JP2023544124A - Ｉｌ－１３およびｏｘ４０ｌを標的化する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド - Google Patents

Abstract

本開示は、炎症性疾患に罹っている対象を処置するための新規のタイプの薬物を提供する。具体的には、本開示は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）がＯＸ４０Ｌに結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤがＩＬ－１３に結合することを特徴とする、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むポリペプチドを提供する。本開示はまた、核酸、ベクターおよび組成物も提供する。

Description

１ 分野
本開示は、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）およびＯＸ４０Ｌを標的化するポリペプチドに関する。本開示はまた、該ポリペプチドをコードする核酸分子および該核酸を含むベクター、ならびに該ポリペプチド、核酸またはベクターを含む組成物にも関する。本開示はさらに、自己免疫疾患および／または炎症性疾患および／または線維性疾患に罹っている対象を処置する方法における使用のためのこれらの製品に関する。さらに、本開示は、これらの製品を生産する方法に関する。

２ 技術的背景
抑制されていない免疫応答は、宿主の防御に必要な一方で、例えば喘息およびアトピー性皮膚炎などの様々な自己免疫疾患および／または炎症性疾患を引き起こす可能性がある。免疫系の自然および適応アームによって媒介される免疫応答のカスケード（例えば、抗原認識、抗原プロセシング、抗原提示、サイトカイン生産、抗体生産、標的細胞死滅）は、様々な免疫疾患の始まりと蔓延を促進する。自己免疫疾患および炎症性疾患は慢性であることが多く、生命を脅かす可能性さえある。アレルギー性およびアトピー性疾患、例えば喘息およびアトピー性皮膚炎は、２型免疫応答によって優勢に促進され、高いＩｇＥ生産および好酸球増加症のような２型免疫性の顕著な特色によって特徴付けられる。

現在、中等度から重度の喘息を有する患者は、現在利用可能な標準的治療処置に対して不適切に応答する。

特に、低い好酸球性表現型を有する喘息患者において、現在の標準的な療法は、抗ＩＬ４Ｒαモノクローナル抗体であるデュピルマブ（Ｓａｎｏｆｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの登録商標、デュピクセント（Ｄｕｐｉｘｅｎｔ）（登録商標）という名前で市販されている））、モノクローナル抗ＩＬ５抗体であるメポリズマブ（ＧＳＫ Ｇｒｏｕｐの登録商標、ヌーカラ（Ｎｕｃａｌａ）（登録商標）という名前で市販されている）もしくはレスリズマブ（Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｌｔｄの登録商標、シンケア（Ｃｉｎｑａｉｒ）（登録商標）という名前で市販されている）、または抗ＩｇＥモノクローナル抗体であるオマリズマブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧの登録商標、ゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）（登録商標）という名前で市販されている）などの生物学的製剤による処置を含む。

上述したような従来のモノクローナル抗体による患者の処置は、２型経路のブロックならびに症状の有意な低減および／または喘息の処置において有効性を示しているが、これらの処置に対して十分および最適に応答していない患者の部分集団が依然としてある。

アトピー性皮膚炎に関して、多数のアンタゴニスト抗体が初期臨床的効能を示している。

ＫＹ１００５（Ｋｙｍａｂ製）は完全ヒトモノクローナル抗体であり、ＯＸ４０Ｌに結合し、ＯＸ４０ＬがＯＸ４０を活性化するのをブロックし、それによって炎症性状態および／または自己免疫状態を有する患者の根底にある免疫系の不均衡に対処し得る。

ＩＳＢ ８３０（以前はＧＢＲ ８３０、Ｇｌｅｎｍａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製）は、ＯＸ４０に対するヒト化モノクローナル抗体である。ＯＸ４０阻害は、アトピー性皮膚炎を含むＴ細胞媒介性疾患における治療的役割を果たす可能性がある。

ＫＨＫ ４０８３は、アトピー性皮膚炎および潰瘍性大腸炎を処置するための免疫調節抗ＯＸ４０モノクローナル抗体（Ｋｙｏｗａ Ｋｉｒｉｎ製）である。皮下および静脈内製剤の初期段階の臨床開発がいくつかの国で進行中である。

トラロキヌマブは、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）および円形脱毛症の処置のためにＬｅｏ Ｐｈａｒｍａによって開発中のＩＬ－１３－中和ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。トラロキヌマブはＩＬ－１３ヘリックスＡおよびＤに結合し、故にＩＬ－１３がＩＬ－１３Ｒα１およびＩＬ－１３Ｒα２と相互作用するのを防ぐ。トラロキヌマブは欧州および米国でアトピー性皮膚炎に関する規制審査中である。臨床開発がアトピー性皮膚炎に関しては複数の国で、円形脱毛症に関しては米国で進行中である。

ＯＸ４０、ＯＸ４０ＬまたはＩＬ－１３に対する上記のアンタゴニスト抗体の一部は、アトピー性皮膚炎で初期臨床的効能を示しているが、この２型炎症性疾患を処置する改善された薬剤に対する満たされていない医学的な必要性がある。

発明者らは、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、例えば特に喘息およびアトピー性皮膚炎、および／または線維性疾患を処置するための新規の改善された薬剤を開発した。これらの薬剤は、ＩＬ－１３およびＯＸ４０Ｌを含む２つまたは複数の疾患因子を標的化する。これらの因子は、自己免疫疾患または炎症性疾患または線維性疾患に関連する生物学的メカニズムを媒介している。

インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）は、２型ヘルパーＴ（Ｔｈ２）細胞、ＣＤ４細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、肥満細胞、好塩基球細胞、好酸球細胞およびニュオサイトによって分泌されるサイトカインである。ＩＬ－１３は、ＩｇＥ合成、杯細胞過形成、粘膜分泌過多、気道過敏、および線維症における中心的な制御因子である。ＩＬ－１３は、アレルギー性炎症、および喘息を含む種々の疾患の主要なメディエーターである。ＩＬ－１３のシグナル伝達は、ＩＬ－４との共有マルチサブユニット受容体を介して媒介される。この受容体は、ＩＬ－４受容体アルファ（ＩＬ－４Ｒα）およびＩＬ－１３受容体アルファ１（ＩＬ－１３Ｒα１）からなるヘテロ二量体の受容体複合体である。ＩＬ－１３のＩＬ－１３Ｒα１への高い親和性は、それらの結合形成をもたらし、これがさらに、ＩＬ－４Ｒαへのヘテロ二量体形成および２型ＩＬ－４受容体の生産の可能性を増加させる。ヒトおよびマウス研究からのデータは、喘息およびアトピー性皮膚炎を含む２型免疫疾患においてＩＬ－１３が果たす重要な役割を示している。

ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２またはＴＮＦＳＦ４としても公知の）はＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、ＯＸ４０受容体（ＣＤ１３４またはＴＮＦＲＳＦ４としても公知の）の誘導性共刺激性リガンドである。ＯＸ４０Ｌは、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞を含む活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）で主に発現される。一方、ＯＸ４０は、活性化されたＴ細胞およびナチュラルキラーＴ細胞で主に発現される。ＯＸ４０Ｌは膜結合分子として主に発現されるが、切断された可溶型で検出することもできる。ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０は、免疫応答を調整する活性化Ｔ細胞によって特徴付けられる多数の疾患における免疫共刺激制御因子として認識されている。ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０はＯＸ４０を介してシグナル伝達を開始させ、炎症性サイトカインの生産および放出、エフェクターＴ細胞（例えばＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ１７）および細胞傷害性Ｔ細胞の増殖および蓄積を含む様々な活性をもたらす。ヒトおよびマウス研究からのデータは、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ軸が、喘息およびアトピー性皮膚炎を含む複数の２型免疫疾患において重要な役割を果たしていることを示唆する。ＯＸ４０ＬまたはＯＸ４０の遮断は、喘息のマウスモデルにおいて疾患を低減することが示されており、アトピー性皮膚炎患者の皮膚サンプルはＯＸ４０発現上昇Ｔ細胞を含有することが示される場合がある。

いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、上述した生物学的メカニズムは、２型炎症性応答の始まりと蔓延の中心的役割を果たし、アトピー性皮膚炎および喘息などの疾患を引き起こす様々な免疫病理学的経路の根底に横たわっている。

これまで、ＩＬ－１３とＯＸ４０Ｌの両方を標的化する活発な臨床開発プログラムはない。

ところで、発明者らは驚くべきことに、単一の薬剤を用いたＯＸ４０ＬとＩＬ－１３の二重標的化は、同じ適応症に対する単一特異性薬剤療法が十分に有効ではない可能性がある部分集団における低２型と高２型喘息の両方、およびアトピー性皮膚炎において十分な効能を付与する可能性を有することを見出した。

複数の疾患因子を標的化することは、例えば、異なる治療標的に結合する２つの別々の生物学的製剤、例えば抗体の共投与またはコンビナトリアルな使用によって達成されることが記載されている。しかしながら、別々の生物学的製剤の共投与またはコンビナトリアルな使用は、実用面と商業面両方の視点から問題がある可能性がある。例えば、別々の製品の２回の注射は、患者にとってより不便でより苦痛を伴う処置レジメンをもたらし、これは、コンプライアンスに負の影響を与える可能性がある。２つの別々の製品の単回注射に関して、両方の製品の必要な濃度での許容可能な粘性と好適な安定性および不干渉を可能にする配合物を提供することは、難しいかまたは不可能であり得る。加えて、共投与および共配合物は、２つの別々の薬物の生産を必要とすることから、全体コストを増加させる可能性がある。

したがって、患者に都合よく投与することができる、抗自己免疫疾患薬剤および／または抗炎症性疾患薬剤および／または抗線維性疾患薬剤の改善の必要性もある。

別々の生物製剤、例えば抗体の共投与またはコンビナトリアルな使用に関連する上記の制限に対処するための１つの戦略として、２つの異なる抗原に結合することができる二重特異性抗体が示唆されてきた。

二重特異性抗体構築物が複数の様式で提唱されている。例えば、二重特異性抗体様式は、２つの抗体の化学的コンジュゲーションまたはそれらの断片を含んでいてもよい（非特許文献１；非特許文献２）。

Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５．２２９（４７０８）：８１～８３頁 Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８７．１３９（７）：２３６７～２３７５頁

しかしながら、このような二重特異性抗体様式のデメリットとしては、例えば皮下投与を難しくする、高濃度での高い粘性が挙げられる。さらに、各結合単位は、ポリペプチドの安定性および生産効率に意味を持つ、特異的で高い親和性を有する異なる標的との相互作用を必要とする。例えば、二重特異性抗体様式の生産は、軽鎖の誤対合または重鎖の誤対合に関連するＣＭＣ（化学、製造および品質管理）問題につながる可能性が潜在的にある。

したがって、自己免疫応答および／または炎症性応答をモジュレートするために、２つまたはそれ以上の標的に対する十分な親和性でＯＸ４０ＬとＩＬ－１３の両方に結合する改善された二重または多重特異性抗体構築物の必要性がある。同時に、このような構築物は、例えば微生物宿主で効率的に生産でき、患者に都合よく投与できることが望ましい。このような構築物は理想的には、連続処置の回数が制限され、故にタイミングの間隔を十分にあけられるように、処置しようとする対象において十分に長い半減期も有するべきである。さらに、処置しようとする対象において、既存の抗体（すなわち、抗体構築物による最初の処置の前に対象に存在する抗体）へのこのような構築物の反応性を制限することが望ましい。

発明者らは、ＯＸ４０ＬおよびＩＬ－１３を同時に特異的に標的化する二重特異性または多重特異性ポリペプチド（本開示に関して免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）構築物とも呼ばれる）が、単一特異性抗ＯＸ４０Ｌおよび／または単一特異性抗ＩＬ－１３ポリペプチドと比較して、２型炎症性応答をモジュレートする効率を向上させることを見出した。前記ポリペプチドまたはＩＳＶＤ構築物は、効率的に生産し（例えば微生物宿主で）、都合よく投与することができた。さらに、このようなポリペプチドまたはＩＳＶＤ構築物は、処置しようとする対象における既存の抗体（すなわち、抗体構築物による最初の処置の前に対象に存在する抗体）への反応性が制限されることを示すことができた。一部の実施形態においてこのようなポリペプチドまたはＩＳＶＤ構築物は、連続処置の回数が制限され、故にタイミングの間隔を十分にあけられるように、処置しようとする対象において十分に長い半減期を示す。

本開示のポリペプチド（本開示に関して免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）構築物とも呼ばれる）は、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなり、少なくとも１つのＩＳＶＤはＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤはＩＬ－１３に特異的に結合する。一部の実施形態によれば、ＯＸ４０Ｌに結合する少なくとも１つのＩＳＶＤはヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、ＩＬ－１３に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤはヒトＩＬ－１３に特異的に結合する。

一部の実施形態によれば、本開示のポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する。例えば、結合単位は、血清タンパク質、例えばヒト血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤであり得る。

本開示のポリペプチドを発現することが可能な核酸分子、核酸または核酸分子を含むベクター、およびポリペプチド、核酸またはベクターを含む組成物も提供される。一部の実施形態において、組成物は医薬組成物である。

本開示によるポリペプチドをコードする核酸またはベクターを含む宿主または宿主細胞も提供される。

さらに、本開示によるポリペプチドを生産する方法であって、少なくとも：
ａ．好適な宿主細胞もしくは宿主生物中で、または別の好適な発現系中で、核酸配列を発現させる工程；場合により、それに続いて：
ｂ．本開示によるポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む前記方法が提供される。

さらに、本開示は、医薬としての使用のための、ポリペプチド、ポリペプチドを含む組成物、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もしくはベクターを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、ポリペプチドまたは組成物は、自己免疫疾患および／または２型炎症性疾患のような炎症性疾患の処置における使用のためである。一部の実施形態において、２型炎症性疾患は、アトピー性皮膚炎および喘息からなる群から選択される。一部の実施形態において、ポリペプチドまたは組成物は、線維性疾患の処置における使用のためである。

加えて、自己免疫疾患および／または２型炎症性疾患のような炎症性疾患を処置する方法であって、医薬的に活性な量の本開示によるポリペプチドまたは組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法が提供される。一部の実施形態において、２型炎症性疾患は、アトピー性皮膚炎および／または喘息である。加えて、線維性疾患を処置する方法であって、医薬的に活性な量の本開示によるポリペプチドまたは組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法が提供される。一部の実施形態において、本方法は、１つまたはそれ以上の追加の治療剤を投与することをさらに含む。

さらに、自己免疫疾患および／または２型炎症性疾患のような炎症性疾患を処置するための医薬組成物の調製における本開示のポリペプチドまたは組成物の使用が提供される。一部の実施形態において、２型炎症性疾患は、アトピー性皮膚炎および／または喘息である。線維性疾患を処置するための医薬組成物の調製における本開示のポリペプチドまたは組成物の使用も提供される。

特に、本開示は以下の実施形態を提供する：

実施形態１．医薬としての使用のための、ポリペプチド、該ポリペプチドを含む組成物、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であって、該ポリペプチドは、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなり、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み、
該ＩＳＶＤは、Ｎ末端から開始する順番にある、ポリペプチドまたは組成物。

実施形態２．少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含み、場合により、１種またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、実施形態１に記載の使用のための組成物。

実施形態３．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、
実施形態１または２に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態４．ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を有し；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態１～３のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態５．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を有し；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を有する、実施形態１～４のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態６．前記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、実施形態１～５のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態７．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、実施形態６に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態８．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンのような）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧのような）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、実施形態６～７のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態９．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、実施形態８に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１０．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含む、実施形態９に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１１．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、実施形態９～１０のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１２．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態９～１１のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１３．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を有する、実施形態９～１２のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１４．ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態１～１３のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１５．ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１～１４のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１６．２型炎症性疾患のような炎症性疾患の処置における使用のための、実施形態１～１５のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１７．２型炎症性疾患は、喘息およびアトピー性皮膚炎からなる群から選択される、実施形態１６に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１８．少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなるポリペプチドであって、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ）第１のＩＳＶＤはＯＸ４０Ｌに結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤはＩＬ－１３に結合し、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有する ＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤはＩＬ－１３に結合し、
ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み、
該ＩＳＶＤは、Ｎ末端から開始する順番にある、ポリペプチド。

実施形態１９．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、
実施形態１８に記載のポリペプチド。

実施形態２０．ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を有し；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態１８または１９のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態２１．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を有し；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を有する、実施形態１８～２０のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態２２．前記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、実施形態１８～２１のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態２３．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、実施形態２２に記載のポリペプチド。

