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JP2023550743A - Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む融合タンパク質並びに特定のタンパク質分解のためのドメインの標的化 - Google Patents

Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む融合タンパク質並びに特定のタンパク質分解のためのドメインの標的化 Download PDF

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JP2023550743A JP2023529985A JP2023529985A JP2023550743A JP 2023550743 A JP2023550743 A JP 2023550743A JP 2023529985 A JP2023529985 A JP 2023529985A JP 2023529985 A JP2023529985 A JP 2023529985A JP 2023550743 A JP2023550743 A JP 2023550743A
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Abstract

本開示は、ヒトＥ２ユビキチン又はユビキチン様ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインと、調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインと、を含む調節ドメインを含む分子を提供する。
そのような分子をコードするポリヌクレオチド、そのような分子を同定及び産生する方法、並びに使用、よりわけ、調節不全の基質によって媒介される対象の疾患及び／又は状態を治療又は予防する際の使用に適した関連する医薬組成物及びキットも提供される。

Description

ユビキチン化は、タンパク質へのユビキチンの迅速且つ可逆的な翻訳後共有結合によって特徴付けられる。この機構は、分解のためにタンパク質を標的化すること、並びにそれらの細胞内局在、細胞内シグナル伝達、及び他のタンパク質との相互作用を調節することにおいて重要な役割を果たす（非特許文献１、非特許文献２、及び非特許文献３）。
ユビキチン（Ｕｂ）は、小さな（７６アミノ酸；８．６ｋＤａ）調節タンパク質である。タンパク質へのユビキチンの付加はユビキチン化と呼ばれる。ユビキチン化は、ユビキチンＣ末端の活性化を伴う。これが起こるために、Ｅ１ Ｕｂ活性化酵素は、アデノシン三リン酸依存性反応においてＵｂとチオエステル結合を形成する。これに続いて、Ｅ２ユビキチン結合酵素（及び潜在的にＥ３～Ｕｂ中間体としてのＨＥＣＴ型Ｅ３ユビキチンリガーゼ）への結合、及び基質タンパク質へのライゲーションが行われる。ユビキチンは、（ｉ）イソペプチド結合を介したリジン残基、（ｉｉ）チオエステル結合を介したシステイン残基、（ｉｉｉ）エステル結合を介したセリン及びトレオニン残基、又は（ｉｖ）ペプチド結合を介したタンパク質のＮ末端のアミノ基によって標的基質に結合することができる。
単一のユビキチンタンパク質（モノユビキチン化）又はユビキチン鎖（ポリユビキチン化）を基質に付加することができる。ポリユビキチン鎖では、二次ユビキチン分子は、前のユビキチン分子の７つのリジン残基（例えばＫ４８又はＫ６３）又はＮ末端メチオニンのうちの１つに結合している。タンパク質へのユビキチンの付加は、プロテアソームによる分解のためにそれらを標識し、それらの細胞位置を変化させ、それらの活性に影響を与え、タンパク質相互作用を促進又は防止することによって、タンパク質の調節を可能にする。
ユビキチン様タンパク質（Ｕｂｌ）と呼ばれるユビキチンに類似したいくつかのタンパク質は、同様の機構で使用することができる。ヒトゲノムは、Ｉ型Ｕｂｌと考えられるユビキチン自体を含まないユビキチン様タンパク質の少なくとも８つのファミリをコードする。これらは、小ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、発生的にダウンレギュレートされた神経前駆細胞８（ＮＥＤＤ８）、オートファジー関連タンパク質８（ＡＴＧ８）、オートファジー関連タンパク質１２（ＡＴＧ１２）、ユビキチン関連修飾因子１（ＵＲＭ１）、ユビキチン折り畳み修飾因子１（ＵＦＭ１）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０、及びインターフェロン刺激遺伝子１５（ＩＳＧ１５）である。Ｉ型Ｕｂｌは、共有結合的コンジュゲーションが可能である。共有結合コンジュゲーションは、Ｃ末端の１～２個のグリシン残基を介して起こる。ヒトはまた、２型Ｕｂｌであるファウユビキチン様タンパク質（ＦＵＢＩ）をコードし、これは共有結合コンジュゲーションができない。ＳＵＭＯ又はＮＥＤＤ８によってタグ付けされたタンパク質は分解について認識されないが、それらは、遺伝子転写活性化、タンパク質局在化及び安定化において役割を果たす。各標的機能の組み合わせは、Ｅ１、Ｅ２及びＥ３酵素の独自の組み合わせを有する。
Ｅ２酵素は、ユビキチンを標的基質に転移するように作用し、全てが、ユビキチンコア触媒ドメイン（ＵＢＣドメイン）と呼ばれる約１５０アミノ酸のコア触媒ドメインを共有する。一般に、ドメインは、典型的には４つのαヘリックス及び４本鎖βシートを有するα／β倍をとる（非特許文献４）。重要なループ領域は、Ｅ３結合部位及びＥ２活性部位の一部を形成する。この表面は、ＲＩＮＧ－Ｅ３ドメイン及びＨＥＣＴ－Ｅ３ドメインの両方への結合に関与し、Ｅ１酵素によって認識される領域と重複する。ＵＢＣドメインは約１４～１６ｋＤａであり、異なるファミリメンバー間で約３５％保存されている（非特許文献５）。Ｅ２は、特定の系に適合した共通フォールドを有する。ほとんどのＥ２は単一の構造ＵＢＣドメインのみを包含するが、多くは、重要なＥ２特異的機能性、例えば、鎖構築Ｅ２に対する結合ユビキチンの認識を付与し得る短いＮ末端及び／又はＣ末端伸長を有する。Ｕｂｅ２Ｒ１及びＵｂｅ２Ｇ２を含むいくつかのＥ２は機能的に重要な挿入を有し、いくつかのＥ２はＵＢＣドメインに連結された追加の構造化ドメインを有する（例えば、Ｕｂｅ２Ｋ）か、又は大きなマルチドメインタンパク質の一部である（Ｕｂｅ２Ｏ又はＢＩＲＣ６）。
Ｅ２酵素は、主に、Ｅ２～Ｕｂコンジュゲートから基質へのユビキチンの転移のための２種類の反応に関与する。（１）トランスチオール化（チオエステルからチオール基への転移－例えばＨＥＣＴ型Ｅ３リガーゼの活性部位システイン残基へのユビキチンの転移）及び（２）アミノ分解（チオエステルからアミノ基への転移）が報告されているが、他のものも報告されている。（非特許文献４）。
全てのＥ２は、Ｅ１酵素及び１つ以上のＥ３と相互作用する。更に、Ｅ２は、標的タンパク質と直接係合し得（例えば、ＢＩＲＣ６及びＵＢＥ２ＯなどのＥ３／Ｅ２ハイブリッドと呼ばれるものは、Ｅ３からの支援なしにそれらの基質と相互作用し、それらの基質をユビキチン化することができるので、Ｅ３非依存性である）、したがって、標的がユビキチンによってどこでどのように修飾されるかの決定において役割を果たし得る。今日まで、Ｅ３がＥ２の化学反応性プロファイルを変化させる例はないため、所与のＥ２の固有の反応性は、その生成物の性質を予測する可能性が高い。
それらの機構的戦略に基づいて、Ｅ３は３つのファミリ、すなわちＲＩＮＧ、ＨＥＣＴ及びＲＩＮＧ－ｂｅｔｗｅｅｎ－ＲＩＮＧＳ（ＲＢＲ）に分類されている。ＲＩＮＧ／ＵボックスＥ３ユビキチンリガーゼは、基質とＥ２－Ｕｂコンジュゲートの両方に結合することができる。ＨＥＣＴ／ＲＢＲドメインＥ３リガーゼは更に、ユビキチン（Ｅ３－Ｕｂ）と中間体チオエステルを形成することができなければならない。いくつかのＥ２は、複数のタイプのＥ３と共に機能することができる。
ＨＥＣＴドメイン含有Ｅ３ユビキチンリガーゼは、Ｕｂを基質に転移する前に、その活性部位システインにＵｂ（Ｅ３～Ｕｂ）を有する中間体チオエステルを形成するが、ほとんどのＲＩＮＧフィンガードメイン含有Ｅ３酵素は、Ｅ２酵素及び基質に同時に結合する足場として作用する。
ＲＩＮＧ Ｅ３（ほとんどのＥ３）は、Ｕｂの基質への化学的転移に直接関与しない。それらは、基質及びＥ２～Ｕｂコンジュゲートに結合して、Ｅ２活性部位から基質へのＵｂの直接移動を促進する。ＲＩＮＧ Ｅ３ｓは、Ｅ２～Ｕｂコンジュゲートのタンパク質補因子として機能する。ＲＩＮＧ Ｅ３／Ｅ２～Ｕｂ複合体は動的であるが、ＲＩＮＧ Ｅ３との相互作用は、アミノ分解に対する多くの（しかし全てではない）Ｅ２～Ｕｂコンジュゲートの固有の反応性を増加させる。例えば、Ｅ２ｓのＵｂｅ２Ｄファミリは、Ｅ３の非存在下ではゆっくりとリジンと反応するが、ＲＩＮＧドメインの存在下では迅速に反応する。
Ｅ２～Ｕｂは、一般に、ＲＩＮＧ Ｅ３結合時に「閉状態」をとる。保存されたＲＩＮＧ（アロステリックリンクピン）残基、通常はアルギニン、リジン又はアスパラギンは、ループ７のＥ２骨格カルボニル及びＵｂの尾部の１つ又は複数の骨格基に水素結合を供与する。このＥ２～Ｕｂ閉状態は、アミノ分解の活性化状態と考えられる。トランスチオール化反応は、Ｅ３の非存在下で容易に起こり得る。したがって、Ｅ３～Ｕｂ共役中間体（例えば、ＨＥＣＴＥ３ｓ）で進行するＥ３は、Ｅ２～Ｕｂ閉状態を促進する必要がないと仮定される。
ユビキチン又はユビキチン様タンパク質によるその修飾を介して特定の標的を制御する能力は、タンパク質機能の研究及び疾患との戦いにおいて潜在的な有用性を有することが理解されよう。
ＰＲＯｔｅｏｌｙｓｉｓ－ＴＡｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒａｓ（ＰＲＯＴＡＣ）は、ユビキチン－プロテアソーム経路を利用し、標的タンパク質とＥ３リガーゼとの同時結合を通じて作動する翻訳後様式でのタンパク質の時間的に制御された除去を可能にする操作された化学的実体である。ＰＲＯＴＡＣ分子は、標的タンパク質をＥ３ユビキチンリガーゼと接触させ、Ｅ２ユビキチン結合酵素からのユビキチンの転移を促進し、標的タンパク質のユビキチン化及びプロテアソームによる分解をもたらす。ＰＲＯＴＡＣは、創薬及び新しい治療法の開発における用途のために、以前は「薬になり得なかった」タンパク質を標的とする大きな可能性を有する（非特許文献６）。第一世代のＰＲＯＴＡＣは、Ｅ３リガーゼβ－ＴＲＣＰに結合するホスホペプチドと、ＭｅｔＡＰ－２を標的とする小分子オバリシンとを含むペプチドベースのＰＲＯＴＡＣであった（非特許文献６）。それ以来、小分子ＰＲＯＴＡＣ、ＭＤＭ２ベースのＰＲＯＴＡＣ、ＩＡＰベースのＰＲＯＴＡＣ、ＣＲＢＮベースのＰＲＯＴＡＣ及びＶＨＬベースのＰＲＯＴＡＣが開発されている。例えばアンドロゲン受容体（非特許文献７）、サイクリン依存性キナーゼ９（非特許文献８及び非特許文献９）、及びｃ－Ｍｅｔを標的とする３０を超える小分子ＰＲＯＴＡＣが報告されており、標的タンパク質の分解は、効力、選択性、及び薬物耐性に関して、阻害よりもいくつかの利点を提供する（非特許文献１０）。
一連の生物学的ＰＲＯＴＡＣも開発されている。例えば、非特許文献１１は、Ｅ３ユビキチンリガーゼの活性を、単鎖Ｆｖイントラボディ又はフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）モノボディなどのデザイナー結合タンパク質と組み合わせる操作されたタンパク質キメラである、いわゆるユビキボディを記載している。非特許文献１２は、変異ＫＲＡＳ分解を特異的に誘導し、膵臓腫瘍の成長を強力に阻害する組換えキメラタンパク質を開発した。キメラタンパク質は、Ｒａｆ１のＲａｓ結合ドメイン（ＲＢＤ）及びＥ３アダプタータンパク質を含む。非特許文献１３は、ユビキチン化及びプロテアソーム分解のために内因性標的タンパク質を選択的に結合し、ＣＵＬ２－Ｅ３リガーゼ複合体に動員するポリペプチドバインダーにつながれた、Ｃｕｌｌｉｎ２（ＣＵＬ２）Ｅ３リガーゼ複合体の基質受容体であるフォンヒッペル・リンダウ（ＶＨＬ）タンパク質を保有する親和性指向タンパク質ミサイル（ＡｄＰＲＯＭシステム）を記載している。別の生物学に基づく分解系は、非特許文献１４によって開発されたいわゆるＴｒｉｍ－Ａｗａｙ技術であり、これは、抗体のＦｃドメインに高親和性で結合するＥ３ユビキチンリガーゼであるＴＲＩＭ２１を含む。
しかしながら、ＰＲＯＴＡＣ技術がオフターゲット効果、インビボ代謝安定性、細胞透過性、及び高分子量など、臨床用途のために成熟する前に、様々な問題が存在している。このような二機能性分子を合成及び最適化することも困難であり、これらは研究及び製造における重要な障害である。したがって、更なるそのような二官能性分子が依然として必要とされている。
Ｇｌｉｃｋｍａｎ ａｎｄ Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ ２００２，８２（２）：３７３－４２８ Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ ａｎｄ Ｒｉｅｚｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００７，３１５（５８０９）：２０１－５ Ｓｃｈｎｅｌｌ ａｎｄ Ｈｉｃｋｅ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３，２７８（３８）：３５８５７－６０ Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２０１６，２６：４２３ Ｄｉｋｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９，１０：６５９－６７１ Ｓｃｈｎｅｅｋｌｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔｅｒ ２００８，１８（２２）：５９０４－０８ Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０１８，１４（２）：１６３－７０ Ｒｏｂｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１７，５３（５４）：７５７７－８０ Ｂｕｒｓｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０１８，２５（１）：６７－７７ Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１６，７（２８）：４４２９９－４４３０９ Ｐｏｒｔｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８９（１１）：７８４４－５） Ｐａｎ ｅｔ ａｌ（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７（２８）：４４２９９－４４３０９） Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ ７：１７００６６） Ｃｌｉｆｔ ｅｔ ａｌ（Ｃｅｌｌ ２０１７，１７１（７）：１６９２－１７０６）
Ｅ３ユビキチンリガーゼを必要とする全ての既知の生物学的ＰＲＯＴＡＣにもかかわらず、驚くべきことに、予想外に、本発明者らは、ユビキチン又はユビキチン様タンパク質経路を介したタンパク質の標的化分解又は調節を提供することができるＥ２酵素を含有する新規なクラスの分子を同定した。そのような分子は、産生がより簡単であり、より小さく、送達がより容易であり、内因性タンパク質にあまり依存せず、調節がより容易であり、より広範な標的セットに到達し得る。
本明細書で提供されるのは、分子であって、（ａ）ヒトＥ２酵素又はその機能的部分と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメイン、及び（ｂ）調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインを含む、分子である。ある特定の実施形態において、その分子は、Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分を含まない。いくつかの実施形態では、分子は融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、調節ドメインは標的化ドメインに対してＮ末端にある。他の実施形態では、調節ドメインは、標的化ドメインのＣ末端である。
前述の分子と、分子を細胞に標的化することができる標的化部分とを含む化合物を、本明細書中に更に提供する。個体において分子を送達するための医薬品の製造における、（ｉ）前述の分子及び（ｉｉ）分子を細胞に標的化することができる標的化部分を含む化合物の使用が、本明細書中に更に提供される。
本開示は、前述の分子又は前述の化合物をコードするポリヌクレオチドを更に提供する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターなどの前述のポリヌクレオチドを含むベクターを、本明細書中に更に提供する。ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を、本明細書中に更に提供する。前述の分子又は前述の化合物と更なる治療薬とを含む組成物を、本明細書中に更に提供する。
前述の分子、前述の化合物、前述のポリヌクレオチド、前述のベクター、前述の宿主細胞、又は前述の組成物、及び１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物が、本明細書中に更に提供される。
本開示の別の態様は、前述の分子を個体の細胞に送達する方法を提供し、該方法は、該個体に、（ｉ）該分子及び（ｉｉ）該分子を該細胞に標的化することができる標的化部分を含む化合物を投与することと、又は個体に前述のポリヌクレオチド若しくはベクターを投与することとを含み、ここで、ポリヌクレオチド若しくはベクターは細胞中の分子をコードする。
本開示の別の態様は、（ａ）ヒトＥ２酵素又はその機能的部分に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメインと、（ｂ）調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインと、を含み、場合により、キットは、Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分を含まない、キット・オブ・パーツを提供する。
更に、本明細書では、（ａ）前述の分子と、（ｂ）調節される基質を含有する細胞を標的とすることができる標的化部分と、を含むキット・オブ・パーツであって、場合により、標的化部分が、抗体などの結合パートナーである、キット・オブ・パーツが提供される。
被験体において異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療する方法であって、前述の分子、前述の化合物、前述のポリヌクレオチド、前述のベクター、前述の宿主細胞、前述の医薬組成物又は前述の組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書中に更に提供される。 被験体において異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療するのに使用するための前述の分子、前述の化合物、前述のポリヌクレオチド、前述のベクター、前述の宿主細胞、前述の医薬組成物、又は前述の組成物が、本明細書中に更に提供される。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、癌、糖尿病、自己免疫疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、疼痛、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン病、真菌性疾患、寄生虫性疾患、関節炎、免疫不全又は炎症性疾患である。
基質を調節する方法であって、分子が基質を調節するのに有効な条件下で基質を前述の分子と接触させることを含む方法が、本明細書で更に提供される。いくつかの実施形態では、調節することは、基質が分解されること、又は基質が分解されることが防止されること、又は基質の細胞内位置が変更されること、又は基質の１つ若しくは複数の活性が調節されること（例えば、増加又は減少）、又は基質の翻訳後修飾の程度が調節されることを含む。
基質を潜在的な薬物標的として同定する方法であって、（ａ）基質を含む細胞、組織又は器官を提供することと、（ｂ）細胞、組織又は器官を前述の分子、前述の化合物、前述のポリヌクレオチド又は前述のベクターと接触させることと、（ｃ）細胞、組織又は器官の１以上の特性に対する分子、化合物、ポリヌクレオチド又はベクターの効果を評価することと、を含み、特定の疾患状態と相関する効果の同定が、基質が特定の疾患に対する潜在的な薬物標的であることを示す、方法が本明細書で更に提供される。
基質の機能を評価する方法であって、（ａ）基質を含む細胞、組織又は器官を提供することと、（ｂ）細胞、組織又は器官を前述の分子、前述の化合物、前述のポリヌクレオチド又は前述のベクターと接触させることと、（ｃ）細胞、組織又は器官の１以上の特性に対する分子、化合物、ポリヌクレオチド又はベクターの効果を評価することと、を含む方法が本明細書で更に提供される。
異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療するのに有用であり得る試験剤を同定する方法であって、基質を提供することと、（ａ）ヒトＥ２ユビキチン又はユビキチン様ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメイン、及び（ｂ）調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインを含む試験剤を提供することであって、任意で、試験剤は、Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその一部を含まない、ことと、基質の調節を容易にするために、試験剤に有効な条件下で基質と試験剤とを接触させることと、試験剤が基質を調節するかどうかを決定することとを含む、方法は本明細書で更に提供される。いくつかの態様において、方法は、疾患又は状態のアッセイにおいて試験剤を試験する工程を更に含む。
Ｅ３融合ポリペプチドとＥ２融合ポリペプチドとを比較するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＳＨＰ２タンパク質の分解の図である。図１Ａは、コードされたコントロール及び融合ポリペプチド構築物のレンチウイルス形質導入後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞溶解物のウエスタンブロットの図である。ＳＨＰ２及び負荷対照アルファチューブリンを示す。ＳＨＰ２タンパク質レベルが低下している、Ｅ２融合ポリペプチドＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３の２つの複製試料。ブラックボックスはＥ３リガーゼ融合ポリペプチドを形質導入された細胞からの溶解物を特定し、灰色のボックスはＥ２融合ポリペプチド構築物を特定する。図１Ｂは、ウエスタンブロットのシグナルのデンシトメトリーを示すグラフである。ＳＨＰ２タンパク質レベルのバンド密度を、アルファチューブリン負荷対照バンド密度に対して正規化し、次いで、対照ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞ＳＨＰ２レベルのパーセンテージとして表した。データは、複数の細胞株における複数の反復を表す。 Ｅ３リガーゼ及びＥ２生物学的融合ポリペプチドにおける配向及びリンカー長を比較する、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＳＨＰ２タンパク質の分解。図２Ａは、コードされたコントロール及び融合ポリペプチド構築物のレンチウイルス形質導入後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞溶解物のウエスタンブロットの図である。ＳＨＰ２タンパク質及びＧＡＰＤＨ負荷対照を示す。ブラックボックスはＥ３リガーゼ融合ポリペプチドを形質導入された細胞からの溶解物を特定し、灰色のボックスはＥ２融合ポリペプチド構築物を特定する。図２Ｂは、ウエスタンブロットのシグナルのデンシトメトリーを示すグラフである。ＳＨＰ２タンパク質レベルのバンド密度を、ＧＡＰＤＨ負荷対照バンド密度に対して正規化し、次いで、対照ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞ＳＨＰ２レベルのパーセンテージとして表した。ＵＢＥ２Ｄ１調節ドメイン構築物は、より短い名称Ｅ２Ｄ１を使用している。サンプル名の中で、「短い」及び「長い」は、それぞれ９アミノ酸及び１９アミノ酸の異なるリンカー長を指す。 Ｅ３リガーゼ及びＥ２生物学的融合ポリペプチドにおける配向及びリンカー長を比較する、Ｕ２０Ｓ細胞におけるＳＨＰ２タンパク質の分解の図である。図３Ａは、コードされたコントロール及び融合ポリペプチド構築物のレンチウイルス形質導入後のＵ２０Ｓ細胞溶解物のウエスタンブロットの図である。ＳＨＰ２タンパク質及びＧＡＰＤＨ負荷対照を示す。ブラックボックスはＥ３リガーゼ融合ポリペプチドを形質導入された細胞からの溶解物を特定し、灰色のボックスはＥ２融合ポリペプチド構築物を特定する。図３Ｂは、ウエスタンブロットのシグナルのデンシトメトリーを示すグラフである。ＳＨＰ２タンパク質レベルのバンド密度を、ＧＡＰＤＨ負荷対照バンド密度に対して正規化し、次いで、対照Ｕ２０Ｓ細胞ＳＨＰ２レベルのパーセンテージとして表した。ＵＢＥ２Ｄ１調節ドメイン構築物は、より短い名称Ｅ２Ｄ１を使用している。サンプル名の中で、「短い」及び「長い」は、それぞれ９アミノ酸及び１９アミノ酸の異なるリンカー長を指す。図３Ｃは、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（Ｂｉｏｔｅｋ（登録商標））によるイメージング後の蛍光シグナルに基づくＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ＿ａＣＳ３（ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ＿ａＣＳ３）構築物を使用したＳＨＰ２分解の異なるリンカー長及び効率を比較するグラフである。ＳＨＰ２及びＨＡタグタンパク質レベルの蛍光強度を、これらのエピトープに特異的な抗体を使用してプローブし、ＳＨＰ２レベルを、各実験内の未処理細胞内に見出されるＳＨＰ２レベルに基づいて０～１００％の範囲に正規化した。データは、ｎ＝３以上の生物学的反復に対応する。リンカー長の残基の数は、リンカー配列中のアミノ酸の数を指す。 結合ドメインとしてのＳＨＰ２結合モノボディの高親和性バリアント及び低親和性バリアントを比較する、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＳＨＰ２タンパク質の分解の図である。ＳＨＰ２に対する高親和性を有する標準的なａＣＳ３モノボディ（ＳＨＰ２Ｃ－ＳＨ２ドメインＫｄ＝４－９．１ｎＭ）を、より低い親和性を有するＶ３３Ｒ ａＣＳ３変異体（ＳＨＰ２ Ｃ－ＳＨ２ドメインＫｄ＝１．２μＭ）と比較した。Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国特許出願公開第２０１３１１０（３７）号：１４９２４－９及び補足情報）。注：モノボディａＣＳ３は、本明細書ではＣＳ３とも呼ばれる。図４Ａは、ａＣＳ３及びａＣＳ３ Ｖ３３Ｒ変異体結合ドメインを有するコードされた対照及び融合ポリペプチド構築物のレンチウイルス形質導入後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞溶解物のウエスタンブロットの図である。ＳＨＰ２タンパク質及びＧＡＰＤＨ負荷対照を示す。ブラックボックスはＥ３リガーゼ融合ポリペプチドを形質導入された細胞からの溶解物を特定し、灰色のボックスはＥ２融合ポリペプチド構築物を特定する。ウエスタンブロットには、Ｅ２Ｄ１＿ｌｏｎｇ＿ａＣＳ３の２つの複製サンプルが存在する。図４Ｂは、ウエスタンブロットのシグナルのデンシトメトリーを示すグラフである。ＳＨＰ２タンパク質レベルのバンド密度を、ＧＡＰＤＨ負荷対照バンド密度に対して正規化し、次いで、対照ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞ＳＨＰ２レベルのパーセンテージとして表した。ＵＢＥ２Ｄ１調節ドメイン構築物は、より短い名称Ｅ２Ｄ１を使用している。サンプル名の中で、「長い」は、調節ドメインと結合ドメインとの間の１９アミノ酸リンカーを指す。 結合ドメインとしてのＳＨＰ２結合モノボディの高親和性バリアント及び低親和性バリアントを比較する、Ｕ２０Ｓ細胞におけるＳＨＰ２タンパク質の分解の図である。ＳＨＰ２に対する高親和性を有する標準的なａＣＳ３モノボディ（ＳＨＰ２Ｃ－ＳＨ２ドメインＫｄ＝４－９．１ｎＭ）を、より低い親和性を有するＶ３３Ｒ ａＣＳ３変異体（ＳＨＰ２ Ｃ－ＳＨ２ドメインＫｄ＝１．２μＭ）と比較した。Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国特許出願公開第２０１３１１０（３７）号：１４９２４－９及び補足情報）。注：モノボディａＣＳ３は、本明細書ではＣＳ３とも呼ばれる。図５Ａは、ａＣＳ３及びａＣＳ３ Ｖ３３Ｒ変異体結合ドメインを有するコードされた対照及び融合ポリペプチド構築物のレンチウイルス形質導入後のＵ２０Ｓ細胞溶解物のウエスタンブロットの図である。ＳＨＰ２タンパク質及びＧＡＰＤＨ負荷対照を示す。ブラックボックスはＥ３リガーゼ融合ポリペプチドを形質導入された細胞からの溶解物を特定し、灰色のボックスはＥ２融合ポリペプチド構築物を特定する。図５Ｂは、ウエスタンブロットのシグナルのデンシトメトリーを示すグラフである。ＳＨＰ２タンパク質レベルのバンド密度を、ＧＡＰＤＨ負荷対照バンド密度に対して正規化し、次いで、対照Ｕ２０Ｓ細胞ＳＨＰ２レベルのパーセンテージとして表した。ＵＢＥ２Ｄ１調節ドメイン構築物は、より短い名称Ｅ２Ｄ１を使用している。サンプル名の中で、「長い」は、調節ドメインと結合ドメインとの間の１９アミノ酸リンカーを指す。 Ｋ１９ ＤＡＲＰｉｎ＿Ｅ２融合ポリペプチド及びＫ１９ ＤＡＲＰｉｎ＿Ｅ３融合ポリペプチドを使用したＫＲａｓの分解の比較の図である。ＤＡＲＰｉｎ Ｋ１９は、ＧＤＰ及びＧＴＰ結合ＫＲＡＳ（Ｂｅｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１９１０（１）：２６０７）の両方に結合するが、Ｅ３＿５は陰性対照（非結合）ＤＡＲＰｉｎである。ＤＡＲＰｉｎ融合ポリペプチド構築物をＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡｄ２９３細胞株の両方で試験した。図６Ａは、コードされたコントロール及び融合ポリペプチド構築物のレンチウイルス形質導入後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡｄ２９３細胞溶解物のウエスタンブロットの図である。ＫＲａｓタンパク質及びαチューブリン負荷対照タンパク質を示す。ブラックボックスはＥ３リガーゼ融合ポリペプチドを形質導入された細胞からの溶解物を特定し、灰色のボックスはＥ２融合ポリペプチド構築物を特定する。図６Ｂは、ウエスタンブロットのシグナルのデンシトメトリーを示すグラフである。ＫＲＡＳタンパク質レベルのバンド密度をαチューブリン負荷対照バンド密度に正規化し、次いで対照ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＡｄ２９３細胞ＫＲＡＳレベルのパーセンテージとしてそれぞれ表した。 Ｅ３及びＥ２融合ポリペプチドの概略図である。図７Ａは、リンカーを介して結合ドメインに融合されたＥ３リガーゼＶＨＬを含むＥ３生物学的融合ポリペプチドの例を示す図である。Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１７，Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ ７：１７００６６）によって以前に記載されたように。結合ドメイン（例えば、モノボディ、ナノボディ又は抗体模倣物）は、細胞内の標的タンパク質（内因性タンパク質又はウイルスタンパク質などの非内因性若しくは異所性発現タンパク質）をＥｌｏＢ／Ｃ／ＣＵＬ２／ＲＢＸ１ Ｅ３リガーゼ機構に動員することができる。次いで、この複合体は、ユビキチンの標的タンパク質への転移を可能にするＥ２結合酵素に結合する。鎖を形成する複数のユビキチン分子の付加は、ポリユビキチン化と呼ばれ、プロテアソームによる分解のために標的タンパク質を標識する。代替的なＥ３リガーゼ融合ポリペプチドは、標的タンパク質のユビキチン化を可能にするために異なるタンパク質の関与を必要とし得る。図７Ｂは、リンカーを介してコンジュゲートドメインに直接融合されたＥ２ユビキチンコンジュゲートドメインを含むＥ２生物学的融合ポリペプチドの例の図である。コンジュゲートドメイン（例えば、モノボディ、ナノボディ又は抗体模倣物）は、細胞内の標的タンパク質（内因性タンパク質又はウイルスタンパク質などの非内因性若しくは異所性発現タンパク質）に結合して、Ｅ２ユビキチンコンジュゲートドメインが標的タンパク質にユビキチンを転移させることを可能にすることができる。標的タンパク質のポリユビキチン化は、プロテアソームによる標的タンパク質の分解をもたらす。これらの例において、Ｅ２ユビキチンコンジュゲートドメインがユビキチン様コンジュゲートドメインによって置き換えられたならば、ユビキチンが標的タンパク質に転移するのではなく、ユビキチン様分子が標的タンパク質（例えば、ＳＵＭＯ、ＮＥＤＤ８、ＲＵＢ１、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、ＩＳＧ１５、ＦＡＵ、又はＵＲＭ１）に転移されるであろう。 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における、ａＣＳ３コンジュゲートドメインに融合されたＥ２ユビキチンコンジュゲート酵素及びＥ２ユビキチン様コンジュゲート酵素コアドメインのパネルのＳＨＰ２タンパク質発現に対する効果の調査の図である。２６個の異なるＥ２ユビキチン結合酵素及びＥ２ユビキチン様結合酵素コアドメインを、融合タンパク質として、ＨＡタグ＿Ｅ２＿Ｌｉｎｋｅｒ＿ａＣＳ３の形式でレンチウイルスプラスミド上にコードした。次いで、レンチウイルス粒子を作製し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を形質導入するために使用した。図８Ａは、コードされた対照及びＥ２融合構築物のパネルのレンチウイルス形質導入後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞溶解物のウエスタンブロットの図である。ウエスタンブロットを、ＳＨＰ２、ＨＡタグ（融合タンパク質の発現レベルを示す）及びアルファチューブリン（ローディング対照として）に対する抗体でプローブした。ＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３融合タンパク質をコードするレンチウイルス粒子で形質導入されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞からのタンパク質溶解物を、比較目的のために各別個のゲル上で泳動した。図８Ｂは、ＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３融合ポリペプチドで観察されたＳＨＰ２分解と比較して、各Ｅ２コアドメイン融合タンパク質で観察されたＳＨＰ２タンパク質の量を示すグラフである。値を、ウエスタンブロットのシグナルのデンシトメトリーを使用して計算した。ＳＨＰ２タンパク質レベルのバンド密度をαチューブリン負荷対照バンド密度に正規化し、次いで、ＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３融合ポリペプチドをコードするレンチウイルス粒子で形質導入した細胞について観察されたＳＨＰ２レベルのパーセンテージとして表した。目的のコアドメインは、ＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３と同様又はより大きな程度までＳＨＰ２タンパク質レベルを低下させることができるものであった。 Ｕ２０Ｓ細胞における、ａＣＳ３コンジュゲートドメインに融合されたＥ２ユビキチンコンジュゲート酵素及びＥ２ユビキチン様コンジュゲート酵素コアドメインのパネルのＳＨＰ２タンパク質発現に対する効果の調査の図である。２６個の異なるＥ２ユビキチン結合酵素及びＥ２ユビキチン様結合酵素コアドメインを、融合タンパク質として、ＨＡタグ＿Ｅ２＿Ｌｉｎｋｅｒ＿ａＣＳ３の形式でレンチウイルスプラスミド上にコードした。次いで、レンチウイルス粒子を作製し、Ｕ２０Ｓ細胞を形質導入するために使用した。図９Ａは、コードされた対照及びＥ２融合構築物のパネルのレンチウイルス形質導入後のＵ２０Ｓ細胞溶解物のウエスタンブロットの図である。ウエスタンブロットを、ＳＨＰ２、ＨＡタグ（融合タンパク質の発現レベルを示す）及びアルファチューブリン（ローディング対照として）に対する抗体でプローブした。ＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３融合タンパク質をコードするレンチウイルス粒子で形質導入されたＵ２０Ｓ細胞からのタンパク質溶解物を、比較目的のために各別個のゲル上で泳動した。図９Ｂは、ＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３融合ポリペプチドで観察されたＳＨＰ２分解と比較して、各Ｅ２コアドメイン融合タンパク質で観察されたＳＨＰ２タンパク質の量を示すグラフである。値を、ウエスタンブロットのシグナルのデンシトメトリーを使用して計算した。ＳＨＰ２タンパク質レベルのバンド密度をαチューブリン負荷対照バンド密度に正規化し、次いで、ＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３融合ポリペプチドをコードするレンチウイルス粒子で形質導入した細胞について観察されたＳＨＰ２レベルのパーセンテージとして表した。目的のコアドメインは、ＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３と同様又はより大きな程度までＳＨＰ２タンパク質レベルを低下させることができるものであった。 ＳＨＰ２の分解及び融合ポリペプチドの発現レベルに対する、ａＣＳ３結合ドメイン内のリジン残基の変異の影響の調査の図である。ａＣＳ３モノボディは、３つのリシン残基（Ｋ７、Ｋ５５及びＫ６４）を含有し、Ｅ２ユビキチン結合酵素との融合タンパク質として発現された場合、（自己）ユビキチン化及び分解を起こしやすい。３つのａＣＳ３リジン残基を個別に組み合わせて変異させ、ＨＡタグ＿Ｅ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ＿ａＣＳ３フォーマットのＵＢＥ２Ｄ１融合ポリペプチドの結合ドメインとして細胞で発現させた。社内で行われた構造モデリングは、どのアミノ酸残基の変化がモノボディ安定性を保持すべきかを示した。リジン残基Ｋ７をグルタミン（Ｋ７Ｑ）に変異させた。リジン残基Ｋ５５をチロシン（Ｋ５５Ｙ）に変異させ、リジン残基Ｋ６４をヒスチジン（Ｋ６４Ｈ）に変異させた。これらのａＣＳ３バリアントを含有する融合ポリペプチドを発現する細胞におけるＳＨＰ２分解及び融合ポリペプチド発現に対する効果を、それぞれＳＨＰ２タンパク質及びＨＡタグ発現レベルについてのウエスタンブロット探査によって測定した。図１０Ａは、コードされた対照及びリジン変異ａＣＳ３バリアント融合ポリペプチド構築物のレンチウイルス形質導入後のＵ２０Ｓ細胞溶解物のウエスタンブロットの図である。ウエスタンブロットを、ＳＨＰ２、ＨＡタグ（融合タンパク質の発現レベルを示す）及びアルファチューブリン（ローディング対照として）に対する抗体でプローブした。図１０Ｂは、ウエスタンブロットのシグナルのデンシトメトリーを示すグラフである。ＳＨＰ２タンパク質レベルのバンド密度を、アルファチューブリン負荷対照バンド密度に対して正規化し、次いで、対照Ｕ２０Ｓ細胞ＳＨＰ２レベルのパーセンテージとして表した。図１０Ｃは、ウエスタンブロットのシグナルのデンシトメトリーを示すグラフである。ＨＡタグ付き融合ポリペプチドレベルのバンド密度をαチューブリン負荷対照バンド密度に対して正規化し、次いで、ＨＡタグ付きＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３（ＷＴ）レベルのパーセンテージとして表した。図１０が続く。融合ポリペプチドのＵＢＥ２Ｄ１又はＵＢＥ２Ｂ調節ドメインの触媒部位を変異させるか、又は標的タンパク質に対する結合ドメイン親和性を低下させると、標的タンパク質の分解が低下する。図１０Ｄは、Ｕ２０Ｓ細胞を、ＳＨＰ２標的化融合ポリペプチドのバリアントをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトし（全てのリジンが除去されたａＣＳ３結合ドメイン、すなわちＫ７Ｑ、Ｋ５５Ｙ、Ｋ６４Ｈを使用すること）、標的ＳＨＰ２タンパク質レベルを、２４時間のインキュベーション後にウエスタンブロッティングによって決定することを示す図である。Ｕ２０Ｓ細胞に、対照としてＥＧＦＰをコードするｍＲＮＡ（非分解ｍＲＮＡ）をトランスフェクトした。バリアントには、（ｉ）調節ドメイン、例えばＵＢＥ２Ｄ１（Ｃ８５Ａ）及びＵＢＥ２Ｂ（Ｃ８８Ａ）の触媒システイン残基を変異させることと、（ｉｉ）ａＣＳ３のＶ３３Ｒ変異によりＳＨＰ２に対する結合ドメイン親和性を低下させることと、（ｉｉｉ）活性に対する効果を決定するためにＥ３リガーゼとの相互作用に関与するＵＢＥ２Ｄ１残基を変異させることと、が含まれた（すなわちＦ６２Ａ）。図１０Ｅは、ＵＢＥ２Ｄ１融合ポリタンパク質について、図１０Ｆは、ＵＢＥ２Ｂ融合ポリタンパク質について、ＥＧＦＰでトランスフェクトしたＵ２０Ｓ細胞における、ローディング対照レベルに対するウエスタンブロット帯域強度のデンシトメトリー測定からのＳＨＰ２発現レベルの定量化及びＳＨＰ２レベルに対しての正規化の図である。 ＨｕＲを標的とするＶＨＨナノボディ（ＨｕＲ８及びＨｕＲ１７）結合ドメインを含むＵＢＥ２Ｄ１融合物を使用した、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるヒト抗原Ｒ（ＨｕＲ）の分解の調査の図である。ＨｕＲは、主に核タンパク質である。Ｃａｓ９ＶＨＨナノボディ結合ドメインを有する対照ＵＢＥ２Ｄ１融合タンパク質が含まれる。Ｃａｓ９は細菌タンパク質であるため、哺乳動物細胞では内因的に発現されない。したがって、Ｃａｓ９ＶＨＨナノボディは、哺乳動物細胞中のいかなるタンパク質にも選択的に結合すべきではない。両方の方向の融合構築物について、ＨｕＲタンパク質レベルに対する効果を調査した。図１１Ａは、コードされた対照（ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｃａｓ９ＶＨＨ）及びＨｕＲ結合バリアント融合ポリペプチド構築物、ＵＢＥ２Ｄ１＿ＨｕＲ１７及びＵＢＥ２Ｄ１＿ＨｕＲ８のレンチウイルス形質導入後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞溶解物のウエスタンブロットの図である。ウエスタンブロットを、（ローディングコントロールとしての）ＨｕＲ及びアルファチューブリンに対する抗体によりプローブ探査した。図１１Ｂは、ウエスタンブロットのシグナルのデンシトメトリーを示すグラフである。ＨｕＲタンパク質レベルのバンド密度をαチューブリン負荷対照バンド密度に正規化し、次いで、ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｃａｓ９ＶＨＨを発現する細胞について観察されたＨｕＲレベルのパーセンテージとして表した。図１１Ｃは、コードされた対照（Ｃａｓ９ＶＨＨ＿ＵＢＥ２Ｄ１）及びＨｕＲ結合バリアント融合ポリペプチド構築物、ＨｕＲ１７＿ＵＢＥ２Ｄ１及びＨｕＲ８＿ＵＢＥ２Ｄ１のレンチウイルス形質導入後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞溶解物のウエスタンブロットの図である。ウエスタンブロットを、（ローディングコントロールとしての）ＨｕＲ及びアルファチューブリンに対する抗体によりプローブ探査した。図１１Ｄは、ウエスタンブロットのシグナルのデンシトメトリーを示すグラフである。ＨｕＲタンパク質レベルのバンド密度をαチューブリン負荷対照バンド密度に正規化し、次いで、Ｃａｓ９ＶＨＨ＿ＵＢＥ２Ｄ１を発現する細胞について観察されたＨｕＲレベルのパーセンテージとして表した。 ＨｕＲを標的とするＶＨＨナノボディ（ＨｕＲ８及びＨｕＲ１７）結合ドメインを含むＵＢＥ２Ｄ１融合物を使用した、Ｕ２０Ｓ細胞におけるヒト抗原Ｒ（ＨｕＲ）の分解の調査の図である。ＨｕＲは、主に核タンパク質である。Ｃａｓ９ＶＨＨナノボディ結合ドメインを有する対照ＵＢＥ２Ｄ１融合タンパク質が含まれる。Ｃａｓ９は細菌タンパク質であるため、哺乳動物細胞では内因的に発現されない。したがって、Ｃａｓ９ＶＨＨナノボディは、哺乳動物細胞中のいかなるタンパク質にも選択的に結合すべきではない。両方の方向の融合構築物について、ＨｕＲタンパク質レベルに対する効果を調査した。図１２Ａは、コードされた対照（ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｃａｓ９ＶＨＨ）及びＨｕＲ結合バリアント融合ポリペプチド構築物、ＵＢＥ２Ｄ１＿ＨｕＲ１７及びＵＢＥ２Ｄ１＿ＨｕＲ８のレンチウイルス形質導入後のＵ２０Ｓ細胞溶解物のウエスタンブロットの図である。ウエスタンブロットを、（ローディングコントロールとしての）ＨｕＲ及びアルファチューブリンに対する抗体によりプローブ探査した。図１２Ｂは、ウエスタンブロットのシグナルのデンシトメトリーを示すグラフである。ＨｕＲタンパク質レベルのバンド密度をαチューブリン負荷対照バンド密度に正規化し、次いで、ＵＢＥ２Ｄ１ Ｃａｓ９ＶＨＨを発現する細胞について観察されたＨｕＲレベルのパーセンテージとして表した。図１２Ｃは、コードされた対照（Ｃａｓ９ＶＨＨ＿ＵＢＥ２Ｄ１）及びＨｕＲ結合バリアント融合ポリペプチド構築物、ＨｕＲ１７＿ＵＢＥ２Ｄ１及びＨｕＲ８＿ＵＢＥ２Ｄ１のレンチウイルス形質導入後のＵ２０Ｓ細胞溶解物のウエスタンブロットの図である。ウエスタンブロットを、（ローディングコントロールとしての）ＨｕＲ及びアルファチューブリンに対する抗体によりプローブ探査した。図１２Ｄは、ウエスタンブロットのシグナルのデンシトメトリーを示すグラフである。ＨｕＲタンパク質レベルのバンド密度をαチューブリン負荷対照バンド密度に正規化し、次いで、Ｃａｓ９ＶＨＨ＿ＵＢＥ２Ｄ１を発現する細胞について観察されたＨｕＲレベルのパーセンテージとして表した。 ＨＰＡＣ細胞株におけるＫＲａｓの分解についての異なる分解ドメインを比較するグラフである。ＨＰＡＣ膵臓癌細胞株を、（ＫＲａｓ結合ＤＡＲＰｉｎ Ｋ１９を使用して）ＫＲａｓを標的化するＰＲＯＴＡＣをコードするレンチウイルスで形質導入した。以下の分解ドメインを含有するＰＲＯＴＡＣを調査した。ＵＢＥ２Ｄ１（Ｅ２Ｄ１）、ＵＢＥ２Ｂ（Ｅ２Ｂ）及びＶＨＬ。ＫＲａｓ標的化ＰＲＯＴＡＣを、「結合ドメイン＿調節ドメイン」及び「調節ドメイン＿結合ドメイン」の両方の向きで試験した。陰性対照ＤＡＲＰｉｎ Ｅ３＿５を、以下の向きの様々な分解ドメインと組み合わせて陰性対照結合ドメインとして使用した：Ｅ３＿５＿調節ドメイン。図１３Ａは、レンチウイルスＰＲＯＴＡＣ構築物で形質導入された細胞溶解物におけるＫＲａｓ及びローディングコントロールのアルファチューブリン発現のウエスタンブロットの図である。図１３Ｂは、ＫＲａｓ及びαチューブリン発現のウエスタンブロット濃度測定を用いたＫＲａｓ発現の定量グラフである。データは、未処理細胞単独対照と比較して示され、αチューブリン負荷対照レベルに対して正規化されている。
