JP2024506052A

JP2024506052A - ロイコノストック・シトレウム菌株を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患の予防または治療用医薬組成物

Info

Publication number: JP2024506052A
Application number: JP2023547883A
Authority: JP
Inventors: チン，ファ・スプ
Original assignee: Liscure Biosciences Co Ltd
Current assignee: Liscure Biosciences Co Ltd
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2022-02-07
Publication date: 2024-02-08
Also published as: CA3207792A1; EP4289441A4; EP4289441A1; WO2022169338A1; US20240122996A1

Abstract

本発明は、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｃｉｔｒｅｕｍ）菌株またはその培養物を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患、具体的には、原発性胆汁性肝硬変（Ｐｒｉｍａｒｙｂｉｌｉａｒｙｃｉｒｒｈｏｓｉｓ；ＰＢＣ）または原発性硬化性胆管炎（Ｐｒｉｍａｒｙｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ；ＰＳＣ）に対する予防、改善または治療用組成物に関する。本発明による組成物は、いくつかの胆汁うっ滞性肝疾患に対して優れた予防および治療効果を示すため、ヒトまたは動物の胆汁うっ滞性肝疾患の治療、予防または改善などの用途のための組成物として有用に用いられることができる。

Description

本発明は、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｃｉｔｒｅｕｍ）菌株またはその培養物を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患、具体的には、原発性胆汁性肝硬変（Ｐｒｉｍａｒｙｂｉｌｉａｒｙｃｉｒｒｈｏｓｉｓ；ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（Ｐｒｉｍａｒｙｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ；ＰＳＣ）に対する予防、改善、または治療用組成物に関する。

胆汁うっ滞性肝疾患（ｃｈｏｌｅｓｔａｔｉｃｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙ）は、胆汁酸および脂質の蓄積によって引き起こされる疾患である。肝臓は、脂肪酸合成、ミトコンドリアβ－酸化、およびリン脂質輸送を含む中心的な脂質代謝過程を調節する。胆道閉塞（ｂｉｌｉａｒｙｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）または肝損傷によって引き起こされる胆汁分泌障害は、コレステロールおよびリン脂質代謝を妨げる。胆管結紮（ｂｉｌｅｄｕｃｔｌｉｇａｔｉｏｎ，ＢＤＬ）ラットモデルにおいて、肝脂質濃度は変化がないのに対し、超低密度リポタンパク質（ｖｅｒｙｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＶＬＤＬ）コレステロールおよび低密度リポタンパク質（ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＬＤＬ）コレステロールの血清レベルが著しく増加した（Ｔ．Ｋａｍｉｓａｋｏ、ｅｔａｌ．、ＨｅｐａｔｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．２５、ｎｏ．２、ｐｐ．９９－１０４、２００３）。

胆汁うっ滞性肝疾患の一つであるＰＢＣは、慢性胆汁うっ滞性疾患の様相を呈する比較的まれな疾患であるにもかかわらず、特徴的な臨床像と病態生理学のために多くの消化器科の医師から注目を集めてきた。ＰＢＣは、すべての人種に出現し、人口１００万人当たり１００～２００人程の有病率を示し、発症年齢はたいてい３０～７０歳であるが、特に中年女性に多く発症し、家族に患者がいる場合、ＰＢＣ患者が女性家族に現れる可能性が対照群に比べて１０００倍程高いことが知られている。様々な自己免疫疾患が伴うことがあり、特徴的にはほとんどの患者から抗ミトコンドリア抗体が発見される。組織学的には、進行性非化膿性胆管炎（ｎｏｎｓｕｐｐｕｒａｔｉｖｅｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）を特徴とする。

ＰＳＣは、ＰＢＣと共に原因が明確に明らかにされていない慢性胆汁うっ滞性疾患であって、肝内および肝外胆管の炎症性線維化と破壊を示し、よく炎症性腸疾患を伴う特徴を有している。ＰＢＣと同様に進行し、肝硬変および合併症を引き起こすが、効果的な内科的治療がない。

