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JP2024522947A - 極めて高い特異性及び感度で標的核酸を増幅及び検出するための方法 - Google Patents

極めて高い特異性及び感度で標的核酸を増幅及び検出するための方法 Download PDF

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Abstract

核酸増幅による核酸標的検出方法であって、少なくとも１種の標的核酸と、核酸分子にハイブリダイゼーションする際または核酸分子に組み込まれる際に余分に発光するように適合された少なくとも１種の発光基／部分で標識された、少なくとも１種の非伸長性オリゴヌクレオチドまたは伸長可能なオリゴヌクレオチドとを提供すること；発光基／部分の色を異なる色に変換するかまたはそれを発熱（ｔｈｅｒｍａｌｉｓｅ）するように適合された少なくとも１種のコンバーターまたはアクセプター基／部分で標識されており、増幅産物に組み込まれる、少なくとも１種の伸長可能なオリゴヌクレオチドを提供すること；発光基で標識されたオリゴヌクレオチドの発光基／部分を標的核酸増幅産物にハイブリダイズさせるかまたは組み込むことであって、それにより発光基／部分が余分に発光し、余分な発光が標的増幅の尺度となる、ハイブリダイズさせるかまたは組み込むこと、を含む、方法。方法では、いかなる非特異的増幅も、発光基の余分な発光のみの除去を選択的に制御することにより、制御された減衰下で検出可能なシグナルを一切生成しない。【選択図】 図１

Description

本発明は、核酸増幅のためのプロセスに関する。より具体的には、Ｌｉｂｒａプライマー対及びＬｉｂｒａプローブ－プライマー対を含む当該プロセスは、極めて高い特異性及び感度で標的核酸を増幅及び検出する。
全ての生体及び細胞に存在する遺伝性（遺伝）物質であるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、それらの全ての特性及び能力の設計図である。このため、遺伝物質は、生体もしくはウイルスまたはその任意の特別な特性の同定、あるいは遺伝子型の変動の判定、あるいは生体の疾患または欠損の分子分析のために想定されてきた。細胞中ならびに生体の器官及び組織の入手可能な試料中の核酸の量が少ないため、核酸の検出または分析には、核酸の検出及び／または定量化のためにその量を増幅する必要がある。過去４０年間に多くの核酸増幅技術が開発されてきた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は最も重要であり、開発された最初の増幅技術であり（米国特許第４，６８３，１９５号明細書；同第４，６８３，２０２号明細書；及び同第４，９６５，１８８号明細書；Saiki et al., 1985, Science 230:1350-1354）、ＬＤＲ及びＰＣＲ（米国特許第６，７９７，４７０号明細書）、１種以上のＲＮＡポリメラーゼを使用する等温増幅反応または手順（国際公開第２００６／０８１２２２号パンフレット）、鎖置換増幅（米国特許第ＲＥ３９，００７Ｅ号明細書）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Wu, et al Genomics 4: 560-569(1990)、Barany, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189 - 193 (1991)）、Ｑβ ＲＮＡレプリカーゼ系（国際公開第１９９４／０１６１０８号パンフレット）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（米国特許第５，８５４，０３３号明細書）、ＮＡＳＢＡ（米国特許第５，１３０．２３８号明細書）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）（Nucleic Acids Research ---）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ヘリカーゼポリメラーゼ増幅（ＨＰＡ）が特に挙げられ、これらの各々はその全体が参照により本明細書に援用される。
測定可能／定量可能なシグナルを生成するための多くの化学反応も開発されており、中でもとりわけ、蛍光ベースの化学反応が最適な化学反応であり、中でも最も重要なものとしては、フルオロフォア及びクエンチャーで二重標識された加水分解プローブを使用するＴａｑｍａｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（米国特許第５，５３８，８４８号明細書）、プライマーの１つに二重標識ステム構造プローブ及びＰＣＲブロッカーエレメント（ＰＣＲ ｂｌｏｃｋｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）ヘキサエチレン単量体を含むＳｃｏｒｐｉｏｎプライマー法（Whitcombe, et al Nat Biotech. 17: 804-807(1999)、米国特許第６，５８９，７４３号明細書、Solinas et al Nucleic Acids Res 29: E96,2001）、二本鎖ＤＮＡにインターカレートしたときに一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに結合したときよりも強力に蛍光を発するインターカレーティング色素である臭化エチジウム（米国特許第５，９９４，０５６号明細書；同第６，１７１，７８５号明細書、同第６，８１４，９３４号明細書）、インターカレーティング色素ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ１［Ririe et al., Analytical Biochem. 245: 154 (1997)］、分子ビーコン（米国特許５，９２５，５１７号明細書及び同第６，１０３，４７６号明細書、同第６，４８５，９０１号明細書、同第６，３５５，４２１号明細書及び同第６，５９３，０９１号明細書）、ＬＵＸプライマー（Nazarenko et al Nucleic Acids Res 30:e37,2002）、ＦＲＥＴシグナルを生成するドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアで標識された直鎖状プライマー対（国際公開第０３／１０２２３９Ａ２号パンフレット）が特に挙げられ、これらの各々はその全体が参照により本明細書に援用される。
核酸増幅では、増幅の範囲は非常に大きく、数コピーから数十億コピーの標的核酸が合成され得る。しかし、核酸増幅に伴う問題は、特異的増幅産物とともに非特異的増幅産物が生成されることである。しばしば観察される非特異的増幅産物の種類の１つは、鋳型非依存性増幅アーチファクトである「プライマー二量体」である。プライマー二量体は二本鎖増幅産物であり、その長さは典型的には、増幅反応に使用される２つのプライマーの長さの合計に近似する。これは、一方のプライマーが他方のプライマー上で伸長されるときに形成される。結果として生じる鎖状連結（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｉｏｎ）により、望ましくない鋳型が形成され、その鋳型は長さが短いことから、より効率的に増幅され、特異的標的増幅産物と競合する。同様に、２つの増幅プライマーに加えてプローブを使用する場合、一方のプライマーがプローブ上で伸長されるとき、同様の望ましくない鎖状連結された増幅アーチファクトである「プライマー二量体様」産物が形成され、その長さは典型的には、２つのプライマー及びプローブの長さの合計に等しい。これらの非特異的増幅産物は、標的核酸のコピー数が少ない場合、阻害物質が試料中に存在する場合、及び試薬、すなわちプライマー及びプローブの品質が良好ではない場合により多く形成される。非特異的増幅産物の形成を回避することは極めて困難であり、低減させることができるが消失させることは不可能である。これらの非特異的産物の形成は、検出方法の特異性及び感度を低下させる。
さらに、これら全てのシグナル生成化学反応では、非特異的増幅産物も同様に標的増幅産物とともにシグナルを生成し、標的検出感度及び特異性に影響を及ぼす。この問題を克服するために、非特異的増幅産物の形成を抑制することが問題の解決策として提供されている。また、これに対し、ホットスタート増幅、具体的にはホットスタートＰＣＲ増幅法が解決策として採用されている。段階的に改善されている多くのホットスタート法が開発されてきた。
例えば、とりわけ、試薬を分離または隔離するためのワックスなどの感熱性物質の使用（米国特許第５，４１１，８７６号明細書）、米国特許第５，３３８，６７１号明細書、同第５，６７７，１５２号明細書に記載されているＤＮＡポリメラーゼ特異的抗体によるＤＮＡポリメラーゼの熱可逆的阻害、米国特許第５，４１８，１４９号明細書に記載されている方法を使用した反応の開始前に形成された伸長産物の酵素的分解、３’末端でのプライマー（単数または複数）の化学修飾（米国特許第６，００１，６１１号明細書）、高温で元に戻るまたは解離する核酸ポリメラーゼの可逆的化学修飾（米国特許第５，７７３，２５８号明細書及びMoretti et al, Biotechniques 25: 716, 1998）があり、これらは全体が参照により組み込まれる。米国特許出願公開第２０２０／０３７０１０９号明細書と付された２０２０年１１月２６日付の最近の米国特許出願では、２つ以上の既存のホットスタート機構を組み合わせて使用するデュアルホットスタートによる解決策が開示されている。
あらゆる解決策があるにもかかわらず、核酸標的増幅の感度及び特異性を増加させる、核酸増幅の非特異的増幅問題に対する完全なまたは極めて良好な解決策は依然として見つかっていない。良好な感度と特異性の両方を有する単一のプロセスは存在せず、全ての既存のプロセスは概ね同じ特異性及び感度（それぞれ約９５％及び７０～８０％）を有する。非特異的増幅は感度及び特異性を低下させる。ホットスタートＰＣＲ以外で、ホットスタートＰＣＲに近い他の妥当な解決策はない。ホットスタートＰＣＲにより、反応設定中及び初期変性工程中の非特異的産物の形成を防止することができる。その後、ポリメラーゼは後続の熱サイクリングまたは増幅サイクルにおいて全ての温度で活性になるため、このサイクリング工程中のプライマー二量体またはプライマー二量体様非特異的産物の形成は回避することができない。非特異的増幅産物はサイズが小さいため、比較的より効率的な増幅用鋳型である。非特異的産物の形成は確率論的現象であり、増幅プロセスの初期サイクルで非特異的産物が形成される場合、非特異的産物が標的配列の増幅を凌駕し、その結果、標的増幅の失敗または標的増幅産物の収率低下及び標的検出の感度低下が生じる。よって、この問題に対する解決策ならびに本発明で論じられるようなより高い特異性及び感度での標的核酸の検出のための改善された核酸増幅プロセスが、依然として必要とされている。結果として、この問題は、過去３０年間で克服されていないＰＣＲ技術の発展に対する技術的制約となっている。結果として、ＰＣＲ及びｑＰＣＲは、新規技術であり極めて高価な装置を必要とするデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄＰＣＲ）に敗れつつある。よって、ＰＣＲ及び他の増幅プロセスにおける上記問題を費用効果が高い形で解決するための解決策または改善策が必要とされている。したがって、この問題に対するさらなる改善策またはより良好な解決策が必要とされている。
発明の目的
したがって、本発明の基本的な目的は、標的核酸の検出及び／または定量化のための核酸増幅方法を提供することである。
本発明の別の目的は、より高い感度及びより高い特異性を有し、プライマー二量体及びプライマー二量体様非特異的核酸増幅産物からの一切のシグナルまたは微小なシグナルを伴わない核酸増幅方法を提供することである。
本発明の別の目的は、プライマー二量体及びプライマー二量体様非特異的増幅産物からのシグナルの低減または消失を伴う方法を提供することにより、かかる非特異的シグナルの干渉に起因する従来のＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）及び他の核酸増幅法の問題に対する解決策によって問題を解決することである。
別の目的は、標的核酸の増幅ならびに標的核酸の検出及び／または定量化のためのキット（単数または複数）を提供することであり、キットは、ドナー・フルオロフォアもしくはアクセプター・フルオロフォア（放射性クエンチャー）／非放射性クエンチャーで別々に標識された本発明の標識されたプライマー対、または本発明のドナー・フルオロフォアで標識されたプローブ、アクセプター・フルオロフォア（放射性クエンチャー）／非放射性クエンチャーで標識されたプライマー及び非標識プライマーもしくはアクセプター・フルオロフォア（放射性クエンチャー）／非放射性クエンチャーで標識された２つのプライマー、のいずれかを含み、本発明はまた、１種以上の増幅試薬、例えば、核酸ポリメラーゼまたはリガーゼ、ヌクレオシド三リン酸及び適切な緩衝液を制限なく含み得る。
さらに別の目的は、本発明のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア（放射性クエンチャー）／非放射性クエンチャーで標識されたプライマーまたはドナー・フルオロフォアで標識されたプローブ及びアクセプター・フルオロフォア（放射性クエンチャー）／非放射性クエンチャーで標識されたプライマー（複数可）を使用して、試料中の標的核酸の絶対定量化を達成することである。
発明の概要
したがって、本発明における基本的な態様によれば、核酸増幅による核酸標的の検出及び／または定量化の方法であって、
少なくとも１種の標的核酸と、核酸分子にハイブリダイゼーションする際または核酸分子に組み込まれる際に余分に発光するように適合された少なくとも１種の発光基／部分で標識された、少なくとも１種の非伸長性オリゴヌクレオチドまたは伸長可能なオリゴヌクレオチドとを提供すること、
発光基／部分の色を異なる色に変換するかまたはそれを発熱（ｔｈｅｒｍａｌｉｓｅ）するように適合された少なくとも１種のコンバーターまたはアクセプター基／部分で標識されており、増幅産物に組み込まれる、少なくとも１種の伸長可能なオリゴヌクレオチドを提供すること、
発光基で標識されたオリゴヌクレオチドの発光基／部分を標的核酸増幅産物にハイブリダイズさせるかまたは組み込むことであって、それにより発光基／部分が余分に発光し、余分な発光が標的増幅の尺度となる、ハイブリダイズさせるかまたは組み込むこと、を含み、
核酸増幅が、特定のシグナリング部分とアテニュエーターもしくはアクセプター部分との対の、シグナリングオリゴヌクレオチド上のシグナリング部分を選択的に配置することにより、及びアテニュエーターもしくはアクセプターオリゴヌクレオチド上のアテニュエーターもしくはアクセプター部分を選択的に配置することにより、コンバーターまたはアクセプター基／部分による非特異的増幅産物中の発光基の余分な発光のみの除去を選択的に制御することによって、いかなる非特異的増幅も、制御された減衰下で検出可能なシグナルを一切生成しないように行われ、その結果、非特異的産物からの正味のシグナル増強及び正味のシグナル、標的増幅シグナルの正味のシグナル減衰及び減少がない、方法が提供される。
本発明の別の態様は、非特異的増幅産物におけるシグナルの減衰の程度が、非特異的増幅産物におけるシグナリング部分のシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しく、その結果、非特異的産物からの正味のシグナル増強及び正味のシグナル、標的増幅シグナルの正味のシグナル減衰及び減少がない、方法を提供する。
本発明のさらに別の態様は、シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端からのシグナリング部分で標識された塩基の距離に、レシーバーまたはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端からのアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識された塩基の距離を加算し、シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端とアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端との間の起こり得る重複の距離を減算した距離が、非特異的増幅産物におけるシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しいシグナルの減衰をもたらす、非特異的増幅産物中のシグナリング部分で標識された塩基とアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識された塩基との間の分離距離を含む、方法を提供することである。
本発明のさらに別の態様は、シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端からシグナリング部分で標識された塩基を分離している塩基の数に、アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端からアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識された塩基を分離している塩基の数を加算し、シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端とアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端との間の起こり得る塩基重複の数を減算したものが、非特異的増幅産物におけるシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しいシグナルの減衰をもたらす、非特異的増幅産物中のシグナリング部分で標識された塩基とアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識された塩基との間を分離している塩基の数を構成する、方法を提供する。
本発明のさらに別の態様は、シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端からのシグナリング部分で標識された塩基の距離に、レシーバーまたはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端からのアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識された塩基の距離を加算し、シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端とアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端との間の起こり得る重複の距離を減算したものが、非特異的増幅産物におけるシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しいシグナルの減衰をもたらす、非特異的増幅産物中のシグナリング部分で標識された塩基とアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識された塩基との間の分離距離を構成する、方法を提供する。
本発明の別の態様は、シグナル増強及び対応する減衰の程度が、（ｉ）約１～１００％のシグナル増強の場合、非特異的増幅産物からの均衡した非実質的シグナルのためのシグナルの対応する減衰が約１～５０％に維持されるように選択的に制御され、（ｉｉ）約２０～８０％のシグナル増強の場合、非特異的増幅産物からの均衡した非実質的シグナルのためのシグナルの対応する減衰が約１７～４５％に維持されるように選択的に制御され、（ｉｉｉ）約３０～７０％のシグナル増強の場合、非特異的増幅産物からの均衡した非実質的シグナルのためのシグナルの対応する減衰が約２３～４０％に維持されるように選択的に制御される、方法を提供する。
本発明のさらに別の態様は、使用されるシグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドが、標的増幅産物または標的の一方の鎖にハイブリダイズする、核酸増幅をモニタリングするためのプローブであり、使用されるアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドが、プローブがハイブリダイズするのと同じ鎖または標的増幅産物もしくは標的の他方の鎖のいずれかにアニーリングされる核酸増幅プライマーの一方であり、使用される両方の増幅プライマーがアテニュエーターもしくはアクセプター部分で選択的に標識される、方法を提供する。
本発明の別の態様は、シグナリング部分が、シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端上または３’末端から最大３０塩基離れた位置の、但し５’末端を除く、塩基のいずれかに配置され、アテニュエーターもしくはアクセプター部分が、アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端から少なくとも２塩基離れた任意の塩基上または３’末端から最大３０塩基離れた任意の塩基上に配置される、方法を提供する。
本発明のなお別の態様は、使用されるシグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチド及びアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドが、標的増幅産物または標的核酸の２本の鎖に別々にアニーリングし、かつポリメラーゼ（単数または複数）によって伸長される、２つの核酸増幅プライマーである方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、シグナリング部分が、シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端から少なくとも２ヌクレオチド離れた任意の塩基上または３’末端から最大３０塩基離れた位置の、但し５’末端を除く、塩基のいずれかに配置され、アテニュエーターもしくはアクセプター部分が、アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端から少なくとも２ヌクレオチド離れた任意の塩基上または３’末端から最大３０塩基離れた任意の塩基上に配置される、方法を提供する。
本発明のさらに別の態様は、使用されるシグナリング部分が、ドナー・フルオロフォアであり、使用されるアテニュエーターもしくはアクセプター部分が、アクセプター・フルオロフォアであるかまたはエネルギーを受容するがエネルギーもしくは電磁放射線を一切放出しない非放射性アクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分であり、シグナルが蛍光シグナルであり、シグナル減衰がドナー・フルオロフォアの蛍光シグナルのクエンチングであり、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター部分がエネルギー移動対である、方法を提供する。
本発明の別の態様は、非特異的増幅産物中のシグナリング部分で標識された塩基とアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識された塩基との間の分離距離が、非特異的増幅産物におけるシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しいシグナルの減衰がそれぞれ２Ｒ０距離とＲ０距離との間となるように選択される方法を提供し、ここで、３．７オングストロームは塩基間距離であり、Ｒ０は、シグナリング部分とアクセプター部分との対、より具体的にはドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアまたは非放射性アクセプター部分との対のフェルスター半径である（フェルスター半径Ｒ０値範囲 ２２Å～７５Å）。
本発明のさらなる態様は、非特異的増幅産物中のシグナリング部分で標識された塩基とアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識された塩基との間の分離距離が、選択的にそれぞれ１．３０２５Ｒ０距離～１．０３４Ｒ０距離である非特異的増幅産物におけるシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しいシグナルの減衰がもたらされるように選択される方法を提供し、ここで、３．７オングストロームは塩基間距離であり、Ｒ０は、シグナリング部分とアクセプター部分との対、より具体的にはドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアまたは非放射性アクセプター部分との対のフェルスター半径である（フェルスター半径Ｒ０値範囲 ２２Å～７５Å）。
本発明のさらに別の態様は、使用される非特異的増幅産物中のシグナリング部分で標識された塩基とアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識された塩基との間の分離距離が、それぞれ１．２２４Ｒ０距離～１．０６９９Ｒ０距離である非特異的増幅産物におけるシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しいシグナルの減衰をもたらすような方法を提供し、ここで、３．７オングストロームは塩基間距離であり、Ｒ０は、シグナリング部分とアクセプター部分との対、すなわちドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアまたは非放射性アクセプター部分との対のフェルスター半径である（フェルスター半径Ｒ０値範囲 ２２Å～７５Å）。
本発明のなお別の態様は、非特異的増幅産物中のシグナリング部分で標識された塩基とアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識された塩基との間を分離している塩基の数が、１．３０２５（Ｒ０）～１．０３４（Ｒ０）の距離に相当する非特異的増幅産物におけるシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しいシグナルの減衰が約（１．３０２５Ｒ０／３．７）塩基～（１．０３４Ｒ０／３．７）塩基となるように選択される方法を提供し、ここで、３．７オングストロームは塩基間距離であり、Ｒ０は、オングストロームで表されるドナー・フルオロフォア部分とアクセプター部分とのエネルギー移動対のフェルスター半径であり、フルオロフォア部分とアクセプター部分とのエネルギー移動対の全範囲で約６．１～２６．４塩基に相当する（フェルスター半径Ｒ０値範囲 ２２Å～７５Å）。
本発明のなお別の態様は、非特異的増幅産物中のシグナリング部分で標識された塩基とアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識された塩基との間を分離している塩基の数が、１．３０２５（Ｒ０）～１．０３４（Ｒ０）の距離に相当する非特異的増幅産物におけるシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しいシグナルの減衰が約（１．３０２５Ｒ０／３．７）塩基～（１．０３４Ｒ０／３．７）塩基となるように選択されることを提供し、ここで、３．７オングストロームは塩基間距離であり、Ｒ０は、オングストロームで表されるドナー・フルオロフォア部分とアクセプター部分とのエネルギー移動対のフェルスター半径であり、フルオロフォア部分とアクセプター部分とのエネルギー移動対の全範囲で約６．１～２６．４塩基に相当する（フェルスター半径Ｒ０値範囲 ２２Å～７５Å）。
本発明の別の態様は、非特異的増幅産物中のシグナリング部分で標識された塩基とアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識された塩基との間を分離している塩基の数が、１．２２４（Ｒ０）～１．０６９９（Ｒ０）の距離に相当する非特異的増幅産物におけるシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しいシグナルの減衰が約（１．２２４Ｒ０／３．７）塩基～（１．０６９９Ｒ０／３．７）塩基となるように選択される方法を提供し、ここで、３．７オングストロームは塩基間距離であり、Ｒ０は、オングストロームで表されるドナー・フルオロフォア部分とアクセプター部分とのエネルギー移動対のフェルスター半径であり、フルオロフォア部分とアクセプター部分とのエネルギー移動対の全範囲で約６．４～２４．８塩基に相当する（フェルスター半径Ｒ０値範囲 ２２Å～７５Å）。
本発明のさらに別の態様は、使用されるシグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチド及びアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドが直鎖状である方法を提供する。
本発明のなお別の態様は、標識されたプローブの３’末端及び／５’末端に追加の標識部分であるビオチンなどが配置される方法を提供する。
本発明の別の態様は、請求項６に記載のシグナリング部分もしくはドナー・フルオロフォアで標識されたプローブまたは請求項８に記載のシグナリング部分もしくはドナー・フルオロフォア部分で標識されたプライマーが、さらにアクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャーを、またはフルオロフォアで標識された塩基の近傍にある標識されたプライマーもしくはプローブの配列に十分に相補的でありステム構造を形成するための５～８塩基の配列を、５’末端に備えており、かつクエンチャーを備えているかまたは備えておらず、フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブと５～８塩基の配列との間の介在スペーサーを備えているかまたは備えていない、方法を提供する。
本発明のなお別の態様は、シグナリング部分またはドナー・フルオロフォア部分で標識された塩基とドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの３’末端とを分離している塩基の数に、アクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識された塩基とアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識されたプライマーの３’末端とを分離している塩基の数を加算したものが、ドナー・フルオロフォア部分とアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分とのエネルギー移動対の全範囲で６～４０塩基である、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、シグナリング部分またはフルオロフォアで標識された塩基とフルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの３’末端とを分離している塩基の数に、アクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識された塩基とアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識されたプライマーの３’末端とを分離している塩基の数を加算したものが、ドナー・フルオロフォアとアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分とのエネルギー移動対の全範囲で１０～３０塩基である、方法を提供する。
本発明のなおさらなる態様は、２つ以上のシグナリング部分またはドナー・フルオロフォアが、シグナリング部分で標識されたプローブまたはプライマー上に配置され、２つ以上のアクセプター部分またはクエンチャーが、アクセプター部分で標識されたプライマー（単数または複数）上に配置される、方法を提供する。
本発明の別の態様は、ネステッド核酸増幅において、第１のプライマー対が標的核酸の第１のセグメントを増幅し、第２のプライマー対が第１のセグメントの第２のセグメントを増幅する方法であって、第２のプライマー対が、アクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識された第２のプライマー対から選択される２つの核酸増幅プライマーを含む、シグナリング部分またはドナー・フルオロフォア部分で標識されかつアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識されたｌｉｂｒａプライマー対である、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、第１のプライマー対のプライマーが、さらにアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で適切に標識されて提供される、方法を提供する。
本発明のさらに別の態様は、セミネステッド核酸増幅において、第１のプライマー及び第２のプライマーが標的核酸の第１のセグメントを一緒に増幅し、第３のプライマーが第１のプライマーと共同して第１のセグメントの第２のセグメントを増幅する方法であって、第１のプライマー及び第３のプライマーが、シグナリング部分またはフルオロフォア部分で標識されかつアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識されたｌｉｂｒａプライマー対であり、第２のプライマーもまたアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーでさらに標識されて提供される、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、ネステッド核酸増幅において、第１のプライマー対が標的核酸の第１のセグメントを増幅し、第２のプライマー対が第１のセグメントの第２のセグメントを増幅し、プローブが使用され、このプローブが第２のセグメントにハイブリダイズし、プローブ及び第２のプライマー対が、それぞれシグナリング部分またはドナー・フルオロフォア部分で標識されたプローブ及びアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識されたプライマー（複数可）であり；ここで、第１のプライマー対もまたアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で適切に標識されてさらに提供される、方法を提供する。
本発明のさらに別の態様は、セミネステッド核酸増幅において、第１のプライマー及び第２のプライマーが標的核酸の第１のセグメントを一緒に増幅し、第３のプライマーが第１のプライマーとともに第１のセグメントの第２のセグメントを増幅し、第２のセグメントにハイブリダイズするプローブが使用され、プローブならびに第１のプライマー及び／または第３のプライマーが、それぞれシグナリング部分またはドナー・フルオロフォア部分で標識されたプローブ及びアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識されたプライマー（複数可）である、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、半合成標的核酸配列が、当該技術分野における任意の公知の方法（多くの方法があり、当業者であればこれらの方法を認識している）によって、第１の非標的配列または第１の非標的配列及び第２の非標的配列を標的核酸配列の一方または両方の末端に付加することにより生成され、標的核酸の増幅が、１つの標的特異的プライマー及び第１の非標的配列特異的プライマーによって、または第１及び第２の非標的配列特異的プライマーによって、のいずれかでそれぞれ駆動される方法であって、増幅プライマーが、配列番号２１及び２２を選択的に含む請求項８または本発明に記載のシグナリング部分またはドナー・フルオロフォア部分で標識されたプライマー及びアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識されたプライマーであり、また、第１の非標的配列及び第２の非標的配列がｔａｉｌ ＰＣＲによって標的配列に付加されており、第１の非標的配列及び第２の非標的配列が２つのＰＣＲプライマーの５’末端に付加されている、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、プローブがさらに提供され、ここで、このプローブ及びプライマーが、本発明の標識されたプライマー（複数可）及びプローブであり、シグナリング部分またはドナー・フルオロフォアで標識されたプローブである、方法を提供する。
本発明のさらに別の態様は、配列番号２２を選択的に含む、シグナリング部分またはドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブが、５’末端にクエンチャー／アクセプター・フルオロフォアを備えているか、またはドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーもしくはプローブのドナー・フルオロフォアで標識された塩基付近の塩基にハイブリダイズしてヘアピンを形成する５～８塩基の配列が付加されているかのいずれかであり、５’末端にクエンチャーを有しているかまたは有しておらず、かつリンカーで連結されているかまたはリンカーを有さない、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、シグナリング部分もしくはフルオロフォア部分で標識されたプライマーの標的増幅産物への組み込み時またはシグナリング部分もしくはフルオロフォア部分で標識されたプローブの標的増幅産物へのハイブリダイゼーション時のドナー・フルオロフォアのシグナル増強または蛍光増強の程度が、４～８倍であり、かかる産物からの非実質的シグナルのための非特異的増幅産物におけるシグナル減衰または蛍光クエンチングの程度が、７５～８７％であり、シグナリング部分またはフルオロフォア部分とアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分との分離が、０．８３２７（Ｒ０／３．７）塩基～０．７２８４（Ｒ０／３．７）塩基に相当する０．８３２７Ｒ０～０．７２８４Ｒ０である方法を提供し、ここで、３．７オングストロームは塩基間距離であり、Ｒ０は、オングストローム単位でのフルオロフォア部分とアクセプター部分とのエネルギー移動対のフェルスター半径であり、フルオロフォア部分とアクセプター部分とのエネルギー移動対の全範囲で約４～１６塩基に相当する（フェルスター半径Ｒ０値範囲 ２２Å～７５Å）。
