JP2024522083A - ナノポアを使用して分子を検出する多重方法 - Google Patents

Abstract

試料中の複数の分子を検出するための方法であって、（ａ）試料を担体及びナノポアと接触させることであって、担体が、一本鎖リーダーと、識別子領域と、検出される分子に特異的な分子結合領域と、を含み、モータータンパク質が、ナノポア内の識別子領域の移動を制御することができるように、担体に結合している、接触させることと、（ｂ）担体がナノポア内を移動するとき、１つ以上の光学的又は電気的測定を行って、識別子領域を特徴付け、かつ分子が分子結合領域に結合しているか否かを判定することと、を含む、方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、ナノポア技術を使用して試料中の分子を検出する多重方法に関する。本発明はまた、分子を結合及び特定するための担体、及びそのような担体の集団、並びにそのような担体を含むキット及びシステムに関する。

生物学的センサは、医療診断の極めて重要な部分であり、急速に成長している業界の部分である。バイオマーカー（例えば、タンパク質）センシングに使用される現在の最先端の検出技術は、通常、ＥＬＩＳＡアッセイを介した定量的な光学読み出し、又は定性的な色の読み出しとカップリングされており、低濃度によって制限され、まれな事象を隠す。抗体に基づく検出技術は、通常、ポリペプチド標的に範囲が限定され、低濃度での低い感度に苦しむ。質量分析（ＭＳ）に基づく技術は、概して、大規模な試料調製を必要とし、また、低濃度での低い感度に苦しむ場合があるが、標的化されたＭＳ技術は、複数の標的を分析する場合、大きな試料サイズを必要とする。

ナノポア技術は、これまで非ポリヌクレオチド分子を検出するために使用されてきた。ＷＯ２０１３／１２１２０１には、アプタマーを含むプローブ及び膜貫通ポア技術を使用して１つ以上の分子の存在又は不在を判定するための方法が記載され、トロンビンの検出が例示されている。ＤＮＡ担体は、これまで標的の選択的な標識なしの検出を可能にするために使用されてきたが、単一の分析物に限定され、容易に拡張することができない（例えば、Ｓｚｅ ｅｔ ａｌ．”Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｓ ８．１（２０１７）：１－１０、及びＣａｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｓ １０．１（２０１９）：１－９を参照されたい）。

更に、バイオマーカーのいくつかの集団、例えば、ｍｉＲＮＡの集団は、寿命が短く、低濃度で存在し、これは、それらが現在、臨床的にアクセス不可能であることを意味する。

したがって、生体液などの複雑な試料中の複数の可溶性タンパク質、ｍｉＲＮＡ、及びバイオマーカーなどの他の分子の同時検出を達成することができる分析方法が必要とされている。更に、そのような技術には標的分子の非常に低い濃度を検出することができることも必要とされている。これを達成することができる技術は、例えば、診断及び病気の進行の監視のための医療において、広範囲に影響を与えることが期待される。そのような技術はまた、汚染物質（ｐｏｌｌｕｔａｎｔ）又は他の汚染物質（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ）の存在について水試料を研究するなど、異なる分野で適用される可能性がある。

本開示は、タンパク質、ｍｉＲＮＡ、及び他のバイオマーカー、並びに他のタイプの分子を検出するために、ナノポア技術を利用する方法などに関する。この技術は、高い感度及び迅速な読み出しでの、未処理の試料における、直接に高度な多重化検出の可能性を有している。

したがって、以下のものが本明細書で提供される：
－試料中の複数の分子を検出するための方法であって、
（ａ）試料を担体及びナノポアと接触させることであって、担体が、一本鎖リーダーと、識別子領域と、検出される分子に特異的な分子結合領域と、を含み、モータータンパク質が、ナノポア内の識別子領域の移動を制御することができるように、担体に結合している、接触させることと、
（ｂ）担体がナノポア内を移動するとき、１つ以上の光学的又は電気的測定を行って、識別子領域を特徴付け、かつ分子が分子結合領域に結合しているか否かを判定することと、を含む、方法、
－一本鎖リーダーと、識別子領域と、検出される分子に特異的な分子結合領域と、を含む担体であって、モータータンパク質が、一本鎖リーダーと識別子領域との間の位置で担体に結合している、担体、
－複数の分子のための担体の集団であって、各担体が、一本鎖リーダーと、識別子領域と、検出される分子に特異的な分子結合領域と、を含み、モータータンパク質が、一本鎖リーダーと識別子領域との間の位置で担体に結合しており、集団における異なる担体が、異なる識別子領域及び異なる分子結合領域を含む、担体の集団、
－試料中の複数の分子を検出するためのキットであって、
（ｉ）担体の集団であって、各担体が、識別子領域と、検出される分子に特異的な分子結合領域と、を含み、集団における異なる担体が、異なる識別子領域及び異なる分子結合領域を含む、担体の集団と、
（ｉｉ）一本鎖リーダーを含むアダプターと、
（ｉｉ）モータータンパク質と、を含む、キット、並びに
－試料中の複数の分子を検出するためのシステムであって、
（ｉ）担体の集団であって、各担体が、一本鎖リーダーと、識別子領域と、検出される分子に特異的な分子結合領域と、を含み、モータータンパク質が、一本鎖リーダーと識別子領域との間の位置で担体に結合しており、集団内の異なる担体が、異なる識別子領域及び異なる分子結合領域を含む、担体の集団と、
（ｉｉｉ）ナノポアと、を含む、システム。

バーコード配列決定及びバイオマーカーの検出の概略図。全体的に、主に、バーコードと、標的化された分析物が結合した結合領域（例えば、ｃＤＮＡ、アプタマー、抗体）と、からなるカスタム設計された鎖が膜につながれている。標的が結合した鎖は、生物学的ナノポア（ＣｓｇＧ）を通って転位することによって検出される。 （ｉ）ナノポアへの通り抜けを容易にするためのリーダーと、（ｉｉ）捕捉速度を増強させるためのコレステロールリンカーを有するテザーと、（ｉｉｉ）印加電圧下でナノポアとカップリングするときに、バーコードを配列決定するための不規則な曲線のシグナルを提供するモータータンパク質と、（ｉｖ）ポリヌクレオチド識別子区画（例えば、バーコード又は繰り返され得る複数のバーコード）と、（ｖ）バーコードを接続するスペーサーと、（ｖｉ）例えば、ｍｉＲＮＡ、タンパク質、又は神経伝達物質を選択的に標的とする、アプタマー／ｃ－ｍｉＲＮＡ／抗体などの分子結合領域と、を含む、例示的な完全な担体の概略図。 （ｉ）ナノポアへの通り抜けを容易にするためのリーダーと、（ｉｉ）捕捉速度を増強させるためのコレステロールリンカーを有するテザーと、（ｉｉｉ）印加電圧下でナノポアとカップリングするときに、バーコードを配列決定するための不規則な曲線のシグナルを提供するモータータンパク質と、からなるアダプターを含む、例示的な完全な担体の概略図。アダプターは、（ｉ）単一Ａのオーバーハングで相補鎖にハイブリダイゼーションされたアダプターライゲーション部分と、（ｉｉ）ポリヌクレオチド識別子区画（バーコード又は繰り返され得る複数のバーコード）と、（ｉｉｉ）バーコードを接続するスペーサーと、（ｉｖ）例えば、標的ｍｉＲＮＡ、タンパク質、又は神経伝達物質を選択的に結合するアプタマー／ｃ－ｍｉＲＮＡ／抗体などの１つ以上の分子結合領域と、からなるＤＮＡ鎖にライゲーションされている。 担体及び分子結合領域上の分子の存在又は不在を判定するための方法の例示。酵素消化を使用して、特異的である分子に結合していない任意の分子結合領域を除去／消化する。（ａ）ニッキング酵素又はエンドヌクレアーゼの部位は、分子結合領域が、特異的である分子に結合している場合にはニッキング酵素又はエンドヌクレアーゼから隠されるが、分子が分子結合領域に結合していない場合には露出されるように、担体に含まれる。試料を、特異的である分子に対して分子結合領域に好適な条件下で担体と接触させた後、ニッキング酵素又はエンドヌクレアーゼを、分子結合領域が特異的である分子に結合していない任意の担体にニックが導入されるように添加し得る。そのような消化後、標的分子に結合している担体は、識別子領域（バーコード配列）によって生成されたシグナルの後の電流シグナルの存在又は不在に基づいて、標的分子に結合している担体と区別され得る。 担体及び分子結合領域上の分子の存在又は不在を判定するための方法の例示。酵素消化を使用して、特異的である分子に結合していない任意の分子結合領域を除去／消化する。（ｂ）試料を、特異的である分子に対して分子結合領域に好適な条件下で担体と接触させた後、エキソヌクレアーゼを、分子結合領域が消化されるように添加され得る。そのような消化後、標的分子に結合している担体は、識別子領域（バーコード配列）によって生成されたシグナルの後の電流シグナルの存在又は不在に基づいて、標的分子に結合している担体と区別され得る。 バーコード配列決定及び逆多重化。（ａ）全ての配列は、ベースコールアルゴリズムでベースコールされ（スライド１９～２５を参照されたい）、バーコード配列である参照配列に整列される。最大整列スコアは、バーコードを分類するために使用される。最大整列スコア及び２番目に高いスコアが近すぎる場合、事象は分類されない。更に、ｐ値は、事象を分類し、偽陽性分類を除去するために使用される。 バーコード配列決定及び逆多重化。（ｂ）この方法では、記録された全ての事象の８６％が使用及び分類され、９９．９５％の精度が達成される。 配列決定、整列、及びバーコード分類。（ａ）バーコード配列決定は、９０％超の精度を有し、偽陽性について、０．０００１％の可能性を有する。 配列決定、整列、及びバーコード分類。（ｂ）誤ったバーコード分類に対する優先が非常に低いことを示す混同マトリックス。 バーコード１：ＴＧＣＴＡＣＴＣＴＣＣＴＣＡＴＡＡＧＣＡＧＴＣＣＧＧＴＧＴＡＴＣＧＡＴ， バーコード２：ＡＴＣＧＣＴＡＣＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＡＴＣＡＴＡＧＴＣＧＡＧＴ， バーコード３：ＡＧＣＴＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＡＣＧＡＧＣＴＧＣＧＴ， バーコード４：ＧＴＡＡＧＴＣＴＧＣＡＴＣＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＡＴＡ， バーコード５：ＣＴＡＣＧＡＣＡＧＴＡＣＧＣＴＡＧＣＡＡＧＧＡＴＡＧＡＣＡＣＴＡＣＧＡ， バーコード６：ＴＡＣＴＧＡＡＣＡＣＡＡＧＴＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＧＣＡＡＴＣＡＣＡＡＴ， バーコード７：ＡＧＴＣＴＡＣＣＡＴＴＡＣＴＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＴＡＧＣＣＴＣＡＣＴＣ， バーコード８：ＴＧＣＡＣＧＡＧＴＧＣＧＴＧＴＣＡＡＣＣＧＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＧＴＧ， バーコード９：ＣＴＡＧＴＧＣＧＣＡＧＴＴＧＴＣＴＣＧＧＣＧＧＡＧＴＴＧＡＧＡＣＴＧＡ， バーコード１０：ＧＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＴＧＴＣＴＧＴＣ． 複雑な混合物中で１０個のバーコード化された担体を識別した。同じ濃度では、バーコード化された担体の検出率においてバイアスは観察されなかった。使用されたバーコードは、上記のバーコード１～１０であった。 失速分析を使用して、標的がバーコード化された鎖に結合しているか否かを判定した。（ａ）標的分析物がバーコード化された鎖に結合していない場合、電流シグナルは、（滞留時間、電流振幅において）失速を示さない。 失速分析を使用して、標的がバーコード化された鎖に結合しているか否かを判定した。（ｂ）結合した分析物（ここでは、相補的ｍｉＲＮＡで例を示す）は、担体を失速させ、それは固有の電流プロファイルをもたらす。 ｍｉＲＮＡを添加した場合（６２．１８％）よりも、ｍｉＲＮＡを含まない担体（バーコード６）の失速が有意に少ない（６．４％）。 図８－１の続きである。 濃度依存性を有するｍｉＲＮＡの多重化検出。１０個の異なるバーコードは、１０個の異なるｍｉＲＮＡの検出及び区別を可能にする。捕捉速度においてはいくつかの不均一性が観察されたが、動作範囲は０～５ｎＭのｍｉＲＮＡで同様のままであった。使用されたバーコードは、上記のバーコード１～１０であった。 ｍｉＲＮＡ１： ＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＣＵＧＵＧＧＵＵＵＧＵ， ｍｉＲＮＡ２： ＡＧＡＧＣＵＵＡＧＣＵＧＡＵＵＧＧＵＧＡＡＣ， ｍｉＲＮＡ３： ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧ， ｍｉＲＮＡ４： ＡＣＣＵＧＧＣＡＵＡＣＡＡＵＧＵＡＧＡＵＵＵ， ｍｉＲＮＡ５： ＵＧＵＡＡＡＣＡＵＣＣＣＣＧＡＣＵＧＧＡＡＧ， ｍｉＲＮＡ６： ＵＧＵＡＡＡＣＡＵＣＣＵＡＣＡＣＵＣＵＣＡＧＣ， ｍｉＲＮＡ７： ＡＧＣＵＧＧＵＡＡＡＡＵＧＧＡＡＣＣＡＡＡＵ， ｍｉＲＮＡ８： ＧＡＧＣＵＵＵＵＧＧＣＣＣＧＧＧＵＵＡＵＡＣ， ｍｉＲＮＡ９： ＡＡＣＡＵＵＣＡＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＧＧＵ， ｍｉＲＮＡ１０： ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ． 図９－１の続きである。 トロンビンと１５ｍｅｒのトロンビン結合アプタマーとの間の結合の検出。トロンビンとの結合時に、不規則な曲線の事象は、はるかに長い滞留時間を示し、電流反転の観点から、４００ｎＭのトロンビンとの結合時の失速の有意な増加が見られ、これは、Ｇ四重鎖及びアプタマー－タンパク質相互作用の巻き戻しに対応する。実施例１で提供される第１のトロンビン担体をこの実験で使用した。 図１０－１の続きである。 トロンビンと１５ｍｅｒのトロンビン結合アプタマーとの間の結合の濃度依存性。結合を、トロンビン濃度を０ｎＭから４００ｎＭに増加させることによって確認した。トロンビン濃度が増加するにつれて、より長い滞留時間を伴うより多くの不規則な曲線の事象として、担体の失速の増加が観察された。実施例１で提供される第１のトロンビン担体をこの実験で使用した。 ステム－ループアプタマーを使用したセロトニンの検出。実施例１に提供されるセロトニンアプタマーに関連するバーコード配列を使用した。担体におけるセロトニン及びアプタマーの構造を示す。バーコードがポアと相互作用する場合に生成されるシグナル、及びアプタマーがポアと相互作用する場合に生成されるシグナルを示す例示的な電流トレースが提供される。表及びグラフに示されるように、アプタマーの展開によって引き起こされる平均の遅延は、セロトニン濃度とともに増加する。 ステム－ループアプタマーを使用したセロトニンの検出。（Ａ）セロトニンの不在下及び４０ｍＭのセロトニンの存在下での電流トレース。電流対滞留時間のプロットに示されるように、セロトニンの存在下で滞留時間が増加する。 図１３Ａ－１の続きである。 ステム－ループアプタマーを使用したセロトニンの検出。（Ｂ）０ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、及び４０ｍＭのセロトニンについての電流対滞留時間のプロットを示す。失速事象の濃度依存的な増加が観察された。 ステム－ループアプタマーを使用したアセチルコリンの検出。使用されたバーコード及びアプタマー配列を示す。アセチルコリンを伴わない、及び伴う担体の例示的な測定値が提供される。アセチルコリンの濃度と遅延パーセンテージとの間の相関が観察された。 モータータンパク質を伴わない分子の検出。（Ａ）トロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ）を使用した、増加する濃度のトロンビンの検出。影付き領域は、ＴＢＡのシグナルを示す。より低いｎＡでシグナルを有する事象は、ＴＢＡが結合したトロンビンを示す。 図１５Ａ－１の続きである。 モータータンパク質を伴わない分子の検出。（Ｂ）セロトニン結合アプタマー（ＳＢＡ）を使用した、増加するセロトニン濃度の検出。影付き領域は、ＳＢＡが結合したセロトニンのＳＢＡ単独について観察されるシグナルに関連する。 モータータンパク質を伴わない分子の検出。（Ｃ）多重化試料中のバーコードの検出。バーコードは、バーコード領域のシグナルの振幅に基づいて区別される。 図１５Ｃ－１の続きである。 多重化スクリーニング及び検出戦略の例。担体の集団を使用して、スクリーニング及び診断のための生物学的パスポートを生成し得る。 担体鎖の配列－ｍｉＲＮＡ。 図１７－１の続きである。 担体鎖の配列－タンパク質及び神経伝達物質。 バーコード分類の混同マトリックス。 複数のｍｉＲＮＡの検出 Ａ．対照（０ｎＭ）と比較して、１０ｎＭのｍｉＲＮＡを有するバーコード化された試料（バーコード１３）の転位時間の増加。 複数のｍｉＲＮＡの検出 Ｂ．（上部）関連する移動標準偏差プロットを伴うバーコード事象の特性電流トレース。移動標準偏差がある特定の閾値（０．００３）を下回る場合、事象は遅延として分類された。（下部）関連する移動標準偏差プロットを伴う遅延した事象の特性電流トレース。 複数のｍｉＲＮＡの検出 Ｃ．単一バーコード（バーコード３８）滴定曲線（ｎ＝５）。 複数のｍｉＲＮＡの検出 Ｄ．同じ試料中の（それぞれの）ｍｉＲＮＡ濃度を増加させた４０個の異なるバーコードの多重化滴定曲線（ｎ＝５）。 複数のｍｉＲＮＡの検出 Ｅ．多重化実験（ｎ＝５）において添加された１０ｎＭのｍｉＲＮＡについて検出された遅延を示し、１０ｎＭのｍｉＲＮＡが添加された各バーコードについて個々の実験の散布図と重ね合わせた、箱ひげ図（ｎ＝１、ドット）。 多重化実験における未知のｍｉＲＮＡ濃度の定量化。（Ａ）４０個のバーコード多重化実験のための滴定曲線を個別にプロットした。各曲線は、ヒルフィット関数で適合された。添加されたｍｉＲＮＡの真の濃度（濃い灰色）及び標準曲線に基づいて判定された添加されたｍｉＲＮＡの予測濃度（薄い灰色）。結果は、予測された濃度と実際の濃度との間の非常に高い重複を示している。 多重化実験における未知のｍｉＲＮＡ濃度の定量化。（Ｂ）予測値から実際の値を引いた差（ｎ＝１２）を示す残差解析。 ｃＴｎＩの検出。Ａ：ｃＴｎＩアプタマー配列。 ｃＴｎＩの検出。Ｂ： 事象時間の比較＋／－３０ｎｇ／ｍｌのｃＴｎＩ ｃＴｎＩの検出。Ｃ： Ｃ３ピークまでの事象時間。 ｃＴｎＩの検出。Ｄ： Ｃ３ピークから終了までの事象時間。ｃＴｎＩの濃度－遅延関係、事象は、対照事象のｔ＞９５％ｉｌｅで「遅延」される。 ｃＴｎＩの検出。Ｅ： 総事象時間。 ｃＴｎＩの検出。Ｆ： Ｃ３ピークまでの事象時間。 ｃＴｎＩの検出。Ｇ： Ｃ３ピークから終了までの事象時間。

