JP2023536568A - 微生物の培養培地 - Google Patents

Abstract

発酵産物を産生するための細菌発酵プロセスにおいて沈殿を減少させる方法であって、前記発酵プロセスは、ａ）バッチ培地を使用したバッチ相で細菌の成長のため宿主細胞を培養するステップ、およびｂ）フィード培地を使用してフェドバッチ相で発酵産物を産生するために宿主細胞を培養するステップ、を含み、フィード培地およびバッチ培地はそれぞれ非沈殿培地溶液であり、ここで、ｉ）バッチ培地は、ある量のカルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、ならびに、少なくとも５ｍＭのある量のクエン酸塩および／もしくはクエン酸ならびに／または少なくとも１ｍＭのある量のＥＤＴＡである少なくとも１つのキレート剤を含み、ｉｉ）フィード培地は、少なくとも１ｍＭであり、バッチ培地と比較して少なくとも５倍高いある量のカルシウム塩（Ｍ／Ｍ）を含み、ｉｉｉ）フィード培地は、少なくとも３ｍＭであり、バッチ培地と比較して少なくとも２倍高いある量のマグネシウム塩（Ｍ／Ｍ）を含み、ｉｖ）フィード培地は、バッチ培地に含まれる量（Ｍ／Ｍ）の９０％未満のある量のリン酸塩を含む、方法。

Description

本発明は、細菌の発酵プロセスにおける沈殿を減少させる方法、ならびにバッチ培地およびフィード培地を含む細菌の発酵プロセスで使用するための培地システムに関する。

大腸菌などの細菌細胞における組換えタンパク質産生の最も効率的な方法の１つは、フェドバッチである。バッチ相の間、細胞は非常に高い細胞密度まで成長することができる。このバッチ相の後にフェドバッチ相が続き、発酵産物の形成がスイッチオンされ、細胞が供給されて産物が産生される。

高い細胞密度への大腸菌細胞の培養は、発酵産物の高い収率にとって不可欠な前提条件である。この目的のために、細胞は、高い細胞密度を達成するためにバッチ相で無制限に成長しており（μ＝μ_ｍａｘ）、その後のフェドバッチ相の間、炭素供給源（例えば、グルコースまたはグリセロール）は、通常、基質制限条件下で計量供給される。細菌細胞の高い細胞密度発酵は、発酵産物、例えば異種タンパク質の産生のための高い空間時間収率を達成する魅力的な生物工学的手段である。

大腸菌のフェドバッチ高密度発酵は、細胞の培養における中程度から重度の沈殿という欠点を抱えている。沈殿の発生は、細胞培養培地を調製するとき、例えば、培地を低いｐＨで調製するとき、加熱滅菌後、またはｐＨを約ｐＨ７．０の所望の値に設定するときに、既に開始することがある。これまでのところ、培地化合物が沈殿したとしても、化合物が限定的になると再び溶解すると仮定されている。

Ｋｏｒｚら（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５，３９：５９－６５）は、グルコースまたはグリセロールを炭素供給源として使用する大腸菌の高い細胞密度培養のためのフェドバッチ技術を記載している。フィード培地を所定のフィード速度で使用して、フェドバッチプロセスでの炭素の制限的な成長を、不完全な基質酸化に起因する毒性副産物である酢酸の形成を引き起こさない成長速度で維持する。

Ｗｉｌｍｓら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２００１，７３（２）：９５－１０３）は、大腸菌における異種タンパク質の産生のための高い細胞密度発酵を記載している。

Ｃａｌｌｅｊａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０１６，１１３（４）：７７２－７８２）は、フェドバッチ大腸菌培養物におけるタンパク質産生のシミュレーションおよび予測を記載している。グルコースを唯一の炭素供給源として使用する異なる規定の最小培地を様々な株に使用した。マグネシウム塩との共沈殿を回避するために、リン酸塩溶液を含むフィード培地組成物を使用した。

Ｈａｒｄｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７、１３２：３５９～３７４）は、大腸菌株のフェドバッチの培養、ならびにバッチおよびフェドバッチ培地の使用を記載している。あらゆる沈殿物を分解するためにリン酸を使用した。

欧州特許第１５８４６８０号明細書は、プラスミドＤＮＡを産生するためのフェドバッチ発酵プロセスで使用するための定義された細胞培養培地を開示している。フィード培地は、バッチ培地と比較して、少なくとも同じ量またはそれより多いリン酸塩を含む。

国際公開第９５／２９９８６号パンフレットは、リンの供給源としてリン酸ガラスを使用する高細胞密度細菌発酵においてメタロホスフェート沈殿を制御する方法を開示している。

国際公開第２０１８０１１２４２号パンフレットは、特定のキレート剤を含む発酵培地を開示している。

Ｓｈｉｌｏａｃｈら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２００５，２３：３４５－３５７）は、大腸菌を高細胞密度に成長させる方法の開発を概説している。

Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇら（Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９１，２０：１７－２８）は、硫酸マグネシウムを補充したグルコースを供給する、制御された特定の成長速度で大腸菌を高い細胞密度で培養するフェドバッチプロセスを記載している。

細菌細胞の培養物にある沈殿物は、細菌の発酵プロセスの堅牢性に影響を及ぼす可能性がある。沈殿物の化合物は、細胞に利用できない。異なる取り扱い手順またはアップスケーリングによる沈殿物の量および組成の変動は、細胞の栄養利用可能性の変動をもたらし得る。さらに、それは、分析（例えば、粒子に起因して乱される光学密度（ＯＤ）測定）、下流処理（ＤＳＰ、例えばフィルタの目詰まり）、または培地の濾過ステップがその使用前に必要とされる場合（例えば、ｐＨ設定後の小容量、ハイスループット発酵システム用の充填容器）に対する問題を生じる可能性がある。したがって、細菌細胞の培養物の沈殿を減少させることが望ましい。

