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JP2024511760A - エラー補正のための固有分子識別子を有するトランスポゾンベースの技術を使用した指向性タグメンテーション配列決定ライブラリーの調製方法 - Google Patents

エラー補正のための固有分子識別子を有するトランスポゾンベースの技術を使用した指向性タグメンテーション配列決定ライブラリーの調製方法 Download PDF

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JP2024511760A JP2023557365A JP2023557365A JP2024511760A JP 2024511760 A JP2024511760 A JP 2024511760A JP 2023557365 A JP2023557365 A JP 2023557365A JP 2023557365 A JP2023557365 A JP 2023557365A JP 2024511760 A JP2024511760 A JP 2024511760A
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JP2023557365A
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スーザン シー． ベリティ，
ロバート スコット キュルステン，
ナイル アンソニー ゴームリー，
アンドリュー ビー． ケネディ，
サラ イー． シュルツァバーガー，
アンドリュー スラッター，
エマ ベル，
セバスチャン ジョルジ ガブリエル リクー，
グレース デサンティス，
フィオナ ケイパー，
ハン－ユー チュアン，
オリバー ジョン ミラー，
ジェイソン リチャード ベトリー，
スティーブン グロス，
マッツ エクストランド，
Original Assignee
イルミナ インコーポレイテッド
イルミナ ケンブリッジ リミテッド
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Abstract

次世代配列決定のための核酸ライブラリーを調製するための材料及び方法が、本明細書に記載される。配列決定ライブラリーの調製におけるトランスポゾンベースの技術を用いた固有分子識別子の使用に関する様々なアプローチが記載されている。増幅及び配列決定エラーを同定及び補正するための配列決定材料及び方法も本明細書に記載される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６３／１６８，８０２号の優先権の利益を主張し、この出願は、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
配列表
この出願は、電子フォーマットでの配列表と共に出願されている。配列表は、「２０２２－０３－２９＿０１２４３－００２４－００ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題されたファイル（２０２２年３月２９日作成、４キロバイトのサイズ）として提供されている。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、低頻度変異体の配列決定感度を増加させる固有分子識別子（ＵＭＩ）を組み込むためのトランスポゾンベースの技術を使用したＤＮＡ及びＲＮＡ配列決定ライブラリーの調製に関する。
次世代配列決定（ＮＧＳ）は、がんの研究者が、非常に正確な配列決定データを使用して単一のアッセイにおいて多数の遺伝子を評価することを可能にしている。しかしながら、合成ベースの方法はいずれも固有のエラーを含む。エラー率は、多くのＮＧＳベースの用途の達成を成功させるのに十分に低い（０．５％未満）が、より低い濃度の標的核酸が得られる試料収集のための非侵襲的な、又は他の方法を使用する新しい方法は、より低いエラー率を必要とし得る。例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の分析を用いて、生検を必要とせずに血中の体細胞変異を検出することができるが、総ｃｆＤＮＡ内の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の割合が低いため、変異対立遺伝子頻度が、既存の方法の検出限界近くになる。ライブラリー調製方法から生じ得るアーチファクトを、低頻度変異体と誤る場合があり、それによって、方法の感度及び信頼性を低下させる。
トランスポゾンベースの技術を用いて、全ゲノム配列決定ライブラリーを調製することができる。例えば、以前にＮｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐとして知られていたＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐ（ＲＵＯ）は、広い核酸入力範囲（１～５００ｎｇ）、複数の試料タイプ、並びに小ゲノム及び大ゲノムの両方をサポートする。４時間未満で、３５０塩基対断片のライブラリーを生成することができ、標的核酸をトランスポソーム複合体で処理することによって、核酸が配列決定のために同時に断片化及びタグ化（「タグメンテーション化」）されるようになる。
トランスポゾンベースの技術に従って調製されたライブラリーは、ＮＧＳデータにおける固有のエラー率を低下させるために、固有分子識別子（ＵＭＩ）を組み込むことによって改善され得る。配列決定ライブラリーへのＵＭＩの組み込みは、ＵＭＩ Ｅｒｒｏｒ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ Ａｐｐが同じ標的分子由来の複数のリードを認識し、それらを単一のリードに折り畳み、最終的なバリアントコールにおけるエラーを低減することを可能にする。鎖型（すなわち、フォーク型）ライブラリーと組み合わせたＵＭＩは、配列決定データにおいて個々の鎖分子を解明することができる。本開示は、トランスポゾンベースの技術を使用してＵＭＩライブラリーを調製するための材料及び方法を提供する。
本開示は、トランスポゾンベースの技術を使用してＵＭＩを含む核酸配列決定ライブラリーを調製するための材料、組成物、及び方法に関する。
実施形態１は、二本鎖核酸ライブラリーを作製する方法であり、ライブラリー中の各断片は、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含み、方法は、（ａ）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）第１のトランスポザーゼと、（ｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列、及び第１のＵＭＩを含む第１のトランスポゾンと、（ｉｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、第１のトランスポソーム複合体に適用することと、（ｂ）二本鎖標的核酸を第１のトランスポソーム複合体でタグメンテーションして、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することであって、各タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片は、第１のアダプター配列及び第１のＵＭＩを含む、ことと、（ｃ）タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を第１のトランスポソーム複合体から遊離させることと、（ｄ）任意選択的に、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を伸長させることと、（ｅ）任意選択的に、第１のトランスポゾンを、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片又は伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（ｆ）タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することと、（ｇ）タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。
実施形態２は、第１のトランスポゾン内の第１のＵＭＩが、第１のアダプター配列と第１の３’トランスポゾン末端配列との間に位置する、実施形態１に記載の方法である。
実施形態３は、第１のトランスポゾン内の第１のアダプター配列が、第１のＵＭＩと第１の３’トランスポゾン末端配列との間に位置する、実施形態１又は２に記載の方法である。
実施形態４は、（ａ）第２のトランスポザーゼと、（ｂ）第２のアダプター配列及び第２の３’トランスポゾン末端配列を含む第３のトランスポゾンと、（ｃ）第２の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第４のトランスポゾンと、を含む、第２のトランスポソーム複合体を更に含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５は、タグメンテーション化工程が、（ａ）第１のアダプター配列及び第１のＵＭＩを含む第１の鎖と、（ｂ）第２のアダプター配列を含む第２の鎖と、を含む、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成する、実施形態４に記載の方法である。
実施形態６は、（ａ）第３のトランスポゾンが第２のＵＭＩを更に含み、（ｂ）第２のアダプター配列が第２のＵＭＩと第２の３’トランスポゾン末端配列との間に位置する、実施形態４又は５に記載の方法である。
実施形態７は、タグメンテーション化工程が、（ａ）第１のアダプター配列及び第１のＵＭＩを含む第１の鎖と、（ｂ）第２のアダプター配列及び第２のＵＭＩを含む第２の鎖と、を含む、二本鎖標的核酸断片を生成する、実施形態６に記載の方法である。
実施形態８は、二本鎖核酸ライブラリーを作製する方法であり、ライブラリー中の各断片はＵＭＩを含み、方法は、（ａ）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列及び第１のアダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、（ｉｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、トランスポソーム複合体に適用することと、（ｂ）二本鎖標的核酸の第１の鎖をトランスポソーム複合体でタグメンテーションして、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することであって、各タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片は、第１のアダプター配列を含む、ことと、（ｃ）タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片をトランスポソーム複合体から遊離させることと、（ｄ）第２のアダプター配列、ＵＭＩ、及び第１の３’末端トランスポゾン配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含むポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることと、（ｅ）任意選択的に、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長させることと、（ｆ）任意選択的に、ポリヌクレオチドを、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片又は伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（ｇ）ＵＭＩを含むタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することであって、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’末端に直接隣接して位置する、ことと、（ｈ）ＵＭＩを含むタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。
実施形態９は、二本鎖核酸ライブラリーを作製する方法であり、ライブラリー中の各断片はＵＭＩを含み、方法は、（ａ）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列及び第１のアダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、（ｉｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、トランスポソーム複合体に適用することと、（ｂ）二本鎖標的核酸の第１の鎖をトランスポソーム複合体でタグメンテーションして、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することであって、各タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片は、第１のアダプター配列を含む、ことと、（ｃ）タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片をトランスポソーム複合体から遊離させることと、（ｄ）ＵＭＩ及び第２のアダプター配列を含む第１のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることと、（ｅ）任意選択的に、第１のポリヌクレオチドに相補的な領域を含む第２のポリヌクレオチドを付加して、二本鎖アダプターを生成することと、（ｆ）任意選択的に、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長させることと、（ｇ）任意選択的に、第２のポリヌクレオチドを、伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第２の鎖とライゲーションすることと、（ｈ）ＵＭＩを含むタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することであって、ＵＭＩは、二本鎖標的核酸断片と第２のアダプター配列との間に位置する、ことと、（ｉ）ＵＭＩを含むタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。
実施形態１０は、ハイブリダイズさせる工程の後に、方法が、（ａ）二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長させることと、（ｂ）第１のポリヌクレオチドをコピーすることと、を更に含む、実施形態９に記載の方法である。
実施形態１１は、二本鎖核酸ライブラリーを作製する方法であり、ライブラリー中の各断片は２つの異なるＵＭＩを含み、方法は、（ａ）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）第１のトランスポソーム複合体であって、（１）第１のトランスポザーゼと、（２）（ａ）二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上の第１のトランスポゾン及び（ｂ）第２のトランスポゾンを含む、第１のフォーク型アダプターと、を含み、第１のトランスポゾンは、第１の３’末端トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列の第１のコピー、及び第１のＵＭＩを含み、第２のトランスポゾンは、第２のアダプター配列の第１のコピー、並びに第１の３’末端トランスポゾン末端配列及び第１のＵＭＩに完全に又は部分的に相補的である配列を含み、更に、第１のアダプター配列の第１のコピーは一本鎖であり、第２のアダプター配列の第１のコピーは二本鎖部分を含む、第１のトランスポソーム複合体、並びに、（ｉｉ）第２のトランスポソーム複合体であって、（１）第２のトランスポザーゼと、（２）（ａ）二本鎖標的核酸断片の第２の鎖上の第３のトランスポゾン及び（ｂ）第４のトランスポゾンとを含む、第２のフォーク型アダプターと、を含み、第３のトランスポゾンは、第２の３’末端トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列の第２のコピー、及び第２のＵＭＩを含み、第３のトランスポゾンは、第２のアダプター配列の第２のコピー、並びに第２の３’末端トランスポゾン末端配列及び第２のＵＭＩに完全に又は部分的に相補的である配列を含み、更に、第１のアダプター配列の第２のコピーは一本鎖であり、第２のアダプター配列の第２のコピーは二本鎖部分を含む、第２のトランスポソーム複合体、に適用することと、（ｂ）二本鎖標的核酸をフォーク型アダプターでタグメンテーションして、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することであって、各タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片は、第１のアダプター配列の第１及び第２のコピー、第１のＵＭＩ、第２のアダプター配列の第１及び第２のコピー、及び第２のＵＭＩを含む、ことと、（ｃ）タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片をトランスポソーム複合体から遊離させることと、（ｄ）任意選択的に、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を伸長させることと、（ｅ）第２及び第４のトランスポゾンを、二本鎖標的核酸断片又は伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（ｆ）タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することと、（ｇ）タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。
実施形態１２は、二本鎖核酸ライブラリーを作製する方法であり、ライブラリー中の各断片は４つの異なるＵＭＩを含み、方法は、（ａ）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）第１のトランスポソーム複合体であって、（１）第１のトランスポザーゼと、（２）（ａ）二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上の第１のトランスポゾン及び（ｂ）第２のトランスポゾンを含む、第１のフォーク型アダプターと、を含み、第１のトランスポゾンは、第１の３’末端トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列の第１のコピー、第１のＵＭＩの第１のコピー、及び第２のアダプター配列の第１のコピーを含み、第２のトランスポゾンは、第１の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列、第３のアダプター配列の第１のコピー、第２のＵＭＩの第１のコピー、及び第４のアダプター配列を含み、更に、第１、第２、及び第３のアダプター配列の第１のコピーは一本鎖であり、第４のアダプター配列は二本鎖部分を含む、第１のトランスポソーム複合体、並びに、（ｉ）第２のトランスポソーム複合体であって、（１）第２のトランスポザーゼと、（２）（ａ）二本鎖標的核酸断片の第２の鎖上の第３のトランスポゾン及び（ｂ）第４のトランスポゾンを含む、第２のフォーク型アダプターと、を含み、第３のトランスポゾンは、第２の３’末端トランスポゾン末端配列、第５のアダプター配列の第１のコピー、第３のＵＭＩの第１のコピー、及び第６のアダプター配列の第１のコピーを含み、第４のトランスポゾンは、第２の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列、第７のアダプター配列の第１のコピー、第４のＵＭＩの第１のコピー、及び第８のアダプター配列を含み、更に、第５、第６、及び第７のアダプター配列の第１のコピーは一本鎖であり、第８のアダプター配列は二本鎖部分を含む、第２のトランスポソーム複合体、に適用することと、（ｂ）二本鎖標的核酸をフォーク型アダプターでタグメンテーションして、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することであって、各タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片は、第１、第２、第３、第５、第６、及び第７アダプター配列の第１のコピー、第１、第２、第３、及び第４のＵＭＩの第１のコピー、第６のアダプター配列、並びに第８のアダプター配列を含む、ことと、（ｃ）タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片をトランスポソーム複合体から遊離させることと、（ｄ）任意選択的に、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を伸長させることと、（ｅ）第２及び第４のトランスポゾンを、二本鎖標的核酸断片又は伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（ｆ）タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することと、（ｇ）タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。
実施形態１３は、第１、第２、第３、及び第４のＵＭＩが相補的又は異なる配列であってもよい、実施形態６、７、１１、又は１２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１４は、二本鎖標的核酸が二本鎖ＤＮＡである、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１５は、二本鎖標的核酸がｃｔＤＮＡである、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１６は、二本鎖標的核酸がｃｆＤＮＡである、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１７は、二本鎖標的核酸がＲＮＡである、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１８は、二本鎖標的核酸がｃＤＮＡであるか、又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖がＲＮＡから生成される、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１９は、第１のアダプター配列が５’第１リード配列決定アダプター配列である、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２０は、第２のアダプター配列が、５’第２リード配列決定アダプター配列である、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２１は、第１及び第２のアダプター配列が、５’第１リード及び５’第２リード配列決定アダプター配列である、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２２は、５’第１リード及び５’第２リード配列決定アダプター配列が、固有プライマー結合部位を含む、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２３は、第１のＵＭＩが、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上にある、実施形態１、２、４～８、又は１３～２２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２４は、第１のＵＭＩの第１のコピーがタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上にあり、第１のＵＭＩの第２のコピーが第２の鎖上にある、実施形態１、３、５～７、１３～２２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２５は、第１のＵＭＩが、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上にあり、第２のＵＭＩが、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第２の鎖上にある、実施形態１～７、１３～２２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２６は、第１、第２、第３、又は第４のトランスポゾンがビオチンタグを更に含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７は、第１、第２、第３、又は第４のトランスポゾンが、第１の固有プライマー結合配列を更に含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２８は、第１、第２、第３、又は第４のトランスポゾンが、第２の固有プライマー結合配列を更に含む、実施形態２７に記載の方法である。
実施形態２９は、固有プライマー結合配列が、Ａ２、Ａ１４、及び／又はＢ１５を含む、実施形態２７又は２８に記載の方法である。
実施形態３０は、ハイブリダイズさせる工程が、フォーク型アダプターを生成する、実施形態８～１０又は１４～２２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１は、二本鎖標的核酸断片の３’末端からトランスポゾンの５’末端まで伸長させることを更に含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３２は、ライゲーション工程が、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の３’末端又は伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の３’末端を、第１、第２、又は第４のトランスポゾンの５’末端とライゲーションすることを含む、実施形態１～７又は１１～３１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３３は、伸長及び／又はライゲーション工程が、伸長ライゲーション混合物中で任意選択的に実施される、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３４は、ポリヌクレオチドが、（ａ）ヘアピンＵＭＩ、（ｂ）ヘアピンＵＭＩ及びユニバーサルハイブリダイズテール、（ｃ）スプリントライゲーションアダプター、又は（ｄ）３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを含む３’アダプターを含む、実施形態８、１５～２２、２６～３３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３５は、ヘアピンＵＭＩが、伸長工程及び／又はライゲーション工程中は安定であるが、増幅工程中は安定ではない、実施形態３４に記載の方法である。
実施形態３６は、ヘアピンＵＭＩが３又は４塩基対ステムを含む、実施形態３４又は３５に記載の方法である。
実施形態３７は、ユニバーサルハイブリダイズテールが、任意のＤＮＡヌクレオチドに結合できるヌクレオチドを含む、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３８は、ライゲーション工程が、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端をユニバーサルハイブリダイズテールの５’末端とライゲーションすることを含む、実施形態３４～３７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３９は、（ａ）ポリヌクレオチドが、ヘアピンＵＭＩを含む３’アダプターを含み、（ｂ）伸長工程が、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端からヘアピンＵＭＩの５’末端まで伸長させることを含む、実施形態３４に記載の方法である。
実施形態４０は、ライゲーション工程が、伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端をヘアピンＵＭＩの５’末端とライゲーションすることを含む、実施形態３９に記載の方法である。
実施形態４１は、（ａ）ポリヌクレオチドが、スプリントライゲーションアダプターを含み、（ｂ）伸長工程が、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端からスプリントライゲーションアダプターの５’末端まで伸長させることを含む、実施形態３４に記載の方法である。
実施形態４２は、伸長工程が、９塩基を伸長させることを含む、実施形態４１に記載の方法である。
実施形態４３は、ライゲーション工程が、伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端をスプリントライゲーションアダプターの第１の鎖の５’末端とライゲーションすることを含む、実施形態４１又は４２に記載の方法である。
実施形態４４は、（ａ）ポリヌクレオチドが、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを含み、（ｂ）伸長工程が、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第１の鎖をコピーすることによって、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端から鋳型スイッチオリゴヌクレオチド内の接合部まで伸長させることと、（ｃ）鋳型を第１の鎖から３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの不対領域に切り替えることと、（ｄ）３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの不対領域を接合部から３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの不対領域の５’末端にコピーすることと、を含む、実施形態３４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４５は、伸長、切り替え、及びコピーすることが、ＤＮＡ指向性鋳型切り替えが可能なポリメラーゼによって行われる、実施形態４４に記載の方法である。
実施形態４６は、ＤＮＡ指向性鋳型切り替えが可能なポリメラーゼが、ＭＭＬＶ逆転写酵素を含む、実施形態４４又は４５に記載の方法である。
実施形態４７は、ライゲーション工程が、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の３’末端を、第１、第２、又は第４のトランスポゾンの５’末端とライゲーションすることを含む、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４８は、増幅工程の後に、あるサイズ範囲内の増幅された核酸断片を選択することを更に含む、実施形態１～３３又は４７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４９は、増幅工程が、ライブラリーを固体支持体に付着させるために、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の一端又は両端にオリゴヌクレオチドを付加することを含む、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５０は、増幅工程が、少なくとも第１リード配列決定オリゴヌクレオチド及び／又は第２リード配列決定オリゴヌクレオチドを添加することを含む、実施形態１～４９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５１は、増幅工程が、少なくともＰ５オリゴヌクレオチド及びＰ７オリゴヌクレオチドを添加することを含む、実施形態１～５０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５２は、増幅工程が、少なくとも複数のｉ５オリゴヌクレオチド及び複数のｉ７オリゴヌクレオチドを添加することを含む、実施形態１～５１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５３は、トランスポソーム複合体、第１のトランスポソーム複合体及び／又は第２のトランスポソーム複合体が固体支持体上にある、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５４は、トランスポソーム複合体、第１のトランスポソーム複合体及び／又は第２のトランスポソーム複合体が溶液中にある、実施形態１～５３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５５は、実施形態１～５４のいずれか１つに記載の方法によって生成された二本鎖核酸ライブラリーを配列決定する方法であり、ＵＭＩを配列決定して、ＤＮＡ配列決定における感度を増加させる。
実施形態５６は、類似の融解温度を有する配列決定プライマーを結合させることを含む、実施形態５５に記載の方法である。
実施形態５７は、固有プライマー結合配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む配列決定プライマーを結合させることを含む、実施形態５５又は５６に記載の方法である。
実施形態５８は、少なくともＡ２配列を有するプライマーを配列決定することを含む、実施形態５５～５７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５９は、少なくともＡ１４配列及びＢ１５配列を有するプライマーを配列決定することを含む、実施形態５５～５７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態６０は、少なくとも架橋プライマーを有するプライマーを配列決定することを含む、実施形態５５～５９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態６１は、暗サイクルを更に含み、データが配列決定法の一部について記録されていない、実施形態５５～６０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態６２は、記録されていないデータが、３’トランスポゾン末端配列に関連する配列データである、実施形態５５～６０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態６３は、方法が暗サイクルの必要性をなくす、実施形態５５～６０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態６４は、伸長工程が、ＵＭＩ又は第１のＵＭＩをコピーして二重鎖ＵＭＩを生成するポリメラーゼを含む、実施形態１又は９に記載の方法である。
実施形態６５は、（ａ）トランスポザーゼと、（ｂ）３’トランスポゾン末端配列及び５’アダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、（ｃ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、トランスポソーム複合体である。
実施形態６６は、第１のトランスポゾンの５’アダプター配列が、Ａ１４配列（配列番号４）、Ａ２配列（配列番号７）、及び／又はＢ１５配列（配列番号５）を含む、実施形態６５に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態６７は、第１のトランスポゾンがＵＭＩ配列を更に含む、実施形態６５又は６６に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態６８は、第１又は第２のトランスポゾンがＡ１４－ＭＥ（配列番号１）を含む、実施形態６５～６７のいずれか１つに記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態６９は、第１又は第２のトランスポゾンがＢ１５－ＭＥ（配列番号２）を含む、実施形態６５～６７のいずれか１つに記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態７０は、第１のトランスポゾンの３’トランスポゾン末端配列が、ＭＥ（配列番号６）又はＭＥ’（配列番号３）を含む、実施形態６５～６７のいずれか１つに記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態７１は、第２のトランスポゾンの３’トランスポゾン末端配列が、ＭＥ（配列番号６）又はＭＥ’（配列番号３）を含む、実施形態６５～６７のいずれか１つに記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態７２は、第２のトランスポゾンが３’アダプター配列を更に含み、第２のトランスポゾンの３’アダプター配列が、第１のトランスポゾンの５’アダプター配列に部分的に又は完全に相補的である、実施形態６７に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態７３は、第２のトランスポゾンが３’アダプター配列を更に含み、第２のトランスポゾンの３’アダプター配列のどの部分も第１のトランスポゾンの５’アダプター配列に相補的ではない、実施形態６７に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態７４は、第２のトランスポゾンの３’アダプター配列が、Ａ１４配列（配列番号４）、Ａ２配列（配列番号７）、Ｂ１５配列（配列番号５）、Ｘ配列、Ｙ’配列、Ａ配列、及び／又はＢ配列を含む、実施形態７２又は７３に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態７５は、第２のトランスポゾンが、第１のトランスポゾンのＵＭＩ配列に相補的である配列を更に含む、実施形態７２又は７４に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態７６は、第２のトランスポゾンがＵＭＩを更に含み、第２のトランスポゾンのＵＭＩが、第１のトランスポゾンのＵＭＩとは異なる配列を含む、実施形態７３又は７４のトランスポソーム複合体である。
実施形態７７は、Ｂ１５配列又はＡ１４配列に相補的なオリゴヌクレオチドを更に含む、実施形態７５又は７６に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態７８は、（ａ）Ａ１４配列に隣接するＡアダプター配列、（ｂ）Ｂ１５配列に隣接するＢアダプター配列、（ｃ）ＭＥ配列に隣接するＸアダプター配列、及び／又は（ｄ）ＭＥ’配列に隣接するＹ’アダプター配列を更に含む、実施形態７６に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態７９は、トランスポソーム複合体が、第１又は第２のトランスポゾンを介して固体支持体に固定されている、実施形態６５～７８のいずれか１つに記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態８０は、トランスポソーム複合体が、相補的オリゴヌクレオチドを介して固体支持体に固定されている、実施形態７７に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態８１は、固体支持体がビーズである、実施形態７９又は８０に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態８２は、実施形態６５～８１のいずれか１つに記載のトランスポソーム複合体を含むキットである。
実施形態８３は、実施形態６５～８１のいずれか１つに記載のトランスポソーム複合体を生成するためのキットである。
追加の目的及び利点は、以下の説明において部分的に記載され、一部は説明から理解されるか、又は実践によって習得され得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせによって実現及び達成されるであろう。