ＰＳＣの正確な原因はまだ知られていないが、自己免疫反応、肝門脈菌血症、遺伝的素因などが関与すると考えられている。患者に様々な自己抗体（ＡＮＡ、ＳＭＡ、ＡＮＣＡ）が現れ、補体と免疫複合体が血中で増加しており、炎症性腸疾患がよく伴う点などは、自己免疫性機序が原因である可能性を示唆する。ＰＳＣは、患者家族内での有病率が高く、ＨＬＡ関連性が一部で知られ、遺伝的素因が発病に関与すると考えられる。遺伝的素因を持つ人々からは炎症性腸疾患などによる肝門脈の菌血症が生じ、次いで活性化されたクッパー（Ｋｕｐｆｆｅｒ）細胞によりＴＮＦ－α分泌が増加され、肝内病変が生じる機序も提示されているが、正確な病因についてはまだ明確に明らかにされていない（ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＨｅｐａｔｏｌｏｇｙ，大韓肝学会誌１０巻３ｓ号ｐｐ．３６－５３，２００４）。

近年、幹細胞を含む組成物（韓国登録特許第１０－２１５９６３０号）ないし複数のバクテリアを含む剤形（米国公開特許第２０２１－０００８１２８号）の胆汁うっ滞性肝疾患の予防または治療効果が開示されているが乳酸菌由来のロイコノストック・シトレウム菌株またはその培養物を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患の予防または治療効果については記載されたところがない。

このような背景の下、本発明者らは、毒性および副作用のほとんどない乳酸菌を用いた胆汁うっ滞性肝疾患の予防および治療用物質を探すために研究した結果、ロイコノストック・シトレウム菌株またはその培養物が、原発性胆汁性肝硬変または原発性硬化性胆管炎に対する予防または治療効能があることを確認し、本発明を完成した。

韓国登録特許第１０－２１５９６３０号米国公開特許第２０２１－０００８１２８号

Ｔ．Ｋａｍｉｓａｋｏ、ｅｔａｌ．、ＨｅｐａｔｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．２５、ｎｏ．２、ｐｐ．９９－１０４、２００３ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＨｅｐａｔｏｌｏｇｙ，大韓肝学会誌１０巻３ｓ号ｐｐ．３６－５３，２００４

本発明の目的は、ロイコノストック・シトレウム菌株を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患の予防または治療用医薬組成物を提供することである。

また、本発明の他の目的は、ロイコノストック・シトレウム菌株を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患の予防、改善用食品組成物、または食品添加剤組成物を提供することである。

また、本発明の他の目的は、ロイコノストック・シトレウム菌株を有効成分として含む家畜の胆汁うっ滞性肝疾患の予防、改善用飼料組成物、または飼料添加剤組成物を提供することである。

前記目的を達成するために、ロイコノストック・シトレウム菌株またはその培養物を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。

また、本発明は、ロイコノストック・シトレウム菌株またはその培養物を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患の予防、改善用食品組成物、または食品添加剤組成物を提供する。

また、本発明は、ロイコノストック・シトレウム菌株またはその培養物を有効成分として含む家畜の胆汁うっ滞性肝疾患の予防、改善用飼料組成物、または飼料添加剤組成物を提供する。

本発明によるロイコノストック・シトレウム菌株またはその培養物は、数々の胆汁うっ滞性肝疾患に対して優れた予防および治療効果を示すため、ヒトまたは動物の胆汁うっ滞性肝疾患の治療、予防、または改善などの用途のための組成物として有用に用いられることができる。

