して、CD4＋T細胞における活性化サイトカイン、例えばIL-12、IL-10、IL-17A、IL-2、IL-8、IFN-γおよびIL-1bのサイトカイン合成および分泌を増加させる。ある態様において、サイトカイン分泌は、対照（例えば、処理されていない細胞）と比較して少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％または少なくとも500％増加される。サイトカイン分泌を定量する方法は当技術分野で公知であり、例えば、限定されないが、サイトカインアレイを含む。
いくつかの態様において、本明細書において提供される抗体:HSP70複合体（例えば、77AまたはそのFcバリアントを含む複合体）は、NK細胞におけるサイトカイン放出を活性化する。ある態様において、NK細胞のそのような活性化は、対照発現（例えば、処理されていないNK細胞）と比較して、複合体で処理されたNK細胞における活性化サイトカイン、例えば表19のサイトカインのサイトカイン合成および分泌を増加させる。ある態様において、NK細胞のそのような活性化は、対照発現（例えば、処理されていないNK細胞）と比較して、NK細胞における活性化サイトカイン、例えばIL-2、IL-2RaおよびM-CSFのサイトカイン合成および分泌を増加させる。ある態様において、サイトカイン分泌は、対照（例えば、処理されていない細胞）と比較して少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％または少なくとも500％増加される。サイトカイン分泌を定量する方法は当技術分野で公知であり、例えば、限定されないが、サイトカインアレイを含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供される抗体:HSP70複合体（例えば、77AまたはそのFcバリアントを含む複合体）は、樹状細胞、例えば未成熟および/または成熟樹状細胞を活性化する。ある態様において、樹状細胞、例えば未成熟樹状細胞のそのような活性化は、対照発現（例えば処理されていない樹状細胞、例えば未成熟樹状細胞）と比較して、例えばCD11c樹状細胞上のCD83活性化マーカーの発現を増加させる。ある態様において、CD83の発現は、対照（例えば、処理されていない細胞）と比較して少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％または少なくとも500％増加される。
いくつかの局面において、抗体（単独またはHSP70との複合体）は、ヒトFcγR（例えば、FcγR1、FcγR2a、FcγR2b、FcγR2c、FcγR3aおよび/またはFcγR3b）に結合するか、または結合することができる。いくつかの局面において、抗体（単独またはHSP70、例えば、そのADP結合および/もしくはペプチド結合形態のHSP70との複合体）は、表面プラズモン共鳴またはOctetバイオレイヤー干渉法（BLI）分析によって決定された場合に、約50nM未満、約40nM未満、約30nM未満、約20nM未満、約10nM未満、約9nM未満、約8nM未満、約7nM未満、約6nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1nM未満、約0.9nM未満、約0.85nM未満、約0.8nM未満、約0.75nM未満、約0.7nM未満、約0.6nM未満、約0.5nM未満、約0.1nM未満、約0.05nMまたは約20pM未満、約10pM未満、約9pM未満、約8pM未満、約7pM未満、約6pM未満、約5pM未満、約4pM未満、約3pM未満、約2pM未満、約1pM未満、約0.9pM未満、約0.85pM未満、約0.8pM未満、約0.75pM未満、約0.7pM未満、約0.6pM未満、約0.5pM未満、約0.1pM未満または約0.05pM未満のKDでヒトFcγR（例えば、FcγR1、FcγR2a、FcγR2b、FcγR2c、FcγR3aおよび/またはFcγR3b）に結合する。いくつかの局面において、抗体（単独またはHSP70、例えば、ADP結合されたおよび/もしくはペプチド結合された形態のHSP70との複合体）は、表面プラズモン共鳴またはOctetバイオレイヤー干渉法（BLI）分析によって決定された場合に、約50nM～約0.05nM、約50nM～約0.075nM、約50nM～約0.1nM、約50nM～約0.5nM、約50nM～約1nM、約40nM～約0.05nM、約40nM～約0.075nM、約40nM～約0.1nM、約40nM～約0.5nM、約40nM～約1nM、約30nM～約0.05nM、約30nM～約0.075nM、約30nM～約0.1nM、約30nM～約0.5nM、約30nM～約1nM、20nM～約0.05nM、約20nM～約0.075nM、約20nM～約0.1nM、約20nM～約0.5nM、約20nM～約1nM、約10nM～約0.05nM、約10nM～約0.075nM、約10nM～約0.1nM、約10nM～約0.5nM、約10nM～約1nM、約5nM～約0.05nM、約5nM～約0.075nM、約5nM～約0.1nM、約5nM～約0.5nM、約5nM～約1nM、約3nM～約0.05nM、約3nM～約0.075nM、約3nM～約0.1nM、約3nM～約0.5nM、約3nM～約1nM、約3nM～約2nM、約2nM～約0.05nM、約2nM～約0.075nM、約2nM～約0.1nM、約2nM～約0.5nM、約2nM～約1nM、約1nM～約0.05nM、約1nM～約0.075nM、約1nM～約0.1nM、約1nM～約0.5nM、約0.5nM～約0.05nM、約0.5nM～約0.075nM、約0.5nM～約0.1nM、約0.1nM～約0.05nM、約0.1nM～約0.075nMまたは約0.075nM～約0.05nMのKDで、ヒトFcγR（FcγR1、FcγR2a、FcγR2b、FcγR2c、FcγR3aおよび/またはFcγR3b）に結合する。
いくつかの局面において、重鎖可変領域配列、例えば、SEQ ID NO:7、12～17および26～103の任意の1つのVH配列またはその任意のバリアントは、当技術分野で公知の様々な重鎖定常領域配列に共有結合され得ることが想定される。同様に、軽鎖可変領域配列、例えば、SEQ ID NO:8、19～24および105～157の任意の1つのVLまたはその任意のバリアントは、当技術分野で公知の様々な軽鎖定常領域配列に共有結合され得ることが想定される。
例えば、抗体または抗体断片は、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgDおよびIgEの重鎖定常領域から選択される、特に、例えばIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4の（例えば、ヒト）重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を有し得る。別の態様において、抗体または抗体断片は、例えば、カッパまたはラムダの（例えば、ヒト）軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域を有する。定常領域は、抗体または抗体断片の特性を改変するために（例えば、Fc受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能および/または補体機能のうちの1つまたは複数を増加または減少させるために）変化させること、例えば変異させることができる。一態様において、抗体または抗体断片はエフェクター機能を有し、補体を固定することができる。
いくつかの局面において、抗体または抗体断片の重鎖の定常領域は、ヒトIgG1アイソタイプであり、アミノ酸配列:
Figure 2024536133000006
を有する。
いくつかの局面において、ヒトIgG1定常領域は、アミノ酸Gly236（SEQ ID NO:235では位置119、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばGly236Ala（G236A））、例えば、IgG1定常領域は、SEQ ID NO:236のアミノ酸配列（GA）を含む。いくつかの局面において、ヒトIgG1定常領域は、（i）アミノ酸Gly236（SEQ ID NO:235では位置119、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばGly236Ala（G236A））、（ii）アミノ酸Ala330（SEQ ID NO:235では位置213、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばAla330Leu（A330L））、および/または（iii）アミノ酸Ile332（SEQ ID NO:235では位置215、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばIle332Glu（I332E））、例えばIgG1定常領域は、SEQ ID NO:237のアミノ酸配列（GAALIE）を含む。いくつかの局面において、ヒトIgG1定常領域は、（i）アミノ酸Met252（SEQ ID NO:235では位置135、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばMet252Tyr（M252Y））、（ii）アミノ酸Ser254（SEQ ID NO:235では位置137、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばSer254Thr（S254T））、および/または（iii）アミノ酸Thr256（SEQ ID NO:235では位置139、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばThr256Glu（T256E））、例えばIgG1定常領域は、SEQ ID NO:238のアミノ酸配列（YTE）を含む。いくつかの局面において、ヒトIgG1定常領域は、（i）アミノ酸Met428（SEQ ID NO:235の位置311、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばMet428Leu（M428L））、および/または（ii）アミノ酸Asn434（SEQ ID NO:235の位置317、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばAsn434Ser（N434S））、例えば、IgG1定常領域は、SEQ ID NO:239のアミノ酸配列（LS）を含む。いくつかの局面において、ヒトIgG1定常領域は、（i）アミノ酸Thr307（SEQ ID NO:235では位置190、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばThr307Gln（T307Q））、（ii）アミノ酸Gln311（SEQ ID NO:235では位置194、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばGln311Val（Q311V））、および/または（iii）アミノ酸Ala378（SEQ ID NO:235では位置261、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばAla378Val（A378V））、例えばIgG1定常領域は、SEQ ID NO:240のアミノ酸配列（DF215）を含む。いくつかの局面において、ヒトIgG1定常領域は、（i）アミノ酸Thr256（SEQ ID NO:235の位置139、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばThr256Asp（T256D））、（ii）アミノ酸Asn286（SEQ ID NO:235の位置169、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばAsn286Asp（N286D））、（iii）アミノ酸Thr307（SEQ ID NO:235の位置190、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）、例えばThr307Arg（T307R）、（iv）アミノ酸Gln311（SEQ ID NO:235の位置194、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばGln311Val（Q311V））、および/または（v）アミノ酸Ala378（SEQ ID NO:235の位置261、前の段落のSEQ ID NO:235では枠で囲まれている）において修飾されており（例えばAla378Val（A378V））、例えばIgG1定常領域は、SEQ ID NO:241のアミノ酸配列（DF228）を含む。別段の指示がない限り、すべての残基番号は、EUナンバリング（Kabat,E.A.,et al.（1991）Sequences Of Proteins Of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242）に従う。
いくつかの局面において、抗体または抗体断片の重鎖の定常領域は、ヒトIgG1アイソタイプであり、アミノ酸配列:
Figure 2024536133000007
を有する。
いくつかの局面において、ヒトIgG1定常領域は、抗体のグリコシル化を妨げるために、アミノ酸Asn297（前段落中のSEQ ID NO:217において枠で囲まれている）において改変されている（例えば、Asn297Ala（N297A））。いくつかの局面において、抗体の定常領域は、Fc受容体相互作用を変化させるために、アミノ酸Leu235（前段落中のSEQ ID NO:217において枠で囲まれている）において改変されている（例えば、Leu235Glu（L235E）またはLeu235Ala（L235A））。いくつかの局面において、抗体の定常領域は、Fc受容体相互作用を変化させるために、アミノ酸Leu234（前段落中のSEQ ID NO:217において枠で囲まれている）において改変されている（例えば、Leu234Ala（L234A））。いくつかの局面において、抗体の定常領域は、アミノ酸Glu233（前段落中のSEQ ID NO:217において枠で囲まれている）において改変されている（例えば、Glu233Pro（E233P））。いくつかの局面において、抗体の定常領域は、アミノ酸234および235の両方において変化している、例えばLeu234AlaおよびLeu235Ala（L234A/L235A）。いくつかの局面において、抗体の定常領域は、アミノ酸233、234および234において変化している、例えば、Glu233Pro、Leu234AlaおよびLeu235Ala（E233P L234A/L235A）（Armour KL.et al.（1999）Eur.J.Immunol.29（8）:2613-24）。すべての残基番号は、EUナンバリング（Kabat,E.A.,et al.（1991）Sequences Of Proteins Of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242）に従う。
いくつかの局面において、抗体の重鎖の定常領域は、ヒトIgG1アイソタイプであり、アミノ酸配列:
Figure 2024536133000008
を有する。
いくつかの局面において、ヒトIgG1定常領域は、抗体のグリコシル化を妨げるために、アミノ酸Asn297（前段落中のSEQ ID NO:218において枠で囲まれている）において改変されている（例えば、Asn297Ala（N297A））。いくつかの局面において、抗体の定常領域は、Fc受容体相互作用を変化させるために、アミノ酸Leu235（前段落中のSEQ ID NO:218において枠で囲まれている）において改変されている（例えば、Leu235Glu（L235E）またはLeu235Ala（L235A））。いくつかの局面において、抗体の定常領域は、Fc受容体相互作用を変化させるために、アミノ酸Leu234（前段落中のSEQ ID NO:218において枠で囲まれている）において改変されている（例えば、Leu234Ala（L234A））。いくつかの局面において、抗体の定常領域は、アミノ酸Glu233（前段落中のSEQ ID NO:218において枠で囲まれている）において改変されている（例えば、Glu233Pro（E233P））。いくつかの局面において、抗体の定常領域は、アミノ酸234および235の両方において変化している、例えばLeu234AlaおよびLeu235Ala（L234A/L235A）。いくつかの局面において、抗体の定常領域は、アミノ酸233、234および234において変化している、例えば、Glu233Pro、Leu234AlaおよびLeu235Ala（E233P L234A/L235A）（Armour KL.et al.（1999）Eur.J.Immunol.29（8）:2613-24）。すべての残基番号は、EUナンバリング（Kabat,E.A.,et al.,前出）に従う。
いくつかの局面において、ヒトIgG1定常領域は、第2の定常領域とのヘテロ二量体化のために、「ノブ」変異、例えば、T366Y、または「ホール」変異、例えば、Y407Tのいずれかを含むように改変されている（EUナンバリング（Kabat,E.A.,et al.,前出）に従う残基番号）。
いくつかの局面において、抗体の重鎖の定常領域は、ヒトIgG1アイソタイプ、例えばヒトIgG1アイソタイプのアロタイプ、例えばIgG1 G1m3アロタイプである。例示的なヒトIgG1アロタイプは、Magdelaine-Beuzelin et al.,（2009）Pharmacogenet.Genomics 19（5）:383-7に記載されている。
いくつかの局面において、抗体の重鎖の定常領域は、ヒトIgG2アイソタイプであり、アミノ酸配列:
Figure 2024536133000009
を有する。
いくつかの局面において、ヒトIgG2定常領域は、抗体のグリコシル化を妨げるために、アミノ酸Asn297（前段落中のSEQ ID NO:219において枠で囲まれている）において改変されており（例えば、Asn297Ala（N297A））、残基番号は、EUナンバリング（Kabat,E.A.,et al.,前出）に従う。
いくつかの局面において、抗体の重鎖の定常領域は、ヒトIgG3アイソタイプであり、アミノ酸配列:
Figure 2024536133000010
を有する。
いくつかの局面において、ヒトIgG3定常領域は、抗体のグリコシル化を妨げるために、アミノ酸Asn297（前段落中のSEQ ID NO:220において枠で囲まれている）において改変されている（例えば、Asn297Ala（N297A））。いくつかの局面において、ヒトIgG3定常領域は、半減期を延長するために、アミノ酸Arg435（前段落中のSEQ ID NO:220において枠で囲まれている）において改変されている（例えば、Arg435H（R435H））。すべての残基番号は、EUナンバリング（Kabat,E.A.,et al.,前出）に従う。
いくつかの局面において、抗体の重鎖の定常領域は、ヒトIgG4アイソタイプであり、アミノ酸配列:
Figure 2024536133000011
を有する。
いくつかの局面において、ヒトIgG4定常領域は、鎖交換を防止または低減するためにヒンジ領域内で改変されており、例えば、いくつかの局面において、ヒトIgG4定常領域は、Ser228（前段落中のSEQ ID NO:221において枠で囲まれている）において改変されている（例えばSer228Pro（S228P））。他の態様において、ヒトIgG4定常領域は、Fc受容体相互作用を変化させるために、アミノ酸Leu235（前段落中のSEQ ID NO:221において枠で囲まれている）において改変されている（例えば、Leu235Glu（L235E））。いくつかの局面において、ヒトIgG4定常領域は、Ser228およびLeu335の両方において改変されている（例えば、Ser228ProおよびLeu235Glu（S228P/L235E））。いくつかの局面において、ヒトIgG4定常領域は、抗体のグリコシル化を妨げるために、アミノ酸Asn297（前段落中のSEQ ID NO:221において枠で囲まれている）において改変されている（例えば、Asn297Ala（N297A））。すべての残基番号は、EUナンバリング（Kabat,E.A.,et al., 前出）に従う。
いくつかの局面において、ヒトIgG定常領域は、FcRn結合を増強するように改変される。FcRnへの結合を増強するFc変異の例は、Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu（それぞれ、M252Y、S254T、T256E）（Dall'Acqua et al.（2006）J.Biol.Chem. 281（33）:23514-23524）、またはMet428LeuおよびAsn434Ser（M428L、N434S）（Zalevsky et al.（2010）Nature Biotech. 28（2）:157-159）である。すべての残基番号は、EUナンバリング（Kabat,E.A.,et al., 前出）に従う。
いくつかの局面において、ヒトIgG定常領域は、抗体依存性細胞傷害性（ADCC）および/または補体依存性細胞傷害性（CDC）を変化させるように修飾されている、例えば、Natsume et al.（2008）Cancer Res. 68（10）:3863-72;Idusogie et al.（2001）J.Immunol. 166（4）:2571-5;Moore et al.（2010）mAbs 2（2）:181-189;Lazar et al.（2006）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103（11）:4005-4010,Shields et al.（2001）J.Biol.Chem. 276（9）:6591-6604;Stavenhagen et al.（2007）Cancer Res. 67（18）:8882-8890;Stavenhagen et al.（2008）Advan.Enzyme Regul. 48:152-164;Alegre et al.（1992）J.Immunol. 148:3461-3468に記載されているアミノ酸修飾。
いくつかの局面において、ヒトIgG定常領域は、ヘテロ二量体化を誘導するように修飾されている。例えば、CH3ドメイン内にThr366にアミノ酸修飾、例えば、より嵩高いアミノ酸、例えば、Tyrでの置換（T366W）を有する重鎖は、それぞれ、位置Thr366、Leu368およびTyr407において、より嵩高くないアミノ酸、例えば、Ser、AlaおよびValへのアミノ酸修飾（T366S/L368A/Y407V）を有するCH3ドメインを有する第2の重鎖と優先的に対を形成することができる。CH3修飾を介したヘテロ二量体化は、ジスルフィド結合の導入によって、例えば、対向するCH3ドメイン上でSer354をCysに（S354C）、Y349をCysに（Y349C）変えることによって、さらに安定化させることができる（Carter（2001）J.Immunol.Methods 248:7-15）。
いくつかの局面において、抗体の軽鎖の定常領域は、ヒトκ定常領域、例えば、アミノ酸配列:
Figure 2024536133000012
を有するヒトκ定常領域である。
いくつかの局面において、抗体の軽鎖の定常領域は、ヒトκ定常領域、例えば、アミノ酸配列:
Figure 2024536133000013
を有するヒトκ定常領域である。
いくつかの局面において、抗体の軽鎖の定常領域は、ヒトλ定常領域、例えば、アミノ酸配列:
Figure 2024536133000014
を有するヒトλ定常領域である。
いくつかの局面において、抗体または抗体断片は、
（a）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むVHCDR1と、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むVHCDR2と、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むVHCDR3とを含む、免疫グロブリン重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むVLCDR1と、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むVLCDR2と、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むVLCDR3とを含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域;ならびに