本開示は、標的化部分及び調節ドメインを含む分子を使用する標的化タンパク質調節、並びにタンパク質機能を研究し、疾患に対抗するためのそのような調節の使用に関する。特に、本開示の第１の態様は、（ａ）ヒトＥ２酵素又はその機能的部分に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメインと、（ｂ）調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインと、を含む分子を提供する。
「分子」という用語は、本明細書で定義される調節ドメイン及び標的化ドメインを有する任意の実体の意味を含む。好ましい実施形態では、分子はポリペプチドである。いくつかの実施形態では、調節ドメイン及び標的化ドメインは、ポリペプチドリンカーを介して結合している。好ましくは、分子はポリペプチドであり、調節ドメイン及び標的化ドメインは、本明細書に更に記載されるように、ポリペプチドリンカーを介して結合している。
調節ドメイン及び標的化ドメインへの言及は、本明細書で説明される調節及び標的化のそれぞれの機能を有する分子の個別の部分を単に指すことが理解されよう。このようにして、本開示の分子は、典型的には適切な長さのリンカーによって連結された２つのタンパク質結合ドメインを含む二機能性分子であると考えることができる。ドメインの異なるそれぞれの機能を考えると、分子は一般にヘテロ二官能性であることが理解されよう。
調節ドメインとは、本発明者らは、標的基質の１つ以上の活性を調節すること、及び／又は標的基質の細胞位置を調節すること、及び／又は標的基質の安定性を調節すること、及び／又は標的基質の翻訳後修飾の程度を調節することなどの、標的基質の調節を促進することができる本開示の分子の部分の意味を含む。調節ドメインは、任意の手段によって標的の調節をもたらし得るが、調節ドメインはＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含有するので、調節は典型的にはユビキチン又はユビキチン様タンパク質を標的基質に結合させることによって媒介されることが理解されるであろう。当業者は、標的基質にコンジュゲートされた異なるユビキチン又はユビキチン様タンパク質が、どのユビキチン又はユビキチン様タンパク質がそれにコンジュゲートされるかに応じて、標的基質の１つ以上の活性及び／又は標的基質の細胞位置及び／又は標的基質の安定性に対して異なる効果を発揮することを認識するであろう。このような効果は、Ｈｅｒｒｍａｎ ｅｔ ａｌ（Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２００７，１００（９）：１２７６－１２９１）に概説されている。また、ユビキチン又はユビキチン様タンパク質の標的基質へのコンジュゲーションは、例えば立体障害によって、化学反応の速度を遅くする及び／又は下流のシグナル伝達を防止するなどの立体効果によって標的基質の活性を調節し得る。ユビキチン又はユビキチン様分子を基質に付加することは、ユビキチン／ユビキチン様タンパク質付加のサイズのために、基質と結合パートナーとの相互作用を直接妨げ得る（例えば、ＲＡＳ：ＲＡＦ結合を遮断し、それによってシグナル伝達を停止させることができる）。誤解を避けるために、そのような効果は全て、本明細書で使用される「調節」という用語に包含される。
一実施形態において、調節は、分解される標的基質、又は標的基質の安定性の増加、又は標的基質の細胞内位置の変化、又は調節される標的基質の１つ若しくは複数の活性（例えば、増加又は減少）、又は調節される標的基質の翻訳後修飾の程度を含む。
特定の実施形態では、調節ドメインは、ユビキチンを標的基質にコンジュゲートさせることができるＥ２ユビキチンコンジュゲートドメインを含み、それにより標的基質が分解される。このようにして、調節ドメインが標的基質を分解するように作用するとき、それは分解ドメインと称され得ることが理解されよう。
別の具体的な実施形態において、調節は、標的基質の細胞内位置を調節すること、又は標的基質の１つ若しくはそれを超える活性を調節することができるＥ２ユビキチン様コンジュゲートドメインを含む。
したがって、ドメインによって発揮される調節の同一性に依存して、調節ドメインは、分解ドメイン、局在化ドメイン、活性化ドメイン又は不活性化ドメインであると考えられ得ることが理解されよう。好ましい実施形態では、調節ドメインは分解ドメインである。
好ましい実施形態では、調節ドメインは、Ｅ２ユビキチンコンジュゲートドメインを含むことによって標的基質を分解するように作用し、その場合、それは分解ドメインと呼ばれ得る。
分解とは、標的基質がプロテアソーム中で分解されることによって標的基質の量が減少するという意味を含む。標的基質の量は、本開示の分子が存在する場合、本開示の分子が存在しない場合の標的基質の量と比較して減少し得る。例えば、本開示の分子の存在下では、標的基質の量は、本開示の分子の非存在下での標的基質の量と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％減少し得る。同様に、細胞が本開示の分子を含む場合、分子は、本開示の分子の非存在下での細胞中の標的基質のレベルと比較して、細胞中の標的基質の量を、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％減少させ得ることが理解されよう。好ましくは、標的基質の量は、検出不能なレベルまで減少される。一実施形態では、本開示の分子は、本開示の分子の非存在下で、標的基質の量の３０～１００％、例えば４０～１００％、５０～１００％、６０～１００％、７０～１００％、８０～１００％又は９０～１００％の分解をもたらす。基質は、本開示の分子の非存在下で、バックグラウンドレベルで、例えば正常なタンパク質代謝回転の一部として分解され得ることが理解される。この場合、調節は、バックグラウンド分解速度よりも大きく標的基質を分解するように作用し得る。
細胞内標的基質の場合、分解の程度は、本開示の分子を含有する細胞中の標的基質のレベルを測定し、そうでなければ実質的に同じであるが本開示の分子を含有しない細胞中の標的基質のレベルを測定することによって評価することができる。「実質的に同じ」とは、細胞が同じタイプ（例えば、実質的に同じ細胞表面マーカーを発現する）である、及び／又は同じ組織に由来する、及び／又は細胞周期の同じ段階にあるという意味を含む。或いは、本開示の分子の非存在下で細胞中の標的基質の出発量を測定し、次いで、本開示の分子を細胞に添加した後に標的基質の量を測定することができる。更に別の代替法として、本開示の分子が存在する細胞中の標的基質の量を陰性対照と比較することもできる。「陰性対照」とは、本開示の分子の不活性型が存在する細胞、例えば、標的化ドメイン及び／又は調節ドメインを欠くか、或いは非機能的標的化ドメイン及び／又は調節ドメインを含む分子の意味を含む。例えば、不活性型は、基質に対する結合ドメインを欠いていてもよく、又は無関係な結合ドメインを有していてもよい。同様に、不活性型は、不活性な調節ドメイン、例えば、調節を媒介するために必要とされる１以上の結合パートナーと相互作用することができないものを含み得る。例えば、実施例６を含めて以下に更に記載されるように、突然変異Ｆ６２Ａを含有するＥ２酵素のバリアントＵＢＥ２Ｄ１は、調節活性を完全に無効にした。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、これは、Ｆ６２残基がＵＢＥ２Ｄ１とＲＮＦ４などの環型Ｅ３リガーゼとの間の相互作用に関与しているためであると考えている。したがって、陰性対照は、Ｅ２タンパク質がＥ３タンパク質と相互作用できないもの、例えば、Ｅ２タンパク質ＵＢＥ２Ｄ１中のＦ６２に対応する位置に突然変異を含むもの（例えばＦ６２Ａ）であり得ることが理解されよう。別の例では、不活性調節ドメインは、触媒システイン残基の位置に１つ以上の突然変異を含み、それによってその触媒活性を無効にすることができる。調節ドメインの触媒システイン残基における例示的な変異には、ＵＢＥ２Ｄ１についてはＣ８５Ａ及びＵＢＥ２ＢについてはＣ８８Ａが含まれ、これらは調節活性を無効にする。本開示は、以下の表１２Ａにそのような陰性対照融合タンパク質の例を提供する。この場合も、陰性対照の細胞が、そうでなければ本開示の分子を含有する細胞と実質的に同じであることが好ましい。したがって、本開示の分子の非存在下での基質の量と比較した少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％などの分解への言及は、他の点では実質的に同じであるが本開示の分子を含有しない細胞中の基質の量と比較すること、又は本開示の分子を細胞に添加する前の細胞中の基質の量と比較すること、又は本開示の分子の不活性バージョンを含有する細胞中の基質の量と比較することの意味を含むことが理解されよう。
本開示の分子の存在下及び非存在下での標的基質のレベルの評価は、当技術分野で周知の技術を使用して行うことができる。例えば、タンパク質のレベルを評価することは、当技術分野における標準的な慣行であり、任意の適切な方法を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ又は放射免疫アッセイ、免疫蛍光、ＨＰＬＣ、ゲル電気泳動及びキャピラリー電気泳動（その後、例えば、ＵＶ又は蛍光検出が続く）などの免疫アッセイを使用して、標的基質を検出及び定量することができる。質量分析によって標的基質のレベルを測定する方法は当技術分野で周知であり、任意の適切な形態の質量分析を使用することができる。ウエスタンブロッティング、免疫沈降、パラフィン上の免疫組織化学、免疫蛍光、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びフローサイトメトリーも使用され得る。実施例において更に記載されるように、ウエスタンブロッティング及びデンシトメトリーは、標的基質を検出及び定量する簡便な方法である。
上記のように、いくつかの実施形態では、どのユビキチン又はユビキチン様タンパク質が標的基質に結合するようになるかに応じて、調節ドメインは、局在化ドメイン、活性化ドメイン又は不活性化ドメインと考えられ得る。
局在化ドメインとは、標的基質が特定の細胞位置（例えば、細胞小器官などの１つ以上の特定の細胞内位置）に優先的に存在するように標的基質を誘導するように作用するドメインの意味を含む。例えば、本開示の分子の存在下では、分子の局在化ドメインは、本開示の分子の非存在下でそれらの特定の細胞内位置に残留する標的基質の割合と比較して、特定の細胞内位置に存在する細胞内の標的基質のより高い割合をもたらし得る。標的基質の細胞局在を評価する方法は当技術分野で周知であり、免疫組織化学技術などの任意の適切な方法を使用することができる。そのような局在化ドメイン及び局在化の文脈における標的基質へのユビキチン様タンパク質のコンジュゲーションの効果の例としては、Ｅｍｂａｂｅ ｅｔ ａｌ（“＞Ｍｄｍ２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＮＥＤＤｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＨｕＲ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＨｕＲ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｉｔ ｆｒｏｍ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，” Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１２，５５（４）：１２３７－４８），Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ（“ＳＵＭＯｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｉｍｐｏｒｔ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ Ｋｉｎａｓｅ １ ｔｏ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｉｔｓ Ｍｉｔｏｔｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，” Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２０１７ ２１，２１４７－５９），Ｍａｔｕｎｉｓ ｅｔ ａｌ（“Ａ ｎｏｖｅｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｎ－ＧＴＰａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲａｎＧＡＰ１ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｏｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ，” Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９６，１３５（６ Ｐｔ １）：１４５７－７０）、及びＭａｈａｊａｎ ｅｔ ａｌ（“Ａ ｓｍａｌｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＲａｎＧＡＰ１ ｔｏ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲａｎＢＰ２，” Ｃｅｌｌ １９９７ ８８（１）：９７－１０７）によって実証されたものが挙げられ、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
活性化ドメインとは、本発明者らは、本開示の分子の非存在下での１つ又は複数の活性の参照レベルと比較して、標的基質の１つ又は複数の活性を増加させるように作用するドメインの意味を含む。１つ又は複数の活性は、タンパク質及び／又は核酸などの細胞実体との結合相互作用、或いは酵素活性又はシグナル伝達活性を含み得る。１つ又は複数の活性は、本開示の分子の非存在下での１つ又は複数の活性と比較して、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍増加し得る。そのような活性は、ＥＬＩＳＡなどの当技術分野で周知の技術を使用してアッセイすることができ、当業者は、科学文献を調べることによって問題の標的基質にアッセイを調整することができるであろう。そのような活性化ドメインの例及び活性化の文脈における標的基質へのユビキチン様タンパク質のコンジュゲーションの効果には、Ｓｏｕｃｙ ｅｔ ａｌ（“Ｃｕｌｌｉｎ－ＲＩＮＧ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｅ３ ｌｉｇａｓｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅ ＮＥＤＤ８ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｂｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ，” Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９，１５（１２）：３９１２－１６）及びＮｏｈ ｅｔ ａｌ（“ＮＥＤＤｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ＲＣＡＮ１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ，” ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１２，７（１０）：ｅ４８３１５）によって実証されたものが含まれ、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
不活性化ドメインとは、本発明者らは、本開示の分子の非存在下での１つ又は複数の活性の参照レベルと比較して、標的基質の１つ又は複数の活性を減少させるように作用するドメインの意味を含む。１つ又は複数の活性は、タンパク質及び／又は核酸などの細胞実体との結合相互作用、或いは酵素活性又はシグナル伝達活性を含み得る。１以上の活性は、本開示の分子の非存在下での１以上の活性と比較して、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍低下し得、好ましくは検出不能なレベルまで低下する。そのような不活性化ドメインの例及び不活性化との関連における標的基質へのユビキチン様タンパク質のコンジュゲーションの効果には、Ｋａｍｙｎｉｎａ及びＳｔｏｖｅｒ（“ＳＲＥＢＰ ＳＵＭＯｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＳＲＥＢＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｏ－ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｈａｔ ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ３（ＨＤＡＣ３）” Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ２０１７，９６３：１４３－６８）及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ（“ＳＵＭＯｙｌａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＳＦ－１ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ＣＤＫ７－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｅｒｉｎｅ ２０３ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，” Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ２００９，２９（３）：６１３－２５）によって実証されたものが含まれ、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
「Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメイン」とは、ユビキチン又はユビキチン様タンパク質を標的基質に結合させることができるドメインの意味を含む。例えば、調節ドメインは、ユビキチンに結合し、ユビキチンを標的基質に転移することができるＥ２ユビキチンコンジュゲートドメインを含み得る。或いは、調節ドメインは、ユビキチン様タンパク質に結合し、ユビキチン様タンパク質を標的基質、例えばＳＵＭＯ、ＮＥＤＤ８、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、ＩＳＧ１５、ＵＦＭ１、ＦＡＴ１０、ＵＲＭ１及びＦＵＢＩのいずれか１つに転移することができるＥ２ユビキチン様コンジュゲートドメインを含み得る。
いくつかの実施形態では、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインが標的基質を結合する能力は、Ｅ２ユビキチン又はユビキチンコンジュゲートドメインが、問題の標的基質を選択的に標的化する標的化ドメインと並んで本開示の分子の一部である場合に評価され得る。したがって、一実施形態において、本開示の分子内のＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインは、標的基質の少なくとも１０％がユビキチン又はユビキチン様タンパク質に結合体化されるように、ユビキチン又はユビキチン様タンパク質を標的基質に結合体化することができる。好ましくは、標的基質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％がユビキチン又はユビキチン様タンパク質にコンジュゲートされる。評価は、インビボ又はインビトロで行われ得る。例えば、評価は、組換え生化学アッセイによって、又は細胞内で行われ得る。
標的基質へのユビキチン又はユビキチン様タンパク質のコンジュゲート化は、当技術分野における日常的な方法を使用して直接的又は間接的に評価され得ることが理解されるであろう。例えば、ユビキチン又はユビキチン様タンパク質の標的基質へのコンジュゲーションは、ユビキチン又はユビキチン様タンパク質コンジュゲーション（例えばＳＤＳ ＰＡＧＥ分離）のマーカーとしての標的基質の分子量の変化を検出することによって、又はウエスタンブロット及び例えばユビキチン又はユビキチン様タンパク質に特異的な抗体に基づくイムノアッセイを使用することによって直接測定され得る。或いは、ユビキチン又はユビキチン様タンパク質の標的基質へのコンジュゲーションは、例えば、コンジュゲーションの下流効果、すなわち標的基質の分解又は本明細書に記載の別の調節を評価することによって間接的に測定され得る。ここでも、当技術分野で周知であり、本明細書及び実施例に記載されているような間接測定には、任意の適切な技術を使用することができる。そのようなアッセイは、インビボ又はインビトロであり得ることが理解されよう。ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲーションを測定する方法の具体例としては、定量的生細胞アッセイ（例えばＲｉｃｈｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ（“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ ｋｉｎｅｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ＰＲＯＴＡＣ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ，” ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０１８，１３（９）：２７５８－７０を参照されたい）などの細胞アッセイ、インビボビオチン化アッセイ（例えば、Ｐｉｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ “Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ，” Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１７，７：４０７５６を参照されたい）などのビオチン化アッセイ、質量分析及び／又は免疫染色が挙げられる。活性はまた、組換えアッセイ（例えばＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって提供されるものを参照されたい）などの組換えアッセイを使用して測定され得る。
ヒトは約４１個のＥ２酵素を有し、アミノ酸配列（及びそれらをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）は、ＧｅｎＢａｎｋ又はＵｎｉＰｒｏｔを参照することによって入手可能である。様々なヒトＥ２酵素をコードするアミノ酸配列及びヌクレオチド配列も、以下の表７～９に含まれる。ヒトＥ２は、ヒト細胞における治療的使用に適合し、ヒトにおいて免疫原性応答を誘発する可能性が低いことが理解されよう。
Ｅ２酵素には様々な分類が存在する。例えば、Ｍｉｃｈｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ（Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ２００９，６８：６１６－６２８）は、系統発生分析に基づいて酵素を１７ファミリ、ファミリ１～１７に分類しており、そのようなファミリは全て本開示の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載のＥ２酵素には、ファミリ１ Ｅ２酵素、ファミリ２ Ｅ２酵素、ファミリ３ Ｅ２酵素、ファミリ４ Ｅ２酵素、ファミリ５ Ｅ２酵素、ファミリ６ Ｅ２酵素、ファミリ７ Ｅ２酵素、ファミリ８ Ｅ２酵素、ファミリ９ Ｅ２酵素、ファミリ１０ Ｅ２酵素、ファミリ１１ Ｅ２酵素、ファミリ１２ Ｅ２酵素、ファミリ１３ Ｅ２酵素、ファミリ１４ Ｅ２酵素、ファミリ１５ Ｅ２酵素、ファミリ１６ Ｅ２酵素、及びファミリ１７ Ｅ２酵素のいずれか１つから選択されるＥ２酵素のいずれかの意味が含まれる。Ｈｏｒｍａｅｃｈｅａ－Ａｇｕｌｌａ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２０１８，４１（３）：１６８－１７８）は、酵素を４つのクラス、クラスＩ～ＩＶに分類している。クラスＩはＵＢＣドメインのみを含有し、クラスＩＩ及びＩＩＩはそれぞれＮ末端又はＣ末端伸長のいずれかを有し、クラスＩＶ Ｅ２はＮ末端及びＣ末端伸長の両方を有する。ここでも、誤解を避けるために、そのような全てのクラスのＥ２が本開示の範囲に含まれ、したがって、本明細書に記載のＥ２酵素によって、クラスＩ Ｅ２、クラスＩＩ Ｅ２、クラスＩＩＩ Ｅ２及びクラスＩＶ Ｅ２の意味が含まれる。
「ヒトＥ２酵素又はその機能的部分に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する」とは、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインが、任意のヒトＥ２酵素又はその機能的部分（例えば、表３～９に列挙される任意のヒトＥ２酵素）に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、任意のヒトＥ２酵素又はその機能的部分（例えば、表３～９に列挙される任意のヒトＥ２酵素）に対して少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有さなければならないという意味を含む。
「機能部分」とは、例えば上記のように、ユビキチン又はユビキチン様結合能を有するヒトＥ２酵素の一部の意味を含む。典型的には、機能部分は、少なくとも２０アミノ酸長、例えば少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０アミノ酸長である。好ましくは、機能部分は、５０～１５０アミノ酸長又は８０～１５０アミノ酸長、例えば１００～１５０アミノ酸長である。例えば、ヒトＥ２酵素の機能部分は、例えば、機能部分が、問題の標的基質を選択的に標的化する標的化ドメインと並んで本開示の分子の一部である場合、ユビキチン又はユビキチン様タンパク質を標的基質にコンジュゲートすることができるヒトＥ２酵素の一部を含む。以下でより明確になるように、機能的部分は、好ましくはＵＢＣドメインであるが、その部分が依然としてユビキチン又はユビキチン様タンパク質を標的基質にコンジュゲートすることができるならば、ＵＢＣドメインの一部であってもよいことが理解されよう。
一実施形態では、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインは、Ｅ２酵素又はその機能的部分に由来するか、又は合成である。
全てのＥ２酵素は、ＵＢＣドメインと呼ばれるコア触媒ドメインを有する。したがって、一実施形態では、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインは、ヒトＥ２酵素のユビキチンコア触媒（ＵＢＣ）ドメイン、又はそれでもなおユビキチン又はユビキチン様コンジュゲーション能力を有するヒトＥ２酵素のＵＢＣドメインのバリアントを、例えば上記のように含む。したがって、本開示で使用されるＵＢＣドメインは、天然に存在していてもよく、例えばヒトＥ２酵素に由来していてもよく、又は合成であってもよい。合成バリアントは、以下に更に詳細に記載されるように、ＵＢＣドメイン内のコンセンサス配列に従って設計され得る。
ヒトＥ２酵素のＵＢＣドメインのアミノ酸配列を以下の表８に提供する。更なるＥ２酵素のＵＢＣドメインのアミノ酸配列は、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣｌｕｓｔａｌ Ｗなどの標準的なアラインメント技術を使用して表８のＵＢＣドメインの１つに対応する配列を検索することによって、当業者によって同定することもできることが理解されよう。ＵＢＣドメインは、一般に、４つのアルファヘリックス及び４本鎖ベータシートから構成される。
ヒトＥ２酵素中のＵＢＣの長さは、１１７アミノ酸～２８４アミノ酸の範囲であり、したがって、一実施形態では、ＵＢＣドメインは、１１０～２９０アミノ酸、例えば１１７～２８４アミノ酸又は１４０～１９２アミノ酸を含む。
ＵＢＣドメインの比較により、例えば、Ｍｉｃｈｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ（“Ｗｈａｔ ｗａｓ ｔｈｅ ｓｅｔ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ａｎｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｏｍｍｏｎ ａｎｃｅｓｔｏｒ？”Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ２００９，６８：６１６－６２８；特に、その図６を参照されたい）によって記載されるように、その中の重要な保存された領域又はコンセンサス配列を同定した。例えば、一般的なシグネチャモチーフは、ＨｘＮトリペプチド（例えば、ＨＰＮ又はヒスチジンプロリン－アスパラギン）及びこのカノニカルモチーフのＣ末端側の第８のアミノ酸に一般的に位置する活性システイン残基である。ＰｘｘｘＰ（配列番号２０６）モチーフ及びＰｘｘｘＰモチーフのＣ末端から２６～４３アミノ酸のトリプトファン残基（配列番号２０６）も保存されている。
したがって、１つの実施形態において、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインは、保存された触媒システイン残基を含有するＵＢＣドメインを含む。しかしながら、ＵＢＣドメインは必ずしも触媒システイン残基を必要としないことが理解されよう。例えば、ＵＢＥ２Ｖ１及びＵＢＥ２Ｖ２は、保存されたシステイン残基を欠くが、それでもなお、リジン６３（Ｋ６３）ポリユビキチン鎖形成を可能にするためにＵｂｅ２Ｎと相互作用する。換言すれば、ＵＢＣドメインは、例えば他のＥ２タンパク質との相互作用を介して細胞環境で活性になるものであり得ることが理解されよう。それにもかかわらず、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインは、触媒性であり、保存されたシステイン残基を有するものであることが好ましい。
別の実施形態では、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインは、ＨＰＮトリペプチドなどのＨｘＮペプチドモチーフを含むＵＢＣドメインを含む。したがって、ＵＢＣドメインは、ＨｘＮペプチドモチーフ（ＨＰＮトリペプチド）及びこのカノニカルモチーフのＣ末端側の第８のアミノ酸に一般に位置する保存されたシステイン残基を含み得ることが理解されるであろう。
Ｍｉｃｈｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ（Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ２００９，６８：６１６－６２８）によって記載された１７ファミリへのＥ２の特徴付けを使用すると、ファミリ５（このファミリのヒトＥ２はＵＢＥ２Ｊ１及びＵＢＥ２Ｊ２である）は、ＴＰＮＧＲＦ（配列番号２０８）又はＴＡＮＧＲＦ（配列番号２０９）によって置き換えられたカノニカルトリペプチドＨｘＮを見逃した。したがって、更なる実施形態では、ＵＢＣドメインは、ＨｘＮモチーフの代わりに、ＴｘＮＧＲＦ（配列番号２１０）ペプチドモチーフ、例えばＴＰＮＧＲＦ（配列番号２０８）又はＴＡＮＧＲＦ（配列番号２０９）を含み得る。したがって、ＵＢＣは、ＴｘＮＧＲＦ（配列番号２１０）ペプチドモチーフ、例えばＴＰＮＧＲＦ（配列番号２０８）又はＴＡＮＧＲＦ（配列番号２０９）、及び保存されたシステイン残基を含み得る。
更なる実施形態では、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインは、ＰｘｘｘＰ（配列番号２０６）ペプチドモチーフ、例えばＰｘｘＰＰ（配列番号２０７）モチーフを含むＵＢＣドメインを含む。
更なる実施形態では、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインは、保存されたトリプトファン残基を含むＵＢＣドメインを含む。好ましくは、これは、ＰｘｘｘＰモチーフ（配列番号２０６）、例えばＰｘｘＰＰ（配列番号２０７）モチーフのＣ末端から２６～４３アミノ酸の間である。
なお更なる実施形態では、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインは、（ｉ）保存されたシステイン残基；及び／又は（ｉｉ）ＨｘＮペプチドモチーフ、例えばＨＰＮ、又はＴｘＮＧＲＦ（配列番号２１０）ペプチドモチーフ、例えばＴＰＮＧＲＦ（配列番号２０８）又はＴＡＮＧＲＦ（配列番号２０９）；及び／又は（ｉｉｉ）ＰｘｘｘＰ（配列番号２０６）ペプチドモチーフ、例えばＰｘｘＰＰ（配列番号２０７）モチーフ；及び／又は（ｉｖ）保存されたトリプトファン残基を含むＵＢＣドメインを含む。
なお更なる実施形態では、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインは、（ｉ）保存されたシステイン残基；（ｉｉ）ＨｘＮペプチドモチーフ、例えばＨＰＮ、又はＴｘＮＧＲＦ（配列番号２１０）ペプチドモチーフ、例えばＴＰＮＧＲＦ（配列番号２０８）又はＴＡＮＧＲＦ（配列番号２０９）；（ｉｉｉ）ＰｘｘｘＰ（配列番号２０６）ペプチドモチーフ、例えばＰｘｘＰＰ（配列番号２０７）モチーフ；（ｉｖ）保存されたトリプトファン残基を含むＵＢＣドメインを含み、保存されたトリプトファン残基は、ＰｘｘｘＰモチーフ（配列番号２２０６）のＣ末端から２６～３４アミノ酸であり、保存されたシステイン残基は、ＨｘＮ又はＴｘＮＧＲＦモチーフのＣ末端まで８アミノ酸以内である。
一実施形態では、ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインは、ヒトＥ２酵素のＵＢＣのバリアントであるＵＢＣドメインを含み、このバリアントは、ヒトＥ２酵素のＵＢＣと少なくとも８０％の配列同一性を共有する。例えば、バリアントは、ＵＢＥ２Ａ（ｈＨＲ６Ａ）、ＵＢＥ２Ｂ（ｈＨＲ６Ｂ）、ＵＢＥ２Ｃ（ＵｂｃＨ１０）、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｄ２（ＵｂｃＨ５Ｂ）、ＵＢＥ２Ｄ３（ＵｂｃＨ５Ｃ）、ＵＢＥ２Ｄ４（ＨＢＵＣＥ１）、ＵＢＥ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３（ＵｂｃＨ９）、ＵＢＥ２Ｆ（ＮＣＥ２）、ＵＢＥ２Ｇ１（ＵＢＥ２Ｇ）、ＵＢＥ２Ｇ２（ＵＢＣ７）、ＵＢＥ２Ｈ（ＵＢＣＨ）、ＵＢＥ２Ｉ（Ｕｂｃ９）、ＵＢＥ２Ｊ１（ＮＣＵＢＥ１）、ＵＢＥ２Ｊ２（ＮＣＵＢＥ２）、ＵＢＥ２Ｋ（ＨＩＰ２）、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｌ６（ＵｂｃＨ８）、ＵＢＥ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＵＢＥ２Ｎ（Ｕｂｃ１３）、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ１（ＮＩＣＥ－５）、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１（ＣＤＣ３４）、ＵＢＥ２Ｒ２（ＣＤＣ３４Ｂ）、ＵＢＥ２Ｓ（Ｅ２－ＥＰＦ）、ＵＢＥ２Ｔ（ＨＳＰＣ１５０）、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１（ＵＥＶ－１Ａ）、ＵＢＥ２Ｖ２（ＭＭＳ２）、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＥ２Ｚ（Ｕｓｅ１）、ＵＶＥＬＤ（ＵＥＶ３）、ＢＩＲＣ６（ａｐｏｌｌｏｎ）、ＦＴＳ（ＡＫＴＩＰ）、ＴＳＧ１０１、及びＵＦＣ１（それぞれ配列番号４２～８２）のいずれか１つのＵＢＣドメインと少なくとも８０％配列同一性（少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性等）のアミノ酸配列を有し得る。
２つのポリペプチド間の配列同一性パーセントは、任意の適切なコンピュータプログラム、例えばウィスコンシン大学遺伝的計算グループのＧＡＰプログラムを使用して決定され得、配列が最適にアラインメントされたポリペプチドに関して同一性パーセントが計算されることが理解されよう。アラインメントは、代替的にＣｌｕｓｔａｌ Ｗ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９４，２２（２２）：４６７３－８０）を使用して実行されてもよい。使用されるパラメータは、以下の通りであってもよい。高速ペアワイズアラインメントパラメータ：Ｋタプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、上部対角線の数；５。採点方法：ｘパーセント。複数アラインメントパラメータ：ギャップオープンペナルティ；１０、ギャップ拡張ペナルティ；０．０５．スコア行列：ＢＬＯＳＵＭ．
典型的には、ヒトＥ２酵素のＵＢＣと少なくとも８０％の配列同一性を共有するそのようなバリアントは、上記のようにＵＢＣドメインの保存された配列を依然として保持する。したがって、ヒトＥ２酵素のＵＢＣのバリアントは、好ましくは、（ｉ）保存されたシステイン残基；及び／又は（ｉｉ）ＨｘＮペプチドモチーフ、例えばＨＰＮ、又はＴｘＮＧＲＦ（配列番号２１０）ペプチドモチーフ、例えばＴＰＮＧＲＦ（配列番号２０８）又はＴＡＮＧＲＦ（配列番号２０９）；及び／又は（ｉｉｉ）ＰｘｘｘＰ（配列番号２０６）ペプチドモチーフ、例えばＰｘｘＰＰ（配列番号２０７）モチーフ；及び／又は（ｉｖ）保存されたトリプトファン残基を含む。最も好ましくは、ヒトＥ２酵素のＵＢＣのバリアントは、（ｉ）保存されたシステイン残基；（ｉｉ）ＨｘＮペプチドモチーフ、例えばＨＰＮ、又はＴｘＮＧＲＦ（配列番号２１０）ペプチドモチーフ、例えばＴＰＮＧＲＦ（配列番号２０８）又はＴＡＮＧＲＦ（配列番号２０９）；（ｉｉｉ）ＰｘｘｘＰ（配列番号２０６）ペプチドモチーフ、例えばＰｘｘＰＰ（配列番号２０７）モチーフ；（ｉｖ）保存されたトリプトファン残基を含み、保存されたトリプトファン残基は、ＰｘｘｘＰモチーフ（配列番号２０６）のＣ末端から２６～３４アミノ酸であり、保存されたシステイン残基は、ＨｘＮ又はＴｘＮＧＲＦモチーフ（配列番号２１０）のＣ末端まで８アミノ酸以内である。
バリアントとは、アミノ酸配列が１つ以上の欠失を含むＵＢＣドメインのバリアント、及び／又は１つ以上のアミノ酸置換；及び／又は親ヒトＥ２酵素ＵＢＣのアミノ酸配列と比較した１つ以上の挿入を含む。
バリアントは、任意の適切な方法で製造され得る。従来の部位特異的突然変異誘発を使用してもよく、又は当技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応に基づく手順を使用してもよい。
典型的には、本明細書に開示されるバリアントのアミノ酸置換は、例えばアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換は当技術分野で周知であり、（元の残基＜－＞置換）Ａｌａ（Ａ）＜－＞Ｖａｌ，Ｇｌｙ又はＰｒｏ；Ａｒｇ（Ｒ）＜－＞Ｌｙｓ又はＨｉｓ；Ａｓｎ（Ｎ）＜－＞Ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）＜－＞Ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）＜－＞Ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）＜－＞Ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｇ）＜－＞Ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）＜－＞Ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）＜－＞Ａｒｇ；Ｉｌｅ（Ｉ）＜－＞Ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）＜－＞Ｉｌｅ，Ｖａｌ又はＭｅｔ；Ｌｙｓ（Ｋ）＜－＞Ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）＜－＞Ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）＜－＞Ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）＜－＞Ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）＜－＞Ｔｈｒ又はＣｙｓ；Ｔｈｒ（Ｔ）＜－＞Ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）＜－＞Ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）＜－＞Ｐｈｅ又はＴｒｐ；及びＶａｌ（Ｖ）＜－＞Ｌｅｕ又はＡｌａを含む。