本発明の目的は、細胞培養培地での沈殿を回避するフェドバッチ細菌細胞培養プロセス、およびそれぞれの非沈殿培地システムを提供することである。さらなる目的は、大腸菌などの細菌細胞による高細胞密度発酵のためのバッチおよびフィード培地であって、培地化合物の沈殿が、成長する妥当なｐＨの範囲（ｐＨ±６．７～７．３）で防止されるバッチおよびフィード培地を提供することである。

本目的は、特許請求され、本明細書でさらに説明される主題によって解決される。

本発明は、発酵産物を産生するための細菌発酵プロセスにおいて沈殿を減少させる方法を提供し、発酵プロセスは、
ａ）バッチ培地を使用したバッチ相で細菌の成長のため宿主細胞を培養するステップ、および
ｂ）フィード培地を使用してフェドバッチ相で発酵産物を産生するために宿主細胞を培養するステップ、を含み、
フィード培地およびバッチ培地はそれぞれ非沈殿培地溶液であり、
ここで、
ｉ）バッチ培地は、ある量のカルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、ならびに、少なくとも５ｍＭのある量のクエン酸塩および／もしくはクエン酸ならびに／または少なくとも１ｍＭのある量のＥＤＴＡである少なくとも１つのキレート剤を含み、
ｉｉ）フィード培地は少なくとも１ｍＭであり、バッチ培地と比較して少なくとも５倍高い量のカルシウム塩（Ｍ／Ｍ）を含み、
ｉｉｉ）フィード培地は、少なくとも３ｍＭであり、バッチ培地と比較して少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも１５倍高い量のマグネシウム塩を含み（Ｍ／Ｍ）、
ｉｖ）フィード培地は、バッチ培地に含まれる量の９０％未満、または８０％未満、または７０％未満、または６０％未満、または５０％未満、または４０％未満、または３０％未満、または２０％未満、または１０％未満、または９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（Ｍ／Ｍ）のいずれか１つより少ないリン酸塩の量を含む。

特定の態様によれば、
ａ）カルシウム塩の量は、バッチ培地で最大１ｍＭであり、フィード培地で最大５ｍＭ、または最大４ｍＭであり、および／または
ｂ）マグネシウム塩の量は、バッチ培地で１～３ｍＭであり、フィード培地で３～１００ｍＭ、または３０～６０ｍＭであり、および／または
ｃ）リン酸塩の量はバッチ培地中３０～１２０ｍＭであり、フィード培地中には、バッチ培地に含まれる量の９０％未満（Ｍ／Ｍ）、好ましくはフィード培地中１０ｍＭ未満またはそれ以下、好ましくは最大９ｍＭ、最大８ｍＭ、最大７ｍＭ、最大６ｍＭ、最大５ｍＭ、または最大４ｍＭ、または最大３ｍＭ、好ましくはフィード培地中にリン酸塩は存在しない。

キレート剤は、クエン酸ナトリウム、クエン酸、またはＥＤＴＡなどのクエン酸塩のいずれか１つを含んでもよく、またはそれからなってもよく、または例えばクエン酸イオンの総量を得るためのクエン酸ナトリウムとクエン酸との混合物であってもよく、またはＥＤＴＡとクエン酸塩およびクエン酸のいずれか１つまたは両方との混合物であってもよい。

具体的には、キレート剤の好ましい量は、５、６、７、８、９、または１０ｍＭの少なくともいずれか１つ、最大で１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ｍＭのクエン酸イオン（合計）のいずれか１つの量で、好ましくは６から７０ｍＭのクエン酸イオン（合計）のモル範囲内で、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸塩および／またはクエン酸を含むかまたはそれからなる。

具体的には、キレート剤の好ましい量は、ＥＤＴＡナトリウムなどのＥＤＴＡを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍＭの少なくともいずれか１つ、最大で３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、または２０ｍＭのいずれか１つの量で、好ましくは１．５から２２ｍＭのモル範囲内で含むか、またはそれからなる。

特定の態様によれば、バッチ培地は、細菌細胞を高密度に成長させるために必要に応じてすべての栄養素、サプリメント、および賦形剤をさらに含む。

具体的には、バッチ培地は、グルコースおよび／またはグリセロールなどの有機炭素供給源、または細菌細胞を成長させるために適切に使用される任意の複合炭水化物を含む。

具体的には、バッチ培地はアンモニウム塩をさらに含む。

特定の態様によれば、フィード培地は、高密度細菌細胞の培養物中で発酵産物を産生するために必要に応じてすべての栄養素、サプリメント、および賦形剤をさらに含む。

具体的には、フィード培地は、グルコースおよび／またはグリセロールなどの有機炭素供給源、またはミネラル培地に適切に使用される任意の化学的に定義された炭水化物を含む。具体的には、フィード培地は、成長制限様式でフェドバッチ相の間に細胞の培養物に添加される。

特定の態様によれば、バッチ培地およびフィード培地のいずれか一方または両方は、微量元素をさらに含む。

特定の態様によれば、バッチ培地およびフィード培地のいずれか一方または両方は、６．７から７．３の範囲のｐＨを有する。

特定の態様によれば、発酵プロセスは、６．７～７．３の範囲のｐＨで行われ、好ましくはアンモニア水またはアルカリ溶液または化合物が、細胞の培養全体を通して、または少なくともフェドバッチ相の間に所望のｐＨを得るなどのために、ｐＨ調整のために計量供給される。

典型的には、フェドバッチ相は、バッチ相で細胞を培養した約８～２４時間後に開始し、これは、温度、培地の組成、培地の濃度、反応器のサイズなどの様々な個々の因子に依存し、特に使用される細菌株の性質にも依存し得る。有利には、発酵産物の合成は、フェドバッチ相の開始後約０～１５時間でスイッチが入る。しかし、正確な時間は、この時点で既に到達している培養物の細胞密度に依存し得る。産生期の前に望ましい細胞密度を達成することによって、所望の発酵産物の体積収率を最大化することができる。