本発明の別の態様は、シグナリング部分またはフルオロフォアで標識された塩基とフルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの３’末端とを分離している塩基の数に、アクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識された塩基とアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識されたプライマーの３’末端とを分離している塩基の数を加算したものが４～１６塩基である、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、第１のシグナリング部分または第１のフルオロフォア部分で標識された第１のプライマー、アクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識された第２のプライマー及び第２のシグナリング部分または第２のフルオロフォア部分で標識されたプローブが、核酸増幅に使用され、ここで、第１のシグナリング部分または第１のフルオロフォア部分が、標的増幅時に第１のシグナルを生成し、プローブの第２のシグナリング部分または第２のフルオロフォア部分が、標的増幅産物へのプローブのハイブリダイゼーション時に第２の蛍光シグナルを生成し、第１のシグナリング部分または第１のフルオロフォアで標識された第１のプライマー及びアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識された第２のプライマーが、本発明のシグナリング部分またはフルオロフォア部分で標識されたプライマーとアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識されたプライマーとの対であり、第１のシグナリング部分またはフルオロフォア部分で標識された第１のプライマー、アクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識された第２のプライマー及び第２のシグナリング部分または第２のフルオロフォア部分で標識されたプローブが、本発明の標識されたプライマー及びプローブであり、第１のシグナリング部分または第１のフルオロフォア部分が、第２のシグナリング部分または第２のフルオロフォア部分に対するアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーであるかまたはその逆である、方法３２を提供する。
本発明のさらなる態様は、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマー及びアクセプター・フルオロフォアで標識されたプライマーが、標的核酸配列を増幅するために使用され、ここで、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアが、プライマーの３’末端から少なくとも２ヌクレオチド離れて配置されており、ドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアとが、標的増幅産物中で５～３０塩基で分離されており、その結果、ＦＲＥＴシグナル、より具体的にはドナー・フルオロフォアの励起に対するアクセプター・フルオロフォアからの放出が標的増幅時に生成される、方法を提供する。
本発明の別の態様は、２つの増幅プライマーの一方が、アクセプター・フルオロフォアで標識されて提供され、標的配列にハイブリダイズするドナー・フルオロフォアで標識されたプローブが、代わりに標的核酸増幅に使用され、ここで、アクセプター・フルオロフォアが、標識されたプライマーの３’末端から少なくとも２ヌクレオチド離れて配置されており、ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブが、その３’末端でまたは５’末端塩基を除く３’末端から離れた塩基上でドナー・フルオロフォアで標識されており、ドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアとが、プローブが標的増幅産物にハイブリダイズするときに５塩基以上で分離されており、その結果、ＦＲＥＴシグナル、より具体的にはドナー・フルオロフォアの励起に対するアクセプター・フルオロフォアからの放出が標的増幅時に生成される、方法を提供する。
本発明のなおさらなる態様は、プローブがアクセプター・フルオロフォアで標識されて提供され、標識されたプライマーが代わりにドナー・フルオロフォアで標識されて提供される方法を提供する。
本発明のさらに別の態様は、標的増幅においてドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアとが１０～２０塩基で分離されている方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、標的増幅産物中でドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアとが１４～２０塩基で分離されている方法を提供する。
本発明の別の態様は、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの３’末端からドナー・フルオロフォアで標識された塩基を分離している距離または塩基の数に、アクセプター・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの３’末端からアクセプター・フルオロフォアで標識された塩基を分離している距離または塩基の数を加算し、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの３’末端とアクセプター・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの３’末端との間の重複距離または重複塩基の数を減算したものがそれぞれ、非特異的増幅産物からの非実質的シグナルのためのドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアとの間の静的クエンチングのための距離または相当する塩基の分離と等しい、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、静的クエンチングの距離がプラスマイナス３もしくはプラスマイナス２もしくはプラスマイナス１もしくは０であるか、または標識された塩基が互いに対向して配置される方法を提供する。
本発明のさらに別の態様は、３’末端に標的特異的配列もしくはポリチミジン配列もしくは１つ以上の非チミン塩基を有するポリチミジン配列を保有し、５’末端にプロモーター配列を保有する第１のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、または二本鎖アダプターであって、アダプターを標的配列に付着させるための塩基数個の５’末端突出部とアダプターの５’末端にあるプロモーター配列とを有するか、もしくはアダプターを標的配列に付着させるための塩基数個の３’末端突出部とアダプターの５’末端にあるプロモーター配列とを有する、二本鎖アダプターを使用して、または一続きの標的配列及びプロモーター配列を５’末端に有する第１のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プロモーター配列が、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである標的核酸配列に付加されており；
標的配列の線形増幅が、ＲＮＡポリメラーゼ及びリボヌクレオシド三リン酸を使用したＲＮＡ転写と併せて、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素及びデオキシヌクレオシド三リン酸を使用して、第２の標的特異的プライマーとプロモーター配列を保有する第１のオリゴヌクレオチドプライマーとを使用した連続的ポリメラーゼ伸長によって行われ、ここで、プロモーター配列を保有する第１のプライマー及び第２の標的特異的プライマーが、ドナー・フルオロフォア及びクエンチャー／アクセプター・フルオロフォアで標識された本発明の請求項８～１０及び１７のいずれか一項に記載のプライマー対であり、使用されるシグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチド及びアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドが、標的増幅産物または標的核酸の２本の鎖に別々にアニーリングし、かつポリメラーゼ（単数または複数）によって伸長される、２つの核酸増幅プライマーであり（請求項８）；シグナリング部分が、シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端から少なくとも２ヌクレオチド離れた任意の塩基上または３’末端から最大３０塩基離れた位置の、但し５’末端を除く、塩基のいずれかに配置され、アテニュエーターもしくはアクセプター部分が、アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端から少なくとも２ヌクレオチド離れた任意の塩基上または３’末端から最大３０塩基離れた任意の塩基上に配置され（請求項９）；使用されるシグナリング部分が、ドナー・フルオロフォアであり、使用されるアテニュエーターもしくはアクセプター部分が、アクセプター・フルオロフォアであるかまたはエネルギーを受容するがエネルギーもしくは電磁放射線を一切放出しない非放射性アクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分であり（請求項１０）、使用されるシグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチド及びアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドが直鎖状である（請求項１７）、方法を提供する。
本発明の別の態様は、プロモーター配列を保有する第１のプライマー及び第２のプライマーのいずれかまたは両方が、クエンチャーまたはアクセプター・フルオロフォアで標識されており、ドナー・フルオロフォアで標識された標的特異的プローブが使用され、標識されたプローブ及び標識されたプライマー（複数可）が、請求項６に記載のシグナリング部分またはドナー・フルオロフォアで標識されたプローブを有する、本発明のドナー・フルオロフォアで標識されたプローブ及びアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーで標識されたプライマー（複数可）であり；ここで、シグナリング部分が、シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端上または３’末端から最大３０塩基離れた位置の、但し５’末端を除く、塩基のいずれかに配置され、アテニュエーターもしくはアクセプター部分が、アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端から少なくとも２塩基離れた任意の塩基上または３’末端から最大３０塩基離れた任意の塩基上に配置され（請求項７）；使用されるシグナリング部分が、ドナー・フルオロフォアであり、使用されるアテニュエーターもしくはアクセプター部分が、アクセプター・フルオロフォアであるかまたはエネルギーを受容するがエネルギーもしくは電磁放射線を一切放出しない非放射性アクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分であり（請求項１０）；使用されるシグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチド及びアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドが直鎖状である（請求項１７）、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、クエンチャーが、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの５’末端にも付着されている方法を提供する。
本発明のなおさらなる態様は、核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含み、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、アレルまたはアレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応（アレルＰＣＲ）、アレルＲＴ－ＰＣＲ、Ｔａｉｌ ＰＣＲ、ドロップレットＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、非対称ＰＣＲ（２つのプライマーの一方が他方のプライマーと比較して極めて低濃度で使用され、一本鎖標的増幅産物が生成される）、ネステッドＰＣＲ、セミネステッドＰＣＲ、メチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ）ＰＣＲ、ｉｎ－ｓｉｔｕ ＰＣＲであり、標的増幅産物のサイズが、３５～４００塩基対、好ましくは５０～２５０塩基対である、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、核酸増幅反応が、ループ媒介等温核酸増幅反応（ＬＡＭＰ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応（ＲＰＡ）、ヘリカーゼポリメラーゼ増幅反応（ＨＰＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）を含むがこれらに限定されない等温核酸増幅反応を含み、ここで、ＬＡＭＰで使用されるループプライマーがＤＮＡ鎖分離を促進し、リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、ジャイレース、トポイソメラーゼなどの鎖分離酵素が、一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質と共同での変性または鎖分離のためにＲＰＡ及びＨＰＡで使用され、標的増幅産物のサイズが、７５～１０００塩基対、好ましくは１００～２５０塩基対である、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、標識されたプライマー－プローブ対を使用して標的核酸の絶対定量化が行われ、ここで、使用されるシグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドが、標的増幅産物または標的の一方の鎖にハイブリダイズする、核酸増幅をモニタリングするためのプローブであり、使用されるアテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドが、核酸増幅プライマーの一方であり（請求項６に記載）；
シグナリング部分が、シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端上または３’末端から最大３０塩基離れた位置の、但し５’末端を除く、塩基のいずれかに配置され、アテニュエーターもしくはアクセプター部分が、アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端から少なくとも２塩基離れた任意の塩基上または３’末端から最大３０塩基離れた任意の塩基上に配置され（請求項７に記載）；
使用されるシグナリング部分が、ドナー・フルオロフォアであり、使用されるアテニュエーターもしくはアクセプター部分が、アクセプター・フルオロフォアであるかまたはエネルギーを受容するがエネルギーもしくは電磁放射線を一切放出しない非放射性アクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分であり、シグナルが蛍光シグナルであり、シグナル減衰がドナー・フルオロフォアの蛍光シグナルのクエンチングであり、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター部分がエネルギー移動対である（請求項１０）、方法；
ならびに、配列番号２１及び２２を選択的に含む標識されたプライマー対及びそのためのキット（単数または複数）であって、キット（単数または複数）が、少なくとも１種のドナー・フルオロフォアで標識されたオリゴヌクレオチドプローブ及びアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー（複数可）、
または少なくともドナー・フルオロフォアで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー及びアクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドプライマーであって、使用されるシグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチド及びアテニュエーター部分もしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドが、標的増幅産物もしくは標的核酸の２本の鎖に別々にアニーリングし、かつポリメラーゼ（単数または複数）によって伸長される、２つの核酸増幅プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマー、を１つ以上の容器中に含むキット（単数または複数）を提供し、
キット（単数または複数）は、反応緩衝液、複数のデオキシヌクレオシド三リン酸、ポリメラーゼ酵素（単数または複数）、陽性対照鋳型及び増幅用の対応する標識されたプライマー対、ならびに追加の構成成分をさらに含有し得る。
本発明の別の態様は、オリゴヌクレオチドが、選択的に１０～５０塩基長、好ましくは１５～３５塩基長、より好ましくは２０～３０塩基長であり、標的配列に相補的であり、標的上でハイブリダイズまたはアニーリングする能力を有しており、標的上で核酸合成をプライミングする能力を失っておらず、１つ以上の修飾塩基、または修飾糖部分（単数または複数）、または１つ以上の塩基アナログを保有している、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、陽性対照鋳型及び陽性対照鋳型に特異的な請求項６～１７、２８、２９、３４、３５、４６のいずれか一項に記載の標識されたプライマー対または標識されたプライマーとプローブとの対が増幅反応中にさらに提供される、方法を提供する。
本発明のさらに別の態様は、本発明の請求項６～１７、２８～２９、３４～３５、４６のいずれか一項に記載のドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーとアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーとの複数の対またはドナー・フルオロフォアで標識されたプローブとアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーとの複数の対が、複数の標的配列の同時検出及び／または定量化のための多重化反応に使用される、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、１つまたは複数または非常に多数の、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはドナー・フルオロフォアで標識されたプローブが、多炭素原子（ｍｕｌｔｉ－ｃａｒｂｏｎ ａｔｏｍ）有機リンカーまたはポリエチレングリコールまたはハイブリッドリンカーまたはポリチミジンオリゴヌクレオチドを介して、十分な長さの追加の有機リンカーを有してまたは有さずに、ガラスもしくはガラスウエハ、またはポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのプラスチック、またはデキストラン、セルロース、ナイロンなどの透明または半透明の固体表面に付着されるかまたは共有結合されるかまたは係留され、マイクロ流体チャネルが、単一の増幅反応において単一または複数または多数の核酸標的の検出に使用される、方法を提供する。
本発明の別の態様は、核酸増幅反応が、任意の公知の核酸増幅反応、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応を含み、有効量の増幅プライマーまたは有効量の標識されたプライマーと標識されたプローブまたは標識されたプライマーに加えて、少なくとも１種のポリメラーゼ酵素、反応緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸を試料に添加する工程と、少なくとも変性工程、アニーリング工程、伸長工程もしくはアニーリングと伸長とを組み合わせた単一の工程の間、または等温反応工程において試料をサイクルにかける工程と、ドナー・フルオロフォア励起光または放射線で反応混合物を励起させる工程と、ドナー・フルオロフォアまたはアクセプター・フルオロフォアの放出を測定する工程とを少なくとも含む、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、ドナー・フルオロフォア、アクセプター・フルオロフォア及びクエンチャーが、二本鎖ＤＮＡへのインターカレーション時に蛍光を増強させる、インターカレーティング色素臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ１（商標）、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（商標）、ＹＯＰＲＯ １（商標）、ＳＹＴＯ ９（商標）、アクリジンオレンジ、非対称シアニン色素を含むがこれらに限定されない二本鎖ＤＮＡインターカレーティング色素、及び色素フルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、６－ＦＡＭ（アジド）、２’７’－ジメトキシ－４’５－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、５－（４，６－ジクロロトリアジン－２イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＶＩＣ（ビクトリアブルー）、ＶＩＣとほぼ同一のスペクトルプロファイルを有するＭＡＸ ＶＩＣ、Ａ ＶＩＣ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の同等物であるＳＵＮ（商標）、ＴＹＥ（商標）５６３、ＴＹＥ ６６５、ＴＹＥ ７０５、ＮＥＤ、フルオレスカミン、ピレン、ピレンブチレート、スクシミジル（ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ）１ピレンブチレート、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミン１２３、ローダミンＢ、スルホローダミン、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、６－カルボキシ－Ｘローダミン（ＲＯＸ）、スルホローダミンｂ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－Ｘ、ＳＩＭＡ ｄｙｅ（商標）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－Ｘ、ＴＥＸ６１５ Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ＴＡＭＲＡ（商標）（アジド）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）－Ｘ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ（商標）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、テルビウムキレート、ユーロピウムキレート、量子ドット、グラフェン量子ドット、５－（２’－アミノエチル）アミノナフチルアミド－３，５ジスルホネート（ルシファーイエローｖｓ）、７－アミノ－４－メチルクマリン（ａｍｃ、クマリン１２０）、７－アミノ－４－トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）、シアニン２、シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７を含むがこれらに限定されないシアニン色素（スルホン化もしくは非スルホン化）、［５－ジメチルアミノ］ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、４－（４’－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、ＤＡＢＳＹＬ、４－ジメチルアミノフェニルアゾフェニル）－４’－イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、ＩＡＥＤＡＮＳ（５－（（（（２－ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレンスルホン酸）、ＥＤＡＮＳ、ＱＳＴ ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ ２１、ＱＳＹ ３５（ＱＳＹ色素はジアリール－ローダミン誘導体である）、ＢＩＯＤＩＰＹ ＦＬを含むがこれに限定されないＢＩＯＤＩＰＹ色素、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ３５０、４８８、５４６、５５５、５６８、５９４、６４７、６６０、７５０色素を含むがこれらに限定されないＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ色素、ＡＴＴＯ（商標）４８８（ＮＨＳエステル）、ＡＴＴＯ（商標）５３２、ＡＴＴＯ（商標）５５０、ＡＴＴＯ（商標）５６５、ＡＴＴＯ（商標）５９０、ＡＴＴＯ（商標）６３３、ＡＴＴＯ（商標）６４７Ｎ、ＡＴＴＯ（商標）Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ（商標）６４７Ｎ（ＮＨＳエステル）を含むがこれらに限定されないＡＴＴＯ色素、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、ＭＧＢ色素（主溝もしくは副溝結合色素）、ＬＩ－ＣＯＲ社のＩＲＤｙｅｓ（登録商標）ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）６４０、Ｄｙ７５０、非放射性クエンチャー（Ｎａｎｏｇｏｌｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー０、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー１、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー２、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー３、Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）、Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）、ＩＤＴ社クエンチャーＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）ＲＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、ＺＥＮ（商標）、ＴＡＯ及び／またはＺＥＮ（登録商標）、ナノ粒子クエンチャーを含むがこれらに限定されない）、一本鎖結合タンパク質を含む群から選択される方法を提供する。
本発明のさらに別の態様は、核酸増幅反応に使用されるポリメラーゼ酵素（単数または複数）が、天然であるかまたは修飾されているかまたはキメラの、鎖置換活性もしくは鋳型非依存性プライマー活性もしくは塩基伸長活性、エキソヌクレアーゼ活性を有するもしくは有さないＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素、または逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有するポリメラーゼ、またはＲＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼである、酵素であり、ここで、ポリメラーゼが、熱安定性、周囲温度または周囲温度未満で活性な酵素、ホットスタートポリメラーゼ（ポリメラーゼが高温、好ましくはプライマーアニーリング温度で加熱された後に活性化する）であり得る、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、核酸（メチル化もしくは非メチル化）または非核酸標的を検出するために使用される方法であって、核酸または非核酸標的に対して極めて高い親和性を有する第１の結合部分が、核酸または非核酸標的を捕捉するために使用され、かつ同じ第１の結合部分であり得るかまたは核酸もしくは非核酸標的に対して極めて高い親和性を有する異なる結合部分であり得る第２の結合部分が、捕捉された核酸または非核酸標的に結合するために使用されるか、あるいは極めて高い親和性で第２の結合部分に結合する第３の結合部分が使用され、ここで、第２の結合部分または第３の結合部分が、合成または天然の核酸標的分子が付加されて提供され、結合した第２の結合部分または第３の結合部分が、核酸が付加された未結合の第２の結合部分または第３の結合部分（ｕｎｂｏｕｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｐｐｅｎｄｅｄ ｓｅｃｏｎｄ ｏｒ ｔｈｉｒｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を洗い落とした後に、請求項６～１７、２８～２９、３４～３５、４６、５４のいずれか一項に記載のものを選択的に含むドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマー対またはプローブとプライマーとの対を使用した核酸増幅によって検出及び定量化され；
結合部分が、結合対である抗原－抗体、タンパク質－抗タンパク質抗体、抗体－抗体、抗体－抗ＩｇＧ抗体、一次抗体－二次抗体、プロテインＡ－抗体、プロテインＧ－抗体、ビオチン－アビジン、ビオチン－ストレプトアビジン、レクチン－糖、核酸－核酸、タンパク質－核酸、ペプチド核酸、アプタマー－アプタマー、アプタマー－核酸、アプタマー－タンパク質、ハプテン－抗ハプテン抗体から好ましくは選択され、ハプテンが、蛍光色素、ブロモ－ｄ－ＵＴＰ、アフラトキシン及び他のマイコトキシン、ペプチド、糖を含むがこれらに限定されない小分子である、方法を提供する。
本発明の別の態様は、多数のｍ－ＲＮＡまたはｃ－ＤＮＡの検出及び／または定量化のための方法であって、各ｍ－ＲＮＡまたはｃ－ＤＮＡ（ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ）に特異的な第１の増幅プライマーを提供すること、及びｍ－ＲＮＡまたはｃ－ＤＮＡに付加された配列から選択される共通プライマー（試料中の全てのｍ－ＲＮＡまたはｃ－ＤＮＡに共通）を第２の増幅プライマーとして提供し、かつさらに各ｍ－ＲＮＡまたはｃ－ＤＮＡに特異的なプローブを提供すること、を含み、ここで、第１の増幅プライマー、第２の共通増幅プライマー及びプローブが、６～１７、２８～２９、３４～３５、４６を選択的に含むプライマー及びプローブである、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブが、非ヌクレオチド有機リンカー、ヘキサメチレン、ヘキサポリエチレングリコールまたはそれらのキメラもしくはより長い長さのものを介してプライマーの一方に付着または連結されて提供され、プローブが、連結されたプライマーの伸長を通じて生成された新生核酸鎖（ｎａｓｃｅｎｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｔｒａｎｄ）にハイブリダイズする、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、核酸増幅反応を行うためのキットであって、
（ａ）請求項８～１７、２８、３４、４１、４３、４８～５０、５４～５６のいずれか一項に記載の、少なくともドナー・フルオロフォアで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー及びアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー；
（ｂ）請求項２８、４３、４８及び５０のいずれか一項に記載のものならびに配列番号２１～２２を選択的に含む、少なくともドナー・フルオロフォアで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー（単数または複数）及びアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー（単数または複数）；
（ｃ）請求項１９、２３、２４～２５、２９、３５、４８～５０のいずれか一項に記載のものを選択的に含む、少なくともドナー・フルオロフォアで標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（単数または複数）及びアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー（単数または複数）；
（ｄ）請求項４１に記載のものを選択的に含む、少なくともドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識された、プロモーター配列を保有する第１のプライマー及び標的特異的な第２のプライマー；
（ｅ）少なくとも陽性対照鋳型及び請求項６～１７、２４～３５、４１～４３、４８～５０、５４～５６のいずれか一項に記載のものを選択的に含む、陽性対照鋳型に特異的なドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマー対またはプライマー及びプローブ；
（ｆ）標識されたプライマー対であって、ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブが、非ヌクレオチド有機リンカー、ヘキサメチレン、ヘキサポリエチレングリコールまたはそれらのキメラもしくはより長い長さのものを介してアクセプター・フルオロフォア部分またはクエンチャー部分で標識されたプライマーに付着または連結されて提供され、プローブが、連結されたプライマーの伸長を通じて生成された新生核酸鎖にハイブリダイズする、標識されたプライマー対
を選択的に含む請求項６、１０～１７、２６～３３、３５、４２、４９～５０、５４～５６のいずれか一項に記載のものを選択的に含む、少なくともドナー・フルオロフォアで標識されたオリゴヌクレオチドプローブ及びアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー（複数可）を１つ以上の容器中に含む、キットを提供する。
別の態様では、本発明は、反応緩衝液、複数のデオキシヌクレオシド三リン酸、ポリメラーゼ酵素または酵素、陽性対照鋳型及び陽性鋳型のそれぞれの標識されたプライマー対を含むキットを提供する。
本発明のさらに別の態様は、標的核酸が、精製もしくは部分精製された核酸または未精製の核酸であり、天然もしくは合成もしくは半合成の一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖ｃ－ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、エキソソームＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍ－ＲＮＡ）、小分子ＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、ｓＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡを含むがこれらに限定されない）、極小胚様幹細胞を含む幹細胞由来ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡ、または癌細胞ＤＮＡ（体液、生検試料、腫瘍、膿、唾液、糞便、癌幹細胞を含むがこれらに限定されない任意の供給源に由来する）、及び１つまたは２つの非標的合成配列を標的核酸の末端に付加することにより生成される一本鎖または二本鎖の合成または半合成ＤＮＡまたはＲＮＡから選択されることを提供する。さらに、標的核酸は、核酸分子全体を構成する必要はなく、また、感染因子のゲノム配列、ゲノム配列の変異（数個の塩基もしくは長い配列の単一塩基の変化もしくは欠失もしくは挿入）、または生死を問わない、ヒト細菌、酵母、真菌、植物、動物、ヒト、寄生生物及びそれらのウイルスならびに任意の他の生物のゲノム配列の存在もしくは不在またはそれらの変異（数個の塩基もしくは長い配列の単一塩基の変化もしくは欠失もしくは挿入）は、疾患もしくは障害の存在、または感染症もしくは疾患もしくは障害に対する感受性、または疾患治療に対する適合性、出生前診断、遺伝形質、遺伝子型、アレル型、ＳＮＰ検出、細胞型、組織型、種もしくは株の種類、癌種もしくは癌のサブタイプ、癌の検出、疾患タイピングもしくはサブタイピング、発現遺伝子に関連付けられる。
本発明の設定の完全な理解は、以下の図を参照することによって得ることができる。