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明はいずれも例示的かつ説明的のみであり、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、１つの（いくつかの）実施形態を図解し、明細書とともに本明細書に記載される原理を説明する役割を果たす。
ビーズ連結トランスポソーム（ＢＬＴ）を使用してＤＮＡ断片をタグメンテーションするために捕捉オリゴヌクレオチドが使用される実施形態を示す。 Ａ２アダプターを用いた固有分子識別子（ＵＭＩ）の組み込みを示す。この方法は、ＢＬＴをＨｙｂ２Ｙワークフローと組み合わせて、二重鎖ＵＭＩエラー補正の利点を有する配列決定に適したタグメンテーション化ＤＮＡライブラリーを作製する。ＵＭＩは、無作為化配列を含み得る。 実施例１に記載されるように調製された二重鎖ＵＭＩ ＤＮＡライブラリーの配列決定を示す。図３Ａは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐ及びプライマーの標準リード１、標準リード２、標準ｉ５、及び標準ｉ７の濃縮を伴うＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐの標準的な配列を示す。図３Ｂは、４つのカスタムプライマー及び１９回の暗サイクルを含むＮｅｘｔｅｒａ配列決定法を示す。灰色の矢印は、カスタムプライマーがアニールする場所を示す。図３Ｃは、Ｑ３０以上の割合の可能性として表される例示的な配列決定ランにおける各サイクルの品質を示す。図３Ｄは、例示的な配列決定ランにおけるｉ７及びｉ５プライマーを使用した配列決定シグナル強度を示す。図３Ｅは、ＢＬＴ二重鎖ＵＭＩ設計（図２に記載）とＴｒｕＳｉｇｈｔ ＵＭＩ（ＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｄｕｐｌｅｘ）法の二重鎖ファミリーの割合を比較する。 実施例１に記載されるように調製された二重鎖ＵＭＩ ＤＮＡライブラリーの配列決定を示す。図３Ａは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐ及びプライマーの標準リード１、標準リード２、標準ｉ５、及び標準ｉ７の濃縮を伴うＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐの標準的な配列を示す。図３Ｂは、４つのカスタムプライマー及び１９回の暗サイクルを含むＮｅｘｔｅｒａ配列決定法を示す。灰色の矢印は、カスタムプライマーがアニールする場所を示す。図３Ｃは、Ｑ３０以上の割合の可能性として表される例示的な配列決定ランにおける各サイクルの品質を示す。図３Ｄは、例示的な配列決定ランにおけるｉ７及びｉ５プライマーを使用した配列決定シグナル強度を示す。図３Ｅは、ＢＬＴ二重鎖ＵＭＩ設計（図２に記載）とＴｒｕＳｉｇｈｔ ＵＭＩ（ＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｄｕｐｌｅｘ）法の二重鎖ファミリーの割合を比較する。 実施例１に記載されるように調製された二重鎖ＵＭＩ ＤＮＡライブラリーの配列決定を示す。図３Ａは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐ及びプライマーの標準リード１、標準リード２、標準ｉ５、及び標準ｉ７の濃縮を伴うＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐの標準的な配列を示す。図３Ｂは、４つのカスタムプライマー及び１９回の暗サイクルを含むＮｅｘｔｅｒａ配列決定法を示す。灰色の矢印は、カスタムプライマーがアニールする場所を示す。図３Ｃは、Ｑ３０以上の割合の可能性として表される例示的な配列決定ランにおける各サイクルの品質を示す。図３Ｄは、例示的な配列決定ランにおけるｉ７及びｉ５プライマーを使用した配列決定シグナル強度を示す。図３Ｅは、ＢＬＴ二重鎖ＵＭＩ設計（図２に記載）とＴｒｕＳｉｇｈｔ ＵＭＩ（ＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｄｕｐｌｅｘ）法の二重鎖ファミリーの割合を比較する。 実施例１に記載されるように調製された二重鎖ＵＭＩ ＤＮＡライブラリーの配列決定を示す。図３Ａは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐ及びプライマーの標準リード１、標準リード２、標準ｉ５、及び標準ｉ７の濃縮を伴うＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐの標準的な配列を示す。図３Ｂは、４つのカスタムプライマー及び１９回の暗サイクルを含むＮｅｘｔｅｒａ配列決定法を示す。灰色の矢印は、カスタムプライマーがアニールする場所を示す。図３Ｃは、Ｑ３０以上の割合の可能性として表される例示的な配列決定ランにおける各サイクルの品質を示す。図３Ｄは、例示的な配列決定ランにおけるｉ７及びｉ５プライマーを使用した配列決定シグナル強度を示す。図３Ｅは、ＢＬＴ二重鎖ＵＭＩ設計（図２に記載）とＴｒｕＳｉｇｈｔ ＵＭＩ（ＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｄｕｐｌｅｘ）法の二重鎖ファミリーの割合を比較する。 実施例１に記載されるように調製された二重鎖ＵＭＩ ＤＮＡライブラリーの配列決定を示す。図３Ａは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐ及びプライマーの標準リード１、標準リード２、標準ｉ５、及び標準ｉ７の濃縮を伴うＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐの標準的な配列を示す。図３Ｂは、４つのカスタムプライマー及び１９回の暗サイクルを含むＮｅｘｔｅｒａ配列決定法を示す。灰色の矢印は、カスタムプライマーがアニールする場所を示す。図３Ｃは、Ｑ３０以上の割合の可能性として表される例示的な配列決定ランにおける各サイクルの品質を示す。図３Ｄは、例示的な配列決定ランにおけるｉ７及びｉ５プライマーを使用した配列決定シグナル強度を示す。図３Ｅは、ＢＬＴ二重鎖ＵＭＩ設計（図２に記載）とＴｒｕＳｉｇｈｔ ＵＭＩ（ＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｄｕｐｌｅｘ）法の二重鎖ファミリーの割合を比較する。 架橋プライマー再ハイブリダイゼーションによる二重鎖ＵＭＩ ＤＮＡライブラリーの配列決定を示す。 ＵＭＩ－ＢＬＴのトランスポソーム構造（図５Ａ）及びワークフロー（図５Ｂ）を示す。ＴｓＴｎ５＝トランスポザーゼ。 ＵＭＩ－ＢＬＴのトランスポソーム構造（図５Ａ）及びワークフロー（図５Ｂ）を示す。ＴｓＴｎ５＝トランスポザーゼ。 暗サイクルあり（図６Ａ）及び暗サイクルなし（図６Ｂ）の二重鎖ＵＭＩライブラリーの配列決定を示す。 暗サイクルあり（図６Ａ）及び暗サイクルなし（図６Ｂ）の二重鎖ＵＭＩライブラリーの配列決定を示す。 ＩＤＰＥ、ＴｒｕＳｅｑ（商標）、暗サイクルありの非フォーク型ＵＭＩ－ＢＬＴ、及び架橋プライマー再ハイブリダイゼーションを含む非フォーク型ＵＭＩ－ＢＬＴを使用した配列決定ランにおけるＱ３０％スコアを示す。Ｑ３０％スコアは、リード１及びリード２について示す。 ｃｆＤＮＡ由来の単一ＵＭＩを有するＤＮＡライブラリーの調製に使用されるＢＬＴ及び濃縮ワークフローを示す。いくつかの実施形態では、循環核酸キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ＃５５１１４）を使用してｃｆＤＮＡを抽出した。 古典的なＮｅｘｔｅｒａアダプターを用いた単一ＵＭＩの組み込みを示す。この方法は試料のインデックス化を可能にしないが、標準的な配列決定方法は、インデックスリードから組み込まれたＵＭＩを捕捉することができる。いくつかの実施形態では、標準配列決定プライマーを使用してＵＭＩを読み取る。 ＵＭＩのタグメンテーション化ＤＮＡ断片への組み込みが成功し、タグメンテーション化ライブラリー全体にわたって均一に分布したことを示す全リード％を示す。 単一のＵＭＩ－ＢＬＴライブラリーが、ＴｒｕＳｅｑ（商標）ライブラリー（図１１Ａにおいて「ＵＭＩなし」として示される）よりも大きい平均標的カバレッジ及びｃｆＤＮＡのライブラリーへのより高い変換を有することを示す。図１１Ａは、Ｒｅａｄ Ｃｏｌｌａｐｓｉｎｇ分析によって提供される重複排除した平均標的カバレッジを示す。図１１Ｂは、ＴｒｕＳｅｑ（商標）法と単一ＵＭＩ－ＢＬＴ法（図１１Ｂにおいて「ｅＢＢＮ」として示される）とを比較する。 単一のＵＭＩ－ＢＬＴライブラリーが、ＴｒｕＳｅｑ（商標）ライブラリー（図１１Ａにおいて「ＵＭＩなし」として示される）よりも大きい平均標的カバレッジ及びｃｆＤＮＡのライブラリーへのより高い変換を有することを示す。図１１Ａは、Ｒｅａｄ Ｃｏｌｌａｐｓｉｎｇ分析によって提供される重複排除した平均標的カバレッジを示す。図１１Ｂは、ＴｒｕＳｅｑ（商標）法と単一ＵＭＩ－ＢＬＴ法（図１１Ｂにおいて「ｅＢＢＮ」として示される）とを比較する。 固有二重インデックス（ＵＤＩ）に適合する配列決定用ＤＮＡライブラリーを作製するために、ＢＬＴにおいてフォーク型アダプター捕捉オリゴヌクレオチドを使用する、二重鎖ＵＭＩの組み込みを示す。 ＵＤＩに適合する配列決定用ＤＮＡライブラリーを作製するために、ＢＬＴにおいてフォーク型アダプター捕捉オリゴヌクレオチドを使用する、二重鎖ＵＭＩの組み込みを示す。 Ｈｙｂ２Ｙ、並びにヘアピン－ＵＭＩ及びユニバーサルハイブリダイゼーション５’テール（ユニバーサルハイブリダイズテール）を含有する３’アダプターとのライゲーションを示す。この方法は、Ａ１４のみのＴｎ５を利用する。ライゲーション工程はＨｙｂ２Ｙの後に行われ、伸長工程は不要である。いくつかの実施形態では、ユニバーサルハイブリダイズテールは、ユニバーサルワトソン－クリック塩基対形成が可能なイノシン塩基を含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルハイブリダイズテールは、Ａ１４及び／又はＢ１５にハイブリダイズできる。＊はライゲーション接合部を示す。いくつかの実施形態では、ユニバーサルハイブリダイゼーション５’は、Ａ１４及びＢ１５にハイブリダイズできる。 Ｈｙｂ２Ｙ、伸長、及びヘアピンＵＭＩを含有する３’アダプターとのライゲーションを示す。Ｈｙｂ２Ｙの後、伸長工程が起こり、ライゲーション工程が続く。いくつかの実施形態では、ヘアピンステムは、安定性のために３～４塩基対を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンループは約４塩基を含む。＊はライゲーション接合部を示す。 Ｈｙｂ２Ｙ、伸長、及び３’アダプター複合体とのライゲーションを示す。この方法は、Ａ１４のみのＴｎ５を利用する。いくつかの実施形態では、スプリントライゲーションアダプターは、スプリント部分及びテール部分の２つの部分を含む。各部分は、約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、Ａ１４’、ＭＥ、及び／又はＸは、切断又は除去され得る。＊はライゲーション接合部を示す。 Ａ１４のみのＴｎ５を利用する鋳型スイッチオフＭＥ配列法を示す。鋳型スイッチ伸長工程は、ハイブリダイゼーション工程の後に行われる。いくつかの実施形態では、約７０ヌクレオチドの長い鋳型スイッチを使用することができる。いくつかの実施形態では、スイッチオリゴヌクレオチドは、それ自体が二次構造（すなわち、折り畳み）を形成でき、これにより、ある実施形態において意図されるような機能を妨げる。スイッチオリゴヌクレオチドの折り畳みは、Ｐ７側のＭＥの代わりにＴｒｕＳｅｑ（商標）アダプター配列を使用することによって回避できる（＊＊＊で示される）。いくつかの実施形態では、Ａ１４’は、切断又は省略され得る。＊＊は、鋳型スイッチ接合部を示す。 ポリメラーゼ鋳型スイッチを用いた３’ＵＭＩ及びアダプター配列の付加を示す。標的ＤＮＡのタグメンテーションは、Ａ１４トランスポソームを用いて行った（図１８Ａ）。Ｈｙｂ２Ｙを用いて、一本鎖ポリメラーゼ鋳型スイッチアダプターを付加する（図１８Ｂ）。挿入ＤＮＡは、鋳型を挿入ＤＮＡからポリメラーゼ鋳型スイッチアダプターに切り替えることができるポリメラーゼを使用して伸長される（図１８Ｃ）。ＰＣＲを用いて、試料インデックス及びフローセルプライマーを使用するＡ１４及びＢ１５からのライブラリーを増幅する（図１８Ｄ）。 ポリメラーゼ鋳型スイッチを用いた３’ＵＭＩ及びアダプター配列の付加を示す。標的ＤＮＡのタグメンテーションは、Ａ１４トランスポソームを用いて行った（図１８Ａ）。Ｈｙｂ２Ｙを用いて、一本鎖ポリメラーゼ鋳型スイッチアダプターを付加する（図１８Ｂ）。挿入ＤＮＡは、鋳型を挿入ＤＮＡからポリメラーゼ鋳型スイッチアダプターに切り替えることができるポリメラーゼを使用して伸長される（図１８Ｃ）。ＰＣＲを用いて、試料インデックス及びフローセルプライマーを使用するＡ１４及びＢ１５からのライブラリーを増幅する（図１８Ｄ）。 ポリメラーゼ鋳型スイッチを用いた３’ＵＭＩ及びアダプター配列の付加を示す。標的ＤＮＡのタグメンテーションは、Ａ１４トランスポソームを用いて行った（図１８Ａ）。Ｈｙｂ２Ｙを用いて、一本鎖ポリメラーゼ鋳型スイッチアダプターを付加する（図１８Ｂ）。挿入ＤＮＡは、鋳型を挿入ＤＮＡからポリメラーゼ鋳型スイッチアダプターに切り替えることができるポリメラーゼを使用して伸長される（図１８Ｃ）。ＰＣＲを用いて、試料インデックス及びフローセルプライマーを使用するＡ１４及びＢ１５からのライブラリーを増幅する（図１８Ｄ）。 ポリメラーゼ鋳型スイッチを用いた３’ＵＭＩ及びアダプター配列の付加を示す。標的ＤＮＡのタグメンテーションは、Ａ１４トランスポソームを用いて行った（図１８Ａ）。Ｈｙｂ２Ｙを用いて、一本鎖ポリメラーゼ鋳型スイッチアダプターを付加する（図１８Ｂ）。挿入ＤＮＡは、鋳型を挿入ＤＮＡからポリメラーゼ鋳型スイッチアダプターに切り替えることができるポリメラーゼを使用して伸長される（図１８Ｃ）。ＰＣＲを用いて、試料インデックス及びフローセルプライマーを使用するＡ１４及びＢ１５からのライブラリーを増幅する（図１８Ｄ）。 ５’アダプター配列並びにポリメラーゼ伸長及び近接を使用する３’ＵＭＩの付加を示す。標的ＤＮＡのタグメンテーションは、Ａ１４トランスポソームを用いて行った（図１９Ａ）。Ｈｙｂ２Ｙを用いて、５’二本鎖アダプターを付加する（図１９Ｂ）。ポリメラーゼ伸長及び近接５’ライゲーションを用いて、ＵＭＩを挿入ＤＮＡに付加する（図１９Ｃ）。ＰＣＲを用いて、試料インデックス及びフローセルプライマーを使用するＡ１４及びＢ１５からのライブラリーを増幅する（図１９Ｄ）。 ５’アダプター配列並びにポリメラーゼ伸長及び近接を使用する３’ＵＭＩの付加を示す。標的ＤＮＡのタグメンテーションは、Ａ１４トランスポソームを用いて行った（図１９Ａ）。Ｈｙｂ２Ｙを用いて、５’二本鎖アダプターを付加する（図１９Ｂ）。ポリメラーゼ伸長及び近接５’ライゲーションを用いて、ＵＭＩを挿入ＤＮＡに付加する（図１９Ｃ）。ＰＣＲを用いて、試料インデックス及びフローセルプライマーを使用するＡ１４及びＢ１５からのライブラリーを増幅する（図１９Ｄ）。 ５’アダプター配列並びにポリメラーゼ伸長及び近接を使用する３’ＵＭＩの付加を示す。標的ＤＮＡのタグメンテーションは、Ａ１４トランスポソームを用いて行った（図１９Ａ）。Ｈｙｂ２Ｙを用いて、５’二本鎖アダプターを付加する（図１９Ｂ）。ポリメラーゼ伸長及び近接５’ライゲーションを用いて、ＵＭＩを挿入ＤＮＡに付加する（図１９Ｃ）。ＰＣＲを用いて、試料インデックス及びフローセルプライマーを使用するＡ１４及びＢ１５からのライブラリーを増幅する（図１９Ｄ）。 ５’アダプター配列並びにポリメラーゼ伸長及び近接を使用する３’ＵＭＩの付加を示す。標的ＤＮＡのタグメンテーションは、Ａ１４トランスポソームを用いて行った（図１９Ａ）。Ｈｙｂ２Ｙを用いて、５’二本鎖アダプターを付加する（図１９Ｂ）。ポリメラーゼ伸長及び近接５’ライゲーションを用いて、ＵＭＩを挿入ＤＮＡに付加する（図１９Ｃ）。ＰＣＲを用いて、試料インデックス及びフローセルプライマーを使用するＡ１４及びＢ１５からのライブラリーを増幅する（図１９Ｄ）。 挿入ＤＮＡとインラインである、すなわち隣接する３’ＵＭＩを付加する特定の実施形態を比較する。特定の実施形態では、鋳型スイッチ伸長が使用される。特定の実施形態では、伸長及びライゲーションが使用される。 トランスポソーム複合体オリゴヌクレオチドを固体支持体表面に付着させる特定の実施形態を示す。これらの実施形態は、５’ビオチン化ライブラリー断片の存在によって損なわれ得る標的濃縮法によるＢＬＴの有用性を助ける選択肢を提供する。図２１Ａは、アダプターにおける相補的塩基対合によるＴｓｍアダプターの間接的な３’ビオチン結合を示す。図２１Ｂは、直接的な３’ビオチン化結合を示す。図２１Ｃは、直接的な５’ビオチン化結合を示す。 トランスポソーム複合体オリゴヌクレオチドを固体支持体表面に付着させる特定の実施形態を示す。これらの実施形態は、５’ビオチン化ライブラリー断片の存在によって損なわれ得る標的濃縮法によるＢＬＴの有用性を助ける選択肢を提供する。図２１Ａは、アダプターにおける相補的塩基対合によるＴｓｍアダプターの間接的な３’ビオチン結合を示す。図２１Ｂは、直接的な３’ビオチン化結合を示す。図２１Ｃは、直接的な５’ビオチン化結合を示す。 トランスポソーム複合体オリゴヌクレオチドを固体支持体表面に付着させる特定の実施形態を示す。これらの実施形態は、５’ビオチン化ライブラリー断片の存在によって損なわれ得る標的濃縮法によるＢＬＴの有用性を助ける選択肢を提供する。図２１Ａは、アダプターにおける相補的塩基対合によるＴｓｍアダプターの間接的な３’ビオチン結合を示す。図２１Ｂは、直接的な３’ビオチン化結合を示す。図２１Ｃは、直接的な５’ビオチン化結合を示す。
配列の説明
表１は、本明細書中で参照される特定の配列のリストを提供する。全ての配列は、タンパク質及び核酸配列について、それぞれ、Ｎ末端からＣ末端又は５’から３’のいずれかで示されている。表１における特定の配列は、配列のライブラリー由来の例示的な配列を表す。例えば、以下のセクションＩＩ．Ａで説明されるように、「ＵＭＩ」は、ＵＭＩ配列のライブラリーを表す。別の例では、ＭＥ配列は、配列番号６の例示的なＭＥと比較した場合、配列変異を含有し得る。同様に、Ａ１４－ＭＥ配列は、配列番号１の例示的なＡ１４－ＭＥと比較した場合、配列変異を含有し得る。配列変異は、例えば、核酸突然変異、核酸置換、核酸欠失、核酸付加、核酸挿入、配列切断、より長い配列、より短い配列、ＵＭＩ配列、プライマー配列、インデックスタグ配列、捕捉配列、バーコード配列、開裂配列、アンカー配列、ユニバーサル配列、スペーサー配列、トランスポゾン末端配列、配列決定関連配列、及びそれらの任意の組み合わせを含み得る。別の例では、配列決定に関連するプライマー及びアダプターは、プライマー及びアダプターのライブラリーを指し得る。ｉ５及びｉ７配列のライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ａｄａｐｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ＃１００００００００２６９４ ｖ１５によって提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列番号１０及び１１などの例示的なカスタムプライマーにおいて、ｉ５及びｉ７部分は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ａｄａｐｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ＃１００００００００２６９４ ｖ１５によって提供されるような配列変異を含有し得る。
Ｉ．定義
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション配列」又は「ＨＹＢ」は、相補ハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズできる配列を指す。１つのライブラリー産物中のＨＹＢの別のライブラリー産物中のＨＹＢ’へのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション付加物をもたらすことができ、このとき、２つのライブラリー産物は、ＨＹＢ／ＨＹＢ’のハイブリダイゼーションを介して互いにアニールする。
本明細書で使用される「Ｈｙｂ２Ｙ」又は「Ｈｙｂ２Ｙワークフロー」は、フォーク型アダプター構造（Ｙアダプター構造としても知られる）を作製するためのＨＹＢ／ＨＹＢ’の使用を指す。全てではないがいくつかの場合において、このプロセスはまた、１つのオリゴヌクレオチドの別のオリゴヌクレオチドでの置換を包含する。
ビーズ連結トランスポソーム（ＢＬＴ）の文脈において、「Ｈｙｂ２Ｙ」、すなわち、ＨＹＢ／ＨＹＢ’を使用してフォーク型アダプター構造を生成することは、Ｔｎ５トランスポソーム生成物複合体から非転移鎖を除去し、それを、置換するオリゴヌクレオチドに対する追加の配列を含有し得る別のオリゴヌクレオチドで置換することをもたらす。そうすることで、使用されているアダプターの新しいフォーク型構造を作成するか、又は既存のフォーク型構造を維持することができる。
本明細書で使用される「インサート配列」は、ポリヌクレオチドに含まれる標的核酸の領域を指す。ポリヌクレオチドは、複数のインサート配列を含み得る。
本明細書で使用される「スタックリード」は、単一のポリヌクレオチドから生成される複数のインサート配列の配列決定リードに関する。これらの配列決定リードは連続的であり得る。例えば、２つ以上のインサート配列及び２つ以上のプライマー配列を含むポリヌクレオチドを用いて、スタックリードを生成することができる。本明細書で使用される「スタックリードライブラリー」は、スタックリードを生成するために使用され得る複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドのライブラリーを指す。
本明細書で使用される「合成による配列決定」又は「ＳＢＳ」は、リードプライマーの結合を改善するためにポリヌクレオチドに組み込まれる配列を指す。ポリヌクレオチドがタグメンテーションによって産生されるライブラリー産物から作製される実施形態では、ＳＢＳはモザイク末端配列であってもよく、ＳＢＳ’はＭＥ及びＭＥ’などのモザイク末端配列の相補体であってもよい。ライブラリー産物がＴｒｕＳｅｑ（商標）法（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して産生される場合、ＳＢＳ及びＳＢＳ’配列もアダプターに含まれ得る。
ＩＩ．トランスポゾンベースの技術を用いたＵＭＩライブラリーの調製
固有分子識別子（ＵＭＩ）は、配列決定エラーの同定及び補正、並びにＰＣＲ複製のための二本鎖核酸ライブラリーに組み込まれる核酸配列である。ＵＭＩは、多くのＤＮＡ分子が一緒に配列決定される場合に、１つのソースＤＮＡ分子を別のものから区別するために使用される。ＵＭＩは、配列決定及びＰＣＲのアーチファクト、並びにホルマリン固定、パラフィン包埋、ＦＦＰＥ組織において典型的に見出されるものなどの鎖特異的ＤＮＡ損傷由来のエラーを同定する際に役立ち得る。ＵＭＩは、ＰＣＲ増幅及び配列決定の間に生じるエラー由来のノイズの低減を可能にし、１％未満の対立遺伝子頻度で一塩基バリアント（ＳＮＶ）（例えば、無細胞ＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ中）の検出を可能にする。
本明細書に記載の材料及び方法をトランスポゾンベースの技術と共に使用して、ＵＭＩを二本鎖核酸ライブラリーに組み込むことができる。本明細書中で使用される場合、「ＵＭＩライブラリー」は、各断片が少なくとも１つのＵＭＩを含む二本鎖核酸断片のライブラリーである。本明細書に記載される特定の実施形態では、各断片は、１つ、２つ、又はそれ以上のＵＭＩを含み得る。
トランスポゾンベースの技術と組み合わされる配列決定ライブラリーを生成するための方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、トランスポゾンベースの技術は、断片の末端において固有のアダプター配列でタグ化した二本鎖核酸断片の集団を生成するための、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）による一連のＤＮＡ Ｐｒｅｐ製品に対するワークフローを含む。転位反応において使用するための種々のＨＹＢ又はＨＹＢ’配列が開示される。いくつかの実施形態では、この方法は、溶液混合物中で実行される。いくつかの実施形態では、ＢＬＴなどの固体支持体が使用される。
多くの実施形態では、ＵＭＩライブラリーを調製する方法は、二本鎖標的核酸を有する試料を１つ、２つ、又はそれ以上のトランスポソーム複合体に適用する第１の工程を含む。
いくつかの実施形態では、第１の工程の後、ＵＭＩライブラリーを調製する方法は、（１）核酸をタグメンテーションして、ＵＭＩ及びアダプター配列を含む核酸断片を生成することと、（２）トランスポソーム複合体から核酸断片を遊離させることと、（３）トランスポゾン又は伸長させたトランスポゾンを核酸断片とライゲーションすることと、（４）ＵＭＩを含む核酸断片を生成することと、を更に含む。いくつかの実施形態では、この方法は、二本鎖標的核酸断片が伸長される、遊離工程の後の任意選択の伸長工程を更に含む。この伸長工程は、ギャップ充填としても知られている。
いくつかの実施形態では、第１の工程の後、ＵＭＩライブラリーを調製する方法は、（１）核酸をタグメンテーションして、アダプター配列を含む核酸断片を生成することと、（２）トランスポソーム複合体から核酸断片を遊離させることと、（３）ＵＭＩの組み込みのために、アダプター配列及びＵＭＩを含むポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることと、を更に含む。ポリヌクレオチドは、３’末端トランスポゾン配列に完全に又は部分的に相補的である配列を更に含む。この方法は、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長させる任意選択の工程を更に含み得る。この方法は、ポリヌクレオチド又は伸長させたポリヌクレオチドをライゲーションする任意選択の工程を更に含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、ＵＭＩを有する二本鎖標的核酸断片を生成することを更に含み、このときＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’末端に直接隣接して位置する。
いくつかの実施形態では、第１の工程の後、ＵＭＩライブラリーを調製する方法は、（１）二本鎖標的核酸の第１の鎖をトランスポゾンでタグメンテーションして、第１のアダプター配列を含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（２）トランスポソーム複合体から二本鎖標的核酸断片を遊離させることと、（３）ＵＭＩ及び第２のアダプター配列を含む第１のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることと、を更に含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（１）第１のポリヌクレオチドに相補的な領域を含む第２のポリヌクレオチドを付加して二本鎖アダプターを生成する、（２）二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長する、及び／又は（３）任意選択的に、二本鎖アダプターを二本鎖標的核酸断片とライゲーションするための、任意選択の工程を更に含み得る。
いくつかの実施形態では、第１の工程の後に、ＵＭＩライブラリーを調製する方法は、（１）二本鎖標的核酸をフォーク型アダプタートランスポゾンでタグメンテーションして、第１のアダプター配列の第１及び第２のコピー、第１のＵＭＩ、第２のアダプター配列の第１及び第２のコピー、並びに第２のＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（２）トランスポソーム複合体から二本鎖標的核酸断片を遊離させることと、（３）フォーク型アダプタートランスポゾンを二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、を更に含む。いくつかの実施形態では、遊離工程の後、二本鎖標的核酸断片を伸長し、この場合、続くライゲーション工程は、伸長させたフォーク型アダプタートランスポゾンを二本鎖標的核酸断片とライゲーションする。
多くの実施形態では、ＵＭＩライブラリーが作製された後、方法は、ＵＭＩライブラリーを増幅することを更に含む。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、トランスポゾンアダプターを使用してタグメンテーション中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、ポリヌクレオチドアダプターを使用してタグメンテーション後に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、ポリヌクレオチドアダプターを伸長及び／又はライゲーションすることによって組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、ライブラリー増幅の前に組み込まれる。
これらの工程のそれぞれの態様は、以下のセクションで説明される。
Ａ．固有分子識別子（ＵＭＩ）
固有分子識別子（ＵＭＩ）は、個々の核酸分子を互いに区別するために使用され得る核酸分子に適用されるか、又は同定されるヌクレオチドの配列である。ＵＭＩは、リード配列が１つのソース核酸分子又は別のものであるかどうかを決定するために、それらが関連する核酸分子とともに配列決定され得る。「ＵＭＩ」という用語は、ポリヌクレオチドの配列情報及び物理的ポリヌクレオチド自体の両方を指すために本明細書で使用され得る。ＵＭＩは、１つの試料のリードを他の試料のリードから区別するために一般的に使用されるバーコードに類似しているが、ＵＭＩは、代わりに、個々の試料からの多くの断片が一緒に配列決定される場合、核酸鋳型断片を別の断片から区別するために使用される。ＵＭＩは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／１０８９７２号及び国際公開第２０１８／１３６２４８号に記載されるように、多くの方式で定義することができる。
ＵＭＩは、一本鎖又は二本鎖であってもよく、少なくとも５塩基、少なくとも６塩基、少なくとも７塩基、少なくとも８塩基、又はそれ以上であってもよい。特定の実施形態では、ＵＭＩは、５～８塩基、５～１０塩基、５～１５塩基、５～２５塩基、８～１０塩基、８～１２塩基、８～１５塩基、又は８～２５塩基などの長さである。更に、特定の実施形態では、ＵＭＩは、３０塩基以下、２５塩基以下、２０塩基以下、１５塩基以下の長さである。本明細書で提供されるＵＭＩ配列の長さは、配列の固有の／識別可能な部分を指してもよく、配列決定プライマーとして機能し得、異なる識別子配列を有する複数のＵＭＩ間で共通である隣接する共通又はアダプター配列（例えば、ｐ５、ｐ７）を除外し得ることを理解すべきである。
ＵＭＩは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１８／１３６２４８号に記載されるように、多くの方式で定義することができる。ＵＭＩは、アダプター中に挿入されるか、そうでなければ配列決定されるソースＤＮＡ分子中に組み込まれる、ランダム、擬似ランダム若しくは部分的ランダム、又は非ランダムヌクレオチド配列であってもよい。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは固有であり、各ＵＭＩは、試料中に存在する任意の所与のソースＤＮＡ分子について固有の識別を提供することができる。本明細書に記載されるように、トランスポゾンアダプター及びポリヌクレオチドアダプターを用いて、配列決定される標的核酸にＵＭＩを組み込むことができ、個々の配列決定された分子はそれぞれ、それを他の全ての断片から区別するのに役立つＵＭＩを有する。いくつかの実施形態では、多数の異なる物理的ＵＭＩを用いて、試料中のＤＮＡ断片を一意に同定することができる。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、それぞれ及び全てのソースＤＮＡ分子についての独自性を確実にするのに十分な長さである。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩのライブラリーは、非ランダム配列を含む。いくつかの実施形態では、非ランダムＵＭＩ（nonrandom UMI、ｎｒＵＭＩ）は、特定の実験又は適用のために事前定義される。ある特定の実施形態では、規則を使用して、セットの配列を生成するか、又はセットから試料を選択してｎｒＵＭＩを得る。例えば、セットの配列は、配列が特定のパターンを有するように生成され得る。いくつかの実施形態では、各配列は、特定の数（例えば、２、３、又は４）のヌクレオチドだけ、セット中の他の全ての配列と異なる。すなわち、ｎｒＵＭＩ配列は、特定の数より少ないヌクレオチドを置き換えることによって、任意の他の利用可能なｎｒＵＭＩ配列に変換され得ない。いくつかの実装形態では、配列決定プロセスで使用されるＵＭＩのセットは、特定の配列長を与えられた全ての可能なＵＭＩよりも少ないＵＭＩを含む。例えば、６個のヌクレオチドを有するｎｒＵＭＩｓのセットは、合計４Ａ６＝４０９６個の可能な異なる配列の代わりに、合計９６個の異なる配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＵＭＩのライブラリーは、１２０個の非ランダム配列を含む。
ｎｒＵＭＩが全ての可能な異なる配列よりも少ない配列を有するセットから選択されるいくつかの実施において、ｎｒＵＭＩの数は、ソースＤＮＡ分子の数よりも少なく、場合によっては著しく少ない。このような実施では、ｎｒＵＭＩ情報を、仮想ＵＭＩ、参照配列上のリード位置、及び／又はリードの配列情報などの他の情報と組み合わせて、同じソースＤＮＡ分子に由来する配列リードを同定することができる。
「仮想固有分子インデックス」又は「仮想ＵＭＩ」は、ソースＤＮＡ分子中の固有サブ配列である。いくつかの実施形態では、仮想ＵＭＩは、ソースＤＮＡ分子の末端又はその付近に位置する。１つ以上のこのような固有の末端位置は、単独で、又は他の情報と組み合わせて、ソースＤＮＡ分子を一意に同定できる。異なるソースＤＮＡ分子の数及び仮想ＵＭＩ中のヌクレオチドの数に応じて、１つ以上の仮想ＵＭＩは、試料中のソースＤＮＡ分子を一意に同定できる。場合によっては、ソースＤＮＡ分子を同定するために、２つの仮想固有分子識別子の組み合わせが必要とされる。このような組み合わせは極めてまれであり、おそらく試料中に１つだけ見出すことができる。いくつかの場合において、１つ以上の物理的ＵＭＩと組み合わせた１つ以上の仮想ＵＭＩは共に、ソースＤＮＡ分子を一意に同定することができる。いくつかの実施形態では、仮想ＵＭＩは、Ｎｅｘｔｅｒａ断片化プロセスに由来する断片化末端ポイントに存在する。
いくつかの実施形態では、ｒＵＭＩｓのライブラリーは、１つ以上の配列長を与えられた全ての可能な異なるオリゴヌクレオチド配列からなるＵＭＩのセットから、置き換えあり又はなしで、ランダム試料として選択されるランダムＵＭＩ（random UMI、ｒＵＭＩ）を含み得る。例えば、ＵＭＩのセット中の各ＵＭＩがｎ個のヌクレオチドを有する場合、セットは、互いに異なる配列を有する４Ａｎ個のＵＭＩを含む。４Ａｎ個のＵＭＩから選択されたランダム試料は、ｒＵＭＩを構成する。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩのライブラリーは、擬似ランダム又は部分的にランダムであり、ｎｒＵＭＩとｒＵＭＩとの混合物を含み得る。
多くの実施形態では、ＵＭＩは、当該核酸のタグメンテーション中又は後にオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを使用して標的二本鎖核酸に付加される。多くの実施形態では、ＵＭＩは、ライブラリー増幅工程の前に標的二本鎖核酸に付加される。
いくつかの実施形態では、ＴｒｕＳｉｇｈｔ（登録商標）Ｏｎｃｏｌｏｇｙワークフロー（Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ番号２００２４５８６）のＵＭＩ試薬が、本開示に従って利用され得る。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩライブラリー中の二本鎖核酸分子はそれぞれ、１つの固有ＵＭＩ配列、又は単一のＵＭＩを含む。多くの実施形態では、ＵＭＩは挿入ＤＮＡのいずれかの側に位置してもよい。いくつかの実施形態では、アダプター配列又は他のヌクレオチド配列は、ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に存在してもよい。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩライブラリーは二重鎖ＵＭＩを含み、これは単一ＵＭＩの使用と比較してエラーの検出限界を低下させる可能性がある。二重鎖ＵＭＩは、当業者が、配列決定反応において生じ得るエラーにもかかわらず、プラス鎖をそのマイナス鎖と対合させることを可能にする。このような配列決定ミスマッチは、配列決定の間に同定され、核酸断片の配列は、ミスマッチを有するにもかかわらず、なお正確に再構成され得る。いくつかの実施形態では、二重鎖ＵＭＩを含むＵＭＩライブラリーを作製する方法は、以下のセクションＩＩ．Ｃで詳細に論じるように、フォーク型アダプターを含む。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターはＢＬＴフォークアダプタである。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩライブラリー中の各二本鎖核酸断片は、２つ、３つ、又は４つのＵＭＩ配列を含む。ＵＭＩ配列は、互いに相補的である配列を有してもよく、又はそれぞれ異なる配列を有してもよい。
いくつかの実施形態では、アダプター配列又は他のヌクレオチド配列は、各ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に存在してもよい。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの５’に位置する。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のアダプター配列を表す核酸の配列は、ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に位置してもよい。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、アダプター配列とトランスポゾン末端配列との間に位置する。
多くの実施形態では、ＵＭＩは、二本鎖標的核酸断片の第１の鎖、第２の鎖、又は両方の鎖上にあってもよい。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、第１の鎖上にある。いくつかの実施形態では、ＵＭＩの第１のコピーは二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上にあり、ＵＭＩの第２のコピーは第２の鎖上にある。いくつかの実施形態では、第１のＵＭＩは第１の鎖上にあり、第２のＵＭＩは第２の鎖上にある。
１．インラインＵＭＩ
ＵＭＩは、二本鎖核酸分子上のいずれに位置してもよい。多くの実施形態では、二本鎖核酸分子上のＵＭＩの位置は様々である。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡに直接隣接して位置し、すなわち、ＵＭＩは「インラインＵＭＩ」である。いくつかの実施形態では、インラインＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’に隣接する。いくつかの実施形態では、インラインＵＭＩは、挿入ＤＮＡの５’に隣接する。現在のＢＬＴ法は、標的インサートに隣接するＭＥを含有するため、ＩｌｌｕｍｉｎａライゲーションアダプターのＵＭＩとの使用を排除する。ＵＭＩは、二本鎖核酸中のＰＣＲ複製物の除去及び低頻度変異体の検出に有用であるが、ＵＤＩは、ライブラリー配列決定及び逆多重化におけるインデックスホッピングに起因する試料の不正確なアサインメントを軽減するのに有用である。ＵＤＩは、固有のｉ５及びｉ７インデックス配列であり、両方の末端がＵＤＩを含むように、標的核酸の末端に付加される。ＵＤＩは、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｏｖａＳｅｑ ６０００システムなどのパターン化されたフローセルと共に使用される（例えば、国際公開第２０１８／２０４４２３号、同第２０１８／２０８６９９号、同第２０１／９０５５７１５号、及び同第２０１６／１７６０９１号参照、それらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。当業者は、インラインＵＭＩが、ＵＭＩライブラリーと、ＵＤＩを利用する標準的な下流ライブラリー調製物、例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ（商標）及びＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ワークフローにおける試料多重化ＰＣＲ及び配列決定試薬レシピとの適合性を可能にすることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、インラインＵＭＩと共に使用される配列決定法は、カスタムプライマー又はカスタムリードを必要としない。
