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JP2024530672A - 新規なコロナウイルス感染症に対するｍＲＮＡワクチンの組成物および方法 - Google Patents

新規なコロナウイルス感染症に対するｍＲＮＡワクチンの組成物および方法 Download PDF

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JP2024530672A JP2024508014A JP2024508014A JP2024530672A JP 2024530672 A JP2024530672 A JP 2024530672A JP 2024508014 A JP2024508014 A JP 2024508014A JP 2024508014 A JP2024508014 A JP 2024508014A JP 2024530672 A JP2024530672 A JP 2024530672A
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デイビッド ブラウン，
レンシャン チェン，
チュ ヒョン チョン，
ジフェン ロン，
ドン シェン，
チュン ルー，
パトリック ワイ． ルー，
シェンガオ タン，
ジアシー ヘ，
ジーヤン ヘ，
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Abstract

少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異を含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片をコードするリボ核酸（ＲＮＡ）が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、Ｓタンパク質は、デルタバリアントに由来する。加えて、関連するポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、キット、産生方法、および使用の方法が、提供される。ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年８月１１日に出願された米国仮出願第６３／２３２１０１号に基づく優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
技術分野
２０１９－ｎＣｏＶ感染症のワクチン接種、予防、および処置のための予防剤および治療剤が、提供される。
背景
コロナウイルス（ＣｏＶ）は、種の壁を繰り返し越え、一部は重要なヒト病原体として出現してきた。過去２０年の間に、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、２００２、属：ベータコロナウイルス、亜属：サルベコウイルス）および中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、２０１２、属：ベータコロナウイルス、亜属：メルベコウイルス）という動物に感染する２つのコロナウイルスが進化し、ヒトにおいて大流行を引き起こした。例えば、Drosten et al., New Engl J Med. 2003; 348:1967-1976およびZaki et al.,. New Engl J Med. 2012; 367:1814-1820を参照されたい。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、コロナウイルス疾患を引き起こすコロナウイルスの新しい株である。例えば、Zhu et al., N Engl J Med. 2020, 382:727-733を参照されたい。２０２１年７月２６日付けの世界保健機関（ＷＨＯ）によって公開されたＣＯＶＩＤ－１９ Ｗｅｅｋｌｙ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｕｐｄａｔｅ ａｎｄ Ｗｅｅｋｌｙ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｕｐｄａｔｅでは、世界中でほぼ２億件の症例および４００万件を超える死亡が確認されている。利用可能なＣＯＶＩＤ－１９の治癒はないが、入院した成人の治療管理にはステロイドが使用されており、Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）は、ＣＯＶＩＤ－１９を有する非入院個体の処置における抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、例えば、ソトロビマブ、およびカシリビマブとイムデビマブとの組合せの緊急時使用認定（ＥＵＡ）を発行している。例えば、www.covid19treatmentguidelines.nih.govで入手可能な最終アクセス２０２１年７月２７日のCOVID-19 Treatment Guidelines Panel. Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Treatment Guidelines. National Institutes of Healthを参照されたい。
Drosten et al., New Engl J Med. 2003; 348:1967-1976 Zaki et al.,. New Engl J Med. 2012; 367:1814-1820 Zhu et al., N Engl J Med. 2020, 382:727-733 COVID-19 Treatment Guidelines Panel. Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Treatment Guidelines. National Institutes of Health
したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の有効な予防および処置に対する差し迫った必要性が残っている。本開示は、この必要性を満たし、関連する利点も同様に提供する。
要旨
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイク（ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片、ならびにスパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）が、本明細書に提供される。Ｓタンパク質またはその免疫原性断片は、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタバリアントのＳタンパク質、例えば、配列番号１またはそのバリアントと比較して、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異は、配列番号１のＲ６８２に対応するアミノ酸としてのセリン（Ｓ）（Ｒ６８２Ｓ）、配列番号１のＲ６８５に対応するアミノ酸としてのグリシン（Ｇ）（Ｒ６８５Ｇ）、配列番号１のＦ８１７に対応するアミノ酸としてのプロリン（Ｐ）（Ｆ８１７Ｐ）、配列番号１のＡ８９２に対応するアミノ酸としてのＰ（Ａ８９２Ｐ）、配列番号１のＡ８９９に対応するアミノ酸としてのＰ（Ａ８９９Ｐ）、配列番号１のＡ９４２に対応するアミノ酸としてのＰ（Ａ９４２Ｐ）、配列番号１のＫ９８６に対応するアミノ酸としてのＰ（Ｋ９８６Ｐ）、または配列番号１のＶ９８７に対応するアミノ酸としてのＰ（Ｖ９８７Ｐ）のうちの１つまたは複数を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、スパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片をコードするＲＮＡは、配列番号２を含まない。一態様では、Ｓタンパク質またはその免疫原性断片をコードするＲＮＡは、配列番号５５を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然に存在するバリアント、例えば、デルタバリアントにおいて見出され得る突然変異のうちの１つまたは複数をさらに含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる、Ｓタンパク質をコードする。一部の実施形態では、これらの突然変異は、配列番号１のＮ４４０に対応するアミノ酸としてのリシン（Ｋ）（Ｎ４４０Ｋ）、配列番号１のＥ４８４に対応するアミノ酸としてのＫ（Ｅ４８４Ｋ）、配列番号１のＴ１９に対応するアミノ酸としてのアルギニン（Ｒ）（Ｔ１９Ｒ）、配列番号１のＶ７０に対応するアミノ酸としてのフェニルアラニン（Ｆ）（Ｖ７０Ｆ）、配列番号１のＴ９５に対応するアミノ酸としてのイソロイシン（Ｉ）（Ｔ９５Ｉ）、配列番号１のＧ１４２に対応するアミノ酸としてのアスパラギン酸（Ｄ）（Ｇ１４２Ｄ）、配列番号１のＥ１５６に対応する欠失（Ｅ１５６Δ）、配列番号１のＦ１５７に対応する欠失（Ｆ１５７Δ）、配列番号１のＲ１５８に対応するアミノ酸としてのＧ（Ｒ１５８Ｇ）、配列番号１のＡ２２２に対応するアミノ酸としてのバリン（Ｖ）（Ａ２２２Ｖ）、配列番号１のＷ２５８に対応するアミノ酸としてのロイシン（Ｌ）（Ｗ２５８Ｌ）、配列番号１のＫ４１７に対応するアミノ酸としてのアスパラギン（Ｎ）（Ｋ４１７Ｎ）、配列番号１のＫ４１７に対応するアミノ酸としてのＲ（Ｌ４５２Ｒ）、配列番号１のＴ４７８に対応するアミノ酸としてのＫ（Ｔ４７８Ｋ）、配列番号１のＤ６１４に対応するアミノ酸としてのＧ（Ｄ６１４Ｇ）、配列番号１のＰ６８１に対応するアミノ酸としてのＲ（Ｐ６８１Ｒ）、または配列番号１のＤ９５０に対応するアミノ酸としてのＮ（Ｄ９５０Ｎ）のうちの１つまたは複数を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、Ｓタンパク質またはその免疫原性断片は、配列番号５、６、７、１０、１１、もしくは１４のうちのいずれか１つのポリペプチド、またはそのそれぞれの同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。本開示は、これらのポリペプチドおよびその同等物をコードするＲＮＡまたはＤＮＡをさらに提供する。一部の実施形態では、ＲＮＡは、配列番号９、１３、もしくは１６のポリヌクレオチド、またはそのそれぞれの同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡは、３’非翻訳領域（３’ ＵＴＲ）、ポリアデニル化（ポリＡ）尾部、および５’非翻訳領域（５’ ＵＴＲ）のうちの１つまたは複数をさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、配列番号３２を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。配列番号９、１３、１６は、Ｓポリペプチドをコードする。配列番号３２は、５および３’ ＵＴＲならびにポリＡ尾部をさらに含む配列番号９である。
一態様では、本明細書に開示されるＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡが、提供される。コードするＤＮＡの相補体もまた、提供される。さらなる態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むベクターが、提供される。一実施形態では、ベクターは、必要に応じて、配列番号３３またはその同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる、プラスミドである。なおもさらなる態様では、本明細書に開示されるＲＮＡ、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、または本明細書に開示されるベクターのうちの１つまたは複数を含む細胞が、提供される。一態様では、担体、必要に応じて、薬学的に許容される担体と、本明細書に開示されるＲＮＡ、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、または本明細書に開示される細胞のうちの１つまたは複数とを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる、組成物が、提供される。
追加として、本明細書に開示されるＤＮＡまたはＲＮＡを産生させる方法が、提供される。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に開示される細胞を、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを発現させるのに好適な条件下において培養するステップを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。他の実施形態では、本方法は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはベクターを、ＲＮＡを発現させるのに好適な条件下において、ＲＮＡポリメラーゼ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン－５’－三リン酸（ＧＴＰ）、およびウリジン三リン酸（ＵＴＰ）または化学的に改変されたＵＴＰ（例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジン三リン酸）と接触させるステップを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。さらなる実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡを単離するステップをさらに含む。
一態様では、本明細書に開示されるタンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡ、またはＤＮＡと、担体、例えば、薬学的に許容される担体とを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる、組成物が、提供される。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ポリマーナノ粒子を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。さらなる実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ヒスチジン－リシンコポリマー（ＨＫＰ）を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、脂質、必要に応じてカチオン性脂質（例えば、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、すなわちＭＣ３）、ヘルパー脂質、コレステロール、またはＰＥＧ化脂質のうちの１つまたは複数をさらに含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、ＬＮＰは、９－ヘプタデカニル８－｛（２－ヒドロキシエチル）［６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル］アミノ｝オクタノエート（ＳＭ－１０２）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、またはこれらのそれぞれの同等物のうちの１つまたは複数を含む。さらなる実施形態では、ＬＮＰは、ヘルパー脂質、コレステロール、またはＰＥＧ化脂質のうちの１つまたは複数をさらに含む。さらなる薬学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝食塩水などが、ナノ粒子組成物に添加されてもよい。
さらなる実施形態では、薬学的に許容される担体は、希釈剤、アジュバント、結合剤、安定剤、緩衝化剤、塩、親油性溶媒、または保存剤をさらに含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、自己アセンブル型ナノ粒子である。さらなる態様では、本明細書に開示されるＲＮＡを含む自己アセンブル型ナノ粒子を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる、組成物が、提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子は、ＲＮＡを封入する。他の実施形態では、ナノ粒子は、共有結合により、または共有結合によらずにＲＮＡに連結されている。
さらなる実施形態では、組成物を産生させる方法が、提供される。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に開示されるＲＮＡを、ＨＫＰと接触させるステップであって、それによって、ＲＮＡおよびＨＫＰが、ナノ粒子へと自己アセンブルするステップを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。追加として、または代替的には、本方法は、本明細書に開示されるＲＮＡを、脂質と接触させるステップであって、それによって、ＲＮＡおよび脂質が、ナノ粒子へと自己アセンブルするステップを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。さらなる実施形態では、接触させるステップは、マイクロ流体ミキサー、例えば、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｉｇｎｉｔｅにおいて行われる。
別の態様では、（ａ）対象が症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有するのを予防すること、（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答の誘導を、それを必要とする対象において行うこと、（ｃ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２もしくはそのＳタンパク質とアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）との結合の低減を、それを必要とする対象において行うこと、（ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象を処置すること、または（ｅ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷の低減を、それを必要とする対象において行うことのうちの１つまたは複数を行う方法が、提供される。本方法は、対象に、本明細書に開示されるＲＮＡもしくはＤＮＡ、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、または本明細書に開示される組成物のうちの１つまたは複数を投与するステップをさらに含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一態様では、本明細書に開示されるＲＮＡもしくはＤＮＡ、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、または本明細書に開示される組成物と、ネブライザーとを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる、吸入システムが、提供される。
別の態様では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片を産生させる方法が、提供される。本方法は、本明細書に開示される細胞を、Ｓタンパク質またはその免疫原性断片を発現させるのに好適な条件下において培養するステップを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。さらなる実施形態では、本明細書の方法は、Ｓタンパク質またはその免疫原性断片を単離するステップをさらに含む。代替的には、または追加として、Ｓタンパク質またはその免疫原性断片は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって、産生され得る。
追加として、必要に応じて対象もしくは対象の細胞またはその両方において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とその受容体、例えば、ＡＣＥ２との結合を低減または阻害する候補薬剤をスクリーニングするための方法が、提供される。本方法は、スパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片を、本明細書に開示されるＲＮＡから発現させるステップと、発現されたＳタンパク質またはその免疫原性断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体、例えば、ＡＣＥ２との間の結合を、候補薬剤の存在ありもしくはなしで、または異なる濃度の候補薬剤を用いて、測定するステップとを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、候補薬剤の存在下において発現されたＳタンパク質またはその免疫原性断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体との間の結合が、候補薬剤なしと比較して少ないことは、候補薬剤が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とその受容体との結合を低減または阻害することを示す。一部の実施形態では、候補薬剤の濃度の増加に伴って、発現されたＳタンパク質またはその免疫原性断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体との間の結合が減少することは、候補薬剤がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とその受容体との結合を低減または阻害することを示す。
なおもさらなる態様では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片をコードするＲＮＡを選択するための方法が、提供される。本方法は、ＲＮＡを細胞に形質導入するステップと、細胞を、ＲＮＡを発現させるのに好適な条件下において培養するステップと、細胞によって分泌されたＩＦＮ－αもしくはＩＦＮ－βまたはその両方を測定するステップとを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、本方法は、野生型Ｓタンパク質またはその免疫原性断片をコードするＲＮＡと比較して、ＩＦＮ－αもしくはＩＦＮ－βまたはその両方の分泌がないか、またはＩＦＮ－αもしくはＩＦＮ－βまたはその両方の分泌が少ない場合に、ＲＮＡを選択するステップをさらに含む。
また、本明細書に記載される方法における使用のためのキットも、提供される。一部の実施形態では、キットは、使用のための説明書と、本明細書に開示されるＲＮＡ、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される組成物、または本明細書に開示される吸入システムのうちの１つまたは複数とを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
図１は、ＲＬ－００７脂質中のＲＮＡを産生させるためのＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｉｇｎｉｔｅの代表的なパラメーター設定を提供する。ＲＬ－００７は、最終濃度で６．２５ｍＭのＳＭ－１０２、１．２５ｍＭのＤＳＰＣ、４．８１５ｍＭのコレステロール、および０．１８７５ｍＭのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（すなわち、５０：１０：３８：１．５のモル比）を混合することによって、調製される。０．１３ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡを、３：１（体積／体積）の比でＲＬ－００７と混合した。
図２Ａ～２Ｃは、青色蛍光タンパク質をコードし、様々なポリＡ尾部を含む（図２ＡではポリＡ ４０、および図２ＢではポリＡ ６０）かまたはポリＡ尾部を含まない（図２Ｃ）ＲＮＡをトランスフェクトした細胞における、青色蛍光タンパク質の発現を示す、代表的な画像を提供する。 同上。 同上。
図３は、青色蛍光タンパク質をコードし異なるＵＴＲを含むＲＮＡのトランスフェクション後の様々な時点（０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、および１４４時間）において測定した、蛍光強度によって示される青色蛍光タンパク質の発現を示す棒グラフを提供する。左から１つ目のバーのセットは、β－グロブリン５’ ＵＴＲを使用して取得したデータを表す。左から２つ目のバーのセットは、本明細書に開示されるＳＹＳ ５’ ＵＴＲを使用して取得したデータを表す。左から３つ目のバーのセットは、５’ ＵＴＲを使用せずに取得したデータを表す。左から４つ目のバーのセットは、ブランク対照群から取得したデータを表す。エラーバーは、３つの複製物の標準偏差を示す。
図４は、実施例９に詳述される代表的なＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－β ＥＬＩＳＡの結果を示す。Ｓ ＷＴは、野生型スパイクタンパク質を表す。Ｓ ＲＢＤは、スパイク受容体結合タンパク質を表す。Ｓ２Ｐは、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの突然変異を含むことを表す。Ｓ６Ｐは、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐの突然変異を含むことを表す。ＵＫは、英国において最初に特定されたアルファバリアントを表す。ＳＡは、南アフリカにおいて最初に特定されたベータバリアントを表す。ＧＳは、配列最適化されたＲＮＡ（配列番号５４）を表す。Ａ５４９は、陰性対照であるＡ５４９肺癌上皮細胞を示す。
図５Ａ～５Ｂは、実施例９に示されるＩＦＮ－α ＥＬＩＳＡの定量的結果を提供する。図５Ａは、標準曲線であり、図５Ｂは、対応する計算を提供する。 同上。
図６Ａ～６Ｂは、実施例９に示されるＩＦＮ－β ＥＬＩＳＡ結果の定量的結果を提供する。図６Ａは、標準曲線であり、図６Ｂは、対応する計算を提供する。 同上。
図７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ヒト／ＩＴＡ／ＩＮＭＩ１／２０２０ウイルスでのチャレンジ後の免疫付与マウスおよび非免疫付与マウスにおける臨床的重症度スコア曲線を示す。ウイルスチャレンジの前に、群１のマウスにはＰＢＳを投与し、群２のマウスには、ｍＲＮＡ ＲＬ－００７ １μｇ／動物で免疫付与を行い、群３のマウスには、ｍＲＮＡ ＲＬ００７ ５μｇ／動物で免疫付与を行い、群４のマウスには、ｍＲＮＡ ＲＬ００７ １０μｇ／動物で免疫付与を行った。
図８Ａ～８Ｄは、処置したマウスの体重を示す。図８Ａは、非免疫付与マウスおよび免疫付与マウスの群平均体重を示す。図８Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ヒト／ＩＴＡ／ＩＮＭＩ１／２０２０単離物（ＮＣＢＩ受託番号ＭＴ０６６１５６）でのウイルスチャレンジ後の非免疫付与マウスおよび免疫付与マウスの群平均体重を示す。ＮＬＳにおける免疫付与後およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ヒト／ＩＴＡ／ＩＮＭＩ１／２０２０単離物でのウイルスチャレンジ後の群１～４のマウスの体重。それぞれの個々のマウスの体重を、ＮＬＳへの送達後に測定した体重に対するパーセンテージとして、およびＧＭＵにおけるウイルスチャレンジ前に測定した体重に対するパーセンテージとして、計算した。マウスのそれぞれの群について、平均および平均の標準誤差（ＳＥＭ）を提示する。群１－「Ｃ」は、対照の非免疫付与マウスを表す。図８Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１６１７．２デルタバリアントでのウイルスチャレンジ前の非免疫付与マウスおよび免疫付与マウスの群平均体重を示す。図８Ｄは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１６１７．２デルタバリアントでのウイルスチャレンジ後の非免疫付与マウスおよび免疫付与マウスの群平均体重を示す。ｍ－Ｃｏは、低用量（０．５０μｇ／マウス）および高用量（５μｇ／マウス）で送達された対照ワクチンである。非対照マウスには、ＲＬ－００７担体を使用したＲＶ－１７３０（図８Ｃおよび図８Ｄにおいて「ＲＮＡＩｍｍｕｎｅ」とラベル付けされている）でワクチン接種を行った。 同上。 同上。 同上。
図９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ヒト／ＩＴＡ／ＩＮＭＩ１／２０２０（ＮＣＢＩ受託番号ＭＴ０６６１５６）でのウイルスチャレンジ後の群１～４のマウスにおける体温曲線を示す。マウスのそれぞれの群について、平均および平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。ウイルスチャレンジの前に、群１のマウスにはＰＢＳを投与し、群２のマウスには、ｍＲＮＡ ＲＬ－００７ １μｇ／動物で免疫付与を行い、群３のマウスには、ｍＲＮＡ ＲＬ００７ ５μｇ／動物で免疫付与を行い、群４のマウスには、ｍＲＮＡ ＲＬ００７ １０μｇ／動物で免疫付与を行った。実験は、実施例１０に記載されている。
図１０は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でチャレンジしたマウスの生存率を示すカプランマイヤー曲線である。ウイルスチャレンジの前に、群１のマウスにはＰＢＳを投与し、群２のマウスには、ｍＲＮＡ ＲＬ－００７ １μｇ／動物で免疫付与を行い、群３のマウスには、ｍＲＮＡ ＲＬ００７ ５μｇ／動物で免疫付与を行い、群４のマウスには、ｍＲＮＡ ＲＬ００７ １０μｇ／動物で免疫付与を行った。実験は、実施例１０に記載されている。
図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、および図１１Ｄは、プラーク低減中和滴定（ＰＲＮＴ）を使用して評価したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ヒト／ＩＴＡ／ＩＮＭＩ１／２０２０に対するマウス血清滴定データを示す。中和力価は、陰性対照血清と比べて、プラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）に５０％を上回る低減（ＰＲＮＴ５０）または９０％を上回る低減（ＰＲＮＴ９０）をもたらしたもっとも低い希釈の逆数として計算した。図１１Ａは、１３日目に採取したプライム免疫付与後のマウス血清のＰＲＮＴ５０を示し、図１１Ｂは、１３日目に採取したプライム免疫付与後のマウス血清のＰＲＮＴ９０を示し、図１１Ｃは、２７日目に採取したブースト免疫付与後のマウス血清のＰＲＮＴ５０を示し、図１１Ｄは、２７日目に採取したブースト免疫付与後のマウス血清のＰＲＮＴ９０を示す。記号および水平方向の線は、それぞれ、それぞれの試料の個々の力価およびそれぞれの群の平均力価を表す。血清力価は、Ｌｏｇ２希釈の逆数として表した。実験は、実施例１０に記載されている。 同上。 同上。 同上。
図１２は、安楽死時点で摘出した肺組織の組織病理学スコアを示す。組織病理学スコアは、それぞれの群について罹患した肺のパーセンテージ（０＝なし、１＝０～２５％、２＝２６～５０％、３＝５１～７５％、および４＝７６～１００％）ならびに（特異的肺病変部：０＝なし、１＝最小限、２＝軽度、３＝中等度、および４＝重度）に基づいてスコア付けした、総肺スコア、間質性肺炎（ｐｎ）、および血管周囲カフのグラフ表示である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ヒト／ＩＴＡ／ＩＮＭＩ１／２０２０チャレンジ後３日目に安楽死に指定されたマウスの肺組織の一部分を、肺組織におけるウイルス力価に関して分析した。肺組織におけるウイルス力価を、ウイルスチャレンジの３日後にそれぞれの群から５匹のマウスにおいて判定した。群１のマウスには、ＰＢＳ対照を投与した（図７において「Ｃ」として特定される）。群２、３、および４のマウスには、それぞれ、１μｇ／動物、５μｇ／動物、１０μｇ／動物の用量でＲＬ００７ ｍＲＮＡワクチンで免疫付与を行った。ウイルス力価は、ｐ．ｆ．ｕ．／ｍＬとして計算した。実験は、実施例１１に記載されている。
図１３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でのチャレンジの１３日後に摘出した図７に開示されるように処置したマウスの代表的な肺組織の組織病理学画像を示す。それぞれの群について代表的なマウスから得たＨ＆Ｅで染色した組織のスライドを、２０倍の拡大率でスキャンした。群１のマウスには、ＰＢＳ対照を投与した。群２、３、および４のマウスには、それぞれ、１μｇ／動物、５μｇ／動物、１０μｇ／動物の用量でｍＲＮＡワクチンＲＬ００７で免疫付与を行った。左上：群１、マウスＲ２４－１０１－０１０、右上：群２、マウスＲ２４－１０１－０１３、左下：群３、マウスＲ２４－１０１－０２３、右下：群４、マウスＲ２４－１０１－０３４。実験は、実施例１１に記載されている。
図１４は、ブーストの９週間後の図７に開示されるように処置したマウスのＴｈ－１およびＴｈ－２サイトカイン測定を示す。脾細胞を、１群当たり５匹のマウスから単離し、ペプチドなしまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に由来するオーバーラップするペプチドのプールで再刺激した。７２時間後に、培養上清を、遠心分離によって採取し、分泌されたＴｈ１－サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α）およびＴｈ２－サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３）を、ビーズに基づく１１プレックスＴＨ１／ＴＨ２マウスＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘマルチプレックスイムノアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。蛍光を、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００／２００システムで測定し、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ Ａｎａｌｙｓｔ １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析した。定量下限に満たないものは、ゼロに設定した。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（対応のないスチューデントｔ検定、ＰＢＳ対照と比較）。実験は、実施例１４に記載されている。
図１５Ａ、図１５Ｂ、および図１５Ｃは、脾細胞でのＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析を示す。ブーストの９週間後に、脾細胞を、１群当たり５匹のマウスから単離し、次いで、脾細胞（９６ウェル当たり２×１０５個の細胞）を、マウスＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍａｂｔｅｃｈ）に播種し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタスパイクタンパク質サブユニットＳ１およびＳ２に由来するオーバーラップするペプチドのプールを用いてｅｘ ｖｉｖｏで１６時間再刺激した。図１５Ａは、Ｃｙｔａｔｉｏｎ７を使用することによって取得し定量した画像を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１。図１５Ｂは、デルタスパイクタンパク質サブユニットＳ１を用いてｅｘ ｖｉｖｏで再刺激した２×１０５個の細胞当たりのＩＦＮ－γスポットを定量するグラフである。図１５Ｃは、デルタスパイクタンパク質サブユニットＳ２を用いてｅｘ ｖｉｖｏで再刺激した２×１０５個の細胞当たりのＩＦＮ－γスポットを定量するグラフである。実験は、実施例１５に記載されている。 同上。
図１６は、フローサイトメトリーを使用したメモリーＴ細胞のサイトカイン分析を示す。ブーストの９週間後に、脾細胞を、１群当たり５匹のマウスから単離し、タンパク質輸送阻害剤カクテルの存在下において、ペプチドなしまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に由来するオーバーラップするペプチドのプールで再刺激した。マウスを、実施例１６に示されるように処置した。１６時間後に、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を行って、ＣＤ４＋ およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を定量した。ペプチドの非存在下におけるサイトカイン発現は、バックグラウンドと考え、それぞれの個々のマウスについてＳ１およびＳ２ペプチドプールから測定した応答から差し引いた。実験は、実施例１６に記載されている。
図１７は、異なるバリアントスパイクタンパク質に対するＲＶ－１７３０で免疫付与した血清のエンドポイントＩｇＧ力価を示す。ＲＶ－１７３０は、配列番号５２を含む、実施例３に従って調製された代表的なＲＬ－００７ ｍＲＮＡワクチン製剤である。配列番号５２は、配列番号５５に示されるオープンリーディングフレームを含む。ＲＶ－１７３０は、実施例３に従って調製されたＲＬ－００７担体を使用する。実験は、実施例１２に記載されている。
図１８Ａおよび図１８Ｂは、実施例１３に示されるＲＶ－１７３０免疫付与後の１４日目（図１８Ａ）および３５日目（図１８Ｂ）におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス粒子（ＰＰ）に対する中和抗体力価を示す。ブラジル：ガンマバリアント、６１４Ｄ：野生型、ＵＫ：アルファバリアント、デルタ：デルタバリアント、６１４Ｇ：Ｄ６１４Ｇバリアント、ＳＡ：ベータバリアントのシュードウイルス粒子のデータを示す。実験は、実施例１３に記載されている。 同上。
図１９Ａ～１９Ｄは、５つの群のマウス（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５）にわたる様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＰＰ感染に対する免疫付与マウス血清の作用を示す。ｘ軸は、化合物濃度を示し、Ｙ軸は、相対的ＰＰ感染度を示す。６１４Ｄ－ＰＰ（図１９Ａ）、デルタ－ＰＰ（図１９Ｂ）、オミクロン－ＰＰ（図１９Ｃ）、ＢＡ．２－ＰＰ（図１９Ｄ）のデータを示す。実験は、実施例１３に記載されている。 同上。
図２０は、５つの群のマウス（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５）にわたるシュードウイルス中和アッセイにおける異種ワクチン接種血清のＩＣ５０（血清％）のグラフである。野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、デルタＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、オミクロンＢＡ．１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、およびオミクロンＢＡ．２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス粒子に対する中和抗体力価を、第１および第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチン免疫付与用量後に測定した。マウスは、ＲＶ－１７３０、または当該技術分野において公知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン、例えば、Ｐｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈから入手可能なＢＮＴ１６２ｂ２もしくはＭｏｄｅｒｎａから入手可能なｍＲＮＡ－１２７３の第１および第２のワクチン免疫付与用量の組合せを受容した。実験は、実施例１３に記載されている。
詳細な説明
定義
理解されるように、本明細書において使用される節または小節の見出しは、構成上の目的のためのものにすぎず、記載される主題を制限および／または分離するものと見なされるものではない。
本開示は、記載される特定の実施形態に制限されるものではなく、したがって、当然ながら、変動し得ることを理解されたい。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のものにすぎず、制限することを意図するものではないこともまた、理解されたい。
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、デバイス、および材料が、ここに記載されている。本明細書に引用されるすべての技術および特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。先行する開示により本開示がそのような開示に先立つ権利を有さないことを認めると解釈されるものは、本明細書には存在しない。
本開示の実施には、別途示されない限り、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来的な技法が用いられることになり、これらは、当業者の技能の範囲内である。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition、一連のAusubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology、一連のMethods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)、MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)、MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach、Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual、Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition、Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis、米国特許第４，６８３，１９５号、Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization、Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization、Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation、Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986))、Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning、Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)、Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells、Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)、Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002))、Sohail (ed.) (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press)、およびPlotkin et al., Plotkin;s Human Vaccines, 7th edition (Elsevier)を参照されたい。
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈により別途明確に指示されない限り、複数形の参照物を含む。例えば、「１つの細胞（a cell）」という用語は、複数の細胞を含み、その混合物を含む。
本明細書において使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、化合物、組成物、および方法が、記載される要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することが意図される。「から本質的になる（consisting essentially of）」は、化合物、組成物、および方法を定義して使用される場合、組合せにいくらかの本質的な重要性をもつ他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書において定義される要素から本質的になる組成物は、例えば、単離および精製方法、ならびに薬学的に許容される担体、保存剤などに起因する微量の混入物を除外しない。「からなる（consisting of）」は、他の成分の微量よりも多い要素を除外することを意味するものとする。これらの移行部用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本技術の範囲内である。
すべての数値表記、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、範囲を含め、１、５、または１０％の増分で（＋）または（－）に変動する近似値である。必ずしも明示されているわけではないが、すべての数値表記は、「約」という用語が先行することを理解されたい。また、必ずしも明示されているわけではないが、本明細書に記載される試薬が単なる例示であること、およびそのようなものの同等物が当該技術分野において公知であることも、理解されたい。
本明細書において使用される「約」という用語は、測定可能な値、例えば、量または濃度などに言及している場合、指定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書において使用される場合、本明細書に使用される比較用語、例えば、高い、低い、増加、減少、低減、またはこれらの任意の文法上の変化形は、基準からのある特定の変動を指し得る。一部の実施形態では、そのような変動は、基準よりも、約１０％、もしくは約２０％、もしくは約３０％、もしくは約４０％、もしくは約５０％、もしくは約６０％、もしくは約７０％、もしくは約８０％、もしくは約９０％、もしくは約１倍、もしくは約２倍、もしくは約３倍、もしくは約４倍、もしくは約５倍、もしくは約６倍、もしくは約７倍、もしくは約８倍、もしくは約９倍、もしくは約１０倍、もしくは約２０倍、もしくは約３０倍、もしくは約４０倍、もしくは約５０倍、もしくは約６０倍、もしくは約７０倍、もしくは約８０倍、もしくは約９０倍、もしくは約１００倍、またはそれよりも高いことを指し得る。一部の実施形態では、そのような変動は、基準の約１％、または約２％、または約３％、または約４％、または約５％、または約６％、または約７％、または約８％、または約０％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％を指し得る。
当業者には理解されるように、ありとあらゆる目的のために、本明細書に開示されるすべての範囲はまた、ありとあらゆる可能性のある部分範囲およびその部分範囲の組合せを包含する。さらに、当業者には理解されるように、範囲は、それぞれの個々のメンバーを含む。
「必要に応じた」または「必要に応じて」とは、続いて記載される状況が、発生し得る場合も発生し得ない場合もあること、ならびにその説明には、状況が発生する事例および発生しない事例が含まれることを意味する。
本明細書において使用される場合、「および／または」とは、関連する列挙された項目のうちの１つまたは複数のありとあらゆる可能性のある組合せ、ならびに代替形（「または」）で解釈される場合には組合せの欠如を指し、それを包含する。
「実質的に」または「本質的に」とは、ほぼ全体的にまたは完全にを意味し、例えば、なんらかの所与の数の９５％またはそれよりも上を意味する。一部の実施形態では、「実質的に」または「本質的に」とは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％を意味する。
用語「許容される」、「有効な」、もしくは「十分な」とは、本明細書に開示される任意の構成要素、範囲、用量形態などの選択について説明して使用される場合、前記構成要素、範囲、用量形態などが、開示される目的に好適であることを意図する。
一部の実施形態では、構成要素の名称における「第１」、「第２」、「第３」、「第４」、または同様の用語は、それらの名称においてある特定の同一性を共有している１つを上回る構成要素を区別し、特定するために使用される。例えば、「第１のＲＮＡ」および「第２のＲＮＡ」は、２つのＲＮＡを区別するために使用される。
２０１９新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）またはヒトコロナウイルス２０１９（ＨＣｏＶ－１９もしくはｈＣｏＶ－１９）とも称される重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＣＯＶＩＤ－１９（コロナウイルス疾患２０１９）パンデミックの原因である呼吸器疾病であるＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルスである。
それぞれのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンは、直径が５０～２００ナノメートルであり、直鎖状ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡゲノム（約３０，０００塩基長）、ならびにＳ（スパイク）、Ｅ（エンベロープ）、Ｍ（膜）、およびＮ（ヌクレオキャプシド）タンパク質として知られる４つの構造タンパク質を含む。Ｎタンパク質は、ＲＮＡゲノムを保持し、Ｓ、Ｅ、およびＭタンパク質は、一緒になって、ウイルスエンベロープを作成する。コロナウイルスＳタンパク質は、２つの機能的部分（Ｓ１およびＳ２）に分割される糖タンパク質である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２において、スパイクタンパク質は、ウイルスが宿主細胞の膜に結合してそれと融合することを可能にすることを担うタンパク質であり、具体的には、そのＳ１サブユニットが結合を触媒し、Ｓ２サブユニットが融合を触媒する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、ヒト細胞上の受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に対して十分な親和性を有し、それらを細胞進入の機序として使用することが、研究により示されている。膜貫通型プロテアーゼセリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）による初期スパイクタンパク質プライミングもまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の進入に必要なものとして示されている。宿主タンパク質ニューロピリン１（ＮＲＰ１）は、ＡＣＥ２を使用したウイルスの宿主細胞進入を補助し得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンが標的細胞に結合した後、細胞のＴＭＰＲＳＳ２は、ウイルスのスパイクタンパク質を切断して開放し、Ｓ２サブユニット内の融合ペプチドおよび宿主受容体ＡＣＥ２を露出させる。融合の後に、ビリオンの周囲にエンドソームが形成され、それによって宿主細胞の残部から分離される。ビリオンは、エンドソームのｐＨが低下するか、または宿主システインプロテアーゼであるカテプシンがそれを切断すると、脱出（escape）する。ビリオンは、次いで、ＲＮＡを細胞内に放出し、細胞に強制的にウイルスのコピーを産生および拡散させ、これが、さらなる細胞に感染する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子バリアントは、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックにわたって出現し、世界中で流行している。米国で流行しているＢ．１．１．７（アルファ）、Ｂ．１．３５１（ベータ）、Ｂ．１．６１７．２（デルタ）、およびＰ．１（ガンマ）バリアントは、問題のバリアントとして分類されている。他のバリアント、例えば、Ｂ．１．５２６（イオタ）、Ｂ．１．４２７（イプシロン）、Ｂ．１．４２９（イプシロン）、Ｂ．１．６１７（カッパ、デルタ）、Ｂ．１．５２５（イータ）、およびＰ．２（ゼータ）も存在する。したがって、本明細書において使用される「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」という用語は、バリアントのうちのいずれか１つもしくは複数またはすべてを指し得る。一部の実施形態では、本明細書において使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、インドで最初に特定されたデルタバリアントを指す。さらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタバリアントは、Ｓタンパク質をコードする遺伝子に突然変異を含み、Ｓタンパク質における以下のアミノ酸突然変異のうちの１つまたは複数を引き起こす：Ｔ１９Ｒ、Ｖ７０Ｆ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ａ２２２Ｖ、Ｗ２５８Ｌ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、またはＤ９５０Ｎ。一部の実施形態では、デルタバリアントは、Ｋ４１７Ｎのアミノ酸突然変異を含むデルタプラスバリアントである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有する対象は、症状がない無症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症から、重篤な疾病を有する症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症まで、広範な臨床症状を経験し得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症は、以下の疾病カテゴリー重症度に分類され得るが、それぞれのカテゴリーの基準は、臨床ガイドラインおよび臨床試験にわたって重複または変動してもよく、患者の臨床ステータスは、経時的に変化し得る。無症候性または前症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症は、対象がウイルス学的試験を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験で陽性であるが、症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症と一致する症状（例えば、発熱、咳嗽、咽喉痛、倦怠感、頭痛、筋肉痛、吐き気、嘔吐、下痢、味覚および嗅覚の喪失）を示さない場合に、発生する。症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症は、対象が、Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって定義されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症と関連する軽度、中等度、重度、または重篤な疾病を示す場合に、発生する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症と関連する軽度の疾病を有する対象は、発熱、咳嗽、咽喉痛、倦怠感、頭痛、筋肉痛、吐き気、嘔吐、下痢、味覚および嗅覚の喪失を含むがこれらに限定されない症状を示すが、息切れも、呼吸困難も、胸部イメージング異常も有さない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症と関連する中等度の疾病を有する対象は、臨床評価またはイメージング中に下気道疾患の根拠を示し、海抜レベルで室内気において９４％以上の酸素飽和度（ＳｐＯ２）を有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症と関連する重度の疾病を有する対象は、海抜レベルで室内気において９４％未満のＳｐＯ２、３００ｍｍ Ｈｇ未満の吸入酸素の画分に対する動脈酸素分圧の比（ＰａＯ２／ＦｉＯ２）、３０回／分を上回る呼吸速度、または５０％を上回る肺浸潤を有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症と関連する重篤な疾病を有する対象は、呼吸器不全、敗血症性ショック、および／または多臓器不全を有する。
コロナウイルス感染症の症状としては、軽度の症状、例えば、疲労、刺痛、手足の刺痛もしくは痺れ、めまい、意識障害、脳に霧がかかったような状態（brain fog）、身体痛、悪寒、食欲不振、吐き気、嘔吐、腹部疼痛もしくは不快感、嗅覚喪失、味覚障害、筋力低下、羞明、腺腫脹、頭痛、咳嗽、乾性咳嗽、息切れ、咽喉痛、下肢筋力低下／痺れ、下痢、血中Ｏ２低下、くしゃみ、鼻汁または後鼻漏；重度の症状、例えば、人工呼吸器の使用、高熱、重度の咳嗽、せん妄、発作、卒中、全身性炎症（systematic inflammation）、サイトカインストーム、ならびに他の症状、例えば、発熱、扁桃腺腫脹、肺炎、気管支炎、および呼吸困難が挙げられるが、これらに限定されない。
コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のウイルス感染症は、当該技術分野において公知の市販入手可能な試験によって検出することができ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはイムノアッセイによるものが使用され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、当該技術分野において公知の試験を使用してコロナウイルスを検出するステップをさらに含む。一実施形態では、活動性ウイルス感染症は、ウイルスが複製を行い新しいウイルスを産生している、進行中の感染症を指す。そのような活動性ウイルス感染症は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して検出することができる。ＰＣＲにおける使用に好適なプライマーおよびプローブの非限定的な例としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のための２０１９－ｎＣｏＶ ＣＤＣプローブおよびプライマーキット（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＫＩＴ－ｎＣｏＶ－ＰＰ１－１０００）、２０１９－ｎＣｏＶキット、５００ ｒｘｎ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （ＩＤＴ）、カタログ番号１０００６６０６）、および２０１９－ｎＣｏＶキット、１０００ ｒｘｎ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （ＩＤＴ）、カタログ番号１０００６７７０）が挙げられる。また、www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.htmlおよびwww.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/List-of-Acceptable-Commercial-Primers-Probes.pdfも参照されたい。そのような試験を行うための好適なプロトコールは、www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/virus-requests.html、www.fda.gov/media/134922/download、www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/processing-sputum-specimens.pdf、www.fda.gov/media/134922/download、www.fda.gov/media/134919/download、www.fda.gov/media/134922/download（最終アクセス２０２１年８月１０日）において見出すことができる。一部の実施形態では、Lisboa Bastos M et al. (Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 2020 Jul 1;370:m2516. doi: 10.1136/bmj.m2516)によって考察されているものなど、抗体を検出することに基づくＣＯＶＩＤ－１９の診断アッセイが、本明細書に開示されるものと組み合わされる。
他の市販入手可能な試験としては、以下の表に列挙されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
SARS-CoV-2およびCOVID-19の市販入手可能な試験
「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は、２つまたはそれよりも多くのサブユニットのアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはペプチド模倣体から構成される化合物を指して、互換可能に、かつそのもっとも広い意味で使用される。サブユニット（これは、残基とも称される）は、ペプチド結合によって連結され得る。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結されてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならないが、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に関しては制限がない。本明細書において使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然および／または非天然もしくは合成のいずれかのアミノ酸を指し、グリシン、ならびにＤおよびＬの両方の光学異性体、アミノ酸アナログ、ならびにペプチド模倣体が含まれる。
本明細書において使用される場合、「スパイクタンパク質」、「スパイク糖タンパク質」、または「Ｓタンパク質」という用語は、エンベロープ型ウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面の脂質二重層から突出している糖タンパク質を指して互換可能に使用される。一部の実施形態では、Ｓタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を指す。さらなる実施形態では、本明細書において使用されるＳタンパク質またはその同等物はまた、Ｓタンパク質バリアント（例えば、天然に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント、例えば、デルタバリアントのＳタンパク質）、Ｓタンパク質突然変異体（例えば、本明細書に開示される突然変異型Ｓタンパク質）、Ｓタンパク質断片（例えば、免疫原性断片）、またはこれらの任意の組合せ（例えば、追加の突然変異を有するように操作された天然に存在するバリアント、もしくはその断片）を指す。
一部の実施形態では、本明細書において使用されるＳタンパク質は、Ｓ１ポリペプチドもしくはＳ２ポリペプチドまたはその両方を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、本明細書において使用されるＳタンパク質は、Ｓ１およびＳ２の両方を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる、前駆体タンパク質である。そのような前駆体は、カテプシンＬ（ＣＴＳＬ）、膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＭＰＲＳＳ２）、またはフューリンによってＳ１およびＳ２にプロセシングされて、成熟Ｓ１およびＳ２タンパク質を生じることができる。一部の実施形態では、本明細書において使用されるＳタンパク質は、成熟Ｓ１タンパク質および成熟Ｓ２タンパク質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる、タンパク質複合体を指す。他の実施形態では、本明細書において使用されるＳタンパク質は、Ｓ１タンパク質を指す。なおも他の実施形態では、本明細書において使用されるＳタンパク質は、Ｓ２タンパク質を指す。一部の実施形態では、前駆体タンパク質は、配列番号１に記載されるポリペプチドまたはその同等物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、Ｓ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸（ａａ）１３～ａａ６８５に記載されるポリペプチドまたはその同等物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、Ｓ２タンパク質は、配列番号１のアミノ酸（ａａ）６８６～ａａ１２７３に記載されるポリペプチドまたはその同等物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、Ｓ２タンパク質は、配列番号１のアミノ酸（ａａ）８１６～ａａ１２７３に記載されるポリペプチドまたはその同等物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。Ｓタンパク質またはその根底にある遺伝子のさらなる非限定的な例示的な配列は、遺伝子識別子：４３７４０５６８（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/43740568から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０４５５１２．２（www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512.2/から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ０ＤＴＣ２（www.uniprot.org/uniprot/P0DTC2から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）において見出すことができ、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、Ｓタンパク質の断片（例えば、免疫原性断片）は、Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、特定の内因性受容体配列に結合して標的細胞への進入を獲得する、ウイルス由来の短い免疫原性断片を指す。一部の実施形態では、ＲＢＤは、膜融合および細胞質への送達を促進するために内因性受容体と相互作用するのに必要とされる「スパイク」糖タンパク質の一部（Ｓドメイン）を指す。一部の実施形態では、本明細書において使用されるＲＢＤは、配列番号１のａａ３１９～ａａ５４１に記載されるポリペプチドまたはその同等物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
本明細書において使用される場合、「アンジオテンシン変換酵素２」または「ＡＣＥ２」という用語は、必要に応じて間質、腎臓、精巣、胆嚢、および心臓に位置する細胞の膜に結合する酵素を指す。ＡＣＥ２は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むいくつかのコロナウイルスの細胞への進入点として機能する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質自体は、ＡＣＥ２の下方調節によって上皮を損傷することが知られている。一部の実施形態では、「ＡＣＥ２」という用語は、ヒトＡＣＥ２を指す。このタンパク質または根底にある遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ識別子：ＧＣ０ＸＭ０１５４９４（www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ACE2から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、ＨＧＮＣ：１３５５７（www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#!/hgnc_id/13557から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ： ５９２７２（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/59272から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１３０２３４（useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?g=ENSG00000130234;r=X:15494566-15607236から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、ＯＭＩＭ（登録商標）：３００３３５（omim.org/entry/300335から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ： Ｑ９ＢＹＦ１（www.uniprot.org/uniprot/Q9BYF1から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）において見出すことができ、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用される場合、「膜貫通型セリンプロテアーゼ２」または「ＴＭＰＲＳＳ２」という用語は、ＩＩ型膜貫通ドメイン、受容体クラスＡドメイン、スカベンジャー受容体システインリッチドメイン、およびプロテアーゼドメインを含む、タンパク質を指す。このタンパク質は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をタンパク質分解により切断しそれを活性化することによって、ウイルスの宿主細胞への進入を促進する。細胞への進入にこのタンパク質を使用することが見出されているウイルスとしては、インフルエンザウイルス、ならびにヒトコロナウイルスＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。一部の実施形態では、「ＴＭＰＲＳＳ２」という用語は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２を指す。このタンパク質または根底にある遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ識別子ＧＣ２１Ｍ０４１４６４（www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TMPRSS2から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、ＨＧＮＣ：１１８７６（www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#!/hgnc_id/11876から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ： ７１１３（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7113から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８４０１２（useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?g=ENSG00000184012;r=21:41464300-41531116から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、ＯＭＩＭ（登録商標）：６０２０６０（omim.org/entry/602060から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ： Ｏ１５３９３（www.uniprot.org/uniprot/O15393から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）において見出すことができ、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用される場合、「カテプシンＬ」または「ＣＴＳＬ」という用語は、ペプチダーゼＣ１ファミリーのメンバーであり、いずれも単一のタンパク質前駆体から産生される重鎖および軽鎖がジスルフィド連結されたものから構成される二量体である、タンパク質を指す。追加として、このタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１サブユニットを切断し、これが、ウイルスの細胞への進入に必要である。一部の実施形態では、「ＣＴＳＬ」という用語は、ヒトＣＴＳＬを指す。このタンパク質または根底にある遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ識別子：ＧＣ０９Ｐ０８７７２５（www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=CTSLから取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、ＨＧＮＣ：２５３７（www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#!/hgnc_id/2537から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ： １５１４（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1514から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１３５０４７（useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?g=ENSG00000135047;r=9:87724051-87731469から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、ＯＭＩＭ（登録商標）：１１６８８０（omim.org/entry/116880から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ： Ｐ０７７１１（www.uniprot.org/uniprot/P07711から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）において見出すことができ、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用される場合、「フューリン」という用語は、ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒ（配列番号５０、（ＲＫＲまたはＲＲＲ））コンセンサスモチーフにおける切断が可能なプロテアーゼ酵素を指す。それはまた、スパイクタンパク質を、一塩基性Ｓ１／Ｓ２切断部位ＲＲＡＲ（配列番号４８）においてタンパク質分解により切断することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を促進する。この切断は、スパイクタンパク質に媒介される細胞－細胞融合およびヒト肺細胞への進入に必須である。一部の実施形態では、フューリンという用語は、哺乳動物フューリン、例えば、ウシフューリンを指し、例えば、www.uniprot.org/uniprot/Q28193（最終アクセス２０２１年８月１０日）から取得されるＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ２８１９３を参照されたい。一部の実施形態では、「フューリン」という用語は、ヒトフューリンを指す。このタンパク質または根底にある遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ識別子：ＧＣ１５Ｐ０９０８６８（www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=FURINから取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、ＨＧＮＣ：８５６８（www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#!/hgnc_id/8568から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ： ５０４５（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5045から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１４０５６４（useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?g=ENSG00000140564;r=15:90868588-90883564から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、ＯＭＩＭ（登録商標）：１３６９５０（omim.org/entry/136950から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ： Ｐ０９９５８（www.uniprot.org/uniprot/P09958から取得、最終アクセス２０２１年８月１日）において見出すことができ、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、タンパク質の断片は、免疫原性断片であり得る。本明細書において使用される場合、「免疫原性断片」という用語は、それが由来するタンパク質の免疫原性を少なくとも部分的に保持するようなポリペプチド断片を指す。一部の実施形態では、免疫原性断片は、少なくとも約３アミノ酸（ａａ）長、もしくは少なくとも約４ａａ長、もしくは少なくとも約５ａａ長、もしくは少なくとも約６ａａ長、もしくは少なくとも約７ａａ長、もしくは少なくとも約８ａａ長、もしくは少なくとも約９ａａ長、もしくは少なくとも約１０ａａ長、もしくは少なくとも約１５ａａ長、もしくは少なくとも約２０ａａ長、もしくは少なくとも約２５ａａ長、もしくは少なくとも約３０ａａ長、もしくは少なくとも約３５ａａ長、もしくは少なくとも約４０ａａ長、もしくは少なくとも約５０ａａ長、もしくは少なくとも約６０ａａ長、もしくは少なくとも約７０ａａ長、もしくは少なくとも約８０ａａ長、もしくは少なくとも約９０ａａ長、もしくは少なくとも約１００ａａ長、もしくは少なくとも約１２０ａａ長、もしくは少なくとも約１５０ａａ長、もしくは少なくとも約２００であるか、またはそれよりも長い。一部の実施形態では、Ｓタンパク質の免疫原性断片は、Ｓタンパク質のＲＢＤを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
本明細書において使用される場合、参照配列における特定された位置「に対応する」目的の配列におけるアミノ酸（ａａ）またはヌクレオチド（ｎｔ）残基の位置は、残基位置が、目的の配列と参照配列との間の配列アライメントにおいて特定される位置にアライメントすることを指す。そのような配列アライメントを行うための様々なプログラム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａおよびＢＬＡＳＴが、利用可能である。一態様では、同等のポリヌクレオチド、タンパク質、および対応する配列は、ＢＬＡＳＴ（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiにおいてアクセス可能、最終アクセス２０２１年８月１日）を使用して決定することができる。
本明細書において使用される場合、アミノ酸突然変異は、本明細書において、整数によって分かれた２つの文字、例えば、Ｔ１９Ｒとして言及される。最初の文字は、突然変異を受けるもともとのアミノ酸残基の一文字コードを提供し、一方で最後の文字は、突然変異を提供し、例えば、Δにより欠失が示されるか、または突然変異されたアミノ酸残基の一文字コードが提供される。一部の実施形態では、整数は、必要に応じて、Ｎ末端からＣ末端へと数えた、突然変異がないアミノ酸配列における突然変異されるアミノ酸残基の番号付けである。一部の実施形態では、整数は、必要に応じて、Ｎ末端からＣ末端へと数えた、突然変異されたアミノ酸配列における突然変異されたアミノ酸残基の番号付けである。一部の実施形態では、整数は、突然変異される残基もしくは突然変異された残基またはその両方に対応する（例えば、アライメントする）配列番号１におけるアミノ酸残基の番号付けである。
明示的な記述なしに、および別途意図されない限り、本開示が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドに関する場合、そのようなものの同等物または生物学的同等物は、本開示の範囲内であることが意図されると推定される。本明細書において使用される場合、「その生物学的同等物」という用語は、参照タンパク質、ポリペプチド、または核酸に言及する場合、「その同等物」と同義であることが意図され、相同性は最小限であるが、依然として所望される構造または機能性を維持するものを意図する。本明細書において別途記述されない限り、本明細書において言及される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質はまた、その同等物を含むことが企図される。例えば、同等物は、少なくとも約７０％の相同性もしくは同一性、または少なくとも８０％の相同性もしくは同一性、または少なくとも約８５％の相同性もしくは同一性、または代替的には少なくとも約９０％の相同性もしくは同一性、または代替的には少なくとも約９５％の相同性もしくは同一性、または代替的には少なくとも約９６％の相同性もしくは同一性、または代替的には少なくとも約９７％の相同性もしくは同一性、または代替的には少なくとも約９８％の相同性もしくは同一性、または代替的には少なくとも約９９％の相同性もしくは同一性（一態様では、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａアライメントプログラムを使用して決定される）を意図し、参照タンパク質、ポリペプチド、または核酸と実質的に同等の生物学的活性を呈する。代替的には、ポリヌクレオチドに言及する場合、その同等物は、ストリンジェントな条件下において、参照ポリヌクレオチドまたはその相補的配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
参照ポリペプチドの同等物は、参照ポリペプチドに対して少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％のアミノ酸同一性（一態様では、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａアライメントプログラムを使用して決定される）を有するポリペプチド、または必要に応じて約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度、約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度、約５５％～約７５％のホルムアミド濃度、および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、もしくは脱イオン水の洗浄溶液を含む高ストリンジェンシー条件下において、参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補的配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、または代替的にはそれからなる。
一部の実施形態では、第１の配列（核酸配列またはアミノ酸）を、第２の配列と比較し、２つの配列間の同一性パーセンテージを計算することができる。さらなる実施形態では、第１の配列は、本明細書において、同等物と称され得、第２の配列は、本明細書において、参照配列と称され得る。なおもさらなる実施形態では、同一性パーセンテージは、第１の配列の全長配列に基づいて計算される。他の実施形態では、同一性パーセンテージは、第２の配列の全長配列に基づいて計算される。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換可能に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらのアナログのいずれかを指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、公知または不明の任意の機能を行い得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、もしくはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、重合の後に、例えば、標識化成分とのコンジュゲーションによって、さらに改変されてもよい。この用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。別途示されるかまたは必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態をなすことが公知であるかまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびポリヌクレオチドがＲＮＡである場合にチミンの代わりにウラシル（Ｕ）の特定の配列から構成される。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベットでの表示である。このアルファベットでの表示は、中央処理装置を有するコンピュータのデータベースに入力することができ、機能ゲノミクスおよび相同性検索などのバイオインフォマティクス用途に使用することができる。
「ＲＮＡ」という用語は、本明細書において使用される場合、その当該技術分野において一般的に許容されている意味を指す。一般に、ＲＮＡという用語は、少なくとも１つのリボフラノシド部分を含むポリヌクレオチドを指す。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば、部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えで産生されたＲＮＡ、ならびに天然に存在するＲＮＡとは１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または変更が異なる変更されたＲＮＡを含み得る。そのような変更は、例えば、ＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド材料の付加を含み得る。核酸分子におけるヌクレオチドは、また、非標準的ヌクレオチド、例えば、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドも含み得る。これらの変更されたＲＮＡは、アナログまたは天然に存在するＲＮＡのアナログと称され得る。一部の実施形態では、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。
「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）ポリペプチド（天然に存在する、天然に存在しない、または改変された、アミノ酸のポリマー）をコードする任意のポリヌクレオチドを指し、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｅｘ ｖｉｖｏにおいてコードされたポリペプチドを産生するように翻訳され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるｍＲＮＡは、少なくとも１つのコーディング領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップ、およびポリＡ尾部を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
ワクチン接種は、疾患の予防および制御のためのもっとも成功している医学的アプローチである。ワクチンの開発および使用の成功により、何千人もの命が救われ、多額の資金が節約されている。ＲＮＡワクチンの重要な利点は、ＲＮＡが、検査室において、容易に入手可能な材料を使用して、鶏卵または他の哺乳動物細胞の使用が必要な場合がある従来的なワクチン製造よりも低費用かつ高速で、ＤＮＡ鋳型から産生させることができることである。加えて、ｍＲＮＡワクチンは、ワクチンの発見および開発を合理化し、新しく生じる感染性疾患に対する迅速な対応を促進する可能性を有する。例えば、Maruggi et al., Mol Ther. 2019; 27(4):757-772を参照されたい。
前臨床および臨床試験では、ｍＲＮＡワクチンが、動物モデルおよびヒトにおいて、安全かつ長く持続する免疫応答を提供することが示されている。感染性疾患に対するｍＲＮＡワクチンは、予防的処置または治療的処置として開発され得る。感染性病原体の抗原を発現するｍＲＮＡワクチンは、強力なＴ細胞免疫応答および体液性免疫応答を誘導することが示されている。例えば、Pardi et al., Nat Rev Drug Discov. 2018; 17:261-279を参照されたい。ｍＲＮＡワクチンを生成するための産生手順は、全微生物ワクチン、弱毒化生ワクチン、およびサブユニットワクチンの産生と比較して、無細胞、単純、かつ高速である。この高速かつ単純な製造プロセスにより、ｍＲＮＡは、新たに生じる感染性疾患と、有効なワクチンに対する切実な必要性との間の溝を埋めることができる可能性のある有望なバイオ製品となっている。
「単離された」という用語は、本明細書において核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡに関連して使用される場合、それぞれ、巨大分子の天然の供給源に存在している他のＤＮＡまたはＲＮＡとは分離されている分子を指す。「単離された核酸」という用語は、断片として天然に存在せず、天然の状態で見出されないであろう、核酸断片を含むことを意味する。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質から単離されているポリペプチド、タンパク質、および／または宿主細胞を指して本明細書に使用され、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。他の実施形態では、「単離された」という用語は、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、天然の状態で通常関連している構成要素、細胞、およびその他のものから分離していることを意味する。例えば、単離された細胞は、類似ではない表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離されている細胞である。当業者には明らかなように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、それをその天然に存在する対応物と区別するための「単離」を必要としない。
一部の実施形態では、「操作された」または「組換え」という用語は、天然に存在するタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、株、野生型株、または参照種の親宿主株において通常見出されない少なくとも１つの改変を有することを指す。一部の実施形態では、「操作された」または「組換え」という用語は、ヒトの介入によって合成されていることを指す。本明細書において使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技法によって産生されたポリペプチドを指し、一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡが、好適な発現ベクターに挿入され、これを使用して、宿主細胞に形質転換を行って、異種タンパク質を産生させる。
本明細書において使用される場合、「相補的」配列とは、逆平行で互いにアライメントしたときに、互いに対合する複数の個々のヌクレオチド塩基を含む、２つのヌクレオチド配列を指す。ヌクレオチド塩基の対合は、水素結合を形成し、したがって、相補的配列によって形成される二本鎖構造を安定させる。配列が「相補的」と見なされるために、必ずしも、２つの配列内のすべてのヌクレオチド塩基が互いに対合するわけではない。配列は、例えば、２つの配列内のヌクレオチド塩基のうちの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が互いに対合する場合、相補的と考えることができる。一部の実施形態では、相補的という用語は、２つの配列内のヌクレオチド塩基の１００％が、互いに対合することを指す。加えて、配列は、２つの配列の全長が、互いに有意に異なる場合にも、依然として「相補的」と考えられ得る。例えば、１５個のヌクレオチドのプライマーは、プライマーを数百個のヌクレオチドを含むより長いポリヌクレオチドの特定の領域と逆平行にアライメントしたときに、プライマーの複数の個々のヌクレオチド塩基が、そのより長いポリヌクレオチド内のヌクレオチド塩基と対合する場合、そのより長いポリヌクレオチドに対して「相補的」であると考えられ得る。ヌクレオチド塩基の対合は、当該技術分野において公知であり、例えば、ＤＮＡの場合、プリンアデニン（Ａ）は、ピリミジンチミン（Ｔ）と対合し、ピリミジンシトシン（Ｃ）は、常にプリングアニン（Ｇ）と対合し、一方でＲＮＡの場合には、アデニン（Ａ）は、ウラシル（Ｕ）と対合し、グアニン（Ｇ）は、シトシン（Ｃ）と対合する。さらに、２つの相補的配列において互いに逆平行にアライメントするが対ではないヌクレオチド塩基は、本明細書において、ミスマッチと称される。
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドを指す。
「発現する」という用語は、遺伝子産物、例えば、ｍＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の産生を指す。本明細書において使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、または転写されたｍＲＮＡが、続いてペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。
「遺伝子産物」または代替的に「遺伝子発現産物」は、遺伝子が転写され翻訳されると生成される、アミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を指す。一部の実施形態では、遺伝子産物は、遺伝子が転写されると生成される、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、例えば、干渉ＲＮＡを指し得る。
ポリヌクレオチドに適用される「コードする」という用語は、その生来の状態で、または当業者に周知の方法によって操作された場合に、転写されて、ポリペプチドまたはその断片のｍＲＮＡを産生し、必要に応じて翻訳されて、ポリペプチドまたはその断片を産生し得る場合に、ポリペプチドを「コードする」と称されるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり、コーディング配列は、そこから推測することができる。さらに、本明細書において使用される場合、アミノ酸配列のコーディング配列は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。
「化学的改変」および「化学的に改変された」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）、またはシチジン（Ｃ）リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに関する、それらの位置、パターン、パーセント、または集団のうちの少なくとも１つにおける改変を指す。一部の実施形態では、この用語は、天然に存在する５’末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド改変を指す。さらなる実施形態では、化学的改変は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、または２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される。一部の実施形態では、化学的に改変されたヌクレオチドの組込みの程度は、ワクチン製剤に対する免疫応答の改善のために最適化されている。他の実施形態では、この用語は、天然に存在する５’末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド改変を除外する。
ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、一部の実施形態では、所望される機能または特性を達成するためにポリヌクレオチドの合成中または合成後に導入される非天然の改変されたヌクレオチドを含む。改変は、ヌクレオチド間連結、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。改変は、鎖の末端または鎖内の任意の他の箇所において、化学合成またはポリメラーゼ酵素により導入され得る。ポリヌクレオチドの領域のうちのいずれかが、化学的に改変され得る。
