JP2024161633A

JP2024161633A - 酵素を用いたペプチドライゲーション

Info

Publication number: JP2024161633A
Application number: JP2021157054A
Authority: JP
Inventors: 敏幸脇本; Toshiyuki Wakimoto; 研一松田; Kenichi Matsuda; 雅和小林; Masakazu Kobayashi
Original assignee: Hokkaido University NUC
Current assignee: Hokkaido University NUC
Priority date: 2021-09-27
Filing date: 2021-09-27
Publication date: 2024-11-20
Also published as: WO2023048262A1

Abstract

【課題】ペプチド合成のための新たな酵素ツール、および新たなペプチド修飾技術を提供する。
【解決手段】ペニシリン結合タンパク質型チオエステラーゼ（ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥ）を触媒として用いて、ドナーペプチド基質（ドナー基質）のＣ末端とアクセプターペプチド基質（アクセプター基質）のＮ末端の間にアミド結合を生じさせることを特徴とする、ライゲーションされたペプチドの製造方法、ならびにＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥを触媒として用いて、修飾基を含むドナー基質のＣ末端とアクセプター基質のＮ末端の間にアミド結合を生じさせることを特徴とする、修飾されたペプチドの製造方法。
【選択図】なし

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り１．北海道大学の学内メール配布日：令和３年２月１５日２．北海道大学薬学部講義室における修士論文発表会開催日：令和３年３月１日３．日本薬学会第１４１年会（広島）の講演要旨ウェブサイトのアドレスｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｐｈａｒｍ１４１／ｓｕｂｊｅｃｔ／２７Ｖ０２－ａｍ－１３／ｃｌａｓｓ？ｃｒｙｐｔｏＩｄ＝掲載日：令和３年３月５日４．「新規ペプチド環化酵素ＰＢＰ型チオエステラーゼの機能解析とその応用」と題する修士論文北海道大学薬学研究院・薬学部図書館に寄贈公表日：令和３年３月１５日５．日本薬学会第１４１年会（広島）オンライン開催開催日：令和３年３月２７日

本発明は、酵素によるペプチドの製造およびペプチドの修飾に関する。

ペプチド（本明細書においてはオリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質も含む）は生命活動を支える根幹的な生体分子であり、人為的な修飾による可視化あるいは機能制御の技術は生命現象の解明に大きく貢献する。また抗体やインスリンに代表されるように、ペプチド自体も重要な創薬モダリティである。そのため、ペプチドの位置特異的な修飾手法はこれまで精力的に研究されており（非特許文献１）、新たなペプチドの創出も試みられている。一般にペプチドは高温条件・有機溶媒に対する耐性が低く、また化学的特徴の類似した露出した反応点を多数有するため、いかに温和かつ高選択的に修飾を導入できるかが課題となる。反応条件が温和であり、高い分子認識能を示す酵素触媒は、タンパク質修飾ツールとしての応用が期待されており、これまでＳｏｒｔａｓｅ、ＢｕｔｅｌａｓｅＩ、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ変異酵素等の酵素がペプチドのＮ末端の修飾ツールとして提案されてきた（非特許文献２）。しかしこれらは各々長所・短所（高すぎる基質特異性や基質自体の安定性）があり、標的にできる対象は限定的であるため、酵素ツールのレパートリー拡充が望まれている。

一方、発明者らはこれまで、土壌細菌（放線菌）から新規な酵素ファミリーであるペニシリン結合タンパク質型チオエステラーゼ（ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥ）を発見し、本酵素がペプチドの分子内アミド化（環化）反応を効率よく触媒することを見出した（特許文献１）。

国際特許出願公開公報ＷＯ２０１９／２１６２４８

Hoyt, E.A. et al., Nat. Rev. Chem. 3, 147-171 (2019). Rosen, C. B. & Francis, M. B. Nat. Chem. Biol. 13, 697-705 (2017).