いくつかの実施形態では、標準的な配列決定法を用いて、インラインＵＭＩを有するＵＭＩライブラリーを配列決定する。これらの実施形態では、ＵＭＩは、挿入核酸の３’末端に隣接する（図２０）。したがって、各ＵＭＩ及び挿入核酸配列は、それらの間のＭＥ配列を配列決定する必要なく、リード２を使用して捕捉される。これらの実施形態では、配列決定法は、暗サイクルを含まない。暗サイクルは、以下のセクションＩＩＩ．Ａで説明される。
いくつかの実施形態では、「インラインＵＭＩ」は、挿入ＤＮＡとアダプター配列との間に位置する。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、第２のアダプター配列である。
Ｂ．トランスポソーム複合体
一般に、本発明のトランスポゾン複合体は、１つ以上の目的とする核酸配列への標的化を媒介する１つ以上の要素と共に、トランスポザーゼ並びに第１及び第２のトランスポゾンを含む。
本明細書で使用されるとき、「トランスポソーム複合体」は、少なくとも１つのトランスポザーゼ（又は本明細書に記載の他の酵素）及びトランスポゾン認識配列から構成される。いくつかのそのようなシステムでは、トランスポザーゼは、転移反応を触媒することができる機能的複合体を形成するために、トランスポゾン認識配列に結合する。いくつかの態様では、トランスポゾン認識配列は、二本鎖トランスポゾン末端配列である。トランスポザーゼは、標的核酸内のトランスポザーゼ認識部位に結合し、トランスポゾン認識配列を標的核酸に挿入する。いくつかのそのような挿入事象では、トランスポゾン認識配列（又は末端配列）の１つの鎖が標的核酸に転写され、開裂事象が生じる。例示的な転位手順及びシステムは、トランスポザーゼでの使用に容易に適合され得る。
いくつかの実施形態では、この方法は、１つ、２つ、又はそれ以上のトランスポソーム複合体を含む。各トランスポソーム複合体は、同じ方法で使用することもできる他のトランスポソーム複合体とは異なるトランスポザーゼ及びトランスポゾンを含むことができる。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと、１つ、２つ、又はそれ以上のトランスポゾンとを含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと、３’トランスポゾン末端配列及び５’アダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、を含む。第１のトランスポゾンの５’アダプター配列は、Ａ１４配列（配列番号４）、Ａ２配列（配列番号７）、及び／又はＢ１５配列（配列番号５）を含み得る。いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンはまた、ＵＭＩ配列を含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体はまた、第１及び第２のトランスポゾンを含む。第２のトランスポゾンは、５’トランスポゾン末端配列を含む。第２のトランスポゾンの５’トランスポゾン末端配列は、第１のトランスポゾンの３’トランスポゾン末端配列と相補的であり得る。
いくつかの実施形態では、第２のトランスポゾンはまた、３’アダプター配列を含む。第２のトランスポゾンの３’アダプター配列は、第１のトランスポゾンの５’アダプター配列に部分的に又は完全に相補的であり得る。
いくつかの実施形態では、第２のトランスポゾンの３’アダプター配列は、第１のトランスポゾンの５’アダプター配列に相補的な部分を含有しない。
いくつかの実施形態では、第２のトランスポゾンの３’アダプター配列は、Ａ１４配列（配列番号４）、Ａ２配列（配列番号７）、Ｂ１５配列（配列番号５）、及び／又は第１のトランスポゾンのＵＭＩ配列に相補的である配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２のトランスポゾンは、ＵＭＩを更に含む。第２のトランスポゾンのＵＭＩは、第１のトランスポゾンのＵＭＩと同じ配列又は異なる配列であってもよい。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、１つ、２つ、又はそれ以上のトランスポゾンを含み、それぞれがＡ１４－ＭＥ（配列番号１）及び／又はＢ１５－ＭＥ（配列番号２）を含む配列を有する。
いくつかの実施形態では、トランスポゾン複合体は、ＭＥ（配列番号６）又はＭＥ’（配列番号３）を含む３’トランスポゾン末端配列を有する第１のトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、トランスポゾン複合体は、ＭＥ（配列番号６）又はＭＥ’（配列番号３）を含む３’トランスポゾン末端配列を有する第２のトランスポゾンを含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、Ａ１４配列（配列番号４）、Ａ２配列（配列番号７）、Ｂ１５配列（配列番号５）、ＭＥ配列（配列番号６）、及び／又はＭＥ’配列（配列番号３）に隣接する追加のアダプター配列を含む。参照により本明細書に組み込まれるＩｌｌｕｍｉｎａ Ａｄａｐｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ＃１００００００００２６９４ ｖ１５に開示されているものなど、多くの配列を追加のアダプター配列として使用することができる。いくつかの実施形態では、追加のアダプター配列は、Ａアダプター配列、Ｂアダプター配列、Ｘアダプター配列、又はＹ’アダプター配列である。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、Ｂ１５配列及び／又はＡ１４配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ビーズ又は他の材料などの固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第１又は第２のトランスポゾンを介して固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第１又は第２のトランスポゾンのアダプター配列（Ｂ１５配列又はＡ１４配列など）に相補的なオリゴヌクレオチドを介して固定化される。
１．トランスポザーゼ
「トランスポザーゼ」は、トランスポゾン末端含有組成物（例えば、トランスポゾン、トランスポゾン末端、トランスポゾン末端組成物）を有する機能的複合体を形成し、かつ二本鎖標的核酸へのトランスポゾン末端含有組成物の挿入又は転位を触媒することができる酵素を意味する。本明細書に提示されるトランスポザーゼはまた、レトロトランスポゾン及びレトロウイルスからのインテグラーゼを含み得る。
本明細書に提供されるある特定の実施形態で使用され得る例示的なトランスポザーゼとしては、Ｔｎ５トランスポザーゼ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼ、ビブリオハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）、Ｒ１及びＲ２末端配列を含むＭｕＡトランスポザーゼ及びＭｕトランスポザーゼ認識部位、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｔｎ５５２、Ｔｙ１、Ｔｎ７トランスポザーゼ、Ｔｎ／Ｏ及びＩＳ１０、Ｍａｒｉｎｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ、Ｔｃ１、Ｐ Ｅｌｅｍｅｎｔ、Ｔｎ３、細菌挿入配列、レトロウイルス、及び酵母のレトロトランスポゾンが挙げられる（又はそれによってコードされる）。より多くの例としては、ＩＳ５、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、ＩＳ９１１、及びトランスポザーゼファミリー酵素の設計されたバージョンが挙げられる。本明細書に記載される方法はまた、トランスポザーゼの組み合わせを含み、単一のトランスポザーゼのみを含むのではない。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５、Ｔｎ７、ＭｕＡ、若しくはビブリオハーベイトランスポザーゼ、又はこれらの活性変異体である。他の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ又はその変異体である。他の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ又はその変異体である。他の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ又はその活性変異体である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ、又はその活性変異体である。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ国際公開第２０１５／１６０８９５号に記載されているＴｎ５トランスポザーゼである。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対する５４、５６、３７２、２１２、２１４、２５１、及び３３８位での変異を有する、高活性Ｔｎ５である。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼ：Ｅ５４Ｋ、Ｍ５６Ａ、Ｌ３７２Ｐ、Ｋ２１２Ｒ、Ｐ２１４Ｒ、Ｇ２５１Ｒ、及びＡ３３８Ｖに対する以下の変異を有する高活性Ｔｎ５である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼ融合タンパク質は、融合伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）タグを含む。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型配列に対するアミノ酸５４、５６、及び３７２における変異を含む高活性Ｔｎ５トランスポザーゼである。いくつかの実施形態では、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼは融合タンパク質であり、任意選択で、融合タンパク質は伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）である。いくつかの実施形態では、認識部位は、Ｔｎ５型トランスポザーゼ認識部位である（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：７３６７，１９９８）。一実施形態では、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼと複合体を形成するトランスポザーゼ認識部位が使用される（例えば、ＥＺ－Ｔｎ５ＴＭトランスポザーゼ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは野生型Ｔｎ５トランスポザーゼである。
全体にわたって使用されるとき、「トランスポザーゼ」という用語は、トランスポゾン含有組成物（例えば、トランスポゾン、トランスポゾン組成物）を備えた機能複合体を形成し、インビトロ転位反応で、共にインキュベートされる二本鎖標的核酸へのトランスポゾン含有組成物の挿入又は転位を触媒することができる酵素を指す。提供される方法のトランスポザーゼはまた、レトロトランスポゾン及びレトロウイルスからのインテグラーゼを含む。提供される方法において使用され得る例示的なトランスポザーゼとしては、野生型又は変異体形態のＴｎ５トランスポザーゼ及びＭｕＡトランスポザーゼが挙げられる。
「転位反応」は、１つ以上のトランスポゾンがランダムな部位又はほぼランダムな部位で標的核酸に挿入される反応である。転位反応の必須成分は、転移トランスポゾン配列及びその相補体（すなわち、非転移トランスポゾン末端配列）、並びに機能的転位又はトランスポソーム複合体を形成するために必要な他の構成要素を含む、トランスポゾンのヌクレオチド配列を示すトランスポザーゼ及びＤＮＡオリゴヌクレオチドである。本開示の方法は、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ及びＴｎ５型トランスポゾン末端によって、又はＭｕＡ若しくはＨＹＰＥＲＭｕトランスポザーゼ並びにＲ１及びＲ２末端配列を含むＭｕトランスポゾン末端によって形成される転位複合体を用いることによって例示される（例えば、Ｇｏｒｙｓｈｉｎ，Ｉ．ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｗ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：７３６７，１９９８、及びＭｉｚｕｕｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，３５：７８５，１９８３；Ｓａｖｉｌａｈｔｉ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：４８９３，１９９５を参照されたく、それらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。しかしながら、意図された目的のために標的核酸にタグ付けするのに十分な効率で、ランダム又はほぼランダムな様式でトランスポゾン末端を挿入することができる任意の転位システムが提供される方法で使用され得る。提供される方法で使用され得る既知の転位システムの他の例としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｔｎ５５２、Ｔｙｌ、トランスポゾンＴｎ７、Ｔｎ／Ｏ及びＩＳ１０、マリナートランスポザーゼ、Ｔｅｌ、Ｐエレメント、Ｔｎ３、細菌挿入配列、レトロウイルス、並びに酵母のレトロトランスポゾン（例えば、Ｃｏｌｅｇｉｏ Ｏ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：２３８４－８，２００１；Ｋｉｒｂｙ Ｃ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１７３－８６，２００２、Ｄｅｖｉｎｅ Ｓ Ｅ，ａｎｄ Ｂｏｅｋｅ Ｊ Ｄ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：３７６５－７２，１９９４、国際特許出願第９５／２３８７５号、Ｃｒａｉｇ，Ｎ Ｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７１：１５１２，１９９６、Ｃｒａｉｇ，Ｎ Ｌ，Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ：Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：２７－４８，１９９６、Ｋｌｅｃｋｎｅｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：４９－８２，１９９６、Ｌａｍｐｅ Ｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１５：５４７０－９，１９９６、Ｐｌａｓｔｅｒｋ Ｒ Ｈ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０４：１２５－４３，１９９６、Ｇｌｏｏｒ，Ｇ Ｂ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２６０：９７－１ １４，２００４、Ｉｃｈｉｋａｗａ Ｈ，ａｎｄ Ｏｈｔｓｕｂｏ Ｅ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１８８２９－３２，１９９０、Ｏｈｔｓｕｂｏ，Ｆ ａｎｄ Ｓｅｋｉｎｅ，Ｙ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：１－２６，１９９６、Ｂｒｏｗｎ Ｐ Ｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：２５２５－９，１９８９、Ｂｏｅｋｅ Ｊ Ｄ ａｎｄ Ｃｏｒｃｅｓ Ｖ Ｇ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：４０３－３４，１９８９を参照されたく、それらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、それらに限定されない。
トランスポゾンを標的配列に挿入するための方法は、適切なインビトロ転位システムが利用可能であるか、又は当該技術分野の知識に基づいて開発し得る任意の適切なトランスポゾンシステムを使用してインビトロで実施することができる。一般に、本開示の方法で使用するための適切なインビトロ転位システムは、少なくとも、十分な純度、十分な濃度、及び十分なインビトロ転位活性のトランスポザーゼ酵素、並びにトランスポザーゼが、転位反応を触媒し得るそれぞれのトランスポザーゼと機能複合体を形成するトランスポゾンを必要とする。使用され得る好適なトランスポザーゼトランスポゾン末端配列は、トランスポザーゼの野生型、誘導体又は変異体から選択されるトランスポザーゼと複合体を形成する野生型、誘導体又は変異体トランスポゾン末端配列を含むが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼを含む。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼである。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼの２つの分子のダイマーを含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ホモダイマーであり、トランスポザーゼの２つの分子は各々、同じ型の第１及び第２のトランスポゾンに結合している（例えば、各モノマーに結合した２つのトランスポゾンの配列は同じであり、「ホモダイマー」を形成する）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、トランスポソーム複合体の２つの集団を採用する。いくつかの実施形態では、各集団におけるトランスポゾンは同じである。いくつかの実施形態では、各集団におけるトランスポソーム複合体は、ホモダイマーであり、第１の集団は、各モノマーにおいて第１のアダプター配列を有し、第２の集団は、各モノマー中に異なるアダプター配列を有する。
「トランスポゾン末端」という用語は、インビトロ転位反応で機能するトランスポザーゼ又はインテグラーゼ酵素との複合体を形成するために必要なヌクレオチド配列（「トランスポゾン末端配列」）のみを示す二本鎖核酸分子を指す。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸分子は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端は、転位反応においてトランスポザーゼと機能複合体を形成することができる。非限定的な例として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号の開示に記載されるように、トランスポゾン末端は、１９－ｂｐの外側末端（「outer end、ＯＥ」）トランスポゾン末端、内側末端（「inner end、ＩＥ」）トランスポゾン末端、又は野生型若しくは変異体Ｔｎ５トランスポザーゼによって認識される「モザイク末端」（「mosaic end、ＭＥ」）トランスポゾン末端、又はＲ１及びＲ２トランスポゾン末端を含み得る。トランスポゾン末端は、インビトロ転位反応においてトランスポザーゼ又はインテグラーゼ酵素と機能複合体を形成するのに好適な任意の核酸又は核酸類似体を含み得る。例えば、トランスポゾン末端は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾塩基、非天然塩基、修飾骨格を含むことができ、一方又は両方の鎖にニックを含むことができる。「ＤＮＡ」という用語は、トランスポゾン末端組成物に関連して本開示全体を通して使用されるが、任意の好適な核酸又は核酸類似体がトランスポゾン末端において利用され得ることを理解すべきである。
２．転移鎖及び非転移鎖
同様に、「転移鎖」という用語は、両方のトランスポゾン末端の転移部分を指す。同様に、「非転移鎖」という用語は、両方の「トランスポゾン末端」の非転移部分を指す。転移鎖の３’末端は、インビトロ転位反応で標的ＤＮＡに結合又は転移される。転移されたトランスポゾン末端配列に相補的なトランスポゾン末端配列を示す非転移鎖は、インビトロ転位反応で標的ＤＮＡに結合又は転移されない。
いくつかの実施形態では、転移鎖及び非転移鎖は、共有結合している。例えば、いくつかの実施形態では、転移及び非転移鎖配列は、単一のオリゴヌクレオチド上に、例えば、ヘアピン構成で提供される。したがって、非転移鎖の遊離末端は、転位反応によって標的ＤＮＡに直接的には結合されないが、非転移鎖は、ヘアピン構造のループによって転移鎖に連結されているため、非転移鎖は、ＤＮＡ断片に間接的に付着することになる。トランスポソーム構造並びにトランスポソームを調製及び使用する方法の更なる例は、米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号の開示に見出すことができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、３’トランスポゾン末端配列と、５’アダプター配列と、を含む、第１のトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、５’トランスポゾン末端配列を含む第２のトランスポゾンを含み、５’トランスポゾン末端配列は、３’トランスポゾン末端配列に相補的である。
したがって、いくつかの実施形態では、タグメンテーション化工程は、（１）第１のアダプター配列及び第１のＵＭＩを含む第１の鎖と、（２）第２のアダプター配列を含む第２の鎖と、を含む、二本鎖標的核酸断片を生成する。いくつかの実施形態では、第２の鎖は、第２のＵＭＩを更に含んでよい。
３．タグメンテーション
「タグメンテーション」は、断片及びタグ核酸に対するトランスポザーゼの使用を指す。タグメンテーションは、トランスポゾン末端配列（本明細書でトランスポゾンと称される）を含む１つ以上のアダプター配列で複合体化されたトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体による核酸の修飾を含む。タグメンテーションは、ＤＮＡの断片化及び二重鎖断片の両方の鎖の５’末端へのアダプターのライゲーションを同時にもたらし得る。
多くの実施形態では、タグメンテーションは、トランスポゾン末端配列及びアダプター配列を含むトランスポゾンで複合体化されたトランスポザーゼをそれぞれ含む、複数のトランスポソーム複合体を含み得る。いくつかの実施形態では、タグメンテーションは、複数のトランスポソーム複合体中の全てのアダプター配列が同一である対称タグメンテーションである。いくつかの実施形態では、タグメンテーションは、複数のトランスポソーム複合体が２つの異なるアダプター配列セットを含む標準又は非対称タグメンテーションである。アダプター配列は、以下のセクションＩＩ．Ｃで説明される。対称タグメンテーション及び非対称タグメンテーションは、国際公開第２０１５／１６８１６１号及び同第２０１７／０４０３０６号に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、方法は、第１のトランスポザーゼと、第１のトランスポゾンと、第２のトランスポゾンと、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第２のトランスポザーゼと、第３のトランスポゾンと、第４のトランスポゾンと、を更に含む。
多くの実施形態では、タグメンテーション化工程は、様々な方法で配置され得るアダプター配列及び／又はＵＭＩを有する二本鎖標的核酸断片を生成する。アダプター配列及びＵＭＩの位置（又は５’から３’へのアダプター配列及びＵＭＩの順序）は、タグメンテーションにおいて使用されるトランスポゾンアダプターに依存する。いくつかの実施形態は、タグメンテーション化工程は、第１のアダプター配列及び第１のＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成する。いくつかの実施形態では、第１のアダプター配列及び第１のＵＭＩは、核酸断片の第１の鎖上にある。
いくつかの実施形態は、タグメンテーション化工程は、第１のアダプター配列、第１のＵＭＩ、及び第２のアダプター配列を含む二本鎖標的核酸断片を生成する。いくつかの実施形態では、第１のアダプター配列及び第１のＵＭＩは、核酸断片の第１の鎖上にあり、一方第２のアダプター配列は、核酸断片の第２の鎖上にある。
いくつかの実施形態では、タグメンテーション化工程は、第１のアダプター配列、第１のＵＭＩ、第２のアダプター配列、及び第２のＵＭＩを含む二本鎖を生成する。いくつかの実施形態では、第１のアダプター配列及び第１のＵＭＩは核酸断片の第１の鎖上にあり、一方第２のアダプター配列及び第２のＵＭＩは核酸断片の第２の鎖上にある。
いくつかの実施形態では、タグメンテーション化工程は、フォーク型アダプタートランスポゾンを有する二本鎖標的核酸を生成して、第１のアダプター配列の第１及び第２のコピー、第１のＵＭＩ、第２のアダプター配列の第１及び第２のコピー、並びに第２のＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成する。
いくつかの実施形態は、タグメンテーション化工程は、第３のＵＭＩ及び／又は第４のＵＭＩを更に含む二本鎖標的核酸断片を生成する。
いくつかの実施形態では、タグメンテーション化工程は、１つ以上のアダプター配列を含み、ＵＭＩを含まない、二本鎖標的核酸を生成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のアダプター配列は、核酸断片の第１の鎖上にある。
４．固定化されたトランスポソーム複合体
その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９６８３２３０号に記載されているように、いくつかの異なる種類の固定化トランスポソームをこれらの方法で使用することができる。本明細書に提示される方法及び組成物では、トランスポソーム複合体は、固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体及び／又は捕捉オリゴヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含むポリヌクレオチドなどの１つ以上のポリヌクレオチドを介して支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼ酵素を固体支持体に結合するリンカーを介して固定化され得る。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素及びポリヌクレオチドの両方が、固体支持体に固定化される。固体支持体への分子（例えば、核酸）の固定化に言及する場合、「固定化された」及び「結合された」という用語は、本明細書では互換的に使用され、両方の用語は、明示的に又は文脈によってのいずれかで別段指示されない限り、直接的又は間接的、共有結合、又は非共有結合を包含することが意図される。いくつかの実施形態では、共有結合が使用され得るが、一般的に、必要とされるのは、例えば、核酸増幅及び／又は核酸配列決定を必要とする用途において、支持体を使用することが意図される条件下で、分子（例えば、核酸）が、支持体に固定化されたままである又は結合したままであるということである。
いくつかの実施形態では、トランスポソームは、ビオチンタグを含むトランスポゾンを使用して固定化される。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の複合体の密度で固体支持体上に存在する。
いくつかの実施形態では、固定化ライブラリー中の二本鎖断片の長さは、固体支持体上のトランスポソーム複合体の密度を増加又は減少させることによって調整される。
ａ）捕捉オリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体上に固定化される。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡの３’末端は、捕捉オリゴヌクレオチドに結合する。
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの３’末端は、捕捉オリゴヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体上に標的ＲＮＡを固定化するように機能し得る。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、ポリＴ配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡであり、ｍＲＮＡは、ポリＴ配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドに結合する。
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、ポリＴ配列を含まない。
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、Ｐ５又はＰ７配列を介してビーズに固定化される。
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、固定化トランスポソームの第１のポリヌクレオチドに含まれる第１のタグにも存在するタグを含む。
ｂ）固体支持体
特定の実施形態は、ポリヌクレオチドなどの生体分子への共有結合を可能にする反応基を含む中間材料の層又はコーティングの適用によって機能化された不活性基質又はマトリックス（例えば、ガラススライド、ポリマービーズなど）から構成される固体支持体を利用することができる。このような支持体の例としては、ガラスなどの不活性基質上に支持されるポリアクリルアミドヒドロゲル、特に国際公開第２００５／０６５８１４号及び米国特許出願公開第２００８／０２８０７７３号に記載されているポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これらに限定されず、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。そのような実施形態では、生体分子（ポリヌクレオチド）は、中間材料（例えば、ヒドロゲル）に直接共有付着してもよいが、中間材料は、それ自体が基質又はマトリックス（例えば、ガラス基質）に非共有結合してもよい。用語「固体支持体への共有結合」は、この種類の配列を包含するように適宜解釈されるべきである。
「固体表面」、「固体支持体」という用語、及び本明細書の他の文法的等価物は、トランスポソーム複合体の結合に適切であるか、又は適切であるように修飾され得る任意の材料を指す。当業者によって理解されるように、可能な基質の数は非常に多い。可能な基質としては、ガラス及び変性又は機能化ガラス、プラスチック（例えば、アクリル、ポリスチレン、並びにスチレン及び他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）など）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロース、セラミックス、樹脂、シリカ、又はシリコン及び変性シリコンを含むシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバ束、並びに様々な他のポリマーを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、特に有用な固体支持体及び固体表面は、フローセル装置内に配置される。例示的なフローセルは、以下に更に詳細に示される。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、規則的なパターンでのトランスポソーム複合体の固定に好適なパターン化された表面を含む。「パターン化された表面」は、固体支持体の露出層内又はその上における、異なる領域の配置を指す。例えば、領域のうちの１つ以上は、１つ以上のトランスポソーム複合体が存在する特徴であり得る。この特徴は、トランスポソーム複合体が存在しない間質領域によって分離され得る。いくつかの実施形態では、パターンは、行及び列にある特徴のｘ－ｙフォーマットであり得る。いくつかの実施形態では、パターンは、特徴及び／又は間質領域の反復配置であり得る。いくつかの実施態様では、パターンは、特徴及び／又は間質領域のランダム配置であり得る。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、固体支持体上にランダムに分布している。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、パターン化された表面上に分布している。本明細書に記載される方法及び組成物において使用することができる例示的なパターン化表面は、米国特許出願第１３／６６１，５２４号又は米国特許出願公開第２０１２／０３１６０８６（Ａ１）号に記載されており、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面にウェル又は窪みのアレイを含む。これは、フォトリソグラフィ、スタンピング技術、成形技術、及びマイクロエッチング技術を含むがこれらに限定されない様々な技術を使用して、当該技術分野において一般的に既知であるように加工することができる。当該技術分野において理解されるように、使用される技術は、アレイ基板の組成物及び形状に依存する。
固体支持体の組成及び幾何学的形状は、その使用によって異なり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、スライド、チップ、マイクロチップ及び／又はアレイなどの平面構造である。したがって、基質の表面は、平面層の形態であり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、フローセルの１つ以上の表面を含む。本明細書で使用するとき、用語「フローセル」は、１つ又はそれ以上の流体試薬を流通させることができる固体表面を含むチャンバを指す。本開示の方法において容易に使用することができるフローセル及び関連する流体システム及び検出プラットフォームの例は、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第２００４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第１９９１／０６６７８号、同第２００７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、同第７，２１１，４１４号、同第７，３１５，０１９号、同第７，４０５，２８１号、及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、固体支持体又はその表面は、チューブ又は容器の内面又は外面などの非平面である。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ミクロスフェア又はビーズを含む。本明細書における「ミクロスフェア」又は「ビーズ」又は「粒子」又は文法的均等物は、小さな離散粒子を意味する。好適なビーズ組成物としては、プラスチック、セラミックス、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾル（thoria sol）、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックス、又はセファロースなどの架橋デキストラン、セルロース、ナイロン、架橋ミセル、及びテフロン（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されず、並びに固体支持体について本明細書に概説される任意の他の材料を全て使用することができる。Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｄ．の「Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ」は、有用なガイドである。ある特定の実施形態では、ミクロスフェアは、磁気ミクロスフェア又はビーズである。
ビーズは球状である必要はない。不規則な粒子を使用してもよい。代替的に又は追加的に、ビーズは多孔質であってもよい。ビーズサイズは、ナノメートル、すなわち、１００ｎｍから、ミリメートル、すなわち、１ｍｍまでの範囲であり、ビーズは約０．２ミクロン～約２００ミクロン、又は約０．５～約５マイクロメートルであるが、いくつかの実施形態では、より小さな又はより大きなビーズが使用されてもよい。
これらの表面結合トランスポソームの密度は、第１のポリヌクレオチドの密度を変化させることによって、又は固体支持体に付加されるトランスポザーゼの量によって、調節することができる。例えば、いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、１ｍｍ２あたり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の複合体の密度で固形支持体上に存在する。
支持体への核酸の結合は、剛性又は半剛性にかかわらず、共有結合又は非共有結合を介して起こり得る。例示的な結合は、米国特許第６，７３７，２３６号、同第７，２５９，２５８号、同第７，３７５，２３４号、同第７，４２７，６７８号、及び米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５（Ａ１）号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、核酸又は他の反応成分は、ゲル又は他の半固体支持体に結合され得、これは次に、固相支持体に結合又は接着される。このような実施形態では、核酸又は他の反応成分は、固相であると理解される。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、微小粒子、ビーズ、平面支持体、パターン化された表面、又はウェルを含む。いくつかの実施形態では、平面支持体は、チューブの内面又は外面である。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、その上に固定化されて調製されたタグ付きＤＮＡ断片のライブラリーを有する。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、その上に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドと第１のポリヌクレオチドとを含み、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列及び第１のタグを含む３’部分を含む。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、トランスポソーム複合体を形成するために第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを更に含む。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、その上に固定化された捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含む。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、トランスポソーム複合体を形成するために第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを更に含む。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるような固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、トランスポザーゼを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、逆転写酵素ポリメラーゼを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＤＮＡを固定化するための第２の固体支持体を更に含む。