ロイコノストック・シトレウムＷｉＫｉｍ０１０４菌株を胆管結紮（Ｂｉｌｅｄｕｃｔｌｉｇａｔｉｏｎ）誘導された動物モデルに処理した後、犠牲にしたマウスの肝組織を観察した写真を示す図である。ロイコノストック・シトレウムＷｉＫｉｍ０１０４菌株を胆管結紮（Ｂｉｌｅｄｕｃｔｌｉｇａｔｉｏｎ）誘導された動物モデルに処理した後、犠牲にしたマウスの肝組織をＨ＆Ｅ染色し、肝細胞壊死を観察した写真を示す図である。ロイコノストック・シトレウムＷｉＫｉｍ０１０４菌株を胆管結紮（Ｂｉｌｅｄｕｃｔｌｉｇａｔｉｏｎ）誘導された動物モデルに処理した後、犠牲にしたマウスの肝組織の細胞壊死の程度を評価したグラフを示す図である。ロイコノストック・シトレウムＷｉＫｉｍ０１０４菌株を胆管結紮（Ｂｉｌｅｄｕｃｔｌｉｇａｔｉｏｎ）誘導された動物モデルに処理した後、犠牲にしたマウスの肝組織をシリウスレッド（ｓｉｒｕｓｒｅｄ）で染色し、肝細胞線維化を観察した写真を示す図である。ロイコノストック・シトレウムＷｉＫｉｍ０１０４菌株を胆管結紮（Ｂｉｌｅｄｕｃｔｌｉｇａｔｉｏｎ）誘導された動物モデルに処理した後、犠牲にしたマウスの肝組織のシリウスレッド％陽性領域（ｓｉｒｕｓｒｅｄ％ｐｏｓｉｔｉｖｅａｒｅａ）および繊維化指数の程度を評価したグラフを示す図である。ロイコノストック・シトレウムＷｉＫｉｍ０１０４菌株を胆管結紮（Ｂｉｌｅｄｕｃｔｌｉｇａｔｉｏｎ）誘導された動物モデルに処理した後、犠牲にしたマウスの肝組織から単離されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを用いて、α－ＳＭＡおよびＣｏｌ１ａ１発現量を測定したグラフを示す図である。ロイコノストック・シトレウムＷｉＫｉｍ０１０４菌株を胆管結紮（Ｂｉｌｅｄｕｃｔｌｉｇａｔｉｏｎ）誘導された動物モデルに処理した後、犠牲にしたマウスの肝組織から単離されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを用いて、ＩＬ－６およびＩＬ－１β発現量を測定したグラフを示す図である

本発明のロイコノストック・シトレウム菌株またはその培養物を有効成分として含む組成物は、胆汁うっ滞性肝疾患の予防または治療効果を有し、医薬組成物として用いられることができる。

本発明のロイコノストック・シトレウム菌株は、乳酸菌株である。前記ロイコノストック・シトレウム菌株は、プロバイオティクスであって、乳酸菌の一般的な整腸効果および免疫増強効果を有する。ロイコノストック属の乳酸菌が整腸効果、免疫増強効果を有することは周知の事実である。

前記ロイコノストック・シトレウム菌株は、ロイコノストック・シトレウムＷｉＫｉｍ０１０４株であってもよく、配列番号１の（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）の核酸配列を有する。

前記ロイコノストック・シトレウム菌株は、ＭＲＳ液体培地に０．１～１０％接種し、２５～３７℃で４時間～４８時間の間、培養して用いることができる。

前記培養の方法は、静置培養方法が好ましいが、これに限定されるものではない。

本発明において、「プロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）」とは、「ヒトを含む動物の消化管内で宿主の腸内微生物の環境を改善し、宿主の健康に有益な影響を与える生きている微生物」という意味で理解される。プロバイオティクスは、プロバイオティック活性を有する生きている微生物であって、単一菌株または複合菌株の形でヒトや動物に乾燥した細胞の形態や発酵産物の形態で供給される場合、宿主の腸内細菌叢に有益な影響を及ぼすことができる。

前記胆汁うっ滞性肝疾患は、肺胆汁うっ滞性肝疾患、腎臓胆汁うっ滞性肝疾患、または肝胆汁うっ滞性肝疾患であってもよく、これらに限定されるものではない。

本発明による組成物に含まれるロイコノストック・シトレウム菌株は、生菌体または死菌体として存在してもよく、または乾燥若しくは凍結乾燥の形態で存在してもよい。また、ロイコノストック・シトレウム菌株の培養物が有効成分であることができ、前記培養物には生菌培養液または死菌上澄み液を含むことができる。様々な組成物内に含ませるのに適した乳酸菌の形態および製剤化の方法は当業者に広く知られている。

前記組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、および直腸内投与などで投与することができ、好ましくは、静脈内注入方法で投与することができるが、これらに限定されるものではない。

前記組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、および反応感受性などの要因に応じて多様に処方することができる。

本発明の組成物が医薬組成物として活用される場合、本発明の医薬組成物は、前記の有効成分の外に薬学的に適切で生理学的に許容される補助剤を用いて製造することができ、前記補助剤としては、賦形剤、崩壊剤、甘味料、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤または香味剤などが用いられることができる。