分子担体及び多重方法
本開示は、試料中の複数の分子を検出する方法に関する。本方法は、試料を担体と接触させることを含み、担体は、検出される分子に特異的な分子結合領域に関連した識別子領域を含む。モータータンパク質の制御下で、担体がポアなどの検出器内を移動するとき、識別子領域が特徴付けられ、分子が分子結合領域に結合しているか否かが判定される。したがって、方法は、関連する識別子領域の特徴付け及び分子が分子結合領域に結合しているか否かの判定から、検出される分子が存在するか、又は不在かを特定する。試料内の複数の分子が検出され得る。以下でより詳細に説明するように、本方法は、試料中の複数の分子を正しく検出及び特定することを可能にする。

上記で説明したように、試料中の分子を特定するための方法は、当該技術分野で既知である。当該技術分野で既知の１つの方法は、アプタマー及び尾部を含むプローブを含む（ＷＯ２０１３／１２１２０１を参照されたい）。異なるアプタマー及び異なる尾部を有する異なるプローブが提供され、各尾部は、分析物がアプタマーに結合しているか否かに応じて、ポアを通って流れる電流に対して異なる効果を有し得る。このようにして、本方法は、試料中の複数の分析物を検出し得る。アプタマーに結合した分析物の存在又は不在は、分析物がアプタマーに結合していないプローブと比較した場合、分析物がアプタマーに結合している場合のポアを通る尾部の移動の失速によって検出される。

しかしながら、従来技術の方法は、生成され得るプローブの多様性及び異なる尾部の数によって制限される。異なる分析物は、単に、プローブの長さ、プローブの尾部における二本鎖領域の存在又は不在、及び各担体における異なるアプタマーの異なる結合親和性を変化させることによって互いに区別される。これらの制限は、互いに区別され得る試料中の異なる分析物の数を制限する。

本発明者らは、試料内の多数の異なる分析物及び／又は担体を区別する方法を考案した。本発明者らは、ポア内の分子特異的な識別子領域の移動を制御することができるように、担体上に位置するモータータンパク質を含む担体を考案した。制御された移動は、例えば、配列決定によって、識別子領域の正確な特徴付けを可能にする。異なる分子を検出するように設計されたモータータンパク質を含む担体における識別子領域間の差は、ポアを通る担体の移動がこのように制御される場合、はるかに小さくなり得る。したがって、本発明者らによって考案された担体は、多数の異なる識別子領域の標識なしの特定を可能にする。したがって、単一試料中の複数の分析物を特定するための高度な多重化方法は、本担体を使用して実施され得る。異なる試料と接触した担体の代替識別子領域を含むことによって、本発明の方法はまた、複数の試料からの複数の分析物の同時測定を可能にする。

本明細書に開示の改良された方法は、試料中の非常に低レベルの分析物の検出において良いパフォーマンスを発揮する（すなわち、高い感度を有する）。本明細書に開示の方法は、超希釈試料（サブピコモルレベル）を使用して、例えば、希少タンパク質及びｍｉＲＮＡ分子の効率的な検出及びスクリーニングを可能にし、ハイスループットな方法で単一分子感度を達成し得る。本明細書に開示の方法は、例えば、約１ｐＭ～約１ｆＭという低い濃度で試料中に存在する、タンパク質又はｍｉＲＮＡなどのポリヌクレオチドなどの分子を検出するために使用され得る。分子を検出する標準的なアプタマーに基づく方法は、検出可能なシグナルを生成するためにより高い濃度の分析物を必要とする。本明細書に開示の方法は、単一分子レベルでの検出を可能にし、試料中の分子の濃度を判定するために使用され得る。担体の分子結合領域への分子の特異的な結合は、例えば、担体上の膜アンカーを介したポアを含む膜への局在化によって、分子の有効濃度を増加させることを可能にする。本明細書に開示の担体はまた、例えば、天然の臨床試料などの未処理の試料中の分子の多重検出を可能にするという利点も提供する。

したがって、本明細書で提供されるのは、試料中の複数の分子を検出するための方法において複数の分子を検出するための方法であって、
（ａ）試料を担体及びナノポアと接触させることであって、担体が、一本鎖リーダーと、識別子領域と、検出される分子に特異的な分子結合領域と、を含み、モータータンパク質が、ナノポア内の識別子領域の移動を制御することができるように、担体に結合している、接触させることと、
（ｂ）担体がナノポア内を移動するとき、１つ以上の光学的又は電気的測定を行って、識別子領域を特徴付け、かつ分子が分子結合領域に結合しているか否かを判定することと、を含む、方法である。

識別子領域の特徴付け
担体は、１つ以上の識別子領域を含む。方法は、識別子領域を特徴付けるために、担体が、検出器と相互作用する、例えば、ポア内を移動することを必要とする。識別子領域を特徴付けるために行われ得る好適な測定は、以下に考察される。

好ましくは、識別子領域は、ポリヌクレオチドを含むか、又はそれである。好ましくは、識別子領域のポリヌクレオチド配列が、決定される。任意の好適な技術が、使用され得る。本開示は、特に、単一分子の特徴付け及び低濃度の分子の検出に適している。例示的な好適な配列決定技術は、本明細書においてより詳細に考察される。例えば、いくつかの好ましい実施形態では、配列決定技術は、ナノポアセンシング方法である。ナノポアセンシング方法は、ここで詳細に説明される。しかしながら、本明細書に開示の方法は、ナノポアセンシングに限定されない。他の単一分子配列決定技術は、本明細書に開示の方法に従うことが可能である。

ナノポア鎖配列決定において、識別子領域はポア内を移動する。識別子領域がポア内を移動するときに記録されたシグナルは、識別子領域の配列が決定されることを可能にする。識別子領域の他の特徴、例えば（ｉ）ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの二次構造、及び（ｉｖ）ポリヌクレオチドが修飾されているか否かは、識別子領域を特徴付けるために代替的に又は追加的に決定され得る。

ナノポアのチャネル内の担体分子の存在は、ポアを通るオープンチャネルイオン流に影響を及ぼす。これがポアチャネルの「分子センシング」の本質である。オープンチャネルイオン流の変動は、好適な測定技術を使用して、例えば、電流の変化によって測定され得る（例えば、ＷＯ２０００／２８３１２、及びＤ．Ｓｔｏｄｄａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０１０，１０６，７７０２－７又はＷＯ２００９／０７７７３４）。電流の減少によって測定されるイオン流の減少度は、ポア内又はポアの近くの障害物のサイズに関連している。類似の情報は、例えば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，９８６－９９１（２０１５）に開示の光学的方法を使用して得られ得る。したがって、ポア内又はポアの近くでの目的とする分子（例えば、標的ポリヌクレオチド）の結合により、検出可能かつ測定可能な事象が提供され、それにより、「生物学的センサ」の基礎が形成される。

核酸分子又は個々の塩基がポア内を移動するとき（例えば、ナノポアのチャネルを通過するとき）、塩基間のサイズの違いにより、チャネルを通るイオン流の直接相関した減少が引き起こされる。イオン流の変動が記録され得る。イオン流の変動を記録するための好適な電気的測定技法は、例えば、ＷＯ２０００／２８３１２及びＤ．Ｓｔｏｄｄａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０１０，１０６，ｐｐ７７０２－７（単一チャネル記録機器）、並びに例えばＷＯ２００９／０７７７３４（マルチチャネル記録技法）に記載されている。好適な較正により、イオン流の特徴的な減少を使用して、チャネルを横断する特定のヌクレオチド及び関連塩基をリアルタイムで特定することができる。典型的なナノポア核酸配列決定では、ヌクレオチドによるチャネルの部分的遮断のため、目的とするヌクレオチド配列の個々のヌクレオチドがナノポアのチャネルを連続して通過したときにオープンチャネルのイオン流が減少する。上記の好適な記録技法を使用して測定されるのは、このイオン流の減少である。イオン流の減少は、チャネルを通る既知のヌクレオチドについて測定されたイオン流の減少に較正することができ、結果としてどのヌクレオチドがチャネルを通過するかを判定するための手段が得られ、したがって、連続して行われる場合、ナノポアを通過する核酸のヌクレオチド配列を決定する方法が得られる。個々のヌクレオチドの正確な判定では、チャネルを通るイオン流の減少が、典型的には、狭窄部（又は「読み取りヘッド」）を通過する個々のヌクレオチドのサイズと直接相関する必要がある。配列決定は、例えば、ポリメラーゼ又はヘリカーゼなどの関連モータータンパク質の作用を介してポアを通って「通り抜けた」無傷の核酸ポリマーに対して実施され得ることが理解されるであろう。好適なモータータンパク質は、本明細書でより詳細に記載されている。

分子結合の判定
本方法は、分子が担体の分子結合領域に結合しているか否かを判定する。いくつかの実施形態では、本方法は、担体に特異的に結合した分子の存在又は不在を検出するために使用される。担体に特異的に結合した分子の不在の存在は、試料中の分子の不在の存在を示す。

方法はまた、遊離担体に対する分子結合担体の相対濃度、又は試料中の分子の絶対濃度など、分子の濃度を判定するために使用され得る。相対濃度及び絶対濃度は、得られた測定値から任意の好適な方法で計算され得る。相対濃度及び絶対濃度を判定する方法の例は、実施例及び図に提供される。

担体の分子結合領域と検出器との相互作用を使用して、分子が担体の分子結合領域に結合しているか否かを判定する。

ナノポア検出を使用する場合、分子結合領域は、分子結合領域が分子に特異的に結合しているか否かに応じて、ポアを通って流れる電流に影響を及ぼす。分子結合領域は、分子が結合していない場合には一方向にポアを通る電流に影響を及ぼし、分子が結合している場合には異なる方向にポアを通る電流に影響を及ぼす。これは、分子結合領域に特異的に結合した分子の存在又は不在、したがって、方法を使用して判定される試料中の分子の存在又は不在を可能にするため、重要である。

担体における分子特異的な識別子領域（すなわち、担体においてのみ存在する識別子領域であり、その担体はまた、所与の目的の分子に特異的な分子結合領域を含む）によって生成されるシグナルを使用して、担体に結合しているか、又は結合していない分子を特定し、したがって、試料中に存在するか、又は不在の分子を特定する。

分子が分子結合領域に結合しているか否かに応じて、ポアを通って流れる電流に対する分子結合領域の影響は、担体、又は担体の分子結合領域がポア内を移動するのにかかる時間に基づいて測定され得る。例えば、分子結合領域がアプタマーである場合、アプタマーの二次及び三次構造は、ポア内の担体の進行を検出可能に遅延させるか、又は一時的に失速させ得る。アプタマーがその同族分子に結合している場合、担体は、ポア内で進行するためのより高いエネルギー障壁を克服する必要があり得、ポアを通るアプタマーの進行の速度は、アプタマーが分子に結合していない場合よりも（伸長相互作用など）検出可能に遅延し得る。

いくつかの実施形態では、分子結合領域は、ｍｉＲＮＡなどの標的分子に相補的なポリヌクレオチドであり得る。そのような実施形態では、分子結合領域が分子に結合していない場合、担体は「通常の」速度でポア内を進行し得る。分子結合領域がｍｉＲＮＡなどの標的分子に結合する場合、そのとき、分子結合領域の二本鎖区画は、進行が検出可能に遅延又は失速されるように、ポア内の担体の進行に影響を及ぼし得る。このようにして、担体の分子結合領域に特異的に結合した分子の存在又は不在が判定され得る。

いくつかの実施形態では、分子結合領域は、抗体、抗体断片、ナノボディ、又はアフィボディであり得る。そのような分子結合領域の存在は、ポアを通る担体全体の移動を防止し得るが、分子の存在又は不在が判定され得る。理論に拘束されることを望まないが、担体のそのような分子結合領域は、ポアへの「漏れたプラグ」として機能する。ナノポア測定は、システム内の小さな変化に非常に敏感であり、個々のヌクレオチド塩基間を区別することができるため、分子が分子結合領域に結合しているか否かに応じて、プラグの「漏れ」の違いを検出することができる。

対照実験を実行して、分子が結合していない場合と比較して、担体が分子に特異的に結合している場合に、ポアを通って流れる電流及び／又は担体の進行に対して分子結合領域が有する影響を判定し得る。次いで、特定の分子が試験試料中に存在するか、又は不在かを判定するために、試験試料に対する本明細書に記載の方法の実行からの結果をそのような対照実験から導出された結果と比較し得る。これは、ＷＯ２０１３／１２１２０１においてより詳細に記載されている。

代替的な方法を使用して、分子が分子結合領域に結合しているか否かを判定し得る。例えば、分子が結合している場合と分子が結合していない場合の、分子結合領域の消化の差異に依存する消化に基づく方法が使用され得る。概して、担体の分子結合領域に結合した分子は、分子結合領域を消化から保護し得る。

例えば、分子結合領域がポリヌクレオチドである場合、制限酵素又は一本鎖ニッキング酵素などの部位特異的エンドヌクレアーゼが使用され得る。分子が結合していない場合、ポリヌクレオチド分子結合領域は消化され、ポア内で担体が移動すると、その不在が検出される。分子が結合している場合、ポリヌクレオチド分子結合領域は、消化されないか、又は単に「ニックが入り」、上記のように、ポア内の担体の進行の遅延又は失速、及び任意選択で、分子結合領域の特徴付けをもたらす。

消化方法は、分子結合領域が、抗体、抗体断片、ナノボディ、又はアフィボディなどのポリヌクレオチドである場合にも適用され得る。分子結合領域への分子の結合は、プロテアーゼ標的部位の保護をもたらし得、したがって、分子結合領域は消化されない。分子が不在の場合、分子結合領域は消化され得る。シグナルの差を使用して、担体上の分子の存在又は不在を判定し得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスペーサーは、担体の分子結合領域のリーダー配列側に位置付けされ得る。スペーサーは、ポア内の担体の進行を遅延させるか、又は失速させ、したがって、測定されたシグナルにおける分子結合領域の位置の指標を提供する。更に、スペーサーの存在はまた、分子が結合している場合にポア内の担体の進行の遅延又は失速が誇張されることを可能にし、したがって、担体上の分子の存在又は不在を判定するためのより明確なシグナルを提供する。

本方法はまた、実施例でより詳細に記載されるように、分子の濃度を判定することを可能にする。いくつかの実施形態では、試料における遊離担体と比較した分子が結合した担体の相対濃度を判定する。これは、試料間の分子レベルの相対的変化の判定に有用であり得る。いくつかの実施形態では、試料内の分子の絶対濃度を判定し得る。これは、実施例に例示されるように、標準曲線を参照として使用して実施され得る。

本方法は、好ましくは、複数の分子を同時に検出することを可能にする多重方法である。例えば、本方法は、５つ以上、１０個以上、５０個以上、１００個以上、例えば、２００～５００個、５００個以上、例えば、６００～１０００個、又は少なくとも１０００個、例えば、１０００～１００００個などの２つ以上の異なる分子を検出するためのものであり得る。

モータータンパク質
当業者が理解するように、任意の好適なモータータンパク質を本明細書に提供される方法及び製品に使用することができる。モータータンパク質は、ポリヌクレオチドに結合し、ナノポアなどの検出器に関する、例えばポアを通るその移動を制御することができる任意のタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のモータータンパク質が担体に結合している。

いくつかの実施形態では、モータータンパク質は、ポリヌクレオチドハンドリング酵素であるか、又はそれに由来する。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドと相互作用し、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性を改変することが可能なポリペプチドである。酵素は、ポリヌクレオチドを特定の位置に配向させるか又は移動させることによって、ポリヌクレオチドを修飾することができる。

いくつかの実施形態では、モータータンパク質は、酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０及び３．１．３１のうちのいずれかのメンバーに由来する。

典型的には、モータータンパク質は、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、又はそれらのバリアントである。

モータータンパク質は、典型的には、担体が溶液中にあるとき、担体上で失速される。いくつかの実施形態では、担体上のモータータンパク質は、モータータンパク質が（スペーサーの末端から外れて移行することによって以外）担体から離脱するのを防止するように修飾される。モータータンパク質を任意の好適な方法で適合させることができる。例えば、モータータンパク質が担体にロードされ、その後、それがスペーサーから離脱するのを防止するように修飾され得る。代替的に、モータータンパク質が担体にロードされる前に、それが担体から離脱するのを防止するように修飾され得る。モータータンパク質が担体から離脱するのを防止するためのモータータンパク質の修飾は、ＷＯ２０１４／０１３２６０において考察されている方法など当該技術分野で既知の方法を使用して達成され得、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、特にポリヌクレオチド鎖から離脱するのを防止するためのヘリカーゼなどのモータータンパク質の修飾について記載する一節を参照する。

例えば、モータータンパク質は、モータータンパク質がポリヌクレオチド鎖から離脱するときにその鎖が通過することができるポリヌクレオチド非結合開口部、例えば、空洞、溝、又は空隙を有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド非結合開口部は、モータータンパク質がスペーサーから離脱するときにスペーサーが通過することができる開口部である。いくつかの実施形態では、所与のモータータンパク質のポリヌクレオチド非結合開口部は、その構造を参照することにより、例えば、そのＸ線結晶構造を参照することにより判定することができる。Ｘ線結晶構造は、ポリヌクレオチド基質の存在下及び／又は不在下で得ることができる。いくつかの実施形態では、所与のモータータンパク質におけるポリヌクレオチド非結合開口部の位置は、当該技術分野で既知の標準パッケージを使用して分子モデリングによって推定又は確認され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド脱結合開口部は、モータータンパク質の１つ以上の部分、例えば、１つ以上のドメインの移動によって過渡的に生成され得る。

モータータンパク質は、ポリヌクレオチド非結合開口部を閉鎖することによって修飾され得る。したがって、ポリヌクレオチド非結合開口部を閉鎖することにより、モータータンパク質がスペーサーから離脱するのが防止され得る。例えば、モータータンパク質は、ポリヌクレオチド非結合開口部を共有結合的に閉じることによって修飾され得る。いくつかの実施形態では、この方式で対処するための好ましいモータータンパク質は、ヘリカーゼである。
一実施形態では、モータータンパク質は、エキソヌクレアーゼである。好適な酵素には、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号１）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素（配列番号２）、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲｅｃＪ（配列番号３）及びバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ（配列番号４）、ＴａｔＤエキソヌクレアーゼ、並びにそれらのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。配列番号３に示される配列又はそのバリアントを含む３つのサブユニットが相互作用して、トリマーエキソヌクレアーゼを形成する。

一実施形態では、モータータンパク質は、ポリメラーゼである。ポリメラーゼは、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏｎ（登録商標）から市販されている）、ＮＥＢからのＫｌｅｎｏｗ、又はそれらのバリアントであり得る。一実施形態では、酵素は、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号５）又はそのバリアントである。本開示において使用され得るＰｈｉ２９ポリメラーゼの修飾されたバージョンが米国特許第５，５７６，２０４号に開示されている。

一実施形態では、モータータンパク質は、トポイソメラーゼである。一実施形態では、トポイソメラーゼは、部分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２及び５．９９．１．３のうちのいずれかのメンバーである。トポイソメラーゼは、ＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの形成を触媒することが可能な酵素である、逆転写酵素であり得る。それらは、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）から市販されている。

