JP2024166935A - 非線形光学顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 一次光との相互作用が担保され、試料のラマン散乱光に係る情報を高感度に取得することが可能な非線形光学顕微鏡を提供する。
【解決手段】 非線形光学顕微鏡であって、ポンプ光とプローブ光を少なくとも含む一次光を出射する光源と、載置部に載置された試料の後方に配置され一次光を集光し試料に対し入射させる第１の対物レンズと、焦点の少なくとも一部を第１の対物レンズと共有し試料の前方に配置される第２の対物レンズと、第２の対物レンズより前方に配置される反射部と、試料から後方に出射される光に含まれるポンプ光成分とプローブ光成分のうちいずれか一方を光学的に選択する第１のフィルタと、第１のフィルタにより選択された成分または選択されなかった成分のいずれかを検出する後方光検出器と、を有する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、非線形光学効果を利用して試料の情報を光学的に取得するための非線形光学顕微鏡に関する。

非線形光学過程を利用した非線形光学顕微鏡は、照射光の光強度に対する試料の非線形性応答を含む非線形光散乱を検出することで、試料に含まれる分子振動などの分子情報に基づいたイメージングを行うことができる。このとき散乱光に含まれる情報は集光した１点で発生したものと見なされるため、集光したスポットを試料内で２次元または３次元に走査することで、試料の２次元または３次元の分子情報を含む画像が得られる。このような非線形光学過程として、多光子吸収蛍光、第二次高調波発生、コヒーレントアンチストークスラマン散乱や誘導ラマン散乱などが知られている。

非特許文献１では、ポンプ光と高速変調されたストークス光を試料に照射することで、ストークス光の変調に従って誘導ラマン散乱効果によりポンプ光が微小に変動する。ここでストークス光の変調周波数に基づいてポンプ光を位相検出することで、ポンプ光の変動成分のみを高感度に検出している。

また特許文献１では、コヒーレントアンチストークスラマン（ＣＡＲＳ）散乱において、表裏非対称な試料の照射光透過側に反射フィルタと検出器、照射光反射側に検出器を設けている。反射フィルタは試料から生じたＣＡＲＳ光を通過し、ポンプ光とストークス光を反射させることで、試料から生じる双方向のＣＡＲＳ光を取得することができる。最後にこれら双方向のＣＡＲＳ光を取得した出力値の差分に基づき試料のＣＡＲＳ背景光を除去することで信号対雑音比（ＳＮＲ、ＳＮ比）を向上させている。

特表２０１３－５１７４９０号公報

Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９； ３２２（５９０９）： １８５７－１８６１

従前の非線形光学顕微鏡では、試料と一次光とのラマン散乱の相互作用が低いため非線形散乱光の信号レベルおよびラマン散乱光像の信号耐雑音比が不足する場合があり優位な信号や、像の視認性が低いため有意な画像所見が得にくい場合があった。

非特許文献１および特許文献１では、非線形光学過程によって生じる散乱光からバイアス成分を除去することで低レベルの信号を取得しているが、検出する非線形散乱光（ラマン散乱光）の強度自体を増やす構成ではなかった。

本発明は、入射光と試料との相互作用を担保し、試料における誘導ラマン散乱光に係る情報を高感度に取得することが可能な非線形光学顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の実施形態に係る非線形光学顕微鏡は、ポンプ光とプローブ光を少なくとも含む一次光を出射する光源と、載置部に載置された試料の後方に配置され前記一次光を集光し前記試料に対し入射させる第１の対物レンズと、焦点の少なくとも一部を前記第１の対物レンズと共有し前記試料の前方に配置される第２の対物レンズと、
前記第２の対物レンズより前方に配置される反射部と、
前記試料から後方に出射される光に含まれるポンプ光成分とプローブ光成分のうちいずれか一方を光学的に選択する第１のフィルタと、前記第１のフィルタにより選択された成分または選択されなかった成分のいずれかを検出する後方光検出器と、を有する非線形光学顕微鏡と、を有する。

また、本発明の実施形態に係る非線形光学顕微鏡は、ポンプ光とプローブ光を少なくとも含む一次光を出射する光源と、載置部に載置された試料の後方に配置され前記一次光を集光し前記試料に対し入射させる第１の対物レンズと、焦点の少なくとも一部を前記第１の対物レンズと共有し前記試料の前方に配置される第２の対物レンズと、
前記第２の対物レンズより前方に配置され、前記試料からの二次光のうち前方に出射される成分の入射を前記第２の対物レンズを介して受け反射し三次光として前記第２の対物レンズを介して前記試料に入射させる反射部と、
前記試料から後方に出射される光のうち、前記一次光と前記三次光のそれぞれにより前記試料から発生した第１のラマン散乱光成分と第２のラマン散乱光成分とを光学的に選択する第１のフィルタと、前記第１のフィルタにより選択された成分または選択されなかった成分のいずれかを検出する後方光検出器と、を有する。

本発明によれば、入射光と試料との相互作用を担保し、試料における誘導ラマン散乱光に係る情報を高感度に取得することが可能な非線形光学顕微鏡を提供することが可能となる。

第１の実施形態に係る非線形光学顕微鏡の概略構成を示す図である。 第２の実施形態に係る非線形光学顕微鏡の概略構成を示す図である。 第２の実施形態に係る非線形光学顕微鏡における励起光および光検出のタイミングを示すタイミングチャートである。 第３の実施形態に係る非線形光学顕微鏡の概略構成を示す図である。 第３の実施形態に係るレーザ走査光学系を示す概略構成図である。 第４の実施形態に係る非線形光学顕微鏡の概略構成を示す図である。

＜第１の実施形態＞
図１を用いて、第１の実施形態に係る非線形光学顕微鏡１０００について説明する。

本実施形態では、試料に生ずる非線形光学過程のうち誘導ラマン散乱を検出する非線形光学顕微鏡について説明する。ただし、本発明は誘導ラマン散乱以外の非線形光学散乱に適用することもできる。図１は本発明による非線形光学顕微鏡の好適な形態の１例を示す図である。