前記医薬組成物は、投与のために前記した有効成分に加えて、さらに薬学的に許容される担体を１種以上含んで医薬組成物として好ましく製剤化することができる。

例えば、錠剤またはカプセル剤の形態に製剤化するために、有効成分はエタノール、グリセロール、水などのような経口、非毒性の薬学的に許容される不活性担体と組み合わせることができる。また、所望するまたは必要な場合、適合する結合剤、潤滑剤、崩壊剤、および発色剤もまた混合物に含まれることができる。適合する結合剤は、これらに限定されるものではないが、澱粉、ゼラチン、グルコースまたはベータラクトースのような天然糖、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガントまたはオレイン酸ナトリウムのような天然および合成ガム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを含む。崩壊剤はこれらに限定されるものではないが、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが含まれる。液体溶液に製剤化される組成物において許容される医薬担体としては、滅菌および生体に適したものとして、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分のうち１成分以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、および潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。

さらに、当該分野における好適な方法として、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、ＥａｓｔｏｎＰＡに開示されている方法を用いて、各疾患に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。

本発明のロイコノストック・シトレウム菌株またはその培養物を有効成分として含む組成物は、胆汁うっ滞性肝疾患の予防、改善用食品組成物、または食品添加剤組成物として用いられることができる。

前記食品組成物は、健康機能食品の形態であってもよい。

前記「健康機能食品」は、健康機能食品に関する法律に従って人体に有用な機能性を有する原料や成分を用いて製造および加工した食品を意味（第３条第１号）し、「機能性」とは、人体の構造および機能に対して栄養素を調節したり、生理学的作用などのような保健用途に有用な効果が得られること（同条第２号）を意味する。

前記食品組成物は、食品添加物をさらに含むことができ、「食品添加物」としての適否は、他の規定がない限り、食品医薬品安全処にて承認された食品添加物公定書の総則および一般試験法などに従って当該品目に関する規格および基準により判定する。

前記「食品添加物公定書」に収載された品目としては、例えば、ケトン類、グリシン、クエン酸カリウム、ニコチン酸、けい皮酸などの化学的合成品、カキ色素、甘草抽出物、結晶セルロース、グアーガムなどの天然添加物、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム製剤、麺類添加アルカリ剤、保存料製剤、タール色素製剤などの混合製剤類が挙げられる。

本発明の有効成分が含まれた食品としては、パン、餅類、堅果類、キャンディー類、チョコレート類、チューインガム、ジャム類のような菓子類、アイスクリーム類、氷果類、アイスクリーム粉末類のようなアイスクリーム製品類、牛乳類、低脂肪牛乳類、乳糖分解ミルク、加工乳類、ヤギ乳、発酵乳類、バターミルク類、濃縮乳類、乳クリーム類、バター類、天然チーズ、加工チーズ、粉乳類、乳清類のような乳加工品類、食肉加工品、鶏卵加工品、ハンバーガーのような食肉製品類、練り物、ハム、ソーセージ、ベーコンなどの魚肉加工品のような魚肉製品類、ラーメン類、乾麺類、生麺類、揚げ麺類、糊化乾麺類、改良半生麺類、冷凍麺類、パスタ類のような麺類、果実飲料、野菜類飲料、炭酸飲料、豆乳類、ヨーグルトなどの乳酸菌飲料、混合飲料のような飲料、醤油、味噌、コチュジャン、春醤、清麹醤(チョングッチャン)、混合醤油、酢、ソース類、トマトケチャップ、カレー、ドレッシングのような調味食品、マーガリン、ショートニングおよびピザが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

前記したものの他、本発明の組成物は、種々の栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含むことができる。その他に本発明の組成物は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、および野菜飲料を製造するための果肉を含むことができる。これらの成分は、独立してまたは組み合わせて用いられることができる。

本発明の有効成分を含む飲料組成物は、他の成分には特別な制限はなく、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。前記した天然炭水化物の例は、単糖類（例えば、ブドウ糖、果糖など）；二糖類（例えば、マルトース、スクロースなど）および多糖類（例えば、デキストリン、シクロデキストリンなど）のような通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。前記したもの以外の香味剤として天然香味剤（ソーマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ）、グリチルリチンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に用いることができる。