図１は、内部ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマー及び内部アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーを使用したＰＣＲ増幅の概略図を示す。ドナー・フルオロフォアはドナー固有の励起光で励起され、ドナー・フルオロフォアの放出が測定される。標的増幅時にドナー・フルオロフォアの蛍光が増強され、非特異的プライマー二量体の形成時にドナー・フルオロフォアの蛍光の増強及びクエンチングが同時に生じる。ドナー・フルオロフォアの蛍光の増強とクエンチングが均衡している場合、ドナー・フルオロフォアの正味の蛍光または正味のクエンチングは存在せず、その結果、ドナー・フルオロフォアからのシグナルがなくなり、よってプライマー二量体からのシグナルがなくなる。標的ＤＮＡ（１）は変性（２）により分離する（３）；プライマー及びポリメラーゼ（４）；プライマー伸長（５）；標的増幅産物（６）；プライマー二量体形成及びプライマー二量体（７、８）。 図２は、内部アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマー及びドナー・フルオロフォアで標識されたプローブを使用したＰＣＲ増幅の概略図を示す。ドナー・フルオロフォアはドナー・フルオロフォア固有の励起光で励起され、ドナー・フルオロフォアの放出が測定される。プローブの標的増幅時及びハイブリダイゼーション時にドナー・フルオロフォアの蛍光が増強され、非特異的プライマー二量体様産物の形成時及びドナー・フルオロフォアで標識されたプローブのハイブリダイゼーション時にドナー・フルオロフォアの蛍光の増強及びクエンチングが同時に生じる。ドナー・フルオロフォアの蛍光の増強とクエンチングが均衡している場合、ドナー・フルオロフォアの正味の蛍光または正味のクエンチングは存在せず、その結果、ドナー・フルオロフォアからのシグナルがなくなり、よってプライマー二量体様非特異的産物からのシグナルがなくなる。さらに、最初に形成されたプライマー二量体様非特異的産物は、プローブがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖に対して伸長され、増幅可能なプライマー二量体様非特異的産物を生成する。 図３～図２６は、増幅サイクル数に対する蛍光シグナルのグラフ表示である増幅曲線である。Ｃｑ値は、増幅反応の蛍光シグナルが機械によって設定された閾値蛍光シグナルを越える増幅サイクル数、かつ曲線の傾きが閾値線と交差するサイクル数である。Ｃｑ値は、試料中の標的コピーの数と線形相関し、試料中に存在する標的コピー数の指標である。各試料反応及び対照反応について反応が三連で実行されるため、各々に３本の曲線があり、いくつかの図では４本または５本の曲線がある。図３～８は、大腸菌ハウスキーピング遺伝子トレオニン合成酵素のフルオレセイン及びＢｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー１標識プライマー対ベースの増幅の増幅曲線であり、図２１は、１ｎｇのＤＮＡを使用した、大腸菌ハウスキーピング遺伝子ホモセリンキナーゼのフルオレセイン及びＢＨＱ１二重標識Ｔａｑｍａｎプローブベースのアッセイの増幅曲線であり、図２２は、本発明の方法の標識プライマープローブ対及び標識プライマー対ベースの検出の感度及び特異性を、本分野の至適基準であるＴａｑｍａｎプローブアッセイの感度及び特異性と比較するために同時に行われた、Ｔａｑｍａｎアッセイの鋳型なし対照反応である。図３、５及び７は、試料（１ｎｇのＤＮＡ）及びプライマー配列である配列番号８及び１０；配列番号９及び１０；配列番号７及び１０のそれぞれの増幅曲線である。図３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａはそれぞれの融解曲線である。 図４、６及び８は、プライマー配列である配列番号８及び１０；配列番号９及び１０；配列番号７及び１０をそれぞれ使用した、鋳型なし対照反応の増幅曲線である。 上記参照 上記参照 上記参照 上記参照 図９は、濃度０．４μＭのＦＡＭ標識プライマー配列番号９を使用した、鋳型なしでの増幅の増幅曲線を示す。図９Ａはその融解曲線である。 図１０は、濃度０．１μＭのＦＡＭ標識プライマー、配列番号９、及び濃度０．３μＭの配列番号１０を使用した、鋳型なしでの増幅の増幅曲線であり、図１０Ａはその融解曲線である。 図１１は、濃度０．２μＭのＦＡＭ標識プライマー、配列番号９、及び濃度０．３μＭの配列番号１０を使用した、鋳型なしでの増幅の増幅曲線であり、図１１Ａはその融解曲線である。 図１２は、濃度０．２μＭのＦＡＭ標識プライマー、配列番号９、及び濃度０．２μＭの配列番号１０を使用した、鋳型なしでの増幅の増幅曲線であり、図１２Ａはその融解曲線である。 図１３は、濃度０．１μＭのＦＡＭ標識プライマー、配列番号９、及び濃度０．３μＭの配列番号１０を使用した、１ｎｇの鋳型ＤＮＡを用いた増幅の増幅曲線であり、図１３Ａはその融解曲線である。 図１４は、濃度０．２μＭのＦＡＭ標識プライマー、配列番号９、及び濃度０．３μＭの配列番号１０を使用した、１ｎｇの鋳型ＤＮＡを用いた増幅の増幅曲線であり、図１４Ａはその融解曲線である。 図１５～１９は、大腸菌ハウスキーピング遺伝子トレオニン合成酵素のフルオレセイン標識プローブ及びＢｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー１標識プライマーベースの増幅の増幅曲線である。 同上 同上 同上 同上 図３参照 図３参照 図３参照 図２３及び図２４は、共通非標的プライマー対を使用した、大腸菌トレオニン合成酵素遺伝子標的の増幅に関する試料反応及び対照反応の増幅曲線である。 同上 図２５及び図２６は、より高い特異性のために融解曲線が十分に分離されたＦＲＥＴシグナル（ドナー・フルオロフォアが励起され、アクセプター・フルオロフォアの放出が測定される）を生成するための、大腸菌トレオニン合成酵素遺伝子標的の増幅に関する試料反応及び対照反応の増幅曲線である。 同上
本発明は、添付図面及び以下の説明を参照して詳細に記載される。
したがって、本発明の基本的な態様によれば、他の既存の方法と比較して、より高い感度及びより高い特異性を有する標的検出のための核酸増幅方法が提供される。本発明は、プライマー二量体またはプライマー二量体様非特異的増幅産物の形成の低減を試みるものではなく、プライマー二量体及びプライマー二量体様非特異的増幅産物からのシグナルの低減または消失を試みるものである。結果として、増幅反応に任意の非特異的シグナルが含まれなくなり、よって特異性及び感度が高くなる（特異性及び感度は相互依存的であり、特異性を増加させようとすると感度が低下し、逆もまた同様である）。非特異的増幅産物の形成を低減させるために現在利用可能なホットスタート手法を使用することは必要ではないが、追加として本発明の解決策とともに使用することができる。本発明は、９５％以上の特異性、及び本分野の至適基準であるＴａｑｍａｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの感度（７０～８０％）よりも高い、すなわち８０％超、好ましくは９０％超の感度を示す検出方法を開示する。この方法は、特異性を増加させることに加えて標的増幅産物のシグナルを増加させることにより、感度を増加させる。
当該技術分野における既存の／現在の方法及び他の方法のプライマー及びプローブは、標的増幅産物に加えて、非特異的プライマー二量体及びプライマー二量体様増幅産物からもシグナルを生成する。シグナルが増加すると、標的増幅産物と非特異的増幅産物の両方のシグナルが増加するが、シグナル対ノイズ比は何らの影響も受けない。他方、本発明の方法のプライマー及びプローブは、標的増幅産物のみからシグナルを生成し、非特異的プライマー二量体及びプライマー二量体様増幅産物からのシグナル生成を回避するように特別に設計されている。さらに、本発明の方法のプライマー及びプローブは、標識されたプライマーまたは標識されたプローブのドナー・フルオロフォアで標識された塩基の位置及び隣接塩基配列に応じて、標的増幅産物からより高いシグナルを生じさせるようにさらに設計されている。したがって、プライマー二量体及びプライマー二量体様非特異的産物からのシグナルがゼロまたはそれに近いことに加えて、標的増幅産物からのシグナルが増加すると、シグナル対ノイズ比がより高くなり、よって検出感度及び特異性がより高くなる。
本発明の方法のプライマー及びプローブは、ドナー・フルオロフォア及び／またはアクセプター・フルオロフォア（放射性クエンチャー）／クエンチャーで標識され、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア（放射性クエンチャー）／クエンチャーが、標的増幅産物中で十分に分離されかつそれらのＦＲＥＴ（エネルギー移動）距離を越えた状態に維持されるように選択、設計及び標識され、その結果、それらの間にはエネルギー移動相互作用がなく、ドナー・フルオロフォアの蛍光の増強によって標的増幅時に蛍光シグナルが生成される。
他方、プライマー二量体またはプライマー二量体様非特異的増幅産物では、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア（放射性クエンチャー）／クエンチャーがそれらのＦＲＥＴ（エネルギー移動）距離内にあり、その結果、ドナー・フルオロフォアからアクセプター・フルオロフォア（放射性クエンチャー）／クエンチャーへのエネルギー移動及びドナー・フルオロフォアの蛍光のクエンチングが生じる。かかる産物では、ドナー・フルオロフォアの蛍光の増強及びクエンチングが同時に生じる。ドナー・フルオロフォアの蛍光のクエンチングの程度は、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア（放射性クエンチャー）／クエンチャーのスペクトル特性、ならびにプライマー二量体産物またはプライマー二量体様産物におけるそれらの分離、ならびにドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア（放射性クエンチャー）／クエンチャーの付着に使用されるリンカーの長さに依存する。
クエンチングの程度が増強より大きい場合、これらの非特異的産物からシグナルは生成されない。結果として、特異性は高くなるが、プライマー二量体産物またはプライマー二量体様産物における過剰なクエンチングにより全体の蛍光シグナルが低減し、よって標的増幅産物により生成されるシグナルが低減するため、感度は減少する。この場合、特異性は最も高くなるが、感度はわずかに低減する。
プライマー二量体またはプライマー二量体様非特異的産物におけるドナー・フルオロフォアの蛍光の増強及びクエンチングが等しいかまたは均衡している場合、これらの非特異的産物によるシグナルは生成されず、標的増幅産物の蛍光シグナルは失われない。結果として、特異性と感度の両方が最も高くなる。
一方、クエンチングが増強よりも少ない場合、これらの非特異的産物からのシグナルが存在し、その結果特異性は減少するが、感度は減少しない。この場合、特異性はわずかに低減するが、感度は最も高くなる。この選択は、本発明の方法において利用可能な３つの選択肢のうちの最後にすべきであるが、ある特定の状態で使用することができる。ドナー・フルオロフォアの蛍光の増強とクエンチングとのこの均衡によって、本発明の標識されたプライマー及びプローブは、Ｌｉｂｒａプライマー対及びＬｉｂｒａプライマー－プローブ対と命名されている。この機構は既存のプライマー及びプローブでは機能せず、これは本発明の設計及び方法に特有のものである。
プライマー及びプローブは、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアで標識されており、かつ標的増幅産物中でドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアがそれらのＦＲＥＴ距離内に配置されるように選択、設計及び標識されており、その結果、ドナー・フルオロフォアからアクセプター・フルオロフォアへのエネルギー移動が生じ、アクセプター・フルオロフォアからのＦＲＥＴシグナル（ドナー・フルオロフォアの励起に特有の波長の放射線でドナー・フルオロフォアを励起させ、アクセプター・フルオロフォアの蛍光を測定する）が標的増幅時に生成される。また、プライマー二量体またはプライマー二量体様非特異的増幅産物中では、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアは、それらの短距離エネルギー移動距離、すなわち静的／接触クエンチング距離内にあり（ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアで標識された塩基は、互いに対向して配置されるか、またはそれらの間が０～３塩基、好ましくは０～１塩基で分離されて配置される）、その結果、ドナー・フルオロフォアからアクセプター・フルオロフォアへのエネルギー移動及びドナー・フルオロフォアの蛍光のクエンチング、ならびにアクセプター・フルオロフォアの蛍光が生じ、プライマー二量体産物またはプライマー二量体様産物からのシグナルがゼロまたはほぼゼロになる。
標的核酸配列は、一本鎖もしくは二本鎖の核酸配列（天然もしくは人工）、核酸増幅産物、メチル化ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、Ｃ－ＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）、エキソソームＤＮＡ、または感染因子の配列、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ゲノム配列の変異（数個の塩基もしくは長い配列の単一塩基の変化もしくは欠失もしくは挿入）、または生死を問わない、細菌、酵母、ヒト、動物、植物及びそれらの病原体（ウイルスを含む）もしくは任意の他の生物のゲノム配列、ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍ－ＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒ－ＲＮＡ）、小分子ＲＮＡ、転移ＲＮＡ（ｔ－ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉ－ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－／ｐｒｉ－ｍｉ－ＲＮＡ）であり、それらの存在または不在は、感染因子、障害もしくは疾患の存在、または感染症もしくは疾患もしくは障害に対する感受性、または疾患治療に対する適合性、遺伝形質、出生前診断、遺伝子型、細胞型、組織型、アレル型、ＳＮＰ検出種もしくは株の種類、癌種、癌のサブタイプ、癌の検出、疾患の種類もしくはサブタイプ、発現遺伝子などに関連付けられるが、上記に限定されない。
別の目的は、臨床試料（限定されないが、血液、尿、リンパ液、唾液、脳脊髄（ＣＳＦ）液、気管支洗浄液、汗、腹水、羊水、痰、糞便、膿、精液、膣スワブ、咽頭及び鼻スワブなどの体液、結節、組織試料、腫瘍試料、生検試料、液体細胞診試料、循環腫瘍細胞、循環幹細胞、極小胚様幹細胞、幹細胞、癌細胞、癌幹細胞、培地、発酵ブロス、土壌、水、食品、石油坑井試料、法医学的試料などを含む）を含むがこれらに限定されない生体試料または非生体試料中に存在する、ポリヌクレオチド（核酸）または非核酸分析物を検出することである。ポリヌクレオチド／核酸、非核酸分析物は、精製されていないか、あるいは公知の核酸精製方法もしくは抽出方法、または他の方法のいずれかによって精製されているかまたは部分的に精製されている場合がある。
以下の定義は、本開示の主題をより明確かつ簡潔に説明しかつ明らかにするために、以下の説明及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語に対して提供される。
別途明記されていない限り、本明細書における「ａ」または「ａｎ」という単語は、少なくとも１つを意味し、単数形には複数形も含まれる。一例としてであり限定するものではないが、「標的核酸（ａ ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」は、標的核酸種の特定の種の１つ以上（ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）のコピー及び２つ以上の異なる標的核酸種を意味する。「及び／または」は、スラッシュの前後の用語が一緒にまたは別々に採用され得ることを意味する。例示目的であり限定するものではないが、Ａ及び／またはＢは、Ａ及びＢ、またはＡもしくはＢを意味し得る。
本明細書における「シグナルがゼロ」という単語は、検出可能なシグナルがないことを意味し、「シグナルがほぼゼロ」とは、微小なまたは非実質的なシグナルを意味する。
本明細書で論じられる濃度、距離、時間、量、温度などの前に、「約」、「概ね」が言外に存在し、わずかで非実質的な偏差は本明細書における本発明の教示の範囲内であると解釈されることが理解されよう。
さらに、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という単語の使用は、本発明の教示の範囲を限定することを意図するものではない。前述の一般的な説明及び詳細な説明は、例示及び説明のためのものに過ぎず、本教示を制限するものではないことを理解されたい。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、完全な２’－デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）もしくは完全なリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはそれらのキメラ混合物を含むがこれらに限定されないヌクレオチド単量体の一本鎖及び二本鎖ポリマーを指し、またヌクレオチドアナログを含む場合があり、ヌクレオチドモノマーは、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合連結、またはヌクレオチド間アナログ及びＨ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋などを含む関連する対イオンによって連結されている。
互換的に使用される「鎖」、「核酸鎖」という用語は、デオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの単一のポリヌクレオチド鎖を指す。
合成核酸または半合成核酸は、それらのヌクレオチド基本単位を使用して、（ＰＣＲもしくはＰＣＲ以外の生化学的反応、または天然配列への合成配列の追加によって）化学的または生化学的に実験室で合成される。
オリゴヌクレオチドは、それらの基本単位を使用して実験室で化学合成されるかまたは天然核酸分子から実験室で生化学的に生成される、長さが短いリボース核酸ポリマーまたはデオキシリボース核酸ポリマーである。それは、２つの末端、すなわち５’末端及び３’末端に２つのヒドロキシル部分を有する。ポリヌクレオチドは、典型的には５～４０ヌクレオチドの範囲のサイズであり、当該技術分野ではオリゴヌクレオチドと称されることもあり、数千モノマー単位のサイズになる場合がある。別途記載されていない限り、ポリヌクレオチドが示される場合は常に、ヌクレオチドは左から右へ５’－３’方向にあり、「Ａ」はデオキシ－アデノシンを表し、「Ｇ」はデオキシ－グアノシンを表し、「Ｃ」はデオキシシトシンを表し、「Ｕ」はデオキシ－ウリジンを表し、「Ｔ」はデオキシ－チミジンを表すと理解される。さらに、リボース核酸またはデオキシリボース核酸と、リボヌクレオチド及び２’－デオキシヌクレオチドとは同義である。
「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドのリン酸エステル、例えば三リン酸エステルを指し、最も一般的なエステル化部位は、ペントース糖のＣ５位である。「ヌクレオシド」という用語は、アデニン、グアニン、デアザデニン、デアザグアニンなどのプリン塩基もしくはデアザプリン塩基、またはシトシン、ウラシル、シュードウラシル、チミン、イノシンなどのピリミジン塩基を含有しており、その１’位でペントース糖に連結された化合物を指し、ペントース塩基がプリン塩基の９位及びピリミジン塩基の１位に付着している２’デオキシ型及び２’ヒドロキシル型を含む。
人工ヌクレオチドは、プリン－ピリミジン塩基または糖部分またはリン酸基のいずれかが修飾された合成修飾ヌクレオチドである。例示的な塩基アナログには、シュードウリジン、２，６ジアミノプリン、ヒポキサンチン、イソグアニン、イソシトシン、２－チオピリミジン、Ｃ－５プロピレンが含まれ、例示的な糖アナログには、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、アリルオキシ、ブトキシ、イソブトキシ、イソプロポキシ及びフェノキシ、アジド、アミノまたはアルキルアミノ、フルオロ、クロロ及びブロモで修飾された糖の２’位または３’位が含まれ、ロックドヌクレオチド（リボヌクレオチドのリボース糖部分の２’ヒドロキシル基及び４’ヒドロキシル基が互いに連結されており、したがってロックされている（ＬＮＡ））が含まれる。リン酸アナログは、非酸素部分、例えば硫黄、セレン、ホウ素に置き換えられた１つ以上の酸素原子を有する。例示的なリン酸アナログには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエートが含まれる。関連する対イオン及びペプチドヌクレオチド（Ｎ－（２－アミノエチル）グリシン骨格などの中性ペプチドがリン酸基に付着している（ＰＮＡ））を含む、ホスホラニリノチオエート（Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｎｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホラミダイト、ボラノホスフェート。
ハプテン：ハプテンは、それ自体では免疫応答を誘発しないが、タンパク質またはペプチドなどのキャリア分子に付着されると免疫応答を誘発する小分子であり、キャリア分子自体が免疫原性である場合もあればそうでない場合もある。
アプタマー：アプタマーは、塩基または糖部分（単数または複数）が修飾された、長さの短い一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡまたは合成核酸である。
「増幅された産物」、「増幅産物」または「アンプリコン」という用語は、ＰＣＲなどの増幅法において一対のプライマーを使用してポリメラーゼにより増幅されたＤＮＡの断片を指す。
「標的増幅産物」、「特異的増幅産物」、「標的特異的増幅産物」、「特異的増幅産物」、「特異的標的増幅産物」という用語は、互換的に使用され、ＰＣＲなどの増幅法において一対のプライマーを使用してポリメラーゼにより増幅された特定の核酸の断片を指す。
「標的」、「標的配列」、「標的核酸」、「特異的標的」、「標的特異的」、「標的核酸配列」、「特異的配列」、「標的特異的配列」、「特異的核酸」、「特異的核酸配列」、「目的の核酸」、「鋳型」という用語は、互換的に使用され、増幅されるかもしくは検出されるかのいずれかまたはその両方である、あるいは増幅されかつ定量化される、所望の領域または特定の核酸の所望の領域を指す。
「同一の」、「同一の配列」という用語は、互換的に使用され、同じ配列または相補的配列を有する２つの核酸配列を意味する。
「相補的配列」は、相補的配列のヌクレオチド塩基がヌクレオチド配列のそれぞれの相補的塩基と対形成する、核酸配列の相補体であり、例えば、グアニン塩基はシトシン塩基に相補的であり、アデニン塩基はチミジン塩基またはウラシル塩基に相補的である。ハイブリッドが安定している限り、塩基相補性は完全であっても部分的であってもよい。塩基相補性とは、塩基対を形成する能力である。２つの配列が相補的であるとは、一方の配列が他方の配列を補完することを意味する。
互換的に使用される「重合」、「核酸合成」は、核酸鋳型、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの使用を通じて、またはヌクレオチドの連続的付加を通じてプライマーの配列を伸長させるプロセスを指す。
３’ヒドロキシル（ＯＨ）基を備えた自由に伸長可能な３’末端を有する「プライマー」は、Ｇ、Ｃ、Ａ及びＴなどのデオキシリボヌクレオチド、ならびにＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などのポリメラーゼ酵素、ならびに補助因子である置換基またはｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす置換基を含む適切な緩衝液の存在下で、適切な温度で十分な時間にわたって、プライマーを伸長しかつ核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を産生する合成または重合反応をプライミングまたは開始することができる、化学合成されたまたは比較的大きな核酸分子から生成されたオリゴヌクレオチドを指す。選択されたプライマーは、増幅される各特異的核酸配列のそれぞれの鎖にハイブリダイズするように少なくとも実質的に相補的である。プライマーは通常、記載されたようなプライマー末端などの所定の配列位置に非相補的ヌクレオチドが存在し得る場合を除いて、相補的である。
いくつかの実施形態では、プライマーは一本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、非相補的ヌクレオチド配列または断片は、プライマー配列の残部が標的核酸の標的領域に相補的または十分に相補的である場合、プライマーの５’末端に付着され得る。いくつかの実施形態では、非相補的ヌクレオチド配列は、非標的配列と称される。
「プローブ」は、蛍光レポーター色素に付着した、または蛍光レポーター色素及びビオチンなど、もしくは蛍光レポーター色素及びクエンチャーに付着した非伸長性オリゴヌクレオチドであり、このオリゴヌクレオチドは、核酸増幅反応で増幅される標的核酸の鎖に相補的である。
「アニーリングする（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）」または「アニーリングする（ａｎｎｅａｌ）」及び「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」または「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」または「ハイブリダイゼーション」という用語は、限定されないが、Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ及びＧ：Ｃのワトソン－クリック塩基対形成を使用した、二重鎖またはより高次の構造の形成をもたらす、ある核酸と別の核酸とのヌクレオチド塩基対形成を意味する。
「増幅」、「標的増幅」、「核酸増幅」という用語は、互換的に使用され、核酸配列の混合物内の特定の核酸配列の濃度を増加させるための任意の増幅プロセスまたは手順の使用を指す。
核酸増幅プロセスであるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で典型的に使用される「熱サイクリング」、「熱サイクル（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｓ）」、「熱サイクル（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅ）」という用語は、完全変性温度からアニーリング／ハイブリダイゼーション温度へ、伸長温度へ、そして完全変性温度に戻る、温度変化の反復サイクルを指す。いくつかの実施形態では、アニーリング／ハイブリダイゼーション温度及び伸長温度は、単一の温度に統合される。この用語は、上記の温度変化サイクルの反復サイクルも指す。いくつかの実施形態では、使用され得る「単一サイクル」または「単一ラウンドのサイクリング」という用語は、上述の一連の温度変化（単数または複数）の１ラウンドを意味する。いくつかの実施形態では、単一ラウンドのサイクリングは、変性温度、第１のアニーリング／ハイブリダイゼーション温度と第１の伸長温度との反復サイクル、及び第２のアニーリング／ハイブリダイゼーション温度と第２の伸長温度との反復サイクルを含んでもよく、ここで、第１のアニーリング温度及び伸長温度は第２のアニーリング温度及び伸長温度と異なるか、または第１のアニーリング温度は第２のアニーリング温度と異なる。サイクル数は１回または４５回までの任意の数であり得る。完全変性温度は二本鎖ＤＮＡ断片を巻き戻して２本の一本鎖にし、アニーリング温度はプライマーがＤＮＡ断片の分離された鎖の相補鎖にアニーリングまたはハイブリダイズすることができるようにし、伸長温度は増幅産物またはアンプリコンの新生ＤＮＡ鎖の合成ができるようにする。
等温増幅プロセスでは、標的配列の増幅に単一の温度のみが使用され、二本鎖ＤＮＡの２本の鎖の分離は、プライマーがループにアニーリングすることができるようにするループ構造を備えたプライマーを使用すること（ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ））、またはリコンビナーゼ（リコンビナーゼ－ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ））、ヘリカーゼ（ヘリカーゼ－ポリメラーゼ増幅（ＨＰＡ））、トポイソメラーゼ（トポイソメラーゼ－ポリメラーゼ増幅（ＴＰＡ））などのＤＮＡ二本鎖巻き戻し酵素を使用することにより達成され、またＬＡＭＰで使用される、核酸の新生鎖を合成するポリメラーゼは、鎖置換酵素活性も有している。
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）または定量的等温増幅とは、反応混合物または核酸試料中の核酸を定量化するための増幅を意味し、増幅シグナルは、増幅反応の対数期においてシグナルが閾値を越えるときに取得される。
ホットスタートＰＣＲは、一般に、必須反応構成成分、例えばポリメラーゼの第１の温度（典型的には比較的低温）での利用可能性を、必須構成成分が増幅反応に関与することが可能になる第２の温度（典型的にはプライマーのアニーリング温度である比較的高温）に達するまで、制限することを指す。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）は、逆転写酵素を使用してＲＮＡ鎖からＤＮＡ鎖を合成し、次いで合成されたＤＮＡ鎖に対してＰＣＲを用いるプロセスである。このプロセスでは、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせ、または逆転写酵素活性とポリメラーゼ活性の両方を有する酵素のいずれかが使用される。
アレルポリメラーゼ連鎖反応（アレルＰＣＲ）では、増幅反応の２つのプライマーの一方が、その３’末端から１～４塩基離れた１塩基または２塩基に標的配列との塩基ミスマッチ（単数または複数）を保有し、標的配列のアレルは、１塩基または２塩基の配列、好ましくはプライマーの一方の３’末端から２番目の塩基である１塩基の配列が異なる。さらに、プライマーの一方は、アクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分で標識されたアレルプライマーであり、ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブは、増幅された標的の２本の鎖の一方にハイブリダイズする。
メチル化状態ＰＣＲまたはメチル化特異的ＰＣＲを含むメチル化特異的核酸増幅では、メチル化ＤＮＡが亜硫酸水素塩試薬で処理され、これによりメチル化ＤＮＡのメチルシトシン塩基がウラシル塩基に変換されて、ＤＮＡの配列が変化する。次いで、変化した配列に特異的なプライマーを使用してその配列が増幅される。
エマルジョンＰＣＲでは、標的配列のＰＣＲ増幅は油－水エマルジョン中で行われ、形成される水滴の各々が少数の、好ましくは単一の核酸分子を含有する程度まで、水性ＰＣＲ反応混合物が油で希釈される。
ビーズＰＣＲでは、標的核酸に結合してそれを捕捉し、別の標的特異的プライマーと共同して標的核酸を増幅するプライマーをビーズ（単数または複数）が保有している。ビーズがエマルジョンＰＣＲに使用されるか、または捕捉された標的核酸を有する各ビーズが小孔中に捕捉されＰＣＲ増幅に供されるかのいずれかである。
ドロップレットＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）では、全ての必要成分、反応緩衝液、ヌクレオチド、酵素（単数または複数）、プライマー、またはプライマー及びプローブ、ならびに標的核酸を完全に備えたＰＣＲ反応混合物が、数千の個々の反応液滴に分配され、増幅シグナルが増幅反応の終点で取得される。ｄＰＣＲにより、極めて低いコピー数の標的の検出及び標的の絶対定量化が可能になる。
互換的に使用される「非特異的シグナル」、「非特異的蛍光」、「バックグラウンド蛍光」という用語は、所望の増幅産物またはアンプリコン以外の二本鎖核酸（非特異的増幅産物または非特異的アンプリコン）に会合したフルオロフォアまたは核酸結合色素分子から放出される検出可能なシグナルを指し、所望の増幅産物またはアンプリコンは、標的核酸の増幅産物を含み、いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態の反応に含まれ得る内部標準物質または陽性対照配列を含む。
非特異的増幅は、意図される増幅産物（特異的標的増幅産物）以外の増幅産物（単数または複数）が生成または産生される増幅事象であり、当該意図されない増幅産物は非特異的増幅産物と呼ばれる。
プライマー二量体：これは、２つのプライマー分子がそれらの伸長可能３’末端で互いに重複し、増幅反応のポリメラーゼが２つのプライマー分子の３’末端を、一方を他方の鋳型として使用して伸長させる場合に生成または産生される非特異的増幅産物である。
プライマー二量体様増幅産物は、一方または両方の増幅プライマーの３’末端配列が、増幅反応のモニタリングに使用されるプローブの非伸長性３’末端配列と重複する場合に生成または産生される非特異的増幅産物であり、増幅反応のポリメラーゼは、プローブを鋳型として使用してプライマー（複数可）分子の３’末端を伸長させる。このように形成されたプライマー二量体様産物は、増幅プロセスにおいて、プローブがハイブリダイズする鎖に相補的な標的鎖に対してさらに伸長され、増幅可能なプライマー二量体様産物が生成される。
本明細書で使用される「変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）」及び「変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）」という用語は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）断片、少なくとも１種の標的核酸、二本鎖増幅産物またはアンプリコン、二本鎖ポリヌクレオチド断片を含むがこれらに限定されない二本鎖核酸／ポリヌクレオチドが、適宜、２本の一本鎖ポリヌクレオチドまたは一本鎖もしくは実質的に一本鎖のポリヌクレオチドに変換されるプロセスを指す。融解温度、または「Ｔｍ」は、核酸二重鎖の安定性の尺度であり、特定の核酸二重鎖の塩基対の半分が解離する温度である。「融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）」または「融解曲線（ｍｅｌｔ ｃｕｒｖｅ）」は、特定の核酸二重鎖の塩基対の解離及び会合の曲線またはプロファイルであり、通常は－ｄＦ／ｄＴ対Ｔのプロットであり、ここで「Ｆ」は核酸二重鎖の蛍光の尺度であり、「Ｔ」は温度である。
本明細書で使用される「標識」という用語は、検出可能なまたは定量化可能なシグナルを提供するためにまたはその提供を補助するために使用することができ、かつ核酸またはオリゴヌクレオチドに付着させることができる、任意の原子または分子を指し、ここで、検出可能シグナルは蛍光シグナルであり、検出可能な蛍光を生成する標識は、本明細書では「フルオロフォア」または「レポーター色素」または「蛍光色素」または「色素」と称され、フルオロフォアの蛍光シグナルを吸収するもしくは低減させるか、またはフルオロフォアもしくは蛍光色素の蛍光をクエンチングする標識は、クエンチャーである。クエンチャーは、フルオロフォア（アクセプター・フルオロフォアもしくは放射性クエンチャー）または非放射性クエンチャーまたはダーククエンチャー（蛍光シグナルを吸収するが、光または放射線を一切放出しない）であり得る。フルオロフォアは、光を含む電磁放射線が照射されると、エネルギーまたは光を含む電磁放射線を発し、このエネルギーまたは電磁放射線もしくは光の発出が、フルオロフォアの放出である。フルオロフォアにより放出されるエネルギーまたは電磁放射線もしくは光は、フルオロフォアに照射されるエネルギーまたは電磁放射線とは異なり、フルオロフォアの蛍光である。フルオロフォアは、特定の波長（単数または複数）の光または放射線を吸収し、波長（単数または複数）が異なる独特の光または放射線を放出する。蛍光最大値または放出最大値は、フルオロフォアの蛍光放出が最大となる波長である。自身のエネルギーまたは光もしくは放射線をアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーに移動させるフルオロフォアは、ドナー・フルオロフォアである。アクセプター・フルオロフォアは、ドナー・フルオロフォアのエネルギーを吸収し、ドナーのものとは異なる特有のエネルギーまたは電磁放射線もしくは光を発し、放射性クエンチャーとも呼ばれる。他方、ダーククエンチャーまたは非放射性クエンチャーは、ドナーのエネルギーまたは電磁放射線もしくは光を吸収し、電磁放射線または光を一切発しない。
「レポーター色素」、「蛍光色素」、「色素」という用語は、「核酸結合色素」または「インターカレーティング色素」も含み、これらの用語は互換的に使用される。核酸結合色素は、二本鎖ポリヌクレオチドに特異的な蛍光分子、または二本鎖ポリヌクレオチドと会合したときに一本鎖ポリヌクレオチドとの会合よりも実質的に大きな蛍光増強を少なくとも示す蛍光分子を指す。核酸結合色素の非限定的な例としては、臭化エチジウム、ヘキスト色素３３３４２、ヘキスト色素３３２５８、ＤＡＰＩ、ランタニドキレート（ＮＤＩ－（ＢＨ－ＨＣＴ－Ｅｕ３＋キレート）ならびに非対称シアニン色素ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ及びＰｉｃｏ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、Ａｖａｇｒｅｅｎ（登録商標）、ＹＯＰＲＯ １、ＳＹＴＯ ９、アクリジンオレンジが挙げられる。
フルオロフォアの励起スペクトルは、電磁放射線のスペクトル波長範囲全体にわたってフルオロフォアにより吸収される電磁放射線のエネルギーをグラフ表示したものであり、フルオロフォアの放出スペクトルは、電磁放射線のスペクトル波長範囲全体にわたってフルオロフォアにより放出される電磁放射線のエネルギーである。
スペクトル重なりとは、あるフルオロフォアまたはクエンチャーの励起スペクトルと別のフルオロフォアの放出スペクトルとの重なりである。