なお、本願明細書において、前方、後方を用いる場合があり、前方、後方は、試料１０８と、着目しているポンプ光の進行方向と、を基準として用いる。第２の対物レンズの１１０は試料１０８の前方に配置される。かかる第２の対物レンズ１１０の配置に関する「前方」は、ポンプ光１１１１、プローブ光１１２１を含む一次光１１００と、試料１０８と、を基準として規定され、一次光１１００の進行方向に沿って、試料１０８から遠ざかる側を意味する。同様にして、かかる第１の対物レンズ１０７の配置に関する「後方」は、一次光１１００の進行方向と逆方向に沿って、試料１０８から遠ざかる側を意味する。

（一次光光源）
一次光光源１００は、ポンプ光１１１１を出射するポンプ光光源１０１とプローブ光１１２１を出射するプローブ光光源１０２と、ポンプ光１１１１とプローブ光１１２１とを合波するダイクロイックミラー１０５と、を有する。

なお、ポンプ光１１１１は励起光１１１１と換言する場合がある。ダイクロイックミラー１０５は、合波部１０５と換言する場合がある。

（ポンプ光光源） 次に、ポンプ光１１１１を出射するポンプ光光源１０１について説明する。ポンプ光光源１０１から出射されたポンプ光１１１１は、ダイクロイックミラー１０５へ入射する。ここで、ポンプ光１１１１は、パルス光が採用される。パルス光であるポンプ光１１１１は、試料１０８における非線形光学効果の発生効率の観点から、フェムト秒からピコ秒程度のオーダのパルス幅を有する短パルス光が採用される。また、ポンプ光１１１１のパルスの繰り返し周波数は、ポンプ光１１１１の強度揺れの影響を緩和する観点から１ＭＨｚ以上が採用されるが、この限りではない。ポンプ光１１１１の波長、パルス幅、繰り返し周波数を満たすものとして近赤外帯で発振するチタンサファイアレーザが採用される場合がる。チタンサファイアレーザをポンプ光光源１０１に用いる場合、ポンプ光１１１１の波長は、７００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲に設定される。

（プローブ光光源）
次に、プローブ光１１２１を出射するプローブ光光源１０２について説明する。ポンプ光１１１１と同様の理由で、プローブ光１１２１は、フェムト秒からピコ秒オーダのパルス幅を有する短パルス光が採用される。プローブ光１１２１の波長は、ポンプ光１１１１の波長とは異なったものが採用される。プローブ光１１２１の波長は、検出する分子情報のラマンシフト（波数）に換算される波長程度、ポンプ光１１１１と異なる波長が採用される場合がある。ポンプ光光源１０１がチタンサファイアレーザの場合、プローブ光１０２２の波長は１０００ｎｍ以上１１００ｎｍ以下の範囲を掃引できる光源採用される場合がある。

プローブ光光源１０２は、ＹｂファイバーレーザやＥｒファイバーレーザなどの光ファイバーレーザが採用される場合がある。またプローブ光１１２１のパルス繰り返し周波数は、ポンプ光１１１１のパルス繰り返し周波数の１／２とされる。ポンプ光１１１１の繰り返し周波数をプローブ光１１２１の２倍にすることで、試料１０８の非線形光学効果により得られるラマン散乱光の生成周波数を含む変調信号を、プローブ光１０２２と同じパルス繰り返し周波数で検出することができる。一方、ポンプ光１１１１とプローブ光１１２１のパルス繰り返し周波数を一致させて、ポンプ光１１１１またはプローブ光１１２１に対して強度変調を与えた形態が、第１の実施形態の変形形態として含まれる。

（一次光の光路）
プローブ光１１２１は、光学遅延系１０３および導光ミラー１０４を介し、ダイクロイックミラー１０５で反射し、ポンプ光１１１１と同軸で合波される。ダイクロイックミラー１０５で合波する際に、ポンプ光１１１１とプローブ光１１２１のパルスが時間的に一致するように光学遅延系１０３を用いてプローブ光１１２１の光路長さが調整される。ここでポンプ光１１１１およびプローブ光１１２１は偏光ビームスプリッタである半透過鏡１０６を透過する直線偏光方位を有しているため、低い光損失をもって透過鏡１０６を透過する。ポンプ光１１１１およびプローブ光１１２１は、半透鏡１０６により一部透過し、第１の対物レンズ１０７により試料１０８内に集光される。一次光光源１００から試料１０８までの光路が、一次光（１１１１、１１２１）の光路区間に該当する。

（二次光に含まれる前方散乱光と後方散乱光）
試料１０８から前方に出射する二次前方散乱光１２００ｆｓは、二次前方散乱ポンプ光成分１２１１ｆｓおよび二次前方散乱プローブ光成分１２２１ｆｓを含む。二次前方散乱光１２００ｆｓは、第２の対物レンズ１１０により平行光化され、さらに試料１０８の前方に位置する反射部１１１に入射する。本願明細書において、半透鏡１０６は、ハーフミラー１０６と換言される場合があるが、半（ハーフ）は、透過率Ｔと反射率Ｒの比が、０．５／０．５＝１である形態に限定されない。また、本願明細書において、平行光化は、試料１０８が含む分子の分子振動に対応するラマンシフトとポンプ光１１１１とプローブ光１１２１の波数差とが一致していると、誘導ラマン散乱効果が発生する。誘導ラマン散乱効果により、試料１０８からの二次信号（散乱信号）に含まれるポンプ光成分の強度が僅かに減少し、プローブ光成分の強度が僅かに増大する。試料１０８からの二次光に含まれる二次光前方散乱成分１２００ｆｓは、図１のように、前方散乱ポンプ光１２１１ｆｓと前方散乱プローブ光１２２１ｆｓを含む。同様にして、試料１０８からの二次光に含まれる二次光後方散乱成分は、図１のように、後方散乱ポンプ光１２１１ｂｓと後方散乱プローブ光１２２１ｂｓと、を含む。従来の誘導ラマン散乱顕微鏡の構成では、試料１０８からの二次光のうち前方散乱か後方散乱のいずれかの成分を検出の対象としなかったのに対して、本実施形態の構成では、前方と後方の両散乱成分を検出対象としている点で採光効率が高い。