一部の実施形態では、ＲＮＡの残基のうちの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれよりも高いパーセンテージが、本明細書に開示される改変のうちの１つまたは複数によって化学的に改変されている。一部の実施形態では、ＲＮＡのウリジン残基のうちの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれよりも高いパーセンテージが、本明細書に開示される改変のうちの１つまたは複数によって化学的に改変されている。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡは、最適化されている。最適化は、一部の実施形態では、標的および宿主生物におけるコドン使用頻度を一致させて、適切なフォールディングを確実にするため；ｍＲＮＡ安定性を増加させるか、もしくは二次構造を低減させるように、ＧＣ含有量を偏らせるため；遺伝子構築もしくは発現を損傷し得るタンデムリピートコドンもしくは塩基回数を最小限に抑えるため；転写および翻訳制御領域をカスタマイズするため；タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去するため；コードされるタンパク質への翻訳後改変部位（例えば、グリコシル化部位）の除去／追加のため；タンパク質ドメインを追加、除去、もしくはシャッフルするため；制限部位を挿入もしくは欠失させるため；リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を改変するため；タンパク質の様々なドメインが適切にフォールディングすることを可能にするように、翻訳速度を調節するため；またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減もしくは排除するために、使用され得る。
「３’非翻訳領域」（３’ ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしない、終止コドン（すなわち、翻訳の終了をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）のすぐ下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。一部の実施形態では、３’ ＵＴＲは、本明細書において使用される場合、配列番号１８、２２、または２４のうちの１つまたは複数を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
「５’非翻訳領域」（５’ ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしない、開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）のすぐ上流（すなわち、５’）にあるＲＮＡの領域を指す。一部の実施形態では、５’ ＵＴＲは、本明細書において使用される場合、配列番号２０または２６のうちの一方または両方を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
「ポリＡ尾部」は、複数の連続したアデノシン一リン酸を含み、３’ ＵＴＲから下流、例えば、すぐ下流（すなわち、３’）にある、ｍＲＮＡの領域である。ポリＡ尾部は、１０～３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。追加として、または代替的には、関連する生物学的状況（例えば、細胞、ｉｎ ｖｉｖｏ）において、ポリＡ尾部は、例えば、細胞質における酵素分解からｍＲＮＡを保護するように機能し、転写終止、ｍＲＮＡの核外輸送、および翻訳を補助する。一部の実施形態では、ポリＡ尾部は、本明細書において使用される場合、配列番号２７、２８、または３０のうちの１つまたは複数を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）方法は、ほぼすべての配列のＲＮＡ分子の鋳型により誘導される合成を可能にする。ＩＶＴ方法を使用して合成することができるＲＮＡ分子のサイズは、短いオリゴヌクレオチドから、数千塩基の長い核酸ポリマーまでの範囲に及ぶ。ＩＶＴ方法は、大量のＲＮＡ転写産物（例えば、マイクログラムからミリグラムの量）の合成を可能にする（Beckert et al., Methods Mol Biol. 703:29-41(2011)、Rio et al. RNA: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2011, 205-220、およびCooper, Geoffery M. The Cell: A Molecular Approach. 4th ed. Washington D.C.: ASM Press, 2007, 262-299）。一般に、ＩＶＴは、目的の配列の上流にあるプロモーター配列を特徴とするＤＮＡ鋳型を利用する。プロモーター配列は、もっとも一般的にはバクテリオファージ起源のものであるが（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列）、多数の他のプロモーター配列が、ｄｅ ｎｏｖｏで設計されたものを含め、許容され得る。ＤＮＡ鋳型の転写は、典型的には、特定のバクテリオファージプロモーター配列に対応するＲＮＡポリメラーゼを使用することによって、もっとも良好に達成される。例示的なＲＮＡポリメラーゼとしては、とりわけ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ＩＶＴは、一般に、ｄｓＤＮＡで開始されるが、一本鎖で進行してもよい。
本明細書に開示されるＲＮＡは、任意の適切な合成方法を使用して作製することができることが、理解される。例えば、一部の実施形態では、ＲＮＡは、ＩＶＴを使用して、鋳型としての一本鎖ボトム鎖ＤＮＡ、およびプロモーターとしての機能を果たす相補的オリゴヌクレオチドから作製される。一本鎖ボトム鎖ＤＮＡは、ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のＤＮＡ鋳型としての機能を果たし得、例えば、プラスミド、ＰＣＲ産物、または化学合成から得ることができる。一部の実施形態では、一本鎖ボトム鎖ＤＮＡは、環状鋳型から線形化される。一本鎖ボトム鎖ＤＮＡ鋳型は、一般に、ＩＶＴを促進するためのプロモーター配列、例えば、バクテリオファージプロモーター配列を含む。一本鎖ボトム鎖ＤＮＡおよびトップ鎖プロモーター相補的オリゴヌクレオチドを使用してＲＮＡを作製する方法は、当該技術分野において公知である。例示的な方法としては、ＤＮＡボトム鎖鋳型をトップ鎖プロモーター相補的オリゴヌクレオチド（例えば、Ｔ７プロモーター相補的オリゴヌクレオチド、Ｔ３プロモーター相補的オリゴヌクレオチド、またはＳＰ６プロモーター相補的オリゴヌクレオチド）とアニーリングすること、続いて、プロモーター配列に対応するＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用したＩＶＴが挙げられるが、これらに限定されない。
ＩＶＴ方法はまた、二本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して行うこともできる。例えば、一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ鋳型は、当該技術分野において利用可能な鎖伸長技法を使用して、相補的オリゴヌクレオチドを伸長して相補的ＤＮＡ鎖を生成することによって作製される。一部の実施形態では、プロモーター配列および目的の１つまたは複数のエピトープをコードする配列を含む一本鎖ボトム鎖ＤＮＡ鋳型を、トップ鎖プロモーター相補的オリゴヌクレオチドにアニーリングし、ＰＣＲ様プロセスに供して、トップ鎖を伸長させて二本鎖ＤＮＡ鋳型を生成する。代替的には、または追加として、ボトム鎖プロモーター配列に相補的かつ目的の１つまたは複数のエピトープをコードする配列に相補的な配列を含むトップ鎖ＤＮＡを、ボトム鎖プロモーターオリゴヌクレオチドにアニーリングさせ、ＰＣＲ様プロセスに供して、ボトム鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡ鋳型を生成する。一部の実施形態では、ＰＣＲ様のサイクル数は、１～２０回のサイクル、例えば、３～１０回のサイクルの範囲に及ぶ。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ鋳型は、化学的合成方法によって完全または部分的に合成される。二本鎖ＤＮＡ鋳型は、本明細書に記載されるようにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に供され得る。
本明細書において「～の発現を誘導する」またはその任意の文法上の変化形としても使用される「転写制御下において」とは、当該技術分野において十分に理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列の転写および必要に応じて翻訳が、転写の開始に寄与するかまたは転写を促進するエレメントに作動可能に連結されていることに依存することを示す。
「作動可能に連結された」とは、ポリヌクレオチドが、細胞においてそれらが機能することを可能にする様式で配置されていることを意図する。
「調節配列」、「発現制御エレメント」、または「プロモーター」という用語は、本明細書において使用される場合、転写または複製しようとする標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結されており、標的ポリヌクレオチドの発現または複製を促進する、ポリヌクレオチドを意図する。
プロモーターは、発現制御エレメントまたは調節配列の例である。プロモーターは、調節される遺伝子転写の制御点を提供する、遺伝子または他のポリヌクレオチドの５’または上流に位置していてもよい。一部の実施形態では、プロモーターは、本明細書において使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼに対応する。さらなる実施形態では、プロモーターは、本明細書において使用される場合、Ｔ７プロモーター、またはＳＰ６プロモーター、またはＴ３プロモーターを含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。好適なプロモーターの非限定的な例は、国際公開第ＷＯ２００１００９３７７Ａ１号に提供されている。
「ＲＮＡポリメラーゼ」は、既存の鋳型ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に相補的なポリリボヌクレオチド配列を産生する酵素を指す。一部の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、必要に応じて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼである。好適なポリメラーゼの非限定的な例は、米国特許第ＵＳ１０５２６６２９Ｂ２号においてさらに詳述されている。
一部の実施形態では、「ベクター」という用語は、非分裂細胞および／または緩徐分裂細胞に感染しそれに形質導入を行い、必要に応じて、標的細胞のゲノムに組み込まれる能力を有する、組換えベクターを意図する。ベクターの非限定的な例としては、プラスミド、ナノ粒子、リポソーム、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣなどが挙げられる。一部の実施形態では、プラスミドベクターは、市販入手可能なベクターから調製され得る。他の実施形態では、ウイルスベクターは、当該技術分野において公知の技法に従って、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶなどから産生され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。一実施形態では、ベクターは、プラスミドである。一実施形態では、ベクターは、ナノ粒子、必要に応じて、ポリマーナノ粒子または脂質ナノ粒子である。
ポリヌクレオチドが作動可能に連結され得るプロモーターおよびクローニング部位の両方を含むベクターは、当該技術分野において周知である。そのようなベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）などの供給源から市販入手可能である。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を最適化するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加、または変更して、余分で不適切な可能性のある選択的翻訳開始コドンまたは転写もしくは翻訳のいずれかのレベルで発現に干渉し得るかもしくはそれを低減させ得る他の配列を排除することが、必要であり得る。代替的には、コンセンサスリボソーム結合部位を、開始コドンのすぐ５’に挿入して、発現を増強させることができる。
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体ＤＮＡとは別個の染色体外ＤＮＡ分子である。多くの場合には、それは、環状であり、二本鎖である。プラスミドは、微生物集団内で水平方向の遺伝子移入の機序を提供し、典型的には、所与の環境状態下において選択的利点を提供する。プラスミドは、競合的環境ニッチにおいて、天然に存在する抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子を有し得るか、または代替的には、産生されるタンパク質が、類似の状況下において毒素としての作用を果たし得る。多数のプラスミドが、そのような用途で市販入手可能である。複製しようとする遺伝子は、細胞を特定の抗生物質に対して耐性にする遺伝子および多重クローニング部位（ＭＣＳ、またはポリリンカー）を含むプラスミドのコピーに挿入され、この多重クローニング部位は、いくつかの一般的に使用される制限部位を含む短い領域であり、この位置へのＤＮＡ断片の容易な挿入を可能にする。プラスミドの別の主要な用途は、大量のタンパク質を作製することである。この場合、研究者は、目的の遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を成長させる。細菌がその抗生物質耐性を付与するタンパク質を産生させるのと同様に、挿入された遺伝子から多量のタンパク質を産生するように誘導することも可能である。これは、遺伝子またはそれが後にコードするタンパク質を大量生産する安価かつ容易な手段である。
「ウイルスベクター」は、宿主細胞に、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで送達しようとするポリヌクレオチドを含む、組換えで産生されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。当業者には公知のように、ウイルスには６つのクラスがある。ＤＮＡウイルスは、クラスＩおよびＩＩを構成する。ＲＮＡウイルスおよびレトロウイルスが、残りのクラスをなす。クラスＩＩＩのウイルスは、二本鎖ＲＮＡゲノムを有する。クラスＩＶのウイルスは、正の一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、ゲノム自体がｍＲＮＡとしての作用を果たし、クラスＶのウイルスは、ｍＲＮＡ合成のための鋳型として使用される負の一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。クラスＶＩのウイルスは、正の一本鎖ＲＮＡゲノムを有するが、複製だけでなくｍＲＮＡ合成においてもＤＮＡ中間体を有する。レトロウイルスは、ＲＮＡの形態で遺伝子情報を運搬するが、しかしながら、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡは感染した細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれるＤＮＡ形態へと逆転写される。組み込まれたＤＮＡ形態は、プロウイルスと称される。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどが挙げられる。アルファウイルスベクター、例えば、セムリキ森林ウイルスに基づくベクターおよびシンドビスウイルスに基づくベクターもまた、遺伝子療法および免疫療法における使用のために開発されている。Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439およびYing, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827を参照されたい。本明細書において使用される場合、感染多重度（ＭＯＩ）は、感染中に細胞ごとに追加されるウイルス粒子の数を指す。
レトロウイルス、例えば、ガンマレトロウイルスおよび／またはレンチウイルスは、（ａ）脂質および糖タンパク質を含むエンベロープ、（ｂ）標的細胞に誘導されるＲＮＡ（通常、５’末端にキャップを含み、３’末端にＬＴＲが隣接したポリＡ尾部を含む、二量体ＲＮＡ）である、ベクターゲノム、（ｃ）キャプシド、ならびに（ｄ）タンパク質、例えば、プロテアーゼを含む。米国特許第６，９２４，１２３号は、ある特定のレトロウイルス配列が、標的細胞ゲノムへの組込みを促進することを開示している。この特許は、それぞれのレトロウイルスゲノムが、ビリオンタンパク質および酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖと称される遺伝子を含むことを教示している。これらの遺伝子は、両方の末端に、長い末端リピート（ＬＴＲ）と称される領域が隣接している。ＬＴＲは、プロウイルス組込みおよび転写を担う。それらはまた、エンハンサー－プロモーター配列としての機能も果たす。換言すると、ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するプシー配列に起因して生じる。ＬＴＲ自体は、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と称される３つのエレメントに分割することができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に固有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両方の末端においてリピートされる配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に固有の配列に由来する。３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルス間で相当に変動し得る。ウイルスゲノムに関して、ポリ（Ａ）付加（終止）部位は、右手側のＬＴＲのＲとＵ５との間の境界部にある。Ｕ３は、プロウイルスの転写制御エレメントのほとんどを含み、これは、プロモーターならびに細胞および一部の場合にはウイルス転写活性化因子タンパク質に応答する複数のエンハンサー配列を含む。
構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ自体に関して、ｇａｇは、ウイルスの内部構造タンパク質をコードする。ｇａｇタンパク質は、タンパク質分解によりプロセシングされて、成熟タンパク質ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（キャプシド）、およびＮＣ（ヌクレオキャプシド）となる。ｐｏｌ遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼを含む逆転写酵素（ＲＴ）、ならびにゲノムの複製を媒介する関連するＲＮａｓｅ Ｈおよびインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする。
ウイルスベクター粒子の産生に関して、ベクターＲＮＡゲノムは、宿主細胞において、それをコードするＤＮＡ構築物から発現される。ベクターゲノムによってコードされない粒子の成分は、トランスに、宿主細胞において発現される追加の核酸配列（通常、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子のいずれかまたは両方を含む、「パッケージング系」）によって提供される。ウイルスベクター粒子の産生に必要とされる配列のセットは、一過的トランスフェクションによって宿主細胞に導入されてもよく、またはそれらは宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよく、またはそれらは混合方法で提供されてもよい。関係する技法は、当業者に公知である。
「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」という用語は、本明細書において使用される場合、この名称と関連する、ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に属する、ウイルスのクラスのメンバーを指す。このウイルスのいくつかの血清型は、遺伝子送達に好適であることが知られており、すべての公知の血清型は、様々な組織タイプに由来する細胞に感染し得る。少なくとも１１個の連続的に番号付けされたＡＡＶ血清型が、当該技術分野において公知である。本明細書に開示される方法において有用な非限定的な例示的な血清型としては、１１個の血清型のうちのいずれか、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはバリアントもしくは合成の血清型、例えば、ＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂが挙げられる。ＡＡＶ粒子は、３つの主要なウイルスタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含むか、代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ、またはＡＡＶ ｒｈ７４のものを指す。これらのベクターは、市販入手可能であるか、または特許もしくは技術文献において記載されている。
また、遺伝子送達ビヒクルとしては、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセル、および標的化ウイルスタンパク質－ＤＮＡ複合体も挙げられる。標的化抗体またはその断片も含むリポソームは、本明細書に開示される方法において使用することができる。ポリヌクレオチドの細胞または細胞集団への送達に加えて、本明細書に記載されるタンパク質の細胞または細胞集団への直接的な導入は、タンパク質トランスフェクションの非限定的な技法によって行うことができ、代替的には、発現を増強させることができ、かつ／または本明細書に開示されるタンパク質の活性を促進させることができる培養条件は、他の非限定的な技法である。
「調節配列」、「発現制御エレメント」、または「プロモーター」という用語は、本明細書において使用される場合、転写および／または複製しようとする標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結されており、標的ポリヌクレオチドの発現および／または複製を促進する、ポリヌクレオチドを意図する。プロモーターは、発現制御エレメントまたは調節配列の例である。プロモーターは、調節される遺伝子転写の制御点を提供する、遺伝子または他のポリヌクレオチドの５’または上流に位置していてもよい。ポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩは、プロモーターの例である。
ポリメラーゼＩＩまたは「ｐｏｌ ＩＩ」プロモーターは、ｍＲＮＡ、ならびにほとんどのｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡの前駆体を合成するためのＤＮＡの転写を触媒する。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例は、当該技術分野において公知であり、限定することなく、ホスホグリセリン酸キナーゼ（「ＰＧＫ」）プロモーター、ＥＦ１－アルファ；ＣＭＶ（最小サイトメガロウイルスプロモーター）、ならびにレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター由来のＬＴＲが挙げられる。
エンハンサーは、標的配列の発現を増加させる調節エレメントである。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーターおよびエンハンサーの両方の機能を提供することができる配列を含むポリヌクレオチドである。例えば、レトロウイルスの長い末端リピートは、プロモーターおよびエンハンサーの両方の機能を含む。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」であってもよく、「外因性」であってもよく、または「異種」であってもよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノムにおいて所与の遺伝子と天然に連結されているものである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子の転写が、連結されたエンハンサー／プロモーターによって誘導されるように、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）を用いて、その遺伝子に並置されているものである。
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック塩基対合、フーグスティーン結合、または任意の他の配列特異的様式で生じ得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、複数鎖の複合体を形成する３つもしくはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断など、さらに拡張的なプロセスにおける１つのステップを構成し得る。
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」条件下において行われ得る。一般に、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、１０×ＳＳＣまたは同等のイオン強度／温度の溶液中で、約４０℃において行われる。中等度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、典型的に、６×ＳＳＣにおいて約５０℃で行われ、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、一般に、１×ＳＳＣにおいて約６０℃で行われる。ハイブリダイゼーション反応はまた、「生理学的条件」下において行われてもよく、これは、当業者に周知である。生理学的条件の非限定的な例は、細胞において通常見出される温度、イオン強度、ｐＨ、およびＭｇ２＋濃度である。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約２５℃～約３７℃のインキュベーション温度、約６×ＳＳＣ～約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度、約０％～約２５％のホルムアミド濃度、および約４×ＳＳＣ～約８×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中等度ハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃～約５０℃のインキュベーション温度、約９×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの緩衝液濃度、約３０％～約５０％のホルムアミド濃度、および約５×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度、約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度、約５５％～約７５％のホルムアミド濃度、および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、５分間～２４時間であり、１回、２回、またはそれよりも多くの洗浄ステップで、洗浄インキュベーション時間は、約１、２、または１５分間である。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を使用したＳＳＣの同等物を利用することができることが、理解される。
ハイブリダイゼーションが、２つの一本鎖ポリヌクレオチド間において逆平行構成で生じる場合、反応は、「アニーリング」と称され、これらのポリヌクレオチドは、「相補的」と記載される。二本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが、第１のポリヌクレオチドの鎖のうちの１つと第２のものとの間で生じる場合、もう一方のポリヌクレオチドに対して「相補的」または「相同」であり得る。「相補性」または「相同性」（１つのポリヌクレオチドが、もう一方と相補的である程度）は、一般に許容される塩基対合法則に従って、互いと水素結合を形成することが予測される対抗する鎖における塩基の割合に関して、定量可能である。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的でアライメントされ得るそれぞれの配列における位置を比較することによって、決定することができる。比較される配列におけるある位置が、同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合、これらの分子は、その位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有されている一致するかまたは相同である位置の数の関数である。「非関連」または「非相同」配列は、本開示の配列のうちの１つと、４０％を下回る同一性、または代替的には２５％を下回る同一性を共有する。一部の実施形態では、同一性は、２つのペプチドまたはポリヌクレオチド間において、それらの全長にわたって、または２つのうちの短い方の配列にわたって、または２つのうちの長い方の配列にわたって、計算される。
もう一方の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、アライメントした場合に、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が、２つの配列を比較して同じであることを意味する。このアライメントおよび相同性または配列同一性パーセントは、当該技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biologyに記載されているものを使用して、決定することができる。好ましくは、デフォルトのパラメーターが、アライメントに使用される。１つのアライメントプログラムは、ＢＬＡＳＴであり、デフォルトのパラメーターを使用する。具体的には、プログラムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰであり、以下のデフォルトのパラメーターを使用する：遺伝子コード＝標準、フィルター＝なし、鎖＝両方、カットオフ＝６０、予測＝１０、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、説明＝５０個の配列、並べ替え＝高スコア、データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスにおいて見出すことができる：blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi、最終アクセス２０２１年８月１日。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはそのアナログである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはそのアナログである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリッドまたはそのアナログである。
一部の実施形態では、参照核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの同等物は、参照物によってコードされるものと同じ配列をコードする。一部の実施形態では、参照核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの同等物は、参照物、相補的参照物、逆参照物、または逆相補的参照物に、必要に応じて高ストリンジェンシーの条件下において、ハイブリダイズする。
追加として、または代替的には、同等の核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは、参照核酸、ポリヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドに対して、少なくとも７０％の配列同一性、もしくは少なくとも７５％の配列同一性、もしくは少なくとも８０％の配列同一性、もしくは代替的には少なくとも８５％の配列同一性、もしくは代替的には少なくとも９０％の配列同一性、もしくは代替的には少なくとも９２％の配列同一性、もしくは代替的には少なくとも９５％の配列同一性、もしくは代替的には少なくとも９７％の配列同一性、もしくは代替的には少なくとも９８％の配列、もしくは代替的には少なくとも９９％の配列同一性を有するものであるか、または代替的には、同等の核酸は、高ストリンジェンシー条件下において、参照ポリヌクレオチドもしくはその相補体にハイブリダイズする。一態様では、同等物は、同じタンパク質またはタンパク質の機能的同等物をコードしなければならず、これは、必要に応じて、本明細書に記載される１つまたは複数のアッセイを通じて特定することができる。追加として、または代替的には、ポリヌクレオチドの同等物は、参照または親ポリヌクレオチドと同じかまたは類似の機能のタンパク質またはポリペプチドをコードするであろう。
「形質導入する」または「形質導入」という用語は、それによって外来ヌクレオチド配列が細胞へと導入される、プロセスを指す。一部の実施形態では、この形質導入は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって行われる。
「検出可能な標識」、「標識」、「検出可能なマーカー」、または「マーカー」は、互換可能に使用され、これには、放射性同位体、蛍光色素、化学発光性化合物、色素、および酵素を含めたタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な標識はまた、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、または組成物に結合することができる。
本明細書において使用される場合、「標識」または検出可能な標識という用語は、検出しようとする組成物に直接的または間接的にコンジュゲートされる、直接的または間接的に検出可能な化合物または組成物、例えば、Ｎ末端ヒスチジンタグ（Ｎ－Ｈｉｓ）、磁気活性同位体、例えば、１１５Ｓｎ、１１７Ｓｎ、および１１９Ｓｎ、非放射性同位体、例えば、１３Ｃおよび１５Ｎ、「標識化」組成物を生成するようなポリヌクレオチドまたはタンパク質、例えば、抗体を意図する。この用語はまた、挿入された配列が発現されるとシグナルを提供する、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされる配列、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）なども含む。標識は、それ自体が検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学的変更を触媒してもよい。標識は、小規模な検出に好適であってもよく、または高スループットなスクリーニングにより好適であってもよい。そのため、好適な標識としては、磁気活性同位体、非放射性同位体、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含めたタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。標識は、単純に検出されてもよく、または定量されてもよい。単純に検出される応答は、一般に、その存在だけが確認される応答を含むが、一方で、定量される応答は、一般に、定量可能な（例えば、数値で報告可能な）値、例えば、強度、極性、または他の特性を有する応答を含む。発光または蛍光アッセイの場合、検出可能な応答は、結合に実際に関与するアッセイ成分と関連する発光体もしくはフルオロフォアを使用して直接的に、または別の（例えば、レポーターもしくはインジケーター）成分と関連する発光体もしくはフルオロフォアを使用して間接的に、生成され得る。シグナルを生じる発光性標識の例としては、生物発光および化学発光が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な発光応答は、一般に、発光シグナルの変化またはその発生を含む。アッセイ成分を発光標識するための好適な方法および発光体は、当該技術分野において公知であり、例えば、Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed)に記載されている。発光性プローブの例としては、エクオリンおよびルシフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「イムノコンジュゲート」という用語は、第２の薬剤、例えば、細胞毒性剤、検出可能な薬剤、放射性薬剤、標的化剤、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、半合成抗体、または多重特異性抗体と会合したかまたはそれに連結された抗体または抗体誘導体を含む。
好適な蛍光標識の例としては、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル－クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー（商標）、およびテキサスレッドが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な光学色素は、Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)に記載されている。
一部の実施形態では、蛍光標識は、細胞または組織に存在するかまたはその表面上に存在する細胞成分、例えば、細胞表面マーカーへの共有結合を促進するように、官能化される。好適な官能基としては、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステル、およびハロゲン化スルホニルが挙げられるがこれらに限定されず、これらのすべては、蛍光標識を第２の分子に結合させるために使用することができる。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、薬剤、マーカー、または第２の標識化剤のいずれかへの結合の部位に依存するであろう。
本明細書において使用される場合、精製標識またはマーカーは、標識がコンジュゲートされた分子または成分、例えば、エピトープタグ（Ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグを含むがこれらに限定されない）、親和性タグ（グルタチオン－Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ－ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、もしくはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を含むがこれらに限定されない）、または蛍光タグを精製する際に使用され得る標識を指す。
「選択マーカー」は、選択的培養レジメンにおいて成長させた細胞の生存または成長に必要なタンパク質またはタンパク質をコードする遺伝子を指す。典型的な選択マーカーは、選択的薬剤、例えば、抗生物質、除草剤、または他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列を含む。選択マーカーの例としては、抗生物質、例えば、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、Ｇ ４１８、ネオマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、メトトレキサート、ジカンバ、グルホシネート、またはグリホサートに対する耐性を付与するための遺伝子が挙げられる。
「培養する」という用語は、様々な種類の培地上または培地中での細胞または生物のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの拡大を指す。培養で成長させた細胞の子孫は、親細胞と完全に同一（すなわち、形態学的、遺伝子的、または表現型的に）ではない場合があることを理解されたい。
一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞は、真核生物細胞または原核生物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、細胞株、例えば、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ ２９３細胞もしくは２９３細胞）、２９３Ｔ細胞、またはａ５４９細胞である。
「宿主細胞」は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指す。ある特定の改変が、突然変異または環境的影響のいずれかに起因して後続の世代において生じ得るため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書において使用される場合、この用語の範囲内に依然として含まれる。宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、細胞株、例えば、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ ２９３細胞もしくは２９３細胞）、２９３Ｔ細胞、またはａ５４９細胞である。
「真核生物細胞」は、モネラ界を除く生物界のすべてを含む。これらは、膜結合型核により容易に区別することができる。動物、植物、真菌、および原生生物は、細胞が、内部膜および細胞骨格によって複雑な構造に構成された、真核生物または生物である。もっとも特徴的な膜結合構造は、核である。別途具体的に示されない限り、「宿主」という用語は、例えば、酵母、高次植物、昆虫、および哺乳動物細胞を含む、真核生物宿主を含む。真核生物細胞または宿主の非限定的な例としては、サル、イヌ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、鳥、爬虫類、およびヒトが挙げられる。
通常、核または任意の他の膜結合オルガネラが欠如している「原核生物細胞」は、細菌および古細菌の２つのドメインに分割される。追加として、染色体ＤＮＡを有する代わりに、これらの細胞の遺伝子情報は、プラスミドと称される環状ループ内にある。細菌細胞は、非常に小さく、およそ動物ミトコンドリアサイズ（直径約１～２μｍおよび長さ１０μｍ）である。原核生物細胞は、３つの主要な形状を特徴とする：錐体形状、球形状、および螺旋状。真核生物のような精巧な複製プロセスを行う代わりに、細菌細胞は、二分裂で分裂する。例としては、桿菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
「組成物」は、活性剤と、不活性（例えば、検出可能な薬剤もしくは標識）または活性な別の化合物または組成物、例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝化剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなどとの組合せを意味し、薬学的に許容される担体を含むことが意図される。
担体はまた、薬学的賦形剤および添加剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば、糖、単糖、二糖、三糖、四糖のオリゴ糖、およびオリゴ糖を含む；誘導体化された糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖など；ならびに多糖、または糖ポリマー）を含み、これらは、単独または組合せで存在し得、単独または組合せで１～９９．９９重量または体積％を構成し得る。例示的なタンパク質賦形剤は、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどが挙げられる。緩衝化能力においても機能し得る代表的なアミノ酸成分としては、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが挙げられる。炭水化物賦形剤もまた、本技術の範囲内であることが意図され、その例としては、単糖類、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなど；二糖類、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど；多糖類、例えば、ラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど；ならびにアルジトール、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、およびミオイノシトールが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される組成物は、医薬組成物であり得る。「医薬組成物」は、活性剤と、組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏでの診断用または治療用での使用に好適にする不活性または活性な担体との組合せを含むことが意図される。
「薬学的に許容される担体」とは、本明細書に開示される組成物において使用され得る任意の希釈剤、賦形剤、または担体を指す。薬学的に許容される担体は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、ホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられる。好適な薬学的担体は、この分野における標準的な参考文献であるRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Companyに記載されている。それらは、意図される投与形態、すなわち、経口用錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに関連して選択され得、従来的な医薬慣例と相容れるものであり得る。
本明細書において使用される場合、「賦形剤」という用語は、長期安定化のため、固形製剤の増量のため、または最終剤形において活性成分に治療的増強を付与するため、例えば、薬物吸収を促進するか、粘度を低減させるか、もしくは可溶性を増強するために含まれる、医薬の活性成分とともに製剤化される天然または合成の物質を指す。
本開示に従って使用される組成物は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態でパッケージングされ得る。「単位用量」または「投薬量」という用語は、対象において使用するのに好適な物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、その投与、すなわち、適切な経路およびレジメンと関連して所望される応答をもたらすように計算された所定の量の組成物を含む。投与しようとする量は、処置回数および単位用量の両方に応じて、所望される結果および／または保護に依存する。組成物の正確な量はまた、医師の判断に依存し、それぞれの個体に特有である。用量に影響を及ぼす因子としては、対象の身体状態および臨床状態、投与の経路、意図される処置目標（症状の緩和か治癒か）、ならびに具体的な組成物の効力、安定性、および毒性が挙げられる。製剤化した後、溶液は、投薬製剤と適合性のある様式および治療的または予防的に有効な量で、投与される。製剤は、様々な投薬形態、例えば、本明細書に記載される注射用溶液のタイプで、容易に投与される。
単位用量、投薬量、またはレジメンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する中和活性に関して、所与のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、またはキットのＩＣ５０から判定することができる。「ＩＣ５０」は、５０％阻害に必要とされるポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、またはキットの濃度を意味する。代替的には、有効量は、所与のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、またはキットのＥＣ５０から判定することができる。「ＥＣ５０」は、ｉｎ ｖｉｖｏで最大中和作用の５０％を得るために必要とされる血漿濃度を意味する。
本明細書において使用される組合せは、組成物の個々の活性成分が、組み合わせて使用するために別個に製剤化され、特定の投薬量ありまたはなしで別個にパッケージングされ得ることを意図する。組合せの活性成分は、同時または逐次的に投与され得る。
４分岐のヒスチジン－リシン（ＨＫ）ペプチドポリマーＨ２Ｋ４ｂは、高分子量ＤＮＡプラスミドの良好な担体であるが（Leng et al. Nucleic Acids Res 2005; 33:e40.）、比較的低い分子量のｓｉＲＮＡの担体としては不良であることが示されている（Leng et al. J Gene Med 2005; 7:977-986.）。Ｈ２Ｋ４ｂの２つのヒスチジンリッチペプチドアナログ、すなわち、Ｈ３Ｋ４ｂおよびＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂは、ｓｉＲＮＡの有効な担体であることが示されている（Leng et al. J Gene Med 2005; 7: 977-986、Chou et al. Biomaterials 2014; 35:846-855.）が、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂがわずかにより有効であると見られている（Leng et al. Mol Ther 2012; 20:2282-2290.）。さらに、ｓｉＲＮＡのＨ３Ｋ４ｂ担体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ ｓｉＲＮＡポリプレックスよりも有意に高い程度にサイトカインを誘導した（Leng et al. Mol Ther 2012; 20:2282-2290.）。好適なＨＫポリペプチドは、国際公開第ＷＯ／２００１／０４７４９６号、同第ＷＯ／２００３／０９０７１９号、および同第ＷＯ／２００６／０６０１８２号に記載されており、これらのそれぞれの内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。これらのポリペプチドは、リシン側鎖ε－アミノ基およびＮ末端が様々なＨＫ配列に連結された、リシン骨格（３つのリシン残基）を有する。ＨＫポリペプチド担体は、例えば、固相合成を含む、当該技術分野において周知である方法によって、合成することができる。