（b）（i）SEQ ID NO:242と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖;および/もしくはSEQ ID NO:249と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖;
（ii）SEQ ID NO:243と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖;および/もしくはSEQ ID NO:249と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖;
（iii）SEQ ID NO:244と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖;および/もしくはSEQ ID NO:249と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖;
（iv）SEQ ID NO:245と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖;および/もしくはSEQ ID NO:249と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖;
（v）SEQ ID NO:246と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖;および/もしくはSEQ ID NO:249と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖;
（vi）SEQ ID NO:247と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖;および/もしくはSEQ ID NO:249と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖;または
（vii）SEQ ID NO:248と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖;および/もしくはSEQ ID NO:249と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖
を含む。
いくつかの局面において、抗体または抗体断片は、
（i）SEQ ID NO:242に記載の配列を有する重鎖、もしくはSEQ ID NO:242と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖;および/もしくはSEQ ID NO:249に記載の配列を有する軽鎖、もしくはSEQ ID NO:249と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖;
（ii）SEQ ID NO:243に記載の配列を有する重鎖、もしくはSEQ ID NO:243と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖;および/もしくはSEQ ID NO:249に記載の配列を有する軽鎖、もしくはSEQ ID NO:249と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖;
（iii）SEQ ID NO:244に記載の配列を有する重鎖、もしくはSEQ ID NO:244と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖;および/もしくはSEQ ID NO:249に記載の配列を有する軽鎖、もしくはSEQ ID NO:249と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖;
（iv）SEQ ID NO:245に記載の配列を有する重鎖、もしくはSEQ ID NO:245と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖;および/もしくはSEQ ID NO:249に記載の配列を有する軽鎖、もしくはSEQ ID NO:249と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖;
（v）SEQ ID NO:246に記載の配列を有する重鎖、もしくはSEQ ID NO:246と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖;および/もしくはSEQ ID NO:249に記載の配列を有する軽鎖、もしくはSEQ ID NO:249と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖;
（vi）SEQ ID NO:247に記載の配列を有する重鎖、もしくはSEQ ID NO:247と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖;および/もしくはSEQ ID NO:249に記載の配列を有する軽鎖、もしくはSEQ ID NO:249と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖;または
（vii）SEQ ID NO:248に記載の配列を有する重鎖、もしくはSEQ ID NO:248と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する重鎖;および/もしくはSEQ ID NO:249に記載の配列を有する軽鎖、もしくはSEQ ID NO:249と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する軽鎖
を含む。
III. 薬学的製剤
本開示は、HSP70を選択的に標的とする抗体を含む薬学的組成物を提供する。このような組成物は、予防的または治療的有効量の抗体またはその断片と薬学的に許容され得る担体とを含む。
「薬学的または薬理学的に許容され得る」という語句は、適宜、ヒトなどの動物に投与された場合に有害な、アレルギー性の、またはその他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。抗体またはさらなる有効成分を含む薬学的組成物の調製は、本開示に照らして当業者に公知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与のために、調製物は、FDA Office of Biological Standardsによって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の基準を満たさなければならないことが理解されるであろう。
有効成分は、非経口投与用に製剤化することができ、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内経路を介した注射用に製剤化することができる。典型的には、このような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができ、注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するための使用に適した固体形態も調製することができ、製剤を乳化させることもできる。
本態様の治療用組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能な組成物の形態で有利に投与され、注射前に液体中に溶解または懸濁するのに適した固体形態も調製され得る。これらの調製物も乳化され得る。
注射可能な使用に適した薬学的形態には、無菌の水溶液または分散液;ゴマ油、落花生油、または水性プロピレングリコールを含む製剤;および無菌の注射可能溶液または分散液の即時の調製のための無菌粉末が含まれる。すべての場合において、前記形態は無菌でなければならず、容易に注射され得る程度に流動性でなければならない。前記形態はまた、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。
タンパク質性組成物は、中性形態または塩形態に製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩には、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が含まれる。遊離のカルボキシル基とともに形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。
薬学的組成物は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒を含むことができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によっておよび界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の抑制は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの事例では、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤も含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、持続放出製剤などの形態をとることができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。適切な薬学的作用物質の例は、Remington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。このような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するように、適切な量の担体とともに、好ましくは精製された形態で、予防的または治療的有効量の抗体またはその断片を含有する。
抗体の受動的移行は、一般に、静脈内または筋肉内注射の使用を伴う。その結果生じる免疫は一般に短期間しか持続せず、特に非ヒト起源のガンマグロブリンに起因する、過敏反応および血清病の潜在的リスクも存在する。抗体は、注射に適した担体、すなわち無菌および注射可能な担体中に製剤化され得る。
一般に、本開示の組成物の成分は、別々にまたは単位剤形中に一緒に混合されて供給され、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの気密容器内の乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、組成物は、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入瓶によって投薬することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
ある特定の態様において、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約0.1％の有効成分を含み得る。他の態様において、有効成分は、単位の重量の約2％～約75％、または例えば約25％～約60％、およびその中の導出可能な任意の範囲を含み得る。
「単位用量」または「投与量」という用語は、対象における使用に適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち適切な経路および処置レジメンに関連して上述した所望の応答を生じるように計算された所定量の治療用組成物を含有する。処置の回数および単位用量の両方に従う投与されるべき量は、所望される効果に依存する。患者または対象に投与される本態様の組成物の実際の投与量は、対象の体重、年齢、健康状態および性別、処置されている疾患の種類、疾患浸透の程度、以前のまたは同時の治療的介入、患者の特発性疾患、投与経路、ならびに特定の治療物質の効力、安定性および毒性などの物理的および生理学的要因によって決定することができる。例えば、用量は、投与当たり約1μg/kg/体重～約1000mg/kg/体重（このような範囲は介在する用量を含む）またはそれより多く、およびその中で導出可能な任意の範囲も含み得る。本明細書に列記される数から導出可能な範囲の非限定的な例では、約5μg/kg/体重～約100mg/kg/体重、約5μg/kg/体重～約500mg/kg/体重などの範囲を投与することができる。投与を担当する医師は、いずれにせよ、組成物中の有効成分の濃度および個々の対象に対する適切な用量を決定する。
IV. 処置の方法
本態様のある局面は、例えば肺がん、前立腺がん、胃がん、甲状腺がん、乳がん、多発性骨髄腫、メラノーマ、結腸がん、または膵がん等のがんなどの、上昇したレベルのHSP70を伴う疾患または障害を予防または処置するために使用することができる。HSP70の機能は、任意の適切な薬物、例えば抗HSP70抗体によって低下され得る。
本明細書で使用される「がん」という用語は、固形腫瘍、転移性がんまたは非転移性がんを記述するために使用され得る。ある特定の態様において、がんは、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮に由来し得る。
がんは、具体的には、以下の組織型のものであり得るが、これらに限定されない:新生物、悪性;癌;癌、未分化;巨細胞および紡錘細胞癌;小細胞癌;乳頭癌;扁平上皮癌;リンパ上皮癌;基底細胞癌;石灰化上皮癌;移行上皮癌;乳頭状移行上皮癌;腺癌;ガストリノーマ、悪性;胆管癌;肝細胞癌;複合型肝細胞癌および胆管癌;索状腺癌;腺様嚢胞癌;腺腫性ポリープにおける腺癌;腺癌、家族性大腸ポリポーシス;固形癌;カルチノイド腫瘍、悪性;細気管支肺胞腺癌;乳頭状腺癌;嫌色素性癌;好酸球癌;好酸性腺癌;好塩基球癌;明細胞腺癌;顆粒細胞癌;濾胞腺癌;乳頭状および濾胞腺癌;非被包性硬化性癌;副腎皮質癌;類内膜癌;皮膚付属器癌;アポクリン腺癌;皮脂腺癌;耳道腺癌;粘膜表皮癌;嚢胞腺癌;乳頭状嚢胞腺癌;乳頭状漿液性嚢胞腺癌;粘液性嚢胞腺癌;粘液性腺癌;印環細胞癌;浸潤性乳管癌;髄様癌;小葉癌;炎症性癌;パジェット病、乳房;腺房細胞癌;腺扁平上皮癌;扁平上皮化生を伴う腺癌;胸腺腫、悪性;卵巣間質腫瘍、悪性;莢膜細胞腫、悪性;顆粒膜細胞腫瘍、悪性;セルトリ間質細胞腫瘍、悪性;セルトリ細胞癌;ライディッヒ細胞腫瘍、悪性;脂質細胞腫瘍、悪性;傍神経節腫、悪性;乳房外傍神経節腫、悪性;褐色細胞腫;血管球血管肉腫;悪性黒色腫;無色素性黒色腫;表在拡大型黒色腫;巨大色素性母斑における悪性黒色腫;類上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児性横紋筋肉腫;肺胞横紋筋肉腫;間質肉腫;混合腫瘍、悪性;ミュラー管混合腫瘍;腎芽腫;肝芽腫;癌肉腫;間葉腫、悪性;ブレンナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胚性癌;奇形腫、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛癌;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管周囲細胞腫、悪性;リンパ管肉腫;骨肉腫;傍骨性骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽細胞腫、悪性;間葉性軟骨肉腫;骨巨細胞腫;ユーイング肉腫;歯原性腫瘍、悪性;エナメル上皮歯牙肉腫;エナメル上皮腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣腫;星状細胞腫;原形質性星状細胞腫;線維性星細胞腫;星状芽細胞腫;神経膠芽腫;乏突起神経膠腫;乏突起神経膠芽細胞腫;原始神経外胚葉性;小脳肉腫;神経節芽細胞腫;神経芽細胞腫;網膜芽細胞腫;嗅神経原性腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経鞘腫、悪性;顆粒細胞腫瘍、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病;ホジキン;傍肉芽腫;悪性リンパ腫、小リンパ球性;悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性;悪性リンパ腫、濾胞性;菌状息肉症;他の特定型非ホジキンリンパ腫;悪性組織球症;多発性骨髄腫;肥満細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;形質細胞性白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞白血病;骨髄性白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;肥満細胞白血病;巨核芽球性白血病;骨髄性肉腫;および有毛細胞白血病。
ある特定の態様では、開示される組成物または方法を用いて処理される対象の血清（または対象からの血清試料）は、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、または30ng/mlを超えるHSP70レベルを有する。
それにもかかわらず、本発明は、非がん性疾患（例えば、真菌感染症、細菌感染症、ウイルス感染症、神経変性疾患および/または遺伝性障害）を処置するためにも使用され得ることも認識されている。
ある特定の態様では、本態様の組成物および方法は、化学療法または免疫療法などの第2のまたは追加の治療と組み合わせて、HSP70に対する抗体または抗体断片を含む。このような療法は、上昇したHSP70を伴う任意の疾患の処置において適用することができる。例えば、疾患はがんであり得る。
併用療法を含む前記方法および組成物は、治療効果もしくは保護効果を増強し、および/または別の抗がん療法もしくは抗過剰増殖療法の治療効果を増加させる。治療的および予防的方法および組成物は、がん細胞の死滅および/または細胞過剰増殖の阻害などの所望の効果を達成するのに有効な組み合わせた量で提供することができる。この過程は、細胞を抗体または抗体断片および第2の治療の両方と接触させることを含み得る。組織、腫瘍または細胞は、1つもしくは複数の作用物質（すなわち、抗体もしくは抗体断片または抗がん剤）を含む1つもしくは複数の組成物もしくは薬理学的製剤と接触させることができ、または組織、腫瘍および/もしくは細胞を2つもしくはそれより多くの異なる組成物もしくは製剤と接触させることによって接触させることができ、ここで、1つの組成物は、1）抗体もしくは抗体断片、2）抗がん剤、または3）抗体もしくは抗体断片および抗がん剤の両方を提供する。また、このような併用療法は、化学療法、放射線療法、外科療法または免疫療法と組み合わせて使用することができると考えられる。
「接触された」および「曝露された」という用語は、細胞に適用される場合、治療構築物および化学療法剤または放射線療法剤が標的細胞に送達されるか、または標的細胞と直接並置して配置される過程を記述するために本明細書で使用される。細胞死滅を達成するために、例えば、両作用物質は、細胞を死滅させるか、または細胞が分裂するのを防ぐのに有効な併用量で細胞に送達される。
抗体は、抗がん処置に対して前、間、後、または様々な組み合わせで投与され得る。投与は、同時から数分、数日、数週間の範囲の間隔であり得る。抗体または抗体断片が抗がん剤とは別個に患者に提供される態様においては、2つの化合物が依然として患者に対して有利に併用効果を発揮することができるように、一般に、各送達の時間の間に著しい期間が経過しないようにするであろう。このような例では、互いに約12～約24または約72時間以内、より具体的には、互いに約6～約12時間以内に抗体療法および抗がん療法を患者に提供し得ることが考えられる。いくつかの状況において、処置の期間を大幅に延長することが望ましいことがあり得、この場合、それぞれの投与の間に数日（2、3、4、5、6または7）～数週間（1、2、3、4、5、6、7または8）が経過する。
ある特定の態様において、一連の処置は、1～90日またはそれを超えて続くであろう（このような範囲には、介在する日が含まれる）。ある作用物質は、1日目～90日目の任意の日（このような範囲には、介在する日が含まれる）またはこれらの任意の組み合わせに与えられ得、別の作用物質は、1日目～90日目の任意の日（このような範囲には、介在する日が含まれる）またはこれらの任意の組み合わせに与えられることが想定される。1日（24時間）以内に、患者には、単回または複数回の作用物質の投与が与えられ得る。さらに、一連の処置の後、抗がん処置が投与されない期間が存在することが想定される。この期間は、患者の予後、強度、健康状態などの患者の状態に応じて、1～7日間、および/または1～5週間、および/または1～12か月またはそれより長く（このような範囲には、介在する日が含まれる）継続し得る。処置サイクルは必要に応じて繰り返されることが予想される。
様々な組み合わせが使用され得る。以下の例では、抗体療法は「A」であり、抗がん療法は「B」である。
Figure 2024536133000015
本態様の任意の化合物または治療の患者への投与は、もし存在すれば作用物質の毒性を考慮に入れて、このような化合物の投与のための一般的なプロトコルに従う。したがって、いくつかの態様において、併用療法に起因する毒性をモニターする工程が存在する。
A. 化学療法
本態様によれば、多種多様な化学療法剤が使用され得る。「化学療法」という用語は、がんを処置するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの処置において投与される化合物または組成物を意味するために使用される。これらの作用物質または薬物は、細胞内でのそれらの活性の様式、例えば、それらが細胞周期に影響を与えるかどうか、およびどの段階で影響を与えるかによって分類される。あるいは、作用物質は、DNAを直接架橋する、DNA中に挿入する、または核酸合成に影響を与えることによって染色体および有糸分裂の異常を誘発するその能力に基づいて特徴付けられ得る。