実施形態２４．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンのような）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧのような）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、実施形態２２～２３のいずれか１つに記載のポリペプチド。

実施形態２５．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、実施形態２４に記載のポリペプチド。

実施形態２６．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含む、実施形態２５に記載のポリペプチド。

実施形態２７．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、実施形態２５～２６のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態２８．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態２５～２７のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態２９．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を有する、実施形態２５～２８のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態３０．ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態１８～２９のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態３１．配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１８～２９のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態３２．実施形態１８～３１によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。

実施形態３３．実施形態３２による核酸を含む宿主または宿主細胞。

実施形態３４．実施形態１８～３１によるポリペプチドを生産するための方法であって、少なくとも：
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物中で、または別の好適な発現系中で、実施形態３２による核酸を発現させる工程；場合により、それに続いて：
ｂ）実施形態１８～３１によるポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む、前記方法。

実施形態３５．少なくとも１つの実施形態１８～３１のいずれかによるポリペプチド、または実施形態３２による核酸を含む組成物。

実施形態３６．少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含み、場合により、１種またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、実施形態３５に記載の組成物。

実施形態３７．２型炎症性疾患のような炎症性疾患を処置する方法であって、医薬的に活性な量の、実施形態１８～３１のいずれかによるポリペプチド、または実施形態３５～３６のいずれかによる組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。

実施形態３８．２型炎症性疾患は、喘息およびアトピー性皮膚炎からなる群から選択される実施形態３７に記載の方法。

実施形態３９．２型炎症性疾患のような炎症性疾患を処置するための医薬組成物の調製における、実施形態１８～３１のいずれかによるポリペプチド、または実施形態３５～３６のいずれかによる組成物の使用。

実施形態４０．２型炎症性疾患は、喘息およびアトピー性皮膚炎から選択される、実施形態３９に記載のポリペプチドまたは組成物の使用。

実施形態４１．少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなるポリペプチドであって、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有する ＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み、
該ＩＳＶＤは、Ｎ末端から開始する順番にある、ポリペプチド。

ヒトＯＸ４０Ｌを発現するＣＨＯ－Ｋｉ細胞におけるフローサイトメトリーによって示されたＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７への可溶性ＩＬ－１３および膜結合ｈＯＸ４０Ｌの同時の結合を示す図である。ＩＲＲ０００９６は、陰性対照Ｖ_ＨＨである。 ＩＳＶＤ Ｆ０２７１００１８７およびコンパレーター１およびコンパレーター２と命名された参照抗ｈＩＬ－１３ ｍＡｂによるエオタキシン放出アッセイにおけるヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ－１３の阻害を示す図である。コンパレーター１およびコンパレーター２はいずれも、ヒトＩＬ－１３に対する標準的な従来のモノクローナル抗体である。データポイントは全体的な平均値であり（ｎ＝２）、エラーバーは＋／－ＳＤを表す。 ＰＢＭＣ活性アッセイで決定した場合の、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７およびコンパレーター３と命名された参照化合物抗ｈＯＸ４０Ｌ ｍＡｂによる膜結合ＯＸ４０Ｌの阻害を示す図である。コンパレーター３は、ヒトＯＸ４０Ｌに対する標準的な従来のモノクローナル抗体である。データポイントは全体的な平均値であり（ｎ＝２）、エラーバーは＋／－ＳＤを表す。 対照ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０１１８６と比較した、９６種のヒト血清サンプルに存在する既存の抗体の、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７への結合を示す箱ひげ図（中央値および四分位範囲を含む）である。 ３種共培養アッセイにおける、ヒトＰＢＭＣによるアレルゲンＤｅｒ Ｐによって誘導されたＩＬ－５およびＣＣＬ２６生産に対する、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７ならびに参照抗体抗ｈＩＬ－１３ ｍＡｂ（コンパレーター１と命名）、および抗ｈＯＸ４０Ｌ ｍＡｂ（コンパレーター３と命名）の阻害プロファイルを示す図である。ＭＲＣ５線維芽細胞およびＡ５４９上皮細胞と共に培養された正常なドナーＰＢＭＣを、３７℃の細胞培養インキュベーター中で、３ｍｇ／ｍＬのＤｅｒ Ｐで刺激し、１１．１ｎＭのＩＳＶＤ、コンパレーター１と命名された抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ、またはコンパレーター３である抗ｈＯＸ４０Ｌ参照ｍＡｂと共に２４ウェルプレート中で６日間インキュベートした。新たに収集された上清中のＩＬ－５およびＣＣＬ２６濃度をヒト磁気Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ（Ｈｕｍａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｌｕｍｉｎｅｘ Ａｓｓａｙ）によって測定した。ＩＳＶＤポリペプチドまたは抗体のどちらも受けなかった刺激されていない（最小）および刺激した（最大）対照サンプルに対する阻害のパーセンテージを計算した。全ての計算を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０を使用して実行した。データは、上述した設定による３つの独立した実験から組み合わされた全てのドナーの平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表される。図５；７日時点の３種共培養アッセイにおけるＩＬ－５阻害。４人のＰＢＭＣドナーからの結果。図６：７日時点の３種共培養アッセイにおけるＣＣＬ２６阻害。４人のＰＢＭＣドナーからの結果。 ３種共培養アッセイにおける、ヒトＰＢＭＣによるアレルゲンＤｅｒ Ｐによって誘導されたＩＬ－５およびＣＣＬ２６生産に対する、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７ならびに参照抗体抗ｈＩＬ－１３ ｍＡｂ（コンパレーター１と命名）、および抗ｈＯＸ４０Ｌ ｍＡｂ（コンパレーター３と命名）の阻害プロファイルを示す図である。ＭＲＣ５線維芽細胞およびＡ５４９上皮細胞と共に培養された正常なドナーＰＢＭＣを、３７℃の細胞培養インキュベーター中で、３ｍｇ／ｍＬのＤｅｒ Ｐで刺激し、１１．１ｎＭのＩＳＶＤ、コンパレーター１と命名された抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ、またはコンパレーター３である抗ｈＯＸ４０Ｌ参照ｍＡｂと共に２４ウェルプレート中で６日間インキュベートした。新たに収集された上清中のＩＬ－５およびＣＣＬ２６濃度をヒト磁気Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ（Ｈｕｍａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｌｕｍｉｎｅｘ Ａｓｓａｙ）によって測定した。ＩＳＶＤポリペプチドまたは抗体のどちらも受けなかった刺激されていない（最小）および刺激した（最大）対照サンプルに対する阻害のパーセンテージを計算した。全ての計算を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０を使用して実行した。データは、上述した設定による３つの独立した実験から組み合わされた全てのドナーの平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表される。図５；７日時点の３種共培養アッセイにおけるＩＬ－５阻害。４人のＰＢＭＣドナーからの結果。図６：７日時点の３種共培養アッセイにおけるＣＣＬ２６阻害。４人のＰＢＭＣドナーからの結果。 Ｆ２７１００１８７は、ＮＳＧマウスの肺におけるヒト活性化エフェクターメモリーおよびセントラルメモリーＴ細胞の細胞充実性を有意に低下させたことを示す図である。Ａ）ビヒクルで処置したマウスと比較したところ、活性化細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞）は、用量１１．１ｍｇ／ｋｇ、３．７２ｍｇ／ｋｇ、１．１１ｍｇ／ｋｇまたは０．３７ｍｇ／ｋｇのいずれにおいてもＦ２７１００１８７では有意に低下しなかった。Ｂ）ビヒクルで処置したマウス（１３２，０３５細胞）と比較したところ、活性化細胞（ＣＤ４＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ３８＋細胞）、１１．１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１６，６０９細胞）、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１７，７７９細胞）、１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１４，８０８細胞）および０．３７ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（２３，５６８細胞）で低下した。Ｃ）ビヒクルで処置したマウス（６８５，７２６細胞）と比較したところ、エフェクターメモリー細胞は、１１．１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１５１，９７４細胞）、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１６４，６３９細胞）、１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１５６，６７７細胞）および０．３７ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１７６，２４３細胞）で低下した。Ｄ）ビヒクルで処置したマウス（６８１，５０８細胞）と比較したところ、セントラルメモリー細胞は、１１．１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１０６，４９７細胞）、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（９７，４６５細胞）、１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（９５，１３５細胞）および０．３７ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１３５，０９８細胞）で低下した。 Ｆ２７１００１８７は、ＮＳＧマウスの肺におけるヒト活性化細胞（ＣＤ１９＋）、メモリーＢ細胞、および形質芽細胞の細胞充実性を有意に低下させたことを示す図である。Ａ）ビヒクルで処置したマウス（６０，３９３細胞）と比較したところ、活性化細胞（ＣＤ１９＋）は、１１．１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１１，５８１細胞）、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（８，２３６細胞）、１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（９，９４８細胞）および０．３７ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１０，２４８細胞）で低下した。Ｂ）ビヒクルで処置したマウス（６，４６７細胞）と比較したところ、メモリーＢ細胞は、１１．１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１，６３６細胞）、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（９１４細胞）、１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１，２４３細胞）および０．３７ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１１，２６８ ３細胞）で低下した。Ｃ）ビヒクルで処置したマウス（２６，１４８細胞）と比較したところ、形質芽細胞は、１１．１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（３，２７０細胞）、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（２，２１６細胞）、１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（３，３１４細胞）および０．３７ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（２，５５９細胞）で低下した。 Ｆ２７１００１８７は全ての用量で、ＮＳＧマウスの血漿中のヒト２型主要サイトカインＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１０の検出可能なレベルを有意に低下させたことを示す図である。ビヒクルで処置したマウス（２．２０３ｐｇ／ｍｌ）と比較したところ、ヒトＩＬ－２は、１１．１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（０．７１１５ｐｇ／ｍｌ）、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（０．６８９ｐｇ／ｍｌ）、１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（０．８５９３ｐｇ／ｍｌ）および０．３７ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１．６５９ｐｇ／ｍｌ）で低下した。ビヒクルで処置したマウス（４４．４２ｐｇ／ｍｌ）と比較したところ、ヒトＩＬ－４は、１１．１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１．０７４ｐｇ／ｍｌ）、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（７．８５９ｐｇ／ｍｌ）、１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（３．９２０ｐｇ／ｍｌ）および０．３７ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（７．４１５ｐｇ／ｍｌ）で低下した。ビヒクルで処置したマウス（１４．７４ｐｇ／ｍｌ）と比較したところ、ヒトＩＬ－５は、１１．１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（０ｐｇ／ｍｌ）、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１．３８８ｐｇ／ｍｌ）、１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（０．６１９２ｐｇ／ｍｌ）および０．３７ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（０．６５１７ｐｇ／ｍｌ）で低下した。ビヒクルで処置したマウス（５８．７４ｐｇ／ｍｌ）と比較したところ、ヒトＩＬ－１０は、１１．１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（９．３２４ｐｇ／ｍｌ）、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１０．５１ｐｇ／ｍｌ）、１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１２．９４ｐｇ／ｍｌ）および０．３７ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１３．４７ｐｇ／ｍｌ）で低下した。 Ｆ２７１００１８７は全ての用量で、ＮＳＧマウスの血漿中のヒトＩｇＥの検出可能なレベルを有意に低下させたことを示す図である。ビヒクルで処置したマウス（３８３．２ｐｇ／ｍｌ）と比較したところ、ヒトＩｇＥは、１１．１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（０ｐｇ／ｍｌ）、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（４２．９５ｐｇ／ｍｌ）、１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１１．５５ｐｇ／ｍｌ）および０．３７ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１１．９１ｐｇ／ｍｌ）で低下した。 Ｆ２７１００１８７は、ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスの血漿中のヒトＩＬ－１３、ＩＬ－５、ＴＡＲＣ、およびマウスエオタキシンの検出可能なレベルを有意に低下させたことを示す図である。ビヒクルで処置したマウス（９８１．７ｐｇ／ｍｌ）と比較したところ、ヒトＩＬ－１３は、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（２８．９４ｐｇ／ｍｌ）および１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（２５．８９ｐｇ／ｍｌ）で低下した。ビヒクルで処置したマウス（１１２１ｐｇ／ｍｌ）と比較したところ、ヒトＩＬ－５は、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１．１５８ｐｇ／ｍｌ）および１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（１．０７９ｐｇ／ｍｌ）で低下した。ビヒクルで処置したマウス（６２３．９ｐｇ／ｍｌ）と比較したところ、ヒトＴＡＲＣは、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（２５９．７ｐｇ／ｍｌ）および１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（３６８．５ｐｇ／ｍｌ）で低下した。ビヒクルで処置したマウス（１１０７ｐｇ／ｍｌ）と比較したところ、マウスエオタキシンは、３．７２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（８０３．２ｐｇ／ｍｌ）および１．１１ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（９８４．４ｐｇ／ｍｌ）で低下した。 ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７の概略的な提示であり、Ｎ末端からＣ末端へ１価ビルディングブロック／ＩＳＶＤ １５Ｂ０７ＡＭ、４Ｂ０２／１、ＡＬＢ２３００２、および４Ｂ０６／１は９ＧＳリンカーを介して接続される。 Ｆ２７１００１８７は、ＨＤＭチャレンジ後の肺好酸球、ＢＡＬ ＩＬ－５および好酸球パーセントを有意に低下させたことを示す図である。Ａ）ビヒクルで処置したマウス（２．３７スコア）と比較したところ、肺好酸球は、５．２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（０．５２９スコア）および１．０ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（０．５８５スコア）で低下した。Ｂ）ビヒクルで処置したマウス（１．７９８ｐｇ／ｍｌ）と比較したところ、ＢＡＬ ＩＬ－５は、５．２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（０．４１７８ｐｇ／ｍｌ）および１．０ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（０．６８２５ｐｇ／ｍｌ）で低下した。Ｃ）ビヒクルで処置したマウス（１４．２７パーセント）と比較したところ、ＢＡＬ好酸球パーセントは、５．２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（２．８９７パーセント）および１．０ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（２．８３６パーセント）で低下した。 Ｆ２７１００１８７は、ＨＤＭチャレンジ後の皮膚炎症を有意に低下させたことを示す図である。ビヒクルで処置したマウス（３．２５スコア）と比較したところ、皮膚炎症は、５．２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（２．０１８スコア）および１．０ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（２．４７５スコア）で低下した。 Ｆ２７１００１８７は、血清中のＩｇＥレベルを有意に低下させたことを示す図である。ビヒクルで処置したマウス（５４８．７ｐｇ／ｍｌ）と比較したところ、血清ＩｇＥレベルは、５．２ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（－１２９１ｐｇ／ｍｌ）および１．０ｍｇ／ｋｇ Ｆ２７１００１８７用量（－１８０．２ｐｇ／ｍｌ）で低下した。

本開示は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、例えばアトピー性皮膚炎および喘息、および／または線維性疾患を処置するための新規のタイプの薬物を提供する。

発明者らは、ＯＸ４０ＬおよびＩＬ－１３を同時に標的化するポリペプチドが、単一特異性抗ＯＸ－４０Ｌまたは抗ＩＬ－１３ポリペプチドと比較して、インビトロおよび／またはインビボで２型炎症性応答をモジュレートする効率の向上をもたらすことを見出した。前記ポリペプチドは、効率的に生産することができる（例えば微生物宿主で）。さらに、このようなポリペプチドは、処置しようとする対象における既存の抗体（すなわち、抗体構築物による最初の処置の前に対象に存在する抗体）への反応性が制限されることを示すことができた。一部の実施形態において、このようなポリペプチドは都合よく投与され、連続処置の回数が依然として制限され、故にこれらの処置がタイミングの間隔を都合よくあけられるように、処置しようとする対象において十分に長い半減期を示し得る。

ポリペプチドは少なくとも二重特異性であるが、例えば、三重特異性、四重特異性または五重特異性であってもよい。さらに、ポリペプチドは少なくとも４価であるが、例えば５価または６価などであってもよい。

用語「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」、または「五重特異性」は全て用語「多重特異性」に該当し、それぞれ２種、３種、４種、または５種の異なる標的分子に結合することを指す。用語「２価」、「３価」、「４価」、「５価」、または「６価」は全て用語「多価」に該当し、それぞれ２種、３種、４種、または５種の結合単位（ＩＳＶＤのような）の存在を示す。例えば、ポリペプチドは、三重特異性４価、例えば４つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドであってもよく、この場合、１つのＩＳＶＤはヒトＯＸ４０Ｌに結合し、２つのＩＳＶＤはヒトＩＬ－１３に結合し、１つのＩＳＶＤはヒト血清アルブミンに結合する（例えば、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７）。このようなポリペプチドは、例えば２つのＩＳＶＤがヒトＯＸ４０ＬまたはヒトＩＬ－１３上の２つの異なるエピトープと結合する場合、同時にバイパラトピックであり得る。用語「バイパラトピック」は、同じ標的分子の２つの異なる部分（例えば、エピトープ）に結合することを指す。