特定の態様によれば、宿主細胞は、バッチ相で、５、１０、２０、３０、４０、または５０ｇ細胞乾燥重量／リットルの少なくともいずれか１つの密度まで成長され、宿主細胞は、成長制限条件下でフェドバッチ相で培養される。１０から８０ｇ／ｌの間、好ましくは２０から６０ｇ／ｌの間の細胞密度が特に好ましい。

産生期の開始時には、細胞密度が最大細胞密度の約１０～６０％に達することが好ましい。

特定の態様によれば、細菌宿主細胞が、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される種の産生宿主細胞である。

本明細書に記載の発酵産物を産生するための宿主細胞として、任意の適切なグラム陰性菌を使用することができる。適切なグラム陰性菌としては、大腸菌、ネズミチフス菌、蛍光菌、エルウィニア・カロトボーラ、赤痢菌、肺炎桿菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、およびアシネトバクター・バウマンニが挙げられる。好ましくは、産生宿主細胞は、大腸菌、特に発酵産物を高収率で産生するように操作された組換え大腸菌である。

大腸菌の例としては、大腸菌Ｋ１２株由来のもの、具体的には、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｃ６００、ＤＨ１、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＲＶ３０８、ＤＨ５α、ＸＬ１０－Ｇｏｌｄ、ＴＯＰ１０、ＭＧ１６５５、ＤＨ１０Ｂ、Ｗ３１１０、Ｏｒｉｇａｍｉ、ＢＷ２５１１３株由来のもの、ならびにＢ株に由来するもの、具体的にはＢＬ－２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｃ４１（ＤＥ３）などが挙げられる。

好ましい細菌宿主細胞は、野生型（操作されていない）宿主細胞によって産生されない発酵産物を産生するための遺伝子構築物を発現するように、またはそのような野生型宿主細胞と比較してより高い収率でそのような遺伝子構築物を発現するように遺伝子操作された組換え細胞である。

発酵産物は、異種産物であってもよく、または野生型宿主細胞によって天然に産生されるが、より低い収率の産物であってもよい。

特定の態様によれば、発酵産物は、目的のタンパク質（ＰＯＩ）、代謝経路、ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡなど）、またはプラスミドＤＮＡもしくはプラスミドベクターなどの組換えＤＮＡ分子のいずれか１つである。特定の態様によれば、発酵産物はプラスミドＤＮＡではない。

例えば、細菌宿主細胞は、目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含む異種発現カセットを導入するように遺伝子操作された組換え宿主細胞であり得る。次いで、ＧＯＩを発現させ、細胞の培養物からＰＯＩを単離することによって、細菌宿主細胞によってＰＯＩを産生することができる。特定の態様によれば、細菌宿主細胞は、タンパク質の折り畳みを促進するためのヘルパータンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を組み込むことによってＰＯＩを発現するように操作される。

別の例によれば、細菌宿主細胞は、例えばプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージ、ウイルスベクターおよびそれらのハイブリッドなどの共有結合閉環（ｃｃｃ）組換えＤＮＡ分子を含むＲＮＡまたはＤＮＡ分子を産生するように遺伝子操作することができる。

宿主細胞は、発酵産物を細胞培養培地に産生し得るか、または発酵産物を細胞培養培地に放出するために破壊され得る。発酵産物は、細胞培養培地から適切に単離され、場合により精製される。

具体的には、発酵プロセスは、産生期を誘導するステップを含む。誘導するステップは、培養培地または温度シフトなどの培養技術の変更によるものであり得る。

特定の実施形態は、誘導性プロモーターなどの誘導物質を組み込むように操作された宿主細胞を使用する。誘導刺激が加えられるとすぐに活性化される誘導性プロモーターを使用して、その制御下で遺伝子の転写を方向付けることができる。誘導刺激を伴う成長条件下では、細胞は通常、正常条件下よりもゆっくりと成長する。

特定の態様によれば、細菌宿主細胞は、誘導性プロモーターを含む発酵産物を産生および／または発現するための遺伝子構築物、特に発現カセットなどの異種遺伝子構築物を含み、遺伝子構築物の発現は、細胞の培養成分の枯渇もしくは制限によって、または誘導物質の添加によって誘導される。

タンパク質合成は、調節可能なプロモーターシステムを切り替えることによって開始することができる。使用されるシステムに応じて、このスイッチオンは、原則として、物質の添加または物理量の変更によって行われる。

細菌アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）プロモーター、ｔａｃ、ｌａｃ、ｐａｃ、Ｔ７、Ｔ５、Ａ１、Ａ３、ｌｐｐ、Ｓｐ６、ｎｐｒ、ｔｒｃ、ｓｙｎ、σ７０、ｐＬ、ｃｓｐＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐまたはマンノース、メリビオース、ラムノースもしくはアラビノースプロモーターのいずれかなどの様々な誘導性プロモーターを使用することができる。

具体的な例によれば、発現は、リン酸枯渇または制限の際に誘導される。

具体的には、フィード培地はリン酸塩を含まない。ｐｈｏＡプロモーターが細菌宿主細胞における異種タンパク質発現のために使用される場合、ｐｈｏＡプロモーター活性のために誘導された細胞は、典型的には、リン酸が枯渇した培地で培養することによってリン酸が欠乏する。

別の具体例によれば、ｌａｃシステム（プロモーター、オペレーターおよび誘導物質）を使用して発現を誘導し、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を添加することによってスイッチオンを実行する。

別の具体例によれば、プラスミド含有細菌宿主細胞は、成長速度が制限されるフェドバッチ相の一部の間に低温で成長され、続いて、プラスミドを蓄積させるために、温度上昇シフトによるプラスミド産生の誘導および高温での継続的な成長が続き、制限された成長速度での温度シフトは、プラスミドの収率および純度を改善する。そのようなプロセスは、高コピー数プラスミドの温度感受性を利用する。