本明細書におけるポリメラーゼは、ヌクレオチドの重合反応を触媒する酵素である。ポリメラーゼは、デオキシリボヌクレオチドが重合されるかまたはリボヌクレオチドが重合されるかに応じて、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼであり得る。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの場合、ＲＮＡポリメラーゼが一本鎖ＤＮＡを鋳型として使用してリボヌクレオチドを重合させることによりＲＮＡ分子を合成するとき（このプロセスはＲＮＡ転写と呼ばれる）、または逆転写酵素は、それがＲＮＡ鎖を鋳型として使用してデオキシヌクレオチドを重合させることによりＤＮＡ鎖を合成するとき（このプロセスは逆転写と呼ばれる）。一部の逆転写酵素は、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ酵素活性の両方を有する（Thermus thermophilusまたはＴｔｈポリメラーゼ）。一部のＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性、エキソヌクレアーゼ酵素活性、鋳型非依存性ポリメラーゼ活性を有し得る。ポリメラーゼは、３７０Ｃ超かつ最大６０℃超の温度で酵素活性を示す場合、中度熱安定性（ｍｅｓｏ－ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）ポリメラーゼであり、ポリメラーゼが６００℃超の温度で活性である場合、熱安定性ポリメラーゼである。ポリメラーゼは、３７０℃以下の温度で酵素活性を示す場合は周囲温度ポリメラーゼ（３７℃～２５０℃）であり、または２５０℃未満の温度で酵素活性を示す場合は低温ポリメラーゼである。ポリメラーゼは、プライマーのアニーリング温度で重合活性を示すポリメラーゼであるホットスタートポリメラーゼであり得る。核酸ポリメラーゼ（ｎｕｃｌｅｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ヘリカーゼ活性またはＤＮＡ巻き戻し活性を有する熱安定性ポリメラーゼからなる群から選択され得るがこれらに限定されない。
さらに、本明細書では、本発明で教示する方法を実践または実施するためのキットも提供される。本明細書における「キット」という用語は、典型的には１つ以上の容器または器に入った１つ以上の、関連する構成成分または組成物のパッケージ化されたセットを指す。キットは、典型的には、試料からの少なくとも１種の標的核酸を重合及び／または増幅するためのプライマー対として少なくとも１対のオリゴヌクレオチドを含むことができ、オリゴヌクレオチド対の一方の構成要素は、フルオロフォアまたはインターカレーティング色素などの検出可能な標識で標識されており、対の他方の構成要素はクエンチャーで標識されている。キットはまた、典型的には、試料からの少なくとも１種の標的核酸を重合及び／または増幅するためのプライマー対としての少なくとも１対のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドプライマー対の少なくとも一方の構成要素はクエンチャーで標識されている）と、増幅反応をモニタリングするためのプローブとしての、検出可能な標識、フルオロフォアまたはインターカレーティング色素を備えた別の非伸長性オリゴヌクレオチドと、を含むことができる。キットはまた、典型的には、試料からの少なくとも１種の標的核酸を重合及び／または増幅するためのプライマー対として少なくとも１対のオリゴヌクレオチドを含むことができ、オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアまたはインターカレーティング色素などの検出可能な標識で標識されており、フルオロフォアの一方の構成要素はドナー・フルオロフォアであり、他方の構成要素はアクセプター・フルオロフォアである。キットはまた、典型的には、試料からの少なくとも１種の標的核酸を重合及び／または増幅するためのプライマー対としての少なくとも１対のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドプライマー対の少なくとも一方の構成要素は検出可能な標識で標識されている）と、増幅反応をモニタリングするためのプローブとしての別の検出可能な標識で標識された別の非伸長性オリゴヌクレオチドと、を含むことができ、検出可能な標識はフルオロフォアまたはインターカレーティング色素であり、２つの標識はドナーとアクセプターとの対である。キットはまた、対照反応に使用される予め定義された核酸を含有する試料も含有することができる。キットはまた、任意選択的に、核酸鋳型から少なくとも１種の標的核酸を増幅するのに必要な、プライマー及びプローブ以外の全ての構成成分を含有する反応混合物もしくはＰＣＲマスター混合物を含むことができ、または核酸鋳型から少なくとも１種の標的核酸を増幅するのに必要な、緩衝液、塩、二価金属イオン（Ｍｇ２＋、Ｍｎ、２＋ ｄＮＴＰ（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＵ）、酵素、グリセロール、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ゼラチン、１種以上の界面活性剤、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のストック溶液も含有することができ、各構成成分の使用濃度範囲は当該技術分野で周知であり、当業者によってさらに最適化することができる。いくつかの実施形態では、キットは、複数のプライマーセットまたはプライマープローブセットを含み得る。他の実施形態では、当業者によって理解されるであろう特定の系またはキットも含まれるかまたは企図される。キットはまた、増幅反応を行うための反応器（単数または複数）を含有することができ、反応器は、分子生物学実験室で一般的に使用されるマイクロチューブまたは微量遠心管（０．２／０．５ｍｌ）及びそれに類するもの、マルチウェルプレートのウェル、スライドガラスまたはシリコンウエハのスポット、マイクロ流体デバイスのチャネルまたはチャンバを含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、単に構成上の目的のためのものであり、いかなる形でも所望の主題を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に組み込まれる全ての特許及び他の参照文献は、任意の目的でその全体が参照により明示的に組み込まれる。組み込まれた文献のいずれかが本明細書に定義されているいずれかの用語と矛盾する場合、本明細書が優先される。本発明の教示は種々の実施形態と併せて説明されているが、本発明の教示がかかる実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の教示は、当業者によって理解されるであろう種々の代替例、修正例及び同等物を包含する。本明細書全体を通じて、特定の用語の例示は、非限定的な例とみなされるべきである。
したがって、本発明は、標的増幅のシグナルを生成するためのドナー・フルオロフォアの蛍光の増強のため、及びプライマー二量体もしくはプライマー二量体様非特異的核酸増幅産物からのゼロもしくはほぼゼロのシグナルを生成するためのドナー・フルオロフォアの蛍光のクエンチングを相殺する均衡した蛍光の増強またはドナー・フルオロフォアの増強を相殺する均衡したクエンチングのための、核酸増幅のプロセスを提供する。
別の目的は、非特異的プライマー二量体（増幅反応に使用されるポリメラーゼによる、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーの３’末端とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーの３’末端の重複及び伸長により形成される）ならびにプライマー二量体様増幅産物（ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブの３’末端とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーの３’末端の重複ならびにプローブを鋳型として使用したポリメラーゼによる標識されたプライマーの伸長により形成される）において同時に発生するドナー・フルオロフォアの蛍光の増強とドナー・フルオロフォアの蛍光のクエンチングとを均衡させて、これらの非特異的産物によるシグナルが生成されないようにすることである。
本発明のさらに別の目的は、ドナー・フルオロフォア部分で標識された直鎖状プライマー及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分で標識された直鎖状プライマーを標的核酸増幅に使用することである。プライマーは、ドナー・フルオロフォア部分及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分が標的増幅産物中で互いに十分に分離されて、この２つの部分間で顕著なエネルギー移動がなく、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーの標的増幅産物への組み込みによりドナー・フルオロフォアの蛍光が顕著に増強され、且つ融解曲線及び融解温度（Ｔｍ）も標的増幅産物によって生成されるように選択され、そのように標識される。
しかし、非特異的プライマー二量体増幅産物では、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーがそれらのＦＲＥＴ距離内にあり、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分がドナー・フルオロフォア部分の蛍光をクエンチングし（図１）、２つのプライマー上のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーの位置は、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーによるドナー・フルオロフォアの蛍光のクエンチング量がドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーのプライマー二量体産物への組み込みによるドナー・フルオロフォアの蛍光の増強量と等しいかまたは概ね等しいように選択される。結果として、非特異的プライマー二量体産物の形成時にシグナルは生成されず、標的検出の感度はプライマー二量体中のドナー・フルオロフォアの蛍光のクエンチングによる影響を受けず、融解曲線もプライマー二量体によって生成される。
別の目的は、２つのプライマー上のドナー・フルオロフォア部分及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分の、３’末端から少なくとも２塩基離れた位置、好ましくはより多くの塩基数離れた位置の任意の塩基（ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーの５’末端塩基を除く）への配置を適切に選択することである。ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーとアクセプター・フルオロフォアで標識されたプライマーとの対は、ｌｉｂｒａプライマー対である。
別の目的は、非特異的プライマー二量体増幅産物中のドナー・フルオロフォアの蛍光が、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーによって、それぞれ１～１００パーセント、好ましくは２０～８０パーセント、より好ましくは４０～７０パーセントである対応するプローブハイブリダイゼーション時のドナー・フルオロフォアの蛍光の増強の程度に応じて、１～５０パーセント、好ましくは１７～４５パーセント、より好ましくは３０～４０パーセントクエンチングされるように、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーをプライマー上に配置することである。
別の目的は、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーの３’末端とドナー・フルオロフォアで標識された塩基とを分離している塩基の数に、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーの３’末端とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識された塩基とを分離している塩基の数を加算し、プライマー二量体中で互いに重複している標識されたプライマーの３’末端にある塩基の数を減算したものが、ドナー・フルオロフォア部分とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分との間での１～５０パーセント、好ましくは１７～４５パーセント、より好ましくは３０～４０パーセントのエネルギー移動の距離に相当する塩基の数と等しくなることである。
別の目的は、ドナー・フルオロフォアで標識された塩基とドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーの３’末端との間の距離に、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識された塩基とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーの３’末端との間の距離を加算し、プライマー二量体中のプライマーの３’末端にある塩基間で重複している距離を減算したものが、ドナー・フルオロフォア部分とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分との間での１～５０パーセント、好ましくは１７～４５パーセント、より好ましくは３０～４０パーセントのエネルギー移動の距離と等しくなることである。
別の態様では、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーは、同じ実体であっても異なる実体であってもよい２つのフルオロフォアで標識されている。これにより、２つのフルオロフォア間でＦＲＥＴが生じ、増幅産物の増強されたシグナルがさらに増加する。
本発明の別の目的は、ドナー・フルオロフォア部分で標識された直鎖状プローブ及び一対の直鎖状プライマーを標的核酸増幅に使用することであり、ここで、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分は、一方または両方のプライマー上に配置されている。プライマー及びプローブは、ドナー・フルオロフォア部分とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分が互いに十分に分離されて、アクセプター／クエンチャーで標識されたプライマーが組み込まれた標的増幅産物の鎖またはアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーがハイブリダイズ／アニーリングする標的鎖のいずれかにプローブがハイブリダイズするときに、この２つの部分間で顕著なエネルギー移動がなく、且つ標識されたプローブのハイブリダイゼーション時にドナー・フルオロフォアの蛍光が顕著に増強するように選択されて、そのように標識される。標識されたプローブは、標的増幅産物からのプローブの融解に特異的な融解曲線及び融解温度を生成する。
しかし、非特異的プライマー二量体様増幅産物（標識されたプローブ及び標識されたプライマー（複数可）の３’末端の重複ならびにプローブを鋳型として使用した、増幅反応に使用されるポリメラーゼによる標識されたプライマーの伸長により形成される）では、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーは、プライマー二量体様産物の一方の鎖に組み込まれ、ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブは、アクセプター／クエンチャーで標識されたプライマーが組み込まれたプライマー二量体様産物の鎖にハイブリダイズする（図２）。ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブのハイブリダイゼーションにより、ドナー・フルオロフォアの蛍光が増強され、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーがそれらのＦＲＥＴ／エネルギー移動距離内に入り、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分がドナー・フルオロフォア部分の蛍光をクエンチングする。プローブ及びプライマー（複数可）上のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーの位置は、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーによるドナー・フルオロフォアの蛍光のクエンチング量がドナー・フルオロフォアの蛍光の増強量と等しいかまたは概ね等しくなるように選択される。結果として、非特異的プライマー二量体様産物の形成時にシグナルは生成されず、標的検出の感度はプライマー二量体様産物中のドナー・フルオロフォアの蛍光のクエンチングによる影響を受けない。
さらに、ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブは、ＭＧＢ色素（副溝結合物質）をさらに有することができ、プローブはＭＧＢプローブである。本明細書で使用される「副溝結合物」という用語は、二本鎖ＤＮＡの副溝に、場合によっては配列特異的な形で適合する小分子を指す。一般に、副溝結合物質は長く平坦な分子であり、三日月様形状をとることができるため、二重らせんの副溝にぴったりと適合し、水に取って代わることが多い。副溝結合分子は、典型的にはねじれの自由度を有する結合（ｂｏｎｄｓ ｗｉｔｈ ｔｏｒｓｉｏｎａｌ ｆｒｅｅｄｏｍ）により接続されたいくつかの芳香環（限定されないが、例えばフラン環、ベンゼン環またはピロール環）で構成される。
別の目的は、プローブ上のドナー・フルオロフォア部分の、３’末端への配置、または５’末端塩基位置を除く３’末端から離れた任意の塩基上への配置、及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマー上のアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分の、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーの３’末端から少なくとも２塩基離れた、好ましくはより多くの塩基数離れた任意の塩基上への配置を適切に選択することである。ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプローブプライマー対は、ｌｉｂｒａプローブ－プライマー対である。
さらなる目的は、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分で標識された、プローブベースの検出の両方のプライマーを使用することであり、２つのプライマー上のアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分は同じであっても異なっていてもよい。
別の態様では、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーは、非特異的プライマー二量体様増幅産物へのドナー・フルオロフォアで標識されたプローブのハイブリダイゼーション時に、ドナー・フルオロフォアの蛍光が、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーによって、それぞれ１～１００パーセント、好ましくは２０～８０パーセント、より好ましくは４０～７０パーセントである対応するプローブハイブリダイゼーション時のドナー・フルオロフォアの蛍光の増強の程度に応じて、１～５０パーセント、好ましくは１７～４５パーセント、より好ましくは３０～４０パーセントクエンチングされるように、プローブ及びプライマー上にそれぞれ配置される。
別の目的は、ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブの３’末端とドナー・フルオロフォアで標識された塩基とを分離している塩基の数に、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーの３’末端とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識された塩基とを分離している塩基の数を加算し、プライマー二量体様産物中でドナー・フルオロフォアで標識されたプローブの３’末端塩基と重複しているアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーの３’末端にある塩基の数を減算したものが、ドナー・フルオロフォア部分とアクセプター／クエンチャー部分との間での１～５０パーセント、好ましくは１７～４５パーセント、より好ましくは３０～４０パーセントの共鳴エネルギー移動／エネルギー移動の距離に相当する塩基の数と等しくなることである。
別の目的は、ドナー・フルオロフォアで標識された塩基とドナー・フルオロフォアで標識されたプローブの３’末端との間の距離に、アクセプター／クエンチャーで標識された塩基とアクセプター／クエンチャーで標識されたプライマーの３’末端との間の距離を加算し、プライマー二量体様産物中の標識されたプライマーの３’末端塩基とプローブの３’末端塩基との間で重複している距離を減算したものが、ドナー・フルオロフォア部分とアクセプター／クエンチャー部分との間での１～５０パーセント、好ましくは１７～４５パーセント、より好ましくは３０～４０パーセントの共鳴エネルギー移動の距離と等しくなることである。
実施形態の特定の拡張では、ヘキサメチレンまたはヘキサ－ポリエチレングリコール、好ましくはヘキサ－ポリエチレングリコールまたはそれらのキメラもしくはそれらのより長い長さのものなどの非ヌクレオチド有機リンカー（非ヌクレオチド有機リンカーは、前進中のポリメラーゼを鋳型から脱落させる）によって２つの増幅プライマーの一方に連結されたドナー・フルオロフォアで標識されたプローブが提供され、このプローブは、プローブに連結したプライマーによって合成された新生標的増幅鎖または標的アンプリコン鎖にハイブリダイズするように設計されている。
別の拡張では、ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブは、同じ実体であっても異なる実体であってもよい２つのフルオロフォアで標識されている。これによりＦＲＥＴが生じ、フルオロフォアで標識されたプローブの増強されたシグナルがさらに増加する。
ドナー・フルオロフォアの蛍光は、通常、ドナー・フルオロフォアで標識された塩基周囲のプライマーまたはプローブのヌクレオチド配列、ドナー・フルオロフォアで標識された塩基周囲のグアニン塩基の存在、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの３’末端に対するドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブ上のドナー・フルオロフォアの位置、プライマーまたはプローブへのドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーの付着に使用されるリンカー、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの二次構造、プライマーまたはプローブの標識効率、適用される反応条件に応じて、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーの増幅産物への組み込み時またはドナー・フルオロフォアで標識されたプローブの増幅産物もしくは標的鎖へのハイブリダイゼーション時に、１～１００パーセント、好ましくは２０～８０パーセント、より好ましくは４０～７０パーセント増強される。
非特異的プライマー二量体またはプライマー二量体様増幅産物では、非特異的増幅産物による任意のシグナル生成を回避するために、プライマーまたはプローブのドナー・フルオロフォアの蛍光は、プライマーのアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーによって、１～５０パーセント、好ましくは１７～４５パーセント、より好ましくは３０～４０パーセントクエンチングされる。アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーによるドナー・フルオロフォアの蛍光のクエンチングの程度は、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーのスペクトル特性及びそれらの距離または分離に依存するのみならず、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーをプライマー及びプローブに付着させるために使用されるリンカーにも依存する。
別の目的は、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの５’末端に、ドナー・フルオロフォアに対する追加のクエンチャーまたはドナー・フルオロフォアで標識された塩基周囲の塩基に相補的な４～８塩基（クエンチャーを有しているかまたは有していない）の非標的配列を配置することである。かかる状態では、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブが増幅産物に組み込まれるかまたはそれにハイブリダイズされると、ドナー・フルオロフォアの蛍光が約３～８倍増加する。プライマー上、またはプライマー及びプローブ上のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーの位置は、ドナー・フルオロフォアの蛍光がプライマー二量体産物またはプライマー二量体様産物中で６５～９０パーセントクエンチングされるように選択される。ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの３’末端とドナー・フルオロフォアを保有する塩基とを分離している塩基の数に、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーの３’末端とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーを保有する塩基とを分離している塩基の数を加算し、プライマー二量体産物またはプライマー二量体様産物中の標識されたプライマーの３’末端間で、または標識されたプライマーの３’末端と標識されたプローブの３’末端で重複している塩基の数を減算したものは、ドナー・フルオロフォア部分とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分との間での６５～９０パーセントの共鳴エネルギー移動／エネルギー移動の距離に相当する塩基の数と等しい。
ドナー・フルオロフォアを保有する塩基とドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの３’末端との間の距離に、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識された塩基とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーの３’末端との間の距離を加算し、プライマー二量体産物またはプライマー二量体様産物中の標識されたプライマーの３’末端にある塩基間で、または標識されたプライマーの３’末端にある塩基と標識されたプローブの３’末端にある塩基との間で重複している距離を減算したものは、ドナー・フルオロフォア部分とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分との間での６５～９０パーセントの共鳴エネルギー移動／エネルギー移動の距離と等しい。
エネルギー移動は、第２のフルオロフォアまたはクエンチャーの励起スペクトルが第１のフルオロフォアの放出スペクトルと相当多く重複しており、且つ２つの部分が近接している場合における、適切な電磁放射線で励起されたときの第１のフルオロフォア部分から第２のフルオロフォア部分またはクエンチャー部分へのエネルギー移動のプロセスである。エネルギーを移動させる第１のフルオロフォアはドナー・フルオロフォアまたはドナーと呼ばれ、第２のフルオロフォアはアクセプター・フルオロフォアまたはドナー・フルオロフォアのアクセプターと呼ばれ、クエンチャーはドナー・フルオロフォアのアクセプターまたはクエンチャーと呼ばれる。ドナー・フルオロフォアからアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーへの、それらが互いに極めて近接しているかまたは接触しているときに短い距離で起こるエネルギー移動は、短距離エネルギー移動プロセスであり、結果として生じるドナー・フルオロフォアのクエンチングは、静的または接触クエンチングと呼ばれる。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、ドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーとの間で一切の接触を伴わずに溶液相で発生する長距離エネルギー移動である。
フェルスター半径の値は、特定のエネルギー移動効率に対するドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーとの間の距離の目安を示すものである。有意なエネルギー移動は、最大２Ｒ０の距離までである。さらに、エネルギー移動効率「Ｅ」に対するドナーとアクセプターとの間の距離「Ｒ」は、式Ｒ＝（１／Ｅ－１）１／６ Ｒ０で得られ、Ｒ０は、５０％のエネルギー移動効率に対するドナーとアクセプターとの間の距離である。
フェルスター半径Ｒ０は、
Ｒ０＝［８．８×１０２３×ｋ２×ｎ４×ＱＹＤ×Ｊ（λ）］１／６ Å
として表される（式中、ｋ２＝双極子方向係数、ｎ＝屈折率、εＡ＝アクセプターの消衰係数、ＱＹＤ＝アクセプター不在下でのドナーの蛍光量子収率、Ｊ（λ）＝スペクトル重なり積分＝積分［εＡ（λ）．ＦＤ（λ）．（λ）４ｄ（λ）］ｃｍ３ Ｍ（式中、ＦＤ＝総積分強度の関数としてのドナーの蛍光放出強度）及びÅ＝オングストローム単位）。
フェルスター半径Ｒ０は、スペクトルの重なりまたはスペクトルの重なりの積分が小さい場合、すなわち、ドナー・フルオロフォアの放出最大値とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーの励起最大値がそれほど近似していない場合には長くなり、スペクトルの重なりまたはスペクトルの重なりの積分が大きい場合、すなわち、ドナー・フルオロフォアの放出最大値とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーの励起最大値が極めて近似している場合には短くなる。フェルスター半径は通常、２２～７５オングストロームの範囲内に入る。多くのドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアとの対のフェルスター半径は、公開されている文献（Penguang Wu et al, Analytical Biochemistry vol - 218, pages 1 - 13, 1994、Robert H Fairclough et al Methods in Enzymology, vol - 48, pages - 347 - 379, 1978）またはドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー色素の供給業者、特にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社のカタログ／ハンドブックもしくはウェブサイトから利用可能である。さらに、より新しいドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーが常に開発されている。
ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー分子は、主に疎水性であり、近接すると互いに折り重なる（ｃｏｌｌａｐｓｅ）傾向があり、その結果、ＦＲＥＴ相互作用に加えて静的または接触クエンチング相互作用が生じる。さらに、一本鎖オリゴヌクレオチドは二次構造を形成し、折り返している。結果として、近距離では、２つのエネルギー移動機構（ＦＲＥＴ及び静的／接触クエンチング）が機能し、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドの場合のＲ０値の測定値は、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーをオリゴヌクレオチドに連結するために使用されるリンカーの長さ及び種類に依存することになる。このため、Ｒ０値を正確にまたはより良好に推定するには、静的／接触クエンチングエネルギー移動の任意の寄与を排除するために、２Ｒ０距離に対するエネルギー移動効率「Ｅ」の測定が必要となる。二次構造または折り返しを有さない二本鎖構造中の２つの部分間に特定の分離を設けることにより、任意のドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーとの対のクエンチングを測定することが好都合である場合がある。
ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマー／プローブの３’末端とドナー・フルオロフォアを保有する塩基とを分離している塩基の数に、アクセプター／クエンチャーで標識されたプライマー（複数可）の３’末端とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーを保有する塩基とを分離している塩基の数を加算した値は、非特異的プライマー二量体またはプライマー二量体様増幅産物からのシグナル生成を回避するためには、通常６～３５塩基、好ましくは８～３０塩基、より好ましくは１０～２５塩基の範囲内にになり、これは、ドナー・フルオロフォア－アクセプター・フルオロフォア／クエンチャー対、ならびに標識されたプライマーの３’末端間及び標識されたプライマーの３’末端と標識されたプローブの３’末端との間での最大６塩基の重複を考慮したドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマー対またはプライマープローブ対の３’末端の重複の程度に依存する。標識された複数のプライマーの３’末端間及び標識されたプライマーの３’末端と標識されたプローブの３’末端との間の塩基の重複が６塩基を超える場合、６～３５の範囲のより長い方の末端がさらに伸長される。
ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーのドナー・フルオロフォアに加えて、クエンチャーまたは４～８塩基の非標的配列もドナー・フルオロフォアで標識されたプライマー／プローブの５’末端に配置される場合、非特異的プライマー二量体またはプライマー二量体様増幅産物からのシグナル生成を回避するために、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマー／プローブの３’末端とドナー・フルオロフォアを保有する塩基とを分離している塩基の数に、アクセプター／クエンチャーで標識されたプライマーの３’末端とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーを保有する塩基とを分離している塩基の数を加算した値は、ドナー・フルオロフォア－アクセプター・フルオロフォア／クエンチャー対、ならびにドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマー対またはプライマープローブ対の３’末端の重複に応じて、約５～２５塩基、好ましくは１０～２０塩基である。
別の目的は、第１のプライマー対が標的核酸の第１のセグメントを増幅し、第２のプライマー対が第１のセグメントの第２のセグメントを増幅する、ネステッド核酸増幅を適用して標的核酸を検出することである。第２のプライマー対が本発明のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアで標識されたｌｉｂｒａプライマー対であるか、または第２のプライマー対の一方もしくは両方の構成要素がアクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャーで標識されており、且つ第２のセグメントにハイブリダイズするドナー・フルオロフォアで標識されたプローブがさらに使用されるか、のいずれかであり、ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブ及びアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーで標識された第２のプライマー対は、上述したような本発明のドナー・フルオロフォア部分で標識されたプローブ及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマー（複数可）（ｌｉｂｒａプライマープローブ対）である。さらに、第１のプライマー対は、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識して提供することもできる。さらに、第３のプライマー対を用いて、第１のセグメントが増幅され得る標的核酸のより大きなセグメントを増幅することもできる。さらに、増幅反応は１工程または２工程で行うことができ、第１の工程で生成されたアンプリコンが第２の工程で増幅される。
別の目的は、第１のプライマー及び第２のプライマーが標的核酸の第１のセグメントを増幅し、第３のプライマーが第１のプライマーとともに第１のセグメントの第２のセグメントを増幅する、セミネステッド核酸増幅を適用して標的核酸を検出することである。第１のプライマー及び第３のプライマーが本発明のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャーで標識されたｌｉｂｒａプライマー対であるか、または第１のプライマー及び第３のプライマーの一方もしくは両方がアクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャーで標識されており、且つ第２のセグメントにハイブリダイズするドナー・フルオロフォアで標識されたプローブがさらに使用されるか、のいずれかであり、プローブならびに第１のプライマー及び第３のプライマーは、上述したような本発明のドナー・フルオロフォア部分で標識されたプローブ及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマー（複数可）（ｌｉｂｒａプライマープローブ対）である。さらに、増幅反応は１工程または２工程で行うことができ、第１の工程で生成されたアンプリコンが第２の工程で増幅される。