（走査方法）
本実施形態の非線形光学顕微鏡２０００は、試料１０８は、載置部１１８を介して試料走査部１０９に保持されている。かかる構成を採用することで、試料１０８は、試料走査部１０９により一次光１１００の光軸に対して交差する方向に二次元に移動するように構成されている。本実施形態の試料１０８は、一次光１１００の光軸に対して垂直な面を走査面として二次元に移動する。試料走査部１０９は、第１の対物レンズ１０７と第２の対物レンズ１１０で共有される焦点を試料１０８に対して走査する走査手段であると換言される。試料走査部１０９は、一次光１１００の光軸方向と交差する方向に載置部１１８を移動させる走査手段であると換言される。

（二次光のうちの前方散乱成分）
第２の対物レンズ１１０により略平行光となった前方散乱ポンプ光１２１１ｆｓおよび前方散乱プローブ光１１２１ｆｓは、正反射するように第２の対物レンズ１１０の前方に設けられた反射部１１１により進行方向が反転される。試料１０８の第１の対物レンズ１０７の焦点と重なる領域から射出された光は、第２の対物レンズ１１０により略平行光に変換され後述する反射部１１０に向かって進行する。ここで、第１の対物レンズ１０７と第２の対物レンズ１１０は、互いの焦点の少なくとも一部を共有するように、試料１０８を挟んで対向配置されている。前方散乱ポンプ光１２１１ｆｓ、前方散乱プローブ光１１２１ｆｓは、それぞれ、二次光前方散乱成分１２００ｆｓのポンプ光成分１２１１ｆｓ、プローブ光成分１２２１ｆｓと換言される場合がある。

（三次光）
図１のように、反射部１１１で進行方向が反転した二次光前方散乱成分１２００ｆｓは、第２の対物レンズ１１０を介して試料１０８への再入射する機会があることから、三次光１３００として示している。三次光１３００は、三次光のポンプ光成分１３１１、三次光のプローブ光成分１３２１と、を含む。

（四次光に含まれる前方散乱成分）
三次光のポンプ光成分１３１１および三次光のプローブ光成分１３２１は、第２の対物レンズ１１０を介して試料１０８と重なる焦点に集光され、試料１０８と相互作用して散乱し四次光として試料１０８から出射する。

試料１０８から出射した四次光のうち、第１の対物レンズ１０７の側に向かって進行する前方散乱成分１４００ｆｓは、ポンプ光成分に該当する１４１１ｆｓとプローブ光成分に該当する１４２１ｆｓとを含む。ポンプ光成分に該当する１４１１ｆｓとプローブ光成分に該当する１４２１ｆｓは、第１の対物レンズ１０７を介して同軸に略平行化され、半透過鏡１０６で反射され、主光軸である一次光１１００の光軸から第１のフィルタ１１２に向かうように分岐される。

分岐された四次光の前方散乱成分１４００ｆｓ（１４１１ｆｓ、１４２１ｆｓ）は、第１のフィルタ１１２により光学的に分離される。本実施形態では、四次光の前方散乱成分１４００ｆｓのうちポンプ光成分１４１１ｆｓが受光レンズ１１３を介して前方光検出器６０４で検出される。

前方光検出器６０４は、第１のフィルタ１１２により選択された光として、二次光の後方散乱光１２００ｂｓに含まれるポンプ光成分１２１１ｂｓと、四次光の前方散乱光１４００ｆｓに含まれるポンプ光成分１４１１ｆｓと、を検出する。第１のフィルタ１１２は、ポンプ光成分を透過しプローブ光成分を減衰する分光投下特性を有すると換言される。前方光検出器６０４が検出するポンプ光成分１２１１ｂｓとポンプ光成分１４１１ｆｓは、いずれも、一次光１１００と三次光１３００に起因して試料１０８で生じた誘導ラマン散乱効果を反映した信号である。

本実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡２０００は、第２の対物レンズ１１０の前方に設けた反射部１１１により、前方光検出器６０４が検出する信号が、三次光１３００に起因するポンプ光成分１４１１ｆｓの分だけ少なくとも増感される。

試料１０８の第１の対物レンズ１０７の焦点と重なる領域から射出された光は、第１の対物レンズ１０７により略平行光に変換される。わずかに強度が減少した三次光のポンプ光成分１３１１、および、わずかに強度が増大した三次光のプローブ光成分１３２１は、第２の対物レンズ１１０により試料１０８に集光され誘導ラマン散乱効果を生じさせる。かかる三次光１３００による誘導ラマン散乱効果により、誘導ラマン散乱効果がないときに比べて四次光１４００のポンプ光成分１４１１は三次光のポンプ光成分１３１１に比べて加算的に強度が減少する。同様にして、かかる三次光１３００による誘導ラマン散乱効果により、誘導ラマン散乱効果がないときに比べて四次光１４００のプローブ光成分１４２１の強度は三次光のプローブ光成分１３２１に対して増大する。

前方光検出器６０４は、検出した光を制御部１１５が読み取り制御処理が可能な出力信号に変換する。第１のフィルタ１１２は三次光のポンプ光成分１３１１を選択的に透過させているが、三次光のプローブ光成分１３２１を選択的に透過するものであってもよい。

（制御部と画像化）
制御部１１５は、前方光検出器６０４の出力信号と試料走査部１０９からの走査信号を受信し、かかる出力信号と走査信号とに基づいた画像化信号を生成し、生成した画像化信号を画像処理部１１６に出力する。画像処理部１１６は、受信した画像化信号を画像処理し画像化する。画像処理部１１６は、コンピュータ、ワークステーション等の計算機が採用される。画像処理部１１６は、コンピュータ１１６と換言される場合がある。制御部１１５は、光源１００が一次光１１００を出射する時刻と、後方光検出器１１４がパルス光を検出する時刻と、に基づいて、試料１０８から射出されたラマン散乱光を経時的に分離する分離手段を構成する要素であると換言される。

また、後方光検出器の出力信号をより増感するために、不図示のロックインアンプを用いて、プローブ光１１２１のパルス繰り返し周波数信号を参照入力としたロックイン検出などを行う形態が採用される場合がある。以上、本実施形態に係る非線形光学顕微鏡１０００は、一次光１１００ならびに三次光１３００を含む入射光と試料１０８との相互作用を担保し、試料１０８における誘導ラマン散乱光に係る情報を高感度に取得することが可能となる。