そのようなヒスチジン－リシンペプチドポリマー（「ＨＫポリマー」または「ＨＫＰ」）は、驚くべきことに、ｍＲＮＡ担体として有効であったこと、およびそれらを単独、またはリポソームと組み合わせて使用して、ｍＲＮＡの標的細胞への有効な送達を提供することができることが、見出されている。ＰＥＩおよび他の担体と同様に、当初の結果は、ＨＫポリマーが、核酸を運搬および放出するそれらの能力が異なることを示唆していた。しかしながら、ＨＫポリマーは、ペプチド合成装置で再現性をもって作製することができるため、それらのアミノ酸配列を、容易に変動させ、それによって、ＲＮＡの結合および放出、ならびにＨＫポリマーおよびＲＮＡを含むポリプレックスの安定性の微細な制御が可能となり得る（Chou et al. Biomaterials 2014; 35:846-855.、Midoux et al. Bioconjug Chem 1999; 10:406-411.、Henig et al. Journal of American Chemical Society 1999; 121:5123-5126.）。ｍＲＮＡ分子を、１つまたは複数のＨＫＰ担体と混合すると、成分は、ナノ粒子へと自己アセンブルする。
本明細書に記載される場合、有益なことに、ＨＫポリマーは、３つのリシンのアミノ酸コアに連結された４つの短いペプチド分岐を含む。ペプチド分岐は、構成が異なる、ヒスチジンおよびリシンアミノ酸からなる。これらのヒスチジン－リシンペプチドポリマー（ＨＫポリマー）の一般構造は、式Ｉに示されており、式中、Ｒは、ペプチド分岐であり、Ｋは、アミノ酸Ｌ－リシンである。
式Ｉにおいて、Ｋは、Ｌ－リシンであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のそれぞれは、独立して、ヒスチジン－リシンペプチドである。Ｒ１～４分岐は、本発明のＨＫポリマーにおいて、同じであっても異なってもよい。Ｒ分岐が「異なる」場合、その分岐のアミノ酸配列は、ポリマー内の他のＲ分岐のそれぞれとは異なる。式Ｉに示される本発明のＨＫポリマーにおいて使用される好適なＲ分岐としては、以下のＲ分岐ＲＡ～Ｒ－Ｊが挙げられるが、これらに限定されない。
ＲＡ＝ＫＨＫＨＨＫＨＨＫＨＨＫＨＨＫＨＨＫＨＫ－ （配列番号３８）
ＲＢ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ－ （配列番号３９）
ＲＣ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ－ （配列番号４０）
ＲＤ＝ｋＨＨＨｋＨＨＨｋＨＨＨＨｋＨＨＨｋ－ （配列番号４１）
ＲＥ＝ＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ－ （配列番号４２）
ＲＦ＝ＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ－ （配列番号４３）
ＲＧ＝ＫＨＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＨＫ－ （配列番号４４）
ＲＨ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫ－ （配列番号４５）
ＲＩ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ－ （配列番号４６）
ＲＪ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫ－ （配列番号４７）
ｍＲＮＡ組成物において使用され得る具体的なＨＫポリマーとしては、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のそれぞれが、同じであり、ＲＡ～ＲＪ（表１）から選択される、ＨＫポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。これらのＨＫポリマーは、それぞれ、Ｈ２Ｋ４ｂ、Ｈ３Ｋ４ｂ、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ、Ｈ３ｋ（＋Ｈ）４ｂ、Ｈ－Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ、ＨＨ－Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ、Ｈ４Ｋ４ｂ、Ｈ３Ｋ（１＋Ｈ）４ｂ、Ｈ３Ｋ（３＋Ｈ）４ｂ、およびＨ３Ｋ（１，３＋Ｈ）４ｂと称される。これらの１０個の例のそれぞれにおいて、大文字の「Ｋ」は、Ｌ－リシンを表し、小文字の「ｋ」は、Ｄ－リシンを表す。Ｈ３Ｋ４ｂと比較して余剰のヒスチジン残基は、分岐配列内で下線で示されている。ＨＫポリマーの命名法は、以下の通りである：
１）Ｈ３Ｋ４ｂについては、分岐内の優勢なリピート配列は、－ＨＨＨＫ－（配列番号４９）であり、したがって、「Ｈ３Ｋ」は、その名称の一部であり、「４ｂ」は、分岐の数を指す；
２）Ｈ３Ｋ４ｂおよびアナログのそれぞれの分岐には４つの－ＨＨＨＫ－（配列番号４９）モチーフが存在し、第１の－ＨＨＨＫ－モチーフ（配列番号４９）（「１」）が、リシンコアにもっとも近い；
３）Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂは、１つの余剰ヒスチジンが、Ｈ３Ｋ４ｂの第２の－ＨＨＨＫ－モチーフ（配列番号４９）（モチーフ２）に挿入されているＨ３Ｋ４ｂのアナログである；
４）Ｈ３Ｋ（１＋Ｈ）４ｂおよびＨ３Ｋ（３＋Ｈ）４ｂペプチドについては、それぞれ、第１（モチーフ１）および第３（モチーフ３）のモチーフに余剰ヒスチジンが存在する；
５）Ｈ３Ｋ（１，３＋Ｈ）４ｂについては、分岐の第１および第３の両方のモチーフに２つの余剰ヒスチジンが存在する。
表1
ゲル遅延度アッセイ、ヘパリン置換アッセイ、およびフローサイトメトリーを含む、当該技術分野において周知の方法を行って、ＨＫポリマーに加えてリポソームを含む様々な製剤の性能を、ｍＲＮＡの送達の成功に関して評価することができる。好適な方法は、例えば、Gujrati et al, Mol. Pharmaceutics 11:2734-2744 (2014)およびParnaste et al., Mol Ther Nucleic Acids. 7: 1-10 (2017)に記載されている。
また、ｍＲＮＡの細胞内への取り込みの検出は、ＳＭＡＲＴＦＬＡＲＥ（登録商標）技術（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を使用して達成することができる。これらのスマートフレアは、細胞内のＲＮＡ配列を認識すると蛍光顕微鏡で分析することができる蛍光の増加をもたらす配列が結合した、ビーズである。
他の方法としては、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を測定することが挙げられ、例えば、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを使用して、トランスフェクションの効率を測定することができる。例えば、ルシフェラーゼモデルＨＫＰおよびリポソーム製剤を使用してｍＲＮＡを送達する有効性を示しているHe et al (J Gene Med. 2021 Feb;23(2):e3295)を参照されたい。
上述のルシフェラーゼモデルにおいて、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂおよびＤＯＴＡＰ（カチオン性脂質）の組合せは、驚くべきことに、ｍＲＮＡをＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞へと運搬するその能力に関して相乗的であった（Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ／リポソーム対リポソーム、Ｐ＜０．０００１）。この組合せは、それぞれ、ポリマー単独およびカチオン性脂質担体よりも、ｍＲＮＡの担体として、約３倍および８倍有効性が高かった。すべてのＨＫペプチドが、ＤＯＴＡＰ脂質と相乗的な活性を示したわけではなかった。例えば、Ｈ３Ｋ４ｂおよびＤＯＴＡＰの組合せは、ルシフェラーゼｍＲＮＡの担体として、ＤＯＴＡＰリポソームよりも有効性が低かった。ＤＯＴＡＰ以外に、ＨＫペプチドとともに使用され得る他のカチオン性脂質としては、リポフェクチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、リポフェクタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、およびＤＯＳＰＥＲが挙げられる。
上述のルシフェラーゼモデルにおいては、分岐内のＬ－リシンがＤ－リシンと置き換えられたＨ３ｋ（＋Ｈ）４ｂのＤ異性体が、もっとも有効なポリマー担体であった（Ｈ３ｋ（＋Ｈ）４ｂ対Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ、Ｐ＜０．０５）。ｍＲＮＡのＤ異性体／リポソーム担体は、それぞれ、Ｈ３ｋ（＋Ｈ）４ｂ単独およびリポソーム担体よりも、ほぼ４倍および１０倍有効性が高かった。Ｄ－Ｈ３ｋ（＋Ｈ）４ｂ／脂質の組合せは、Ｌ－Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ／脂質の組合せよりもわずかにより有効であったが、この比較は、統計学的に有意差はなかった。
Ｈ３Ｋ４ｂおよびＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂの両方を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて核酸の担体として使用することがきる。例えば、Leng et al. J Gene Med 2005; 7: 977-986およびChou et al., Cancer Gene Ther 2011; 18: 707-716を参照されたい。これらのこれまでの発見にもかかわらず、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂは、ルシフェラーゼモデルにおいて、他の類似のアナログと比較して、ｍＲＮＡの担体として極めて良好であった（表２）。
表2
特に、これは、様々な重量：重量（ＨＫ：ｍＲＮＡ）比において、Ｈ３Ｋ４ｂよりも高いｍＲＮＡトランスフェクション効率を有する。４：１の比では、ルシフェラーゼ発現は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、有意な細胞毒性を伴うことなく、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂでＨ３Ｋ４ｂよりも１０倍高かった。さらに、緩衝化能力は、Ｈ３Ｋ４ｂおよびＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂにおけるヒスチジンの（重量）パーセントが、それぞれ、６８．９および７０．６％であるため、それらのトランスフェクションの相違における本質的な因子であるとは考えられない。
ゲル遅延度アッセイは、ｍＲＮＡの電気泳動移動度が、ＨＫポリマーによって遅延されたことを示す。遅延作用は、ペプチドのｍＲＮＡに対する重量比が高くなると増加した。しかしながら、ｍＲＮＡは、２：１の比のＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂでは完全に遅延され、一方で、Ｈ３Ｋ４ｂによっては完全に遅延されなかった。これにより、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂが、より安定なポリプレックスを形成することができることが示唆されたが、これは、ｍＲＮＡ送達に好適な担体となるその能力に有利であった。
Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂペプチドがｍＲＮＡにより緊密に結合することのさらなる確認が、ヘパリン置換アッセイで実証された。様々な濃度のヘパリンを、ｍＲＮＡおよびＨＫを用いて形成されたポリプレックスに添加すると、特に、低いヘパリン濃度において、ｍＲＮＡが、Ｈ３Ｋ４ｂポリマーによって、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂポリマーよりも容易に放出されたことを観察した。これらのデータにより、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂが、ｍＲＮＡに結合することができ、Ｈ３Ｋ４ｂよりも安定なポリプレックスを形成することができることが示唆される。
シアニン－５で標識したルシフェラーゼｍＲＮＡを用いて、Ｈ３Ｋ４ｂおよびＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂポリプレックスのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への取り込みを、フローサイトメトリーを使用して比較した。異なる時点（１時間、２時間、および４時間）において、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂポリプレックスは、Ｈ３Ｋ４ｂポリプレックスよりも効率的に、細胞内に移入された。これらの結果と類似して、蛍光顕微鏡法により、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂポリプレックスが、Ｈ３Ｋ４ｂポリプレックスよりも有意に多く、酸性エンドソーム小胞内に局在化されたことが示された（Ｈ３Ｋ４ｂ対Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ、Ｐ＜０．００１）。興味深いことに、エンドサイトーシス小胞とオーバーラップしない不規則な形状のＨ３Ｋ４ｂポリプレックスは、細胞外にあった可能性が高く、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂポリプレックスでは観察されなかった。
ＨＫポリマーおよびカチオン性脂質（すなわち、ＤＯＴＡＰ）の両方が、有意にかつ独立して、プラスミドのトランスフェクションを増加させることが知られている。例えば、Chen et al. Gene Ther 2000; 7: 1698-1705を参照されたい。結果として、これらの脂質が、ＨＫポリマーと一緒になって、ｍＲＮＡトランスフェクションを増強させるかどうかを、調査した。注目すべきことに、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂおよびＨ３ｋ（＋Ｈ）４ｂ担体は、ＤＯＴＡＰリポソームよりも有意に良好なｍＲＮＡの担体であった。Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂおよびＤＯＴＡＰ脂質の組合せは、ｍＲＮＡをＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞へと運搬する能力に関して、相乗的であった。この組合せは、ｍＲＮＡの担体として、それぞれ、ポリマー単独およびリポソーム担体よりも約３倍および８倍有効性が高かった（Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ／脂質対リポソームまたはＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ）。注目すべきことに、すべてのＨＫペプチドが、ＤＯＴＡＰ脂質で改善された活性を示したわけではなかった。Ｈ３Ｋ４ｂおよびＤＯＴＡＰ担体の組合せは、ルシフェラーゼｍＲＮＡの担体として、ＤＯＴＡＰリポソームよりも有効性が低かった。ＤＯＴＡＰおよびＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ担体の組合せは、ｍＲＮＡを細胞内へと運搬するそれらの能力に関して、相乗的であることが見出された。例えば、He et al. J Gene Med. 2020 Nov 10:e3295を参照されたい。
一部の実施形態では、担体、例えば、ＮＫＰナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ改変脂質、ステロール、および非カチオン性脂質をさらに含む。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、イオン化可能カチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は、中性脂質であり、ステロールは、コレステロールである。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、またはＭＣ３）、およびジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される。
一部の実施形態では、担体は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約５０ｎｍ～約２００ｎｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子担体／製剤は、典型的には、脂質、特に、イオン化可能カチオン性脂質、例えば、本明細書に開示されるＳＭ－１０２、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、またはジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、ＬＮＰ担体／製剤は、中性脂質、ステロール（例えば、コレステロール）、および粒子の凝集を低減させることができる分子、例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ改変脂質（本明細書においてＰＥＧ化脂質とも称される）をさらに含む。追加の例示的な脂質ナノ粒子組成物およびそれを作製する方法は、例えば、Semple et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:172-176、Jayarama et al. (2012), Angew. Chem. Int. Ed., 51:8529-8533、およびMaier et al. (2013) Molecular Therapy 21:1570-1578に記載されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、「疾患」または「障害」という用語は、本明細書で使用される場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症と診断されているステータス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有することが疑われるステータス、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有する高い危険性にあるステータスを指す。一実施形態では、「疾患」または「障害」という用語は、本明細書において使用される場合、症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有すると診断されているステータス、症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有することが疑われるステータス、または症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有する高い危険性にあるステータスを指す。
一実施形態では、「疾患」または「障害」という用語は、本明細書において使用される場合、ＣＯＶＩＤ－１９、ＣＯＶＩＤ－１９を有すると診断されているステータス、ＣＯＶＩＤ－１９を有することが疑われるステータス、またはＣＯＶＩＤ－１９を有する高い危険性にあるステータスを指す。一実施形態では、「疾患」または「障害」という用語は、本明細書において使用される場合、症候性ＣＯＶＩＤ－１９、症候性ＣＯＶＩＤ－１９を有すると診断されているステータス、症候性ＣＯＶＩＤ－１９を有することが疑われるステータス、または症候性ＣＯＶＩＤ－１９を有する高い危険性にあるステータスを指す。
本明細書において使用される場合、「動物」という用語は、例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーの生きた多細胞脊椎動物生物を指す。「哺乳動物」という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカクなど）、飼育動物（例えば、イヌおよびネコ）、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、ならびに実験動物（例えば、マウス、コウモリ、ラット、ウサギ、モルモット）を含む。
「対象」、「宿主」、「個体」、および「患者」という用語は、動物、典型的には哺乳動物を指して、本明細書において互換可能に使用される。任意の好適な哺乳動物を、本明細書に記載される方法によって処置することができる。哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカクなど）、飼育動物（例えば、イヌおよびネコ）、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、ならびに実験動物（例えば、マウス、ラット、コウモリ、ウサギ、モルモット）が挙げられる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。哺乳動物は、任意の年齢または任意の発達段階（例えば、成体、１３歳～１９歳（teen）、小児、幼児、または子宮内の哺乳動物）にあり得る。哺乳動物は、雄性であっても雌性であってもよい。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、疾患を有するか、疾患を有すると診断されているか、または疾患を有することが疑われる。
本明細書において使用される場合、対象における疾患を「処置すること」またはその「処置」は、（１）疾患の素因があるか、もしくは疾患の症状をまだ呈していない対象において、症状もしくは疾患が発生するのを予防すること、（２）疾患を阻害するか、もしくはその発達を停止させること、または（３）疾患もしくは疾患の症状を緩和するか、もしくはその退縮を引き起こすことを指す。当該技術分野において理解されるように、「処置」は、臨床結果を含め、有益な結果または所望される結果を得るためのアプローチである。本技術の目的に関して、有益な結果または所望される結果としては、検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらず、１つまたは複数の症状の軽減または緩和、状態（疾患を含む）の程度の減弱、状態（疾患を含む）の安定化（すなわち、悪化しない）、状態（疾患を含む）、進行の減速または遅延、状態（疾患を含む）の緩和または一時的緩和、状態（state）、ならびに寛解（部分的であるか完全であるかを問わない）のうちの１つまたは複数を挙げることができるが、これらに限定されない。一態様では、処置は、予防を除外する。
一部の実施形態では、「処置すること」、「処置」などの用語は、本明細書において使用される場合、疾患の原因、その進行、その重症度、またはその症状のうちの１つもしくは複数を低減、緩和、または排除するように疾患を緩和すること、あるいはそれ以外では対象における疾患を有益に変化させることを意味する。患者を「処置すること」またはその「処置」への言及は、予防を含むことが意図される。処置はまた、先制的な性質であってもよく、すなわち、これには、疾患の危険性に晒されるかまたはその危険性にある対象における疾患の予防が含まれ得る。疾患の予防は、例えば、病原体への感染の予防の場合など、疾患からの完全な保護を含み得るか、または疾患進行の予防が含まれ得る。例えば、疾患の予防は、任意のレベルで疾患に関連する任意の作用の完全な喪失を意味しない場合があり、代わりに、臨床的に有意または検出可能なレベルまでの疾患の症状の予防を意味してもよい。疾患の予防はまた、疾患の後期ステージへの疾患の進行の予防も意味し得る。
「免疫応答」は、概して、外来物質に対するリンパ球の抗原特異的応答を指す。「免疫原」および「免疫原性」という用語は、免疫応答を誘起する能力を有する分子を指す。すべての免疫原は抗原であるが、しかしながら、すべての抗原が免疫原性というわけではない。本明細書に開示される免疫応答は、体液性（抗体活性を介する）、または細胞媒介性（Ｔ細胞活性化を介する）であり得る。応答は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで発生し得る。当業者であれば、タンパク質、核酸、脂肪酸、脂質、リポ多糖、および多糖を含む、様々な巨大分子が、免疫原性となる可能性を有することを理解するであろう。当業者であれば、免疫応答を誘起することができる分子をコードする核酸が、必然的に免疫原をコードすることをさらに理解するであろう。当業者であれば、免疫原が、全長分子に限定されるものではなく、部分分子を含み得ることをさらに理解するであろう。
本明細書において使用される場合、一部の実施形態では「ウイルス量」、「ウイルス力価」、「ウイルスレベル」、または「ウイルス発現」としても知られている「ウイルス負荷」は、ウイルス感染症の重症度の尺度であり、感染した生物、罹患した体液、または生物学的試料におけるウイルスの量を推定することによって計算することができる。
本明細書において使用される場合、生物学的試料または試料は、対象から得られる。例示的な試料としては、細胞試料、組織試料、生検、液体試料、例えば、前鼻孔スワブ、眼液（眼房水および硝子体液）、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、喀痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または射精前液、女性の射精（female ejaculate）、汗、涙液、嚢胞液、胸水および腹腔液、心膜液、腹水、リンパ液、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、月経、膿汁、皮脂、吐瀉物、腟分泌物／洗浄液、滑液、粘膜分泌物、便水、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞液、または臍帯血を含むがこれらに限定されない、血液ならびに生物学的起源の他の液体試料が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、試料は、上気道標本、例えば、鼻咽頭（ＮＰ）標本、中咽頭（ＯＰ）標本、中鼻甲介スワブ、前鼻孔（鼻孔スワブ）標本、または鼻咽頭洗浄液／吸引液もしくは鼻孔洗浄／吸引（ＮＷ）標本であり得る。
一部の実施形態では、試料は、血液または血液製剤（例えば、血清、血漿など）、臍帯血、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞、胃、腹腔、胆管、耳、関節鏡）、女性生殖器系洗浄液、尿、糞便、喀痰、唾液、鼻粘液、前立腺液、洗浄液、精液、リンパ液、胆汁、涙液、汗、母乳、乳房液など、またはこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない、対象由来の流体を含む。一部の実施形態では、液体生物学的試料は、血漿または血清試料である。「血液」という用語は、本明細書において使用される場合、対象に由来する血液試料または調製物を指す。この用語は、全血、血液製剤、または血液の任意の画分、例えば、従来的に定義される血清、血漿、バフィーコートなどを包含する。一部の実施形態では、「血液」という用語は、末梢血を指す。血漿は、抗凝血剤で処置した血液の遠心分離により得られる全血の画分を指す。血清は、血液試料を凝固させた後に残る流体の水様部分を指す。流体試料は、病院または診療所が一般的に準ずる標準的なプロトコールに従って採取されることが多い。血液については、適切な量の末梢血（例えば、３～４０ミリリットル）が採取されることが多く、調製の前または後に標準的な手順に従って保管され得る。
「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強させる物質または混合物を指す。非限定的な例として、アジュバントは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムホスフェート、またはジメチルジオクタデシルアンモニウムアセテート（ＤＤＡ）、ならびにマイコバクテリウムの総脂質抽出物の非極性画分または前記非極性画分の一部を含み得る（例えば、米国特許第８，２４１，６１０号を参照されたい）。別の実施形態では、合成ナノ担体は、少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびアジュバントを含み得る。非限定的な例として、アジュバントを含む合成ナノ担体は、国際公開第ＷＯ２０１１１５０２４０号および米国公開第ＵＳ２０１１０２９３７００号に記載される方法によって製剤化され得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
「接触させること」という用語は、２つまたはそれよりも多くの間の直接的または間接的な結合または相互作用を意味する。直接的な相互作用の具体的な例は、結合である。間接的な相互作用の具体的な例は、１つの実体が、中間分子に対して作用し、これが、第２の参照される実体に対して作用することである。接触させることは、本明細書において使用される場合、溶液中、固相中、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、細胞内、およびｉｎ ｖｉｖｏを含む。ｉｎ ｖｉｖｏで接触させることは、投与することまたは投与に言及し得る。
ポリヌクレオチド、ベクター、細胞もしくはベクター、または他の薬剤、およびそれを含む組成物の「投与」または「送達」は、１回の投薬において、処置の過程全体で連続的または間欠的に行われ得る。投与のもっとも有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療に使用される組成物、治療の目的、処置されている標的細胞、および処置されている対象によって変動するであろう。単回または複数回の投与は、処置医師、または動物の場合には処置獣医師によって選択される用量レベルおよびパターンで、行われ得る。一部の実施形態では、投与することまたはその文法上の変化形はまた、ある特定の間隔での１回を上回る投薬を指す。一部の実施形態では、間隔は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間であるか、またはそれよりも長い。一部の実施形態では、１回の投薬は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれよりも多い回数、繰り返される。好適な投薬量の製剤および薬剤を投与する方法は、当該技術分野において公知である。投与経路もまた決定され得、もっとも有効な投与経路を決定する方法は、当業者に公知であり、処置に使用される組成物、処置の目的、処置されている対象の健康状態または疾患ステージ、および標的細胞または組織によって変動し得る。投与経路の非限定的な例としては、吸入、筋肉内投与、鼻内投与、経口投与、腹腔内、注入、注射、および局所適用が挙げられる。好ましい実施形態では、投与経路は、吸入または筋肉内投与である。一部の実施形態では、投与は、ある特定の期間、例えば、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約２４時間、またはそれよりも長くにわたる注入（例えば、対象の末梢血への）である。
投与という用語には、限定することなく、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内、脳槽内注射もしくは注入、皮下注射、またはインプラント）、吸入スプレーによる鼻内、腟内、直腸、舌下、尿道（例えば、尿道坐剤）、または局所投与経路（例えば、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾルなど）による投与を含むものとし、それぞれの投与経路に適切な従来的な非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、およびビヒクルを含む好適な投与単位製剤において、単独でまたは一緒に、製剤化され得る。本開示は、投与経路、製剤、または投薬スケジュールによって限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、有益な結果または所望される結果を実現するのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与、適用、または投薬で投与され得る。そのような送達は、個々の投薬単位が使用される期間、治療剤のバイオアベイラビリティ、投与経路などを含む、いくつかの変数に依存する。しかしながら、任意の特定の対象に対する本明細書に開示される治療剤の具体的な用量レベルは、用いられる具体的な薬剤の活性、薬剤のバイオアベイラビリティ、投与経路、動物の年齢およびその体重、動物の全般的な健康状態、性別、食事、投与の時間、排出速度、薬物の組合せ、ならびに処置される具体的な障害の重症度および投与形態を含む様々な因子に依存することを理解されたい。一般に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて有効であることが見出される濃度と釣り合う血清レベルを達成するのに有効である薬剤の量を投与することが望ましいであろう。これらの検討事項、ならびに有効な製剤化および投与の手順は、当該技術分野において周知であり、標準的な教本に記載されている。
本明細書において使用される場合、「ＲＬ－００７」および「ＲＬ００７」という用語は、最終濃度で６．２５ｍＭのＳＭ－１０２、１．２５ｍＭのＤＳＰＣ、４．８１５ｍＭのコレステロール、および０．１８７５ｍＭのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（すなわち、５０：１０：３８：１．５のモル比）を混合することによって調製された脂質ナノ粒子製剤または混合物を指す。「ＲＬ－００７ワクチン」、「ＲＬ００７ワクチン」、「ＲＬ－００７ ｍＲＮＡワクチン」、または「ＲＬ００７ ｍＲＮＡワクチン」という用語は、ＲＬ－００７担体を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる、ワクチンを指す。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ＲＬ－００７を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
本開示を実施するための様式
ＲＮＡ
本明細書の開示は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイク（Ｓ）タンパク質またはその断片（例えば、免疫原性断片）をコードするリボ核酸（ＲＮＡ）またはＤＮＡを提供する。Ｓタンパク質または断片は、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、断片または免疫原性断片は、Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）またはその同等物、例えば、配列番号１のａａ３１９～ａａ５４１に対応する（例えば、アライメントする）断片を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、特定の内因性受容体配列に結合して標的細胞への進入を獲得する、ウイルス由来の短い免疫原性断片を指す。一部の実施形態では、ＲＢＤは、膜融合および細胞質への送達を促進するために内因性受容体と相互作用するのに必要とされる「スパイク」糖タンパク質の一部を指す。一部の実施形態では、本明細書において使用されるＲＢＤは、配列番号１のａａ３１９～ａａ５４１に記載されるポリペプチドまたはその同等物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、断片または免疫原性断片は、少なくとも約５アミノ酸長、もしくは少なくとも約８アミノ酸長、もしくは少なくとも約１０アミノ酸長、もしくは少なくとも約１５アミノ酸長、もしくは少なくとも約２０アミノ酸長、もしくは少なくとも約２５アミノ酸長、もしくは少なくとも約３０アミノ酸長、もしくは少なくとも約４０アミノ酸長、もしくは少なくとも約５０アミノ酸長、もしくは少なくとも約６０アミノ酸長、もしくは少なくとも約７０アミノ酸長、もしくは少なくとも約８０アミノ酸長、もしくは少なくとも約１００アミノ酸長、もしくは少なくとも約１２５アミノ酸長、もしくは少なくとも約１５０アミノ酸長、もしくは少なくとも約１６０アミノ酸長、もしくは少なくとも約１７０アミノ酸長、もしくは少なくとも約１８０アミノ酸長、もしくは少なくとも約１９０アミノ酸長、もしくは少なくとも約２００アミノ酸長、もしくは少なくとも約２５０アミノ酸長、もしくは少なくとも約３００アミノ酸長、またはそれよりも長く、必要に応じて、Ｓタンパク質のＲＢＤまたはその同等物を含むか、それから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。免疫原性断片は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導すること、もしくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のその受容体、例えば、ＡＣＥ２への結合を低減もしくは阻害すること、またはその両方を行うのに有用であり、非免疫原性である断片は、本明細書に提供されるアッセイにおいて対照として有用である。
一部の実施形態では、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異は、フューリン様切断部位における突然変異を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。さらなる実施形態では、フューリン様切断部位は、ＲＲＡＲ（配列番号４８）を含むか、または代替的にはそれからなるか、またはなおもさらにはそれからなる。なおもさらなる実施形態では、本明細書に開示されるＳタンパク質またはその断片におけるフューリン様切断部位は、配列番号１のアミノ酸（ａａ）６８２～ａａ６８５に対応する（例えば、アライメントする）。一部の実施形態では、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異は、配列番号１のＲ６８２に対応するアミノ酸としてのセリン（Ｓ）（Ｒ６８２Ｓ）、配列番号１のＲ６８３に対応するアミノ酸としてのＳ（Ｒ６８３Ｓ）、配列番号１のＲ６８５に対応するアミノ酸としてのグリシン（Ｇ）（Ｒ６８５Ｇ）、または配列番号１のＲ６８２に対応するアミノ酸としてのＧ（Ｒ６８２Ｇ）のうちの１つまたは複数を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異は、Ｒ６８２ＳおよびＲ６８５Ｇを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、突然変異型フューリン様切断部位は、本明細書に開示されるＳタンパク質またはその断片を安定させる。
追加として、または代替的には、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異は、配列番号１のＦ８１７（Ｆ８１７Ｐ）、配列番号１のＡ８９２（Ａ８９２Ｐ）、配列番号１のＡ８９９（Ａ８９９Ｐ）、配列番号１のＡ９４２（Ａ９４２Ｐ）、配列番号１のＫ９８６（Ｋ９８６Ｐ）、または配列番号１のＶ９８７（Ｖ９８７Ｐ）のうちのいずれか１つまたは複数（例えば、いずれか２つ、またはいずれか３つ、またはいずれか４つ、またはいずれか５つ、または６つすべて）に対応するアミノ酸としてのプロリン（Ｐ）を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異は、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、なおもさらにはそれからなる。これらの２つの突然変異は、本明細書においてＳ２Ｐと称される。一部の実施形態では、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異は、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、なおもさらにはそれからなる。これらの６つの突然変異は、本明細書において「Ｓ－ＨｅｘａＰｒｏ」または「Ｓ６Ｐ」と称される。一部の実施形態では、Ｓ２ＰまたはＳ６Ｐ突然変異を含むＳタンパク質または断片（例えば、その免疫原性断片）は、Ｓ２ＰまたはＳ６Ｐ突然変異を有さないものと比較して、以下の特性のうちの１つまたは複数を有する：ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはその両方における発現レベルの増加；例えば、室温、熱下、もしくは凍結－解凍後の高い安定性；またはタンパク質立体構造の維持。
一部の実施形態では、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異は、配列番号１のＲ６８２に対応するアミノ酸としてのセリン（Ｓ）（Ｒ６８２Ｓ）、配列番号１のＲ６８５に対応するアミノ酸としてのグリシン（Ｇ）（Ｒ６８５Ｇ）、配列番号１のＦ８１７に対応するアミノ酸としてのプロリン（Ｐ）（Ｆ８１７Ｐ）、配列番号１のＡ８９２に対応するアミノ酸としてのＰ（Ａ８９２Ｐ）、配列番号１のＡ８９９に対応するアミノ酸としてのＰ（Ａ８９９Ｐ）、配列番号１のＡ９４２に対応するアミノ酸としてのＰ（Ａ９４２Ｐ）、配列番号１のＫ９８６に対応するアミノ酸としてのＰ（Ｋ９８６Ｐ）、または配列番号１のＶ９８７に対応するアミノ酸としてのＰ（Ｖ９８７Ｐ）のうちの１つまたは複数を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
理論によって束縛されることを望むものではないが、突然変異型フューリン様切断部位およびＳ２ＰまたはＳ６Ｐ突然変異を含むＳタンパク質またはその断片は、これらの突然変異を有さないもの、突然変異型フューリン様切断部位を単独で含むもの、またはＳ２ＰもしくはＳ６Ｐを単独で含むものよりも優れた利点（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける高い発現レベル、もしくは良好な安定性、またはその両方）を示す。一部の実施形態では、両方の突然変異セットを含むことの利点は、相乗的である。
一部の実施形態では、Ｓタンパク質またはその断片は、天然に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント、例えば、アルファバリアント、ベータバリアント、デルタバリアント、またはガンマバリアントに由来する。例えば、本明細書に開示される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異を、Ｓタンパク質バリアントまたはその断片、例えば、アルファバリアント、ベータバリアント、デルタバリアント、またはガンマバリアントに操作し、それによって、突然変異型Ｓタンパク質またはその断片を得ることができる。
さらなる実施形態では、Ｓタンパク質またはその断片は、キメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に由来する。キメラＳタンパク質は、第１の天然に存在するＳバリアントのその１つもしくは複数のアミノ酸または連続するセグメントが、第２の天然に存在するＳバリアントの対応するアミノ酸または連続するセグメントで置換されたものを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、Ｓタンパク質またはその断片は、天然に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント、例えば、デルタバリアントにおいて見出される１つまたは複数の突然変異をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号１のＮ４４０に対応するアミノ酸としてのリシン（Ｋ）（Ｎ４４０Ｋ）、または配列番号１のＥ４８４に対応するアミノ酸としてのＫ（Ｅ４８４Ｋ）のうちの一方または両方を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。追加として、または代替的には、１つまたは複数の突然変異は、配列番号１のＴ１９に対応するアミノ酸としてのアルギニン（Ｒ）（Ｔ１９Ｒ）、配列番号１のＶ７０に対応するアミノ酸としてのフェニルアラニン（Ｆ）（Ｖ７０Ｆ）、配列番号１のＴ９５に対応するアミノ酸としてのイソロイシン（Ｉ）（Ｔ９５Ｉ）、配列番号１のＧ１４２に対応するアミノ酸としてのアスパラギン酸（Ｄ）（Ｇ１４２Ｄ）、配列番号１のＥ１５６に対応する欠失（Ｅ１５６Δ）、配列番号１のＦ１５７に対応する欠失（Ｆ１５７Δ）、配列番号１のＲ１５８に対応するアミノ酸としてのＧ（Ｒ１５８Ｇ）、配列番号１のＡ２２２に対応するアミノ酸としてのバリン（Ｖ）（Ａ２２２Ｖ）、配列番号１のＷ２５８に対応するアミノ酸としてのロイシン（Ｌ）（Ｗ２５８Ｌ）、配列番号１のＫ４１７に対応するアミノ酸としてのアスパラギン（Ｎ）（Ｋ４１７Ｎ）、配列番号１のＫ４１７に対応するアミノ酸としてのＲ（Ｌ４５２Ｒ）、配列番号１のＴ４７８に対応するアミノ酸としてのＫ（Ｔ４７８Ｋ）、配列番号１のＤ６１４に対応するアミノ酸としてのＧ（Ｄ６１４Ｇ）、配列番号１のＰ６８１に対応するアミノ酸としてのＲ（Ｐ６８１Ｒ）、または配列番号１のＤ９５０に対応するアミノ酸としてのＮ（Ｄ９５０Ｎ）を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、およびＤ９５０Ｎを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、およびＤ９５０Ｎを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｔ１９Ｒ、Ｖ７０Ｆ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ａ２２２Ｖ、Ｗ２５８Ｌ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、およびＤ９５０Ｎを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｔ１９Ｒ、Ｖ７０Ｆ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ａ２２２Ｖ、Ｗ２５８Ｌ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、およびＤ９５０Ｎを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、Ｓタンパク質は、配列番号５のポリペプチドまたはその同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、配列番号５の同等物は、配列番号５の突然変異、すなわち、Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ｄ９５０Ｎ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐを保持する。さらなる実施形態では、ＲＮＡまたはＤＮＡは、配列番号５をコードするポリヌクレオチドまたはその同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、Ｓタンパク質は、配列番号６のポリペプチドまたはその同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、配列番号６の同等物は、配列番号６の突然変異、すなわち、Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｒ６８２Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ｄ９５０Ｎ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐを保持する。さらなる実施形態では、ＲＮＡまたはＤＮＡは、配列番号６をコードするポリヌクレオチドまたはその同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、Ｓタンパク質は、配列番号７のポリペプチドまたはその同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、配列番号７の同等物は、配列番号７の突然変異、すなわち、Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｄ９５０Ｎ、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｒ６８２Ｓ、およびＲ６８５Ｇを保持する。さらなる実施形態では、ＲＮＡは、配列番号９のポリヌクレオチドまたはその同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、配列番号９の同等物は、配列番号７またはその同等物を依然としてコードする。