化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロスホスファミドなどのアルキル化剤;ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホナート;ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メチュレドーパ（meturedopa）およびウレドーパ（uredopa）などのアジリジン;アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamine）を含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン（methylamelamine）;アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）;カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）;ブリオスタチン;カリスタチン;CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）;クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン1およびクリプトフィシン8）;ドラスタチン;デュオカルマイシン（合成類似体、KW-2189およびCB1-TM1を含む）;エロイテロビン（eleutherobin）;パンクラチスタチン;サルコジクチイン;スポンジスタチン;クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（novembichin）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミドおよびウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード;カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン（ranimnustine）などのニトロソ尿素（nitrosurea）;エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマlIおよびカリケアマイシンオメガI1）などの抗生物質;ダイネマイシンAを含むダイネマイシン（dynemicin）;クロドロネートなどのビスホスホナート;エスペラミシン;ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（authrarnycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンCなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（nogalarnycin）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシン;メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）などの代謝拮抗剤;デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体;フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリンおよびチオグアニンなどのプリン類似体;アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビンおよびフロクスウリジンなどのピリミジン類似体;カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタンおよびテストラクトンなどのアンドロゲン;ミトタンおよびトリロスタンなどの抗副腎剤（anti-adrenal）;フロリン酸（frolinic acid）などの葉酸補充剤;アセグラトン;アルドホスファミド配糖体;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキサート（edatraxate）;デフォファミン（defofamine）;デメコルチン;ジアジコン;エルフォルミチン;酢酸エリプチニウム;エポチロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダイニン;マイタンシンおよびアンサミトシンなどのマイタンシノイド;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール;ニトラエリン（nitraerine）;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;ポドフィリン酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK多糖複合体;ラゾキサン;リゾキシン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン;2,2'、2''-トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン（特にT-2毒素、ベラクリンA（verracurin A）、ロリジンAおよびアングイジン（anguidine））;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン（gacytosine）;アラビノシド（「Ara-C」）;シクロホスファミド;タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなどの白金配位錯体;ビンブラスチン;白金;エトポシド（VP-16）;イホスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ノバントロン;テニポシド;エダトレキサート;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロナート;イリノテカン（例えば、CPT-11）;トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000;ジフルオロメチルオルニチン（DFMO）;レチノイン酸などのレチノイド;カペシタビン;カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン（gemcitabien）、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質転移酵素阻害剤、トランスプラチナ（transplatinum）、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体が含まれる。
B. 放射線療法
DNA損傷を引き起こし、広く使用されてきた他の要因には、一般にγ線、X線および/または腫瘍細胞への放射性同位体の指向された送達として知られているものが含まれる。マイクロ波、陽子線照射（米国特許第5,760,395号および同第4,870,287号）およびUV照射などの他の形態のDNA損傷因子も企図される。これらの要因はすべて、DNA、DNAの前駆体、DNAの複製と修復、および染色体の組み立てと維持に対する広範囲の損傷に影響を与える可能性が最も高い。X線の線量範囲は、長期間（3～4週間）の1日当たり50～200レントゲンの線量から、2000～6000レントゲンの単回線量までの範囲である。放射性同位体の線量範囲は大きく異なり、同位体の半減期、放出される放射線の強度および種類ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。ある特定の態様では、本開示の抗体は、放射線療法、例えばγ線、X線、および/または腫瘍細胞に対する放射性同位体の直接送達と組み合わせて使用される。
C. 免疫療法
当業者は、免疫療法が本態様の方法と組み合わせてまたは併せて使用され得ることを理解するであろう。がん処置の状況において、免疫療法薬は、一般に、がん細胞を標的にして破壊するために免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存している。リツキシマブ（RITUXAN（登録商標））はそのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のあるマーカーに対して特異的な抗体であり得る。抗体は単独で治療のエフェクターとして機能し得るか、または他の細胞を動員して細胞死滅に実際に影響を及ぼし得る。抗体は、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合され、単に標的化剤としても機能し得る。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を運搬するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性T細胞およびNK細胞が含まれる。
免疫療法の一局面において、腫瘍細胞は、標的化に適した、すなわち他の細胞の大部分に存在しない何らかのマーカーを持たなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれもが、本態様の文脈での標的化に適切であり得る。一般的な腫瘍マーカーには、B細胞成熟抗原、CD20、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（p97）、gp68、GPRC5D、TAG-72、HMFG、シアリルルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、ラミニン受容体、erb Bおよびp155が含まれる。免疫療法の別の局面は、抗がん効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、ガンマ-IFNなどのサイトカイン、MIP-1、MCP-1、IL-8などのケモカイン、およびFLT3リガンドなどの成長因子を含む免疫刺激分子も存在する。
現在調査中または使用中の免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物（米国特許第5,801,005号および同第5,739,169号; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998）;サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、IL-1、GM-CSFおよびTNF（Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998）;遺伝子療法、例えば、TNF、IL-1、IL-2およびp53（Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; 米国特許第5,830,880号および同第5,846,945号）;ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗CD20、抗ガングリオシドGM2、ならびに抗p185（Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; 米国特許第5,824,311号）である。1つまたは複数の抗がん療法が、本明細書に記載される抗体療法とともに使用され得ることが想定される。
いくつかの局面において、本明細書に記載される組み合わせは、ケモカイン（C-X-Cモチーフ）受容体2（CXCR2）阻害剤などの腫瘍免疫抑制を減少させる作用物質を含む。いくつかの態様において、CXCR2阻害剤はダニリキシン（CAS登録番号:954126-98-8）である。ダニリキシンは、GSK1325756または1-（4-クロロ-2-ヒドロキシ-3-ピペリジン-3-イルスルホニルフェニル）-3-（3-フルオロ-2-メチルフェニル）尿素としても知られている。ダニリキシンは、例えば、Miller et al. Eur J Drug Metab Pharmacokinet（2014）39:173-181;およびMiller et al. BMC Pharmacology and Toxicology（2015）, 16:18に開示されている。いくつかの態様において、CXCR2阻害剤はレパリキシン（CAS登録番号:266359-83-5）である。レパリキシンは、レペルタキシンまたは（2R）-2-［4-（2-メチルプロピル）フェニル］-N-メチルスルホニルプロパンアミドとしても知られている。レパリキシンは、CXCR1/2の非競合的アロステリック阻害剤である。レパリキシンは、例えば、Zarbock et al. British Journal of Pharmacology（2008）,1-8に開示されている。いくつかの態様において、CXCR2阻害剤はナバリキシンである。ナバリキシンは、MK-7123、SCH527123、PS291822または2-ヒドロキシ-N,N-ジメチル-3-［［2-［［（1R）-1-（5-メチルフラン-2-イル）プロピル］アミノ］-3,4-ジオキソシクロブテン-1-イル］アミノ］ベンズアミドとしても知られている。ナバリキシンは、例えば、Ning et al.,Mol Cancer Ther 2012;11（6）:1353-64に開示されている。いくつかの態様において、CXCR2阻害剤は、N-［2-［［（2,3-ジフルオロフェニ）メチル］チオ］-6-｛［（1R,2S）-2,3-ジヒドロキシ-1-メチルプロピル］オキシ｝-4-ピリミジニル］-1-アゼチジンスルホンアミドとしても知られるAZD5069である。いくつかの態様において、CXCR2阻害剤は、国際公開第2020/028479号に開示されているものなどの抗CXCR2抗体である。
いくつかの局面において、本明細書に記載される組み合わせは、例えば、TLRアゴニストなどの、樹状細胞を活性化する作用物質を含む。本明細書で定義される「TLRアゴニスト」は、Bauer et al., 2001, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:9237-9242に記載されているように、toll様受容体を活性化する任意の分子である。TLRアゴニストは、小分子、組換えタンパク質、抗体もしくは抗体断片、核酸、またはタンパク質であり得る。ある特定の態様において、TLRアゴニストは、組換え、天然リガンド、免疫賦活性ヌクレオチド配列、小分子、精製された細菌抽出物または不活化された細菌調製物である。
リポ多糖、ペプチドグリカン、フラジェリンおよびリポテイコ酸など、微生物由来のTLRのいくつかのアゴニストが記載されている（Aderem et al., 2000,Nature 406:782-787; Akira et al., 2001, Nat.Immunol. 2:675-680）。これらのリガンドのいくつかは、TLRの異なるパターンを発現する異なる樹状細胞サブセットを活性化することができる（Kadowaki et al., 2001, J.Exp.Med. 194:863-869）。したがって、TLRアゴニストは、TLRアゴニスト特性を有する微生物剤の任意の調製物であり得る。ある種の非翻訳DNAは、TLRを活性化することによって免疫応答を刺激することが示されている。特に、CpGモチーフを含有する免疫賦活性オリゴヌクレオチドは広く開示されており、リンパ球を活性化することが報告されている（米国特許第6,194,388号を参照）。本明細書で使用される「CpGモチーフ」は、メチル化されていないシトシン-グアニン（CpG）ジヌクレオチドとして定義される。CpGモチーフを含有する免疫賦活性オリゴヌクレオチドも、本発明の方法によるTLRアゴニストとして使用することができる。免疫賦活性ヌクレオチド配列は、ホスホロチオアート修飾などの構造修飾によって安定化され得るか、またはインビボ薬物動態および腫瘍標的化を改善するためにカチオン性リポソーム中に封入され得る。
いくつかの態様において、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば、共刺激分子）を強めるか、またはシグナルを弱める。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば、共刺激分子）を強めるか、またはシグナルを弱める。免疫チェックポイント遮断によって標的とされ得る免疫チェックポイントタンパク質としては、アデノシンA2A受容体（A2AR）、B7-H3（CD276としても知られる）、BおよびTリンパ球アテニュエータ（BTLA）、CCL5、CD27、CD38、CD8A、CMKLR1、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CD152としても知られるCTLA-4）、CXCL9、CXCR5、糖質コルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質（GITR）、HLA-DRB1、ICOS（CD278としても知られる）、HLA-DQA1、HLA-E、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（IDO1）、キラー細胞免疫グロブリン（KIR）、リンパ球活性化遺伝子-3（CD223としても知られるLAG-3）、Merチロシンキナーゼ（MerTK）、NKG7、OX40（CD134としても知られている）、プログラム死1（PD-1）、プログラム死リガンド1（CD274としても知られるPD-L1）、PDCD1LG2、PSMB10、STAT1、IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体（TIGIT）、T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン3（TIM-3）、ならびにT細胞活性化のVドメインIg抑制因子（C10orf54としても知られるVISTA）が挙げられる。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、PD-1軸および/またはCTLA-4を標的とする。
免疫チェックポイント阻害剤は、小分子、組換え型のリガンドもしくは受容体などの薬物であり得るか、またはヒト抗体などの抗体であり得る（例えば、国際公開第2015/016718号; Pardoll,Nat Rev Cancer, 12（4）:252-264,2012;いずれも参照により本明細書に組み入れられる）。免疫チェックポイントタンパク質またはその類似体の公知の阻害剤が使用され得、特に、キメラ化抗体、ヒト化抗体またはヒト型の抗体が使用され得る。当業者であれば承知しているように、本開示で言及されるある種の抗体に対しては、代替名および/または同等の名前が使用され得る。このような代替名および/または同等の名前は、本開示の文脈において交換可能である。例えば、ランブロリズマブは、MK-3475およびペムブロリズマブという代替名および同等の名前でも知られていることが知られている。
いくつかの態様において、PD-1結合アンタゴニストは、PD-1のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な局面において、PD-1リガンド結合パートナーは、PD-L1および/またはPD-L2である。別の態様において、PD-L1結合アンタゴニストは、PD-L1のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な局面において、PD-L1結合パートナーは、PD-1および/またはB7-1である。別の態様において、PD-L2結合アンタゴニストは、PD-L2のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な局面において、PD-L2結合パートナーはPD-1である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、米国特許第8,735,553号、同第8,354,509号および同第8,008,449号に記載されており、これらのすべては参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で提供される方法において使用するための他のPD-1軸アンタゴニストは、すべて参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2014/0294898号、同第2014/022021号および同第2011/0008369号に記載されているように、当技術分野において公知である。
いくつかの態様において、PD-1結合アンタゴニストは、抗PD-1抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）である。いくつかの態様において、抗PD-1抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびCT-011からなる群から選択される。いくつかの態様において、PD-1結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のFc領域）に融合されたPD-L1またはPD-L2の細胞外またはPD-1結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの態様において、PD-1結合アンタゴニストは、AMP-224である。MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558およびOPDIVO（登録商標）としても知られるニボルマブは、国際公開第2006/121168号に記載されている抗PD-1抗体である。MK-3475、Merck 3475、ランブロリズマブ、KEYTRUDA（登録商標）およびSCH-900475としても知られるペムブロリズマブは、国際公開第2009/114335号に記載されている抗PD-1抗体である。hBATまたはhBAT-1としても知られるCT-011は、国際公開第2009/101611号に記載されている抗PD-1抗体である。B7-DCIgとしても知られるAMP-224は、国際公開第2010/027827号および国際公開第2011/066342号に記載されているPD-L2-Fc融合可溶性受容体である。
本明細書で提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、CD152としても知られる細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）である。ヒトCTLA-4の完全なcDNA配列は、Genbankアクセッション番号L15006を有する。CTLA-4はT細胞の表面上に見られ、抗原提示細胞の表面上のCD80またはCD86に結合すると「オフ」スイッチとして作用する。CTLA-4は、T細胞共刺激タンパク質CD28に類似しており、両分子は、それぞれB7-1およびB7-2とも呼ばれる抗原提示細胞上のCD80およびCD86に結合する。CTLA-4は抑制性シグナルをT細胞に伝達するのに対して、CD28は刺激性シグナルを伝達する。細胞内CTLA-4は制御性T細胞にも見られ、制御性T細胞の機能にとって重要であり得る。T細胞受容体とCD28を介したT細胞の活性化は、B7分子に対する抑制性受容体であるCTLA-4の増加した発現をもたらす。
いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。本発明の方法での使用に適した抗ヒトCTLA-4抗体（またはこれに由来するVHおよび/もしくはVLドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。あるいは、当技術分野で認知された抗CTLA-4抗体を使用することができる。例えば、米国特許第8,119,129号、国際公開第01/14424号、同第98/42752号;同第00/37504号（CP675,206、トレメリムマブとしても知られている;旧名称チシリムマブ）、米国特許第6,207,156号; Hurwitz et al.（1998）Proc Natl Acad Sci USA 95（17）:10067-10071; Camacho et al.（2004）J Clin Oncology 22（145）:Abstract No.2505（抗体CP-675206）;およびMokyr et al.（1998）Cancer Res,58:5301-5304に開示されている抗CTLA-4抗体を本明細書に開示されている方法において使用することができる。前述の各刊行物の教示は、参照により本明細書に組み入れられる。CTLA-4への結合について、これらの当技術分野で認知された抗体のいずれかと競合する抗体も使用することができる。例えば、ヒト化CTLA-4抗体は、国際公開第2001/014424号、同第2000/037504号および米国特許第8,017,114号に記載されており、すべて参照により本明細書に組み入れられる。
例示的な抗CTLA-4抗体は、イピリムマブ（10D1、MDX-010、MDX-101およびYervoy（登録商標）としても知られる）またはその抗原結合断片およびバリアント（例えば、国際公開第01/14424号を参照）である。他の態様において、抗体は、イピリムマブの重鎖および軽鎖のCDRまたはVRを含む。したがって、一態様において、抗体は、イピリムマブのVH領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインならびにイピリムマブのVL領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む。別の態様において、抗体は、上記の抗体と同じCTLA-4上のエピトープとの結合および/または上記の抗体と同じCTLA-4上のエピトープへの結合について競合する。別の態様において、抗体は、上記の抗体と少なくとも約90％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約90％、少なくとも約95％または少なくとも約99％の可変領域同一性）を有する。CTLA-4を調節するための他の分子には、すべて参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5844905号、同第5885796号および国際公開第1995001994号および同第1998042752号に記載されているようなCTLA-4リガンドおよび受容体、ならびに参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8329867号に記載されているようなイムノアドヘシンが含まれる。