一実施形態では、モータータンパク質は、ヘリカーゼである。任意の好適なヘリカーゼが、本明細書に提供される方法に従って使用され得る。例えば、本開示に従って使用されるモータータンパク質又は各モータータンパク質は、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼ、ＴｒｗＣヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼ、及びＤｄａヘリカーゼ、又はそれらのバリアントから独立して選択され得る。モノマーヘリカーゼは、一緒に結合されたいくつかのドメインを含み得る。例えば、ＴｒａＩヘリカーゼ及びＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、２つのＲｅｃＤヘリカーゼドメイン、１つのリラクサーゼドメイン、及び１つのＣ末端ドメインを含有し得る。ドメインは、典型的には、オリゴマーを形成することなく機能することが可能であるモノマーヘリカーゼを形成する。好適なヘリカーゼの特定の例としては、Ｈｅｌ３０８、ＮＳ３、Ｄｄａ、ＵｖｒＤ、Ｒｅｐ、ＰｃｒＡ、Ｐｉｆ１、及びＴｒａＩが挙げられる。これらのヘリカーゼは、典型的には、一本鎖ＤＮＡに作用する。二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に沿って移動することができるヘリカーゼの例としては、ＦｔｆＫ及び六量体酵素複合体、又はＲｅｃＢＣＤなどのマルチサブユニット複合体が挙げられる。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、その全内容が参照により組み込まれる、ＷＯ２０１３／０５７４９５などの刊行物に記載されている。ＲｅｃＤヘリカーゼは、その全内容が参照により組み込まれる、ＷＯ２０１３／０９８５６２などの刊行物に記載されている。ＸＰＤヘリカーゼは、その全内容が参照により組み込まれる、ＷＯ２０１３／０９８５６１などの刊行物に記載されている。Ｄｄａヘリカーゼは、これらの各々の全内容が参照により組み込まれる、ＷＯ２０１５／０５５９８１及びＷＯ２０１６／０５５７７７などの刊行物に記載されている。

一実施形態では、ヘリカーゼは、配列番号６に示される配列（Ｔｒｗｃ Ｃｂａ）若しくはそのバリアント、配列番号７に示される配列（Ｈｅｌ３０８ Ｍｂｕ）若しくはそのバリアント、又は配列番号８に示される配列（Ｄｄａ）若しくはそのバリアントを含む。バリアントは、本明細書において考察される方式のうちのいずれかにおいて天然配列とは異なり得る。配列番号８の例示的なバリアントは、Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを含む。配列番号８の更なる例示的なバリアントは、Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわち、Ｍ１の欠失、次いでＧ１及びＧ２の付加）を含む。

いくつかの実施形態では、モータータンパク質（例えば、ヘリカーゼ）は、作動の少なくとも２つの活性モード（モータータンパク質が移動を容易にするのに必要な全ての成分、例えば、本明細書において考察されるＡＴＰ及びＭｇ２＋などの燃料及び補因子を備えている場合）及び作動の１つの不活性モード（モータータンパク質が移動を容易にするのに必要な成分を備えていない場合）でポリヌクレオチドの移動を制御し得る。

移動を容易にするのに必要な全ての成分を備えている場合（つまり、活性モードで）、モータータンパク質（エゲリカーゼ）は、ポリヌクレオチドに沿って５’から３’又は３’から５’の方向（モータータンパク質によって異なる）に移動する。モータータンパク質を使用してナノポアに対するポリヌクレオチド鎖の移動を制御する実施形態では、モータータンパク質を使用して、ポリヌクレオチドを（例えば、印加された場に逆らって）ポアから離れて（例えば、それから出て）移動させるか、又はポリヌクレオチドを（例えば、印加された場に従って）ポアに向かって（例えば、その中に）移動させるかのいずれかを行うことができる。例えば、モータータンパク質が向かって移動するポリヌクレオチドの末端がポアによって捕捉されると、モータータンパク質は、印加された電位から生じる場の方向に逆らって作用し、ねじ状（ｔｈｒｅａｄｅｄ）ポリヌクレオチドをポアから（例えばシスチャンバ内に）引き抜く。しかしながら、モータータンパク質が離れて移動する端がポア内で捕捉されると、モータータンパク質は、印加された電位から生じる場の方向に従って作用し、ねじ状ポリヌクレオチドをポア内に（例えば、トランスチャンバ内に）押し込む。

モータータンパク質（例えば、ヘリカーゼ）が移動を容易にするのに必要な成分を備えていない場合（すなわち、不活性モードで）、モータータンパク質は、ポリヌクレオチドに結合し、ポリヌクレオチドが、例えば印加された電位から生じる場によってポア内に引き込まれることによってナノポアに対して移動するときに、ポリヌクレオチドの移動を遅延させるブレーキとして機能することができる。不活性モードでは、ポリヌクレオチドのどちらの末端が捕捉されるかは問題ではなく、ポアに対するポリヌクレオチドの移動を決定するのは印加される場であり、モータータンパク質は、ブレーキとして作用する。不活性モードにある場合、モータータンパク質によるポリヌクレオチドの移動制御は、ラチェッティング、スライディング、及びブレーキングを含む、いくつかの方式で記載することができる。

活性モードでは、モータータンパク質は、典型的には、燃料分子を消費する。燃料は、典型的には、遊離ヌクレオチド又は遊離ヌクレオチド類似体である。遊離ヌクレオチドは、限定されないが、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環式アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環式グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、及びデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）のうちの１つ以上であり得る。遊離ヌクレオチドは、通常、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、又はｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、典型的には、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。

モータータンパク質の補因子は、モータータンパク質が機能することを可能にする因子である。補因子は、好ましくは、二価金属カチオンである。二価金属カチオンは、好ましくは、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃａ^２＋、又はＣｏ^２＋である。補因子は、最も好ましくは、Ｍｇ^２＋である。

本明細書に記載の方法では、モータータンパク質は、膜貫通ポアなどの検出器内の識別子領域の移動を制御することができるように、担体に結合している。

検出器内の担体の移動は、任意の好適な手段によって制御され得る。いくつかの実施形態では、構築物の移動は、物理的又は化学的力（電位）によって駆動される。いくつかの実施形態では、物理的な力は、電気的（例えば電圧）電位又は温度勾配などによって提供される。

いくつかの実施形態では、検出器は、ナノポアであり、構築物は、電位がナノポアを横切って印加されると、ナノポアに対して移動する。ポリヌクレオチドは負に帯電しているため、ナノポアを横切って電位を印加すると、ポリヌクレオチドは、印加された電位の影響下でナノポアに対して移動する。例えば、正の電位がナノポアのシス側に対してナノポアのトランス側に印加されると、負に帯電した分析物がナノポアのシス側からナノポアのトランス側に移動するように誘導される。同様に、正の電位がナノポアのシス側に対してナノポアのトランス側に印加される場合、これは、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側への負に帯電した分析物の移動を妨げる。負の電位がナノポアのシス側に対してナノポアのトランス側に印加されると、逆のことが起こる。適切な電圧を印加する装置及び方法は、本明細書でより詳細に記載されている。いくつかの実施形態では、化学的力は、濃度（例えば、ｐＨ）勾配によって提供される。

試料
試料は、任意の好適な試料であり得る。試料は、生体試料であってもよい。本明細書に記載のいずれの方法も、任意の有機体又は微生物から得られたか、又は抽出された試料に対してインビトロで実行され得る。有機体又は微生物は、通常は、古細菌、原核生物、又は真核生物であり、通常は、植物界、動物界、真菌界、モネラ界、及び原生生物界の五界のうちの一つに属する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の様々な態様の方法は、任意のウイルスから得られたか、又は抽出された試料に対してインビトロで実行され得る。

試料は、好ましくは、流体試料である。試料は、複雑な生物流体であってもよい。試料は、通常は、体液を含む。体液は、ヒト又は動物から取得してもよい。ヒト又は動物は、疾患を有する、疾患を有する疑いがある、又は疾患の危険性があるものであってもよい。試料は、尿、リンパ液、唾液、粘液、精液、脳脊髄液又は羊水、全血、血漿、又は血清であり得る。典型的には、試料は、ヒト由来のものであるが、代わりに、別の哺乳動物由来のもの、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ又はブタなどの商業的に飼育されている動物由来のもの、あるいはネコ又はイヌなどのペットであってもよい。

代替的に、植物由来の試料は、通常は、穀物、豆類、果物、又は野菜などの市販の作物、例えば、小麦、大麦、オート麦、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、大豆、米、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、豆、レンズ豆、サトウキビ、ココア、綿、茶、又はコーヒーから取得する。

試料は、非生体試料であってもよい。非生体試料は、好ましくは、流体試料である。非生体試料の例としては、外科用流体、水、例えば飲料水、海水、又は河川水、及び臨床検査用の試薬が挙げられる。

試料は、典型的には、アッセイされる前に、例えば、遠心分離によって、又は不必要な分子若しくは細胞、例えば赤血球を濾過して取り除く膜への通過によって処理され得る。試料は、採取された直後に測定されてもよい。試料はまた、典型的には、アッセイの前に、好ましくは－７０℃未満で保管され得る。

いくつかの実施形態では、試料は、ゲノムＤＮＡを含み得る。ゲノムＤＮＡは、断片化され得るか、又は本明細書に記載のいずれの方法もゲノムＤＮＡを断片化することを更に含み得る。ＤＮＡは、任意の好適な方法によって断片化され得る。例えば、ＤＮＡを断片化する方法は、当該技術分野で既知である。そのような方法は、ＭｕＡトランスポザーゼなどのトランスポザーゼ、又は市販のＧチューブを使用し得る。

本明細書に開示の方法は、１つ以上の試料から１つ以上の分子を検出し、単一のアッセイを使用して、どの試料で分子が検出されるかを判定するために使用され得る。これは、特定の分子結合領域に関連する識別子領域及び特定の試料に関連する識別子領域の両方を含む担体が使用される場合に、達成され得る。１つ以上の試料は、少なくとも３、４、５、１０、２０、５０、又は１００個の試料など、２つ以上であり得る。試料は、例えば、異なる患者、患者内の異なるタイプの組織、又は異なる時点で採取され得る。異なる時点は、秒、分、日、月、又は年によって区切られ得る。試料には、１つ以上の対照試料が含まれ得る。

試料は、試料調製なしで、又は最小限の試料調製で調べられ得るか、又は試料は、例えば、本方法における使用前に、不純物を除去するか、又は検出される分子のタイプを濃縮するために処理をされ得る。未処理又は最小限に処理された試料を使用する能力は、試料収集から分析への迅速なターンオーバーをもたらす。

分子
本明細書に記載の担体は、検出される分子に特異的な分子結合領域を含む。本明細書に開示の方法は、複数の分子を検出するためのものである。本明細書で提供される「分子」という用語は、「分析物」という用語と互換的に使用され得る。

分子は、分子結合領域によって特異的に結合し得る任意の分子であり得る。例えば、分子は、金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、染料、漂白剤、医薬品、診断薬、レクリエーショナルドラッグ、爆発物、及び／又は環境汚染物質であり得る。分子は、バイオマーカーであり得る。本方法は、２つ以上のタンパク質、２つ以上のヌクレオチド、又は２つ以上の医薬品など、２つ以上の同じタイプの分子を検出することを含み得る。本方法は、１つ以上のタンパク質、１つ以上のヌクレオチド、及び１つ以上の医薬品など、２つ以上の異なるタイプの分子を検出することを含み得る。

分子は、細胞から分泌され得る。代替的に、分子は、本方法が実行され得る前に分子が細胞から抽出される必要があるように、細胞内に存在していてもよい。

一実施形態では、分子は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及び／又はポリヌクレオチドから選択される。

一実施形態では、分子は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド及び／又はタンパク質から選択される。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、天然に生じるものであっても、非天然に生じるものであってもよい。ポリペプチド又はタンパク質は、それらの中に合成又は修飾アミノ酸を含み得る。アミノ酸へのいくつかの異なるタイプの修飾が当該技術分野で既知である。好適なアミノ酸及びその修飾は、膜貫通ポアに関して以下に考察される。本開示の目的のために、分子は、当該技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾され得ることを理解されたい。

タンパク質は、酵素、抗体、ホルモン、成長因子、又はサイトカインなどの成長調節タンパク質であり得る。サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１３などのインターロイキン、ＩＦＮ－γなどのインターフェロン、並びにＴＮＦ－αなどの他のサイトカインから選択され得る。タンパク質は、細菌タンパク質、真菌タンパク質、ウイルスタンパク質、又は寄生生物由来タンパク質であり得る。

一実施形態では、分子は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及び／又はポリヌクレオチドから選択される。ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖、及び少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基は、典型的には、複素環式である。核酸塩基には、プリン及びピリミジン、より具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシル、及びシトシンが挙げられるが、これらに限定されない。糖は、典型的には、ペントース糖である。ヌクレオチド糖としては、限定されないが、リボース及びデオキシリボースが挙げられる。ヌクレオチドは、典型的には、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、典型的には、一リン酸、二リン酸、又は三リン酸を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’又は３’側に結合され得る。

ヌクレオチドには、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５－メチルシチジン一リン酸、５－メチルシチジン二リン酸、５－メチルシチジン三リン酸、５－ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、５－ヒドロキシメチルシチジン二リン酸、５－ヒドロキシメチルシチジン三リン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、５－メチル－２’－デオキシシチジン一リン酸、５－メチル－２’－デオキシシチジン二リン酸、５－メチル－２’－デオキシシチジン三リン酸、５－ヒドロキシメチル－２’－デオキシシチジン一リン酸、５－ヒドロキシメチル－２’－デオキシシチジン二リン酸、及び５－ヒドロキシメチル－２’－デオキシシチジン三リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、又はｄＣＭＰから選択される。ヌクレオチドは、脱塩基であり得る（すなわち、核酸塩基を欠く）。ヌクレオチドは、追加の修飾を含有してもよい。特に、好適な修飾されたヌクレオチドには、２’－アミノピリミジン（２’－アミノシチジン及び２’－アミノウリジンなど）、２’－ヒドロキシルプリン（２’－フルオロピリミジンなど（２’－フルオロシチジン及び２’フルオロウリジンなど）、ヒロドキシルピリミジン（５’－α－Ｐ－ボラノウリジンなど）、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルシチジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンなど）、４’－チオピリミジン（４’－チオウリジン及び４’－チオシチジンなど）が含まれるが、これらに限定されず、ヌクレオチドは、核酸塩基の修飾（５－ペンチニル－２’－デオキシウリジン、５－（３－アミノプロピル）－ウリジン、及び１，６－ジアミノヘキシル－Ｎ－５－カルバモイルメチルウリジンなど）を有する。

オリゴヌクレオチドは、典型的には、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下、又は５以下のヌクレオチドなどの、５０以下のヌクレオチドを有する短いヌクレオチドポリマーである。オリゴヌクレオチドは、脱塩基及び修飾されたヌクレオチドを含む、上に考察されたヌクレオチドのうちのいずれかを含み得る。

ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１つの鎖にハイブリダイズした１つの鎖のＲＮＡを含み得る。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、又はヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーなどの当該技術分野で既知の任意の合成核酸であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドを含む、上記で考察されたヌクレオチドのうちのいずれかを含み得る。

ポリヌクレオチドは、任意の長さであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、又は少なくとも５００ヌクレオチド長若しくはヌクレオチド対長であり得る。ポリヌクレオチドは、１０００ヌクレオチド長以上若しくはヌクレオチド対長以上、５０００ヌクレオチド長以上若しくはヌクレオチド対長以上、又は１０００００ヌクレオチド長以上若しくはヌクレオチド対長以上であり得る。

一実施形態では、分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現の転写後調節において役割を果たす一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子である。

分子は、特定の表現型又は特定のタイプの細胞に関連し得る。例えば、分子は、細菌細胞を示し得る。分子は、ウイルス、真菌、又は寄生生物を示し得る。これらの分子は、レクリエーショナルドラッグ（ＳＡＭＨＳＡ５パネル試験など）、爆発物、又は環境汚染物質の特定のパネルであり得る。

一実施形態では、分子は、疾患又は状態を診断又は予後するために使用され得るバイオマーカーである。バイオマーカーは、タンパク質又はポリヌクレオチドなどの上記の分子のうちのいずれかであり得る。バイオマーカーの好適なパネルは、例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ，Ａ．Ｖ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ７，ｐ１８２４－１８３７、Ｊａｃｑｕｅｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ８，ｐ２６８７－２６９９、Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｎ．Ｌ．ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５６，１７７－１８５に記載のように、当該技術分野で既知である。疾患又は状態は、好ましくは、がん、冠状動脈性心疾患、心血管疾患、又は敗血症である。

一実施形態では、分子は、神経伝達物質である。神経伝達物質は、細胞間でシナプスを横切ってシグナルを伝達する分子である。神経伝達物質の例としては、アセチルコリン、ドーパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ＡＴＰなどのヌクレオチド、グルタメート、アスパラテート、及びδ－アミノ酪酸などのアミノ酸、並びにエンケファリンが挙げられる。

リーダー配列
本開示の担体は、一本鎖リーダー配列を含む。リーダー配列は、典型的には、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、修飾されたポリヌクレオチド（脱塩基ＤＮＡなど）、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はポリペプチドなどのポリマーを含む。いくつかの実施形態では、リーダー配列は、ポリｄＴ区画などのＤＮＡの一本鎖を含む。リーダー配列は、任意の長さであり得るが、典型的には、２０～１２０、３０～１００、４０～８０、又は５０～７０ヌクレオチド長などの、１０～１５０ヌクレオチド長である。

識別子領域
本開示の担体は、識別子領域を含む。担体は、２つ以上、３、４、５つ以上など２つ以上の識別子領域、例えば、約１０個以上の識別子領域などを含み得る。いくつかの実施形態では、担体上の異なる識別子領域は、識別子領域が検出器内を通過するとき、関連した分子結合領域の同一性が判定され得るように、異なる分子結合領域と関連し得る。したがって、担体は、一連の識別子領域及び分子結合領域を含み得る。担体は、検出器内の識別子領域の移動が、担体に結合したモータータンパク質によって制御されるように配置される。

いくつかの実施形態では、担体上の２つ以上の識別子領域の存在を使用して、異なる試料から担体を区別し得る。いくつかの実施形態では、２つ以上識別子領域を含む担体は、複数の試料中の複数の分子を検出するための方法において使用され得、したがって、担体は、例えば、試料に固有の１つの識別子領域及び担体が結合する分子に固有の１つの識別子領域を含み得る。担体の識別子領域は、担体が膜貫通ポアに接触すると、担体に結合したモータータンパク質が膜貫通ポア内の識別子領域の移動を制御するように位置付けされる。

識別子領域の目的は、担体に結合している分子の同一性の固有のシグナルとして機能することである。更なる識別子領域は、例えば、担体が接触された試料を特定するために、担体の供給源の固有のシグナルとして機能し得る。いくつかの実施形態では、識別子領域は、ポリヌクレオチドであるか、又はポリヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチドは、以下に考察されるもののうちのいずれかであり得る。識別子ポリヌクレオチドは、２～２００、２～１００、２～７５、２～５０、２～４０、２～３０、２～２５、４～１００、４～７５、４～５０、４～４０、４～３０、４～２５、４～２０、４～１５、４～１０、６～１００、６～７５、６～５０、６～４０、６～３０、６～２５、６～２０、６～１５、６～１０、８～１００、８～７５、８～５０、８～４０、８～３０、８～２５、８～２０、又は８～１５ヌクレオチド長などの２～３００ヌクレオチド長であり得る。

いくつかの実施形態では、分子結合領域又はその一部は、識別子領域である。例えば、識別子領域は、分子結合領域と重複し得る。そのような実施形態では、分子結合領域及び識別子領域は、好ましくはポリヌクレオチドである。分子結合領域が、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするアプタマー又はポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドである場合、分子結合領域のポリヌクレオチド配列は、結合した分子に固有であり、したがって、分子を特定するために作用する。いくつかの実施形態では、識別子領域及び分子結合領域は、重複しない。