好ましい実施形態では、ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインは、ヒトＥ２酵素のＵＢＣドメイン、例えば、ＵＢＥ２Ａ（ｈＨＲ６Ａ）、ＵＢＥ２Ｂ（ｈＨＲ６Ｂ）、ＵＢＥ２Ｃ（ＵｂｃＨ１０）、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｄ２（ＵｂｃＨ５Ｂ）、ＵＢＥ２Ｄ３（ＵｂｃＨ５Ｃ）、ＵＢＥ２Ｄ４（ＨＢＵＣＥ１）、ＵＢＥ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３（ＵｂｃＨ９）、ＵＢＥ２Ｆ（ＮＣＥ２）、ＵＢＥ２Ｇ１（ＵＢＥ２Ｇ）、ＵＢＥ２Ｇ２（ＵＢＣ７）、ＵＢＥ２Ｈ（ＵＢＣＨ）、ＵＢＥ２Ｉ（Ｕｂｃ９）、ＵＢＥ２Ｊ１（ＮＣＵＢＥ１）、ＵＢＥ２Ｊ２（ＮＣＵＢＥ２）、ＵＢＥ２Ｋ（ＨＩＰ２）、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｌ６（ＵｂｃＨ８）、ＵＢＥ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＵＢＥ２Ｎ（Ｕｂｃ１３）、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ１（ＮＩＣＥ－５）、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１（ＣＤＣ３４）、ＵＢＥ２Ｒ２（ＣＤＣ３４Ｂ）、ＵＢＥ２Ｓ（Ｅ２－ＥＰＦ）、ＵＢＥ２Ｔ（ＨＳＰＣ１５０）、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１（ＵＥＶ－１Ａ）、ＵＢＥ２Ｖ２（ＭＭＳ２）、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＥ２Ｚ（Ｕｓｅ１）、ＵＶＥＬＤ（ＵＥＶ３）、ＢＩＲＣ６（ａｐｏｌｌｏｎ）、ＦＴＳ（ＡＫＴＩＰ）、ＴＳＧ１０１、及びＵＦＣ１のいずれか１つを含み、そのＵＢＣドメインのアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４２～８２で特定される。
ＢＩＲＣ６及びＵＢＥ２Ｏは、それらがＥ３非依存性Ｅ２ユビキチン結合酵素であるので、Ｅ２／Ｅ３ハイブリッド酵素として当技術分野で記載されていることが理解されるであろう（Ｂａｒｔｋｅ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２００４及びＵｌｌａｈ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｊ ２０１８参照）。誤解を避けるために、そのような酵素は、本明細書におけるＥ２酵素の定義に含まれる。
本明細書における「ヒトＥ２」による誤解を避けるために、本発明者らは、酵素を発現するｃＤＮＡ又は遺伝子が最初にヒト由来の遺伝物質を使用して得られたが、タンパク質がその後に任意の宿主細胞で発現され得るように、「ヒトＥ２に由来する」という意味を含む。したがって、ヒトＥ２が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核宿主細胞で発現され得るが、それでもなおヒトＥ２であると考えられることは明らかであろう。
更なる実施形態では、調節ドメインはＥ２酵素を含み、Ｅ２酵素はＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む。したがって、調節ドメインは、そのＵＢＣドメイン又はその別の機能的部分だけでなく、全長Ｅ２酵素を含み得ることが理解されよう。
調節ドメインがＥ２酵素を含む場合、Ｅ２酵素は、任意のヒトＥ２酵素に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば以下の表３～８に列挙されるもの、例えばヒトＥ２酵素に対して少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するものである。好ましくは、Ｅ２酵素は、ＵＢＥ２Ａ（ｈＨＲ６Ａ）、ＵＢＥ２Ｂ（ｈＨＲ６Ｂ）、ＵＢＥ２Ｃ（ＵｂｃＨ１０）、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｄ２（ＵｂｃＨ５Ｂ）、ＵＢＥ２Ｄ３（ＵｂｃＨ５Ｃ）、ＵＢＥ２Ｄ４（ＨＢＵＣＥ１）、ＵＢＥ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３（ＵｂｃＨ９）、ＵＢＥ２Ｆ（ＮＣＥ２）、ＵＢＥ２Ｇ１（ＵＢＥ２Ｇ）、ＵＢＥ２Ｇ２（ＵＢＣ７）、ＵＢＥ２Ｈ（ＵＢＣＨ）、ＵＢＥ２Ｉ（Ｕｂｃ９）、ＵＢＥ２Ｊ１（ＮＣＵＢＥ１）、ＵＢＥ２Ｊ２（ＮＣＵＢＥ２）、ＵＢＥ２Ｋ（ＨＩＰ２）、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｌ６（ＵｂｃＨ８）、ＵＢＥ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＵＢＥ２Ｎ（Ｕｂｃ１３）、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ１（ＮＩＣＥ－５）、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１（ＣＤＣ３４）、ＵＢＥ２Ｒ２（ＣＤＣ３４Ｂ）、ＵＢＥ２Ｓ（Ｅ２－ＥＰＦ）、ＵＢＥ２Ｔ（ＨＳＰＣ１５０）、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１（ＵＥＶ－１Ａ）、ＵＢＥ２Ｖ２（ＭＭＳ２）、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＥ２Ｚ（Ｕｓｅ１）、ＵＶＥＬＤ（ＵＥＶ３）、ＢＩＲＣ６（ａｐｏｌｌｏｎ）、ＦＴＳ（ＡＫＴＩＰ）、ＴＳＧ１０１、及びＵＦＣ１からなる群から選択されるヒトＥ２酵素と少なくとも８０％の配列同一性を有し、そのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１～４１で提供される（表７を参照されたい）。最も好ましくは、Ｅ２酵素は、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ２、又はＵＢＥ２Ｒ２である。
したがって、Ｅ２酵素は、例えば配列番号１～４１で提供されるように、ヒトＥ２酵素のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する本明細書に記載されるヒトＥ２酵素のいずれかの変異型（例えば、表３～９を参照されたい）であり得ることが理解されよう。バリアントとは、１つ以上の欠失を含むヒトＥ２酵素のアミノ酸配列の意味を含み、及び／又は１つ以上のアミノ酸置換；及び／又は１つ以上の挿入を含む。アミノ酸置換が好ましく、上記の保存的アミノ酸置換が含まれる。したがって、調節ドメインは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５若しくは２０、２５個又は最大３０個のアミノ酸が他のアミノ酸によって付加、欠失及び／又は置換（例えば、保存的置換）されているヒトＥ２酵素又はヒトＥ２酵素（例えば、本明細書に記載されているもののいずれか、例えば表３～９に記載されている）のＵＢＣドメインを含み得ることが理解されよう。一般に、変異は、触媒活性に重要なシステイン残基、ＨｘＮモチーフ、触媒活性に重要であるＰｘｘｘＰモチーフ（配列番号２０６）、例えばシステイン残基を含む本明細書に記載の保存領域の外側に限定される。同様に、変異は、一般に、Ｅ２酵素の調節機能の媒介に関与するＥ２酵素と１つ以上の結合パートナーとの間の相互作用を妨害しない。例えば、実施例６に記載されるように、突然変異Ｆ６２Ａを含有するＥ２酵素のバリアントＵＢＥ２Ｄ１は、ＵＢＥ２Ｄ１とＲＮＦ４などの内因性ＲＩＮＧ型Ｅ３リガーゼとの間の相互作用にＦ６２残基が関与しているためであると考えられた調節活性を完全に無効にした。したがって、典型的には、Ｅ２酵素の変異型は、依然としてＥ３酵素と相互作用することができる（例えば、所望の調節機能を実行するために天然に結合するＥ３タンパク質）。「依然としてＥ３酵素と相互作用することができる」とは、Ｅ２酵素の変異型が、Ｅ３酵素への結合の少なくとも５０％、例えば、結合の６０％、７０％、８０％又は９０％、より好ましくはＥ３酵素への結合の９５％又は９９％を、変動のないＥ２酵素とＥ３酵素との間の結合レベルとして示すという意味を含む。タンパク質－タンパク質相互作用を評価するための方法は、Ｅ２：Ｅ３結合対を含む、当技術分野における標準的な実行である（例えば、Ｇｕｎｄｏｇｄｕ ａｎｄ Ｗａｌｄｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１９；２８：１７５８－１７７０；Ｎｉｎｇ Ｚｈｅｎｇ ａｎｄ Ｎｉｔｚａｎ Ｓｈａｂｅｋ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．８６：１２９－１５７，２０１７；ａｎｄ Ｔｕｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２９３，１６３２４－１６３３６，２０１８）。
また、本開示の分子の自己ユビキチン化を最小限に抑えるために、例えばヒトＥ２酵素又はその機能的部分内の任意の１つ以上のリジン残基を修飾することによって、ヒトＥ２酵素又はその機能的部分（例えば、ＵＢＣドメイン）を修飾することが望ましい場合がある。「修飾」とは、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、保存的置換）、並びに／或いは欠失並びに／或いは付加の意味を含む。これは、従来の部位特異的突然変異誘発などの標準的な組換え技術を使用して、又はＰＣＲの使用によって行うことができる。そのような改変ヒトＥ２酵素はまた、バリアントと見なされ得る。そのような修飾（例えば、１つ又は複数のリジン残基が別のアミノ酸に置換されている場合）はまた、例えば修飾が安定化修飾である場合、例えばタンパク質結晶構造からのモデリング予測に基づいて、得られるタンパク質の安定性を増加させ得る。
追加的又は代替的に、本開示の分子の安定性を高めるために、例えば、安定化することが知られているヒトＥ２酵素又はその機能的部分内の任意の１つ以上のアミノ酸残基を改変することによって、例えば、タンパク質結晶構造からのモデリング予測に基づいて、ヒトＥ２酵素又はその機能的部分（例えば、ＵＢＣドメイン）を改変することが望ましい場合がある。再び、「修飾」とは、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、保存的置換）、並びに／或いは欠失並びに／或いは付加の意味を含む。そのような改変ヒトＥ２酵素はまた、バリアントと見なされ得る。
したがって、調節ドメインは、３０個までのアミノ酸修飾、例えば１個、又は２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個まで、又は１５個、２０個、２５個まで、又は３０個までのアミノ酸修飾を含む、配列番号１～８２（すなわち、表３～９のヒトＥ２酵素又はそのＵＢＣドメインのいずれか）のいずれか１つのアミノ酸配列の１つのバリアントを含むものであり得ることが理解されよう。修飾は、例えば、自己ユビキチン化を最小限に抑え、及び／又は安定性を高めるものであり得る。
好ましい実施形態では、調節ドメインは、ＵＢＥ２Ａ（ｈＨＲ６Ａ）、ＵＢＥ２Ｂ（ｈＨＲ６Ｂ）、ＵＢＥ２Ｃ（ＵｂｃＨ１０）、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｄ２（ＵｂｃＨ５Ｂ）、ＵＢＥ２Ｄ３（ＵｂｃＨ５Ｃ）、ＵＢＥ２Ｄ４（ＨＢＵＣＥ１）、ＵＢＥ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３（ＵｂｃＨ９）、ＵＢＥ２Ｆ（ＮＣＥ２）、ＵＢＥ２Ｇ１（ＵＢＥ２Ｇ）、ＵＢＥ２Ｇ２（ＵＢＣ７）、ＵＢＥ２Ｈ（ＵＢＣＨ）、ＵＢＥ２Ｉ（Ｕｂｃ９）、ＵＢＥ２Ｊ１（ＮＣＵＢＥ１）、ＵＢＥ２Ｊ２（ＮＣＵＢＥ２）、ＵＢＥ２Ｋ（ＨＩＰ２）、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｌ６（ＵｂｃＨ８）、ＵＢＥ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＵＢＥ２Ｎ（Ｕｂｃ１３）、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ１（ＮＩＣＥ－５）、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１（ＣＤＣ３４）、ＵＢＥ２Ｒ２（ＣＤＣ３４Ｂ）、ＵＢＥ２Ｓ（Ｅ２－ＥＰＦ）、ＵＢＥ２Ｔ（ＨＳＰＣ１５０）、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１（ＵＥＶ－１Ａ）、ＵＢＥ２Ｖ２（ＭＭＳ２）、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＥ２Ｚ（Ｕｓｅ１）、ＵＶＥＬＤ（ＵＥＶ３）、ＢＩＲＣ６（ａｐｏｌｌｏｎ）、ＦＴＳ（ＡＫＴＩＰ）、ＴＳＧ１０１、及びＵＦＣ１（Ｅ２酵素がそれぞれ配列番号１～４１で特定されるアミノ酸配列からなる群から選択されるＥ２酵素を含む。
上で記載され、配列番号１～８２に列挙されている可能な調節ドメインの例のいずれも、それらを発現するために採用されたクローニング戦略から生じ得る、一方又は両方の末端に最大５個のアミノ酸（例えば、最大２アミノ酸）を含有し得ることが理解されるであろう。しかし、これらのアミノ酸は調節ドメインの機能を変化させるべきではないことが理解されよう。例えば、配列番号１４７における調節ドメインｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ（ＶＨＬ）タンパク質は、クローニング戦略に由来するＮ末端に２つのアミノ酸アラニン及びメチオニンを含有するが、配列番号１９９では、ＶＨＬ調節ドメインはこれらの２つのアミノ酸を欠いている。しかしながら、両方の場合において、調節ドメインは関連する機能性を有する。
ドメインを標的化することによって、本発明者らは、標的基質を標的化することができる任意のドメイン又は部分の意味を含む。好ましくは、標的化ドメインは、基質を選択的に標的化することができる。例えば、標的化ドメインが任意の他の基質よりも大きな程度で基質を標的化する場合が好ましく、好ましくは基質のみを標的化する。
一実施形態において、標的化ドメインは、基質に結合し、好ましくは、基質に特異的に結合する。例えば、標的化ドメインが、本開示の分子が使用されることが意図される細胞中の任意の他の基質よりも大きな程度で基質に結合する場合が好ましい（例えば、調節されるべき基質を含有する細胞）。例えば、標的化ドメインが、細胞内の少なくとも１つの他の基質よりも少なくとも５倍又は１０倍低い（すなわち、より高い親和性）、好ましくは１００倍又は５００倍を超えるＫｄ値（解離定数）を有する場合が好ましい。より好ましくは、基質の標的化ドメインは、細胞内の少なくとも１つの他の基質よりも１０００倍又は５０００倍低いＫｄ値を有する。Ｋｄ値は、当技術分野で周知の方法を使用して容易に決定することができる。
標的化ドメインは、典型的には、ポリペプチド（例えば、基質に選択的に結合するもの）、例えば、モノボディ、ナノボディ、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、イントラボディ、ミニボディ、足場タンパク質、例えば、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、ペプチドバインダー又はリガンド結合ドメイン、好ましくは特異的に結合するもの（例えば、標的基質に対して高い（例えば、ナノモルＫｄ又はそれ以上）親和性で結合することができるリガンド結合ドメイン）のいずれか１つである。
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント及び二重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。そのようなフラグメントには、標的物質に対するそれらの結合活性を保持する全抗体のフラグメント、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２フラグメント、並びに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質及び抗体の抗原結合部位を含む他の合成タンパク質が含まれる。抗体の一部のみを含む標的化ドメインは、血液からのクリアランス速度を最適化することによって有利であり得、Ｆｃ部分に起因して非特異的結合を受けにくくなり得る。ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ダイアボディ、ラクダ科動物抗体及び操作されたラクダ科動物抗体も含まれる。更に、ヒトへの投与のために、抗体及びそのフラグメントはヒト化抗体であり得、これは現在当該技術分野で周知である（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．，５ｔｈ ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ，ＩＳＢＮ：９７８－０－４７０－１１７９１－０）。
モノボディ、ナノボディ、イントラボディ、ユニボディ、非対称ＩｇＧ様抗体（例えば、ＴｒｉｏｎＰｈａｒｍａ／ＦｒｅｓｅｎｉｕｓＢｉｏｔｅｃｈ；ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；ＣｒｏｓｓＭＡｂｓ，Ｒｏｃｈｅ；静電的に一致した抗体、ＡＭＧＥＮ；ＬＵＺ－Ｙ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）本体、ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ；バイオロン酸、Ｍｅｒｕｓ；Ｆａｂ交換抗体、Ｇｅｎｍａｂ）、対称ＩｇＧ様抗体（例えば、二重標的化（ＤＴ）－Ｉｇ、ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ；ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；架橋ＭＡｂ、カルマノスがんセンター；ｍＡｂ２、Ｆ－ｓｔａｒ；及びＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ，ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＩｇＧ融合（例えば二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、Ａｂｂｏｔｔ；ＩｇＧ様二重特異性抗体、ＥｌｉＬｉｌｌｙ；Ｔｓ２Ａｂ，Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡＺ；ＢｓＡｂ，ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ；ＨＥＲＣＵＬＥＳ，ＢｉｏｇｅｎＩｄｅｃ；ＴｖＡｂ，Ｒｏｃｈｅ）Ｆｃ融合（例えばＳｃＦｖ／Ｆｃ融合、ＡｃａｄｅｍｉｃＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ；ＳＣＯＲＰＩＯＮ，ＥｍｅｒｇｅｎｔＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ；ｄｕａｌａｆｆｉｎｉｔｙｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ－ＤＡＲＴ），ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ；二重（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ，ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＡｎｔｉｂｏｄｙＭｅｄｉｃｉｎｅ）Ｆａｂｆｕｓｉｏｎｓ（例えばＦ（ａｂ）２，Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ；二重作用又はＢｉｓ－Ｆａｂ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ），ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ；二価二重特異性、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ；及びＦａｂ－Ｆｖ，ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ），ＳｃＦｖ－及びダイアボディベース抗体（例えば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥｓ）、マイクロメット；タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ），Ａｆｆｉｍｅｄ；ＤＡＲＴｓ，ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ；一本鎖ダイアボディ、Ａｃａｄｅｍｉｃ；ＴＣＲ様抗体、ＡＩＴ，ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ；ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ；及びＣＯＭＢＯＤＩＥＳ，ＥｐｉｇｅｎＢｉｏｔｅｃｈ），ＩｇＧ／ｎｏｎ－ＩｇＧｆｕｓｉｏｎｓ（例えばｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｓ，ＥＭＤＳｅｒｏｎｏ，Ｐｈｉｌｏｇｅｎ，ＩｍｍｕｎＧｅｎｅ，ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ；超抗体融合タンパク質、ＡｃｔｉｖｅＢｉｏｔｅｃｈ；及び免疫動員性ｍＴＣＲＡｇａｉｎｓｔＣａｎｃｅｒ，ＩｍｍＴＡＣ）並びにオリゴクローナル抗体（例えばＳｙｍｐｈｏｇｅｎ及びＭｅｒｕｓ）も含まれる。
抗体は、Ｃａｒｔｅｒ（“Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎ”，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００６，６（５）：３４３－５７、及びＣａｒｔｅｒ（“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ”，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２０１１，３１７（９）：１２６１－９）を参照されたい）、本明細書に記載される特異性決定領域と共に本明細書に組み込まれる。したがって、「抗体」という用語は、アフィボディ及び非免疫グロブリン系フレームワークも含む。例としては、アドネクチン、アンチカリン、アフィリン、トランスボディ、ＤＡＲＰｉｎｓ、Ｔｎ３分子、トリマーＸ、マイクロタンパク質、フィノマー、アビマー、セングリン及びカルビトール（エカランチド）が挙げられる。
所与の標的基質に適した標的化ドメインは、当業者によって、当技術分野で長年確立された技術を使用して作製され得る。例えば、モノクローナル抗体及び抗体フラグメントの調製方法は当技術分野で周知であり、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”Ｎａｔｕｒｅ １９７５，２５６：４９５－４９７）；抗体ファージディスプレイ（Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ，“Ｍａｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４，１２：４３３－４５５）；リボソームディスプレイ（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．， “Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９９，２３１：１１９－１３５）；反復的コロニーフィルタスクリーニング（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｂｙ ｃｏｌｏｎｙ ｆｉｌｔｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００１，２９：Ｅ２７）が挙げられる。更に、本開示での使用に適した抗体及び抗体フラグメントは、例えば、以下の刊行物に記載されている。“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ“，Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８２）；“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ“，Ｈ．Ｚｏｌａ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８７，ＩＳＢＮ：０－８４９３６－４７６－０；“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ“１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ｅｄｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８．ＩＳＢＮ ０－８７９６９－３１４－２；“Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ“ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ｅｄｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９．ＩＳＢＮ ０－８７９６９－５４３－９；ａｎｄ“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｓｔｅｆａｎ Ｄｕｅｂｅｌ，Ｅｄ．，１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，－ Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００７．ＩＳＢＮ：３－５２７－３１４５３－９。
本開示の標的化ドメインは、単一特異性、二重特異性、三重特異性又はより大きな多重特異性であり得る。多重特異性標的化ドメインは、基質の異なるエピトープに特異的であり得るか、又は本開示の基質ポリペプチド並びに異種組成物、例えば異種ポリペプチド又は固体支持体材料の両方に特異的であり得る。そのような多重特異性標的化ドメインは、より複雑なマルチドメイン基質を標的化するための価値を有し得ることが理解されよう。
本開示の分子の標的化ドメインのユビキチン化を最小限に抑えるために、標的化ドメイン中のリジン残基の数を最小限に抑えることが望ましい場合がある。したがって、標的化ドメインは、リジンアミノ酸を例えばアルギニン残基で置換することによって改変され得る。そのようにするための技術は、当技術分野において周知である。
適切な標的化ドメインの特定の例は、実施例に例示されており、Ｓｒｃ相同２（ＳＨ２）ドメイン含有ホスファターゼ２（ＳＨＰ２）のＣ－ＳＨ２ドメインに選択的に結合するモノボディａＣＳ３、ヒト抗原Ｒに結合するナノボディであるＨｕＲ８及びＨｕＲ１７、ＫＲａｓタンパク質に結合するＤＡＲＰｉｎ Ｋ１９、及び陰性対照の例として本明細書で利用される細菌Ｃａｓ９タンパク質に選択的に結合するＣａｓ９（哺乳動物では発現されないため）を含む。これらの標的化ドメインのアミノ酸配列、並びにａＣＳ３のリジンバリアントが表１０に含まれており、任意のそのような標的化ドメインが本開示の文脈において使用され得ることが理解されるであろう。したがって、一実施形態では、標的化ドメインは、配列番号１２６～１３５、１３８～１３９、２５７のいずれか１つのアミノ酸配列、又は最大２０個のアミノ酸修飾、例えば最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は最大１０、１５、若しくは２０個のアミノ酸修飾を有するそのバリアントを有する。「修飾」とは、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、保存的置換）、並びに／或いは付加並びに／或いは欠失の意味を含む。別の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号１２６～１３５、１３８～１３９、２５７のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号１２６～１３５、１３８～１３９、２５７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号１２６～１３５、１３８～１３９、２５７のいずれか１つと少なくとも８５％若しくは９０％の配列同一性、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを有する。標的化ドメインのバリアントは、例えば１つ以上のリジン残基を修飾することによって（例えば、それらの１つ又は複数を別のアミノ酸残基に置換すること及び／又はそれらの１つ又は複数を欠失させることによって）標的化ドメインのユビキチン化を最小化するように、並びに／或いは例えばタンパク質結晶構造からのモデリング予測に基づいて安定性を増加させることが知られている１つ以上の修飾を作製することによって標的化ドメインの安定性を増加させるように修飾されたものであり得ることが理解されよう。
いくつかの実施形態では、本開示は、標的化ドメインが、リジン残基の１つ又は複数が別のアミノ酸で置換されている、及び／又は欠失されている、配列番号１２６～１３５、１３８～１３９、２５７のいずれか１つのアミノ酸配列のバリアントであり；並びに／或いは調節ドメインが、１つ又は複数のリジン残基が別のアミノ酸で置換及び／又は欠失されている、配列番号４２～８２のいずれか１つのアミノ酸配列のバリアントである、
分子を提供する。
基質（又は標的基質）とは、本開示の分子によって標的化され、それによってユビキチン又はユビキチン様タンパク質にコンジュゲートされ、それによって調節され得る（例えば劣化）任意の基質の意味を含む。
好ましくは、標的基質はポリペプチドであり、典型的には細胞内ポリペプチドであり、それによって本発明者らは、少なくとも１つの部分が細胞内にある任意のポリペプチドの意味を含む。したがって、基質は、細胞質ゾル及び／又は細胞内の細胞小器官に存在する細胞内ポリペプチドであってもよく、又は少なくとも細胞内部分を有する膜貫通ポリペプチド（例えば、ＧＰＣＲ）などの膜ポリペプチドであってもよい。しかしながら、ユビキチンは、細胞内液及び細胞外液の両方に見られ、多数の細胞プロセスの調節に関与している。細胞外ユビキチンは免疫応答の調節に関連しており（Ｓｕｊａｓｈｖｉｌｉ，“Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，”Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ ２０１６，Ｅｐｕｂ ２０１６：４１９０３９０）；及びＢａｓｋａ ｅｔ ａｌは、ユビキチン－プロテアソーム経路の構成成分が哺乳動物の精巣上体液（ＥＦ）中に分泌されることを示唆している（Ｂａｓｋａ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ，”Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００８，２１５（３）：６８４－９６）。したがって、特定の状況において、本開示の分子は、細胞外標的基質を調節するために使用され得ることが理解されよう。しかしながら、好ましくは、基質は細胞内ポリペプチドである。
一実施形態では、基質は、原形質膜、細胞質、核、ミトコンドリア、エンドソーム、小胞体、ミトコンドリア及びゴルジ装置の１つ又は複数に局在する。
可能な標的基質の例は、発癌性タンパク質、シグナル伝達タンパク質、ＧＰＣＲ、翻訳後修飾タンパク質、接着タンパク質、受容体、細胞周期タンパク質、チェックポイントタンパク質、ウイルスタンパク質、プリオンタンパク質、細菌タンパク質、寄生性タンパク質、真菌タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、構造タンパク質、酵素、免疫原、抗原、及び／又は病原性タンパク質を含む。標的基質は、従来的にｄｒｕｇｇａｂｌｅであり得るか又は現在ｄｒｕｇｇａｂｌｅであり得ないかにかかわらず、任意の潜在的な治療標的であり得ることが理解されよう。
特定の実施形態において、基質は、Ｒａｓ、ＫＲａｓ及びＳＨＰ２からなる群から選択される。他の可能な標的基質としては、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）プロテアーゼ３Ｃ、ムスカリン性アセチルコリン受容体２（Ｍ２Ｒ）、ベータ２アドレナリン受容体（β２－ＡＲ）、交差結合エンドヌクレアーゼＭＵＳ８１（ＭＵＳ８１）及びヒト抗原Ｒ（ＨｕＲ）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、調節ドメイン及び標的化ドメインとはリンカーによってつながれる。リンカーとは、調節ドメインを標的化ドメインに結合する化学的部分の意味を含む。調節ドメインが、例えばリンカーによって標的化ドメインに共有結合している場合が好ましい。
したがって、調節ドメイン及び標的化ドメインは、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ（“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，” Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９７９，１００：１００－８）に一般的に記載されているもの等、架橋分子の従来の任意の方式によって連結され得る。例えば、調節ドメイン又は標的化ドメインの一方は、チオール基で富化され得、他方は、それらのチオール基と反応することができる二官能性薬剤、例えば、ヨード酢酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＩＡ）又はＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、共役種間にジスルフィド架橋を組み込むヘテロ二官能性架橋剤と反応し得る。例えば、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルで達成されるアミド及びチオエーテル結合は、一般に、ジスルフィド結合よりもインビボでより安定である。ビスマレイミド試薬は、チオール基（例えば、抗体のシステイン残基のチオール基）の別のチオール含有部分（例えば、Ｔ細胞抗原又はリンカー中間体のチオール基）への連続的又は同時的な様式での結合を可能にすることが知られている。チオール基と反応性であるマレイミド以外の他の官能基としては、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート及びイソチオシアネートが挙げられる。
特に好ましい実施形態では、調節ドメイン及び標的化ドメインはポリペプチドであり、調節ドメインは、リンカーを介さずに直接的に、又はリンカーを介して間接的に、標的化ドメインに結合している。
したがって、調節ドメイン及び標的化ドメインは、核酸分子によってコードされ得る融合ポリペプチドの構成部分であり得ることが理解されよう。したがって、特に好ましい実施形態では、本開示の分子は、（ａ）ヒトＥ２酵素又はその機能的部分と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメインと、（ｂ）調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインと、を含む融合ポリペプチドである。調節ドメインは、標的化ドメインのＮ末端にあってもよく、又は標的化ドメインは、調節ドメインのＮ末端にあってもよい。融合ポリペプチドとは、２つ以上のタンパク質、例えば上記の２つの異種ドメイン、すなわち調節ドメイン及び標的化ドメインに由来するアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチドの意味を含む。融合タンパク質はまた、別個のタンパク質に由来するアミノ酸部分の間にアミノ酸の領域を連結することを含み得る。
適切には、調節ドメイン及び標的化ドメインは、両方のドメインがそれぞれの活性を保持するように連結され、その結果、分子を標的基質に標的化することができ、基質を結果的に調節することができる。したがって、融合ポリペプチドが、例えば、標的化基質と標的基質との間の立体的破壊を防ぐために、調節ドメインと標的化ドメインとの間にペプチドリンカーを含むことが望ましい場合がある。適切なリンカーペプチドは、典型的にはランダムコイルコンフォメーションをとるものであり、したがって、リンカーは、グリシン、セリン又はグリシン＋セリン残基の混合物を含み得る。リンカーが含み得る他のアミノ酸には、ロイシン、グルタマート、アルギニン、プロリン、アラニン、アスパラギン、チロシン、アスパルタート、バリン及びトレオニンのいずれか１つ又は複数が含まれる。好ましくは、リンカーは、１～４５個のアミノ酸残基、例えば５～２８個のアミノ酸残基長、より好ましくは１～２０個のアミノ酸残基、又は４～２０個のアミノ酸残基、例えば５～１９個のアミノ酸残基長を含む。最も好ましくは、リンカーは、６～２０個のアミノ酸残基、例えば９～１９個のアミノ酸残基の長さを含む。特定の長さのリンカーは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８アミノ酸残基の長さを含む。
使用され得る特に好ましいリンカーの例を表１０に列挙し、これは、ペプチドＧＧＧＧＳ（配列番号１４６）又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４５）又はＬＥＧＧＧＧＳＳＲ（配列番号１４１）又はＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＲ（配列番号１４２）ＡＡＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＴ（配列番号１４３）又はＧＧＧＧＧ（配列番号１４４）又はＬＥＧＧＳＲ（配列番号２１１）又はＬＥＧＧＧＳＧＧＳＳＲ（配列番号２１２）又はＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＳＳＲ（配列番号２１３）又はＬＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＳＲ（配列番号２１４）又はＬＥＧＧＧＧＳＧＰＳＧＧＧＧＰＳＧＳＲ（配列番号２１５）又はＬＥＳＮＧＧＧＧＳＰＡＰＡＰＧＧＧＧＳＧＳＳＲ（配列番号２１６）又はＬＥＧＧＧＧＳＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＧＧＧＧＳＳＲ（配列番号２１７）又はＴＧＧＳＡＧＧＳＧＧＳＡＧＧＳＧＧＳＡＧＧＳＧＧＳＡ（配列番号２１８）又はＡＧＳＧＧＳＴＧＳＧＧＳＰＴＰＳＴＳＧＧＳＴＧＳＧＧＡＳ（配列番号２１９）又はＡＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＮＳＳＴＳＧＧＳＧＧＳＧＧＡＳ（配列番号２２０）又はＧＧＳＰＶＰＳＴＰＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＰＶＰＳＴＰＧＳ（配列番号２２１）、又はＳＰＧＴＧＳＰＧＴＧＳＰＧＴＧＳＰＧＴＧＳＰＧＴＧＳＰＧ（配列番号２２２）を含む。これらの例における「ＬＥ」及び「ＳＲ」は、ヌクレオチド配列に導入された制限クローニング部位に起因して存在することが理解されよう。これらの例示的リンカーのいずれかにおける１以上のセリン残基は、グリシン残基に置換され得ることが更に理解されるであろう。
適切な標的化ドメインをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で公知であるか、又は公知の配列から、例えば標的基質と相互作用することが公知のタンパク質の配列から、又はＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ及びｄｂＥＳＴデータベースなどのヌクレオチド配列データベースに含まれるものから容易に設計することができる。適切な調節ドメインをコードするポリヌクレオチドは当技術分野で公知であり、又は公知のＥ２酵素配列から容易に設計され、作製され得る。
適切なリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドは、リンカーペプチド配列から容易に設計され、作製され得る。
したがって、本開示の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、周知の遺伝子工学技術を用いて容易に構築することができる。
次いで、核酸を適切な宿主中で発現させて、本開示の分子、例えば融合ポリペプチドを産生する。したがって、本開示の融合ポリペプチドをコードする核酸は、本開示の融合ポリペプチドの発現及び産生のために適切な宿主細胞を形質転換するために使用される発現ベクターを構築するために、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に改変された既知の技術に従って使用され得る。
本開示のポリペプチドをコードする核酸は、適切な宿主への導入のために多種多様な他の核酸配列に連結され得ることが理解される。コンパニオン核酸は、当技術分野で周知のように、宿主の性質、宿主への核酸の導入様式、及びエピソームの維持又は組込みが所望されるかどうかに依存する。
上記で述べられ、実施例において明らかにされるように、本発明者らは、Ｅ３リガーゼではなく、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含有する調節ドメインを含む分子による標的基質の標的化された調節を提供することが可能であることを見出した。したがって、一実施形態では、本開示の分子又は融合ポリペプチドは、Ｅ３ユビキチン又はユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分を含まない。Ｅ３ユビキチン又はユビキチン様リガーゼの機能的部分により、本発明者らは、ユビキチン又はユビキチン様タンパク質の基質への移動を、例えば直接的に（ＨＥＣＴ Ｅ３ユビキチンリガーゼと同様に）又は間接的に（ＲＩＮＧ Ｅ３ユビキチンリガーゼと同様に）補助することが依然として可能なＥ３ユビキチン又はユビキチン様リガーゼの一部を含む。Ｅ３ユビキチン又はユビキチン様リガーゼ活性のアッセイは、当技術分野で公知の任意の適切な技術を使用して行うことができ、Ｅ３ユビキチン又はユビキチン様リガーゼが基質及びＥ２－Ｕｂ又はＥ２－Ｕｂｌに結合することができるかどうかを試験することを含み得る（例えば、Ｒｉｃｈｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ ｋｉｎｅｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ＰＲＯＴＡＣ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ，” ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０１８，１３（９）：２７５８－７０）によって記載されている三元複合体形成アッセイを参照のこと）。「Ｅ３ユビキチン又はユビキチン様リガーゼを含まない」とは、本開示の分子又はポリペプチドがＥ３ユビキチン又はユビキチン様リガーゼに共有結合していないという意味を含む。例えば、本開示の分子が融合ポリペプチドである場合、その融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｅ３ユビキチン又はユビキチン様リガーゼもコードしない。
一実施形態では、本開示の分子（例えば、本開示のポリペプチド）は、Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分を含まず、Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分は、ＲＩＮＧ（Ｒｅａｌｌｙ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅ）ドメイン、Ｕボックスドメイン、ＨＥＣＴ（Ｅ６－ＡＰカルボキシル末端に相同）ドメイン、及びＲＢＲドメインからなる群から選択される１つ又は複数のドメインを含むものである。一実施形態では、本開示の分子は、核局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル又はエンドソーム局在化シグナルなどの細胞内局在化シグナルを含む。