ペプチド合成のための新たな酵素ツール、および新たなペプチド修飾技術が望まれている。

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を重ね、ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥが分子内のアミド化だけでなく、分子間のアミド化を触媒できることを見出した。具体的には、ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥが、アクセプターペプチド基質（アクセプター基質という）のＮ末端に位置選択的にドナーペプチド基質（ドナー基質という）をアミド結合を介して結合しうることを見出した。本発明者らは、かかる知見に基づいて本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下のものを提供する。
（１）ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥを触媒として用いて、ドナー基質のＣ末端とアクセプター基質のＮ末端との間にアミド結合を生じさせることを特徴とする、ライゲーションされたペプチドの製造方法。
（２）ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥが、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する酵素であるか、あるいはその変異体酵素であり、変異体酵素が、下記アミノ酸配列のいずれか：
（ａ）配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して３８％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸配列において、数個または数十個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されているアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号：１に示す塩基配列に相補的な塩基配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
を有し、かつ配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する酵素と同等またはそれ以上のペプチドライゲーション活性を有するものである、（１）記載の方法。
（３）ドナー基質のＣ末端側から２番目の残基およびＣ末端残基が、それぞれ、カチオン性アミノ酸および疎水性Ｄ－アミノ酸であり、Ｃ末端疎水性Ｄ－アミノ酸のカルボキシル基が活性化されているものである、（１）または（２）記載の方法。
（４）Ｃ末端疎水性Ｄ－アミノ酸のカルボキシル基の活性化が、チオエステル型の脱離基を付与することにより行われる、（３）記載の方法。
（５）ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥを触媒として用いて、修飾基を含むドナー基質のＣ末端とアクセプター基質のＮ末端との間にアミド結合を生じさせることを特徴とする、修飾されたペプチドの製造方法。
（６）ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥが、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する酵素であるか、あるいはその変異体酵素であり、変異体酵素が、下記アミノ酸配列のいずれか：
（ａ）配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して３８％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸配列において、数個または数十個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されているアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号：１に示す塩基配列に相補的な塩基配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
を有し、かつ配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する酵素と同等またはそれ以上のペプチドライゲーション活性を有するものである、（５）記載の方法。
（７）ドナー基質のＣ末端側から２番目の残基およびＣ末端残基が、それぞれ、カチオン性アミノ酸および疎水性Ｄ－アミノ酸であり、Ｃ末端疎水性Ｄ－アミノ酸のカルボキシル基が活性化されているものである、（５）または（６）記載の方法。
（８）Ｃ末端疎水性Ｄ－アミノ酸のカルボキシル基の活性化が、チオエステル型の脱離基を付与することにより行われる、（７）記載の方法。
（９）ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥを含む、ペプチドライゲーション用キット。
（１０）ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥを含む、修飾されたペプチドを作成するためのキット。
（１１）修飾基を含むドナー基質をさらに含む、（１０）記載のキット。

本発明は、ペプチド合成のための新たな酵素ツール、および新たなペプチド修飾技術を提供する。本発明により得られるライゲーションペプチドは、Ｄ－アミノ酸を含むアミド結合を有するので、Ｌ－アミノ酸のみからなるペプチドよりも分解酵素に対する耐性が向上する。本発明のペプチドライゲーションは酵素によるものなので、化学合成法のような保護基の付与および脱保護の煩雑な操作が不要である。さらに本発明は、ペプチドやタンパク質のＮ末端選択的な修飾手法を提供する。この修飾手法を用いて、非ペプチド性構造をペプチドやタンパク質のＮ末端に導入することもできる。

図１の上段は、ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥによるペプチドライゲーション反応のスキームを示す。図１の下段は、図１の上段に示すドナー基質とアクセプター基質を用いたライゲーション反応生成物を分析したＬＣ－ＭＳのチャートを示す。＋Ｎｓｍ１６は、酵素を含む反応系から得られた生成物のチャートを示し、ｓｕｂｓｔｒａｔｅｏｎｌｙは、酵素を含まない反応系から得られた生成物のチャートを示す。図２は、サイズの小さな修飾ペプチドをドナー基質とした場合のライゲーション反応生成物を分析したＬＣ－ＭＳのチャートを示す。Ａｌｌｉｎは、酵素を含む反応系から得られた生成物のチャートを示し、ｓｕｂｓｔｒａｔｅｏｎｌｙは、酵素を含まない反応系から得られた生成物のチャートを示す。

本発明は、第１の態様において、ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥを触媒として用いて、ドナー基質のＣ末端とアクセプター基質のＮ末端との間にアミド結合を生じさせることを特徴とする、ライゲーションされたペプチドの製造方法を提供する。

ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥは、本発明者らが土壌細菌（放線菌）から見出した新規な酵素ファミリーであり、非リボソームペプチド生合成に関わる環化酵素ファミリーである（Kuranaga, T. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 9447-9451、およびMatsuda, K. et al. Nat. Catl. 2020, 3, 507-515）。

ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥがペプチド環化反応だけでなく、ペプチドライゲーション反応を触媒しうることが、本発明者らにより初めて見出された。本明細書において、ペプチドライゲーションは、ドナー基質のＣ末端アミノ酸残基とアクセプター基質のＮ末端アミノ酸残基の間にアミド結合（ペプチド結合）を生じさせることをいう。本発明において使用しうるＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥはペプチドライゲーション反応を触媒しうるものである。なお、本明細書において、「ライゲーション」という用語はペプチドの環化反応を含まない。

本発明のペプチドライゲーションに用いるＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥは、公知のものから選択することができる。その例として、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｎｏｕｒｓｅｉＮＢＲＣ１５４５２由来の酵素Ｎｓｍ１６が挙げられるがこれに限定されない。酵素Ｎｓｍ１６をはじめとするＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥは公知のクローニング方法を用いて取得することができる。

本発明において、酵素Ｎｓｍ１６が好ましく用いられる。酵素Ｎｓｍ１６をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に示す。酵素Ｎｓｍ１６のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。すなわち、本発明において、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する酵素、あるいは配列番号：１に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素が好ましく用いられる。

酵素Ｎｓｍ１６の変異体であって、酵素Ｎｓｍ１６と同等またはそれ以上のペプチドライゲーション活性を有する酵素も本発明において好ましく用いられる。酵素Ｎｓｍ１６と同等またはそれ以上のペプチドライゲーション活性は、酵素Ｎｓｍ１６の約５０％以上の活性、好ましくは約７０％以上の活性、より好ましくは約８０％以上の活性、さらにより好ましくは約９０％以上の活性をいう。酵素のペプチドライゲーション活性は、ドナー基質およびアクセプター基質を反応させ、生成物を分析することによって測定することができる。例えば、本明細書の実施例に記載した手順に準じて試供酵素ならびにドナー基質およびアクセプター基質を反応させ、得られた反応液をＬＣ－ＭＳ分析に供してライゲーション生成物量を測定することにより、ペプチドライゲーション活性を測定してもよい。

酵素Ｎｓｍ１６の変異体の具体例としては、配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して約３５％以上、例えば約３８％以上、好ましくは約５０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらにより好ましくは約９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素であって、酵素Ｎｓｍ１６と同等またはそれ以上のペプチドライゲーション活性を有する酵素が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴＰなどの公知の検索手段を用いて決定することができる。

酵素Ｎｓｍ１６の変異体のさらなる具体例としては、配列番号：２に示すアミノ酸配列において、数個または数十個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されているアミノ酸配列を有する酵素であって、酵素Ｎｓｍ１６と同等またはそれ以上のペプチドライゲーション活性を有する酵素が挙げられるが、これらに限定されない。ここで、数個とは、２個、３個、５個、４個、６個、７個、８個または９個をいう。数十個とは、約１０個～約９０個程度をいい、例えば約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個または約９０個、あるいはこれらの数値の間の数であってもよい。アミノ酸配列中のアミノ酸の置換は、任意のアミノ酸での置換であってよいが、好ましくは同様の性質および／または構造を有するアミノ酸にて置換される。例えば、以下のカッコ内のアミノ酸を互いに置換してもよい：（Ｇ、Ａ）、（Ｋ、Ｒ、Ｈ）、（Ｄ、Ｅ）、（Ｎ、Ｑ）、（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、（Ｃ、Ｍ）、（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｈ）、（Ｖ、Ｌ、Ｉ）。

酵素Ｎｓｍ１６の変異体のさらなる具体例としては、ストリンジェントな条件下で配列番号：１に示す塩基配列に相補的な塩基配列にハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有する酵素であって、酵素Ｎｓｍ１６と同等またはそれ以上のペプチドライゲーション活性を有する酵素が挙げられるが、これらに限定されない。

ストリンジェントな条件は当業者に公知であり、例えば下記条件が挙げられる：
０．２５ＭＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液を含む緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６～２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡを含む緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件；あるいは
２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む緩衝液中で３７℃において、より厳しい条件としては０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む緩衝液中で４２℃において、さらに厳しい条件としては０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む緩衝液中で６５℃において洗浄を行う条件。
ストリンジェントな条件は上例に限定されない。