５．液相トランスポソーム複合体
トランスポソーム複合体は、液相トランスポソーム複合体であってもよい。これらの液相トランスポソーム複合体は可動性であってもよく、固体支持体に固定化されていなくてもよい。いくつかの実施形態では、液相トランスポソーム複合体を使用して、溶液中でタグ付き断片を生成する。
更に、本方法は、液相トランスポソーム複合体を伴う工程を含んでもよい。例えば、本明細書に提示される方法は、溶液中にトランスポソーム複合体を提供し、ＤＮＡがトランスポソーム複合体溶液によって断片化される条件下で、液相トランスポソーム複合体を固定化断片と接触させる工程であって、それによって、溶液中に１つの末端を有する固定化核酸断片を得ることを更に含み得る。いくつかの実施形態では、溶液中のトランスポソーム複合体は、第２のタグを含むことができ、その結果、方法は、第２のタグを有する固定化核酸断片を生成し、第２のタグは溶液中にある。第１及び第２のタグは、異なるか又は同じであり得る。
いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ断片が液相トランスポソーム複合体によって更に断片化される条件下で、液相トランスポソーム複合体を二本鎖核酸と接触させることであって、それによって、溶液中に１つの末端を有する固定化核酸断片を得ることを更に含み得る。
いくつかの実施形態では、液相トランスポソーム複合体は、第２のタグを含み、それによって、溶液中に第２のタグを有する固定化核酸断片を生成する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のタグは異なる。いくつかの実施形態では、液相トランスポソーム複合体の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、第２のタグを含む。
いくつかの実施形態では、表面結合トランスポソームの１つの形態は、固体支持体上に主に存在する。例えば、いくつかの実施形態では、当該固体支持体上に存在するタグの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、同じタグドメインを含む。そのような実施形態では、表面結合トランスポソームとの最初のタグメンテーション反応後、ブリッジ構造の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、ブリッジの各末端に同じタグドメインを含む。第２のタグメンテーション反応は、ブリッジを更に断片化する溶液からのトランスポソームを付加することによって行われ得る。いくつかの実施形態では、液相トランスポソームのほとんど又は全ては、第１のタグメンテーション反応において生成されたブリッジ構造上に存在するタグドメインとは異なるタグドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、液相トランスポソーム中に存在するタグの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、第１のタグメンテーション反応において生成されたブリッジ構造上に存在するタグドメインとは異なるタグドメインを含む。
いくつかの実施形態では、鋳型の長さは、標準的なクラスター化学を使用して好適に増幅され得るものよりも長い。例えば、いくつかの実施形態では、鋳型の長さは、少なくとも１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、２４００ｂｐ、２５００ｂｐ、２６００ｂｐ、２７００ｂｐ、２８００ｂｐ、２９００ｂｐ、３０００ｂｐ、３１００ｂｐ、３２００ｂｐ、３３００ｂｐ、３４００ｂｐ、３５００ｂｐ、３６００ｂｐ、３７００ｂｐ、３８００ｂｐ、３９００ｂｐ、４０００ｂｐ、４１００ｂｐ、４２００ｂｐ、４３００ｂｐ、４４００ｂｐ、４５００ｂｐ、４６００ｂｐ、４７００ｂｐ、４８００ｂｐ、４９００ｂｐ、５０００ｂｐ、１００００ｂｐ、３００００ｂｐ、又は１００，０００ｂｐである。そのような実施形態では、第２のタグメンテーション反応は、次いで、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，６８３，２３０号に記載されるように、ブリッジを更に断片化する溶液からのトランスポソームを付加することによって行われ得る。したがって、第２のタグメンテーション反応は、ブリッジの内部スパンを除去することができ、更なる配列決定工程の準備ができているクラスターに変換することができる表面に固定された短い切り端を残す。特定の実施形態では、鋳型の長さは、上で例示したものから選択される上限及び下限によって規定される範囲内であり得る。
Ｃ．アダプター
本明細書で使用される「アダプター」は、１つ以上の所望の意図される目的又は用途のための１つ以上の「アダプター配列」を示すトランスポゾン又はポリヌクレオチドを指す。アダプターは、任意の所望の目的のために提供される任意の配列を含むことができる。
アダプターは、５’アダプター又は３’アダプターであってよい。５’アダプターは、標的核酸分子の５’末端に連結されることを意図して使用される。３’アダプターは、標的核酸分子の３’末端に連結されることを意図している。
いくつかの実施形態では、アダプター配列は、増幅反応のためのプライマーとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、配列決定反応のためのプライマーとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、ＵＭＩの組み込みのためのポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。そのような実施形態では、ＨＹＢ／ＨＹＢ’又はＨｙｂ２Ｙワークフローを使用して、ＵＭＩを組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、アダプター配列は、ＵＭＩ、プライマー配列、インデックスタグ配列、捕捉配列、バーコード配列、開裂配列、アンカー配列、ユニバーサル配列、スペーサー領域、トランスポゾン末端配列、若しくは配列決定関連配列、又はそれらの組み合わせを含む。本明細書で使用される場合、配列決定関連配列は、後の配列決定工程に関連する任意の配列であり得る。配列決定関連配列は、下流の配列決定工程を単純化するように作用し得る。例えば、配列決定関連配列は、他の点でアダプターを核酸断片にライゲーションする工程を介して組み込まれる配列であり得る。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、特定の配列決定方法においてフローセルへの結合を容易にするために、Ｐ５又はＰ７配列（又はそれらの相補体）を含む。任意の他の適切な特徴がアダプターに組み込まれ得ること、及びアダプター配列が任意の組み合わせで使用され得、５’から３’への任意の順序で配置され得ることが理解される。いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端配列は、モザイク末端配列（ＭＥ）である。
アダプターは、１つ、２つ、又はそれ以上のリード配列決定アダプター配列を含み得る。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、５’第１リード配列決定アダプター配列である。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、５’第２リード配列決定アダプター配列である。いくつかの実施形態では、第１のリード及び／又は第２のリード配列決定アダプター配列は、固有プライマー結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、アダプター配列は、５ｂｐ～２００ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、１０ｂｐ～１００ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、２０ｂｐ～５０ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ｂｐの長さを有する配列を含む。
種々の配列がアダプターにおいて使用され得るが、以下に提供されるのは、アダプター配列、固有プライマー結合部位、ポリヌクレオチド、又はトランスポゾン末端配列（ＭＥ）において使用され得る特定の配列である。配列は、任意の組み合わせで使用されてもよく、５’から３’の順序で配置されてもよい。Ａ１４－ＭＥ、ＭＥ、Ｂ１５－ＭＥ、ＭＥ’、Ａ１４、Ｂ１５、及びＭＥの例示的な配列を以下に示す。
Ａ１４－ＭＥ：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号１）
Ｂ１５－ＭＥ：５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号２）
ＭＥ’：５’－ｐｈｏＳ－ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ－３’（配列番号３）
Ａ１４：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
Ｂ１５：５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ－３’（配列番号５）
ＭＥ：ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号６）
Ａ２：ＴＣＡＣＴＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣ（配列番号７）
いくつかの実施形態では、アダプター配列は、タグメンテーション中に組み込まれる。これらの実施形態では、アダプター配列を有するトランスポゾンが、タグメンテーション工程において使用される。
いくつかの実施形態では、アダプター配列は、アダプターライゲーション工程中に組み込まれる。これらの実施形態では、アダプター配列を有するポリヌクレオチドが、ライゲーション工程において使用される。いくつかの実施形態では、１つ、２つ、又はそれ以上のポリヌクレオチドが使用され得る。
１．フォーク型アダプター
いくつかの実施形態では、アダプターは、Ｙ字型アダプターとしても知られるフォーク型アダプターであってもよい。フォーク型アダプターに基づく技術は、例えば、ＴｒｕＳｅｑ（商標）試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）のワークフローにおいて例示されるような、ポリヌクレオチドを生成するために利用することができる。また、ＴｒｕＳｉｇｈｔ（登録商標）Ｏｎｃｏｌｏｇｙキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）のワークフローの試薬を使用して、フォーク型アダプターをアセンブルすることもできる。多くの実施形態では、ＨＹＢ／ＨＹＢ’ワークフローを用いて、フォーク型アダプターを生成する。
本明細書で使用される場合、「フォーク型アダプター」は、核酸の２つの鎖を含むアダプターを指し、２つの鎖はそれぞれ、他方の鎖に相補的である領域及び他方の鎖に相補的ではない領域を含む。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプター中の２つの鎖の核酸は、ライゲーションの前に一緒にアニーリングされ、アニーリングは、相補的領域に基づく。いくつかの実施形態では、相補的領域は、それぞれ１２ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターは、二本鎖ＤＮＡ断片の末端で両方の鎖にライゲーションされる。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターは、二本鎖ＤＮＡ断片の一方の末端にライゲーションされる。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターは、二本鎖ＤＮＡ断片の両端にライゲーションされる。いくつかの実施形態では、断片の対向する末端上のフォーク型アダプターは異なる。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターの一方の鎖は、断片へのライゲーションを促進するために、その５’でリン酸化される。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターの一方の鎖は、３’Ｔの直前にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、３’Ｔはオーバーハングである（すなわち、フォーク型アダプターの他方の鎖中のヌクレオチドと対形成していない）。いくつかの実施形態では、３’Ｔオーバーハングは、ライブラリー断片上に存在するＡテールと塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート結合は、３’Ｔオーバーハングのエキソヌクレアーゼ消化をブロックする。いくつかの実施形態では、部分的に相補的なプライマーを用いるＰＣＲは、末端を伸長し、フォークを分解するためにアダプターライゲーションの後に使用される。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、次の構造を有する。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、次の構造を有する。
２．トランスポゾンアダプター
いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、タグメンテーション化工程中に組み込まれる。これらの実施形態では、ＵＭＩを組み込むために使用されるアダプターはトランスポゾンである。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、アダプター配列と３’トランスポゾン末端配列との間に位置する。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、ＵＭＩと３’末端トランスポゾン末端配列との間に位置する。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、フォーク型アダプタートランスポゾンである。フォーク型アダプターは、２つの鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプタートランスポゾンの第１の鎖は、３’末端トランスポゾン末端配列と、アダプター配列と、ＵＭＩとを含む。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプタートランスポゾンの第２の鎖は、アダプター配列と、第１のフォーク型アダプタートランスポゾンの第１の鎖に完全に又は部分的に相補的である配列とを含む。第１及び第２の鎖において完全な又は部分的な相補性を有する配列は、２つの鎖がハイブリダイズして、フォーク型構造を形成することを可能にする。
いくつかの実施形態では、２つ以上のフォーク型アダプタートランスポゾンを用いて、２つ以上のＵＭＩ及び２つ以上のアダプター配列をライブラリーに組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、２つのフォーク型アダプタートランスポゾンを用いて、２つのＵＭＩ及び４つのアダプター配列をライブラリーに組み込む。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸をフォーク型アダプタートランスポゾンでタグメンテーションすることにより、２つのＵＭＩ、第１のアダプター配列の第１及び第２のコピー、並びに第２のアダプター配列の第１及び第２のコピーを有する二本鎖標的核酸断片が生成される。
いくつかの実施形態では、２つのフォーク型アダプタートランスポゾンを用いて、４つのＵＭＩ及び４つのアダプター配列をライブラリーに組み込む。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸をフォーク型アダプタートランスポゾンでタグメンテーションすることにより、４つのＵＭＩ及び４つのアダプター配列を有する二本鎖標的核酸断片が生成される。
いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の固有プライマー結合配列を更に含む。いくつかの実施形態では、固有プライマー結合配列は、Ｈｙｂ２Ｙワークフローにおいて使用される。いくつかの実施形態では、固有プライマー結合配列は、カスタム配列決定プライマーをアニーリングするために使用される。いくつかの実施形態では、固有プライマー結合配列は、Ａ２、Ａ１４、及び／又はＢ１５を含む。
３．ポリヌクレオチドアダプター
いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、タグメンテーションの後に組み込まれる。これらの実施形態では、ＵＭＩを組み込むために使用されるアダプターはポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、この方法は、１つ、２つ、又はそれ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＵＭＩと、１つ、２つ、又はそれ以上のアダプター配列とを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、相補的配列を介して他のポリヌクレオチド又はトランスポゾンにハイブリダイズするための領域を含む。例えば、ポリヌクレオチドは、３’末端トランスポゾン配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、ハイブリダイズ工程において処理されて、フォーク型アダプターを生成する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの一部は、３’アダプターを含み得る。３’アダプターは、ヘアピンＵＭＩ、ユニバーサルハイブリダイズテール、スプリントライゲーションアダプター、及び／又は鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヘアピンＵＭＩを含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドは、ユニバーサルハイブリダイズテールを更に含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンＵＭＩは、伸長及び／又はライゲーション工程中は安定であるが、この方法の増幅工程中は安定ではない。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、３又は４塩基対ステムを含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルハイブリダイズテールは、任意のＤＮＡ分子に結合できるイノシンなどのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、スプリントライゲーションアダプターを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを含む。
Ｄ．タグメンテーション後の伸長及びライゲーション工程
いくつかの実施形態では、タグメンテーション事象後に残された核酸配列中のギャップは、伸長工程を使用して埋めることができる。一般に、伸長工程の後にライゲーション工程が続く。伸長及び／又はライゲーションは、適切な条件を使用して行われる。いくつかの実施形態では、使用される緩衝液は、伸長－ライゲーションミックス緩衝液（例えば、伸長－ライゲーションミックス緩衝液３、ＥＬＭ３）である。Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌ Ｅｘｏ－（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０３Ｓ）又はＴｔａｑ６０８などのポリメラーゼを、かかる伸長及び／又はライゲーション工程において使用できる。Ｔａｑポリメラーゼ、又は前述のポリメラーゼのいずれかの変異体、アナログ、若しくは誘導体もまた、この工程において代わりに使用され得る。
いくつかの実施形態では、二本鎖標的核酸断片が伸長される。いくつかの実施形態では、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖が伸長される。
いくつかの実施形態では、二本鎖標的核酸断片の３’末端は、トランスポゾンの５’末端まで伸長される。
いくつかの実施形態では、伸長工程は、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端からヘアピンＵＭＩの５’末端まで伸長させることを含む。
いくつかの実施形態では、伸長工程は、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰ混合物を含むものなどの、鎖置換伸長反応を用いて行われる。
いくつかの実施形態では、伸長工程の後にライゲーションが続く。これらの実施形態では、方法は、ポリメラーゼ及びリガーゼを処理して、核酸鎖を伸長及びライゲーションして、完全な二本鎖タグ化断片を生成することを含み得る。
いくつかの実施形態では、伸長工程は、９塩基伸長させることを含む。
いくつかの実施形態では、伸長工程は、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端からスプリントライゲーションアダプターの５’末端まで伸長させることを含む。
いくつかの実施形態では、伸長工程は、二本鎖標的核酸断片の第１の鎖をコピーすることによって、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端から鋳型スイッチオリゴヌクレオチド内の接合部まで伸長させることを含む。
いくつかの実施形態では、転位事象後に残された核酸配列中にギャップは存在しない。これらの実施形態では、方法は、リガーゼを使用してトランスポゾン又はポリヌクレオチドを二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることを含み、伸長工程は使用されない。
ＴｒｕＳｅｑ及びＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ５００（例えば、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｖ２ Ｇｕｉｄｅ、１５０２６４９５ Ｒｅｖ．Ｆ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，２０１４を参照されたい）など、アダプターライゲーションの工程を含む多種多様なライブラリー調製方法が当技術分野で公知である。例示的なライゲーションされたフォーク型アダプターは、国際公開第２００７／０５２００６号、米国特許出願公開第２０２０／００８０１４５号、米国特許第９，８６８，９８２号、及び国際公開第２０２０／１４４３７３号に記載されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。他のライゲーション方法と共に使用されるアダプターを、この方法において使用してもよい（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ａｄａｐｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，２０２１参照）。特に、アダプターライゲーションは、タグメンテーションによって断片をタグ化する方法（アダプター配列が転位反応中に断片に組み込まれる）と比較して、アダプター（より長いアダプターなど）のより柔軟な組み込みを可能にし得る。タグメンテーションを含むいくつかの方法において、更なるアダプター配列がＰＣＲ反応によって組み込まれてもよく、この方法は、更なるアダプター配列を組み込むための更なるＰＣＲ工程の必要性を排除し得る。
ライゲーション技術は、配列決定のためのＮＧＳライブラリーを調製するために一般的に使用される。いくつかの実施形態は、ライゲーション工程は、酵素を用いて、特殊化されたアダプターをＤＮＡ断片の両端に接続する。いくつかの実施形態では、Ａ塩基は、各鎖の平滑末端に付加され、配列決定アダプターへのライゲーションのためにそれらを調製する。いくつかの実施形態では、各アダプターはＴ塩基オーバーハングを含有し、アダプターをＡテール断片化ＤＮＡにライゲーションするための相補的オーバーハングを提供する。
アダプターライゲーションプロトコールは、他の方法よりも有利であることが知られている。例えば、アダプターライゲーションを用いて、シングルリード、ペアエンドリード、及びインデックスリードのための配列決定プライマーハイブリダイゼーション部位の完全な相補体を生成することができる。いくつかの実施形態では、アダプターライゲーションは、インデックスタグ及びインデックスプライマー部位を付加するための更なるＰＣＲ工程の必要性を排除する。
いくつかの実施形態では、ライゲーション工程は、二本鎖標的核酸断片の３’末端のトランスポゾンの５’末端とのライゲーションを含む。
いくつかの実施形態では、ライゲーション工程は、二本鎖標的核酸断片の３’末端の複数のトランスポゾンの５’末端とのライゲーションを含む。
いくつかの実施形態では、ライゲーション工程は、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端とユニバーサルハイブリダイズテールの５’末端とのライゲーションを含む。
いくつかの実施形態では、ライゲーション工程は、伸長させた二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端とスプリントライゲーションアダプターの第１の鎖の５’末端とのライゲーションを含む。
Ｅ．鋳型切り替え
いくつかの実施形態では、核酸断片のトランスポソーム複合体からの遊離後に、鋳型スイッチ又は鎖交換工程を実施することができる。いくつかの実施形態では、この鋳型切り替え工程の後に、ギャップ充填及びライゲーションが続く。いくつかの実施形態では、この方法は、チューブ内又はフローセル内で行われ得る。
鋳型切り替えは、ポリメラーゼが、新たに合成された鎖に依然として結合しながら伸長を中断し、別の核酸鎖で合成を再開する能力を指す。いくつかの実施形態では、（１）伸長、（２）鋳型切り替え、及び（３）タグメンテーション後の合成の再開の工程は、ＤＮＡ鋳型切り替えが可能なポリメラーゼによって行われる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素である。
いくつかの実施形態では、鋳型は、二本鎖標的核酸断片の第１の鎖から、３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの不対領域に切り替えられる。いくつかの実施形態では、コピー工程が鋳型切り替え工程の後に続き、３’スイッチオリゴヌクレオチドの不対領域を、鋳型スイッチオリゴヌクレオチド中の接合部からかかる不対領域の５’末端にコピーする。
Ｆ．増幅
ＵＭＩライブラリーを、任意選択的に、当該技術分野で公知の任意の適切な増幅法に従って増幅し、１つ以上の配列決定プライマーを用いて配列決定することができる。いくつかの実施形態では、ＵＭＩライブラリーは、固体支持体上で増幅される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ＢＬＴタグメンテーションが起こる同じ固体支持体である。このような実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物は、試料調製物が、最初の試料導入工程から、増幅まで、及び任意選択的に配列決定工程まで、同じ固体支持体上で進行することを可能にする。
例えば、いくつかの実施形態では、ＵＭＩライブラリーは、米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の開示によって例示されるように、クラスター増幅法を使用して増幅され、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の組み込まれている材料は、固定されている核酸分子のクラスター又は「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅産物を固体支持体上に固定することを可能にする固相核酸増幅の方法を記載する。そのようなアレイ上の各クラスター又はコロニーは、複数の同一の固定化されたポリヌクレオチド鎖及び複数の同一の固定化された相補的ポリヌクレオチド鎖から形成される。そのように形成されたアレイは、本明細書では一般に「クラスター化アレイ」と称される。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号に記載されているような固相増幅反応の産物は、固定されているポリポリヌクレオチド鎖と固定されている相補鎖の対をアニーリングすることによって形成されるいわゆる「架橋（bridged）」構造体であり、両方の鎖は、いくつかの実施形態では、共有結合を介して、５’末端で固体支持体上に固定されている。クラスター増幅方法論は、固定化された核酸鋳型を使用して固定化されたアンプリコンを産生する方法の例である。他の好適な方法を用いて、本明細書で提供される方法に従って生成されたＵＭＩライブラリーから固定されたアンプリコンを生成することもできる。例えば、１つ以上のクラスター又はコロニーは、増幅プライマーの各対の一方又は両方のプライマーが固定化されているかどうかにかかわらず、固相ＰＣＲによって形成することができる。
他の実施形態では、ＵＭＩライブラリーは、溶液中で増幅される。例えば、いくつかの実施形態では、核酸断片は、開裂されるか、又は別の方法で固体支持体から遊離され、次いで増幅プライマーは、溶液中で遊離分子にハイブリダイズされる。他の実施形態では、増幅プライマーを、１つ以上の初期の増幅工程のために核酸断片にハイブリダイズさせ、その後溶液中の後続の増幅工程を行う。したがって、いくつかの実施形態では、固定化された核酸鋳型を使用して、液相アンプリコンを産生することができる。
本明細書に記載されるか、又は当該技術分野において一般に既知である増幅法のいずれも、ＵＭＩライブラリーを増幅するために、ユニバーサル又は標的特異的プライマーと共に利用され得ることを理解されたい。増幅のための好適な方法には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，００３，３５４号に記載されるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）及び核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれるが、これらに限定されない。上記の増幅方法を使用して、関心対象の１つ以上の核酸を増幅することができる。例えば、マルチプレックスＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどを含むＰＣＲを利用してＵＭＩライブラリーを増幅することができる。いくつかの実施形態では、関心対象の核酸に特異的に向けられるプライマーは、増幅反応に含まれる。
ポリヌクレオチドの増幅に好適な他の方法としては、オリゴヌクレオチド伸長及びライゲーション、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５－２３２（１９９８）、参照により本明細書に組み込まれる）、及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（oligonucleotide ligation assay、ＯＬＡ）（一般に米国特許第７，５８２，４２０号、同第５，１８５，２４３号、同第５，６７９，５２４号、及び同第５，５７３，９０７号、欧州特許第０３２０３０８（Ｂ１）号、欧州特許第０３３６７３１（Ｂ１）号、欧州特許第０４３９１８２（Ｂ１）号、国際公開第９０／０１０６９号、国際公開第８９／１２６９６号、及び国際公開第８９／０９８３５号、その全てが参照により組み込まれる）技術、を挙げることができる。これらの増幅方法論は、ＵＭＩライブラリーを増幅するように設計され得ることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態では、増幅方法は、目的の核酸に特異的に向けられるプライマーを含むライゲーションプローブ増幅又はオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応を含み得る。いくつかの実施形態では、増幅方法は、目的の核酸に特異的に指向されるプライマーを含有するプライマー伸長ライゲーション反応を含んでもよい。目的の核酸を増幅するように特別に設計することができるプライマー伸長及びライゲーションプライマーの非限定的な例として、増幅は、米国特許第７，５８２，４２０号及び同第７，６１１，８６９号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に例示されるようなＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に使用されるプライマーを含み得る。
本開示の方法で使用され得る例示的な等温増幅方法としては、例えばＤｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５２６１－６６（２００２）により例示される多置換増幅（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＭＤＡ）、又は例えば米国特許第６，２１４，５８７号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により例示される等温鎖置換核酸増幅が挙げられるが、これらに限定されない。本開示で使用され得る他の非ＰＣＲベースの方法としては、例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５、米国特許第５，４５５，１６６号、及び同第５，１３０，２３８号、並びにＷａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１－９６（１９９２）に記載されている鎖置換増幅（ＳＤＡ）又は例えば、Ｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：２９４－３０７（２００３）に記載されている超分枝鎖置換増幅が挙げられ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。等温増幅法は、ゲノムＤＮＡのランダムプライマー増幅のために、鎖置換Ｐｈｉ ２９ポリメラーゼ又はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大型断片、５’→３’エキソ－とともに使用することができる。これらのポリメラーゼの使用は、それらの高い加工性及び鎖置換活性を利用する。高い加工性により、ポリメラーゼは、１０～２０ｋｂの長さの断片を産生することが可能になる。上記のように、クレノウポリメラーゼなどの低いプロセッシビティと鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して、等温条件下でより小さな断片を産生することができる。増幅反応、条件、及び成分の更なる説明は、米国特許第７，６７０，８１０号の開示に詳細に記載されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
本開示において有用な別の核酸増幅法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｒｏｔｈｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（５）：１３２１－２（１９９３）に記載されるように、定常５’領域の後にランダム３’領域が続く２ドメインプライマーの集団を使用するタグ付きＰＣＲである。増幅の第１のラウンドは、ランダムに合成された３’領域からの個々のハイブリダイゼーションに基づいて、熱変性ＤＮＡ上で多数の開始を可能にするために実施される。３’領域の性質により、開始部位は、ゲノム全体にランダムであると考えられる。その後、結合していないプライマーを除去し、定常５’領域に対して相補的であるプライマーを使用して、更なる複製を行うことができる。
いくつかの実施形態では、増幅工程は、ライブラリーを固体支持体に付着させるために、核酸断片の一端又は両端にオリゴヌクレオチドを付加することを含む。
いくつかの実施形態では、増幅工程は、少なくとも第１リード配列決定オリゴヌクレオチド及び／又は第２リード配列決定オリゴヌクレオチドを添加することを含む。いくつかの実施形態では、増幅工程は、少なくともＰ５オリゴヌクレオチド及びＰ７オリゴヌクレオチドを添加することを含む。いくつかの実施形態では、増幅工程は、少なくとも複数のｉ５オリゴヌクレオチド及び複数のｉ７オリゴヌクレオチドを添加することを含む。
いくつかの実施形態では、増幅工程の後、方法は、増幅工程の後にサイズ範囲内の増幅された核酸断片を選択することを含み得る。
Ｇ．ＵＭＩライブラリーを作製する方法
アダプターは、５’から３’への任意の組み合わせ又は順序で２つ以上のアダプター配列を含み得るが、本開示は、様々な実施形態において使用され得るアダプターを提供する。本開示はまた、本明細書で説明されるアダプターと共に使用され得る複数の方法を提供する。本開示の方法は、以下のアダプター及び方法のうちの１つ以上を含み得る。
１．単一ＵＭＩを用いてＵＭＩライブラリーを作製する方法
図１に示されるように、例示的なアダプターは、その第１の鎖上の５’から３’へ、Ｂ１５、Ａ２、ＵＭＩ、及びＭＥのアダプター配列を含む。アダプター中、ＵＭＩはＡ２とＭＥとの間に位置する。ＵＭＩは、ｎｒＵＭＩ及び／又はｒＵＭＩを含み得る。その第２の鎖上に、アダプターは、ＭＥに相補的である配列を含む。アダプターはまた、アダプターが固体支持体と共に使用できるように、ビオチンタグを含む。他の実施形態では、固体支持体は使用されず、研究者は液相トランスポソーム複合体を使用することができる。
図２に示され、実施例１に記載されるように、ＵＭＩライブラリーを作製する例示的な方法は、（１）二本鎖核酸ライブラリーを作製することであって、ライブラリー中の各断片はＵＭＩを含み、方法は、（ａ）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）第１のトランスポザーゼと、（ｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列、及び第１のＵＭＩを含む第１のトランスポゾンと、（ｉｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、第１のトランスポソーム複合体に適用することを含む、ことと、（２）二本鎖標的核酸を第１及び第２のトランスポゾンでタグメンテーションして、第１のアダプター配列及び第１のＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（３）二本鎖標的核酸断片を第１のトランスポソーム複合体から遊離させることと、（４）任意選択的に、二本鎖標的核酸断片を伸長させ、それによって単一ＵＭＩをコピーして二重鎖ＵＭＩを生成することと、（５）トランスポゾン又は伸長させたトランスポゾンを二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（６）ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（７）二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。