別の目的は、タンパク質、抗原、抗体、脂質、グリコシル化生体分子、生細胞または死細胞、癌細胞、幹細胞、極小胚様幹細胞、癌幹細胞、癌タンパク質及びＤＮＡマーカー、メチル化ＤＮＡ、転写因子、サイトカイン、炭水化物／糖、ハプテンなどの小分子を含むがこれらに限定されない核酸または非核酸標的を検出することであり、ここで、核酸または非核酸標的に対して極めて高い親和性を有する第１の結合部分が、核酸または非核酸標的を捕捉するために使用され、且つ同じ第１の結合部分であり得るかまたは核酸もしくは非核酸標的に対して極めて高い親和性を有する異なる結合部分であり得る第２の結合部分が、捕捉された核酸または非核酸標的に結合するために使用されるか、あるいは極めて高い親和性で第２の結合部分に結合する第３の結合部分が使用される。第２の結合部分または第３の結合部分は、核酸が付加された未結合の第２の結合部分または第３の結合部分を洗い落とした後に、本発明のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたｌｉｂｒａプライマー対またはｌｉｂｒａプローブ及びプライマー対を使用した核酸増幅によって検出され得る合成または天然の核酸標的分子が付加されて提供される。
結合部分は、結合対である抗原－抗体、タンパク質－抗タンパク質抗体、抗体－抗体、抗体－抗ＩｇＧ抗体、一次抗体－二次抗体、プロテインＡ－抗体、プロテインＧ－抗体、ビオチン－アビジン、ビオチン－ストレプトアビジン、レクチン－糖、核酸－核酸、タンパク質－核酸、タンパク質－タンパク質、アプタマー－アプタマー、アプタマー－核酸、アプタマー－タンパク質、ハプテン－抗ハプテン抗体の群から選択され得るがこれらに限定されず、ハプテンは、蛍光色素、ブロモ－ｄ－ＵＴＰ、アフラトキシン及び他のマイコトキシン、ペプチド、糖を含むがこれらに限定されない小分子である。
別の目的は、結合部分を使用して細胞または標的核酸（メチル化もしくは非メチル化）を捕捉することであり、この結合部分は、抗体、タンパク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、アプタマーまたは核酸であり、捕捉された細胞または捕捉された標的核酸は、本発明のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたｌｉｂｒａプライマー対またはｌｉｂｒａプローブ及びプライマー対を使用した核酸増幅によって、精製の有無を問わず検出される。
別の目的は、第１のドナー・フルオロフォアで標識された第１のプライマー、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識された第２のプライマー及び第２のドナー・フルオロフォアで標識されたプローブを使用することであり、２つのプライマー上の第１のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーの位置は、標的増幅時に第１のドナー・フルオロフォアが第１の蛍光シグナルを生成するように選択される。第１のドナー・フルオロフォアで標識されたプライマー及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーは、本発明のｌｉｂｒａプライマー対である。
さらに、第２のドナー・フルオロフォアで標識されたプローブが標的増幅産物にハイブリダイゼーションする際にプローブの第２のドナー・フルオロフォアが第２の蛍光シグナルを生成するように、第１及び第２のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーが選択され、プライマー及びプローブ上のそれらの位置が選択される。第２のドナー・フルオロフォアで標識されたプローブ、第１のドナー・フルオロフォアで標識されたプライマー及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーは、本発明のｌｉｂｒａプライマー－プローブ対であり、第１のドナー・フルオロフォアが第２のドナー・フルオロフォアのドナーであるか、または好ましくは第２のドナー・フルオロフォアが第１のドナー・フルオロフォアのドナーであるかのいずれかである。
別の目的は、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマー及びアクセプター・フルオロフォアで標識されたプライマーを使用して、標的核酸配列を増幅することである。ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマー及びアクセプター・フルオロフォアで標識されたプライマーは、標的増幅産物中のドナーとアクセプター間のエネルギー移動が２０～７０パーセント、好ましくは３０～４０パーセントとなるように選択されて、そのように標識される。標的増幅におけるドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアとの間の分離は、標的増幅産物がプライマー二量体の融解曲線または融解温度から十分に分離されている融解曲線または融解温度が生成されるように、ドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアとの対のスペクトル特性に応じて、８～２５塩基であることが好ましく、１２～２０塩基であることがより好ましい。ドナー・フルオロフォアが励起され、アクセプター・フルオロフォアの放出（ＦＲＥＴシグナル）が測定されて、標的増幅の推定値が得られる。
ドナー・フルオロフォアで標識された塩基とドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーの３’末端を分離している塩基の数に、アクセプター・フルオロフォアで標識された塩基とアクセプター・フルオロフォアで標識されたプライマーの３’末端とを分離している塩基の数を加算し、２つのプライマーの３’末端の間で重複する可能性のある塩基数を減算したものが、プラスマイナス３、好ましくはプラスマイナス１、または０であるか、またはより好ましくは、２つの標識された塩基がプライマー二量体中で互いに対向して配置され、その結果、ドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアとの間に静的または接触クエンチングが存在し、ドナーのクエンチングを生じさせるドナー・フルオロフォアからアクセプター・フルオロフォアへのエネルギー移動が存在すると同時に、静的または接触クエンチングによるアクセプター・フルオロフォア放出のクエンチングが存在することにより、プライマー二量体からのシグナルがゼロまたはほぼゼロになる。
この実施形態の別の拡張では、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーとアクセプターで標識されたプライマーとの対の代わりに、ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブ及びアクセプター・フルオロフォアで標識されたプライマーが同じ規格で使用される。
別の目的は、本発明のドナー・フルオロフォアで標識されたプライマー及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーを、アレル特異的増幅、好ましくはアレルＰＣＲにおいて使用することである。ここでは、プライマーの一方がアレル特異的であり、その３’末端から２番目の塩基がアレル塩基（対象とされる変異塩基）であり、アレルプライマーのドナー・フルオロフォアまたはアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識された塩基は、アレルプライマーの３’末端から２～５塩基、好ましくは３～４塩基離れたチミン塩基であり、さらに、ドナー・フルオロフォアまたはアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたＴ塩基は、２つのアレル間のより良好な識別のために、標的配列の対応する塩基と、ＧからＴまたはＣからＴまたはＡからＴ、好ましくはＧからＴまたはＣからＴの塩基ミスマッチを有し得る。さらに、上記の２つの標識されたプライマーは、本発明のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアで標識されたｌｉｂｒａプライマーである。
別の拡張では、ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブは、本発明のアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーと併せて使用され、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーは、好ましくはアレル特異的プライマーである。さらに上述したものと同じ規格を有しており、標識されたプローブ及びプライマーは、本発明のドナー・フルオロフォアで標識され、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたｌｉｂｒａプローブ－プライマー対である。
本発明の別の目的は、少なくとも陽性対照鋳型（複数可）に加えて、陽性対照鋳型（単数または複数）に対する本発明の少なくともドナー・フルオロフォアで標識されたプライマー及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマー［ｌｉｂｒａプライマー対］または少なくともドナー・フルオロフォアで標識されたプローブ及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマー（複数可）［ｌｉｂｒａプライマー－プローブ対（複数可）］を提供することである。
別の目的は、複数の標的配列の検出及び／または定量化のために、本発明のドナー・フルオロフォアで標識され、且つアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識された複数のｌｉｂｒａプライマー対、またはドナー・フルオロフォアで標識され、且つアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識された複数のｌｉｂｒａプローブ及びプライマー対を使用した多重化を用いることである。
別の目的は、１つの非標的プライマーを標的特異的プライマーと併せて使用して、または２つの非標的プライマーを使用して少なくとも１種の標的配列を増幅することであり、ここで、非標的プライマー配列（単数または複数）は、当該技術分野で公知の方法のいずれかによって標的配列の１つまたは２つの末端に付加されるかまたは組み込まれ、１つの標的特異的プライマーと１つの非標的プライマーとの組み合わせ及び２つの非標的プライマーの組み合わせは、本発明のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアで標識されたｌｉｂｒａプライマー対である。さらに、非標的配列（単数または複数）を、当該技術分野で公知の方法のいずれかを使用して標的配列（単数または複数）に付加することができ、決して限定されるものではないが、その方法には、５’末端に非標的配列（単数または複数）が付加され、それらを重合またはＰＣＲ反応（Ｔａｉｌ ＰＣＲ反応などを含む）で伸長させる、ＰＣＲプライマー（単数または複数）、あるいは５’末端に第１の非標的配列の配列を保有する第１の標的特異的一本鎖オリゴヌクレオチド及び３’末端に第２の非標的配列の配列を保有する第２の標的特異的一本鎖オリゴヌクレオチドを標的配列の一方の鎖とハイブリダイズさせ、リガーゼ酵素を使用して第１の標的特異的オリゴヌクレオチドと第２の標的特異的オリゴヌクレオチドとをライゲーションさせること（２つの標的特異的一本鎖オリゴヌクレオチドは２つの連続した配列であり、そのうちの１つはライゲーション用のリン酸基を有する）である。あるいはポリメラーゼを使用して、５’末端に第１の非標的配列を保有しかつ一本鎖ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡまたはｍ－ＲＮＡまたは一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ標的の３’末端と重複する数個の塩基を３’末端に有する第１の一本鎖配列を伸長させ、同様に、５’末端に第２の非標的配列を保有しかつ（一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ標的上の）上記伸長産物の３’末端と重複する数個の塩基を３’末端に有する第２の一本鎖配列を伸長させることが含まれる。
さらに、ｔａｉｌ ＰＣＲでは、特定の目的は、通常必要とされるプライマー濃度の一部が、増幅プライマーまたはプライミング配列と、プライマーまたはプライミング配列の５’末端にあるｔａｉｌ配列とをそれぞれ含む２つのｔａｉｌプライマーを使用することであり、ここで、ｔａｉｌ配列は標的特異的配列ではなく、標的増幅の開始及び標的増幅の駆動には、２つの非標的ｔａｉｌ配列に対応する別のプライマー対を使用する。２つのｔａｉｌ配列に対応するプライマー対は、本発明のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたｌｉｂｒａプライマー対である。
さらなる目的は、ドナー・フルオロフォア部分で標識された上記の非標的プライマーであって、その５’末端にアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーまたは４～８個の非標的配列を追加的に提供することによりクエンチングされた、非標的プライマーを提供することである。
別の目的は、５’末端にプロモーター配列を保有し、３’末端にポリＴ配列を保有し、それに続いて１つまたは２つの非チミン塩基を有するまたは有さない（好ましくは有する）第１の非標的プライマーと、第２の標的特異的プライマーとを使用して標的を増幅することであり、第１の非標的プライマー及び第２の標的特異的プライマーは、本発明のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアで標識されたｌｉｂｒａプライマー対である。第１の非標的プライマーは、標的配列（ＲＮＡ／ＤＮＡ、好ましくはメッセンジャーＲＮＡ、ｍ－ＲＮＡ）上に伸長され、第２の標的特異的プライマーは、伸長鎖上に位置し、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを含むポリメラーゼ（単数または複数）によって伸長され、ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ配列を転写するための鋳型が生成され、ＲＮＡが転写される。プライマー伸長及びＲＮＡ転写が何度も繰り返され、標的配列が線形増幅される。別の拡張では、プロモーター配列と塩基数個の３’末端突出部とを有する二本鎖アダプターが、上記の第１の非標的プライマー配列の代わりに使用される。標的ＤＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。さらなる拡張では、ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブも使用され、標識されたプローブ及びプライマー（複数可）は本発明のｌｉｂｒａプライマー－プローブ対である。
別の目的は、ドナー・フルオロフォアもしくはアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーまたはドナー・フルオロフォアで標識されたプローブを、（それらの５’末端もしくは３’末端または内部塩基／内部連結を介して）ガラスもしくはガラスウエハまたはプラスチック（透明もしくは半透明）またはウェルもしくはスポットなどの固体表面に共有結合的に付着させ、反応混合物中で反応チャンバの固体表面と接触している他のプライマー（単数または複数）を提供し、核酸増幅に供することである。単一の核酸標的配列または複数の核酸標的配列に対する非常に多くの標識されたプライマーまたはプローブを、単一または複数の核酸標的を検出するために反応チャンバ（単数または複数）［ウェル（複数可）］の固体表面に共有結合的に付着させることができる。
別の目的は、本発明のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたｌｉｂｒａプライマー対またはドナー・フルオロフォアで標識されかつアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたｌｉｂｒａプローブ－プライマー対を、標的配列（単数または複数）の絶対定量化に使用することである。増幅による核酸標的の絶対定量化の１つの態様は、核酸増幅反応にポアソン分布を適用することである。ポアソン分布を適用するには、増幅反応中に単一の標的配列が存在する確率が１未満である必要があり、同じ増幅反応混合物がナノリットル以下の体積の数千の液滴に分割され、各液滴の増幅反応シグナルは、ＰＣＲまたはｑＰＣＲで使用される増幅の対数期におけるシグナルの測定とは著しく対照的に、増幅反応の終点で測定される。これは、デジタルＰＣＲまたはドロップレットＰＣＲとして知られている。デジタルＰＣＲでは、終点での測定を使用することと、そのためのプライマーまたはプライマー及びプローブの使用量が少ないことにより、多数の増幅反応が失敗することが問題である。結果として、良好な定量化のために２００００～４００００個の液滴が生成されるが、これには高価な専用装置が必要となる。ｌｉｂｒａプライマー対またはｌｉｂｒａプローブ－プライマー対の使用により、より多くのプライマー及びプローブを使用することができるようになり、よって反応の失敗が少なくなり、よって標的配列（単数または複数）の良好な絶対定量化を達成するために使用する液滴の数が少なくなるか、または極少体積の反応の数が少なくなる。
ある特定の実施形態では、核酸分子を合成する方法が提供され、かかる方法は、少なくとも１種の、ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマー及びアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーで標識されたプライマーと、１種以上のヌクレオシド三リン酸及び／またはデオキシヌクレオシド三リン酸と、熱安定性または非熱安定性ポリメラーゼとの混合物と標的核酸配列を接触させることを含み、ここで、非特異的プライマー二量体産物からのシグナルは消失されるかまたは概ね消失される。ある特定の実施形態では、核酸分子を合成する方法が提供され、かかる方法は、ドナー・フルオロフォアで標識された少なくとも１種のプローブ及びアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーで標識された１つ以上のプライマーと、１種以上のヌクレオシド三リン酸及び／またはデオキシヌクレオシド三リン酸と、熱安定性または非熱安定性ポリメラーゼとの混合物と標的核酸配列を接触させることを含み、ここで、非特異的プライマー二量体様産物からのシグナルは消失されるかまたは概ね消失される。ある特定の実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。
ある特定の実施形態では、ある特定の本発明の方法を実施するためのキット（単数または複数）が提供される。キット（単数または複数）は、ドナー・フルオロフォアまたはアクセプター・フルオロフォアもしくは非放射性クエンチャーで別々に標識された少なくとも１種のプライマー対を１つ以上の容器中に含む。ある特定の実施形態では、ある特定の本発明の方法を実施するためのキット（単数または複数）が提供され、キット（単数または複数）は、ドナー・フルオロフォアまたはアクセプター・フルオロフォアもしくは非放射性クエンチャーで別々に標識された少なくとも１種のプライマー対を１つ以上の容器中に含み、このプライマー対は、任意の標的配列を増幅するための共通のユニバーサルプライマー対である。ある特定の実施形態では、キット（単数または複数）は、ドナー・フルオロフォアで標識された少なくとも１種のプローブ及びアクセプター・フルオロフォアまたは非放射性クエンチャーで標識された少なくとも１種以上のプライマーを含む。さらに、キット（単数または複数）はまた、全ての必要な構成成分（ＰＣＲミックスまたはＰＣＲマスターミックスまたは増幅反応ミックス）を含有する反応混合物、１種以上のヌクレオシド三リン酸及び／もしくはデオキシヌクレオシド三リン酸、反応緩衝液、熱安定性もしくは非熱安定性ポリメラーゼ（単数または複数）または熱安定性もしくは非熱安定性リガーゼ、酵素トポイソメラーゼ、リコンビナーゼ、熱安定性もしくは非熱安定性ヘリカーゼ、熱安定性もしくは非熱安定性一本鎖結合タンパク質（単数または複数）を含有してもよい。さらに、キット（単数または複数）はまた、少なくとも１種の陽性対照鋳型、及び陽性対照鋳型を増幅するための標識されたプライマー対または標識されたプライマープローブ対を含有してもよい。
プライマー及びプローブは、１０～５０塩基長、好ましくは１５～３５塩基長、より好ましくは２０～３０塩基長のオリゴヌクレオチドであり、相補性に起因する所望の特性が得られる限り、すなわち標的にハイブリダイズする能力または標的をプライミングする能力が失われていない限り、標的配列と完全にまたは不完全に相補的であってよく、１つ以上の修飾塩基または修飾糖部分（単数または複数）を保有することができ、１つ以上の修飾塩基または修飾糖部分を保有することができる。
標的核酸は、天然もしくは合成もしくは半合成の一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖ｃ－ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、エキソソームＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍ－ＲＮＡ）、小分子ＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、ｓＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡを含むがこれらに限定されない）、極小胚様幹細胞を含む幹細胞由来ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡ、または癌細胞ＤＮＡ（体液、生検試料、腫瘍、膿、唾液、糞便、癌幹細胞を含むがこれらに限定されない任意の供給源に由来する）、及び１つまたは２つの非標的合成配列を標的核酸の末端に付加することにより生成される一本鎖または二本鎖の合成または半合成ＤＮＡまたはＲＮＡから選択される。さらに、標的核酸は核酸分子全体を構成する必要はない。
内部塩基上のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー標識は、デオキシヌクレオチドの４つの塩基上、デオキシウリジン上、好ましくはチミン塩基上のいずれかにあり得る。
別の目的は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、アレルＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、セミネステッドＰＣＲ、メチル化状態ＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、Ｔａｉｌ ＰＣＲ、ドロップレットＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、Ｉｎ－ｓｉｔｕ ＰＣＲ、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）を含むがこれらに限定されない等温核酸増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ヘリカーゼポリメラーゼ増幅（ＨＰＡ）、ＮＡＳＢＡ、及び等温増幅の変形（等温増幅のアレルプライマーまたはプライマー－プローブ対、ネステッドまたはセミネステッドプライマー対、ネステッドまたはセミネステッドプライマー－プローブ対の変形を含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されないポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）から核酸増幅を選択することである。
ＰＣＲ増幅における標的増幅産物の長さは、４０～２００塩基対、好ましくは７０～１２０塩基対である。等温ループ媒介核酸増幅（ＬＡＭＰ）における標的増幅産物の長さは、１００～６００塩基対、好ましくは１５０～２８０塩基対であり、内部プライマーまたはループプライマーはｌｉｂｒａプライマー対として標識される。リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）では、標的増幅産物の長さは１０００塩基対にもなり得るが、１００～２００塩基対が好ましく、プライマーはｌｉｂｒａプライマー対として標識される。ヘリカーゼポリメラーゼ増幅（ＨＰＡ）では、標的増幅産物の長さは１０００塩基対にもなり得るが、１００～２００塩基対が好ましい。
本発明のドナー・フルオロフォア、アクセプター・フルオロフォア及びクエンチャーは、レポーター色素または色素、フルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、６－ＦＡＭ（アジド）、２’７’－ジメトキシ－４’５－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、５－（４，６－ジクロロトリアジン－２イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＶＩＣ（ビクトリアブルー）、ＶＩＣとほぼ同一のスペクトルプロファイルを有するＭＡＸ（商標）ＶＩＣ、Ａ ＶＩＣ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の同等物であるＳＵＮ（商標）、ＴＹＥ（商標）５６３、ＮＥＤ、フルオレスカミン、ピレン、ピレンブチレート、スクシミジル１ピレンブチレート、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミン１２３、ローダミンＢ、スルホローダミン、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、６－カルボキシ－Ｘローダミン（ＲＯＸ）、スルホローダミンｂ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－Ｘ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－Ｘ、ＴＥＸ６１５ Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ＴＡＭＲＡ（商標）（アジド）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）－Ｘ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ（商標）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、テルビウムキレートユーロピウムキレート、量子ドット、グラフェン量子ドット、５－（２’－アミノエチル）アミノナフチルアミド－３，５ジスルホネート（ルシファーイエローｖｓ）、７－アミノ－４－メチルクマリン（ａｍｃ、クマリン１２０）、７－アミノ－４－トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）、シアニン２、シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７を含むがこれらに限定されないシアニン色素（スルホン化もしくは非スルホン化）、［５－ジメチルアミノ］ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、４－（４’－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、ＤＡＢＳＹＬ、４－ジメチルアミノフェニルアゾフェニル）－４’－イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、ＩＡＥＤＡＮＳ（５－（（（（２－ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレンスルホン酸）、ＥＤＡＮＳ、ＱＳＴ ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ ２１、ＱＳＹ ３５（ＱＳＹ色素はジアリール－ローダミン誘導体である）、ＢＩＯＤＩＰＹ ＦＬを含むがこれに限定されないＢＩＯＤＩＰＹ色素、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ３５０、４８８、５４６、５５５、５６８、５９４、６４７色素を含むがこれらに限定されないＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ色素、ＡＴＴＯ（商標）４８８、ＡＴＴＯ（商標）５３２、ＡＴＴＯ（商標）５５０、ＡＴＴＯ（商標）５６５、ＡＴＴＯ（商標）、ＡＴＴＯ（商標）５９０、ＡＴＴＯ（商標）６３３、ＡＴＴＯ（商標）６４７Ｎを含むがこれらに限定されないＡＴＴＯ色素、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、ＬＩ－ＣＯＲ社のＩＲＤｙｅｓ（登録商標）ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）６４０、Ｄｙ７５０、非放射性クエンチャー（Ｎａｎｏｇｏｌｄ、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー０、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー１、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー２、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー３、Ｅｃｌｉｐｓｅクエンチャー、ダーククエンチャー、ＩＤＴ社クエンチャーＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）ＲＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、ＺＥＮ（商標）、ＴＡＯ及び／またはＺＥＮ（登録商標）、ナノ粒子クエンチャー、ＭＧＢ色素を含むがこれらに限定されない）から選択される。
さらなる色素は、参照文献（Penguang Wu et al, Analytical Biochemistry vol - 218, pages 1 - 13, 1994、Robert H Fairclough et al Methods in Enzymology, vol - 48, pages - 347 - 379, 1978）に列挙されている色素から選択することもでき、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖｓｉｔｅでは、一般的なＦＲＥＴ対及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社のＨａｎｄ Ｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓについて検索することができる。新たなフルオロフォア及びクエンチャーは常に開発されており、特別な要件なしに使用することができる。実際、多数のフルオロフォア及びクエンチャーがあり、それらを全て含めると極めて大きなリストとなる。
一般的な方法は以下のとおりである。
１）全てのオリゴヌクレオチドは、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社及び他の商業ベンダーからＨＰＬＣ精製済みで購入したものであるか、または固相ホスホトリエステル化学反応によって化学合成することができる。
２）染色体ＤＮＡの調製：
大腸菌細胞をＬＢ培地で一晩増殖させ、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ－７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
Ｑｉａｇｅｎ社の染色体ＤＮＡ精製キットをキットのプロトコルに従って使用して、細胞ペレットを染色体ＤＮＡ単離に使用した。精製ＤＮＡを、２６０ｎｍでの光学密度を測定することにより分光光度的に推定した。
３）．フルオロフォアまたはクエンチャーで標識したプライマー及びプローブの合成：
内部ドナー・フルオロフォアまたはアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識したプライマー及びプローブを、４種のデオキシヌクレオチドホスホラミダイト及びドナー・フルオロフォアまたはアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー標識チミジン（ｄＴ）ホスホラミダイト（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol - 92, pages 9347 - 9351）を内部標識に使用して、オリゴ合成機での固相ホスホトリエステル化学反応により化学合成する。
ドナー・フルオロフォアを標識した３’末端標識ホスホラミダイトを使用して、３’末端にドナー・フルオロフォアで標識したプローブを合成する。
ドナー・フルオロフォアもしくはアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーまたはビオチンを標識した５’末端標識ホスホラミダイトを使用して、５’末端にドナー・フルオロフォアもしくはアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーまたはビオチンを標識したプローブを合成する。
ドナー・フルオロフォアまたはアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識したプライマー及びプローブは、商業ベンダーから入手することができる。
４）オリゴヌクレオチドの精製：
使用するプライマー及びプローブを、ＨＰＬＣまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製する。
オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ精製は、一般に、７５％アセトニトリル中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ－６．５）及び０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ－６．５）の直線勾配を使用して、Ｃ－１８逆相カラムで行われる。
ＰＡＧＥ精製は、オリゴ合成機からの脱塩オリゴヌクレオチド調製物を８％ポリアクリルアミドゲルに適用し、高電圧（ゲルの長さに応じて５００～１０００ボルト）を印加することにより行われる。
最も緩徐に移動するバンドをゲルから切り出し、それを破砕して溶出緩衝液（酢酸アンモニウム緩衝液）中またはゲル溶出器具内で浸漬させた後、精製オリゴヌクレオチドをゲルから溶出させる。
オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ及びＰＡＧＥ精製のための多くの方法が、当該技術分野で利用可能である。非標識及び標識オリゴヌクレオチドを供給する商業ベンダーは、依頼された場合、オリゴヌクレオチドの必要な精製を提供する。
カートリッジ精製、ＨＰＬＣ精製またはＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）精製を含む、様々な種類の精製が利用可能である。
全ての標識オリゴヌクレオチドならびに非標識オリゴヌクレオチド及び合成配列は、ベンダーがＨＰＬＣまたはＰＡＧＥにより精製した。
５．ＰＣＲの増幅条件（プライマー対またはプライマー－プローブ対を使用）：
増幅反応は、商業ベンダーのＫａｐａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから供給された２Ｘ Ｋａｐａ ＰＣＲマスターミックス、濃度０．２μＭの標識プライマー及び非標識プライマーならびに標識プローブを使用して、１０または１５μｌの増幅反応体積で行った。
あるいは、市販の反応マスターミックスの代わりに、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）と、５０ｍＭ ＫＣｌと、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２と、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰと、０．０１％ゼラチンと、２．０または３．０単位のＴａｑポリメラーゼと、を含有するＰＣＲ反応ミックスを使用することができる。
ＰＣＲに使用した熱サイクリングパラメータは、９５℃で２分間の初期変性、続いて９５℃で１０秒間の変性と、５５℃で４５秒のアニーリングと、７２℃で１５秒間の伸長とのサイクルが４５回であった。
２０分間の９４℃での最終変性の分析も行った。
ＰＣＲ増幅は、ＣＦＸ ３８４ ＲＴ ＰＣＲブロックを備えたＢｉｏ Ｒａｄシリーズ１０００サイクラーで行った。
全てのプライマー及びプローブは、ＩＤＴ社Ｗｅｂサイトのｐｒｉｍｅｒ ｐｒｅｍｉｅｒ、またはＧｅｎｅ ｓｃｒｉｐｔソフトウェア、またはＩＤＴ社Ｏｌｉｇｏａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアを使用して設計及び分析した。
この進歩は、以下の非限定的な例示的な説明によって下記でさらに説明される。以下の実施例１～８は、本発明の特徴を説明するものである。
実施例１： ドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーとの間の、２つの部分間のエネルギー移動が微小である距離または分離