また、本発明のロイコノストック・シトレウム菌株またはその培養物を有効成分として含む組成物は、家畜の胆汁うっ滞性肝疾患の予防、改善用飼料組成物、または飼料添加剤組成物として用いられることができる。

前記組成物が飼料添加剤として製造される場合、前記組成物は２０～９０％の高濃縮液、粉末、または顆粒の形態で製造することができる。前記の飼料添加剤は、クエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸、リンゴ酸などの有機酸や、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酸性ピロリン酸、ポリリン酸塩（重合リン酸塩）などのリン酸塩や、ポリフェノール、カテキン、アルファ－トコフェロール、ローズマリー抽出物、ビタミンＣ、緑茶抽出物、甘草抽出物、キトサン、タンニン酸、フィチン酸などの天然抗酸化剤のいずれかまたは一つ以上をさらに含むことができる。飼料として製造される場合、前記組成物は、通常の飼料の形態で製剤化されることができ、通常の飼料成分を共に含むことができる。

前記飼料および飼料添加剤は、穀物、例えば、粉砕または粉砕された小麦、オーツ麦、大麦、トウモロコシ、および米；植物性タンパク質飼料、例えば、菜の花、大豆、およびヒマワリを主成分とする飼料；動物性タンパク質飼料、例えば、血粉、肉骨粉、骨粉、および魚粉；糖粉および乳製品、例えば、各種粉乳および乳清粉末からなる乾燥成分などをさらに含むことができ、それ以外にも栄養補助剤、消化および吸収向上剤、成長促進剤などをさらに含むことができる。

前記飼料添加剤は、動物に単独で投与したり、食用担体中において他の飼料添加剤と組み合わせて投与することもできる。また、前記飼料添加剤は、トップドレッシングとして、またはこれらを動物飼料に直接混合するか、または飼料とは別途の経口製剤として、容易に動物に投与することができる。前記飼料添加剤を動物飼料とは別途に投与する場合、当技術分野において周知のごとく、薬学的に許容される食用担体と組み合わせて、即放性または徐放性製剤で製造することができる。これらの食用担体は、固体または液体、例えば、トウモロコシのデンプン、ラクトース、スクロース、大豆フレーク、ピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油およびプロピレングリコールであってもよい。固体担体が使用される場合、飼料添加剤は、錠剤、カプセル剤、散剤、トローチ剤または含糖錠剤または微分散性形態のトップドレッシングであってもよい。液体担体が用いられる場合、飼料添加剤はゼラチン軟質カプセル剤、シロップ剤、懸濁液、エマルジョン剤、または溶液剤の剤形であってもよい。

また、前記飼料および飼料添加剤は、補助剤、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶液促進剤などを含有することができる。前記飼料添加剤は、浸漬、噴霧または混合して動物の飼料に添加することによって用いられることができる。

本発明の飼料または飼料添加剤は、哺乳類、家禽および魚類を含む多数の動物の食餌に適用することができる。

前記哺乳類として、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、齧歯類、および、マウス、ハムスター、モルモットなどの実験用齧歯類だけでなく、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ）などに用いることができ、前記家禽類として、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、キジ、およびウズラなどにも用いることができ、前記魚類として、コイ、フナ、マスなどに用いることができるが、これらに限定されるものではない。

以下、実施例を通して本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、唯一本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に基づいて、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明なことであろう。

実施例１．菌株の培養
ロイコノストック・シトレウムＷｉＫｉｍ０１０４（寄託番号ＫＣＣＭ１２４２０Ｐ）菌株は、寄託者である韓国食品研究院の許可を受け、分譲を受けて実験を行った。

上記分譲を受けたロイコノストック・シトレウムＷｉＫｉｍ０１０４菌株をＭＲＳ液体培地３０ｍｌに１％接種し、３０℃で１８時間静置培養した。培養後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、培養液を別々に保存し、菌体はＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水：ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）溶液に３回洗浄し、残りの培地成分を除去した。