この例示的な方法において、第１のトランスポゾン内の第１のＵＭＩは、第１のアダプター配列と第１の３’トランスポゾン末端配列との間に位置する。
図３Ｂに示され、実施例２に記載されるように、ＵＭＩライブラリーを配列決定する例示的な方法は、１９回の暗サイクルを含む（以下のセクションＩＩＩ．Ａで論じる）。この方法では、ＭＥ配列の１９塩基は、１９回の暗サイクル中に画像化されない。この方法は、次の４つのプライマー、すなわち、カスタムプライマー１ ＵＭＩ＋リード１、カスタムプライマーｉ５、カスタムプライマーｉ７、及びカスタムプライマー４ ＵＭＩ＋リード２を使用する。
この例示的なアダプター及び方法を用いて、第１のＵＭＩが二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上にあり、第２のＵＭＩが二本鎖標的核酸断片の第２の鎖上にあるＵＭＩライブラリーが作製される。
ＵＭＩライブラリーを配列決定する別の例示的な方法を使用してもよい。図４に示され、実施例３に記載されるように、例示的な方法は、次の６つのカスタムプライマー、すなわち、カスタムＵＭＩ １リード（配列番号８）、インサート１リード用カスタム架橋プライマー（配列番号９）、カスタムｉ７リード（配列番号１０）、カスタムｉ５リード（配列番号１１）、カスタムＵＭＩ ２リード（配列番号１２）、及びインサート２リード用カスタム架橋プライマー（配列番号１３）を含む。この配列決定法では、配列番号１及び５を有するプライマーを組み合わせ、配列番号３及び４を有するプライマーを組み合わせ、配列番号２及び６を有するプライマーを組み合わせる。
２．ＵＭＩ－ＢＬＴを用いてＵＭＩライブラリーを作製する方法
２つの例示的なアダプターを図５Ａに示す。第１のアダプターは、その第１の鎖上の５’から３’へ、Ａ１５及びＭＥの配列を含む。第１のアダプターはまた、その第２の鎖上にＭＥに相補的である配列を含む。
第２のアダプターは、その第１の鎖上の５’から３’へ、Ｂ１５、Ａ２、ＵＭＩ、及びＭＥの配列を含む。ＵＭＩは、Ａ２とＭＥとの間に位置する。第２のアダプターはまた、その第２の鎖上にＭＥに相補的である配列を含む。第１及び第２のアダプターはビオチンタグを含む。
図５Ｂに示され、実施例４に記載されるように、ＵＭＩライブラリーを作製する例示的な方法は、（１）二本鎖核酸ライブラリーを作製することであって、ライブラリー中の各断片はＵＭＩを含み、方法は、（ａ）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）第１のトランスポザーゼと、（ｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列、及び第１のＵＭＩを含む第１のトランスポゾンと、（ｉｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、第１のトランスポソーム複合体に適用することを含む、ことと、（２）二本鎖標的核酸を第１及び第２のトランスポゾンでタグメンテーションして、第１のアダプター配列及び第１のＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（３）二本鎖標的核酸断片を第１のトランスポソーム複合体から遊離させることと、（４）任意選択的に、二本鎖標的核酸断片を伸長させることと、（５）ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（７）二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。
この例示的な方法において、第１のトランスポゾン内の第１のＵＭＩは、第１のアダプター配列と第１の３’トランスポゾン末端配列との間に位置する。
この例示的な方法は、（１）第２のトランスポザーゼと、（２）第２のアダプター配列及び第２の３’トランスポゾン末端配列を含む第３のトランスポゾンと、（３）第２の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第４のトランスポゾンと、を含む、第２のトランスポソーム複合体を更に含む。
本明細書に記載される例示的なアダプター及び方法を用いて、第１のＵＭＩが二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上にあるＵＭＩライブラリーを作製する。
図６Ａに示され、実施例５に記載されるように、ＵＭＩライブラリーを配列決定する例示的な方法は、暗サイクルと、次の４つのプライマー、すなわち、標準インサートリード１、カスタムｉ７、標準ｉ５、及びＵＭＩ＋インサートリード２を含む。
ＵＭＩライブラリーを配列決定する別の例示的な方法を使用してもよい。図６Ｂに示され、実施例６に記載されるように、例示的な方法は、次の４つのプライマー、すなわち、標準インサートリード１、カスタムｉ７、標準ｉ５、ＵＭＩプライマー、及びインサートリード２架橋プライマーを含む。この方法では、ＵＭＩプライマーがインサートリード２架橋プライマーによって置換される架橋プライマー再ハイブリダイゼーション工程が使用される。
３．無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）から調製されるＵＭＩライブラリーを作製する方法
２つの例示的なアダプターを図９に示す。第１のアダプターは、その第１の鎖上の５’から３’へ、Ｐ５、ＵＭＩ、Ａ１４、及びＭＥの配列を含む。第１のアダプターはまた、その第２の鎖上にＭＥに相補的である配列を含む。ＵＭＩは、Ｐ５とＡ１４との間に位置する。
第２のアダプターは、その第１の鎖上の５’から３’へ、Ｐ７、ＵＭＩ、Ｂ１５、及びＭＥの配列を含む。ＵＭＩは、Ｐ７とＢ１５との間に位置する。第２のアダプターはまた、その第２の鎖上にＭＥに相補的である配列を含む。第１及び第２のアダプターはビオチンタグを含む。
図９に示され、実施例７に記載されるように、ＵＭＩライブラリーを作製する例示的な方法は、（１）二本鎖核酸ライブラリーを作製することであって、ライブラリー中の各断片はＵＭＩを含み、方法は、（ａ）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）第１のトランスポザーゼと、（ｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列、及び第１のＵＭＩを含む第１のトランスポゾンと、（ｉｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、第１のトランスポソーム複合体に適用することを含む、ことと、（２）二本鎖標的核酸を第１及び第２のトランスポゾンでタグメンテーションして、第１のアダプター配列及び第１のＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（３）二本鎖標的核酸断片を第１のトランスポソーム複合体から遊離させることと、（４）任意選択的に、二本鎖標的核酸断片を伸長させることと、（５）ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（７）二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。第１のトランスポゾン内の第１のアダプター配列は、第１のＵＭＩと第１の３’トランスポゾン末端配列との間に位置する。
この例示的な方法は、（１）第２のトランスポザーゼと、（２）第２のアダプター配列及び第２の３’トランスポゾン末端配列を含む第３のトランスポゾンと、（３）第２の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第４のトランスポゾンと、を含む、第２のトランスポソーム複合体を更に含む。
この方法は、（１）第３のトランスポゾンが第２のＵＭＩを更に含み、（２）第２のアダプター配列が第２のＵＭＩと第２の３’トランスポゾン末端配列との間に位置する、ことを更に含む。この方法において、タグメンテーション化工程は、（１）第１のアダプター配列及び第１のＵＭＩを含む第１の鎖と、（２）第２のアダプター配列及び第２のＵＭＩを含む第２の鎖と、を含む、二本鎖標的核酸断片を生成する。
本明細書に記載される例示的なアダプター及び方法を用いて、第１のＵＭＩの第１のコピーが二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上にあり、第１のＵＭＩの第２のコピーが第２の鎖上にある、ＵＭＩライブラリーが作製される。
図９に示され、実施例８に記載されるように、ＵＭＩライブラリーを配列決定する例示的な方法は、次の４つのプライマー、すなわち、リード１（標準プライマー）、ＵＭＩリード（標準ｉ７プライマー）、ＵＭＩリード（標準ｉ５プライマー）及びリード２（標準プライマー）を含む。
ＵＭＩライブラリーを配列決定する別の例示的な方法を使用してもよい。図６Ｂに示され、実施例６に記載されるように、例示的な方法は、次の４つのプライマー、すなわち、標準インサートリード１、カスタムｉ７、標準ｉ５、ＵＭＩプライマー、及びインサートリード２架橋プライマーを含む。この方法では、ＵＭＩプライマーがインサートリード２架橋プライマーによって置換される架橋プライマー再ハイブリダイゼーション工程が使用される。
４．ＵＤＩ及び二重鎖ＵＭＩを用いてＵＭＩライブラリーを作製するための第１の方法
２つの例示的なアダプターを図１２に示す。第１及び第２のアダプターは、フォーク型アダプターである。
第１のアダプターは、その第１の鎖上の５’から３’へ、Ａ１４、ＵＭＩ－Ａ、及びＭＥの配列を含む。第１のアダプターはまた、その第２の鎖上の５’から３’へ、ＭＥ’、ＵＭＩ－Ａ’、及びＢ１５がＢ１５’にハイブリダイズしているＢ１５二重鎖の配列を含む。ＵＭＩ－Ａは、Ａ１４とＭＥとの間に位置する。ＵＭＩ－Ａ’は、ＭＥ’とＢ１５二重鎖との間に位置する。
第２のアダプターは、その第１の鎖上の５’から３’へ、Ａ１４、ＵＭＩ－Ｂ、及びＭＥの配列を含む。第２のアダプターはまた、その第２の鎖上の５’から３’へ、ＭＥ’、ＵＭＩ－Ｂ’、及びＢ１５二重鎖の配列を含む。ＵＭＩ－Ｂは、Ａ１４とＭＥとの間に位置する。
第１及び第２のアダプターはそれぞれ、ビオチンタグを含む。
図１２に示され、実施例９に記載されるように、ＵＭＩライブラリーを作製する例示的な方法は、（１）二本鎖標的核酸を含む試料を第１のトランスポソーム複合体及び第２のトランスポソーム複合体に適用することと、（２）二本鎖標的核酸をフォーク型アダプタートランスポゾンでタグメンテーションして、第１のアダプター配列の第１及び第２のコピー、第１のＵＭＩ、第２のアダプター配列の第１及び第２のコピー、並びに第２のＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（３）二本鎖標的核酸断片をトランスポソーム複合体から遊離させることと、（４）任意選択的に、二本鎖標的核酸断片を伸長させることと、（５）フォーク型アダプタートランスポゾン又は伸長させたフォーク型アダプタートランスポゾンを二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（６）ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（７）二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。
この方法では、第１のトランスポソーム複合体は、（１）第１のトランスポザーゼと、（２）二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上の第１のフォーク型アダプタートランスポゾンとを含み、（ｉ）第１のフォーク型アダプタートランスポゾンの第１の鎖は、第１の３’末端トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列の第１のコピー、及び第１のＵＭＩを含み、（ｉｉ）第１のフォーク型アダプタートランスポゾンの第２の鎖は、第２のアダプター配列の第１のコピー、及び第１のフォーク型アダプタートランスポゾンの第１の鎖に完全に又は部分的に相補的である配列を含む。
更に、第２のトランスポソーム複合体は、（１）（ｉ）第２のトランスポザーゼと、（ｉｉ）二本鎖標的核酸断片の第２の鎖上の第２のフォーク型アダプタートランスポゾンとを含む、第２のトランスポソーム複合体を含み、（ａ）第２のフォーク型アダプタートランスポゾンの第１の鎖は、第２の３’末端トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列の第２のコピー、及び第２のＵＭＩを含み、（ｂ）第２のフォーク型アダプタートランスポゾンの第２の鎖は、第２のアダプターの第２のコピー、及び第２のフォーク型アダプタートランスポゾンの第１の鎖に完全に又は部分的に相補的である配列を含む。
図６Ａに示され、実施例５に記載されるように、ＵＭＩライブラリーを配列決定する例示的な方法は、暗サイクルと、次の４つのプライマー、すなわち、標準インサートリード１、カスタムｉ７、標準ｉ５、及びＵＭＩ＋インサートリード２を含む。
ＵＭＩライブラリーを配列決定する別の例示的な方法を使用してもよい。図６Ｂに示され、実施例６に記載されるように、例示的な方法は、次の４つのプライマー、すなわち、標準インサートリード１、カスタムｉ７、標準ｉ５、ＵＭＩプライマー、及びインサートリード２架橋プライマーを含む。この方法では、ＵＭＩプライマーがインサートリード２架橋プライマーによって置換される架橋プライマー再ハイブリダイゼーション工程が使用される。
図１２に示され、実施例１０に記載されるように、ＵＭＩライブラリーを配列決定する例示的な方法は、暗サイクルと、次のプライマー、すなわち、Ａ１４リード、Ｂ１５リード、ｉ７リード、及びｉ５リードを含む。
５．ＵＤＩ及び二重鎖ＵＭＩを用いてＵＭＩライブラリーを作製するための第２の方法
２つの例示的なアダプターを図１３に示す。第１及び第２のアダプターは、フォーク型アダプターである。ＵＭＩライブラリーを作製するこの方法で二重鎖配列決定を使用するために、各フォーク型アダプター内のＵＭＩのアニール対は相補的ではない。（比較のために図１２を参照）。
この方法における各アダプターは二本鎖であり、各鎖上に１つのＵＭＩを有する２つのＵＭＩを含有する（図１３）。２つの鎖をＭＥ領域でアニーリングして、非相補的な二重鎖ＵＭＩを有するフォーク型アダプターを生成する。二重鎖ＵＭＩは相補的配列を含まないため、各アダプターは互いに別々にアニーリングされる。
第１のアダプターは、その第１の鎖上の５’から３’へ、Ａ１４、Ａ、ＵＭＩ－１、Ｘ、及びＭＥの配列を含む。第１のアダプターはまた、その第２の鎖上の５’から３’へ、ＭＥ’、Ｙ、ＵＭＩ－２’、Ｂ、及びＢ１５がＢ１５’にハイブリダイズしているＢ１５二重鎖の配列を含む。ＵＭＩ－１は、ＡとＵＭＩ－１との間に位置する。ＵＭＩ－２’は、ＭＥ’とＢとの間に位置する。
第２のアダプターは、その第１の鎖上の５’から３’へ、Ａ１４、Ａ、ＵＭＩ－４’、Ｘ、及びＭＥの配列を含む。第２のアダプターはまた、その第２の鎖上の５’から３’へ、ＭＥ’、Ｙ’、ＵＭＩ－３、Ｂ、及びＢ１５二重鎖の配列を含む。ＵＭＩ－４’は、ＡとＸとの間に位置する。ＵＭＩ－３は、ＢとＹ’との間に位置する。
第１及び第２のアダプターはそれぞれ、ビオチンタグを含む。
図１３に示され、実施例１１に記載されるように、ＵＭＩライブラリーを作製する例示的な方法は、（１）二本鎖標的核酸を含む試料を第１のトランスポソーム複合体及び第２のトランスポソーム複合体に適用することと、（２）二本鎖標的核酸をフォーク型アダプタートランスポゾンでタグメンテーションして、第１のアダプター配列の第１及び第２のコピー、第１のＵＭＩ、第２のアダプター配列の第１及び第２のコピー、並びに第２のＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（３）二本鎖標的核酸断片をトランスポソーム複合体から遊離させることと、（４）任意選択的に、二本鎖標的核酸断片を伸長させることと、（５）フォーク型アダプタートランスポゾン又は伸長させたフォーク型アダプタートランスポゾンを二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（６）ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（７）二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。
この方法では、第１のトランスポソーム複合体は、（１）第１のトランスポザーゼと、（２）二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上の第１のフォーク型アダプタートランスポゾンとを含み、（ｉ）第１のフォーク型アダプタートランスポゾンの第１の鎖は、第１の３’末端トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列の第１のコピー、及び第１のＵＭＩを含み、（ｉｉ）第１のフォーク型アダプタートランスポゾンの第２の鎖は、第２のアダプター配列の第１のコピー、及び第１のフォーク型アダプタートランスポゾンの第１の鎖に完全に又は部分的に相補的である配列を含む。
更に、第２のトランスポソーム複合体は、（１）（ｉ）第２のトランスポザーゼと、（ｉｉ）二本鎖標的核酸断片の第２の鎖上の第２のフォーク型アダプタートランスポゾンとを含む、第２のトランスポソーム複合体を含み、（ａ）第２のフォーク型アダプタートランスポゾンの第１の鎖は、第２の３’末端トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列の第２のコピー、及び第２のＵＭＩを含み、（ｂ）第２のフォーク型アダプタートランスポゾンの第２の鎖は、第２のアダプターの第２のコピー、及び第２のフォーク型アダプタートランスポゾンの第１の鎖に完全に又は部分的に相補的である配列を含む。
更に、（１）第１のフォーク型アダプタートランスポゾンの第１の鎖は、第３アダプター配列を更に含み、（２）第１のフォーク型アダプタートランスポゾンの第２の鎖は、第４アダプター配列及び第３のＵＭＩを更に含み、（３）第２のフォーク型アダプタートランスポゾンの第１の鎖は、第３アダプター配列に完全に又は部分的に相補的である配列を更に含み、（４）第２のフォーク型アダプタートランスポゾンの第２の鎖は、第４アダプター配列及び第４のＵＭＩに完全に又は部分的に相補的である配列を更に含み、（５）タグメンテーション化工程は、第３のＵＭＩ及び第４のＵＭＩを更に含む二本鎖標的核酸断片を生成する。
図１３に示され、実施例１２に記載されるように、ＵＭＩライブラリーを配列決定する例示的な方法は、暗サイクルと、次の６つのカスタムプライマー、すなわち、カスタム１、カスタムＵＭＩ ｉ７、カスタムｉ７、カスタム２、カスタムＵＭＩ ｉ５、及びカスタムｉ５を含む。
６．ヘアピンＵＭＩ及びユニバーサルハイブリダイズテールを含むアダプターを使用してインラインＵＭＩを生成する方法
例示的な３’アダプターを図１４に示し、実施例１３に記載する。アダプターは、５’から３’へ、ユニバーサルハイブリダイズテール、ヘアピンＵＭＩ、ＭＥ’、及びＢ１５を含む。ヘアピンＵＭＩは、バルジを形成する３又は４塩基対ステム構造を含む。ユニバーサルハイブリダイズテールは、任意のＤＮＡ分子に結合できるイノシンを含み、これは転移鎖の露出した５’塩基へのハイブリダイゼーションを可能にする。
実施例１３に記載されるように、インラインＵＭＩを用いてＵＭＩライブラリーを作製する例示的な方法は、（１）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列及び第１のアダプター配列を含むトランスポゾンと、を含むトランスポソーム複合体に適用することと、（２）二本鎖標的核酸の第１の鎖をトランスポゾンでタグメンテーションして、第１のアダプター配列を含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（３）二本鎖標的核酸断片をトランスポソーム複合体から遊離させることと、（４）第２のアダプター配列、ＵＭＩ、及び第１の３’末端トランスポゾン配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含むポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることと、（５）ポリヌクレオチドを、二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（６）ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することであって、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’末端に直接隣接して位置する、ことと、（７）二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。
更にライゲーション工程は、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端とユニバーサルハイブリダイズテールの５’末端とのライゲーションを含む。
更に、ヘアピンＵＭＩは、伸長工程及び／又はライゲーション工程中は安定であるが、増幅工程中は安定ではない。
この方法によれば、ＵＭＩは、二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上にある。
本明細書に記載される例示的なアダプター及び方法は、インラインＵＭＩが挿入ＤＮＡの３’末端に隣接するＵＭＩライブラリーを作製する（図２０）。標準的な配列決定法を用いて、各ＵＭＩ及びインサートＤＮＡ配列を、ＭＥ配列を配列決定することなく、リード２を使用して捕捉する。ＵＭＩライブラリーを作製するためのこの例示的なアダプター及び方法の使用は、ＵＭＩライブラリーが配列決定されるときの暗サイクルの必要性を排除する。
７．ヘアピンＵＭＩを含むインラインＵＭＩの製造方法
例示的な３’アダプターを図１５に示し、実施例１４に記載する。アダプターは、５’から３’へ、ヘアピンＵＭＩ、ＭＥ’、及びＢ１５を含むポリヌクレオチドである。ヘアピンＵＭＩは、バルジを形成する３又は４塩基対ステム構造を含む。
実施例１４に記載されるように、インラインＵＭＩを用いてＵＭＩライブラリーを作製する例示的な方法は、（１）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列及び第１のアダプター配列を含むトランスポゾンと、を含むトランスポソーム複合体に適用することと、（２）二本鎖標的核酸の第１の鎖をトランスポゾンでタグメンテーションして、第１のアダプター配列を含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（３）二本鎖標的核酸断片をトランスポソーム複合体から遊離させることと、（４）第２のアダプター配列、ＵＭＩ、及び第１の３’末端トランスポゾン配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含むポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることと、（５）二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸張させることと、（６）伸張させたポリヌクレオチドを、二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（７）ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することであって、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’末端に直接隣接して位置する、ことと、（８）二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。
更に、伸長工程は、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端からヘアピンＵＭＩの５’末端まで伸長させることを含む。
更に、ライゲーション工程は、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端とはピンＵＭＩの５’末端とのライゲーションを含む。
更に、ヘアピンＵＭＩは、伸長工程及び／又はライゲーション工程中は安定であるが、増幅工程中は安定ではない。
この方法によれば、ＵＭＩは、二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上にある。
本明細書に記載される例示的なアダプター及び方法は、ＵＭＩが挿入ＤＮＡの３’末端に隣接するＵＭＩライブラリーを作製する（図２０）。標準的な配列決定法を用いて、各ＵＭＩ及びインサートＤＮＡ配列を、ＭＥ配列を配列決定することなく、リード２を使用して捕捉する。ＵＭＩライブラリーを作製するためのこの例示的なアダプター及び方法の使用は、ＵＭＩライブラリーが配列決定されるときの暗サイクルの必要性を排除する。
８．スプリントライゲーションアダプターを含むインラインＵＭＩを製造するための第１の方法
例示的な３’アダプターを図１６に示し、実施例１５ａに記載する。アダプターは、部分的二本鎖を含む３’スプリントライゲーションアダプター複合体を含むポリヌクレオチドである。アダプターの２つの部分は、スプリント（図１６、３’スプリントライゲーションアダプター、下の鎖を参照）、及びテール（図１６、３’スプリントライゲーションアダプター、上の鎖を参照）である。スプリント部分は、５’から３’へ、ＭＥ、ＵＭＩ’、ＭＥ’、切断Ａ１４’を含む。テール部分は、５’から３’へ、ＵＭＩ、ＭＥ’及びＢ１５を含む。複合体は、ＵＭＩ及びＭＥ配列のハイブリダイゼーションによって形成される。
実施例１５ａに記載されるように、インラインＵＭＩを用いてＵＭＩライブラリーを作製する例示的な方法は、（１）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列及び第１のアダプター配列を含むトランスポゾンと、を含むトランスポソーム複合体に適用することと、（２）二本鎖標的核酸の第１の鎖をトランスポゾンでタグメンテーションして、第１のアダプター配列を含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（３）二本鎖標的核酸断片をトランスポソーム複合体から遊離させることと、（４）第２のアダプター配列、ＵＭＩ、及び第１の３’末端トランスポゾン配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含むポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることと、（５）ポリヌクレオチドを、二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（６）ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することであって、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’末端に直接隣接して位置する、ことと、（７）二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。
更に、伸長工程は、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端からスプリントライゲーションアダプターの５’末端まで９塩基伸長させることを含む。
更に、ライゲーション工程は、伸長させた二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端とスプリントライゲーションアダプターの第１の鎖の５’末端とのライゲーションを含む。
この方法によれば、ＵＭＩは、二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上にある。
本明細書に記載される例示的なアダプター及び方法は、ＵＭＩが挿入ＤＮＡの３’末端に隣接するＵＭＩライブラリーを作製する（図２０）。標準的な配列決定法を用いて、各ＵＭＩ及びインサートＤＮＡ配列を、ＭＥ配列を配列決定することなく、リード２を使用して捕捉する。ＵＭＩライブラリーを作製するためのこの例示的なアダプター及び方法の使用は、ＵＭＩライブラリーが配列決定されるときの暗サイクルの必要性を排除する。
９．スプリントライゲーションアダプターを含むインラインＵＭＩを製造するための第２の方法
例示的な３’アダプターを図１６に示し、実施例１５ｂに記載する。アダプターは、部分的二本鎖を含む３’スプリントライゲーションアダプター複合体を含むポリヌクレオチドである。アダプターの２つの部分は、スプリント（図１６、３’スプリントライゲーションアダプター、下の鎖を参照）、及びテール（図１６、３’スプリントライゲーションアダプター、上の鎖を参照）である。スプリント部分は、５’から３’へ、Ｘ、ＵＭＩ’、ＭＥ’、切断Ａ１４’を含み、このとき、Ｘは、完全長又は切断型であり得る３’ＴｒｕＳｅｑ（商標）アダプター配列である。テール部分は、５’から３’へ、ＵＭＩ、Ｘ’及びＢ１５を含む。複合体は、ＵＭＩ及びＸ配列のハイブリダイゼーションによって形成される。
実施例１５ｂに記載されるように、インラインＵＭＩを用いてＵＭＩライブラリーを作製する例示的な方法は、（１）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列及び第１のアダプター配列を含むトランスポゾンと、を含むトランスポソーム複合体に適用することと、（２）二本鎖標的核酸の第１の鎖をトランスポゾンでタグメンテーションして、第１のアダプター配列を含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（３）二本鎖標的核酸断片をトランスポソーム複合体から遊離させることと、（４）第２のアダプター配列、ＵＭＩ、及び第１の３’末端トランスポゾン配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含むポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることと、（５）ポリヌクレオチドを、二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（６）ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することであって、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’末端に直接隣接して位置する、ことと、（７）二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。
更に、伸長工程は、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端からスプリントライゲーションアダプターの５’末端まで９塩基伸長させることを含む。
更に、ライゲーション工程は、伸長させた二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端とスプリントライゲーションアダプターの第１の鎖の５’末端とのライゲーションを含む。
この方法によれば、ＵＭＩは、二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上にある。
本明細書に記載される例示的なアダプター及び方法は、ＵＭＩが挿入ＤＮＡの３’末端に隣接するＵＭＩライブラリーを作製する（図２０）。標準的な配列決定法を用いて、各ＵＭＩ及びインサートＤＮＡ配列を、ＭＥ配列を配列決定することなく、リード２を使用して捕捉する。ＵＭＩライブラリーを作製するためのこの例示的なアダプター及び方法の使用は、ＵＭＩライブラリーが配列決定されるときの暗サイクルの必要性を排除する。
１０．３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを含むインラインＵＭＩを製造するための第１の方法
例示的な３’アダプターを図１７に示し、実施例１６ａに記載する。アダプターは、長さが約７０ヌクレオチドの鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり、５’から３’へ、Ｂ１５’、ＭＥ又はＸ、ＵＭＩ’、ＭＥ’、及びＡ１４’を含有する。
実施例１６ａに記載されるように、インラインＵＭＩを用いてＵＭＩライブラリーを作製する例示的な方法は、（１）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列及び第１のアダプター配列を含むトランスポゾンと、を含むトランスポソーム複合体に適用することと、（２）二本鎖標的核酸の第１の鎖をトランスポゾンでタグメンテーションして、第１のアダプター配列を含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（３）二本鎖標的核酸断片をトランスポソーム複合体から遊離させることと、（４）第２のアダプター配列、ＵＭＩ、及び第１の３’末端トランスポゾン配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含むポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることと、（５）ポリヌクレオチドを、二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（６）ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することであって、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’末端に直接隣接して位置する、ことと、（７）二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。
更に、伸長工程は、（１）二本鎖標的核酸断片の第１の鎖をコピーすることによって、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の３’末端から鋳型スイッチオリゴヌクレオチド内の接合部まで伸長させることと、（２）鋳型を第１の鎖から３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの不対領域に切り替えることと、（３）３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの不対領域を接合部から３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの不対領域の５’末端にコピーすることと、を含む。
この方法によれば、ＵＭＩは、二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上にある。
本明細書に記載される例示的なアダプター及び方法は、ＵＭＩが挿入ＤＮＡの３’末端に隣接するＵＭＩライブラリーを作製する（図２０）。標準的な配列決定法を用いて、各ＵＭＩ及びインサートＤＮＡ配列を、ＭＥ配列を配列決定することなく、リード２を使用して捕捉する。ＵＭＩライブラリーを作製するためのこの例示的なアダプター及び方法の使用は、ＵＭＩライブラリーが配列決定されるときの暗サイクルの必要性を排除する。
１１．オリゴヌクレオチドがＡ１４’中に修飾を含む、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを含むインラインＵＭＩを作製するための第２の方法
例示的な３’アダプターを図１７に示し、実施例１６ｂに記載する。アダプターは、長さが約７０ヌクレオチドの鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり、５’から３’へ、Ｂ１５’、ＭＥ又はＸ、ＵＭＩ’、ＭＥ’、及び任意選択的にＡ１４’の一部を含有する。Ａ１４’配列は切断又は除去されている。したがって、このアダプターは、上記ＩＩ．Ｇ．１０におけるアダプターがＡ１４’配列を有することを除いて、上記ＩＩ．Ｇ．１０において説明されたアダプターと同じであるが、この実施形態では、Ａ１４’配列は、切断されるか又は除去されている。
実施例１６ｂに記載されるように、この例示的な方法は、上記のＩＩ．Ｇ．１０に開示される工程を含む。
この方法によれば、ＵＭＩは、二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上にある。
本明細書に記載される例示的なアダプター及び方法は、ＵＭＩが挿入ＤＮＡの３’末端に隣接するＵＭＩライブラリーを作製する（図２０）。標準的な配列決定法を用いて、各ＵＭＩ及びインサートＤＮＡ配列を、ＭＥ配列を配列決定することなく、リード２を使用して捕捉する。ＵＭＩライブラリーを作製するためのこの例示的なアダプター及び方法の使用は、ＵＭＩライブラリーが配列決定されるときの暗サイクルの必要性を排除する。
１２．５’二本鎖アダプター、ポリメラーゼ伸長工程、及び近接ライゲーション工程を含む、インラインＵＭＩを製造するための方法
例示的なアダプターは、図１９Ｂに示される。アダプターは、２つのオリゴヌクレオチドを含む５’二本鎖を含む。第１のオリゴヌクレオチドは、５’から３’へ、Ｂ１５、Ｘ、及びＵＭＩを含む。第２のオリゴヌクレオチドは、５’から３’へ、ＵＭＩ’、Ｘ’、及びＢ１５’を含む。第１及び第２のオリゴヌクレオチドはハイブリダイズされ、二本鎖アダプターを形成する。
実施例１６ｄに記載され、図１９Ａ～図１９Ｃに示されるように、インラインＵＭＩを用いてＵＭＩライブラリーを作製する例示的な方法は、（１）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列及び第１のアダプター配列を含むトランスポゾンと、を含むトランスポソーム複合体に適用することと、（２）二本鎖標的核酸の第１の鎖をトランスポゾンでタグメンテーションして、第１のアダプター配列を含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（３）二本鎖標的核酸断片をトランスポソーム複合体から遊離させることと、（４）ＵＭＩ及び第２のアダプター配列を含む第１のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることと、（５）第１のポリヌクレオチドに相補的な領域を含む第２のポリヌクレオチドを付加して二本鎖アダプターを生成することと、（６）二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長させることと、（７）二本鎖アダプターを二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（８）ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することであって、ＵＭＩは、二本鎖標的核酸断片と第２のアダプター配列との間に位置する、ことと、（９）二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。上記ライゲーション工程は、（図１９Ｂに示されるように）ライゲーションされる５’リン酸及び３’ＯＨが同じ鋳型鎖にハイブリダイズされないため、「近接ライゲーション」と呼ばれる。
本明細書に記載される例示的なアダプター及び方法は、ＵＭＩが挿入ＤＮＡの３’末端に隣接するＵＭＩライブラリーを作製する（図１９ｄ）。標準的な配列決定法を用いて、各ＵＭＩ及びインサートＤＮＡ配列を、ＭＥ配列を配列決定することなく、リード２を使用して捕捉する。ＵＭＩライブラリーを作製するためのこの例示的なアダプター及び方法の使用は、ＵＭＩライブラリーが配列決定されるときの暗サイクルの必要性を排除する。
１３．５’一本鎖ポリメラーゼ鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを含むインラインＵＭＩを製造するための方法
例示的なアダプターは、図１８Ｂに示される。アダプターは、５’から３’へ、Ｂ１５、Ｘ、及びＵＭＩを有する５’ポリメラーゼ鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを含む。