いくつかの実施形態では、識別子領域は、バーコード配列を含む。ポリヌクレオチドバーコードは、当該技術分野で周知である（Ｋｏｚａｒｅｗａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ，（２０１１），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７３３，ｐ２７９－２９８）。バーコードは、特異的かつ既知の方法でポアを通って流れる電流に影響を及ぼすポリヌクレオチドの特異的な配列である。バーコード配列は、典型的には、４ヌクレオチド長以上、８ヌクレオチド長以上、又は１２ヌクレオチド長以上などの２ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態では、バーコード配列は、２～４５、２～４０、２～３５、２～３０、２～２５、４～５０、４～４５、４～４０、４～３５、４～３０、４～２５、４～２０、４～１５、４～１０、６～５０、６～４５、６～４０、６～３５、６～３０、６～２５、６～２０、６～１５、６～１０、８～５０、８～４５、８～４０、８～３５、８～３０、８～２５、８～２０、又は８～１５ヌクレオチド長などの２～５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、バーコード配列は、１０～５０、１０～４５、１０～４０、１０～３５、１０～３０、１０～２５、又は１０～２０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、バーコード配列は、１５～５０、１５～４５、１５～４０、１５～３５、１５～３０、又は１５～２５ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、バーコード配列は、２０～５０、２０～４５、２０～４０、２０～３５、又は２０～３０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、バーコード配列は、２５～５０、２５～４５、２５～４０、又は２５～３５ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、バーコード配列は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ヌクレオチド長であり得る。

バーコードの長さが長いほど、使用され得る固有の組み合わせの数が多くなる。バーコード配列決定の精度を増加させるために、バーコードは担体において繰り返され、バーコードが校正読み取りされることを可能にし得る。したがって、識別子領域は、３～１０個などの２つ以上、例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、又は６つ以上のコピーのバーコードを含み得る。

バーコード化は、ハイライト多重化検出を可能にする。例えば、４塩基のバーコードは、最大２５６個のタンパク質又はｍｉＲＮＡ標的を可能にする（４^４＝２５６）固有の構成を生成するであろう。塩基の数を増やして、例えば、４^８、４^１２個の固有の組み合わせを生成し得る。例えば、８塩基配列を使用して、６５，５３６個の固有のバーコードを生成し得る。これは、通常、最大で約５個又は約１０個の分子など、１個又は一握りの分子のみを任意の一度に選択的にプローブし得る感知及び診断の全般において、大きな前進である。

いくつかの実施形態では、識別子領域は、本明細書に記載のスペーサー又は一連のスペーサーを含み得る。一連のスペーサーは、２つ以上、例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、又は６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、又は１０個以上のスペーサーを含み得る。一連のスペーサーは、２０個以上、５０個以上、又は１００個以上のスペーサーを含み得る。一連のスペーサーは、２～１００、２～５０、２～２０、又は２～１０などの２～１０００個のスペーサーを含み得る。一連のスペーサーにおけるスペーサーは、同じでも異なってもよい。識別子領域がポア内で移動するとき、スペーサーの特徴的なシグナルが測定され得る。異なる担体分子におけるスペーサーのタイプ及び数は、測定されたシグナルに基づいて区別され得る。スペーサーは、本明細書に記載のスペーサー、例えば、ｉＳｐ９及びｉＳｐ１８スペーサーのうちのいずれかであり得る。

分子結合領域
本開示の担体は、検出される分子に特異的な分子結合領域を含む。いくつかの実施形態では、担体は、２つ以上の分子結合領域を含み得る。担体は、同じタイプの１つ以上の分子結合領域を含み得、及び／又は２つ以上の異なる分子結合領域を含み得る。２つ以上の分子結合領域は、４、５、６つ以上など、例えば、約１０個などの３つ以上の分子結合領域であり得る。担体中の異なる分子結合領域は、典型的には、異なる分子に特異的に結合する。これにより、単一の担体を使用して複数の分子（分析物）の検出が可能になる。

担体において、識別子領域は、各分子結合領域に関連し得る。典型的には、識別子領域は、その関連する分子結合領域が検出器と相互作用する前に、ポアなどの検出器を通過するように位置付けされる。

担体において、１つの識別子領域は、２つ以上、３つ以上などの１つ以上の分子結合領域、例えば４～１０個の分子結合領域に関連し得る。この状況では、２つ以上の分子結合領域は、典型的には、同じ分子に結合する。２つ以上の分子結合領域は、異なる分子に特異的であり得る。２つ以上の分子結合領域は、本明細書に定義されるものなどのスペーサー又は一連のスペーサーによって分離され得る。スペーサーは、分子結合領域を、関連する識別子領域から分離し得る。

担体がポアと接触するとき、分子結合領域に結合した分子の存在又は不在が判定され得るように、目的の分子に特異的に結合することを条件として、任意の分子結合領域が使用され得る。例えば、分子結合領域は、アプタマー；相補的ＤＮＡ配列；抗体、抗体断片、ナノボディ、若しくはアフィボディなどのペプチド若しくはタンパク質；クリック化学反応基；ビオチン若しくはストレプトアビジンなどであり得る。

一実施形態では、分子結合領域は、アプタマーである。アプタマーは、１つ以上の分子に結合する小分子である。好適なアプタマー及びアプタマーの作製方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、ＷＯ２０１３／１２１２０１において提供され、これは、参照により本明細書に組み込まれる。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（２００７），Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２４，ｐ３８１－４０３、Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，ｐ５０５－５１０、Ｂｏｃｋ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ ３５５，ｐ５６４－５６６）又はＮＯＮ－ＳＥＬＥＸ（Ｂｅｒｅｚｏｖｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２８，ｐ１４１０－１４１１）を使用して生成され得る。アプタマーは、ペプチドアプタマー又はオリゴヌクレオチドアプタマーであり得る。一実施形態では、アダプターは、ペプチドアプタマーである。ペプチドアプタマーは、任意のアミノ酸を含み得る。アミノ酸は、以下に考察されるもののうちのいずれかであり得る。一実施形態では、アプタマーは、オリゴヌクレオチドアプタマーである。オリゴヌクレオチドアプタマーは、任意のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは、上に考察されるもののうちのいずれかであり得る。アプタマーは、任意の長さであり得る。アプタマーは、典型的には、約１５～約５０、約２０～約４０、又は約２５～約３０のアミノ酸長又はヌクレオチド長などの少なくとも１５アミノ酸長又はヌクレオチド長である。

一実施形態では、分子結合領域は、ポリヌクレオチドである。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、アプタマーである。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、検出されるポリヌクレオチド分子（標的ポリヌクレオチド）に相補的な配列を含む。標的ポリヌクレオチドは、任意の長さであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、又は少なくとも５００ヌクレオチド長若しくはヌクレオチド対長であり得る。標的ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、典型的には、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下、又は５以下のヌクレオチドなどの、５０以下のヌクレオチドを有する短いヌクレオチドポリマーである。分子結合領域は、好ましくは、ｍｉＲＮＡに相補的である。ｍｉＲＮＡは、転写後遺伝子調節の役割を有する短い非コードＲＮＡであり、通常、２１～２３ヌクレオチド長であるが、２０～２５ヌクレオチド長などの１８～３０ヌクレオチド長であり得る。

検出される分子がポリヌクレオチドである場合、分子結合領域は、標的ポリヌクレオチドの相補体と、少なくとも９７％、９８％、又は９９％など、９０％以上同一である配列を含み得る。そのような分子結合領域では、相補体中の１つ以上、例えば２、３、４、又は５つのヌクレオチドは、標的ポリペプチド中の対応するヌクレオチドと塩基対形成し得る非正準ヌクレオチドで置き換えられ得る。好ましくは、分子結合領域は、標的ポリヌクレオチドの相補体を含む。

一実施形態では、分子結合領域は、抗体、抗体断片、ナノボディ、又はアフィボディである。本明細書で使用される「抗体」という用語は、全抗体（２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む）、並びにその抗原結合断片に関し得る。抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片、並びにｓｃＦｖが含まれ得るが、これらに限定されない。ナノボディは、Ｖ_ＨＨ断片又はＶ_ＮＡＲ断片などの単一ドメイン抗体である。アフィボディは、アミノ酸配列及び潜在的な抗原結合の大きな多様性を可能にする、３つのヘリックスのうちの２つ上にアミノ酸置換を有する３つのヘリックス足場ドメインを含む抗体模倣物である。アフィボディは、Ｆｒｅｊｄ，Ｆｒｅｄｒｉｋ Ｙ．、及びＫｙｕ－Ｔａｅ Ｋｉｍ．（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４９．３（２０１７）：ｅ３０６－ｅ３０６）及びＬｏｌｏｍ，Ｊｏｈｎ，ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５８４．１２（２０１０）： ２６７０－２６８０）において考察されている。好適な抗体、抗体断片、ナノボディ、及びアフィボディは、当該技術分野で既知であるか、又は標準的な方法によって調製され得る。

ポリペプチドを結合する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｇｕｉｍａｒａｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８．９（２０１３）：１７８７、Ｔｈｅｉｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８．９（２０１３）：１８００、及びＫｏｕｓｓａ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６７．２（２０１４）：１３４－１４１に記載されているように、ソルターゼ媒介反応を使用したタンパク質の部位特異的なＣ末端、Ｎ末端、又は内部ループ標識を使用が使用され得、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、好適な技術を利用して、抗体などのタンパク質を担体に組み込むことができる。

検出される分子に特異的な分子結合領域は、無関係の分子に結合するよりも高い親和性で、その意図する標的分子（それが検出することを意図する分子）に結合することができる。検出される分子がタンパク質である場合、無関係の分子は、ウシ血清アルブミンなどの無関係の対照タンパク質であり得る。無関係の分子は、検出される分子がポリヌクレオチドである場合、スクランブルされた対照ポリヌクレオチド（例えば、意図された標的分子と同じ数及びタイプのヌクレオチドを有するランダムポリヌクレオチド配列）であり得る。検出される分子は、好ましくは、対照よりも少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、又は少なくとも１０００倍大きい親和性で分子結合領域に結合する。親和性は、当該技術分野で既知の方法によって判定され得る。例えば、親和性は、ＥＬＩＳＡアッセイ、生体層干渉法、表面プラズモン共鳴、速度論的方法、又は平衡／溶液法によって判定され得る。当業者は、どの分子が分子結合領域に特異的に結合するかを認識するであろう。

いくつかの交差反応性は、例えば、意図される標的ｍｉＲＮＡ分子と同様の配列を有するｍｉＲＮＡポリヌクレオチド、又は密接に関連するドメインを共有するタンパク質とで生じ得る。好ましくは、分子結合領域は、その標的分子に、より高い親和性、例えば、関連するポリヌクレオチドなど、例えば、同様の配列を有するｍｉＲＮＡポリヌクレオチド、又は相同体などの関連タンパク質などの関連する分子よりも少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、又は少なくとも１０００倍大きい親和性で結合する。

スペーサー
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、担体は、スペーサーを含む。スペーサーは、好ましくは、結合したモータータンパク質と分子結合領域との間に位置付けされる。モータータンパク質がスペーサーと相互作用する場合、ポア内の担体の移動が失速する（又は、言い換えれば、遅延（ｓｌｏｗｅｄ）又は遅延（ｄｅｌａｙｅｄ）する）。スペーサーは、より好ましくは、分子結合領域に直接隣接して位置付けされる。担体が検出器内で移動するとき、モータータンパク質の移動は、分子結合領域がポアと相互作用する前に、スペーサーによって失速される。モータータンパク質がスペーサーで失速した場合、スペーサーを含まない同様の担体と比較して、分子が分子結合領域に結合している場合、誇張された光学的又は電気的シグナルが生成され得る。識別子領域が分子結合領域から分離されている場合、スペーサーは、好ましくは、識別子領域と分子結合領域との間で担体に配置される。

担体が検出器を通って移動するとき、例えば、担体がナノポアに対して移動するとき、モータータンパク質がスペーサーに遭遇するとき、特有の電気的又は光学的シグナルが生成される。例えば、結合したモータータンパク質と分子結合領域との間に位置付けされたスペーサーは、分子結合領域が検出器と相互作用するときに生成されるシグナルが明確に特定されることを可能にする特有のシグナルとして機能し得、例えば、担体がナノポア内を移動するときに生成されるシグナル／トレース／不規則な曲線で配置される。したがって、スペーサーは、分子結合領域が検出器内で移動するときに生成されるシグナルの位置を決めるためのマーカーとして使用され得、分子結合領域に特異的に結合した分子の存在又は不在の判定を容易にする。

スペーサーは、モータータンパク質の移動を妨げるエネルギー障壁を提供し得る。例えば、スペーサーは、ポリヌクレオチド上のモータータンパク質の牽引を減少させることによってモータータンパク質を失速させ得る。これは、例えば、脱塩基スペーサー、すなわち、塩基が担体中の１つ以上のヌクレオチドから除去されたスペーサーを使用することによって達成され得る。

スペーサーは、例えば、嵩高い化学基を導入してモータータンパク質の移動を物理的に妨げることによって、モータータンパク質の移動を物理的にブロックすることができる。スペーサーは、ポリヌクレオチドの二本鎖領域であり得る。

スペーサーは、典型的には、ポリマーなどの線状分子を含み得る。典型的には、線状スペーサーは、標的ポリヌクレオチドとは異なる構造を有する。例えば、標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである場合、スペーサー又は各スペーサーは、典型的には、ＤＮＡを含まない。特に、標的ポリヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、スペーサー又は各スペーサーは、好ましくは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、又はヌクレオチド側鎖を有する合成ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１つ以上のニトロインドール、１つ以上のイノシン、１つ以上のアクリジン、１つ以上の２－アミノプリン、１つ以上の２－６－ジアミノプリン、１つ以上の５－ブロモ－デオキシウリジン、１つ以上の逆位チミジン（逆位ｄＴ）、１つ以上の逆位ジデオキシ－チミジン（ｄｄＴ）、１つ以上のジデオキシ－シチジン（ｄｄＣ）、１つ以上の５－メチルシチジン、１つ以上の５－ヒドロキシメチルシチジン、１つ以上の２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、１つ以上のイソ－デオキシシチジン（Ｉｓｏ－ｄＣ）、１つ以上のイソ－デオキシグアノシン（Ｉｓｏ－ｄＧ）、１つ以上のＣ３（ＯＣ_３Ｈ_６ＯＰＯ_３）基、１つ以上の光切断可能な（ＰＣ）［ＯＣ_３Ｈ_６－Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_３ＮＯ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）ＯＰＯ_３］基、１つ以上のヘキサンジオール基、１つ以上のスペーサー９（ｉＳｐ９）［（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_３ＯＰＯ_３］基、若しくは１つ以上のスペーサー１８（ｉＳｐ１８）［（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_６ＯＰＯ_３］基、又は１つ以上のチオール結合を含み得る。スペーサーは、これらの基の任意の組み合わせを含み得る。これらの基の多くは、ＩＤＴ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））から市販されている。例えば、Ｃ３、ｉＳｐ９、及びｉＳｐ１８スペーサーは、全てＩＤＴ（登録商標）から入手可能である。スペーサーは、スペーサー単位として任意の数の上の基を含み得る。

いくつかの実施形態では、スペーサーは、モータータンパク質を失速させる１つ以上の化学基を含み得る。いくつかの実施形態では、好適な化学基は、１つ以上のペンダント化学基である。１つ以上の化学基は、担体における１つ以上の核酸塩基に結合され得る。１つ以上の化学基は、担体の骨格に結合され得る。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上などの任意の数の適切な化学基が存在し得る。好適な基としては、限定されないが、フルオロフォア、ストレプトアビジン及び／又はビオチン、コレステロール、メチレンブルー、ジニトロフェノール（ＤＮＰｓ）、ジゴキシゲニン及び／又は抗ジゴキシゲニン、並びにジベンジルシクロオクチン基が挙げられる。いくつかの実施形態では、スペーサーはポリマーを含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ポリペプチド又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるポリマーを含み得る。

いくつかの実施形態では、スペーサーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の脱塩基ヌクレオチドなどの、１つ以上の脱塩基ヌクレオチド（すなわち、核酸塩基を欠くヌクレオチド）を含み得る。核酸塩基は、脱塩基ヌクレオチドにおける－Ｈ（ｉｄＳｐ）又は－ＯＨによって置き換えられ得る。脱塩基スペーサーは、１つ以上の隣接するヌクレオチドから核酸塩基を除去することによって、標的ポリヌクレオチドに挿入され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、３－メチルアデニン、７－メチルグアニン、１，Ｎ６－エテノアデニンイノシン、又はヒポキサンチンを含むように修飾され得、核酸塩基は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）を使用してこれらのヌクレオチドから除去され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、ウラシル、及びウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼＵＤＧ）で除去された核酸塩基を含むように修飾され得る。一実施形態では、１つ以上のスペーサーは、いかなる脱塩基ヌクレオチドも含まない。

１つ以上のスペーサーが、単体の他の場所に存在し得る。スペーサーは、任意の好適な数のスペーサーを含み得る。例えば、担体は、１～約２０個のスペーサーなど、２つ以上、３つ以上、又は５つ以上のスペーサー、例えば、１～約１０個のスペーサーを含み得る。

失速領域
いくつかの実施形態では、担体は、失速領域を含む。担体の失速領域は、担体が溶液中にあるとき（すなわち、ポアと接触し、ポア内で移動する前に）、モータータンパク質が担体上に局在する位置を提供する。失速領域は、典型的には、リーダー領域と識別子領域との間に存在する。これにより、リーダーは、ポアへの通り抜けなど、検出器と相互作用することができる。また、それは、担体と検出器との相互作用時に、検出器、例えば、ポアを通る識別子領域の移動を制御することができるように、担体上にモータータンパク質を位置付けする。

いくつかの実施形態では、失速領域は、本明細書及びＷＯ２０２０／２３４６１２に記載のスペーサーである。担体は、モータータンパク質がスペーサーから離れるのを防ぐブロッキング部分を更に含み得る。

ブロッキング部分は、典型的には、モータータンパク質が生来ポリヌクレオチドを処理する方向とは反対の方向へのモータータンパク質の移動を阻止する部分である。例えば、モータータンパク質がポリヌクレオチド鎖を自然に５’から３’の方向に処理する場合、好適なブロッキング部分は、モータータンパク質が３’から５’の方向に移動するのを阻止する部分であり得る。同様に、モータータンパク質がポリヌクレオチド鎖を自然に３’から５’の方向に処理する場合、好適なブロッキング部分は、モータータンパク質が５’から３’の方向に移動するのを阻止する部分であり得る。

ブロッキング部分は、典型的には、モータータンパク質がスペーサーから離れる移動を阻止するために担体に結合している。モータータンパク質がスペーサーから離れるのを阻止することは、立体ブロックを提供してモータータンパク質の移動を物理的に阻止することによって達成され得る。モータータンパク質がスペーサーから離れて移動するのを阻止することは、化学的ブロッキング部分であって、モータータンパク質がその上で又はそれを越えて移動することができない、化学的ブロッキング部分を使用することによって達成することができる。いくつかの実施形態では、ブロッキング部分は、本明細書において考察されるスペーサー基のうちの１つ以上を含む。他の実施形態では、ブロッキング部分は、ポリヌクレオチド鎖を含み得る。

担体はまた、失速領域又はスペーサーに接続されたローディング部位を含み得る。ローディング部位は、モータータンパク質をポリヌクレオチドアダプターにロードするための部位である。好適なローディング部位は、ＷＯ２０２０／２３４６１２により詳細に記載されている。

モータータンパク質をポリヌクレオチド上にロードし、溶液中でポリヌクレオチド上のモータータンパク質を失速させる方法、好適なスペーサー、及び好適なブロッキング部分は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０／２３４６１２、及び参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１３５８３８においてより詳細に記載されている。

アンカー
いくつかの実施形態では、担体は、担体に結合された膜アンカー又は膜貫通ポアアンカーを含む。アンカーは、担体に共有結合で、又は非共有結合で結合され得る。例えば、アンカーは、担体のポリヌクレオチド領域にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドに結合され得る。アンカーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる担体のポリヌクレオチド領域は、分子の分子結合領域への特異的結合を妨げないという意味で、分子結合領域とは異なる。