酵素Ｎｓｍ１６の変異体は、天然由来のものであってもよく、例えば遺伝子工学的手法を用いて人工的に作出されたものであってもよい。例えば、酵素Ｎｓｍ１６の変異体は、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｎｏｕｒｓｅｉＮＢＲＣ１５４５２以外の放線菌が有するＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥであってもよい。

酵素Ｎｓｍ１６およびその変異体を、Ｎｓｍ１６遺伝子またはそのホモログもしくはオーソログをクローニングしてこれらの酵素をコードする遺伝子を得ることによって製造してもよい。例えば本明細書の実施例に記載した方法にて酵素Ｎｓｍ１６得てもよい。

本明細書において、ペプチドは、アミノ酸残基がペプチド結合によって連結された分子をいう。アミノ酸残基数は２以上である。本明細書において、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質もペプチドに包含される。本明細書において、ペプチド中のアミノ酸残基間の結合のすべてがペプチド結合である必要はない。ペプチドを構成するアミノ酸は、天然のタンパク質中に含まれるものであってもよく、天然のタンパク質中に含まれないものであってもよい（例えば、β－アラニン、γ－アミノ酪酸、オルニチン、ホモシステインなど）。ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ－体であってもよく、Ｄ－体であってもよい。ペプチドを構成するアミノ酸は、生体内に存在するものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。ペプチドは、非ペプチド性の構造や修飾基（これらについては後述）を含んでいてもよい。本明細書において、ペプチドの左端がＮ末端であり、右端がカルボキシル末端である。

アクセプター基質は任意のペプチドであってよい。アクセプター基質を構成するアミノ酸残基の種類は特に限定されない。アクセプター基質を構成するアミノ酸残基の数も特に限定されないが、少ないほうが好ましい。

ドナー基質は任意の種類および数のアミノ酸残基を含むペプチドであってよい。ドナー基質のＣ末端側から２番目のアミノ酸残基がカチオン性アミノ酸であることが好ましい。ドナー基質のＣ末端アミノ酸残基が疎水性アミノ酸であることが好ましい。ドナー基質のＣ末端アミノ酸残基がＤ－体であることが好ましい。ドナー基質のＣ末端側から２番目の残基およびＣ末端残基が、それぞれ、カチオン性アミノ酸および疎水性Ｄ－アミノ酸であることが、より好ましい。

カチオン性アミノ酸は公知であり、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチンが例示されるが、これらに限定されない。カチオン性アミノ酸は、７よりも高い等電点を有するアミノ酸と言ってもよい。

疎水性アミノ酸も公知であり、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンが例示されるが、これらに限定されない。疎水性アミノ酸は、グリシンよりも高い疎水性インデックスを有するアミノ酸と言ってもよい。

ドナー基質のＣ末端アミノ酸は、そのカルボキシル基を活性化することが必須である。活性化の例としてエステル化が挙げられるが、これに限定されない。エステル化の例としては、チオエステル化、アルキルエステル化（例えばメチルエステル化、エチルエステル化など）などが挙げられるが、これらに限定されない。ドナー基質のＣ末端Ｄ－アミノ酸のカルボキシル基をチオエステル化して活性化すること、すなわちチオエステル型の脱離基を付与して活性化することが好ましい。Ｎ－アセチルシステアミンを用いてチオエステル化すること（ＳＮＡＣ体の形成）が好ましい。

ドナー基質は非ペプチド性の構造を含んでいてもよい。非ペプチド性の構造は、天然のペプチドには含まれていない構造をいい、その種類や構造は特に限定されない。非ペプチド性の構造の例としては、ビオチン、フルオレセイン、ローダミンなどの標識類、ルシフェリン、ＰＥＧ、糖類、脂質、核酸などが挙げられるが、これらに限定されない。非ペプチド性の構造は天然由来のものであってもよく、人工的に作出されたものであってもよい。非ペプチド性の構造は、以下に述べる修飾基であってもよい。ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥおよび非ペプチド性の構造を含むドナー基質を用いて、アクセプター基質に非ペプチド性の構造を付与することができる。同様に、非ペプチド性の構造に限らず、修飾基を含むドナーペプチドを用いて、アクセプター基質を修飾することができる。

したがって、本発明は、もう１つの態様において、ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥを触媒として用いて、修飾基を含むドナー基質のＣ末端とアクセプター基質のＮ末端との間にアミド結合を生じさせることを特徴とする、修飾されたペプチドの製造方法を提供する。