用語「第１のＩＳＶＤ」、「第２のＩＳＶＤ」、「第３のＩＳＶＤ」などは、本明細書で使用される場合、互いに対するＩＳＶＤの相対的な位置のみを示し、番号付けは、本開示のポリペプチドのＮ末端から開始される。したがって「第１のＩＳＶＤ」は、「第２のＩＳＶＤ」よりＮ末端に近く、それに対して「第２のＩＳＶＤ」は、「第３のＩＳＶＤ」などよりＮ末端に近い。したがって、Ｃ末端から考える場合、ＩＳＶＤの配置は逆である。番号付けは絶対ではなく、少なくとも３つのＩＳＶＤの相対的な位置を示すに過ぎないため、ＯＸ４０ＬまたはＩＬ－１３に結合する他の結合単位／ビルディングブロック、例えば追加のＩＳＶＤ、または別の標的に結合するＩＳＶＤがポリペプチド中に存在し得ることは排除されない。さらに、番号付けは、他の結合単位／ビルディングブロック、例えばＩＳＶＤがその間に配置され得る可能性を排除しない。例えば、下記でさらに記載されるように（特に、セクション５．３「（インビボでの）半減期の延長」を参照）、ポリペプチドは、別のヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤをさらに含んでいてもよく、これも例えば「第２のＩＳＶＤ」と「第３のＩＳＶＤ」との間に配置されていてもよい。

上記の観点から、本開示は、少なくとも１つのＩＳＶＤがＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤがＩＬ－１３に特異的に結合する、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドを提供する。

ポリペプチドの構成要素、例えばＩＳＶＤは、１つまたはそれ以上の好適なリンカー、例えばペプチド性リンカーによって互いに連結されていてもよい。

２またはそれ以上の（ポリ）ペプチドを接続するためのリンカーの使用は当業界において周知である。例示的なペプチド性リンカーは、表Ａ－５に示される。使用されることが多いペプチド性リンカーのクラスの一つは、「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」または「ＧＳ」リンカーとして公知である。これらは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）残基から本質的になるリンカーであり、通常、ＧＧＧＧＳ（配列番号６５）モチーフ（例えば、式（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｎを有し、ｎは、１、２、３、４、５、６、７またはそれより多くであり得る）などのペプチドモチーフの１つまたはそれ以上の反復を含む。このようなＧＳリンカーの一部の使用されることが多い例は、９ＧＳリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号６８）１５ＧＳリンカー（ｎ＝３）および３５ＧＳリンカー（ｎ＝７）である。Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１３年１０月１５日；６５（１０）：１３５７～１３６９；およびＫｌｅｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１４）２７（１０）：３２５～３３０が参照される。

本開示のポリペプチドでは、一部の実施形態において、ポリペプチドの構成要素を互いに連結するために、９ＧＳリンカーの使用が選択される。

一実施形態において、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合するＩＳＶＤは、ポリペプチドのＮ末端に位置する。発明者らは、驚くべきことに、このような立体配置はポリペプチドの生産収率を増加させることができることを見出した。

また、一実施形態において、ＩＬ－１３に特異的に結合するＩＳＶＤの１つは、ポリペプチドのＣ末端に位置する。

したがって、一部の実施形態において、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端から開始する順番で、以下を含むかまたはそれからなる：ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、ＩＬ－１３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、本明細書で定義される増加した半減期を有するポリペプチドを提供する任意選択の結合単位、およびＩＬ－１３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤ。一部の実施形態において、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する結合単位はＩＳＶＤである。

一部の実施形態においてポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端から開始する順番で、以下を含むかまたはそれからなることが提供される：ＯＸ４０Ｌに特異的に結合するＩＳＶＤ、リンカー、ＩＬ－１３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、リンカー、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤ、リンカー、およびＩＬ－１３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤ。一部の実施形態において、リンカーは９ＧＳリンカーである。

ポリペプチドのこのような立体配置は、生産収率の増加、優れたＣＭＣ特性、ならびに最適化された機能性および免疫応答のモジュレーションに関するより強い効力をもたらすことができる。

一部の実施形態において、本開示のポリペプチドは、ヒト血清中の既存の抗体による結合の低減を示す。この目的を達成するために、一実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＳＶＤ中、または各ＩＳＶＤ中に、アミノ酸１１位におけるバリン（Ｖ）およびアミノ酸８９位におけるロイシン（Ｌ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を有する。別の実施形態において、ポリペプチドは、天然に存在する、天然に存在しない、またはその混合物のいずれかの１～５個のアミノ酸の伸長、例えばＩＳＶＤのＣ末端における単一のアラニン（Ａ）伸長を有する。ＩＳＶＤのＣ末端は、ＶＴＶＳＳ（配列番号８１）であってもよい。別の実施形態においてポリペプチドは、少なくとも１つのＩＳＶＤ中、または各ＩＳＶＤ中に、１１０位におけるリシン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を有する。別の実施形態において、ＩＳＶＤは、少なくとも１つのＩＳＶＤ中、または各ＩＳＶＤ中に、１１２位におけるリシン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を有する。一部の実施形態において、単一のアラニンを付加した後、ポリペプチドのＣ末端が、例えば、配列ＶＴＶＳＳＡ（配列番号９０）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号９１）、ＶＱＶＳＳＡ（配列番号９２）、ＶＴＶＫＳＡ（配列番号９３）、ＶＴＶＱＳＡ（配列番号９４）、ＶＫＶＫＳＡ（配列番号９５）、ＶＫＶＱＳＡ（配列番号９６）、ＶＱＶＫＳＡ（配列番号９７）、またはＶＱＶＱＳＡ（配列番号９８）を有するように、ＩＳＶＤのＣ末端は、ＶＫＶＳＳ（配列番号８２）、ＶＱＶＳＳ（配列番号８３）、ＶＴＶＫＳ（配列番号８４）、ＶＴＶＱＳ（配列番号８５）、ＶＫＶＫＳ（配列番号８６）、ＶＫＶＱＳ（配列番号８７）、ＶＱＶＫＳ（配列番号８８）、またはＶＱＶＱＳ（配列番号８９）である。一実施形態において、配列はＶＫＶＳＳＡである（配列番号９１）。別の実施形態において、ポリペプチドは、各ＩＳＶＤ中に、アミノ酸１１位におけるバリン（Ｖ）およびアミノ酸８９位におけるロイシン（Ｌ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）、場合により、少なくとも１つのＩＳＶＤ中に、１１０位におけるリシン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を有し、天然に存在する、天然に存在しない、またはその混合物のいずれかの１～５個のアミノ酸の伸長、例えばＩＳＶＤのＣ末端における単一のアラニン（Ａ）伸長を有する（ポリペプチドのＣ末端が、例えば配列ＶＴＶＳＳＡ（配列番号９０）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号９１）、またはＶＱＶＳＳＡ（配列番号９２）を有するように）。これに関するさらなる情報については、各々は参照によってその全体を本明細書に組み入れる、例えばＷＯ２０１２／１７５７４１およびＷＯ２０１５／１７３３２５を参照されたい。

一実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１と、９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、４つのＩＳＶＤのＣＤＲは、それぞれ下記のセクション「５．１免疫グロブリン単一可変ドメイン」および「５．３（インビボにおける）半減期の延長」に記載の項目Ａ～Ｄ（またはＫａｂａｔの定義を使用する場合、Ａ’～Ｄ’）で定義された通りであり、特に：
・ＯＸ４０Ｌに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有し；
・ＩＬ－１３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有し；
・ＩＬ－１３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有し；ならびに
・ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有するか、
または代替としてＫａｂａｔの定義を使用する場合：
・ＯＸ４０Ｌに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有し；
・ＩＬ－１３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有し；
・ＩＬ－１３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有し；ならびに
・ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する。

一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。

本開示のポリペプチドは、一部の実施形態において、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較して、ヒトＯＸ４０ＬおよびヒトＩＬ－１３に対して少なくとも半分の結合親和性、少なくとも同じ結合親和性、またはさらにより多い結合親和性を有し、ここで結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

５．１ 免疫グロブリン単一可変ドメイン
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（ＩＳＶＤ）は、「単一可変ドメイン」と同義的に使用され、これは、免疫グロブリン分子であって、抗原結合部位が単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、それにより形成されるものを定義する。これは、免疫グロブリン単一可変ドメインを、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する「従来の」免疫グロブリン（例えばモノクローナル抗体）またはその断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ）とは別に設定している。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）と軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）とが相互作用して、抗原結合部位を形成する。この場合、Ｖ_ＨとＶ_Ｌの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与することになり、すなわち合計６つのＣＤＲが、抗原結合部位形成に関与することになる。

上記の定義を考慮すれば、従来の４鎖抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子；当業界において公知）の、またはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、例えばジスルフィドで連結されたＦｖまたはｓｃＦｖ断片、もしくはこのような従来の４鎖抗体由来のダイアボディ（全て当業界において公知）の抗原－結合ドメインは通常、免疫グロブリン単一可変ドメインとみなされないが、これは、これらの場合では、抗原のそれぞれのエピトープに結合することは通常、１つの（単一の）免疫グロブリンドメインによって起こるのではなく、一対の（会合する）免疫グロブリンドメイン、例えば軽鎖および重鎖可変ドメインによって、すなわち連帯してそれぞれの抗原のエピトープに結合する免疫グロブリンドメインのＶ_Ｈ－Ｖ_Ｌ対によって起こるためである。

対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の免疫グロブリン可変ドメインと対合せずに抗原のエピトープに特異的に結合することが可能である。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶ_Ｈ、単一のＶ_ＨＨまたは単一のＶ_Ｌドメインによって形成される。

したがって、単一の抗原結合単位（すなわち、機能的な抗原結合単位を形成するのに、単一の抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用する必要がないように、単一可変ドメインから本質的になる機能的な抗原結合単位）を形成することが可能である限りは、単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、Ｖ_Ｌ－配列）もしくはその好適な断片；または重鎖可変ドメイン配列（例えば、Ｖ_Ｈ－配列またはＶ_ＨＨ配列）もしくはその好適な断片であり得る。

免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）は、例えば重鎖ＩＳＶＤであってもよく、例えばＶ_Ｈ、Ｖ_ＨＨ、例えばラクダ化Ｖ_Ｈまたはヒト化されたＶ_ＨＨなどであってもよい。一部の実施形態によれば、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）は、ラクダ化Ｖ_Ｈまたはヒト化Ｖ_ＨＨを含むＶ_ＨＨである。重鎖ＩＳＶＤは、従来の４鎖抗体または重鎖抗体由来であってもよい。

例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、単一ドメイン抗体（または単一ドメイン抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」もしくはｄＡｂ（またはｄＡｂとして使用するのに好適なアミノ酸配列）、もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（本明細書で定義される通りであり、その例としては、これに限定されないが、Ｖ_ＨＨが挙げられる）；他の単一可変ドメイン、またはそれらのいずれか１つのあらゆる好適な断片であり得る。

特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（例えばＶ_ＨＨ、例えばヒト化Ｖ_ＨＨまたはラクダ化Ｖ_Ｈなど）またはその好適な断片であり得る。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）およびＮａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の登録商標である。

「Ｖ_ＨＨドメイン」は、Ｖ_ＨＨ、Ｖ_ＨＨ抗体断片、およびＶ_ＨＨ抗体としても公知であり、これは元々、「重鎖抗体」の（すなわち、「軽鎖を欠失した抗体」の；Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６～４４８、１９９３）免疫グロブリンの可変ドメインと結合する抗原として説明されていた。用語「Ｖ_ＨＨドメイン」は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体（本明細書では「Ｖ_Ｈドメイン」と称される）に存在する重鎖可変ドメインおよび従来の４鎖抗体（本明細書では「Ｖ_Ｌドメイン」と称される）に存在する軽鎖可変ドメインと区別するために選択された。Ｖ_ＨＨのさらなる説明のために、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによる総論（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７～３０２頁、２００１）、および一般的な背景技術として言及されている以下の特許出願：Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ ＢｒｕｓｓｅｌのＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９およびＷＯ９６／３４１０３；ＵｎｉｌｅｖｅｒのＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ１１３４２３１およびＷＯ０２／４８１９３；Ｖｌａａｍｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ ｖｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（ＶＩＢ）のＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６およびＷＯ０３／０５５５２７；Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ Ｎ．Ｖ．およびＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．のＷＯ０３／０５０５３１；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ ＣａｎａｄａによるＷＯ０１／９０１９０；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓによるＷＯ０３／０２５０２０（＝ＥＰ１４３３７９３）；ならびにＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．によるＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７およびＷＯ０６／１２２８２５が参照され、これらの各々は参照によってその全体を本明細書に組み入れる。

典型的には、免疫グロブリンの生成は、実験動物の免疫化、免疫グロブリンを生産する細胞を融合してハイブリドーマを作り出すこと、および望ましい特異性に関してスクリーニングすることを含む。代替として、免疫グロブリンは、ナイーブまたは合成ライブラリーを、例えばファージディスプレイによってスクリーニングすることによって生成してもよい。

免疫グロブリン配列、例えばＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の生成は、様々な出版物で広範囲に説明されており、その中でもＷＯ９４／０４６７８、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら １９９３およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら ２００１（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７～３０２頁、２００１）を例示することができ、これらの各々は参照によってその全体を本明細書に組み入れる。これらの方法において、前記標的抗原に対する免疫応答を誘導するために、ラクダ科動物が標的抗原で免疫化される。前記免疫化から得られたＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのレパートリーはさらに、標的抗原と結合するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓに関してスクリーニングされる。

これらの例において、抗体の生成は、免疫化および／またはスクリーニングのために精製した抗原を必要とする。抗原は、天然源から精製してもよいし、または組換え体生産の過程で精製してもよい。

免疫グロブリン配列の免疫化および／またはスクリーニングは、このような抗原のペプチド断片を使用して実行することができる。

マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒトおよびラクダ科動物免疫グロブリン配列を含む、異なる起源の免疫グロブリン配列が使用される。本開示はまた、完全ヒト、ヒト化またはキメラ配列も含む。例えば、本開示は、ラクダ科動物免疫グロブリン配列およびヒト化ラクダ科動物免疫グロブリン配列、またはラクダ化ドメイン抗体、例えば、Ｗａｒｄらによって記載されるようなラクダ化ｄＡｂを含む（例えばＷＯ９４／０４６７８およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．、３３９：２８５～２９０頁、１９９４およびＰｒｏｔ． Ｅｎｇ．、９：５３１～５３７頁、１９９６を参照、これらの各々は参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。さらに、本開示はまた、例えば多価および／または多重特異性構築物を形成する融合した免疫グロブリン配列（１つまたはそれ以上のＶ_ＨＨドメインを含有する多価および多重特異性ポリペプチドならびにそれらの調製については、Ｃｏｎｒａｔｈら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ． ２７６、１０． ７３４６～７３５０頁、２００１、ならびに例えばＷＯ９６／３４１０３およびＷＯ９９／２３２２１も参照され、これらの各々は参照によってその全体を本明細書に組み入れる）、ならびにタグまたは他の機能的部分、例えば毒素、標識、放射化学物質などを含む免疫グロブリン配列も使用し、これらは本開示の免疫グロブリン配列から誘導可能である。

「ヒト化Ｖ_ＨＨ」は、天然に存在するＶ_ＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ヒト化」されている、すなわち、前記天然に存在するＶ_ＨＨ配列のアミノ酸配列中の（特にフレームワーク配列中の）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、ヒトからの従来の４鎖抗体（例えば上記で示された）からのＶ_Ｈドメイン中の対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つまたはそれ以上によって置き換えることによってヒト化されているアミノ酸配列を含む。これは、例えば本明細書および文献（例えば、参照によってその全体を組み入れるＷＯ２００８／０２００７９）のさらなる説明に基づき、当業者には明らかであるそれ自体公知の方式で実行することができる。ここでも注目すべきことに、このようなヒト化Ｖ_ＨＨは、それ自体公知のあらゆる好適な方式で得ることができ、したがって、厳密には、出発材料として天然に存在するＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに限定されない。