ドナー・フルオロフォアからアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーへのエネルギー移動が微小である、ドナー・フルオロフォア部分とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー部分との間の分離は、ドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーとの対ごとに異なる。全てのドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーとの対は、それぞれのフェルスター半径（Ｒ０）（ドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー間のエネルギー移動効率が０．５である分離）を有しており、その範囲は２２オングストローム～７５オングストロームであり、２Ｒ０分離したドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー間のエネルギー移動は無視できるものである。したがって、２Ｒ０を越える分離の場合、エネルギー移動は微小であり、対応する分離は１２塩基～４０塩基となる。しかしながら、ＰＣＲでは極めて高レベルの増幅が行われるため、検出可能なシグナルが少量のエネルギー移動によって生成され得る。加えて、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーをオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブに付着させるために使用するリンカーの長さも、２つの部分間の実際の分離を決定する際に重要である。さらに、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャー分子は、大部分が疎水性であり、近くに配置されると互いに相互作用する傾向がある。したがって、ドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーとの対は、Ｒ０値範囲の下限から選択される場合、分離はそれらの２Ｒ０距離よりもさらに大きくする必要がある。したがって、エネルギー移動が微小である分離のためには、ドナーとアクセプター／クエンチャーとの対の２Ｒ０分離に小さな追加の分離を追加した方がよい。
標的増幅反応におけるドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーとの間の４０塩基以上の分離は、標的配列増幅用の標識プライマー及び標識プローブを設計する際に、一切の悪影響を伴わずに安全に使用することができる。本実施例では、ドナー・フルオロフォアＦＡＭ及びＢＨＱ１クエンチャーを、標的増幅産物中で４０塩基／塩基対を超える分離で使用した。
実施例２： ドナー・フルオロフォアＦＡＭ標識プライマー及びプローブの蛍光増強の測定
この目的のために、ドナー・フルオロフォアＦＡＭで標識したオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブ（各々２．５ｐモル）の蛍光を、ＣＦＸ ３８４ ＲＴ ＰＣＲブロックを備えたＢｉｏ Ｒａｄシリーズ１０００サイクラーにおいて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ Ｐｈ－８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ及び２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２の緩衝液中、総体積１５μｌで、鋳型を用いずに（Ｆ１）、及び最初に９５℃で２分間加熱し、次いで温度を０．１℃／秒の速度で２５℃まで低減させることにより、これらのオリゴヌクレオチドに対する相補性を有するＨＰＬＣ精製合成鋳型３、配列番号１８（各々１２．５ｐモル）にハイブリダイズさせて（Ｆ２）、測定した。
２つの測定値間の蛍光値の差から、合成鋳型へのハイブリダイゼーション時のフルオロフォアＦＡＭの蛍光増強の程度を得た。使用したオリゴヌクレオチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１及び配列番号１２であった。ＦＡＭ標識オリゴが合成鋳型配列にハイブリダイゼーションした際のドナー・フルオロフォアの蛍光の増強率を、上記の２つの蛍光シグナル測定値から算出した（増強＝［｛（Ｆ２－Ｆ１）／Ｆ１｝×１００パーセント］）。異なるプロトコル及び異なる合成鋳型が使用されている。チューブ間に多少の変動があったが、最良の結果を考慮に入れた。リアルタイムＰＣＲ機を使用するよりも、分光蛍光光度計での測定の方が増強率のより良好な推定値が得られる。
結果：
増強％は以下のとおりである（合成鋳型－３、配列番号１８を使用）：
１）配列番号５－（－）２．０％ ２）配列番号６－１７％ ３）配列番号７－１５％ ４）配列番号８－４５％ ５）配列番号９－４０％ ６）配列番号１１－（－）４％ ７）配列番号１２－（－）２８％
結論：ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドのＦＡＭ蛍光の増強の程度は、ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端または内部塩基にあるＦＡＭ標識塩基の位置に応じて異なる。さらに、増強率の値は、ＨＰＬＣ精製合成鋳型の純度にも依存する。
フルオロフォア標識塩基の近傍にＧ塩基が存在することが、フルオロフォアで標識したオリゴヌクレオチドの蛍光のクエンチングに重要な役割を果たすことが知られている。これはさらに、塩基配列、オリゴヌクレオチドの一次及び二次構造、局所配列ならびにリンカーの長さに依存し、標識オリゴヌクレオチドが相補的配列にハイブリダイズするかまたは伸長される場合に変化する（Seidel et al, J Phys Chem, 1996, Vol-100: 5541 - 5553；Kelly et al, Science, 1999, Vol - 283: 375 - 381；Nazarenko et al, Nucleic Acid Research, 2002, Vol. 30, No. 9, 2089 - 2195）。
実施例３： ドナー・フルオロフォアＦＡＭとクエンチャーＢＨＱ１間のクエンチングの程度の測定
この目的のために、ドナー・フルオロフォアＦＡＭで標識したオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブ（各々２．５ｐモル）の蛍光放出を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ Ｐｈ－８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ及び２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２の緩衝液中、総体積１５μｌで、ハイブリダイズさせずに（Ｆ１）、またはこれらのオリゴヌクレオチドに対する相補性を有するＨＰＬＣ精製合成鋳型（１２．５ｐモル）に５５℃で１０分間、別々にハイブリダイズさせて（Ｆ２）、ならびにＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド（各々２．５ｐモル）とＢＨＱ１クエンチャー標識オリゴヌクレオチド（各々３．７５ｐモル）とを一緒に、両方のオリゴヌクレオチドに対する相補性を有するＨＰＬＣ精製合成鋳型（１２．５ｐモル）に５５℃で１０分間、別々にハイブリダイズさせて（Ｆ３）、測定した。Ｆ２値とＦ１値の差は増強を示す。Ｆ２－Ｆ１値は増強された蛍光値を示し、Ｆ３－Ｆ２は正味のクエンチングを示す。また、クエンチング率は［（Ｆ３－Ｆ２）／Ｆ２］×１００％で算出される。実験は、ＣＦＸ３８４ ＲＴ－ＰＣＲブロックを備えたＢｉｏ－Ｒａｄシリーズ１０００サイクルで行った。
チューブ間に変動があったが、起こり得る最良の結果を考慮に入れた。この測定には、分光蛍光光度計がリアルタイムＰＣＲ機よりも良好な機器である。また、ＦＡＭ標識オリゴと非標識相補性オリゴ及びＢＨＱ１標識オリゴとのハイブリダイゼーションにより、より良好な結果が得られる。
使用したオリゴヌクレオチド及び合成鋳型ならびに様々な分離でのクエンチング率は以下のとおりである。
１）鋳型１－配列番号１６、配列番号５及び配列番号４、分離－６塩基、及びクエンチング－２６％、
２）鋳型１－配列番号１６、配列番号６及び配列番号４、分離－９塩基、及びクエンチング－２１％、
３）鋳型２－配列番号１７、配列番号５及び配列番号４、分離－８塩基、及びクエンチング－２３％、
４）鋳型２－配列番号１７、配列番号６及び配列番号４、分離－１１塩基、及びクエンチング－１６％。
本実験で使用した合成鋳型の配列は、鋳型－１（配列番号１６）及び鋳型－２（配列番号１７）である。
合成鋳型上のＦＡＭフルオロフォア標識オリゴヌクレオチド及びＢＨＱ１クエンチャー標識オリゴヌクレオチドの相対的配向を図－３に示す。
鋳型－１、配列番号１６：
５’ ＴＴＣ ＴＡＣ ＧＧＴ ＴＴＡ ＣＣＧ ＡＡＴ ＧＴＧ Ａ／ＡＧ ＡＡＴ ＧＧＴ ＣＡＣ ＴＧＧ ＣＴＴ ＡＴＣ ＡＣＣ Ｃ ３’ ３’ＡＡＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＴＴＡ ＣＡＣ Ｔ／ＴＣ ＴＴＡ ＣＣＡ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＡＡ ＴＡＧ ＴＧＧ Ｇ ５’
鋳型－２、配列番号１７：
５’ ＴＴＣ ＴＡＣ ＧＧＴ ＴＴＡ ＣＣＧ ＡＡＴ ＧＴＧ Ａ／ＡＴ／ＡＧ ＡＡＴ ＧＧＴ ＣＡＣ ＴＧＧ ＣＴＴ ＡＴＣ ＡＣＣ Ｃ ３’
３’ ＡＡＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＴＴＡ ＣＡＣ Ｔ／ＴＡ／ＴＣ ＴＴＡ ＣＣＡ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＡＡ ＴＡＧ ＴＧＧ Ｇ ５’
鋳型－３、配列番号１８：
５’ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＡ ＴＡＡ ＡＣＧ ＣＣＧ ＡＧＡ／ＡＧＡ ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＣＴ ＧＧＣ ＴＴＡ ＴＣＡ ＣＣＣ ３’
３’ ＧＴＡ ＧＴＧ ＧＴＴ ＡＴＴ ＴＧＣ ＧＧＣ ＴＣＴ／ ＴＣＴ ＴＡＣ ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＣＧ ＡＡＴ ＡＧＴ ＧＧＧ ５’
赤－配列番号４、青－配列番号５／６、マゼンタ－配列番号７／８／９
異なる鋳型にハイブリダイズしたときの配列番号４、５、６、７、８、９の配列の互いに対する相対的アラインメントを示すために、個々の配列（５～９）を色分けした。配列番号５及び６は、標識の位置が異なる同一の配列を有する。配列番号７、８及び９は、標識の位置が異なる同一の配列を有する。
実施例４： ＦＡＭ標識プライマー及びＢＨＱ１標識プライマーを使用した細菌大腸菌のトレオニン合成酵素遺伝子の増幅
標的配列：
配列番号２６ ｇａｔｃｃｔｃｔｃｇ ｇｃｇｔｔｔａｔｔｇ ｇｔｇａｔｇａａａｔ ｃｃｃａｃａｇｇａａ ａｔｃｃｔｇｇａａｇ ａｇｃｇｃｇｔｇｃｇ ｃｇｃｇｇｃｇｔｔｔ ｇｃｃｔｔｃｃｃｇｇ ｃｔｃｃｇｇｔｃｇｃ ｃａａｔｇｔｔｇａａ ａｇｃｇａｔｇｔｃｇ ｇｔｔｇｔｃｔｇｇａ
増幅反応を、各０．２μＭのＦＡＭ標識フォワードプライマー（配列番号７、８及び９）ならびに０．２μＭのＢＨＱ１標識リバースプライマー（配列番号１０）を別々に使用し、２Ｘ Ｋａｐａ ＰＣＲマスターミックス、１ｎｇの大腸菌染色体ＤＮＡ調製物を使用してまたはＤＮＡなしで（対照として）、１５μｌまたは１０μｌの反応体積で三連で行い、大腸菌トレオニン合成酵素遺伝子の１１１塩基対セグメントを増幅した。いずれか１つの増幅反応セット（鋳型ありまたは鋳型なしの反応のセット）において、ＦＡＭ標識プライマーのいずれか１つ及びＢＨＱ１標識リバースプライマーを使用した。
比較のために、増幅反応を、同じ１ｎｇ量の大腸菌染色体ＤＮＡを使用してまたはＤＮＡなしで（対照反応）、５’末端にＦＡＭ、３’末端にクエンチャーＢＨＱ１を保有する０．２μＭのＴａｑｍａｎプローブ（配列番号１５）、各々０．６μＭのフォワードプライマー（配列番号１３）及びリバースプライマー（配列番号１４）ならびに２Ｘ Ｋａｐａ ＰＣＲマスターミックスを使用して、１５μｌまたは１０μｌの反応体積で三連で行い、大腸菌ホモセリンキナーゼ遺伝子の１４５塩基対セグメントを増幅した。
配列番号７、８及び９は同じヌクレオチド配列を有するが、ＦＡＭ標識の位置が異なる。ＦＡＭ標識フォワードプライマー及びＢＨＱ１標識リバースプライマーのヘテロ二量体分析では、それらの３’末端が９塩基重複し、うち４塩基が一致しており、ΔＧ＝（－）５．０ｋｃａｌ／モルでヘテロ二量体が形成されたことが示されている。
配列番号７、８及び９について、ＦＡＭ標識プライマーの３’末端からのＦＡＭ標識塩基の分離とＢＨＱ１標識リバースプライマーの３’末端からのＢＨＱ１標識塩基の分離との合計は、それぞれ２１塩基、１１塩基及び１４塩基であり、プライマー二量体中のＦＡＭ標識塩基とＢＨＱ１標識塩基との推定される分離は、それぞれ１２塩基、２塩基及び５塩基である。
配列番号８のフォワードプライマー及び配列番号１０のリバースプライマーの増幅反応は、鋳型ＤＮＡを用いた増幅反応では平均増幅Ｃｑ値１９．８を示し（図３）、鋳型なし対照反応ではＣｑ値０を示した（図４）。図３Ａ及び図４Ａはそれぞれの融解曲線である。
配列番号９のフォワードプライマー及び配列番号１０のリバースプライマーの増幅反応は、鋳型ＤＮＡを用いた増幅反応では平均増幅Ｃｑ値１９．２を示し（図５）、鋳型なし対照反応ではＣｑ値３７．４、３８．６、４０．４及び０を示した（図６）。図５Ａ及び図６Ａはそれぞれの融解曲線である。
配列番号７のフォワードプライマー及び配列番号１０のリバースプライマーの増幅反応は、鋳型ＤＮＡを用いた増幅反応では平均増幅Ｃｑ値２１．８を示し（図７）、鋳型なし対照反応ではＣｑ値０を示した（図８）。図７Ａ及び図８Ａはそれぞれの融解曲線である。
考察：配列番号９のフォワードプライマー及び配列番号１０の場合、配列番号９の３’末端からのＦＡＭ標識塩基の分離と配列番号１０リバースプライマーの３’末端からのＢＨＱ１標識塩基の分離の合計は、１４塩基である。これら２つのプライマーによって、９塩基が重複し、ΔＧ＝（－）５．０ｋｃａｌ／モル（インシリコ分析）のヘテロ二量体が形成される可能性がある。結果として、フォワードプライマーのドナー・フルオロフォアＦａｍ及びリバースプライマーのクエンチャーＢＨＱ１は、非特異的プライマー二量体において５個の介在塩基（６塩基間距離）で分離して近接すると予想される。実施例２で実証されたように、相補的配列へのＦＡＭ標識プライマー配列番号９のハイブリダイゼーション時に約４０％の増強が見られる。４０％の増強を均衡させるのに必要なクエンチングの程度は、約２８．６％である。５塩基の分離でのＦＡＭフルオロフォアとＢＨＱ１クエンチャーとの間のクエンチングの程度は、６塩基の分離で測定した場合（実施例３）の２６％を超えるはずであり、プライマー二量体におけるＦＡＭ蛍光の増強を正確に均衡させるのに必要な２８．６％のクエンチングよりも少ない場合がある。結果として、プライマー二量体からの有効な正味の蛍光放出が起こり、プライマー二量体からのシグナルが生じる。このため、鋳型なしの対照反応は、本発明のプライマー配列番号９及び配列番号１０を使用して、増幅Ｃｑ値３７．４、３８．６、４０．４及び０を示した。プライマー上のＦＡＭフルオロフォア及びクエンチャーＢＨＱ１の配置は、プライマー二量体からのシグナルがゼロになる最適な配置よりも高い側（ｈｉｇｈｅｒ ｓｉｄｅ）にある。しかし、このシグナルはほぼゼロのシグナルであり、たとえシグナルをゼロにするのに最適なプライマー対ではないとしても、標的増幅に使用することができる。配列番号９について測定された４０％の増強は、実際の増強よりわずかに少ない可能性がある。
さらに、フォワードプライマーとリバースプライマーの代わりにプライマー二量体を形成する配列番号９のフォワードプライマーの問題に関して、増幅反応を、鋳型を使用せずに、濃度０．４μＭのフォワードプライマー（通常使用する濃度の２倍）を使用しリバースプライマーを使用せずに（図９）［図９Ａは融解曲線］、濃度０．１μＭのフォワードプライマー及び濃度０．２μＭのリバースプライマーを使用して、濃度０．１μＭのフォワードプライマー（通常使用する濃度の半分）及び濃度０．３μＭのリバースプライマー（通常使用する濃度の１．５倍）を使用して（図１０、図１０Ａは融解曲線である）、濃度０．２μＭ濃度のフォワードプライマー及び濃度０．２μＭのリバースプライマー（標識プライマーに通常使用する）を使用して（図１２、図１２Ａは融解曲線）行った。これらの反応ではプライマー二量体の形成はなかった。しかし、鋳型ＤＮＡを一切用いずに、０．２μＭ（通常）濃度のフォワードプライマー及び０．３μＭ（通常濃度の１．５倍のリバースプライマー）を使用した増幅反応では、プライマー二量体が形成された（図１１、図１１Ａ）。通常使用する濃度の２倍のＦＡＭ標識フォワードプライマーではプライマー二量体が一切形成されなかったため、鋳型なし対照反応（図－６）で形成されたプライマー二量体は、ＦＡＭ標識フォワードプライマー配列番号９とＢＨＱ１標識リバースプライマー配列番号１０との間のプライマー二量体の形成によるものであり、ＦＡＭ標識フォワードプライマーによるホモ二量体形成によるものではない。さらに、ＦＡＭ標識フォワードプライマーを通常使用する濃度の半分で使用し、かつＢＨＱ１標識リバースプライマーの濃度を増加させることにより、またはＦＡＭ標識フォワードプライマーを通常使用する濃度で使用し、かつＢＨＱ１標識リバースプライマーの濃度を増加させることにより、ＦＡＭ標識フォワードプライマーとＢＨＱ１標識リバースプライマーとの間のプライマー二量体の形成をＦＡＭ標識フォワードプライマーの自己二量体に対して偏らせることができる。この方針で、ＦＡＭ標識フォワードプライマー０．１μＭ（通常使用する濃度の半分）及び０．３μＭのＢＨＱ１標識リバースプライマー（通常濃度の１．５倍）を使用して増幅反応を行った（図１３、図１３Ａは融解曲線である）。感度を大きく減少させることなく、標的配列が良好に増幅された。他方、ＦＡＭ標識フォワードプライマー０．２μＭ（通常使用する濃度）及び０．３μＭのＢＨＱ１標識リバースプライマー（通常濃度の１．５倍）を使用したところ（図１４、図１４Ａは融解曲線である）、比較するとわずかに良好な増幅が示された。したがって、ＦＡＭ標識フォワードプライマー（配列番号９）０．２μＭ（通常使用する濃度）及び０．３μＭのＢＨＱ１標識リバースプライマー（通常濃度の１．５倍）は、多くの有害影響及びＦＡＭ標識プライマーのホモ二量体を伴わずにこの偏りを生じさせる目的に使用することができる。４塩基の相補性を有する非特異的プライマー二量体の形成に偏るようにプライマーが設計されたことに留意すべきである。これらの塩基相補性の多さ及びΔＧ＝－５．０ＫＣａｌ／モルは望ましくなく、ヘテロ二量体形成のΔＧ値は－３．０ＫＣａｌ／モル未満である必要がある。
配列番号８と配列番号１０とのプライマー対の場合、配列番号８の３’末端からのＦＡＭ標識塩基の分離と配列番号１０の３’末端からのＢＨＱ１標識塩基の分離の合計は、１１塩基である。９塩基が重複し、ヘテロ二量体の形成にはΔＧ値－５．０ＫＣａｌ／モルである可能性がある（インシリコ分析）。結果として、フォワードプライマーのドナー・フルオロフォアＦＡＭ及びリバースプライマーのクエンチャーＢＨＱ１は、非特異的プライマー二量体において２個の介在塩基で分離して近接すると予想される。実施例（２）で実証されたように、ＦＡＭ標識プライマー（配列８）のその相補的配列へのハイブリダイゼーション時に約４５％の増強が見られる。４５％の増強を均衡させるのに必要なクエンチングの程度は、約３１％である。
２塩基の分離でのＦＡＭフルオロフォアとＢＨＱ１クエンチャーとの間のクエンチングの程度は、６塩基の分離で測定した場合（実施例３）の２６％を超え、かつ２８．６％を超える（配列番号９及び配列番号１０の場合）はずであり、プライマー二量体におけるＦＡＭ蛍光の増強を正確に均衡させるのに必要な３１％のクエンチング以下である場合がある。結果として、形成されたプライマー二量体では、増強とクエンチングが概ね均衡するか、またはクエンチングがごくわずかに多くなるかのいずれかであり、その結果、プライマー二量体からのシグナルがなくなるか、または過剰なクエンチングによりシグナルがわずかに減少する。２塩基及び５塩基の近接した分離では、かかる短い分離における接触クエンチングの関与を考慮すると、クエンチングの程度に大きな差がない可能性があることが留意され得る。配列番号８及び配列番号１０のＢＨＱ２の増幅反応の増幅曲線（図３）及び融解曲線（図３Ａ）は、これを裏付けている。結果として、配列番号９と配列番号１０とのプライマー対のＣｑ値（１９．２）と比較してＣｑ値（１９．８）がわずかに増加し、配列番号９及び配列番号１０と比較して感度が少し低いことが示される。これは、配列番号９及び配列番号１０による増幅の場合にはわずかな正味の増強があるためである。
配列番号７と配列番号１０とのプライマー対の場合、配列番号７の３’末端からのＦＡＭ標識塩基の分離と配列番号１０の３’末端からのＢＨＱ１標識塩基の分離の合計は、２１塩基である。９塩基が重複し、ヘテロ二量体の形成にはΔＧ値が－５．０ＫＣａｌ／モルである可能性がある。結果として、フォワードプライマーのドナー・フルオロフォアＦＡＭ及びリバースプライマーのクエンチャーＢＨＱ１は、非特異的プライマー二量体において１２個の介在塩基で分離して近接すると予想される。実施例（２）で実証されたように、相補的配列へのＦＡＭ標識プライマー（配列番号７）のハイブリダイゼーション時に約１５％の増強が見られる。１５％の増強を均衡させるのに必要なクエンチングの程度は、約１３．０５％である。
１２塩基の分離でのＦＡＭフルオロフォアとＢＨＱ１クエンチャーとの間のクエンチングの程度は、１１塩基の分離で測定した場合（実施例３）の１６％よりもわずかに少ないはずであり、プライマー二量体におけるＦＡＭ蛍光の増強を正確に均衡させるのに必要な１３．０５％を超えるであろう。結果として、形成されたプライマー二量体では正味のクエンチングが生じ、その結果、プライマー二量体からのシグナルがなくなり、過剰なクエンチングによりシグナルが減少する。配列番号７及び配列番号１０を使用した増幅の標的増幅曲線（図７）及び鋳型なし対照の増幅曲線（図８）は、これを裏付けている。鋳型なし対照の増幅の３５サイクル後に、蛍光シグナルの漸進的な下方低減または増幅曲線の負の曲率が観察され得る。結果として、配列番号９と配列番号とのプライマー対（１９．２）のＣｑ値と比較してＣｑ値（２１．８）が増加し、配列９及び配列番号１０ならびにＴａｑｍａｎプローブ増幅（Ｃｑ－２１．２）（図２１）と比較して感度が低いことが示される。図２２はＴａｑｍａｎアッセイの鋳型なし対照反応である。
さらに、配列番号９と配列番号１０とのプライマー対の平均Ｃｑ値１９．２は、Ｔａｑｍａｎプローブアッセイ（配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５）のＣｑ値２１．２より２．０単位低い。Ｃｑ値が低いほど標的増幅産物の収率が高く、検出感度が高い。すなわち、配列番号９と配列番号１０とのプライマー対の増幅は、本開示の配列番号９及び配列番号１０を使用した標的増幅がＴａｑｍａｎアッセイよりも高感度であることを実証する。通常、２．０単位のＣｑ値の差は、標的数量の約５～７倍の差に相当する。
配列番号８と配列番号１０とのプライマー対のＣｑ値１９．８は、Ｔａｑｍａｎプローブアッセイ（配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５）のＣｑ値より１．４単位低く、配列番号９と配列番号１０とのプライマー対のＣｑ値より０．６単位大きい。配列番号８と配列番号１０とのプライマー対の増幅は、標的増幅において、Ｔａｑｍａｎアッセイも高感度であるが、配列番号９と配列番号１０とのプライマー対よりも低感度であることを実証する。両方のプライマー対（配列番号９と配列番号１０及び配列番号８と配列番号１０）の結果は、本発明の蛍光増強及びクエンチングの相殺／均衡の概念と一致している。
さらに、プライマー配列である配列番号９／配列番号８の場合の蛍光増強は４０／４５％に過ぎないが、増強の程度は、文献に報告されているように６０％～８０％もの高さになり得る。その場合、至適基準であるＴａｑｍａｎアッセイに対する現在のＣｑ値の差である２．０単位は、３．０～４．０単位に増加する可能性があり、これは標的増幅シグナルにおける及び本開示の方法を使用した核酸増幅による標的検出または定量化の感度における大きな飛躍となる。ＦＡＭ標識プライマーの５’末端にクエンチャーをさらに配置すると、蛍光増強が増加し、よって感度がより良好になる。
配列番号８及び配列番号９のＦＡＭフルオロフォアはプライマー配列の概ね中央にあり、配列番号７では配列の５’末端付近にあることが観察され得る。リバースプライマー配列番号１０では、クエンチャーＢＨＱ１は３’末端から５塩基離れている。さらに、シグナルをゼロまたはほぼゼロにするためには、非特異的プライマー二量体産物における蛍光増強とクエンチングとを均衡させるためにクエンチャーＢＨＱ１をＦＡＭフルオロフォアにより近づける必要があり、これには、フォワードプライマー配列である配列番号８または配列番号９の３’末端とリバースプライマー配列番号１０の３’末端との間の長い塩基重複（９塩基）、及びリバースプライマー配列番号１０内のＢＨＱ１の３’末端付近への配置が必要であることが観察され得る。標的検出の感度をより高くするには蛍光増強をより高くする必要があり、そのためにはドナー・フルオロフォアをドナー・フルオロフォア標識プライマーの中央付近に配置する必要があり、かつアクセプターまたはクエンチャーで標識したプライマーのアクセプターまたはクエンチャー部分アクセプターまたはクエンチャー部分をその３’末端付近で標識する必要がある。ドナー・フルオロフォアの蛍光増強は、それを３’末端付近に配置する場合は１～２０パーセント少なくなり、これは実施例５のドナー・フルオロフォアＦＡＭ標識プローブである配列番号５及び配列番号６の場合に見ることができる。ドナー・フルオロフォアを、フルオロフォア標識プライマーの３’末端から遠く離れた、ドナー・フルオロフォア標識プライマー（配列番号７）の中央と５’末端との間に配置する場合、アクセプターまたはクエンチャーを、アクセプターまたはクエンチャーで標識したプライマーの３’末端付近に配置する必要があり、かつフルオロフォア標識フォワードプライマー（配列番号７）とＢＨＱ１標識リバースプライマー（配列番号１０）との間のより長い重複がある。
標識プライマー及び標識プローブの新しいロットにより、より良好な結果が得られる。新しいロットは常により良好に動作する。それは、これらの標識オリゴヌクレオチドは安定化されない限りそれほど安定していないためであり、安定化は一部の企業によって適正な組成で行われている。非特異的プライマー二量体産物の形成はランダム／確率論的現象であり、あるときには形成され、別のときには形成されない場合がある。さらに、非特異的産物の形成は、使用する標識プライマー及び標識プローブの品質ならびに阻害物質の存在に依存する。標識プライマー及び標識プローブを２つの異なるロットで入手した。
実施例５： ＦＡＭ標識プローブ及びＢＨＱ１標識プライマーを使用した細菌大腸菌のトレオニン合成酵素遺伝子の増幅
標的ＤＮＡ
配列番号－３ ｔｇｇｃａｃａａａｔ ｇｃｔｇａｃｃｃａｔ ａｔｔｇｃｇｇｇｔｇ ａｔａａｇｃｃａｇｔ ｇａｃｃａｔｔｃｔｇ ａｃｃｇｃｇａｃｃｔ ｃｃｇｇｔｇａｔａｃ ｃｇｇａｇｃｇｇｃａ ｇｔｇｇｃｔｃａｔｇ ｃｔｔｔｃｔａｃｇｇ ｔｔｔａｃｃｇａａｔ ｇｔｇａａａｇｔｇｇ
増幅反応を、各０．２μＭの非標識フォワードプライマー（配列番号１）を使用し、ＢＨＱ１標識リバースプライマー（配列番号４、配列番号２）を別々に使用し、ＦＡＭ標識プローブ（配列番号５及び配列番号６）を別々に使用し、２ｘ Ｋａｐａ ＰＣＲマスターミックス（Ｋａｐａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を１ｎｇの大腸菌染色体ＤＮＡ調製物とともに使用してまたはＤＮＡなしで（対照として）、１０／１５μｌの反応体積で三連で行い、大腸菌トレオニン合成酵素遺伝子の１１３塩基対セグメントを増幅した。いずれかの増幅反応セット（鋳型ありまたは鋳型なしの反応のセット）において、ＦＡＭ標識プローブのいずれか１つ及びＢＨＱ１標識リバースプライマーのいずれか１つを、フォワードプライマー配列１と組み合わせて使用した。
比較のために、増幅反応を、同じ１ｎｇ量の大腸菌染色体ＤＮＡを使用してまたはＤＮＡなしで（対照反応）、５’末端にＦＡＭ、３’末端にクエンチャーＢＨＱ１を保有する０．２μＭのＴａｑｍａｎプローブ（配列番号１５）、各々０．６μＭのフォワードプライマー（配列番号１３）及びリバースプライマー（配列番号１４）ならびに２Ｘ Ｋａｐａ ＰＣＲマスターミックスを使用して、１０／１５μｌの反応体積で三連で行い、大腸菌ホモセリンキナーゼ遺伝子の１４５塩基対セグメントを増幅した。
プローブ配列である配列番号５及び６は同じヌクレオチド配列を有するが、ＦＡＭ標識の位置が異なる。リバースプライマーである配列番号４及び配列番号２は同じヌクレオチド配列を有するが、ＢＨＱ１標識の位置が異なる。ＦＡＭ標識プローブ及びＢＨＱ１標識リバースプライマーのヘテロ二量体分析では、それらの３’末端で４塩基が重複し、３’末端で４塩基が一致し、ΔＧ＝（－）５．１２ｋｃａｌ／モルでヘテロ二量体が形成されたことが示されている。
ＦＡＭ標識プローブ（配列番号５）の３’末端からのＦＡＭ標識塩基の分離とＢＨＱ１標識リバースプライマー（配列番号４）の３’末端からのＢＨＱ１標識塩基の分離との合計は１５塩基であり、プライマー二量体様非特異的産物中のＦＡＭ標識塩基とＢＨＱ１標識塩基との推定される分離は１１塩基である。ＦＡＭ標識プローブ（配列番号６）の３’末端からのＦＡＭ標識塩基の分離とＢＨＱ１標識リバースプライマー（配列番号４）の３’末端からのＢＨＱ１標識塩基の分離との合計は１８塩基であり、プライマー二量体様非特異的産物中のＦＡＭ標識塩基とＢＨＱ１標識塩基との推定される分離は１４である。ＦＡＭ標識プローブ（配列番号６）の３’末端からのＦＡＭ標識塩基の分離とＢＨＱ１標識リバースプライマー（配列番号２）の３’末端からのＢＨＱ１標識塩基の分離との合計は７塩基であり、プライマー二量体様非特異的産物中のＢＨＱ１標識リバースプライマーの３’末端からのＢＨＱ１標識塩基の推定される分離は３である。
プローブ（配列番号５）及びリバースプライマー（配列番号４）の増幅反応から、鋳型ＤＮＡを用いた増幅反応では平均増幅Ｃｑ値２１．８が得られ（図１５）、鋳型なし対照反応ではＣｑ値４１．０７、４０．２５及び０が得られた（図１６）。図１６Ａは、鋳型なし対照反応の融解曲線である。
プローブ（配列番号６）及び配列番号４のリバースプライマーの増幅反応は、鋳型ＤＮＡを用いた増幅反応では平均増幅Ｃｑ値２０．４を示し（図１７）、鋳型なし対照反応ではＣｑ値０を示した（図１８）。反応の２つは異常であったため無視した。
プローブ（配列番号６）及び配列番号２のリバースプライマーの増幅反応は、鋳型ＤＮＡを用いた増幅反応では平均増幅Ｃｑ値２４．０を示し（図１９）、鋳型なし対照反応ではＣｑ値０を示した（図２０）。
考察：プローブ（配列番号５）及びリバースプライマー（配列番号４）の場合、配列番号５の３’末端からのＦＡＭ標識塩基の分離と配列番号４の３’末端からのＢＨＱ１標識塩基の分離の合計は、１５塩基である。これら２つの標識プローブ及び標識プライマーによって、４塩基が重複し、ΔＧ＝（－）５．０ｋｃａｌ／モル（インシリコ分析）のヘテロ二量体が形成される。結果として、プローブのドナー・フルオロフォアＦＡＭ及びリバースプライマーのクエンチャーＢＨＱ１は、非特異的プライマー二量体様産物中で１１個の介在塩基で分離して近接すると予想される。実施例２で実証されたように、増強測定試験では、相補的配列へのＦＡＭ標識プローブのハイブリダイゼーション時の顕著な増強は観察されなかった。しかし、標的増幅のＣｑ値２１．８は、ＦＡＭ標識プローブ（配列番号５）の蛍光が増強されていることを示している。１１塩基の分離でのＦＡＭフルオロフォアとＢＨＱ１クエンチャーとの間の測定されたクエンチングの程度（実施例３）は、約１６％であり、これは、プローブ（配列番号５）のハイブリダイゼーション時のＦＡＭ蛍光の増強を均衡させるのに必要なクエンチングよりも大きい。
プライマー二量体様産物からの蛍光放出の正味のクエンチングが予想される。１つの増幅曲線のみがＣｑ値が０で非特異的産物の形成のない水平の増幅曲線を示し、３つの増幅曲線はＣｑ値３６、４０．２５及び４１．０７を示す（図１９）［図１９Ａ、融解曲線］ため、わずかな正味のクエンチングとも考えることができる。１つの融解曲線のみが良好な負のピークを示す一方で、残りの３つの融解曲線はいずれも正のピークを示さないが、これらの２つの融解曲線は、鋭い負のピークを伴わずに負の方向に漸進的に融解していることを示しており、水平状態とはわずかに異なる可能性がある。これは、増幅反応の後の方のサイクルでの非特異的産物の形成によるものであり得る。プローブ及びプライマー上のＦＡＭフルオロフォア及びクエンチャーＢＨＱ１の配置は、プライマー二量体からのシグナルがゼロになる最適な配置には満たないか、またはその境界域にある。本発明の標識の構成は、シグナルをゼロにするための最良のプライマー対ではないとしても、標的増幅に使用することができる。プライマー二量体様産物中のＦＡＭとＢＨＱ１との間の分離が１塩基または２塩基増加すると、シグナルがゼロまたはほぼゼロになる可能性がある。
プローブ（配列番号６）及びリバースプライマー配列番号４の場合、配列番号６の３’末端からのＦＡＭ標識塩基の分離と配列番号４の３’末端からのＢＨＱ１標識塩基の分離の合計は１８塩基であり、ＦＡＭ標識プローブの３’末端とＢＨＱ１標識リバースプライマーの３’末端との間に４塩基の重複が存在する可能性がある。結果として、フォワードプライマーのドナー・フルオロフォアＦＡＭ及びリバースプライマーのクエンチャーＢＨＱ１は、非特異的プライマー二量体様産物中で１４個の介在塩基で分離して近接すると予想される。実施例２で実証されたように、相補的配列へのＦＡＭ標識プローブ（配列番号６）のハイブリダイゼーション時に約１７％の増強が見られる。１７％の増強を均衡させるのに必要なクエンチングの程度は、約１５％である。１１塩基の分離でのＦＡＭフルオロフォアとＢＨＱ１クエンチャーとの間のクエンチングの程度（実施例３）は１６％であり、この場合、１４個の介在塩基の分離によりクエンチングが生じ、これは、プライマー二量体におけるＦＡＭ蛍光の増強を正確に均衡させるのに必要な１５％のクエンチングとほぼ等しくなる。配列番号６及び配列番号４を使用した増幅の増幅曲線（図１７）及び鋳型なし対照の増幅曲線（図１８）は、これを裏付けている。さらに、鋳型なし対照反応はＣｑ値０を示した。これは、増強とクエンチングがほぼ均衡しているかまたは非特異的産物の形成がないかのいずれかを示している。
プローブ（配列番号６）及びリバースプライマー（配列番号２）の場合、配列番号６の３’末端からのＦＡＭ標識塩基の分離と配列番号２の３’末端からのＢＨＱ１標識塩基の分離の合計は、７塩基である。プローブ（配列番号６）の３’末端とリバースプライマー（配列番号２）の３’末端との間の４塩基の重複の可能性を考慮すると、プローブのドナー・フルオロフォアＦＡＭ及びリバースプライマーのクエンチャーＢＨＱ１は、非特異的プライマー二量体様産物中で３個の介在塩基で分離して近接すると予想される。実施例２で測定され実証されたように、相補的配列へのハイブリダイゼーションでは、ＦＡＭ標識プローブ（配列番号６）のハイブリダイゼーション時に約１７％の増強が見られる。１７％の増強を均衡させるのに必要なクエンチングの程度は、１５％である。３塩基の分離でのＦＡＭフルオロフォアとＢＨＱ１クエンチャーとの間のクエンチングの程度（実施例３）は２６％を超えると予想され、これは、増強とクエンチングとを均衡させるのに必要な１５％のクエンチングよりも大きい。プライマー二量体様非特異的産物には正味のクエンチングがあり、これにより標的検出の感度が低減する。標的増幅曲線（図１９）及び鋳型なし対照増幅曲線（図２０）は、これを裏付けている。鋳型なし対照の増幅曲線が３５サイクル後に負の傾きを示すことに留意され得る。
標識プライマー及び標識プローブの新しいロットにより、より良好な結果が得られる。新しいロットは常により良好に動作する。それは、これらの標識オリゴヌクレオチドは安定化されない限りそれほど安定していないためであり、安定化は一部の企業によって適正な組成で行われている。本実施例のＦＡＭ標識プローブ中のＦＡＭは、プローブの３’末端またはその付近に配置されている。ＦＡＭ標識プローブ中のＦＡＭをプローブの３’末端から遠く離して配置すると、ＦＡＭの蛍光の増強がより高くなり、その結果標的検出の感度が高くなる。非特異的プライマー二量体産物の形成はランダム／確率論的現象であり、あるときには形成され、別のときには形成されない場合がある。さらに、非特異的産物の形成は、使用する標識プライマー及び標識プローブの品質ならびに阻害物質の存在に依存する。
ＦＡＭフルオロフォアがプローブ配列５の３’末端にあるか、またはプローブ配列６の３’末端から４塩基離れており、ＢＨＱ１クエンチャーがクエンチャー標識プライマー配列４の３’末端から１５塩基離れており、かつＢＨＱ１標識リバースプライマー配列２の３’末端から５塩基離れていることが観察され得る。したがって、３’末端またはその付近にフルオロフォアを配置した場合、プローブ配列６の標的配列へのハイブリダイゼーションの蛍光増強は約１７パーセントである。非特異的プライマー二量体様産物における１７パーセントの増強を均衡させるには、リバースプライマーのクエンチャーＢＨＱ１によるＦＡＭフルオロフォアの１５パーセントのクエンチングが必要となる。プローブ配列５の場合、増強ははるかに少なく、プライマー二量体様非特異的産物における配列５のＦＡＭフルオロフォアのクエンチングに必要とされるのは、ＢＨＱ１標識リバースプライマーのＢＨＱ１クエンチャーによる１５パーセントのクエンチングよりはるかに低いものである。非特異的プライマー二量体様産物におけるＦＡＭのクエンチングを少なくするには、フルオロフォアＦＡＭ及びＢＨＱ１クエンチャーが極めて遠く離れている必要がある。プローブ配列５及びリバースプライマー配列４を使用した非特異的産物におけるＦＡＭとＢＨＱ１間の１１塩基の分離により、正味のクエンチングが生じ、この非特異的産物ではＦＡＭの蛍光増強の均衡が取れていない。配列４のＢＨＱ１標識は、３’末端から１５塩基離れており、これは配列４の中央と５’末端との間である。同様に、プローブ配列６及びリバースプライマー配列４を使用した非特異的産物におけるＦＡＭとＢＨＱ１間の１４塩基の分離により、非特異的産物におけるＦＡＭの蛍光増強が概ね均衡してクエンチングされ、ここで、ＦＡＭは配列６の３’末端から４塩基離れており、ＢＨＱ１は３’末端から１５塩基離れており、これは配列４の中央と５’末端との間である。したがって、ドナー・フルオロフォアＦＡＭがＦＡＭ標識プローブの３’末端またはその付近に配置されている場合、クエンチャーＢＨＱ１を、ＢＨＱ１クエンチャー標識プライマーの３’末端から遠く離れた、ＢＨＱ１標識プライマーの中央と５’末端との間に配置する必要がある。さらに、プローブ配列番号６では、ＦＡＭフルオロフォアは３’末端から４塩基離れており、ＢＨＱ１クエンチャー標識プライマー配列番号２では、ＢＨＱ１は３’末端から５番目の塩基に配置されている。標識プローブと標識プライマーの両方において、標識は３’末端付近にある。非特異的シグナルはないが標的増幅シグナルの大幅な減少があり、よって感度が減少する。これは、ドナー・フルオロフォア及びクエンチャーを３’末端またはその付近に配置する際の問題である。
Figure 2024522947000003
実施例６： ＴａｑｍａｎアッセイとＬｉｂｒａアッセイとの間の特異性及び感度の比較