いくつかの実施形態では、アンカーは、本明細書に開示の方法に従って標的ポリヌクレオチドの特徴付けを助ける。例えば、担体を膜貫通ポアと接触させることを含む方法では、膜アンカー又は膜貫通ポアアンカーは、膜貫通ポアの周りでの選択された担体の局在化を容易にし得る。アンカー及びテザーという用語は、本明細書で互換的に使用される。

アンカーは、膜に挿入することができるポリペプチドアンカー及び／又は疎水性アンカーであり得る。一実施形態では、疎水性アンカーは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ、ポリペプチド、タンパク質、又はアミノ酸、例えば、コレステロール、パルミテート、又はトコフェロールである。アンカーは、チオール、ビオチン、又は界面活性剤を含み得る。一態様では、アンカーは、ビオチン（ストレプトアビジンに結合するため）、アミロース（マルトース結合タンパク質又は融合タンパク質に結合するため）、Ｎｉ－ＮＴＡ（ポリ－ヒスチジン又はポリ－ヒスチジンタグ付きタンパク質に結合するため）、又はペプチド（抗原など）であり得る。

一実施形態では、アンカーは、１つのリンカー、又は２つ、３つ、４つ以上のリンカーを含む。好ましいリンカーとしては、限定されないが、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖、及びポリペプチドなどのポリマーが挙げられる。これらのリンカーは、線状、分岐状、又は環式であり得る。例えば、リンカーは、環式ポリヌクレオチドであり得る。アダプターは、環式ポリヌクレオチドリンカー上の相補配列にハイブリダイズすることができる。１つ以上のアンカー又は１つ以上のリンカーは、制限部位又は光解離性基などの、切断又は分解され得る成分を含み得る。リンカーは、タンパク質中のシステイン残基に結合するためにマレイミド基で官能化され得る。好適なリンカーは、ＷＯ２０１０／０８６６０２に記載されている。

一実施形態では、アンカーは、コレステロール又は脂肪アシル鎖である。例えば、ヘキサデカン酸などの６～３０個の炭素原子の長さを有する任意の脂肪アシル鎖が使用され得る。好適なアンカー、及びアンカーをアダプターに結合する方法の例は、ＷＯ２０１２／１６４２７０及びＷＯ２０１５／１５０７８６に開示されている。同じ方法を使用して、アンカーを担体に結合することができる。

検出器
任意の好適な検出器が、本明細書に記載の方法において使用され得る。検出器は、配列決定方法に有用な任意の検出器であり得る。例えば、ナノポア配列決定又は単一分子リアルタイム配列決定、例えば、合成による配列決定、技術。好ましくは、本明細書で使用される方法における検出器は、ナノポアである。任意の好適なナノポアが、本明細書に記載の方法において使用され得る。一実施形態では、ナノポアは、膜貫通ポアである。

膜貫通ポアは、膜をある程度横切る構造である。それは、印加された電位によって駆動される水和イオンが膜を横切って又は膜内を流れることを可能にする。膜貫通ポアは、典型的には、水和イオンが膜の一方の側から膜の他方の側に流れることができるように、膜全体を横切る。しかしながら、膜貫通ポアは、膜を横切る必要はない。それは一端で閉鎖されている場合もある。例えば、ポアは、膜内のウェル、ギャップ、チャネル、トレンチ、又はスリットであり得、それに沿って又はその中に水和イオンが流れることができる。

任意の膜貫通ポアが本明細書に提供される方法で使用され得る。ポアは、生物学的であっても人工であってもよい。好適なポアには、タンパク質ポア、ポリヌクレオチドポア、及び固体ポアが含まれるが、これらに限定されない。ポアは、ＤＮＡ折り紙ポアであり得る（Ｌａｎｇｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２；３３８： ９３２－９３６）。好適なＤＮＡ折り紙ポアは、ＷＯ２０１３／０８３９８３、ＷＯ２０１８／０１１６０３、及びＷＯ２０２０／０２５９７４に開示されている。

一実施形態では、ナノポアは、膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、ポリヌクレオチドなどの、水和イオンが膜の一方の側から膜の他方の側に流れることを可能にする、ポリペプチド又はポリペプチドの集合体である。本明細書に提供される方法では、膜貫通タンパク質ポアは、印加電位によって駆動される水和イオンが膜の片側から反対側に流れることを可能にするポアを形成することができる。膜貫通タンパク質ポアは、好ましくは、ポリヌクレオチドが、トリブロックコポリマー膜などの膜の一方の側から他方の側に流れることを可能にする。膜貫通タンパク質ポアは、ポリヌクレオチドがポアを通って移動することを可能にする。

一実施形態では、ナノポアは、モノマー又はオリゴマーである膜貫通タンパク質ポアである。ポアは、好ましくは、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、又は少なくとも１６のサブユニットなどのいくつかの繰り返しサブユニットから構成されている。ポアは、好ましくは、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマ－、又はナノマーポアである。ポアは、ホモオリゴマー又はヘテロオリゴマーであり得る。

一実施形態では、膜貫通タンパク質ポアは、イオンが通って流れることができるバレル又はチャネルを含む。ポアのサブユニットは、典型的には、中心軸を取り囲み、鎖を膜貫通βバレル若しくはチャネル又は膜貫通α－ヘリックスバンドル若しくはチャネルに寄与する。

典型的には、膜貫通タンパク質ポアのバレル又はチャネルは、標的ポリヌクレオチド（本明細書に記載のもの）などの分析物との相互作用を促進するアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、好ましくは、バレル又はチャネルの狭窄部付近に位置する。膜貫通タンパク質ポアは、典型的には、アルギニン、リジン、若しくはヒスチジンなどの１つ以上の正電荷アミノ酸、又はチロシン若しくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、典型的には、ポアと、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は核酸との間の相互作用を促進する。

一実施形態では、ナノポアは、β－バレルポア又はα－ヘリックス束ポアに由来する膜貫通タンパク質ポアである。β－バレルポアは、β鎖から形成されるバレル又はチャネルを含む。好適なβ－バレルポアは、α－溶血毒、炭疽毒素、及びロイコシジンなどβ－毒素、並びにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓポリン（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、又はＭｓｐＤ、ＣｓｇＧ、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａオートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）など細菌の外膜タンパク質／ポリン、並びにリセニンなど他のポアを含むが、これらに限定されない。α－ヘリックスバンドルポアは、α－ヘリックスから形成されるバレル又はチャネルを含む。好適なα－ヘリックスバンドルポアは、内膜タンパク質及びα外膜タンパク質、例えばＷＺＡ及びＣｌｙＡ毒素を含むが、これらに限定されない。

一実施形態では、ナノポアは、Ｍｓｐ、α－溶血素（α－ＨＬ）、リセニン、ＣｓｇＧ、ＣｌｙＡ、Ｓｐ１、若しくは溶血性タンパク質フラガセアトキシンＣ（ＦｒａＣ）に由来するか、又はそれらに基づく膜貫通ポアである。

一実施形態では、ナノポアは、ＣｓｇＧ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｋ－１２亜株ＭＣ４１００由来のＣｓｇＧに由来する。そのようなポアはオリゴマーであり、典型的には、ＣｓｇＧに由来する７、８、９、又は１０個のモノマーを含む。ポアは、同一のモノマーを含むＣｓｇＧに由来するホモオリゴマーポアであり得る。代替的に、ポアは、他とは異なる少なくとも１つのモノマーを含むＣｓｇＧに由来するヘテロオリゴマーポアであり得る。ＣｓｇＧに由来する好適なポアの例は、例えば、ＷＯ２０１６／０３４５９１、ＷＯ２０１７／１４９３１６、ＷＯ２０１７／１４９３１７、ＷＯ２０１７／１４９３１８、ＷＯ２０１８／２１１２４１、及びＷＯ２０１９／００２８９３に開示されている。

一実施形態では、ナノポアは、リセニンに由来する膜貫通ポアである。ライセニンに由来する好適なポアの例は、ＷＯ２０１３／１５３３５９に開示されている。

一実施形態では、ナノポアは、α－溶血素（α－ＨＬ）に由来するか、又はそれに基づく膜貫通ポアである。野生型α－ヘモリジンポアは、７つの同一のモノマー又はサブユニットで形成される（すなわち、七量体である）。α－ヘモリジンポアは、α－ヘモリジン－ＮＮ又はそのバリアントであり得る。バリアントは、好ましくは、Ｅ１１１位及びＫ１４７位にＮ残基を含む。

一実施形態では、ナノポアは、Ｍｓｐに由来する、例えば、ＭｓｐＡに由来する膜貫通タンパク質ポアである。ＭｓｐＡに由来する好適なポアの例は、ＷＯ２０１２／１０７７７８に開示されている。

一実施形態では、ナノポアは、ＣｌｙＡに由来するか、又はそれに基づく膜貫通ポアである。ＣｌｙＡ に由来する好適なポアの例は、ＷＯ２０１４／１５３６２５に開示されている。

一実施形態では、検出器は、ナノピペットである。ナノピペットは、典型的には、約１０ｎｍ～約１２、約１５、約１８、又は約２０ｎｍなどの約１０ｎｍの直径を有する。ナノピペットは、石英毛細管、ガラス、及び／又は炭素、炭素層でコーティングされたそのようなガラスから作製され得る。好適なナノピペットは、当該技術分野で既知である。

膜
ナノポアの使用を含む実施形態では、ナノポアは、典型的には、膜内に存在し、例えば、ナノポアは、膜を横切り、及び／又は膜を通るチャネルを提供する。任意の好適な膜が使用され得、好適な膜は、当該技術分野で既知である。

膜は、好ましくは、両親媒性層である。両親媒性層は、親水性及び親油性の両方の特性を有するリン脂質などの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性分子は、合成であっても天然であってもよい。非天然両親媒性物質及び単層を形成する両親媒性物質は、当該技術分野で既知であり、例えば、ブロックコポリマーが挙げられる（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００９，２５，１０４４７－１０４５０）。

ブロックコポリマーは、ジブロック（２つのモノマーサブユニットからなる）であり得るが、また、２つ超のモノマーサブユニットから構築されて、両親媒性物質として挙動する、より複雑な配置を形成することができる。コポリマーは、トリブロック、テトラブロック、又はペンタブロックコポリマーであり得る。膜は、好ましくは、トリブロックコポリマー膜である。

膜は、例えば、国際出願第２０１４／０６４４４３号又は同第２０１４／０６４４４４号に開示されている膜のうちの１つであり得る。

両親媒性分子は、アンカーのカップリングを容易にするように化学修飾又は官能化され得る。両親媒性層は、単層又は二重層であり得る。両親媒性層は、典型的には、平面である。両親媒性層は、湾曲していてもよい。両親媒性層は、支持されていてもよい。

両親媒性膜は、典型的には、天然に可動性であり、本質的には、およそ１０^－８ｃｍｓ^－１の脂質拡散速度を有する二次元流体として作用する。これは、ポア及びアンカーされた担体が、典型的には、両親媒性膜内を移動することができることを意味する。

膜は、脂質二重層であり得る。脂質二重層は、任意の脂質二重層であり得る。好適な脂質二重層としては、限定されないが、平面脂質二重層、支持二重層又はリポソームが挙げられる。脂質二重層は、好ましくは、平面脂質二重層である。好適な脂質二重層は、ＷＯ２００８／１０２１２１、ＷＯ２００９／０７７７３４、及びＷＯ２００６／１００４８４に開示されている。

脂質二分子層は、ＷＯ２００９／０７７７３４に記載の乾燥脂質から形成され得る。脂質二分子層は、ＷＯ２００９／０７７７３４に記載の開口を横切って形成され得る。

脂質二重層を形成する任意の脂質組成物が使用され得る。脂質組成物は、表面電荷、膜タンパク質を支持する能力、充填密度、又は機械的特性などの必要な特性を有する脂質二重層が形成されるように選択される。脂質組成物は、１つ以上の異なる脂質を含み得る。例えば、脂質組成物は、最大１００個の脂質を含有し得る。脂質組成物は、好ましくは、１～１０個の脂質を含有する。脂質組成物は、天然脂質及び／又は人工脂質を含み得る。

膜は、固体層を含み得る。固体状態層は、限定されないが、マイクロエレクトロニクス材料、Ｓｉ_３Ｎ_４、Ａ１_２Ｏ_３、及びＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機及び無機ポリマー、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）などのプラスチック、又は２成分付加硬化シリコーンゴムなどのエラストマー、並びにガラスを含む、有機及び無機材料の両方から形成され得る。固体状態層は、グラフェンから形成され得る。好適なグラフェン層は、ＷＯ２００９／０３５６４７に開示されている。膜が固体状態層を含む場合、ポアは、典型的には、固体状態層内に含有される両親媒性膜又は層に、例えば、固体状態層内の穴、ウェル、ギャップ、チャネル、トレンチ、又はスリット内に存在する。当業者は、好適な固体状態／両親媒性ハイブリッド系を調製することができる。好適な系は、ＷＯ２００９／０２０６８２及びＷＯ２０１２／００５８５７に開示されている。上述の両親媒性膜又は層のうちのいずれかが使用され得る。

本明細書に開示の方法は、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然に生じる脂質二分子層を使用して実行され得る。人工両親媒性層は、典型的には人工トリブロックコポリマー層である。層は、ポアに加えて、他の膜貫通タンパク質及び／又は膜内タンパク質、並びに他の分子を含み得る。好適な装置及び条件は、以下に考察される。本開示の方法は、典型的には、インビトロで実行される。

特徴付け
本開示の方法は、本明細書により詳細に記載されるように、担体の識別子領域を特徴付けることと、分子が分子結合領域に結合しているか否かを判定することと、を含む。

特徴付け及び分子が分子結合領域に結合しているか否かの判定は、任意の好適な検出器システムを使用して実行され得る。特徴付け、及び分子が分子結合領域に結合しているか否かの判定は、例えば、ポアが膜に挿入されている膜／ポア系を調査するのに好適な任意の装置を使用して実行され得る。この方法は、膜貫通ポアセンシングに好適な任意の装置を用いて実施してもよい。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバと、チャンバを２つの区画に分離する障壁と、を備え得る。障壁は、膜貫通ポアを含有する膜が形成される開口を有し得る。膜貫通ポアが、本明細書に記載されている。

特徴付け方法は、ＷＯ２００８／１０２１２０、ＷＯ２０１０／１２２２９３、又はＷＯ２０００／０２８３１２に記載の装置を使用して実行され得る。

特徴付け方法は、担体が検出器、例えばナノポア内を移動するとき、１つ以上の光学的又は電気的測定を行うことを含み得る。電気的測定は、典型的には、電流の測定によって、ポアを通るイオン電流の流れを測定することであり得る。可能な電気的測定には、電流測定、インピーダンス測定、トンネル又は電子トンネル測定（Ｉｖａｎｏｖ ＡＰ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１１ Ｊａｎ １２；１ ｌ（ｌ）：２７９－８５）、及びＦＥＴ測定（国際出願第２００５／１２４８８８号）、例えば、電圧ＦＥＴ測定が含まれる。いくつかの実施形態では、シグナルは、固体ナノポアを横断する電子トンネル又は固体ナノポアを横断する電圧ＦＥＴ測定であり得る。

代替的に、ポアを通るイオンの流れは、Ｈｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９ Ｖｏｌ．１３１，Ｎｏ．５，２００９によって開示されるように、光学的に測定され得る。ナノポアを使用した光学ポリマー配列決定のための方法は、ＷＯ２０１６／００９１８０に記載されている。

したがって、装置はまた、電位を印加し、膜及びポアを横切る電気的シグナルを測定することが可能な、電気回路を備え得る。特徴付け方法は、パッチクランプ又は電圧クランプを使用して実行され得る。特徴付け方法は、好ましくは、電圧クランプの使用を含む。

特徴付け方法は、各アレイが、１２８、２５６、５１２、１０２４、２０００、３０００、４０００、６０００、１００００、１２０００、１５０００個以上のウェルを備える、ウェルのシリコンに基づくアレイで実行され得る。

特徴付け方法は、ポアを通って流れる電流の測定を含み得る。本方法は、典型的には、膜及びポアを横切って印加される電圧を用いて実行される。使用される電圧は、典型的には、＋２Ｖ～－２Ｖ、典型的には、－４００ｍＶ～＋４００ｍＶである。使用される電圧は、好ましくは、－４００ｍＶ、－３００ｍＶ、－２００ｍＶ、－１５０ｍＶ、－１００ｍＶ、－５０ｍＶ、－２０ｍＶ、及び０ｍＶから選択される下限並びに＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶ、及び＋４００ｍＶから独立して選択される上限を有する範囲にある。使用される電圧は、より好ましくは、１００ｍＶ～２４０ｍＶの範囲、最も好ましくは、１２０ｍＶ～２２０ｍＶの範囲にある。増加した印加電位を使用することによって、ポアによる異なるヌクレオチド間の区別を増加させることが可能である。

特徴付け方法は、典型的には、例えば、アルカリ金属塩、ハロゲン化物塩などの金属塩、例えば、アルカリ金属塩化物塩などの塩化物塩などの任意の電荷担体の存在下で実行される。電荷担体としては、イオン性液体又は有機塩、例えば、テトラメチルアンモニウムクロリド、トリメチルフェニルアンモニウムクロリド、フェニルトリメチルアンモニウムクロリド、又は１－エチル－３－メチルイミダゾリウムクロリドを挙げることができる。上述の例示的な装置では、塩は、チャンバ内の水溶液中に存在する。典型的には、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、又は塩化セシウム（ＣｓＣｌ）が使用される。ＫＣｌが、好ましい。塩は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）などのアルカリ土類金属塩であり得る。塩濃度は、飽和であり得る。塩濃度は、３Ｍ以下であってもよく、典型的には、０．１～２．５Ｍ、０．３～１．９Ｍ、０．５～１．８Ｍ、０．７～１．７Ｍ、０．９～１．６Ｍ、又は１Ｍ～１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは、１５０ｍＭ～１Ｍである。特徴付け方法は、好ましくは、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍ、又は少なくとも３．０Ｍなどの、少なくとも０．３Ｍの塩濃度を使用して実行される。高い塩濃度は、高いシグナル対ノイズ比を提供し、結合／非結合を示す電流が正常な電流変動のバックグラウンドに対して特定されることを可能にする。

特徴付け方法は、典型的には、緩衝液の存在下で実行される。上述の例示的な装置では、緩衝剤は、チャンバ内の水溶液中に存在する。任意の好適な緩衝液が使用され得る。典型的には、緩衝液は、ＨＥＰＥＳである。別の好適な緩衝液は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液である。本方法は、典型的には、４．０～１２．０、４．５～１０．０、５．０～９．０、５．５～８．８、６．０～８．７、又は７．０～８．８、又は７．５～８．５のｐＨで実行される。使用されるｐＨは、好ましくは、約７．５である。

特徴付け方法は、０℃～１００℃、１５℃～９５℃、１６℃～９０℃、１７℃～８５℃、１８℃～８０℃、１９℃～７０℃、又は２０℃～６０℃で実施され得る。特徴付け方法は、典型的には、室温で実行され得る。特徴付け方法は、任意選択で、酵素機能を支持する温度、例えば、約３７℃で実行される。

担体、担体の集団、キット、及びシステム
担体、担体の集団、キット、及びシステムもまた本明細書に提供される。

本開示の担体は、一本鎖リーダーと、識別子領域と、検出される分子に特異的な分子結合領域と、を含み、モータータンパク質が、一本鎖リーダーとポリヌクレオチド識別子との間の位置で担体に結合している。本明細書に記載のリーダー、識別子領域、分子結合領域、及びモータータンパク質は、考察される担体、担体の集団、キット、及びシステムの実施形態のうちのいずれかにおいて適用され得る。担体は、上述した追加の特色のうちのいずれかを更に含み得る。