本明細書で提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、CD223としても知られるリンパ球活性化遺伝子3（LAG-3）である。ヒトLAG-3の完全なタンパク質配列は、Genbankアクセッション番号NP-002277を有する。LAG-3は、活性化されたT細胞、ナチュラルキラー細胞、B細胞および形質細胞様樹状細胞の表面上に見出される。LAG-3は、抗原提示細胞の表面上のMHCクラスIIに結合すると、「オフ」スイッチとして作用する。LAG-3の阻害は、エフェクターT細胞および阻害剤制御性T細胞の両方を活性化する。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗LAG-3抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。本発明の方法での使用に適した抗ヒトLAG-3抗体（またはこれに由来するVHおよび/もしくはVLドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。あるいは、当技術分野で認知された抗LAG-3抗体を使用することができる。例示的な抗LAG-3抗体は、レラトリマブ（BMS-986016としても知られる）またはその抗原結合断片およびバリアントである（例えば、国際公開第2015/116539号を参照）。他の例示的な抗LAG-3抗体としては、TSR-033（例えば、国際公開第2018/201096号を参照）、MK-4280およびREGN3767が挙げられる。MGD013は、国際公開第2017/019846号に記載されている抗LAG-3/PD-1二重特異性抗体である。FS118は、国際公開第2017/220569号に記載される抗LAG-3/PD-L1二重特異性抗体である。
本明細書で提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、C10orf54としても知られるT細胞活性化のVドメインIg抑制因子（VISTA）である。ヒトVISTAの完全なタンパク質配列は、Genbankアクセッション番号NP＿071436を有する。VISTAは白血球上に見出され、T細胞エフェクター機能を阻害する。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗VISTA3抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。本発明の方法での使用に適した抗ヒトVISTA抗体（またはこれに由来するVHおよび/もしくはVLドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。あるいは、当技術分野で認知された抗VISTA抗体を使用することができる。例示的な抗VISTA抗体は、JNJ-61610588（オンバチリマブとしても知られている）である（例えば、国際公開第2015/097536号、国際公開第2016/207717号、国際公開第2017/137830号、国際公開第2017/175058号を参照）。VISTAは、PD-L1およびVISTAの両方を選択的に標的とする小分子CA-170でも阻害することができる（例えば、国際公開第2015/033299号、国際公開第2015/033301号を参照）。
本明細書で提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）である。ヒトIDOの完全なタンパク質配列は、Genbankアクセッション番号NP＿002155を有する。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は小分子IDO阻害剤である。例示的な小分子としては、BMS-986205、エパカドスタット（INCB24360）およびナボキシモド（GDC-0919）が挙げられる。
本明細書で提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、CD38である。ヒトCD38の完全なタンパク質配列は、Genbankアクセッション番号NP＿001766を有する。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CD38抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。本発明の方法での使用に適した抗ヒトCD38抗体（またはこれに由来するVHおよび/もしくはVLドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。あるいは、当技術分野で認知された抗CD38抗体を使用することができる。例示的な抗CD38抗体は、ダラツムマブ（例えば、米国特許第7,829,673号）である。
本明細書で提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、CD278としても知られるICOSである。ヒトICOSの完全なタンパク質配列は、Genbankアクセッション番号NP＿036224を有する。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ICOS抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。本発明の方法での使用に適した抗ヒトICOS抗体（またはこれに由来するVHおよび/もしくはVLドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。あるいは、当技術分野で認知された抗ICOS抗体を使用することができる。例示的な抗ICOS抗体には、JTX-2011（例えば、国際公開第2016/154177号、国際公開第2018/187191号を参照）およびGSK3359609（例えば、国際公開第2016/059602号を参照）が含まれる。
本明細書で提供される方法で標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体（TIGIT）である。ヒトTIGITの完全なタンパク質配列は、Genbankアクセッション番号NP＿776160を有する。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗TIGIT抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。本発明の方法での使用に適した抗ヒトTIGIT抗体（またはこれに由来するVHおよび/もしくはVLドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。あるいは、当技術分野で認知された抗TIGIT抗体を使用することができる。例示的な抗TIGIT抗体は、MK-7684である（例えば、国際公開第2017/030823号、国際公開第2016/028656号を参照）。
本明細書で提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、CD134としても知られるOX40である。ヒトOX40の完全なタンパク質配列は、Genbankアクセッション番号NP＿003318を有する。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗OX40抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。本発明の方法での使用に適した抗ヒトOX40抗体（またはこれに由来するVHおよび/もしくはVLドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。あるいは、当技術分野で認知された抗OX40抗体を使用することができる。例示的な抗OX40抗体は、PF-04518600である（例えば、国際公開第2017/130076号を参照）。ATOR-1015は、CTLA4およびOX40（例えば、国際公開第2017/182672号、国際公開第2018/091740号、国際公開第2018/202649号、国際公開第2018/002339号を参照されたい）を標的とする二重特異性抗体である。
本明細書で提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、TNFRSF18およびAITRとしても知られる糖質コルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質（GITR）である。ヒトGITRの完全なタンパク質配列は、Genbankアクセッション番号NP＿004186を有する。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗GITR抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。本発明の方法での使用に適した抗ヒトGITR抗体（またはこれに由来するVHおよび/もしくはVLドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。あるいは、当技術分野で認知された抗GITR抗体を使用することができる。例示的な抗GITR抗体はTRX518である（例えば、国際公開第2006/105021号を参照）。
いくつかの態様において、免疫療法は、エクスビボで生成された自己抗原特異的T細胞の移入を含む養子免疫療法であり得る。養子免疫療法のために使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の拡大増殖、または遺伝子工学によるT細胞のリダイレクションのいずれかによって生成することができる（Park,Rosenberg et al. 2011）。腫瘍特異的T細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功することが示されている。T細胞における新しい特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）の遺伝子導入によって首尾よく生成されている（Jena,Dotti et al., 2010）。CARは、単一の融合分子中において1つまたは複数のシグナル伝達ドメインと結合されている標的化部分からなる合成受容体である。一般に、CARの結合部分は、フレキシブルリンカーによって結合されたモノクローナル抗体の軽鎖および可変断片を含む、単鎖抗体（scFv）の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインに基づく結合部分も首尾よく使用されてきた。第1世代CARのシグナル伝達ドメインは、CD3ζの細胞質領域またはFc受容体γ鎖に由来する。CARは、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性腫瘍からの腫瘍細胞の表面に発現された抗原に対してT細胞を首尾よくリダイレクトさせてきた（Jena,Dotti et al. 2010）。
一態様において、本出願は、がんの処置のための併用療法であって、養子T細胞療法およびチェックポイント阻害剤を含む、併用療法を提供する。一局面において、養子T細胞療法は、自己および/または同種異系T細胞を含む。別の局面において、自己および/または同種異系T細胞は、腫瘍抗原に対して標的化される。
D. 手術
がん患者の約60％は、予防的、診断的または病期分類的、根治的および対症療法的手術を含む何らかの種類の手術を受ける。根治的手術には、がん性組織の全部または一部が物理的に除去され、切り取られ、および/または破壊され、本態様の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および/または代替療法などの他の治療と組み合わせて使用され得る切除が含まれる。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍切除に加えて、手術による処置には、レーザー手術、凍結手術、電気手術および顕微鏡制御手術（モース術）が含まれる。
がん性の細胞、組織または腫瘍の一部または全部を切除すると、体内に空洞が形成され得る。処置は、追加の抗がん療法を伴う領域の灌流、直接注射または局所適用によって達成され得る。このような処置は、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日もしくは7日ごと、または1週、2週、3週、4週および5週ごと、または1か月、2か月、3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月もしくは12か月ごとに反復され得る。これらの処置は、投与量も様々であり得る。
E. その他の作用物質
処置の治療効果を改善するために、その他の作用物質が本態様のある特定の局面と組み合わせて使用され得ることが想定される。これらの追加の作用物質には、細胞表面受容体およびギャップ結合の上方制御に影響を与える作用物質、細胞分裂抑制および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を増大させる作用物質またはその他の生物学的作用物質が含まれる。ギャップ結合の数を増大させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増加させるであろう。他の態様において、処置の抗過剰増殖効果を向上させるために、本態様のある特定の局面と組み合わせて細胞分裂抑制または分化剤を使用することができる。本態様の有効性を向上させるために、細胞接着の阻害剤が企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（FAK）阻害剤およびロバスタチンである。処置効果を向上させるために、本態様のある特定の局面と組み合わせて抗体c225などのアポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる他の作用物質を使用することができることがさらに企図される。
V. 検出の方法
いくつかの局面において、本開示は、HSP70の発現を検出するための免疫検出方法に関する。数例を挙げると、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、イムノラジオメトリックアッセイ、フルオロイムノアッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、ドットブロッティング、FACS分析、およびウェスタンブロットを含む多種多様なアッセイ形式が、タンパク質産物を検出するために企図される。様々な有用な免疫検出方法の工程は、科学文献に記載されている。一般に、免疫結合方法は、試料を得る工程と、場合によっては、免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、試料を検出されるべきタンパク質に対して特異的な抗体と接触させる工程とを含む。一般に、免疫複合体形成の検出は当技術分野で周知であり、多数のアプローチの適用によって達成され得る。これらの方法は、一般に、放射性、蛍光性、生物学的および酵素的タグのいずれかなどの標識またはマーカーの検出に基づく。当然のことながら、当技術分野で知られているように、第2の抗体および/またはビオチン/アビジンリガンド結合配列などの二次結合リガンドの使用を通してさらなる利点を見出し得る。
検出において使用される抗体は、それ自体が検出可能な標識に連結され得、この場合、次いで、この標識を単に検出し、それによって組成物中の一次免疫複合体の量を決定することができる。あるいは、一次免疫複合体内で結合された第1の抗体は、該抗体に対して結合親和性を有する第2の結合リガンドによって検出され得る。これらの事例では、第2の結合リガンドは、検出可能な標識に連結され得る。第2の結合リガンドは、しばしば、それ自体が抗体であり、したがって「二次」抗体と呼ばれ得る。一次免疫複合体は、二次免疫複合体の形成を可能にするのに十分な有効な条件下および期間で、標識された二次結合リガンドまたは抗体と接触される。次いで、一般的には、任意の非特異的に結合された標識された二次抗体またはリガンドを除去するために、二次免疫複合体は洗浄され、次いで、二次免疫複合体中の残りの標識が検出される。
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、本発明によって提供される検出方法に適した任意の試料を指す。試料は、検出または単離に適した材料を含む任意の試料であり得る。試料の供給源には、血液、胸水、腹水、尿、唾液、悪性腹水、気管支肺胞洗浄液、滑液および気管支洗浄液が含まれる。一局面において、試料は、例えば全血またはその任意の画分もしくは成分を含む血液試料である。本発明との使用に適した血液試料は、静脈、動脈、末梢、組織、臍帯などの血液細胞またはその成分を含む公知の任意の供給源から抽出され得る。例えば、試料は、周知かつ日常的な臨床方法（例えば、全血を抜き取って処理するための手順）を用いて取得され、処理され得る。一局面において、例示的な試料は、がんを有する対象から採取された末梢血であり得る。いくつかの局面において、生物学的試料は複数の細胞を含む。ある特定の局面において、生物学的試料は新鮮な組織または凍結された組織を含む。特定の局面において、生物学的試料は、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織を含む。いくつかの局面において、生物学的試料は、組織生検、穿刺吸引物、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、便、唾液、循環腫瘍細胞、エキソソーム、または吸引物および汗などの身体分泌物である。いくつかの局面において、生物学的試料は無細胞DNAを含有する。
VI. キット
態様の様々な局面では、治療剤ならびに/または他の治療剤および送達剤を含有するキットが想定される。いくつかの態様では、態様の治療を調製および/または投与するためのキットが提供される。キットは、本態様の薬学的組成物のいずれかを含有する1つまたは複数の密封されたバイアルを含み得る。キットは、例えば、少なくとも1つのHSP70抗体、ならびに態様の成分を調製、製剤化および/もしくは投与するための試薬、または本発明の方法の1つもしくは複数の工程を実施するための試薬を含み得る。いくつかの態様では、キットはまた、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトルまたはチューブなどのキットの構成要素と反応しない容器である適切な容器を含み得る。容器は、プラスチックまたはガラスなどの滅菌可能な材料から作製され得る。
キットは、本明細書に記載される方法の手順の工程を概説する指示書をさらに含み得、本明細書に記載される手順と実質的に同じ手順に従うか、または当業者に公知である。指示情報は、コンピュータを使用して実行されたときに、薬学的に有効な量の治療剤を送達する現実のまたは仮想の手順の表示を引き起こす機械読み取り可能な指示を含有するコンピュータ読み取り可能な媒体内に存在し得る。
VII. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれている。以下の実施例に開示されている技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい形態を構成すると考えることができることが当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の態様において多くの変更を行うことができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を依然として得ることができることを理解すべきである。
実施例1 - HSP70を標的とする治療用抗体の作製
抗HSP70mAbを作製するために、緑色蛍光タンパク質（GFP）に融合されたヒトHSP70を発現するマウス線維芽細胞L細胞（Willert et al.,2003）を作製し、MD Anderson Monoclonal Antibody Core Facilityと共同してBALB/cマウスの足蹠中に注射した。3日ごとに4回の注射の初期系列、ならびに13および15日目の2回の追加注射の後、マウス脾臓細胞をSp2/0-Ag14マウス骨髄腫細胞（Shulman et al.,1978）と融合させてハイブリドーマを作製した。単一細胞クローニングにより、混合培養物における96のクローンの最初のアウトプットが46のクローンに絞られ、その後、HSP70-GFPを発現するL細胞を認識するが、ベクターを有する野生型、またはGFPを発現するL細胞を認識しないmAbを同定するためにドライセルELISAでスクリーニングした。次に、フローによって完全な状態のMM1.S骨髄腫細胞上の、およびウェスタンブロッティングによってMM1.S細胞抽出物中のHSP70を認識する能力によって、残りの28個のハイブリドーマクローンによって作製されたmAbを特徴付け、17個のクローンが興味深い特性を有することが示された。RPMI8226ヒト骨髄腫細胞とCRISPR/Cas9媒介性ゲノム編集を使用してHSP70がノックアウトされた8226細胞とを使用して、密接に相同なHSP70ファミリーメンバー（Daugaard et al.,2007）への結合と比較した、HSP70への結合について17個のクローンをさらにスクリーニングし、6つのmAbがヒトHSP70に対して最も高い特異性を有するという結論に至った。最終スクリーニングとして、溶骨性骨疾患の発症を含むヒト骨髄腫の自然経過の多くを再現するモデルにおいて、ルシフェラーゼ（luc）発現MOPC315.BMマウス骨髄腫細胞を注射した免疫適格BALB/cマウス中で、抗体の抗腫瘍活性を評価した（Hofgaard et al.,2012）。アミノ酸レベルでのマウスHSP70とヒトHSP70間の極めて近い95％の相同性（Hunt＆Calderwood,1990）、およびmAbが両方のタンパク質に結合したという知見のために、これは可能であった。クローン77Aは、パイロット研究において抗腫瘍活性を示し（図1）、2/5の処置されたマウスが100日に再発することなく完全な骨髄腫消失を示したので、クローン77A（以下、77Aと称する）をさらなる研究のために選択した。
77A抗体の相補性決定領域（CDR）および可変領域を表1～3に提供する。
（表１）77A抗体の重鎖可変配列および軽鎖可変配列のCDR
Figure 2024536133000016
（表２）77A抗体可変領域をコードするアミノ酸配列
Figure 2024536133000017
（表３）77A抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列
Figure 2024536133000018
実施例2 - mAb77AはヒトHSP70に対して強い親和性を示す
Octet分析を実行して、77A結合の親和性および動態を研究した（図2A）。大腸菌中で作製されたマウスHSP70およびヒトHSP70に対する解離定数（KD）は、それぞれ9.88×10-7および8.50×10-10であったが、真核生物の昆虫Sf9細胞中で作製されたHSP70に対する解離定数（KD）は、検出限界（1.0×10-12）未満であった。いくつかの状況を提供するために、77Aの0.85nM親和性は、それぞれB細胞リンパ腫および骨髄腫に対して臨床的に使用されている抗CD20mAbリツキシマブ（5.2nM）（Malviay et al.,2012）および抗CD38mAbダラツムマブ（4.36nM）（van de Donk et al.,2016）の親和性に比肩する。したがって、77Aは、特にヒトHSP70に対して強い親和性を有し、原核細胞中で作製されたヒトHSP70と真核細胞中で作製されたヒトHSP70との差は、77Aが異なるように折り畳まれたエピトープまたは翻訳後修飾されたエピトープを標的とし得ることを示唆している。