９０個の陽性模擬臨床試料及び８４個の陰性模擬臨床試料で感度及び特異性の比較を行った。ヒト鼻スワブ抽出物に大腸菌染色体ＤＮＡ（コピー数２×１０５、２×１０４、２×１０３、２×１０２、２×１０１、２×１００、１ｎｇ～１０ｆｇのＤＮＡ）をスパイクすることにより、模擬臨床試料を調製した。
鼻スワブを２０ｍＭ Ｔｒｉ－ＨＣｌ Ｐｈ－７．５に懸濁させ、それぞれ市販の染色体ＤＮＡ抽出キットからのものである、染色体ＤＮＡ抽出緩衝液２００μｌ及び無水エタノール２００μｌを鼻スワブ懸濁液２００μｌに加え、シリカＤＮＡ抽出カラムにロードし、６０パーセントのエタノール及び８０パーセントのエタノールを含有する洗浄緩衝液で洗浄して、最後にミリＱ水１００μｌでカラムを溶出することにより、鼻スワブ抽出物を調製した。溶離液は、実験に使用した鼻スワブ抽出物である。
大腸菌染色体ＤＮＡ調製物を水で１０倍に段階希釈した。実験にはＫａｐａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの２Ｘ Ｋａｐａマスターミックスを使用した。増幅反応を、Ｂｉｏ Ｒａｄサーマルサイクラーシリーズ１０００ ＣＦＸ ３８４ ＲＴ－ＰＣＲ機で、濃度０．２μＭの各標識プライマー及び標識プローブならびに濃度０．２μＭの非標識プライマー（但しＴａｑＭａｎアッセイ用の濃度０．４μＭの非標識プライマーは例外とする）を用いて１２．５μｌの反応体積で行った。
使用したプライマー及びプローブは、大腸菌トレオニン合成酵素遺伝子の１１３ｂｐ及び１１１ｂｐセグメントの増幅用は配列番号１、６及び４；配列番号１、６及び２；配列番号８及び１０であり、大腸菌ホモセリンキナーゼ遺伝子の１４５ｂｐセグメントの増幅用は配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５であった。
考察：配列番号１は、大腸菌トレオニン合成酵素遺伝子の１１３ｂｐセグメントを増幅するための非標識フォワードプライマーであり、配列番号２及び配列番号４はそのセグメントを増幅するためのＢＨＱ１標識リバースプライマーであり、配列番号６は、これら２つの増幅反応のためのＦＡＭ標識共通プローブである。配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５はそれぞれ、大腸菌ホモセリンキナーゼ遺伝子の１４５ｂｐセグメントを増幅するための、非標識フォワードプライマー及びリバースプライマー、ならびにＦＡＭ及びＢＨＱ１二重標識ＴａｑＭａｎプローブである。配列番号８は、大腸菌トレオニン合成酵素遺伝子の１１１ｂｐセグメントを増幅するためのＦＡＭ標識フォワードプライマーであり、配列番号１０は、そのセグメントを増幅するためのＢＨＱ１標識リバースプライマーである。
配列番号１、配列番号４及び配列番号６を使用した増幅反応では、ＴａｑＭａｎアッセイと比較して約５．５％高い感度及び３．６％高い特異性が示されたのに対し、配列番号８及び配列番号１０を使用した増幅反応では、ＴａｑＭａｎアッセイと比較して約１０．３％高い感度及び５．９％高い特異性が示された。
プローブ配列番号６のＦＡＭフルオロフォアの蛍光増強は、プライマー配列番号８のＦＡＭフルオロフォアの蛍光増強と比較して小さく、したがってこの差により、プローブ配列番号６及びリバースプライマー４を使用した増幅反応と比較して、配列番号８及び配列番号１０を使用した増幅反応の場合に感度がより高くなる。
さらに、配列番号８と配列番号１０とのプライマー対の場合には、ＦＡＭ標識プローブ配列番号６及びＢＨＱ１標識リバースプライマー配列番号４の場合と比較して、非特異的増幅産物におけるＢＨＱ１によるＦＡＭ蛍光のクエンチングが比較的多い。これが、配列番号８と配列番号１０とのプライマー対の増幅反応（３５サイクル後の鋳型なし対照の曲線の下降）の場合に、プローブ配列番号６及びリバースプライマー配列番号４の増幅反応（鋳型なし対照の直線増幅曲線）と比較して特異性が高くなる理由である。
プローブ配列番号６のＦＡＭ標識の蛍光増強は、配列番号６のＦＡＭ標識プローブ及びＢＨＱ１標識リバースプライマー２を含む増幅反応と、ＦＡＭ標識プローブ配列番号６及びＢＨＱ１標識リバースプライマー４を含む増幅反応とで同じであり、共通である。唯一の相違は、ＢＨＱ１が、リバースプライマー配列番号４（３’末端から１６塩基離れている）と比較して、リバースプライマー配列番号２の３’末端に極めて近接している（３’末端から５塩基離れている）ことである。前者の場合（配列番号２）では、後者の場合（配列番号４）と比較して非特異的増幅産物におけるＦＡＭとＢＨＱ１間の分離がはるかに少なく、よって非特異的増幅産物におけるクエンチャーＢＨＱ１によるＦＡＭフルオロフォアのクエンチングがはるかに増加する。これにより、プローブ配列６及びリバースプライマー配列番号４を含む増幅反応の特異性（特異性－９２．８％）と比較して、プローブ配列番号６及びリバースプライマー配列番号２を含む増幅反応の特異性が改善される（特異性－９６．６％）。非特異的増幅産物におけるＢＨＱ１によるＦＡＭ蛍光のこの過剰なクエンチングによって、非特異的増幅からの非実質的シグナルの生成に必要な均衡したクエンチングを超える正味のクエンチングが存在する。この反応中の非特異的増幅産物におけるこの過剰なクエンチングにより、この増幅反応の全体的な蛍光レベルが低減し、これにより標的増幅産物からのシグナルが低減し、よって感度が低減する。このため、標識プローブ配列番号６及び標識リバースプライマー配列番号２を含むこの反応では、標的検出感度が相当低減し（感度－６５．４％）、これは標識プローブ配列番号６及び標識リバースプライマー配列番号４を含む後者の場合の標的検出感度（感度－８１．３％）、ならびにＴａｑＭａｎアッセイを含む他の全ての反応（感度－７５．８％）よりも低い。
配列番号２及び６は、この標的増幅のためのＢＨＱ１標識リバースプライマーとＦＡＭ標識プローブの組み合わせとしては良好ではない。
実施例７： 標識された非標的プライマーを使用した細菌大腸菌のトレオニン合成酵素遺伝子の増幅
各々３フェムトモルの、５’末端に第１の非標的プライマー配列を保有し、３’末端に大腸菌トレオニン合成酵素遺伝子配列を保有する第１のオリゴヌクレオチド配列（配列番号１９）及び５’末端に大腸菌トレオニン合成酵素遺伝子配列を保有し、３’末端に第２の非標的プライマー配列を保有する第２のオリゴヌクレオチド配列（配列番号２０）であって、配列番号１９の３’末端がリン酸基を有し、第１及び第２のオリゴヌクレオチド上のトレオニン合成酵素遺伝子配列が２つの連続した配列であり、かつ１本の鎖にハイブリダイズするように設計されている第１及び第２のオリゴヌクレオチド配列を、リガーゼ酵素を含有するライゲーション緩衝液中の１ｎｇの大腸菌染色体ＤＮＡに加え、８℃で４時間インキュベートした。
このライゲーション混合物のアリコートを、３ｐモルのＢｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー１を標識した第１の非標的プライマー（配列番号２１）及び３ｐモルのＦＡＭ標識した第２の非標的プライマー（配列番号２２）を使用し、２Ｘ Ｋａｐａ ＰＣＲマスターミックスを使用して、標的ＤＮＡを含有しない対照反応とともに、１５μｌの反応体積で三連でＰＣＲ増幅に使用した。ＰＣＲ増幅には、６３℃で４５秒間のアニーリング及び１５秒間の伸長を使用した。大腸菌トレオニン合成酵素遺伝子配列はＣｑ値２０．４で良好に増幅され（図２３）、対照反応ではＣｑ値０が示された（図２４）。
実施例７の実例は、実施例４及び５の実例とは異なる。実施例４及び５は、標識したＬｉｂｒａプライマー対及び標識したＬｉｂｒａプライマー－プローブ対を使用した標的検出に関するものである。これら２つの実施例のｌｉｂｒａプライマー－プローブ対及びｌｉｂｒａプライマー対は、標的ごとに異なり、各標的に対して別々に設計及び標識されている。他方、実施例７の共通非標的プライマー対もｌｉｂｒａプライマー対であるが、任意の特定の標的のために特別に設計されたものではなく、同じプライマー対をより高い特異性及び感度で任意の標的の増幅に使用することができるように特別に設計されており、同時に、プライマー対は非特異的標的配列を一切増幅せず、共通非標的プライマー対はいかなる生体の配列とも相当多くの塩基の一致を有さない。プライマー対である配列番号２１及び２２は、２つのユニバーサルプライマーの対であるため、これは、２つの非標識の標的特異的増幅プライマー及びＤＮＡインターカレーティング色素のみが提供される、任意の標的に汎用的な標的検出方法であるＤＮＡ二本鎖インターカレーティング色素ベースの検出を代替するものである。この二本鎖ＤＮＡインターカレーティング色素ベースの検出方法は、特異性及び感度が不足しているため、より高い特異性及び感度が必要とされる診断用途などの用途には使用されない。実施例６の解決策は、より高い特異性及び感度を備えながらも、ＤＮＡインターカレーティング色素ベースの検出の有用性を達成することである。実際、実施例７の標識プライマー対は、ＤＮＡインターカレーティング色素の代用品である。この検出戦略は、新しく、簡素でより安価であり、ＤＮＡインターカレーティング色素ベースの増幅試薬などの既製の増幅試薬として使用するために設計されており、特に、ＤＮＡインターカレーティング色素ベースの増幅試薬と比較して優れた特異性及び感度のために設計されている。これは、ＤＮＡインターカレーティング色素ベースの検出の特異性及び感度が比較的低いという問題の解決策である。本実施例７のプライマーの設計要件は、ｌｉｂｒａプライマー対及びｌｉｂｒａプライマー－プローブ対の設計要件と同じである。すなわち、ドナー・フルオロフォアを保有する塩基とドナー・フルオロフォアで標識したプライマーの３’末端とを分離している塩基の数に、アクセプター・フルオロフォア／クエンチャーを保有する塩基とアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識したプライマーの３’末端とを分離している塩基の数を加算した合計が、６～３５塩基または６～４０塩基の範囲内である。さらに、これらのプライマーは、非標的配列からの非特異的増幅産物の形成を回避するために、いかなる生物のヌクレオチド配列またはいかなる配列とも相当多くの塩基の一致を有さないように設計されている。
実施例６の２つのプライマーは、異なる目的（ユニバーサル試薬）のための異なる戦略で使用されるｌｉｂｒａプライマーであり、よって、ｌｉｂｒａプライマー対及びｌｉｂｒａプライマー－プローブ対の特異性及び感度と同様の特異性及び感度をもたらす。標的増幅のＣｑ値２０．４及び標的なし対照反応のＣｑ値０は、感度及び特異性が高いことをそれぞれ示しており、ＴａｑｍａｎプローブアッセイのＣｑ値はそれぞれ２１．２及び０である。本実施例７のプライマー対は、最良のｌｉｂｒａプライマー対ではなく、さらにより良好な特異性及び感度を達成するために、より良好な標識プライマー対を設計することができる。
代替的戦略では、標的配列に対する２つのＰＣＲプライマーに、２つの標識された非標的プライマー配列（配列番号２１及び配列番号２２）に対応する配列を２つのＰＣＲプライマーの５’末端に別々に付加し、非標的配列が付加された通常のＰＣＲプライマー濃度の１００分の１の２つの標的増幅プライマーならびに通常の濃度の２つの標識された非標的プライマー（配列番号２１及び配列番号２２）を用いて標的配列の増幅を行う。
実施例８： ＦＲＥＴシグナルを生成するための標識プライマーを使用した細菌大腸菌のホモセリンキナーゼ遺伝子の増幅
増幅反応を、ＰＣＲマスターミックス中で、１ｎｇの大腸菌染色体ＤＮＡ調製物を用いてまたはＤＮＡなしで（対照として）、各々３ｐモルの非標識フォワードプライマー（配列番号２３、５’－ＧＡＴＡＡＧＣＴＧＣＣＧＴＣＡＧＡＡＣＣ－３’）、内部フルオレセイン標識リバースプライマー（配列番号２４、５’－ＡＡＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＡＡＧ－３’）及び内部フルオレセイン標識プローブ（配列番号２５、５’－ＣＣＡ ＧＴＧ ＧＣＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＡＡＴ ＡＴＧ－３’）を使用して、１５μｌの反応体積で三連で行い、大腸菌ホモセリンキナーゼ遺伝子の１４５塩基対セグメントを増幅した。フルオレセインを４６５ｎｍで励起させ、フルオレセインの放出を５１０ｎｍで測定することにより増幅反応をモニタリングした。標的増幅反応はＣｑ値２１．３（図２５）を示したのに対し、標的ＤＮＡを含有しない対照反応はＣｑ値０を示した（図２６）。
実施例８における標的検出の方法または戦略は、ｌｉｂｒａプライマー－プローブ対及びｌｉｂｒａプライマー対に基づく実施例４～７のものとは異なる。実施例４～７では、標的検出に非ＦＲＥＴシグナル生成を使用しており、ドナー・フルオロフォアが励起され、ドナー・フルオロフォアの放出がシグナルとして測定される。反対に、実施例８では、標的検出のためにＦＲＥＴシグナルが生成され、ドナー・フルオロフォアが励起され、アクセプター・フルオロフォアの放出がシグナルとして測定される。この戦略の利点は、蛍光バックグラウンドが低く、プライマー二量体と区別可能である標的増幅産物の融解曲線が生成されることであり、これはＴａｑｍａｎプローブベースの検出では不可能なさらなる特異性である。実施例８の戦略または方法の感度及び特異性は、Ｔａｑｍａｎプローブベースの標的検出方法の感度及び特異性と同程度またはそれよりわずかに良好であるが、ｌｉｂｒａプライマー－プローブ対及びｌｉｂｒａプライマー対を含む本発明の上記の３つの戦略（実施例４～６及び７）の感度及び特異性より低い。
ＦＲＥＴベースのシグナル生成方法では、ＦＲＥＴプライマー対及びＦＲＥＴプライマー－プローブ対は、アクセプター・フルオロフォアからのシグナルをより高くするために、ドナーとアクセプター間でエネルギー移動が最大（７０～８０パーセント）となるように設計されている。アクセプターからのより高いシグナルは、標的検出感度及び特異性に相当の差を生じさせず、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアで標識したプライマー対の標的増幅産物の融解曲線は、非特異的プライマー二量体の融解曲線と弁別不能であることが観察された。他方、実施例８の方法では、プライマー及びプローブは、標的増幅産物中でドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォア間のエネルギー移動が３０～５０パーセントのみとなるように標識されかつそのように構成されており、結果として、標識プライマー対または標識プライマープローブ対がさらに分離されることにより、非特異的プライマー二量体の融解曲線と区別可能である標的増幅産物の融解曲線が得られる。したがって、さらなる特異性が達成される。さらに、プライマーは、プライマー二量体またはプライマー二量体様非特異的増幅産物中で、ドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアとが３ヌクレオチド以下で分離されるように標識されており、その結果、プライマー二量体またはプライマー二量体様非特異的増幅産物からのシグナルがゼロまたはほぼゼロになる。
本実施例８では、非標識プライマー及びフルオレセイン標識プライマー及びフルオレセイン標識プローブ（一方のフルオレセインがドナーとして機能し、他方のフルオレセインがアクセプターとして機能する）が使用されるが、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア（ドナー・フルオロフォアとは異なる）を標識したプライマー対を、標的検出に同様に使用することができる。アクセプター・フルオロフォアは、ドナー・フルオロフォアとは異なることが好ましい。標識プライマー及び標識プローブは、ドナー・フルオロフォアとアクセプター・フルオロフォアとが標的増幅産物中で１５～２５塩基で分離されるように選択されかつ標識される。
配列番号１： 合成プライマー
配列番号２： １８番塩基にＢＨＱ１ ＤＹＥを有する合成プライマー
配列番号４： 合成プライマー－７番塩基にブラックホールクエンチャー１
配列番号５： 合成オリゴヌクレオチドプローブ－２４番塩基にフルオレセイン色素
配列番号６： 合成オリゴヌクレオチドプローブ－２１番塩基にフルオレセイン色素
配列番号７： 合成プライマー－３番塩基にフルオレセイン色素
配列番号８： 合成プライマー－１３番塩基にフルオレセイン色素
配列番号９： 合成プライマー－１０番塩基にフルオレセイン色素
配列番号１０： 合成プライマー－１６番塩基にブラックホールクエンチャー１
配列番号１１： 合成オリゴヌクレオチドプローブ－１番塩基にフルオレセイン色素
配列番号１２： 合成プライマー－１番塩基にフルオレセイン色素ｏｎＢａｓｅ１
配列番号１３： 合成プライマー
配列番号１４： 合成プライマー
配列番号１５： 合成オリゴヌクレオチドプローブ－１５番塩基（５’末端）にフルオレセイン色素および２１番塩基（３’末端）にブラックホールクエンチャー１
配列番号１６： 配列番号５（プローブ）と配列番号６（プローブ）と配列番号４（プライマー）とハイブリダイズし、フルオレセイン色素およびブラックホールクエンチャー１の間位に異なる分離を生成するための合成標的配列
配列番号１７：配列番号５（プローブ）と配列番号６（プローブ）と配列番号４（プライマー）とハイブリダイズし、フルオレセイン色素およびブラックホールクエンチャー１の間位に異なる分離を生成するための合成標的配列
配列番号１８： 配列番号７（プライマー）と配列番号８（プライマー）と配列番号９（プライマー）とハイブリダイズし、フルオレセイン色素の増強を測定するための合成標的配列
配列番号１９： ５’末端の非標的プライマー配列および３’末端の大腸菌スレオニンシンターゼ遺伝子配列
配列番号２０： ５’末端の大腸菌スレオニンシンターゼ遺伝子配列および３’末端の非標的プライマー配列
配列番号２１： 合成プライマー－２３番塩基にブラックホールクエンチャー１
配列番号２２： 合成プライマー－１５番塩基にフルオレセイン色素
配列番号２３： 合成プライマー
配列番号２４： 合成プライマー－１７番塩基にフルオレセイン色素
配列番号２５： 合成オリゴヌクレオチドプローブ－２７番塩基にフルオレセイン色素

Claims (59)

  1. 核酸増幅による核酸標的の検出及び／または定量化の方法であって、下記工程を含む方法。
    少なくとも１種の標的核酸と、核酸分子にハイブリダイゼーションする際または核酸分子に組み込まれる際に余分に発光するように適合された少なくとも１種の発光基／部分で標識された、少なくとも１種の非伸長性オリゴヌクレオチドまたは伸長可能なオリゴヌクレオチドとを提供すること、
    前記発光基／部分の色を異なる色に変換するかまたはそれを発熱（ｔｈｅｒｍａｌｉｓｅ）させるように適合された少なくとも１種のコンバーターまたはアクセプター基／部分で標識されており、増幅産物（複数可）に組み込まれる、少なくとも１種の伸長可能なオリゴヌクレオチドを提供すること、
    前記発光基で標識されたオリゴヌクレオチドの前記発光基／部分を標的核酸増幅産物にハイブリダイズさせるかまたは組み込み、前記発光基／部分を余分に発光させ、前記余分な発光が前記法的増幅の基準とすること、
    を含み、前記核酸増幅を、減衰の制御下において任意の非特異的な増幅が任意の検出可能なシグナルを生じないように実施するが、このとき、コンバーターまたはアクセプター基／部分による、非特異的な増幅産物内の発光基による余分な発光のみの除去を選択的に制御して、特定のシグナリング部分及びアテニュエーター／コンバーター部分対のために、シグナリングオリゴヌクレオチド上のシグナリング部分を選択的に配置し、且つアテニュエーターもしくはアクセプターオリゴヌクレオチド上のアテニュエーターもしくはアクセプター部分を選択的に配置して、非特異的増幅産物中の正味のシグナル増強及び正味のシグナルを無くし、正味のシグナルの減衰が無く、標的増幅シグナルの喪失がない状態とする、方法。
  2. 非特異的増幅産物におけるシグナルの減衰の程度を非特異的増幅産物中の前記シグナリング部分のシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しくするような制御を提供して、非特異的増幅産物中の正味のシグナル増強及び正味のシグナルを無くし、正味のシグナルの減衰が無く、標的増幅シグナルの喪失がない状態とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端から前記シグナリング部分で標識された塩基までの距離に対して、レシーバーまたはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端から前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識された塩基までの距離を加算し、さらに前記シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端と前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端との間の起こり得る重複の距離を減算した距離が、前記非特異的増幅産物におけるシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しいシグナルの減衰をもたらす、非特異的増幅産物中の前記シグナリング部分で標識された塩基と前記アテニュエーター部分または前記アクセプター部分で標識された塩基との間の分離距離を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端から前記シグナリング部分で標識された塩基を分離する塩基の数に対して、前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端から前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識された塩基を分離する塩基の数を加算し、前記シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端と前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端との間で重複し得る塩基の数を減算した塩基数は、非特異的な増幅産物において前記シグナリング部分と前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分とを分離する塩基の数を含み、これによって、非特異的増幅産物におけるシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しくするようにシグナルが減衰される、請求項２に記載の方法。
  5. シグナル増強及び対応する減衰の程度の選択的制御が、以下を含む、請求項１に記載の方法。
    （ｉ）シグナル増強が約１～１００％のとき、非特異的増幅産物からのシグナルの均衡した非実質的なシグナルの対応する減衰を約１～５０％に維持し、
    （ｉｉ）シグナル増強が約２０～８０％のとき、非特異的増幅産物からの均衡した非実質的なシグナルのために、シグナルの対応する減衰を約１７～４５％に維持し、
    （ｉｉｉ）シグナル増強が約３０～７０％のとき、非特異的増幅産物からの均衡した非実質的なシグナルのために、シグナルの対応する減衰を約２３～４０％に維持する。
  6. 使用する前記シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドが、前記標的増幅産物または前記標的の一方の鎖にハイブリダイズされる、核酸増幅をモニタリングするためのプローブであり、
    使用する前記アテニュエーター部分または前記アクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドが、前記標的増幅産物もしくは標的において前記プローブがハイブリダイズするのと同じ鎖または他方の鎖にアニーリングされ、使用する増幅プライマーの両鎖がアテニュエーターもしくはアクセプター部分で選択的に標識される、請求項１に記載の方法。
  7. シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドにおいて、その３’末端の塩基、または前記３’末端から最大３０塩基離れた位置の、但し５’末端を除く、任意の塩基に前記シグナリング部分が配置され、アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドにおいて、その３’末端から少なくとも２塩基で最大３０塩基離れた位置の任意の塩基にアテニュエーターもしくはアクセプター部分が配置される、請求項６に記載の方法。
  8. 使用される前記シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチド及び前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチド（複数）が、前記標的増幅産物または前記標的核酸の２本の鎖に別々にアニーリングし、ポリメラーゼ（単数または複数）によって伸長される、２つの核酸増幅プライマーである、請求項１に記載の方法。
  9. 前記シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドにおいて、３’末端から少なくとも２ヌクレオチドで最大３０塩基離れた位置の、但し５’末端を除く、任意の塩基に前記シグナリング部分が配置されており、アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドにおいて、３’末端から少なくとも２ヌクレオチドで最大３０塩基離れた位置の任意の塩基にアテニュエーターもしくはアクセプター部分が配置されている、請求項８に記載の方法。
  10. 使用する前記シグナリング部分がドナー・フルオロフォアであり、使用する前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分がアクセプター・フルオロフォアであるか、あるいはエネルギーを受容するがエネルギーまたは電磁放射線を一切放出しない非放射性アクセプターもしくはクエンチャー部分であり、シグナルが蛍光シグナルであり、シグナル減衰が前記ドナー・フルオロフォアの蛍光シグナルのクエンチングであり、前記ドナー・フルオロフォアと前記アクセプター部分がエネルギー移動対である、請求項１に記載の方法。
  11. 非特異的増幅産物における、前記シグナリング部分標識塩基と、前記アテニュエーターもしくはアクセプター標識塩基との間の分離距離を、非特異的増幅産物におけるシグナルの減衰の程度を非特異的増幅産物中の前記シグナリング部分のシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しくするように選択し、前記距離はそれぞれ２Ｒ０距離とＲ０距離との間であり、塩基間距離は３．７オングストロームであり、前記Ｒ０は、前記シグナリング部分と前記アクセプター部分との対、より具体的には前記ドナー・フルオロフォアと前記アクセプター・フルオロフォアまたは非放射性アクセプター／クエンチャー部分との対のフェルスター半径（フェルスター半径Ｒ０の値は２２Å～７５Åの範囲内）である、請求項５に記載の方法。
  12. 非特異的増幅産物における、前記シグナリング部分標識塩基と、前記アテニュエーターもしくはアクセプター標識塩基との間の分離距離を、非特異的増幅産物におけるシグナルの減衰の程度を非特異的増幅産物中の前記シグナリング部分のシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しくするように選択し、前記距離はそれぞれ１．３０２５Ｒ０距離と１．０３４Ｒ０距離との間であり、塩基間距離は３．７オングストロームであり、前記Ｒ０は、前記シグナリング部分と前記アクセプター部分との対、より具体的には前記ドナー・フルオロフォアと前記アクセプター・フルオロフォアまたは非放射性アクセプター／クエンチャー部分との対のフェルスター半径（フェルスター半径Ｒ０の値は２２Å～７５Åの範囲内）である、請求項５に記載の方法。
  13. 非特異的増幅産物における、前記シグナリング部分標識塩基と、前記アテニュエーターもしくはアクセプター標識塩基との間の分離距離を、非特異的増幅産物におけるシグナルの減衰の程度を非特異的増幅産物中の前記シグナリング部分のシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しくするように選択し、前記距離はそれぞれ１．２２４Ｒ０距離と１．０６９９Ｒ０距離との間であり、塩基間距離は３．７オングストロームであり、前記Ｒ０は、前記シグナリング部分と前記アクセプター部分との対、より具体的には前記ドナー・フルオロフォアと前記アクセプター・フルオロフォアまたは非放射性アクセプター／クエンチャー部分との対のフェルスター半径（フェルスター半径Ｒ０の値は２２Å～７５Åの範囲内）である、請求項５に記載の方法。
  14. 非特異的増幅産物における、前記シグナリング部分標識塩基と、前記アテニュエーターもしくはアクセプター標識塩基とを分離する塩基数を、非特異的増幅産物におけるシグナルの減衰の程度を非特異的増幅産物中の前記シグナリング部分のシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しくするように選択し、前記塩基数が、２．０（Ｒ０）と（Ｒ０）との間の距離に等しい（２Ｒ０／３．７）から（Ｒ０／３．７）塩基であり、塩基間距離は３．７オングストロームであり、前記Ｒ０は、ドナー・フロオロフォアとアクセプター部分とのエネルギー移動対のフェルスター半径をオングストロームで表したものであり、前記ドナー・フロオロフォアとアクセプター部分とのエネルギー移動対の全体に対しては６～４０塩基に等しい（フェルスター半径Ｒ０の値は２２Å～７５Åの範囲内）、請求項１１に記載の方法。
  15. 非特異的増幅産物における、前記シグナリング部分標識塩基と、前記アテニュエーターもしくはアクセプター標識塩基とを分離する塩基数を、非特異的増幅産物におけるシグナルの減衰の程度を非特異的増幅産物中の前記シグナリング部分のシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しくするように選択し、前記塩基数が、１．３０２５（Ｒ０）と１．０３４（Ｒ０）との間の距離に等しい（１．３０２５Ｒ０／３．７）から（１．０３４Ｒ０／３．７）塩基であり、塩基間距離は３．７オングストロームであり、前記Ｒ０は、ドナー・フロオロフォアとアクセプター部分とのエネルギー移動対のフェルスター半径をオングストロームで表したものであり、前記ドナー・フロオロフォアとアクセプター部分とのエネルギー移動対の全体に対しては６．１～２６．４塩基に等しい（フェルスター半径Ｒ０の値は２２Å～７５Åの範囲内）、請求項１２に記載の方法。
  16. 非特異的増幅産物における、前記シグナリング部分標識塩基と、前記アテニュエーターもしくはアクセプター標識塩基とを分離する塩基数を、非特異的増幅産物におけるシグナルの減衰の程度を非特異的増幅産物中の前記シグナリング部分のシグナルの増強の程度と等しいかまたは概ね等しくするように選択し、前記塩基数が、１．２２４（Ｒ０）と１．０６９９（Ｒ０）との間の距離に等しい（１．２２４Ｒ０／３．７）から（１．０６９９Ｒ０／３．７）塩基であり、塩基間距離は３．７オングストロームであり、前記Ｒ０は、ドナー・フロオロフォアとアクセプター部分とのエネルギー移動対のフェルスター半径をオングストロームで表したものであり、前記ドナー・フロオロフォアとアクセプター部分とのエネルギー移動対の全体に対しては６．４～２４．８塩基に等しい（フェルスター半径Ｒ０の値は２２Å～７５Åの範囲内）、請求項１３に記載の方法。
  17. 使用する前記シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチド及び前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドが直鎖状である、請求項１に記載の方法。
  18. 追加の標識部分であるビオチン等も、標識プローブの３’末端及び５’末端に配置されている、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記シグナリング部分またはドナー・フルオロフォアで標識された、請求項６に記載のプローブ、またはシグナリング部分またはドナー・フルオロフォア部分で標識された、請求項８に記載のプライマーが、その５’末端にアクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャー、またはステム構造を形成する前記フルオロフォアで標識された塩基の近傍にある前記標識されたプライマーまたはプローブの配列に十分に相補的な５～８塩基の配列をさらに備えて、前記伸長可能なオリゴヌクレオチドがクエンチャーを備えているかまたは備えておらず、前記ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブと前記５～８塩基の配列との間に介在スペーサーを備えているかまたは備えていない、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記シグナリング部分もしくはドナー・フルオロフォア部分で標識された塩基と、前記ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの３’末端とを分離している塩基の数に対して、前記アクセプターもしくはクエンチャー部分で標識された塩基と、前記アクセプターもしくはクエンチャー部分で標識されたプライマーの３’末端とを分離している塩基の数を加算した値が、前記ドナー・フロオロフォアとアクセプターもしくはクエンチャー部分とのエネルギー移動対の全体に対して６～４０塩基である、請求項６または８に記載の方法。
  21. 前記シグナリング部分もしくはフルオロフォア部分で標識された塩基と、前記ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの３’末端とを分離している塩基の数に対して、前記アクセプターもしくはクエンチャー部分で標識された塩基と、前記アクセプターもしくはクエンチャー部分で標識されたプライマーの３’末端とを分離している塩基の数を加算した値が、前記ドナー・フロオロフォアとアクセプターもしくはクエンチャー部分とのエネルギー移動対の全体に対して１０～３０塩基である、請求項６または８に記載の方法。
  22. ２つ以上のシグナリング部分またはドナー・フルオロフォアが、前記シグナリング部分で標識されたプローブまたはプライマー上に配置され、２つ以上のアクセプター部分またはクエンチャーが、前記アクセプター部分で標識されたプライマー（単数または複数）上に配置される、請求項６または８に記載の方法。
  23. ネステッド核酸増幅において、第１のプライマー対が標的核酸の第1のセグメントを増幅し、第２のプライマー対が前記第１のセグメントの第２のセグメントを増幅し、前記第２のプライマー対が前記シグナリングもしくはドナー・フルオロフォア部分で標識され、前記第２のプライマー対から選択される２つの核酸増幅プライマーを含む、アクセプターもしくはクエンチャー部分で標識されたｌｉｂｒａプライマー対がアクセプターもしくはクエンチャー部分で標識されている、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記第１のプライマー対の複数のプライマーが、アクセプターもしくはクエンチャー部分である適切な標識をさらに備える、請求項２３に記載の方法。
  25. 第１のプライマーと第２のプライマーが共に標的核酸の第１のセグメントを増幅し、第３のプライマーが前記第１のプライマーと共同で前記第１のセグメントの第２のセグメントをセミネステッド核酸増幅で増幅し、前記第１及び第３のプライマーが、シグナリングもしくはフルオロフォア部分で標識され、且つアクセプターもしくはクエンチャー部分で標識されたｌｉｂｒａプライマー対であり、前記第２のプライマーもアクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャーでさらに標識されている、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 第１のプライマー対が標的核酸の第１のセグメントを増幅し、第２のプライマー対が前記第１のセグメントの第２のセグメントをネステッド核酸増幅で増幅し、前記第２のセグメントにプローブがハイブリダイズするときにプローブを使用し、前記プローブと前記第２のプライマー対が、シグナリングもしくはフルオロフォア部分で標識されたプローブとアクセプターもしくはクエンチャーで標識されたプライマー（複数可）であり、前記第１のプライマー対もアクセプターもしくはクエンチャーでさらに標識されている、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 第１のプライマーと第２のプライマーが共に標的核酸の第１のセグメントを増幅し、第３のプライマーと第１のプライマーが前記第１のセグメントの第２のセグメントをセミネステッド核酸増幅で増幅し、前記第２のセグメントにハイブリダイズするプローブを使用し、前記プローブと前記第１及び／または第３のプライマーが、シグナリングもしくはフルオロフォア部分で標識されたプローブとアクセプターもしくはクエンチャーで標識されたプライマー（複数可）である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 第１の非標的配列または第１の非標的配列と第２の非標的配列を前記標的核酸配列の一方または両方の末端に付加することにより半合成標的核酸配列を生成し、前記標的核酸の増幅を、１つの標的特異的プライマー及び前記第１の非標的配列に特異的なプライマー、または前記第１の非標的配列に特異的なプライマー及び前記第２の非標的配列に特異的なプライマーのいずれかによって実施し、前記増幅プライマー（複数）がシグナリングもしくはドナー・フルオロフォア部分及びアクセプターもしくはクエンチャー部分で標識されたプライマーである配列番号２１： ａｇａｔｇｔｃｃｇｔ ｇｃｔａｃｃａｇａｇ ａｃｔｃｔｃｇ及び配列番号２２： ｔｇｇｇｃａｇｇｔｃ ｇｔｔａｔａｃｃｇｇ ｔｇａｃｔ であり、加えて、第１及び第２の非標的配列がテールＰＣＲにより標的比列に付加され、前記第１及び第２の非標的配列が２つのＰＣＲプリマ－の５’末端に付加されている、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 追加でプローブを提供し、前記プローブ及びプライマーは本発明の標識プライマー（複数可）及びプローブであり、シグナリング部分もしくはドナー・フルオロフォアで標識された、請求項６に記載のプローブである、請求項２８に記載の方法。