実施例１６ｃに記載され、図１８Ａ～図１８Ｃに示されるように、インラインＵＭＩを用いてＵＭＩライブラリーを作製する例示的な方法は、（１）二本鎖標的核酸を含む試料を、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）第１の３’末端トランスポゾン末端配列及び第１のアダプター配列を含むトランスポゾンと、を含むトランスポソーム複合体に適用することと、（２）二本鎖標的核酸の第１の鎖をトランスポゾンでタグメンテーションして、第１のアダプター配列を含む二本鎖標的核酸断片を生成することと、（３）二本鎖標的核酸断片をトランスポソーム複合体から遊離させることと、（４）ＵＭＩ及び第２のアダプター配列を含む第１のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることと、（５）二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長させることと、（６）第１のポリヌクレオチドをコピーすることと、（７）ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を生成することであって、ＵＭＩは、二本鎖標的核酸断片と第２のアダプター配列との間に位置する、ことと、（９）二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む。上記の伸長工程は、標的核酸鎖からアダプター鎖への鋳型スイッチを含む。
本明細書に記載される例示的なアダプター及び方法は、ＵＭＩが挿入ＤＮＡの３’末端に隣接するＵＭＩライブラリーを作製する（図１８ｄ）。標準的な配列決定法を用いて、各ＵＭＩ及びインサートＤＮＡ配列を、ＭＥ配列を配列決定することなく、リード２を使用して捕捉する。ＵＭＩライブラリーを作製するためのこの例示的なアダプター及び方法の使用は、ＵＭＩライブラリーが配列決定されるときの暗サイクルの必要性を排除する。
Ｈ．試料及び標的核酸
本開示に従って使用される生物学的試料は、標的核酸を含む任意のタイプであり得る。しかしながら、試料は完全に精製される必要はなく、例えば、タンパク質と混合された核酸、他の核酸種、他の細胞成分、及び／又は任意の他の夾雑物を含むことができる。いくつかの実施形態では、生体試料は、核酸、タンパク質、他の核酸種、他の細胞成分、及び／又はインビボで見られるものとほぼ同じ割合で存在する任意の他の夾雑物の混合物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、成分は、無傷細胞に見られるものと同じ割合で見出される。いくつかの実施形態では、生体試料は、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、又は０．６０以下の２６０／２８０吸光度比を有する。いくつかの実施形態では、生体試料は、少なくとも２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、又は０．６０の２６０／２８０吸光度比を有する。本明細書で提供される方法により、核酸を固形支持体に結合させることができるため、他の夾雑物は、表面結合タグメンテーションが生じた後に固形支持体を洗浄するだけで除去することができる。生体試料は、例えば、粗細胞溶解物又は全細胞を含み得る。例えば、本明細書に記載の方法において固体支持体に適用される粗細胞溶解物は、他の細胞成分から核酸を単離するために従来から使用している分離工程のうちの１つ以上が行われる必要はない。例示的な分離工程は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９、及びＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌに記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、固体支持体に適用される試料は、１．７以下である２６０／２８０吸光度比を有する。
したがって、いくつかの実施形態では、生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、粘液、痰、尿、精液、脳脊髄液、気管支吸引液、糞便、及びそれらの浸軟組織、若しくはそれらの溶解物、又は核酸を含む任意の他の生体標本を含み得る。
いくつかの実施形態では、試料は、血液である。いくつかの実施形態では、試料は、細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、粗細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、方法は、試料を固体支持体に適用した後に試料中の細胞を溶解して、細胞溶解物を生成する工程を更に含む。
いくつかの実施形態では、試料は、生検試料である。いくつかの実施形態では、生検試料は、液体又は固体試料である。いくつかの実施形態では、がん患者由来の生検試料を使用して、対象が予測遺伝子中に特定の変異又はバリアントを有するかどうかを決定するために、目的の配列を評価する。
本明細書に提示される方法及び組成物の１つの利点は、フローセルに生体試料を添加することができ、その後の溶解工程及び精製工程は、フローセルに必要な試薬を流すだけで、更なる移動又は取り扱い工程なしにフローセル内で全て生じ得ることである。
１．ＤＮＡ
いくつかの実施形態では、試料は、標的二本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、以下のセクションＩＩ．Ｈ．３で詳細に説明されるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖である。
２．ＲＮＡ
いくつかの実施形態では、試料は、標的ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、試料は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、コード、非翻訳領域（ＵＴＲ）配列、イントロン配列、及び／又は遺伝子間配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上の少なくとも部分に対して相補的である配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、メッセンジャＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（transfer RNA、ｔＲＮＡ）、又はリボソームＲＮＡ（ribosomal RNA、ｒＲＮＡ）である。適切な捕捉オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの種類に基づいて設計され得る。
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの３’末端は、捕捉オリゴヌクレオチドに結合する。
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ポリアデニル化される（すなわち、アデニン塩基のみを含むＲＮＡのストレッチを含む）。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリＡテールを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの３’末端は、ポリＡテールを含む。
いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡは、ポリＡ配列を含み、ポリＴ配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドに結合する。
３．ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、ライブラリー調製の第１の工程として、ＲＮＡを含む試料から合成される。言い換えれば、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＢＬＴによるタグメンテーションの前に溶液中で生成され得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、次いで、捕捉オリゴヌクレオチドによってＢＬＴ上に捕捉される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、トランスポソーム複合体に含まれるトランスポザーゼに対する親和性に基づいてＢＬＴに直接結合する。
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ合成は、逆転写酵素によって行われる。いくつかの実施形態では、このｃＤＮＡ合成により、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が得られ、ＲＮＡの鎖にハイブリダイズすることができるＤＮＡの鎖が生成される。いくつかの実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼは、ｃＤＮＡを合成する条件下で、ＲＮＡを含む試料に付加される。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡを合成するための条件は、ＲＮＡに結合することができるヌクレオチド及び／又はプライマー（ポリＴプライマー及び／又はランダマープライマーなど）の存在を含む。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＲＮＡからＤＮＡを調製するだけである（二本鎖ＤＮＡを得るためにＤＮＡの更なるコピーを生成することなく）。
いくつかの実施形態では、溶液中で生成されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、次いで、ＢＬＴに結合され、タグメンテーションされ得る。ＲＮＡについて上記のセクションＩＩ．Ｈ．２に説明されるように、標的ＲＮＡは、ポリＴ配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドに結合するポリＡテールを含み得る。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の断片は、標的ＲＮＡのコード、非翻訳領域（ＵＴＲ）、イントロン、及び／又は遺伝子間配列を生成するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡからタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリーを調製する方法は、ｃＤＮＡを合成し、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成するための条件下で、標的ＲＮＡを含む試料に逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を、トランスポソーム複合体が上に固定化された固体支持体に固定化することであって、トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含み、試料は、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が捕捉オリゴヌクレオチド又はトランスポザーゼに直接結合する条件下で、固体支持体に適用される、固定化することと、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が１つの鎖の５’末端にタグ付けされる条件下でトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対して断片化を行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリーを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＲＮＡ鎖の５’末端である。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＤＮＡ鎖の５’末端である。
ＩＩＩ．ＵＭＩライブラリーを配列決定する方法
本開示は更に、本明細書に提供される方法に従って作製されるＵＭＩライブラリーの配列決定に関する。ＵＭＩライブラリーは、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ナノポア配列決定などを含む直接配列決定などの任意の適切な配列決定法に従って配列決定することができる。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、固体支持体上で配列決定される。いくつかの実施形態では、配列決定のための固体支持体は、表面結合タグメンテーションが起こるものと同じ固体支持体である。いくつかの実施形態では、配列決定のための固体支持体は、増幅が起こるのと同じ固体支持体である。
１つの例示的な配列決定方法論は、合成による配列決定（sequencing-by-synthesis、ＳＢＳ）である。ＳＢＳでは、核酸鋳型（例えば標的核酸又はそのアンプリコン）に沿った核酸プライマーの伸長を監視して、鋳型中のヌクレオチドの配列を決定する。基礎となる化学プロセスは、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される）であり得る。特定のポリマーベースのＳＢＳの実施形態では、プライマーに付加されるヌクレオチドの順序及び種類の検出を使用して鋳型の配列を決定することができるように、蛍光標識ヌクレオチドを鋳型依存的にプライマーに付加する（それによってプライマーを伸長させる）。
フローセルは、本開示の方法によって生成された、増幅されたＤＮＡ断片を収容するための便利な固体支持体を提供する。そのようなフォーマットの１つ以上の増幅されたＤＮＡ断片は、サイクル中に試薬を繰り返し送達することを含むＳＢＳ又は他の検出技術に供することができる。例えば、第１のＳＢＳサイクルを開始するために、１つ以上の標識されたヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどを、１つ以上の増幅された核酸分子を収容するフローセルに流入／通過させることができる。プライマー伸長によって標識ヌクレオチドを組み込む部位は、検出することができる。任意選択的に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマーに付加されると、更なるプライマー伸長を終結する可逆的終結特性を更に含むことができる。例えば、脱ブロック作用因子が送達されてその部分を除去するまで、その後の伸長が起こらないように、可逆的ターミネータ部分を有するヌクレオチド類似体をプライマーに付加することができる。したがって、可逆的終端を使用する実施形態では、脱ブロック試薬をフローセルに送達することができる（検出発生の前又は後）。洗浄は、様々な送達工程の間に実施することができる。次に、サイクルをｎ回繰り返してプライマーをｎ個のヌクレオチドで伸長し、それによって長さｎの配列を検出することができる。本開示の方法によって産生されるアンプリコンと共に使用するために容易に適合させることができる例示的なＳＢＳ手順、流体系及び検出プラットフォームは、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、同第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、同第７，２１１，４１４号、同第７，３１５，０１９号、同第７，４０５，２８１号、及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
パイロシークエンシングなどの、サイクル反応を使用する他の配列決定手順を使用することができる。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に組み込まれるときに無機ピロリン酸（inorganic pyrophosphate、ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１），８４－９（１９９６）、Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１），３－１１（２００１）、Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５），３６３（１９９８）、米国特許第第６，２１０，８９１号、同第６，２５８，５６８号、及び同第６，２７４，３２０号、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。パイロシークエンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（adenosine triphosphate、ＡＴＰ）に即座に変換されることで検出することができ、生成されたＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼ産生光子を介して検出することができる。したがって、配列決定反応は、発光検出システムを介して監視することができる。蛍光ベースの検出システムに使用される励起放射線源は、パイロシークエンシング手順には必要ない。本開示により産生された アンプリコンへのパイロ配列決定の適用に適合させることができる有用な流体システム、検出器、及び手順は、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１１／５７１１１号、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８（Ａ１）号、米国特許第７，５９５，８８３号、及び同第７，２４４，５５９号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを伴う方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer、ＦＲＥＴ）相互作用を介して、又はゼロモード導波路（zeromode waveguide、ＺＭＷ）を用いて検出することができる。ＦＲＥＴベースの配列決定のための技術及び試薬は、例えば、Ｌｅｖｅｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，６８２－６８６（２００３）、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３，１０２６－１０２８（２００８）、Ｋｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５，１１７６－１１８１（２００８）に記載され、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかのＳＢＳ実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの組み込み時に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づく配列決定は、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている電気検出器及び関連技術、又は、米国特許出願公開第２００９／００２６０８２（Ａ１）号、同第２００９／０１２７５８９（Ａ１）号、同第２０１０／０１３７１４３（Ａ１）号、若しくは同第２０１０／０２８２６１７（Ａ１）号に記載されている配列決定方法及びシステムを使用することができ、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。動力学的除外を使用して標的核酸を増幅するための本明細書に記載の方法は、プロトンを検出するために使用される基質に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に記載の方法を使用し、プロトンを検出するために使用されるアンプリコンのクローン集団を産生することができる。
別の有用な配列決定技術は、ナノポア配列決定である（例えば、Ｄｅａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，１４７－１５１（２０００）、Ｄｅａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３５：８１７－８２５（２００２）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２：６１１－６１５（２００３）を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかのナノポアの実施形態では、標的核酸又は標的核酸から除去された個々のヌクレオチドは、ナノポアを通過する。核酸又はヌクレオチドがナノポアを通過するとき、各ヌクレオチドの種類は、ポアの電気コンダクタンスの変動を測定することによって識別され得る。（米国特許第７，００１，７９２号、Ｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３，１９９６－２００１（２００７）、Ｈｅａｌｙ，Ｎａｎｏｍｅｄ．２，４５９－４８１（２００７）、Ｃｏｃｋｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，８１８－８２０（２００８）、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
本開示による検出に適用することができるアレイベースの発現及び遺伝子型解析のための例示的な方法は、米国特許第７，５８２，４２０号、同第６，８９０，７４１号、同第６，９１３，８８４号、若しくは同第６，３５５，４３１号、又は米国特許出願公開第２００５／００５３９８０（Ａ１）号、同第２００９／０１８６３４９（Ａ１）号、若しくは同第２００５／０１８１４４０（Ａ１）号に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の方法の利点は、複数の標的核酸の迅速かつ効率的な検出を並行して提供することである。したがって、本開示は、上記で例示されるものなどの当該技術分野において既知の技術を使用して核酸を調製及び検出することができる統合システムを提供する。したがって、本開示の統合システムは、増幅試薬及び／又は配列決定試薬を１つ以上の核酸断片に送達することができる流体成分を含むことができ、システムは、ポンプ、弁、リザーバ、流体ラインなどの構成要素を含む。フローセルは、標的核酸を検出するための統合システムで構成及び／又は使用することができる。例示的なフローセルは、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８（Ａ１）号及び米国特許出願第１３／２７３，６６６号に記載され、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。フローセルについて例示されるように、統合システムの流体構成要素の１つ以上を増幅方法及び検出方法に使用することができる。核酸配列決定の実施形態を一例として取ると、統合システムの流体構成要素の１つ以上を、本明細書に記載の増幅方法、及び上記に例示したような配列決定方法における配列決定試薬の送達に使用することができる。代替的に、統合システムは、増幅方法を実施し、検出方法を実施するための別々の流体システムを含み得る。増幅された核酸を作成し、また核酸の配列を決定することができる統合配列決定システムの例としては、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及び参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／２７３，６６６号に記載のデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示のＵＭＩライブラリーを配列決定する方法は、ＵＭＩを配列決定して、ＤＮＡ配列決定における上昇した感度を提供する。いくつかの実施形態では、配列決定方法は、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を含む。
Ａ．暗サイクル
いくつかの実施形態では、カスタム配列決定レシピを調製し、ＮｅｘｔＳｅｑソフトウェアを使用して、特定の配列の記録をスキップするために使用される暗サイクルを含むように選択した。その配列の配列決定化学反応は依然として実行されるが、配列決定は機器によって画像化されない。暗サイクルを用いて、配列決定結果を全体的に悪化させ得る、ＭＥ配列のライブラリーなどの低多様性配列を繰り返し配列決定することに関するフェージング／プレフェージング問題を軽減する。暗サイクルの後、標的核酸のインサート配列が記録されるように、配列の画像化が再開される。
カスタム配列決定レシピは、スキップされる配列の長さに及ぶ適切な数の暗サイクルを含むように、標準レシピの変法を含めた。言い換えれば、暗サイクルの数は、スキップが意図される塩基の数に等しい。例えば、スキップされる配列が１９塩基長のＭＥ配列である場合、１９回の暗サイクルが使用される。いくつかの実施形態では、スキップされる配列は、ＭＥ配列である。１９ヌクレオチド長のＭＥを有する実施形態では、暗サイクルの数は１９である。異なる数のヌクレオチドを有するＭＥでは、暗サイクルは一般的にヌクレオチドの数である。暗サイクルによる最大の利益を得るために、ユーザはＭＥ全体をスキップすることができるが、ＭＥドメイン及びその配列部分の大部分をスキップして、結果におけるそれらのヌクレオチドを無視することも可能である。
いくつかの実施形態では、配列決定法は、データが配列決定法の一部について記録されていない暗サイクルを含む。いくつかの実施形態では、記録されていないデータは、３’トランスポゾン末端配列に関連する配列データである。いくつかの実施形態では、記録されていない配列データは、ＭＥ配列である。いくつかの実施形態では、暗サイクルは１９サイクルを含む。
いくつかの実施形態では、配列決定法は、暗サイクルを含まない。これらの実施形態では、ＵＭＩライブラリーを調製する方法は、各ＵＭＩが挿入核酸の３’末端に隣接しており、それらの間にＭＥ配列がないため、暗サイクルの必要性を排除する（図２０）。
いくつかの実施形態では、カスタムプライマーを使用して暗サイクルの必要性を排除する。これらの実施形態では、カスタムプライマーは、ＭＥと整列する配列を含む架橋プライマーである（図４及び６Ｂ）。これらの実施形態では、ＭＥ配列は画像化されない。
Ｂ．配列決定プライマー
Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリー調製キット及び配列決定プラットフォーム、例えば、Ｎｅｘｔｅｒａ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐｒｅｐ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＰＣＲ、ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）、ＴｒｕＳｉｇｈｔ（登録商標）、及びＴｒｕＳｅｑ（商標）を用いてＵＭＩライブラリーを配列決定するために使用され得る配列決定プライマー及びアダプター配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ａｄａｐｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ＃１００００００００２６９４ ｖ１５に開示されている通りであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの配列決定プライマー及びアダプターは、本開示に従って修飾され得る。かかるプライマー及びアダプターの例としては、リード１、リード２、インデックス１リード、インデックス２リード、インデックス１（ｉ７）アダプター、インデックス２（ｉ５）アダプター、インデックスアダプター１～２７、ＴｒｕＳｅｑユニバーサルアダプター、インデックスＰＣＲプライマー、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇアダプター、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇリード配列決定プライマー、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇインデックスリード配列決定プライマー、及びＰＣＲプライマーインデックス配列１～１２が挙げられる。
いくつかの実施形態では、配列決定方法は、類似の融解温度を有する配列決定プライマーを結合させることを含む。
１．カスタムプライマー
カスタムプライマーは、異なる機能を果たすために配列決定反応において使用され得る。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩ配列は、ＵＭＩへのプライマー結合を可能にするためにカスタムプライマーに含まれる。
いくつかの実施形態では、カスタムプライマーは、プライマーを長くするように機能し、かつ／又はプライマーの融解温度に影響を及ぼす配列を含み得る。いくつかの実施形態では、同じ反応において使用され得るカスタム配列決定プライマー及び標準配列決定プライマーは、類似の融解温度を有し得る。
いくつかの実施形態では、カスタムプライマーは、１つ以上のスペーサーを含む架橋プライマーである。スペーサーは、架橋プライマーが任意の核酸配列と整列することを可能にする。
いくつかの実施形態では、スペーサーは、標的核酸配列に結合し得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、イノシンなどのユニバーサルハイブリダイゼーション配列を含む。
いくつかの実施形態では、スペーサーは、標的核酸配列に結合させることなく、それと整列し得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、非核酸リンカーを含む。
いくつかの実施形態では、スペーサーは、可変配列と整列する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＵＭＩ配列と整列する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＵＤＩ配列と整列する。
いくつかの実施形態では、配列決定プライマーは、１つ以上の固有プライマー結合配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、配列決定プライマーは、少なくともＡ２配列、少なくともＡ１４配列、又は少なくともＢ１５配列を含む。
いくつかの実施形態では、固有プライマー結合配列は、Ａ２、Ａ１４、及び／又はＢ１５である。
ａ）スペーサー
本明細書で使用するとき、配列中のスペーサー領域は、既知の遺伝子機能のための任意の構造的又は分類情報を保持しない核酸配列を指す。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド上のスペーサー領域は、様々な配列と整列することができる。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、ある範囲のｉ５配列と整列することができ、これはＩｌｌｕｍｉｎａ Ａｄａｐｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ＃１００００００００２６９４ ｖ１５に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、ＵＭＩ配列と整列する。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、ＭＥ配列と整列する。
いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、ユニバーサル配列である。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、非ＤＮＡスペーサーである。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、イノシン又はニトロインドールなどのユニバーサル塩基を含む。あるいは、スペーサーは合成リンカーを含み得る。合成リンカーの例としては、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、１’，２’－ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）、光切断可能スペーサー（ＰＣスペーサー）、スペーサー９、及びスペーサー１８が挙げられる。Ｃ３スペーサーは、オリゴヌクレオチドの内部又は５’末端に組み込むことができるＣ３スペーサーホスホラミダイトである。複数のＣ３スペーサーをオリゴヌクレオチドのいずれかの末端に付加して、フルオロフォア又は他のペンダント基の付加のための長い親水性スペーサーアームを導入することができる。ヘキサンジオールは、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長をブロックすることができる６炭素グリコールスペーサーである。この３’修飾は、より長いオリゴヌクレオチドの合成を支持することができる。ｄＳｐａｃｅｒ修飾を用いて、オリゴヌクレオチド内に安定な無塩基部位を導入することができる。ＰＣスペーサーは、ＤＮＡ塩基間又はオリゴヌクレオチドと５’－修飾基との間に配置することができる。ＰＣスペーサーは、３００～３５０ｎｍスペクトル範囲のＵＶ光への曝露によって切断され得る１０原子スペーサーアームを提供する。切断により、５’－リン酸基を有するオリゴヌクレオチドが遊離される。スペーサー９は、オリゴヌクレオチドの５’末端若しくは３’末端に、又は内部に組み込むことができるトリエチレングリコールスペーサーである。複数の挿入を用いて、長いスペーサーアームを作製することができる。スペーサー１８（ｉＳｐ１８）は、１８原子のヘキサエチレングリコールスペーサーであり、単一修飾として付加できる最長のスペーサーアームとみなすことができる。
いくつかの実施形態では、スペーサーは、ｉＳｐ１８リンカーを含む。本明細書で使用するとき、ｉＳｐ１８リンカーは、Ｃ１８スペーサー（１８原子ヘキサ－エチレングリコールスペーサー）を有する標準的な修飾リンカーであり、４塩基対の長さに等しい。したがって、２×ｓｐ１８リンカーは、長さが８塩基対と同等である。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、２×ｉＳｐ１８合成リンカーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、１、２、３、４、５、６個以上のＣ１８スペーサーなどの、１つ以上のＣ１８スペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、２つのＣ１８スペーサ（長さが８ヌクレオチドと同等）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、長さが２塩基対と同等のＣ９スペーサーである。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、１、２、３、４、５、６個以上のＣ９スペーサーなどの、１つ以上のＣ９スペーサー（トリエチレングリコールスペーサー）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１０塩基対スペーサーなどの既存のインデックスと共に使用される従来のスペーサーである。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、スペーサーの組み合わせ、例えば、１つ以上のＣ１８スペーサーと１つ以上のＣ９スペーサーとの組み合わせ、又は本明細書に記載の任意のスペーサーの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、又は３０塩基対と同等の長さである。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、８又は１０塩基対又はヌクレオチドにほぼ同等の長さである。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、インデックス領域と同じ長さであるように具体的に選択される。いくつかの実施形態では、インデックス領域は、８ヌクレオチドの長さであり、スペーサー領域は、２つのＣ１８スペーサーを含む。いくつかの実施形態では、インデックス領域は、１０ヌクレオチドの長さであり、スペーサー領域は、２つのＣ１８スペーサー及び１つのＣ９スペーサーを含む。
いくつかの実施形態では、スペーサーは、無塩基ヌクレオチドを含む。無塩基ヌクレオチドは、スペーサーの任意の位置に導入することができる。無塩基ヌクレオチドを有するスペーサーの例としては、ｄＳｐａｃｅｒ（１’，２’－ジデオキシリボース、ＤＮＡ無塩基）、ｒＳｐａｃｅｒ（すなわち、ＲＮＡ無塩基）、及びＡｂａｓｉｃ ＩＩが挙げられる。いくつかの実施形態では、ｄＳｐａｃｅｒは、無塩基フラン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ＴＨＦ誘導体、又は無プリン／無ピリミジン（ＡＰ）ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、スペーサーは、ゆらぎ塩基を含む。ゆらぎ塩基は、スペーサーの任意の位置に導入することができる。ゆらぎ塩基対は、グアニン－ウラシル、ヒポキサンチン－ウラシル、ヒポキサンチン－アデニン、及びヒポキサンチン－シトシンなどのワトソン－クリック塩基対規則に従わない２つのヌクレオチド間の対合である。
ＩＶ．トランスポソーム複合体を含むキット
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示されるトランスポソーム複合体の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、キットは、トランスポサーゼ、並びにトランスポゾン、５’及び３’トランスポゾン末端配列、アダプター配列、ＵＭＩ配列、及び／又は他のＨＹＢ／ＨＹＢ’配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、かかるトランスポソーム複合体を生成するための構成要素を含む。
キットは、種々のアダプターのいずれかを含み得る。多くの実施形態では、アダプターは、３’アダプター、ポリヌクレオチドアダプター、フォーク型アダプター、ヘアピンＵＭＩアダプター、ヘアピンＵＭＩ及びユニバーサルハイブリダイズテールアダプター、スプリントライゲーションアダプター、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドアダプター、並びに任意の適切なオリゴヌクレオチドから選択され得る。
いくつかの実施形態では、キットは、Ｈｙｂ２Ｙのための構成要素、例えばアダプター及び緩衝液を含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、ビーズなどの固体支持体を含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、逆転写酵素ポリメラーゼを含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、配列決定プライマーを含み得る。
以下の実施例は、ＵＭＩを有するＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製することに関する方法を記載する。ＢＬＴ法（例えば、以前はＮｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ、及びＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓとして知られていたＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐ（研究用途のみ、ＲＵＯ））を使用した配列決定ライブラリーの生成は、ＮＧＳライブラリー調製ワークフローと適合する便利で効率的な方法である。これらの多くについて、配列決定されたＤＮＡ分子の相対的な方向及び固有性（すなわち、標的ＤＮＡのストランド性又は方向性）を追跡し、それらをバイオインフォマティクス的に分解することができることが望ましい。実施例に記載されている方法は、現世代のＢＬＴ法によっては得られない特徴であるストランド性又は方向性を提供するためのＵＭＩの使用に関する。ＵＭＩは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ（商標）法を使用せずに組み込まれる。以下の実施例は、ＵＭＩを組み込む異なる方法を開示する。
実施例１．二重鎖ＵＭＩエラー補正を可能にするためにＵＭＩ－ＢＬＴを使用する配列決定のためのＤＮＡライブラリーの調製
この実施例は、固有二重インデックス（ＵＤＩ）及び二重鎖ＵＭＩを有するＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製するために使用される非対称タグメンテーションＢＬＴ法を記載する。この例は、エラー補正のためにＵＤＩとＵＭＩとを組み合わせる方法を記載する。単一ＵＭＩを使用してＤＮＡライブラリーをタグ化し、続いて単一ＵＭＩをコピーして二重鎖ＵＭＩを生成する。