本実施形態は、二次光１２００の前方散乱成分１２００ｆｓのポンプ光成分１２１１ｆｓおよびプローブ光成分１２２１ｆｓを反射部１１１で反射させ、三次光１３００を試料１０８に再帰させる形態を採用しているがこれに限らない。例えば、反射部１１１の代わりに不図示の光ファイバーを採用する形態が第１の実施形態の変形形態となる。かかる光ファイバーを用いて、二次光１２００の前方散乱成分１２００ｆｓのポンプ光成分１２１１ｆｓおよびプローブ光成分１２２１ｆｓを反転させることもできる。

＜第２の実施形態＞
図２、図３を用いて、第２の実施形態に係る非線形光学顕微鏡２０００について説明する。

非線形光学顕微鏡２０００は、多重反射により、試料１０８へのプローブ光の入射回数を高めるための後方部分透過鏡２０１と、散乱時相取得部２０２と、を有する点において、少なくとも、非線形光学顕微鏡１０００と相違する。

（後方部分透過鏡）
後方部分透過鏡２０１は、第１の対物レンズ１０７と半透鏡１０６との間に配置される光学要素である。後方部分透過鏡２０１は、一次光１１００の光束の一部と後方散乱光１２００ｂｓの光束の一部とを透過する後方透過部（不図示）と、後方散乱光１２００ｂｓの光束の残部の少なくとも一部を反射する後方反射部（不図示）と、を含む光学要素である。

非線形光学顕微鏡２０００は、試料１０８に対して２回を超えて励起光およびプローブ光を含む集束光を入射させる形態であると換言される。後方部分透過鏡２０１は、ポンプ光１１１１およびプローブ光１１２１を含む一次光１１００の光束の一部を透過し、同光束の一部を反射する部分透過鏡である。後方部分透過鏡２０１は、半透鏡１０６と第１の対物レンズ１０７の間に配置され、ポンプ光成分１４１１ｆｓおよびプローブ光成分１４２１ｆｓを含む四次光の前方散乱成分１４００ｆｓの光束を、第１の対物レンズ１０７へ向けて反射する。後方部分透過鏡２０１により光束の一部が反射された四次光の前方散乱成分１４００ｆｓは、一次光１１００の光束の後方部分透過鏡２０１により透過成分と同様にして、試料１０８からの誘導ラマン散乱光を発生させる。後方部分透過鏡２０１により光束の一部が反射された四次光の前方散乱成分１４００ｆｓは、五次光による六次光後方散乱成分、七次光による八次光の前方散乱成分を誘導ラマン散乱に寄与する成分として前方光検出器６０４が受光する成分に加算する。一方、部分透過鏡２０１を採用する本実施形態の非線形光学顕微鏡２０００は、光束の一部に対する反射による増感効果と光束の一部に対する透過によるトリミング効果が生じる点で、第１の実施形態の非線形光学顕微鏡１０００と相違する。

本実施形態の非線形光学顕微鏡２０００において、後方部分透過鏡２０１により、半透過鏡１０６と反射部１１１の間の区間を往復する光線は複数存在する。試料１０８の画像化に用いる一次光１１００のポンプ光成分１１１１を元とする三次光としての励起光を三次光１３００のポンプ光成分１３１１として図２に示した。また、一次光１１００のプローブ光成分１１２１を元とするプローブ光を三次光１３００のプローブ光成分１３２１として図２に示した。

反射部１１１から第２の対物レンズ１１０へ進行する三次光１３００のポンプ光成分１３１１およびプローブ光成分１３２１は、第２の対物レンズ１１０、試料１０８、第１の対物レンズ１０７を通過する。次に、ポンプ光成分１３１１およびプローブ光成分１３２１を含む三次光１３００は、第１の実施形態と同様にして、四次光の前方散乱成分１４００ｆｓとして後方部分透過鏡２０１に向かう。後方部分透過鏡２０１にて四次光の前方散乱成分１４００ｆｓの光束は、その一部が透過し、半透鏡１０６、第１のフィルタ１１２、受光レンズ１１３、を順に介して前方光検出器６０４が検出する。

（散乱時相取得部）
次に、散乱時相取得部２０２について、図２、図３を用いて説明する。

前方光検出器６０４は、三次光１３００のポンプ光成分１３１１とともに、反射部１１１と後方部分透過鏡２０１を往復するポンプ光成分が受光され光検出される。このため、三次光１３００のポンプ光成分１３１１のみに由来する信号を、前方光検出器６０４の出力信号から分離する必要がある。

散乱時相取得部２０２は、ポンプ光光源１０１からの出力信号を時相基準として前方光検出器６０４が検出した検出信号から、第Ｎ次のポンプ光入射による散乱光かの情報を取得する。散乱時相取得部２０２は、前方光検出器６０４の出力信号と後方光検出器１１４の出力信号とを比較すること可能なように構成されていると換言される。ここで、Ｎは整数が採用される。制御部１１５は、散乱時相取得部２０２からの情報に基づき、第Ｎ次の散乱光であることを特定する。画像処理部１１６は、制御部１１５からの信号に基づき誘導ラマン散乱像を取得する。散乱時相取得部２０２は、光源１００が一次光１１００を出射する時刻３００と、後方光検出器１１４がパルス光を検出する時刻３０１、３０２～と、に基づいて、試料１０８から射出されたラマン散乱光を経時的に分離する分離手段を構成すると換言される。

散乱時相取得部２０２が、三次光１３００のポンプ光成分１３１１の信号を前方光検出器６０４の出力信号から分離する方法について図３を用いて説明する。図３は、励起光のタイミングチャート（ａ）と光検出のタイミングチャート（ｂ）を含んでいる。

ポンプ光光源１０１から出力される励起光出力のタイミングチャート（ａ）において、横軸は時刻を、縦軸は励起光出力を、それぞれ示している。また、前方光検出器６０４が検出する検出信号のタイミングチャート（ｂ）において、縦軸は受光強度を、横軸は時刻をそれぞれ示している。図３のタイミングチャート（ａ）、（ｂ）は、共通の基準時刻と単位時間で表示を互いに揃えている。