ペプチドに対してより高い親和性を有し、より免疫原性である形態であるので、これまでの研究は、ADP-アガロース上でのHSP70の精製によってADP-HSP70に焦点を当ててきた（Greene et al.,2018; Peng et al.,1997）。実際、77Aは、腫瘍由来のペプチド抗原を含有するであろうADP-HSP70複合体への優先的結合を示す（図2B）。さらに、HSP70-GFPへの77Aの結合のELISA研究は、ADPおよびペプチド基質（NRL）が存在する場合に最大の親和性を示す（図2C）。ADP/ペプチドが結合した形態でのHSP70へのこの優先的結合は、腫瘍微小環境からの腫瘍関連抗原の送達を増強する可能性が高い。
実施例3 - HSP70欠失変異体を使用した77Aエピトープのマッピング
HSP70への77Aの結合をよりよく理解するために、CRISPR/Cas9編集を使用してHSP70KOヒト胎児腎臓（HEK）293T細胞を作製し、次いで、N末端GFP融合物または様々なHSP70欠失変異体とともに完全長HSP70を発現させた（図3A）。77Aでの細胞抽出物の免疫沈降（IP）、これに続くα-GFP抗体でのウェスタンブロッティングによって、77Aが、641アミノ酸（aa）の完全長HSP70、および17アミノ酸（aas）がC末端から欠失した624aaタンパク質に結合するが、結合はさらなる30aaの欠失で減少することが示された（図3B）。これらの知見は、これらの変異体を発現する293T細胞に結合する77Aのフロー研究を通じて確認された。より小さな欠失は、aas604～614が欠失された場合に、細胞培養上清からの分泌型HSP70を認識する77Aの能力の低下を示した（図3C）。興味深いことに、細胞溶解物由来のHSP70を標的として使用した場合、594～604の欠失は減少した認識を伴った。これらの知見は、77Aが、以前に記載されたmAbの標的ではないアミノ酸594～614中のエピトープを認識すること（図3D）、および77Aによる認識に影響を及ぼす分泌型HSP70の異なった翻訳後修飾が存在し得ること、または77Aがコシャペロンの状況でHSP70に結合することを示唆している。77Aが相互作用するHSP70中の重要なアミノ酸を同定するために、アラニンスキャニング分析を行った（図3E）。この分析により、77Aは、K573、E576、W580、R596およびE598を二次的な重要部位として、H594、K595およびQ601を一次的な重要部位として含むHSP70の立体構造エピトープを認識することが決定され（図3F）、これらの部位はSEQ ID NO:11中のアミノ酸に対応する。これらのデータは、HSP70がそのADP結合形態および抗原性ペプチド結合形態である場合に77Aが新規HSP70ドメインに結合して基質結合を固定し、取り込みを増加させるモデルを支持する。
実施例4 - 免疫不全骨髄腫モデルにおける77Aの異なる活性
77Aは、真核細胞由来のヒトHSP70に強く結合したので（図2A）、その活性をヒト骨髄腫細胞に対してインビボで調べた。ヌードマウス中のluc標識されたMM1.S細胞のモデルにおいて、77Aは、用量依存的な抗腫瘍活性を示し（図4A）、50μgの注射として週に2回与えられると、いくらかの腫瘍増殖の低下が認められ、100μgおよび200μgの用量においてより強い活性が認められた。ELISAによって測定されると、これにはヒト軽鎖レベルの低下が伴った。注目すべきことに、SCIDマウス中および非肥満糖尿病重症複合免疫不全IL-2受容体γヌル（NOD/SCID IL-2Rγヌル（NSG））マウス中のMM1.S細胞を用いてこの研究を繰り返した場合、77Aはインビボイメージング（図4B）または軽鎖定量化によって活性を示さなかった。まとめると、これらの対照的な結果は、77Aが、ヌードマウスによって保持されるがNSGマウスには存在しない免疫エフェクター細胞に依存することを示唆した。さらに、MM1.S細胞および77Aを利用するインビトロアッセイは、直接的な細胞傷害活性を示さず、77Aは、抗体依存性細胞傷害または補体依存性細胞傷害（ADCC、CDC）を誘導しなかった。
実施例5 - 77Aは樹状細胞によるHSP70取り込みを増強する
DC、マクロファージおよびナチュラルキラー（NK）細胞はNSGマウスでは欠損している（Shultz et al.,1995）のに対して、これらの細胞はヌードマウス中には存在し、機能している。NSGマウスとヌードマウスには他の相違が存在するが、腫瘍細胞から分泌されるHSP70はDCへの抗原の送達を促進することが知られているので（Shevtsov＆Multhoff,2016;Binder,2008）、まず、DCに焦点を当てた。したがって、Sf9細胞中で作られた精製されたヘキサ-（6x）-ヒスチジンタグ化ヒトHSP70を使用し、Alexa Fluor 488タグ化α-6x-His-タグmAbを使用して、マウス顆粒球マクロファージCSF（GM-CSF）およびMYCおよびRAFがん遺伝子を発現するレトロウイルスベクターでC57BL/6マウスの骨髄分離株を形質導入することによって作製された不死化マウス系統であるDC2.4未成熟DC（Shen et al.,1997）による6x-His-HSP70の取り込みを研究した。77Aは、鶏卵リゾチームに対して作られた対照アイソタイプmAb（IgG2Bと呼ばれる）と比較して、4℃および37℃でHSP70取り込みを大幅に増加させたが（図5）、他のα-HSP70mAbはこの活性を有さなかった。77Aの存在下での増強されたHSP70取り込みは、DC2.4細胞の免疫蛍光染色によっても実証することができた（図6）。最後に、電子顕微鏡法（EM）によって、15nMの金粒子にコンジュゲートさせた77Aを用いて、DC中へのHSP70の取り込みを調べた。77Aは、以前のアッセイにおけるように、EMにより、IgG2Bとの比較でHSP70取り込みを増強し（図5および図6）、HSP70は、ファゴリソソームに似た細胞内細胞質膜結合体中に見出された（図7;赤色矢印）。
マウスおよびヒトHSP70に対する77Aの親和性の実質的な差（図5）を考慮して、2つのバリアント間で異なる各アミノ酸に対する単一の変化（K→E、Q→R、N→S）（図14A）、可能な2つのアミノ酸変化のそれぞれを有するヒトHSP70、および3つすべてを有するヒトHSP70を発現させるために、部位特異的突然変異誘発を使用した。HSP70 KO 293T細胞中でこれらを発現させ、（図3と同様に）IP研究において77Aの結合能を調べた。DC2.4細胞がIgG2Bおよび77Aの存在下でこれらの変異体を取り込む能力を、（図5と同様に）FACSによって研究する。マウス配列に一致させるための594～614領域におけるヒトHSP70配列の変異は、HSP70に対する77Aの親和性およびDC2.4細胞による取り込みを誘導する77Aの能力を低下させる（図14B）。
77A/HSP70複合体がDCによって取り込まれる受容体を決定することは、同様に影響を受ける他の免疫エフェクターを同定するのに役立ち得る。マウスFcγR2Bを発現するHSP70ノックアウトHEK239T細胞は、77Aが結合したHSP70を取り込むことが見出された。同様に、ヒトFcγR2AまたはヒトFcγR2Bを発現するHSP70ノックアウトHEK239T細胞は、77Aが結合したHSP70を取り込むことが見出されたが、他のFc受容体の発現はこの効果をもたらさなかった（図13）。ヒトFcγR2AおよびFcγR2Bは、単球/マクロファージおよび樹状細胞において発現される（Bruhns,2012）。
実施例6 - HSP70のDC取り込みは成熟を増強する
DCによるHSP70取り込みの機能的な帰結の研究を開始するために、IgG2Bまたは77Aのいずれかの存在下でDC2.4細胞をHSP70に曝露した。RNAを採取し、cDNAに変換し、これを384個の遺伝子を含有するBioRad Immune Response Tier 1-4 qPCRアレイにハイブリダイズさせた。対照に対して2倍またはそれより多くの変化の閾値を使用すると、IgG2Bは陰性対照と比較して比較的少数の遺伝子を活性化した（図8A;上のパネル）のに対して、77Aは、はるかに大きな遺伝子セットの転写を活性化した（図8A;下のパネル）。Ingenuity Pathway Analysisは、最も活性化された経路は樹状細胞成熟に相当する経路であり（図8B）、1つには、CD70（Bourque＆Hawiger,2018）、アデノシンデアミナーゼ（Casanova et al.,2012）、カテプシンS（Kim et al.,2017）およびCCケモカインリガンド5（Wang et al.,2002）を含む上位遺伝子のいくつかがDC機能において鍵となる役割を果たすという知見によって反映されることを明らかとした。他の活性化された経路には、神経炎症シグナル伝達経路、Th1およびTh2シグナル伝達の両方、ならびにToll様受容体（TLR）シグナル伝達が含まれた。さらに、これらの実験からの細胞培養上清を収集し、サイトカインアレイを使用して分析した。対照としてのIgG2Bと比較した77Aの存在下でHSP70によって誘導された注目すべき変化には、とりわけ、腫瘍壊死因子（TNF）-α、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）およびインターロイキン（IL）-1を含む、DC生物学において鍵となる役割を果たすサイトカイン（Turner et al.,2014）の増加が含まれた（図8C）。
実施例7 - 腫瘍モデルにおける77Aの活性
77Aは多くの腫瘍に関連する一般的な免疫機構に影響を及ぼした可能性があることから、黒色腫モデルにおける、および十分に性質決定されており、免疫学的にコールドであると考えられ（Kim et al.,2014）、表面HSP70を発現しないマウストリプルネガティブ乳癌（TNBC）（Chen et al.,2019）モデルである4T1細胞における、77Aの活性の試験を行った。luc標識された4T1細胞を乳房脂肪パッド中に注射され、77Aで処置された免疫適格BALB/cマウスは、IgG2Bと比較してより遅い原発腫瘍増殖を示した（図9A）。特に、77Aは、肺（図9B）ならびに脾臓および肝臓への転移性疾患の発症を強く阻害した。生存したマウスから32日目に末梢血を収集し、T細胞サブセットに対するマルチパラメータフローによって分析したところ、CD4＋T細胞の著しい増加およびCD8＋T細胞のより穏やかな増加が示された（図9C）。また、末梢血中のMHCクラスII＋細胞（図9D）、およびクラスII＋かつCD11c＋である細胞の増加が認められ、77A処理後のマウスDCの増加と一致した。77Aは、A549ヒト肺癌細胞を含むいくつかの腫瘍モデルにおいて、（a）ヒト初代CD4＋およびCD8＋T細胞中へのHSP70の取り込みを誘導し（図9E）、（b）T細胞増殖ならびにCD69およびHLA DRを含む成熟マーカーの発現を増強し、（c）MHC非依存性細胞溶解性CD4T細胞活性を刺激する（図9F）ことが見出された。
黒色腫モデルには、ヌードマウスにおけるA375黒色腫モデルを使用した。77Aの最初の用量を23日目に与え、最後の用量を39日目に与えた。腫瘍体積は77Aで処置されたマウスにおいてより遅かった（図9G）。
実施例8 - 4T1をベースとするワクチン戦略の有効性を増強するための77Aの有用性
プロフェッショナル抗原提示細胞としての役割に鑑みて、DCはワクチン戦略の開発のための魅力的な標的と長い間考えられてきた（Gornati et al.,2018）。したがって、HSP70-ペプチド抗原複合体の取り込みを増強する77Aの能力を通じて、77Aがワクチンの有効性を増大させることができる可能性を検討した。これを試験するために、HSP70-GFPを発現する4T1細胞を使用して、ADP-アガロースカラムでADP-HSP70-ペプチド複合体を精製し、BALB/cマウスにPBSを注射するか、またはIgG2Bもしくは77AとともにADP-HSP70-ペプチドワクチンを注射した。ATP-HSP70と比較して、ADP-HSP70は、腫瘍由来ペプチドを含む基質に対してより高い親和性を有し、したがってより免疫原性である形態であるので（Greene et al., 1995; Peng et al., 1997; Craig＆Marszalek、2017）、ADP-HSP70に焦点を当てた（HSP70機構の基本の概要については図10を参照されたい）。0日目に、生きた4T1-luc標識されたHSP70-GFP発現細胞をマウスに同所性に注射し、動物全身イメージングによって腫瘍の発生をモニターした。IgG2Bの存在下でのADP-HSP-ペプチド複合体によるワクチン接種は、PBS対照と比較して、生きた4T1細胞による負荷後のマウスにおいて腫瘍増殖を遅らせなかった（図11A）が、77Aとのワクチン接種は大幅に増殖を遅らせた。次いで、37日目にこれらのマウスから単離された脾細胞が、照射された4T1細胞に7日間曝露され、CD4＋の増加およびより少ない程度ではあるがCD8＋T細胞の増加を示した（図11Bおよび図11C;左パネル）。また、これらの細胞は、7日後に、HSP70-GFPを発現する4T1細胞、またはHSP70-GFPなしの4T1細胞に対して増強された細胞傷害性を示し（図11Bおよび図11C;右パネル）、HSP70-GFP由来の抗原および他の腫瘍由来抗原の両方を認識する細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の発生の可能性を裏付けた。この可能性は、これらのT細胞がインターフェロン（IFN）-γおよびIL2を産生する能力を評価することによっても試験した。77Aをワクチン接種されたマウス由来の推定CD4＋CTLは、IgG2B対照と比較して、4T1または4T1-HSP70-GFP細胞に曝露された場合、増加したIFNγおよびIL2分泌を示した（図12A）。CD8＋CTLの場合には（図12B）、CD8＋CTLはまた、ADP-HSP70複合体および77Aとのワクチン接種後に4T1または4T1-HSP70-GFP細胞のいずれかに曝露されたときに、増加したIFNγ分泌を示したが、IL-2産生については結果はより顕著ではなかった。まとめると、これらのデータは、77AがDCによる抗原取り込みを増強し、より堅牢な下流のCD4＋およびCD8＋T細胞応答をもたらし得ることを示唆している。
実施例9 - クローン77A HSP70 mAbの腫瘍標的の同定
ペグ化リポソームドキソルビシン（PLD;Doxil（登録商標））は、乳がん治療に対して規制上の承認を有し（Lao et al.,2013）］、他の悪性腫瘍に対して活性であり（Lyseng-Williamson et al.,2013）、ICDを引き起こす（Kroemer et al.,2013）ので、77Aと組み合わせる最初の作用物質として選択された。4T1細胞を同所性に注射されたBALB/cマウスにおいて、IgG2Bまたは77AとPLDを評価した。PLD＋IgG2Bと比較して、PLD＋77Aは腫瘍増殖のより大きな低下および遅延を誘導し（図15A）、PLD＋77Aにより4/5のマウスが治癒したが（100日目に再発がないと定義した）、わずか1/5のPLD＋IgG2B対照について、これが当てはまった。また、CT26ベースの免疫適格結腸癌モデルでこの組み合わせを評価したところ、腫瘍増殖のより大きな低下および遅延が再び見られた。注目すべきことに、81日目まで、3/5のPLD＋77Aマウスは生存したままであり、腫瘍再発はなかったが、わずか1/5のIgG2B＋PLDマウスが生存し、その個体は測定可能な疾患を有していた（図15B）。
実施例10 - 抗HSP70抗体エピトープビニング
異なる無関係な抗HSP70抗体が77AのHSP70への結合を妨害または遮断した程度を決定するために、エピトープビニング実験を行った。
ビニング実験を行うために、抗体をビニング対で準備した。Octetプラットフォームをサンドイッチ構成で使用した。分析は、Data Analysis HTソフトウェアを使用して行った。各対の第1の抗体をディップアンドリードセンサ表面上に搭載し、次いでセンサをHSP70溶液中に浸漬して抗原を負荷した。最後に、各対について第2の抗体中にセンサを浸漬し、応答を測定した。各対についての結果をペアワイズマトリックスで表にした。
結果を図16に示す。図16中の数字は、競合する可能性がある抗体の存在下での最大結合のパーセントを反映している。予想通り、すべての抗体が自身と競合した。図示されているように、77Aは、C92F3-5（Fisher Scientific）またはN15F2-5（Enzo Life Sciences）と競合しない。
実施例11 - ATP結合HSP70と比較したADP結合HSP70の結合速度論
バイオレイヤー干渉法（BLI）計測手段およびELISAを使用して、HSP70のATPまたはADP結合形態のいずれかへの77Aの結合を特徴付けた。
HSP70をSF9細胞中で発現させた。ADPまたはATP結合タンパク質に対して選択的な樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して、対応して結合したHSP70組換えタンパク質のバルク調製物を濃縮した。溶出後に決定されるタンパク質濃度は、その後のアッセイにおいて等しい濃度が使用され得るように測定した。BLIベースのアッセイでは、抗体および試薬をマイクロウェルプレート上に希釈し、機器に搭載した。試験される抗体をディップアンドリードセンサ上に固定化し、次いで、ATPまたはADP濃縮されたHSP70への結合中の速度論について観察した。ELISAのために、関連する濃縮されたHSP70タンパク質をELISAプレートウェル上に一晩直接コーティングした。次いで、試験抗体をプレートウェルにわたって連続希釈し、適切な二次抗体-HRPコンジュゲートを使用して検出した。TMB基質を使用してプレートを発色させ、酸停止溶液を使用してO.D.を安定化させた。BLIセンソグラムトレースデータを図17に示す。図示されているとおり、ATP濃縮HSP70とは対照的に、ADP濃縮HSP70については、抗原会合工程の間に優れた応答（nmシフト）が存在した。結合速度論を表4に示す。図示されているように、77Aは、ATP濃縮HSP70よりも4倍以上大きい親和性（KD）でADP濃縮HSP70に結合した。
（表４）ATP結合HSP70と比較したADP結合HSPに対する77Aの結合速度論
Figure 2024536133000019
図18に示されているELISAデータは同じ傾向を示し、77Aは、ATP濃縮HSP70よりもADP濃縮HSP70でより高い最大吸光度を有した。77Aはまた、ADP濃縮HSP70（0.7372nM）で、ATP濃縮HSP70（1.774nM）より低いEC50値を有した。
まとめると、これらの結果は、77AがATP-HSP70タンパク質と比較してADP-HSP70タンパク質に優先的に結合することを示している。
実施例12 - マウスCT-26腫瘍モデルにおける77A活性
本実施例は、マウスCT-26結腸直腸腺癌悪液質モデルにおける、単独でのおよび抗CTLA4抗体と組み合わせた77A抗体の試験を記載する。
CT26細胞をヌードBALB/cマウスの皮下に接種した。腫瘍が約80mm3の平均体積に達した時点で処置を開始した。14、17および21日目に、10mg/kgの77A、アイソタイプ対照（IgG2B）および/または抗CTLA4抗体をマウスに投与した。腫瘍体積を図19に示す。図示されているように、77Aと抗CTLA-4抗体との組み合わせが、腫瘍体積に対して最大の効果を有し、この組み合わせは、アイソタイプ対照と比較して腫瘍体積を有意に低下させた。この併用療法は、5匹すべての処置された動物において腫瘍を完全に根絶した。
実施例13 - ヒト化
本実施例は、77A抗体のヒト化バリアントの作製を記載する。
77A抗体についてのマウス免疫グロブリンファミリーサブグループを決定し、次いで、抗原結合配列をモデル化し、重鎖および軽鎖の両方について関連するヒト免疫グロブリンファミリーの適合する潜在的フレームワーク中に移植した。必要に応じて、逆突然変異を使用した。5つのヒト化重鎖バリアント（表5に示されているhVH-1～hVH-5）および5つのヒト化軽鎖バリアント（表5に示されているhVL-1～hVL-5）を作製した。hVH-1～hVH-5の配列アラインメントが図20Aに示され、hVL-1～hVL-5の配列アラインメントが図20Bに示されている。
（表５）ヒト化可変領域配列
Figure 2024536133000020
各ヒト化重鎖と軽鎖の組み合わせを含む抗体を作製し、性質を決定した。これらの抗体をh77A-1～h77A-25と呼び、対応するアミノ酸配列を表6に示す。
（表６）ヒト化77Aバリアント
Figure 2024536133000021
バイオレイヤー干渉法（BLI）を使用して、結合に関してヒト化バリアントの性質を決定した。マウス77A抗原結合領域およびヒトFc領域を含むキメラ抗体も試験した。抗体および試薬をマイクロウェルプレート上に希釈し、機器に搭載した。希釈された抗体を最初にディップアンドリードセンサ上に固定化し、次いでベースラインの測定値を取得した。続いて、溶液中の抗原または緩衝液のみを含有するウェル中にセンサを浸漬した。プロトコルの各工程中の光の干渉パターンのシフトの測定によって、センサに結合した分子の数の変化を定量化した。これらの値およびアッセイにおいて使用した試薬の濃度に基づいて数学的モデリングを行い、速度論の値を計算するために使用した。
結果が表7に示されている。図示されているように、試験したヒト化バリアントのすべてが、親マウス抗体の2～5倍以内の親和性測定値を有していた。
（表７）ヒト化77A抗体結合速度論
Figure 2024536133000022
実施例14 - ヒト化77Aバリアントによって媒介されるHSP70取り込み
本実施例は、ヒト化77Aバリアントによって媒介されるHSP70の取り込みにおけるFc受容体関与の評価を記載する。
マウスFc受容体またはヒトFc受容体のパネルをコードするベクターを用いて、293HSP70KO細胞を24時間トランスフェクトした。トランスフェクションは、10cmの皿中で、JetPrimeを使用して、2.5μg（マウスFc受容体の場合）または1.42μg（ヒトFc受容体の場合）の各ベクターを用いて行った。
次に、HSP70GFP（BME Free;5μg/ml）およびGFP-Nanobody Alexa-488（1:1000）を単独でまたは抗体（1μg/ml）と組み合わせて37℃で1時間添加した。次いで、FACによって細胞を分析した。
試験した抗体は、それぞれ実施例12に記載されているように、IgG2アイソタイプ対照、77A（マウス）、ヒトIgG1Fcドメインを有するキメラ77A、ヒトIgG2Fcドメインを有するキメラ77A、ヒトIgG4ドメインを有するキメラ77a、ならびにヒト化バリアントh77A-1（hVH-1およびhVL-1を含む）、h77A-6（hVH-2およびhVL-1を含む）およびh77A-11（hVH-3およびhVL-1を含む）であった。ヒト化抗体h77A-1、h77A-6およびh77A-11は、それぞれヒトIgG2Fcドメインを用いて試験した。
試験したマウスFc受容体は、FcγR1（Origeneカタログ番号MR225268）、FcγR2B（Origeneカタログ番号MR204036）、FcγR3（Origeneカタログ番号MR203404）およびFcγR4（Origeneカタログ番号MR203178）であった。
試験したヒトFC受容体は、FcγR1A（Origeneカタログ番号RC207487）、FcγR1B（Origeneカタログ番号RC219204）、FcγR2A（Origeneカタログ番号RC205786）、FcγR2B（Origeneカタログ番号RC211982）、FcγR2C（Origeneカタログ番号RC213460）、FcγR3A（Origeneカタログ番号SC124061）およびFcγR3B（Origeneカタログ番号RC204749）であった。
結果を図21～図24に示す。ヒトFcγRを用いた結果の要約を表8に示す。結果は、3つのヒト化抗体すべてならびにキメラおよび親マウス77A抗体が、FcγR2AおよびFcγR2B受容体を介したHSP70の取り込みを媒介することができることを実証した。キメラIgG1およびIgG4抗体はまた、FcγR1A受容体を介してHSP70取り込みを媒介した。マウスFcγRを用いた結果の要約を表9に示す。実験は、3つのヒト化抗体すべてがマウスFcγR2B受容体を介したHSP70の取り込みを媒介することができることを実証した。キメラIgG1抗体は、FcγR1、FcγR2BおよびFcγR4受容体を介した取り込みを促進するのに対して、IgG4キメラは、HSP70取り込みのためにFcγR1およびFcγR2B受容体を利用した。親マウス抗体は、受容体FcγR2BおよびFcγR4を介した取り込みを促進した。
（表８）ヒトFcγRを用いた取り込み実験の要約
Figure 2024536133000023