本実施例の方法は、ＢＬＴ法をＨｙｂ２Ｙワークフローと組み合わせた。タグメンテーション工程において、第１のＵＭＩを標的ＤＮＡの第１の鎖に付加し、第２のＵＭＩを標的ＤＮＡの第２の鎖に付加した。
この方法では、追加のＡ２アダプター配列をＢＬＴ中のトランスポゾンアームに付加し、Ｈｙｂ２Ｙワークフローを使用してＵＭＩをコピーした。ＢＬＴアダプターへのＡ２シーケンスの追加は、２つの目的を果たす。第１に、反対鎖上に対合したＵＭＩを有するように伸長できるＨｙｂ２Ｙオリゴヌクレオチドのアニーリングを可能にする。Ｈｙｂ２ＹオリゴヌクレオチドのＡ２へのハイブリダイゼーションは、伸長が最小限である他の方法に依存するのではなく、ＵＭＩ及びアダプター配列をコピーできるより長い伸長を可能にする。第２に、Ａ２配列は、標準配列決定プライマーと同じアニーリング温度（Ｔｍ）を有する配列決定のためのカスタム配列決定レシピ及びカスタムプライマーの開発を可能にする。更に、この方法に従って調製されたライブラリーは、フォーク型アダプターＢＬＴ設計が使用される場合に時折観察されるアダプター二量体の量を減少させる。アダプター二量体を回避することによって、この方法はまた、ライブラリー収量を増加させる。
Ａ．材料
この実施例では次の材料を使用した。（１）ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｔｒｕ－Ｑ ７標準試料（Ｈｏｒｉｚｏｎカタログ番号ＨＤ７３４）、（２）Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＩＤＰＥ、Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ番号２００２５５２３及び２００２５５２４、以前は、Ｎｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘ ｆｏｒ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）、（３）ＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ＵＭＩ試薬（Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ番号２００２４５８６）、（４）ＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｔｕｍｏｒ １７０試薬（Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ番号２００２８８２１）、（５）Ｎｅｗ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｂｌｏｃｋｅｒ ＮＨＢ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ参照番号２００３１７７１）、（６）Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ ＥＬＭ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ番号２００１９１１７）、（７）ＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０ ｖ２．５キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ番号２００２４９０６）、及び（８）カスタムプライマー。
Ｂ．二重鎖ＵＭＩを有するＢＬＴライブラリー
この方法では、標的ＤＮＡ断片をタグメンテーションするためのＢＬＴを、まず、ＵＭＩ－ＢＬＴを含む捕捉オリゴヌクレオチドを用いて反応混合物中で調製した（図１）。タグメンテーションのための標的ＤＮＡを、ＵＭＩ－ＢＬＴを有する反応混合物に添加した（図２）。１０ｎｇ及び５０ｎｇのｇＤＮＡ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｔｒｕ－Ｑ ７標準試料を標的ＤＮＡとして使用した。
ＡＢ長単一ＵＭＩを含有するタグメンテーション化ライブラリーを、ＩＤＰＥで使用したｅＢＬＴと同様の密度で作製したＢＬＴを用いて調製した。ライブラリーは、ＴｒｕＳｉｇｈｔ（商標）Ｔｕｍｏｒ（ＴＳＴ１７０、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）プローブを用いて、ＩＤＰＥプロトコールガイドラインに従って調製した。タグメンテーション停止緩衝液ＳＴ２を添加して、タグメンテーションプロセスを停止させた。
得られたタグメンテーション化ライブラリーを５５℃で５分間加熱して、タグメンテーション化ライブラリーを溶液中に遊離させた。３’－ビオチン化ＭＥはビーズに結合したままであり、転移しなかった。反応混合物を室温で５分間インキュベートし、反応混合物をタグメンテーション洗浄緩衝液（ＴＷＢ）で２回洗浄した。
次いで、Ｈｙｂ２Ｙオリゴヌクレオチド（図２の５’Ｐ－Ａ２’Ａ１４’－３’）を添加し、６５℃で１０分間アニーリングした。反応混合物を３７℃までゆっくりと放冷した。次いで、反応混合物の上清を除去し、ギャップ充填のために伸長－ライゲーションミックスＥＬＭ３と混合した。
３７℃で３０分間のＥＬＭ３中での伸長及びライゲーションによって、３４塩基をギャップ充填する。ＵＭＩ配列はこの工程中にコピーされ、これにより、ＵＭＩを使用して上の鎖及び下の鎖を同定及びグループ化することが可能になることによって、ＵＭＩ二重鎖エラー補正が可能になる。次いで、固相可逆性固定ビーズ（ＳＰＲＩ）を使用して反応混合物を洗浄し、タグメンテーション化ＤＮＡを有する溶液を生成した。ＵＤＩプライマーを用いて９サイクルのＰＣＲを行い、タグメンテーション化ＤＮＡを増幅した。次いで、ＳＰＲＩを用いてＰＣＲ産物を精製して、正しいサイズ範囲内に入るタグメンテーション化ＤＮＡを捕捉した。最後に、ライブラリー（約５００ｎｇのＤＮＡ）を、ＩＤＰＥ及びＴＳＴ１７０プローブを用いて濃縮した。更なるブロッカーを、ＡＢ－長ＢＬＴプローブのハイブリダイゼーションのために添加した。
これらの工程は、二重鎖ＵＭＩを有する標準構造ＢＬＴライブラリーを生成した。ライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＵＤＩによるＰＣＲ増幅に使用できるＡ１４及びＢ１５オリゴヌクレオチド配列を含んでいた（図２）。
Ｃ．単一ＵＭＩを有するＢＬＴライブラリー
第２のＢＬＴライブラリーを調製した。このライブラリーは単一ＵＭＩを含み、Ａ－Ｂ－短単一ＵＭＩを用いて作製した。ライブラリーは、ＢＬＴハイブリダイゼーションのために追加のブロッカーを使用しなかったことを除いて、Ａ－Ｂ－長単一ＵＭＩについて上述した工程を使用して調製した。
Ｄ．対照ライブラリー
比較のために、ＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｔｕｍｏｒ １７０プロトコールガイドラインに従ってＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ＵＭＩ試薬を用いて、別個のタグメンテーション化ライブラリーを調製した。
更なる比較のために、ＵＭＩを含まないライブラリーを、ＮＦＥを用いて調製した。
実施例２．暗サイクルによる二重鎖ＵＭＩを含むＤＮＡライブラリーの配列決定
この実施例は、実施例１のＤＮＡライブラリーを配列決定する方法を記載する。
Ａ．材料
この実施例では次のシステム及び材料を使用した。（１）ＮｅｘｔＳｅｑ ５００配列決定システムを使用した（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ＃１５０４６５６３）、及び（２）必要に応じて、実施例１のライブラリーに特異的な配列決定プライマー及びカスタムプライマー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ＃１５０５７４５６）。
Ｂ．方法
実施例１のライブラリーをプールし、変性させ、プロトコールガイドラインに従ってＮｅｘｔＳｅｑ ５００配列決定カートリッジに加えた。カスタムプライマーを希釈し、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００及びＮｅｘｔＳｅｑ ５５０ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｇｕｉｄｅに従ってカートリッジ内の関連位置に添加した。
カスタム配列決定レシピを配列決定機器にロードし、ＮｅｘｔＳｅｑソフトウェアを使用して選択した。レシピは、ＭＥ領域にわたって１９回の暗サイクルを含むように標準レシピを変更することを含んでいた。暗サイクルは、画像化を伴わない配列決定サイクルであり、これは、配列決定結果を全体的に悪化させ得るフェージング／プレフェージングの問題を補正した。暗サイクルは、上記セクションＩＩＩ．Ａで詳細に説明されている。暗サイクルの間、ＭＥ領域の１９塩基を画像化しなかった。暗サイクルの後、画像化を再開し、挿入配列を画像化した。
試料シートは、ＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ＵＭＩ Ｒｅａｇｅｎｔｓガイドに見られる設定を含んでいた。
内部ＵＭＩ折り畳みＡＰＰ及びＤｒａｇｅｎ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｐｐを用いて、Ｂａｓｅｓｐａｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｕｂでデータ分析を行った。
１．プライマー
使用したカスタム配列決定プライマーは、図３Ｂに示す通りである。４つのカスタムプライマーは、標準的な配列決定プライマーと適合する融解温度（Ｔｍ）を含み、したがって、同じ配列決定反応において混合及び使用することができる。カスタムプライマーは、図３Ｂに示すように、（１）カスタムプライマー１ ＵＭＩ＋リード１、（２）カスタムプライマーｉ５、（３）カスタムプライマーｉ７、及び（４）カスタムプライマー４ ＵＭＩ＋リード２であった。カスタムプライマーは、図３Ｂの青色矢印によって示されるように、それぞれの領域にアニールするように設計した。カスタムプライマー１ ＵＭＩ＋リード１をＡ１４－Ａ２配列にアニールした。カスタムプライマーｉ５をＡ１４’－Ａ２’配列にアニールした。カスタムプライマーｉ７をＡ２’－Ｂ１５’配列にアニールした。カスタムプライマー４ ＵＭＩ＋リード２をＢ１５－Ａ２配列にアニールした。挿入ＤＮＡの配列を、カスタムプライマー１ ＵＭＩ＋リード１及びカスタムプライマー４ ＵＭＩ＋リード２を用いて読み取った。
合計６つのプライマーを含有する３つのカスタムプライマーポートを、この配列決定法に使用した。ｉ７及びｉ５カスタムプライマーを、配列決定のための標準的な操作手順に従って１つのカスタムプライマーポートに添加した。この実施例に従って使用及び調製されるプライマーは、配列決定カートリッジ上の利用可能なプライマーポート数が限られている当業者にとって有用であり得る。例えば、一部の配列決定プラットフォームは、利用可能プライマーポートは３つのみである。この方法は、配列決定プロセス中の異なる時間に使用される単一反応における異なるカスタム配列決定プライマーの混合を可能にし、それによって、当業者が配列決定カートリッジ上に必要とされるカスタムプライマーポートの数を最小限にすることを可能にする。
任意選択的に、この方法は、代わりに、カスタムプライマー１ ＵＭＩ＋リード１及びカスタムプライマー２ ＵＭＩ＋リード２の２つのプライマーのみを含み得る。これらの２つのプライマーは予め混合することができ、２つのカスタムプライマーポートのみを必要とする。
Ｃ．結果
図３Ｃは、配列決定ランにおけるサイクル毎の品質スコアを示す。簡潔に言えば、品質スコアは、ベースコールでのエラーの確率の予測である。高品質スコアは、ベースコールがより信頼性が高く、不正確である可能性がより低いことを意味する。Ｑ３０のクオリティスコアを有する塩基コールでは、１，０００における１つの塩基コールが不正確であると予測される。配列決定の品質がＱ３０に達する場合、事実上全ての読み取りが完全であり、エラーやあいまいさがなくなる。Ｑ３０は、次世代配列決定における品質のベンチマークと考えられる。
図３Ｃは、≧Ｑ３０の％を示すが、図３Ｄは、この実施例の配列決定ランにおけるサイクル毎の配列決定サイクルの強度を示す。暗サイクルを用いて、配列決定の速度を上げ、アダプター配列にわたる反応の情報価値のない画像の記録を回避した。暗サイクル（及び明サイクル）は、挿入部で新しい読み取りを開始することと比較して、後続の配列決定の質を低下させる（図３Ｃ及び図３Ｄ）。
５０ｎｇの鋳型インプットを用いた配列決定反応において、ＴｒｕＳｉｇｈｔ ＵＭＩ法は優れた性能を示した。実施例１におけるＨｙｂ２Ｙワークフローは、配列決定性能の改善を可能にするために最適化を必要とした可能性がある。
図３Ｅに示すように、ＴｒｕＳｉｇｈｔ ＵＭＩ法（ＴｒｕＳｉｇｈｔ－Ｄｕｐｌｅｘ）は、５０ｎｇの鋳型インプットを用いた反応において優れた性能を実証した。これは、実施例１における伸長及びライゲーション工程中に使用されるポリメラーゼによってＵＭＩ配列に導入されたエラーに起因して、分析の第１の工程においてＵＭＩリードが破棄されることによって引き起こされた可能性がある。図３Ｅでは、二重鎖ＵＭＩを有さない設計を０と呼んだ。フォーク－二重鎖ライブラリーのアダプターブロッキングも最適以下であった。それにもかかわらず、フォーク－二重鎖データセットは、２０％の二重鎖ファミリーと呼ばれていた。この数は、実施例１のＨｙｂ２Ｙワークフローにおける生化学的反応に対する最適化によって改善されるはずである。最適化され得るパラメータの例としては、オリゴヌクレオチド濃度、ハイブリダイゼーション時間、ハイブリダイゼーション温度、及びハイブリダイゼーションに使用される配列の選択が挙げられる。
実施例３．架橋プライマー再ハイブリダイゼーションによる二重鎖ＵＭＩを含むＤＮＡライブラリーの配列決定
この実施例は、実施例１のＤＮＡライブラリーを配列決定する方法を記載する。
Ａ．材料
材料は、上記実施例２に記載した通りである。
Ｂ．方法
方法は、上記の実施例２に記載の通りであるが、以下の改変を伴う。
ここでは、暗サイクルを含まないカスタム配列決定レシピが使用される。レシピは、リード１及びリード４の間の追加のプライマー再ハイブリダイゼーションを更に含む（図４）。
１．プライマー
この実施例におけるカスタムプライマーは、表２及び図４に提供される通りである。リード１及びリード６のプライマーは架橋プライマーである。
各架橋プライマーは、Ａ１４－Ａ２配列にアニールする配列、ＵＭＩ配列にまたがるがアニールしない２つのスペーサー、及びＭＥ配列にアニールする配列を含む。タグメンテーション化ライブラリーにおいて、Ａ１４－Ａ２及びＭＥ配列は定常配列であるが、ＵＭＩ配列は変化する。この実施例において、使用されるｉＳｐ１８の２つのコピーは、プライマー２及び６の各々における２つのスペーサーである。
この実施例の配列決定方法において、プライマー１を最初にアニーリングし、次いでプライマー２をアニーリングするために除去される。同様に、プライマー５をアニールした後、プライマー６のアニールのために除去される。インサートＤＮＡの配列を、インサート１リード用のカスタム架橋プライマー及びインサート２リード用のカスタム架橋プライマーを用いて読み取った。
実施例４．二重鎖ＵＭＩエラー補正を可能にするためにＵＭＩ－ＢＬＴを使用する配列決定のためのＤＮＡライブラリーの調製
本実施例は、エラー補正のためにＵＤＩ及び二重鎖ＵＭＩを用いてＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製するために使用される非対称タグメンテーションＢＬＴ法を記載する。材料は実施例１に記載した通りである。タグメンテーション工程において、ＵＭＩを標的ＤＮＡの第１の鎖に付加し、標的ＤＮＡの第２の鎖はＵＭＩによってタグメンテーションされなかった。
この方法において、標的ＤＮＡをタグメンテーションするためのＵＭＩ－ＢＬＴを含むトランスポソーム構造は、図５Ａに示される通りである。タグメンテーション化ＤＮＡは、図５Ｂに示すように処理される。タグメンテーション化ＤＮＡをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で洗浄し、トランスポザーゼＴｓＴｎ５（図５Ａ及び図５Ｂに示す）を除去する。タグメンテーション化ＤＮＡライブラリーを、ＵＤＩプライマーを使用するＰＣＲによって増幅する。
実施例５．暗サイクルによる二重鎖ＵＭＩを含むＤＮＡライブラリーの配列決定
本実施例は、暗サイクルを含む実施例４のＤＮＡライブラリーを配列決定する方法を記載する（図６Ａ）。
Ａ．材料
材料は、上記実施例２に記載した通りである。
Ｂ．方法
方法は、上記の実施例２に記載の通りであるが、以下の改変を伴う。
１．プライマー
この方法では、（１）標準インサートリード１、（２）カスタムｉ７、（３）標準ｉ５、及び（４）ＵＭＩ＋インサートリード２の４つのプライマーを使用した。プライマーは、図６Ａの黒色矢印によって示されるように、それぞれの領域にアニールするように設計した。標準インサートリード１をＡ１４－ＭＥ配列にアニールした。カスタムｉ７をＡ２’－Ｂ１５’配列にアニールした。標準ｉ５をＭＥ’－Ａ１４’配列にアニールした。ＵＭＩ＋インサートリード２をＢ１５－Ａ２配列にアニールした。
Ｃ．結果
本実施例の配列決定方法（図６Ａ）を、ＴｒｕＳｅｑ（商標）法又はＩＤＰＥ標準法（図３Ａ）を使用した配列決定ランと比較した。図７（「暗」）に示されるこの方法についての標準配列決定リード１及びＲ４ ＵＭＩ＋インサートリード２のＱ３０％は、方法がＩＤＰＥ（「ＩＤＰＥ標準」）及びＴｒｕＳｅｑ（商標）（「ＴｒｕＳｅｑ標準」）法ほど良好に機能しなかったが、この方法が成功したことを示す。暗サイクル後にＱ３０％スコアの減少も観察された。この配列決定方法は、３つのプライマーのみを使用し、３つ以下のプライマーを支持し得るカートリッジを有する配列決定機器と共に使用される場合、好ましい方法であり得る。
実施例６．架橋プライマー再ハイブリダイゼーションによる二重鎖ＵＭＩを含むＤＮＡライブラリーの配列決定
本実施例は、暗サイクルの代わりに架橋プライマー再ハイブリダイゼーションを含む、実施例４のＤＮＡライブラリーを配列決定する方法を記載する（図６Ｂ）。
Ａ．材料
材料は、上記実施例５に記載した通りである。
Ｂ．方法
方法は、上記の実施例５に記載の通りであるが、以下の改変を伴う。
１．プライマー
この方法では、（１）標準インサートリード１、（２）カスタムｉ７、（３）標準ｉ５、（４）ＵＭＩ、及び（５）インサートリード２架橋プライマーの５つのプライマーを使用する。プライマーは、図６Ｂの黒色矢印によって示されるように、それぞれの領域にアニールするように設計した。プライマー（１）～（４）は、前段落に記載した領域にアニールする。プライマー５は、Ａ２－Ｂ１３配列にアニールする配列、ＵＭＩ配列にまたがるがアニールしないスペーサー、及びＭＥ配列にアニールする配列を含む。プライマー５は、配列決定法における暗サイクルの必要性を排除する。この方法において、プライマー４をまずアニールし、次いでプライマー５のアニールのために除去される。インサートＤＮＡの配列を、標準インサートリード１及びインサートリード２架橋プライマーを用いて読み取る。
Ｃ．結果
本実施例の配列決定方法（図６Ｂ）を、ＴｒｕＳｅｑ（商標）法又はＩＤＰＥ標準法（図３Ａ）を使用した配列決定ランと比較した。図７（「再ｈｙｂ」）に示されるこの方法についての標準配列決定リード１及びＲ５挿入リード２架橋プライマーのＱ３０％は、方法がＴｒｕＳｅｑ（商標）（「ＴｒｕＳｅｑ標準」）及びＩＤＰＥ（「ＩＤＰＥ標準」）方法と同様に機能し、暗サイクルを用いる方法（「暗」実施例５も参照）よりも配列決定が良好であったことを示す。
実施例７．配列決定のためのＵＭＩ ＢＬＴを用いる無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）からのＤＮＡライブラリーの調製
本実施例は、エラー補正のためにＵＤＩ及び二重鎖ＵＭＩを用いてＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製するために使用される非対称タグメンテーションＢＬＴ法を記載する。材料は実施例１に記載した通りである。タグメンテーション工程において、第１のＵＭＩを標的ＤＮＡの第１の鎖に付加し、第２のＵＭＩを標的ＤＮＡの第２の鎖に付加した。
ｃｆＤＮＡを、１人の患者の５ｍＬの血漿から抽出した。Ｍｇ２＋を含まないＢＬＴ Ｔｎ５を使用してｃｆＤＮＡを抽出した。図８に示されるように、ｃｆＤＮＡを、対照としてＴｒｕＳｅｑ（商標）ワークフローを使用して処理したか、又は本実施例に記載される方法を使用して処理した（図８の「ｅＢＢＮ」）。
まず、ｃｆＤＮＡを、ＴｒｕＳｅｑ（商標）ワークフローを使用して以下のように処理した。（１）３０分間の末端修復、（２）３０分間のＡ－テーリング、（３）３０分間のＵＭＩのライゲーション、（４）３０分間のアダプターのライゲーション、（５）ＳＰＲＩの洗浄、及び（６）ＰＣＲによる増幅。
図９に示すように、既存の方法のタグメンテーションワークフローに従って、以下の工程でｃｆＤＮＡの別の試料を処理した。（１）ｃｆＤＮＡを、単一ＵＭＩアダプターを含む捕捉オリゴヌクレオチドで５分間タグメンテーションし、（２）タグメンテーションを停止し、（３）タグメンテーション化ｃｆＤＮＡ、すなわちＵＭＩライブラリーを５～１０分間の洗浄を用いて洗浄し、（４）作製したＵＭＩライブラリーをＰＣＲによって増幅した。
この方法では、ＵＤＩの代わりにＵＭＩをＢＬＴ捕捉オリゴヌクレオチドに付加したが、これにより、ＵＤＩを使用する更なるインデックス化を排除する。ＵＭＩは、ＢＬＴ捕捉部分を有する鎖と同じ鎖上にはなく、ＵＭＩは転移鎖上にあり、一方、ＢＬＴ捕捉部分は非転移鎖上にある。
１０個のＵＭＩ配列をｉ７位置に使用し、１０個のＵＭＩ配列をｉ５位置に使用した。タグメンテーション化ＤＮＡ断片をギャップ充填し、Ｐ５及びＰ７プライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。この方法は、標準配列決定プライマーを使用する配列決定に対して準備ができているＡ１４及びＢ１５オリゴヌクレオチド配列を有する標準構造ＢＬＴライブラリーを生成した。
実施例８．単一ＵＭＩを含むＤＮＡライブラリーの配列決定
この実施例は、実施例７のＤＮＡライブラリーを配列決定する方法を記載する。
Ａ．材料
材料は、上記実施例２に記載した通りである。
Ｂ．方法
方法は、上記の実施例２に記載の通りであるが、以下の改変を伴う。
１．プライマー
この実施例は、標準配列決定ラン及び標準配列決定プライマーであるＮｅｘｔｅｒａ Ｒｅａｄプライマー１（ＮＲ１リード）、ｉ７リード、ｉ５リード、及びＮｅｘｔｅｒａ Ｒｅａｄプライマー２（ＮＲ２リード）を含んだ。プライマーは、図９の黒色矢印によって示されるように、それぞれの領域にアニールするように設計した。ｉ７及びｉ５領域はＵＭＩによって損なわれているので、ＵＭＩをインデックスリードから捕捉した。
Ｃ．結果
ＤＮＡライブラリー全体のＵＭＩリードの均一な分布は、単一ＵＭＩのタグメンテーション化ＤＮＡ断片への組み込みが成功したことを示す（図１０）。配列決定リードに対してＲｅａｄ Ｃｏｌｌａｐｓｉｎｇ分析工程を実施して、重複リードをグループ化し、それらを単一のコンセンサス整列リードに折り畳んだ。得られたリード（重複排除されたリード）は、より高い塩基あたりの品質及び種々の供給源由来のより低いノイズを有する。Ｒｅａｄ Ｃｏｌｌａｐｓｉｎｇは、ＵＭＩが関与する場合の品質管理に対する有用な測定基準である。
図１１Ａ及び図１１Ｂに示されるように、単一のＵＭＩ－ＢＬＴライブラリー（図１１Ｂにおいて「ｅＢＢＮ」として示される）は、ＴｒｕＳｅｑ（商標）ライブラリー（図１１Ａにおいて「ＵＭＩなし」として示される）よりも大きい重複排除された平均標的カバレッジ及びｃｆＤＮＡのライブラリーへのより高い変換を有することを示す。
実施例９．ＵＤＩによる配列決定及び二重鎖配列エラー補正のための二重鎖ＵＭＩ－ＢＬＴを使用するＤＮＡライブラリーの調製
本実施例は、エラー補正のためにＵＤＩ及び二重鎖ＵＭＩを用いてＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製するために使用される対称タグメンテーションＢＬＴ法を記載する。材料は実施例１に記載した通りである。この方法は、ＢＬＴのフォーク型アダプター捕捉オリゴヌクレオチド中に二重鎖ＵＭＩを含む（図１２）。タグメンテーション工程において、ＵＭＩを標的ＤＮＡの両方の鎖に付加する。
まず、１２０個の異なるＵＭＩ二重鎖を含むＵＭＩのプールを形成する。各ＵＭＩ二重鎖を別々に調製し、次いで一緒に混合して、ＵＭＩのプールを形成する。このプールを使用してフォーク型アダプター捕捉オリゴヌクレオチドを調製し、次いでこれを使用してユニバーサルＵＭＩ ＢＬＴ（ユニバーサルＵＭＩ Ｔｓｍ）を調製する。標的ＤＮＡ断片を、ユニバーサルＵＭＩ Ｔｓｍを使用してタグメンテーションする。ＥＬＭを用いてギャップ充填及びライゲーションを行う。タグメンテーション化ＤＮＡは、Ｎｅｘｔｅｒａ Ｉｎｄｅｘプライマーを使用してＰＣＲによって増幅され、配列決定の準備ができている。
実施例１０．二重鎖ＵＭＩ及びＵＤＩを含むＤＮＡライブラリーの配列決定
この実施例は、二重鎖ＵＭＩ及びＵＤＩを含む実施例９のＤＮＡライブラリーを配列決定する方法を記載する。この方法は、ＭＥ領域の画像化を回避するための、４つの標準プライマー及び暗サイクルの使用を含む。
Ａ．材料
材料は、上記実施例２に記載した通りである。
Ｂ．方法
方法は、上記の実施例２に記載の通りであるが、以下の改変を伴う。
１．プライマー
この実施例は、１９回の暗サイクル並びに配列決定プライマーである（１）Ａ１４リード、（２）ｉ７リード、（３）Ｂ１５リード、及び（４）ｉ５リードを用いた配列決定ランを含む。プライマーは、図１２の灰色矢印によって示されるように、それぞれの領域にアニールするように設計した。
標準Ａ１４リードプライマー及び標準Ｂ１５リードプライマーは、Ａ１４領域及びＢ１５領域にアニールする。これらの領域は、短いヌクレオチド配列（すなわち、１４塩基対）を含み、これは、Ａ１４リードプライマー及びＢ１５リードプライマーにおける低Ｔｍの設計をもたらす。プライマーは、ＵＭＩ配列を読み取ることができるように、それぞれのＴｍを増加させる、追加の１０塩基対などの修飾から利益を得る。
実施例１１．インデックス化及び二重鎖配列エラー補正を可能にする配列決定のためのＤＮＡライブラリーの調製
本実施例は、エラー補正のためにＵＤＩ及び二重鎖ＵＭＩを用いてＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製するために使用される対称タグメンテーションＢＬＴ法を記載する。材料は実施例１に記載した通りである。この方法は、ＢＬＴのフォーク型アダプター捕捉オリゴヌクレオチド中にＵＭＩを含む（図１３）。タグメンテーション工程において、ＵＭＩを標的ＤＮＡの両方の鎖に付加する。
ＵＭＩ、ＢＬＴ、及びタグメンテーション化ＤＮＡを調製するための工程は、上記実施例９に記載の通りである。
実施例１２．ＤＮＡライブラリーの配列決定
この実施例は、実施例１１のＤＮＡライブラリーを配列決定する方法を記載する。
Ａ．材料
材料は、上記実施例２に記載した通りである。
Ｂ．方法
方法は、上記の実施例２に記載の通りであるが、以下の改変を伴う。
１．プライマー
この実施例は、６つのカスタム配列決定プライマーである（１）カスタム１、（２）カスタムＵＭＩｉ７、（３）カスタムｉ７、（４）カスタム２、（５）カスタムＵＭＩｉ５、及び（６）カスタムｉ５を含む。プライマーは、図１３の黒色矢印によって示されるように、それぞれの領域にアニールするように設計した。
実施例１３．ヘアピンＵＭＩ及びユニバーサルハイブリダイズテールを含む３’アダプターを使用する配列決定のためのＤＮＡライブラリーの調製
この実施例は、ＵＭＩがタグメンテーション後に組み込まれる、ＵＭＩを有するＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製するために使用される非対称タグメンテーションＢＬＴ法を記載する（図１４）。ヘアピン－ＵＭＩ及びユニバーサルハイブリダイズテールを含む３’アダプターを用いて、ＵＭＩを組み込む。
材料は実施例１に記載した通りである。
この方法は、標的ＤＮＡを５’配列決定アダプター（５’アダプター）でタグメンテーションし、次いで、ＵＭＩが挿入ＤＮＡの３’末端に直接隣接して配置されるように、３’配列決定アダプター（３’アダプター）を５’アダプターＭＥ配列にハイブリダイズさせることを含む。これにより、標準的な下流のライブラリー調製工程（すなわち、試料多重化ＰＣＲ）及び配列決定試薬レシピとの適合性を確実にする、インラインＵＭＩが生成される。
５’アダプター配列Ａ１４のみを含有するトランスポソームを用いて二本鎖ＤＮＡに対してタグメンテーションを行い、非転移Ｔｎ５－モザイク末端配列であるＭＥを変性させる。３’アダプターは、一般的なワトソン－クリック塩基対形成が可能なイノシン塩基を含み得る、３’ユニバーサルハイブリダイズテールを含有するオリゴヌクレオチドである。３’ユニバーサルハイブリダイズテールは、ＵＭＩヘアピン、及びＭＥ’配列、及び３’アダプター配列であるＢ１５を更に含有する。
Ｈｙｂ２Ｙを用いて、３’アダプターを５’アダプターＭＥにハイブリダイズする。ユニバーサルハイブリダイズテールは、転移鎖の露出した５’塩基（５’アダプターに隣接する）にハイブリダイズされる。９ヌクレオチドのユニバーサルハイブリダイズテールを用いて、転移鎖の露出した９ヌクレオチドは完全にハイブリダイズし、ユニバーサルハイブリダイズテールの５’は大腸菌ＤＮＡリガーゼによって非転移鎖の３’にライゲーションされる。９ヌクレオチド未満のユニバーサルハイブリダイズテールを使用すると、ライゲーションの前に非転移鎖の更なる伸長工程が必要となる場合がある。
標準的な配列決定方法（実施例２に記載され、図３Ｂ及び図２０に示される）を用いて、この実施例のライブラリーを、それぞれ挿入ＤＮＡに先行及び後続する、リード２の開始点又はリード１の末端点において配列決定できる。リードは、インサートの品質及び可変インサート長に起因して、リード２の開始点において捕捉される可能性がより高い。
ユニバーサルハイブリダイズテールオリゴヌクレオチドは、各（元の）ＤＮＡ分子の固有コピー（固有コピーインデックス、ＵＣＩ）を追跡し、分解する可能性を提供する。元の挿入分子の異なるコピーは、同じＵＭＩによって異なる９ヌクレオチドユニバーサルハイブリダイズテール配列を有することができる。ＵＭＩと同様に、ＵＣＩは、配列決定リードにおける所定の位置とインラインである。したがって、バイオインフォマティクス的に同定され得る。
実施例１４．ヘアピン－ＵＭＩを含む３’アダプターを使用する配列決定のためのＤＮＡライブラリーの調製
この実施例は、ＵＭＩがタグメンテーション後に組み込まれる、インラインＵＭＩを有するＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製するために使用される非対称タグメンテーションＢＬＴ法を記載する（図１５）。ヘアピン－ＵＭＩを含む３’アダプターを用いて、ＵＭＩを組み込む。
材料は実施例１に記載した通りである。
３’アダプターは、実施例１３に記載されるようにヘアピンＵＭＩを含有するが、ユニバーサルハイブリダイズテールを含有しない。
５’アダプタータグメンテーション及び３’アダプターハイブリダイゼーション工程を、実施例１３に記載されるように行う。３’アダプターハイブリダイゼーションの後、非転移鎖の３’を、ハイブリダイズした３’アダプターの５’末端に達するまで、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する。（ＤＮＡポリメラーゼは鎖置換を含まず、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含まない。）これにより、ＵＭＩ－ヘアピンの５’末端が３’アダプターの３’末端に近接して配置される。
標準的な配列決定方法（実施例２に記載され、図３Ｂ及び図２０に示される）を用いて、この実施例のライブラリーを、それぞれ挿入ＤＮＡに先行及び後続する、リード２の開始点又はリード１の末端点において配列決定できる。リードは、インサートの品質及び可変インサート長に起因して、リード２の開始点において捕捉される可能性がより高い。
実施例１５ａ．３’スプリントライゲーションアダプターを使用する配列決定のためのＤＮＡライブラリーの調製。
この実施例は、ＵＭＩがタグメンテーション後に組み込まれる、インラインＵＭＩを有するＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製するために使用される非対称タグメンテーションＢＬＴ法を記載する（図１６）。３’スプリントライゲーションアダプターを使用してＵＭＩを組み込む。
材料は実施例１に記載した通りである。
５’アダプタータグメンテーション及び３’アダプターハイブリダイゼーション工程を、実施例１３に記載されるように行う。
３’スプリントライゲーションアダプターは、ＵＭＩ－ＭＥ’－Ｂ１５と非転移鎖との間のライゲーションのためのスプリントを作り出す、部分的に二本鎖の複合体である（図１６）。３’スプリントライゲーションアダプターの各鎖は、アダプターの２つの部分のうちの１つを形成し、各鎖は約５０ヌクレオチド長である。アダプターの２つの部分は、スプリント（図１６、３’スプリントライゲーションアダプター、下の鎖を参照）、及びテール（図１６、３’スプリントライゲーションアダプター、上の鎖を参照）である。アダプタースプリント部分は、５’から３’へ、ＭＥ、ＵＭＩ’、ＭＥ’、切断Ａ１４’の領域を含む。ＭＥ及びＡ１４’配列の両方は、所望のハイブリダイゼーション特異性を改善するため、かつアダプターオリゴヌクレオチドコストを減少させるために切断され得る。例えば、ＭＥは、５’から３’へのアダプター結合に必要な完全なＭＥ’配列との分子内ハイブリダイゼーションを防ぐために切断される。アダプターテール部分は、ＵＭＩ及びＭＥ配列を介してアダプタースプリント部分にハイブリダイズし、これは、５’アダプターと３’アダプターとの間のハイブリダイゼーションを安定化させることによって効率を改善し得る。アダプターテール部分は、５’から３’へ、ＵＭＩ、ＭＥ’、及びＢ１５の領域を含有する。アダプターテール部分は切断されていない。標的ＤＮＡの非転移鎖をアダプターのテールの５’末端まで伸長させ、実施例１４に記載のライゲーション工程に従って特定されるようにライゲーションする。
標準的な配列決定方法（実施例２に記載され、図３Ｂ及び図２０に示される）を用いて、この実施例のライブラリーを、それぞれ挿入ＤＮＡに先行及び後続する、リード２の開始点又はリード１の末端点において配列決定できる。
実施例１５ｂ．３’スプリントライゲーションアダプターを使用する配列決定のためのＤＮＡライブラリーの調製。
この実施例は、ＵＭＩがタグメンテーション後に組み込まれる、インラインＵＭＩを有するＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製するために使用される非対称タグメンテーションＢＬＴ法を記載する（図１６）。３’スプリントライゲーションアダプターを使用してＵＭＩを組み込む。この実施例は、以下の変更を加えた実施例１５ａによって提供される方法を記載する。
３’スプリントライゲーションアダプターは、以下の変更を加えた上記実施例１５ａに記載される通りである。アダプタースプリント部分は、５’から３’へ、Ｘ、ＵＭＩ’、ＭＥ’の領域を含有する。実施例１５ａのスプリント部分と比較して、この実施例におけるスプリント部分は、３’スプリントアダプターがビーズ上の３’アダプター付加を容易にできるように、Ａ１４’を含有しない。Ｘ配列は、３’ＴｒｕＳｅｑ（商標）アダプター配列の一部であり、所望のハイブリダイゼーション特異性を改善し、アダプターオリゴヌクレオチドコストを減少させるために切断され得る。アダプターテール部分は、５’から３’へ、ＵＭＩ、Ｘ’及びＢ１５の領域を含有する。
この実施例のライブラリーは、次の変更を加え、すなわち、カスタムリード２プライマーを必要として、標準的な配列決定方法（実施例２に記載され、図３Ｂ及び図２０に示される）を使用して配列決定される。
実施例１６ａ．３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを使用する配列決定のためのＤＮＡライブラリーの調製
この実施例は、ＵＭＩがタグメンテーション後に組み込まれる、インラインＵＭＩを有するＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製するために使用される非対称タグメンテーションＢＬＴ法を記載する（図１７）。３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを使用してＵＭＩを組み込む。
材料は実施例１に記載した通りである。
３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、約７０ヌクレオチド長であり、５’から３’へ、Ｂ１５’、ＭＥ又はＸ、ＵＭＩ’、ＭＥ’、及びＡ１４’の領域を含有する。
５’アダプタータグメンテーション及び３’アダプターハイブリダイゼーション工程を、実施例１３に記載されるように行う。ハイブリダイゼーション後、マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素などの、ＤＮＡ指向性鋳型切り替えが可能なポリメラーゼを用いて伸長を行う。非転移鎖を伸長して、転移鎖の５’末端を９ヌクレオチドまでコピーする。鋳型スイッチ接合部（図１７中の＊＊）に到達すると、ポリメラーゼは、鋳型として非転移ＤＮＡ鎖を使用することから、３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドに切り替えることができる。このようにして、ＵＭＩ、ＭＥ’／Ｘ’、及びＢ１５配列は、３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドからコピーされる。
標準的な配列決定方法（実施例２に記載され、図３Ｂ及び図２０に示される）を用いて、この実施例のライブラリーを、それぞれ挿入ＤＮＡに先行及び後続する、リード２の開始点又はリード１の末端点において配列決定できる。
実施例１６ｂ．３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを使用する配列決定のためのＤＮＡライブラリーの調製
この実施例は、ＵＭＩがタグメンテーション後に組み込まれる、インラインＵＭＩを有するＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製するために使用される非対称タグメンテーションＢＬＴ法を記載する（図１７）。３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを使用してＵＭＩを組み込む。この実施例は、３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドに以下の変更を加えた実施例１６ａによって提供される方法を記載する。
３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドのＡ１４’配列は、３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドのビーズ上の付加を容易にするため、切断又は除去される。
標準的な配列決定方法（実施例２に記載され、図３Ｂ及び図２０に示される）を用いて、この実施例のライブラリーを、それぞれ挿入ＤＮＡに先行及び後続する、リード２の開始点又はリード１の末端点において配列決定できる。
実施例１６ｃ．５’一本鎖ポリメラーゼ鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを使用する配列決定のためのＤＮＡライブラリーの調製
この実施例は、ＵＭＩがタグメンテーション後に組み込まれる、インラインＵＭＩを有するＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製するために使用される非対称タグメンテーションＢＬＴ法を記載する（図１８Ａ～図１８Ｄ）。５’ポリメラーゼ鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを用いてＵＭＩを組み込む。
材料は実施例１に記載した通りである。循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を標的ＤＮＡとして使用する。