実施例２．動物モデルにおける胆汁蓄積抑制効果の確認

２－１．実験動物マウスの条件
実験に使用された実験動物は、雄８週齢のＣ５７ＢＬ６マウスの供給を受け、室温２０±２℃、湿度５５±１５％が維持されるＳＰＦ環境の動物飼育室で１週間の安定化期間を経て、実験期間の間飼育した。飼料は、抗生物質が添加されていない一般的なぺレット飼料を供給し、水は随時摂取できるようにし、1週間、食事に適応させた後、実験を行った。

２－２．胆管結紮（Ｂｉｌｅｄｕｃｔｌｉｇａｔｉｏｎ）誘導された動物モデルの作製
原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）などの胆汁うっ滞性肝疾患は、肝細胞に細胞毒性胆汁が蓄積することが重要な原因である。胆汁うっ滞性疾患に対するロイコノストック・シトレウム菌株の効能を確認するために、胆管結紮（Ｂｉｌｅｄｕｃｔｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った。

上記実施例２－１にて用意したマウスの胆管を非吸収性手術用縫合糸で二回縫った。対照群では胆管を縫わずに同じ方法で手術を行った。術後、マウスを薬物投与開始当日の体重、黄疸、および尿の色の変化等を基準に、Ｚ配列法に従って群分けを行った。グループ化した後、実験群ではロイコノストック・シトレウムＷｉＫｉｍ０１０４菌株組成物を２×１０^９ＣＦＵ／日で１日１回、２週間０．２ｍＬ／ｈｅａｄｖｏｌｕｍｅで経口投与した。対照群は同量のＰＢＳを食餌した。全ての動物に対し、１日１回一般的な症状を観察し、１日２回、瀕死動物および死亡動物の有無を確認し、観察は術後から投与終了時まで行った。２週間の投与を終了し、マウスを犠牲にした。

２－２．肝臓組織の病理学的分析
上記２－２にて用意した犠牲マウスの剖検を行い、組織分析を行った。腹部臓器について目視検査を行い、内部臓器の異常有無を確認し、肝組織と腸組織を摘出した。摘出された肝組織は生理食塩水で洗浄し、濾紙で水分を除去した後、肝臓の形状は写真を撮って比較した結果を図１に示した。

図１に示すように、胆管結紮（Ｂｉｌｅｄｕｃｔｌｉｇａｔｉｏｎ）誘導対照群において、手術対照群と比較して肝臓の色が黄色く変化し、ロイコノストック・シトレウムの投与により正常マウスである手術対照群と同様の肝臓の形状と色に変化したことが確認された。

また、組織病理学的検査のために肝臓組織を１０％中性ホルマリンに固定し、固定された組織は、切出し、脱水、およびパラフィン包埋などの一般的な組織処理過程を経て、パラフィンブロックで作製して薄切した。薄切した組織切片にヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ）（Ｈ＆Ｅ）染色を行い、肝細胞の壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）胆管細胞の増殖、門脈の浮腫の有無を組織学的に分析し、その結果を図２および図３に示した。

図２および図３に示すように、Ｈ＆Ｅ染色の結果、ＢＤＬモデル対照群において肝細胞壊死部分（矢印）が観察され、胆管周辺に胆管細胞の増殖が観察された。ロイコノストック・シトレウム菌株の処理群では、肝細胞壊死が著しく減少したことが目視で確認でき、組織病理スコアの結果、肝細胞壊死スコアが著しく減少する結果が示された。

２－４．胆汁うっ滞による肝線維化の評価
上記２－２にて用意した犠牲にしたマウスから得た肝細胞を用いて、肝線維化の分析を行った。胆汁うっ滞性肝疾患における主な病理症状の一つとして肝細胞の壊死と共に肝線維化が知られているところ、胆汁うっ滞による肝線維化を評価するために、シリウスレッド（ｓｉｒｕｓｒｅｄ）染色により確認した結果および組織病理の評価を通じて線維化指数を示したグラフを図４および図５に示した。

図４に示すように、ＢＤＬによって増加したシリウスレッド％陽性領域（ｓｉｒｕｓｒｅｄ％ｐｏｓｉｔｉｖｅａｒｅａ）がロイコノストック・シトレウム菌株を処理した群において著しく減少したことが確認され、図５に示すように、ＢＤＬによって増加した線維化スコアが対照群と比較して、ロイコノストック・シトレウム菌株を処理した群において著しく減少したことが確認された。