本開示の融合ポリペプチドの例としては、表１２Ａに列挙されたものが挙げられるので、好ましい実施形態では、本開示の分子は、それぞれ配列番号１５６～１６７、１７０～１９５、２０２～２０５、２３６～２４８、２５３～２５６及び２６６～２７５を有する、表１２Ａに列挙された融合ポリペプチドのいずれか１つであり、より好ましくは、本開示の分子は、配列番号１５６～１６７、１７１～１９５、２０２～２０４、２３６～２４８、２５３～２５６、２６７、２７０及び２７２のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。配列番号１５６～１６７、１７０～１９５、２０２～２０５、２３６～２４８、２５３～２５６及び２６６～２７５のポリペプチドのバリアント、好ましくは配列番号１５６～１６７、１７１～１９５、２０２～２０４、２３６～２４８、２５３～２５６、２６７、２７０及び２７２のいずれか１つのポリペプチドのバリアント、例えば最大５０個のアミノ酸修飾（例えばアミノ酸置換（好ましくは保存的置換）及び／又は付加及び／又は欠失、例えば最大４５、４０、３５、３０、２５又は２０個の修飾、例えば最大１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸修飾を有するバリアント、或いはそれぞれ配列番号１５６～１６７、１７０～１９５、２０２～２０５、２３６～２４８、２５３～２５６及び２６６～２７５、好ましくは配列番号１５６～１６７、１７１～１９５、２０２～２０４、２３６～２４８、２５３～２５６、２６７、２７０、及び２７２、例えば少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する表１２Ａに列挙される融合ポリペプチドのいずれか１つと少なくとも５０％の配列同一性を有するバリアントも挙げられる。バリアントは、分子を標的基質に標的化することができ、基質を結果的に調節することができるように、調節ドメイン及び標的化ドメインが依然としてそれらのそれぞれの機能を果たすことができるものでなければならないことが理解されよう。バリアント内の調節ドメインのＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインは、ヒトＥ２酵素又はその機能的部分と少なくとも８０％の配列同一性を依然として有していなければならないことも理解されるであろう。表１２Ａに列挙される融合ポリペプチドのバリアントは、標的化ドメイン（例えばａＣＳ３若しくはＫ１９又はそれらのバリアント）が別の標的化ドメイン、例えば場合によってはａＣＳ３若しくはＫ１９又はそのバリアントで置換されたものであってもよく、及び／又は調節ドメインが別の調節ドメインで置換されたものであってもよいことが更に理解される。
いくつかの実施形態では、本開示の分子は、例えば、本開示の分子を含む細胞の同定又は選択を可能にするために、検出可能なマーカーを含む。「検出可能なマーカー」とは、本開示の分子内にある場合に、分子の存在を同様に検出することができるように、直接的又は間接的に検出することができるマーカーの意味を含む。例えば、融合ポリペプチドが発現されているかどうかを決定するために、本開示の融合ポリペプチドに検出可能なマーカーを含めることが望ましい場合がある。したがって、一実施形態では、本開示の分子は、検出可能なマーカーを更に含む。検出可能なマーカーの例としては、親和性タグ、例えば赤血球凝集素Ａエピトープタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号１２４）、Ｇｌｕ－Ｇｌｕタグ（ＣＥＥＥＥＹＭＰＭＥ；配列番号１２５）及びＦＬＡＧタグ（抗ＦＬＡＧ抗体と結合する）が挙げられる。使用され得るマーカーの他の例は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識又は他のアミノ酸系標識である。任意の適切なマーカーを使用することができるが、本開示の分子のタンパク質分解をもたらし得る自己ユビキチン化を最小限に抑えるために、リジン残基を含有しないマーカーが好ましい。そのようなペプチドマーカーをコードする核酸分子は、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）から入手可能である。検出可能なマーカーは、融合ポリペプチドのＮ末端又は融合ポリペプチドのＣ末端に存在し得るか、又はペプチドリンカーが調節ドメインと標的化ドメインとの間に存在する場合、検出可能なマーカーは融合ポリペプチドのリンカー内に存在し得ることが理解されるであろう。様々な位置に検出可能なマーカーを有する構築物の例を表１２Ａに見出すことができる。
更なる実施形態では、本開示の分子は、本開示の分子を特定の細胞内位置に導くために使用され得る追加の局在化部分を含み得る。局在化部分とは、本開示の分子を特定の細胞内位置に標的化し、それによって、その細胞内位置における本開示の分子の濃度を、局在化部分の非存在下におけるその細胞内位置における本開示の分子の濃度と比較して増加させる部分の意味を含む。細胞内位置は、標的基質が主に存在する位置であり得る。例えば、標的基質が主に核内に存在する場合、分子を核に向かわせる局在化部分を含むことが望ましい場合がある。同様に、本開示の分子は、特定の細胞内位置で選択的に標的基質を調節（例えば、分解する）するために使用され得ることが理解されよう。例えば、分子は、ミトコンドリアに存在するが核に存在する同じ基質ではない標的基質を調節する（例えば、分解する）ために使用され得る。
細胞内局在を評価する手段は、当業者に周知である。例えば、これは、免疫蛍光染色及び高含量画像化によって試験することができる。標的タンパク質は、特異的抗体及び本開示の分子の存在を使用するために、抗タグ抗体で染色することによって染色することができる。蛍光タグ付けされた二次抗体を使用することにより、これを高含有量共焦点イメージングによって検出することができる。更に、細胞核、ミトコンドリア又は他の細胞小器官を特定の色素で染色することができる。核に局在する核局在化配列（ＮＬＳ）（Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００７，２８２（８）：５１０１－０５）、及び原形質膜に局在するＣＡＡＸモチーフ又はパルミトイル化部位（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ ２００５，１６：１６０６－１６；Ｇｕａｎ ａｎｄ Ｆｉｅｒｋｅ，Ｓｃｉ Ｃｈｉｎａ Ｃｈｅｍ ２０１１，５４（１２）：１８８８－９７；Ａｉｃａｒｔ－Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ － Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ ２０１１，１８０８（１２）：２９８１９４）を含む、様々な局在化モチーフが当業者に周知である。任意のそのような局在化モチーフが本開示の分子に含まれ得る。
表１２Ａに列挙される融合ポリペプチドは特定の配向（例えば、Ｎ末端からＣ末端への「調節ドメイン－リンカー－標的化ドメイン」）で示されているが、誤解を避けるために、逆の配向も本開示の範囲に含まれる。例えば、配列番号１９３の融合ポリペプチド（ＨＡ＿ＵＦＣ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３）は、「調節ドメイン－リンカー－標的化ドメイン」の向きにあるが、逆向きの「標的化ドメイン－リンカー－調節ドメイン」も本開示の範囲に含まれることが理解されよう。
したがって、本開示は、調節ドメイン、標的化ドメイン、任意で調節ドメインと標的化ドメインとの間のペプチドリンカー、及び任意で検出可能なマーカー及び／又は局在化ドメインを含む融合ポリペプチドを提供することが理解されよう。例えば、本開示は、調節ドメイン、標的化ドメイン、調節ドメインと標的化ドメインとの間のペプチドリンカー、及び場合により検出可能なマーカー及び／又は局在化ドメインを含む融合ポリペプチドを含む。
好ましい実施形態では、本開示の第１の態様は、ヒトＥ２酵素（例えば、以下の表３～９のいずれかに列挙されているようなもの）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２酵素と、Ｅ２酵素を基質に標的化することができる標的化ドメイン（例えば、モノボディ又はナノボディ）とを含む融合ポリペプチドを含む。
好ましい実施形態では、本開示の第１の態様は、ヒトＥ２酵素（例えば、以下の表３～９のいずれかに列挙されているようなもの）の機能的部分に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインと、Ｅ２酵素を基質に標的化することができる標的化ドメイン（例えば、モノボディ又はナノボディ）とを含む融合ポリペプチドを含む。好ましくは、機能的部分はＵＢＣドメインである。
本開示の第２の態様は、（ｉ）本開示の第１の態様による分子と、（ｉｉ）分子を細胞に標的化することができる標的化部分と、を含む化合物を提供する。
本開示の第１の態様による分子の優先傾向は、上記のものを含む。例えば、化合物は、本開示の第１の態様の融合ポリペプチドと、分子を細胞に標的化することができる標的化部分とを含み得る。
細胞は、本開示の分子又はポリペプチドが調節することができる標的基質を含む細胞であることが理解されよう。したがって、細胞は、分解することが望ましい基質を含み得、本開示の分子は、分解ドメインである調節ドメインを含む。
部分を標的化することによって、本発明者らは、調節する（例えば、分解する）ことが望ましい基質を含む細胞を標的化することができる任意の部分の意味を含む。調節する（例えば、分解する）ことが望ましい基質を含有する細胞とは、その基質を含有する全ての細胞、又はその細胞のサブセットにおいてのみその基質を調節すること（例えば、分解する）が望ましい基質を含有する細胞のサブセットの意味を含む。好ましくは、標的化ドメインは、調節すること（例えば、分解する）が望ましい基質を含む細胞を選択的に標的化することができる。例えば、標的化部分は、任意の他のタイプの細胞よりも大きな程度で細胞を標的化することが好ましく、最も好ましくは、調節すること（例えば、分解する）が望ましい基質を含む細胞のみを標的化する。
一実施形態では、標的化部分は、調節する（例えば、分解する）ことが望ましい基質を含む細胞によって発現されるか又はそれに関連する実体の特異的結合パートナーである。典型的には、発現された実体は、細胞上に選択的に発現される。例えば、発現した実体の存在量は、典型的には、他の細胞、例えば、処置される個体内よりも、調節する（例えば、分解する）ことが望ましい基質を含む細胞上で、１０又は１００又は５００又は１０００又は５０００又は１００００高い。
「結合パートナー」とは、特定の細胞によって発現される実体に結合する分子の意味を含む。好ましくは、結合パートナーは、その実体に選択的に結合する。例えば、結合パートナーが、別の細胞によって発現される少なくとも一つの他の実体（例えば、調節する（例えば、分解する）ことが望ましい基質を含有しない細胞又は基質を含有するが、その細胞において調節する（例えば、分解する）ことが望ましくない細胞）よりも少なくとも５倍又は１０倍低い（すなわち、より高い親和性）、好ましくは１００倍又は５００倍超低いＫｄ値（解離定数）を有する場合が好ましい。より好ましくは、その実体の結合パートナーは、別の細胞（例えば、調節する（例えば、分解する）ことが望ましい基質を含有しない細胞又は基質を含有するが、その細胞において調節する（例えば、分解する）ことが望ましくない細胞）によって発現される少なくとも一つの他の実体よりも１０００倍又は５０００倍超低いＫｄ値を有する。
典型的には、結合パートナーは、調節する（例えば、分解する）ことが望ましい基質を含む細胞中又は細胞上で、宿主の任意の他の細胞中よりも有意に高い濃度で、結合パートナーに存在するか又はアクセス可能な実体に結合するものである。したがって、結合パートナーは、他の細胞よりもかなり高い量で発現される、調節する（例えば、分解する）のに望ましい基質を含む細胞上の表面分子又は抗原に結合し得る。同様に、結合パートナーは、他の細胞よりも大きく調節する（例えば、分解する）ことが望ましい基質を含有する細胞によって細胞外液に分泌された実体に結合し得る。例えば、標的基質が癌細胞に存在する場合、結合パートナーは、細胞膜上に発現されるか又は腫瘍細胞外液に分泌された腫瘍関連抗原に結合し得る。
好ましい実施形態では、結合パートナーは、調節する（例えば、分解する）ことが望ましい基質を含む細胞に存在するか又はアクセス可能な実体に結合するものである。好ましくは、実体は、結合パートナーによって結合されると、結合パートナー（及び任意の関連分子、例えば本開示の第２の態様の化合物）の細胞内への内在化をもたらすものである。細胞内送達が主な取り込み機構としてエンドサイトーシス経路に依存する場合、エンドソーム若しくはリソソーム、又はエンドソーム若しくはリソソーム内に含まれ得る任意の他の小胞から逃れる手段を化合物（例えば、本開示の第１の態様の分子）内に含めること、或いは別の手段（すなわち、化合物の外部）と係合してそのような逃避を媒介することが望ましい場合があることが理解されよう。エンドソーム脱出を増強する方法は当業者に周知であり、Ｈｕｍ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ ２０１１，２２（１０）：Ａ１４－Ａ１４ ａｎｄ ｉｎ Ｌｏｅｎｎ ｅｔ ａｌ（Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１６，６：３２３０１）に概説されているものが挙げられる。例えば、本開示の第２の態様の化合物（及び／又は本開示の第１の態様の分子）は、エンドソームのエスケープドメインを含み得る。
標的化部分は、ポリペプチド、ペプチド、小分子又はペプチド模倣体のいずれかであり得る。典型的には、標的化部分は、ポリペプチド、例えばモノボディ、ナノボディ、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、イントラボディ、ミニボディ、新規骨格、ペプチドバインダー又はリガンド結合ドメインのいずれか１つである。
好ましい実施形態では、標的化部分は、抗体などの結合パートナーである。抗体は、調節する（例えば、分解する）ことが望ましい基質を含む細胞によって発現される抗原、例えば細胞の表面に発現される抗原に結合するものであり得る。好ましくは、抗原は、抗体によって結合されると、例えば受容体媒介エンドサイトーシスによって、本開示の第２の態様の化合物の細胞内への内在化をもたらすものである。
本開示の分子及び標的化部分がポリペプチドである場合、本開示の第２の態様の化合物はまた、調節ドメイン、標的化ドメイン及び標的化部分を含む融合ポリペプチドを構成し得ることが理解されよう。したがって、標的化部分は、それ自体が標的化ドメイン及び調節ドメインを含む融合ポリペプチドに融合されたポリペプチドであり得る。
当業者は、例えば、その細胞に特異的な表面抗原又は分子を同定し、その抗原又は分子の結合パートナーを見つけることによって、任意の所与の細胞に適した結合パートナーを容易に選択することができることが理解される。腫瘍関連抗原、免疫細胞抗原及び感染因子に対する抗体及びそのフラグメントについて、かなりの研究が既に行われている。したがって、いくつかの実施形態では、所与の細胞型に対して適切な標的化部分を選択することは、典型的には、例えば、Ｍｕｒｏ（“Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ，” Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１２，１６４（２）：１２５－３７）及びＣａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ，” Ｅｎｄｏｃｒ－ｒｅｌａｔ Ｃａｎｃｅｒ ２００４，１１：６５９－８７）の総説によって導かれる文献を検索することを含む。或いは、細胞を患者（例えば、生検によって）から採取し、その細胞に対する抗体が調製される。そのような「テーラーメード」抗体は既に知られている。抗体は、得られた患者だけでなく、多数の他の患者についても腫瘍細胞への結合を付与することが実証されている。したがって、複数のそのような抗体が市販されている。所与の望ましくない細胞に適した結合パートナーを同定する他の方法には、遺伝子アプローチ（例えばマイクロアレイ）、プロテオミクスアプローチ（例えば、示差質量分析）、免疫学的アプローチ（例えば、動物を腫瘍細胞で免疫すること、及び悪性細胞を特異的に標的とする抗体分泌クローンを同定すること）、疾患細胞自体に対する抗体ライブラリーを使用したファージディスプレイ選択（表現型スクリーニング；Ｒｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ２０１３，１２：１１，Ｓａｎｄｅｒｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ２０１５，１４：１４７ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１６，７（４２）６８２７８－９１を参照のこと）、及びシステム生物学アプローチを使用して標的を同定するインシリコアプローチが含まれる。
標的化ドメインは、典型的には、調節ドメインを標的基質（例えば、細胞内ポリペプチド）に向けるように細胞の内部で機能するものであり、一方、標的化部分は、典型的には、調節ドメイン及び標的化ドメインをその細胞に標的化するように細胞の外部で機能することが理解されよう。
癌治療などのための抗体－薬物コンジュゲートは、Ｃａｒｔｅｒ ＆ Ｓｅｎｔｅｒ （Ｃａｎｃｅｒ Ｊ ２００８，１４（３）：１５４－６９）、及びＣｈａｒｉ ｅｔ ａｌ（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ２０１４、５３：３７５１）によって総説されており、本開示のこの態様の化合物はそのような抗体薬物コンジュゲートと見なすことができることが理解されよう（米国特許第５，７７３，００１号明細書；米国特許第５，７６７，２８５号明細書；米国特許第５，７３９，１１６号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許出願公開第２００６／００８８５２２号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０００８８４０号明細書；米国特許第７，６５９，２４１号明細書；Ｈｕｇｈｅｓ ２０１０ Ｎａｔ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ９：６６５，Ｌａｓｈ ２０１０；Ｉｎ ｖｉｖｏＴｈｅ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｐｏｒｔ ３２－３８；Ｍａｈａｔｏ ｅｔ ａｌ ２０１１，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ６３：６５９；Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．２００６，ＢＭＣＬ １６：３５８；Ｄｒｕｇｓ Ｒ Ｄ １１（１）：８５－９５も参照されたい）。ＡＤＣは、一般に、腫瘍細胞上に存在する標的に対するモノクローナル抗体、細胞傷害性薬物、及び抗体を薬物に結合するリンカーを含む。したがって、本開示の第２の態様の化合物は、抗体である標的化部分、調節ドメイン及び標的化ドメインを含むＡＤＣであり得る。調節ドメイン及び標的化ドメインの優先傾向には、本開示の第１の態様に関連して上述したものが含まれる。
標的化部分は、既知の方法で本開示の第１の態様の分子に結合され得る。例えば、標的化部分が抗体などのポリペプチドであり、本開示の第１の態様の分子が融合ポリペプチドである場合、標的化部分、調節ドメイン及び標的化ドメインは、当技術分野で周知であり、上記のように、融合ポリペプチドとして発現され得る。或いは、標的化部分は、共有結合又は非共有結合のいずれかで、任意の他の公知の手段によって本開示の第１の態様の分子に結合され得る。
いくつかの実施形態では、標的化部分は、リンカーによって本開示の分子に結合される。リンカーによって、本発明者らは、標的化部分を本開示の第１の態様の分子に結合させる化学的部分の意味を含む。結合は共有結合又は非共有結合であり得る。好ましくは、共有結合性である。したがって、本開示の第１の態様の標的化部分及び分子は、例えば本開示の第１の態様に関連して上述したように、分子を架橋する従来の方法のいずれかによって連結され得る。標的化部分をＴ細胞抗原に結合させるためには、多数のホモ二官能性及びヘテロ二官能性架橋化学が適切であり、任意のそのような化学が使用され得ることが理解されよう。
いくつかの実施形態では、本開示の第１の態様の分子及び本開示の第２の態様の化合物は、適切な核酸分子によってコードされ、適切な宿主細胞で発現される。したがって、本開示の第３の態様は、本開示の第１の態様の分子又は本開示の第２の態様の化合物をコードするポリヌクレオチドを提供する。したがって、本開示の第１の態様の分子又は本開示の第２の態様の化合物が融合ポリペプチドである場合、本開示はそのような融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが理解されよう。本開示の第１の態様の分子及び本開示の第２の態様の化合物の優先傾向は、本開示のそれぞれの態様に関して上述したものを含む。
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよく、又はＲＮＡであってもよい。それは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによって、又は合成反応によってポリマーに組み込むことができる任意の基質を含み得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの構築前又は後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。
本開示の第１の態様の分子又は本開示の第２の態様の化合物をコードする適切な核酸分子は、当技術分野で周知の標準的なクローニング技術、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲを使用して作製され得る。参照により本明細書に組み込まれる、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（ｅｄｓ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに例示されるように、遺伝子及びｃＤＮＡをクローニング及び操作し、ＤＮＡを変異させ、ポリヌクレオチドからポリペプチドを宿主細胞において発現させるための分子生物学的方法は、当技術分野において周知である。適切なポリヌクレオチドの例としては、配列番号２２３～２３５、２４９～２５２及び２５８～２６５が割り当てられている以下の表１２Ｃのものが挙げられ、好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号２２３～２３５、２４９～２５２、２５９、２６２及び２６４のいずれか１つである。
本開示の第４の態様は、本開示の第３の態様のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。ベクターは、任意のタイプのもの、例えば、発現ベクターなどの組換えベクターであり得る。発現ベクターは、宿主細胞におけるポリペプチドの発現及び／又は分泌を可能にする要素（例えば、プロモータ、翻訳の開始及び終結のシグナル、並びに転写の調節の適切な領域）を含有する。適切な発現系には、構成的発現系又は誘導性発現系が含まれる。特に、ベクターはウイルスベクター、例えばレンチウイルス又はアデノウイルス又はレトロウイルスであり得る。最も詳細には、ベクターは、レンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。他のベクターとしては、腫瘍溶解性ウイルスが挙げられる。
特定の実施形態では、核酸分子及びベクターは、以下に記載され、当技術分野で公知の製剤及び方法を使用する遺伝子治療アプローチを介して本開示の治療態様で使用され得ることが理解される。
本開示の第５の態様は、本開示の第３の態様のポリヌクレオチド又は本開示の第４の態様のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、又は真核細胞、例えば哺乳動物細胞、ヒト細胞、酵母、昆虫若しくは植物細胞などの様々な宿主細胞のいずれかを使用することができる。宿主細胞は、癌細胞株などの細胞株であり得る。細胞の適切な例としては、Ａｄ２９３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｕ２０Ｓ、ＨＣＴ１１６、ＨｅＬａ及びＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。多くの適切なベクター及び宿主細胞は、当技術分野で非常によく知られている。好ましくは、宿主細胞は安定な細胞株である。或いは、宿主細胞は、患者から得られた細胞であり得る。
本開示はまた、本開示の第１の態様の分子又は本開示の第２の態様の化合物を作製するための方法を含む。例えば、本開示は、適切な宿主細胞において、本開示の分子若しくは第１の態様又は本開示の第２の態様の化合物をコードする組換えベクターを発現させることと、分子又は化合物を回収することとを含む。ポリペプチドを発現及び精製するための方法は、当技術分野で非常によく知られている。
本開示はまた、本開示の第３の態様に記載のポリヌクレオチド分子又は本開示の第４の態様に記載のベクターを導入することを含む、細胞を作製する方法を提供する。ポリヌクレオチド分子及び／又はベクターを導入する適切な方法には、上記のものが含まれ、一般に当技術分野で公知である。
本開示の分子又は化合物を産生する方法で使用される宿主細胞に加えて、宿主細胞自体を治療、例えば細胞媒介療法で直接使用することができる。例えば、他の翻訳後状態の発現を依然として維持しながら、疾患を引き起こすタンパク質、特に翻訳後状態（例えば、リン酸化状態）を選択的に調節又は分解することが有用であり得る。したがって、本開示は、例えば、医学における使用のために、又は対象における異常なレベルの基質若しくはその形態によって媒介される疾患若しくは状態を予防若しくは治療するために、本開示による宿主細胞を対象に投与することを含む、治療方法を提供する。したがって、本開示はまた、医学における使用のための、例えば、対象における異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態の予防又は治療における使用のための本開示の第５の態様による宿主細胞を提供する。本開示はまた、医薬に使用するための医薬品、例えば被験体において異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態の予防又は治療に使用するための医薬品の製造における宿主細胞の使用を提供する。Ｆｏｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ，“Ｍｕｌｔｉ－ｉｎｐｕｔ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｇｒａｄｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，” Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１９，３７（１０）：１２０９－１６は、細胞療法におけるＰＲＯＴＡＣの使用を記載している。本開示の様々な薬剤（例えば、分子、化合物、ポリヌクレオチド、ベクター及び組成物）を治療にどのように使用することができるかについての更なる議論を以下に提供する。
以下に説明するように、本開示の分子又は本開示の化合物は、任意の他の治療剤（例えば、抗がん化合物）の非存在下で臨床的に有効であり得るが、更なる治療剤と組み合わせて分子又は化合物（又は当該分子又は化合物をコードするポリヌクレオチド）を投与することが有利であり得る。
したがって、本開示の第６の態様は、本開示の第１の態様、本開示の第２の態様による化合物、本開示の第３の態様によるポリヌクレオチド、本開示の第４の態様によるベクター、又は本開示の第５の態様による細胞、及び更なる治療薬を含む組成物を提供する。
一実施形態では、更なる治療剤は、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗糖尿病剤、免疫療法剤、抗炎症剤、抗生物質、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。そのような薬剤の例は当技術分野で周知であり、当業者によって容易に特定することができる。
好ましくは、更なる治療剤は抗癌剤である。更なる抗がん剤は、メクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ－サルコリシン）及びクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード；ヘキサメチルメラミン、チオテパ等のエチレンイミン及びメチルメラミン；ブスルファンなどのアルキルスルホネート；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル－ＣＣＮＵ）、及びストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）等のニトロソ尿素；並びにデカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾール－カルボキサミド）等のトリアゼン；メトトレキサート（アメトプテリン）などの葉酸類似体を含む代謝拮抗剤；フルオロウラシル（５－フルオロウラシル；５－ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン；ＦＵｄＲ）及びシタラビン（シトシンアラビノシド）などのピリミジン類似体；並びにプリン類似体及び関連する阻害剤、例えばメルカプトプリン（６－メルカプトプリン；６ＭＰ）、チオグアニン（６－チオグアニン；ＴＧ）及びペントスタチン（２’－デオキシコホルマイシン）；ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン（ＶＬＢ）及びビンクリスチンを含む天然生成物；エトポシド及びテニポシドなどのエピポドフィロトキシン；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）及びマイトマイシン（マイトマイシンＣ）等の抗生物質；Ｌ－アスパラギナーゼなどの酵素；並びに生物学的応答修飾因子、例えばインターフェロンアルフェノーム；シスプラチン（ｃｉｓ－ＤＤＰ）及びカルボプラチンなどの白金配位錯体を含む種々の薬剤；ミトキサントロン、アントラサイクリン等のアントラセンジオン；ヒドロキシ尿素などの置換尿素；プロカルバジン（Ｎ－メチルヒドラジン、ＭＩＨ）等のメチルヒドラジン誘導体；ミトタン（ｏ，ｐ’－ＤＤＤ）、アミノグルテチミド等の副腎皮質抑制剤；タキソール及び類似体／誘導体；細胞周期阻害剤；ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））などのプロテオソーム阻害剤；イマチニブ（Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標））などのシグナル伝達酵素（例えば、チロシンキナーゼ）阻害剤、ＣＯＸ－２阻害剤、並びにフルタミド及びタモキシフェンなどのホルモンアゴニスト／アンタゴニストを含むアルキル化剤から選択され得る。特に、チラパザミンを利用してもよい。
本開示の第７の態様は、医学における使用のための、本開示の第１の態様による分子、本開示の第２の態様による化合物、本開示の第３の態様によるポリヌクレオチド、本開示の第４の態様によるベクター、本開示の第５の態様による細胞又は本開示の第６の態様による組成物を提供する。
本開示の第８の態様は、本開示の第１の態様による分子、本開示の第２の態様による化合物、本開示の第３の態様によるポリヌクレオチド、本開示の第４の態様によるベクター、本開示の第５の態様による細胞又は本開示の第６の態様による組成物と、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と、を含む医薬組成物を提供する。
本開示の第１の態様に記載の分子、本開示の第２の態様に記載の化合物、本開示の第３の態様に記載のポリヌクレオチド、本開示の第４の態様に記載のベクター、本開示の第５の態様に記載の細胞又は本開示の第６の態様に記載の組成物は、単独で投与することが可能であるが、１つ又は複数の許容される担体、希釈剤又は賦形剤と共に医薬製剤として提供することが好ましい。「薬学的に許容される」とは、製剤が滅菌されており、発熱物質を含まないことを含む。適切な薬学的キャリア、希釈剤及び賦形剤は、薬学の分野で周知である。担体（複数可）は、阻害剤と適合性であり、そのレシピエントに有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。典型的には、担体は、無菌で発熱物質を含まない水又は生理食塩水であるが、他の許容可能な担体が使用されてもよい。
適切な場合、製剤は、単位剤形で提供されてもよく、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製されてもよい。そのような方法は、活性成分（例えば、本開示の分子、化合物、ポリヌクレオチド、ベクター又は組成物）を、１つ以上の補助成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体又は細かく分割された固体担体又はその両方と均一且つ密接に会合させ、次いで、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
経口投与に適した本開示による製剤は、それぞれが所定量の活性成分を含有するカプセル、カシェ剤又は錠剤；粉末又は顆粒として；水性液体又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として；或いは水中油型液体エマルジョン又は油中水型液体エマルジョンとしてなどの個別の単位として提供され得る。活性成分はまた、ボーラス、練り薬又はペーストとして提供されてもよい。
いくつかの実施形態では、単位投与製剤は、有効成分の１日用量若しくは単位、１日サブ用量又はその適切な割合を含有する製剤である。上記で特に言及された成分に加えて、本開示の製剤は、問題の製剤の種類を考慮して当技術分野で慣用的な他の薬剤を含み得、例えば、経口投与に適したものは香味剤を含み得ることを理解されたい。
個体に投与される本開示の薬剤の量は、特定の個体の状態に対抗するのに有効な量である。量は、医師によって決定されてもよい。
好ましくは、本明細書に記載の任意の医学的使用の文脈において、治療される対象はヒトである。或いは、被験体は、動物、例えば家畜（例えば、イヌ又はネコ）、実験動物（例えば実験用げっ歯動物、例えばマウス、ラット又はウサギ）又は農業において重要な動物（すなわち、家畜）、例えばウマ、ウシ、ヒツジ又はヤギであり得る。
本開示の分子は、様々な方法で細胞（例えば、調節する（例えば、分解する）ことが望ましい基質を含有する細胞）に送達することができることが理解されよう。例えば、本開示の分子は、本開示の第２の態様の化合物に関して上述したように、別個の標的化部分に結合しているために、個体の細胞を標的化することができる融合ポリペプチドであり得る。このようにして、融合ポリペプチドは、細胞の近傍にもたらされ、例えば、標的化部分が細胞上の実体（例えば、細胞表面上）に結合した後の内在化によって細胞に送達され得る。或いは、本開示の分子は融合ポリペプチドであってもよく、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入することによって細胞に送達される。
したがって、本開示の第９の態様は、個体の細胞（例えば、調節する（例えば、分解する）ことが望ましい基質を含有する細胞）に本開示の第１の態様による分子を送達する方法を提供し、方法は、本開示の第２の態様の化合物を個体に投与すること、又は本開示の第３の態様のポリヌクレオチド若しくは本開示の第４の態様のベクターを個体に投与することを含み、ここで、ポリヌクレオチド又はベクターは細胞内の分子をコードする。
分子、化合物、ポリヌクレオチド又はベクターは、経口的に、又は任意の非経口経路によって、例えば、有効成分を含む医薬製剤の形態で、場合により、薬学的に許容される剤形の非毒性有機若しくは無機、酸若しくは塩基、付加塩の形態で投与され得る。活性成分は、様々な用量で投与され得る。
本開示はまた、個体の細胞（例えば、調節する（例えば、分解する）ことが望ましい基質を含有する細胞）に本開示の第１の態様の分子を送達するのに使用するための、本開示の第２の態様の化合物、本開示の第３の態様のポリヌクレオチド又は本開示の第４の態様のベクターを提供する。
同様に、本開示はまた、本開示の第１の態様による分子を個体の細胞（例えば、調節する（例えば、分解する）ことが望ましい基質を含有する細胞）に送達するための医薬の製造における、本開示の第２の態様による化合物、本開示の第３の態様によるポリヌクレオチド又は本開示の第４の態様によるベクターの使用を提供する。
本開示の第１０の態様は、キット・オブ・パーツであって、（ａ）ヒトＥ２酵素又はその機能的部分に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメインと、（ｂ）調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインと、を含み、場合により、キットは、Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分を含まない、キット・オブ・パーツを提供する。
調節ドメイン、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメイン、標的化ドメイン、基質及びＥ３ユビキチン又はユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分の優先傾向には、本開示の第１の態様に関して上述したものが含まれる。
一実施形態では、キットは、調節ドメインを標的化ドメインに連結するのに適した連結手段を更に含む。本明細書の他の箇所に記載されるようなリンカーを含む任意の適切な連結手段を使用することができる。したがって、キットは、調節ドメインを標的化ドメインに結合することができるリンカーを更に含み得る。連結は共有結合又は非共有結合であり得る。
更なる実施形態では、キットは、調節される（例えば分解される）基質を含む細胞を標的とすることができる標的化部分を更に含む。したがって、キットは、適切な調節ドメイン、標的化ドメイン及び標的化部分が選択され、次いで組み合わされて所与の個体に合わせた治療を形成する「プラグアンドプレイ」の状況において有用であり得ることが理解されよう。そのようなキットは、本明細書及び以下に記載される本開示の治療態様での使用に適していることが理解されよう。例えば、癌が特定の癌遺伝子の発現又は活性に依存することが示された場合、その癌遺伝子を分解又は他の調節の標的とすることができる。これは、乱雑なＥ２酵素又はその機能的部分若しくはバリアントを使用して達成され得るが、癌遺伝子が特定のＥ２酵素の基質タンパク質であることが知られている場合、そのＥ２酵素が選択され得る。標的化部分の優先傾向には、本開示の第２の態様に関して上述したものが含まれる。標的化部分が抗体であることが好ましい。
本開示の第１１の態様は、キット・オブ・パーツであって、（ａ）本開示の第１の態様の分子と、（ｂ）調節される（例えば分解される）基質を含有する細胞を標的とすることができる標的化部分と、を含むキット・オブ・パーツを提供する。本開示の第１の態様の分子及び基質の優先傾向には、本開示の第１の態様に関して上述したものが含まれ、標的化部分の優先傾向には、本開示の第２の態様に関して上述したものが含まれる。標的化部分が抗体であることが好ましい。再び、そのようなキットは、本明細書及び以下に記載される本開示の治療態様での使用に適しており、「プラグアンドプレイ」の状況で有用であり得ることが理解されよう。
一実施形態では、キットは、本開示の第１の態様の分子を標的化部分に連結するのに適した連結手段を更に含む。本明細書の他の箇所に記載されるようなリンカーを含む任意の適切な連結手段を使用することができる。したがって、キットは、本開示の第１の態様の分子を標的化部分に結合することができるリンカーを更に含み得る。連結は共有結合又は非共有結合であり得る。
本開示の第１２の態様は、キット・オブ・パーツであって、（ａ）ヒトＥ２酵素又はその機能的部分と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメインをコードするポリヌクレオチドと、（ｂ）調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインをコードするポリヌクレオチドと、を含み、場合により、キットは、Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分をコードするポリヌクレオチドを含まない、キット・オブ・パーツを提供する。
調節ドメイン、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメイン、標的化ドメイン、基質及びＥ３ユビキチン又はユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分の優先傾向には、本開示の第１の態様に関して上述したものが含まれる。
実施形態では、キットは、調節される基質を含む細胞におけるポリヌクレオチドの一方又は両方の発現を指令することができる一又は複数のプロモータ配列を含む。プロモータは、構成的に活性であってもよく、又は誘導性であってもよく、それによって細胞におけるポリヌクレオチドの発現の時間的調節を可能にする。発現を特定の細胞型又は組織に標的化するために、組織特異的プロモータを使用することが有用であり得る。そのようなプロモータは当技術分野で周知であり、例えば科学文献を調べることに基づいて、容易に供給又は設計することができる。
本開示によって提供される更なるキット・オブ・パーツは、（ａ）本開示の第１の態様による分子をコードするポリヌクレオチドと、（ｂ）調節される基質を含有する細胞を標的とすることができる標的化部分と、を含む。本開示の第１の態様による分子及び標的化部分の優先傾向には、上記のものが含まれる。そのようなキットは、上記のような「プラグアンドプレイ」システムで使用することもでき、本開示の第１の態様による分子をコードするポリヌクレオチドを使用して、例えば最終的な治療用途に応じて、適切な標的化部分に結合させることができるそのような分子を発現させることができることが理解されよう。
以下に考察するように、本開示の薬剤は、被験体において異常なレベルの基質によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療するのに有用である。したがって、対象を治療する前に、細胞、例えば対象から採取された生検材料中の細胞においてどの基質が異常なレベルにあるかを確認又は確認することが有用であり得ることが理解されよう。したがって、上記のキット・オブ・パーツのいずれかが、調節される基質を含有する細胞の発現プロファイルを評価するための１つ又は複数の試薬を更に含む場合に有用であり得ることが理解されよう。細胞（例えば、生検試料において）の発現プロファイルの評価は、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ転写物）又はタンパク質レベルを測定するための日常的なアッセイを使用して行うことができる。例えば、トランスクリプトーム技術又はプロテオミクス技術が使用され得る。基質をコードする核酸の結合パートナー、基質自体の結合パートナー、及びＰＣＲプライマーを含む任意の適切な試薬を使用することができる。好ましくは、試薬は、基質に結合する抗体である。
以下に更に論じるように、本開示の薬剤は、細胞、組織又は器官の１つ又は複数の特性に対する本開示の分子の効果を評価することによって、基質の機能を評価するのに有用性を有する。したがって、いくつかの実施形態では、上記のキット・オブ・パーツのいずれかは、細胞の特性を評価するための手段を更に含み得る。このようにして、キットをスクリーニングの状況で使用して、例えば、細胞の所与の特性に特定の効果を有する基質を同定することができる。
細胞の特性として、本発明者らは、生存、成長、増殖、分化、遊走、形態、シグナル伝達、代謝活性、遺伝子発現、タンパク質翻訳、及び細胞間相互作用のいずれかを含む。細胞の１つ又は複数の特性を評価することは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して実施することができる。例えば、細胞の生存、成長、増殖、分化、遊走及び形態のいずれかを顕微鏡又は画像分析によって評価することができる。特性はまた、適切なマーカーを使用して検出され得る。例えば、検出可能に標識されたタンパク質、レポーターの発現及び／又は細胞成分及びマーカーの一段階標識は、例えば蛍光顕微鏡法（例えば、細胞－細胞接触を同定するためのＥ－カドヘリン染色）によって、細胞構造、多細胞組織化及び他の読み出しを直接可視化することを可能にし得る。遺伝子発現は、機能的ゲノム（例えば、マイクロアレイ）技術、プロテオミクス技術又は免疫組織化学技術によるタンパク質翻訳などによって評価され得る。免疫蛍光、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ染色又はアネキシンＶアッセイのいずれかを使用することができる。したがって、当業者は、所与の特性を評価するために適切な技術を選択し、それによって適切な手段を選択することができることが理解される。手段の例としては、抗体、プライマー、酵素試薬、イムノアッセイ試薬、目的の実体の検出可能なマーカー（例えば、タンパク質又は核酸）のいずれかが挙げられる。