複数の分子についての本明細書に記載の担体の集団もまた提供される。集団における異なる担体は、異なる識別子領域及び異なる分子結合領域を含み得る。例えば、集団における各担体は、固有の識別子領域及び固有の分子結合領域を含み得る。集団における各担体の複数のコピーが存在してもよい。言い換えれば、担体の分子結合領域に関連する識別子領域は、集団における異なる分子に結合する他の全ての分子結合領域に関連する識別子領域とは異なり得る。いくつかの実施形態では、担体の識別子領域は、異なる分子に結合する集団における他の担体の識別子領域とは異なる。

「に関連する」という用語は、識別子領域を使用して、同じ担体上の１つ以上の分子結合領域を固有に特定し得るように識別子領域及び１つ以上の分子結合領域が同じ担体上に存在することを意味する。典型的には、識別子領域は、分子結合領域が検出器と相互作用する前に、モータータンパク質の制御下で検出器と相互作用するように、担体において位置付けされる。識別子領域は、分子結合領域に直接隣接していてもよく、又はリンカーによって分離されていてもよい。リンカーは、典型的には、３～約２０などの２～約５０、好ましくは、約５～約１０塩基長である。リンカーは、本明細書に記載の任意のヌクレオチドを含み得る。１つ以上のスペーサーはまた、識別子領域とその関連する分子結合領域との間に位置付けられ得る。スペーサーは、スペーサーの片側又は両側にリンカーを有するか、又は有しないで存在し得る。

（ｉ）本明細書に記載の担体の集団と、（ｉｉ）モータータンパク質と、を含む、試料中の複数の分子を検出するためのキットもまた提供される。

（ｉ）本明細書に記載の担体の集団と、（ｉｉ）モータータンパク質と、（ｉｉｉ）膜貫通ポアと、を含む、試料中の複数の分子を検出するためのシステムが更に提供される。

キット又はシステムは、本明細書で定義されるように、２つ以上の担体の集団を含み得る。分子結合領域に関連する識別子領域に加えて、集団における各担体は、その集団における全ての担体に共通であり、キット又はシステムにおける任意の他の集団の担体には存在しない更なる識別子領域を含み得、すなわち、更なる識別子領域は、その集団の担体に固有である。したがって、キット又はシステムは、３、４、５つ以上などの２つ以上の担体集団、例えば、１０個以上、２０個以上、又は５０個以上の担体集団を含み得、各集団における担体は、その集団の担体に固有の更なる識別子領域を含み得る。そのようなキット又はシステムを使用して、複数の試料を同時に分析し得る。同じ検出器及び更なる識別子領域を使用して検出される試料の各々に存在する分子は、所与の分子がどの試料に存在するか、又は不在かを判定するために使用され得る。

定義
単数名詞を指すときに不定冠詞又は定冠詞、例えば、「ａ」又は「ａｎ」、「ｔｈｅ」が使用される場合、他のことが明記されない限り、これは、その名詞の複数形を含む。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、他の要素又はステップを除外しない。更に、明細書及び特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は、同様の要素を区別するために使用されており、必ずしも連続的又は経時的な順序について記載するために使用されているわけではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載の本発明の実施形態は、本明細書に記載又は例示される以外の順序で操作可能であることを理解されたい。以下の用語又は定義は、単に、本発明の理解を助けるために提供される。別途本明細書で具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての用語は、それらが本発明の技術分野の当業者にとってそうであるのと同じ意味を有する。開業医には、特に、当該技術分野の定義及び技術用語について、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４^ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １１４），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２０１６）を参照することを推奨する。本明細書に提供される定義は、当業者によって理解されるよりも小さい範囲を有すると解釈されるべきではない。

本明細書で使用される「約」は、量、持続時間などの測定可能な値を指す場合、特定の値から±２０％又は±１０％、より好ましくは、±５％、更により好ましくは、±１％、なおより好ましくは、±０．１％の変動を包含することを意味するが、そのような変動は、開示の方法を実施するのに適切である。

本明細書で使用される「ヌクレオチド配列」、「ＤＮＡ配列」、又は「核酸分子」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、並びにＲＮＡを含む。本明細書で使用される「核酸」という用語は、各ヌクレオチド上の３’末端及び５’末端が、ホスホジエステル結合によって連結されている、一本鎖又は二本鎖の共有結合したヌクレオチド配列である。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基又はリボヌクレオチド塩基で構成され得る。核酸は、インビトロで合成によって製造され得るか、又は天然源から単離され得る。核酸としては、修飾されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ、例えば、メチル化されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は翻訳後修飾、例えば、７－メチルグアノシンによる５’－キャッピング、切断及びポリアデニル化などの３’－処理、並びにスプライシングを受けたＲＮＡを更に挙げることができる。核酸としてはまた、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）などの合成核酸（ＸＮＡ）を挙げることができる。また、本明細書で「ポリヌクレオチド」とも称される核酸のサイズは、典型的には、二本鎖ポリヌクレオチドについては塩基対（ｂｐ）の数として、又は一本鎖ポリヌクレオチドの場合にはヌクレオチド（ｎｔ）の数として表される。１０００ｂｐ又はｎｔは、キロベース（ｋｂ）に等しい。約４０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチドは、典型的には、「オリゴヌクレオチド」と呼ばれ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを介したＤＮＡの操作に使用するためのプライマーを含み得る。

本開示の文脈における「アミノ酸」という用語は、その最も広い意味で使用され、各アミノ酸に特異的な側鎖（例えば、Ｒ基）とともに、アミン（ＮＨ_２）官能基及びカルボキシル（ＣＯＯＨ）官能基を含有する有機化合物を含むことを意味する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然Ｌα－アミノ酸又は残基を指す。天然に生じるアミノ酸について一般的に使用される１文字及び３文字の略語が、本明細書で使用される：Ａ＝Ａｌａ、Ｃ＝Ｃｙｓ、Ｄ＝Ａｓｐ、Ｅ＝Ｇｌｕ、Ｆ＝Ｐｈｅ、Ｇ＝Ｇｌｙ、Ｈ＝Ｈｉｓ、Ｉ＝Ｉｌｅ、Ｋ＝Ｌｙｓ、Ｌ＝Ｌｅｕ、Ｍ＝Ｍｅｔ、Ｎ＝Ａｓｎ、Ｐ＝Ｐｒｏ、Ｑ＝Ｇｌｎ、Ｒ＝Ａｒｇ、Ｓ＝Ｓｅｒ、Ｔ＝Ｔｈｒ、Ｖ＝Ｖａｌ、Ｗ＝Ｔｒｐ、及びＹ＝Ｔｙｒ（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ ｅｄ．，ｐｐ．７１－９２，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。「アミノ酸」という一般用語は、更に、Ｄ－アミノ酸、レトロ－インベルソアミノ酸、並びにアミノ酸類似体などの化学修飾されたアミノ酸、ノルロイシンなどのタンパク質に通常組み込まれない天然アミノ酸、及びβ－アミノ酸などのアミノ酸に特徴的であることが当該技術分野で既知の特性を有する化学合成された化合物を含む。例えば、天然のＰｈｅ又はＰｒｏと同じペプチド化合物の立体構造制限を可能にするフェニルアラニン又はプロリンの類似体又は模倣体は、アミノ酸の定義内に含まれる。そのような類似体及び模倣物は、本明細書では、それぞれのアミノ酸の「機能的等価物」と称される。アミノ酸の他の例は、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ｖｏｌ．５ ｐ．３４１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．１９８３によって列挙されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。

「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、アミノ酸残基のポリマー、並びにそのバリアント及び合成類似体を指すために本明細書で交換可能に使用される。したがって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の化学類似体などの合成非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマーに適用される。ポリペプチドはまた、限定されないが、グリコシル化、タンパク質分解性切断、脂質化、シグナルペプチド切断、プロペプチド切断、リン酸化などを挙げることができる、成熟又は翻訳後修飾プロセスを受け得る。ペプチドは、組換え技法を使用して、例えば、組換え又は合成ポリヌクレオチドの発現を通じて作製され得る。組換え生成されたペプチドは、典型的には、培養培地を実質的に含まず、例えば、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは、約１０％未満、最も好ましくは、約５％未満に相当する。

「タンパク質」という用語は、二次構造又は三次構造を有する折り畳まれたポリペプチドについて記載するために使用される。タンパク質は、単一のポリペプチドから構成され得るか、又は集合して多量体を形成する複数のポリペプチドを含み得る。多量体は、ホモオリゴマー、又はヘテロオリゴマーであり得る。タンパク質は、天然タンパク質若しくは野生型タンパク質、又は修飾されたタンパク質若しくは非天然タンパク質であり得る。タンパク質は、例えば、１つ以上のアミノ酸の付加、置換、又は欠失によって、野生型タンパク質とは異なり得る。

タンパク質の「バリアント」は、問題の未修飾又は野生型タンパク質と比較して、アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を有し、それらが由来する未修飾タンパク質と同様の生物学的及び機能的活性を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、及び酵素を包含する。本明細書で使用される「アミノ酸同一性」という用語は、配列が、比較枠にわたってアミノ酸ごとに同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適に整列された配列を比較枠にわたって比較し、同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、及びＭｅｔ）が両方の配列に現れる位置の数を判定して、一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較枠（すなわち、枠サイズ）における位置の総数で除算し、その結果に１００を乗算することによって計算して、配列同一性のパーセンテージが得られる。

本発明の全ての態様及び実施形態では、「バリアント」は、対応する野生型タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の完全配列同一性を有する。配列同一性はまた、全長ポリヌクレオチド又はポリペプチドの断片又は部分に対するものであり得る。したがって、配列は、全長参照配列と５０％のみの全体的な配列同一性を有し得るが、特定の領域、ドメイン、又はサブユニットの配列は、参照配列と８０％、９０％、又は９９％もの配列同一性を共有し得る。

「野生型」という用語は、天然源から単離された遺伝子又は遺伝子生成物を指す。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に観察される遺伝子であり、したがって、遺伝子の「正常」又は「野生型」形態を任意に設計される。対照的に、「修飾された」、「変異体」、又は「バリアント」という用語は、野生型遺伝子又は遺伝子生成物と比較した場合、配列における修飾（例えば、置換、切断、又は挿入）、翻訳後修飾、及び／又は機能的特性（例えば、変化した特徴）を示す遺伝子又は遺伝子生成物を指す。天然に存在する変異体を単離することができることに留意されたく、これらは、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較して改変された特徴を有するという事実によって特定される。天然アミノ酸を導入又は置換するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、メチオニン（Ｍ）は、変異体モノマーをコードするポリヌクレオチドにおける関連する位置でメチオニンのコドン（ＡＴＧ）をアルギニンのコドン（ＣＧＴ）で置き換えることによって、アルギニン（Ｒ）で置換され得る。非天然アミノ酸を導入又は置換するための方法もまた、当該技術分野で周知である。例えば、非天然アミノ酸は、変異体モノマーを発現するために使用されるＩＶＴＴ系に合成アミノアシル－ｔＲＮＡを含めることによって導入され得る。代替的に、それらは、特定のアミノ酸の合成（すなわち、天然に存在しない）類似体の存在下で、それらの特定のアミノ酸に対して栄養要求性であるＥ．ｃｏｌｉ中で変異体モノマーを発現させることによって導入され得る。それらはまた、変異体モノマーが部分的ペプチド合成を使用して生成される場合、裸のライゲーションによって生成され得る。保存的置換は、同様の化学構造、同様の化学的特性、又は同様の側鎖体積の他のアミノ酸でアミノ酸を置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えられるアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性、又は電荷を有し得る。あるいは、保存的置換は、既存の芳香族又は脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族又は脂肪族である別のアミノ酸を導入してもよい。保存的アミノ酸変化は、当該技術分野で周知であり、以下の表１に定義される２０個の主要なアミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が同様の極性を有する場合、これはまた、表２におけるアミノ酸側鎖についての疎水性スケールを参照することによって判定され得る。

本明細書においてより詳細に記載されるように、変異体又は修飾されたタンパク質、モノマー又はペプチドは、任意の方式及び任意の部位で化学修飾され得る。変異体又は修飾されたモノマー若しくはペプチドは、好ましくは、１つ以上のシステインへの分子の結合（システイン結合）、１つ以上のリジンへの分子の結合、１つ以上の非天然アミノ酸への分子の結合、エピトープの酵素修飾、又は末端の修飾によって化学修飾される。そのような修飾を実行するための好適な方法は、当該技術分野で周知である。修飾されたタンパク質、モノマー、又はペプチドの変異体は、任意の分子の結合によって化学修飾され得る。例えば、修飾されたタンパク質、モノマー、又はペプチドの変異体は、色素又はフルオロフォアの結合によって化学修飾され得る。

本発明は、特定の実施形態に関して、及び特定の図面を参照して説明されるが、本発明はそれに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲におけるいかなる参照符号も、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。無論、必ずしも全ての態様又は利点が本発明の任意の特定の実施形態に従って達成され得るわけではないことを理解されたい。したがって、例えば、当業者は、本発明が、本明細書で教示又は示唆され得る他の態様又は利点を必ずしも達成するのではなく、本明細書で教示される１つの利点又は利点の群を達成又は最適化する様式で具現化又は実行され得ることを認識するであろう。

本発明は、添付の図面と併せて閲読される場合、その特色及び利点と一緒に、構成及び操作する方法の両方に関して、以下の詳細な説明を参照することによって最も良好に理解され得る。本発明の態様及び利点は、以下に記載の実施形態から明らかになり、それらを参照して解明されるであろう。本明細書全体を通じて、「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」又は「一実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」への言及は、実施形態と併せて記載される特定の特色、構造、又は特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して様々な場所で「一実施形態では（ｉｎ ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」又は「一実施形態では（ｉｎ ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」という語句が出現した場合、必ずしも全て同じ実施形態を指すわけではないが、指す場合もある。同様に、本発明の例示的な実施形態の記載において、本発明の様々な特色は、開示を合理化し、様々な本発明の態様のうちの１つ以上の理解を助けることを目的として、単一の実施形態、図、又はその記載において一緒にグループ化されることがあることが理解されるべきである。しかしながら、開示のこの方法は、特許請求される発明が、各請求項に明示的に記載されているよりも多くの特色を必要とする意図を反映するものとして解釈されるものではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するように、本発明の態様は、単一の前述の開示の実施形態の全ての特色よりも少ない範囲にある。

本開示の「実施形態」は、別途文脈が示さない限り、具体的に一緒に組み合わせられ得ることが理解されるべきである。（別途文脈が暗示しない限り）全ての開示の実施形態の特定の組み合わせは、特許請求される本発明の更に開示された実施形態である。

加えて、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明らかに指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」への言及は、２つ以上のポリヌクレオチドを含み、「モータータンパク質」への言及は、２つ以上のそのようなタンパク質を含み、「ヘリカーゼ」への言及は、２つ以上のヘリカーゼを含み、「モノマー」への言及は、２つ以上のモノマーを指し、「ポア」への言及は、２つ以上のポアを含むなどである。

本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、上記又は下記にかかわらず、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明による方法の特定の実施形態、特定の構成、並びに材料及び／又は分子が、本明細書において考察されてきたが、形態及び詳細における様々な変更又は修正が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく行われ得ることが理解されるべきである。以下の実施例は、特定の実施形態をより良好に例示するために提供されており、本出願を限定するものとみなされるべきではない。本出願は、特許請求の範囲によってのみ限定される。

以下の実施例では、担体を２つの部分で合成し、その部分を一緒にライゲーションした。担体全体が、ライゲーションを必要とせずに単一の単位として合成され得ることも想定される。

実施例１
この例では、これまでに設計された担体のうちのいくつかについて説明する。提供された配列にはリーダーは含まれない。リーダーは、図２Ａに示すように、リーダー及びモータータンパク質の失速領域を含むポリヌクレオチドの３’末端に相補的な領域も含む、ライゲーションＣ鎖（例えば、ＣＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＴＡＧＧＡ）の使用を介して提供される配列に付加され得る。

提供される担体配列は、タンパク質（トロンビン及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質など）、神経伝達物質（セロトニン及びドーパミンなど）及びｍｉＲＮＡを含む分子に結合し得る。各担体の識別子領域は、他の全ての担体の担体とは異なる。同じ分子に結合する異なる担体上の異なる分子結合領域が、同じバーコードを使用する場合があることが予見される。

配列は、５’ライゲーション鎖と、識別子配列又はバーコード（下線）と、任意選択で、ｉＳｐＣ３又はｉＳｐ１８スペーサーを含むスペーサー領域と、分子結合領域（斜体）と、を含む。この例における分子結合領域は、アプタマー又はｍｉＲＮＡの相補的配列である。
トロンビン

セロトニン

ドーパミン

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、Ｓタンパク質

ｍｉＲＮＡ（バーコード１１～２０）
アダプター＿バーコード１１＿ｃ－ｈａｓ－ｍｉＲ－４９７－５ｐ

アダプター＿バーコード１２＿ｃ－ｈａｓ－ｍｉＲ－２７ｂ－５ｐ

アダプター＿バーコード１３＿ｃ－ｈａｓ－ｍｉＲ－２１－５ｐ

アダプター＿バーコード１４＿ｃ－ｈａｓ－ｍｉＲ－２２１－５ｐ

アダプター＿バーコード１５＿ｃ－ｈａｓ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ

アダプター＿バーコード１６＿ｃ－ｈａｓ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ

アダプター＿バーコード１７＿ｃ－ｈａｓ－ｍｉＲ－１３３ａ－５ｐ

アダプター＿バーコード１８＿ｃ－ｈａｓ－ｍｉＲ－２０８ａ－５ｐ

アダプター＿バーコード１９＿ｃ－ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ

アダプター＿バーコード２０＿ｃ－ｈａｓ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ

Ｃ３スペーサーなしのｍｉＲＮＡＳ（バーコード２１～２２）
アダプター＿バーコード２１＿ｃ－ｈａｓ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ

アダプター＿バーコード２２＿ｃ－ｈａｓ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ

実施例２
この実施例は、それらの固有のバーコードの配列決定及び逆多重化による個々の担体の特定を説明する。この実施例はまた、失速分析によって分析物に結合している担体の特定についても説明する。

方法
実施例１に記載のバーコード（総濃度３０ｎＭ、各々等しい濃度）を、ヌクレアーゼフリー水中で１：３のモル比で、ライゲーションｃ鎖とともに１時間インキュベーションした。ハイブリダイゼーションは、４℃で３分間遠心分離し、続いて室温で１時間インキュベーションすることによって開始した。得られた混合物を１０ｎＭのアダプターと混合し、ライゲーションを、等量のＴＡリガーゼマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加することによって実施し、４℃で３分間遠心分離して、低温でリガーゼを保存しながら、異なる成分を完全に混合した。室温で２０分間インキュベーションした後、総体積の１．４倍のＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｔｌｅｒ）を添加して、更なる精製のために核酸を吸収した。ビーズを短い断片緩衝液（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄して、ライゲーションされていない過剰な量の非ハイブリダイズのライゲーションｃ鎖及びバーコードを選択的に除去した。精製後、ビーズをヌクレアーゼフリー水で洗浄して、ライゲーションされたモータータンパク質－バーコード複合体を含有する精製された核酸を洗い流した。配列決定実験の最終溶液を、溶出液、配列決定緩衝液、テザー（１００ｎＭ）、ヌクレアーゼフリー水によって作製し、ある特定の濃度の標的化された分析物とともに少なくとも３０分間インキュベーションした。

全ての実験を、既存のカスタム作成されたＭＡＴＬＡＢコードであるＮａｎｏｐｏｒｅアプリ（２００６年から２０２１年の間にＪｏｓｈｕａ Ｅｄｅｌによって開発された）で分析した。ＦＡＳＴ５配列決定ファイルがアプリにアップロードされ、更に処理された。このアプリは、ＭｉｎＩＯＮの５１２チャネル全てを個別又は一括でアップロードして分析することを可能にした。