５’一本鎖ポリメラーゼ鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、５’から３’へ、Ｂ１５、Ｘ、及びＵＭＩの領域を有する５’アダプターである（図１８Ｂ）。
タグメンテーション及びアダプターハイブリダイゼーション工程を、実施例１３に記載されるように行う（図１８Ａ～図１８Ｂ）。この実施例では、５’アダプターをＭＥ’の５’に付加する（図１８Ｂ）。
次いで、ポリメラーゼ鋳型スイッチを用いて、５’アダプターをＤＮＡインサートに付加する。ポリメラーゼは、鋳型としての挿入ＤＮＡの使用から、鋳型としての付加された５’アダプターの使用に切り替わる（図１８Ｃ）。伸長が完了したら、Ｂ１５、Ｘ、及びＵＭＩ配列を挿入ＤＮＡの３’末端に融合させ、ＰＣＲ反応における鋳型として使用して、更なるフローセル及び試料インデックスアダプターエレメントを付加することができる（図１８Ｄ）。
この実施例のライブラリーを、標準的な配列決定法（実施例２に記載される）を使用して配列決定する。Ｘ領域は、ＭＥの非存在下でのＢ１５からの配列決定のために適切なＴｍに達するように、Ｂ１５領域を伸長するために働く。
実施例１６ｄ．５’二本鎖アダプター、ポリメラーゼ伸長及び近接ライゲーションを使用する配列決定のためのＤＮＡライブラリーの調製
この実施例は、ＵＭＩがタグメンテーション後に組み込まれる、インラインＵＭＩを有するＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製するために使用される非対称タグメンテーションＢＬＴ法を記載する（図１９Ａ～図１９Ｄ）。５’二本鎖アダプターを使用してＵＭＩを組み込む。
材料は実施例１に記載した通りである。循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を標的ＤＮＡとして使用する。
この実施例では、５’二本鎖アダプターは、その第１の鎖上に５’から３’へ、Ｂ１５、Ｘ、及びＵＭＩの領域を含有する。第２の鎖は、５’から３’へ、本明細書に列挙される相補的配列であるＵＭＩ’、Ｘ’、及びＢ１５’を含む。５’－リン酸は、５’アダプターの第２の鎖上に存在するが、タグメンテーションアダプター上のＭＥ’は、ＭＥ’と５’アダプターとのライゲーションを阻止するために脱リン酸化される（図１９Ｂ）。
タグメンテーション及びアダプターハイブリダイゼーション工程を、実施例１３に記載されるように行う（図１９Ａ～図１９Ｂ）。５’アダプターをＭＥ’の５’に付加する（図１９Ｂ）。アダプターハイブリダイゼーションの間、５’アダプターの第１の鎖及び第２の鎖は混合されて二本鎖を形成する。また、タグメンテーションアダプター上のＭＥ’は、５’アダプターとのライゲーションを阻止するために脱リン酸化される（図１９Ｂ）。
次いで、Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌ Ｅｘｏ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０３Ｓ）又はＴｔａｑ６０８などのポリメラーゼを用いて、最初の転位反応からギャップを横切って伸長させる（図１９Ｃ）。Ｔａｑポリメラーゼ、又は前述のポリメラーゼのいずれかの変異体、アナログ、若しくは誘導体もまた、この工程において代わりに使用され得る。使用したポリメラーゼは、鎖置換又はエキソヌクレアーゼ活性を欠いている。ギャップ伸長は、ＭＥ’との接合部で終結する。
次いで、近接ライゲーション工程が、３’伸長産物と５’アダプターの第２の鎖との間で起こる（図１９Ｃ）。
この実施例のライブラリー（図１９Ｄ）を、標準的な配列決定法（実施例２に記載される）を使用して配列決定する。Ｘ領域は、ＭＥの非存在下でのＢ１５からの配列決定のために適切なＴｍに達するように、Ｂ１５領域を伸長するために働く。リードは、インサートの品質及び可変インサート長に起因して、リード２の開始点において捕捉される可能性がより高い。
実施例１７．低頻度変異体の検出のためのＤＮＡライブラリーの調製
この実施例は、低頻度一塩基バリアント（ＳＮＶ）及び構造変異体（ＳＶ）の検出のためのＤＮＡ配列決定ライブラリーを調製するために使用される非対称タグメンテーションＢＬＴ法を記載する。
第１のＤＮＡライブラリーを、上記実施例７に記載の方法を使用して調製する。第２のＤＮＡライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ（商標）法を使用して調製する。
ＳＮＶ 及びＳＶを特定の量、すなわち２％、０．５％及び０．２％で含有するＤＮＡを使用する。
均等物
前述の明細書は、当業者が実施形態を実践することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳細に詳述し、本発明者らによって想到される最良の様式を説明する。しかしながら、前述の内容が本文にどれほど詳細にあらわれていても、実施形態は多くの方式で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
本明細書で使用するとき、約という用語は、明示的に示されているか否かにかかわらず、例えば、整数、割合、及び百分率を含む数値を指す。用語は、一般に、当業者が列挙された値（例えば、同じ機能又は結果を有する）と同等であると考えられる数値の範囲（例えば、列挙された範囲の±５～１０％）を指す。少なくとも及び約などの用語が数値又は範囲のリストの前にある場合、その用語はリスト内に提供される値又は範囲の全てを変更する。場合によっては、約という用語は、最も近い有効数字に丸められた数値を含んでもよい。

Claims (83)

  1. 二本鎖核酸ライブラリーを作製する方法であって、前記ライブラリー中の各断片は固有分子識別子（ＵＭＩ）を含み、前記方法は、
    ａ．二本鎖標的核酸を含む試料を、
    ｉ．第１のトランスポザーゼと、
    ｉｉ．第１の３’末端トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列、及び第１のＵＭＩを含む第１のトランスポゾンと、
    ｉｉｉ．前記第１の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、第１のトランスポソーム複合体に適用することと、
    ｂ．前記二本鎖標的核酸を前記第１のトランスポソーム複合体でタグメンテーションして、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することであって、各タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片は前記第１のアダプター配列及び前記第１のＵＭＩを含む、ことと、
    ｃ．前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を前記第１のトランスポソーム複合体から遊離させることと、
    ｄ．任意選択的に、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を伸長させることと、
    ｅ．任意選択的に、前記第１のトランスポゾンを、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片又は前記伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、
    ｆ．タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することと、
    ｇ．前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む、方法。
  2. 前記第１のトランスポゾン内の前記第１のＵＭＩが、前記第１のアダプター配列と前記第１の３’トランスポゾン末端配列との間に位置する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１のトランスポゾン内の前記第１のアダプター配列が、前記第１のＵＭＩと前記第１の３’トランスポゾン末端配列との間に位置する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. ａ．第２のトランスポザーゼと、
    ｂ．第２のアダプター配列及び第２の３’トランスポゾン末端配列を含む第３のトランスポゾンと、
    ｃ．前記第２の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第４のトランスポゾンと、を含む、第２のトランスポソーム複合体を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記タグメンテーション化工程が、
    ａ．前記第１のアダプター配列及び前記第１のＵＭＩを含む第１の鎖と、
    ｂ．前記第２のアダプター配列を含む第２の鎖と、を含む、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成する、請求項４に記載の方法。
  6. ａ．前記第３のトランスポゾンが、第２のＵＭＩを更に含み、
    ｂ．前記第２のアダプター配列が、前記第２のＵＭＩと前記第２の３’トランスポゾン末端配列との間に位置する、請求項４又は５に記載の方法。
  7. 前記タグメンテーション化工程が、
    ａ．前記第１のアダプター配列及び前記第１のＵＭＩを含む第１の鎖と、
    ｂ．前記第２のアダプター配列及び前記第２のＵＭＩを含む第２の鎖と、を含む、二本鎖標的核酸断片を生成する、請求項６に記載の方法。
  8. 二本鎖核酸ライブラリーを作製する方法であって、前記ライブラリー中の各断片はＵＭＩを含み、前記方法は、
    ａ．二本鎖標的核酸を含む試料を、
    ｉ．トランスポザーゼと、
    ｉｉ．第１の３’末端トランスポゾン末端配列、及び第１のアダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、
    ｉｉｉ．前記第１の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、トランスポソーム複合体に適用することと、
    ｂ．前記二本鎖標的核酸の第１の鎖を前記トランスポソーム複合体でタグメンテーションして、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することであって、各タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片は前記第１のアダプター配列を含む、ことと、
    ｃ．前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を前記トランスポソーム複合体から遊離させることと、
    ｄ．第２のアダプター配列、ＵＭＩ、及び前記第１の３’末端トランスポゾン配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含むポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることと、
    ｅ．任意選択的に、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長させることと、
    ｆ．任意選択的に、前記ポリヌクレオチドを、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片又は前記伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、
    ｇ．前記ＵＭＩを含むタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することであって、前記ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’末端に直接隣接して位置する、ことと、
    ｈ．前記ＵＭＩを含むタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む、方法。
  9. 二本鎖核酸ライブラリーを作製する方法であって、前記ライブラリー中の各断片はＵＭＩを含み、前記方法は、
    ａ．二本鎖標的核酸を含む試料を、
    ｉ．トランスポザーゼと、
    ｉｉ．第１の３’末端トランスポゾン末端配列、及び第１のアダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、
    ｉｉｉ．前記第１の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、トランスポソーム複合体に適用することと、
    ｂ．前記二本鎖標的核酸の第１の鎖を前記トランスポソーム複合体でタグメンテーションして、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することであって、各タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片は前記第１のアダプター配列を含む、ことと、
    ｃ．前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片をトランスポソーム複合体から遊離させることと、
    ｄ．ＵＭＩ及び第２のアダプター配列を含む第１のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることと、
    ｅ．任意選択的に、前記第１のポリヌクレオチドに相補的な領域を含む第２のポリヌクレオチドを付加して、二本鎖アダプターを生成させることと、
    ｆ．任意選択的に、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長させることと、
    ｇ．任意選択的に、前記第２のポリヌクレオチドを、前記伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の前記第２の鎖とライゲーションすることと、
    ｈ．前記ＵＭＩを含むタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することであって、前記ＵＭＩは、前記二本鎖標的核酸断片と前記第２のアダプター配列との間に位置する、ことと、
    ｉ．前記ＵＭＩを含む前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む、方法。
  10. 前記ハイブリダイズさせる工程の後に、前記方法が、
    ａ．前記二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長することと、
    ｂ．前記第１のポリヌクレオチドをコピーすることと、を更に含む、請求項９に記載の方法。
  11. 二本鎖核酸ライブラリーを作製する方法であって、前記ライブラリー中の各断片は２つの異なるＵＭＩを含み、前記方法は、
    ａ．二本鎖標的核酸を含む試料を、
    ｉ．第１のトランスポソーム複合体であって、
    １．第１のトランスポザーゼと、
    ２．（ａ）前記二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上の第１のトランスポゾン、及び（ｂ）第２のトランスポゾンを含む、第１のフォーク型アダプターと、を含み、
    前記第１のトランスポゾンは、第１の３’末端トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列の第１のコピー、及び第１のＵＭＩを含み、
    前記第２のトランスポゾンは、第２のアダプター配列の第１のコピー、並びに前記第１の３’末端トランスポゾン末端配列及び前記第１のＵＭＩに完全に又は部分的に相補的である配列を含み、
    更に、前記第１のアダプター配列の前記第１のコピーは一本鎖であり、前記第２のアダプター配列の前記第１のコピーは二本鎖部分を含む、第１のトランスポソーム複合体、並びに、
    ｉｉ．第２のトランスポソーム複合体であって、
    １．第２のトランスポザーゼと、
    ２．（ａ）前記二本鎖標的核酸断片の第２の鎖上の第３のトランスポゾン、及び（ｂ）第４のトランスポゾンを含む、第２のフォーク型アダプターと、を含み、
    前記第３のトランスポゾンは、第２の３’末端トランスポゾン末端配列、前記第１のアダプター配列の第２のコピー、及び第２のＵＭＩを含み、
    前記第３のトランスポゾンは、前記第２のアダプター配列の第２のコピー、並びに前記第２の３’末端トランスポゾン末端配列及び前記第２のＵＭＩに完全に又は部分的に相補的である配列を含み、
    更に、前記第１のアダプター配列の前記第２のコピーは一本鎖であり、前記第２のアダプター配列の前記第２のコピーは二本鎖部分を含む、第２のトランスポソーム複合体、に適用することと、
    ｂ．前記二本鎖標的核酸を前記フォーク型アダプターでタグメンテーションして、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することであって、各タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片は、前記第１のアダプター配列の前記第１のコピー及び前記第２のコピー、前記第１のＵＭＩ、前記第２のアダプター配列の前記第１のコピー及び前記第２のコピー、並びに前記第２のＵＭＩを含む、ことと、
    ｃ．前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を前記トランスポソーム複合体から遊離させることと、
    ｄ．任意選択的に、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を伸長させることと、
    ｅ．前記第２及び第４のトランスポゾンを、前記二本鎖標的核酸断片又は前記伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、
    ｆ．タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することと、
    ｇ．前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む、方法。
  12. 二本鎖核酸ライブラリーを作製する方法であって、前記ライブラリー中の各断片は４つの異なるＵＭＩを含み、前記方法は、
    ａ．二本鎖標的核酸を含む試料を、
    ｉ．第１のトランスポソーム複合体であって、
    １．第１のトランスポザーゼと、
    ２．（ａ）前記二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上の第１のトランスポゾン、及び（ｂ）第２のトランスポゾンを含む、第１のフォーク型アダプターと、を含み、
    前記第１のトランスポゾンは、第１の３’末端トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列の第１のコピー、第１のＵＭＩの第１のコピー、及び第２のアダプター配列の第１のコピーを含み、
    前記第２のトランスポゾンは、前記第１の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列、第３のアダプター配列の第１のコピー、第２のＵＭＩの第１のコピー、及び第４のアダプター配列を含み、
    更に、前記第１、第２、及び第３のアダプター配列の前記第１のコピーは一本鎖であり、前記第４のアダプター配列は二本鎖部分を含む、第１のトランスポソーム複合体、並びに、
    ｉｉ．第２のトランスポソーム複合体であって、
    １．第２のトランスポザーゼと、
    ２．（ａ）前記二本鎖標的核酸断片の第２の鎖上の第３のトランスポゾン、及び（ｂ）第４のトランスポゾンを含む、第２のフォーク型アダプターと、を含み、
    前記第３のトランスポゾンは、第２の３’末端トランスポゾン末端配列、第５のアダプター配列の第１のコピー、第３のＵＭＩの第１のコピー、及び第６のアダプター配列の第１のコピーを含み、
    前記第４のトランスポゾンは、前記第２の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列、第７のアダプター配列の第１のコピー、第４のＵＭＩの第１のコピー、及び第８のアダプター配列を含み、
    更に、前記第５、第６、及び第７のアダプター配列の前記第１のコピーは一本鎖であり、前記第８のアダプター配列は二本鎖部分を含む、第２のトランスポソーム複合体、に適用することと、
    ｂ．前記二本鎖標的核酸を前記フォーク型アダプターでタグメンテーションして、タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することであって、各タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片は、前記第１、第２、第３、第５、第６、及び第７アダプター配列の前記第１のコピー、前記第１、第２、第３、及び第４のＵＭＩの前記第１のコピー、前記第６のアダプター配列、並びに前記第８のアダプター配列を含み、
    ｃ．前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を前記トランスポソーム複合体から遊離させることと、
    ｄ．任意選択的に、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を伸長させることと、
    ｅ．前記第２及び第４のトランスポゾンを、前記二本鎖標的核酸断片又は前記伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、
    ｆ．タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を生成することと、
    ｇ．前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片を増幅することと、を含む、方法。
  13. 前記第１、第２、第３、及び第４のＵＭＩが相補的又は異なる配列であってもよい、請求項６、７、１１、又は１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記二本鎖標的核酸が二本鎖ＤＮＡである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記二本鎖標的核酸がｃｔＤＮＡである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記二本鎖標的核酸がｃｆＤＮＡである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記二本鎖標的核酸がＲＮＡである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  18. 二本鎖標的核酸が、ｃＤＮＡであるか、又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が、ＲＮＡから生成される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記第１のアダプター配列が、５’第１リード配列決定アダプター配列である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記第２のアダプター配列が、５’第２リード配列決定アダプター配列である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記第１及び第２のアダプター配列が、５’第１リード及び５’第２リード配列決定アダプター配列である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記５’第１リード及び５’第２リード配列決定アダプター配列が、固有プライマー結合部位を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記第１のＵＭＩが、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の前記第１の鎖上にある、請求項１、２、４～８、又は１３～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記第１のＵＭＩの第１のコピーが前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の前記第１の鎖上にあり、前記第１のＵＭＩの第２のコピーが前記第２の鎖上にある、請求項１、３、５～７、１３～２２のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記第１のＵＭＩが、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の前記第１の鎖上にあり、前記第２のＵＭＩが、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の前記第２の鎖上にある、請求項１～７、１３～２２のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記第１、第２、第３、又は第４のトランスポゾンがビオチンタグを更に含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記第１、第２、第３、又は第４のトランスポゾンが、第１の固有プライマー結合配列を更に含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記第１、第２、第３、又は第４のトランスポゾンが、第２の固有プライマー結合配列を更に含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記固有プライマー結合配列が、Ａ２、Ａ１４、及び／又はＢ１５を含む、請求項２７又は２８に記載の方法。
  30. 前記ハイブリダイズさせる工程が、フォーク型アダプターを生成する、請求項８～１０又は１４～２２のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記二本鎖標的核酸断片の３’末端から前記トランスポゾンの５’末端まで伸長させることを更に含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記ライゲーション工程が、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の３’末端又は前記伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の３’末端を、前記第１、第２、又は第４のトランスポゾンの５’末端とライゲーションすることを含む、請求項１～７又は１１～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記伸長及び／又はライゲーション工程が、伸長ライゲーション混合物中で任意選択的に実施される、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ポリヌクレオチドが、
    ａ．ヘアピンＵＭＩ、
    ｂ．ヘアピンＵＭＩとユニバーサルハイブリダイズテール、
    ｃ．スプリントライゲーションアダプター、又は
    ｄ．３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチド、を含む３’アダプターを含む、請求項８、１５～２２、２６～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記ヘアピンＵＭＩが、前記伸長工程及び／又は前記ライゲーション工程中は安定であるが、前記増幅工程中は安定ではない、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ヘアピンＵＭＩが３又は４塩基対ステムを含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
  37. 前記ユニバーサルハイブリダイズテールが、任意のＤＮＡヌクレオチドに結合できるヌクレオチドを含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記ライゲーション工程が、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の前記第２の鎖の３’末端を前記ユニバーサルハイブリダイズテールの５’末端とライゲーションすることを含む、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. ａ．前記ポリヌクレオチドが、ヘアピンＵＭＩを含む３’アダプターを含み、
    ｂ．前記伸長工程が、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の前記第２の鎖の３’末端から前記ヘアピンＵＭＩの５’末端まで伸長させることを含む、請求項３４に記載の方法。
  40. 前記ライゲーション工程が、前記伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の第２の鎖の前記３’末端を前記ヘアピンＵＭＩの前記５’末端とライゲーションすることを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. ａ．前記ポリヌクレオチドが、スプリントライゲーションアダプターを含み、
    ｂ．前記伸長工程が、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の前記第２の鎖の３’末端から前記スプリントライゲーションアダプターの５’末端まで伸長させることを含む、請求項３４に記載の方法。
  42. 前記伸長工程が、９塩基を伸長させることを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ライゲーション工程が、前記伸長させたタグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の前記第２の鎖の前記３’末端を前記スプリントライゲーションアダプターの第１の鎖の５’末端とライゲーションすることを含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
  44. ａ．前記ポリヌクレオチドが、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを含み、
    ｂ．前記伸長工程が、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の前記第１の鎖をコピーすることによって、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の前記第２の鎖の３’末端から前記鋳型スイッチオリゴヌクレオチド内の接合部まで伸長させることと、
    ｃ．前記第１の鎖から前記３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの不対領域に鋳型を切り替えることと、
    ｄ．前記３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの不対領域を、前記接合部から前記３’鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの前記不対領域の５’末端にコピーすることと、を含む、請求項３４のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記伸長、切り替え、及びコピーすることが、ＤＮＡ指向性鋳型切り替えが可能なポリメラーゼによって行われる、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記ＤＮＡ指向性鋳型切り替えが可能なポリメラーゼが、ＭＭＬＶ逆転写酵素を含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
  47. 前記ライゲーション工程が、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の３’末端を、第１、第２、又は第４のトランスポゾンの５’末端とライゲーションすることを含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記増幅工程の後に、あるサイズ範囲内の増幅された核酸断片を選択することを更に含む、請求項１～３３又は４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記増幅工程が、前記ライブラリーを固体支持体に付着させるために、前記タグメンテーション化二本鎖標的核酸断片の一端又は両端にオリゴヌクレオチドを付加することを含む、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記増幅工程が、少なくとも第１リード配列決定オリゴヌクレオチド及び／又は第２リード配列決定オリゴヌクレオチドを添加することを含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記増幅工程が、少なくともＰ５オリゴヌクレオチド及びＰ７オリゴヌクレオチドを添加することを含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記増幅工程が、少なくとも複数のｉ５オリゴヌクレオチド及び複数のｉ７オリゴヌクレオチドを添加することを含む、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記トランスポソーム複合体、前記第１のトランスポソーム複合体及び／又は前記第２のトランスポソーム複合体が固体支持体上にある、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記トランスポソーム複合体、前記第１のトランスポソーム複合体及び／又は前記第２のトランスポソーム複合体が溶液中にある、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法によって生成された二本鎖核酸ライブラリーを配列決定する方法であって、前記ＵＭＩを配列決定して、ＤＮＡ配列決定における感度を増加させる、方法。
  56. 類似の融解温度を有する配列決定プライマーを結合させることを含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 固有プライマー結合配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む配列決定プライマーを結合させることを含む、請求項５５又は５６に記載の方法。
  58. 少なくともＡ２配列を有するプライマーを配列決定することを含む、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 少なくともＡ１４配列及びＢ１５配列を有するプライマーを配列決定することを含む、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
  60. 少なくとも架橋プライマーを有するプライマーを配列決定することを含む、請求項５５～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 暗サイクルを更に含み、データが前記配列決定法の一部について記録されていない、請求項５５～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 記録されていない前記データが、前記３’トランスポゾン末端配列に関連する配列データである、請求項５５～６０のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記方法が、暗サイクルの必要性をなくす、請求項５５～６０のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記伸長工程が、前記ＵＭＩ又は前記第１のＵＭＩをコピーして二重鎖ＵＭＩを生成するポリメラーゼを含む、請求項１又は９に記載の方法。
  65. トランスポソーム複合体であって、
    ａ．トランスポザーゼと、
    ｂ．３’トランスポゾン末端配列及び５’アダプター配列を含む、第１のトランスポゾンと、
    ｃ．前記第１の３’末端トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、トランスポソーム複合体。
  66. 前記第１のトランスポゾンの前記５’アダプター配列が、Ａ１４配列（配列番号４）、Ａ２配列（配列番号７）、及び／又はＢ１５配列（配列番号５）を含む、請求項６５に記載のトランスポソーム複合体。
  67. 前記第１のトランスポゾンが、ＵＭＩ配列を更に含む、請求項６５又は６６に記載のトランスポソーム複合体。
  68. 前記第１又は第２のトランスポゾンが、Ａ１４－ＭＥ（配列番号１）を含む、請求項６５～６７のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
  69. 前記第１又は第２のトランスポゾンが、Ｂ１５－ＭＥ（配列番号２）を含む、請求項６５～６７のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
  70. 前記第１のトランスポゾンの前記３’トランスポゾン末端配列が、ＭＥ（配列番号６）又はＭＥ’（配列番号３）を含む、請求項６５～６７のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
  71. 前記第２のトランスポゾンの前記３’トランスポゾン末端配列が、ＭＥ（配列番号６）又はＭＥ’（配列番号３）を含む、請求項６５～６７のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
  72. 前記第２のトランスポゾンが、３’アダプター配列を更に含み、
    前記第２のトランスポゾンの前記３’アダプター配列は、前記第１のトランスポゾンの前記５’アダプター配列に部分的に又は完全に相補的である、請求項６７に記載のトランスポソーム複合体。
  73. 前記第２のトランスポゾンが、３’アダプター配列を更に含み、
    前記第２のトランスポゾンの前記３’アダプター配列は、前記第１のトランスポゾンの前記５’アダプター配列に相補的な部分がない、請求項６７に記載のトランスポソーム複合体。
  74. 前記第２のトランスポゾンの前記３’アダプター配列が、Ａ１４配列（配列番号４）、Ａ２配列（配列番号７）、Ｂ１５配列（配列番号５）、Ｘ配列、Ｙ’配列、Ａ配列、及び／又はＢ配列を含む、請求項７２又は７３に記載のトランスポソーム複合体。
  75. 前記第２のトランスポゾンが、前記第１のトランスポゾンの前記ＵＭＩ配列に相補的である配列を更に含む、請求項７２又は７４に記載のトランスポソーム複合体。
  76. 前記第２のトランスポゾンが、ＵＭＩを更に含み、前記第２のトランスポゾンの前記ＵＭＩは、前記第１のトランスポゾンの前記ＵＭＩとは異なる配列を含む、請求項７３又は７４に記載のトランスポソーム複合体。
  77. 前記Ｂ１５配列又はＡ１４配列に相補的なオリゴヌクレオチドを更に含む、請求項７５又は７６に記載のトランスポソーム複合体。
  78. ａ．Ａ１４配列に隣接するＡアダプター配列、
    ｂ．Ｂ１５配列に隣接するＢアダプター配列、
    ｃ．ＭＥ配列に隣接するＸアダプター配列、及び／又は
    ｄ．ＭＥ’配列に隣接するＹ’アダプター配列、を更に含む、請求項７６に記載のトランスポソーム複合体。
  79. 前記トランスポソーム複合体が、前記第１のトランスポゾン又は前記第２のトランスポゾンを介して固体支持体に固定されている、請求項６５～７８のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
  80. 前記トランスポソーム複合体が、前記相補的オリゴヌクレオチドを介して固体支持体に固定されている、請求項７７に記載のトランスポソーム複合体。
  81. 前記固体支持体がビーズである、請求項７９又は８０に記載のトランスポソーム複合体。
  82. 請求項６５～８１のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体を含む、キット。
  83. 請求項６５～８１のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体を生成するための、キット。
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