２－５．肝線維化および炎症に関連するサイトカイン発現量の分析
上記２－２にて用意した犠牲マウスから得た肝組織からＲＮＡを単離し、線維化および炎症に関連する遺伝子マーカーであるα－ＳＭＡ（アルファ－平滑筋アクチン：ａｌｐｈａ－ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ）およびＣｏｌ１ａ１（１型コラーゲン１α：ｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅ１ａ）の変化をｑ－ＲＴ -PCR法により確認した。各群のマウス肝組織にトリゾール１ｍｌを添加し、ホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で組織を粉砕した後、クロロホルム（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）、イソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を用いてＲＮＡを分離した後、ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを用いて線維化および炎症性サイトカインの変化を観察した結果を図６および図７に示した。

図６に示すように、ＢＤＬ対照群と比較してロイコノストック・シトレウム菌株を処理した群においてα－ＳＭＡおよびＣｏｌ１ａ１の発現が著しく減少したことが確認された。

図７に示すように、ＢＤＬ対照群と比較してロイコノストック・シトレウム菌株を処理した群において、ＩＬ－６およびＩＬ－１βの発現が著しく減少したことが確認された。

以上の結果により、本発明による組成物を処理した場合に胆汁蓄積による肝細胞の損傷、線維化および炎症等に優れた効果を示すことにより、胆汁うっ滞性肝疾患の予防および治療用組成物として用いられ得ることが確認された。

［受託番号］
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１２４２０Ｐ
受託日：２０１８１２１４

Claims

ロイコノストック・シトレウム菌株またはその培養物を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患の予防または治療用医薬組成物。
前記ロイコノストック・シトレウム菌株は、配列番号１の核酸配列を有する、ロイコノストック・シトレウムＷｉＫｉｍ０１０４（ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｃｉｔｒｅｕｍＷｉＫｉｍ０１０４；受託番号ＫＣＣＭ１２４２０Ｐ）菌株である、請求項１に記載の胆汁うっ滞性肝疾患の予防または治療用医薬組成物。
前記胆汁うっ滞性肝疾患は、原発性胆汁性肝硬変（Ｐｒｉｍａｒｙｂｉｌｉａｒｙｃｉｒｒｈｏｓｉｓ；ＰＢＣ）または原発性硬化性胆管炎（Ｐｒｉｍａｒｙｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ；ＰＳＣ）である、請求項１に記載の胆汁うっ滞性肝疾患の予防または治療用医薬組成物。
前記組成物は、経口投与または非経口投与の方法で投与可能であることを特徴とする、請求項１に記載の胆汁うっ滞性肝疾患の予防または治療用医薬組成物。
前記非経口投与の方法は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与または直腸内投与である、請求項４に記載の胆汁うっ滞性肝疾患の予防または治療用医薬組成物。
ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｃｉｔｒｅｕｍ）菌株またはその培養物を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患の予防または改善用食品組成物。
前記食品は、健康機能食品である、請求項６に記載の胆汁うっ滞性肝疾患の予防または改善用食品組成物。
前記食品は、パン、餅、キャンディー、チョコレート、ガム、アイスクリーム、ミルク、チーズ、食肉加工品、魚肉加工品、キムチ、醤油、味噌、コチュジャン、春醤、清麹醤(チョングッチャン)、酢、トマトケチャップ、カレー、ドレッシング、飲料および発酵乳からなる群から選択されるいずれかの食品であることを特徴とする、請求項６に記載の胆汁うっ滞性肝疾患の予防または改善用食品組成物。
ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｃｉｔｒｅｕｍ）菌株またはその培養物を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患の予防または改善用食品添加剤組成物。
ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｃｉｔｒｅｕｍ）菌株またはその培養物を有効成分として含む家畜の胆汁うっ滞性肝疾患の予防または改善用飼料組成物。
前記家畜は、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、マウス、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、キジ、ウズラ、コイ、フナ、およびマスからなる群から選択されるいずれかである、請求項１０に記載の家畜の胆汁うっ滞性肝疾患の予防または改善用飼料組成物。
ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｃｉｔｒｅｕｍ）菌株またはその培養物を有効成分として含む家畜の胆汁うっ滞性肝疾患の予防または改善用飼料添加剤組成物。