別の具体例によれば、発現は糖（アラビノース、ラムノース、メリビオース、ラクトースまたはマンノース）の添加によって誘導される。

本発明はさらに、細菌細胞を培養するためのバッチ培地およびフィード培地を含む、細菌発酵プロセスで使用するための細胞培養培地システムを提供する。バッチ培地およびフィード培地の両方は、非沈殿の培地溶液である。具体的には、培地は、本明細書にさらに記載されるようなフェドバッチ発酵プロセスにおいて好適に使用され得る。具体的には、培地は、部分のキットまたはバッチ培地とフィード培地との組み合わせとして提供され、本発明の方法に関して本明細書に記載される特徴の１つまたは複数によって特徴付けられる。

具体的には、
ｉ）バッチ培地は、ある量のカルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、ならびに、少なくとも５ｍＭのある量のクエン酸塩および／もしくはクエン酸ならびに／または少なくとも１ｍＭのある量のＥＤＴＡである少なくとも１つのキレート剤を含み、かつ
ｉｉ）フィード培地は、少なくとも１ｍＭのある量のカルシウム塩、およびバッチ培地と比較して少なくとも５倍高い量のカルシウム塩（Ｍ／Ｍ）を含み、かつ
ｉｉｉ）フィード培地は、少なくとも３ｍＭのある量のマグネシウム塩、およびバッチ培地と比較して少なくとも１０倍高い量のマグネシウム塩（Ｍ／Ｍ）を含み、かつ
ｉｖ）フィード培地は、バッチ培地に含まれる量の９０％未満のある量のリン酸塩（Ｍ／Ｍ）を含む。

具体的には、培地システムは、以下の特徴、すなわち
ａ）カルシウム塩の量はバッチ培地で最大１ｍＭであり、フィード培地で最大５ｍＭ、または最大４ｍＭであり、
ｂ）マグネシウム塩の量はバッチ培地で１～３ｍＭであり、フィード培地で３～１００ｍＭ、または３０～６０ｍＭであり、
ｃ）リン酸塩の量はバッチ培地で３０～１２０ｍＭであり、フィード培地において、バッチ培地に含まれる量の９０％未満（Ｍ／Ｍ）であり、
ｄ）バッチ培地中のキレート剤量は、最大１００ｍＭのクエン酸塩および／もしくはクエン酸、ならびに／または最大３０ｍＭのＥＤＴＡであり、
ｅ）バッチ培地およびフィード培地は、有機炭素供給源および微量元素をさらに含み、
ｆ）バッチ培地は窒素源をさらに含む、
ということのいずれか１つ以上により特徴づけられる。

具体的には、培地は、６．７～７．３の範囲のｐＨの滅菌溶液である。

具体的な例によれば、
ａ）バッチ培地は、
（ｉ）好ましくはＣａＣｌ_２とする、０～１ｍＭのカルシウム塩、
（ｉｉ）好ましくはＭｇＳＯ_４とする、１～３ｍＭのマグネシウム塩、
（ｉｉｉ）１０～３０ｇ／Ｌのグルコースおよび／またはグリセロール、
（ｉｖ）例えば約９０ｍＭ、好ましくは（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２－Ｈ－クエン酸塩またはＮＨ_３の１つまたは複数とする、５０～１２５ｍＭのアンモニウム、
（ｖ）好ましくは（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、またはＫ_２ＳＯ_４の１つまたは複数とする、５～５０ｍＭ硫酸塩、
（ｖｉ）好ましくはＫＨ_２ＰＯ_４、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、または（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４もしくはＨ_３ＰＯ_４、またはＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４もしくはＫ_２ＨＰＯ_４のうちの１つ以上とする、３０～１２０ｍＭまたは３０～１００ｍＭのリン酸塩、
（ｖｉｉ）５～１００ｍＭのクエン酸塩および／もしくはクエン酸、ならびに／または１～３０ｍＭのＥＤＴＡ、
（ｖｉｉｉ）例えば、銅、マンガン、ナトリウム、ホウ素、亜鉛、および鉄塩の１つまたは複数を含むものなどの微量元素、
（ｉｘ）ならびに場合により消泡剤、を含み、またはそれらからなり、
また、
ｂ）フィード培地は、
（ｉ）好ましくはＣａＣｌ_２とする、１～５ｍＭのカルシウム塩、
（ｉｉ）好ましくはＭｇＳＯ_４とする、３～１００ｍＭまたは３０～６０ｍＭのマグネシウム塩、
（ｉｉｉ）好ましくはＫＨ_２ＰＯ_４、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、または（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４もしくはＨ_３ＰＯ_４、またはＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４もしくはＫ_２ＨＰＯ_４のうちの１つ以上である、バッチ培地中に含有される９０％未満リン酸塩量（Ｍ／Ｍ）、
（ｉｖ）５００～８００ｇ／Ｌ、好ましくは５５０～７００ｇ／Ｌのグルコースおよび／またはグリセロール（例えば、グルコースおよびグリセロールの総量）、
（ｖ）例えば、銅、マンガン、ナトリウム、ホウ素、亜鉛、および鉄塩の１つまたは複数を含むものなどの微量元素、
（ｖｉ）ならびに場合により好ましくは最大２０ｍＭのクエン酸塩および／またはクエン酸、または最大１０ｍＭのＥＤＴＡであるキレート剤、を含み、またはそれらからなる。

バッチ培地のリン酸塩濃度は、特に３０から１２０ｍＭの間、または約３０から１００ｍＭの間で変動し得る。リン酸塩枯渇または制限時に誘導可能な発現システムを使用する場合、リン酸塩濃度は、例えば、リン酸塩濃度を少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８、または９０％のいずれか１つに低下させるために、約１００ｍＭより低くてもよい。