上記方法は、目的ペプチド（アクセプター基質）のＮ末端選択的な修飾手法として用いることができる。修飾基は、目的ペプチドを修飾する基をいい、その種類や構造は特に限定されない。修飾基は、ペプチド性の構造を有していてもよく、非ペプチド性の構造を有していてもよい。修飾基の例としては、蛍光標識、発光標識、放射性標識、ビオチン、アビジン、他のペプチドまたはタンパク質、例えばヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼなどのタグ、ルシフェラーゼ、抗体またはその一部分、抗原またはその一部分、糖類、脂質、核酸などが挙げられるが、これらに限定されない。修飾基は天然由来のものであってもよく、人工的に作出されたものであってもよい。修飾基は上で述べた非ペプチド性の構造であってもよい。

本発明は、さらなる態様において、ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥを含む、ペプチドライゲーション用キットを提供する。通常、該キットには取扱説明書が添付される。該キットは、ドナー基質および／またはアクセプター基質を含んでいてもよい。該キットには、保存性や安定性の点から、例えば凍結乾燥されたＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥを含んでいてもよい。

本発明は、さらなる態様において、ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥを含む、修飾されたペプチドを作成するためのキットを提供する。通常、該キットには取扱説明書が添付される。該キットは、修飾基を含むドナー基質を含んでいてもよい。該キットは、アクセプター基質を含んでいてもよい。該キットには、保存性や安定性の点から、例えば凍結乾燥されたＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥを含んでいてもよい。

本発明は、さらなる態様において、ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥによるペプチドライゲーションに用いられるドナー基質を提供する。好ましくは、ドナー基質のＣ末端側から２番目の残基およびＣ末端残基が、それぞれ、カチオン性アミノ酸および疎水性Ｄ－アミノ酸である。好ましくは、該ドナー基質のＣ末端アミノ酸が活性化されている。より好ましくは、該ドナー基質のＣ末端アミノ酸が、そのカルボキシル基においてＳＮＡＣ体となっている。

本明細書中の用語は、特に断らないかぎり、化学、生物学、生化学、医学、薬学等の分野において通常に理解される意味に解される。本明細書において、数値の前に「約」を付した場合、その数値±２０％、好ましくはその数値±１０％、より好ましくはその数値±５％を表す。

以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。

１．組換え酵素Ｎｓｍ１６の調製
ポリメラーゼＫＯＤＯｎｅ（東洋紡）を用いてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｎｏｕｒｓｅｉＮＢＲＣ１５４５２のゲノムＤＮＡから酵素Ｎｓｍ１６をコードするＤＮＡフラグメントを増幅した。増幅に用いたプライマーのセットは以下のものであった（大文字部分）。フォワードプライマーにはＥｃｏＲＩ認識部位を、リバースプライマーにはＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を付加した（配列番号：３、４の下線部）。
Nsm16_Fw: 5’-ccggaattcGTGCACGGGGACTCAGCGGATCC-3’ （配列番号：３）
Nsm16_Rv: 5’-cccaagcttTTAGTGCGGCCGTGCGCCGTGG-3’ （配列番号：４）
増幅したフラグメントを、ｐＥＴ－２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のマルチクローニングサイト中のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入して、組換え酵素Ｎｓｍ１６発現ベクター（Ｎｓｍ１６－ｐＥＴ２８ａ）を得た。

上で得た発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２３１（ＤＥ３）に導入し、シングルコロニーを５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１０ｍＬの２ｘＹＴ培地（１．６％Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ、１．０％ＢａｃｔｏＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩培養して種培養を得た。２．０ｍＬの培養物を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２００ｍＬの２ｘＹＴ培地に移し、３７℃で３時間培養した。培養物を氷冷し、０．１ｍＬのＩＰＴＧを添加して組換え酵素Ｎｓｍ１６の発現を誘導した。大腸菌を１６℃で一晩培養した。遠心分離（３５００ｘｇ、１０分）により集菌し、超音波ホモジナイザーを用いて破砕した。遠心分離（１７０００ｘｇ、１０分）により残渣を除去した後、可溶性タンパク質を含むフラクションを、洗浄バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）にて平衡化したＮｉ－ＮＴＡアフィニティーカラム（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）に供した。カラムを洗浄バッファーにて洗浄し、５００ｍＭイミダゾール洗浄バッファーにて溶出させた。カラムからの溶出物をＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ０．５ｍＬフィルター（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて濃縮した。タンパク質溶液の濃度をＢｉｏ－Ｒａｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙｋｉｔにて測定した。なお、本実験では、ヒスチジンタグがＮ末端側に付いたタンパク質として組換え酵素Ｎｓｍ１６を得た。そのアミノ酸配列を配列番号：５に示す。