「ラクダ化Ｖ_Ｈ」は、天然に存在するＶ_Ｈドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ラクダ化」されている、すなわち、従来の４鎖抗体からの天然に存在するＶ_Ｈドメインのアミノ酸配列中の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶ_ＨＨドメインにおける対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つまたはそれ以上によって置き換えることによってラクダ化されているアミノ酸配列を含む。これは、例えば本明細書や文献（例えばＷＯ２００８／０２００７９）に記載のさらなる説明に基づき、当業者には明らかであるそれ自体公知の方式で実行することができる。このような「ラクダ化」置換は、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌの境界を形成する、および／またはそこに存在するアミノ酸位置に、および／または本明細書で定義されるようないわゆるラクダの特徴的な残基に挿入され得る（例えばＷＯ９４／０４６７８ならびにＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９４および１９９６）、上記を参照）。一部の実施形態において、ラクダ化Ｖ_Ｈを生成または設計するための出発材料または開始点として使用されるＶ_Ｈ配列は、哺乳動物からのＶ_Ｈ配列、またはヒトのＶ_Ｈ配列、例えばＶ_Ｈ３配列である。しかしながら、注目すべきことに、このようなラクダ化Ｖ_Ｈは、それ自体公知のあらゆる好適な方式で得ることができ、したがって、厳密には、出発材料として天然に存在するＶ_Ｈドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに限定されない。

１つまたはそれ以上の免疫グロブリン配列は、互いにおよび／または他のアミノ酸配列に連結されて（例えばジスルフィド架橋を介して）、同様に有用であり得るペプチド構築物（例えば、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ構築物、「ダイアボディ」および他の多重特異性構築物）を提供できることに留意すべきである。例えば、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎによる総論、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５ Ｓｅｐ；２３（９）：１１２６～３６頁が参照される。一般的に、ポリペプチドが対象への投与を意図される場合（例えば、予防、治療および／または診断目的で）、ポリペプチドは、前記対象には天然に存在しない免疫グロブリン配列を含み得る。

免疫グロブリン単一可変ドメイン配列の構造の非限定的な例は、４つのフレームワーク領域（「ＦＲ」）からなるとみなすことができ、４つのＦＲは、当業界および本明細書ではそれぞれ「フレームワーク領域１」（「ＦＲ１」）；「フレームワーク領域２」（「ＦＲ２」）；「フレームワーク領域３」（「ＦＲ３」）；および「フレームワーク領域４」（「ＦＲ４」）と呼ばれ；これらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）によって遮られ、３つのＣＤＲは、当業界および本明細書ではそれぞれ「相補性決定領域１」（「ＣＤＲ１」）；「相補性決定領域２」（「ＣＤＲ２」）；および「相補性決定領域３」（「ＣＤＲ３」）と呼ばれる。

ＷＯ０８／０２００７９（参照によって本明細書に組み入れる）の５８頁および５９頁の段落ｑ）でさらに記載されるように、免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸残基は、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２０００（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４０（１～２）：１８５～１９５頁；例えばこの出版物の図２を参照）の論文でラクダ科動物からのＶ_ＨＨドメインに適用されている通り、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１）によって付与されたＶ_Ｈドメインの一般的な番号付けに従って番号付けすることができる。注目すべきことに、Ｖ_ＨドメインおよびＶ_ＨＨドメインに関して当業界において周知の通り、ＣＤＲのそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数は変化することがあり、Ｋａｂａｔの番号付けによって示されたアミノ酸残基の総数に対応していなくてもよい（すなわち、Ｋａｂａｔの番号付けによる１つまたはそれ以上の位置が実際の配列において占有されていなくてもよいし、または実際の配列がＫａｂａｔの番号付けによって許容される数より多くのアミノ酸残基を含有していてもよい）。これは、一般的に、Ｋａｂａｔによる番号付けは、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際の番号付けに対応していてもよいし、または対応していなくてもよいことを意味する。Ｖ_ＨドメインおよびＶ_ＨＨドメインにおけるアミノ酸残基の総数は、通常、１１０～１２０の範囲となり、１１２～１１５となることが多い。しかしながら、注目すべきことに、それより短い配列およびそれより長い配列も、本明細書に記載される目的にとって好適であり得る。

本出願において、別段の指定がない限り、ＣＤＲ配列は、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（２０１０年編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ、Ｍａｒｔｉｎ、第３章、３３～５１頁）に記載されたように、ＡｂＭの番号付けに従って決定された。この方法によれば、ＦＲ１は、１～２５位にアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は、２６～３５位にアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は、３６～４９位にアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ２は、５０～５８位にアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は、５９～９４位にアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は、９５～１０２位にアミノ酸残基を含み、ＦＲ４は、１０３～１１３位にアミノ酸残基を含む。

ＣＤＲ領域の決定は、異なる方法に従って行ってもよい。ＫａｂａｔによるＣＤＲ決定において、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ１は、１～３０位にアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１は、３１～３５位にアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ２は、３６～４９位にアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ２は、５０～６５位にアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ３は、６６～９４位にアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ３は、９５～１０２位にアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ４は、１０３～１１３位にアミノ酸残基を含む。

このような免疫グロブリン配列において、フレームワーク配列は、あらゆる好適なフレームワーク配列であってもよく、好適なフレームワーク配列の例は、例えば標準的な教本、および本明細書で述べられたさらなる開示および先行技術に基づき当業者には明らかであろう。

フレームワーク配列は、免疫グロブリンフレームワーク配列または免疫グロブリンフレームワーク配列から得られた（例えば、ヒト化またはラクダ化によって）フレームワーク配列（の好適な組合せ）であり得る。例えば、フレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えばＶ_Ｌ配列）および／または重鎖可変ドメイン（例えばＶ_Ｈ配列またはＶ_ＨＨ配列）から得られたフレームワーク配列であり得る。一実施形態において、フレームワーク配列は、Ｖ_ＨＨ配列から得られたフレームワーク配列（それにおいて、前記フレームワーク配列が、場合により、部分的または完全にヒト化されていてもよい）であるか、または従来のラクダ化Ｖ_Ｈ配列（本明細書で定義される通り）であるかのいずれかである。

特に、本明細書で開示される通りＩＳＶＤ配列に存在するフレームワーク配列は、ＩＳＶＤ配列が、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、例えばヒト化Ｖ_ＨＨまたはラクダ化Ｖ_Ｈを含むＶ_ＨＨになるように、特徴的な残基（本明細書で定義される通り）の１つまたはそれ以上を含有していてもよい。このようなフレームワーク配列の一部の非限定的な例（その好適な組合せ）は、本明細書に記載のさらなる開示から明確になるであろう。

ここでも、本明細書において免疫グロブリン配列に関して一般的に記載される通り、また、前述のもののいずれかの好適な断片（または断片の組合せ）、例えば、好適には１つまたはそれ以上のフレームワーク配列が隣接する、および／またはそれを介して連結された１つまたはそれ以上のＣＤＲ配列を含有する断片（例えば、これらのＣＤＲおよびフレームワーク配列は、断片がそれから得られた完全サイズの免疫グロブリン配列において生じ得る同じ順番で）を使用することも考えられる。

しかしながら、注目すべきことに、開示は、ＩＳＶＤ配列（またはそれを発現させるのに使用されるヌクレオチド配列）の起源にも、ＩＳＶＤ配列またはヌクレオチド配列が生成される（または生成された）または得られる方法にも限定されない。したがって、ＩＳＶＤ配列は、天然に存在する配列（あらゆる好適な種からの）であってもよいし、または合成もしくは半合成の配列であってもよい。具体的な、ただし非限定的な態様において、ＩＳＶＤ配列は、天然に存在する配列（あらゆる好適な種からの）または合成もしくは半合成の配列であり、その例としては、これらに限定されないが、「ヒト化」（本明細書で定義される通り）免疫グロブリン配列（例えば部分的または完全にヒト化されたマウスまたはウサギ免疫グロブリン配列、特に、部分的または完全にヒト化されたＶ_ＨＨ配列）、「ラクダ化」（本明細書で定義される通り）免疫グロブリン配列、加えて、親和性成熟（例えば、合成、ランダムまたは天然に存在する免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲグラフティング、ベニアリング（veneering）、異なる免疫グロブリン配列から得られた断片を組み合わせること、オーバーラップするプライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、および当業者周知の免疫グロブリン配列を操作するための類似の技術；または前述のもののいずれかのあらゆる好適な組合せなどの技術により得られた免疫グロブリン配列が挙げられる。

同様に、ヌクレオチド配列は、天然に存在するヌクレオチド配列または合成もしくは半合成の配列であってもよく、例えば、好適な天然に存在するテンプレートからＰＣＲによって単離される配列（例えば細胞から単離したＤＮＡまたはＲＮＡ）、ライブラリー（特に、発現ライブラリー）から単離されたヌクレオチド配列、天然に存在するヌクレオチド配列に突然変異を導入すること（それ自体公知のあらゆる好適な技術、例えばミスマッチＰＣＲを使用して）によって調製されるヌクレオチド配列、オーバーラップするプライマーを使用するＰＣＲによって調製されたヌクレオチド配列、またはそれ自体公知のＤＮＡ合成のための技術を使用して調製されたヌクレオチド配列であり得る。

上述したように、ＩＳＶＤは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）またはその好適な断片であり得る。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）およびＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．、Ｓａｎｏｆｉ Ｃｏｍｐａｎｙの登録商標である）の一般的な説明については、以下のさらなる説明、および本明細書において引用された先行技術が参照される。しかしながら、この点において、この説明および先行技術は、主として、いわゆる「Ｖ_Ｈ３クラス」のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（すなわち、ＤＰ－４７、ＤＰ－５１またはＤＰ－２９などのＶ_Ｈ３クラスのヒト生殖細胞系配列に対して高度な配列相同性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））を説明したものであることに留意すべきである。しかしながら、本開示は、その最も広い意味で、一般的にあらゆるタイプのＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）を使用することができ、例えば参照によってその全体を組み入れるＷＯ２００７／１１８６７０に記載の、例えばいわゆる「Ｖ_Ｈ４クラス」に属するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（すなわち、ＤＰ－７８などのＶ_Ｈ４クラスのヒト生殖細胞系配列に対して高度な配列相同性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））も使用することに留意すべきである。

一般的に、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（特にＶ_ＨＨ配列、例えば（部分的に）ヒト化Ｖ_ＨＨ配列およびラクダ化Ｖ_Ｈ配列など）は、フレームワーク配列（ここでも本明細書にさらに記載される通り）の１つまたはそれ以上における１つまたはそれ以上の「特徴的な残基」（本明細書に記載される通り）の存在によって特徴付けることができる。したがって、一般的に、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、（一般）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列と定義することができ、式中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し、特徴的な残基の１つまたはそれ以上は、さらに本明細書で定義される通りである。

詳細には、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、（一般）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であってもよく、式中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し、フレームワーク配列は、さらに本明細書で定義される通りである。

より詳細には、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、（一般）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であってもよく、式中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し：
Ｋａｂａｔの番号付けに従って１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８位におけるアミノ酸残基の１つまたはそれ以上が、以下の表Ａ－０に記載した特徴的な残基から選択される。

一部の実施形態において、１１位における特徴的な残基はＬである。一部の実施形態において、３７位における特徴的な残基はＦ^（１）またはＹである。一部の実施形態において、４４位における特徴的な残基はＧ^（２）またはＱ^（３）である。一部の実施形態において、４５位における特徴的な残基はＬ^（２）またはＲ^（３）である。一部の実施形態において、４７位における特徴的な残基はＦ^（１）、Ｌ^（１）またはＷ^（２）である。一部の実施形態において、８３位における特徴的な残基はＫである。一部の実施形態において、８４位における特徴的な残基はＰである。一部の実施形態において、１０３位における特徴的な残基はＷである。一部の実施形態において、１０４位における特徴的な残基はＧである。一部の実施形態において、１０８位における特徴的な残基はＱまたはＬである。

本開示はとりわけ、ＯＸ４０ＬまたはＩＬ－１３に特異的に結合することができるＩＳＶＤを使用する。本開示に関して、特定の標的分子「に結合すること」は、抗体およびそのそれぞれの抗原に関して理解される当業界における通常の意味を有する。

本開示のポリペプチドは、ＯＸ４０Ｌに結合する１つまたはそれ以上のＩＳＶＤ、およびＩＬ－１３に結合する２つまたはそれ以上のＩＳＶＤを含んでいてもよい。例えば、ポリペプチドは、ＯＸ４０Ｌに結合する１つのＩＳＶＤ、およびＩＬ－１３に結合する２つのＩＳＶＤを含んでいてもよい。

一部の実施形態において、少なくとも１つのＩＳＶＤは、その標的分子を機能的にブロックすることができる。例えば、標的化部分は、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０（受容体）との相互作用をブロックすることができ、一部の実施形態において、Ｔ細胞からのＩＬ２のＯＸ４０Ｌ誘導放出を阻害することができ、またはＩＬ－１３とＩＬ－１３Ｒα１（インターロイキン１３受容体、アルファ１）との相互作用、および／もしくはＩＬ－１３／ＩＬ－１３Ｒα１複合体とＩＬ－４Ｒα（アルファインターロイキン－４受容体）との相互作用をブロックすることができる。したがって、一実施形態において、本開示のポリペプチドは、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、ＯＸ４０とのその相互作用を阻害する少なくとも１つのＩＳＶＤ、ならびにＩＬ－１３に特異的に結合し、ＩＬ－１３Ｒα１とのその相互作用、および／またはＩＬ－１３／ＩＬ－１３Ｒα１複合体とＩＬ－４Ｒαとの相互作用を機能的にブロックする２つのＩＳＶＤを含む。

本開示で使用されるＩＳＶＤは、ポリペプチドがＯＸ４０ＬおよびＩＬ－１３に特異的に結合することができるように、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる本開示のポリペプチドの一部を形成する。

したがって、本開示のポリペプチドで使用される少なくとも３つのＩＳＶＤの標的分子は、ＯＸ４０ＬおよびＩＬ－１３である。その例は、哺乳動物ＯＸ４０ＬおよびＩＬ－１３である。ヒトＯＸ４０Ｌ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２３５１０）およびヒトＩＬ－１３（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ３５２２５）が使用されるが、他の種からのバージョン、例えばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、例えばカニクイザル（本明細書では「カニクイザル」としても言及される）、またはラクダ科動物、例えばラマもしくはアルパカからのＯＸ４０ＬおよびＩＬ－１３も本開示に適している。

本開示で使用できるＯＸ４０ＬまたはＩＬ－１３に特異的に結合するＩＳＶＤの具体的な例は、以下の項目Ａ～Ｃに記載される通りである：
Ａ．ヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号１０のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１４のアミノ酸配列を有する。

ヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２に構築物１５Ｂ０７ＡＭに関して示されている１つもしくはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ａで定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物１５Ｂ０７ＡＭの全長アミノ酸配列を有する（配列番号２、表Ａ－１およびＡ－２を参照）。

また、一実施形態において、ヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を有していてもよく、場合により、ＣＤＲは前述の項目Ａで定義された通りである。一部の実施形態において、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。

ＯＸ４０Ｌに特異的に結合するこのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ａ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１つのアミノ酸の差異を有する場合、一部の実施形態において、ＩＳＶＤは、ヒトＯＸ４０Ｌに対して構築物１５Ｂ０７ＡＭの少なくとも半分の結合親和性、少なくとも同じ結合親和性、またはさらにより高い結合親和性を有し、ここで結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

Ｂ．ヒトＩＬ－１３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号７のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号１１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１５のアミノ酸配列を有する。

ヒトＩＬ－１３に特異的に結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２に４Ｂ０２／１構築物に関して示されている１つもしくはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ｂで定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物４Ｂ０２／１の全長アミノ酸配列を有する（配列番号３、表Ａ－１およびＡ－２を参照）。

また、一実施形態において、ヒトＩＬ－１３に特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を有していてもよく、場合により、ＣＤＲは前述の項目Ｂで定義された通りである。一部の実施形態において、ＩＬ－１３に結合するＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。

ＩＬ－１３に結合するこのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ｂ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１つのアミノ酸の差異を有する場合、一部の実施形態において、ＩＳＶＤは、ヒトＩＬ－１３に対して構築物４Ｂ０２／１の少なくとも半分の結合親和性、少なくとも同じ結合親和性、またはさらにより高い結合親和性を有し、ここで結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