本開示の第１３の態様は、対象における異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療する方法であって、本開示の第１の態様の分子、本開示の第２の態様の化合物、本開示の第３の態様のポリヌクレオチド、本開示の第４の態様のベクター、本開示の第５の態様による細胞、本開示の第６の態様の組成物、及び本開示の第８の態様の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
同様に、本開示は、被験体において異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療する際に使用するための、本開示の第１の態様の分子、本開示の第２の態様の化合物、本開示の第３の態様のポリヌクレオチド、本開示の第４の態様のベクター、本開示の第５の態様による細胞、本開示の第６の態様の組成物、及び本開示の第８の態様の医薬組成物を提供する。
同様に、本開示は、被験体において異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療するための医薬品の製造における、本開示の第１の態様の分子、本開示の第２の態様の化合物、本開示の第３の態様のポリヌクレオチド、本開示の第４の態様のベクター、本開示の第６の態様の組成物、及び本開示の第８の態様の医薬組成物の使用を提供する。
状態を予防又は治療することによって、本発明者らは、患者の症状を軽減又は緩和すること（すなわち緩和的使用）、症状が悪化又は進行するのを予防すること、障害を治療すること（例えば、原因物質の阻害又は除去によって）、又は状態若しくは障害がない被験体の状態若しくは障害を予防することの意味を含む。
「異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される状態」とは、病理の少なくとも一部が異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される任意の生物学的又は医学的状態又は障害の意味を含む。状態は、基質又はその形態の異常なレベルによって引き起こされ得、そうでなければ、その形態の基質の異常なレベルは、状態の影響であり得る。異常なレベルとは、基質又はその形態が正常な非病的状態の基質又はその形態よりも高い又は低いレベルで存在するという意味を含む。基質自体の量は、病的状態と非病的状態との間で同じままであり得るが、特定の形態（例えば、特定の翻訳後修飾形態）で存在する基質の量の割合は、病的状態ではより高くてもより低くてもよいことが理解されよう。誤解を避けるために、異常なレベルの基質によって、本発明者らは、その基質の形態、例えば翻訳後修飾形態（例えばリン酸化形態）の異常なレベルの意味を含む。特定の状態の例には、癌、糖尿病、自己免疫疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、疼痛、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン病、真菌性疾患、寄生虫性疾患、関節炎、免疫不全、及び炎症性疾患が含まれる。
本開示の薬剤（例えば、本開示の第１の態様の分子、本開示の第２の態様の化合物、本開示の第３の態様のポリヌクレオチド、本開示の第４の態様のベクター、本開示の第５の態様の細胞、本開示の第６の態様の組成物、及び本開示の第８の態様の医薬組成物）は、任意の適切な方法で製剤化され得、及び／又は任意の適切な投与経路によって個体に投与され得、及び／又は例えば上記のように、及び医師によって決定されるように、適切な用量で個体に投与され得る。
本開示の第１４の態様は、基質を調節する方法であって、分子が基質を調節するのに有効な条件下で基質を本開示の第１の態様の分子と接触させることを含む、方法を提供する。本開示の第１の態様の分子及び基質の優先傾向には、上記のものが含まれる。
調節することによって、本発明者らは、ユビキチン又はユビキチン様タンパク質によって媒介され得る任意の可能なタイプの調節、例えば、標的基質の１つ以上の活性を調節すること、及び／又は標的基質の細胞位置を調節すること、及び／又は標的基質の安定性を調節することの意味を含む。好ましくは、調節は、基質を分解することを含む。したがって、実施形態では、調節することは、基質が分解されること、又は基質が分解されることが防止されること、又は基質の細胞内位置が変更されること、又は基質の１つ若しくは複数の活性が調節されること（例えば、増加又は減少）、又は基質の翻訳後修飾の程度が調節されることを含む。この方法は、インビボ又はインビトロで実施され得る。
「分子が基質を調節するのに有効な条件下で」とは、ユビキチン又はユビキチン様タンパク質が基質にコンジュゲートされ、それによって基質が調節され得るように、基質と分子との間の複合体の形成を可能にする条件下で基質が本開示の分子と接触するという意味を含む。最小条件は、Ｅ１タンパク質、ユビキチン又はユビキチン様タンパク質、及びユビキチン又はユビキチン様タンパク質によって媒介される特定の調節のための細胞機構の存在であろう。例えば、特定の調節がユビキチン媒介分解である場合、分子が基質を分解するのに有効な条件には、そのような分解に必要な細胞機構、例えばプロテアソームなどが含まれる。典型的には、この方法は細胞内で行われるため、細胞条件は分子が基質を調節するのに有効である。しかしながら、インビトロでのユビキチン化アッセイは公知であり、したがって、方法は、例えば、ユビキチン又はユビキチン様タンパク質付加の機構、速度論及び位置を更に理解するためにインビトロで行われ得る。
本開示の薬剤は、潜在的な薬物標的として基質を同定及び／又は検証するのに有用であることが理解される。本開示の薬剤は、細胞内基質を含む細胞基質の標的化された調節（例えば、分解）を提供するので、そのような調節の効果は治療状況において有益であり得る。
したがって、本開示の第１５の態様は、基質を潜在的な薬物標的として同定する方法であって、
（ａ）基質を含む細胞、組織又は器官を提供することと、
（ｂ）細胞、組織又は器官を、本開示の第１の態様に記載の分子又は本開示の第２の態様に記載の化合物又は本開示の第３の態様に記載のポリヌクレオチド又は本開示の第４の態様に記載のベクターと接触させることと、
（ｃ）細胞、組織又は器官の１以上の特性に対する分子、化合物、ポリヌクレオチド又はベクターの効果を評価することであって、特定の疾患状態と相関する効果の同定が、基質が特定の疾患に対する潜在的な薬物標的であることを示すことと、を含む、方法を提供する。
適切な細胞、又はそれらに由来し得る組織／器官としては、骨髄、皮膚、軟骨、腱、骨、筋肉（心筋を含む）、血管、角膜、神経、脳、胃腸、腎臓、肝臓、膵臓（膵島細胞を含む）、肺、下垂体、甲状腺、副腎、リンパ、唾液、卵巣、精巣、子宮頸部、膀胱、子宮内膜、前立腺、外陰部及び食道が挙げられる。Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、多形核白血球、マクロファージ及び樹状細胞などの免疫系の様々な細胞も含まれる。細胞は、幹細胞、前駆細胞又は体細胞であり得る。好ましくは、細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞、又はマウス、ラット、ウサギなどの動物由来の細胞である。細胞は、正常若しくは健康な生体組織、又は疾患若しくは病気に罹患している生体組織、例えば腫瘍に由来する組織若しくは体液に由来し得ることが理解される。
方法は、インビボ、エクスビボ又はインビトロで実施され得ることが理解されよう。例えば、方法は、エクスビボで組織又は器官に対して、インビトロで細胞培養物に対して、又はインビボでそれらの天然環境に存在する場合に細胞、組織又は器官に対して実施され得る。
本開示の第１の態様の分子は、本開示の第１の態様の分子若しくは本開示の第２の態様の化合物（例えば、化合物が、細胞の表面上の実体に結合し、化合物の内在化をもたらす標的化部分を含む場合）と直接接触することによって、或いは本開示の第３の態様のポリヌクレオチド若しくは本開示の第４の態様のベクターを発現させることによって、細胞、器官又は組織に送達され得ることが理解されよう。
細胞、組織又は器官の１つ又は複数の特性に対する分子、化合物、ポリヌクレオチド又はベクターの効果を評価することによって、本発明者らは、特定の疾患状態と相関することが知られている細胞、組織又は器官の任意の１つ又は複数の特性に対する効果を評価する意味を含む。このようにして、基質の調節（例えば、分解）が１つ以上の特性に影響を及ぼすことを知ることにより、その基質を特定の疾患に対する潜在的な薬物標的として同定することが可能である。
細胞、組織又は器官の任意の特性を評価することができ、所与の疾患又は状態について、当業者は、評価すべき適切な特性を容易に特定することができるであろう。したがって、１つ又は複数の特性は、本開示の第１２の態様に関連して上述した細胞の特性、例えば、生存、成長、増殖、分化、遊走、形態、シグナル伝達、代謝活性、遺伝子発現、タンパク質翻訳、及び細胞間相互作用からなる群から選択される特性のいずれかであり得る。組織及び器官の特性には、形態及び多細胞構成が含まれる。癌との関連において、評価される特性は、細胞成長、増殖、分化及び遊走のいずれか１つ又は複数を含み得る。
細胞、組織又は器官の１つ又は複数の特性を評価することは、例えば、本開示の第１２の態様に関連して上述したように、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、方法は、上記の本開示のキット・オブ・パーツの１つを使用して実施され得る。
本開示の第１５の態様と同様の方法で、本開示の薬剤は、例えば、基質を分解し、効果を評価することによって、又はそうでなければ基質を調節することによって、基質の機能を評価し、それらのアップレギュレーションの効果を評価するのに有用であり得ることが理解されよう。
したがって、本開示の第１６の態様は、基質の機能を評価する方法であって、
（ａ）基質を含む細胞、組織又は器官を提供することと、
（ｂ）細胞、組織又は器官を、本開示の第１の態様に記載の分子又は本開示の第２の態様に記載の化合物又は本開示の第３の態様に記載のポリヌクレオチド又は本開示の第４の態様に記載のベクターと接触させることと、
（ｃ）細胞、組織又は器官の１つ以上の特性に対する分子、化合物、ポリヌクレオチド又はベクターの効果を評価することと、を含む、方法を提供する。
細胞、組織及び器官の優先傾向、並びに細胞、組織又は器官の１つ又は複数の特性には、本開示の第１５の態様に関連して上述したものが含まれる。
方法は、インビボ、エクスビボ又はインビトロで実施され得ることが理解されよう。例えば、方法は、エクスビボで組織又は器官に対して、インビトロで細胞培養物に対して、又はインビボでそれらの天然環境に存在する場合に細胞、組織又は器官に対して実施され得る。この方法は、例えば、基質が遺伝子によってコードされるタンパク質である場合、細胞遺伝子又はタンパク質の機能の評価を可能にすることも理解されよう。いくつかの実施形態では、方法は、上記の本開示のキット・オブ・パーツの１つを使用して実施され得る。
本開示の第１７の態様は、異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療するのに有用であり得る薬剤を同定する方法であって、
基質を提供することと、
（ａ）ヒトＥ２ユビキチン又はユビキチン様ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメインと、（ｂ）調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインと、を含む試験剤を提供することであって、任意で、試験剤は、Ｅ３ユビキチン又はユビキチン様リガーゼ又はその一部を含まない、ことと、
基質の調節を容易にするために、試験剤に有効な条件下で基質及び試験剤を接触させることと、
試験剤が基質を調節するかどうかを決定することと、を含む、方法を提供する。
基質、並びに異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態に対する選好には、上記のものが含まれる。例えば、基質（例えばタンパク質）は、それ自体又はその形態（例えばリン酸化形態などの翻訳後修飾形態）が特定の疾患又は状態に関与する細胞内タンパク質であり得る。
試験剤は、本開示の第１の態様による分子であってもよいことが理解されよう。したがって、方法は、基質を調節する（例えば、基質を分解する）ための本開示の第１の態様の候補分子の有効性を評価し、それにより、異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態に対抗するのに有用であり得る分子として分子を同定するために使用され得る。
方法は、インビボ、エクスビボ又はインビトロで実施され得ることが理解されよう。例えば、方法は、エクスビボで組織又は器官に対して、インビトロで細胞培養物に対して、又はインビボでそれらの天然環境に存在する場合に細胞、組織又は器官に対して実施され得る。
「試験剤が基質の調節を促進するのに有効な条件」とは、ユビキチン又はユビキチン様タンパク質が基質にコンジュゲートされ、それによって基質が調節され得るように、基質と分子との間の複合体の形成を可能にする条件下で基質が本開示の分子と接触するという意味を含む。最小条件は、本開示の第１４の態様に関して上で定義されたものを含む。本方法が細胞内で実施され、したがって細胞条件が試験剤にとって基質の調節を促進するのに有効である場合が好ましい。しかしながら、インビトロでのユビキチン化アッセイは公知であり、したがって、この方法はインビトロで行われ得る。
好ましい実施形態において、試験剤は、基質を分解するものである。いくつかの例では、試験剤のハイスループットスクリーニングが好ましいこと、及び方法が、当業者に周知の用語である「ライブラリースクリーニング」方法として使用され得ることが理解される。したがって、試験剤は、試験剤のライブラリーであり得る。かかるライブラリーの調製及びスクリーニング方法は、当該技術分野において公知である。
本開示は、疾患又は状態の治療に使用するための薬物又はリード化合物を同定するためのスクリーニング方法を含む。ハイスループット操作が可能なスクリーニングアッセイが特に好ましいことが理解される。基質を調節する（例えば、分解する）試験剤の同定は、薬剤スクリーニング経路の最初の工程であり得、薬剤は、例えば、問題の疾患又は状態のアッセイにおけるその有効性に基づいて更に選択され得、及び／又は更に改変され得ることが理解される。したがって、方法は、問題の疾患又は状態のアッセイにおいて試験剤を試験する工程を更に含み得る。様々な疾患及び状態についてのアッセイは、当技術分野で公知である。
方法は、同定された薬剤又は修飾された薬剤を合成及び／又は精製する更なる工程を含み得る。本開示は、同定された試験剤を合成、精製及び／又は製剤化する工程を更に含み得る。薬剤はまた、当業者に周知のように、他の試験、例えば毒物学又は代謝試験に供され得る。本開示は、薬物標的検証又は創薬における、本開示の第１の態様の分子又は本開示の第２の態様の化合物又は本開示の第３の態様のポリヌクレオチド又は本開示の第４の態様のベクターの使用を含む。
前述の説明では、明確にするために特定の実施形態を単独で説明することができる。特定の実施形態の特徴が別の実施形態の特徴と互換性がないことが特に明示的に指定されない限り、特定の実施形態は、１つ又は複数の実施形態に関連して本明細書に記載された互換性のある特徴の組み合わせを含むことができる。
離散工程を含む本明細書に開示される任意の方法について、工程は任意の実行可能な順序で実行されてもよく、必要に応じて、２つ以上の工程の任意の組み合わせが同時に実行されてもよい。
本明細書で言及される全ての文書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中の先に刊行されたように見える文献の列挙又は説明は、その文献がこの分野の技術水準の一部である、又はよく知られた一般的な知識であると確認したものであると見なすべきではない。
実施例１：Ｅ３融合ポリペプチドとＥ２融合ポリペプチドとを比較するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＳＨＰ２タンパク質の分解。
序論
この実験の目的は、標準的なＥ３リガーゼ「分解」ドメインではなく「調節」ドメイン又は「分解」ドメインとしてＥ２ユビキチン結合酵素を使用することによって、標的タンパク質を分解することができる生物学的ＰＲＯＴＡＣ（本明細書では融合ポリペプチドと呼ばれる）を産生することができるかどうかを決定することであった。以前の研究は、Ｅ３「分解」ドメインを使用する生物学的ＰＲＯＴＡＣが標的タンパク質を分解する能力を実証している（Ｐｏｒｔｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１４ ２８９（１１）：７８４４－５；Ｐａｎ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１６ ７（２８）：４４２９９－４４３０９；Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ，２０１７ ７（５）．ｐｉｉ：１７００６６）。この実験のために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞に、融合ポリペプチド及び対照タンパク質をコードするレンチウイルス構築物を形質導入した。ＵＢＥ２Ｄ１ Ｅ２ユビキチン結合酵素は、リンカー及びＳＨＰ２結合モノボディａＣＳ３の上流のＮ末端「分解」ドメインとして融合タンパク質に組み込まれるように選択された（Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２０１３ １１０（３７）：１４９２４－９）。対照には、ａＣＳ３、ａＣＳ３モノボディ単独、ＶＨＬ単独、ＵＢＥ２Ｄ１単独及び形質導入されていない対照細胞へのＮ末端及びＣ末端Ｅ３リガーゼ（ＶＨＬ；ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌｉｎｄａｕ）ポリペプチド融合物が含まれる。標的ＳＨＰ２分解の程度を、ウエスタンブロット分析及びウエスタンブロットのバンドのデンシトメトリーによって決定することになる。
材料及び方法
主要な「方法」セクションの「レンチウイルス粒子の作製」セクションに記載されているように、レンチウイルス粒子を作製した。以下の融合ポリペプチド（又は個々の成分）をコードするレンチウイルス粒子を、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において産生させた：ＨＡ＿ａＣＳ３（配列番号１４９）、ＨＡ＿ＶＨＬ（配列番号１６８）、ＨＡ＿ＶＨＬ＿Ｌｉｎｋｅｒ４＿ａＣＳ３（配列番号１５４）、ＨＡ＿ａＣＳ３＿Ｌｉｎｋｅｒ４＿ＶＨＬ（配列番号２００）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１（配列番号１６９）、及びＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ４＿ａＣＳ３（配列番号１９４）。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、「レンチウイルスによる細胞の形質導入」に記載される方法に従って形質導入し、主要な方法のセクションの「ウエスタンブロット分析及び定量化」に記載されるようにウエスタンブロット分析のために調製した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１非形質導入対照（「細胞」）溶解物も含まれる。サンプル溶解物のウエスタンブロット分析を、二次ヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００（Ｌｉｃｏｒ＃９２５－３２２１１；１：１５，０００希釈）を含むウサギ抗ＳＨＰ２（ＣＳＴ＃３３９７；１：１０００希釈）を使用して行い、二次ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－６８０７０；１：１５，０００希釈）を含むマウス抗アルファチューブリン（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－４２２１３；１：１０，０００希釈）を使用して行った。次いで、ブロットをＯｄｙｓｓｅｙシステムで可視化し、ウエスタンブロットの濃度測定をＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して行う。各試料について、ＳＨＰ２タンパク質バンドのデンシトメトリー値を、負荷対照（アルファチューブリン）のそれぞれのデンシトメトリー値で割る。次いで、これらの値を、対照（形質導入されていない）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞について観察されたＳＨＰ２／α－チューブリン値のパーセンテージとして示す。
結果
図１Ａは、ＳＨＰ２タンパク質及びアルファ－チューブリン負荷対照を用いたウエスタンブロットを示す。ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ４＿ａＣＳ３の２つの複製試料（図中では「ＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３」とラベル付けされている）は、対照試料と比較してＳＨＰ２タンパク質レベルが低下していることを示す。デンシトメトリー定量は、ＳＨＰ２タンパク質レベルが９０％低下することを示唆している（図１Ｂ）。ＨＡ＿ＶＨＬ＿Ｌｉｎｋｅｒ４＿ａＣＳ３（図中では「ＶＨＬ＿ａＣＳ３」と表示）を発現するサンプルは、検出可能なＳＨＰ２を示さないが、逆配向ＨＡ＿ａＣＳ３＿Ｌｉｎｋｅｒ４＿ＶＨＬサンプル（図中では「ａＣＳ３＿ＶＨＬ」と表示）は、ＳＨＰ２レベルの約７０～８０％の減少をもたらした（図１Ａ及び図１Ｂ）。ＨＡ＿ＶＨＬ単独（図中では「ＶＨＬ」と表示）及びＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１単独（図中では「ＵＢＥ２Ｄ１」と表示）コントロールは、ＳＨＰ２発現レベルに悪影響を及ぼすようには思われなかったが、ＨＡ＿ａＣＳ３モノボディサンプルの複製物は、ＳＨＰ２タンパク質レベルにおけるいくらかの変動性を実証した。
結論
これらのデータは、Ｅ２ユビキチン結合酵素を含む融合ポリペプチドが標的タンパク質発現を低下させることができることを示唆している。この減少の最も可能性の高い方法は、標的ユビキチン化及びその後のプロテアソーム分解によるものである。異なる向きでＶＨＬ融合構築物を試験して観察されたデータは、結合ドメインと分解ドメインの互いに対する向きが、標的ユビキチン化、したがってＥ３リガーゼによる分解の有効性に影響を及ぼし得ることを示唆している。
実施例２Ａ：Ｅ３リガーゼ及びＥ２融合ポリペプチドにおける融合ポリペプチドドメインの配向及びリンカーの長さの調査。
序論
この実験の目的は、「標的化」ドメインと「調節／分解」ドメインとの間のリンカーの長さ、並びにこれらのドメインの互いに対する配向を調査し、これらの変数が融合ポリペプチド媒介性の標的発現の変化にどのように影響したかを決定することであった。図１に示されるデータは、ＶＨＬ（Ｅ３リガーゼ）分解ドメインでは、Ｎ末端位置がより多くの標的ＳＨＰ２分解をもたらしたことを示唆する。これは、Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ，２０１７（５）．ｐｉｉ：１７００６６）によって報告される配向である。この実験のために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞及びＵ２０Ｓ骨肉腫細胞に、融合ポリペプチド及び対照タンパク質をコードするレンチウイルス構築物を形質導入し、両方の向きにおいて短いもの（９アミノ酸リンカー）を長いもの（１９アミノ酸リンカー）と比較した。ＵＢＥ２Ｄ１ Ｅ２ユビキチン結合酵素をＥ２融合ポリペプチド「調節／分解」ドメインとして選択し、ＶＨＬをＥ３融合ポリペプチド「分解ドメイン」として選択した。ＳＨＰ２結合モノボディａＣＳ３（Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２０１３ １１０（３７）：１４９２４－９）を、全ての融合ポリペプチド構築物において「結合」ドメインとして使用した。対照には、ａＣＳ３モノボディ単独、ＶＨＬ単独、ＵＢＥ２Ｄ１単独及び形質導入されていない対照細胞が含まれる。標的ＳＨＰ２分解の程度をウエスタンブロット分析によって決定し、ウエスタンブロットのバンドのデンシトメトリーによって定量した。
材料及び方法
以下の融合ポリペプチド（又は個々の成分）をコードするレンチウイルス粒子を、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において産生させた：ＨＡ＿ａＣＳ３（配列番号１４９）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１（配列番号１６９）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１５９）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ１＿ａＣＳ３（配列番号１５８）、ＨＡ＿ａＣＳ３＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＵＢＥ２Ｄ１（配列番号２０３）、ＨＡ＿ａＣＳ３＿Ｌｉｎｋｅｒ１＿ＵＢＥ２Ｄ１（配列番号２０２）、ＨＡ＿ＶＨＬ（配列番号１６８）、ＨＡ＿ＶＨＬ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１５３）、ＨＡ＿ＶＨＬ＿Ｌｉｎｋｅｒ１＿ａＣＳ３（配列番号１５２）、ＨＡ＿ａＣＳ３＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＶＨＬ（配列番号１９７）、及びＨＡ＿ａＣＳ３＿Ｌｉｎｋｅｒ１＿ＶＨＬ（配列番号１９６）。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＵ２０Ｓ細胞を、「レンチウイルスによる細胞の形質導入」に記載される方法に従って形質導入し、主要な方法のセクションの「ウエスタンブロット分析及び定量化」に記載されるようにウエスタンブロット分析のために調製した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＵ２０Ｓ非形質導入対照（「細胞」）溶解物も含めた。二次ヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００（Ｌｉｃｏｒ＃９２５－３２２１１；１：１５，０００希釈）を含むウサギ抗ＳＨＰ２（ＣＳＴ＃３３９７；１：１０００希釈）、及び二次ヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００（Ｌｉｃｏｒ＃９２５－３２２１１；１：１５，０００希釈）を有するウサギ抗ＧＡＰＤＨ（ＣＳＴ＃５１７４；１：４，０００）を使用して、試料溶解物のウエスタンブロット分析を実施した。ブロットをＯｄｙｓｓｅｙシステムで可視化し、ウエスタンブロットの濃度測定をＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して行った。各試料について、ＳＨＰ２タンパク質バンドのデンシトメトリー値を、負荷対照（ＧＡＰＤＨ）のそれぞれのデンシトメトリー値で割る。次いで、これらの値を、それぞれ対照（形質導入されていない）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＵ２０Ｓ細胞について観察されたＳＨＰ２／ＧＡＰＤＨ値のパーセンテージとして示す。
結果
図２Ａ及び３Ａは、ＳＨＰ２タンパク質及びＧＡＰＤＨ負荷対照バンドを有するウエスタンブロットを示す。ＵＢＥ２Ｄ１「調節／分解」ドメイン構築物は、図２及び図３においてより短い名称Ｅ２Ｄ１を使用している。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株及びＵ２０Ｓ細胞株の両方において、ＵＢＥ２Ｄ１（Ｅ２Ｄ１）融合ポリペプチド構築物は、対照細胞と比較してＳＨＰ２タンパク質レベルの６０～９０％の低下をもたらした（図２及び図３）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では、異なるリンカーの長さ及び配向の間でＳＨＰ２タンパク質の減少に大きな変動はなかった（図２）。Ｕ２０Ｓ細胞では、ＨＡ＿ａＣＳ３＿Ｌｉｎｋｅｒ１＿ＵＢＥ２Ｄ１構築物（図では「ａＣＳ３＿ｓｈｏｒｔ＿Ｅ２Ｄ１」とラベル付けされている）が最も効果的でないフォーマットと思われるわずかにより多くの変動があった（図３Ａ）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＵ２０Ｓ細胞の両方において、Ｎ末端位置にＶＨＬ Ｅ３リガーゼ分解ドメインを有することは、リンカーの長さに関係なくＳＨＰ２レベルの最大の低下をもたらした（図２及び図３）。ａＣＳ３結合ドメインをＶＨＬ分解ドメインに対してＮ末端に有することは、両方の細胞株においてＳＨＰ２タンパク質レベルのあまり効果的でない低下をもたらした（図２及び図３）。
結論
これらのデータは、Ｅ２ユビキチン結合酵素を含む融合ポリペプチドが、Ｅ３リガーゼ融合ポリペプチドよりもドメイン配向の影響を受けにくい可能性があることを示唆している。このデータもまた、ＵＢＥ２Ｄ１を「調節／分解」ドメインとして使用したＥ２融合ポリペプチドが標的ＳＨＰ２タンパク質レベルを低下させることができることを示した。結果のいくつかの間にいくつかの変動が観察され、これは各細胞試料中の構築物活性又は構築物の量の違いを示し得る。
実施例２Ｂ：Ｅ２融合ポリペプチド中の融合ポリペプチドドメインリンカーの長さの更なる調査
序論
ＰＲＯＴＡＣ活性に対する配向の効果の研究に続いて、この実験の目的は、「標的化」ドメインと「調節／分解」ドメインとの間のリンカーの長さを更に調査して、様々なリンカー長が融合ポリペプチド媒介性の標的発現の変化にどのように影響したかを決定することであった。図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ及び図３Ｂに示されるデータは、９アミノ酸リンカー又は１９アミノ酸リンカーを有するＥ２ユビキチン結合酵素を含む融合ポリペプチドが両方とも、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＵ２０Ｓ細胞において標的ＳＨＰ２タンパク質レベルを低下させることができたことを実証している。この実験のために、更なるリンカーを６、１１、１３、１６、１９、２３、２４、２６及び２８アミノ酸の長さで試験した。ＵＢＥ２Ｄ１ Ｅ２ユビキチン結合酵素を、ここでもＥ２融合ポリペプチド「調節／分解」ドメインとして選択した。ＳＨＰ２結合モノボディａＣＳ３（Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２０１３ １１０（３７）：１４９２４－９）を、全ての融合ポリペプチド構築物において「結合」ドメインとして再び使用した。対照には、形質導入されていない対照細胞が含まれる。標的ＳＨＰ２分解の程度をウエスタンブロット分析によって決定し、ウエスタンブロットのバンドのデンシトメトリーによって定量した。
材料及び方法
ｍＲＮＡ合成：Ｅ２Ｄ１＿ａＣＳ３＿ＨＡ（ＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３＿ＨＡ）リンカーバリアントをコードし、Ｔ７プロモータ、５’ＵＴＲ、融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ及びポリＡテールからなる線状ＤＮＡ鋳型を、他の箇所に記載されるようにｍＲＮＡのインビトロ転写に使用した（Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｉｄｉｎｅ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ＨＰＬＣ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １２，５３０－５４２（２０１８））。
融合ポリペプチドを以下の配置で作製した：ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ＿ａＣＳ３＿ＨＡ、野生型ＵＢＥ２Ｄ１を使用、使用されるリンカーは以下の配列に対応する。
Figure 2023550743000001
これらの実験で使用される融合ポリペプチドは、配列番号２３６～２４８のアミノ酸配列をコードする配列番号２２３～２３５の核酸配列に対応する。
ｍＲＮＡによる細胞のトランスフェクション：Ｕ２０Ｓ細胞を、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用してｍＲＮＡでトランスフェクトした。１ウェル当たり４×１０３個のＵ２ＯＳ細胞をコラーゲン被覆９６ウェルプレートに等分し、３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、細胞を１ウェル当たり１００ｎｇの各ｍＲＮＡコード融合ポリペプチド（トランスフェクション試薬としてＲＮＡｉＭＡＸを使用）でトランスフェクトし、３７℃で２４時間インキュベートした。
定量的ＳＨＰ２分解に対する高含有量イメージング細胞：次いで、細胞をパラホルムアルデヒドを使用して固定した。次いで、ＳＨＰ２及びＨＡタグのレベルを、これらのエピトープに特異的な抗体を使用してプローブし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５Ｈｉｇｈ含有イメージングシステムを使用して検出した。ＳＨＰ２レベルを、各実験内の未処理細胞内で見出されたＳＨＰ２レベルに基づいて、０～１００％の範囲に正規化した。データは、ｎ＝３以上の生物学的反復に対応する。
結果
図３Ｃは、様々なアミノ酸長のリンカーを含む構築物についてのＳＨＰ２タンパク質の正規化された蛍光強度を示す。ＵＢＥ２Ｄ１とａＣＳ３結合ドメインとの間のリンカーの長さに対する融合ポリペプチドの有効性の依存性を調べた。一般に、より短いリンカー（長さが６～２０アミノ酸）は、より低い割合の正規化ＳＨＰ２シグナル、次いでより長いリンカーによって示されるように、一貫してより高いＳＨＰ２分解活性を示した。しかしながら、更に長いリンカー（例えば、２４～２８アミノ酸長）は、標的分解活性をもたらした。
結論
これらのデータは、試験した全ての長さのリンカーが標的分解に成功したことを示す。更に、異なるリンカー組成物を、１９アミノ酸残基長（リンカー２及び１１）及び２８アミノ酸残基長（リンカー１５～１８）のリンカーについて試験したところ、リンカーの配列を変えることは標的分解活性を無効にしないことを実証した。試験した全ての組成物は標的分解をもたらした。したがって、リンカーの長さに関係なく、リンカーの配列の変動にもかかわらず、標的分解活性を維持することができる。
実施例３：Ｅ３リガーゼ及びＥ２融合ポリペプチドの活性に対する結合ドメイン親和性の効果の調査。
序論
この実験の目的は、結合ドメインとしてａＣＳ３モノボディ又は変異ａＣＳ３ Ｖ３３Ｒを使用して、標的タンパク質レベルの低下によって測定される生物学的融合ポリペプチドの活性を調べることであった。融合ポリペプチドバリアントをＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＵ２０Ｓ細胞で試験した。報告されたＳＨＰ２に対する高親和性を有する標準的なａＣＳ３モノボディ（ＳＨＰ２ Ｃ－ＳＨ２ドメインＫｄ＝４－９．１ｎＭ）を、より低い親和性を有するＶ３３Ｒ ａＣＳ３変異体（ＳＨＰ２ Ｃ－ＳＨ２ドメインＫｄ＝１．２μＭ）と比較した（Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２０１３ １１０（３７）：１４９２４－９及び補足情報）。Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．による刊行物では、ａＣＳ３モノボディをＣＳ３と呼ばれた。対照には、ａＣＳ３モノボディ単独、ＶＨＬ単独、ＵＢＥ２Ｄ１単独及び形質導入されていない対照細胞が含まれた。ＵＢＥ２Ｄ１又はＶＨＬのＮ末端及びＣ末端調節／分解ドメインを有する融合ポリペプチドを、標準的なａＣＳ３結合ドメイン又はａＣＳ３ Ｖ３３Ｒ結合ドメインのいずれかで試験した。試験した全ての融合ポリペプチド構築物は、１９アミノ酸の「長い」リンカーを有していた。標的ＳＨＰ２分解の程度をウエスタンブロット分析によって決定し、ウエスタンブロットのバンドのデンシトメトリーによって定量した。
材料及び方法
以下の融合ポリペプチド（又は個々の成分）をコードするレンチウイルス粒子を、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において産生させた：ＨＡ＿ａＣＳ３（配列番号１４９）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１（配列番号１６９）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１５９）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｖ３３Ｒ）（配列番号１６０）、ＨＡ＿ａＣＳ３＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＵＢＥ２Ｄ１（配列番号２０３）、ＨＡ＿ａＣＳ３（Ｖ３３Ｒ）＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＵＢＥ２Ｄ１（配列番号１９５）、ＨＡ＿ＶＨＬ（配列番号１６８）、ＨＡ＿ＶＨＬ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１５３）、ＨＡ＿ＶＨＬ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｖ３３Ｒ）（配列番号１５５）、ＨＡ＿ａＣＳ３＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＶＨＬ（配列番号１９７）、及びＨＡ＿ａＣＳ３（Ｖ３３Ｒ）＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＶＨＬ（配列番号２０１）。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＵ２０Ｓ細胞を、「レンチウイルスによる細胞の形質導入」に記載される方法に従って形質導入し、主要な方法のセクションの「ウエスタンブロット分析及び定量化」に記載されるようにウエスタンブロット分析のために調製した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＵ２０Ｓ非形質導入対照（「細胞」）溶解物も含めた。二次ヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００（Ｌｉｃｏｒ＃９２５－３２２１１；１：１５，０００希釈）を含むウサギ抗ＳＨＰ２（ＣＳＴ＃３３９７；１：１０００希釈）、及び二次ヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００（Ｌｉｃｏｒ＃９２５－３２２１１；１：１５，０００希釈）を有するウサギ抗ＧＡＰＤＨ（ＣＳＴ＃５１７４；１：４，０００）を使用して、試料溶解物のウエスタンブロット分析を実施した。次いで、ブロットをＯｄｙｓｓｅｙシステムで可視化し、ウエスタンブロットの濃度測定をＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して行った。各試料について、ＳＨＰ２タンパク質バンドのデンシトメトリー値を、負荷対照（ＧＡＰＤＨ）のそれぞれのデンシトメトリー値で割った。次いで、これらの値を、それぞれ対照（形質導入されていない）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＵ２０Ｓ細胞について観察されたＳＨＰ２／ＧＡＰＤＨ値のパーセンテージとして提供した。
結果
図４Ａ及び５Ａは、ＳＨＰ２タンパク質及びＧＡＰＤＨ負荷対照バンドを有するウエスタンブロットを示す。ＵＢＥ２Ｄ１「調節／分解」ドメイン構築物は、図４及び図５においてより短い名称「Ｅ２Ｄ１」を使用する。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＵ２０Ｓの両方において、標準的なａＣＳ３結合ドメインを有する全ての試料は、変異した低親和性バリアントａＣＳ３（Ｖ３３Ｒ）よりも大きなＳＨＰ２タンパク質レベルの低下を示した。（図４及び図５）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では、標準的なａＣＳ３結合ドメインを有するＵＢＥ２Ｄ１（Ｅ２Ｄ１）融合ポリペプチド構築物（両方の向き）は、ＳＨＰ２タンパク質の約８０～９０％の減少を示した（図４Ｂ）。比較すると、変異ａＣＳ３（Ｖ３３Ｒ）結合ドメインを有するＵＢＥ２Ｄ１（Ｅ２Ｄ１）融合ポリペプチド構築物（両方の向き）は、ＳＨＰ２タンパク質のおよそ３５～６０％の減少を示した（図４Ｂ）。これらの差は、ａＣＳ３を有するＳＨＰ２タンパク質が検出できないＮ末端ＶＨＬ Ｅ３リガーゼ融合ポリペプチドを調べたとき、更に大きかった。しかし、ａＣＳ３（Ｖ３３Ｒ）バリアントでは、対照細胞と比較したＳＨＰ２タンパク質の減少は４０％であった（図４Ｂ）。Ｕ２０Ｓ細胞（図５）では、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞について記載されたものと同様のパターンの結果が観察された（図４）。
結論
これらのデータは、結合ドメインの結合親和性を低下させることによって、融合ポリペプチドの活性が低下し、より多くの標的タンパク質が細胞内で未分解のままであることを示唆している。これらのデータは、結合ドメインの親和性を増加させると、標的タンパク質分解の量を増加させることができることを示唆している。再び、Ｎ末端ＶＨＬ Ｅ３リガーゼ「分解」ドメインを有することを示すデータは、試験したＥ３リガーゼ融合ポリペプチドについて最も活性な配向であった。ＵＢＥ２Ｄ１及びａＣＳ３を使用したＥ２ユビキチン結合「調節／分解」ドメイン構築物は、これまでに試験された両方の向きにおいてかなり同等の活性を実証する。形質導入効率及びレンチウイルス力価の差によって引き起こされ得るいくつかの変動が実施例間で観察された。
実施例４：Ｅ２融合ポリペプチドを使用した内因性ＫＲａｓタンパク質の分解。
序論
この実験の目的は、Ｅ２ユビキチン結合酵素を「調節／分解」ドメインとして含む融合ポリペプチドを使用して、代替の内因性標的タンパク質を分解できるかどうかを決定することであった。これを、２つの異なる細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡｄ２９３細胞において試験した。試験した融合ポリペプチド構築物の結合ドメインは、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）Ｋ１９又はＥ３＿５のいずれかであった。Ｋ１９は、ＧＴＰ結合ＫＲａｓ及びＧＤＰ結合ＫＲａｓの両方に結合する（Ｂｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１９１０（１）：２６０７）。Ｅ３＿５を陰性対照非選択ＤＡＲＰｉｎとして作用させた（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００３ ３３２（２）：４８９－５０３）。対照には、ＤＡＲＰｉｎＥ３＿５単独、ＶＨＬ単独、及び形質導入されていない対照細胞が含まれた。全ての融合ポリペプチドは、ＤＡＲＰｉｎ Ｋ１９又はＥ３＿５のＮ末端「結合ドメイン」及びＵＢＥ２Ｄ１又はＶＨＬのＣ末端「調節／分解」ドメインを含んでいた。構築物中のドメインを２０アミノ酸リンカー（「リンカー３」）によって連結した。標的ＫＲａｓ分解の程度をウエスタンブロット分析によって決定し、ウエスタンブロットのバンドのデンシトメトリーによって定量した。
材料及び方法