励起光源１００からの励起光出力３００の励起時刻の間隔をΔＴ０とすると、一次光１１００のポンプ光成分１１１１の繰り返し周波数（１／ΔＴ０ Ｈｚ）で周期的に励起される。

一方、前方光検出器６０４の光検出信号の経時的なパターンは、図３（ｂ）に示すように、繰り返し励起周期ΔＴ０の期間内に所定のパターンを呈する。励起光出力３００により試料１０８が一次光１１００で１回励起され二次光１２００の後方散乱成分１２１１ｂｓに対応する検出信号は３０１として示されている。検出信号３０１は、励起タイミング信号３００から、ポンプ光光源１０１と試料１０８、試料１０８と半透過鏡１０６、半透過鏡１０６から前方光検出器６０４までの各区間の延べ光学距離に対応する光の進行に要する時間差ΔＴ１だけ遅延している。

また、同様にして、二次光１２００の前方散乱成分１２１１ｆｓが反射部１１１により反射された三次光１３００で２回目に励起された四次光１４００の前方散乱成分１４００ｆｓに対応する検出信号は３０２として図３（ｂ）に示されている。検出信号３０２は、検出信号３０１から、試料１０８と反射部１１１との光学距離の往復分の時間差ΔＴ２だけ遅延している。

また、四次光１４００の前方散乱成分１４００ｆｓが部分透過鏡２０１により試料１０８に向けて反射され不図示の五次光として３回目に励起された六次光の後方散乱成分に対応する検出信号は３０３として図３（ｂ）に示されている。検出信号３０３は、検出信号３０２から、試料１０８と部分透過鏡２０１との光学距離の往復分の時間差ΔＴ３だけ遅延している。

さらにまた、六次光の前方散乱成分が反射部１１１により試料１０８に向けて反射され不図示の七次光として４回目に励起された八次光の前方散乱成分に対応する検出信号は３０４として図３（ｂ）に示されている。検出信号３０４は、検出信号３０３から、試料１０８と反射部１１１との光学距離の往復分の時間差ΔＴ２だけ遅延している。

部分透過鏡２０１と反射部１１１との間に発生する試料１０８への多重の再帰光と試料１０８からの多重の誘導ラマン散乱光の発光は繰り返されるが、高Ｎ次に対応する光検出信号の強度は減衰され図３（ｂ）では、五次以降が省略されている。

したがって自然数ｎとして励起光出力３００と試料１０８をｎ回目に励起したポンプ光成分に対応する光検出信号の時刻ΔＬ（ｎ）は、以下で示される。ただし、明らかに、ΔＴ１＞ΔＴ２、ΔＴ１＞ΔＴ３、ΔＴ４＝ΔＴ１―ΔＴ３である。
ΔＬ（ｎ）＝ΔＴ４＋ＩＮＴ（（ｎ＋１）／２）×ΔＴ３＋ＩＮＴ（ｎ／２）×ΔＴ２
（式１）

ここで、ΔＴ４は、ポンプ光光源１０１と部分透過鏡２０１、部分透過鏡２０１と半透過鏡１０６、半透過鏡１０６と前方光検出器６０４、の各区間の延べ光学距離に対応する光の信号に要する時間である。また、ＩＮＴ（＃）は、＃を超えない最大の整数を意味する演算子である。

散乱時相取得部２０２は、既知の時間差ΔＴ０、ΔＴ４、ΔＴ２、ΔＴ３と、所定のｎ値に基づき、励起光光源１００と前方光検出器６０４、それぞれの出力信号に基づいて、信号の時相に関する情報を取得する。さらに、散乱時相取得部２０２は、取得した時相に関する情報に基づき、所定の励起次数ｎの信号を分離するための分離信号を制御部１１５に出力することができる。

なお、ΔＬｎは、検出する第ｎ次の検出信号に対応する光学観測系の信号対雑音比を考慮して、検出期間のサンプリング対象とするｎｓ次とする検出信号と、非サンプリング対象とするｎｕ次（ｎｕ＝ｎｓ＋１）とを設定することができる。

なお、図２では三次光１３００のポンプ光成分１３１１を反射配置で取得したが、これに限るものではない。例えば、反射部１１１の代わりに不図示の前方部分透過鏡を配置し、部分反射ミラーと一部透過する励起光およびプローブ光をフィルタにより分離して光検出器で検出してもよい。

＜第３の実施形態＞
図４、図５を用いて、第３の実施形態に係る非線形光学顕微鏡３０００について説明する。

非線形光学顕微鏡３０００は、走査手段として、試料走査部１０９の代わりに第１の走査ミラー４０２１、第２の走査ミラー４０２２と、を含む光軸走査部４０６を有する点において少なくとも、非線形光学顕微鏡１０００、２０００のそれぞれと相違する。

（光軸走査部）
光軸走査部４０６は、互いに同期して互いの法線を歳差動作させ、互いの法線が平行な関係を維持するように対向配置された第１の走査ミラー４０２１、第２の走査ミラー４０２２を含む。光軸走査部４０６は、一次光１１００の光軸を光軸と交差する方向に移動させるように構成される。光軸走査部４０６は、第１の対物レンズ１０７と第２の対物レンズ１１０で共有される焦点を試料１０８に対して走査する走査手段であると換言される。一次光１１００を構成するポンプ光１１１１およびプローブ光１１２１は、第１の走査ミラー４０２１および第２の走査ミラー４０２２によりポンプ光１１１１およびプローブ光１１２１の進行方向に直交する面と平行な方向に角度偏位が与えられる。かかる直交する面と平行な方向は、かかる面内の２方向とすることで試料１０８は、二次元に点走査される。第１の走査ミラー４０２１、第２の走査ミラー４０２２を含む光軸走査部４０６は、第１の対物レンズの焦点が試料１０８の試料面内に沿って走査されるように一次光１１００の光軸に度偏位を与える手段であると換言される。

第１の走査ミラー４０２１および第２の走査ミラー４０２２は、具体的にはガルバノスキャナやレゾナントスキャナ、あるいはポリゴンスキャナであってもよい。第１の走査ミラー４０２１および第２の走査ミラー４０２２は光軸走査部４０６に接続され、角度偏位情報を制御部１１５に出力するものとする。