Ｃ．ヒトＩＬ－１３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号９のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号１３のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１７のアミノ酸配列を有する。

ヒトＩＬ－１３に特異的に結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２に構築物４Ｂ０６／１に関して示されている１つもしくはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ｃで定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物４Ｂ０６／１の全長アミノ酸配列を有する（配列番号５、表Ａ－１およびＡ－２を参照）。

また、一実施形態において、ヒトＩＬ－１３に特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を有していてもよく、場合により、ＣＤＲは前述の項目Ｃで定義された通りである。一部の実施形態において、ＩＬ－１３に結合するＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を有する。

ＩＬ－１３に特異的に結合するこのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ｃ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１つのアミノ酸の差異を有する場合、ＩＳＶＤは、ヒトＩＬ－１３に対して構築物４Ｂ０６／１の少なくとも半分の結合親和性、少なくとも同じ結合親和性、またはさらにより高い結合親和性を有し、ここで結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

一部の実施形態において、上記の項目Ａ～Ｃで定義されるＩＳＶＤのそれぞれは、本開示のポリペプチドに含まれる。一部の実施形態において、上記の項目Ａ～Ｃで定義されるＩＳＶＤのそれぞれを含む本開示のこのようなポリペプチドは、ヒトＯＸ４０ＬおよびヒトＩＬ－１３に対して、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドの少なくとも半分の結合親和性、少なくとも同じ結合親和性、またはさらにより多くの結合親和性を有し、ここで結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

上記の項目Ａ～Ｃで言及される配列番号は、ＡｂＭの定義によるＣＤＲの定義（表Ａ－２を参照）に基づく。Ｋａｂａｔ定義により同じＣＤＲを定義する配列番号（表Ａ－２．１を参照）は、同様に、上記の項目Ａ～Ｃで使用することができることに留意する。

したがって、ＡｂＭの定義を使用して上述したように本開示で使用できるＯＸ４０ＬまたはＩＬ－１３に特異的に結合する具体的なＩＳＶＤは、下記の項目Ａ’～Ｃ’に記載の通りＫａｂａｔ定義を使用して記載することもできる：
Ａ’．ヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、
ｉ．配列番号３１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３５のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号３１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号３５のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１４のアミノ酸配列を有する。

ヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２．１に構築物１５Ｂ０７ＡＭに関して示されている１つもしくはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ａ’で定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物１５Ｂ０７ＡＭの全長アミノ酸配列を有する（配列番号２、表Ａ－１およびＡ－２．１を参照）。

Ｂ’．ヒトＩＬ－１３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号３２のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号３２のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号３６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１５のアミノ酸配列を有する。

ヒトＩＬ－１３に特異的に結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２．１に構築物４Ｂ０２／１に関して示されている１つもしくはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ｂ’で定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物４Ｂ０２／１の全長アミノ酸配列を有する（配列番号３、表Ａ－１およびＡ－２．１を参照）。

Ｃ’．ヒトＩＬ－１３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号３４のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３８のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号３４のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号３８のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１７のアミノ酸配列を有する。

ヒトＩＬ－１３に特異的に結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２．１に構築物４Ｂ０６／１に関して示されている１つもしくはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ｃ’で定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物４Ｂ０６／１の全長アミノ酸配列を有する（配列番号５、表Ａ－１およびＡ－２．１を参照）。

第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との「配列同一性」のパーセンテージは、［第２のアミノ酸配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基と同一な、第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］で割り、［１００％］を掛けることによって計算することができ、この場合、第１のアミノ酸配列と比較した場合の第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の欠失、挿入、置換または付加のそれぞれは、単一のアミノ酸残基（すなわち単一の位置）における差としてみなされる。

通常、上記で概説した計算方法に従って２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のために、最大数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列が「第１の」アミノ酸配列として取り扱われることになり、その他のアミノ酸配列が「第２の」アミノ酸配列として取り扱われることになる。

「アミノ酸の差異」は、本明細書で使用される場合、参照配列に相対する単一のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を指す。一部の実施形態において、アミノ酸の差異は、置換である。

一部の実施形態において、アミノ酸置換は、保存的置換である。一部の実施形態において、このような保存的置換は、以下のグループ（ａ）～（ｅ）内の１つのアミノ酸が、同じグループ内の別のアミノ酸残基で置換されている置換である：（ａ）小さい脂肪族の、非極性の、またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｂ）極性の負電荷を有する残基およびその（非荷電性）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｃ）極性の正電荷を有する残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｄ）大きい脂肪族の、非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；および（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。

一部の実施形態において、保存的置換は、以下の通りである：ＡｌａからＧｌｙへの、またはＳｅｒへの；ＡｒｇからＬｙｓへの；ＡｓｎからＧｌｎへの、またはＨｉｓへの；ＡｓｐからＧｌｕへの；ＣｙｓからＳｅｒへの；ＧｌｎからＡｓｎへの；ＧｌｕからＡｓｐへの；ＧｌｙからＡｌａへの、またはＰｒｏへの；ＨｉｓからＡｓｎへの、またはＧｌｎへの；ＩｌｅからＬｅｕへの、またはＶａｌへの；ＬｅｕからＩｌｅへの、またはＶａｌへの；ＬｙｓからＡｒｇへの、Ｇｌｎへの、またはＧｌｕへの；ＭｅｔからＬｅｕへの、Ｔｙｒへの、またはＩｌｅへの；ＰｈｅからＭｅｔへの、Ｌｅｕへの、またはＴｙｒへの；ＳｅｒからＴｈｒへの；ＴｈｒからＳｅｒへの；ＴｒｐからＴｙｒへの；ＴｙｒからＴｒｐへの；および／またはＰｈｅからＶａｌへの、Ｉｌｅへの、またはＬｅｕへの置換。

５．２ 特異性
用語「特異性」、「特異的に結合する」または「特異的な結合」は、特定の結合単位、例えばＩＳＶＤが十分に高い親和性で結合することができる、同じ生物からの抗原などの異なる標的分子の数を指す（下記を参照）。「特異性」、「特異的に結合する」または「特異的な結合」は、本明細書において、「選択性」、「選択的に結合する」または「選択的な結合」と同義的に使用される。実施形態によれば、結合単位、例えばＩＳＶＤは、その指定された標的に特異的に結合する。

結合単位の特異性／選択性は、親和性に基づいて決定することができる。親和性は、分子相互作用の強度または安定性を表す。親和性は、一般的に、モル／リットル（またはＭ）の単位を有するＫＤ、または解離定数によって示される。親和性はまた、１／ＫＤに等しく、（モル／リットル）^－１（またはＭ^－１）の単位を有する会合定数、ＫＡとして表すこともできる。

親和性は、部分と標的分子上の結合部位との間の結合強度の尺度であり：ＫＤ値が低いほど、標的分子と標的化部分との間の結合強度はより強くなる。

典型的には、本開示で使用される結合単位（例えばＩＳＶＤ）は、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれ未満、例えば１０^－７～１０^－１２モル／リットルまたはそれ未満、より具体的には例えば１０^－８～１０^－１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）（すなわち、１０^５～１０^１２リットル／モルまたはそれより多く、例えば１０^７～１０^１２リットル／モルまたはそれより多く、より具体的には例えば１０^８～１０^１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ））でその標的に（室温で）結合する。

一般的に、１０^－４モル／リットルより大きいあらゆるＫＤ値（または１０^４リットル／ｍｏｌより低いあらゆるＫＡ値）が、非特異的な結合を示すとみなされる。

生物学的な相互作用のＫＤ、例えば、特異的とみなされる免疫グロブリン配列の抗原への結合のＫＤは、典型的には、１０^－５モル／リットル（１００００ｎＭまたは１０μＭ）～１０^－１２モル／リットル（０．００１ｎＭまたは１ｐＭ）またはそれ未満の範囲内である。

したがって、特異的／選択的な結合は、同じ測定方法、例えばＳＰＲを使用した場合、結合単位（またはそれを含むポリペプチド）は、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれ未満のＫＤ値で、ＯＸ４０Ｌおよび／またはＩＬ１３に結合し、関連するサイトカインに１０^－４モル／リットルより大きいＫＤ値で結合することを意味する場合がある。ＯＸ４０Ｌに関連する標的の例は、ヒトＴＲＡＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、およびＲＡＮＫＬである。ＩＬ－１３に関連する標的の例は、ヒトＩＬ－４である。したがって、一実施形態において、ポリペプチド中に含まれる少なくとも１つのＩＳＶＤは、ＯＸ４０Ｌに、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれ未満のＫＤ値で結合し、同じ種のＴＲＡＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、およびＲＡＮＫＬに、１０^－４モル／リットルより大きいＫＤ値で結合し、ポリペプチド中に含まれる少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＩＬ－１３に、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれ未満のＫＤ値で結合し、同じ種のＩＬ－４に、１０^－４モル／リットルより大きいＫＤ値で結合する。

故に、一部の実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較して、ヒトＯＸ４０ＬおよびヒトＩＬ－１３に対して少なくとも半分の結合親和性、少なくとも同じ結合親和性、またはさらにより高い結合親和性を有し、ここで結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

特定の種からの特定の標的への特異的結合は、結合単位が、異なる種からの類似した標的にも特異的に結合する可能性があることを排除しない。例えば、ヒトＯＸ４０Ｌへの特異的結合は、結合単位（またはそれを含むポリペプチド）が、カニクイザルからのＯＸ４０Ｌにも特異的に結合する可能性があることを排除しない。同様に、例えば、ヒトＩＬ－１３への特異的結合は、結合単位（またはそれを含むポリペプチド）が、カニクイザル（「ｃｙｎｏ」）からのＩＬ－１３にも特異的に結合する可能性があることを排除しない。

結合単位の、その指定された標的への特異的な結合は、それ自体公知のあらゆる好適な方式、これらに限定されないが、スキャッチャード分析および／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫検査法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイ、ならびにそれ自体当業界において公知のそれらの様々な改変法；加えて本明細書で述べられる他の技術で決定することができる。

解離定数は、当業者には明らかであろうが、実際の解離定数であってもよいし、または見かけの解離定数であってもよい。解離定数を決定するための方法は、当業者には明らかであり、その例としては、下記で述べられる技術が挙げられる。この点において、１０^－４モル／リットルまたは１０^－３モル／リットルより大きい（例えば１０^－２モル／リットルの）解離定数を測定できない可能性があることも明らかであろう。場合により、当業者には明らかであろうが、（実際の、または見かけの）解離定数は、［ＫＤ＝１／ＫＡ］という関係によって、（実際の、または見かけの）会合定数（ＫＡ）に基づき計算することができる。

２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体公知の様々な技術、例えば周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術を介して測定することができる（例えばＯｂｅｒら、２００１、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３：１５５１～１５５９を参照）。用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書で使用される場合、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によってリアルタイムの生体特異的な相互作用の分析を可能にする光学現象を指し、この場合、一方の分子がバイオセンサーチップに固定され、他方の分子が流動条件下で固定された分子上を通過することで、ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ測定値、したがってＫ_Ｄ（またはＫ_Ａ）値が得られる。これは、例えば、周知のＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して実行することができる。さらなる説明に関しては、Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９３、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９～２６）、Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９１ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０～６２７）、Ｊｏｈｎｓｓｏｎら（１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５～１３１）、およびＪｏｈｎｓｓｏｎら（１９９１、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８～２７７）を参照されたい。

生体分子の相互作用の親和性を決定するための別の周知のバイオセンサー技術は、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）である（例えばＡｂｄｉｃｈｅら、２００８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７７：２０９～２１７を参照）。用語「バイオレイヤー干渉法」または「ＢＬＩ」は、本明細書で使用される場合、２つの表面：内部参照層（参照ビーム）およびバイオセンサーチップ上の固定されたタンパク質の層（シグナルビーム）から反射した光の干渉縞を分析する、標識なしの光学技術を指す。バイオセンサーのチップに結合した分子の数の変化は、波長シフト（ｎｍ）として報告される干渉縞におけるシフトを引き起こし、その規模が、バイオセンサーチップ表面に結合した分子の数の直接の尺度である。相互作用はリアルタイムで測定できるため、会合および解離速度ならびに親和性を決定することができる。ＢＬＩは、例えば、周知のＯｃｔｅｔ（登録商標）システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＵＳＡの一部門）を使用して実行することができる。

代替として、親和性は、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）プラットフォーム（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ、Ｂｏｉｓｅ、ＵＳＡ）を使用する反応速度論除外アッセイ（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ；ＫｉｎＥｘＡ）（例えばＤｒａｋｅら、２００４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２８：３５～４３を参照）で測定することができる。用語「ＫｉｎＥｘＡ」は、本明細書で使用される場合、改変されていない分子の真の平衡結合親和性および速度論を測定するための溶液ベースの方法を指す。抗体／抗原複合体の平衡化溶液を、抗原（または抗体）でプレコーティングされたビーズを有するカラム上に通過させることで、遊離の抗体（または抗原）をコーティングされた分子に結合させることができる。このようにして捕獲された抗体（または抗原）の検出は、抗体（または抗原）と結合する蛍光標識したタンパク質を用いて達成される。

ＧＹＲＯＬＡＢ（登録商標）イムノアッセイシステムは、自動化された生物学的な分析および迅速なサンプルの回転のためのプラットフォームを提供する（Ｆｒａｌｅｙら、２０１３、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ５：１７６５～７４）。

５．３ （インビボにおける）半減期の延長
ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含んでいてもよく、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した（インビボにおける）半減期を有するポリペプチドを提供する。インビボにおける半減期の延長は、例えば、ポリペプチドが、投与された後、哺乳動物、例えばヒト対象において増加した半減期を有することを意味する。半減期は、例えばｔ１／２ベータとして表することができる。

基、残基、部分または結合単位のタイプは、一般的に制限されず、例えば、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群から選択することができる。

より具体的には、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、または血清免疫グロブリン、例えばＩｇＧに結合することができる結合単位からなる群から選択することができる。一部の実施形態において、結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができる。一部の実施形態において、結合単位はＩＳＶＤである。

例えば、ＷＯ０４／０４１８６５（参照によってその全体を組み入れる）は、血清アルブミンに結合する（および特にヒト血清アルブミンに対する）Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）であって、前記タンパク質の半減期を増加させるために他のタンパク質（例えば、望ましい標的に結合する１つまたはそれ以上の他のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））に連結することができるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）を記載している。

国際出願ＷＯ０６／１２２７８７（参照によってその全体を本明細書に組み入れる）は、（ヒト）血清アルブミンに対する多数のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）を記載している。これらのＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）としては、Ａｌｂ－１（ＷＯ０６／１２２７８７では配列番号５２、参照によってその全体を組み入れる）およびそれらのヒト化バリアント、例えばＡｌｂ－８（ＷＯ０６／１２２７８７では配列番号６２、参照によってその全体を組み入れる）と称されるＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）が挙げられる。これらもまた、治療用タンパク質およびポリペプチドならびに他の治療的な実体または部分の半減期を延長するのに使用することができる。

さらに、ＷＯ２０１２／１７５４００（参照によってその全体を組み入れる）は、Ａｌｂ－２３と称されるＡｌｂ－１のさらに改善されたバージョンを記載している。

一実施形態において、ポリペプチドは、Ａｌｂ－１、Ａｌｂ－３、Ａｌｂ－４、Ａｌｂ－５、Ａｌｂ－６、Ａｌｂ－７、Ａｌｂ－８、Ａｌｂ－９、Ａｌｂ－１０およびＡｌｂ－２３から選択される血清アルブミン結合部分を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ＷＯ２０１２／１７５４００の７～９頁に示されているＡｌｂ－８もしくはＡｌｂ－２３、またはそのバリアント、およびＷＯ２０１２／１７５７４１、ＷＯ２０１５／１７３３２５、ＷＯ２０１７／０８０８５０、ＷＯ２０１７／０８５１７２、ＷＯ２０１８／１０４４４４、ＷＯ２０１８／１３４２３５、ＷＯ２０１８／１３４２３４（これらの各々は参照によってその全体を本明細書に組み入れる）に記載されるアルブミンバインダーを含む。血清アルブミンバインダーの一部の非限定的な例は、表Ａ－４にも示される。一部の実施形態において、本開示のポリペプチドは、項目Ｄに記載のさらなる構成要素を含む：
Ｄ．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３；
を含むＩＳＶＤ。

一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号８のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号１２のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１６のアミノ酸配列を有する。