（表９）マウスFcγRを用いた取り込み実験の要約
Figure 2024536133000024
実施例15 - ヒト化77Aバリアントによって媒介されるHSP70の樹状細胞による取り込み
本実施例は、ヒト化77Aバリアントによって媒介される樹状細胞（DC）によるHSP70の取り込みを記載する。
Blood Dendritic Cell Isolation Kit II（Miltenyi Biotec）を使用して、ヒトバフィーコートから樹状細胞を単離した。簡潔には、CD19およびCD14 MicroBeadsのカクテルを使用して、B細胞および単球を磁気的に標識し、枯渇させた。続いて、非磁性フロースルー画分中の予め濃縮された樹状細胞を磁気的に標識し、樹状細胞マーカーCD304（BDCA-4/Neuropilin-1）、CD141（BDCA-3）およびCD1c（BDCA-1）に対する抗体のカクテルを使用して濃縮した。収集された画分には、形質細胞様樹状細胞、1型骨髄樹状細胞（MDC1）、2型骨髄樹状細胞（MDC2）および非DC画分に相当する非標識フロースルー画分が含まれた。高度に純粋な濃縮された細胞画分には、形質細胞様樹状細胞、1型骨髄樹状細胞（MDC1）および2型骨髄樹状細胞（MDC2）が含まれる。
HSP70GFP（BME Free;5μg/ml）とともに細胞をインキュベートし、GFP-Nanobody Alexa-488（1:1000）を単独でまたは抗体（1μg/ml）と組み合わせて4℃で1時間添加した。次いで、ゴーストバイオレット450、CD11C、CD19、CD14、CD80、CD86、CD141、CD1CおよびCD303で、またはそれらに対して細胞を染色した。
試験した抗体は、それぞれ実施例12に記載されているように、IgG2アイソタイプ対照、77A（マウス）、ヒトIgG1Fcドメインを有するキメラ77A、ヒトIgG2Fcドメインを有するキメラ77A、ヒトIgG4ドメインを有するキメラ77a、ならびにヒト化バリアントh77A-1（hVH-1およびhVL-1を含む）、h77A-6（hVH-2およびhVL-1を含む）およびh77A-11（hVH-3およびhVL-1を含む）であった。ヒト化抗体h77A-1、h77A-6およびh77A-11は、それぞれヒトIgG2Fcドメインを用いて試験した。
結果を図25～図28に示す。まとめると、結果は、77AのヒトIgG2アイソフォームが初代ヒトDC中へのHSP70の取り込みを媒介し、形質細胞様および2型末梢血DCを優先的に標的とすることを示した。1型末梢血DCに対しては、より少ない取り込みが観察された。さらに、IgG1キメラは、非標識フロースルー画分中への取り込みのみを誘導した（図25）。
実施例16 - さらなる77Aバリアント
さらなる最適化のために、（実施例12に記載されているように）hVH-1およびhVL-1の組み合わせを含むh77A-1を選択した。
これらの配列を最適化するために、hVH-1およびhVL-1のバリアントを含む大きなライブラリーを作製した。その後、抗体-抗原結合のインシリコモデルを生成し、全ライブラリーに対する抗体-抗原結合をコンピュータでシミュレートした。上位95の抗体は、h77A-1.1～h77A-1.95と称され、表10（Kabat CDR配列）および表11（IMGT CDR配列）に記載されている。h77A-1.1～h77A-1.95中に含まれるCDRバリアントのアミノ酸配列を表12に示し、h77A-1.1～h77A-1.95中に含まれる可変領域バリアントのアミノ酸配列を表13に示す。追加の抗体バリアントh77A-1.96、h77A-1.97、h77A-1.98（表10および11にも記載されている）も作製し、試験した。
（表１０）h77A-1バリアント（Kabat CDR配列）
Figure 2024536133000025
Figure 2024536133000026
Figure 2024536133000027
Figure 2024536133000028
（表１１）h77A-1バリアント（IMGT CDR配列）
Figure 2024536133000029
Figure 2024536133000030
Figure 2024536133000031
（表１２）CDRアミノ酸配列
Figure 2024536133000032
Figure 2024536133000033
（表１３）可変領域アミノ酸配列
Figure 2024536133000034
Figure 2024536133000035
Figure 2024536133000036
Figure 2024536133000037
Figure 2024536133000038
Figure 2024536133000039
Figure 2024536133000040
Figure 2024536133000041
Figure 2024536133000042
ヒト化バリアントhVH-1.1～hVH-1.78の配列アライメントが図29A～図29Fに、hVL-1.1～hVL-1.53の配列アラインメントが図29G～図29Jに図示されている。
これらのバリアントのアミノ酸配列をコードするDNAを合成し、哺乳動物一過性発現プラスミド中にクローニングした。CHOをベースとする一過性発現系を使用してバリアントを発現させ、得られた抗体含有細胞培養上清を遠心分離および濾過によって清澄化した。アフィニティークロマトグラフィーを介して細胞培養上清からバリアントを精製した。精製された抗体をリン酸緩衝生理食塩水溶液中に緩衝液交換した。得られた抗体の純度は、還元および変性SDS-PAGEゲルによって判断して、＞95％であると決定された。抗体濃度は、280nmでの吸光度を測定することによって決定した。
結合アッセイを以下のように行った。抗ヒトFcを使用して、一連のバイオセンサの表面上に抗体バリアントを0.15μg/mlで固定化した。100nMの抗原を前記表面上に通過させて、結合応答を生じさせた。抗体:抗原相互作用の結合データをバイオセンサ上において25℃で収集した。選択した抗体バリアントに対する結果を表14に示す。表14において、X＝610は、解離相の開始時（バイオセンサを抗原と最初に接触させてから610秒後に測定）での捕捉された抗原値（nM）を表し、X＝1495は、解離相の終了時（バイオセンサを抗原と最初に接触させてから1495秒後に測定）での捕捉された抗原値（nM）を表す。表14において、0.2より大きいX＝610値および10％未満の％解離を有する抗体が太字で示されている。
（表１４）結合アッセイ
Figure 2024536133000043
Figure 2024536133000044
Figure 2024536133000045
選択した抗体バリアントに対してさらなる速度論アッセイを行った。アッセイは以下のように行った。抗ヒトFcを使用して、一連のバイオセンサの表面上に抗体バリアントを固定化した。抗原を前記表面上に通過させて、結合応答を生じさせた。抗体:抗原相互作用の結合データをバイオセンサ上において25℃で収集した。結果を包括的にフィットさせ、ka、kdおよびKDの最善値を得るために、抗原の希釈系列を会合工程において使用した。表面に固定化された抗体への抗原の結合についての応答データを1:1結合モデルにフィットさせた。速度論的パラメータを表15に要約する。
（表１５）結合速度論
Figure 2024536133000046
実施例17 - 77A IgG1抗体
本実施例は、h77A-1、IgG1重鎖定常領域（またはそのバリアント）およびカッパ軽鎖定常領域を含む完全長抗体の作製を記載する。
（実施例12に記載されているように）hVH-1およびhVL-1の組み合わせを含むh77A-1を、IgG1重鎖G1m（3）および軽鎖Km（3）アロタイプ（G1m3バリアント）の定常領域に融合した。野生型G1m（3）-Km（3）定常領域に加えて、FcγR2aへの結合を増加させるためのIgG1 G236A変異を含むFcバリアント（GAバリアント）、およびFcγR3aへの結合を増加させるためのIgG1 G236A/A330L/I332E変異を含むFcバリアント（GAALIEバリアント）を作製した。293またはCHO細胞中で抗体を発現させた。
抗体は表16に記載されており、抗体のアミノ酸配列は表17に示されている。
（表１６）h77A-1抗体
Figure 2024536133000047
（表１７）アミノ酸配列
Figure 2024536133000048
実施例18 - 77A高分子量免疫複合体の形成
本実施例は、77AバリアントがHSP70に結合した際の高分子量免疫複合体の形成を記載する。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を使用して、h77A-1-G1m3（「G1m3」;実施例17に記載されているとおり）およびHSP70の共局在を調べた。各タンパク質の検出を可能にするために、h77A-1-G1m3をCF647色素で標識し（「G1m3-CF647」）、HSP70をGFPに融合した（「HSP70-GFP」）。
特に明記しない限り、Superose 6 Increase 10/300 GLカラムをすべての実験に使用した。特別仕様のタンパク質標準を使用してカラムの保持時間を較正して、空隙容量を決定し、分子量の道標とし、溶出時間の直線性を評価した。移動相はPBS、pH7.4であり、0.75 ml/分の流速で走行させた。圧力最大値を650psiに設定し、35分の実行時間とした。180～800nmの範囲の吸光度を検出するように設定されたオンボードPDA検出器を用いて、複合体の検出を行った。488nmでの励起および510nmでの発光を使用して、GFPの蛍光を検出した。650nmでの励起および665nmでの発光を使用して、CF647の蛍光を検出した。LabSolutions分析ソフトウェアを使用して分析を行って、ピーク面積、ピーク高、保持時間およびすべての検出された波長を得た。保持時間を用いておよその分子量を予測した。動態、複合体形成および抗体結合相互作用の差は、HSP70の組換え野生型形態とGFP融合形態との間で無視できると判定された。
ベースライン保持時間を設定し、個々のタンパク質の単量体立体構造を実証するために、G1m3-CF647およびHSP70-GFPの個々の試料をSECカラムに通した。ピークの検出は、HSP70についてはGFPから、または抗体についてはCF647からの蛍光を用いて測定された。結果を図30に示す。
次いで、G1m3-CF647をHSP70-GFPありまたはなしでインキュベートし、SECカラムに通した。3～30マイクログラムの質量のタンパク質を含有する50マイクロリットルの注入体積を用いて、各試料を走行させた。抗体およびHSP70の両方が共局在しているかどうかを決定するために、最初に、G1m3-CF647およびHSP70-GFPを1:1のモル比で使用して単一の複合体化反応を行った。同じ試料を2回走行させ、最初にGFPからの蛍光を検出し、次いで再びCF647からの蛍光を検出した。
SEC分析の結果は、G1m3-CF647およびHSP70-GFPの両方が高分子量複合体に共局在していることを示している（図31）。ピークの得られたパターンは、広範囲のサイズではなく、目立たない規則正しいピークが再現可能に形成されたことを示した。観察された保持時間は再現性があり、より高分子量の複合体が安定であることを示唆した。
さらに、HSP70-GFPに対するG1m3-CF647のいくつかの異なるモル比（1:9、1:3、1:1および3:1）で複合体化反応を行った。次いで、これらの試料を個々に走行させて、まずCF647からの蛍光を検出し（図32）、次いで再びGFPからの蛍光を検出した（図33）。HSP70-GFP（図32）またはG1m3-CF647（図33）のいずれかを追跡すると、ピークの形成は用量応答性であった。
各ピークの推定分子量ならびにG1m3-CF647およびHSP70-GFPの分子量に基づいて、高分子量免疫複合体の組成を予測した。結果を図34に示す。
要約すると、これらの結果は、77Aバリアント、例えばh77A-1-G1m3が、HSP70に結合すると、明確な高分子量免疫複合体を頑強にかつ再現性よく形成することができることを実証している。
実施例19 - 77A:HSP70複合体Fc受容体結合
本実施例は、77抗体およびHSP70複合体によるFc受容体結合を記載する。
上記実施例18で記載されているように、77A抗体バリアントは、HSP70に結合すると高分子量免疫複合体を形成することができる。抗体単独と比較して、これらの複合体によるFc受容体の結合を調べるために、77A抗体バリアントをELISA FcγR結合アッセイにおいて評価した。
簡潔には、50mM炭酸塩-重炭酸塩緩衝液中0.3ug/mLでFc受容体を使用して、ELISAプレートウェルを一晩コーティングした。翌日、1×PBS-T緩衝液を用いてプレートを3回洗浄し、SuperBlockを用いて室温で1時間ブロッキングした。抗体の希釈物を一定量のHSP70と混合し、室温で1時間複合体化させた。プレートを前述のように再び洗浄し、次いで、予め複合体化された抗体/HSP70または抗体のみのいずれかの希釈系列をウェルに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを前述のように再び洗浄し、HRPにコンジュゲートされたヤギFab断片抗ヒトを1:3000に希釈し、室温で15分間ウェルに加えた。プレートを再度洗浄し、TMBを各ウェルに添加した。次いで、硫酸の停止溶液を用いて基質を停止させた。次いで、450nm、540nm、900nmおよび999nmで吸光度を読み取った。
結果を図35および図36に示す。試験された抗体には、マウスIgG1（図35A）、IgG2a（図35B）およびIgG2b（図35C）フォーマットのマウス77A、ならびにヒト化h77A-1-G1m3（実施例17に記載されているとおり;図36）が含まれた。抗体単独とは対照的に、抗体:HSP70複合体はFc受容体により強く結合した。高分子量免疫複合体中での複数の抗体の存在は、増加したアビディティをもたらすと考えられる。FcγRへの結合はFcアイソタイプに依存しなかった。結合活性は、マウス抗体およびヒト化抗体の両方について観察された。
Fc受容体結合結果は、抗体単独またはHSP70との複合体を使用したBLIアッセイにおいて確認された。BLIベースのアッセイのために、抗体および試薬をマイクロウェルプレート上に希釈した。複合体の形成のために、抗体およびHSP70を1:1のモル比で一緒に混合し、1000rpmでの単一軌道の振盪を用いて、30℃で60分間複合体化させた。抗体単独については、同じ濃度の抗体をHSP70なしで使用した。インキュベーション後、BLIディップ・アンド・リードセンサに、10ug/mLの関連するヒトまたはマウスFc受容体を搭載した。次いで、抗体のみを含有するマイクロウェルまたは新たに形成された免疫複合体を含有するマイクロウェル中に、新たに搭載されたセンサを300秒間浸漬した。次いで、センサを緩衝液のみに浸漬して、Fc受容体からの解離を720秒間測定した。
マウス77Aおよびヒト化h77A-1-G1m3の結果を図37に示す。この場合も、マウス（図37A）およびヒト化（図37B）77Aについて、より強い結合が複合体について観察された。Octet Analysis Studioソフトウェアを使用して分析を実行して、h77A-1-G1m3の要約動態（summary kinetics）を決定した。結果は図37Cに示されており、抗体単独と比較して、抗体:HSP70複合体について、結合応答の増強された大きさおよび改善された解離速度を示している。
市販の抗HSP70抗体CM710.1およびN15F2-5の結果を図38に示す。CM710.1およびN15F2-5については、HSP70とのインキュベーションはFc受容体結合に実質的な差をもたらさず、これらの抗体はHSP70に結合した際に、高分子量免疫複合体を形成しないことを示唆した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、市販の抗HSP70抗体CM710.1およびN15F2-5が高分子量免疫複合体を形成する能力をさらに調査した。
実験は、実質的に実施例18に記載されているように行った。簡潔には、抗体（マウスIgG1フォーマットのマウス77A、CM710.1またはN15F2-5のいずれか）をCF647色素で標識し、HSP70をGFPに融合した（「HSP70-GFP」）。ピークの検出は、HSP70についてはGFPから、または抗体についてはCF647からの蛍光を用いて測定された。抗体およびHSP70-GFPを1:1のモル比で使用して、複合体化反応を行った。次いで、SECカラムに同じ試料を2回走行させ、最初にGFPからの蛍光を検出し、次いで再びCF647からの蛍光を検出した。マウス77AおよびN15F2-5の結果を図39Aに示し、マウス77AおよびCM710.1の結果を図39Bに示す。図示されているように、マウス77Aについては、高分子量免疫複合体に対応するピークが観察されたが、CM710.1またはN15F2-5については観察されなかった。
総合すると、これらの結果は、HSP70に結合すると、77A抗体バリアントは高分子量免疫複合体を形成し、これらの高分子量免疫複合体は抗体単独よりFc受容体により強く結合することを示す。市販の抗HSP70抗体CM710.1またはN15F2-5は高分子量免疫複合体を形成するようには見えないので、高分子量免疫複合体を形成する能力は、単にHSP70結合の機能ではない。さらに、複合体形成は、抗体アイソタイプとは無関係に、マウスおよびヒト化77A抗体の両方について起こる。
実施例20 - 77A:HSP70複合体細胞取り込み
本実施例は、77抗体およびHSP70複合体の細胞取り込みを記載する。
上記実施例18で記載されているように、77A抗体バリアントは、HSP70に結合すると高分子量免疫複合体を形成することができる。細胞がこれらの複合体を内部に移行させることができる程度を決定するために、FACSをベースとするアッセイを開発した。
簡単に記載すると、まず、PBS＋1％BSA緩衝液中で、固定量のHSP70-GFPを様々な量の抗体とともに、暗所で室温にて30分間インキュベートすることによって複合体を形成させた。示されている場合、タンパク質分解的に活性な細胞においてGFPシグナルを増強するために、Alexa 488色素（GFPブースター）で標識された抗GFPナノボディをHSP70-GFPに対して1:1000の比で複合体化反応に添加した。抗GFPナノボディは複合体形成を妨害しなかった。
並行して、APC（抗原提示細胞）などのタンパク質分解的に活性な細胞については、10μMの市販のプロテアソーム阻害剤化合物MG-132で、細胞を37℃で3時間前処理した。接着細胞がアッセイされた場合には、0.05％トリプシンを用いて接着細胞を穏やかに剥がし、完全培地中で迅速にクエンチした。接着細胞をペレット化して残存するトリプシンを除去し、（必要に応じて10μMのMG-132を含有する）新鮮な完全培地中に1×106細胞/mLの濃度で再懸濁した。懸濁細胞については、まず、懸濁細胞を300×gで5分間穏やかにペレット化し、1×106細胞/mLで、（必要に応じて10μMのMG-132を含有する）新鮮な完全培地に再懸濁した。その後、細胞を96ウェルプレートの各ウェル中に1×105細胞で等分し、以降4℃で維持した。Fc受容体を内因的に発現しない293細胞による取り込みを促進するために、Fugene HDを所望のFc受容体をコードする8μgのプラスミドDNAに対して3:1の比で使用して、10cm皿中で細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、記載したように細胞をプレートから剥がし、取り込みアッセイにおいて使用した。
抗体:HSP70複合体が形成されたら、プレート中の細胞を前述のようにペレット化し、上清を除去し、複合体の希釈物（および必要に応じてMG-132）を含有する200μLのPBS＋1％ BSA緩衝液をウェルに添加した。細胞を複合体と穏やかに混合し、次いで、暗所で4℃に戻して、細胞に複合体を1時間内部移行させた。次いで、プレートを回転させて細胞をペレット化して、内部移行されなかった複合体を除去した。上清を除去し、次いで、細胞を残りの体積中に再懸濁し、1μLのZombie Violet生死判定染色を各ウェルに添加した。4℃で15分間染色した後、PBSを用いてウェルを洗浄し、150μLのPBSの最終体積中に再懸濁し、FACSを通して流した。取り込みが完了した後、分析および蛍光補正のためにFlowjoソフトウェアを使用した。蛍光補正を適用し、ダブレットを除去した後、生存事象に対して細胞をゲーティングした。次いで、％GFP陽性事象に対して、生きた細胞集団をゲーティングした。
第1のアッセイでは、ヒトFcγR2Aを形質移入された293細胞において、抗体:HSP70-GFP複合体の取り込みをアッセイした。試験された抗体は、ヒトIgG2フォーマットのヒト化h77A-1、およびマウスIgG2bLALAPG（「LALAPG」;還元型Fc受容体結合変異体）フォーマットのマウス77Aであった。図40に示されている結果は、ヒト化h77A-1抗体を使用して形成された複合体が293細胞によって取り込まれたことを示す。
別のアッセイでは、単球性THP-1細胞において、抗体:HSP70-GFP複合体の取り込みをアッセイした。試験された抗体は、ヒトIgG2フォーマットのヒト化h77A-1およびヒト化h77A-1-G1m3であった。抗体をHSP70-GFPおよびGFPブースターと複合体化させた。図41に示されている結果は、293細胞について見られたのと同様の傾向を示し、ニワトリ卵白リゾチームに対して産生された無関係なアイソタイプ対照抗体（抗HEL-IgG）と比較して、またはHSP70単独と比較して、用量応答取り込みが存在した。
ヒトIgG2フォーマットのh77A-1およびh77A-1-G1m3に加えて、（実施例17に記載されているように）h77A-1-G1m3-GAおよびh77A-1-G1m3-GAALIEを用いて、THP-1細胞取り込みアッセイも行った。結果を図42に示す。
マウスIgG1、IgG2a、IgG2bおよびIgG2bLALAPGフォーマットのマウス77Aを使用して、取り込みについて、マウスAPC様細胞株も調べた。RAW264.7マクロファージ細胞（図43）ならびにDC3.2およびDC2.4樹状細胞（図44）のいずれもが、抗体:HSP70-GFP複合体の著しい取り込みを示した。マウス骨髄由来初代単球も、バックグラウンドレベルを超える複合体の取り込みを示した（図45）。
ヒト化h77A-1-G1m3を使用して、取り込みについて、ヒト初代細胞も調べた。ヒトマクロファージ細胞（図46A）およびヒト単球細胞（図46B）はいずれも、抗体:HSP70-GFP複合体の著しい取り込みを示した。h77A-1-G1m3、h77A-1-G1m3-GAおよびh77A-1-G1m3-GAALIEを用いて、ヒトマクロファージ取り込みアッセイも行った。結果を図46Cに示す。各例において、ヒト化h77A-1抗体を用いて形成された複合体は、細胞によって取り込まれた。
総合すると、これらの結果は、77A:HSP70複合体がHSP70取り込みの顕著な増強を示すことを示す。細胞取り込みは種によって限定されなかった。ヒトおよびマウス細胞は、HSP70-GFP単独または対照抗体と比較して、複合体の著しい取り込みを示した。還元型Fc受容体結合LALAPG変異抗体のみが、細胞取り込みのバックグラウンドレベルを再現可能にもたらした。
一貫して、ヒトIgG1（G1m（3））アイソタイプは、IgG2アイソタイプと比較して、HSP70-GFPのより強固な取り込みを媒介するようであった。ヒト細胞からのデータと一致して、ヒトIgG1と機能的に類似するマウスIgG2aは、他のマウスアイソタイプ（IgG1およびIgG2B）よりも良好な取り込みを有していた。さらに、FcバリアントGA/GAALIEは単量体形態のFc受容体の結合エンゲージメントを変化させることができたが、これらのバリアントについて、野生型G1m（3）と比較して同等の細胞取り込みが観察されたので、Fc受容体に対する高分子量免疫複合体の増加したアビディティは、前記単量体Fcバリアントについて観察された結合の差を無効化するようである。
全体として、これらの実験は、免疫複合体がAPCおよびAPC様細胞によって取り込まれ得ること、およびヒトIgG1アイソタイプがこの効果の媒介に関してIgG2より優れていることを示す。
実施例21 - 77A:HSP70複合体細胞取り込み
本実施例は、77抗体およびHSP70複合体の細胞取り込みを記載する。