２方向に角度偏位が与えられたポンプ光１１１１およびプローブ光１１２１はレンズ４０３１、レンズ４０３２を介して第１の対物レンズ１０７により試料１０８中に集光され、第２の対物レンズ１１０により角度偏位をもった略平行光として進行する。さらにポンプ光１１１１およびプローブ光１１２１は１／４波長版４０４で円偏光に変換されたのちにレンズ４０５によって、レンズ４０５の結像面４０５１に結像する。

（結像光学系と走査光学系）
ここで第１の走査ミラー４０２１および第２の走査ミラー４０２２を出射するポンプ光１１１１およびプローブ光１１２１が結像面４０５１において結像するまでの結像光学系と光軸走査系との詳細を図５を用いて説明する。

光軸中心５０１は、レンズ、ミラーなどの光学素子の中心軸と一致するように配置されている。第１の走査ミラー４０２１および第２の走査ミラー４０２２において角度偏位がゼロの場合において、ポンプ光１１１１およびプローブ光１１２１は光軸中心５０１に沿って進行し、レンズによる結像および集光作用をうける。第１の走査ミラー４０２１および第２の走査ミラー４０２２において角度偏位が与えられた場合において、励起光およびプローブ光の進行およびレンズによる結像、集光作用を光束５０２としてあらわしている。

光束５０２の光束径は、ポンプ光光源１０１またはプローブ光光源１０２から出射されるポンプ光１１１１またはプローブ光１１２１のビーム径であってもよく、またビームエキスパンダにより任意に拡大されたビーム径であってもよい。光束５０２はレンズ４０３１に入射し、レンズ４０３２との中間位置にあるレンズ４０３１の中間結像面４０３３での結像を介してレンズ４０３２から出射し、第１の対物レンズ１０７へ入射する。

またレンズ４０３１、レンズ４０３２は第２の走査ミラー４０２２の回転面５０４と第１の対物レンズ１０７の入射瞳面５０３とが共役となるように配置される。なお、レンズ４０３１、レンズ４０３２の配置は第１の対物レンズ１０７の入射瞳面５０３と第１の走査ミラー４０２１の回転面５０５とが共役であってもよい。

また、第１の走査ミラー４０２１の回転面５０５と第２の走査ミラー４０２２の回転面５０４の二等分面と共役であってもよい。光束５０２は第１の対物レンズ１０７の入射瞳面５０３に対して角度偏位をもって入射し、試料１０８中の試料面内の光軸中心５０１と２次元方向に偏位をもって集光する。

試料１０８中に集光した光束は第２の対物レンズ１１０により角度偏位をもった平行な光束として出射し、１／４波長版４０４を透過し、レンズ４０５によりレンズ４０５の結像面４０５１に結像される。レンズ４０５の結像面４０５１の位置にミラー４０７を配置することで、光束５０２はレンズ４０５の結像面４０５１に結像するに至る経路上を逆進させることができる。なおレンズ４０５の結像面４０５１は平面であり、したがってミラー４０７は平面ミラーであるが、レンズ４０５の結像面４０５１が湾曲している場合は、湾曲面と一致するように凹面ミラーあるいは凸面ミラーであってもよい。

以上説明したように、第１の走査ミラー４０２１および第２の走査ミラー４０２２によって与えられる一次光、三次光、五次光の奇数次の光軸の角度偏位に応じて光束５０２は、第１の対物レンズ１０７による集光点（焦点）は試料１０８面内に走査される。さらにレンズ４０５の結像面４０５１にミラー４０７を配置することで、第１の対物レンズ１０７による焦点と重なる領域を有して光束５０１を集光させることができる。

次に、本実施形態の非線形光学顕微鏡３０００における、ｎ次（ｎは奇数）の励起光に起因する誘導ラマン散乱光の検出の機構は、第１の実施形態に係る非線形光学顕微鏡１０００と共通するため以下省略する。

＜第４の実施形態＞
図６を用いて、第４の実施形態に係る非線形光学顕微鏡４０００について説明する。

非線形光学顕微鏡４０００は、反射部１１１の代わりに、前方部分透過鏡６１１、第２のフィルタ６０３、前方光検出器６０４、ミラー微動機構６０５、を含む前方光検出系を有する点において、非線形光学顕微鏡３０００と相違する。

以下、第３の実施形態の非線形光学顕微鏡３０００と本実施形態の非線形光学顕微鏡４０００との相違点に絞って説明し、その他の第３の実施形態との共通点についての説明は省略する。

（前方部分透過鏡を含む前方光検出系）
第１の走査ミラー４０２１および第２の走査ミラー４０２２を走査駆動した状況下を考える。前方部分透過鏡６０１により二次光１２００の前方散乱成分１２００ｆｓの光束が部分的に透過した成分は、前方散乱ポンプ光１２１１ｆｓと前方散乱プローブ光１２２１ｆｓを含む光束が透過された成分である。二次光１２００の前方散乱成分１２００ｆｓの光束のうち、前方部分透過鏡６０１、受光レンズ６０２、第２のフィルタ６０３を介した光束に含まれる前方散乱ポンプ光１２１１ｆの光束の一部を、前方光検出器６０４は受光し検出する。前方部分透過鏡６０１は、二次光１２００のうち前方散乱成分１２００ｆｓの光束の一部を透過する前方透過部と、前方散乱成分１２００ｆｓの光束の残部の少なくとも一部を第２の対物レンズの側に反射する前方反射部と、を含む光学要素であると換言される。

制御部１１５は、第１の実施形態、第３の実施形態と同様にして、光軸走査部４０６の角度偏位情報と、後方光検出器１１４の出力信号に係る情報と、に基づいて第１の画像化信号を生成し、生成した第１の画像化信号を画像処理部１１６に出力する。

また、制御部１１５は、光軸走査部４０６の角度偏位情報と、前方光検出器６０４の出力信号に係る情報と、に基づいて第２の画像化信号を生成し、生成した第２の画像化信号を画像処理部１１６に出力する。