転位事象を、閾値化アルゴリズムを使用して検出した。最初に、実験に応じて、線形ベースラインを－０．１６～－２ｎＡの間に設定した。１．８のステップオフセットを使用して、事象の開始を定義した（緑色の線）。事象がｓｔｄ５０（黒色の線）の閾値を超える場合、それらはアルゴリズムによって検出される。これらの事象は、０．０２５秒～１０秒の事象をフィルタリングすることによって更に分析される。この時間枠内の全ての事象は、事象として定義される。加えて、アルゴリズムを使用して、整列マーカーとして使用される鎖設計内のＣ３又は他のスペーサー要素を位置決めする。このようにして、スペーサーの存在は、担体上の分子の存在又は不在の検出に不可欠ではない。

ＧＵＰＰＹ又は／及びＭｉｎＫＮＯＷソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、前のステップで検出された事象を配列決定し、ベースコールした。

生の読み取りシグナルをベースコールにした後、配列決定された事象を、参照配列、例えば、バーコード配列１～１０に整列させた。次の点が当てはまる場合、アルゴリズムは、最も高い整列スコアの事象にバーコードを割り当てる：
１）整列スコアは５０以上である必要があり、
２）最大整列スコアと２番目に高いスコアとの差は、少なくとも５である必要があり、
３）最大整列スコアと他のバーコードの平均整列スコアとの差は、少なくとも１０である必要があり、
４）ｐ値は、０．０００１以下である必要がある。

全ての基準が満たされた場合にのみ、最大整列は、バーコードとして分類された。そうでない場合、事象は削除され、更なる分析のために考慮されなかった。偽陽性を、集団の残りの部分と比較した最も高い整列スコアのｐ値を計算することによって除去した。

失速分析では、Ｃ３部分、並びに事象の開始及び終了を定義した。これは、全ての配列決定された読み取りの平均転位時間を計算するために重要であった。事象の転位時間が平均と比較して顕著に長かった場合（典型的には、移動するｓｔｄ１００ビンが使用された）、事象は失速として分類された。更に、各失速は、失速とみなすには、２０ビン超である必要があった。

固有のバーコードの配列決定及び逆多重化による個々の担体の特定。
全ての配列をベースコールし、上に記述し、バーコード配列である参照配列に整列させた。最大整列スコアを使用して、バーコードを分類した。最大整列スコア及び２番目に高いスコアが近すぎる場合、事象は分類されなかった。更に、ｐ値を使用して、事象を分類し、偽陽性分類を除去した。この方法では、個々のバーコードの特定で、９９．９５％の精度が達成され、記録された全ての事象の８６％が使用及び分類され、当該技術分野における以前の方法と比較して比較的少ないデータが浪費されたことを意味する（図４）。

バーコード配列は、９０％超の精度を有した。わずか０．０００１％の偽陽性率が観察された（図５（ａ））。本方法は、図５（ｂ）の混同マトリックスに示されるように、間違ったバーコード分類に対して優先が非常に低かった。改良されたアルゴリズム及び検出技術は、バーコード分類を引き続き改善するであろう。バーコード分類を改善する別の方法は、校正読み取り機序として、担体においてバーコードの繰り返しを含むことである。実施例は、１０個のバーコード化された担体が、複雑な混合物内で成功裏に区別され得、高度に多重化アッセイを可能にすることを示す。

失速分析による分析物に結合している担体の特定。
この実施例では、失速分析を使用して、標的がバーコード化された鎖に結合しているか否かを判定した。標的分析物がバーコード化された鎖に結合していない場合、電流シグナルは、（滞留時間、電流振幅において）失速を示さない。結合した分析物（ここでは、相補的ｍｉＲＮＡで例を示す）は、担体を失速させ、それは固有の電流プロファイルをもたらす（図７を参照されたい）。失速は、例えば、（１）二本鎖ヌクレオチド構造の解凍（例えば、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ検出）、（２）Ｇ四重鎖又はステム－ループアプタマー構造のいずれかの解明（例えば、タンパク質、神経伝達物質、及び小さな結合分子分析物の検出のため）、又は（３）結合した抗体－抗原の縞模様に起因し得る。標的分子の相対濃度は、失速した担体対失速していない担体の割合を相関させることによって判定され得る（図８を参照されたい）。試料中の担体の絶対濃度は、ナノポア文献に広く記載されているように、個々の単一分子検出事象間の時間（事象間時間）を測定することによって判定され得る。

本明細書に記載の方法を使用して分子の濃度を判定する別の方法は、分子に結合した担体の検出に対する分子の濃度依存性を判定することである。例えば、標準曲線は、図９に示されるものと同様の様式で調製され得る。

別の実験では、トロンビンと１５ｍｅｒのトロンビン結合アプタマーとの間の結合の検出が研究された。トロンビンとの結合時に、「不規則な曲線の」事象は、はるかに長い滞留時間を示し、電流反転の観点から、４００ｎＭのトロンビンとの結合時の失速の有意な増加が見られ、これは、Ｇ四重鎖及びアプタマー－タンパク質相互作用の巻き戻しに対応する。トロンビンと１５ｍｅｒのトロンビン結合アプタマーとの間の結合の濃度依存性は、トロンビン濃度を０ｎＭから４００ｎＭに増加させることによって更に検証され、失速の増加は、より長い滞留時間を伴うより多くの不規則な曲線の事象として観察された（図１０及び１１を参照されたい）。

別の実験では、ステム－ループアプタマーを使用した結合セロトニンの検出を研究した。セロトニンとの結合時の失速の増加は、セロトニンとの結合時のアプタマーのループからＧ四重鎖への構造再編成に起因し、ループ、Ｇ四重鎖、及びアプタマー－セロトニン相互作用の巻き戻しをもたらした（図１２を参照されたい）。セロトニンとアプタマーとの間の結合の濃度依存性は、０ｎＭから４０ｎＭの間でセロトニン濃度を増加させることによって更に検証された。失速の増加は、より多くの不規則な曲線の事象及びより長い滞留時間として観察された（図１３を参照されたい）。

下の表３に示されるように、平均遅延時間対濃度に基づいて、セロトニンとアプタマーとの間の結合の濃度依存性も観察された。

別の実験では、ステップループアプタマーを使用した結合アセチルコリンの検出を研究した。使用されたバーコード（下線）－スペーサー－アプタマー（斜体）は、以下のとおりであった：

アセチルコリンとの結合時に明らかな失速事象を見ることができる。遅延（失速）パーセンテージに対するアセチルコリンとアプタマーとの間の結合の濃度依存性は、アセチルコリン濃度を０ｎＭから４０ｎＭの間で増加させることによって観察された（図１４）。

実施例３
分析物に結合している担体を特定するための代替方法が利用可能である。

いくつかの実施形態では、特定の失速分析を実施する必要はない。ベースコーリングソフトウェアプログラムＧＵＰＰＹ及びＭｉｎＫＮＯＷ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、担体がポア内を移動するときに生成されるデータを直接分析し得る。

別に、及び前述したように、別の選択肢は、酵素消化を使用して、結合していない分子結合領域を有する担体の任意の部分を除去／消化することである。これは、分析物標的に結合していない担体における分子結合領域を標的とするａ）エンドヌクレアーゼ又はｂ）エキソヌクレアーゼを使用することによって達成され得る（図３を参照されたい）。したがって、消化後、標的に結合している担体、及び標的に結合していない担体は、バーコード配列後の電流シグナルの存在又はその欠如に基づいて区別される。代替的に、分子結合領域がポリペプチドである場合、結合していない分子結合領域を有する担体の部分を消化するプロテアーゼが使用され得るが、ただし、分子結合領域に結合した分子を含む担体と比較し場合、結合されていない、酵素的に消化された分子結合領域を含む担体がポア内を通過するとき、シグナルの差が観察され得る。

実施例４
担体のアセンブリプロトコル
バーコード（総濃度３０ｎＭ、各々等しい濃度）を、１：３のモル比で、ライゲーションｃ鎖とともにインキュベーションした。ハイブリダイゼーションを、４℃で１分間遠心分離し、続いて室温で１時間インキュベーションすることによって開始した。得られた混合物を１０ｎＭのアダプターと混合し、ライゲーションを、等量のＴＡリガーゼマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加することによって実施した。試料を４℃で１分間遠心分離して、低温でリガーゼを保存しながら、異なる成分を完全に混合した。室温で２０分間インキュベーションした後、総体積の１．４倍のＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を添加して、更なる精製のために核酸を吸収した。ビーズを短い断片緩衝液（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２回洗浄して、ライゲーションされていない過剰な量の非ハイブリダイズのライゲーションｃ鎖及びバーコードを選択的に除去した。精製後、ビーズをヌクレアーゼフリー水で洗浄して、ライゲーションされたモータータンパク質－バーコード複合体を含有する精製された核酸を洗い流した。配列決定実験の最終溶液を、溶出液、配列決定緩衝液、テザー（１００ｎＭ）、ヌクレアーゼフリー水によって作製し、ある特定の濃度の標的化された分析物とともに少なくとも３０分間インキュベーションした。ｍｉＲＮＡ実験には、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、及び５０ｎＭの濃度を使用した。タンパク質実験には、１０ｐｇ／ｍＬ、５０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬの濃度を使用した。

実験実行のプロトコル
全ての実験を、３７℃で調査及び／又は顧客のスクリプトを使用して３０分間実行した。

データ分析ワークフロー
全ての実験を、既存のカスタム作成されたＭＡＴＬＡＢコードであるＮａｎｏｐｏｒｅアプリで分析した。ナノポア配列決定デバイス（ＭｉｎＩＯＮデバイス、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から出力されたＦＡＳＴ５配列決定ファイルをアプリにアップロードし、それらを更に処理した。このアプリは、ＭｉｎＩＯＮの５１２チャネル全てを個別又は一括でアップロードして分析することを可能にする。

事象検出
転位事象を、閾値化アルゴリズムを使用して検出する。最初に、実験に応じて、線形ベースラインを－０．１６～－２ｎＡの間に設定する。１．８のステップオフセットを使用して、事象の開始を定義する。事象がｓｔｄ３０の閾値を超える場合、それらはアルゴリズムによって検出される。これらの事象は、０．１秒超の事象についてフィルタリングすることによって更に分析される。この時間枠の全ての事象は、事象として定義される。

配列決定及びベースコーリング
ＧＵＰＰＹ及び／又はＭｉｎＫＮＯＷソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、前のステップで検出された事象を配列決定し、ベースコールした。

整列
生の読み取りシグナルをベースコールにした後、配列決定された事象を、参照配列、この場合、バーコード配列１～４０に整列させた。次の点が当てはまる場合、アルゴリズムは、最も高い整列スコアの事象にバーコードを割り当てた：
１）配列は、「ＧＧＧ」で始まる必要があり、
２）少なくとも１５個の塩基を整列させる必要があり、
３）最初の１０塩基で１つのミスマッチのみ、
４）全ての整列された塩基で１つのミスマッチのみ。

全ての基準が満たされた場合にのみ、最大整列は、バーコードとして分類された。そうでない場合、事象は削除され、更なる分析のために考慮されなかった。

失速
失速分析では、Ｃ３部分、並びに事象の開始及び終了を定義した。これを使用して、全ての配列決定された読み取りの平均転位時間を計算した。事象の転位時間が平均と比較して顕著に長かった場合（典型的には、移動するｓｔｄ７５ビンが使用された）、事象は失速として分類された。更に、各失速は、失速とみなすには、１０ビン超である必要があった。

結果：４０個のバーコードのヒートマップ（図１９）
図１９は、誤ったバーコード分類の優先が非常に低いことを示す混同マトリックスを提示する。試験された４０個のバーコード全てを、９５％超の精度で呼び出した。

結果：複数のｍｉＲＮＡの検出
本明細書に記載の多重化バーコード配列決定方法は、４０個の異なるｍｉＲＮＡの検出を可能にした。結果を図２０に提示する。

結果：未知のｍｉＲＮＡ濃度の定量化
本明細書に記載の方法は、既知のｍｉＲＮＡ濃度の複数の異なる試料の盲検試験を使用して、ｍｉＲＮＡ濃度の正確な予測を可能にした。結果を図２１に提示する。

結果：ｃＴｎＩの検出
タンパク質心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）の検出に関するデータを図２２に示す。示されるトロポニンアプタマー配列は以下のとおりである：ＡＧＴＣＴＣＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＣＧＡＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＣＴＣＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＡＴＴＧＡＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＧＣＣＧＴＧＡＣＴＧ

実施例４の付録
担体鎖の配列－ｍｉＲＮＡ（図１７）

担体鎖の配列－タンパク質及び神経伝達物質（図１８）
心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）：

心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）：

ＢＮＰ：

トロンビン：

Ｓ－タンパク質：

Ｎ－タンパク質：

セロトニン：

アセチルコリン：

標的分析物

タンパク質：
心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）［Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ］
心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）：ＴＮＮＴ２タンパク質ヒト組換え｜ＣＴｎＴ抗原｜ＰｒｏＳｐｅｃ（ｐｒｏｓｐｅｃｂｉｏ．ｃｏｍ）
ＢＮＰ－３２ペプチド：［Ｂａｃｈｅｍ］
ヒトアルファ－トロンビン天然タンパク質、ビオチン（ＲＰ－４３１０３）［Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ］

参照例１
モータータンパク質を使用しない多重アッセイの制限。
上記のように、担体上のモータータンパク質の存在は、識別子領域の正確な特定及び分子結合領域上の分子の存在又は不在の判定を可能にする。本方法がモータータンパク質の不在下で実行される場合、得られ得る測定値に対して制限がある。

一実験では、トロンビンの濃度の増加を、アプタマー（下線）及び３０＊Ｔ通り抜け鎖を含む担体を使用したナノポア測定によって検出した。

このアプローチでは、トロンビンの濃度を定量化することは可能であるが、偽陽性を確認する方法はなく、アッセイを多重化する簡単な方法もない。測定されるのは、アプタマーとタンパク質が結合したアプタマーとの間のシグナルレベルの差だけである（図１５Ａ）。

第２の実験では、セロトニンの濃度の増加を、ステム－ループアプタマー（下線）及び３０＊Ｔ通り抜け鎖を含む担体を使用したナノポア測定によって検出した。

トロンビン実験と同様に、セロトニンの濃度を定量化することは可能であるが、偽陽性を確認する方法はなく、アッセイを多重化する簡単な方法もない。測定されるのは、アプタマーと神経伝達物質が結合したアプタマーとの間のシグナルレベルの差だけである（図１５Ｂ）。