このようにして得られた組換え酵素Ｎｓｍ１６を以下のペプチドライゲーション実験に使用した。

２．基質の合成
本実験に使用したドナー基質およびアクセプター基質を、固相ペプチド合成法にて合成した。固相ペプチド合成プロトコールを以下に示す。
固相ペプチド合成プロトコール
工程１：２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用いることにより（１０分間、室温）、固相に支持されたペプチドのＦｍｏｃ基を除去した。
工程２：反応容器中の樹脂をＤＭＦ（ｘ３）およびＣＨ_２Ｃｌ_２（ｘ３）で洗浄した。
工程３：Ｆ－ｍｏｃにて保護されたビルディングブロック（４ｅｑ）の溶液に、ＮＭＰ中のＤＩＣ（４ｅｑ）およびＯｘｙｍａ（ＤＭＦ中４ｅｑ）を添加した。プレアクティベーションの２～３分後に、混合物を反応容器に注入した。得られた混合物を３０分撹拌した。
工程４：反応容器中の樹脂をＤＭＦ（ｘ３）およびＣＨ２Ｃｌ２（ｘ３）で洗浄した。
工程１－４を繰り返すことによりアミノ酸を固相支持体上に濃縮した。
ドナー基質のＮ末端アミノ酸のチオエステル化はＮ－アセチルシステアミンを用いて常法にて行った。
本実験で用いたドナー基質は：
ビオチン付加されたグリシン－Ｄ－トリプトファン－Ｄ－アルギニン－Ｄ－フェニルアラニンＳＮＡＣ体
であった。
本実験で用いたアクセプター基質は：
Ｄ－フェニルアラニン－グリシン－グリシン－Ｄ－トリプトファン－Ｄ－アルギニン－Ｄ－フェニルアラニン
であった。

３．ペプチドライゲーション（１）
図１の上段に示すドナー基質およびアクセプター基質を、酵素Ｎｓｍ１６にてライゲーションさせた。２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に２００μＭのドナー基質および８００μＭのアクセプター基質を含む反応混合物に、１．０μＭの酵素Ｎｓｍ１６を添加することにより、反応を開始させた。酵素添加後３０℃で２時間インキュベーションし、同体積の０．１％ＴＦＡを添加して反応を停止させた。同体積のメタノールで試料を希釈した後、２００００ｘｇで１０分間遠心分離した。得られた上清をポジティブモードで作動するＬＣ－ＭＳ（ａｍａＺｏｎＳＬ－ＮＰＣ）にて分析した。ＬＣ－ＭＳは島津のＨＰＬＣシステムとカップリングさせた。Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８－ＭＳ－ＩＩ２．０ｘ１５０ｍｍカラム（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ）を用いて分離を行った。移動相ＡおよびＢとして、それぞれ、水＋０．０５％ＴＦＡ、およびアセトニトリル＋０．０５％ＴＦＡを用いた。２０分かけて移動相Ｂを１０％から９０％にするグラジエントモード、流速０．２ｍｌ・ｍｉｎ^－１にて試料を溶出させた。

ＬＣ－ＭＳでの分析結果を図１の下段に示す。酵素添加系では、ドナー基質およびアクセプター基質の減少に伴って加水分解物およびライゲーションしたペプチド（図中Ｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｅと表記、保持時間約９．７分のピーク）の生成が確認された。

４．ペプチドライゲーション（２）
次に、上のペプチドライゲーション（１）で用いたドナー基質のほかに、それよりも小さいドナー基質（図２参照）を用いて、ペプチドライゲーション反応について検討した。本実験で使用した小さいドナー基質は：
ビオチン付加されたＤ－トリプトファン－Ｄ－アルギニン－Ｄ－フェニルアラニンＳＮＡＣ体
ビオチン付加されたＤ－アルギニン－Ｄ－フェニルアラニンＳＮＡＣ体
ビオチン付加されたＤ－フェニルアラニンＳＮＡＣ体
であった。
本実験で使用したアクセプター基質は、上のペプチドライゲーション（１）と同じであった。反応条件は上のペプチドライゲーション（１）と同じであった。