一部の実施形態では、Ｓタンパク質は、配列番号１０のポリペプチドまたはその同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、配列番号１０の同等物は、配列番号１０の突然変異、すなわち、Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｄ９５０Ｎ、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｒ６８２Ｓ、およびＲ６８５Ｇを保持する。さらなる実施形態では、ＲＮＡまたはＤＮＡは、配列番号１０をコードするポリヌクレオチドまたはその同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、Ｓタンパク質は、配列番号１１のポリペプチドまたはその同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、配列番号１１の同等物は、配列番号１１の突然変異、すなわち、Ｔ１９Ｒ、Ｖ７０Ｆ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ａ２２２Ｖ、Ｗ２５８Ｌ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｄ９５０Ｎ、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｒ６８２Ｓ、およびＲ６８５Ｇを保持する。さらなる実施形態では、ＲＮＡは、配列番号１３のポリヌクレオチドまたはその同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、配列番号１３の同等物は、配列番号１１またはその同等物を依然としてコードする。
一部の実施形態では、Ｓタンパク質は、配列番号１４のポリペプチドまたはその同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、配列番号１４の同等物は、配列番号１４の突然変異、すなわち、Ｔ１９Ｒ、Ｖ７０Ｆ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ａ２２２Ｖ、Ｗ２５８Ｌ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｄ９５０Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ４４０Ｋ、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｒ６８２Ｓ、およびＲ６８５Ｇを保持する。さらなる実施形態では、ＲＮＡは、配列番号１６のポリヌクレオチドまたはその同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、配列番号１６の同等物は、配列番号１４またはその同等物を依然としてコードする。一態様では、ＲＮＡは、配列番号５５に開示される配列またはその同等物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、配列番号９、１３、または１６のうちのいずれか１つの同等物は、同等物の全長にわたって約３５％～約７０％のＧＣ含有量からなる。
一部の実施形態では、同等物は、全長参照配列に対して、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、またはそれを上回って同一である。
一部の実施形態では、ＲＮＡは、３’ ＵＴＲをさらに含む。さらなる実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１８、２２、または２４のうちのいずれか１つを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはそれからなる。
一部の実施形態では、ＲＮＡは、５’ ＵＴＲをさらに含む。さらなる実施形態では、５’ ＵＴＲは、配列番号２０または２６を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはそれからなる。
一部の実施形態では、ＲＮＡは、ポリＡ尾部をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリＡ尾部は、配列番号２７、２８、または３０のうちのいずれか１つを含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡは、５’キャップをさらに含む。さらなる実施形態では、５’キャップは、５’ ＣｌｅａｎＣａｐを含むか、または代替的にはそれからなるか、またはなおもさらにはそれからなる。この構造は、開始用のキャッピング済み三量体を使用して、天然に存在する５’キャップ構造を得る。
一部の実施形態では、ＲＮＡは、必要に応じて５’から３’へ、５’ＵＴＲ、本明細書に開示されるＳタンパク質または断片をコードするコーディング配列、３’ＵＴＲ、およびポリＡを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはそれからなる。さらなる実施形態では、ＲＮＡは、配列番号３２または５２を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはそれからなる。
一部の実施形態では、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。これらのＲＮＡをコードするＤＮＡ分子ならびにその相補体が、さらに提供される。
一部の実施形態では、ＲＮＡは、化学的に改変されている。さらなる実施形態では、改変は、ウリジン（Ｕ）残基をＮ１－メチル－シュードウリジン残基に改変することを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはそれからなる。追加として、または代替的には、改変は、Ｕ残基をシュードウリジン残基に改変することを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはそれからなる。
一部の実施形態では、ＲＮＡの残基のうちの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれよりも高いパーセンテージが、化学的に改変されている。
一部の実施形態では、ＲＮＡのウリジン残基のうちの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれよりも高いパーセンテージが、必要に応じてＮ１－メチルシュードウリジンまたはシュードウリジンに化学的に改変されている。さらなる実施形態では、ＲＮＡにおけるウリジン残基のうちの少なくとも約５０％、または少なくとも約７０％、または約１００％が、Ｎ１－メチルシュードウリジンまたはシュードウリジンである。
一部の実施形態では、ウリジン残基のうちのすべてまたは一部が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の間にシュードウリジンによって置き換えられる。この改変は、ｍＲＮＡを細胞における酵素分解に対して安定なものにし、ｍＲＮＡの翻訳効率の増強をもたらす。使用されるシュードウリジンは、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、または当該技術分野において周知である他の改変、例えば、Ｎ６ｍ－エチルアデノシン（ｍ６Ａ）、イノシン、シュードウリジン、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシチジン（ｈｍ５Ｃ）、およびＮ１－メチルアデノシン（ｍ１Ａ）であり得る。改変は、必要に応じて、ｍＲＮＡ全体にわたって行われる。当業者であれば、他の改変されたＲＮＡ残基を使用して、タンパク質の三次元構造を安定させ、タンパク質翻訳を増加させることができることを認識するであろう。
理論によって束縛されることを望むものではないが、天然に存在するＳタンパク質をコードするＲＮＡは、エンドソームＲＮＡセンシング経路、例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８（Ｔｏｌｌ様受容体）を活性化し、それによって、自然免疫を誘導し、それにより、スパイクタンパク質の翻訳が阻害される。加えて、分泌されるＩＦＮ－βは、下流アポトーシス経路の活性化によって細胞表面上に発現される同種受容体の結合時に、腫瘍細胞死を誘起する。しかしながら、本明細書に開示される突然変異型Ｓタンパク質を発現する最適化されたＲＮＡは、この欠点を回避し、したがって、改善された翻訳効率（自然免疫）を示し、それにより、スパイクタンパク質翻訳が阻害される。一部の実施形態では、最適化されたＲＮＡを、それを必要とする対象に投与し、ｉｎ ｖｉｖｏで突然変異型Ｓタンパク質を発現させることができる。さらなる実施形態では、発現されるＳタンパク質は、対象において免疫応答を誘導することができ、それにより、本明細書に開示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症が予防または処置される。追加として、または代替的には、最適化されたＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異型Ｓタンパク質を発現し、必要に応じて、そのような発現されたＳタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫細胞を活性化し得る。次いで、活性化された免疫細胞を使用して、それを必要とする対象を処置することができる。
別の態様では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片を産生させる方法が、提供される。一部の実施形態では、本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法である。本方法は、本明細書に開示される細胞を、Ｓタンパク質またはその免疫原性断片を発現させるのに好適な条件下において培養するステップを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。さらなる実施形態では、本明細書の方法は、Ｓタンパク質またはその免疫原性断片を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、本明細書に開示される宿主細胞である。
追加として、必要に応じて対象もしくは対象の細胞またはその両方において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とその受容体、例えば、ＡＣＥ２との結合を低減または阻害する候補薬剤をスクリーニングするための方法が、提供される。本方法は、スパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片を、本明細書に開示されるＲＮＡから発現させるステップと、発現されたＳタンパク質またはその免疫原性断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体、例えば、ＡＣＥ２との間の結合を、候補薬剤の存在ありもしくはなしで、または異なる濃度の候補薬剤を用いて、測定するステップとを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、候補薬剤の存在下において発現されたＳタンパク質またはその免疫原性断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体との間の結合が、候補薬剤なしと比較して少ないことは、候補薬剤が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とその受容体との結合を低減または阻害することを示す。一部の実施形態では、候補薬剤の濃度の増加に伴って、発現されたＳタンパク質またはその免疫原性断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体との間の結合が減少することは、候補薬剤がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とその受容体との結合を低減または阻害することを示す。一部の実施形態では、Ｓタンパク質またはその免疫原性断片は、測定ステップで、宿主細胞において発現される。追加として、または代替的には、受容体、例えば、ＡＣＥ２は、測定ステップで、宿主細胞において発現される。一部の実施形態では、受容体、例えば、ＡＣＥ２は、測定ステップで宿主細胞から単離される。他の実施形態では、Ｓタンパク質またはその免疫原性断片は、測定ステップで宿主細胞から単離される。一部の実施形態では、単離されたＳタンパク質もしくはその免疫原性断片、または単離された受容体は、検出可能な標識、例えば、蛍光タンパク質をさらに含む。さらなる実施形態では、Ｓタンパク質またはその免疫原性断片と受容体との間の結合は、蛍光に基づくアッセイ、例えば、蛍光顕微鏡法または蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して行われる。
なおもさらなる態様では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片をコードするＲＮＡを選択するための方法が、提供される。本方法は、ＲＮＡを細胞に形質導入するステップと、細胞を、ＲＮＡを発現させるのに好適な条件下において培養するステップと、細胞によって分泌されたＩＦＮ－αもしくはＩＦＮ－βまたはその両方を測定するステップとを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、本方法は、野生型Ｓタンパク質またはその免疫原性断片をコードするＲＮＡと比較して、ＩＦＮ－αもしくはＩＦＮ－βまたはその両方の分泌がないか、またはＩＦＮ－αもしくはＩＦＮ－βまたはその両方の分泌が少ない場合に、ＲＮＡを選択するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＩＦＮ－αもしくはＩＦＮ－βまたはその両方は、酵素結合免疫吸着アッセイを使用して測定される。
ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、および関連する方法
一態様では、本明細書に開示されるＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、またはそれに相補的なポリヌクレオチドが、提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリッド、またはそれらのそれぞれのアナログの群から選択される。
一部の実施形態では、本開示は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質またはその免疫原性断片が、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異を含む、ポリヌクレオチドを提供する。そのようなポリヌクレオチドの非限定的な例は、配列番号５５の配列を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはそれからなる。一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異を含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、配列番号５２の配列を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはそれからなる、ポリヌクレオチドを提供する。
さらなる態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはそれからなる、ベクターが、提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５３の配列を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはそれからなるベクターである。
一部の実施形態では、ベクターは、その転写を誘導するようにポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列をさらに含む。一部の実施形態では、調節配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系における使用に好適である。さらなる実施形態では、調節配列は、プロモーターを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはそれからなる。なおもさらなる実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、必要に応じてバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｔ７プロモーター、またはＳＰ６プロモーター、またはＴ３プロモーターを含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。一部の実施形態では、Ｔ７プロモーターは、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＡ（配列番号５１）を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、調節配列は、本明細書に開示されるＲＮＡを発現させるための細胞における使用に好適である。さらなる実施形態では、調節配列は、プロモーターもしくはエンハンサーまたはその両方を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、ベクターは、その複製を誘導するようにポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列をさらに含む。さらなる実施形態では、調節配列は、以下の：複製起点もしくはプライマーアニーリング部位、プロモーター、またはエンハンサーのうちの１つまたは複数を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、またはベクターは、検出可能なマーカー、精製マーカー、または選択マーカーから選択されるマーカーをさらに含む。
一部の実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクター、必要に応じて、プラスミド、またはリポソーム、またはミセルである。一部の実施形態では、プラスミドは、配列番号３３またはその同等物を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、必要に応じて、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター、または植物ウイルスベクターである。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはベクターは、本明細書に開示されるＲＮＡを産生させる（例えば、転写または発現または複製させる）のに好適である。そのような産生は、ｉｎ ｖｉｖｏであってもｉｎ ｖｉｔｒｏであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドまたはベクターは、ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで産生または複製させるために使用することができる。そのようなＲＮＡは、次いで、必要に応じて好適な薬学的に許容される担体とともに、それを必要とする対象に投与される。代替的には、ポリヌクレオチドまたはベクターは、遺伝子療法として使用することができ、必要に応じて好適な薬学的に許容される担体とともに、それを必要とする対象に直接的に投与され得る。さらなる実施形態では、遺伝子療法は、追加として、他の予防剤または治療剤を対象に送達することができる。
別の態様では、本明細書に開示されるＲＮＡ、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、または本明細書に開示されるベクターのうちの１つまたは複数を含む、細胞。一部の実施形態では、細胞は、原核生物細胞、必要に応じて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である。一部の実施形態では、細胞は、真核生物細胞、必要に応じて、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または酵母細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ ２９３細胞もしくは２９３細胞）または２９３Ｔ細胞である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞は、本明細書に開示されるＲＮＡを産生させる（例えば、転写または発現させる）のに好適である。そのような産生は、ｉｎ ｖｉｖｏであってもｉｎ ｖｉｔｒｏであってもよい。例えば、細胞は、ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで産生させるために使用することができる。そのようなＲＮＡは、次いで、必要に応じて好適な薬学的に許容される担体とともに、それを必要とする対象に投与される。代替的には、細胞は、細胞療法として使用することができ、必要に応じて好適な薬学的に許容される担体とともに、それを必要とする対象に直接的に投与される。さらなる実施形態では、細胞療法は、追加として、他の予防剤または治療剤を対象に送達することができる。
なおも別の態様では、担体、必要に応じて、薬学的に許容される担体と、本明細書に開示されるＲＮＡ、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、または本明細書に開示される細胞のうちの１つまたは複数とを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる、組成物が、提供される。
一部の実施形態では、組成物は、追加の予防剤または治療剤をさらに含む。
一部の実施形態では、追加の予防剤または治療剤は、本明細書に開示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連疾患を予防または処置するのに好適である。さらなる実施形態では、追加の予防剤または治療剤は、抗ウイルス剤、必要に応じてレムデシビル、ロピナビル、リトナビル、イベルメクチン、タミフル、もしくはファビピラビル；抗炎症剤、必要に応じてデキサメタゾン、トシリズマブ、ケブザラ、コルクリス、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、もしくはキナーゼ阻害剤；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症から回復した対象に由来する回復期血漿、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体、必要に応じてバムラニビマブ、エテセビマブ、カシリビマブ、もしくはイムデビマブ；または抗生物質剤、必要に応じてアジスロマイシンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、追加の予防剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関連しない疾患を予防するのに好適である。例えば、追加の予防剤は、別のコロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶのワクチンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。追加として、または代替的には、追加の予防剤は、別のウイルスのワクチン、例えば、インフルエンザ（ｆｌｕ）ワクチン、パピローマウイルスワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン、ポリオワクチン、水痘ワクチン、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ロタウイルスワクチンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、追加の予防剤は、細菌または他の病原体のワクチン、例えば、ジフテリアワクチン、ヘモフィルスインフルエンザＢ型ワクチン、百日咳ワクチン、肺炎球菌ワクチン、破傷風ワクチン、または髄膜炎ワクチンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、追加の予防剤は、非感染性疾患、例えば、がんのワクチンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含む。
一態様では、本明細書に開示されるＲＮＡを産生させる方法が、提供される。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に開示される細胞を、ＲＮＡを発現および／または複製するのに好適な条件下において培養するステップを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。さらなる実施形態では、ＲＮＡは、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）ベクター送達系によって産生される。なおもさらなる実施形態では、プラスミドベクターは、ｍＲＮＡワクチン産生に適合され得る。一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＳＦＶ１、ｐｃＤＮＡ３、およびｐＴＫ１２６が挙げられ、これらはすべて、市販入手可能である。１つの固有のｍＲＮＡ発現系は、ｐＥＶＬである（Grier et al. Mol Ther Nucleic Acids. 19;5:e306 (2016)を参照されたい）。
一部の実施形態では、本方法は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたは本明細書に開示されるベクターを、ＲＮＡを発現させるのに好適な条件下において、ＲＮＡポリメラーゼ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン－５’－三リン酸（ＧＴＰ）、およびウリジン三リン酸（ＵＴＰ）または化学的に改変されたＵＴＰと接触させるステップを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡは、バクテリオファージプロモーター、ＵＴＲ、およびコーディング配列を含む線形ＤＮＡ鋳型から、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）および異なるヌクレオシドの混合物を使用して、線形ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）系において産生される。一部の実施形態では、本方法は、ＲＮＡを単離するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、本方法は、ＲＮＡを保存するステップをさらに含む。
製剤化および関連する方法
一態様では、本明細書に開示されるＲＮＡと、薬学的に許容される担体とを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる、組成物が、提供される。
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ポリマーナノ粒子を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ヒスチジン－リシンコポリマー（ＨＫＰ）を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、ＨＫＰは、配列番号３４～４７から選択される側鎖を含む。理論によって束縛されることを望むものではないが、組成物中のＲＮＡは、ナノ粒子を含まないＲＮＡと比較して、高い安定性を有する。
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、脂質をさらに含む。さらなる実施形態では、脂質は、必要に応じてイオン化可能なカチオン性脂質を含む。なおもさらなる実施形態では、カチオン性脂質は、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）もしくはジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）またはその両方を含む。一部の実施形態では、脂質は、ヘルパー脂質、コレステロール、またはＰＥＧ化脂質のうちの１つまたは複数をさらに含む。
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。さらなる実施形態では、ＬＮＰは、９－ヘプタデカニル８－｛（２－ヒドロキシエチル）［６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル］アミノ｝オクタノエート（ＳＭ－１０２）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、またはこれらのそれぞれの同等物のうちの１つまたは複数を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。なおもさらなる実施形態では、ＬＮＰは、ヘルパー脂質、コレステロール、またはＰＥＧ化脂質のうちの１つまたは複数をさらに含む。
一部の実施形態では、ヘルパー脂質は、ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、（２Ｒ）－３－（ヘキサデカノイルオキシ）－２－｛［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エノイル］オキシ｝プロピル２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＰＯＰＣ）、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のうちの１つまたは複数を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
本明細書において使用される場合、「ＲＬ－００７」および「ＲＬ００７」という用語は、最終濃度で６．２５ｍＭのＳＭ－１０２、１．２５ｍＭのＤＳＰＣ、４．８１５ｍＭのコレステロール、および０．１８７５ｍＭのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（すなわち、５０：１０：３８：１．５のモル比）を混合することによって調製されたイオン化可能脂質同等物を指す。「ＲＬ－００７ワクチン」、「ＲＬ００７ワクチン」、「ＲＬ－００７ ｍＲＮＡワクチン」、または「ＲＬ００７ ｍＲＮＡワクチン」という用語は、ＲＬ－００７担体を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる、ワクチンを指す。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ＲＬ－００７を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、コレステロールは、植物性コレステロールもしくは動物性コレステロールまたはその両方を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（Ｒ－３－［（ω－メトキシ－ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン）、ＰＥＧ－ＤＳＧ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＧ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール）、必要に応じて、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（phophoethanolamine）－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００）］、またはＰＥＧ－ＤＰＧ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）のうちの１つまたは複数を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
さらなる態様では、本明細書に開示されるＲＮＡとＨＫＰとを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる組成物を産生させる方法が、提供される。本方法は、ＲＮＡを、ＨＫＰと接触させるステップであって、それによって、ＲＮＡおよびＨＫＰが、ナノ粒子へと自己アセンブルするステップを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、接触させるステップにおけるＨＫＰおよびＲＮＡの質量比は、約１０：１～約１：１０、例えば、それらの間の任意の範囲または比、例えば、約５：１～１：５、約５：１～１：１、約１０：１、約９．５：１、約９：１、約８．５：１、約８：１、約７．５：１、約７：１、約６．５：１、約６：１、約５．５：１、約５：１、約４．５：１、約４：１、約３．５：１、約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．５：１、約１：１、約１：１．５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：４．５、約１：５、約１：５．５、約１：６、約１：６．５、約１：７、約１：７．５、約１：８、約１：８．５、約１：９、約１：９．５、または約１：１０である。一実施形態では、接触させるステップにおけるＨＫＰおよびＲＮＡの質量比は、約２．５：１である。別の実施形態では、接触させるステップにおけるＨＫＰおよびＲＮＡの質量比は、約４：１である。
一部の実施形態では、本方法は、ＨＫＰおよびＲＮＡをカチオン性脂質と接触させるステップをさらに含む。さらなる実施形態では、カチオン性脂質は、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）もしくはＤＯＴＡＰ（ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニオ）プロパンまたはその両方を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。なおもさらなる実施形態では、接触させるステップにおけるカチオン性脂質およびＲＮＡの質量比は、約１０：１～約１：１０、例えば、それらの間の任意の範囲または比、例えば、約５：１～１：５、約５：１～１：１、約１０：１、約９．５：１、約９：１、約８．５：１、約８：１、約７．５：１、約７：１、約６．５：１、約６：１、約５．５：１、約５：１、約４．５：１、約４：１、約３．５：１、約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．５：１、約１：１、約１：１．５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：４．５、約１：５、約１：５．５、約１：６、約１：６．５、約１：７、約１：７．５、約１：８、約１：８．５、約１：９、約１：９．５、または約１：１０である。一実施形態では、接触させるステップにおけるＲＮＡおよびカチオン性脂質の質量比は、約１：１である。したがって、接触させるステップにおけるＨＫＰ、ＲＮＡ、およびカチオン性脂質の質量比は、ＨＫＰおよびＲＮＡの比、ならびにＲＮＡおよびカチオン性脂質の比に基づいて計算することができる。例えば、ＨＫＰのＲＮＡに対する比が、約４：１であり、カチオン性脂質に対するＲＮＡの比が約１：１である場合、ＨＫＰのＲＮＡ、カチオン性脂質に対する比は、約４：１：１である。
一実施形態では、ＨＫＰ（＋Ｈ）ストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、ヌクレアーゼ不含水において調製した。濃縮したストック溶液を、水中で２．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。ｍＲＮＡ作業溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を、１ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）において調製した。マイクロ流体を使用して２．５ｍｇ／ｍＬのＨＫＰ（＋Ｈ）および１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡを等体積で混合することによって、ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスを形成した。ＨＫＰ（＋Ｈ）のｍＲＮＡに対する質量比は、２．５：１である。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスを、使用前に室温で３０分間インキュベートした。すべてのペプチドに基づくポリプレックスの調製について、そのトランスフェクションまたは注射の前に、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を用いてサイズを判定した。
一部の実施形態では、医薬は、いずれもカチオン性脂質（例えば、本明細書に開示されるもののうちの１つもしくは複数）、ヘルパー脂質（例えば、本明細書に開示されるもののうちの１つもしくは複数）、コレステロール（例えば、本明細書に開示されるもののうちの１つもしくは複数）、およびＰＥＧ化脂質（例えば、本明細書に開示されるもののうちの１つもしくは複数）を含む、ポリマーナノ粒子または脂質ナノ粒子を含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。さらなる実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ＨＫＰをさらに含む。一部の実施形態では、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質の質量比は、約１：１：１：１：１である。
一部の実施形態では、カチオン性脂質およびヘルパー脂質の質量比は、約１０：１～約１：１０、例えば、それらの間の任意の範囲または比、例えば、約５：１～１：５、約５：１～１：１、約１０：１、約９．５：１、約９：１、約８．５：１、約８：１、約７．５：１、約７：１、約６．５：１、約６：１、約５．５：１、約５：１、約４．５：１、約４：１、約３．５：１、約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．５：１、約１：１、約１：１．５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：４．５、約１：５、約１：５．５、約１：６、約１：６．５、約１：７、約１：７．５、約１：８、約１：８．５、約１：９、約１：９．５、または約１：１０である。一実施形態では、カチオン性脂質およびヘルパー脂質の質量比は、約１：１である。
一部の実施形態では、カチオン性脂質およびコレステロールの質量比は、約１０：１～約１：１０、例えば、それらの間の任意の範囲または比、例えば、約５：１～１：５、約５：１～１：１、約１０：１、約９．５：１、約９：１、約８．５：１、約８：１、約７．５：１、約７：１、約６．５：１、約６：１、約５．５：１、約５：１、約４．５：１、約４：１、約３．５：１、約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．５：１、約１：１、約１：１．５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：４．５、約１：５、約１：５．５、約１：６、約１：６．５、約１：７、約１：７．５、約１：８、約１：８．５、約１：９、約１：９．５、または約１：１０である。一実施形態では、カチオン性脂質およびコレステロールの質量比は、約１：１である。
一部の実施形態では、カチオン性脂質およびＰＥＧ化脂質の質量比は、約１０：１～約１：１０、例えば、それらの間の任意の範囲または比、例えば、約５：１～１：５、約５：１～１：１、約１０：１、約９．５：１、約９：１、約８．５：１、約８：１、約７．５：１、約７：１、約６．５：１、約６：１、約５．５：１、約５：１、約４．５：１、約４：１、約３．５：１、約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．５：１、約１：１、約１：１．５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：４．５、約１：５、約１：５．５、約１：６、約１：６．５、約１：７、約１：７．５、約１：８、約１：８．５、約１：９、約１：９．５、または約１：１０である。一実施形態では、カチオン性脂質およびＰＥＧ化脂質の質量比は、約１：１である。
カチオン性脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質の質量比は、本明細書に開示されるカチオン性脂質およびヘルパー脂質、カチオン性脂質およびコレステロール、ならびにカチオン性脂質およびＰＥＧ化脂質の比に基づいて、当業者によって計算され得る。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＭ－１０２、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一実施形態では、ＳＭ－１０２、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ２００－ＤＭＧの質量比は、約１：１：１：１である、ならびに／またはＳＭ－１０２、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ２０００－ＤＭＧのモル比は、約５０：１０：３８．５：１．５である。
一部の実施形態では、本明細書に提供される質量比は、別のパラメーター、例えば、モル比、総重量に対する重量パーセンテージ、総体積に対する成分の重量、または総モル量に対するモルパーセンテージで置き換えられてもよい。成分およびその分子量が判明していれば、当業者であれば、質量比をモル比または他の同等なパラメーターに変換することは困難ではないであろう。
さらなる態様では、本明細書に開示されるＲＮＡとＬＮＰとを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる組成物を産生させる方法が、提供される。本方法は、ＲＮＡを、ＬＮＰと接触させるステップであって、それによって、ＲＮＡおよびＬＮＰが、ナノ粒子へと自己アセンブルするステップを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、接触させるステップは、必要に応じてスリットインターディジタルマイクロミキサーまたはジグザグヘリンボーン（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅ）マイクロミキサー（ＳＨＭ）から選択される、マイクロ流体ミキサーにおいて行われる。一実施形態では、マイクロ流体ミキサーは、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｉｇｎｉｔｅである。
一部の実施形態では、組成物は、追加の予防剤または治療剤、例えば、本明細書に開示されるものをさらに含む。本明細書において使用される場合、「予防剤または治療剤」という用語は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）、化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合性部分、組成物、ベクター、抗原、宿主細胞、ならび／または抗原、宿主細胞、および／もしくは追加の治療剤（例えば、製剤）を含む任意の薬学的に許容される組成物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。一部の実施形態では、追加の予防剤または治療剤は、本明細書に開示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連疾患を予防または処置するのに好適である。一部の実施形態では、追加の予防剤または治療剤は、抗ウイルス剤、ワクチン、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン接種、予防、および処置のための有効用量の核酸を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、追加の予防剤または治療剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然に存在するバリアント、例えば、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、および／またはオミクロンバリアントを予防または処置するのに好適である。一部のさらなる実施形態では、追加の予防剤または治療剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然に存在するバリアントおよびその子孫系統を予防または処置するのに好適である。本明細書において使用される場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然に存在するバリアントの子孫系統は、共通の祖先を有する緊密に関連するウイルスの群であり、これらのすべてが、ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然に存在するバリアントの子孫系統としては、アルファＢ．１．１．７およびＱ系統、ベータＢ．１．３５１、ガンマＰ．１、デルタＢ．１．６１７．２およびＡＹ系統、イプシロンＢ．１．４２７およびＢ．１．４２９、イータＢ．１．５２５、イオタＢ．１．５２６、カッパＢ．１．６１７．１、ミューＢ．１．６２１、Ｂ．１．６２１．１、ゼータＰ．２、ならびに／またはオミクロンＢ．１．１．５２９、ＢＡ．１、ＢＡ．１．１、ＢＡ．２、ＢＡ．３、ＢＡ．４、およびＢＡ．５系統が挙げられるが、これらに限定されない。
さらなる実施形態では、追加の予防剤または治療剤は、抗ウイルス剤、必要に応じてレムデシビル、ロピナビル、リトナビル、イベルメクチン、タミフル、もしくはファビピラビル；抗炎症剤、必要に応じてデキサメタゾン、トシリズマブ、ケブザラ、コルクリス、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、もしくはキナーゼ阻害剤；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症から回復した対象に由来する回復期血漿、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体、必要に応じてバムラニビマブ、エテセビマブ、カシリビマブ、もしくはイムデビマブ；または抗生物質剤、必要に応じてアジスロマイシンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、追加の予防剤または治療剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関連しない疾患を予防するのに好適である。例えば、追加の予防剤または治療剤は、別のコロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶのワクチンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。追加として、または代替的には、追加の予防剤または治療剤は、別のウイルスのワクチン、例えば、インフルエンザ（ｆｌｕ）ワクチン、パピローマウイルスワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン、ポリオワクチン、水痘ワクチン、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ロタウイルスワクチンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、追加の予防剤または治療剤は、細菌または他の病原体のワクチン、例えば、ジフテリアワクチン、ヘモフィルスインフルエンザＢ型ワクチン、百日咳ワクチン、肺炎球菌ワクチン、破傷風ワクチン、または髄膜炎ワクチンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、追加の予防剤または治療剤は、非感染性疾患、例えば、がんのワクチンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
処置の方法
一態様では、本明細書に開示される疾患を予防または処置するための方法が、提供される。追加として、または代替的には、（ａ）対象が症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有するのを予防すること、（ｂ）対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の後に入院するのを予防すること、（ｃ）対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染後に集中治療（例えば、集中治療室（ＩＣＵ））もしくは人工呼吸器またはその両方を必要とするのを予防すること、（ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答の誘導を、それを必要とする対象において行うこと、（ｅ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２もしくはそのＳタンパク質とその受容体、例えば、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）との結合の低減を、それを必要とする対象において行うこと、（ｆ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象を処置すること、または（ｇ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷の低減を、それを必要とする対象において行うことのうちの１つまたは複数を行う方法が、提供される。