フィード培地中のリン酸塩濃度は変動し得、特に、バッチ培地に含まれる濃度の９０％未満、または８０％未満、または７０％未満、または６０％未満、または５０％未満、または４０％未満、または３０％未満、または２０％未満、または１０％未満、または９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（Ｍ／Ｍ）のいずれか１つ未満である。具体的には、フィード培地のリン酸塩濃度の量は、フィード培地が、フィード培地のオートクレーブ前、オートクレーブ中および／またはオートクレーブ後に沈殿しないように低減される。

本明細書に記載のいずれかの培地に含まれる物質の量、濃度および範囲は、所与の値の「約」数＋／－１０％または＋／－５％と理解される。

バッチ培地はある量のキレート剤を含むが、フィード培地はキレート剤を含んでも含まなくてもよく、したがって、キレート剤はフィード培地組成物に任意選択的にのみ存在する。

本発明はさらに、フェドバッチ発酵プロセスにおいて細菌宿主細胞を培養するための方法における本明細書に記載の培地システムの使用を提供する。

本発明はさらに、細菌発酵プロセスにおける発酵産物の製造方法であって、
ａ）宿主細胞を成長させるためのバッチ相、続いて、
ｂ）前記宿主細胞から発酵産物を産生するためのフェドバッチ相、および
ｃ）発酵産物の単離を含み、
本明細書でさらに説明される培地システムを使用する、方法を提供する。

本方法は、本明細書にさらに記載されるように、発酵プロセスおよび培地システムの文脈における特徴によってさらに特徴付けられる。

バッチ培地にキレート剤を使用した場合に沈殿が効果的に防止されたことは驚くべきことであったが、バッチ培地にカルシウム塩は存在しなかったか、または少量しか存在せず、マグネシウム塩は少量しか存在しなかった。産生期にカルシウム塩およびマグネシウム塩を供給することによって、培地および／または細胞の培養物での沈殿が効果的に回避された。さらに、リン酸塩を少量で供給するか、または供給物中にリン酸塩を含まないことによって、培地での沈殿が効果的に回避された。

本明細書に記載の方法、発酵プロセスおよび培地システムにより、発酵の一貫性は、リン酸枯渇誘導またはリン酸制限誘導、または固定相誘導系（Ｐ枯渇系など）について、妥当なｐＨの範囲で、特に改善された。特に、リン酸塩の沈殿が効果的に回避され、それによって発酵の能力および堅牢性が改善された。ｐＨの調節のわずかな変化は多かれ少なかれ沈殿を生じ、したがって細胞に利用可能なリン酸塩沈殿物およびリン酸塩の量を増加または減少させ得るが、本発明は、高細胞密度発酵においてさえ、少なくとも６．７から７．３の間のｐＨの範囲全体にわたる非沈殿条件をもたらし、高い力価を生じる。

別段の指示または定義がない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、当業者に明らかな、当技術分野における通常の意味を有する。例えば、標準的な手引き、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，‘‘Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ’’（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；ｏｒ Ｌｅｗｉｎ，‘‘Ｇｅｎｅｓ ＩＶ’’，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９０）を参照されたい。本明細書を通して使用される特定の用語は、以下の意味を有する。

本明細書で使用される場合、「備える、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、同義的に使用することができ、さらなる部材または部品または要素を許容するオープンな定義として理解されるものとする。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」は、さらなる構成する定義的な特徴の要素がない、最も近い定義と見なされる。したがって、「備える、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」はより広く、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」の定義を含む。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、同じ値、または所与の値の＋／－１０％もしくは＋／－５％異なる値を指す。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」に関する「細胞」という用語は、宿主細胞の単一の細胞、単一の細胞クローン、または細胞株を指すものとする。

本明細書で使用される場合、「細胞株」という用語は、長期間にわたって増殖する能力を獲得した特定の細胞型の確立されたクローンを指す。細胞株は、典型的には、内因性または組換え核酸分子または遺伝子を発現させるため、発酵産物を産生するため、例えばＲＮＡもしくはＤＮＡ核酸分子、細胞代謝産物のような代謝経路の産物を産生するため、またはポリペプチドもしくはタンパク質を産生するために使用される。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、発酵産物を産生するための組換え目的に適切に使用される任意の細菌細胞に特に適用されるものとする。「宿主細胞」という用語はヒトを含まないことがよく理解される。「産生宿主細胞株」または「産生細胞株」は、発酵プロセスの産物を得るためのバイオリアクターでの細胞の培養にすぐに使用できる細胞株であると一般に理解される。

具体的には、本明細書に記載の組換え宿主細胞は、人工の生物および天然（野生型）宿主細胞の誘導体である。本明細書に記載される宿主細胞、方法および使用、例えば、具体的には、１つまたは複数の超える遺伝子改変、前記異種発現カセットまたは構築物、当該トランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞および組換えタンパク質を含むものを指すものは、天然に存在しない、「人工の」または合成のものであり、したがって、「自然法則」の結果とはみなされないことが十分に理解される。本明細書に記載の遺伝子改変は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）により記載されているような、当技術分野で公知のツール、方法および技術を使用することができる。

本明細書で使用される場合、「細胞の培養」または「培養する」または「培養」という用語は、成長、分化、継続的な生存性および生産性を促進する条件下で、インビトロ人工環境において、細胞の活性または静止状態で、特に業界で公知の方法に従って制御されたバイオリアクターにおいて、細胞を維持することを指す。

本明細書で言及される「細胞培養培地」という用語は、細胞の生存率を維持し、増殖、成長および／または例えば炭素供給源の生体内変換などによる発酵産物の産生を支援する基質および栄養素を含有する細胞を培養するための培地である。細胞培養培地は、以下のいずれかを適切な組み合わせで含有し得る：基質（炭素／エネルギー源（例えば、グリセロール、コハク酸塩、乳酸塩、ならびに糖、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、およびフルクトース））、窒素供給源、前駆体、ならびにビタミンおよびミネラルなどの栄養素、塩、緩衝液、アミノ酸、抗生物質、血清または血清代替物、ならびにペプチド成長因子などの他の成分。