上記実施例18で記載されているように、77A抗体バリアントは、HSP70に結合すると高分子量免疫複合体を形成することができる。市販の抗HSP70抗体N15F2-5（Enzo Scientific）およびCM170.1（Klinikum rechts der Isar,Technical University of Munich）はHSP70に結合するが、高次の複合体の形成を刺激することはできない。マウス樹状細胞およびマクロファージ細胞内へのHSP70-GFPの取り込みを媒介するN15F2-5およびCM170.1の能力を試験し、マウスIgG1、IgG2aおよびIgG2bフォーマットのマウス77Aと比較した。生細胞中のGFPを検出および定量するように設計されたFACSをベースとする取り込みアッセイにおいて、抗体を試験した。
簡潔には、組換えHSP70-GFP（1mg/ml）および抗HSP70抗体（5mg/ml）を使用して免疫複合体を生成した。検出を増強するために、抗GFPナノボディ-Alexa-488（gb2AF488-50、Chromotek）も添加した（HSP70-GFPに対して1:1000の比）。抗ニワトリ卵白リゾチーム（抗HEL）抗体を対応する陰性対照として使用した。マウス樹状細胞（DC3.2）またはマウスマクロファージ（MH-S）に室温で1時間添加する前に、撹拌しながら室温で1時間タンパク質をインキュベートすることによって免疫複合体を生成させた。次いで、フローサイトメトリーによる分析の前に、細胞をPBSで3回洗浄した。データ取り込みが完了した後、分析および蛍光補正のためにFlowjoソフトウェアを使用した。蛍光補正を適用し、ダブレットを除去した後、生存事象に対して細胞をゲーティングした。次いで、生細胞集団を％GFP陽性事象についてゲーティングした。
図47および図48に示されているように、陰性対照である抗HELアイソタイプ（IgG1-HEL、IgG2a-HEL、IgG2b-HEL）によって媒介されるHSP70-GFP取り込みは存在しなかった。試験された抗体のうち、77A-IgG2aアイソフォームが、DC3.2およびMH-S細胞内へのHSP-GFP取り込みを刺激する上で最も効果的であった（78.3％および66％の生細胞がGFP陽性であった）。77A-IgG2bアイソタイプは、HSP70-GFPの取り込みをより低い程度で媒介した（それぞれ4.85％および16％のGFP陽性）。著しく減弱したFcγR結合能を有する77A-IgG1アイソタイプおよび77A-IgG2bLALAPG変異体は、MH-S細胞のみで弱く活性であった。市販の抗HSP70 N15-2およびCM170.1抗体は、これらのアッセイにおいては不活性であり、HSP70への結合に際して免疫複合体形成をシミュレートすることができないことと一致した。
実施例22 - 77Aの操作されたFcバリアントの初代細胞取り込み
本実施例は、ヒト初代免疫細胞による77A抗体の操作されたFcバリアントおよびHSP70複合体の取り込みを記載する。
上記のように、ヒト化抗体77Aは可溶性HSP70を標的とし、IgG1 Fc領域中の配列の一部において特異的に改変された。コードされたアミノ酸配列に対するこれらの操作された変異は、2つの新しいFcドメインバリアント（G236A）および（G236A/A330L/I332E）（EUナンバリングシステムに基づく）をもたらし、それぞれ「77AGA」および「77AGAALIE」と記載された。これらのバリアントに加えて、野生型ヒトIgG1 Fcドメインを有する元の抗体配列も保持され、本明細書では「WT」と称される。以下に記載される実験は、ヒトFcγR2Aへの結合を特徴付け、抗体バリアントのそれぞれについて、ヒト初代抗原提示細胞による抗体:HSP70複合体の取り込みに対する機能的影響を決定するために行われた。
ELISAアッセイを実施して、単量体抗体またはHSP70と複合体を形成した抗体のいずれかによる、コーティングされたFcγR2Aへの結合を評価した。簡潔には、プレートを組換えヒトFcγR2Aで、0.3μg/mLで一晩コーティングすることによってアッセイを実施した。次いで、プレートを300μLの1×PBSTで3回洗浄し、次いで、ウェルあたり150μLのSuperBlockを使用して1時間ブロッキングした。前述のように洗浄を繰り返し、次いで、抗体バリアントのいずれか（「単量体抗体」と呼ばれる）または抗体免疫複合体のいずれか（以下「77A ICX」と呼ばれる）の希釈系列を添加した。各希釈系列を作製するために、以下のことを行った:HSP70を一定に保ち、まず、200nMの2×濃度で調製した。まず、第1のウェルに対して、抗体を600nM（開始濃度の2倍）で調製し、次いで、1×PBSTを使用して3倍の増分で段階希釈した。単量体抗体としてのアッセイで使用するために、80μLの各2×抗体希釈物を80μLの1×PBSTに添加し、ピペットによって十分に混合して1×希釈系列を作製し、最高濃度は300nMであった。77A ICXを形成するために、80μLの各2×抗体希釈物を80μLの2×HSP70に添加し、ピペットによって十分に混合した。複合体を室温で1時間形成させ、3:1の抗体:HSP70で開始し、抗体希釈の各段階で減少する比系列を得た。複合体形成後、単量体抗体または77A ICXの希釈系列中の50μLの各試料を適切な対照とともにプレートに添加した。プレートを1時間インキュベートした後、上記のように洗浄した。次に、1×PBST中1:5000の希釈で使用され、HRPにコンジュゲートされた、ヒトFabに対する二次抗体50μLをウェルに添加した。次いで、プレートを室温で15分間インキュベートした。プレートを再び前述のように洗浄し、次いで、50μLのTMB基質溶液を添加した。反応を停止させるために、硫酸を含有するELISA停止溶液をウェルに添加した。次いで、450および540nmの波長で、プレートリーダー上でプレートを読み取った。
FACSをベースとするアッセイを使用して、抗原提示細胞によるHSP70-GFPの取り込みを評価した。使用された様々な初代細胞は、Stemcell Technologies,Inc.から商業的に供給され、予め精製され、クライオバイアル中で凍結されたものを入手した。使用時に、細胞を解凍し、洗浄し、ペレット化してクライオメディアを除去し、次いで、必要に応じて適切な補充物質を含む推奨される培養培地中に1×106細胞/mLで再懸濁した。再懸濁時に、細胞は、10μMのMG-132プロテオソーム阻害剤での処理を始めた。内部移行されたICXのプロテオソーム分解によるGFPシグナルの低下を防ぐために、MG-132の添加が必要とされた。培養培地中において、37℃で5％CO2中でインキュベートしながら、細胞を3.5時間処理した。各抗体、50nM HSP70-GFP、10μM MG-132およびAlexa 488をコンジュゲートされたGFPに対するナノボディの1:220希釈物を含むPBS＋1％BSA中で、免疫複合体（ICX）の形成を行った。各抗体系列について、他のすべてを一定に保ちながら抗体の量を滴定した。使用した抗体の最高濃度は、図に示されているように細胞型依存性であった。これらの混合物を暗所で室温にて30分間インキュベートして複合体を形成させ、次いで氷上で予め冷却した。細胞懸濁液を1.5×105細胞/ウェルで96ウェル丸底プレートに蒔き、ペレット化した。プレートを傾けて上清を除去し、氷上で冷却した。複合体化された抗体:HSP70-GFP混合物を含有する予め冷却された緩衝液を加えた各ウェル中に細胞を穏やかに再懸濁し、4℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をペレット化し、プレートを傾けて上清を捨て、FACS染色緩衝液中に再懸濁した。細胞を再度ペレット化し、プレートを傾けて上清を捨て、プレート中の各ウェルの残存容量に1μLの生死判定染色を添加した。細胞を氷上で暗所にて40分間染色した後、FACS染色緩衝液を添加して細胞を洗浄し、再度ペレット化した。細胞をさらに洗浄し、プレートを傾けて上清を捨てた後、細胞を400μLのPBSに再懸濁した。得られた細胞懸濁液をサイトメータに取り込み、生存事象でゲーティングした。生死判定染色に対してはアミン反応性蛍光補正（ArC）ビーズ、およびGFPチャネルに対してはUltraCompビーズを使用して蛍光補正を行った。
組換えFcγR2Aとの相互作用は、単量体形態の抗体については弱かったが、HSP70との複合体では、受容体に対するアビディティが大幅に増加した（図49A）。組換えFcγR2Aに対して、同様の結合パターンが、77AWT、77AGAおよび77AGAALIEバリアントについて観察された（図49B）。FACSをベースとするアッセイにおいて内部移行が観察され、取り込みはより高い比率で最大であった（図50、図51および図52）。単球は、77AWTバリアントと77AGAALIEバリアントの間で同等の取り込みを有したが、77AGAバリアントでは低下した（図50）。マクロファージは、すべてのバリアントについて概ね重複する取り込み曲線を有していた（図51）。最後に、未成熟樹状細胞は、77AWTおよび77AGAALIEと比較して、改善されたEC50取り込み値、および77AGAバリアント由来の増加した量の取り込みを、ともに示した（図52）。
インビトロELISA実験の結果は、抗体の3つのバリアントのすべて（77AWT、77AGAおよび77AGAALIE）がインビトロで同等の程度でFcγR2Aと相互作用することができることを示した。細胞ベースの取り込みアッセイでは、より低い親和性のFcγRに対する、抗体:HSP70複合体の増加した結合は、増加した量の内部移行を生じさせた。内部移行の量は、抗原提示細胞の種類に応じて、77AWTと比較して、77AGAおよび/または77AGAALIE変異の存在によって増強された。Fc操作されたバリアントはいずれも、マクロファージおよび樹状細胞上で、77AWTと比較して同等または増強された取り込みの能力を示すことができた。単球上でのみ、77AWTは、77AGAまたは77AGAALIEバリアントよりも高いレベルの取り込みを示した。
実施例23 - 初代ヒト免疫細胞の77A野生型および操作されたFc抗体による活性化
本実施例は、HSP70と複合体を形成した77A抗体の操作されたFcバリアントによる初代ヒト細胞の活性化を記載する。
HSP70と複合体を形成した77A抗体（以下ではICXと呼ぶ）を、初代免疫細胞サブセットからの活性化応答の誘発について試験した。これらの研究は、野生型（77AWT）、77AGAまたは77AGAALIEIgG1 Fc操作されたヒト化抗体バリアントを使用して形成されたICXがインビトロアッセイ中に応答を誘発する能力を比較した。ドナーPBMCから濃縮された初代ヒト細胞の様々なリンパ系列および骨髄系列を使用して実験を行った。
18～65歳の成人の健康なドナー由来のヒト末梢血単核細胞（PBMC）を各実験のために取得した。最初に、密度勾配での遠心分離を使用してPBMCを単離した。次いで、バフィーコート層をペレット化し、遠心分離および再懸濁によってPBS中で3回洗浄した。得られたPBMCをフォローアップアッセイのための入力として使用し、未使用のPBMCをクライオメディア中で凍結保存し、次いで液体窒素の気相中で保存した。必要に応じて、凍結されたPBMCを37℃で急速に解凍し、培養培地中に再懸濁し、ペレット化してクライオメディアを除去した。培養条件については、PBMCを完全培養培地（10％FBS、55μM 2-メルカプトエタノール、10mM HEPESを補充したRPMI 1640培地）に再懸濁し、37℃、5％CO2でインキュベートした。使用された各PBMCサブセットについて、Miltenyi単離キットを使用して、バルクPBMCからCD4＋T細胞、CD8＋T細胞、NK細胞または単球集団の所望の標的集団を選択的に濃縮した。未成熟樹状細胞（iDC）を単離するために、まず、記載した濃縮キットを使用して単球を単離し、次いで、脾細胞培地（10％FBS、10mM HEPES、55μM 2-メルカプトエタノール、1×Pen/Strepを補充したRPMI 1640）に、必要とされる適切な容器サイズ中に1×106細胞/mLで播種した。未成熟樹状細胞を生成するために、まず、単球をrhIL-4（250U/mL）およびrhGM-CSF（1,000U/mL）とともに培養して分化を刺激した。48時間後、または酸性化が観察されれば、培地を補充した。刺激の5日後、単球由来の未成熟樹状細胞を計数した。培養培地中で各実験のためにICXを新鮮に調製し、40μg/mLのHSP70と80μg/mLの抗体との1:1混合物のインキュベーションによって実施して、2倍濃度の複合体を得た。アッセイで使用する前に、複合体を室温で1時間形成させた。複合体化後、10μg/mLのHSP70および20μg/mLの抗体のウェル中での最終濃度になるように、0.75mLのこの新たに形成されたICXを培養中の0.75mLの細胞に添加した。示された成分なしで上記のように、ICXの一部を欠く条件を調製した。添加される場合、rhIL-2は10ng/mLの培養条件で使用された。実施されたすべての実験について、樹状細胞またはNK細胞を用いたアッセイは脾細胞培地中で培養されたのに対して、T細胞（CD4＋またはCD8＋）は培養培地中で培養された。増殖アッセイのために、4μM CFSEの存在下でT細胞を30分間標識した後、過剰の色素をクエンチし、培養培地で洗浄した。培養条件でrhIL-2を用いて実施されたアッセイ条件については、rhIL-2を10ng/mLで使用した。陽性対照として、ブドウ球菌のエンテロトキシンBを2μg/mLで培養条件に添加した。アイソタイプ対照として、非結合性の無関係なヒトIgG1抗体（IsoPAL）を使用した。サイトカインおよびCFSE増殖アッセイの両方のために、まず細胞を培地に再懸濁し、次いで種々の処理条件をその後ウェルに加えた。次いで、示された条件で5日間（CFSE）または6日間（サイトカインアレイ）細胞を培養した。CFSE増殖アッセイのアッセイ終点で、細胞をペレット化し、PBSに再懸濁し、次いで、生死判別のために染色した後、BD LSRFortessaサイトメータに取り込んだ。FlowJo分析ソフトウェアを使用する分析のために生存事象をゲーティングした。FACSによる細胞の表現型特徴付けのために、生死判別、CD45、CD8aおよびCD4発現についてT細胞をしかるべく染色した。活性化マーカーは、サイトメータに取り込む前に、α-ヒトCD25およびα-ヒトHLA-DP/DR/DQ FACS試薬を使用することによって染色された。サイトカインアレイアッセイの終点分析のために、その後、培地を回収し、Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening Panel、48 plexキットとともにBio-RAD Bio-Plex Multiplex Systemを使用してプロファイリングを行った。データを取り込み、Bio-Plex Data Proソフトウェアを使用して分析した。観察された強度値を培地のみの対照に対して正規化し、ヒートマップを生成した。
CFSE希釈のためのCD8 T細胞FACSアッセイは、陽性対照とともに、いくつかの実験条件で増殖が起こっていることを実証した（図53）。陰性対照条件では増殖は観察されなかった。形成されたICXに曝露すると、野生型、GAおよびGAALIEバリアントはすべて、培養中のT細胞のサブセットから、培地のみの条件と比較して同等のレベルの増殖を誘発した。ICXのこれらの効果は、CD8 T細胞で直接観察され、観察されたCD8＋T細胞増殖応答を誘発する前に、最初にAPCへのICXの逐次曝露を必要としなかった。IL-2単独、またはIL-2と非複合体化HSP70（および非結合アイソタイプ）の添加は、有意なレベルの増殖を推進するのに十分ではなかった。応答におけるCD8＋T細胞の活性化を測定した表現型FACS分析において、細胞とICXの同時インキュベーションは、HSP70単独で達成された二重陽性HLA-DRおよびCD25細胞のレベルの3倍超をもたらした（図54）。サイトカインアレイの結果は機能データと一致しており、Fcバリアントのいずれかを有するICXが、活性化Th-1に偏ったサイトカインの、増強された、但し同等のレベルをもたらしたことを実証した。これは、培養でのrhIL-2の添加によってさらに増強された（表18）。各サイトカインに特異的な蛍光強度を測定し、得られた蛍光強度値を培地のみの対照の強度に対して正規化することによって、サイトカインアレイを定量した。77A-HSP70 ICXのインキュベーションは、さらなるIL-2刺激の存在下および非存在下で、サイトカイン合成ならびに初代ヒトCD4＋およびNK細胞からの放出も刺激した（それぞれ、表19および20）。異なる77A Fcドメインバリアント間で有意な差は検出されなかった。
（表１８）CD8＋T細胞サイトカインアレイの蛍光強度値
Figure 2024536133000049
Figure 2024536133000050
Figure 2024536133000051
（表１９）NK細胞サイトカインアレイの蛍光強度値
Figure 2024536133000052
Figure 2024536133000053
（表２０）CD4＋T細胞サイトカインアレイの蛍光強度値
Figure 2024536133000054
Figure 2024536133000055
77A ICXは、CD11c樹状細胞上のCD83活性化マーカーの増加した発現によって測定されるように、初代未成熟樹状細胞の活性化も刺激した（図55）。ICXによる樹状細胞活性化の規模は、陽性対照であるTNF-α＋イオノマイシンの組み合わせで観察されたものと同様であった。
これらの研究の結果は、77A ICXへのヒト初代免疫細胞の曝露に対する客観的応答を実証している。いくつかの条件は、完全に増強された応答を観察するためにIL-2の補充を必要としたが、各実験は、活性化応答を誘発するICXの識別可能な効果を示した。野生型、GAおよびGAALIEバリアントは、一般に、同等レベルのインビトロ増殖およびサイトカイン活性化を示した。驚くべきことに、これらの応答のいくつかを部分的に誘発するにはHSP70単独で十分であったが、サイトカインアレイデータならびにHLA-DRおよびCD25の表現型の同時発現は、CD8＋T細胞活性化を増強させる上でICXははるかに効果的であり、Th-1型に偏った応答をもたらすことを示した。
これらのデータは、HSP70:77A免疫複合体の形成が、自然免疫系および適応免疫系の重要な免疫細胞の活性化および成熟の客観的な増加したレベルを通して応答を誘発することを実証している。
実施例24 - 77Aの操作されたFcバリアントのEG7モデルにおけるインビボ活性
本実施例は、HSP70と複合体を形成した77A抗体の操作されたFcバリアントのインビボ活性を記載する。
野生型IgG1抗体77AWTならびに操作されたFc GAおよびGAALIEバリアント（それぞれ、77AGAおよび77AGAALIE）を用いて、ヒト化77Aによる有効性および生存に対する影響を調べるために、改変されたC57BL/6マウス宿主、ならびにホタルルシフェラーゼおよびニワトリ卵白アルブミン遺伝子（OVA）を過剰発現するように改変された播種性EG7-OVAマウスTリンパ腫腫瘍モデルを使用して、インビボ研究を実施した。本研究は、HSP70-OVAおよび試験した抗体のそれぞれを使用してインビトロで予め形成されたHSP70-OVA:77A免疫複合体（ICX）による、確立された播種性腫瘍を既に有するマウスに対する影響を評価することに焦点を合わせた。
本研究で使用されたC57BL/6バックグラウンドの遺伝子改変マウス、遺伝子型B6.Cg-Del（1Fcgr2b-Fcgr3）1RavFcgr1＜tm1Hoga＞Tg（FCGR1A）＃JgjwTg（FCGR2A）11MkzTg（FCGR2B）＃RavTg（FCGR3A）1156RavTg（FCGR3B）1373Ravは、12週齢～16週齢の範囲であり、動物バリア施設で飼育された。実験開始時に、0日目に、100μLのPBS中に懸濁された1×106個のEG7-OVA細胞を雌マウスに静脈内注射した。IVIS 200画像装置を使用してルシフェラーゼ活性について、マウスを週に2回画像撮影した。5つの群への、異なる処置を受けている15匹の雌マウスの無作為割り当てを、ルシフェラーゼシグナル強度に基づいて7日目に行った。免疫化のために使用されるHSP70-OVA:77A免疫複合体をそれぞれの注射のために新たに形成させ、非結合性の無関係なヒトIgG1アイソタイプ（IsoPAL）および非処理PBS対照と比較して、操作されたFcバリアント:GA（77AGA）、GAALIE（77AGAALIE）または野生型（77AWT）抗体のそれぞれを用いて行なった。免疫化のために使用される複合体を生成するために、複合体形成反応において各抗体を独立して使用した。160ng/mLの抗体100μLを使用し、200ng/mLのHSP70-OVA100μLと混合し、合計20ngのHSP70-OVAおよび16ngの特異的抗体を含有する200μLのPBSを得て、これを達成した。混合物を室温で1時間インキュベートして複合体形成を容易に生じさせた後、マウスに200μLの混合物を注射した。7日目および13日目に、マウスの後肢側面にHSP70-OVA:77Aの複合体を皮下注射した。20日目に、腹腔内（IP）投与を介して注射される同じ複合体をマウスに追加投与した。さらなる介入は行われなかった。健康状態についてマウスを毎日モニタリングし続け、画像撮影を週に2回行った。マウスが研究中に死亡した場合、または失調性瀕死状態を呈することに関するプロトコル終点基準を満たした後に安楽死させた場合には、マウスを生存データにおいて死亡として記した。
腫瘍負荷に起因するルシフェラーゼ活性は、ほとんどの群において接種後最初の30日間増加し続け、シグナルはほぼ横ばいになった時点で、腫瘍静止が示唆された（図56）。様々な群での累積腫瘍負荷を測定するために、死亡した動物のルシフェラーゼ値を繰り越した。ルシフェラーゼ活性の保持が時間とともに変動するために、いずれの群に対しても統計学的有意性を帰属させることはできなかった。
生存分析のために、カプラン・マイヤー曲線を作成した（図57）。図示されているように、GA群は、アイソタイプ対照（IsoPAL）と比較して生存について統計学的有意性を達成し、ログランク検定において0.0273のp値であった。GA変異を有するヒト化77A抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、全生存期間に対して優れた影響を有した。しかしながら、本研究では、他の群は統計学的に有意なp値に達することができなかった。データは、77A:HSP70-OVA免疫複合体による免疫化が、EG7-OVA腫瘍によって発現されたオボアルブミン抗原に対して、プライムブースト様式で、複合体化されたタンパク質の抗原交差提示を首尾よく提供することができ、抗腫瘍活性をもたらしたという概念実証を実証した。77AGAの誘発された免疫応答は、試験した他の抗体よりも生存上の利益を提供することができた。
実施例25 - E0771マウスモデルにおける77Aの操作されたFcバリアントのインビボ活性
本実施例は、E0771マウスモデルにおける77A抗体の操作されたFcバリアントのインビボ活性を記載する。
野生型ヒトIgG1 Fcドメインを有する77Aならびに操作されたFcバリアント77AGAおよび77AGAALIEの抗腫瘍活性を試験した。本明細書でE0771-HSP70GFPと呼ばれるヒト組換えHSP70-GFPを過剰発現するように改変されたE0771同系乳房腫瘍モデルを使用して、マウスFcγRがそれらのヒト対応物によって置き換えられた改変されたC57BL/6マウス宿主において実験を行った。
本研究で使用されたC57BL/6バックグラウンドの遺伝子改変マウス、B6.Cg-Del（1Fcgr2b-Fcgr3）1RavFcgr1＜tm1Hoga＞Tg（FCGR1A）＃JgjwTg（FCGR2A）11MkzTg（FCGR2B）＃RavTg（FCGR3A）1156RavTg（FCGR3B）1373Ravは、12週齢～16週齢の範囲であり、動物バリア施設で飼育された。実験開始時に、0日目に、PBS中に懸濁された5×105個の細胞を雌マウスの後側腹部に皮下注射した。次いで、腫瘍増殖が確認された後の10日目に、処置群あたり10匹のマウスの4つの群に、マウスを無作為に割り当てた。ヒトアイソタイプ対照IgG1抗体（IsoPAL）またはそれぞれのヒト化抗体のいずれかを、尾静脈経路注射によって、PBS中100μLで、1mg/kgでマウスに投与した。投与は週2回、合計6回行われた。ノギス測定によって腫瘍体積を得て、平均±SEMとしてプロットした。マウスを全生存期間についても観察し、カプラン・マイヤー曲線を作成した。