宿主中和抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはそのＳタンパク質とその受容体、例えば、ＡＣＥ２との結合を遮断し、ウイルスの中和、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷の減少をもたらす。ウイルス負荷は、ウイルス感染症の重症度の尺度であり、感染した生物、罹患した体液、または生物学的試料におけるウイルスの量を推定することによって直接的に計算することができる。ウイルス負荷の定量は、一般に、プラーク低減中和アッセイ（ＰＲＮＴ）を利用することによって行うことができる。ＰＲＮＴは、ウイルスを中和し、それにより、ウイルスが細胞の単層におけるプラークの形成を引き起こすことを予防する、特定の抗体の能力を利用した、血清学的試験である。このアッセイは、一定量のウイルスを、試験されている血清標本の希釈物と混合し、続いて、混合物を、個々のウイルスに適切な細胞株の細胞に播種することを伴う。プラーク形成単位の濃度は、数日後に形成されたプラークの数によって決定することができる。プラークの可視化のために色素が添加され、個々のプレートにおけるプラークの数を、もともとのビリオンの数で除算して、中和パーセンテージを計算する。ウイルスに応じて、プラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）は、顕微鏡観察、蛍光抗体、または感染した細胞と反応する特異的色素によって測定される。中和力価は、陰性対照血清と比べて、ｐ．ｆ．ｕ．（プラーク形成単位）に５０％を上回る低減（ＰＲＮＴ５０）または９０％を上回る低減（ＰＲＮＴ９０）をもたらしたもっとも低い希釈の逆数として計算することができる。２つの完全にワクチン接種した対象から採取した血清およびワクチン接種していない対象に由来する血清を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用することができる。
対象において誘導される免疫応答は、したがって、中和抗体力価の増加、脾細胞Ｔｈ１－サイトカインレベル（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α）およびＴｈ２－サイトカインレベル（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３）の増加の誘導、ならびに／またはウイルス負荷の減少の誘導を含む。本開示は、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、対象に、本明細書に開示される有効用量のＲＮＡ、またはポリヌクレオチド、またはベクター、または細胞、または組成物を投与し、それによって、対象において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に特異的な免疫応答を誘導するステップを含み、ここで、対象における中和抗体力価は、ワクチン接種後に、非ワクチン接種対象における中和抗体力価と比べて増加する。一部の実施形態では、対象における中和抗体力価は、ワクチン接種後に、非ワクチン接種対象における中和抗体力価と比べて、１対数から１０対数増加する。一部の実施形態では、対象における中和抗体力価は、ワクチン接種後に、非ワクチン接種対象における中和抗体力価と比べて、１対数、２対数、３対数、４対数、５対数、または１０対数増加する。
他の実施形態では、免疫応答は、対象における脾細胞Ｔｈ１－サイトカインレベル（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α）およびＴｈ２－サイトカインレベル（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３）を測定することによって評価される。一部の実施形態では、本方法は、対象に、本明細書に開示される有効用量のＲＮＡ、またはポリヌクレオチド、またはベクター、または細胞、または組成物を投与し、それによって、対象において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に特異的な免疫応答を誘導するステップを含み、ここで、対象における脾細胞Ｔｈ１－サイトカインレベル（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α）および／またはＴｈ２－サイトカインレベル（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３）は、ワクチン接種後に、非ワクチン接種対象における中和抗体力価と比べて増加する。
本方法は、対象に、必要に応じて有効量の、本明細書に開示されるＲＮＡ、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される細胞、または本明細書に開示される組成物のうちの１つまたは複数を投与するステップを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、本方法は、処置を、それを必要とする対象において行うステップ、例えば、対象に、追加の予防剤または治療剤を投与するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、追加の予防剤または治療剤は、本明細書に開示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連疾患を予防または処置するのに好適である。さらなる実施形態では、追加の予防剤または治療剤は、抗ウイルス剤、必要に応じてレムデシビル、ロピナビル、リトナビル、イベルメクチン、タミフル、もしくはファビピラビル；抗炎症剤、必要に応じてデキサメタゾン、トシリズマブ、ケブザラ、コルクリス、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、もしくはキナーゼ阻害剤；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症から回復した対象に由来する回復期血漿、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体、必要に応じてバムラニビマブ、エテセビマブ、カシリビマブ、もしくはイムデビマブ；または抗生物質剤、必要に応じてアジスロマイシンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、追加の予防剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関連しない疾患を予防するのに好適である。例えば、追加の予防剤は、別のコロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶのワクチンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。追加として、または代替的には、追加の予防剤は、別のウイルスのワクチン、例えば、インフルエンザ（ｆｌｕ）ワクチン、パピローマウイルスワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン、ポリオワクチン、水痘ワクチン、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ロタウイルスワクチンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、追加の予防剤は、細菌または他の病原体のワクチン、例えば、ジフテリアワクチン、ヘモフィルスインフルエンザＢ型ワクチン、百日咳ワクチン、肺炎球菌ワクチン、破傷風ワクチン、または髄膜炎ワクチンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。一部の実施形態では、追加の予防剤は、非感染性疾患、例えば、がんのワクチンを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
一部の実施形態では、対象は、ＲＮＡまたは組成物が投与されるときに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有さない。一部の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症は、従来的な方法、例えば、核酸増幅試験（ＮＡＡＴ）、抗原試験、または抗体試験を使用して診断することができる。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、または等温増幅（例えば、ニッキングエンドヌクレアーゼ増幅反応（ＮＥＡＲ）、転写に媒介される増幅（ＴＭＡ）、ループに媒介される等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）、もしくは鎖置換増幅（ＳＤＡ））を含むがこれらに限定されない、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮＡＡＴは、ウイルスの遺伝子材料を含むＲＮＡ（リボ核酸）配列を特異的に特定する。抗原試験は、現在のウイルス感染を意味する特定のウイルス抗原の存在を検出するイムノアッセイである。さらなる詳細は、www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/resources/antigen-tests-guidelines.html（２０２１年８月１日にアクセス）で入手可能である。抗体または血清学試験は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と闘う血液中の抗体を探し、過去の感染またはワクチン接種の成功を示すために一般的に使用されている。しかしながら、ＩｇＭ抗体は、感染後数週間から数ヶ月間持続し得るとはいえ、その持続は、ＩｇＧよりも短いとみられており、したがって、ＩｇＭの検出は、比較的最近の感染を示唆し得る。さらなる詳細は、www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/resources/antibody-tests-guidelines.html（２０２１年８月１日にアクセス）で入手可能である。
一部の実施形態では、対象は、本明細書に開示される疾患、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有する危険性にある。一部の実施形態では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されていない。一部の実施形態では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露される危険性にある。
一部の実施形態では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した後に、他者よりも重症となる可能性が高い。例えば、それらは、感染後に、入院、集中治療、もしくは人工呼吸器を必要とし得るか、または死亡し得る。一部の実施形態では、対象は、６５歳を上回る。一部の実施形態では、対象は、４５歳を上回る。一部の実施形態では、対象は、以下の医学的状態：がん、慢性腎臓疾患、慢性肺疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息（中等度から重度）、間質性肺疾患、嚢胞性線維症、もしくは肺高血圧症）、認知症もしくは他の神経学的状態、糖尿病（１型もしくは２型）、ダウン症候群、心臓状態（例えば、心不全、冠動脈疾患、心筋症、もしくは高血圧症）、ＨＩＶ感染症、免疫不全状態（免疫系の脆弱化）、肝臓疾患、体重超過、肥満、妊娠、鎌状細胞疾患、サラセミア、喫煙（現在もしくは以前）、固形器官もしくは血液幹細胞移植、卒中もしくは脳血管疾患（例えば、脳への血流に影響を及ぼすもの）、または物質乱用障害のうちの１つまたは複数を有する。
一部の実施形態では、投与は、吸入によるものである。さらなる実施形態では、ＲＮＡまたは組成物は、投与の前または最中に、ネブライザー吸入システムによって霧化される。なおもさらなる実施形態では、ネブライザーシステムは、全気道薬物送達のための持ち運び可能なネブライザーである。
一部の実施形態では、投与は、皮下注射によるものである。一部の実施形態では、投与は、筋肉内注射によるものである。一部の実施形態では、投与は、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によるものである。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、エアロゾル、分散液、溶液、または懸濁液の形態であってもよく、吸入、筋肉内、経口、舌下、頬側、非経口、鼻内、皮下、皮内、または局所投与のために製剤化され得る。本明細書において使用される非経口という用語は、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、もまたは髄腔内注射または注入技法などを含む。
本明細書において使用される場合、本明細書に開示されるＲＮＡ、またはポリヌクレオチド、またはベクター、または細胞、または組成物の有効用量は、投与しようとする対象において防御免疫応答を生じるのに必要とされる用量である。本文脈における防御免疫応答とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはそのシュードウイルスでチャレンジした対象において疾患を予防または軽減するものである。本明細書に開示されるＲＮＡ、またはポリヌクレオチド、またはベクター、または細胞、または組成物は、１回または複数回、投与され得る。ワクチンに対する免疫応答の最初の測定は、ＲＮＡ、またはポリヌクレオチド、またはベクター、または細胞、または組成物を受容する対象における抗体の産生を測定することによって行われ得る。この様式で抗体産生を測定する方法はまた、当該技術分野において周知であり、疾患状態を予防する、その発生を阻害する、またはそれを処置する（症状をある程度、好ましくは、症状のすべてを、軽減する）ために必要とされる用量である。薬学的有効用量は、疾患のタイプ、使用される組成物、投与経路、処置されている哺乳動物のタイプ、考慮されている具体的な哺乳動物の身体的特徴、併用医薬、および医学の当業者が認識するであろう他の因子に依存する。一般に、製剤化された組成物の効力に応じて、１日につき体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ～１００ｍｇの量の活性成分が投与される。一部の実施形態では、有効用量の本明細書に開示されるＲＮＡ、またはポリヌクレオチド、またはベクター、または細胞、または組成物は、２回投与される。一部の実施形態では、有効用量の本明細書に開示されるＲＮＡ、またはポリヌクレオチド、またはベクター、または細胞、または組成物は、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、少なくとも４２日間、少なくとも４９日間、少なくとも５６日間、または少なくとも６４日間の間隔で、２回投与される。
さらなる態様では、本明細書に開示されるＲＮＡ、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、または本明細書に開示される組成物と、ネブライザーとを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる、吸入システムが、提供される。さらなる実施形態では、ネブライザーは、全気道薬物送達のための持ち運び可能なネブライザーである。
一部の実施形態では、ＲＮＡ組成物は、所望される治療作用または予防作用を得るために、１日につき対象の体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投薬量レベルで、１日、１週間、または１ヶ月などに１回または複数回、投与され得る。所望される投薬量は、１日に３回、１日に２回、１日に１回、１日おき、３日ごと、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、２ヶ月ごと、３ヶ月ごと、６ヶ月ごとなどで送達され得る。ある特定の実施形態では、所望される投薬量は、複数回投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれよりも多くの投与）を使用して送達され得る。複数回投与が用いられる場合、分割投薬レジメン、例えば、本明細書に記載されるものが、使用され得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ組成物は、０．０００５ｍｇ／ｋｇ～０．０１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ～約０．００７５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００３ｍｇ／ｋｇ、約０．００４ｍｇ／ｋｇまたは約０．００５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投薬量レベルで投与され得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ組成物は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．５００ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．７５０ｍｇ／ｋｇ、または０．０２５ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投薬量レベルで、１回または２回（またはそれよりも多い回数）投与され得る。
一部の実施形態では、ＲＮＡ組成物は、有効投薬量レベルで投与され得る。本明細書に提供されるＲＮＡの有効用量は、単回用量または複数回（例えば、ブースター）用量として投与される、約１０μｇ～５００ｐｇの範囲に及び得る。一部の実施形態では、単回用量のワクチン組成物（例えば、１回、２回、３回、またはそれよりも多い回数投与される）は、約１０μｇのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、単回用量のワクチン組成物（例えば、１回、２回、３回、またはそれよりも多い回数投与される）は、約２０μｇのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、単回用量のワクチン組成物（例えば、１回、２回、３回、またはそれよりも多い回数投与される）は、約３０μｇのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、単回用量のワクチン組成物（例えば、１回、２回、３回、またはそれよりも多い回数投与される）は、約４０μｇのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、単回用量のワクチン組成物（例えば、１回、２回、３回、またはそれよりも多い回数投与される）は、約５０μｇのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、単回用量のワクチン組成物（例えば、１回、２回、３回、またはそれよりも多い回数投与される）は、約１００μｇのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、単回用量のワクチン組成物（例えば、１回、２回、３回、またはそれよりも多い回数投与される）は、少なくとも２５ｐｇのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、単回用量のワクチン組成物（例えば、１回、２回、３回、またはそれよりも多い回数投与される）は、１００μｇ未満のＲＮＡを含む。一部の実施形態では、単回用量のワクチン組成物（例えば、１回、２回、３回、またはそれよりも多い回数投与される）は、１００μｇまたはそれ未満のＲＮＡを含む。一部の実施形態では、単回用量のワクチン組成物（例えば、１回、２回、３回、またはそれよりも多い回数投与される）は、約２５０μｇのＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、対象に投与されるＲＮＡの総量は、約１０μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約２００μｇ、約２５０μｇ、または約５００μｇのｍＲＮＡである。一部の実施形態では、対象に投与されるＲＮＡの総量は、約５０μｇである。一部の実施形態では、対象に投与されるＲＮＡの総量は、約１００μｇである。一部の実施形態では、対象に投与されるＲＮＡの総量は、約２５０μｇである。一部の実施形態では、対象に投与されるＲＮＡの総量は、約５００μｇである。
一部の実施形態では、ＲＮＡ組成物は、０．０１００ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．０７５ｍｇ、０．１００ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．１５０ｍｇ、０．１７５ｍｇ、０．２００ｍｇ、０．２２５ｍｇ、０．２５０ｍｇ、０．２７５ｍｇ、０．３００ｍｇ、０．３２５ｍｇ、０．３５０ｍｇ、０．３７５ｍｇ、０．４００ｍｇ、０．４２５ｍｇ、０．４５０ｍｇ、０．４７５ｍｇ、０．５００ｍｇ、０．５２５ｍｇ、０．５５０ｍｇ、０．５７５ｍｇ、０．６００ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．６５０ｍｇ、０．６７５ｍｇ、０．７００ｍｇ、０．７２５ｍｇ、０．７５０ｍｇ、０．７７５ｍｇ、０．８００ｍｇ、０．８２５ｍｇ、０．８５０ｍｇ、０．８７５ｍｇ、０．９００ｍｇ、０．９２５ｍｇ、０．９５０ｍｇ、０．９７５ｍｇ、または１．０ｍｇの総用量で、またはその総用量を送達するのに十分な投薬量レベルで、２回（例えば、０日目および７日目、０日目および１４日目、０日目および２１日目、０日目および２８日目、０日目および６０日目、０日目および９０日目、０日目および１２０日目、０日目および１５０日目、０日目および１８０日目、０日目および３ヶ月後、０日目および６ヶ月後、０日目および９ヶ月後、０日目および１２ヶ月後、０日目および１８ヶ月後、０日目および２年後、０日目および５年後、または０日目および１０年後に）投与され得る。より高いおよび低い投薬量および頻度の投与が、本開示に包含される。例えば、ＲＮＡ組成物は、３回または４回投与されてもよい。
キット
一態様では、本明細書に開示される方法において使用するためのキットが、提供される。
一部の実施形態では、キットは、使用のための説明書と、本明細書に開示されるＲＮＡ、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される組成物、または本明細書に開示される吸入システムのうちの１つまたは複数とを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。さらなる実施形態では、キットは、本明細書に開示される処置の方法における使用に好適である。
一部の実施形態では、キットは、使用のための説明書と、本明細書に開示されるＲＮＡ、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される細胞、または本明細書に開示される組成物のうちの１つまたは複数と、ＨＫＰ、または脂質、必要に応じてカチオン性脂質とを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。さらなる実施形態では、キットは、本明細書に開示されるＲＮＡまたは組成物を産生させる方法における使用に好適である。
一部の実施形態では、キットは、使用の説明書、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはベクター、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰもしくは化学的に改変されたＵＴＰを含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。さらなる実施形態では、キットは、本明細書に開示されるＲＮＡまたは組成物を産生させるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法における使用に好適である。
以下の実施例は、本開示の一部の実施形態を示すために含まれる。しかしながら、当業者であれば、本開示を踏まえて、開示されている特定の実施形態において、多数の変化が行われてもよく、依然として本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解するはずである。
（実施例１）
ＲＮＡ合成：
本明細書に開示される被試験ＲＮＡを、例えば、本明細書に開示されるベクターおよび当業者には利用可能なＩＶＴキット（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７転写キット）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって合成し、次いで、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１６％のエタノール、およびセルロース繊維を含むエタノール含有クロマトグラフィー緩衝液におけるセルロースへのｄｓＲＮＡの選択的な結合、ならびに遠心分離によって精製した。ｄｓＲＮＡのうちのほぼ９０％を、この手順後に除去することができた。例えば、Baiersdorfer et.al, 2019, Mol Ther Nucleic Acids. 2019 Apr 15;15:26-35を参照されたい。混入物質はまた、ＦＰＬＣおよびＨＰＬＣを使用して排除することもでき、例えば、Kariko et.al, 2011, Nucleic Acids Res. 2011 Nov;39(21):e142を参照されたい。
（実施例２）
ペプチド（ＨＫポリマー）の調製
ＨＫペプチドポリマーを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄのバイオポリマーコア施設がＲａｉｎｉｎ Ｖｏｙａｇｅｒ合成装置（Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）で合成した。
（実施例３）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ製剤の調製
ＰＮＩ－Ｇｅｎｖｏｙ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤：脂質ナノ粒子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方のアッセイにおいてＰＮＩ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｃａｎａｄａ）を陽性対照として用いてＧｅｎＶｏｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用して製剤化した。
ＨＫＰ（＋Ｈ）製剤バージョン１：ＨＫＰ（＋Ｈ）ストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、ヌクレアーゼ不含水において調製した。濃縮したストック溶液を、水中で２．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。ｍＲＮＡ作業溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を、１ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）において調製した。マイクロ流体を使用して２．５ｍｇ／ｍＬのＨＫＰ（＋Ｈ）および１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡを等体積で混合することによって、ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスを形成した。ＨＫＰ（＋Ｈ）のｍＲＮＡに対する質量比は、２．５：１である。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスを、使用前に室温で３０分間インキュベートした。すべてのペプチドに基づくポリプレックスの調製について、そのトランスフェクションまたは注射の前に、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を用いてサイズを判定した。
ＨＫＰ（＋Ｈ）製剤バージョン２：ＨＫＰ（＋Ｈ）ストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、ヌクレアーゼ不含水において調製した。濃縮したストック溶液を、水中で４ｍｇ／ｍＬに希釈した。ｍＲＮＡ作業溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を、１ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）において調製した。４ｍｇ／ｍＬのＨＫＰ（＋Ｈ）および１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡを等体積で混合することによって、ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスを形成した。ＨＫＰ（＋Ｈ）のｍＲＮＡに対する質量比は、４：１である。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスを、使用前に室温で３０分間インキュベートした。それぞれのペプチドに基づくポリプレックスのサイズを、トランスフェクションまたは注射の前に、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で判定した。
ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＤＯＴＡＰ製剤（ＤＯＴＡＰを後混合）：ＨＫＰ（＋Ｈ）ストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、ヌクレアーゼ不含水において調製した。濃縮したストック溶液を、水中で４ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＤＯＴＡＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）は、水性緩衝化溶液中１ｍｇ／ｍＬである。ｍＲＮＡ作業溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を、１ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）において調製した。まず、４ｍｇ／ｍＬのＨＫＰ（＋Ｈ）および１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡを等体積で混合することによって、ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスを形成した。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスを、室温で３０分間インキュベートした。次に、ＨＫＰ（＋Ｈ）溶液と同じ体積のＤＯＴＡＰを、ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスに添加した。ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＤＯＴＡＰのｍＲＮＡに対する質量比は、４：１：１であった。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＤＯＴＡＰナノ粒子を、使用前に室温で３０分間インキュベートした。
ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＭＣ３またはＨＫＰ（＋Ｈ）／ＤＯＴＡＰ製剤（ＭＣ３またはＤＯＴＡＰを事前混合）：ＨＫＰ（＋Ｈ）ストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、ヌクレアーゼ不含水において調製した。濃縮したストック溶液を、水中で４ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＤＯＴＡＰまたはＭＣ３は、水性緩衝化溶液中１ｍｇ／ｍＬである。ｍＲＮＡ作業溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を、１ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）において調製した。等体積のＨＫＰ（＋Ｈ）およびＭＣ３を、４：１の質量比で事前混合し、ＨＫＰ（＋Ｈ）溶液と同じ体積のｍＲＮＡを、事前混合したＨＫＰ（＋Ｈ）／ＭＣ３に添加した。事前混合した４ｍｇ／ｍＬのＨＫＰ（＋Ｈ）／１ｍｇ／ｍＬのＭＣ３および１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡを混合することによって、ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＭＣ３ナノ粒子を形成した。ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＭＣ３のｍＲＮＡに対する質量比は、４：１：１である。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＭＣ３ナノ粒子を、使用前に室温で３０分間インキュベートした。
ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＰＬＡ ＮＰ製剤：ＨＫＰ（＋Ｈ）ストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、ヌクレアーゼ不含水において調製した。濃縮したストック溶液を、水中で４ｍｇ／ｍＬに希釈した。ポリ－Ｌ－乳酸（ＰＬＡ）ナノ粒子（５ｍｇ／ｍＬ）を、水中において調製した。ｍＲＮＡ作業溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を、１ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）において調製した。等体積のＨＫＰ（＋Ｈ）およびｍＲＮＡを、４：１の質量比で混合した。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスを、室温で３０分間インキュベートし、次いで、ＨＫＰ（＋Ｈ）溶液と同じ体積のＰＬＡナノ粒子を、ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ナノ粒子に添加し、ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスがＰＬＡナノ粒子の表面上に吸着されるようにした。ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＰＬＡのｍＲＮＡに対する質量比は、４：５：１であった。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＰＬＡナノ粒子を、使用前に室温で３０分間インキュベートした。
表6: 脂質およびRNA作業溶液を、以下の表に従って調製した。
簡単に述べると、作業範囲を、７０％エタノールで十分に清浄した。それぞれの脂質の４倍ストック溶液を、１００％エタノール中で作製し、使用まで－２０℃で保管した。脂質作業溶液を、以下の成分のそれぞれを、１：１：１：１の比（最終濃度１２．５ｍＭ）で合わせることによって調製した：イオン化可能カチオン性脂質（（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート｝）ＳＭ－１０２同等物、ヘルパー脂質（例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ））、コレステロール、およびＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（すなわち、平均分子量２０００のポリエチレングリコールを有する１－モノメトキシポリエチレングリコール－２，３－ジミリスチルグリセロール）。ＲＮＡ作業溶液を、製剤緩衝液（５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ４．０）において調製した。ＲＮＡ濃度は、脂質濃度、流速比、およびＮ／Ｐ比に依存する。
ＲＮＡおよび脂質ナノ粒子を調製した：ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｉｇｎｉｔｅの電源を入れ、「Ｑｕｉｃｋ Ｒｕｎ」をメインメニューから選択した。フィールドを選択し、ドロップダウンメニューから値を選択するかまたはスクリーン上のキーボードで数字を入力し、次いで、チェックマークをタップすることによって、パラメーターを図１に示されるように設定した。Ｉｇｎｉｔｅの蓋を開け、カートリッジアダプターを、確実に、カートリッジスロットの「Ｌ」インレットに矢印を上に向けて入れ、次いで、ＮｘＧｅｎ（商標）カートリッジをパッケージから取り出し、カートリッジスロットに挿入した。回転式ブロックを、カートリッジのルアーが見えるまで上げた。少なくとも１．５ｍＬの調製したＲＮＡ作業溶液を、３ｍＬのシリンジに吸い出した。必要に応じてブラントニードルを使用した。ニードルを取り出し、シリンジから気泡を除去し、プランジャを使用して液体を先端まで進めた。シリンジ先端部からの滴下を回避した。シリンジを、Ｉｇｎｉｔｅカートリッジの「Ｃ」インレットに挿入し、時計回りにまわしてルアーロックをかけた。少なくとも０．５ｍＬの調製した脂質作業溶液を、必要に応じてブラントニードルを使用して１ｍＬのシリンジに吸い出した。ニードルを取り出し、シリンジから気泡を除去し、プランジャを使用して液体を先端まで進めた。シリンジ先端部からの滴下を回避した。シリンジを、Ｉｇｎｉｔｅカートリッジの「Ｒ」インレットに挿入した。回転式ブロックを、下方向の位置へと戻した。２つの１５ｍＬのコニカルチューブのための試料切り替えアームが設置されていることを確認した。１５ｍＬのコニカル採取チューブに「ＲＮＡ－ＬＮＰ」と記載し、「試料」とラベル付けされたクリップに押し入れた。もう１つのチューブには「廃液」と記載し、「廃液」とラベル付けされたクリップに押し入れた。Ｉｇｎｉｔｅの蓋を閉め、スクリーンの「次へ」をタップした。パラメーターおよびダイアログボックスの情報を確認した。「開始」ボタンを押した。次いで、Ｉｇｎｉｔｅ（商標）のプッシュ装置により、流体がマイクロ流体カートリッジに注入された。製剤が、「ＲＮＡ－ＬＮＰ」とラベル付けされたチューブに採取された。モーターが、ホームポジションに位置に戻った後、スクリーンに、安全に蓋が開けられることが示された。安全になったら蓋が開き、「ＲＮＡ－ＬＮＰ」とラベル付けされたコニカル採取チューブを取り出し、特徴付けおよびさらなる処理のために即座に取り置いた。回転式ブロックを上げ、シリンジをＩｇｎｉｔｅ（商標）から取り出し、廃棄した。回転式ブロックを下の位置に戻し、ＮｘＧｅｎカートリッジを取り出し、廃棄した。追加の試料を作成するために、戻る「＜」ボタンをタップして、Ｑｕｉｃｋ Ｒｕｎのスクリーンに戻し、この段落に記載されているステップを、最初のｑｕｉｃｋ ｒｕｎ設定ステップを除いて繰り返した。
製剤化された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の特徴付けのために、調製の後に、２５～５０μＬの試料画分を、６５０μＬの超純水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、強度平均化粒径（Ｚ平均）を、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）で測定した。
試料画分を、即座にＳｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒ Ｇ２透析カセット（１００００ ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）に移し、４℃で一晩、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。
ＬＮＰ製剤を、Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して濃縮し、０．２２μｍフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）を通し、４℃で保管した（ＰＢＳ）。
また、試料画分を採取し、粒径（透析後の粒径）について測定した。
最終的なｍＲＮＡ濃度および封入効率（ＥＥ）を、Ｑｕａｎｔ－ｉｔ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。
（実施例４）
ｍＲＮＡのｉｎ－ｖｉｔｒｏトランスフェクション
ＲＮＡの適正なタンパク質発現を検証するために、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡまたは本明細書に開示される被試験ＲＮＡを、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ細胞）に一過的にトランスフェクトする。簡単に述べると、４．８×１０５個の細胞を、２ｍｌのＤＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を含む６ウェルプレートに播種する。２４時間後に、細胞が７０～９０％コンフルエントになると、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡまたは被試験ＲＮＡを、リポフェクタミンＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をマニュアルプロトコールに従って使用して、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトする。トランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、２日間培養し、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質発現について測定する。
本明細書に開示される様々な製剤／担体もまた、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡまたは被試験ＲＮＡを標的宿主細胞、例えば、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ ２９３細胞）へと運搬する能力について試験する。簡単に述べると、４．８×１０５個の細胞を、２ｍｌのＤＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清およびペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を含む６ウェルプレートに播種する。２４時間後に、細胞が７０～９０％コンフルエントになると、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡまたは本明細書に開示される被試験ＲＮＡを有する製剤／担体を、それぞれのウェルに添加する。２９３Ｔ細胞を、２日間培養し、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質発現について測定する。
（実施例５）
ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質発現の測定
免疫蛍光分析：トランスフェクションの２日後に、タンパク質発現を、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して免疫蛍光イメージングによって測定する。
細胞ライセートの調製：トランスフェクションの２日後に、培養培地を吸引し、細胞を、氷上で氷冷ＰＢＳにより洗浄する。氷冷溶解緩衝液（ＲＩＰＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をプロテアーゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに添加し、細胞を、４℃で３０分間インキュベートする。細胞を、次いで、細胞スクレイパーを使用して採取し、超音波処理によって溶解させる。１０，０００ｇにおいて４℃で２０分間の遠心分離により細胞残屑をペレットにし、上清を、新しい微量遠心チューブに移す。ライセートのタンパク質濃度を、ウエスタンブロットのためにＢｒａｄｆｏｒｄまたはＢＣＡタンパク質アッセイによって判定する。
ウエスタンブロット：簡単に述べると、それぞれのウェルのゲルに、２０～５０μｇのタンパク質を、４×ＳＤＳ試料緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０×還元緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および追加のｄｄＨ２Ｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、２５μｌ／ウェルの総ローディング体積で混合する。混合物を、９５℃で５分間の加熱によって変性させ、室温に冷却し、ＮＵＰＡＧＥ（商標）４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードする前に遠心分離する。電気泳動による分離の後に、ゲルを、カセットから取り出し、ＩＢＬＯＴ（商標）２ドライブロッティングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して移す。移した膜を、室温（ＲＴ）で１時間、ＴＢＳＴ中の５％無脂肪粉乳でブロッキングし、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴ（ＴＢＳ中の０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）緩衝液で３回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートマウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ２４５１２）である二次抗体とともに、室温で１時間インキュベートする。移した膜を、次いで、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬウエスタンブロッティング基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって現像し、化学発光イメージングシステムを使用してイメージングする。
一部の実施形態では、一次抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質またはその断片、例えば、Ｓタンパク質のＳ２タンパク質もしくはＲＢＤまたはその両方を特異的に認識し、それに結合する。したがって、そのタンパク質産物に対する被試験ＲＮＡの発現を、評価する。さらなる実施形態では、ウエスタンブロットのローディング対照を実行した。例えば、同じ試料を、上述のウエスタンブロットを使用して試験したが、一次抗体がβ－アクチンを特異的に認識してそれに結合することを除く。群間で実質的に類似のタンパク質レベルが、ローディング対照において見出される。
異なるポリＡ尾部、例えば、４０量体のポリＡ（本明細書において「ポリＡ ４０」と称される）または６０－６０ポリＡ（「ポリＡ ６０」を参照されたい）を有するＲＮＡを合成し、精製し、細胞にトランスフェクトし、タンパク質発現について試験した。簡単に述べると、β－グロブリン５’および３’ ＵＴＲ、青色蛍光タンパク質２（ＢＦＰ２）コーディング配列、ならびに異なる合成ポリＡ尾部を含むＤＮＡ構築物を、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成した。さらなる実施形態では、ＤＮＡ構築物は、プラスミドをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）に適したものにするために、カナマイシン選択マーカー、ｐＵＣ５７骨格、およびＴ７プロモーターを含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる、プラスミド骨格をさらに含む。ＩＶＴを、前述のように行った。ＲＮＡを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）の蛍光強度を、ＢｉｏＴｅｋからのＣｉｔａｔｉｏｎ ５顕微鏡を使用して観察した。結果を、図２に示す。図２Ａ～２Ｃのそれぞれの上部パネルは、ＢＦＰの蛍光を示す代表的な画像を提供し、一方で図２Ａ～２Ｃのそれぞれの下部パネルは、対応する明視野画像を提供する。