「発現」または「発現カセット」という用語は、本明細書では、所望のコード配列、および操作可能な連結状態の制御配列を含む核酸分子を指すと理解され、その結果、これらの分子で形質転換またはトランスフェクトされた宿主は、それぞれの配列を組み込み、コードされたタンパク質または宿主細胞代謝産物を産生することができる。本明細書で使用される場合、「遺伝子発現」または「ポリヌクレオチドを発現する」または「核酸分子を発現する」という用語は、ｍＲＮＡへのＤＮＡ転写、ｍＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡの成熟、ｍＲＮＡ搬出、翻訳、タンパク質の折り畳みおよび／またはタンパク質の輸送からなる群から選択される少なくとも１つのステップを包含することを意味する。

１つまたは複数の発現カセットは、本明細書では「発現系」とも理解される。発現系は、ベクターなどの発現構築物に含まれ得る。しかしながら、関連するＤＮＡはまた、宿主細胞染色体に組み込まれ得る。発現は、ポリペプチドまたは代謝産物を含む分泌または非分泌発現産物を指し得る。

発現カセットは、発現構築物として、例えば「ベクター」または「プラスミド」の形態で好都合にも設けられ、典型的には、クローニングされた組換えヌクレオチド配列の転写、すなわち組換え遺伝子の転写および適切な宿主生物におけるそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列である。発現ベクターまたはプラスミドは通常、自律的な複製のための原点または宿主細胞におけるゲノム組み込みのための遺伝子座、選択マーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子、またはゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８、ハイグロマイシンノウルセオトリシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリンなどの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列および転写ターミネーターを含み、これらの構成要素は互いに作動可能に連結されている。本明細書で使用される場合、「プラスミド」および「ベクター」という用語は、自律複製ヌクレオチド配列、ならびに人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）などのヌクレオチド配列を組み込んだゲノムを含む。

本明細書で使用される宿主細胞は、目的の遺伝子を含むベクターまたはプラスミドを細胞に導入することによって得ることができる。原核細胞を形質転換するための技術は、当技術分野において周知である。これらには、熱ショック媒介性取り込み、インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションが含まれ得る。

発現ベクターには、クローニングベクター、改変クローニングベクターおよび特異的に設計されたプラスミドが含まれ得るが、これらに限定されない。本明細書に記載の好ましい発現ベクターは、真核生物宿主細胞における組換え遺伝子の発現に適した発現ベクターであり、宿主生物に応じて選択される。適切な発現ベクターは、典型的には、真核生物宿主細胞においてＰＯＩをコードするＤＮＡを発現させるのに適した調節配列を含む。調節配列の例としては、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳の開始および終結を制御する配列が挙げられる。調節配列は、典型的には、発現されるＤＮＡ配列に作動可能に連結される。

大腸菌などのグラム陰性菌を自らの宿主として利用するプラスミドの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＶＣ１１９、ｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＴＺ－１８Ｒ／－１８Ｕ、ｐＴＺ－１９Ｒ／－１９Ｕ、ｐＧＥＭ－３、ｐＧＥＭ－４、ｐＧＥＭ－３Ｚ、ｐＧＥＭ－４Ｚ、ｐＧＥＭ－５Ｚｆ（－）、ｐＥＴ、ｐＱＥ、ｐＡＣＹＣ、ｐＢＡＤ、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などが挙げられる。大腸菌での発現に適したプラスミドの例には、ｐＡＳ、ｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＭＣ１４０３、ｐＭＣ９３１、およびｐＫＣ３０が含まれる。

宿主細胞における組換えヌクレオチド配列の発現を可能にするために、プロモーター配列は、典型的には、それが作動可能に連結されている下流ヌクレオチド配列の転写を調節および開始することである。発現カセットまたはベクターは、典型的には、コード配列の５’末端に隣接する、例えばコード配列（例えば、ヘルパー因子をコードする）もしくは目的の遺伝子（ＧＯＩ）の上流にありかつ隣接する、またはシグナルもしくはリーダー配列が使用される場合、発現産物（例えば、ヘルパー因子またはＰＯＩ）の発現および分泌を促進するために、それぞれ当該シグナルおよびリーダー配列の上流にありかつ隣接する、プロモーターヌクレオチド配列を含む。

本明細書に記載の特異的な発現構築物は、ヘルパー因子またはＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に、当該プロモーターの転写制御下で作動可能に連結されたプロモーターを含む。具体的には、当該コード配列と天然には会合していないプロモーターを使用することができる。

特定の実施形態では、マルチクローニングベクターを使用することができ、マルチクローニングベクターはマルチクローニングサイトを有するベクターである。具体的には、所望の異種ポリヌクレオチドをマルチクローニング部位に統合するまたは組み込んで、発現ベクターを調製することができる。マルチクローニングベクターの場合、プロモーターは、典型的には、マルチクローニングサイトの上流に配置される。

本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、それぞれの内因性遺伝子の発現を減少させる、および／または内因性タンパク質の産生を減少させるための改変の前に、野生型（天然）宿主細胞に存在する分子および配列、特に内因性遺伝子またはタンパク質を含むことを意味する。特に、自然界で見出される特定の宿主細胞に存在する（およびそこから得ることができる）内因性核酸分子（例えば、遺伝子）またはタンパク質は、「宿主細胞内因性」または「宿主細胞にとって内因性」であると理解される。さらに、核酸またはタンパク質を「内因的に発現する」細胞は、天然に見られるのと同じ特定の種類の宿主と同様に、その核酸またはタンパク質を発現する。さらに、核酸、タンパク質、または他の化合物を「内因的に産生している」または「内因的に産生する」宿主細胞は、自然界で見られるのと同じ特定の種類の宿主細胞と同様に、その核酸、タンパク質、または化合物を産生する。