画像処理部１１６は、第１の画像化信号に基づいて、試料１０８に関する後方散乱像を取得し、第２の画像化信号に基づいて試料１０８に関する前方散乱像を取得する。画像処理部１１６は、後方光検出器１１４の出力信号と前方光検出器６０４の出力信号との差分に関する情報を取得する取得部１１６であると換言される。

ここで、前方部分透過鏡６０１の角度、位置誤差があると以下のような問題が生じる。第２の対物レンズ１１０が試料１０８中に形成する三次光１３００の集光スポット（焦点）と、第１の対物レンズ１０７が試料１０８中に形成する一次光１１００の集光スポット（焦点）の位置が異なる場合が生ずる。この集光スポット（焦点）の位置ずれのため、後方散乱像と前方散乱像に像ずれが生じる。

画像処理部１１６は、後方散乱像と前方散乱像のずれ量に関する情報に基づいて、後方散乱像と前方散乱像の画像ずれを低減する処理を行うように構成してもよい。

画像処理部１１６は、ミラー微動機構６０５を駆動する駆動信号、または、前方部分透過鏡６０１の走査位置に関する情報に基づいて、ミラー微動機構６０５または光軸走査部４０６の少なくともいずれかにフィードバック制御する方法が採用される。かかるフィードバック制御により、２つ対物レンズ１０７、１１０の焦点（集光スポット）の領域が一致することに対応する効果が得られる。かかるフィードバック制御により、後方散乱像と前方散乱像の位置ずれが低減され、試料１０８に関する撮影画像空間解像度を向上させる。

また、後方散乱像と前方散乱像は、ポンプ光光源１０１およびプローブ光光源１０２の出力パルス光の強度揺れの影響を同時に含む場合がある。前方散乱像と前方散乱像とは、試料厚と一次光に対する光学密度の関係から、試料１０８に対する相互作用の影響度が対象な場合といずれかが強い非対称の場合がある。これら要因により非線形光学過程による励起光の変動が異なる場合があるため、後方散乱像と前方散乱像の差分を取得することは、励起光やプローブ光の強度揺れ、試料厚と一次光波長の選択に関してロバストな観察を行うことができる。後方散乱像と前方散乱像の差分を取得する際、前方部分透過鏡６０１の反射率あるいは透過率に基づいて検出信号に対する所定の重みを付与してもよい。

なお、本発明は、以下の構成１～１６に対応する非線形光学顕微鏡を含む。

・構成１
ポンプ光とプローブ光を少なくとも含む一次光を出射する光源と、載置部に載置された試料の後方に配置され前記一次光を集光し前記試料に対し入射させる第１の対物レンズと、焦点の少なくとも一部を前記第１の対物レンズと共有し前記試料の前方に配置される第２の対物レンズと、
前記第２の対物レンズより前方に配置される反射部と、
前記試料から後方に出射される光に含まれるポンプ光成分とプローブ光成分のうちいずれか一方を光学的に選択する第１のフィルタと、前記第１のフィルタにより選択された成分または選択されなかった成分のいずれかを検出する後方光検出器と、を有する非線形光学顕微鏡。

・構成２
ポンプ光とプローブ光を少なくとも含む一次光を出射する光源と、載置部に載置された試料の後方に配置され前記一次光を集光し前記試料に対し入射させる第１の対物レンズと、焦点の少なくとも一部を前記第１の対物レンズと共有し前記試料の前方に配置される第２の対物レンズと、
前記第２の対物レンズより前方に配置され、前記試料からの二次光のうち前方に出射される成分の入射を前記第２の対物レンズを介して受け反射し三次光として前記第２の対物レンズを介して前記試料に入射させる反射部と、
前記試料から後方に出射される光のうち、前記一次光と前記三次光のそれぞれにより前記試料から発生した第１のラマン散乱光成分と第２のラマン散乱光成分とを光学的に選択する第１のフィルタと、前記第１のフィルタにより選択された成分または選択されなかった成分のいずれかを検出する後方光検出器と、を有する非線形光学顕微鏡。

・構成３
前記反射部は、前記第２の対物レンズの前記焦点と共役な位置と重なって位置する構成１または２に係る非線形光学顕微鏡。

・構成４
前記一次光を透過し、前記一次光が通過する方向と逆方向に前記第１の対物レンズを通過する光を前記一次光と光軸と交差する方向に反射し前記一次光の光路から分岐する半透鏡を有し、
前記後方光検出器は、前記半透鏡を介して分岐された分岐光を受光するように配置される構成１または２に係る非線形光学顕微鏡。

・構成５
前記第１の対物レンズと前記半透鏡との間に、前記一次光の光束の一部と前記後方散乱光の光束の一部とを透過する後方透過部と、前記後方散乱光の前記光束の残部の少なくとも一部を反射する後方反射部と、を含む後方部分透過鏡を有する構成４に係る非線形光学顕微鏡。

・構成６
前記反射部は、前記二次光のうち前方散乱成分の光束の一部を透過する前方透過部と、前記前方散乱成分の前記光束の残部の少なくとも一部を前記２の対物レンズの側に反射する前方反射部と、を含む前方部分透過鏡を有する構成４に係る非線形光学顕微鏡。

・構成７
前記試料からの前記二次光のうち前記前方部分透過鏡を透過した光束に含まれるポンプ光成分とプローブ光成分のうちいずれか一方を光学的に選択する第２のフィルタを有する構成６に係る非線形光学顕微鏡。

・構成８
前記第２のフィルタにより選択された成分または選択されなかった成分のいずれかを検出する前方光検出器をさらに有し、
前記前方光検出器の出力信号と前記後方光検出器の出力信号とを比較する散乱時相取得部を有する構成７に係る非線形光学顕微鏡。

・構成９
前記散乱時相取得部の出力に基づいて前記前方部分透過鏡の配置を調整する調整部をさらに有する構成８に係る非線形光学顕微鏡。

・構成１０
前記後方光検出器の出力信号と前記前方光検出器の出力信号との差分に関する情報を取得する取得部を有する構成７に係る非線形光学顕微鏡。

・構成１１
前記第１の対物レンズと前記第２の対物レンズで共有される前記焦点を前記試料に対して走査する走査手段を有する構成１～１０のいずれかの構成に係る非線形光学顕微鏡。