図58に示されているように、そのFcドメイン中にGA変異を有するヒト化77A抗体（77GA）は、腫瘍増殖阻害において同様の応答を有するように見受けられた野生型（77AWT）および77AGAALIE抗体よりも優れた性能を有した。腫瘍増殖の阻害についての統計的有意性が、GAバリアント対アイソタイプ対照（IsoPAL）について、25日目までに観察された。有意性は、多重比較のためのKruskal-Wallis検定を用いた一元配置ANOVAを使用して計算した。多重比較のために計算された得られた調整p値は、GA対アイソタイプ対照について0.0244であった。GAALIEバリアント抗体も、野生型より改善された活性を有するように見えたが、群サイズのために統計学的有意性に達することができなかった。GA抗体は、生存に関して統計学的に有意な改善を示し、ログランク検定において0.0499のp値で有意性に達した（図59）。
これらのデータは、操作された77A Fcバリアントがいずれも、野生型より改善された抗腫瘍活性を有するようであったことを実証する。77AGAバリアントは、統計的に有意な腫瘍増殖阻害および野生型抗体を上回る生存上の利益を提供した。これらのデータは、同一の抗原結合領域にもかかわらず、野生型IgG1と比較して異なるFcγR結合プロファイルを有する操作された77AGAおよび77AGAALIE Fcドメインが、野生型77A抗体と比較して、ヒト化FcγRマウスにおいてより強い免疫応答を誘発したことを示している。
実施例26 - 77Aの操作されたFcバリアントの、照射されたPANO2マウスモデルにおけるインビボ活性
本実施例は、PANO2照射されたマウスモデルにおける77A抗体の操作されたFcバリアントのインビボ活性を記載する。
（HSP70を誘導する）標的指向化された照射で刺激されたマウス腫瘍モデルにおける増加した免疫原性細胞死（ICD）の役割、および腫瘍由来の細胞外HSP70に結合して抗原提示細胞（APC）内へのその取り込みを媒介する77Aの抗腫瘍活性に対する、結果として生じた活性を決定するために、本研究を使用した。野生型IgG1ヒト抗体（77AWT）をFcドメインの定常領域において操作して、77AGAまたは77AGAALIEバリアントを作製した。本研究は、ヒトアイソタイプ対照（IsoPAL）に対して、野生型ならびに、操作された77AGAおよび77AGAALIEIgG1 Fcドメインバリアントの有効性および生存に対する影響を評価した。実験は、腫瘍に向けた放射線の単回照射後に、改変されたC57BL/6マウス宿主およびPANO2同系膵管腺癌（PDAC）腫瘍モデルを使用してインビボで行われた。PANO2細胞株では、マウスHSP70遺伝子は、CRISPRで媒介された部位特異的組換えを通じてそのヒト対応物によって置き換えられ、別個に組み込まれたルシフェラーゼコード配列も含有した。この操作されたPANO2細胞株は、本明細書ではPANO2-CRE2lucと呼ばれる。
本研究で使用されたC57BL/6バックグラウンドの遺伝子改変マウス、B6.Cg-Del（1Fcgr2b-Fcgr3）1RavFcgr1＜tm1Hoga＞Tg（FCGR1A）＃JgjwTg（FCGR2A）11MkzTg（FCGR2B）＃RavTg（FCGR3A）1156RavTg（FCGR3B）1373Ravは、12週齢～16週齢の範囲であり、動物バリア施設で飼育された。実験開始時に、0日目に、PBS中に懸濁された1×106個の腫瘍細胞を雌マウスの後側腹部に皮下注射した。8日目に、まず、CTスキャンによってマウスの画像撮影を行って腫瘍の境界および配向を確認し、次いで10GyのX線放射線を照射した。9日目に、腫瘍体積によって、群あたり10匹のマウスの3つの処置群に、マウスを無作為に割り当てた。IsoPALまたは77AGAもしくは77AGAALIEヒト化バリアント抗体のそれぞれを、尾静脈注射によって、PBS中100μLで、1mg/kg用量でマウスに投与した。投与は週2回、合計6回行われた。ノギス測定によって腫瘍体積を得た。データは、平均±SEMとして表されている。統計学的に有意な腫瘍増殖阻害が、GA対アイソタイプ（PAL）群に対して観察された（図60）。有意性は、多重比較のためのKruskal-Wallis検定を用いた二元配置ANOVAを使用して計算され、11日目までに有意性に達した（データは示さず）。77AGA対IsoPALを比較する61日目のデータに対してWelchのt検定を行い、（＊）によって示されるように、0.0001未満の高度に有意なp値を達成した。しかしながら、本研究では、77AGAALIE処置群は統計学的有意性に達しなかった。
腫瘍体積は、予想通り、放射線照射による処置後に当初減少したが、30日目に近づくと、ほとんどの処置群で元に戻り始めた。しかしながら、ヒト化77AGAバリアントで処置された群は、腫瘍体積の制御を保ち、本研究の終点まで持続する統計学的に有意な腫瘍増殖阻害を示した（図60）。
本実験は、X線照射の抗腫瘍効果が77AGA Fcドメインバリアントとの組み合わせによってさらに増強され得ることを実証する。すべての群で腫瘍体積は照射後にいくらかの退縮を経験したが、照射単独では永続的応答を誘発するには不十分であった。この応答性は、高線量照射によるICDの結果としての、腫瘍由来の細胞外HSP70の増加した放出の結果であった可能性がある。照射単独では永続的な抗腫瘍応答を誘発するのに十分ではなかったので、これらの知見は、ICD誘導剤と組み合わせて永続的応答および腫瘍阻害を最大化するための77Aの潜在的な有用性を強調している。
本明細書に開示され、特許請求されている方法はすべて、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様に関して説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている方法および方法の工程または工程の順序に変形を適用できることは当業者には明らかであろう。より具体的には、本明細書に記載の作用物質は化学的かつ生理学的に関連する特定の作用物質と置き換えられ得るが、同一のまたは同様の結果が達成されることは明らかであろう。当業者に自明なすべてのこのような類似の置換および修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念内にあると見なされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載された詳細を補足する例示的な手順またはその他の詳細を提供する限度まで、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
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Claims (53)

  1. （i）SEQ ID NO:242のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3）およびSEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）;
    （ii）SEQ ID NO:243のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-GA）およびSEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）;
    （iii）SEQ ID NO:244のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-GAALIE）およびSEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）;
    （iv）SEQ ID NO:245のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-YTE）およびSEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）;
    （v）SEQ ID NO:246のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-LS）およびSEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）;
    （vi）SEQ ID NO:247のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-DF215）およびSEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）;または
    （vii）SEQ ID NO:248のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-DF228）およびSEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）
    を含む、ヒトHSP70に結合する抗体。
  2. 表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定された場合に、50nM以下、10nM以下、5nM以下、1nM以下、0.75nM以下、0.5nM以下、0.1nM、0.075nMまたは0.05nM以下のKDでヒトHSP70に結合する、請求項1記載の抗体。
  3. 高次の抗体:HSP70複合体を形成することができる、請求項1または2記載の抗体。
  4. 前記抗体:HSP70複合体が、少なくとも約290kDa、少なくとも約300kDa、少なくとも約580kDa、少なくとも約1,450kDaまたは少なくとも約1,750kDaの分子量を有する、請求項1～3のいずれか一項記載の抗体。
  5. 前記抗体:HSP70複合体が、少なくとも約300kDaの分子量を有する、請求項4記載の抗体。
  6. 前記抗体:HSP70複合体が、約290kDa、約580kDa、約1,450kDaまたは約1,750kDaの分子量を有する、請求項1～4のいずれか一項記載の抗体。
  7. 前記抗体:HSP70複合体中での抗体のHSP70に対する比が約1:2である、請求項3～6のいずれか一項記載の抗体。
  8. 前記抗体:HSP70複合体が、（i）約1つの抗体分子および約2つのHSP70分子;（ii）約2つの抗体分子および約4つのHSP70分子;（iii）約5つの抗体分子および約10のHSP70分子;または（iv）約6つの抗体分子および約12のHSP70分子を含む、請求項3～7のいずれか一項記載の抗体。
  9. 前記抗体:HSP70複合体が、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定された場合に、10nM以下、5nM以下、1nM以下、0.75nM以下、0.5nM以下、0.1nM、0.075nMまたは0.05nM以下のKDでヒトFcγRに結合する、請求項1～8のいずれか一項記載の抗体。
  10. 前記FcγRが、FcγR1、FcγR2a、FcγR2b、FcγR2c、FcγR3aおよび/またはFcγR3bである、請求項9記載の抗体。
  11. 免疫エフェクター細胞による腫瘍由来ADP-HSP70-ペプチド抗原複合体の取り込みを増強する、請求項1～10のいずれか一項記載の抗体。
  12. 前記取り込みが、ヒトFcγR1、ヒトFcγR2a、ヒトFcγR2b、ヒトFcγR2c、ヒトFcγR3aおよび/またはヒトFcγR3bによって媒介される、請求項11記載の抗体。
  13. 前記抗体:HSP70複合体が免疫エフェクター細胞を活性化する、請求項3～12のいずれか一項記載の抗体。
  14. 前記免疫エフェクター細胞が、CD8＋T細胞、CD4＋T細胞、NK細胞および樹状細胞を含む、請求項13記載の抗体。
  15. 高次の抗体:HSP70複合体を形成することができる抗体。
  16. 前記抗体:HSP70複合体が、少なくとも約290kDa、少なくとも約300kDa、少なくとも約580kDa、少なくとも約1,450kDaまたは少なくとも約1,750kDaの分子量を有する、請求項15記載の抗体。
  17. 前記抗体:HSP70複合体が、少なくとも約300kDaの分子量を有する、請求項16記載の抗体。
  18. 前記抗体:HSP70複合体が、約290kDa、約580kDa、約1,450kDaまたは約1,750kDaの分子量を有する、請求項15または16記載の抗体。
  19. 前記抗体:HSP70複合体中での抗体のHSP70に対する比が約1:2である、請求項15～18のいずれか一項記載の抗体。
  20. 前記抗体:HSP70複合体が、（i）約1つの抗体分子および約2つのHSP70分子;（ii）約2つの抗体分子および約4つのHSP70分子;（iii）約5つの抗体分子および約10のHSP70分子;または（iv）約6つの抗体分子および約12のHSP70分子を含む、請求項15～19のいずれか一項記載の抗体。
  21. 前記抗体:HSP70複合体が、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定された場合に、10nM以下、5nM以下、1nM以下、0.75nM以下、0.5nM以下、0.1nM、0.075nMまたは0.05nM以下のKDでヒトFcγRに結合する、請求項15～20のいずれか一項記載の抗体。
  22. 前記FcγRが、FcγR1、FcγR2a、FcγR2b、FcγR2c、FcγR3aおよび/またはFcγR3bである、請求項21記載の抗体。
  23. SEQ ID NO:11のK573～Q601に対応するHSP70のエピトープに結合する、請求項15～22のいずれか一項記載の抗体。
  24. SEQ ID NO:11の以下の残基:H594、K595およびQ601のうちの1つ、2つまたは3つに結合する、請求項15～23のいずれか一項記載の抗体。
  25. SEQ ID NO:11の以下の残基:K573、E576、W580、R596およびE598のうちの1つ、2つ、3つ、4つまたは5つにさらに結合する、請求項24のいずれか一項記載の抗体。
  26. KEWHKREQ（SEQ ID NO:250）を含むHSP70のエピトープに結合する、請求項15～25のいずれか一項記載の抗体。
  27. （i）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むVHCDR1と、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むVHCDR2と、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むVHCDR3とを含む、免疫グロブリン重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むVLCDR1と、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むVLCDR2と、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むVLCDR3とを含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域;または
    ii）SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（hVH-1）、およびSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1）
    を含む、請求項15～26のいずれか一項記載の抗体。
  28. 免疫エフェクター細胞による腫瘍由来ADP-HSP70-ペプチド抗原複合体の取り込みを増強する、請求項15～27のいずれか一項記載の抗体。
  29. 前記取り込みが、ヒトFcγR1、ヒトFcγR2a、ヒトFcγR2b、ヒトFcγR2c、ヒトFcγR3aおよび/またはヒトFcγR3bによって媒介される、請求項28記載の抗体。
  30. （i）抗体;および（ii）HSP70を含む、高次の複合体。
  31. 少なくとも約290kDa、少なくとも約300kDa、少なくとも約580kDa、少なくとも約1,450kDaまたは少なくとも約1,750kDaの分子量を有する、請求項30記載の抗体:HSP70複合体。
  32. 少なくとも約300kDaの分子量を有する、請求項31記載の抗体:HSP70複合体。
  33. 約290kDa、約580kDa、約1,450kDaまたは約1,750kDaの分子量を有する、請求項30または31記載の抗体:HSP70複合体。
  34. 前記抗体:HSP70複合体中での抗体のHSP70に対する比が約1:2である、請求項30～33のいずれか一項記載の抗体:HSP70複合体。
  35. （i）約1つの抗体分子および約2つのHSP70分子;（ii）約2つの抗体分子および約4つのHSP70分子;（iii）約5つの抗体分子および約10のHSP70分子;または（iv）約6つの抗体分子および約12のHSP70分子を含む、請求項30～34のいずれか一項記載の抗体:HSP70複合体。
  36. 表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定された場合に、10nM以下、5nM以下、1nM以下、0.75nM以下、0.5nM以下、0.1nM、0.075nMまたは0.05nM以下のKDでヒトFcγRに結合する、請求項30～35のいずれか一項記載の抗体:HSP70複合体。
  37. 前記FcγRが、FcγR1、FcγR2a、FcγR2b、FcγR2c、FcγR3aおよび/またはFcγR3bである、請求項36記載の抗体:HSP70複合体。
  38. 前記抗体が、SEQ ID NO:11のK573～Q601に対応するHSP70のエピトープに結合する、請求項30～37のいずれか一項記載の抗体:HSP70複合体。
  39. 前記抗体が、SEQ ID NO:11の以下の残基:H594、K595およびQ601のうちの1つ、2つまたは3つに結合する、請求項30～38のいずれか一項記載の抗体:HSP70複合体。
  40. SEQ ID NO:11の以下の残基:K573、E576、W580、R596およびE598のうちの1つ、2つ、3つ、4つまたは5つにさらに結合する、請求項39記載の抗体:HSP70複合体。
  41. 前記抗体が、KEWHKREQ（SEQ ID NO:250）を含むHSP70のエピトープに結合する、請求項30～40のいずれか一項記載の抗体:HSP70複合体。
  42. 前記抗体が、
    （i）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むVHCDR1と、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むVHCDR2と、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むVHCDR3とを含む、免疫グロブリン重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むVLCDR1と、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むVLCDR2と、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むVLCDR3とを含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域;
    （ii）SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（hVH-1）、およびSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1）;
    （iii）SEQ ID NO:242のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3）、およびSEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）;
    （iv）SEQ ID NO:243のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-GA）、およびSEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）;
    （v）SEQ ID NO:244のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-GAALIE）、およびSEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）;
    （vi）SEQ ID NO:245のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-YTE）、およびSEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）;
    （vii）SEQ ID NO:246のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-LS）、およびSEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）;
    （viii）SEQ ID NO:247のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-DF215）、およびSEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）;または
    （ix）SEQ ID NO:248のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（hVH-1-G1m3-DF228）、およびSEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（hVL-1-Km3）
    を含む、請求項30～41のいずれか一項記載の抗体:HSP70複合体。
  43. 請求項1～14のいずれか一項記載の免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列、および/または請求項1～14のいずれか一項記載の免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  44. （i）請求項1～14のいずれか一項記載の免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、および/または（ii）請求項1～14のいずれか一項記載の免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、発現ベクター。
  45. 請求項44記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  46. 請求項1～29のいずれか一項記載の抗体を含む、薬学的組成物。
  47. その必要のある対象においてがんを処置する方法であって、有効量の、請求項1～29のいずれか一項記載の抗体または請求項46記載の薬学的組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
  48. 前記がんが、多発性骨髄腫、乳がん、黒色腫、結腸がん、膵臓がんまたは前立腺がんである、請求項47記載の方法。
  49. 前記がんが、多発性骨髄腫、乳がん、黒色腫、膵臓がんまたは結腸がんである、請求項48記載の方法。
  50. 前記対象が、20ng/mLを超える血清HSP70レベルを有する、請求項47～49のいずれか一項記載の方法。
  51. 化学療法または放射線療法をさらに含む、請求項47～50のいずれか一項記載の方法。
  52. 前記放射線療法が、γ線照射、X線照射および放射性同位体療法から選択される、請求項51記載の方法。
  53. 免疫エフェクター細胞による腫瘍由来ADP-HSP70-ペプチド抗原複合体の取り込みを増強する方法であって、前記細胞を、有効量の請求項1～29のいずれか一項記載の抗体または請求項46記載の薬学的組成物と接触させる工程を含む、方法。
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