ヌクレオチド配列、発現カセットなどの構築物、アミノ酸配列またはタンパク質に関して本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、所与の宿主細胞に対して外来性である、すなわち「外因性」である、例えば当該宿主細胞において自然界では見られない化合物を指すか、または所与の宿主細胞に天然に見られるもの、例えば「内因性」であるが、異種構築物の状況において、またはそのような異種構築物に組み込まれて、例えば内因性核酸と融合したまたはそれと組み合わせた異種核酸を使用し、それによって構築物を異種にする、化合物を指す。内因的に見出される異種ヌクレオチド配列はまた、細胞において非天然、例えば予想される量より多い、または天然に見出される量より多い量で、産生され得る。異種ヌクレオチド配列、または異種ヌクレオチド配列を含む核酸は、おそらく内因性ヌクレオチド配列と配列が異なるが、内因性に見られるのと同じタンパク質をコードする。具体的には、異種ヌクレオチド配列は、自然では宿主細胞と同じ関係で見られないものである。任意の組換えまたは人工のヌクレオチド配列は、異種であると理解される。異種ポリヌクレオチドの例は、本明細書に記載されるように、例えばハイブリッドプロモーターを得るためにプロモーターと天然に会合していないか、またはコード配列に作動可能に連結されているヌクレオチド配列である。結果として、ハイブリッドまたはキメラポリヌクレオチドが得られることがある。異種化合物のさらなる例は、内因性の天然に存在するＰＯＩコード配列が通常作動可能に連結されていない転写制御要素、例えばプロモーターに作動可能に連結されたＰＯＩコードポリヌクレオチドである。

本明細書に記載の「発酵プロセス」は、フェドバッチプロセスである細胞の培養として理解される。具体的には、所望の発酵産物を産生するために、宿主細胞を成長期（「バッチモード」）で培養し、その後、産生期（「フェドバッチモード」）に移行させる。

「バッチ相」または「バッチモード」は、少量の細胞培養液を培地に添加し、培養中に追加の培地を添加せず、または培養液を排出せずに細胞を成長させる細胞の培養プロセスとして理解されるべきである。

「フェドバッチ相」または「フェドバッチモード」は、バッチ相での細胞の成長から開始し、その後、細胞の培養培地がバイオリアクターに連続的に添加（「フェド」）される細胞の培養が連続モードである「フェド」相が続く、培養技術を指す。「フェドバッチ」という用語はまた、反復式のフェドバッチおよび半連続のフェドバッチ発酵プロセスを含む。

フェドバッチプロセスでは、発酵の開始前に、培地に発酵培地化合物のいずれもまたは一部も添加されず、化合物のすべてまたは残りの部分がそれぞれ、発酵プロセス中に供給される。供給するために選択された化合物は、発酵プロセスに一緒に供給されてもよく、または互いに分離されてもよい。

反復式のフェドバッチプロセスでは、バイオマスを含む発酵ブロスの一部が、一定の時間間隔で除去される。

半連続のフェドバッチでは、発酵中に完全な出発培地がさらに供給される。これにより、発酵プロセスには、取り出された発酵ブロスの量に対応する新鮮な培地の一部が補充される。

バッチ相で使用される成長培地は、典型的にはバイオマスの蓄積を可能にし、具体的には炭素供給源、窒素供給源、硫黄供給源およびリン酸塩供給源を含む。典型的には、そのような培地は、さらに微量元素およびビタミンを含み、さらにアミノ酸、ペプトンまたは酵母抽出物を含み得る。

好ましい窒素供給源としては、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、もしくはＮＨ_４Ｃｌまたは（ＮＨ_４）_２－Ｈ－クエン酸塩もしくはＮＨ_３または（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４が挙げられる。

好ましい硫黄供給源としては、ＭｇＳＯ_４、または（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４もしくはＫ_２ＳＯ_４が挙げられる。

好ましいリン酸塩供給源としては、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、または（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４もしくはＨ_３ＰＯ_４、またはＮａＨ_２ＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４もしくはＫ_２ＨＰＯ_４が挙げられる。

さらなる典型的な培地の成分としては、ＫＣｌ、ＣａＣｌ_２、ＮａＣｌおよび微量元素、例えば、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｍｎ、Ｉ、Ｂ、が挙げられる。

好ましくは、培地にビタミンＢ_１が補充される。

産生期では、産生培地は、限られた量の補助炭素供給源のみで特に使用される。例えば、発酵に添加される補助的な炭素供給源の供給物は、最大５０重量％の利用可能な糖または最大１００％の利用可能なアルコールを含む炭素供給源を含み得る。

具体的には、本明細書に記載の宿主細胞は、適切な炭素供給源を含むミネラル培地で培養され、それによって単離プロセスをさらに著しく単純化する。好ましいミネラル培地の例は、利用可能な炭素供給源（例えば、グルコース、グリセロール、ソルビトール、メタノール、エタノール、またはそれらの組み合わせ）、マクロ元素（カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、硫酸塩、リン酸塩）および微量元素（銅塩、ヨウ化物塩、マンガン塩、モリブデン酸塩、コバルト塩、亜鉛塩、および鉄塩、ならびにホウ酸）を含有する塩、ならびに場合により、例えば栄養要求性を補完するためのビタミンまたはアミノ酸を含有するもの、または複合化合物、例えばペプトン、酵母抽出物、カゼイン、カスアミノ酸である。

本明細書に記載の発酵プロセスは、具体的には、バイオリアクターにおけるパイロット規模または工業規模での発酵を可能にする。「バイオリアクター」は、発酵槽もしくは発酵ユニット、または任意の他の適切な反応容器を含むことができる。発酵プロセスは、工業規模の生産に好適に使用されるバイオリアクターを使用することができる。工業規模の発酵プロセスは、典型的には、１００Ｌ、５００Ｌ、もしくは１０００Ｌ、またはさらに大きい、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍ^３の少なくともいずれか、またさらに多い最大５０００ｍ^３である体積規模の発酵プロセスを包含すると理解される。