ヒト血清アルブミンに結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２に構築物ＡＬＢ２３００２に関して示されている１つもしくはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ｄで定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物ＡＬＢ２３００２の全長アミノ酸配列を有する（配列番号４、表Ａ－１およびＡ－２を参照）。

項目Ｄはまた、Ｋａｂａｔ定義を使用して以下のように記載することもできる：
Ｄ’．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号３３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３；
を含むＩＳＶＤ。

一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号３３のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号３７のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１６のアミノ酸配列を有する。

ヒト血清アルブミンに結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２．１に構築物ＡＬＢ２３００２に関して示されている１つもしくそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ｄ’で定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物ＡＬＢ２３００２の全長アミノ酸配列を有する（配列番号４、表Ａ－１およびＡ－２．１を参照）。

また、一実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を有していてもよく、場合により、ＣＤＲは前述の項目Ｄで定義された通りである。一部の実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を有する。

ヒト血清アルブミンに結合するこのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ｄ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１つのアミノ酸の差異を有する場合、ＩＳＶＤは、ヒト血清アルブミンに対して構築物ＡＬＢ２３００２の少なくとも半分の結合親和性、少なくとも同じ結合親和性、またはさらにより高い結合親和性を有し、ここで結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

ヒト血清アルブミンに結合するこのようなＩＳＶＤがＣ末端の位置を有する場合、該ＩＳＶＤはＣ末端アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）伸長を示し、配列番号５２、５３、５５、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および６３から選択される（下記の表Ａ－４を参照）。一実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、Ｃ末端の位置とは別の位置を有し（すなわち、本開示のポリペプチドのＣ末端のＩＳＶＤではない）、配列番号４、５０、５１、５４、および５６から選択される（下記の表Ａ－４を参照）。

５．４ 核酸分子
本開示のポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。

「核酸分子」（「核酸」と同義的に使用される）は、ヌクレオチド配列を形成するためにリン酸主鎖を介して互いに連結されたヌクレオチド単量体の鎖である。核酸は、例えばポリペプチドの発現および／または生産のために、宿主細胞または宿主生物を形質転換／トランスフェクトするのに使用することができる。生産目的のための好適な宿主または宿主細胞は当業者には明らかであり、例えば、あらゆる好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞株、またはあらゆる好適な真菌、原核もしくは真核生物であり得る。本開示のポリペプチドをコードする核酸を含む宿主または宿主細胞も、本開示に包含される。

核酸は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッドであってもよいし、ＰＮＡのような（例えば化学的に）修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。核酸は、一本鎖であってもよいし、または二本鎖ＤＮＡであってもよい。例えば、本開示のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡであってもよい。

本開示の核酸は、それ自体公知の方式で調製するかまたは得てもよいし、および／または好適な天然源から単離してもよい。天然に存在する（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、配列変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子が提供されるように、部位特異的変異誘発に供してもよい。また当業者には明らかであろうが、核酸を調製するために、いくつかのヌクレオチド配列、例えば標的化部分をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、例えば１つまたはそれ以上のリンカーをコードする核酸も、好適な方式で一緒に連結されていてもよい。

核酸を生成するための技術は当業者には明らかであり、その例としては、これらに限定されないが、自動ＤＮＡ合成；部位特異的変異誘発；２つまたはそれ以上の天然に存在する配列および／または合成配列（または２つまたはそれ以上のそれらの一部）を組み合わせること、短縮化された発現産物の発現をもたらす突然変異の導入；１つまたはそれ以上の制限部位の導入（例えば、好適な制限酵素を使用して容易に消化および／またはライゲートすることができるカセットおよび／または領域を作り出すため）、ならびに／または１つまたはそれ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用するＰＣＲ反応による突然変異の導入を挙げることができる。

５．５ ベクター
本開示のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターも提供される。本明細書で使用されるベクターは、遺伝物質を細胞に運ぶのに好適な媒体である。ベクターとしては、裸の核酸、例えばプラスミドまたはｍＲＮＡ、またはより大きい構造に埋め込まれた核酸、例えばリポソームもしくはウイルスベクターが挙げられる。

ベクターは、一般的に、場合により、１つまたはそれ以上の調節エレメント、例えば１つまたはそれ以上の好適なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどに連結された少なくとも１つの核酸を含む。ベクターは、発現ベクターであり得、すなわち、好適な条件下で、例えばベクターが（例えばヒト）細胞に導入されたときに、コードされたポリペプチドまたは構築物を発現させるのに好適なベクターであり得る。ＤＮＡベースのベクターの場合、これは通常、転写のためのエレメントの存在（例えばプロモーターおよびポリＡシグナル）および翻訳のためのエレメントの存在（例えばコザック配列）を含む。

一部の実施形態において、ベクター中において、前記少なくとも１つの核酸および前記調節エレメントは、互いに「作動可能に連結」しており、これは、一般的に、それらが互いに機能的な関係にあることを意味する。例えば、プロモーターは、前記プロモーターがコード配列の転写および／または発現を開始させるかまたはそれ以外の方法でそれらを制御／調節することができる場合、コード配列に「作動可能に連結している」とみなされる（ここで前記コード配列は、前記プロモーターの「制御下」にあると理解されるべきである）。一般的に、２つのヌクレオチド配列が作動可能に連結している場合、それらは同じ方向となり、また通常は同じリーディングフレーム内にある。それらはまた通常は本質的に連続しているが、これもまたそうである必要はない場合もある。

一部の実施形態において、ベクターのいずれの調節エレメントも、それらが意図した宿主細胞または宿主生物においてそれらの意図した生物学的機能を提供できるようなものである。

例えば、プロモーター、エンハンサーまたはターミネーターは、意図した宿主細胞または宿主生物において「作動可能である」はずであり、これは、例えば前記プロモーターが、ヌクレオチド配列、例えばそれに作動可能に連結したコード配列の転写および／または発現を開始させること、またはそれ以外の方法でそれらを制御／調節することが可能であるはずであることを意味する。

５．６ 組成物
本開示はまた、少なくとも１つの本技開示のポリペプチド、本開示のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子、またはこのような核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを含む組成物も提供する。組成物は、医薬組成物であり得る。組成物は、少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含んでいてもよく、場合により、１種またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む。

５．７ 宿主生物
本開示はまた、本開示のポリペプチド、本開示のポリペプチドをコードする核酸、および／または本開示のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞または宿主生物にも関する。

好適な宿主細胞または宿主生物は当業者に明らかであり、例えば、あらゆる好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞株、またはあらゆる好適な真菌、原核もしくは真核生物である。具体的には例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。一部の実施形態において、宿主は、ピチア・パストリスである。

５．８ ポリペプチドの方法および使用
本開示はまた、本開示のポリペプチドを生産するための方法も提供する。本方法は、宿主細胞または宿主生物を、ポリペプチドをコードする核酸で形質転換／トランスフェクトすること、宿主中でポリペプチドを発現させること、場合により、それに続いて、１つまたはそれ以上の単離および／または精製工程を含んでいてもよい。
具体的には、本方法は、：
ａ）好適な発現系中（好適な宿主細胞もしくは宿主生物中で、または別の発現系中）で、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させること；場合により、それに続いて：
ｂ）ポリペプチドを単離および／または精製すること
を含んでいてもよい。

生産目的のための好適な宿主細胞または宿主生物は当業者には明らかであり、例えば、あらゆる好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞株、またはあらゆる好適な真菌、原核もしくは真核生物であり得る。具体的な例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌またはピチア・パストリスが挙げられる。一部の実施形態において、宿主は、ピチア・パストリスである。

記載される本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、または本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物－例えば該ポリペプチドまたはこれを含む組成物－は、医薬として有用である。

したがって、本開示は、医薬としての使用のための、記載される本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、または本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物を提供する。

また、自己免疫疾患および／または炎症性疾患および／または線維性疾患の（予防的または治療的な）処置における使用のための、記載される本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、または本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物も提供される。

さらに、自己免疫疾患および／または炎症性疾患および／または線維性疾患を処置する（予防的および／または治療的な）方法であって、医薬的に活性な量の、記載される本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、または本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法が提供される。

さらに、医薬組成物、例えば、自己免疫疾患または炎症性疾患または線維性疾患を処置するための医薬組成物の調製における、記載される本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、または本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物の使用が提供される。

「対象」は、本開示に関して言及される場合、あらゆる動物であってもよく、例えば哺乳動物であってもよい。哺乳動物のなかでも、ヒトと非ヒト哺乳動物との区別がなされる場合がある。非ヒト動物は、例えばコンパニオンアニマル（例えばイヌ、ネコ）、家畜（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、またはブタ動物）、または一般的に調査目的および／または抗体生産のために使用される動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、例えばカニクイザル、またはラクダ科動物、例えばラマまたはアルパカ）であり得る。

予防および／または治療目的に関して、対象は、あらゆる動物であってもよく、より具体的には、あらゆる哺乳動物、例えばヒト対象であってもよい。

物質（例えばポリペプチド、核酸分子およびベクターなど）または組成物は、あらゆる好適な投与経路によって、例えば経腸（例えば経口または直腸）または非経口（例えば皮膚上、舌下、頬側、経鼻、関節内、皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、真皮下、または経粘膜）投与によって対象に投与することができる。非経口投与、例えば筋肉内、皮下または皮内投与が使用されてもよい。一部の実施形態において、皮下投与が使用される。

有効量の記載されるポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、またはポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物は、意図した処置結果を提供するために、対象に投与することができる。

１つまたはそれ以上の用量が投与されてもよい。１つより多くの用量が投与される場合、用量は、ポリペプチド、組成物、核酸分子またはベクターの作用を最大化するために、好適な間隔で投与されてもよい。

６．１ 実施例１：多重特異性ＩＳＶＤ構築物の生成
ＩＳＶＤ含有ポリペプチドＦ０２７１００１８７（配列番号１）の同定は、データ駆動型二重特異性操作およびフォーマット化戦略から得られ、その中には抗ＯＸ４０Ｌビルディングブロック（それぞれ配列番号１８１、１８０、および１７９としてＷＯ２０１１０７３１８０に記載される、ＯＸ４０Ｌ０１Ｅ０７、ＯＸ４０Ｌ０１Ｂ１１およびＯＸ４０Ｌ１５Ｂ０７）、抗ＩＬ－１３ビルディングブロック（Ｆ０１０７００３Ｄ１２、Ｆ０１０７００９Ｆ０７、Ｆ０１０７００９Ｇ０９、Ｆ０１０７００４Ｂ０２、Ｆ０１０７００４Ｂ０６およびＦ０１０７００７Ｃ１０）および抗ＨＳＡ Ｖ_ＨＨビルディングブロックＡＬＢ２３００２（配列番号１０としてＷＯ２０１７０８５１７２に記載）が含まれた。ビルディングブロックの異なる位置／方向／原子価および異なるリンカー長（９ＧＳ ｖｓ ２０ＧＳ ｖｓ ３５ＧＳ）を適用し、異なるパラメーター（効力、交差反応性、発現など）にとって重要であることを証明した。この実施例における効力は、それぞれ実施例６および７でアッセイしたようなインビトロでのＩＬ－１３誘導エオタキシン放出アッセイの阻害、およびインビトロでのＯＸ４０Ｌによって誘導されたＴ細胞同時刺激の阻害を指す。

１２３個の構築物を含むパネルを、小さいスケールの生産のためにピチア・パストリスで形質転換した。ＩＳＶＤ構築物発現の誘導は、メタノールの段階的な添加によって生じた。分泌されたＩＳＶＤ構築物を含む清澄化培地を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを介した精製とそれに続く脱塩の出発材料として使用した。精製したサンプルを、機能的特徴付けおよび発現評価に使用した。

一部の構築物は、原子価、リンカー長、使用するＩＳＶＤビルディングブロック、およびＩＳＶＤビルディングブロックの相対的な位置に応じて損なわれた効力および発現レベルを示した。一般に、５価ＩＳＶＤ構築物は、２価抗ＯＸ４０ＬビルディングブロックＯＸ４０Ｌ０１Ｅ０７（以下「１Ｅ０７」）がＣ末端に位置する一部のＩＳＶＤを除いて、低い発現レベルを示した。しかしながら、Ｃ末端に位置する１Ｅ０７は、ＯＸ４０Ｌに対して不十分な効力を示した。１価ＯＸ４０Ｌアームを使用して原子価を低減すると、発現レベルは改善したが、ＯＸ４０Ｌに対する効力はやはり不十分であった。故に、特定の組成物（原子価、ビルディングブロックの方向およびリンカー長の利用）は、効力および十分な発現レベルにとって重要であることが見出された。

強力な１価ＯＸ４０Ｌ標的アームを生成して４価多重特異性ＩＳＶＤ構築物に組み込むために、ＯＸ４０ＬビルディングブロックＯＸ４０Ｌ０１５Ｂ０７（以下「１５Ｂ０７」）およびＯＸ４０Ｌ００１Ｂ１１（以下「１Ｂ１１」）を親和性成熟させた。

（Ｖ_ＨＨ）ビルディングブロックごとに、全てのＣＤＲ位置の単一部位飽和ライブラリーのプールを各ＣＤＲについて構築した。それぞれの単一部位飽和ライブラリーは、２２ｃ－ｔｒｉｃｋアプローチ（Ｋｉｌｌｅら． ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ． Ｂｉｏｌ．、２０１３、２（２）、８３～９２頁）に従って設計されるプライマーを使用して構築した。固定したヒトおよびカニクイザルＯＸ４０Ｌで表面プラズモン共鳴分光法（ＳＰＲ）ベースのオフレートスクリーニングを実行して、結合の改善をもたらす個々の突然変異を同定した。

第２の工程では、第１の工程で同定された有益な突然変異を含むコンビナトリアルライブラリーを構築した。ヒトおよびカニクイザルＯＸ４０Ｌでオフレートスクリーニングを再び実行して、結合がさらに改善されたＶ_ＨＨバリアントを同定した。これらのバリアントを、次いで、ＳＰＲによる生物物理的特徴付け親和性決定、およびＰＢＭＣ活性アッセイでの機能的特徴付け（実施例７に記載の通り）のために精製して、最終的な親和性成熟バリアントを選択した。ＩＳＶＤ ＯＸ４０Ｌ０１５Ｂ０７およびＯＸ４０Ｌ００１Ｂ１１の親和性成熟バリアントの特徴を表１に列挙する。

１価ＯＸ４０Ｌビルディングブロック１５Ｂ０７および１Ｂ１１の親和性成熟バージョンを利用して、強力で十分に発現する４価多重特異性ＩＳＶＤ構築物を得ることができた。

４価多重特異性ＩＳＶＤ構築物中の親和性成熟１価１５Ｂ０７ビルディングブロック（１５Ｂ０７ＡＭ）の存在は、非親和性成熟対応物（１５Ｂ０７）と比較して、ＯＸ４０Ｌ駆動ＰＢＭＣ活性アッセイ（実施例７に記載の通り）で２０倍優れた効力をもたらした（表３）。

さらに、４価多重特異性ＩＳＶＤ構築物中の１５Ｂ０７ＡＭビルディングブロックのＮ末端の位置が重要であった。表４の構築物Ｆ－０２７１００１７２およびＦ－０２７１００１７９の比較は、１５Ｂ０７ＡＭビルディングブロックがＮ末端の位置にある場合、Ｃ末端の位置と対比して１０倍優れた効力を示す。

Ｆ－０２７１００１８７（配列番号１）４価多重特異性ＩＳＶＤ中のＮ末端１５Ｂ０７ＡＭビルディングブロックの存在は、単に低い発現収量に陥った５価構築物と比較して、ＣＭＣ特性（すなわち、発現および溶解性）に有益であった。表２に例示される通り、３つの多重特異性ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８６（配列番号９９）（５価）、Ｆ０２７１００１８７（配列番号１）（４価）およびＦ０２７１００１８８（配列番号１００）（５価）は、大きく異なる初期ＣＭＣ（化学、製造および品質管理）プロファイルを示した。５Ｌ発酵時、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７（配列番号１）は、５価ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８６（配列番号９９）およびＦ０２７１００１８８（配列番号１００）より２倍超高い４ｇ／ｌの力価に達し、優れた溶解性も示した。