第３の実験では、ｍｉＲＮＡのレベルを多重形式で検出した。バーコード１～６（ＡＣＧＴＡ、ＧＧＡＣＴ、ＴＴＡＡＣ、ＧＣＴＡＧ、ＣＴＧＡＧ、及びＴＡＧＣＧ）は、各バーコードについて観察された固有の平均電流（それぞれ、１２２．４ｐＡ、１２１．８ｐＡ、１１１．５ｐＡ、１５２．７ｐＡ、１２９．３ｐＡ、１３５．４ｐＡ）によって特定された（図１４Ｃ）。しかしながら、このアプローチは、その多重化能力が制限され、シグナルにおける振幅変動によって制限される。現実的には、多重アッセイでは、５つのバーコードが使用され得る。バーコードの割り当て及び分類は、他のバーコードの特徴的なシグナルと重複する各バーコードについて観察される振幅の分布により、必ずしも正確に分類されるとは限らない。
配列表
配列番号１－Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩ
ＭＭＮＤＧＫＱＱＳＴＦＬＦＨＤＹＥＴＦＧＴＨＰＡＬＤＲＰＡＱＦＡＡＩＲＴＤＳＥＦＮＶＩＧＥＰＥＶＦＹＣＫＰＡＤＤＹＬＰＱＰＧＡＶＬＩＴＧＩＴＰＱＥＡＲＡＫＧＥＮＥＡＡＦＡＡＲＩＨＳＬＦＴＶＰＫＴＣＩＬＧＹＮＮＶＲＦＤＤＥＶＴＲＮＩＦＹＲＮＦＹＤＰＹＡＷＳＷＱＨＤＮＳＲＷＤＬＬＤＶＭＲＡＣＹＡＬＲＰＥＧＩＮＷＰＥＮＤＤＧＬＰＳＦＲＬＥＨＬＴＫＡＮＧＩＥＨＳＮＡＨＤＡＭＡＤＶＹＡＴＩＡＭＡＫＬＶＫＴＲＱＰＲＬＦＤＹＬＦＴＨＲＮＫＨＫＬＭＡＬＩＤＶＰＱＭＫＰＬＶＨＶＳＧＭＦＧＡＷＲＧＮＴＳＷＶＡＰＬＡＷＨＰＥＮＲＮＡＶＩＭＶＤＬＡＧＤＩＳＰＬＬＥＬＤＳＤＴＬＲＥＲＬＹＴＡＫＴＤＬＧＤＮＡＡＶＰＶＫＬＶＨＩＮＫＣＰＶＬＡＱＡＮＴＬＲＰＥＤＡＤＲＬＧＩＮＲＱＨＣＬＤＮＬＫＩＬＲＥＮＰＱＶＲＥＫＶＶＡＩＦＡＥＡＥＰＦＴＰＳＤＮＶＤＡＱＬＹＮＧＦＦＳＤＡＤＲＡＡＭＫＩＶＬＥＴＥＰＲＮＬＰＡＬＤＩＴＦＶＤＫＲＩＥＫＬＬＦＮＹＲＡＲＮＦＰＧＴＬＤＹＡＥＱＱＲＷＬＥＨＲＲＱＶＦＴＰＥＦＬＱＧＹＡＤＥＬＱＭＬＶＱＱＹＡＤＤＫＥＫＶＡＬＬＫＡＬＷＱＹＡＥＥＩＶＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨ
配列番号２－Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素
ＭＫＦＶＳＦＮＩＮＧＬＲＡＲＰＨＱＬＥＡＩＶＥＫＨＱＰＤＶＩＧＬＱＥＴＫＶＨＤＤＭＦＰＬＥＥＶＡＫＬＧＹＮＶＦＹＨＧＱＫＧＨＹＧＶＡＬＬＴＫＥＴＰＩＡＶＲＲＧＦＰＧＤＤＥＥＡＱＲＲＩＩＭＡＥＩＰＳＬＬＧＮＶＴＶＩＮＧＹＦＰＱＧＥＳＲＤＨＰＩＫＦＰＡＫＡＱＦＹＱＮＬＱＮＹＬＥＴＥＬＫＲＤＮＰＶＬＩＭＧＤＭＮＩＳＰＴＤＬＤＩＧＩＧＥＥＮＲＫＲＷＬＲＴＧＫＣＳＦＬＰＥＥＲＥＷＭＤＲＬＭＳＷＧＬＶＤＴＦＲＨＡＮＰＱＴＡＤＲＦＳＷＦＤＹＲＳＫＧＦＤＤＮＲＧＬＲＩＤＬＬＬＡＳＱＰＬＡＥＣＣＶＥＴＧＩＤＹＥＩＲＳＭＥＫＰＳＤＨＡＰＶＷＡＴＦＲＲ
配列番号３－Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲｅｃＪ酵素
ＭＦＲＲＫＥＤＬＤＰＰＬＡＬＬＰＬＫＧＬＲＥＡＡＡＬＬＥＥＡＬＲＱＧＫＲＩＲＶＨＧＤＹＤＡＤＧＬＴＧＴＡＩＬＶＲＧＬＡＡＬＧＡＤＶＨＰＦＩＰＨＲＬＥＥＧＹＧＶＬＭＥＲＶＰＥＨＬＥＡＳＤＬＦＬＴＶＤＣＧＩＴＮＨＡＥＬＲＥＬＬＥＮＧＶＥＶＩＶＴＤＨＨＴＰＧＫＴＰＰＰＧＬＶＶＨＰＡＬＴＰＤＬＫＥＫＰＴＧＡＧＶＡＦＬＬＬＷＡＬＨＥＲＬＧＬＰＰＰＬＥＹＡＤＬＡＡＶＧＴＩＡＤＶＡＰＬＷＧＷＮＲＡＬＶＫＥＧＬＡＲＩＰＡＳＳＷＶＧＬＲＬＬＡＥＡＶＧＹＴＧＫＡＶＥＶＡＦＲＩＡＰＲＩＮＡＡＳＲＬＧＥＡＥＫＡＬＲＬＬＬＴＤＤＡＡＥＡＱＡＬＶＧＥＬＨＲＬＮＡＲＲＱＴＬＥＥＡＭＬＲＫＬＬＰＱＡＤＰＥＡＫＡＩＶＬＬＤＰＥＧＨＰＧＶＭＧＩＶＡＳＲＩＬＥＡＴＬＲＰＶＦＬＶＡＱＧＫＧＴＶＲＳＬＡＰＩＳＡＶＥＡＬＲＳＡＥＤＬＬＬＲＹＧＧＨＫＥＡＡＧＦＡＭＤＥＡＬＦＰＡＦＫＡＲＶＥＡＹＡＡＲＦＰＤＰＶＲＥＶＡＬＬＤＬＬＰＥＰＧＬＬＰＱＶＦＲＥＬＡＬＬＥＰＹＧＥＧＮＰＥＰＬＦＬ
配列番号４－バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ
ＭＴＰＤＩＩＬＱＲＴＧＩＤＶＲＡＶＥＱＧＤＤＡＷＨＫＬＲＬＧＶＩＴＡＳＥＶＨＮＶＩＡＫＰＲＳＧＫＫＷＰＤＭＫＭＳＹＦＨＴＬＬＡＥＶＣＴＧＶＡＰＥＶＮＡＫＡＬＡＷＧＫＱＹＥＮＤＡＲＴＬＦＥＦＴＳＧＶＮＶＴＥＳＰＩＩＹＲＤＥＳＭＲＴＡＣＳＰＤＧＬＣＳＤＧＮＧＬＥＬＫＣＰＦＴＳＲＤＦＭＫＦＲＬＧＧＦＥＡＩＫＳＡＹＭＡＱＶＱＹＳＭＷＶＴＲＫＮＡＷＹＦＡＮＹＤＰＲＭＫＲＥＧＬＨＹＶＶＩＥＲＤＥＫＹＭＡＳＦＤＥＩＶＰＥＦＩＥＫＭＤＥＡＬＡＥＩＧＦＶＦＧＥＱＷＲ
配列番号５－Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ
ＭＫＨＭＰＲＫＭＹＳＣＡＦＥＴＴＴＫＶＥＤＣＲＶＷＡＹＧＹＭＮＩＥＤＨＳＥＹＫＩＧＮＳＬＤＥＦＭＡＷＶＬＫＶＱＡＤＬＹＦＨＮＬＫＦＤＧＡＦＩＩＮＷＬＥＲＮＧＦＫＷＳＡＤＧＬＰＮＴＹＮＴＩＩＳＲＭＧＱＷＹＭＩＤＩＣＬＧＹＫＧＫＲＫＩＨＴＶＩＹＤＳＬＫＫＬＰＦＰＶＫＫＩＡＫＤＦＫＬＴＶＬＫＧＤＩＤＹＨＫＥＲＰＶＧＹＫＩＴＰＥＥＹＡＹＩＫＮＤＩＱＩＩＡＥＡＬＬＩＱＦＫＱＧＬＤＲＭＴＡＧＳＤＳＬＫＧＦＫＤＩＩＴＴＫＫＦＫＫＶＦＰＴＬＳＬＧＬＤＫＥＶＲＹＡＹＲＧＧＦＴＷＬＮＤＲＦＫＥＫＥＩＧＥＧＭＶＦＤＶＮＳＬＹＰＡＱＭＹＳＲＬＬＰＹＧＥＰＩＶＦＥＧＫＹＶＷＤＥＤＹＰＬＨＩＱＨＩＲＣＥＦＥＬＫＥＧＹＩＰＴＩＱＩＫＲＳＲＦＹＫＧＮＥＹＬＫＳＳＧＧＥＩＡＤＬＷＬＳＮＶＤＬＥＬＭＫＥＨＹＤＬＹＮＶＥＹＩＳＧＬＫＦＫＡＴＴＧＬＦＫＤＦＩＤＫＷＴＹＩＫＴＴＳＥＧＡＩＫＱＬＡＫＬＭＬＮＳＬＹＧＫＦＡＳＮＰＤＶＴＧＫＶＰＹＬＫＥＮＧＡＬＧＦＲＬＧＥＥＥＴＫＤＰＶＹＴＰＭＧＶＦＩＴＡＷＡＲＹＴＴＩＴＡＡＱＡＣＹＤＲＩＩＹＣＤＴＤＳＩＨＬＴＧＴＥＩＰＤＶＩＫＤＩＶＤＰＫＫＬＧＹＷＡＨＥＳＴＦＫＲＡＫＹＬＲＱＫＴＹＩＱＤＩＹＭＫＥＶＤＧＫＬＶＥＧＳＰＤＤＹＴＤＩＫＦＳＶＫＣＡＧＭＴＤＫＩＫＫＥＶＴＦＥＮＦＫＶＧＦＳＲＫＭＫＰＫＰＶＱＶＰＧＧＶＶＬＶＤＤＴＦＴＩＫＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ
配列番号６－Ｔｒｗｃ Ｃｂａヘリカーゼ
ＭＬＳＶＡＮＶＲＳＰＳＡＡＡＳＹＦＡＳＤＮＹＹＡＳＡＤＡＤＲＳＧＱＷＩＧＤＧＡＫＲＬＧＬＥＧＫＶＥＡＲＡＦＤＡＬＬＲＧＥＬＰＤＧＳＳＶＧＮＰＧＱＡＨＲＰＧＴＤＬＴＦＳＶＰＫＳＷＳＬＬＡＬＶＧＫＤＥＲＩＩＡＡＹＲＥＡＶＶＥＡＬＨＷＡＥＫＮＡＡＥＴＲＶＶＥＫＧＭＶＶＴＱＡＴＧＮＬＡＩＧＬＦＱＨＤＴＮＲＮＱＥＰＮＬＨＦＨＡＶＩＡＮＶＴＱＧＫＤＧＫＷＲＴＬＫＮＤＲＬＷＱＬＮＴＴＬＮＳＩＡＭＡＲＦＲＶＡＶＥＫＬＧＹＥＰＧＰＶＬＫＨＧＮＦＥＡＲＧＩＳＲＥＱＶＭＡＦＳＴＲＲＫＥＶＬＥＡＲＲＧＰＧＬＤＡＧＲＩＡＡＬＤＴＲＡＳＫＥＧＩＥＤＲＡＴＬＳＫＱＷＳＥＡＡＱＳＩＧＬＤＬＫＰＬＶＤＲＡＲＴＫＡＬＧＱＧＭＥＡＴＲＩＧＳＬＶＥＲＧＲＡＷＬＳＲＦＡＡＨＶＲＧＤＰＡＤＰＬＶＰＰＳＶＬＫＱＤＲＱＴＩＡＡＡＱＡＶＡＳＡＶＲＨＬＳＱＲＥＡＡＦＥＲＴＡＬＹＫＡＡＬＤＦＧＬＰＴＴＩＡＤＶＥＫＲＴＲＡＬＶＲＳＧＤＬＩＡＧＫＧＥＨＫＧＷＬＡＳＲＤＡＶＶＴＥＱＲＩＬＳＥＶＡＡＧＫＧＤＳＳＰＡＩＴＰＱＫＡＡＡＳＶＱＡＡＡＬＴＧＱＧＦＲＬＮＥＧＱＬＡＡＡＲＬＩＬＩＳＫＤＲＴＩＡＶＱＧＩＡＧＡＧＫＳＳＶＬＫＰＶＡＥＶＬＲＤＥＧＨＰＶＩＧＬＡＩＱＮＴＬＶＱＭＬＥＲＤＴＧＩＧＳＱＴＬＡＲＦＬＧＧＷＮＫＬＬＤＤＰＧＮＶＡＬＲＡＥＡＱＡＳＬＫＤＨＶＬＶＬＤＥＡＳＭＶＳＮＥＤＫＥＫＬＶＲＬＡＮＬＡＧＶＨＲＬＶＬＩＧＤＲＫＱＬＧＡＶＤＡＧＫＰＦＡＬＬＱＲＡＧＩＡＲＡＥＭＡＴＮＬＲＡＲＤＰＶＶＲＥＡＱＡＡＡＱＡＧＤＶＲＫＡＬＲＨＬＫＳＨＴＶＥＡＲＧＤＧＡＱＶＡＡＥＴＷＬＡＬＤＫＥＴＲＡＲＴＳＩＹＡＳＧＲＡＩＲＳＡＶＮＡＡＶＱＱＧＬＬＡＳＲＥＩＧＰＡＫＭＫＬＥＶＬＤＲＶＮＴＴＲＥＥＬＲＨＬＰＡＹＲＡＧＲＶＬＥＶＳＲＫＱＱＡＬＧＬＦＩＧＥＹＲＶＩＧＱＤＲＫＧＫＬＶＥＶＥＤＫＲＧＫＲＦＲＦＤＰＡＲＩＲＡＧＫＧＤＤＮＬＴＬＬＥＰＲＫＬＥＩＨＥＧＤＲＩＲＷＴＲＮＤＨＲＲＧＬＦＮＡＤＱＡＲＶＶＥＩＡＮＧＫＶＴＦＥＴＳＫＧＤＬＶＥＬＫＫＤＤＰＭＬＫＲＩＤＬＡＹＡＬＮＶＨＭＡＱＧＬＴＳＤＲＧＩＡＶＭＤＳＲＥＲＮＬＳＮＱＫＴＦＬＶＴＶＴＲＬＲＤＨＬＴＬＶＶＤＳＡＤＫＬＧＡＡＶＡＲＮＫＧＥＫＡＳＡＩＥＶＴＧＳＶＫＰＴＡＴＫＧＳＧＶＤＱＰＫＳＶＥＡＮＫＡＥＫＥＬＴＲＳＫＳＫＴＬＤＦＧＩ
配列番号７－Ｈｅｌ３０８ Ｍｂｕヘリカーゼ
ＭＭＩＲＥＬＤＩＰＲＤＩＩＧＦＹＥＤＳＧＩＫＥＬＹＰＰＱＡＥＡＩＥＭＧＬＬＥＫＫＮＬＬＡＡＩＰＴＡＳＧＫＴＬＬＡＥＬＡＭＩＫＡＩＲＥＧＧＫＡＬＹＩＶＰＬＲＡＬＡＳＥＫＦＥＲＦＫＥＬＡＰＦＧＩＫＶＧＩＳＴＧＤＬＤＳＲＡＤＷＬＧＶＮＤＩＩＶＡＴＳＥＫＴＤＳＬＬＲＮＧＴＳＷＭＤＥＩＴＴＶＶＶＤＥＩＨＬＬＤＳＫＮＲＧＰＴＬＥＶＴＩＴＫＬＭＲＬＮＰＤＶＱＶＶＡＬＳＡＴＶＧＮＡＲＥＭＡＤＷＬＧＡＡＬＶＬＳＥＷＲＰＴＤＬＨＥＧＶＬＦＧＤＡＩＮＦＰＧＳＱＫＫＩＤＲＬＥＫＤＤＡＶＮＬＶＬＤＴＩＫＡＥＧＱＣＬＶＦＥＳＳＲＲＮＣＡＧＦＡＫＴＡＳＳＫＶＡＫＩＬＤＮＤＩＭＩＫＬＡＧＩＡＥＥＶＥＳＴＧＥＴＤＴＡＩＶＬＡＮＣＩＲＫＧＶＡＦＨＨＡＧＬＮＳＮＨＲＫＬＶＥＮＧＦＲＱＮＬＩＫＶＩＳＳＴＰＴＬＡＡＧＬＮＬＰＡＲＲＶＩＩＲＳＹＲＲＦＤＳＮＦＧＭＱＰＩＰＶＬＥＹＫＱＭＡＧＲＡＧＲＰＨＬＤＰＹＧＥＳＶＬＬＡＫＴＹＤＥＦＡＱＬＭＥＮＹＶＥＡＤＡＥＤＩＷＳＫＬＧＴＥＮＡＬＲＴＨＶＬＳＴＩＶＮＧＦＡＳＴＲＱＥＬＦＤＦＦＧＡＴＦＦＡＹＱＱＤＫＷＭＬＥＥＶＩＮＤＣＬＥＦＬＩＤＫＡＭＶＳＥＴＥＤＩＥＤＡＳＫＬＦＬＲＧＴＲＬＧＳＬＶＳＭＬＹＩＤＰＬＳＧＳＫＩＶＤＧＦＫＤＩＧＫＳＴＧＧＮＭＧＳＬＥＤＤＫＧＤＤＩＴＶＴＤＭＴＬＬＨＬＶＣＳＴＰＤＭＲＱＬＹＬＲＮＴＤＹＴＩＶＮＥＹＩＶＡＨＳＤＥＦＨＥＩＰＤＫＬＫＥＴＤＹＥＷＦＭＧＥＶＫＴＡＭＬＬＥＥＷＶＴＥＶＳＡＥＤＩＴＲＨＦＮＶＧＥＧＤＩＨＡＬＡＤＴＳＥＷＬＭＨＡＡＡＫＬＡＥＬＬＧＶＥＹＳＳＨＡＹＳＬＥＫＲＩＲＹＧＳＧＬＤＬＭＥＬＶＧＩＲＧＶＧＲＶＲＡＲＫＬＹＮＡＧＦＶＳＶＡＫＬＫＧＡＤＩＳＶＬＳＫＬＶＧＰＫＶＡＹＮＩＬＳＧＩＧＶＲＶＮＤＫＨＦＮＳＡＰＩＳＳＮＴＬＤＴＬＬＤＫＮＱＫＴＦＮＤＦＱ
配列番号８－Ｄｄａヘリカーゼ
ＭＴＦＤＤＬＴＥＧＱＫＮＡＦＮＩＶＭＫＡＩＫＥＫＫＨＨＶＴＩＮＧＰＡＧＴＧＫＴＴＬＴＫＦＩＩＥＡＬＩＳＴＧＥＴＧＩＩＬＡＡＰＴＨＡＡＫＫＩＬＳＫＬＳＧＫＥＡＳＴＩＨＳＩＬＫＩＮＰＶＴＹＥＥＮＶＬＦＥＱＫＥＶＰＤＬＡＫＣＲＶＬＩＣＤＥＶＳＭＹＤＲＫＬＦＫＩＬＬＳＴＩＰＰＷＣＴＩＩＧＩＧＤＮＫＱＩＲＰＶＤＰＧＥＮＴＡＹＩＳＰＦＦＴＨＫＤＦＹＱＣＥＬＴＥＶＫＲＳＮＡＰＩＩＤＶＡＴＤＶＲＮＧＫＷＩＹＤＫＶＶＤＧＨＧＶＲＧＦＴＧＤＴＡＬＲＤＦＭＶＮＹＦＳＩＶＫＳＬＤＤＬＦＥＮＲＶＭＡＦＴＮＫＳＶＤＫＬＮＳＩＩＲＫＫＩＦＥＴＤＫＤＦＩＶＧＥＩＩＶＭＱＥＰＬＦＫＴＹＫＩＤＧＫＰＶＳＥＩＩＦＮＮＧＱＬＶＲＩＩＥＡＥＹＴＳＴＦＶＫＡＲＧＶＰＧＥＹＬＩＲＨＷＤＬＴＶＥＴＹＧＤＤＥＹＹＲＥＫＩＫＩＩＳＳＤＥＥＬＹＫＦＮＬＦＬＧＫＴＡＥＴＹＫＮＷＮＫＧＧＫＡＰＷＳＤＦＷＤＡＫＳＱＦＳＫＶＫＡＬＰＡＳＴＦＨＫＡＱＧＭＳＶＤＲＡＦＩＹＴＰＣＩＨＹＡＤＶＥＬＡＱＱＬＬＹＶＧＶＴＲＧＲＹＤＶＦＹＶ

Claims (23)

1. 試料中の複数の分子を検出するための方法であって、
   （ａ）前記試料を担体及びナノポアと接触させることであって、前記担体が、一本鎖リーダーと、識別子領域と、検出される分子に特異的な分子結合領域と、を含み、モータータンパク質が、前記ナノポア内の前記識別子領域の移動を制御することができるように、前記担体に結合している、接触させることと、
   （ｂ）担体が前記ナノポア内を移動するとき、１つ以上の光学的又は電気的測定を行って、前記識別子領域を特徴付け、かつ前記分子が前記分子結合領域に結合しているか否かを判定することと、を含む、方法。
2. 前記担体が、前記結合したモータータンパク質と前記分子結合領域との間にスペーサーを更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記担体が、順に、一本鎖リーダーと、識別子領域と、スペーサーと、分子結合領域と、を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記分子結合領域及び／又は前記識別子領域が、ポリヌクレオチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記分子結合領域又はその一部が、前記識別子領域である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記識別子領域が、ポリヌクレオチドであり、バーコード配列を含む、請求項４に記載の方法。
7. 前記担体が、２つ以上の識別子領域及び／又は２つ以上の分子結合領域を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記担体が、２つ以上の識別子領域を含み、前記方法が、複数の試料中の複数の分子を検出するためのものであり、前記担体における１つの識別子領域が、前記試料に固有であり、前記担体における１つの識別子領域が、前記担体が結合する前記分子に固有である、請求項７に記載の方法。
9. 前記分子が、神経伝達物質、タンパク質、及び／又はｍｉＲＮＡを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記分子結合領域が、アプタマーである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記分子結合領域が、抗体、抗体断片、ナノボディ、又はアフィボディである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記分子結合領域が、ｍｉＲＮＡに相補的である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記識別子領域が、ポリヌクレオチドであり、前記方法が、前記識別子領域の前記ポリヌクレオチド配列を決定することを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記方法が、前記分子の存在又は不在を検出するために使用される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記方法が、前記分子の前記濃度を判定するために使用される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記複数の分子が、１０個以上の異なる分子である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記モータータンパク質が、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、トランスロカーゼ、又はトポイソメラーゼである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記ナノポアが、タンパク質ポア、固体状態ポア、又はＤＮＡ折り紙ポアである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 一本鎖リーダーと、識別子領域と、検出される分子に特異的な分子結合領域と、を含む担体であって、モータータンパク質が、前記一本鎖リーダーと前記識別子領域との間の位置で前記担体に結合している、担体。
20. 前記識別子領域と前記分子結合領域との間にスペーサー、及び／又は前記分子結合領域に特異的に結合した分子を更に含む、請求項１９に記載の担体。
21. 複数の分子のための担体の集団であって、前記担体が、請求項１９又は２０で定義されるとおりであり、前記集団における異なる担体が、異なる識別子領域及び異なる分子結合領域を含む、担体の集団。
22. 試料中の複数の分子を検出するためのキットであって、
    （ｉ）担体の集団であって、各担体が、識別子領域と、検出される分子に特異的な分子結合領域と、を含み、前記集団における異なる担体が、異なる識別子領域及び異なる分子結合領域を含む、担体の集団と、
    （ｉｉ）一本鎖リーダーを含むアダプターと、
    （ｉｉｉ）モータータンパク質と、を含む、キット。
23. 試料中の複数の分子を検出するためのシステムであって、
    （ｉ）請求項２１に記載の担体の集団と、
    （ｉｉｉ）ナノポアと、を含む、システム。