追加として、様々なＵＴＲ、例えば、β－グロブリンＵＴＲまたは本明細書に開示されるＳＹＳ ＵＴＲを有するＲＮＡを合成し、精製し、細胞にトランスフェクトし、タンパク質発現について試験した。簡単に述べると、異なる５’ＵＴＲおよびＢＦＰ２を含むＤＮＡ構築物を、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成した。構築物は、プラスミドをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）に適したものにするために、カナマイシン選択マーカー、ｐＵＣ５７骨格、およびＴ７プロモーターを含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなるプラスミド骨格をさらに含む。プラスミドを、調製および精製した後、ＩＶＴを、前述のように行った。ＲＮＡを、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ＢＦＰの蛍光強度を、ＢｉｏＴｅｋからのＣｉｔａｔｉｏｎ ５顕微鏡を使用して測定した。異なる５’ＵＴＲを、様々な時点で比較した。図３を参照されたい。エラーバーは、３つの複製物の標準偏差を示す。
（実施例６）
ヒトＡＣＥ２との結合
本明細書に開示される被試験ＲＮＡによって発現されるＳタンパク質、そのバリアントおよび／または突然変異体と、ヒト細胞上のその受容体、例えば、ヒトＡＣＥ２との間の結合を、さらに調査する。例えば、被試験ＲＮＡをトランスフェクトした、Ｓタンパク質、そのバリアントおよび／または突然変異体を発現する細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ（カタログ番号ＣＲＬ－３２１６、ＡＴＣＣ）またはａ５４９（カタログ番号ＣＣＬ－１８５、ＡＴＣＣ））を、直接的または間接的に蛍光タンパク質、例えば、ＦＩＴＣで標識したヒトＡＣＥ２とともにインキュベートする。インキュベートした細胞を、必要に応じて、洗浄して、未結合のＡＣＥ２を除去する。フローサイトメトリーを行い、それぞれの細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、定性的に測定した。ＭＦＩが高いほど、より多くのＡＣＥ２が細胞に結合しており、ＡＣＥ２と、細胞によって発現されたＳタンパク質、そのバリアントおよび／または突然変異体との間の強い結合（例えば、高い結合親和性を示す）を示す
（実施例７）
ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルおよび注射
ｉｎ ｖｉｖｏ研究を行った。簡単に述べると、６～８週齢の雌性ＢＡＬＢ／Ｃを、それぞれの群当たり４匹のマウスでそれぞれの群にランダム化し、異なる製剤で３０μｇのＥＧＦＰ ｍＲＮＡを右側腹部に筋肉内注射する。上述のものと同じ製剤を用いて、被試験ＲＮＡもまた、ｉｎ ｖｉｖｏ分析、抗体力価測定、および結合のために調製する。
２８日目に、ブーストのための２回目の注射を行い、３５日目に、血清を採取し、抗体力価の測定のためにイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって分析した。
（実施例８）
ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデル。
他の好適な動物モデルを使用して、本明細書に開示される製剤／担体において被試験ＲＮＡを調査し、本明細書に開示される方法における使用ならびに単独または他の可能性のある治療法、例えば、抗炎症療法と組み合わせた治療について、その効率性を評価することができる。
１つの例では、必要に応じて組織特異的プロモーター（例えば、上皮細胞についてはＫｒｔ１８プロモーター、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウス）またはユニバーサルプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーに続いてニワトリβ－アクチンプロモーター）または内因性マウスＡｃｅ２プロモーター下においてヒトＡＣＥ２を発現する遺伝子改変された動物モデルを、本明細書において使用する。これらのマウスのすべては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染に対して感受性であるが、それらのヒトＡＣＥ２発現の違いが、軽度から致死までの疾患の病理学的範囲をもたらす。一部の実施形態では、動物は、マウスである。代替的な動物モデルとしては、ＡＣＥ２がヒトのものに有意に類似しておりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染に対して感受性であると考えられるシリアハムスター、フェレット、および非ヒト霊長類が挙げられる。
ＲＮＡ組成物、例えば、本明細書に開示される製剤／担体における被試験ＲＮＡを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはそのシュードウイルスでのチャレンジの前またはそれと同時に、動物に投与した。ＲＮＡ組成物の投与を、少なくとも１回または２回繰り返した。ＲＮＡ組成物の２回目の投与は、約２週間または約３週間空けて行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはシュードウイルスでチャレンジしない動物は、陰性対照としての機能を果たし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはシュードウイルスでチャレンジしたが処置しなかったものは、陽性対照としての機能を果たした。追加の対照、例えば、当該技術分野において公知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン、例えば、Ｐｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈから入手可能なＢＮＴ１６２ｂ２、Ｍｏｄｅｒｎａから入手可能なｍＲＮＡ－１２７３、またはＪｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ’ｓ Ｊａｎｓｓｅｎから入手可能なＪＮＪ－７８４３６７３５で処置し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはシュードウイルスでチャレンジした動物を、使用した。
ウイルス負荷、肺病理学、肺への免疫細胞浸潤、サイトカイン放出、体重、体毛、姿勢、呼吸窮迫（例えば、努力呼吸）、無気力かどうか、鼻からの液垂れ、喘鳴、中咽頭の粘液蓄積、くしゃみ、軟便などを、作用を評価するためにＲＮＡ組成物の投与後にモニタリングした。
（実施例９）
改変型または非改変型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチン候補をトランスフェクトしたＡ５４９細胞からのＩ型インターフェロン分泌（ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－β）の確認。
実験を行って、ウイルスＲＮＡセンシング経路が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡ（ＳＢＩ）をトランスフェクトしたＡ５４９細胞において自然免疫を活性化し、ＩＦＮ－βの生成およびそれに続くＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質翻訳の抑制をもたらすかどうかを試験した。同じ実験設定を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質（野生型またはＳ２ＰもしくはＳ６Ｐ突然変異を含む）を発現するＲＮＡ、例えば、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードするＲＮＡ（「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＷＴ（ＳＢＩ）」とラベル付けされる）、ＲＮＡのすべてのウリジン残基が化学的に、必要に応じてシュードウリジンに、さらに必要に応じてＮ１－メチルシュードウリジンに改変されている野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードするＲＮＡ（「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＷＴ（１００％改変型）」とラベル付けされる）、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐで突然変異された野生型であり、ＲＮＡの少なくとも１つのウリジン残基が化学的に、必要に応じてシュードウリジンに、さらに必要に応じてＮ１－メチルシュードウリジンに改変されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードするＲＮＡ（「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ２Ｐ ＷＴ」とラベル付けされる）、Ｄ６１４Ｇ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐで突然変異された野生型であり、ＲＮＡの少なくとも１つのウリジン残基が化学的に、必要に応じてシュードウリジンに、さらに必要に応じてＮ１－メチルシュードウリジンに改変されている、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードするＲＮＡ（「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ２Ｐ Ｄ６１４Ｇ」とラベル付けされる）、Ｄ６１４Ｇで突然変異された野生型であり、ＲＮＡの少なくとも１つのウリジン残基が化学的に、必要に応じてシュードウリジンに、さらに必要に応じてＮ１－メチルシュードウリジンに改変されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードするＲＮＡ（「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＤ６１４Ｇ ＷＴ」とラベル付けされる）、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐで突然変異された野生型であり、ＲＮＡの少なくとも１つのウリジン残基が、化学的に、必要に応じてシュードウリジンに、さらに必要に応じてＮ１－メチルシュードウリジンに改変されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードする、配列最適化されたＲＮＡ（「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ６Ｐ（ＲＮＡｉｍｍｕｎｅ）」とラベル付けされる）、南アフリカで最初に特定され、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐでさらに突然変異されており、ＲＮＡの少なくとも１つのウリジン残基が、化学的に、必要に応じてシュードウリジンに、さらに必要に応じてＮ１－メチルシュードウリジンに改変されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のベータバリアントをコードする、ＲＮＡ（「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ６Ｐ＿ＳＡ」とラベル付けされる）、南アフリカで最初に特定され、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐでさらに突然変異されており、ＲＮＡの少なくとも１つのウリジン残基が、化学的に、必要に応じてシュードウリジンに、さらに必要に応じてＮ１－メチルシュードウリジンに改変されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のベータバリアントをコードする、配列最適化されたＲＮＡ（「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ６Ｐ＿ＳＡ＿ＧＳ」とラベル付けされる）、またはＲＮＡの少なくとも１つのウリジン残基が、化学的に、必要に応じてシュードウリジンに、さらに必要に応じてＮ１－メチルシュードウリジンに改変されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＲＢＤをコードする、ＲＮＡ（「ＲＢＤ」とラベル付けされる）に適用した。以下の表におけるさらなる詳細を参照されたい。さらなる実施形態では、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、配列番号１に記載されるポリペプチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。
表7
追加として、同じ実験設定を、本明細書に開示される製剤／担体中の被試験ＲＮＡに適用する。
材料および方法
２９３Ｔ細胞に、以下のうちの１つをコードするＲＮＡを一過的にトランスフェクトし、ＲＮＡの脂質に対する比が約１：３で製剤化した：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＷＴ（ＳＢＩ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＷＴ（１００％改変型）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ２Ｐ ＷＴ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ２Ｐ Ｄ６１４Ｇ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＤ６１４Ｇ ＷＴ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ６Ｐ（ＲＮＡｉｍｍｕｎｅ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ６Ｐ＿ＳＡ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ６Ｐ＿ＳＡ＿ＧＳ、またはＲＢＤ。
２ｍｌのＡ５４９細胞を、２．５×１０５個の細胞の密度で、１２ウェルプレートに播種した。細胞を、５％ ＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃で２４時間インキュベートした。ＲＮＡ（１μｇ）を、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ－Ｉ中に希釈した。７．５μｌのリポフェクタミンＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＭＲＮＡ００８）もまた、希釈し、室温で１０分間インキュベートした。希釈したｍＲＮＡ混合物を、希釈した脂質に添加した。室温で５分間、インキュベーションを行った。ｍＲＮＡ－脂質複合体を、細胞に添加し、５％ ＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃で２４時間インキュベートした。
ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ－αの検出を、ＶｅｒｉＫｉｎｅヒトＩＦＮ－α ＥＬＩＳＡキット（カタログ４１１００、ｐｂｌ ａｓｓａｙ ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して行った。１ｍｌの培養上清を、新しいチューブに移し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。培養上清を、次いで、新しいチューブに移し、使用まで－８０℃で保管した。
標準曲線を生成した：高感度標準曲線１２．５～５００ｐｇ／ｍｌまたは広範囲標準曲線１５６～５０００ｐｇ／ｍｌを構築した。６つのポリプロピレンチューブ（Ｓ１～Ｓ６）にラベル付けを行い、２５０μｌの希釈緩衝液を充填した。ポリプロピレンチップを使用して、ヒトＩＦＮ－α標準物をＳ６に添加し、穏やかに混合した。チップを、それぞれの希釈間で交換した。２５０μｌをＳ６から取り出し、Ｓ５に添加した。同じ連続希釈を、Ｓ４～Ｓ１に行った。すべての希釈物を、使用まで冷蔵保管した（図４）。
ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ－βの検出を、ＶｅｒｉＫｉｎｅヒトＩＦＮ－β ＥＬＩＳＡキット（カタログ４１４１０、ｐｂｌ ａｓｓａｙ ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して行った。１ｍｌの培養上清を、新しいチューブに移し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。培養上清を、次いで、新しいチューブに移し、使用まで－８０℃で保管した。
標準曲線を生成した：７つのポリプロピレンチューブに、ラベル付けを行った（Ｓ１～Ｓ７）。ポリプロピレンチップを使用して、２５０μｌの標準希釈物をそれぞれのチューブに添加したが、４９２．５μｌの標準希釈物を添加したＳ７は除く。１０μｌのヒトＩＦＮ－β標準物を、９０μｌの標準希釈物に添加した。７．５μｌの事前希釈した標準物を、Ｓ７に添加し、十分に混合した。２５０μｌのＳ７をＳ６に移し、十分に混合した。同じ連続希釈を、残りのＳ５～Ｓ１に行った。すべての希釈物を、使用まで取り置いた。
所望される数の試料を試験するために必要とされるマイクロプレートストリップの数を、ブランクおよび標準物を流すのに必要とされる適切なウェル数を加えて判定した。１００μｌのインターフェロン標準物、ブランク、または試料を、それぞれのウェルに添加し、プレートシーラーで覆い、１時間インキュベートした。１時間後に、プレートの内容物を出し、ウェルを、希釈した洗浄緩衝液で１回だけ洗浄した。１００μｌの希釈した抗体溶液をそれぞれのウェルに添加し、プレートシーラーで覆い、１時間インキュベートした。１時間後に、プレートの内容物を出し、ウェルを、希釈した洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μｌの希釈したＨＲＰ溶液を、それぞれのウェルに添加し、プレートシーラーで覆い、１時間インキュベートした。このインキュベーション期間の間に、ＴＭＢ基質溶液を室温まで温めた（２２～２５℃）。１時間後に、プレートの内容物を出し、ウェルを、希釈した洗浄緩衝液で４回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ基質溶液を、それぞれのウェルに添加し、暗所において室温（２２～２５℃）で１５分間インキュベートした。インキュベーションの間、プレートシーラーは使用しなかった。１５分間のＴＭＢのインキュベーション後に、１００μｌの停止溶液を、それぞれのウェルに添加した。マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍでの吸収を、停止溶液の添加後５分以内に判定した。
一部の実施形態では、例えば、上述のトランスフェクション方法を使用して、２９３Ｔ細胞に、本明細書に開示される製剤／担体中の被試験ＲＮＡを一過的にトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞のＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βの放出を、例えば、上述の方法を使用して測定する。
結果
Ａ５４９細胞からのＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βの分泌を評価するために、ＥＬＩＳＡを、本明細書に記載されるように行った。代表的な結果として得られたＥＬＩＳＡプレートを撮影し、これを図４に示し、一方で結果を、図５～６に示されるようにさらに定量した。データは、インターフェロン－α（ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－アルファ）が、未改変のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡ（ＳＢＩ）をトランスフェクトしたＡ５４９細胞からしか分泌されず、インターフェロン－β（ＩＦＮ－βまたはＩＦＮ－ベータ）は、未改変のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡ（ＳＢＩ）、Ｓ２Ｐ ＷＴ、Ｄ６１４Ｇ ＷＴ、およびＳ６Ｐ＿ＳＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞から分泌されたことを示した。
結論
インターフェロン－αは、未改変のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡ（ＳＢＩ）をトランスフェクトしたＡ５４９細胞からしか分泌されなかった。インターフェロン－βは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＷＴ（ＳＢＩ）、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ２Ｐ ＷＴ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＤ６１４Ｇ ＷＴ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ６Ｐ＿ＳＡをコードする未改変のＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞から分泌された。したがって、理論によって束縛されることを望むものではないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＷＴ（ＳＢＩ）をコードする未改変のＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞において観察されたスパイクタンパク質発現の欠如（データは示されない）は、スパイクタンパク質の翻訳を阻害する強力なｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路（自然免疫）の活性化によって引き起こされた可能性がある。
（実施例１０）
Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンの免疫原性および有効性の評価。
合計４０匹の６～８週齢の雌性Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。すべての動物実験は、Ｇｅｏｒｇｅ Ｍａｓｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＧＭＵ）と共同でＮｏｂｌｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅにおいて行った。研究は、品質保証部が直接的に関与することなく行ったが、適用されるＮＬＳ ＳＯＰを遵守し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）、ＧＭＵ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのガイドラインおよび承認に従った。マウスを、順化期間の後に、それぞれ１０匹のマウスからなる４つの群に割り当てた。表３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ヒト／ＩＴＡ／ＩＮＭＩ１／２０２０チャレンジの投薬群を示す。表４は、ＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１６１７．２デルタバリアントの用量群を示す。０日目および１４日目に、群１の動物に、ビヒクルを筋肉内接種し、群２、３、および４のマウスには、実施例３に従って調製した配列番号５２を含む漸増用量の代表的なＲＬ－００７ ｍＲＮＡワクチン製剤を筋肉内接種した。このワクチン製剤は、「ＲＶ－１７３０」と表記され、ＲＬ－００７担体を使用する。－１日目、１３日目、および２７日目に、マウスから血液を採取し、血清試料を、プラーク低減中和試験（ＰＲＮＴ）に使用した。２８日目に、動物を、５．５×１０４ＰＦＵ／マウスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ヒト／ＩＴＡ／ＩＮＭＩ１／２０２０野生型バリアント（ＮＬＳ－ＧＭＵ－ＷＢ２－０４２１２１）（図８Ａおよび図８Ｂ）または１．５×１０４ＰＦＵ／マウスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１６１７．２デルタバリアント（図８Ｃおよび図８Ｄ）で鼻内チャレンジした。チャレンジ後の１３日間、すべてのマウスを、毎日、死亡、体重、体温についてモニタリングし、窮迫の臨床兆候についてスコア付けした。１０を超える臨床重症度スコアを有したか、またはチャレンジ前の２０％を上回って体重が減少したマウスは、人道的に安楽死させ、非生存者として記録した。すべての生存しているマウスを、チャレンジの１３日後に安楽死させた。安楽死させたマウスから肺組織の一部分を摘出し、１０％ホルマリンに入れ、Ｈ＆Ｅ染色による組織病理学アッセイのためにＨｉｓｔｏｓｅｒｖに送った。
表3: SARS-CoV-2/ヒト/ITA/INMI1/2020チャレンジ研究の投薬群
表4: ARS-CoV-2 B.1.1617.2デルタバリアントの用量群
マウスは、チャレンジ後最大１４日間、毎日、死亡、窮迫の臨床兆候、体重、および体温についてモニタリングした。臨床的窮迫の重症度スコアを、ＧＭＵ－ＩＡＣＵＣに承認された動物研究臨床モニタリング表（表５）に基づいて、それぞれのマウスについて毎日記録した。簡単に述べると、１）外観、２）運動性、３）態度、４）呼吸窮迫の４つの観察可能な表現型カテゴリーにおいて０（正常）から３（重症）までのスコア、ならびに体重を、それぞれの個々のマウスについて毎日記録した。１０またはそれを上回る累積スコアを有したマウスは、人道的に安楽死させた。
表5. 臨床重症度スコア付けマトリックス
研究の－１日目、１３日目、および２７日目に採取した血清標本の中和力価を、プラーク低減中和滴定（ＰＲＮＴ）を使用して評価した。すべての血清は、試験する前に５６℃で３０分間インキュベートすることによって、熱不活性化した。それぞれの血清の６つの２倍連続希釈物を、ＥＭＥＭにおいて調製した。希釈物は、１：４～１：３２００の範囲に及び、異なる時点および処置群における中和活性の増加を考慮するように調節した。２５マイクロリットル（２５μＬ）のそれぞれの希釈物を、２５μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１６１７．２デルタバリアントＢＥＩ：ＮＲ－５５６７２ウイルスストックと合わせ、混合し、３７℃で１時間インキュベートした。前夜に１２ウェルプレートに播種したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞から上清を除去し、それぞれのウェルで３００μＬのイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）と置き換えた。インキュベートしたウイルス＋希釈血清の混合物を、Ｖｅｒｏ Ｅ６単層の上に添加し、プレートを、３７℃／５％ ＣＯ２で１時間インキュベートした。プレートを、インキュベーション中、１０～１５分ごとに振盪させた。１時間のインキュベーションの後、２×ＥＭＥＭおよび０．６％アガロースを１：１の比で含む１．５ｍｌの重層を、プレートに添加した。室温でアガロースを固化させた後、プレートを、３７℃／５％ ＣＯ２で７２時間インキュベートした。インキュベーションの後に、０．５ｍｌの１０％ホルムアルデヒドをそれぞれのウェルのアガロースの上に添加することによって細胞を固定化し、室温で一晩インキュベートした。アガロースのパレットを穏やかに除去し、細胞の単層を、０．５ｍｌの１％クリスタルバイオレットの添加により１０～１５分間染色した。染色した後、プレートを、水で洗浄して過剰な染色溶液を除去し、プラークを、それぞれのウイルス希釈物について、手作業で数えた。中和力価は、陰性対照血清と比べて、ｐ．ｆ．ｕ．（プラーク形成単位）に５０％を上回る低減（ＰＲＮＴ５０）または９０％を上回る低減（ＰＲＮＴ９０）をもたらしたもっとも低い希釈の逆数として計算した。２つの完全にワクチン接種した雄性から採取したヒト血清、およびナイーブマウスに由来する血清を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。
結果：ＲＬ－００７で免疫付与したすべてのマウス（群２、３、および４のマウス）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でのチャレンジ後に臨床兆候の重症度に増加を示さなかった。対照的に、群１のマウスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後に、臨床兆候の重症度に急激な増加を示した（図７）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンは、群２、３、または４のマウスの体重に対して作用を有さないことが示された（図８Ａ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後に、投与したマウスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンで免疫付与したすべてのマウス（群２、３、および４のマウス）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジの少なくとも４日後に体重の減少を示した対照（群１）マウスと比較して、体重の変化を示さなかった（図８Ｂ）。同様の傾向が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１６１７．２デルタバリアントでのウイルスチャレンジ後に観察された（図８Ｃおよび図８Ｄ）。マウスの体温も同様の傾向に従い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンで免疫付与したマウスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後数日間にわたって安定した体温を示したが、一方で対照マウスは、ウイルスチャレンジの少なくとも５日後に体温の低下を経験した（図９）。すべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡでワクチン接種したマウスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後少なくとも最大１３日間生存した（図１０）。対照マウスのうちの１０％が、チャレンジ後少なくとも８日間生存した（図１０）。高い中和抗体力価が、免疫付与の少なくとも１３日後（図１１Ａおよび図１１Ｂ）ならびに２７日後（図１１Ｃおよび図１１Ｄ）に観察された。
結論：これらのデータは、本明細書に提供されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンが、対象が症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の症状（例えば、臨床兆候の重症度、体温の変化、および／もしくは体重の変化）または症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有するのを防止することができることを示唆する。本明細書に示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンでの免疫付与は、例えば、免疫付与後、少なくとも１３日間または少なくとも２７日間の期間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体力価を増加させることによって、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導することができる。提供されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンは、したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染した対象を処置することができ、対象のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷を低減させることができる。
（実施例１１）
鼻孔および肺組織におけるウイルス力価。
安楽死させたそれぞれのマウスの右肺組織の一部分を採取し、１０％ホルマリンに入れた。ホルマリンで固定した肺組織試料を、ＡＢＳＬ３から取り出し、組織病理学的アッセイのために、Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖ（１９５２６ Ａｍａｒａｎｔｈ Ｄｒ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ ２０８７４）に送った。チャレンジ後３日目に安楽死が指定されたマウスのそれぞれの肺組織の一部分を、肺組織におけるウイルス力価の分析のために、細胞培養培地に入れた。鼻孔および肺組織におけるウイルス力価を、ウイルスチャレンジの３日後にそれぞれの群から５匹のマウスにおいて判定した。マウスを、イソフルランの吸入によって麻酔し、上気道におけるウイルスの複製および排出（shedding）（ｐｆｕ／ｍＬ）の判定のために、鼻洗浄液を、総体積１００ｍＬの滅菌鼻洗浄緩衝液でそれぞれのマウスから採取した。マウスを、重い麻酔下で人道的に安楽死させ、肺組織を採取した。右肺葉からの組織を、組織培養培地に入れ、ホモジナイズし、下気道におけるウイルス力価の判定に使用した。それぞれの鼻洗浄液または肺ホモジネートの１０倍連続希釈物を、ＥＭＥＭにおいて調製した。前夜に１２ウェルプレートに播種したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞から上清を除去し、それぞれのウェルで３００μＬの希釈した鼻洗浄液または肺ホモジネートと置き換えた。プレートを、３７℃／５％ ＣＯ２で１時間インキュベートした。プレートを、インキュベーション中、１０～１５分ごとに振盪させた。１時間のインキュベーションの後、２×ＥＭＥＭおよび０．６％アガロースを１：１の比で含む１．５ｍＬの重層を、プレートに添加した。室温でアガロースを固化させた後、プレートを、３７℃／５％ ＣＯ２で７２時間インキュベートした。インキュベーションの後に、０．５ｍＬの１０％ホルムアルデヒドをそれぞれのウェルのアガロースの上に添加することによって細胞を固定化し、室温で一晩インキュベートした。アガロースのパレットを穏やかに除去し、細胞の単層を、０．５ｍｌの１％クリスタルバイオレットの添加により１０～１５分間染色した。染色した後、プレートを、水で洗浄して過剰な染色溶液を除去し、プラークを、それぞれのウイルス希釈物について、手作業で数えた。ウイルス力価を、ｐｆｕ／ｍＬとして計算した。
結果および結論：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でのチャレンジの１３日後に摘出した代表的な肺組織の組織病理学画像を、図１３に示す。組織病理学スコアを、総肺スコア、間質性肺炎、および血管周囲カフに基づいて判定した（図１２）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンで免疫付与したマウスは、３回の測定のそれぞれについて、野生型マウスと比較して低い平均組織病理学スコアを有し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症によって生じる組織レベルの症状および損傷に対する保護を提供することが示された。
（実施例１２）
ＲＬ００７で免疫付与した血清の免疫原性。
マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタバリアントＲＶ－１７３０の免疫原性を評価するために、６～８週齢の雌性ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスを、５～８匹のマウスの群にランダムに分割し、ＲＬ００７で皮内注射によってワクチン接種した（マウス１匹当たり１、５、１０、および２０μｇ）。すべてのマウスに、２１日間隔で２回免疫付与した。初回免疫付与の１４日後および３５日後に、尾部採血または心臓穿刺によって、それぞれの免疫付与の前に採血を行った。血液を４℃で一晩凝固させた後、血清を、１０，０００×ｇにおいて４℃で１０分間の遠心分離によって採取した。試料を、さらなる分析まで４℃で保管した。Ｓ１およびＲＢＤ特異的血清ＩｇＧ力価を判定するために、ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を、４℃で一晩、炭酸ナトリウム緩衝液中の組換えＳ１またはＲＢＤ（１μｇ／ｍｌ）１００μｌでコーティングした。ウェルを、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、プレートを、２００μｌのブロッキング緩衝液とともに室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、プレートを、１００μｌの血清とともに室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ－Ｔで５回洗浄し、ＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。最後に、プレートをＰＢＳ－Ｔで５回洗浄し、プレートを、１００μｌの１×ＴＭＢ基質とともに１０分間インキュベートした。１００μｌの１Ｎ－ＨＣｌを添加して反応を停止させ、Ｃｙｔａｔｉｏｎ７を使用して４５０ｎｍで読み取った。逆数エンドポイントＩｇＧ力価については、２倍連続希釈した血清を、異なるスパイクタンパク質を固定化したウェルに添加した。すべての手順は、上記と同じであった。
結果および結論：異なるバリアントスパイクタンパク質に対するＲＬ００７で免疫付与した血清のエンドポイントＩｇＧ力価の増加が、初回および２回目の免疫付与投薬の後に観察された（図１７）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンは、したがって、例えば、初回および２回目の免疫付与投薬後、少なくとも１４日間または少なくとも３５日間の期間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＩｇＧ力価を増加させることによって、対象において異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質に対する免疫応答を誘導することができる。
（実施例１３）
ＲＬ００７で免疫付与した血清の中和抗体力価の判定。
中和抗体の力価を判定するために、本発明者らは、まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－シュードウイルス粒子を生成した。簡単に述べると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ１，２について以前に説明されているプロトコールに従って、いくつかの改変を行って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質構築物でシュードタイプ化したマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）粒子を、ＨＥＫ２９３Ｔ（カタログ番号ＣＲＬ－３２１６、ＡＴＣＣ）細胞において生成した。すべてのプラスミドＤＮＡを、ＺｙｍｏＰＵＲＥ ＩＩ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｐｒｅｐキット（カタログ番号Ｄ４２０１、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で精製した。簡単に述べると、８００万個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、いずれの抗生物質も含まない１６ｍｌのＤＭＥＭ（カタログ番号２５－５００、Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＋１０％ ＦＢＳ（カタログ番号３５－０１０－ＣＶ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、１０ｃｍの組織培養皿（カタログ番号ｓｃ－２５１４６０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に播種した。２日目に、細胞に、リポフェクタミン３０００試薬（カタログ番号Ｌ３００００１５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、８μｇのｐＴＧ－Ｌｕｃ、６μｇのｐＣＭＶ－ＭＬＶｇａｇ－ｐｏｌ、および６μｇのｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク－ΔＣ１９の異なるバリアントをトランスフェクトした。細胞を、さらに４８時間培養した。上清を、５０ｍｌのファルコンチューブに採取し、２９０×ｇで７分間回転処理した。上清（シュードタイプ化ウイルス溶液）を、次いで、適切なシリンジを使用して、０．４５μｍのフィルター（カタログ番号ｓｃ－３５８８１４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に通した。シュードタイプ化ウイルス溶液を、次いで、クライオバイアルにアリコートし、－８０℃で保管した。それぞれの１０ｃｍ細胞培養皿は、約１６ｍｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＰＰを産生する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＰＰを、品質管理のためにＨＥＫ２９３－ＡＣＥ２細胞系（Ｃｏｄｅｘ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓで作製）を用いて試験した。シュードウイルスを用いた中和アッセイのために、血清を５６℃で３０分間インキュベートすることによって、血清を熱不活性化した。感染の前日に、７．５×１０３個のＨＥＫ２９３－ＡＣＥ２細胞を、１５μｌの培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦｅｔａｌＣｌｏｎｅ ＩＩ Ｓｅｒｕｍ、カタログ番号ＳＨ３００６６０３、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のポリＤリシン（カタログ番号３４３９－１００－１、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ， Ｉｎｃ）で事前コーティングした３８４ウェルの白色透明プレート（カタログ番号３５３９６３、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に播種した。細胞プレートを、ＣＯ２インキュベーター（３７℃）に入れた。２日目に、試験しようとする血清を、９６ウェルの化合物プレートにおいて培養培地中に希釈した。６５μｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＬＶシュードウイルス粒子（ｐｐ）を、上述のように調製した２６μｌの試験試料と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。３８４ウェルの細胞プレートのそれぞれのウェルの培地を除去した後、１７．５μｌのそれぞれの血清－ｐｐ混合物を、それぞれのウェルに添加した。プレートを、５４×ｇにおいて４℃で１５分間遠心分離し、追加の７．５ｍｌの培養培地を、次いで、それぞれのウェルに添加した。ルシフェラーゼ活性を、ホタルルシフェラーゼアッセイキット（ＣＢ－８０５５２－０１０、Ｃｏｄｅｘ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ）で測定した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて曲線当てはめに基づいて計算した（データは、感染度のパーセンテージとして正規化した）。
結果および結論：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス粒子に対する中和抗体力価を、初回および２回目の免疫付与投薬の後に測定した。ＩＣ５０値は、曲線当てはめに基づいて計算した。株特異的中和が、観察された。曲線およびＩＣ５０値を、図１８Ａ、図１８Ｂ、図１９Ａ、および図１９Ｂに示す。ＩＣ５０値は、提供される中和アッセイ条件のそれぞれについて、図２０に表で示す。これらのデータは、本明細書に提供されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンが、例えば、初回および２回目の免疫付与投薬の少なくとも１４日後または３５日後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体力価を増加させることによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象において、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質に対する免疫応答を誘導することができることを示す。
（実施例１４）
細胞内サイトカイン染色。
マウスから脾臓を採取し処理して、１０％熱不活性化ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｒ１０培地）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中の単一細胞懸濁液にした。赤血球を、ＲＢＣ溶解緩衝液（ＫＤ Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して溶解させ、Ｒ１０培地に再懸濁して、溶解を停止させた。脾細胞を計数し、１ウェル当たり２００，０００個の細胞を、９６ウェルプレートに添加した。細胞を、次いで、３７℃で７２時間、２μｇのＰｅｐＭｉｘ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（スパイクＢ．１．６１７．２／デルタ）（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ）または陰性対照としての培地単独で刺激した。プレートを遠心分離し、上清を採取し、サイトカイン検出のために－８０℃で凍結させた。マウス１１プレックスキットから分泌されたサイトカインの測定および分析を、上清の２倍希釈後に、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００／２００機器（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を用いて、マルチプレックスビーズベース技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ）アッセイを使用して行った。
結果および結論：７２時間後に、培養上清を、遠心分離によって採取し、分泌されたＴｈ１サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α）およびＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３）を測定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質での刺激は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンで処置したすべてのマウスにおいて、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α）およびＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３）の分泌を増加させた（図１４）。これらのデータは、本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンが、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するサイトカイン放出を誘導することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答を誘導することを示す。
（実施例１５）
脾細胞におけるＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析。
マウスから脾臓を採取し処理して、１０％熱不活性化ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｒ１０培地）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中の単一細胞懸濁液にした。赤血球を、ＲＢＣ溶解緩衝液（ＫＤ Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して溶解させ、Ｒ１０培地に再懸濁して、溶解を停止させた。脾細胞を計数し、６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり２００，０００個の細胞を、マウスＩＦＮ－ｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳ（ＨＲＰ）キット（Ｍａｂｔｅｃｈ）のプレートに添加した。細胞を、次いで、３７℃で１６時間、２μｇのＰｅｐＭｉｘ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（スパイクＢ．１．６１７．２／デルタ）（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ）または陰性対照としての培地単独で刺激した。スポットを、製造業者の説明に従って現像した。スポットを、Ｃｙｔａｔｉｏｎ７によって定量し、それを図１５Ａに示す。