ＩＬ－１３に対する最適な効力のために、２つのＩＬ１３ビルディングブロック間の十分な空間を可能にするため、およびＦ０２７１００１８７、４価多重特異性ＩＳＶＤ構築物中の長い３５ＧＳリンカーの存在を避けるために、両方のＩＬ１３ビルディングブロックを９ＧＳ－ＡＬＢ－９ＧＳ実体を介して連結した。

最後に、ＩＬ－１３およびＯＸ４０Ｌに対する全体的に良好な効力ならびに優れた発現レベルおよびＣＭＣ特徴に基づき、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７を選択した。

６．２ 実施例２：ＯＸ４０Ｌ、ＩＬ－１３および血清アルブミンに対する多重特異性ＩＳＶＤ構築物結合親和性
ヒト、カニクイザル（ｃｙｎｏ）およびアカゲザルＩＬ－１３、ヒトおよびカニクイザルＯＸ４０Ｌ、ならびにヒト、カニクイザルおよびマウス血清アルブミンに対するＦ０２７１００１８７の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）として表される親和性を、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｇｙｒｏｓ）で溶液中親和性測定によって定量化した。

Ｋ_Ｄ制御測定で、ＯＸ４０Ｌ（１．３μＭ～０．００８ｐＭの範囲）、ＩＬ－１３（０．１μＭ～０．２５ｆＭの範囲）、または血清アルブミン（１００μＭ～３．２ｐＭの範囲）の連続希釈物、および固定量のＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７（ＯＸ４０Ｌの場合、１０ｐＭ、ＩＬ－１３の場合、５ｐＭ、ＨＳＡおよびカニクイザルＳＡの場合、１００ｐＭ、ならびにマウスＳＡの場合、３０ｎＭ）を混合して相互作用させ、２４時間もしくは４８時間のいずれか（ＯＸ４０ＬおよびＩＬ－１３の場合）または２時間（血清アルブミンの場合）インキュベートして平衡に到達させた。

受容体制御測定で、ＯＸ４０Ｌ（１．３μＭ～０．０３１ｐＭの範囲）、ＩＬ－１３（０．１μＭ～０．２５ｆＭの範囲）、または血清アルブミン（１００μＭ～３．２ｐＭの範囲）の連続希釈物、および固定量のＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７（ＯＸ４０Ｌの場合、５ｎＭ、ＩＬ－１３の場合、２５０ｐＭ、ならびにＨＳＡおよびカニクイザルＳＡの場合、３０ｎＭ）を混合して相互作用させ、２４時間もしくは４８時間のいずれか（ＯＸ４０ＬおよびＩＬ－１３の場合）または２時間（血清アルブミンの場合）インキュベートして平衡に到達させた。

ビオチン化ヒトＯＸ４０Ｌ／ＩＬ－１３／血清アルブミンを、ビーズのカラムを含有し、平衡化した溶液から遊離のＦ０２７１００１８７を捕獲するための分子プローブとして使用されたＧｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ １０００ＣＤの微細構造に捕獲した。ＯＸ４０Ｌ／ＩＬ１３／血清アルブミンおよびＦ０２７１００１８７の混合物（遊離のＯＸ４０Ｌ／ＩＬ－１３／血清アルブミン、遊離のＦ０２７１００１８７およびＯＸ４０Ｌ／ＩＬ１３／血清アルブミン－Ｆ０２７１００１８７複合体を含有する）を、ビーズを通って流動させ、遊離のＩＳＶＤ構築物濃度に比例する小さいパーセンテージの遊離のＦ０２７１００１８７を捕獲した。次いで蛍光標識した抗ＩＳＶＤ抗体、ＡＢＨ００８６－Ａｌｅｘａ６４７を注入して全ての捕獲されたＦ０２７１００１８７を標識し、過量の蛍光プローブを濯ぎ落とした後、蛍光の変化を決定した。一連の希釈物のフィッティングを、Ｇｙｒｏｌａｂ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して行い、Ｋ_Ｄおよび受容体によれば制御される曲線を分析して、Ｋ_Ｄ値を決定した。

結果（表５）は、多重特異性ＩＳＶＤ構築物が、高親和性でヒト／カニクイザルＯＸ４０Ｌおよびヒト／カニクイザル／アカゲザルＩＬ－１３と結合することを実証する。

６．３ 実施例３：多重特異性ＩＳＶＤ構築物の膜結合ＯＸ４０Ｌへの結合
膜結合ヒトおよびカニクイザルＯＸ４０ＬへのＦ０２７１００１８７の結合を、ヒトまたはカニクイザルＯＸ４０Ｌを発現するＣＨＯ－ＫＩ細胞でフローサイトメトリーを使用して実証した。簡単に言えば、細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドおよび０．１％グルタルアルデヒドで固定し、１×１０^４細胞／ウェルの密度で植え付け、ＩＳＶＤ Ｆ０２７１００１８７またはコンパレーター３と命名された参照化合物抗ｈＯＸ４０Ｌ ｍＡｂの、１００ｎＭから開始して０．５ｐＭまでの希釈系列と共に室温で４８時間インキュベートした。コンパレーター３は、ヒトＯＸ４０Ｌに対する標準的な従来のモノクローナル抗体であり、本明細書に記載される実施例１～１２を通して参照として使用した。細胞を３回洗浄し、その後、抗Ｖ_ＨＨ ｍＡｂ（ＡＢＨ００１１９）と共に４℃で３０分間インキュベートし、再び洗浄し、ヤギ抗マウスＰＥまたはＦＩＴＣ標識抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。サンプルを洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（５ｎＭ ＴＯＰＲＯ３が補充された１０％ＦＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＤ－ＰＢＳ）に再懸濁した。次いで細胞懸濁液をｉＱｕｅｓｃｒｅｅｎｅｒで分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してＥＣ５０値を計算した。Ｆ０２７１００１８７および抗ｈＯＸ４０Ｌ参照ｍＡｂコンパレーター３の結合親和性は、表６に示される。

６．４ 実施例４：多重特異性ＩＳＶＤ構築物はＯＸ４０ＬおよびＩＬ－１３に選択的に結合する
ＯＸ４０ＬおよびＩＬ－１３関連ヒトサイトカインへの結合の非存在を、ＳＰＲ（Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６）により評価した。ＩＬ－１３関連サイトカインとして、ＩＬ－４を評価した。ＯＸ４０Ｌ関連標的として、ヒトＴＲＡＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０ＬおよびＲＡＮＫＬを評価した。

この目的を達成するために、活性化についてはＥＤＣ／ＮＨＳを８０秒間注入し、非活性化については１ＭエタノールアミンＨＣｌを１５０秒間注入するアミンカップリング（ＰｒｏｔｅＯｎアミンカップリングキット。カタログ番号１７６－２４１０）を使用して、サイトカインをＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣセンサーチップ上に２５μｇ／ｍＬで６００秒間固定した。活性化および非活性化中の流速を３０μｌ／分、リガンド注入中の流速を２５μｌ／分に設定した。１０ｍＭ酢酸固定緩衝液のｐＨは、ＲＡＮＫＬを除く全てのサイトカインに関して６．０であった。ＲＡＮＫＬについてｐＨは５．０であった。

次に、１μＭのＦ０２７１００１８７を２分間注入し、４５μＬ／分の流速で６００秒間解離させた。ランニング緩衝液としてＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。陽性対照として、１００ｎＭ α－ｈＩＬ－４、α－ｈＴＲＡＩＬ、α－ｈＣＤ３０Ｌ、α－ｈＣＤ４０Ｌ Ａｂおよびα－ｈＲＡＮＫＬ Ｖ_ＨＨ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、Ｎｂ）を注入した。Ｆ０２７１００１８７と陽性対照間の固定した標的との相互作用を、結合時のチップ上の質量変化の結果として生じる不応性指標の増加を検出して測定した。

全ての陽性対照は、それぞれの標的に結合した。ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７のヒトＩＬ－４、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０ＬおよびＲＡＮＫＬへの結合は検出されなかった。

６．５ 実施例５：多重特異性ＩＳＶＤのＩＬ－１３、ＯＸ４０ＬおよびＨＳＡへの同時の結合
フローサイトメトリーを使用して、ＩＳＶＤ構築物Ｆ２７１００１８７が、組換え可溶性ｈＩＬ－１３および細胞膜結合ｈＯＸ４０Ｌに同時に結合できるかどうかを決定した。この目的を達成するために、ヒトＯＸ４０Ｌを発現するＣＨＯ－ＫＩ細胞を、５×１０^４細胞／ウェルの密度で植え付け、１００ｎＭ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７と共に４℃で９０分間インキュベートした。その後、混合物を、５００ｎＭから開始して７．６ｐＭまで下がるビオチン化ＩＬ－１３の希釈系列と共にインキュベートし、３０μＭ ＨＳＡの存在下、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、その後、ＰＥ標識抗ストレプトアビジンと共に４℃で３０分間インキュベートし、再び洗浄した。サンプルを洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（５ｎＭ ＴＯＰＲＯ３が補充された１０％ＦＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＤ－ＰＢＳ）に再懸濁した。次いで細胞懸濁液をｉＱｕｅｓｃｒｅｅｎｅｒで分析した。用量反応曲線（図１）は、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７が、ＨＡＳの存在下で膜結合ｈＯＸ４０Ｌおよび可溶性ｈＩＬ－１３を同時に結合できるのに対し、陰性対照Ｖ_ＨＨ、ＩＲＲ００９６は結合できないことを実証した。

６．６ 実施例６：ＩＬ－１３によって誘導されたエオタキシン放出の多重特異性ＩＳＶＤによるインビトロ阻害
目的の異なる種（ヒト、アカゲザルおよびカニクイザル）からの可溶性ＩＬ－１３の機能的な活性およびＦ０２７１００１８７によるそれらの阻害を、Ａ５４９ヒト肺癌腫細胞によってエオタキシン放出を調査する細胞ベースのアッセイを使用して研究した。

この目的を達成するために、Ａ５４９懸濁細胞を、１０％ＦＣＳが補充されたＨａｍ’ｓ Ｆ１２Ｋで培養し、４００，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに植え付けた。２４時間のインキュベーション後、Ｆ０２７１００１８７または参照化合物（抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂコンパレーター１およびコンパレーター２）の希釈系列を添加した。コンパレーター１および２はいずれも、ヒトＩＬ－１３に対する標準的な従来のモノクローナル抗体であり、本明細書に記載される実施例１～１２を通して参照として使用した。２０分間のインキュベーション後、ＩＬ－１３（ヒトＩＬ１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ カタログ番号１０３６９－ＨＮＡＣ）、カニクイザルＩＬ１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ カタログ番号１１０５７－ＣＮＡＨ）またはアカゲザルＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２６７４－ＲＭ－０２５））を、１６０ｐＭの最終濃度まで添加した。３０μＭ ＨＳＡの存在下で２４時間さらにインキュベーション後、ヘパリンを５０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加してエオタキシン発現を増強した。追加の４時間のインキュベーション後、細胞上清中に分泌されたエオタキシン３を、ヒトＣＣＬ２６／エオタキシン３ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ３４６）を使用して定量化した。

Ｆ０２７１００１８７は、ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ－１３によって誘導されたエオタキシン３放出を、２５９ｐＭ（ヒトＩＬ－１３）、１９４０ｐＭ（カニクイザルＩＬ－１３）および８５８ｐＭ（アカゲザルＩＬ－１３）のＩＣ５０で濃度依存的に阻害した（表７、図２）。

６．７ 実施例７：ＯＸ４０Ｌによって誘導されたＴ細胞同時刺激の多重特異性ＩＳＶＤ構築物によるインビトロ阻害
ヒトおよびカニクイザルＯＸ４０Ｌの機能的な活性、およびＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７によるそれらの阻害を、ＯＸ４０Ｌによって誘導されたＴ細胞同時刺激を調査する細胞ベースのアッセイ（ＰＢＭＣ活性アッセイ）を使用して研究した。アッセイは、ＰＨＡ－Ｌの準最適濃度（ＯＸ４０発現を誘導するための）の存在下、軟膜由来ＰＢＭＣ（１×１０^５細胞／ウェルの密度の）を、ＯＸ４０Ｌを過剰発現するＣＨＯ－ＫＩ細胞（１×１０^４細胞／ウェルの密度の）と透明な９６ウェルプレート中で共培養して実行した。ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７またはコンパレーター３と命名された参照化合物抗ｈＯＸ４０Ｌ ｍＡｂの希釈系列を共培養物に添加し、加湿インキュベーターで３０μＭ ＨＳＡの存在下、３７℃で２２時間インキュベートした。読み出しは、ＥＬＩＳＡを使用してこれらの細胞の上清中のＩＬ－２レベルを評価して実行した。

ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７は、ヒトおよびカニクイザルＯＸ４０Ｌによって誘導されたＴ細胞活性化を、参照化合物抗ｈＯＸ４０Ｌ ｍＡｂコンパレーター３に匹敵する１．９ｎＭ（ヒトＯＸ４０Ｌ）および１．４ｎＭ（カニクイザルＯＸ４０Ｌ）のＩＣ５０で濃度依存的に阻害した（表８、図３）。

６．８ 実施例８：既存の抗体への多重特異性ＩＳＶＤ構築物結合
健康なボランティアからの９６種の血清サンプルに存在する既存の抗体の、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７への結合を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して決定した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）をランニング緩衝液として使用し、実験を２５℃で実行した。

ＩＳＶＤ構築物を、チップ上に固定されたＨＳＡへの、ＡＬＢ２３００２ビルディングブロックの結合を介してチップ上に捕獲した。ＨＳＡを固定するために、ＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣセンサーチップのリガンドレーンをＥＤＣ／ＮＨＳ（流速３０μΙ／分）で活性化し、ＨＳＡを、ｐＨ４．５のＰｒｏｔｅＯｎ酢酸緩衝液中の１００μｌ／ｍｌで注入して、およそ２６００ＲＵの固定レベルにした。固定した後、表面をエタノールアミンＨＣｌ（流速３０μΙ／分）で不活性化した。

その後、ＩＳＶＤ構築物を、ＨＳＡ表面上に４５μｌ／分で２分にわたり注入して、ＩＳＶＤ捕獲レベルをおよそ８００ＲＵにした。既存の抗体を含有するサンプルを１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）で１：１０希釈し、その後、４５μｌ／分で２分にわたり注入し、それに続き、後続の４００秒の解離工程を行った。各サイクルの後（すなわち新しいＩＳＶＤ捕獲および血液サンプル注入工程の前に）、ＨＳＡ表面を、ＨＣｌ（１００ｍＭ）の４５μｌ／分で２分の注入で再生した。１）ＩＳＶＤ－ＨＳＡ解離および２）参照リガンドレーンへの非特異的な結合を引くことによる二重の参照の後、既存の抗体結合を示すセンサーグラムを得た。１２５秒（会合終了から５秒後）に報告ポイントを設定することによって、既存の抗体の結合レベルを決定した。参照ＩＳＶＤ構築物の１２５秒での結合レベルに対する既存の抗体結合におけるパーセンテージの低減を計算した。

４価のＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７は、各ビルディングブロックにおける突然変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９ＬならびにＣ末端アラニンの導入によって既存の抗体結合の低減のために最適化されたことから、既存の抗体への結合は、対照の最適化されていない５価のＩＳＶＤＦ０２７３０１１８６と比較してより実質的に少ないことが示される（図４）。

６．９ 実施例９：多重特異性ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７によるＯＸ４０ＬおよびＩＬ－１３の阻害は、３種共培養システムにおいてＩＬ－５およびＣＣＬ２６レベルを低減する：
Ｔ細胞活性化に対するＯＸ４０Ｌ遮断の生理学的効果を試験するために、Ｄｅｒ Ｐに反応性であった健康な血液ドナーからのＰＢＭＣを、ＭＲＣ５（線維芽細胞）およびＡ５４９（上皮）細胞と共培養した。これらの細胞の混合は、ＩＬ－５およびＩＬ－１３生産の誘導によって２型免疫応答を駆動するさらなる活性化をもたらした。ＩＬ－１３は、局所上皮細胞によるＣＣＬ２６生産を開始させ、２型免疫応答によって媒介される炎症性疾患およびそれ以上の派生問題をもたらした。加えて、これらの細胞型の再現が目的の組織（皮膚および肺）で見出された。Ｔ細胞応答を、細胞を混合した７日後の上清でサイトカイン測定することによりモニターした。