以下の融合ポリペプチド（又は個々の成分）をコードするレンチウイルス粒子を、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において産生させた：ＨＡ＿ＶＨＬ（配列番号１６８）、ＨＡ＿Ｅ３＿５（配列番号１５１）、ＨＡ＿Ｋ１９＿Ｌｉｎｋｅｒ３＿ＶＨＬ（配列番号１９８）、ＨＡ＿Ｅ３＿５＿Ｌｉｎｋｅｒ３＿ＶＨＬ（配列番号１９９）、ＨＡ＿Ｋ１９＿Ｌｉｎｋｅｒ３＿ＵＢＥ２Ｄ１（配列番号２０４）、及びＨＡ＿Ｅ３＿５＿Ｌｉｎｋｅｒ３＿ＵＢＥ２Ｄ１（配列番号２０５）。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡｄ２９３細胞を、「レンチウイルスによる細胞の形質導入」に記載される方法に従って形質導入し、主要な方法のセクションの「ウエスタンブロット分析及び定量化」に記載されるようにウエスタンブロット分析のために調製した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡｄ２９３非形質導入対照（「細胞」）溶解物も含めた。サンプル溶解物のウエスタンブロット分析を、二次ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－６８０７０；１：１５，０００希釈）を有するマウス抗ＫＲａｓ（ＬＳ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃ＬＳ－Ｃ１７５６６５；１：２０００希釈）、及び二次ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－６８０７０；１：１５，０００ｄｉｌｕｔｉｏｎ）希釈）を有するマウス抗アルファチューブリン（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－４２２１３；１：１０，０００希釈）を使用して実施した。次いで、ブロットをＯｄｙｓｓｅｙで可視化し、ウエスタンブロットの濃度測定をＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して行う。各試料について、ＫＲａｓタンパク質バンドのデンシトメトリー値を、負荷対照（アルファチューブリン）のそれぞれのデンシトメトリー値で割る。次いで、これらの値を、対照（形質導入されていない）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡｄ２９３細胞についてそれぞれ観察されたＫＲａｓ／α－チューブリン値のパーセンテージとして示す。
結果
Ｅ２ユビキチン結合酵素融合ポリペプチドＫ１９＿Ｅ２Ｄ１（ＨＡ＿Ｋ１９＿Ｌｉｎｋｅｒ３＿ＵＢＥ２Ｄ１）を使用したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＡｄ２９３細胞の両方における図６のウエスタンブロットにおいて、８０％を超える内因性ＫＲａｓの分解が観察された。ＵＢＥ２Ｄ１「調節／分解」ドメイン構築物は、図６においてより短い名称「Ｅ２Ｄ１」を使用する。陰性対照融合ポリペプチドＥ３＿５＿Ｅ２Ｄ１（ＨＡ＿Ｅ３＿５＿Ｌｉｎｋｅｒ３＿ＵＢＥ２Ｄ１）は、これらの細胞においていかなるＫＲａｓ分解ももたらさなかった（図６Ａ及び図６Ｂ）。この形式では、Ｅ２融合ポリペプチド（ＵＢＥ２Ｄ１を使用）は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＡｄ２９３細胞の両方においてＫＲａｓタンパク質レベルを低下させるのにＥ３リガーゼ融合ポリペプチド（ＶＨＬを使用）よりも有効であった。Ｋ１９＿ＶＨＬＥ３リガーゼ融合ポリペプチドは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞においてＫＲａｓタンパク質レベルの低下を示しただけであり、Ａｄ２９３細胞では示さなかった。
結論
これらのデータは、Ｅ２ユビキチン結合酵素「調節／分解」ドメインがＳＨＰ２以外の標的を調節することができることを実証している。この場合、結合ドメイン（ＤＡＲＰｉｎＫ１９）は内因性ＫＲａｓを動員し、ＫＲａｓタンパク質レベルの下流での低下をもたらした。試験したリンカー及びドメイン配向において、ＫＲａｓ標的化Ｅ２融合ポリペプチドは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＡｄ２９３細胞の両方において活性を実証することができた。逆に、ＫＲａｓ標的化Ｅ３融合ポリペプチドは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞においていくらかの活性を有したが、Ａｄ２９３細胞では活性を有さなかった。
これらのデータは、（ｉ）試験されたフォーマットがＥ３融合ポリペプチド活性に最適以下であること（この配向は以前はＳＨＰ２標的化ＶＨＬ融合ポリペプチドにあまり有効でなかったが、このＳＨＰ２の減少にもかかわらず、タンパク質レベルは常に検出されたため）、及び／又は（ｉｉ）Ｅ３リガーゼ融合ポリペプチドが、例えば、ＥｌｏＢ／Ｃ／ＣＵＬ２／ＲＢＸ１ Ｅ３リガーゼ機構に必要とされる特定のアダプタータンパク質の発現レベルに起因して、細胞バックグラウンドに応じて活性が変動しやすい可能性があること、のいずれかを示唆している（図７参照）。Ｅ２融合ポリペプチドは、標的結合及びユビキチン転移をもたらすために複数の内因性タンパク質の発現にあまり依存しないので、これは明らかにＥ２融合ポリペプチドを使用する利点であり、より大きな細胞型パネルでの活性を可能にし得る。
実施例５Ａ：ＳＨＰ２標的化融合ポリペプチドにおける「調節／分解」ドメインとしてのコアＥ２ユビキチン及びユビキチン様コンジュゲート化酵素のパネルの研究。
序論
この実験の目的は、Ｅ２融合ポリペプチドフォーマット、すなわちコアＥ２＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３で発現させた場合に、どのコアＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲート酵素配列が標的タンパク質発現を最大限に低下させることができるかを決定することであった。２６個の異なるコアＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲート化酵素配列を試験し、融合ポリペプチド構築物の発現を試験し、得られたＳＨＰ２タンパク質レベルをウエスタンブロットによって決定し、先の実施例で使用したＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３融合ポリペプチドと比較した。構築物のパネルをＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＵ２０Ｓ細胞において試験した。試験したコアＥ２ドメインは、ＵＢＥ２Ｄ１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ２Ｄ２、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＥ２Ｅ１、ＵＢＥ２Ｆ、ＵＢＥ２Ｇ１、ＵＢＥ２Ｇ２、ＵＢＥ２Ｈ、ＵＢＥ２Ｉ、ＵＢＥ２Ｊ２、ＵＢＥ２Ｋ、ＵＢＥ２Ｌ３、ＵＢＥＬ６、ＵＢＥ２Ｍ、ＵＢＥ２Ｏ、ＵＢＥ２Ｑ１、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２Ｒ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＵＢＥ２Ｔ、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｗ、ＢＩＲＣ６及びＵＦＣ１であった。ウエスタンブロットにおいて、これらのサンプルは、ＵＢＥ２Ｄ１がＥ２Ｄ１として示されるように、最初の文字「ＵＢ」を欠いている短い命名法によって示された（図８Ａ及び図９Ａ）。対照には、ａＣＳ３モノボディ単独及び形質導入されていない対照細胞が含まれた。標的ＳＨＰ２分解の程度をウエスタンブロット分析によって決定し、ウエスタンブロットのバンドのデンシトメトリーによって定量した。
材料及び方法
以下の融合ポリペプチド（又は個々の成分）をコードするレンチウイルス粒子を、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において産生させた：ＨＡ＿ａＣＳ３（配列番号１４９）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１５９）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｂ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１５６）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｃ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１５７）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ２＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１７１）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ３＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１７２）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｅ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１７３）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｆ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１７４）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｇ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１７５）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｇ２＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１７６）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｈ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１７７）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｉ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１７８）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｊ２＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１７９）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｋ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１８０）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｌ３＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１８１）、ＨＡ＿ＵＢＥＬ６＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１８２）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｍ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１８３）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｏ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１８４）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｑ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１８５）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｑ２＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１８６）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｒ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１８７）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｓ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１８８）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｔ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１８９）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｕ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１９０）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｗ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１９１）、ＨＡ＿ＢＩＲＣ６＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１９２）、及びＨＡ＿ＵＦＣ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１９３）．
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＵ２０Ｓ細胞を、「レンチウイルスによる細胞の形質導入」に記載される方法に従って形質導入し、主要な方法のセクションの「ウエスタンブロット分析及び定量化」に記載されるようにウエスタンブロット分析のために調製した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＵ２０Ｓ非形質導入対照（「細胞」）溶解物も含めた。サンプル溶解物のウエスタンブロット分析を、二次ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－６８０７０；１：１５，０００希釈）を有するマウス抗ＳＨＰ２（Ａｂｃａｍ＃ａｂ７６２８５；１：１０００希釈）；二次ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－６８０７０；１：１５，０００希釈）を有するマウス抗αチューブリン（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－４２２１３；１：１０，０００希釈）；及び二次ヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００（Ｌｉｃｏｒ＃９２５－３２２１１；１：１５，０００希釈）を有するウサギ抗ＨＡタグ（Ａｂｃａｍ＃ａｂ１３７８３８；１：１０００）。次いで、ブロットをＯｄｙｓｓｅｙシステムで可視化し、ウエスタンブロットの濃度測定をＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して行った。各試料について、ＳＨＰ２タンパク質バンドのデンシトメトリー値を、負荷対照（アルファチューブリン）のそれぞれのデンシトメトリー値で割った。これらの値は、ＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３Ｅ２融合ポリペプチドについて観察されたＳＨＰ２／アルファチューブリン値のパーセンテージとして提供され（図８Ｂ及び図９Ｂ）、任意の他のコアＥ２が、それぞれＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＵ２０Ｓ細胞における標的タンパク質レベルに対してより大きな効果をもたらし得るかどうかを決定する。
結果
以前のデータと一致して、ＳＨＰ２タンパク質の分解が、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＵ２０Ｓ細胞の両方においてＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（図中では「Ｅ２Ｄ１＿ａＣＳ３」と表示されている）を用いて観察された（それぞれ図８及び図９）。このフォーマットで試験したコアＥ２のいくつか（Ｎ末端Ｅ２コアドメイン及びＣ末端ａＣＳ３結合ドメイン）は、ウエスタンブロットによって決定されるように、ＳＨＰ２タンパク質レベルの小さな減少をもたらした（図８Ａ及び９Ａ）。多くの試験した構築物は、ＳＨＰ２タンパク質レベルを低下させないようであった。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＵ２０Ｓ細胞の両方において一貫して、コアＨＡ＿ＵＢＥ２Ｂ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（図中では「Ｅ２Ｂ＿ａＣＳ３」と表示する）及びより少ない程度にＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ２＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（図中では「Ｅ２Ｄ２＿ａＣＳ３」と表示する）は、ウエスタンブロットのバンド密度測定を定量し、ローディングコントロール（図８Ｂ及び図９Ｂ）に対して正規化したとき、ＳＨＰ２タンパク質レベルをＨＡ＿ＵＢＥＤ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３よりも大きい程度に低下させた。ＨＡウエスタンブロットは、これらのＨＡタグ付き融合ポリペプチド構築物の相対的発現レベル及び／又は安定性を示す。ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３及びＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ２＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３の両方が最小のＨＡバンドを示し、細胞における不良構築物発現又は発現された構築物の安定性の不良を示した。一方、両方の細胞株において、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｂ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３構築物は、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３及びＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ２＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３よりも高いＨＡタグ付きタンパク質発現レベルを示した（図８Ａ及び図９Ａ）。多様な配列のコアＥ２「調節／分解」ドメインを有する試験した構築物の大部分は、細胞内での高レベルの構築物発現及び／又は安定性を示すウエスタンブロットによって高いＨＡバンド強度を示した。
結論
これらのデータは、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｂ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３及びＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ２＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３構築物を使用して標的タンパク質の細胞発現レベルの低下をもたらす標的調節について、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の両方において最も低いＳＨＰ２タンパク質レベルをもたらしたことを示す。他のコアＥ２構築物の多くは、たとえあったとしても、標的発現を最小限に減少させるだけである。Ｅ２ユビキチン結合酵素コアドメイン融合ポリペプチドの場合、標的分解は、標的ユビキチン化、ポリユビキチン化及び最後にプロテアソーム分解を含むユビキチン媒介機構によるものと考えられる。Ｅ２ユビキチン様コンジュゲート酵素コア融合ポリペプチド（例えば、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｆ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｉ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３及びＨＡ＿ＵＢＥ２Ｍ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３）は、他の方法で、例えばユビキチン転移自体の非存在下でのユビキチン様分子の転移で、標的タンパク質を翻訳後に修飾又は調節し得る。
実施例５Ｂ：Ｋ１９標的化融合ポリペプチドにおける「調節／分解」ドメインとしてのコアＥ２ユビキチン及びユビキチン様コンジュゲート化酵素の比較。
序論
ＵＢＥ２Ｄ１（Ｅ２Ｄ１）が異なる内因性標的タンパク質（例えば、ＳＨＰ２及びＫ１９）の分解のためにいずれかの向きで機能するという決定に続いて、この実験の目的は、異なるコアＥ２酵素ＵＢＥ２Ｂが向きに関係なく標的タンパク質発現を減少させることもできるかどうかを決定することであった。構築物をＵ２０Ｓ細胞で試験した。試験したコアＥ２ドメインは、ＵＢＥ２Ｄ１（陽性対照として）及びＵＢＥ２Ｂであった。ウエスタンブロットにおいて、これらのサンプルは、ＵＢＥ２Ｄ１がＥ２Ｄ１として示されるように、最初の文字「ＵＢ」を欠いている短い命名法によって示された（図１３）。対照には、形質導入されていない対照細胞が含まれた。標的Ｋ１９分解の程度をウエスタンブロット分析によって決定し、ウエスタンブロットのバンドのデンシトメトリーによって定量した。
材料及び方法
以下の融合ポリペプチドをコードするレンチウイルス粒子を、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において産生させた：ＨＡ＿Ｋ１９＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＵＢＥ２Ｄ１（配列番号２５３）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿Ｋ１９（配列番号２５４）、ＨＡ＿Ｋ１９＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＵＢＥ２Ｂ（配列番号２５５）、及びＨＡ＿ＵＢＥ２Ｂ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿Ｋ１９（配列番号２５６）。以下の分解ドメインを含有するＰＲＯＴＡＣを調査した。ＵＢＥ２Ｄ１（Ｅ２Ｄ１）、ＵＢＥ２Ｂ（Ｅ２Ｂ）及びＶＨＬ。ＫＲａｓ標的化ＰＲＯＴＡＣを、「結合ドメイン＿分解ドメイン」及び「分解ドメイン＿結合ドメイン」の両方の向きで試験した。陰性対照ＤＡＲＰｉｎＥ３＿５を、両方の向きで様々な分解ドメインと組み合わせて陰性対照結合ドメインとして使用した（配列番号２７４～２７６及び２７８）。Ｅ３分解ドメインを有する融合ポリペプチドも、以下のように対照として含めた：ＨＡ＿ＶＨＬ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿Ｋ１９（配列番号２７７）、及びＨＡ＿Ｋ１９＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＶＨＬ（配列番号２７９）。
ＨＰＡＣ膵臓癌細胞を、「レンチウイルスによる細胞の形質導入」に記載される方法に従って形質導入し、主要な方法のセクションの「ウエスタンブロット分析及び定量化」に記載されるようにウエスタンブロット分析のために調製した。ＨＰＡＣ非形質導入対照（「細胞」）溶解物も含めた。サンプル溶解物のウエスタンブロット分析を、二次ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－６８０７０；１：１５，０００希釈）を有するマウス抗ＫＲａｓ（ＬＳ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃ＬＳ－Ｃ１７５６６５；１：２０００希釈）、及び二次ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－６８０７０；１：１５，０００ｄｉｌｕｔｉｏｎ）希釈）を有するマウス抗アルファチューブリン（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－４２２１３；１：１０，０００希釈）を使用して実施した。次いで、ブロットをＯｄｙｓｓｅｙで可視化し、ウエスタンブロットの濃度測定をＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して行う。各試料について、ＫＲａｓタンパク質バンドのデンシトメトリー値を、負荷対照（アルファチューブリン）のそれぞれのデンシトメトリー値で割る。次いで、これらの値を、対照（形質導入されていない）ＨＰＡＣ細胞について観察されたＫＲａｓ／α－チューブリン値のパーセンテージとして示す。
結果
図１３は、Ｋ１９タンパク質及びα－チューブリン負荷対照バンドを有するウエスタンブロットを示す。ＵＢＥ２Ｄ１及びＵＢＥ２Ｂ’の「調節／分解」ドメイン構築物は、図１３においてより短い名称Ｅ２Ｄ１及びＥ２Ｂを使用している。ＨＰＡＣ細胞では、ＵＢＥ２Ｄ１（Ｅ２Ｄ１）融合ポリペプチド構築物の両方の向きが、対照と比較してＫ１９タンパク質レベルの低下をもたらした（図１３Ａ）。同様に、ＶＨＬ融合ポリペプチド構築物の両方の配向は、対照と比較してＫ１９タンパク質レベルの減少をもたらしたが、Ｋ１９＿ＶＨＬ配向はより低いレベルの減少を示した。これらのデータは、他の細胞株で見られるデータと相関しており、ＨＰＡＣ膵癌細胞がＰＲＯＴＡＣ活性を調べるための追加の有効なモデルであることを実証している。図１３Ｂを参照すると、ＵＢＥ２Ｂ（Ｅ２Ｂ）融合ポリペプチド構築物（両方の向き）をＵＢＥ２Ｄ１（Ｅ２Ｄ１）融合ポリペプチド構築物（両方の向き）と比較し、それらは全てＫ１９タンパク質レベルの７０～９０％の低下をもたらした（Ｋ１９＿Ｅ２Ｄ１ ８７％減少；Ｅ２Ｄ１＿Ｋ１９ ８６％減少；Ｋ１９＿Ｅ２Ｂ ８５％減少；及びＥ２Ｂ＿Ｋ１９ ７９％減少）。
結論
これらのデータは、ＵＢＥ２Ｂ分解ドメインの使用が、ＫＲａｓタンパク質発現の分解、並びに実施例５Ａの代替構築物におけるＳＨＰ２発現の分解をもたらし得ることを示す。更に、ＰＲＯＴＡＣ融合ポリペプチドの両方の配向は、標的分解をもたらすことができる。まとめると、これらのデータは、複数の標的ドメインに融合した複数のＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインが、融合ポリペプチド中のこれらのドメインの配向に関係なく、機能的ＰＲＯＴＡＣをもたらすことを実証している。
実施例６Ａ：ａＣＳ３結合ドメイン中のリジン残基を変異させて、これが細胞における融合ポリペプチドの活性及び安定性を改善するかどうかを決定する。
序論
この実験の目的は、融合ポリペプチド内のａＣＳ３モノボディ（Ｋ７、Ｋ５５及びＫ６４）「結合」ドメインに存在する３つのリジン残基が自己ユビキチン化しやすいかどうかを決定することであった。これらのリジン残基がユビキチン化されている場合、これは融合ポリペプチドの分解、低い安定性及び細胞における低下した活性をもたらし得る。リジン残基を、ＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３構築物の一部として個別に及び組み合わせて変異させた。構造モデリングは、どのアミノ酸残基の変化がモノボディ安定性を保持すべきかを示した。リジン残基Ｋ７をグルタミン（Ｋ７Ｑ）に変異させた。リジン残基Ｋ５５をチロシン（Ｋ５５Ｙ）に変異させ、リジン残基Ｋ６４をヒスチジン（Ｋ６４Ｈ）に変異させた。これらのａＣＳ３バリアントを含有する融合ポリペプチドを発現するＵ２０Ｓ細胞におけるＳＨＰ２分解及び融合ポリペプチド発現に対する効果を、それぞれＳＨＰ２タンパク質及びＨＡタグ発現レベルについてのウエスタンブロット探査によって測定した。アルファ－チューブリン発現レベルを、ローディングコントロールとしてのウエスタンブロットによって決定した。対照試料には、ａＣＳ３モノボディ単独、ＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３（ＷＴ）及び形質導入されていない対照細胞が含まれた。標的ＳＨＰ２分解の程度をウエスタンブロット分析によって決定し、ウエスタンブロットのバンドのデンシトメトリーによって定量した。
材料及び方法
以下の融合ポリペプチド（又は個々の成分）をコードするレンチウイルス粒子を、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において産生させた：ＨＡ＿ａＣＳ３（配列番号１４９）、ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（配列番号１５９）、ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ７Ｑ）（配列番号１６１）、ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ５５Ｙ）（配列番号１６２）、ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ６４Ｈ）（配列番号１６３）、ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ７Ｑ、Ｋ５５Ｙ）（配列番号１６４）、ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ７Ｑ、Ｋ６４Ｈ）（配列番号１６５）、ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ５５Ｙ、Ｋ６４Ｈ）（配列番号１６６）、及びＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ７Ｑ、Ｋ５５Ｙ、Ｋ６４Ｈ）（配列番号１６７）。
Ｕ２０Ｓ細胞を、「レンチウイルスによる細胞の形質導入」に記載される方法に従って形質導入し、主要な方法のセクションの「ウエスタンブロット分析及び定量化」に記載されるようにウエスタンブロット分析のために調製した。Ｕ２０Ｓ非形質導入対照（「細胞」）溶解物も含めた。サンプル溶解物のウエスタンブロット分析を、二次ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－６８０７０；１：１５，０００希釈）を有するマウス抗ＳＨＰ２（Ａｂｃａｍ＃ａｂ７６２８５；１：１０００希釈）；二次ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－６８０７０；１：１５，０００希釈）を有するマウス抗αチューブリン（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－４２２１３；１：１０，０００希釈）；及び二次ヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００（Ｌｉｃｏｒ＃９２５－３２２１１；１：１５，０００希釈）を有するウサギ抗ＨＡタグ（Ａｂｃａｍ＃ａｂ１３７８３８；１：１０００）。次いで、ブロットをＯｄｙｓｓｅｙシステムで可視化し、ウエスタンブロットの濃度測定をＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して行った。各試料について、ＳＨＰ２タンパク質バンドのデンシトメトリー値を、負荷対照（アルファチューブリン）のそれぞれのデンシトメトリー値で割った。これらの値は、Ｕ２０Ｓ対照細胞について観察されたＳＨＰ２／アルファチューブリン値のパーセンテージとして提供される。更に、各試料について、ＨＡタグ付きタンパク質バンドのデンシトメトリー値を、負荷対照（アルファチューブリン）のそれぞれのデンシトメトリー値で割った。これらの値は、細胞における融合ポリペプチドタンパク質発現が、結合ドメインリジン残基を除去することによって改善され得るかどうかを決定するために、ＵＢＥ２Ｄ１＿ａＣＳ３（ＷＴ）について観察されたＨＡ／アルファチューブリン値のパーセンテージとして提供される。
結果
これらの結果は、全てのＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（図中では「Ｅ２Ｄ１＿ａＣＳ３」と表示）試料（野生型及びリジン変異体）が、ＳＨＰ２タンパク質発現の少なくとも７５％の減少をもたらすことができたことを示している（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。これらの結果は、試験した全てのバリアント間で同等であると思われる。全てのリジン変異バリアントはまた、野生型ａＣＳ３バリアントと比較してＨＡ発現レベルの増加を示した（図１０Ｃ）。ＨＡ発現の最大の増加は、単独で、又は他のリジン変異と組み合わせて、７位のリジンの変異（Ｋ７Ｑ）を含むようであり、三重変異体で最も高いレベルが観察された（Ｋ７Ｑ、Ｋ５５Ｙ、Ｋ６４Ｈ；図１０Ｃ）。
結論
これらのデータは、ａＣＳ３モノボディ配列からのリシン残基の除去が、細胞における標的ＳＨＰ２分解の程度に悪影響を及ぼさずに、細胞における融合ポリペプチド発現のレベルを増加させるようであったことを示す。融合ポリペプチドが標的ＳＨＰ２と相互作用する能力を維持しながらＨＡ発現を増加させると思われる重要な残基はＫ７であった。この変異を含む全てのバリアントは、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３ＷＴと比較して改善された安定性及び活性プロファイルを示すようであった。三重変異体（Ｋ７Ｑ、Ｋ５５Ｙ、Ｋ６４Ｈ）は、ＨＡ発現及び標的分解の最大の増加を示した。これらのデータは、Ｅ２融合ポリペプチド構築物内で、リジン残基が、これらを代替残基で置換することによって解決することができる自己ユビキチン化の可能性を表すことを示唆している。この場合、ａＣＳ３モノボディ安定性を維持するための最良の突然変異を選択するために、社内構造モデリング研究を行った。これらのデータは、標的ＳＨＰ２分解が試験したバリアントにおいて同等であるか又は増加しているので、活性が維持されているように見えることを示す。
実施例６Ｂ：融合ポリペプチドのＵＢＥ２Ｄ１又はＵＢＥ２Ｂ調節ドメインの触媒部位を変異させるか、又は標的タンパク質に対する結合ドメイン親和性を低下させると、標的タンパク質の分解が低下する。
序論
この実験の目的は、融合ポリペプチドの活性を変化させる点変異の能力を更に調べることであった。これらの実験は、融合ポリペプチド内のａＣＳ３モノボディ（Ｋ７、Ｋ５５及びＫ６４）「結合」ドメインに存在する３つのリジン残基が、異なるシステイン触媒部位を有するＵＢＥ２Ｄ１及びＵＢＥ２Ｂにおいて自己ユビキチン化しやすいかどうかを決定することを目的とした。これらの変異体はまた、標的タンパク質ＳＨＰ２に対する結合ドメインの親和性を低下させるためにａＣＳ３のＶ３３Ｒ変異を用いて試験した。最後に、ＵＢＥ２Ｄ１を、いくつかのＥ３リガーゼとの相互作用に関与する残基Ｆ６２で更に変異させて、活性に対するその効果を決定した。
材料及び方法
ｍＲＮＡ合成：結合ドメイン及び調節ドメインに種々の点変異を有するＳＨＰ２標的化融合ポリペプチドをコードし、Ｔ７プロモータ、５’ＵＴＲ、融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ及びポリＡテールからなる直鎖ＤＮＡ鋳型を、他の箇所に記載されるようにｍＲＮＡのインビトロ転写に使用した（Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｉｄｉｎｅ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ＨＰＬＣ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １２，５３０－５４２（２０１８））。
使用されるｍＲＮＡ配列は、以下の融合ポリペプチドをコードする。ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ７Ｑ，Ｋ５５Ｙ，Ｋ６４Ｈ）＿ＨＡ（配列番号２４０）、ＵＢＥ２Ｄ１（Ｃ８５Ａ）＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ７Ｑ，Ｋ５５Ｙ，Ｋ６４Ｈ）＿ＨＡ（配列番号２６６）、ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ７Ｑ，Ｋ５５Ｙ，Ｋ６４Ｈ，Ｖ３３Ｒ）＿ＨＡ（配列番号２６７）、ＵＢＥ２Ｄ１（Ｃ８５Ａ）＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ７Ｑ，Ｋ５５Ｙ，Ｋ６４Ｈ，Ｖ３３Ｒ）＿ＨＡ（配列番号２６８）、ＵＢＥ２Ｄ１（Ｆ６２Ａ）＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ７Ｑ，Ｋ５５Ｙ，Ｋ６４Ｈ）＿ＨＡ（配列番号２６９）、ＵＢＥ２Ｂ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ７Ｑ，Ｋ５５Ｙ，Ｋ６４Ｈ）＿ＨＡ（配列番号２７０）、ＵＢＥ２Ｂ（Ｃ８８Ａ）＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ７Ｑ，Ｋ５５Ｙ，Ｋ６４Ｈ）＿ＨＡ（配列番号２７１）、ＵＢＥ２Ｂ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ７Ｑ，Ｋ５５Ｙ，Ｋ６４Ｈ，Ｖ３３Ｒ）＿ＨＡ（配列番号２７２）、及びＵＢＥ２Ｂ（Ｃ８８Ａ）＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ａＣＳ３（Ｋ７Ｑ，Ｋ５５Ｙ，Ｋ６４Ｈ，Ｖ３３Ｒ）＿ＨＡ（配列番号２７３）。
ｍＲＮＡによる細胞のトランスフェクション：Ｕ２０Ｓ細胞を、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用してｍＲＮＡでトランスフェクトした。ウェル当たり３．５×１０５個のＵ２ＯＳ細胞を６ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、細胞を、ウェル当たり３μｇの各ｍＲＮＡコード融合ポリペプチドでトランスフェクトし（トランスフェクション試薬としてＲＮＡｉＭＡＸを使用）、３７℃で２４時間インキュベートした。
ウエスタンブロット分析及び定量化：培地を細胞から除去した後、ＰＢＳで洗浄した。アキュターゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて細胞を回収し、３７℃で３分間インキュベートした。次いで、アキュターゼを完全培地の添加により中和した。次いで、細胞懸濁液を回収し、１２００ｒｐｍ（３００×ｇ）で５分間遠心分離して細胞をペレット化した。細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。次いで、これらのチューブを１２００ｒｐｍ（３００×ｇ）で５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の１：１００希釈物を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解する。溶解物を氷上で３０分間インキュベートした後、４℃で１０分間、１５，０００ｒｐｍ（１７，０００×ｇ）で遠心分離することによって、清澄化した。各溶解物のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製造業者の指示に従って）によって決定した。次いで、各細胞株からの４０μｇの溶解物を４～１２％ＢＯＬＴゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にウェルごとに負荷し、２００Ｖで２５分間実行した後、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の指示に従ってｉＢｌｏｔを使用して膜に転写した。次いで、膜をＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（Ｌｉ－ｃｏｒ）中でブロックし、適切な抗体を使用してウエスタンブロット分析を行った（以下の表２参照）。
次いで、製造業者の説明書（Ｌｉ－ｃｏｒ）に従ってＯｄｙｓｓｅｙシステムでブロットを可視化し、製造業者の説明書（Ｌｉ－ｃｏｒ）に従ってＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用してウエスタンブロットバンドの濃度測定を測定した。
結果
融合ポリペプチドの活性を変化させる点突然変異の能力を更に調べるために、突然変異体結合ドメイン及び調節ドメイン融合ポリペプチドのパネルを調べた。ユビキチン化及びその後の分解のためにＳＨＰ２タンパク質を標的とするバリアント融合ポリペプチドのパネルをコードするｍＲＮＡとＵ２０Ｓ細をトランスフェクトした。細胞を、ＲＮＡｉＭＡＸを使用してトランスフェクトし、２４時間インキュベートし、回収し、ＳＨＰ２タンパク質レベルをウエスタンブロットによって分析した。この実施例で使用した融合ポリペプチドバリアントの結合ドメインは、非変異ａＣＳ３結合ドメインと比較して融合ポリペプチド発現を増加させるためにＫ７Ｑ、Ｋ５５Ｙ及びＫ６４Ｈ点変異を含んでいた（図１０Ｃに示すように）。
調査した更なる点突然変異には、以下が含まれた：
（ｉ）調節ドメイン、例えば、ＵＢＥ２Ｄ１（Ｃ８５Ａ）及びＵＢＥ２Ｂ（Ｃ８８Ａ）の触媒システイン残基を変異させることにより、ＳＨＰ２タンパク質レベルを、調節ドメインの触媒残基を不活性化することによって正常なレベルに（又はほぼ正常なレベルに）救済することがもたらされた（図１０Ｄ、図１０Ｅ及び図１０Ｆを参照されたい）；
（ｉｉ）ａＣＳ３の更なるＶ３３Ｒ変異を含めることによって標的タンパク質ＳＨＰ２に対する結合ドメインの親和性を低下させ、その結果、ＳＨＰ２タンパク質レベルを正常な発現レベルにより近づけること。ＳＨＰ２発現レベルは完全には救済されなかった。これは、ａＣＳ３のＶ３３Ｒ点変異が標的結合を完全に無効にするのではなく、親和性を約１００倍低下させるためであると考えられる（Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ，２０１３ １１０（３７）：１４９２４－９、及び補足情報；図１０Ｄ、図１０Ｅ及び図１０Ｆ参照）；並びに
（ｉｉｉ）Ｅ３リガーゼとの相互作用に関与するＵＢＥ２Ｄ１残基Ｆ６２を変異させて、ＳＨＰ２タンパク質の完全な救済をもたらした活性（すなわちＦ６２Ａ）に対する効果を決定すること。
結論
これらのデータは、Ｅ２調節ドメイン（例えば、ＵＢＥ２Ｄ１又はＵＢＥ２Ｂ）の触媒システインをアラニンに変異させることによって、調節ドメインが不活性化され、標的タンパク質修飾（この場合、ＳＨＰ２のユビキチン化及び分解）が阻害されることを示す。更に、標的タンパク質に対する結合ドメインの親和性を低下させることによって、標的タンパク質修飾の程度も低下する。この例では、ａＣＳ３のＶ３３Ｒ変異は、ＳＨＰ２に対する結合親和性を約１００倍低下させた（Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国特許出願公開第２０１３１１０（３７）号：１４９２４－９及び補足情報）。最後に、これらのデータは、ＵＢＥ２Ｄ１のＦ６２Ａ変異がＳＨＰ２分解を消失させるようであるので、Ｅ３リガーゼとＥ２調節ドメインとの相互作用が調節ドメイン活性にとって重要であり得ることを示唆している。残基Ｆ６２は、ＵＢＥ２Ｄ１とＥ３リガーゼＲＮＦ４との間の相互作用に関与することが構造研究によって示されており（Ｇｕｎｄｏｇｄｕ ａｎｄ Ｗａｌｄｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１９；２８：１７５８－１７７０）、これは、ユビキチン化の触媒に関与し得る。この残基のアラニンへの変異は、融合ポリペプチドが標的ＳＨＰ２分解をもたらすのを妨げると思われるＵＢＥ２Ｄ１とのＥ３相互作用を妨げると仮定された。
実施例７：Ｅ２ユビキチン結合酵素融合ポリペプチドを使用した核標的の分解。
序論