結果および結論：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡでワクチン接種したマウスに由来する細胞には、ワクチン接種していない対照マウスと比較して、ＩＦＮ－γスポットの量の増加が存在していた（図１５Ｂおよび図１５Ｃ）。これらのデータは、本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンが、例えば、対象におけるＩＦＮ－γレベルを増加させることによって、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導することができることを示す。
（実施例１６）
メモリーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン分析。
Ｓタンパク質に対応するペプチドプール（Ｓ１およびＳ２）での再刺激の後に、ＲＶ－１７３０で免疫付与したマウスに由来する脾細胞の培養上清を、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカイン１１プレックスマウスｐｒｏｃａｒｔａｐｌｅｘパネルを使用して、分泌されたサイトカインについて評価した。簡単に述べると、ブーストの９週間後に、脾細胞を、１群当たり５匹のマウスから単離し、タンパク質輸送阻害剤カクテルの存在下において、ペプチドなしまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に由来するオーバーラップするペプチドのプールで再刺激した。１６時間後に、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を行って、ＣＤ４＋ およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を定量した。ペプチドの非存在下におけるサイトカイン発現は、バックグラウンドと考え、それぞれの個々のマウスについてＳ１およびＳ２ペプチドプールから測定した応答から差し引いた。
結果および結論：ＣＤ４＋／ＩＦＮ－γおよびＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ Ｔ細胞応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡでワクチン接種したマウスに由来する脾細胞の培養上清において、ワクチン接種していない対照マウスと比較して増加していた（図１６）。本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡワクチンは、例えば、対象におけるＣＤ４＋／ ＩＦＮ－γおよびＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ Ｔ細胞応答を増加させることによって、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導することができる。ＲＶ－１７３０は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ペプチドでのｅｘ ｖｉｖｏ刺激によって、強力な中和活性およびＣＤ８ Ｔ細胞応答、バランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２抗体アイソタイプ応答、ならびにＴ細胞からのサイトカイン放出を誘導する。強力な細胞免疫応答を誘導することにおけるこの広範な有効性は、ＲＶ－１７３０を現在／既存のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントおよびその子孫系統に対して使用するだけでなく、将来的に生じ得る問題のある任意の新しいＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対してＲＶ－１７３０を実装する、固有な能力を提供する。
表8: 配列表
配列番号１、Ｓタンパク質のアミノ酸配列：
配列番号２、Ｄ６１４Ｇ（太字および下線で示される）、ならびにＳ６Ｐ突然変異（Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐ、太字および斜体の下線で示される）を含むＳタンパク質のアミノ酸配列：
配列番号３、配列番号２をコードする最適化されていないＤＮＡ配列：
配列番号４、配列番号２をコードする最適化されていないＲＮＡ配列：
配列番号５、以下の突然変異：Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、およびＤ９５０Ｎのデルタバリアント突然変異；Ｓ２Ｐ（Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ）；ならびにフューリン様切断部位突然変異（Ｒ６８２ＳおよびＲ６８５Ｇ）を含むＳタンパク質のアミノ酸配列：
配列番号６、以下の突然変異：Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｄ９５０Ｎのデルタバリアント突然変異；Ｓ２Ｐ（Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ）；ならびにフューリン様切断部位突然変異（Ｒ６８２ＳおよびＲ６８５Ｇ）を含むＳタンパク質のアミノ酸配列。これは、配列番号５と比較して、Ｐ６８１Ｒ突然変異が欠如している：
配列番号７、以下の突然変異：Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、およびＤ９５０Ｎのデルタバリアント突然変異；Ｓ６Ｐ（Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐ）；ならびにフューリン様切断部位突然変異（Ｒ６８２ＳおよびＲ６８５Ｇ）を含むＳタンパク質のアミノ酸配列。これは、配列番号５と比較して、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、およびＡ９４２Ｐの突然変異をさらに含む：
配列番号８、配列番号７をコードする最適化されたＤＮＡ配列：
配列番号９、配列番号７をコードする最適化されたＲＮＡ配列：
配列番号１０、以下の突然変異：Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、およびＤ９５０Ｎのデルタバリアント突然変異；Ｓ６Ｐ（Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐ）；ならびにフューリン様切断部位突然変異（Ｒ６８２ＳおよびＲ６８５Ｇ）を含むＳタンパク質のアミノ酸配列。これは、配列番号７と比較して、Ｐ６８１Ｒ突然変異が欠如している：
配列番号１１、以下の突然変異：Ｔ１９Ｒ、Ｖ７０Ｆ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ａ２２２Ｖ、Ｗ２５８Ｌ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、およびＤ９５０Ｎのデルタバリアント突然変異；Ｓ６Ｐ（Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐ）；ならびにフューリン様切断部位突然変異（Ｒ６８２ＳおよびＲ６８５Ｇ）を含むＳタンパク質のアミノ酸配列：
配列番号１２、配列番号１１をコードする最適化されたＤＮＡ配列：
配列番号１３、配列番号１１をコードする最適化されたＲＮＡ配列：
配列番号１４、以下の突然変異：Ｔ１９Ｒ、Ｖ７０Ｆ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ａ２２２Ｖ、Ｗ２５８Ｌ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、およびＤ９５０Ｎのデルタバリアント突然変異；Ｅ４８４Ｋのベータバリアント突然変異；Ｎ４４０Ｋのバリアント突然変異、Ｓ６Ｐ（Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐ）；ならびにフューリン様切断部位突然変異（Ｒ６８２ＳおよびＲ６８５Ｇ）を含むＳタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号１５、配列番号１４をコードする最適化されたＤＮＡ配列：
配列番号１６、配列番号１４をコードする最適化されたＲＮＡ配列：
配列番号１７、３’ ＵＴＲのＤＮＡ配列：
配列番号１８、３’ ＵＴＲのＲＮＡ配列：
配列番号１９、β－グロブリン５’ＵＴＲのＤＮＡ配列：
ＡＣＡＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣ
配列番号２０、β－グロブリン５’ＵＴＲのＲＮＡ配列：
ＡＣＡＵＵＵＧＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＡＡＣＵＧＵＧＵＵＣＡＣＵＡＧＣＡＡＣＣＵＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣ
配列番号２１、ＳＹＳ ＵＴＲ ２．０のＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＣＧＣＣＡＣＣ
配列番号２２、ＳＹＳ ＵＴＲ ２．０のＲＮＡ配列：
ＧＧＣＧＣＵＣＧＡＧＣＡＧＧＵＵＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡＵＣＡＡＡＣＧＣＣＡＣＣ
配列番号２３、ＳＹＳ ＵＴＲ １．０のＤＮＡ配列：
ＧＧＧＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＣ
配列番号２４、ＳＹＳ ＵＴＲ １．０のＲＮＡ配列：
ＧＧＧＣＧＣＵＣＧＡＧＣＡＧＧＵＵＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡＵＣＡＡＡＣ
配列番号２５、ＳＹＳ４ ５’ＵＴＲのＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＣＡＣＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＣＧＣＣＡＣＣ
配列番号２６、ＳＹＳ４ ５’ＵＴＲのＲＮＡ配列：
ＧＧＣＧＣＡＣＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡＵＣＡＡＡＣＧＣＣＡＣＣ
配列番号２７、ポリＡ ４０のＤＮＡおよびＲＮＡ配列：
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
配列番号２８、ポリＡ ６０のＤＮＡおよびＲＮＡ配列：
配列番号２９、ポリＡシグナルＨＳＶのＤＮＡ配列：
ＣＧＧＣＡＡＴＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＡＴＡＡＡＡＣＧＣＡＣＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＣ
配列番号３０、ポリＡシグナルＨＳＶのＲＮＡ配列：
ＣＧＧＣＡＡＵＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＡＵＡＡＡＡＣＧＣＡＣＧＧＵＧＵＵＧＧＧＵＣＧＵＵＵＧＵＵＣ
配列番号３１、例証される５’ＵＴＲ－デルタＣ Ｓ６Ｐ－３’ ＵＴＲ－ポリＡのＤＮＡ配列：
配列番号３２、例証される５’ＵＴＲ－デルタＣ Ｓ６Ｐ－３’ ＵＴＲ－ポリＡのＲＮＡ配列：
配列番号３３、プラスミドＤＮＡ配列：
配列番号３４、ＨＫＰ側鎖：ＫＨＫＨＫＨＫＨＫ
配列番号３５、ＨＫＰ側鎖：ＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫ
配列番号３６、ＨＫＰ側鎖：ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨ
配列番号３７、ＨＫＰ側鎖：ＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨ
配列番号３８、ＨＫＰ側鎖：ＫＨＫＨＨＫＨＨＫＨＨＫＨＨＫＨＨＫＨＫ
配列番号３９、ＨＫＰ側鎖：ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ
配列番号４０、ＨＫＰ側鎖：ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ
配列番号４１、ＨＫＰ側鎖：ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ、１番目、５番目、９番目、１４番目、および１８番目のアミノ酸は、Ｄ－アミノ酸である。
配列番号４２、ＨＫＰ側鎖：ＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ
配列番号４３、ＨＫＰ側鎖：ＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ
配列番号４４、ＨＫＰ側鎖：ＫＨＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＨＫ
配列番号４５、ＨＫＰ側鎖：ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫ
配列番号４６、ＨＫＰ側鎖：ＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ
配列番号４７、ＨＫＰ側鎖：ＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫ
配列番号４８、フューリン様切断部位：ＲＲＡＲ
配列番号４９：－ＨＨＨＫ－
配列番号５０： ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒ
配列番号５１：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＡ
配列番号５２：
配列番号５３：
配列番号５４：
配列番号５５：
均等物
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本技術が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。
本明細書において例示的に記載されている本技術は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素、制限の非存在下において、好適に実施され得る。したがって、例えば、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含む（containing）」などの用語は、拡張的かつ制限なしに読解されるものとする。追加として、本明細書において用いられている用語および表現は、制限ではなく説明の意味で使用されており、そのような用語および表現の使用において、示され説明される特性またはその一部分の任意の均等物を排除することを意図するものではなく、様々な改変形態が、特許請求される本技術の範囲内で可能であることが認識される。
したがって、本明細書に提供される材料、方法、および例が、好ましい態様を示すものであり、例示的であり、本技術の範囲に対する制限であることを意図するものではないことを、理解されたい。
本発明は、ある特定の態様、実施形態、および必要に応じた特性によって具体的に開示されているが、そのような態様、実施形態、および必要に応じた特性の改変形態、改善形態、および変化形に、当業者であれば到達可能であること、ならびにそのような改変形態、改善形態、および変化形が、本開示の範囲内であると考えられることを、理解されたい。
本技術は、本明細書において広範かつ包括的に説明されている。包括的な開示内に含まれるより狭い種および亜属の分類のそれぞれもまた、本技術の部分を形成する。これは、本技術の包括的な説明を含むが、任意の主題をその分類群から除去するまたは除去しない否定的制限を条件とし、除外される材料が本明細書において具体的に引用されているかどうかにかかわらない。
加えて、本技術の特性または態様が、マーカッシュ群に関して記載されている場合、当業者であれば、本技術が、それによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたは亜群のメンバーに関して記載されることも認識するであろう。
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それぞれが参照により個別に組み込まれているのと同程度に、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる。矛盾が生じた場合には、定義を含め、本明細書が優先される。
他の態様は、以下の特許請求の範囲内に記載されている。

Claims (95)

  1. 少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異を含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片をコードするリボ核酸（ＲＮＡ）であって、前記少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異が、
    配列番号１のＲ６８２に対応するアミノ酸としてのセリン（Ｓ）（Ｒ６８２Ｓ）、
    配列番号１のＲ６８５に対応するアミノ酸としてのグリシン（Ｇ）（Ｒ６８５Ｇ）、
    配列番号１のＦ８１７に対応するアミノ酸としてのプロリン（Ｐ）（Ｆ８１７Ｐ）、
    配列番号１のＡ８９２に対応するアミノ酸としてのＰ（Ａ８９２Ｐ）、
    配列番号１のＡ８９９に対応するアミノ酸としてのＰ（Ａ８９９Ｐ）、
    配列番号１のＡ９４２に対応するアミノ酸としてのＰ（Ａ９４２Ｐ）、
    配列番号１のＫ９８６に対応するアミノ酸としてのＰ（Ｋ９８６Ｐ）、または
    配列番号１のＶ９８７に対応するアミノ酸としてのＰ（Ｖ９８７Ｐ）
    のうちの１つまたは複数を含むが、
    ただし、前記ＲＮＡが配列番号２を含まないことを条件とする、
    リボ核酸（ＲＮＡ）。
  2. 前記Ｓタンパク質が、
    配列番号１のＮ４４０に対応するアミノ酸としてのリシン（Ｋ）（Ｎ４４０Ｋ）、または
    配列番号１のＥ４８４に対応するアミノ酸としてのＫ（Ｅ４８４Ｋ）
    のうちの一方または両方をさらに含む、請求項１に記載のＲＮＡ。
  3. 前記Ｓタンパク質が、
    配列番号１のＴ１９に対応するアミノ酸としてのアルギニン（Ｒ）（Ｔ１９Ｒ）、
    配列番号１のＶ７０に対応するアミノ酸としてのフェニルアラニン（Ｆ）（Ｖ７０Ｆ）、
    配列番号１のＴ９５に対応するアミノ酸としてのイソロイシン（Ｉ）（Ｔ９５Ｉ）、
    配列番号１のＧ１４２に対応するアミノ酸としてのアスパラギン酸（Ｄ）（Ｇ１４２Ｄ）、
    配列番号１のＥ１５６に対応する欠失（Ｅ１５６Δ）、
    配列番号１のＦ１５７に対応する欠失（Ｆ１５７Δ）、
    配列番号１のＲ１５８に対応するアミノ酸としてのＧ（Ｒ１５８Ｇ）、
    配列番号１のＡ２２２に対応するアミノ酸としてのバリン（Ｖ）（Ａ２２２Ｖ）、
    配列番号１のＷ２５８に対応するアミノ酸としてのロイシン（Ｌ）（Ｗ２５８Ｌ）、
    配列番号１のＫ４１７に対応するアミノ酸としてのアスパラギン（Ｎ）（Ｋ４１７Ｎ）、
    配列番号１のＫ４１７に対応するアミノ酸としてのＲ（Ｌ４５２Ｒ）、
    配列番号１のＴ４７８に対応するアミノ酸としてのＫ（Ｔ４７８Ｋ）、
    配列番号１のＤ６１４に対応するアミノ酸としてのＧ（Ｄ６１４Ｇ）、
    配列番号１のＰ６８１に対応するアミノ酸としてのＲ（Ｐ６８１Ｒ）、または
    配列番号１のＤ９５０に対応するアミノ酸としてのＮ（Ｄ９５０Ｎ）
    のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１または２に記載のＲＮＡ。
  4. 前記少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異が、Ｒ６８２ＳおよびＲ６８５Ｇを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  5. 前記少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異が、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、またはＶ９８７Ｐのうちのいずれか１つ、またはいずれか２つ、またはいずれか３つ、またはいずれか４つ、またはいずれか５つを含むか、またはそれらをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  6. 前記少なくとも１つのアミノ酸の天然に存在しない突然変異が、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを含むか、またはそれらをさらに含む、請求項５に記載のＲＮＡ。
  7. 前記少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異が、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐを含むか、またはそれらをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  8. 前記Ｓタンパク質が、配列番号５のポリペプチドまたはその同等物を含み、配列番号５の前記同等物が、Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ｄ９５０Ｎ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐの突然変異を保持する、請求項１および３から６のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  9. 配列番号５またはその同等物をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項８に記載のＲＮＡ。
  10. 前記Ｓタンパク質が、配列番号６のポリペプチドまたはその同等物を含み、配列番号６の前記同等物が、Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｒ６８２Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ｄ９５０Ｎ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐの突然変異を保持する、請求項１および３から６のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  11. 配列番号６またはその同等物をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１０に記載のＲＮＡ。
  12. 前記Ｓタンパク質が、配列番号７のポリペプチドまたはその同等物を含み、配列番号７の前記同等物が、Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｄ９５０Ｎ、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｒ６８２Ｓ、およびＲ６８５Ｇの突然変異を保持する、請求項１、３、４、および７のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  13. 配列番号９のポリヌクレオチドまたはその同等物を含み、配列番号９の前記同等物が、配列番号７またはその同等物をコードする、請求項１２に記載のＲＮＡ。
  14. 前記Ｓタンパク質が、配列番号１０またはその同等物のポリペプチドを含み、配列番号１０の前記同等物が、Ｔ１９Ｒ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｄ９５０Ｎ、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｒ６８２Ｓ、およびＲ６８５Ｇの突然変異を保持する、請求項１、３、４、および７のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  15. 配列番号１０またはその同等物をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のＲＮＡ。
  16. 前記Ｓタンパク質が、配列番号１１のポリペプチドまたはその同等物を含み、配列番号１１の前記同等物が、Ｔ１９Ｒ、Ｖ７０Ｆ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ａ２２２Ｖ、Ｗ２５８Ｌ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｄ９５０Ｎ、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｒ６８２Ｓ、およびＲ６８５Ｇの突然変異を保持する、請求項１、３、４、および７のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  17. 配列番号１３のポリヌクレオチドまたはその同等物を含み、配列番号１３の前記同等物が、配列番号１１またはその同等物をコードする、請求項１６に記載のＲＮＡ。
  18. 前記Ｓタンパク質が、配列番号１４のポリペプチドまたはその同等物を含み、配列番号１４の前記同等物が、Ｔ１９Ｒ、Ｖ７０Ｆ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Δ、Ｆ１５７Δ、Ｒ１５８Ｇ、Ａ２２２Ｖ、Ｗ２５８Ｌ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｄ９５０Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ４４０Ｋ、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｒ６８２Ｓ、およびＲ６８５Ｇの突然変異を保持する、請求項１から４および７のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  19. 配列番号１６のポリヌクレオチドまたはその同等物を含み、配列番号１６の前記同等物が、配列番号１４またはその同等物をコードする、請求項１８に記載のＲＮＡ。
  20. 配列番号９、１３、または１６のうちのいずれか１つの同等物が、前記同等物の全長にわたって約３５％～約７０％のＧＣ含有量からなる、請求項９、１１、１３、１５、１７、および１９のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  21. 前記同等物が、全長参照配列に対して、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、またはそれを上回って同一である、請求項８から２０のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  22. ３’ＵＴＲをさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  23. 前記３’ＵＴＲが、配列番号１８、２２、または２４のうちのいずれか１つを含む、請求項２２に記載のＲＮＡ。
  24. ５’ＵＴＲをさらに含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  25. 前記５’ＵＴＲが、配列番号２０または２６を含む、請求項２４に記載のＲＮＡ。
  26. ポリＡ尾部をさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  27. 前記ポリＡ尾部が、配列番号２７、２８、または３０のうちのいずれか１つを含む、請求項２６に記載のＲＮＡ。
  28. 配列番号３２を含むかまたはそれからなる、請求項１に記載のＲＮＡ。
  29. 化学的に改変されており、必要に応じて、Ｎ１－メチル－シュードウリジン残基またはシュードウリジン残基のうちの１つまたは複数を含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  30. 前記ＲＮＡにおけるウリジン残基のうちの少なくとも約５０％、または少なくとも約７０％、または約１００％が、Ｎ１－メチルシュードウリジンまたはシュードウリジンである、請求項２９に記載のＲＮＡ。
  31. 請求項１から３０のいずれか一項に記載のＲＮＡをコードするポリヌクレオチドまたはそれに相補的なポリヌクレオチドであって、必要に応じて、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリッド、またはそれらのそれぞれのアナログの群から選択される、ポリヌクレオチド。
  32. 少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異を含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号５５の配列またはその同等物を含む、ポリヌクレオチド。
  33. 少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸突然変異を含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号５２の配列またはその同等物を含む、ポリヌクレオチド。
  34. 請求項３１から３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  35. その転写を誘導するように前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列をさらに含む、請求項３４に記載のベクター。
  36. 前記調節配列が、プロモーターを含む、請求項３５に記載のベクター。
  37. 前記プロモーターが、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、必要に応じて、Ｔ７プロモーター、またはＳＰ６プロモーター、またはＴ３プロモーターを含む、請求項３６に記載のベクター。
  38. 検出可能なマーカー、精製マーカー、または選択マーカーから選択されるマーカーをさらに含む、請求項３４から３７のいずれか一項に記載のベクター。
  39. 非ウイルスベクター、必要に応じて、プラスミド、またはリポソーム、またはミセルである、請求項３４から３８のいずれか一項に記載のベクター。
  40. 前記プラスミドが、配列番号３３、配列番号５３、またはその同等物を含むか、またはそれからなる、請求項３９に記載のベクター。
  41. ウイルスベクター、必要に応じて、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター、または植物ウイルスベクターである、請求項３２から３６のいずれか一項に記載のベクター。
  42. 請求項１から３０のいずれか一項に記載のＲＮＡ、請求項３１から３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項３４から４１のいずれか一項に記載のベクターのうちの１つまたは複数を含む、細胞。
  43. 原核生物細胞、必要に応じて、大腸菌細胞である、請求項４２に記載の細胞。
  44. 真核生物細胞、必要に応じて、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または酵母細胞である、請求項４２に記載の細胞。
  45. 担体と、請求項１から３０のいずれか一項に記載のＲＮＡ、請求項３１から３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３４から４１のいずれか一項に記載のベクター、または請求項４２から４４のいずれか一項に記載の細胞のうちの１つまたは複数とを含む組成物。
  46. 前記担体が、薬学的に許容される担体である、請求項４５に記載の組成物。
  47. 請求項１から３０のいずれか一項に記載のＲＮＡを産生させる方法であって、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の細胞を、前記ＲＮＡを発現させるのに好適な条件下において培養するステップを含む、方法。
  48. 請求項１から３０のいずれか一項に記載のＲＮＡを産生させる方法であって、請求項３１から３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３４から４１のいずれか一項に記載のベクターを、前記ＲＮＡを発現させるのに好適な条件下において、ＲＮＡポリメラーゼ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン－５’－三リン酸（ＧＴＰ）、およびウリジン三リン酸（ＵＴＰ）または化学的に改変されたＵＴＰと接触させるステップを含む、方法。
  49. 前記ＲＮＡを単離するステップをさらに含む、請求項４７または４８に記載の方法。
  50. 請求項１から３０のいずれか一項に記載のＲＮＡと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
  51. 前記薬学的に許容される担体が、ヒスチジン－リシンコポリマー（ＨＫＰ）を含むポリマーナノ粒子を含む、請求項５０に記載の組成物。
  52. 前記ＨＫＰが、配列番号３４から４７から選択される側鎖を含む、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記薬学的に許容される担体が、脂質をさらに含む、請求項５１または５２に記載の組成物。
  54. 前記脂質が、カチオン性脂質を含む、請求項５３に記載の組成物。
  55. 前記カチオン性脂質が、イオン化可能である、請求項５４に記載の組成物。
  56. カチオン性脂質が、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）もしくはジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、またはその両方を含む、請求項５１または５２に記載の組成物。
  57. 前記脂質が、ヘルパー脂質、コレステロール、またはＰＥＧ化脂質のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項５４から５６のいずれか一項に記載の組成物。
  58. 前記薬学的に許容される担体が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、請求項５０に記載の組成物。
  59. 前記ＬＮＰが、９－ヘプタデカニル８－｛（２－ヒドロキシエチル）［６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル］アミノ｝オクタノエート（ＳＭ－１０２）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、またはこれらのそれぞれの同等物のうちの１つまたは複数を含む、請求項５８に記載の組成物。
  60. 前記ＬＮＰが、ヘルパー脂質、コレステロール、またはＰＥＧ化脂質のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項５９に記載の組成物。
  61. 前記ヘルパー脂質が、ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、（２Ｒ）－３－（ヘキサデカノイルオキシ）－２－｛［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エノイル］オキシ｝プロピル２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＰＯＰＣ）、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のうちの１つまたは複数を含む、請求項５７または６０に記載の組成物。
  62. 前記コレステロールが、植物性コレステロールもしくは動物性コレステロール、またはその両方を含む、請求項５７および６０から６１のいずれか一項に記載の組成物。
  63. 前記ＰＥＧ化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（Ｒ－３－［（ω－メトキシ－ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン）、ＰＥＧ－ＤＳＧ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＧ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール）、必要に応じて、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００）］、またはＰＥＧ－ＤＰＧ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）のうちの１つまたは複数を含む、請求項５７および６０から６２のいずれか一項に記載の組成物。
  64. 前記ＬＮＰが、ＳＭ－１０２、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む、請求項５７および６０から６３のいずれか一項に記載の組成物。
  65. 前記ＳＭ－１０２、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ２００－ＤＭＧの質量比が、約１：１：１：１である、ならびに／または前記ＳＭ－１０２、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ２０００－ＤＭＧのモル比が、約５０：１０：３８．５：１．５である、請求項６４に記載の組成物。
  66. 請求項５０から５７のいずれか一項に記載の組成物を産生させる方法であって、請求項１から３０のいずれか一項に記載のＲＮＡを、ＨＫＰと接触させるステップであって、それによって、前記ＲＮＡおよび前記ＨＫＰが、ナノ粒子へと自己アセンブルする、ステップを含む、方法。
  67. 接触させるステップにおけるＨＫＰおよび前記ＲＮＡの質量比が、約１０：１～約１：１０、必要に応じて、２．５：１である、請求項５８または５９に記載の方法。
  68. 前記ＨＫＰおよびＲＮＡを、カチオン性脂質と接触させるステップをさらに含む、請求項６６または６７に記載の方法。
  69. 前記カチオン性脂質が、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）もしくはＤＯＴＡＰ（ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニオ）プロパン）、またはその両方を含む、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記接触させるステップにおける前記カチオン性脂質および前記ＲＮＡの質量比が、約１０：１～約１：１０、必要に応じて、１：１である、請求項６８または６９に記載の方法。
  71. 前記接触させるステップにおける前記ＨＫＰ、ｍＲＮＡ、および前記カチオン性脂質の質量比が、約４：１：１である、請求項６８から７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 請求項５０および５８から６５のいずれか一項に記載の組成物を産生させる方法であって、請求項１から３０のいずれか一項に記載のＲＮＡを、脂質と接触させるステップであって、それによって、前記ＲＮＡおよび前記脂質が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）へと自己アセンブルする、ステップを含む、方法。
  73. 前記ＬＮＰが、９－ヘプタデカニル８－｛（２－ヒドロキシエチル）［６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル］アミノ｝オクタノエート（ＳＭ－１０２）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、またはこれらのそれぞれの同等物のうちの１つまたは複数を含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記ＬＮＰが、ヘルパー脂質、コレステロール、またはＰＥＧ化脂質のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記ヘルパー脂質が、ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、（２Ｒ）－３－（ヘキサデカノイルオキシ）－２－｛［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エノイル］オキシ｝プロピル２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＰＯＰＣ）、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のうちの１つまたは複数を含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記コレステロールが、植物性コレステロールもしくは動物性コレステロール、またはその両方を含む、請求項７４または７５に記載の方法。
  77. 前記ＰＥＧ化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（Ｒ－３－［（ω－メトキシ－ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン）、ＰＥＧ－ＤＳＧ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＧ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール）、必要に応じて、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００）］、またはＰＥＧ－ＤＰＧ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）のうちの１つまたは複数を含む、請求項７４から７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記ＬＮＰが、ＳＭ－１０２、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む、請求項７２から７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記ＳＭ－１０２、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ２００－ＤＭＧの質量比が、約１：１：１：１である、ならびに／または前記ＳＭ－１０２、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ２０００－ＤＭＧのモル比が、約５０：１０：３８．５：１．５である、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記接触させるステップが、必要に応じてスリットインターディジタルマイクロミキサーまたはジグザグヘリンボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ）から選択される、マイクロ流体ミキサーにおいて行われる、請求項６４から７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. （ａ）対象が症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有するのを予防すること、
    （ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答の誘導を、それを必要とする対象において行うこと、
    （ｃ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはそのＳタンパク質のアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）との結合の低減を、それを必要とする対象において行うこと、
    （ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象を処置すること、または
    （ｅ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス負荷の低減を、それを必要とする対象において行うこと
    のうちの１つまたは複数を行う方法であって、
    前記対象に、請求項１から３０のいずれか一項に記載のＲＮＡまたは請求項５０から６５のいずれか一項に記載の組成物のうちの１つまたは複数を投与するステップを含む、
    方法。
  82. 対象を、追加の治療剤で処置するステップをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
  83. 前記追加の治療剤が、
    抗ウイルス剤、必要に応じて、レムデシビル、ロピナビル、リトナビル、イベルメクチン、タミフル、もしくはファビピラビル、
    抗炎症剤、必要に応じて、デキサメタゾン、トシリズマブ、ケブザラ、コルクリス、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、もしくはキナーゼ阻害剤、
    ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症から回復した対象に由来する回復期血漿、
    ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体、必要に応じて、バムラニビマブ、エテセビマブ、カシリビマブ、もしくはイムデビマブ、または
    抗生物質剤、必要に応じて、アジスロマイシン
    のうちの１つまたは複数を含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記対象が、前記ＲＮＡまたは前記組成物が投与されるときに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有さない、請求項８１から８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記ＲＮＡまたは前記組成物が、投与の前または最中に、ネブライザー吸入システムによって霧化される、請求項８１から８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記ネブライザーシステムが、全気道薬物送達のための持ち運び可能なネブライザーである、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記ＲＮＡまたは前記組成物が、皮下注射によって投与される、請求項８１から８４のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記ＲＮＡまたは前記組成物が、筋肉内注射によって投与される、請求項８１から８４のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記ＲＮＡまたは前記組成物が、腹腔内注射（ｉ．ｐ）によって投与される、請求項８１から８４のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記ＲＮＡまたは前記組成物が、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、少なくとも４２日間、少なくとも４９日間、少なくとも５６日間、または少なくとも６４日間の間隔で、２回投与される、請求項８１から８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 請求項１から３０のいずれか一項に記載のＲＮＡまたは請求項５０から６５のいずれか一項に記載の組成物と、ネブライザーとを含む吸入システム。
  92. 前記ネブライザーが、全気道薬物送達のための持ち運び可能なネブライザーである、請求項９１に記載の吸入システム。
  93. 請求項８１から９０のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキットであって、使用のための説明書と、請求項１から３０のいずれか一項に記載のＲＮＡ、請求項４８から６３のいずれか一項に記載の組成物、または請求項８９もしくは９０に記載の吸入システムのうちの１つまたは複数とを含む、キット。
  94. 請求項４７および６６から８０のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキットであって、使用の説明書と、請求項１から３０のいずれか一項に記載のＲＮＡ、請求項３１から３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３４から４１のいずれか一項に記載のベクター、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の細胞、請求項４５もしくは４６に記載の組成物のうちの１つまたは複数と、ＨＫＰ、または脂質、必要に応じてカチオン性脂質とを含む、キット。
  95. 請求項４８または４９における使用のためのキットであって、使用の説明書と、請求項３１から３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３４から４１のいずれか一項に記載のベクターと、ＲＮＡポリメラーゼと、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰまたは化学的に改変されたＵＴＰとを含む、キット。
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