方法：
Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ＣＴＳ（アッセイ培地）と組み合わせた５００μｌ ＡＩＭ Ｖ ＣＴＳ培地中の７．５×１０^４ ＭＲＣ５および７．５×１０^４ Ａ５４９細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに添加し、一晩インキュベートした。次いで、１００μｌのＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７１００１８７、抗ＯＸ４０Ｌ参照ｍＡｂコンパレーター３、または抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂコンパレーター１を、アッセイ培地に１５分間添加した。その後、１．２×１０^６個の解凍し、休ませたアレルギー性ＰＢＭＣを２００μｌアッセイ培地に添加し、その後、使用済み培養物からの低内毒素Ｄｅｒ Ｐ ２００μｌを添加した。培養物を７日間インキュベートした後、培養上清中のＩＬ－５およびＣＣＬ２６をＬｕｍｉｎｅｘによって分析し、２重にアッセイした。４人のドナーの要約を示す。

結果：
Ｆ０２７１００１８７および基準抗体、ならびに抗ｈＯＸ４０Ｌ ｍＡｂコンパレーター３および参照抗ｈＩＬ－１３ ｍＡｂコンパレーター１の阻害応答の集合的な結果は、表９および表１０、ならびに図５および図６に示される。

結論として、これらの結果は、ＩＳＶＤ Ｆ０２７１００１８７が、組織構造的な細胞と共培養したヒトＰＢＭＣを含む複合体アッセイシステムにおいて２つのサイトカイン／ケモカイン（ＩＬ－５およびＣＣＬ２６）をブロックするその能力によって、抗ｈＯＸ４０Ｌ参照ｍＡｂ、すなわちコンパレーター３と同等であり、抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ、すなわちコンパレーター１とほぼ同等であることを実証するものであり、２型炎症性疾患、例えば喘息およびアトピー性皮膚炎、ならびに広範な免疫疾患の適応症の処置のためのその治療上の可能性を強調している。

６．１０ 実施例１０：インビボにおけるＦ０２７１００１８７によって媒介される標的占有および薬力学を評価するためのＮＳＧヒトヒト化マウスモデル
Ｆ０２７１００１８７は、ヒトＯＸ４０ＬおよびＩＬ－１３の両方を標的化し、マウスオーソログと交差反応しない。したがって、Ｆ０２７１００１８７の生物学的活性を評価するために、異種移植されたヒト化モデル系を使用した。雌ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡから得た。これらのマウスは、ヒト造血サイトカイン：幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびインターロイキン－３（ＩＬ－３）を発現し、全てヒトサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー配列によって促進される。三重トランスジェニックマウスは、上記のサイトカインを構成的に生産し、細胞増殖および生存シグナルを提供し、ＣＤ３３＋骨髄系統、およびいくつかのタイプのリンパ系細胞の安定な生着を支持する。
簡単に言えば、生着のために行われたプロトコールは以下の通りである：

研究の０日目に、マウスに、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）２００μｌ中、静脈内（ＩＶ）経路によって５×１０^６個のＤｅｒ Ｐ感受性末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を植え付けた。研究の１、２、３、６、７、８、９、および１０日目に、マウスに、イエダニ（ＨＤＭ）抽出物（Ｇｒｅｅｒ ｌａｂ カタログ番号ＸＰＢ７０－Ｘ２９）４０μｌ中２５μｇを鼻腔内にチャレンジした。１、３、６、８、１０、および１３日目にＨＤＭをチャレンジしたマウスは、ビヒクルまたはＦ２７１００１８７（１１．１、３．７２、１．１１、または０．３７ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの皮下投与を受けた。２０日目に、イソフルラン麻酔によってマウスを麻酔した。イソフルラン麻酔中に、後眼窩採血によって血液を収集した。血液収集後、およびまだイソフルラン麻酔中に、マウスを頚椎脱臼によって致死させた。肺の一部を回収し、ヒト細胞表現型決定（フローサイトメトリー）のために培地に入れた。２０日目の血漿サンプルからのヒトサイトカインおよびケモカインの血漿濃度を、Ｌｕｍｅｎｉｘ評価（カタログ番号ＨＳＴＣＭＡＧ２８ＳＰＭＸ１３、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ）によって決定した。２０日目の血漿サンプルからのヒトＩｇＥの血漿濃度を、ＥＬＩＳＡ（カタログ番号ＢＭＳ２０９７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって決定した。

図７および図８で示されるこれらの実験の結果は、Ｆ０２７１００１８７が、ヒトＴ細胞およびＢ細胞増殖ＮＳＧマウスを有意に阻害できたことを実証する。図９および図１０は、Ｆ０２７１００１８７が、主要なタイプのサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１０）およびＩｇＥ生産を有意に阻害できたことを実証する。まとめると、これらの結果は、Ｆ０２７１００１８７のインビボにおける効能を実証する。

ＮＳＧ－ＰＢＭＣマウスモデルでは、２型アレルギー疾患のいくつかの主要なマーカーが増加する。図７～図１０で示されるこれらの実験の集合的な結果は、Ｆ２７１００１８７が、２型アレルギー疾患の主要なマーカーを有意に阻害できたことを実証するものであり、ヒト２型マーカーに対するＦ２７１００１８７のインビボにおける薬力学的作用を実証する。

６．１１ 実施例１１：インビボにおけるＦ０２７１００１８７によって媒介される標的占有および薬力学を評価するためのＮＳＧ－ＳＧＭ３ヒトヒト化マウスモデル
Ｆ０２７１００１８７は、ヒトＯＸ４０ＬおよびＩＬ－１３の両方を標的化し、マウスオーソログと交差反応しない。したがって、Ｆ０２７１００１８７の生物学的活性を評価するために、異種移植されたヒト化モデル系を使用した。ヒトＣＤ３４＋細胞を生着させた雌ＮＳＧ－ＳＧＭ３（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ－ＩＬ２Ｒγ－／－、ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒγｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡから得た。これらのマウスは、ヒト造血サイトカイン：幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびインターロイキン－３（ＩＬ－３）を発現し、全てヒトサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー配列によって促進される。三重トランスジェニックマウスは、上記のサイトカインを構成的に生産し、細胞増殖および生存シグナルを提供し、ＣＤ３３＋骨髄系統、および数種のタイプのリンパ系細胞の安定な生着を維持する。動物は生着後８０～１００日であった。簡単に言えば、生着のために行われたプロトコールは以下の通りである：
フローサイトメトリーによって実行された生着チェックからのデータは、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓが提供した。生着チェックからの情報を使用して、マウスを群に割り付けた。０および２日目に、マウスは、ビヒクルまたはＩＳＶＤ構築物Ｆ２７１００１８７のいずれかの皮下投与を受けた。研究の１、２、および３日目に、マウスに、ヒトＩＬ－３３（カタログ番号２００－３３－５００ＵＧ、Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）２０μｌ中７．５μｍｇを鼻腔内にチャレンジした。４日目に、イソフルラン麻酔中に、後眼窩採血によって血液を収集した。血液収集後、およびまだイソフルラン麻酔中に、マウスを頚椎脱臼によって致死させた。肺の一部を回収し、ヒト細胞表現型決定（フローサイトメトリー）のために培地に入れた。ヒトサイトカインおよびケモカインの血漿濃度を、Ｌｕｍｅｎｉｘ評価（カタログ番号ＨＳＴＣＭＡＧ２８ＳＰＭＸ１３、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ）によって決定した。２０日目の血漿サンプルからのヒトＩＬ－１３の血漿濃度を、ＥＬＩＳＡ（カタログ番号８８－７４３９－８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって決定した。

図１１で示されるこれらの実験の集合的な結果は、Ｆ０２７１００１８７が、ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスの血漿中のヒトＩＬ－１３の検出可能なレベルを有意に阻害できたことを実証するものであり、ヒトＩＬ－１３に関する標的占有を実証する。さらに、Ｆ０２７１００１８７は、主要な２型サイトカインＩＬ－５、ＴＡＲＣ、およびマウスエオタキシンを有意に阻害できた。したがって、これらの結果は、アトピー性皮膚炎および／または喘息を処置するためのＦ０２７１００１８７の適合性を示している。

実施例１２ 若齢成体アカゲザルにおけるアレルギー性喘息のモデル
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＮＰＲＣ）からの３０匹の２～４歳齢雄アカゲザルを以下に基づき選択した：行動抑制検査、メタコリン反応性に関する肺機能検査（ＰＦＴ）、１５０パーセント有効濃度（ＥＣ１５０）（＜３ｍｇ／ｍｌメタコリン）および２００パーセント有効濃度（ＥＣ２００）（＜８ｍｇ／ｍｌメタコリン）値。理学的検査、全血球計算（ＣＢＣ）および血清化学パネルを、この研究に組み入れた全ての動物で完了した。

この研究のために選択した全ての動物がイエダニ（ＨＤＭ）感作に進んだ。２週間に１回、動物は、１ｍｇミョウバン（１回注射あたり１ｍｌ全容量、Ｔｈｅｒｍｏ ７７１６１）中、約６０ｕｇ ＨＤＭ抽出物（ヤケヒョウダニ（Ｄ． Ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、Ｇｒｅｅｒ Ｂ５８Ａ５２）の単一皮下注射を２８週間にわたって受けた。

エアロゾル化ＨＤＭ（８．５ｕｇ Ｄｅｒｐ １／ｍｌ、凍結乾燥ヤケヒョウダニ、Ｇｒｅｅｒから調製）を、研究の１２週時点に開始し、２週間に１回ベースでネブライザーによって投与した。研究動物をケタミンおよびデクスメデトミジンで落ち着かせ、次いでチャイルドシートに半立位で置いた。落ち着かせた動物に、その後、鼻および口の両方を覆うフェイスマスクを装着した。マウスブロックを置いて、最大エアロゾルの気管および肺への通過を確保した。アトロピンを投与して、典型的にはケタミン鎮静の結果である唾液の生産を最小化した。その理由は、過剰な唾液は気道の閉塞による手順の早期中止につながる可能性があるためである。マスクのはまり具合および頭部の位置を慎重に調整して、気道を塞ぐことなくエアロゾルの漏れを防いだ。フェイスマスクを通じてＨＤＭエアロゾルを約５～１５分間投与した。手順全体を通じて、心拍数および酸素飽和度を持続的にモニターした。手順後、同等の用量のアチパメゾールで鎮静を逆転させた。

血液サンプルを、０週時点、次いで１８週時点からは週１回収集した。２０および２９週時点で、血清サンプルを被験物質投与の薬物動態分析のために収集した。ＨＤＭ皮内注射および皮膚生検は、各研究動物の毛を剃った背中で行った。１箇所あたり１００ｕｌ生理食塩水またはＨＤＭ（１００ｕｌ生理食塩水中、１：１０００Ｗ／Ｖ）のどちらかを、１時点につき８箇所に皮内注射した。ＨＤＭ皮膚反応性および皮膚生検は、１９、２５、および２９週時点で行った。生検は、４ｍｍパンチを使用して肩甲骨間領域から採取し、獣医師の裁量で皮膚用接着剤または縫合により生検部位を閉じた。動物は、各生検後にケトプロフェン（２～５ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ、ＳＩＤ×生検後１～２日）の投与を受けた。

気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）：鎮静下、動物は仰臥位に置いた。喉頭鏡を使用して喉頭を目視し、喉頭をリドカインで麻酔した。気管支鏡を亜区域気管支に入れた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２ｍｇ／ｋｇを手で滴下し、吸引した。これを２回繰り返した。

コホート割り付け：ＰＦＴ基準（前のセクションで定義した）に基づきローリング方式（ｒｏｌｌｉｎｇ ｆａｓｈｉｏｎ）で、６匹の動物の群を３つのコホートのうちの１つに組み入れた。１８週目の間にＢＡＬ手順から得られた好酸球の頻度／数を使用して、動物を処置群または対照（ビヒクル）群に割り付けた。

被験物質投与：動物は、２０週時点からビヒクルまたは被験物質の皮下投与を受けた。被験物質はＦ０２７１００１８７からなり、週１回投与された。ビヒクルも週１回投与された。

剖検：動物は、最終ＰＦＴおよびＢＡＬ手順後すぐ、３０または３１週目の終わりのどちらかで剖検を受ける。安楽死は、ペントバルビタールナトリウムの過剰投与によって行われる。血液は、血清、血漿、およびＰＢＭＣについて収集され、調製される。肺は、ＲＮＡ、フローサイトメトリーおよび組織検査用に調製される各葉から一括および切片除去される。

ＩＬ－５の血漿濃度は、Ｓｉｍｏａ（カタログ番号１０２８６０、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）によって決定した。ＩｇＥの血清濃度は、ＥＬＩＳＡ（カタログ番号ＫＡ２４５０、Ａｂｎｏｖａ）によって決定した。

図１３で示されるこれらの実験の結果は、Ｆ０２７１００１８７が、肺の炎症を有意に阻害できたこと実証するものである（好酸球密度（組織検査）、Ｂａｌ ＩＬ－５および好酸球パーセント）。図１４は、Ｆ０２７１００１８７が、皮膚の炎症を有意に阻害できたこと実証する（組織検査）。図１５は、Ｆ０２７１００１８７が、全身のＩｇＥ生産を有意に阻害できたこと実証する。まとめると、これらの結果は、Ｆ０２７１００１８７のインビボにおける効能を実証するものである。これらの結果は、Ｆ２７１００１８７が喘息の処置に適していることをさらに支持する。

７ 産業上の利用可能性
本明細書に記載されるポリペプチド、それをコードする核酸分子、核酸を含むベクターおよび組成物は、例えば炎症性疾患に罹っている対象の処置において使用することができる。

本明細書で論じられた出版物は、本出願の出願日の前のそれらの開示のためだけに提供される。本明細書では、本発明が先行発明によるそのような公開に先行する資格がないという承認として解釈されるべきものではない。

本発明は、その特定の実施形態と関連して記載されているが、さらなる変更が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従い、本発明が属する技術分野内の公知のまたは通常の習慣の範囲に入り、上に記載され以下の添付の特許請求の範囲の通りの本質的な特徴に適用されるような本開示からの逸脱を含む、本発明のあらゆる変形、使用、または応用を含むことを意図すると理解される。

Claims (25)

1. ポリペプチド、該ポリペプチドを含む組成物、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であって、該ポリペプチドは、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなり、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
   ａ）第１のＩＳＶＤはＯＸ４０Ｌに結合し、
   ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
   ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
   ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
   ｂ）第２のＩＳＶＤはＩＬ－１３に結合し、
   ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
   ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有する ＣＤＲ２；および
   ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
   ｃ）第３のＩＳＶＤはＩＬ－１３に結合し、
   ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
   ｖｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
   ｉｘ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含む、前記ポリペプチドまたは組成物。
2. 少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含み、場合により、１種またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、請求項１に記載の組成物。
3. ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
   ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
   ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、
   請求項１または２に記載のポリペプチドまたは組成物。
4. ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を有し；
   ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を有し；
   ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
5. ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を有し；
   ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を有し；
   ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
6. 前記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
7. 増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、請求項６に記載のポリペプチドまたは組成物。
8. 増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンのような）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧのような）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、請求項６または７に記載のポリペプチドまたは組成物。
9. 増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、請求項８に記載のポリペプチドまたは組成物。
10. ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
    ｉ．配列番号８のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
    ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
    ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
    を含む、請求項９に記載のポリペプチドまたは組成物。
11. ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、請求項９または１０に記載のポリペプチドまたは組成物。
12. 前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を有する、請求項９～１１のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
13. 前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項９～１２のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
14. ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と９０％を超える配列同一性を有する、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
15. ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
16. 医薬としての使用のための、請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
17. ２型炎症性疾患のような炎症性疾患の処置における使用のための、請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
18. ２型炎症性疾患は、喘息および／またはアトピー性皮膚炎からなる群から選択される、請求項１７に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
19. 請求項１～１８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
20. 請求項１９に記載の核酸を含む宿主または宿主細胞。
21. 請求項１～１８のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産するための方法であって、少なくとも：
    ａ）請求項１９に記載の核酸を発現させる工程；場合により、それに続いて：
    ｂ）ポリペプチドを単離および／または精製する工程
    を含む、前記方法。
22. 少なくとも１つの請求項１～１８のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む組成物。
23. 請求項１９に記載の核酸を含む組成物。
24. 自己免疫疾患および／または２型炎症性疾患のような炎症性疾患を処置するための医薬組成物の調製における、請求項１～１８のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項２２に記載の組成物の使用。
25. ２型炎症性疾患は、喘息およびアトピー性皮膚炎からなる群から選択される、請求項２４に記載のポリペプチドまたは組成物の使用。

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