この実験の目的は、Ｅ２融合ポリペプチドフォーマットが主に核標的の分解に成功し得るかどうかを決定することであった。ヒト抗原Ｒは、単一ドメイン抗体／ナノボディ配列がこの標的に利用可能であったため、選択された標的であった。ヒト抗原Ｒ（ＨｕＲ／ＥＬＡＶＬ１）は、標的ｍＲＮＡの安定化及び翻訳アップレギュレーションに関与するＲＮＡ結合タンパク質である。ＨｕＲは主に核に局在するが、異なる刺激に応答して、いくつかの翻訳後修飾によって調節されるプロセスである細胞質に輸送され、これも標的ｍＲＮＡへの結合に影響を及ぼす（Ｄｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．，２００８ ２０：２１６５－２１７３）。この実験のために２つの別個のナノボディ配列を選択した：ＨｕＲ８及びＨｕＲ１７。標的ヒト抗原Ｒに対するＨｕＲ８の結合親和性は２１００ｎＭであり、ＨｕＲ１７の結合親和性は３０ｎＭである。Ｃａｓ９タンパク質を標的とする対照Ｃａｓ９ＶＨＨナノボディ結合ドメインを含めた。Ｃａｓ９は細菌タンパク質であるため、哺乳動物細胞では内因的に発現されない。したがって、Ｃａｓ９ＶＨＨナノボディは、哺乳動物細胞中のいかなるタンパク質にも選択的に結合すべきではない。これらの３つのＶＨＨナノボディは、両方の配向でＵＢＥ２Ｄ１融合体にクローニングされた：（ＵＢ）Ｅ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ＿ＶＨＨ及びＶＨＨ＿Ｌｉｎｋｅｒ＿（ＵＢ）Ｅ２Ｄ１。使用したリンカーは１９アミノ酸リンカー２（配列番号１４２）であった。これらの構築物をコードするレンチウイルス粒子を２つの異なる細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＵ２０Ｓ）に形質導入し、得られたＨｕＲ発現に対する効果をウエスタンブロット分析によって調べた。
材料及び方法
以下の融合ポリペプチド（又は個々の成分）をコードするレンチウイルス粒子を、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において産生させた：ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿Ｃａｓ９、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＨｕＲ８、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＨｕＲ１７、ＨＡ＿Ｃａｓ９＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＵＢＥ２Ｄ１、ＨＡ＿ＨｕＲ８＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＵＢＥ２Ｄ１、及びＨＡ＿ＨｕＲ１７＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＵＢＥ２Ｄ１。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＵ２０Ｓ細胞を、「レンチウイルスによる細胞の形質導入」に記載される方法に従って形質導入し、主要な方法のセクションの「ウエスタンブロット分析及び定量化」に記載されるようにウエスタンブロット分析のために調製した。サンプル溶解物のウエスタンブロット分析を、二次ヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００（Ｌｉｃｏｒ＃９２５－３２２１１；１：１５，０００希釈）を含むウサギ抗ＨｕＲ／ＥＬＡＶＬ１（ＣＳＴ＃１２５８２；１：１０００希釈）を使用して行い、二次ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－６８０７０；１：１５，０００希釈）を含むマウス抗アルファチューブリン（Ｌｉｃｏｒ＃９２６－４２２１３；１：１０，０００希釈）を使用して行った。次いで、ブロットをＯｄｙｓｓｅｙシステムで可視化し、ウエスタンブロットの濃度測定をＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して行った。各試料について、ＨｕＲタンパク質バンドのデンシトメトリー値を、負荷対照（アルファチューブリン）のそれぞれのデンシトメトリー値で割った。次いで、これらの値を、それぞれの対照溶解物（例えば、試験した融合タンパク質の向きに応じてＨＡ＿Ｃａｓ９＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＵＢＥ２Ｄ１又はＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿Ｃａｓ９）について観察されたＨｕＲ／アルファチューブリン値のパーセンテージとして提供する。
結果
これらの結果は、ＨｕＲタンパク質発現が、対照レベルと比較して、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＨｕＲ１７（図中では「ＵＢＥ２Ｄ１＿ＨｕＲ１７」と表示）、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＨｕＲ８（図中では「ＵＢＥ２Ｄ１＿ＨｕＲ８」と表示）、ＨＡ＿ＨｕＲ１７＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＵＢＥ２Ｄ１（図中では「ＨｕＲ１７＿ＵＢＥ２Ｄ１」と表示）及びＨＡ＿ＨｕＲ８＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＵＢＥ２Ｄ１（図中では「ＨｕＲ８＿ＵＢＥ２Ｄ１」と表示）融合タンパク質（図１１及び図１２）を発現するＭＤＡ－ＭＤ－２３１及びＵ２０Ｓ細胞株において低下したことを示す。特定の例では、ＨｕＲレベルは、ＨＡ＿ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿Ｃａｓ９（図中では「ＵＢＥ２Ｄ１＿Ｃａｓ９」と表示）及びＨＡ＿Ｃａｓ９＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿ＵＢＥ２Ｄ１（図中では「Ｃａｓ９＿ＵＢＥ２Ｄ１」と表示）を発現する細胞について観察された対照レベルと比較して９０％も低下した（図１１Ｂ及び図１２Ｄ）。
結論
これらのデータは、ＶＨＨ単一ドメイン抗体（ナノボディ）結合ドメインを含有するＵＢＥ２Ｄ１融合構築物が、標的ＨｕＲ（主に核標的）を首尾よく分解することができることを示す。図１１Ｂ、図１１Ｄ、図１２Ｂ及び図１２Ｄに示される標的ＨｕＲ分解の定量は、ＨｕＲタンパク質の６５～９０％が分解されたことを示唆する。これは、核ＨｕＲが分解画分に含まれることを意味する。
実施例１～７の材料及び方法
レンチウイルス粒子の生成
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、５×１０５細胞／フラスコでＴ２５フラスコに、又は１×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに、以下を含む完全培地に播種した：１０％ｖ／ｖの熱不活化及びガンマ線照射ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＳＡＦＣ）、１％ｖ／ｖのピルビン酸ナトリウム（１００倍；Ｓｉｇｍａ）、１％ｖ／ｖの非必須アミノ酸（１００倍；インビトロジェン）、１％ｖ／ｖのＧｌｕｔａｍａｘ－１（１００倍；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）（最終濃度０．３５ｍｇ／ｍＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で３日間インキュベートして、接着及び８０％コンフルエンスを可能にした。このインキュベーション期間の後、培地を除去し、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎの非存在下で完全培地と交換した。各レンチウイルス世代について、以下を調製した。
Figure 2023550743000002
レンチウイルス産生の規模に応じて、異なる試薬体積を使用した。更なる詳細については、上記の表を参照されたい。１体積の希釈培地（ＯｐｔｉＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ｐＰＡＣＫＨ１ ＤＮＡ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び目的の遺伝子プラスミドＤＮＡ（ｐＣＤＨ＿ｐｕｒｏレンチウイルスプラスミドベクター中）と合わせた。各トランスフェクションについて、第２体積のＯｐｔｉＭＥＭをリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と室温で５分間混合した。次いで、希釈したプラスミド混合物を希釈したリポフェクタミン２０００混合物と合わせ、室温で２０分間インキュベートした後、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を添加し、３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、細胞の各試料から上清を回収し、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（商標）ＧｏＳｔｉｘ（商標）Ｐｌｕｓを製造者の説明書（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）に従って使用してレンチウイルス粒子の存在を確認した。次いで、レンチウイルス粒子を含有する上清を、使用前に滅菌Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）チューブ中０．２２μｍ細孔フィルターに通して濾過した。
レンチウイルスによる細胞の形質導入
Ａｄ２９３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｕ２０Ｓ、ＨＣＴ１１６、ＨｅＬａ及びＨＰＡＣ細胞を、約６０～８０％のコンフルエンスを達成するために、２ｍＬの適切な培地中の６ウェルプレートにおいて成長させる。レンチウイルス形質導入の前に、全ての培地を除去し、１６μｇ／ｍＬポリブレン（最終濃度８μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１０％ＦＢＳを含む２ｍＬのＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と交換した。上記のようにして作製したレンチウイルス粒子を含む２ｍＬの上清を各ウェルに添加した。次いで、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、各細胞型について培地を新鮮な完全培地と交換した。次いで、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で更に２４時間インキュベートした後、選択抗生物質（ピューロマイシン；Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。ピューロマイシンをＡｄ２９３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｕ２０Ｓ及びＨＰＡＣ細胞について２μｇ／ｍＬで添加し、ＨＣＴ１１６細胞については４μｇ／ｍＬ及びＨｅＬａ細胞については１０μｇ／ｍＬで添加した）。細胞を、十分な細胞がウエスタンブロット分析のために収集され得るまで、３７℃、５％ＣＯ２で、抗生物質を含有する関連培地において維持した。細胞試料は、形質導入された細胞のプールを含んでいた。
ウエスタンブロット分析及び定量化
培地を形質導入細胞から除去した後、ＰＢＳで洗浄した。アキュターゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて細胞を回収し、３７℃で３分間インキュベートした。次いで、アキュターゼを完全培地の添加により中和した。次いで、細胞懸濁液を回収し、１２００ｒｐｍ（３００×ｇ）で５分間遠心分離して細胞をペレット化した。細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。次いで、これらのチューブを１２００ｒｐｍ（３００×ｇ）で５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の１：１００希釈物を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解する。溶解物を氷上で３０分間インキュベートした後、４℃、１０，０００ｒｐｍ（１７，０００×ｇ）で１０分間遠心分離することによって清澄化した。上清を新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブに回収し、－８０℃で保存した。各溶解物のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（製造業者の指示に従ってＰｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定した。次いで、各細胞株からの４０μｇの溶解物を４～１２％ＢＯＬＴゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にウェルごとに負荷し、２００Ｖで２５分間実行した後、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の指示に従ってｉＢｌｏｔを使用して膜に転写した。次いで、膜をＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（Ｌｉ－ｃｏｒ）中でブロックし、適切な抗体を使用してウエスタンブロット分析を行った（以下の表２参照）。
Figure 2023550743000003
次いで、製造業者の説明書（Ｌｉ－ｃｏｒ）に従ってＯｄｙｓｓｅｙシステムでブロットを可視化し、製造業者の説明書（Ｌｉ－ｃｏｒ）に従ってＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用してウエスタンブロットバンドの濃度測定を測定した。
Figure 2023550743000004
Figure 2023550743000005
Figure 2023550743000006
Figure 2023550743000007
Figure 2023550743000008
Figure 2023550743000009
Figure 2023550743000010
Figure 2023550743000011
Figure 2023550743000012
Figure 2023550743000013
Figure 2023550743000014
Figure 2023550743000015
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Figure 2023550743000017
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Figure 2023550743000019
Figure 2023550743000020
Figure 2023550743000021
Figure 2023550743000022
Figure 2023550743000023
Figure 2023550743000024
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本明細書で言及される全ての文書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中の先に刊行されたように見える文献の列挙又は説明は、その文献がこの分野の技術水準の一部である、又はよく知られた一般的な知識であると確認したものであると見なすべきではない。
本開示は、例えば、以下に関する。
［１］
分子であって、
（ａ）ヒトＥ２酵素又はその機能的部分と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメインと、
（ｂ）前記調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインと、
を含む、分子。
［２］
Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分を含まない、前記［１］に記載の分子。
［３］
前記調節ドメインが、ユビキチンに結合し、前記ユビキチンを前記基質に転移させることができるＥ２ユビキチンコンジュゲートドメインを含むか、又は前記調節ドメインが、ユビキチン様タンパク質に結合し、前記ユビキチン様タンパク質を前記基質に転移させることができるＥ２ユビキチン様コンジュゲートドメインを含む、前記［１］又は［２］に記載の分子。
［４］
前記ユビキチン様タンパク質が、ＳＵＭＯ、ＮＥＤＤ８、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、ＩＳＧ１５、ＵＦＭ１、ＦＡＴ１０、ＵＲＭ１、又はＦＵＢＩである、前記［３］に記載の分子。
［５］
前記Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインがユビキチンコア触媒（ＵＢＣ）ドメインを含む、前記［１］～［４］のいずれか一項に記載の分子。
［６］
前記ＵＢＣドメインが、１１７～２８４アミノ酸又は１４０～１９２アミノ酸等の１１０～２９０アミノ酸を含む、前記［５］に記載の分子。
［７］
前記ＵＢＣドメインが触媒システイン残基を含有する、前記［１］～［６］のいずれか一項に記載の分子。
［８］
前記ＵＢＣドメインが、ＰｘｘｘＰ（配列番号２０６）ペプチドモチーフ及び前記ＰｘｘｘＰモチーフのＣ末端から２６～４３アミノ酸に位置するトリプトファン残基を含み、場合により、前記ＰｘｘｘＰペプチドモチーフがＰｘｘＰＰ（配列番号２０７）である、前記［５］～［７］のいずれか一項に記載の分子。
［９］
（ｉ）前記ＵＢＣがＨｘＮペプチドモチーフを含み、場合により、前記ＨｘＮモチーフがＨＰＮトリペプチドであるか、又は（ｉｉ）前記ＵＢＣがＴｘＮＧＲＦ（配列番号２１０）ペプチドモチーフを含み、場合により、前記ＴｘＮＧＲＦペプチドモチーフがＴＰＮＧＲＦ（配列番号２０８）又はＴＡＮＧＲＦ（配列番号２０９）である、前記［５］～［８］のいずれか一項に記載の分子。
［１０］
前記Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインが、Ｅ２酵素に由来するか、又は合成である、前記［１］～［９］のいずれか一項に記載の分子。
［１１］
前記調節ドメインが、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含むＥ２酵素を含む、前記［１］～［１０］のいずれか一項に記載の分子。
［１２］
前記Ｅ２酵素が、ファミリ１ Ｅ２酵素、ファミリ２ Ｅ２酵素、ファミリ３ Ｅ２酵素、ファミリ４ Ｅ２酵素、ファミリ５ Ｅ２酵素、ファミリ６ Ｅ２酵素、ファミリ７ Ｅ２酵素、ファミリ８ Ｅ２酵素、ファミリ９ Ｅ２酵素、ファミリ１０ Ｅ２酵素、ファミリ１１ Ｅ２酵素、ファミリ１２ Ｅ２酵素、ファミリ１３ Ｅ２酵素、ファミリ１４ Ｅ２酵素、ファミリ１５ Ｅ２酵素、ファミリ１６ Ｅ２酵素、又はファミリ１７ Ｅ２酵素である、前記［１０］又は［１１］に記載の分子。
［１３］
前記Ｅ２酵素が、クラスＩ Ｅ２酵素、クラスＩＩ Ｅ２酵素、クラスＩＩＩ Ｅ２酵素、又はクラスＩＶ Ｅ２酵素である、前記［１０］～［１２］のいずれか一項に記載の分子。
［１４］
前記Ｅ２酵素が、ヒトＥ２酵素に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記［１０］～［１３］のいずれか一項に記載の分子。
［１５］
前記Ｅ２酵素が、ＵＢＥ２Ａ（ｈＨＲ６Ａ）、ＵＢＥ２Ｂ（ｈＨＲ６Ｂ）、ＵＢＥ２Ｃ（ＵｂｃＨ１０）、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｄ２（ＵｂｃＨ５Ｂ）、ＵＢＥ２Ｄ３（ＵｂｃＨ５Ｃ）、ＵＢＥ２Ｄ４（ＨＢＵＣＥ１）、ＵＢＥ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３（ＵｂｃＨ９）、ＵＢＥ２Ｆ（ＮＣＥ２）、ＵＢＥ２Ｇ１（ＵＢＥ２Ｇ）、ＵＢＥ２Ｇ２（ＵＢＣ７）、ＵＢＥ２Ｈ（ＵＢＣＨ）、ＵＢＥ２Ｉ（Ｕｂｃ９）、ＵＢＥ２Ｊ１（ＮＣＵＢＥ１）、ＵＢＥ２Ｊ２（ＮＣＵＢＥ２）、ＵＢＥ２Ｋ（ＨＩＰ２）、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｌ６（ＵｂｃＨ８）、ＵＢＥ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＵＢＥ２Ｎ（Ｕｂｃ１３）、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ１（ＮＩＣＥ－５）、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１（ＣＤＣ３４）、ＵＢＥ２Ｒ２（ＣＤＣ３４Ｂ）、ＵＢＥ２Ｓ（Ｅ２－ＥＰＦ）、ＵＢＥ２Ｔ（ＨＳＰＣ１５０）、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１（ＵＥＶ－１Ａ）、ＵＢＥ２Ｖ２（ＭＭＳ２）、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＥ２Ｚ（Ｕｓｅ１）、ＵＶＥＬＤ（ＵＥＶ３）、ＢＩＲＣ６（ａｐｏｌｌｏｎ）、ＦＴＳ（ＡＫＴＩＰ）、ＴＳＧ１０１、又はＵＦＣ１である、前記［１０］～［１４］のいずれか一項に記載の分子。
［１６］
前記Ｅ２酵素が、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ２、又はＵＢＥ２Ｒ２である、前記［１０］～［１５］のいずれか一項に記載の分子。
［１７］
前記Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインが、ＵＢＥ２Ａ（ｈＨＲ６Ａ）、ＵＢＥ２Ｂ（ｈＨＲ６Ｂ）、ＵＢＥ２Ｃ（ＵｂｃＨ１０）、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｄ２（ＵｂｃＨ５Ｂ）、ＵＢＥ２Ｄ３（ＵｂｃＨ５Ｃ）、ＵＢＥ２Ｄ４（ＨＢＵＣＥ１）、ＵＢＥ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３（ＵｂｃＨ９）、ＵＢＥ２Ｆ（ＮＣＥ２）、ＵＢＥ２Ｇ１（ＵＢＥ２Ｇ）、ＵＢＥ２Ｇ２（ＵＢＣ７）、ＵＢＥ２Ｈ（ＵＢＣＨ）、ＵＢＥ２Ｉ（Ｕｂｃ９）、ＵＢＥ２Ｊ１（ＮＣＵＢＥ１）、ＵＢＥ２Ｊ２（ＮＣＵＢＥ２）、ＵＢＥ２Ｋ（ＨＩＰ２）、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｌ６（ＵｂｃＨ８）、ＵＢＥ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＵＢＥ２Ｎ（Ｕｂｃ１３）、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ１（ＮＩＣＥ－５）、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１（ＣＤＣ３４）、ＵＢＥ２Ｒ２（ＣＤＣ３４Ｂ）、ＵＢＥ２Ｓ（Ｅ２－ＥＰＦ）、ＵＢＥ２Ｔ（ＨＳＰＣ１５０）、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１（ＵＥＶ－１Ａ）、ＵＢＥ２Ｖ２（ＭＭＳ２）、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＥ２Ｚ（Ｕｓｅ１）、ＵＶＥＬＤ（ＵＥＶ３）、ＢＩＲＣ６（ａｐｏｌｌｏｎ）、ＦＴＳ（ＡＫＴＩＰ）、ＴＳＧ１０１、及びＵＦＣ１（それぞれ配列番号４２～８２）のいずれか１つのＵＢＣドメインと少なくとも８０％の配列同一性のアミノ酸配列を有するＵＢＣドメインを含む、前記［１］～［１６］のいずれか一項に記載の分子。
［１８］
前記Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインが、ＵＢＥ２Ａ（ｈＨＲ６Ａ）、ＵＢＥ２Ｂ（ｈＨＲ６Ｂ）、ＵＢＥ２Ｃ（ＵｂｃＨ１０）、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｄ２（ＵｂｃＨ５Ｂ）、ＵＢＥ２Ｄ３（ＵｂｃＨ５Ｃ）、ＵＢＥ２Ｄ４（ＨＢＵＣＥ１）、ＵＢＥ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３（ＵｂｃＨ９）、ＵＢＥ２Ｆ（ＮＣＥ２）、ＵＢＥ２Ｇ１（ＵＢＥ２Ｇ）、ＵＢＥ２Ｇ２（ＵＢＣ７）、ＵＢＥ２Ｈ（ＵＢＣＨ）、ＵＢＥ２Ｉ（Ｕｂｃ９）、ＵＢＥ２Ｊ１（ＮＣＵＢＥ１）、ＵＢＥ２Ｊ２（ＮＣＵＢＥ２）、ＵＢＥ２Ｋ（ＨＩＰ２）、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｌ６（ＵｂｃＨ８）、ＵＢＥ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＵＢＥ２Ｎ（Ｕｂｃ１３）、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ１（ＮＩＣＥ－５）、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１（ＣＤＣ３４）、ＵＢＥ２Ｒ２（ＣＤＣ３４Ｂ）、ＵＢＥ２Ｓ（Ｅ２－ＥＰＦ）、ＵＢＥ２Ｔ（ＨＳＰＣ１５０）、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１（ＵＥＶ－１Ａ）、ＵＢＥ２Ｖ２（ＭＭＳ２）、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＥ２Ｚ（Ｕｓｅ１）、ＵＶＥＬＤ（ＵＥＶ３）、ＢＩＲＣ６（ａｐｏｌｌｏｎ）、ＦＴＳ（ＡＫＴＩＰ）、ＴＳＧ１０１、及びＵＦＣ１のいずれか１つのＵＢＣドメインを含み、そのＵＢＣドメインのアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４２～８２で特定される、前記［１］～［１７］のいずれか一項に記載の分子。
［１９］
前記調節ドメインが、ＵＢＥ２Ａ（ｈＨＲ６Ａ）、ＵＢＥ２Ｂ（ｈＨＲ６Ｂ）、ＵＢＥ２Ｃ（ＵｂｃＨ１０）、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｄ２（ＵｂｃＨ５Ｂ）、ＵＢＥ２Ｄ３（ＵｂｃＨ５Ｃ）、ＵＢＥ２Ｄ４（ＨＢＵＣＥ１）、ＵＢＥ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３（ＵｂｃＨ９）、ＵＢＥ２Ｆ（ＮＣＥ２）、ＵＢＥ２Ｇ１（ＵＢＥ２Ｇ）、ＵＢＥ２Ｇ２（ＵＢＣ７）、ＵＢＥ２Ｈ（ＵＢＣＨ）、ＵＢＥ２Ｉ（Ｕｂｃ９）、ＵＢＥ２Ｊ１（ＮＣＵＢＥ１）、ＵＢＥ２Ｊ２（ＮＣＵＢＥ２）、ＵＢＥ２Ｋ（ＨＩＰ２）、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｌ６（ＵｂｃＨ８）、ＵＢＥ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＵＢＥ２Ｎ（Ｕｂｃ１３）、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ１（ＮＩＣＥ－５）、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１（ＣＤＣ３４）、ＵＢＥ２Ｒ２（ＣＤＣ３４Ｂ）、ＵＢＥ２Ｓ（Ｅ２－ＥＰＦ）、ＵＢＥ２Ｔ（ＨＳＰＣ１５０）、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１（ＵＥＶ－１Ａ）、ＵＢＥ２Ｖ２（ＭＭＳ２）、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＥ２Ｚ（Ｕｓｅ１）、ＵＶＥＬＤ（ＵＥＶ３）、ＢＩＲＣ６（ａｐｏｌｌｏｎ）、ＦＴＳ（ＡＫＴＩＰ）、ＴＳＧ１０１、及びＵＦＣ１（それぞれ配列番号１～４１）からなる群から選択される前記Ｅ２酵素のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性のアミノ酸配列を有するＥ２酵素を含む、前記［１］～［１８］のいずれか一項に記載の分子。
［２０］
前記調節ドメインが、ＵＢＥ２Ａ（ｈＨＲ６Ａ）、ＵＢＥ２Ｂ（ｈＨＲ６Ｂ）、ＵＢＥ２Ｃ（ＵｂｃＨ１０）、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｄ２（ＵｂｃＨ５Ｂ）、ＵＢＥ２Ｄ３（ＵｂｃＨ５Ｃ）、ＵＢＥ２Ｄ４（ＨＢＵＣＥ１）、ＵＢＥ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３（ＵｂｃＨ９）、ＵＢＥ２Ｆ（ＮＣＥ２）、ＵＢＥ２Ｇ１（ＵＢＥ２Ｇ）、ＵＢＥ２Ｇ２（ＵＢＣ７）、ＵＢＥ２Ｈ（ＵＢＣＨ）、ＵＢＥ２Ｉ（Ｕｂｃ９）、ＵＢＥ２Ｊ１（ＮＣＵＢＥ１）、ＵＢＥ２Ｊ２（ＮＣＵＢＥ２）、ＵＢＥ２Ｋ（ＨＩＰ２）、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｌ６（ＵｂｃＨ８）、ＵＢＥ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＵＢＥ２Ｎ（Ｕｂｃ１３）、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ１（ＮＩＣＥ－５）、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１（ＣＤＣ３４）、ＵＢＥ２Ｒ２（ＣＤＣ３４Ｂ）、ＵＢＥ２Ｓ（Ｅ２－ＥＰＦ）、ＵＢＥ２Ｔ（ＨＳＰＣ１５０）、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１（ＵＥＶ－１Ａ）、ＵＢＥ２Ｖ２（ＭＭＳ２）、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＥ２Ｚ（Ｕｓｅ１）、ＵＶＥＬＤ（ＵＥＶ３）、ＢＩＲＣ６（ａｐｏｌｌｏｎ）、ＦＴＳ（ＡＫＴＩＰ）、ＴＳＧ１０１、及びＵＦＣ１からなる群から選択されるＥ２酵素を含み、そのＥ２酵素のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１～４１で特定される、前記［１］～［１９］のいずれか一項に記載の分子。
［２１］
前記標的化ドメインが前記基質に結合する、前記［１］～［２０］のいずれか一項に記載の分子。
［２２］
前記標的化ドメインが、モノボディ、ナノボディ、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、イントラボディ、ミニボディ、足場タンパク質、例えば、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、ペプチドバインダー及びリガンド結合ドメインのいずれか１つである、前記［１］～［２１］のいずれか一項に記載の分子。
［２３］
前記標的化ドメイン及び／又は調節ドメインがリジン残基を含有しない、前記［１］～［２２］のいずれか一項に記載の分子。
［２４］
前記標的化ドメインが、配列番号１２６～１３５、１３８～１３９、２５７のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、及び／又は前記調節ドメインが、配列番号１～８２のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記［１］～［２３］のいずれか一項に記載の分子。
［２５］
前記標的化ドメインが、配列番号１２６～１３５、１３８～１３９、２５７のいずれか１つのアミノ酸配列若しくは最大２０個のアミノ酸修飾を有するそのバリアントを有し、及び／又は前記調節ドメインが、配列番号１～８２のいずれか１つのアミノ酸配列若しくは最大３０個のアミノ酸修飾を有するそのバリアントを有する、前記［１］～［２４］のいずれか一項に記載の分子。
［２６］
前記標的化ドメインが、リジン残基の１つ又は複数が別のアミノ酸で置換されている、及び／又は欠失されている、配列番号１２６～１３５、１３８～１３９、２５７のいずれか１つのアミノ酸配列のバリアントである；並びに／或いは
前記調節ドメインが、１つ又は複数のリジン残基が別のアミノ酸で置換されている、及び／又は欠失されている、配列番号４２～８２のいずれか１つのアミノ酸配列のバリアントである、
前記［２３］～［２５］のいずれか一項に記載の分子。
［２７］
前記基質が細胞内ポリペプチドである、前記［１］～［２６］のいずれか一項に記載の分子。
［２８］
前記基質が、前記原形質膜、細胞質、核、エンドソーム、小胞体、ミトコンドリア及びゴルジ装置の１つ又は複数に局在する、前記［１］～［２７］のいずれか一項に記載の分子。
［２９］
前記基質が核に局在する、前記［１］～［２８］のいずれか一項に記載の分子。
［３０］
前記基質が、発癌性タンパク質、シグナル伝達タンパク質、ＧＰＣＲ、翻訳後修飾タンパク質、接着タンパク質、受容体、細胞周期タンパク質、チェックポイントタンパク質、ウイルスタンパク質、プリオンタンパク質、細菌タンパク質、寄生性タンパク質、真菌タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、構造タンパク質、酵素、免疫原、抗原、及び／又は病原性タンパク質である、前記［１］～［２８］のいずれか一項に記載の分子。
［３１］
前記基質が、Ｒａｓ、ＫＲａｓ、ＳＨＰ２、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）プロテアーゼ３Ｃ、ムスカリン性アセチルコリン受容体２（Ｍ２Ｒ）、β－２アドレナリン受容体（β２－ＡＲ）、交差結合エンドヌクレアーゼＭＵＳ８１（ＭＵＳ８１）及びヒト抗原Ｒ（ＨｕＲ）からなる群から選択される、前記［１］～［３０］のいずれか一項に記載の分子。
［３２］
前記調節ドメイン及び標的化ドメインが、リンカーによって連結されている、前記［１］～［３１］のいずれか一項に記載の分子。
［３３］
前記リンカーが、ポリペプチドリンカー、例えば、１つ又は複数のグリシン及び／又はセリンアミノ酸残基を含有するポリペプチドである、前記［３２］に記載の分子。
［３４］
前記リンカーが、１～４５アミノ酸長、例えば６～２０アミノ酸長又は５～１９アミノ酸長である、前記［３１］又は［３２］に記載の分子。
［３５］
前記リンカーが、前記ペプチドＧＧＧＧＳ（配列番号１４６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４５）、ＬＥＧＧＧＧＳＳＲ（配列番号１４１）、ＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＲ（配列番号１４２）、ＡＡＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＴ（配列番号１４３）、ＧＧＧＧＧ（配列番号１４４）、ＬＥＧＧＳＲ（配列番号２１１）、ＬＥＧＧＧＳＧＧＳＳＲ（配列番号２１２）、ＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＳＳＲ（配列番号２１３）、ＬＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＳＲ（配列番号２１４）、ＬＥＧＧＧＧＳＧＰＳＧＧＧＧＰＳＧＳＲ（配列番号２１５）、ＬＥＳＮＧＧＧＧＳＰＡＰＡＰＧＧＧＧＳＧＳＳＲ（配列番号２１６）、ＬＥＧＧＧＧＳＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＧＧＧＧＳＳＲ（配列番号２１７）、ＴＧＧＳＡＧＧＳＧＧＳＡＧＧＳＧＧＳＡＧＧＳＧＧＳＡ（配列番号２１８）、ＡＧＳＧＧＳＴＧＳＧＧＳＰＴＰＳＴＳＧＧＳＴＧＳＧＧＡＳ（配列番号２１９）、ＡＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＮＳＳＴＳＧＧＳＧＧＳＧＧＡＳ（配列番号２２０）、ＧＧＳＰＶＰＳＴＰＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＰＶＰＳＴＰＧＳ（配列番号２２１）、又はＳＰＧＴＧＳＰＧＴＧＳＰＧＴＧＳＰＧＴＧＳＰＧＴＧＳＰＧ（配列番号２２２）を含む、前記［３２］～［３４］のいずれか一項に記載の分子。
［３６］
融合ポリペプチドである、前記［１］～［３５］のいずれか一項に記載の分子。
［３７］
前記調節ドメインが、前記標的化ドメインに対してＮ末端である、前記［１］～［３６］のいずれか一項に記載の分子。
［３８］
前記調節ドメインが、前記標的化ドメインに対してＣ末端である、前記［１］～［３６］のいずれか一項に記載の分子。
［３９］
前記Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分が、ＲＩＮＧ（Ｒｅａｌｌｙ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅ）ドメイン、Ｕ－ボックスドメイン、ＨＥＣＴ（Ｅ６－ＡＰカルボキシル末端に相同）ドメイン、及びＲＢＲドメインからなる群から選択される１つ又は複数のドメインを含むものである、前記［２］～［３８］のいずれか一項に記載の分子。
［４０］
検出可能なマーカーを更に含む、前記［１］～［３９］のいずれか一項に記載の分子。
［４１］
前記検出可能なマーカーがリジン残基を含有せず、場合により、前記検出可能なマーカーが赤血球凝集素タグ又はＧｌｕ－Ｇｌｕエピトープタグである、前記［４０］に記載の分子。
［４２］
前記分子が、配列番号１５６～１６７、１７１～１９５、２０２～２０４、２３６～２４８、２５３～２５６、２６７、２７０及び２７２のいずれか１つのアミノ酸配列を有するタンパク質である、前記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の分子。
［４３］
前記分子が、核局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル又はエンドソーム局在化シグナルなどの細胞内局在化シグナルを含む、前記［１］～［４２］のいずれか一項に記載の分子。
［４４］
前記分子が、前記分子の非存在下での基質の量と比較して、前記基質の量を少なくとも２０％減少させることができ、
場合により、前記分子が、他の場合では実質的に同じであるが前記分子を含有しない細胞中の前記基質の量と比較して、細胞中の前記基質の量を少なくとも２０％減少させる、
前記［１］～［４３］のいずれか一項に記載の分子。
［４５］
（ｉ）前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子及び（ｉｉ）前記分子を細胞に標的化することができる標的化部分を含む化合物。
［４６］
前記標的化部分が、抗体などの結合パートナーである、前記［４５］に記載の化合物。
［４７］
前記標的化部分が、前記分子に融合したポリペプチドである、前記［４５］又は［４６］に記載の化合物。
［４８］
任意選択で、前記ポリペプチドが、配列番号２２３～２３５、２４９～２５２及び２５９、２６２及び２６４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む、前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子又は前記［４７］に記載の化合物をコードするポリヌクレオチド。
［４９］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターなどの、前記［４８］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［５０］
前記［４８］に記載のポリヌクレオチド又は前記［４９］に記載のベクターを含む宿主細胞。
［５１］
前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子、前記［４５］～［４７］のいずれか一項に記載の化合物、前記［４８］に記載のポリヌクレオチド、前記［４９］に記載のベクター、又は前記［５０］に記載の宿主細胞、及び更なる治療剤を含む、組成物。
［５２］
前記更なる治療剤が、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗糖尿病剤、免疫治療剤、抗炎症剤、抗生物質、又はそれらの任意の組み合わせである、前記［５１］に記載の組成物。
［５３］
医学に使用するための、前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子、前記［４５］～［４７］のいずれか一項に記載の化合物、前記［４８］に記載のポリヌクレオチド、前記［４９］に記載のベクター、前記［５０］に記載の宿主細胞、又は前記［５１］若しくは［５２］に記載の組成物。
［５４］
前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子、前記［４５］～［４７］のいずれか一項に記載の化合物、前記［４８］に記載のポリヌクレオチド、前記［４９］に記載のベクター、前記［５０］に記載の宿主細胞、又は前記［５１］若しくは［５２］に記載の組成物、及び１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
［５５］
個体に、（ｉ）前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子及び（ｉｉ）前記分子を細胞に標的化することができる標的化部分を含む化合物を投与すること；又は
前記個体に、前記［４８］に記載のポリヌクレオチド又は前記［４９］に記載のベクターを投与することであって、前記ポリヌクレオチド又はベクターが前記細胞内の前記分子をコードする、こと
を含む、前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子を前記個体の前記細胞に送達する方法。
［５６］
前記分子が、前記分子の非存在下での基質の量と比較して、前記基質の量を少なくとも２０％減少させることができ、
場合により、前記分子が、他の場合では実質的に同じであるが前記分子を含有しない細胞中の前記基質の量と比較して、細胞中の前記基質の量を少なくとも２０％減少させる、
前記［５５］に記載の方法。
［５７］
前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子を個体の細胞に送達する際に使用するための、（ｉ）前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子と、（ｉｉ）前記分子を細胞に標的化することができる標的化部分と、を含む化合物。
［５８］
前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子を個体の細胞に送達するための医薬品の製造における、（ｉ）前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子と、（ｉｉ）前記分子を細胞に標的化することができる標的化部分と、を含む化合物の使用。
［５９］
前記分子が、前記分子の非存在下での基質の量と比較して、前記基質の量を少なくとも２０％減少させることができ、
場合により、前記分子が、他の場合では実質的に同じであるが前記分子を含有しない細胞中の前記基質の量と比較して、細胞中の前記基質の量を少なくとも２０％減少させる、
前記［５８］に記載の方法。
［６０］
（ａ）ヒトＥ２酵素又はその機能的部分と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメインと、
（ｂ）前記調節ドメインを前記基質に標的化することができる標的化ドメインと、
を含む、キット・オブ・パーツであって、
場合により、前記キットは、Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分を含まない、
キット・オブ・パーツ。
［６１］
前記調節ドメインを前記標的化ドメインに結合することができるリンカーを更に含む、前記［６０］に記載のキット・オブ・パーツ。
［６２］
（ａ）前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子と、
（ｂ）調節される前記基質を含有する細胞を標的とすることができる標的化部分と、
を含むキット・オブ・パーツであって、
場合により、前記標的化部分が、抗体などの結合パートナーである、
キット・オブ・パーツ。
［６３］
前記調節ドメインを前記標的化ドメインに結合することができるリンカーを更に含む、前記［６２］に記載のキット・オブ・パーツ。
［６４］
（ａ）ヒトＥ２酵素又はその機能的部分と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメインをコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインをコードするポリヌクレオチドと、
を含む、キット・オブ・パーツであって、
場合により、前記キットが、Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分をコードするポリヌクレオチドを含まない、
キット・オブ・パーツ。
［６５］
調節される前記基質を含む細胞における前記ポリヌクレオチドの一方又は両方の発現を指令することができる一又は複数のプロモータ配列を含む、前記［６４］に記載のキット・オブ・パーツ。
［６６］
（ａ）前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子をコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）調節される前記基質を含有する細胞を標的とすることができる標的化部分と、
を含む、キット・オブ・パーツ。
［６７］