  30. 選択的に配列番号２２を含む、前記シグナリング部分もしくはドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブが、さらにその５’末端にクエンチャー／アクセプター・フルオロフォアを備えるか、またはヘアピン構造を形成するドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの前記ドナー・フルオロフォアで標識された塩基の近傍にある塩基にハイブリダイズする５～８塩基の配列を備え、５’末端にクエンチャーを有するか有しておらず、リンカーを介すか解せず連結されている、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記シグナリングもしくはドナー・フルオロフォア部分で標識されたプライマーが前記標的増幅産物へ組み込まれるときの、または前記シグナリングもしくはドナー・フルオロフォア部分で標識されたプローブが前記標的増幅産物へハイブリダイズするときの、前記ドナー・フルオロフォアのシグナル増強または蛍光増強の程度が４～８倍であり、且つ非特異的増幅産物からの非実質的シグナルにおけるシグナル減衰または蛍光クエンチングの程度が７５～８７％であり、前記シグナリングもしくはフルオロフォア部分と、前記アクセプターもしくはクエンチャー部分との分離は０．８３２７Ｒ０～０．７２８４Ｒ０であり、０．８３２７（Ｒ０／３．７）塩基～０．７２８４（Ｒ０／３．７）塩基に等しく、塩基間距離は３．７オングストロームであり、前記Ｒ０は、フロオロフォアとアクセプター部分とのエネルギー移動対のフェルスター半径をオングストローム単位で表したものであり、前記フロオロフォア部分とアクセプター部分とのエネルギー移動対の全体に対しては約４～１６塩基に等しい（フェルスター半径Ｒ０の値は２２Å～７５Åの範囲内）、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記シグナリング部分もしくはフルオロフォアで標識された塩基と、フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの３’末端とを分離する塩基数に対して、前記アクセプターもしくはクエンチャー部分で標識された塩基と、前記アクセプターもしくはクエンチャー部分で標識されたプライマーの３’末端とを分離する塩基数を加算した値が、４～１６塩基である、請求項３１に記載の方法。
  33. 第１のシグナリングもしくは第１のフルオロフォア部分で標識された第１のプライマー、アクセプターもしくはクエンチャー部分で標識された第２のプライマーと第２のシグナリングもしくは第２のフルオロフォア部分で標識されたプローブを核酸増幅に使用し、前記第１のシグナリングもしくは第１のフルオロフォア部分が標的増幅の際に第１のシグナルを発生し、前記プローブの第２のシグナリングもしくは第２のフルオロフォア部分が、前記プローブの標的増幅産物へのハイブリダイゼイションのときに第２の蛍光シグナルを発生し、前記第１のシグナリングもしくは第１のフルオロフォア部分で標識された第１のプライマーと、前記アクセプターもしくはクエンチャー部分で標識された第２のプライマーとが、シグナリングもしくはフルオロフォア部分およびアクセプターもしくはクエンチャー部分で標識された本発明のプライマー対であり、前記第１のシグナリングもしくは第１のフルオロフォア部分で標識された第１のプライマーと、前記アクセプターもしくはクエンチャー部分で標識された第２のプライマーと、前記第２のシグナリングもしくは第２のフルオロフォア部分で標識されたプローブとが、本発明の標識されたプライマー（複数）とプローブであり、前記第１のシグナリングもしくは第１のフルオロフォア部分が、前記第２のシグナリングもしくは第２のフルオロフォア部分のアクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャーであるか、その反対である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. ドナー・フルオロフォア標識プライマー及びアクセプター・フルオロフォア標識プライマーを標的核酸配列の増幅に使用し、前記ドナー・フルオロフォア及び前記アクセプター・フルオロフォアは前記プライマーの３’末端から少なくとも２ヌクレオチド離れた位置に配置され、前記標的増幅産物内で、前記ドナー・フルオロフォアと前記アクセプター・フルオロフォアが５～３０塩基離されていることによって、標的増幅のときに、ＦＲＥＴシグナル、より具体的には、ドナー・フルオロフォアの励起によるアクセプター・フルオロフォアからの放出、が発生する、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. ２つの増幅プライマーの内の１つがアクセプター・フルオロフォアで標識されており、前記標的配列にハイブリダイズする、ドナー・フルオロフォアで標識したプローブを代わりに標的核酸増幅に使用し、前記アクセプター・フルオロフォアが標識プライマーの３’末端から少なくとも２ヌクレオチド離れた位置に配置され、前記ドナー・フルオロフォアで標識したプローブにおいて、３’末端の塩基、または前記３’末端から離れた位置の、但し５’末端を除く、塩基がドナー・フルオロフォアで標識されており、前記プローブが前記標的増幅産物にハイブリダイズするときに前記ドナー・フルオロフォアと前記アクセプター・フルオロフォアが５～３０塩基離されていることによって、標的増幅のときに、ＦＲＥＴシグナル、より具体的には、ドナー・フルオロフォアの励起によるアクセプター・フルオロフォアからの放出、が発生する、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記プローブがアクセプター・フルオロフォアで標識された状態であり、前記プライマーは代わりにドナー・フルオロフォアで標識された状態である、請求項３５に記載の方法。
  37. 標的増幅産物において、前記ドナー・フルオロフォアと前記アクセプター・フルオロフォアが１０～２０塩基で分離されている、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 標的増幅産物において、前記ドナー・フルオロフォアと前記アクセプター・フルオロフォアが１４～２０塩基で分離されている、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの前記ドナー・フルオロフォアで標識された塩基と３’末端とを分離している距離もしくは塩基の数に対して、前記アクセプター・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの前記アクセプター・フルオロフォアで標識された塩基と３’末端とを分離している距離もしくは塩基の数を加算し、前記ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブと前記アクセプター・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブのそれぞれの３’末端の間で重複している距離もしくは重複している塩基の数を減算した値が、
    非特異的増幅産物からの非実質的シグナルに対する前記ドナー・フルオロフォアと前記アクセプター・フルオロフォアとの間の静的クエンチングの距離もしくは対応する塩基分離と等しい、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記静的クエンチングの距離が、±３、または±２、または±１、または０、または標識塩基は互いの反対に配置されている、請求項３９に記載の方法。
  41. ３’末端に標的特異的配列を保有する第１のオリゴヌクレオチドプライマー、またはポリチミジン配列、または１以上の非チミジン塩基を有し且つその５’末端にプロモータ配列を有するポリチミジン配列を使用して、あるいはアダプターを標的配列に結合するための数塩基の突出部を５’末端に有する２本鎖アダプターと、アダプターの５’末端のプロモーター配列、またはアダプターを標的配列に結合するための数塩基の突出部を３’末端に有する２本鎖アダプターと、アダプターの５’末端のプロモーター配列を使用して、あるいは標的配列の伸長鎖とプロモーター配列を５’末端に有する第１のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プロモーター配列を標的核酸配列、単鎖もしくは２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡに結合され、
    標的配列の直鎖状増幅を、第２の標的特異的プライマー、及び第１の標的特異的プライマーを保有する前記プロモーター配列を用い、ＤＮＡポリメラーゼもしくは逆転写酵素とデオキシヌクレオシド三リン酸をＲＮＡポリメラーゼとリボヌクレオシド三リン酸を用いるＲＮＡ転写と組み合わせて用いたシーケンシャルポリメラーゼ伸長反応で実施し、
    プライマーと第２標的特異的プライマーを保有する前記第１のプロモーター配列は、本発明の請求項８～１０及び１７のドナー・フルオロフォア及びクエンチャー／アクセプター・フルオロフォア標識プライマー対であり、使用するシグナリング部分標識オリゴヌクレオチド及びアテニュエーターもしくはアクセプター部分標識オリゴヌクレオチドが、標的増幅産物または標的核酸の２つの鎖に別個にアニーリングし、ポリメラーゼ（単数または複数）によって伸長される２つの核酸増幅プライマー（請求項８）であり、シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドにおいて、その３’末端から少なくとも２塩基で最大３０塩基離れた位置の、但し５’末端を除く、任意の塩基にシグナリング部分が配置されており、アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドにおいて、その３’末端から少なくとも２塩基で最大３０塩基離れた位置の任意の塩基にアテニュエーターもしくはアクセプター部分が配置されており（請求項９）、使用される前記シグナリング部分がドナー・フルオロフォアであり、使用される前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分がアクセプター・フルオロフォアであるかまたはエネルギーを受容するがエネルギーもしくは電磁放射線を一切放出しない非放射性アクセプターもしくはクエンチャー部分であり（請求項１０）、シグナルが蛍光シグナルであり、シグナル減衰が前記ドナー・フルオロフォアの蛍光シグナルのクエンチングであり、前記ドナー・フルオロフォア及び前記アクセプター部分がエネルギー移動対であり、使用する前記シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチド及び前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドが直鎖状である（請求項１７）、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
  42. 第1のプライマー及び第２のプライマーを保有するプロモーター配列の一方または両方をクエンチャーもしくはアクセプター・フルオロフォアで標識し、ドナー・フルオロフォアで標識した標的特異的プローブを使用し、標識されたプローブ及びプライマー（複数可）が、請求項６のシグナリング部分またはドナー・フルオロフォアで標識したプローブを有するドナー・フルオロフォアで標識したプローブ及びアクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャーで標識した本発明のプライマー（複数可）であり、
    シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドにおいて、その３’末端から少なくとも２ヌクレオチドで最大３０塩基離れた位置の、但し５’末端を除く、任意の塩基のいずれかに前記シグナリング部分が配置され、アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドにおいて、その３’末端から少なくとも２塩基で最大３０塩基離れた位置の任意の塩基のいずれかに前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分が配置され（請求項７）、使用される前記シグナリング部分がドナー・フルオロフォアであり、使用される前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分がアクセプター・フルオロフォアであるかまたはエネルギーを受容するがエネルギーもしくは電磁放射線を一切放出しない非放射性アクセプターもしくはクエンチャー部分であり（請求項１０）、シグナルが蛍光シグナルであり、シグナル減衰が前記ドナー・フルオロフォアの蛍光シグナルのクエンチングであり、前記ドナー・フルオロフォア及び前記アクセプター部分がエネルギー移動対であり、使用する前記シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチド及び前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドが直鎖状である（請求項１７）、請求項４１に開催の方法。
  43. 前記ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの５’末端にクエンチャーが皿に結合されている、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含み、前記ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、アレルまたはアレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応（アレルＰＣＲ）、アレルＲＴ－ＰＣＲ、Ｔａｉｌ ＰＣＲ、ドロップレットＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、セミネステッドＰＣＲ、メチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ）ＰＣＲ、またはｉｎ－ｓｉｔｕ ＰＣＲであり、前記標的増幅産物のサイズが、３５～４００塩基対、好ましくは５０～１５０塩基対である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 核酸増幅反応が、ループ媒介等温核酸増幅反応（ＬＡＭＰ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応（ＲＰＡ）、ヘリカーゼポリメラーゼ増幅反応（ＨＰＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などの等温核酸増幅反応を含み、前記ＬＡＭＰで使用されるループプライマーがＤＮＡ鎖分離を促進し、リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、ジャイレース、トポイソメラーゼなどの鎖分離酵素が、一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質と共同での変性または鎖分離のためにＲＰＡ及びＨＰＡで使用され、前記標的増幅産物のサイズが、７５～１０００塩基対、好ましくは１００～２５０塩基対であり、前記等温核酸増幅反応の変法がアレルプライマーまたはプライマー－プローブ対、ネステッドまたはセミネステッドプライマー対、ネステッドまたはセミネステッドプライマー－プローブ対を含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 標的核酸の絶対的定量を表記されたプライマー－プローブ対で実施し、前記シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドが、前記標的増幅産物または前記標的の一方の鎖にハイブリダイズされる、核酸増幅をモニタリングするためのプローブであり、使用する前記アテニュエーター部分または前記アクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドが、（請求項６の）核酸増幅プライマーの１つであり、
    シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチドにおいて、その３’末端から少なくとも２ヌクレオチドで最大３０塩基離れた位置の、但し５’末端を除く、任意の塩基のいずれかに前記シグナリング部分が配置され、アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドにおいて、その３’末端から少なくとも２塩基で最大３０塩基離れた位置の任意の塩基のいずれかに前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分が配置され（請求項７）、
    使用される前記シグナリング部分がドナー・フルオロフォアであり、使用される前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分がアクセプター・フルオロフォアであるかまたはエネルギーを受容するがエネルギーもしくは電磁放射線を一切放出しない非放射性アクセプターもしくはクエンチャー部分であり、シグナルが蛍光シグナルであり、シグナル減衰が前記ドナー・フルオロフォアの蛍光シグナルのクエンチングであり、前記ドナー・フルオロフォアと前記アクセプター部分がエネルギー移動対であり（請求項１０）、標識プライマー対は配列番号２１及び２２を選択的に含み、そのためのキット（複数可）は、単数または複数の容器内に少なくとも1種の前記ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブ及びアクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャーで標識したオリゴヌクレオチドプライマー（複数可）を含む、あるいは少なくともドナー・フルオロフォアで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー及びアクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャーで標識したオリゴヌクレオチドプライマーを含み、前記シグナリング部分で標識されたオリゴヌクレオチド及び前記アテニュエーターもしくはアクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドが、前記標的増幅産物または前記標的核酸の２本の鎖に別々にアニーリングし、ポリメラーゼ（単数または複数）によって伸長される、２つの核酸増幅プライマーであり、前記キット（複数可）は、反応緩衝液、複数のデオキシヌクレオシド三リン酸、ポリメラーゼ酵素または酵素、陽性対照鋳型及び陽性鋳型のそれぞれの標識されたプライマー対、および追加成分をさらに含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記オリゴヌクレオチドが、選択的に１０）は～５０塩基長、好ましくは１５～３５塩基長、より好ましくは２０～３０塩基長であり、標的配列に十分に相補的であり、前記標的上でハイブリダイズまたはアニーリングする能力及び前記標的上で核酸合成をプライミングする能力を有しており、且つ１種以上の修飾塩基、または修飾糖部分（単数または複数）または１種以上の塩基アナログを保有している、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 陽性対照鋳型及び陽性対照鋳型に特異的な請求項６～１７、２８、２９、３４、３５、４６に記載の標識されたプライマー対または標識されたプライマーとプローブとの対が、前記増幅反応中にさらに提供される、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 請求項６～１７、２８、２９、３４、３５、４６に記載の、本発明のドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーとアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーとの複数の対またはドナー・フルオロフォアで標識されたプローブとアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーとの複数の対が、複数の標的配列の同時検出及び／または定量化のための多重化反応に使用される、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. ドナー・フルオロフォアで標識されたプライマーまたはドナー・フルオロフォアで標識されたプローブの単数、複数種、または大きなアレイが、多炭素原子（ｍｕｌｔｉ－ｃａｒｂｏｎ ａｔｏｍ）有機リンカー、ポリエチレングリコール、ハイブリッドリンカーまたはポリチミジンオリゴヌクレオチドを介し、十分な長さの追加の有機リンカーを有りまたは無しで、ガラスもしくはガラスウエハ、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのプラスチック、デキストラン、セルロース、ナイロンなどの透明または半透明の固体表面に付着されるかまたは共有結合されるかまたは係留され、単一の増幅反応における単一、複数または多数の核酸標的の検出にマイクロ流体チャネルを使用する、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記核酸増幅反応が、任意の公知の核酸増幅反応、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応を含み、有効量の増幅プライマーまたは有効量の標識されたプライマーと標識されたプローブまたは標識されたプライマーに加えて、少なくとも１種のポリメラーゼ酵素、反応緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸を試料に添加する工程と、少なくとも変性工程、アニーリング工程、伸長工程もしくはアニーリングと伸長とを組み合わせた単一の工程の間、または等温反応工程において試料をサイクルにかける工程と、ドナー・フルオロフォア励起光または放射線で反応混合物を励起させる工程と、ドナー・フルオロフォアまたはアクセプター・フルオロフォアの放出を測定する工程とを少なくとも含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記ドナー・フルオロフォア、アクセプター・フルオロフォア及びクエンチャーが、二本鎖ＤＮＡへのインターカレーション時に蛍光を増強させる、インターカレーティング色素臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ１（商標）、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（商標）、ＹＯＰＲＯ １（商標）、ＳＹＴＯ ９（商標）、アクリジンオレンジ、非対称シアニン色素を含むがこれらに限定されない二本鎖ＤＮＡインターカレーティング色素、及び色素フルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、６－ＦＡＭ（アジド）、２’７’－ジメトキシ－４’５－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、５－（４，６－ジクロロトリアジン－２イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＶＩＣ（ビクトリアブルー）、ＶＩＣとほぼ同一のスペクトルプロファイルを有するＭＡＸ ＶＩＣ、Ａ ＶＩＣ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の同等物であるＳＵＮ（商標）、ＴＹＥ（商標）５６３、ＴＹＥ ６６５、ＴＹＥ ７０５、ＮＥＤ、フルオレスカミン、ピレン、ピレンブチレート、スクシミジル（ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ）１ピレンブチレート、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミン１２３、ローダミンＢ、スルホローダミン、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、６－カルボキシ－Ｘローダミン（ＲＯＸ）、スルホローダミンｂ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－Ｘ、ＳＩＭＡ ｄｙｅ（商標）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－Ｘ、ＴＥＸ６１５ Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ＴＡＭＲＡ（商標）（アジド）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）－Ｘ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ（商標）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、テルビウムキレート、ユーロピウムキレート、量子ドット、グラフェン量子ドット、５－（２’－アミノエチル）アミノナフチルアミド－３，５ジスルホネート（ルシファーイエローｖｓ）、７－アミノ－４－メチルクマリン（ａｍｃ、クマリン１２０）、７－アミノ－４－トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）、シアニン２、シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７を含むがこれらに限定されないシアニン色素（スルホン化もしくは非スルホン化）、［５－ジメチルアミノ］ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、４－（４’－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、ＤＡＢＳＹＬ、４－ジメチルアミノフェニルアゾフェニル）－４’－イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、ＩＡＥＤＡＮＳ（５－（（（（２－ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレンスルホン酸）、ＥＤＡＮＳ、ＱＳＴ ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ ２１、ＱＳＹ ３５（ＱＳＹ色素はジアリール－ローダミン誘導体である）、ＢＩＯＤＩＰＹ ＦＬを含むがこれに限定されないＢＩＯＤＩＰＹ色素、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ３５０、４８８、５４６、５５５、５６８、５９４、６４７、６６０、７５０色素を含むがこれらに限定されないＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ色素、ＡＴＴＯ（商標）４８８（ＮＨＳエステル）、ＡＴＴＯ（商標）５３２、ＡＴＴＯ（商標）５５０、ＡＴＴＯ（商標）５６５、ＡＴＴＯ（商標）５９０、ＡＴＴＯ（商標）６３３、ＡＴＴＯ（商標）６４７Ｎ、ＡＴＴＯ（商標）Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ（商標）６４７Ｎ（ＮＨＳエステル）を含むがこれらに限定されないＡＴＴＯ色素、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、ＭＧＢ色素（主溝もしくは副溝結合色素）、ＬＩ－ＣＯＲ社のＩＲＤｙｅｓ（登録商標）ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）６４０、Ｄｙ７５０、非放射性クエンチャー（Ｎａｎｏｇｏｌｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー０、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー１、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー２、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャー３、Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）、Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）、ＩＤＴ社クエンチャーＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）ＲＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、ＺＥＮ（商標）、ＴＡＯ及び／またはＺＥＮ（登録商標）、ナノ粒子クエンチャーを含むがこれらに限定されない）、一本鎖結合タンパク質を含む群から選択される、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 核酸増幅反応に使用するポリメラーゼ酵素（単数または複数）が、天然、修飾、またはキメラ酵素であって、ポリメラーゼ活性に加えて鎖置換活性、鋳型非依存性プライマー活性、塩基伸長活性もしくはエキソヌクレアーゼ活性を有するか有さないＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素、または逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有するポリメラーゼ、またはＲＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼであり、前記ポリメラーゼが、熱安定性、周囲温度または周囲温度未満で活性な酵素、ホットスタートポリメラーゼであり得、前記ポリメラーゼが高温、好ましくはプライマーアニーリング温度、で加熱された後に活性化される、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. （メチル化もしくは非メチル化）核酸または非核酸標的を検出するために使用する、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法であって、
    核酸または非核酸標的に対して極めて高い親和性を有する第１の結合部分を、前記核酸または非核酸標的を捕捉するために使用し、前記第１の結合部分と同一または異なる、前記核酸または非核酸標的に対して極めて高い親和性を有する第２の結合部分を、捕捉された前記核酸または非核酸標的を結合するために使用するか、あるいは前記第２の結合部分に極めて高い親和性で結合する第３の結合部分を使用し、合成または天然の核酸標的分子が付加された状態の前記第２の結合部分または前記第３の結合部分を提供し、核酸が付加された状態の未結合の第２の結合部分または第３の結合部分を洗い落とした後に、結合した前記第２の結合部分または前記第３の結合部分を、請求項６～１７、２８、２９、３４、３５、４６に記載のドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマー対またはプローブとプライマーとの対を使用した核酸増幅によって検出及び定量化し、
    前記結合部分が、好ましくは以下の結合対：抗原－抗体、タンパク質－抗タンパク質抗体、抗体－抗体、抗体－抗ＩｇＧ抗体、一次抗体－二次抗体、プロテインＡ－抗体、プロテインＧ－抗体、ビオチン－アビジン、ビオチン－ストレプトアビジン、レクチン－糖、核酸－核酸、タンパク質－核酸、ペプチド核酸、アプタマー－アプタマー、アプタマー－核酸、アプタマー－タンパク質、ハプテン－抗ハプテン抗体から選択され、前記ハプテンが、蛍光色素、ブロモ－ｄ－ＵＴＰ、アフラトキシン及び他のマイコトキシン、ペプチド、糖を含むがこれらに限定されない小分子である、方法。
  55. 多数のｍ－ＲＮＡまたはｃ－ＤＮＡの検出及び／または定量化のための方法である、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法であって、
    各ｍ－ＲＮＡまたはｃ－ＤＮＡに対して特異的な第１の増幅プライマーを提供すること、及び前記ｍ－ＲＮＡまたは前記ｃ－ＤＮＡ及び各ｍ－ＲＮＡまたはｃ－ＤＮＡに対して特異的な追加のプローブに付加された配列から選択される共通プライマー（試料中の全てのｍ－ＲＮＡまたはｃ－ＤＮＡに共通するもの）を第２の増幅プライマーとして提供すること、を含み、前記第１の増幅プライマー、前記第２の共通増幅プライマー、特異的プローブが、請求項６～１７、２８、２９、３４、３５、４６に岸尚標識プライマー対または標識プローブ対である、方法。
  56. 前記ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブが、非ヌクレオチド有機リンカー、ヘキサメチレン、ヘキサポリエチレングリコール、またはそれらのキメラ、またはそれらのより長い長さのものを介して前記アクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャー部分で標識されたプライマーに付着または連結されて提供され、前記プローブが、前記プローブに連結したプライマーの伸長を通じて生成された新生核酸鎖（ｎａｓｃｅｎｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｔｒａｎｄ）にハイブリダイズする、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 核酸増幅反応を行うためのキットであって、単数または複数の容器に、請求項６、１０～１７、２６～３３、３５、４２、４９～５０、５４～５６に記載のドナー・フルオロフォアで標識されたオリゴヌクレオチドプローブと、アクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー（複数可）とを少なくとも選択的に含み、選択的に下記：
    ａ）請求項８～１７、２８、３４、４１、４３、４８～５０、５４～５６に記載の、少なくともドナー・フルオロフォアで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー及びアクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー（複数）、
    ｂ）請求項２８、４３、４８及び５０並びに配列番号２１～２２から選択的に含まれる、少なくともドナー・フルオロフォアで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー（複数可）またはアクセプター・フルオロフォアまたはクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー（複数可）、
    ｃ）請求項１９、２３、２４～２５、２９、３５、４８～５０から選択的に含まれる、少なくともドナー・フルオロフォアで標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（複数可）及びアクセプター・フルオロフォアもしくはクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドプライマー（複数可）、
    ｄ）第1のプライマーを保有する、少なくともドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドプロモーター配列と、請求項41に記載のものを選択的に含む標的特異的な第２のプライマー、
    ｅ）少なくとも陽性対照鋳型及び陽性対照鋳型に特異的なドナー・フルオロフォア並びにアクセプター・フルオロフォア／クエンチャーで標識されたプライマーとの対、及び請求項６～１７、２４～３５、４１～４３、４８～５０、５４～５６に記載のものを選択的に含むプローブ、
    （ｆ）請求項５６に記載の標識プライマー対であって、前記ドナー・フルオロフォアで標識されたプローブが、非ヌクレオチド有機リンカー、ヘキサメチレン、ヘキサポリエチレングリコール、またはそれらのキメラ、またはそれらのより長い長さのものを介して前記アクセプター・フルオロフォア部分または前記クエンチャー部分で標識されたプライマーに付着または連結されて提供され、前記プローブが、前記プローブに連結したプライマーの伸長を通じて生成された新生核酸鎖（ｎａｓｃｅｎｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｔｒａｎｄ）にハイブリダイズする、方法。
  58. 反応緩衝液、複数のデオキシヌクレオシド三リン酸、ポリメラーゼ酵素または酵素、陽性対照鋳型及び陽性鋳型のそれぞれの標識されたプライマー対をさらに含む、請求項５７に記載のキット。
  59. 前記標的核酸が、精製もしくは部分精製された核酸または未精製の核酸であり、天然もしくは合成もしくは半合成の一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖ｃ－ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、エキソソームＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍ－ＲＮＡ）、小分子ＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、ｓＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡを含むがこれらに限定されない）、極小胚様幹細胞を含む幹細胞由来ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡ、または癌細胞ＤＮＡ（体液、生検試料、腫瘍、膿、唾液、糞便、癌幹細胞を含むがこれらに限定されない任意の供給源に由来する）、及び１つまたは２つの非標的合成配列を前記標的核酸の末端に付加することにより生成される一本鎖または二本鎖の合成または半合成ＤＮＡまたはＲＮＡから選択され、標的核酸が、核酸分子全体を構成する必要はなく、また、感染因子のゲノム配列、ゲノム配列の変異（数個の塩基もしくは長い配列の単一塩基の変化もしくは欠失もしくは挿入）、または生死を問わない、ヒト細菌、酵母、真菌、植物、動物、ヒト、寄生生物及びそれらのウイルスならびに任意の他の生物のゲノム配列の存在もしくは不在またはそれらの変異（数個の塩基もしくは長い配列の単一塩基の変化もしくは欠失もしくは挿入）が、疾患もしくは障害の存在、または感染症もしくは疾患もしくは障害に対する感受性、または疾患治療に対する適合性、出生前診断、遺伝形質、遺伝子型、アレル型、ＳＮＰ検出、細胞型、組織型、種もしくは株の種類、癌種もしくは癌のサブタイプ、癌の検出、疾患タイピングもしくはサブタイピング、発現遺伝子に関連付けられる、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。
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