図２に示すＬＣ－ＭＳでの分析結果から、いずれのドナー基質を用いた場合でもライゲーション生成物が認められ（図中Ｃｏｎｊｕｇａｔｅと表記、上から保持時間約９．５分、約９．８分、約８．９分、約１０．２分のピーク）、ドナー基質が小さいほどライゲーション生成物の収率が増加する傾向が示された。ドナー基質がビオチン付加アルギニン－ＳＮＡＣ体Ｄ－フェニルアラニンの場合にライゲーション生成物の収率が最大となった。カチオン性アミノ酸残基（アルギニン）を欠くドナー基質を用いた場合は、ライゲーション生成物は得られたが僅かであった（保持時間約１０．２分のピーク）。これらの結果から、ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥは、ドナー基質中のカチオン性アミノ酸－疎水性アミノ酸モチーフを認識することが示唆された。

本発明は、ペプチド合成のための新たな酵素ツール、および新たなペプチド修飾技術を提供するので、化学、生物学、生化学、医学、薬学等の分野において利用可能である。本発明は、例えば、新薬および新たな研究試薬の開発や製造等に利用可能である。

配列番号：１は、酵素Ｎｓｍ１６をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：２は、酵素Ｎｓｍ１６のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３は、酵素Ｎｓｍ１６をコードするＤＮＡフラグメントを増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列（ＥｃｏＲＩ認識部位を含む）を示す。
配列番号：４は、酵素Ｎｓｍ１６をコードするＤＮＡフラグメントを増幅するためのリバースプライマーの塩基配列（ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を含む）を示す。
配列番号：５は、実施例で得られた組換え酵素Ｎｓｍ１６（ヒスチジンタグを含む）のアミノ酸配列を示す。

Claims

ペニシリン結合タンパク質型チオエステラーゼ（ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥ）を触媒として用いて、ドナーペプチド基質（ドナー基質）のＣ末端とアクセプターペプチド基質（アクセプター基質）のＮ末端との間にアミド結合を生じさせることを特徴とする、ライゲーションされたペプチドの製造方法。
ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥが、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する酵素であるか、あるいはその変異体酵素であり、変異体酵素が、下記アミノ酸配列のいずれか：
（ａ）配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して３８％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸配列において、数個または数十個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されているアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号：１に示す塩基配列に相補的な塩基配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
を有し、かつ配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する酵素と同等またはそれ以上のペプチドライゲーション活性を有するものである、請求項１記載の方法。
ドナー基質のＣ末端側から２番目の残基およびＣ末端残基が、それぞれ、カチオン性アミノ酸および疎水性Ｄ－アミノ酸であり、Ｃ末端疎水性Ｄ－アミノ酸のカルボキシル基が活性化されているものである、請求項１または２記載の方法。
Ｃ末端疎水性Ｄ－アミノ酸のカルボキシル基の活性化が、チオエステル型の脱離基を付与することにより行われる、請求項３記載の方法。
ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥを触媒として用いて、修飾基を含むドナー基質のＣ末端とアクセプター基質のＮ末端との間にアミド結合を生じさせることを特徴とする、修飾されたペプチドの製造方法。
ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥが、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する酵素であるか、あるいはその変異体酵素であり、変異体酵素が、下記アミノ酸配列のいずれか：
（ａ）配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して３８％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸配列において、数個または数十個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されているアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号：１に示す塩基配列に相補的な塩基配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
を有し、かつ配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する酵素と同等またはそれ以上のペプチドライゲーション活性を有するものである、請求項５記載の方法。
ドナー基質のＣ末端側から２番目の残基およびＣ末端残基が、それぞれ、カチオン性アミノ酸および疎水性Ｄ－アミノ酸であり、Ｃ末端疎水性Ｄ－アミノ酸のカルボキシル基が活性化されているものである、請求項５または６記載の方法。
Ｃ末端疎水性Ｄ－アミノ酸のカルボキシル基の活性化が、チオエステル型の脱離基を付与することにより行われる、請求項７記載の方法。
ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥを含む、ペプチドライゲーション用キット。
ＰＢＰ－ｔｙｐｅＴＥを含む、修飾されたペプチドを作成するためのキット。
修飾基を含むドナー基質をさらに含む、請求項１０記載のキット。