調節される前記基質を含有する細胞の発現プロファイルを評価するための１つ又は複数の試薬を更に含む、前記［６０］～［６６］のいずれか一項に記載のキット・オブ・パーツ。
［６８］
細胞の特性を評価するための手段を更に含む、前記［６０］～［６７］のいずれか一項に記載のキット・オブ・パーツ。
［６９］
前記調節ドメインが、前記［１］～［２０］のいずれか一項に定義される通りであり、及び／又は前記標的化ドメインが、前記［２１］～［２６］のいずれか一項に定義される通りである、前記［６０］～［６８］のいずれか一項に記載のキット・オブ・パーツ。
［７０］
前記基質が、前記［２５］～［２８］のいずれか一項に記載の通りである、前記［６０］～［６９］のいずれか一項に記載のキット・オブ・パーツ。
［７１］
前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子又は前記［４５］～［４７］のいずれか一項に記載の化合物を産生する方法であって、前記［４８］に記載のポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させることを含む、方法。
［７２］
前記［４８］に記載のポリヌクレオチド又は前記［４９］に記載のベクターを宿主細胞に導入し、前記分子をコードするポリヌクレオチドを発現させることを含む、前記［７１］に記載の方法。
［７３］
対象において異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療する方法であって、前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子、前記［４５］～［４７］のいずれか一項に記載の化合物、前記［４８］に記載のポリヌクレオチド、前記［４９］に記載のベクター、前記［５０］に記載の細胞、前記［５４］に記載の医薬組成物、又は前記［５１］若しくは［５２］に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
［７４］
前記分子が、前記分子の非存在下での基質の量と比較して、前記基質の量を少なくとも２０％減少させることができ、
場合により、前記分子が、他の場合では実質的に同じであるが前記分子を含有しない細胞中の前記基質の量と比較して、細胞中の前記基質の量を少なくとも２０％減少させる、
前記［７３］に記載の方法。
［７５］
対象における異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療する際に使用するための、前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子、前記［４５］～［４７］のいずれか一項に記載の化合物、前記［４８］に記載のポリヌクレオチド、前記［４９］に記載のベクター、前記［５０］に記載の細胞、前記［５４］に記載の医薬組成物、又は前記［５１］若しくは［５２］に記載の組成物。
［７６］
対象における異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療するための医薬品の製造における、前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子、前記［４５］～［４７］のいずれか一項に記載の化合物、前記［４８］に記載のポリヌクレオチド、前記［４９］に記載のベクター、前記［５０］に記載の細胞、前記［５４］に記載の医薬組成物、又は前記［５１］若しくは［５２］に記載の組成物の使用。
［７７］
前記疾患又は状態が、癌、糖尿病、自己免疫疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、疼痛、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン病、真菌性疾患、寄生虫性疾患、関節炎、免疫不全又は炎症性疾患である、前記［７３］若しくは［７４］に記載の方法又は前記［７５］若しくは［７６］に記載の使用。
［７８］
基質を調節する方法であって、前記分子が前記基質を調節するのに有効な条件下で、前記基質を前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子と接触させることを含む、方法。
［７９］
前記調節することが、前記基質が分解されること、又は前記基質が分解されることが防止されること、又は前記基質の細胞内位置が変更されること、又は前記基質の１つ若しくは複数の活性が調節されること（例えば、増加又は減少）、又は前記基質の翻訳後修飾の程度が調節されることを含む、前記［７８］に記載の方法。
［８０］
潜在的な薬物標的として基質を同定する方法であって、
（ａ）前記基質を含む細胞、組織又は器官を提供することと、
（ｂ）前記細胞、組織又は器官を、前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子、前記［４５］～［４７］のいずれか一項に記載の化合物、前記［４８］に記載のポリヌクレオチド又は前記［４９］に記載のベクターと接触させることと、
（ｃ）前記細胞、組織又は器官の１以上の特性に対する前記分子、化合物、ポリヌクレオチド又はベクターの前記効果を評価することであって、特定の疾患状態と相関する効果の同定が、前記基質が前記特定の疾患に対する潜在的な薬物標的であることを示すことと、
を含む、方法。
［８１］
基質の機能を評価する方法であって、
（ａ）前記基質を含む細胞、組織又は器官を提供することと、
（ｂ）前記細胞、組織又は器官を、前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子、前記［４５］～［４７］のいずれか一項に記載の化合物、前記［４８］に記載のポリヌクレオチド又は前記［４９］に記載のベクターと接触させることと、
（ｃ）前記細胞、組織又は器官の１つ以上の特性に対する前記分子、化合物、ポリヌクレオチド又はベクターの効果を評価することと、
を含む、方法。
［８２］
異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療するのに有用であり得る試験剤を同定する方法であって、
前記基質を提供することと、
（ａ）ヒトＥ２ユビキチン又はユビキチン様ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメインと、（ｂ）前記調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインと、を含む試験剤を提供することであって、任意で、前記試験剤は、Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその一部を含まない、ことと、
前記基質の調節を容易にするために、前記試験剤に有効な条件下で前記基質及び前記試験剤を接触させることと、
前記試験剤が前記基質を調節するかどうかを決定することと、
を含む、方法。
［８３］
前記疾患又は状態のアッセイにおいて前記試験剤を試験することを更に含む、前記［８２］に記載の方法。
［８４］
前記試験剤を合成、精製及び／又は製剤化することを更に含む、前記［８１］又は［８２］に記載の方法。
［８５］
薬物標的検証又は創薬における、前記［１］～［４４］のいずれか一項に記載の分子又は前記［４５］～［４７］のいずれか一項に記載の化合物の使用。

Claims (85)

  1. 分子であって、
    （ａ）ヒトＥ２酵素又はその機能的部分と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメインと、
    （ｂ）前記調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインと、
    を含む、分子。
  2. Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分を含まない、請求項１に記載の分子。
  3. 前記調節ドメインが、ユビキチンに結合し、前記ユビキチンを前記基質に転移させることができるＥ２ユビキチンコンジュゲートドメインを含むか、又は前記調節ドメインが、ユビキチン様タンパク質に結合し、前記ユビキチン様タンパク質を前記基質に転移させることができるＥ２ユビキチン様コンジュゲートドメインを含む、請求項１又は２に記載の分子。
  4. 前記ユビキチン様タンパク質が、ＳＵＭＯ、ＮＥＤＤ８、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、ＩＳＧ１５、ＵＦＭ１、ＦＡＴ１０、ＵＲＭ１、又はＦＵＢＩである、請求項３に記載の分子。
  5. 前記Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインがユビキチンコア触媒（ＵＢＣ）ドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の分子。
  6. 前記ＵＢＣドメインが、１１７～２８４アミノ酸又は１４０～１９２アミノ酸等の１１０～２９０アミノ酸を含む、請求項５に記載の分子。
  7. 前記ＵＢＣドメインが触媒システイン残基を含有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の分子。
  8. 前記ＵＢＣドメインが、ＰｘｘｘＰ（配列番号２０６）ペプチドモチーフ及び前記ＰｘｘｘＰモチーフのＣ末端から２６～４３アミノ酸に位置するトリプトファン残基を含み、場合により、前記ＰｘｘｘＰペプチドモチーフがＰｘｘＰＰ（配列番号２０７）である、請求項５～７のいずれか一項に記載の分子。
  9. （ｉ）前記ＵＢＣがＨｘＮペプチドモチーフを含み、場合により、前記ＨｘＮモチーフがＨＰＮトリペプチドであるか、又は（ｉｉ）前記ＵＢＣがＴｘＮＧＲＦ（配列番号２１０）ペプチドモチーフを含み、場合により、前記ＴｘＮＧＲＦペプチドモチーフがＴＰＮＧＲＦ（配列番号２０８）又はＴＡＮＧＲＦ（配列番号２０９）である、請求項５～８のいずれか一項に記載の分子。
  10. 前記Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインが、Ｅ２酵素に由来するか、又は合成である、請求項１～９のいずれか一項に記載の分子。
  11. 前記調節ドメインが、Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含むＥ２酵素を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の分子。
  12. 前記Ｅ２酵素が、ファミリ１ Ｅ２酵素、ファミリ２ Ｅ２酵素、ファミリ３ Ｅ２酵素、ファミリ４ Ｅ２酵素、ファミリ５ Ｅ２酵素、ファミリ６ Ｅ２酵素、ファミリ７ Ｅ２酵素、ファミリ８ Ｅ２酵素、ファミリ９ Ｅ２酵素、ファミリ１０ Ｅ２酵素、ファミリ１１ Ｅ２酵素、ファミリ１２ Ｅ２酵素、ファミリ１３ Ｅ２酵素、ファミリ１４ Ｅ２酵素、ファミリ１５ Ｅ２酵素、ファミリ１６ Ｅ２酵素、又はファミリ１７ Ｅ２酵素である、請求項１０又は１１に記載の分子。
  13. 前記Ｅ２酵素が、クラスＩ Ｅ２酵素、クラスＩＩ Ｅ２酵素、クラスＩＩＩ Ｅ２酵素、又はクラスＩＶ Ｅ２酵素である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の分子。
  14. 前記Ｅ２酵素が、ヒトＥ２酵素に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の分子。
  15. 前記Ｅ２酵素が、ＵＢＥ２Ａ（ｈＨＲ６Ａ）、ＵＢＥ２Ｂ（ｈＨＲ６Ｂ）、ＵＢＥ２Ｃ（ＵｂｃＨ１０）、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｄ２（ＵｂｃＨ５Ｂ）、ＵＢＥ２Ｄ３（ＵｂｃＨ５Ｃ）、ＵＢＥ２Ｄ４（ＨＢＵＣＥ１）、ＵＢＥ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３（ＵｂｃＨ９）、ＵＢＥ２Ｆ（ＮＣＥ２）、ＵＢＥ２Ｇ１（ＵＢＥ２Ｇ）、ＵＢＥ２Ｇ２（ＵＢＣ７）、ＵＢＥ２Ｈ（ＵＢＣＨ）、ＵＢＥ２Ｉ（Ｕｂｃ９）、ＵＢＥ２Ｊ１（ＮＣＵＢＥ１）、ＵＢＥ２Ｊ２（ＮＣＵＢＥ２）、ＵＢＥ２Ｋ（ＨＩＰ２）、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｌ６（ＵｂｃＨ８）、ＵＢＥ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＵＢＥ２Ｎ（Ｕｂｃ１３）、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ１（ＮＩＣＥ－５）、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１（ＣＤＣ３４）、ＵＢＥ２Ｒ２（ＣＤＣ３４Ｂ）、ＵＢＥ２Ｓ（Ｅ２－ＥＰＦ）、ＵＢＥ２Ｔ（ＨＳＰＣ１５０）、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１（ＵＥＶ－１Ａ）、ＵＢＥ２Ｖ２（ＭＭＳ２）、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＥ２Ｚ（Ｕｓｅ１）、ＵＶＥＬＤ（ＵＥＶ３）、ＢＩＲＣ６（ａｐｏｌｌｏｎ）、ＦＴＳ（ＡＫＴＩＰ）、ＴＳＧ１０１、又はＵＦＣ１である、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の分子。
  16. 前記Ｅ２酵素が、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ２、又はＵＢＥ２Ｒ２である、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の分子。
  17. 前記Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインが、ＵＢＥ２Ａ（ｈＨＲ６Ａ）、ＵＢＥ２Ｂ（ｈＨＲ６Ｂ）、ＵＢＥ２Ｃ（ＵｂｃＨ１０）、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｄ２（ＵｂｃＨ５Ｂ）、ＵＢＥ２Ｄ３（ＵｂｃＨ５Ｃ）、ＵＢＥ２Ｄ４（ＨＢＵＣＥ１）、ＵＢＥ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３（ＵｂｃＨ９）、ＵＢＥ２Ｆ（ＮＣＥ２）、ＵＢＥ２Ｇ１（ＵＢＥ２Ｇ）、ＵＢＥ２Ｇ２（ＵＢＣ７）、ＵＢＥ２Ｈ（ＵＢＣＨ）、ＵＢＥ２Ｉ（Ｕｂｃ９）、ＵＢＥ２Ｊ１（ＮＣＵＢＥ１）、ＵＢＥ２Ｊ２（ＮＣＵＢＥ２）、ＵＢＥ２Ｋ（ＨＩＰ２）、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｌ６（ＵｂｃＨ８）、ＵＢＥ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＵＢＥ２Ｎ（Ｕｂｃ１３）、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ１（ＮＩＣＥ－５）、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１（ＣＤＣ３４）、ＵＢＥ２Ｒ２（ＣＤＣ３４Ｂ）、ＵＢＥ２Ｓ（Ｅ２－ＥＰＦ）、ＵＢＥ２Ｔ（ＨＳＰＣ１５０）、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１（ＵＥＶ－１Ａ）、ＵＢＥ２Ｖ２（ＭＭＳ２）、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＥ２Ｚ（Ｕｓｅ１）、ＵＶＥＬＤ（ＵＥＶ３）、ＢＩＲＣ６（ａｐｏｌｌｏｎ）、ＦＴＳ（ＡＫＴＩＰ）、ＴＳＧ１０１、及びＵＦＣ１（それぞれ配列番号４２～８２）のいずれか１つのＵＢＣドメインと少なくとも８０％の配列同一性のアミノ酸配列を有するＵＢＣドメインを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の分子。
  18. 前記Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインが、ＵＢＥ２Ａ（ｈＨＲ６Ａ）、ＵＢＥ２Ｂ（ｈＨＲ６Ｂ）、ＵＢＥ２Ｃ（ＵｂｃＨ１０）、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｄ２（ＵｂｃＨ５Ｂ）、ＵＢＥ２Ｄ３（ＵｂｃＨ５Ｃ）、ＵＢＥ２Ｄ４（ＨＢＵＣＥ１）、ＵＢＥ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３（ＵｂｃＨ９）、ＵＢＥ２Ｆ（ＮＣＥ２）、ＵＢＥ２Ｇ１（ＵＢＥ２Ｇ）、ＵＢＥ２Ｇ２（ＵＢＣ７）、ＵＢＥ２Ｈ（ＵＢＣＨ）、ＵＢＥ２Ｉ（Ｕｂｃ９）、ＵＢＥ２Ｊ１（ＮＣＵＢＥ１）、ＵＢＥ２Ｊ２（ＮＣＵＢＥ２）、ＵＢＥ２Ｋ（ＨＩＰ２）、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｌ６（ＵｂｃＨ８）、ＵＢＥ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＵＢＥ２Ｎ（Ｕｂｃ１３）、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ１（ＮＩＣＥ－５）、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１（ＣＤＣ３４）、ＵＢＥ２Ｒ２（ＣＤＣ３４Ｂ）、ＵＢＥ２Ｓ（Ｅ２－ＥＰＦ）、ＵＢＥ２Ｔ（ＨＳＰＣ１５０）、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１（ＵＥＶ－１Ａ）、ＵＢＥ２Ｖ２（ＭＭＳ２）、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＥ２Ｚ（Ｕｓｅ１）、ＵＶＥＬＤ（ＵＥＶ３）、ＢＩＲＣ６（ａｐｏｌｌｏｎ）、ＦＴＳ（ＡＫＴＩＰ）、ＴＳＧ１０１、及びＵＦＣ１のいずれか１つのＵＢＣドメインを含み、そのＵＢＣドメインのアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４２～８２で特定される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の分子。
  19. 前記調節ドメインが、ＵＢＥ２Ａ（ｈＨＲ６Ａ）、ＵＢＥ２Ｂ（ｈＨＲ６Ｂ）、ＵＢＥ２Ｃ（ＵｂｃＨ１０）、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｄ２（ＵｂｃＨ５Ｂ）、ＵＢＥ２Ｄ３（ＵｂｃＨ５Ｃ）、ＵＢＥ２Ｄ４（ＨＢＵＣＥ１）、ＵＢＥ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３（ＵｂｃＨ９）、ＵＢＥ２Ｆ（ＮＣＥ２）、ＵＢＥ２Ｇ１（ＵＢＥ２Ｇ）、ＵＢＥ２Ｇ２（ＵＢＣ７）、ＵＢＥ２Ｈ（ＵＢＣＨ）、ＵＢＥ２Ｉ（Ｕｂｃ９）、ＵＢＥ２Ｊ１（ＮＣＵＢＥ１）、ＵＢＥ２Ｊ２（ＮＣＵＢＥ２）、ＵＢＥ２Ｋ（ＨＩＰ２）、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｌ６（ＵｂｃＨ８）、ＵＢＥ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＵＢＥ２Ｎ（Ｕｂｃ１３）、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ１（ＮＩＣＥ－５）、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１（ＣＤＣ３４）、ＵＢＥ２Ｒ２（ＣＤＣ３４Ｂ）、ＵＢＥ２Ｓ（Ｅ２－ＥＰＦ）、ＵＢＥ２Ｔ（ＨＳＰＣ１５０）、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１（ＵＥＶ－１Ａ）、ＵＢＥ２Ｖ２（ＭＭＳ２）、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＥ２Ｚ（Ｕｓｅ１）、ＵＶＥＬＤ（ＵＥＶ３）、ＢＩＲＣ６（ａｐｏｌｌｏｎ）、ＦＴＳ（ＡＫＴＩＰ）、ＴＳＧ１０１、及びＵＦＣ１（それぞれ配列番号１～４１）からなる群から選択される前記Ｅ２酵素のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性のアミノ酸配列を有するＥ２酵素を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の分子。
  20. 前記調節ドメインが、ＵＢＥ２Ａ（ｈＨＲ６Ａ）、ＵＢＥ２Ｂ（ｈＨＲ６Ｂ）、ＵＢＥ２Ｃ（ＵｂｃＨ１０）、ＵＢＥ２Ｄ１（ＵｂｃＨ５Ａ）、ＵＢＥ２Ｄ２（ＵｂｃＨ５Ｂ）、ＵＢＥ２Ｄ３（ＵｂｃＨ５Ｃ）、ＵＢＥ２Ｄ４（ＨＢＵＣＥ１）、ＵＢＥ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３（ＵｂｃＨ９）、ＵＢＥ２Ｆ（ＮＣＥ２）、ＵＢＥ２Ｇ１（ＵＢＥ２Ｇ）、ＵＢＥ２Ｇ２（ＵＢＣ７）、ＵＢＥ２Ｈ（ＵＢＣＨ）、ＵＢＥ２Ｉ（Ｕｂｃ９）、ＵＢＥ２Ｊ１（ＮＣＵＢＥ１）、ＵＢＥ２Ｊ２（ＮＣＵＢＥ２）、ＵＢＥ２Ｋ（ＨＩＰ２）、ＵＢＥ２Ｌ３（ＵｂｃＨ７）、ＵＢＥ２Ｌ６（ＵｂｃＨ８）、ＵＢＥ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＵＢＥ２Ｎ（Ｕｂｃ１３）、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ（Ｅ２－２３０Ｋ）、ＵＢＥ２Ｑ１（ＮＩＣＥ－５）、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１（ＣＤＣ３４）、ＵＢＥ２Ｒ２（ＣＤＣ３４Ｂ）、ＵＢＥ２Ｓ（Ｅ２－ＥＰＦ）、ＵＢＥ２Ｔ（ＨＳＰＣ１５０）、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１（ＵＥＶ－１Ａ）、ＵＢＥ２Ｖ２（ＭＭＳ２）、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＥ２Ｚ（Ｕｓｅ１）、ＵＶＥＬＤ（ＵＥＶ３）、ＢＩＲＣ６（ａｐｏｌｌｏｎ）、ＦＴＳ（ＡＫＴＩＰ）、ＴＳＧ１０１、及びＵＦＣ１からなる群から選択されるＥ２酵素を含み、そのＥ２酵素のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１～４１で特定される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の分子。
  21. 前記標的化ドメインが前記基質に結合する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の分子。
  22. 前記標的化ドメインが、モノボディ、ナノボディ、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、イントラボディ、ミニボディ、足場タンパク質、例えば、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、ペプチドバインダー及びリガンド結合ドメインのいずれか１つである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の分子。
  23. 前記標的化ドメイン及び／又は調節ドメインがリジン残基を含有しない、請求項１～２２のいずれか一項に記載の分子。
  24. 前記標的化ドメインが、配列番号１２６～１３５、１３８～１３９、２５７のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、及び／又は前記調節ドメインが、配列番号１～８２のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の分子。
  25. 前記標的化ドメインが、配列番号１２６～１３５、１３８～１３９、２５７のいずれか１つのアミノ酸配列若しくは最大２０個のアミノ酸修飾を有するそのバリアントを有し、及び／又は前記調節ドメインが、配列番号１～８２のいずれか１つのアミノ酸配列若しくは最大３０個のアミノ酸修飾を有するそのバリアントを有する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の分子。
  26. 前記標的化ドメインが、リジン残基の１つ又は複数が別のアミノ酸で置換されている、及び／又は欠失されている、配列番号１２６～１３５、１３８～１３９、２５７のいずれか１つのアミノ酸配列のバリアントである；並びに／或いは
    前記調節ドメインが、１つ又は複数のリジン残基が別のアミノ酸で置換されている、及び／又は欠失されている、配列番号４２～８２のいずれか１つのアミノ酸配列のバリアントである、
    請求項２３～２５のいずれか一項に記載の分子。
  27. 前記基質が細胞内ポリペプチドである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の分子。
  28. 前記基質が、前記原形質膜、細胞質、核、エンドソーム、小胞体、ミトコンドリア及びゴルジ装置の１つ又は複数に局在する、請求項１～２７のいずれか一項に記載の分子。
  29. 前記基質が核に局在する、請求項１～２８のいずれか一項に記載の分子。
  30. 前記基質が、発癌性タンパク質、シグナル伝達タンパク質、ＧＰＣＲ、翻訳後修飾タンパク質、接着タンパク質、受容体、細胞周期タンパク質、チェックポイントタンパク質、ウイルスタンパク質、プリオンタンパク質、細菌タンパク質、寄生性タンパク質、真菌タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、構造タンパク質、酵素、免疫原、抗原、及び／又は病原性タンパク質である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の分子。
  31. 前記基質が、Ｒａｓ、ＫＲａｓ、ＳＨＰ２、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）プロテアーゼ３Ｃ、ムスカリン性アセチルコリン受容体２（Ｍ２Ｒ）、β－２アドレナリン受容体（β２－ＡＲ）、交差結合エンドヌクレアーゼＭＵＳ８１（ＭＵＳ８１）及びヒト抗原Ｒ（ＨｕＲ）からなる群から選択される、請求項１～３０のいずれか一項に記載の分子。
  32. 前記調節ドメイン及び標的化ドメインが、リンカーによって連結されている、請求項１～３１のいずれか一項に記載の分子。
  33. 前記リンカーが、ポリペプチドリンカー、例えば、１つ又は複数のグリシン及び／又はセリンアミノ酸残基を含有するポリペプチドである、請求項３２に記載の分子。
  34. 前記リンカーが、１～４５アミノ酸長、例えば６～２０アミノ酸長又は５～１９アミノ酸長である、請求項３１又は３２に記載の分子。
  35. 前記リンカーが、前記ペプチドＧＧＧＧＳ（配列番号１４６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４５）、ＬＥＧＧＧＧＳＳＲ（配列番号１４１）、ＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＲ（配列番号１４２）、ＡＡＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＴ（配列番号１４３）、ＧＧＧＧＧ（配列番号１４４）、ＬＥＧＧＳＲ（配列番号２１１）、ＬＥＧＧＧＳＧＧＳＳＲ（配列番号２１２）、ＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＳＳＲ（配列番号２１３）、ＬＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＳＲ（配列番号２１４）、ＬＥＧＧＧＧＳＧＰＳＧＧＧＧＰＳＧＳＲ（配列番号２１５）、ＬＥＳＮＧＧＧＧＳＰＡＰＡＰＧＧＧＧＳＧＳＳＲ（配列番号２１６）、ＬＥＧＧＧＧＳＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＧＧＧＧＳＳＲ（配列番号２１７）、ＴＧＧＳＡＧＧＳＧＧＳＡＧＧＳＧＧＳＡＧＧＳＧＧＳＡ（配列番号２１８）、ＡＧＳＧＧＳＴＧＳＧＧＳＰＴＰＳＴＳＧＧＳＴＧＳＧＧＡＳ（配列番号２１９）、ＡＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＮＳＳＴＳＧＧＳＧＧＳＧＧＡＳ（配列番号２２０）、ＧＧＳＰＶＰＳＴＰＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＰＶＰＳＴＰＧＳ（配列番号２２１）、又はＳＰＧＴＧＳＰＧＴＧＳＰＧＴＧＳＰＧＴＧＳＰＧＴＧＳＰＧ（配列番号２２２）を含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の分子。
  36. 融合ポリペプチドである、請求項１～３５のいずれか一項に記載の分子。
  37. 前記調節ドメインが、前記標的化ドメインに対してＮ末端である、請求項１～３６のいずれか一項に記載の分子。
  38. 前記調節ドメインが、前記標的化ドメインに対してＣ末端である、請求項１～３６のいずれか一項に記載の分子。
  39. 前記Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分が、ＲＩＮＧ（Ｒｅａｌｌｙ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅ）ドメイン、Ｕ－ボックスドメイン、ＨＥＣＴ（Ｅ６－ＡＰカルボキシル末端に相同）ドメイン、及びＲＢＲドメインからなる群から選択される１つ又は複数のドメインを含むものである、請求項２～３８のいずれか一項に記載の分子。
  40. 検出可能なマーカーを更に含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の分子。
  41. 前記検出可能なマーカーがリジン残基を含有せず、場合により、前記検出可能なマーカーが赤血球凝集素タグ又はＧｌｕ－Ｇｌｕエピトープタグである、請求項４０に記載の分子。
  42. 前記分子が、配列番号１５６～１６７、１７１～１９５、２０２～２０４、２３６～２４８、２５３～２５６、２６７、２７０及び２７２のいずれか１つのアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の分子。
  43. 前記分子が、核局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル又はエンドソーム局在化シグナルなどの細胞内局在化シグナルを含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の分子。
  44. 前記分子が、前記分子の非存在下での基質の量と比較して、前記基質の量を少なくとも２０％減少させることができ、
    場合により、前記分子が、他の場合では実質的に同じであるが前記分子を含有しない細胞中の前記基質の量と比較して、細胞中の前記基質の量を少なくとも２０％減少させる、
    請求項１～４３のいずれか一項に記載の分子。
  45. （ｉ）請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子及び（ｉｉ）前記分子を細胞に標的化することができる標的化部分を含む化合物。
  46. 前記標的化部分が、抗体などの結合パートナーである、請求項４５に記載の化合物。
  47. 前記標的化部分が、前記分子に融合したポリペプチドである、請求項４５又は４６に記載の化合物。
  48. 任意選択で、前記ポリペプチドが、配列番号２２３～２３５、２４９～２５２及び２５９、２６２及び２６４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子又は請求項４７に記載の化合物をコードするポリヌクレオチド。
  49. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターなどの、請求項４８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  50. 請求項４８に記載のポリヌクレオチド又は請求項４９に記載のベクターを含む宿主細胞。
  51. 請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の化合物、請求項４８に記載のポリヌクレオチド、請求項４９に記載のベクター、又は請求項５０に記載の宿主細胞、及び更なる治療剤を含む、組成物。
  52. 前記更なる治療剤が、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗糖尿病剤、免疫治療剤、抗炎症剤、抗生物質、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項５１に記載の組成物。
  53. 医学に使用するための、請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の化合物、請求項４８に記載のポリヌクレオチド、請求項４９に記載のベクター、請求項５０に記載の宿主細胞、又は請求項５１若しくは５２に記載の組成物。
  54. 請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の化合物、請求項４８に記載のポリヌクレオチド、請求項４９に記載のベクター、請求項５０に記載の宿主細胞、又は請求項５１若しくは５２に記載の組成物、及び１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
  55. 個体に、（ｉ）請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子及び（ｉｉ）前記分子を細胞に標的化することができる標的化部分を含む化合物を投与すること；又は
    前記個体に、請求項４８に記載のポリヌクレオチド又は請求項４９に記載のベクターを投与することであって、前記ポリヌクレオチド又はベクターが前記細胞内の前記分子をコードする、こと
    を含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子を前記個体の前記細胞に送達する方法。
  56. 前記分子が、前記分子の非存在下での基質の量と比較して、前記基質の量を少なくとも２０％減少させることができ、
    場合により、前記分子が、他の場合では実質的に同じであるが前記分子を含有しない細胞中の前記基質の量と比較して、細胞中の前記基質の量を少なくとも２０％減少させる、
    請求項５５に記載の方法。
  57. 請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子を個体の細胞に送達する際に使用するための、（ｉ）請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子と、（ｉｉ）前記分子を細胞に標的化することができる標的化部分と、を含む化合物。
  58. 請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子を個体の細胞に送達するための医薬品の製造における、（ｉ）請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子と、（ｉｉ）前記分子を細胞に標的化することができる標的化部分と、を含む化合物の使用。
  59. 前記分子が、前記分子の非存在下での基質の量と比較して、前記基質の量を少なくとも２０％減少させることができ、
    場合により、前記分子が、他の場合では実質的に同じであるが前記分子を含有しない細胞中の前記基質の量と比較して、細胞中の前記基質の量を少なくとも２０％減少させる、
    請求項５８に記載の方法。
  60. （ａ）ヒトＥ２酵素又はその機能的部分と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメインと、
    （ｂ）前記調節ドメインを前記基質に標的化することができる標的化ドメインと、
    を含む、キット・オブ・パーツであって、
    場合により、前記キットは、Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分を含まない、
    キット・オブ・パーツ。
  61. 前記調節ドメインを前記標的化ドメインに結合することができるリンカーを更に含む、請求項６０に記載のキット・オブ・パーツ。
  62. （ａ）請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子と、
    （ｂ）調節される前記基質を含有する細胞を標的とすることができる標的化部分と、
    を含むキット・オブ・パーツであって、
    場合により、前記標的化部分が、抗体などの結合パートナーである、
    キット・オブ・パーツ。
  63. 前記調節ドメインを前記標的化ドメインに結合することができるリンカーを更に含む、請求項６２に記載のキット・オブ・パーツ。
  64. （ａ）ヒトＥ２酵素又はその機能的部分と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメインをコードするポリヌクレオチドと、
    （ｂ）前記調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインをコードするポリヌクレオチドと、
    を含む、キット・オブ・パーツであって、
    場合により、前記キットが、Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその機能的部分をコードするポリヌクレオチドを含まない、
    キット・オブ・パーツ。
  65. 調節される前記基質を含む細胞における前記ポリヌクレオチドの一方又は両方の発現を指令することができる一又は複数のプロモータ配列を含む、請求項６４に記載のキット・オブ・パーツ。
  66. （ａ）請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子をコードするポリヌクレオチドと、
    （ｂ）調節される前記基質を含有する細胞を標的とすることができる標的化部分と、
    を含む、キット・オブ・パーツ。
  67. 調節される前記基質を含有する細胞の発現プロファイルを評価するための１つ又は複数の試薬を更に含む、請求項６０～６６のいずれか一項に記載のキット・オブ・パーツ。
  68. 細胞の特性を評価するための手段を更に含む、請求項６０～６７のいずれか一項に記載のキット・オブ・パーツ。
  69. 前記調節ドメインが、請求項１～２０のいずれか一項に定義される通りであり、及び／又は前記標的化ドメインが、請求項２１～２６のいずれか一項に定義される通りである、請求項６０～６８のいずれか一項に記載のキット・オブ・パーツ。
  70. 前記基質が、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の通りである、請求項６０～６９のいずれか一項に記載のキット・オブ・パーツ。
  71. 請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子又は請求項４５～４７のいずれか一項に記載の化合物を産生する方法であって、請求項４８に記載のポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させることを含む、方法。
  72. 請求項４８に記載のポリヌクレオチド又は請求項４９に記載のベクターを宿主細胞に導入し、前記分子をコードするポリヌクレオチドを発現させることを含む、請求項７１に記載の方法。
  73. 対象において異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療する方法であって、請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の化合物、請求項４８に記載のポリヌクレオチド、請求項４９に記載のベクター、請求項５０に記載の細胞、請求項５４に記載の医薬組成物、又は請求項５１若しくは５２に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  74. 前記分子が、前記分子の非存在下での基質の量と比較して、前記基質の量を少なくとも２０％減少させることができ、
    場合により、前記分子が、他の場合では実質的に同じであるが前記分子を含有しない細胞中の前記基質の量と比較して、細胞中の前記基質の量を少なくとも２０％減少させる、
    請求項７３に記載の方法。
  75. 対象における異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療する際に使用するための、請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の化合物、請求項４８に記載のポリヌクレオチド、請求項４９に記載のベクター、請求項５０に記載の細胞、請求項５４に記載の医薬組成物、又は請求項５１若しくは５２に記載の組成物。
  76. 対象における異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療するための医薬品の製造における、請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の化合物、請求項４８に記載のポリヌクレオチド、請求項４９に記載のベクター、請求項５０に記載の細胞、請求項５４に記載の医薬組成物、又は請求項５１若しくは５２に記載の組成物の使用。
  77. 前記疾患又は状態が、癌、糖尿病、自己免疫疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、疼痛、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン病、真菌性疾患、寄生虫性疾患、関節炎、免疫不全又は炎症性疾患である、請求項７３若しくは７４に記載の方法又は請求項７５若しくは７６に記載の使用。
  78. 基質を調節する方法であって、前記分子が前記基質を調節するのに有効な条件下で、前記基質を請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子と接触させることを含む、方法。
  79. 前記調節することが、前記基質が分解されること、又は前記基質が分解されることが防止されること、又は前記基質の細胞内位置が変更されること、又は前記基質の１つ若しくは複数の活性が調節されること（例えば、増加又は減少）、又は前記基質の翻訳後修飾の程度が調節されることを含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 潜在的な薬物標的として基質を同定する方法であって、
    （ａ）前記基質を含む細胞、組織又は器官を提供することと、
    （ｂ）前記細胞、組織又は器官を、請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の化合物、請求項４８に記載のポリヌクレオチド又は請求項４９に記載のベクターと接触させることと、
    （ｃ）前記細胞、組織又は器官の１以上の特性に対する前記分子、化合物、ポリヌクレオチド又はベクターの前記効果を評価することであって、特定の疾患状態と相関する効果の同定が、前記基質が前記特定の疾患に対する潜在的な薬物標的であることを示すことと、
    を含む、方法。
  81. 基質の機能を評価する方法であって、
    （ａ）前記基質を含む細胞、組織又は器官を提供することと、
    （ｂ）前記細胞、組織又は器官を、請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の化合物、請求項４８に記載のポリヌクレオチド又は請求項４９に記載のベクターと接触させることと、
    （ｃ）前記細胞、組織又は器官の１つ以上の特性に対する前記分子、化合物、ポリヌクレオチド又はベクターの効果を評価することと、
    を含む、方法。
  82. 異常なレベルの基質又はその形態によって媒介される疾患又は状態を予防又は治療するのに有用であり得る試験剤を同定する方法であって、
    前記基質を提供することと、
    （ａ）ヒトＥ２ユビキチン又はユビキチン様ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む調節ドメインと、（ｂ）前記調節ドメインを基質に標的化することができる標的化ドメインと、を含む試験剤を提供することであって、任意で、前記試験剤は、Ｅ３ユビキチン若しくはユビキチン様リガーゼ又はその一部を含まない、ことと、
    前記基質の調節を容易にするために、前記試験剤に有効な条件下で前記基質及び前記試験剤を接触させることと、
    前記試験剤が前記基質を調節するかどうかを決定することと、
    を含む、方法。
  83. 前記疾患又は状態のアッセイにおいて前記試験剤を試験することを更に含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記試験剤を合成、精製及び／又は製剤化することを更に含む、請求項８１又は８２に記載の方法。
  85. 薬物標的検証又は創薬における、請求項１～４４のいずれか一項に記載の分子又は請求項４５～４７のいずれか一項に記載の化合物の使用。
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