・構成１２
前記走査手段は、前記一次光の光軸方向と交差する方向に前記載置部を移動させる試料走査部を含む構成１１に係る非線形光学顕微鏡。

・構成１３
前記走査手段は、前記一次光の光軸を前記光軸と交差する方向に移動させる光軸走査部を含む構成１１に係る非線形光学顕微鏡。

・構成１４
前記光軸走査部は、前記第１の対物レンズの前記焦点が前記試料面内に沿って走査されるように前記一次光の光軸に角度偏位を与える走査ミラーを含む構成１３に係る非線形光学顕微鏡。

・構成１５
前記ポンプ光、前記プローブ光はいずれもパルス光を含む構成１～１４いずれかの構成に係る非線形光学顕微鏡。

・構成１６
前記光源が前記一次光を出射する時刻と、前記光検出器がパルス光を検出する時刻と、に基づいて、前記試料から射出されたラマン散乱光を経時的に分離する分離手段を有する構成１５に係る非線形光学顕微鏡。

１０１ ポンプ光光源
１０２ プローブ光光源
１０１１ ポンプ光
１０２１ プローブ光
１０５ ダイクロイックミラー
１０６ 半透鏡
１０７ 第１の対物レンズ
１０８ 試料
１１８ 載置部
１１０ 第２の対物レンズ
１１１ 反射部
１１２ 第１のフィルタ
１１４ 後方光検出器

Claims (16)

1. ポンプ光とプローブ光を少なくとも含む一次光を出射する光源と、載置部に載置された試料の後方に配置され前記一次光を集光し前記試料に対し入射させる第１の対物レンズと、焦点の少なくとも一部を前記第１の対物レンズと共有し前記試料の前方に配置される第２の対物レンズと、
   前記第２の対物レンズより前方に配置される反射部と、
   前記試料から後方に出射される光に含まれるポンプ光成分とプローブ光成分のうちいずれか一方を光学的に選択する第１のフィルタと、前記第１のフィルタにより選択された成分または選択されなかった成分のいずれかを検出する後方光検出器と、を有する非線形光学顕微鏡。
2. ポンプ光とプローブ光を少なくとも含む一次光を出射する光源と、載置部に載置された試料の後方に配置され前記一次光を集光し前記試料に対し入射させる第１の対物レンズと、焦点の少なくとも一部を前記第１の対物レンズと共有し前記試料の前方に配置される第２の対物レンズと、
   前記第２の対物レンズより前方に配置され、前記試料からの二次光のうち前方に出射される成分の入射を前記第２の対物レンズを介して受け反射し三次光として前記第２の対物レンズを介して前記試料に入射させる反射部と、
   前記試料から後方に出射される光のうち、前記一次光と前記三次光のそれぞれにより前記試料から発生した第１のラマン散乱光成分と第２のラマン散乱光成分とを光学的に選択する第１のフィルタと、前記第１のフィルタにより選択された成分または選択されなかった成分のいずれかを検出する後方光検出器と、を有する非線形光学顕微鏡。
3. 前記反射部は、前記第２の対物レンズの前記焦点と共役な位置と重なって位置する請求項１または２に記載の非線形光学顕微鏡。
4. 前記一次光を透過し、前記一次光が通過する方向と逆方向に前記第１の対物レンズを通過する光を前記一次光と光軸と交差する方向に反射し前記一次光の光路から分岐する半透鏡を有し、
   前記後方光検出器は、前記半透鏡を介して分岐された分岐光を受光するように配置される請求項１または２に記載の非線形光学顕微鏡。
5. 前記第１の対物レンズと前記半透鏡との間に、前記一次光の光束の一部と前記後方散乱光の光束の一部とを透過する後方透過部と、前記後方散乱光の前記光束の残部の少なくとも一部を反射する後方反射部と、を含む後方部分透過鏡を有する請求項４に記載の非線形光学顕微鏡。
6. 前記反射部は、前記二次光のうち前方散乱成分の光束の一部を透過する前方透過部と、前記前方散乱成分の前記光束の残部の少なくとも一部を前記２の対物レンズの側に反射する前方反射部と、を含む前方部分透過鏡を有する請求項４に記載の非線形光学顕微鏡。
7. 前記試料からの前記二次光のうち前記前方部分透過鏡を透過した光束に含まれるポンプ光成分とプローブ光成分のうちいずれか一方を光学的に選択する第２のフィルタを有する請求項６に記載の非線形光学顕微鏡。
8. 前記第２のフィルタにより選択された成分または選択されなかった成分のいずれかを検出する前方光検出器をさらに有し、
   前記前方光検出器の出力信号と前記後方光検出器の出力信号とを比較する散乱時相取得部を有する請求項７に記載の非線形光学顕微鏡。
9. 前記散乱時相取得部の出力に基づいて前記前方部分透過鏡の配置を調整する調整部をさらに有する請求項８に記載の非線形光学顕微鏡。
10. 前記後方光検出器の出力信号と前記前方光検出器の出力信号との差分に関する情報を取得する取得部を有する請求項７に記載の非線形光学顕微鏡。
11. 前記第１の対物レンズと前記第２の対物レンズで共有される前記焦点を前記試料に対して走査する走査手段を有する請求項１または２に記載の非線形光学顕微鏡。
12. 前記走査手段は、前記一次光の光軸方向と交差する方向に前記載置部を移動させる試料走査部を含む請求項１１に記載の非線形光学顕微鏡。
13. 前記走査手段は、前記一次光の光軸を前記光軸と交差する方向に移動させる光軸走査部を含む請求項１１に記載の非線形光学顕微鏡。
14. 前記光軸走査部は、前記第１の対物レンズの前記焦点が前記試料面内に沿って走査されるように前記一次光の光軸に角度偏位を与える走査ミラーを含む請求項１３に記載の非線形光学顕微鏡。
15. 前記ポンプ光、前記プローブ光はいずれもパルス光を含む請求項１または２に記載の非線形光学顕微鏡。
16. 前記光源が前記一次光を出射する時刻と、前記光検出器がパルス光を検出する時刻と、に基づいて、前記試料から射出されたラマン散乱光を経時的に分離する分離手段を有する請求項１５に記載の非線形光学顕微鏡。

Images