典型的な発酵時間は、１６℃～４２℃、好ましくは２５～３７℃の範囲の温度で約２４～１２０時間である。

本明細書で使用される場合、「発酵産物」という用語は、本明細書に開示される方法で細胞株を培養することによって産生される産物を指す。発酵産物は、核酸分子、例えばＰＯＩを含むポリペプチドもしくはタンパク質、特に異種タンパク質、または例えば一次もしくは二次代謝産物を含む細胞代謝産物、医薬タンパク質もしくはペプチド、または工業用酵素である、目的の化合物であり得る。

一次代謝産物は、成長、発達または生殖に必須であり、多くの種によって共有される生体分子である。一次代謝産物は、解糖経路またはＴＣＡ回路などの主要な代謝経路の中間体であり得る。一次代謝産物の例は、アミノ酸および核酸である。二次代謝産物は、成長、発達または生殖に必須ではないが、代わりに生態学的機能を有する。二次代謝産物の例は、抗生物質またはβ－ラクタム化合物である。

目的の単離された化合物であり得る発酵産物に関して本明細書で使用される場合、「単離された」または「単離」という用語は、それが天然であれば関連付けられる環境、特に細胞の培養上清から十分に分離されているような化合物を指し、「精製された」または「実質的に純粋な」形態で存在するようにしたものとする。しかし、「単離された」とは、他の化合物または材料との人工または合成混合物を排除すること、または基本的な活性を妨げず、例えば不完全な精製に起因して存在し得る不純物が存在することを、必ずしも意味しない。単離された化合物は、その調製物を産生するためにさらに製剤化することができ、さらに実際の目的のために単離することができ、例えば、診断または治療に使用される場合、目的の化合物を薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することができる。

本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のいずれかを指す。「ポリヌクレオチド」は、５’末端から３’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖のポリマーを指す。それには、発現カセット、自己複製プラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマー、および非機能性ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、１つまたは複数のヌクレオチド配列の機能が当該核酸分子上に存在する少なくとも１つの他のヌクレオチド配列によって影響を受けるような方法での、単一の核酸分子、例えばベクターまたは発現カセットでのヌクレオチド配列の会合を指す。作動可能に連結することにより、核酸配列は、同じ核酸分子の別の核酸配列と機能的関係で配置される。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現を行うことができるとき、組換え遺伝子のコード配列と作動可能に連結される。さらなる例として、シグナルペプチドをコードする核酸は、成熟タンパク質のプリフォームまたは成熟タンパク質などの分泌された形態のタンパク質を発現することができるとき、ＰＯＩをコードする核酸配列に作動可能に連結される。具体的には、互いに作動可能に連結されたそのような核酸は、直ちに連結され得る、すなわち、シグナルペプチドをコードする核酸とＰＯＩをコードする核酸配列との間に、さらなる要素または核酸配列が存在しない。

細胞培養培地の文脈での「沈殿物」または「沈殿」という用語は、以下のように理解される。細胞培養培地に高濃度で存在するいくつかの成分は、特に培地のｐＨが中性付近である場合、調製またはオートクレーブまたは貯蔵の間に沈殿し得る。培地の成分の沈殿は、不確実性の要素を追加するので、極めて望ましくない。培地の成分が沈殿すると、沈殿物中の培地の成分の濃度に対する溶液中の培地の成分が、判明しない。様々な培地の成分の濃度が発酵産物の量と質に影響を及ぼし得るので、これは、培養条件が慎重に制御される商業的培養プロセスにおいて特に望ましくない不確実性の要素である。

「非沈殿性」培地は、粒状の材料（特に、濁りを引き起こす固体の分散がない）を含まず、好ましくは少なくとも６週間～３ヶ月間貯蔵安定性があり、目に見える沈殿物の形成も、光学密度の変化もない透明な溶液として、調製される。

本明細書に記載されるように、非沈殿バッチ培地（成長培地とも呼ばれる）および／または非沈殿フィード培地（産生培地とも呼ばれる）を使用することができる。本明細書に記載の非沈殿培地システムは、少なくともバッチ培地およびフィード培地を含み、これらはそれぞれ非沈殿性の培地である。

非沈殿培地は、本明細書に記載のそれぞれの成分を混合物の中に含む水溶液として特に設けられ、これは場合によりオートクレーブされる。

具体的には、本明細書に記載の培地は、約７のｐＨ、特に６．７～７．３のｐＨの範囲で非沈殿性である。具体的には、本明細書に記載の培地は、６．７～７．３のｐＨの範囲で、細胞の培養物の中で非沈殿性である。

具体的には、本明細書に記載の培地は、細菌細胞培養物へ培地を添加する前と後で非沈殿性であり、それにより、いかなる非有機性の濁りまたは沈殿もない細胞の培養物を得る。

本明細書に記載の非沈殿培地は、本明細書に記載のすべてのそれぞれの成分を含む水性培地として、または少なくとも２つの異なる培地の成分を含むパーツのキットとして提供することができ、これは、混合物を細胞培養物に添加する前に培地の成分の混合物を調製するために設けられてもよく、または発酵プロセスの少なくとも１つの相の間に、細胞培養物の中の培地の成分の混合物を得るために、別々に、組み合わせて、続いて、もしくは並行して使用されてもよいということが、よく理解される。１つ以上、例えば培地の成分すべては、固体または固体材料のそれぞれの混合物として設けられてもよい。

具体的には、バッチ培地のすべての培地の成分がバッチ相の細菌細胞の培養物に与えられ、フィード培地のすべての培地の成分が、フェドバッチ相の細菌細胞の培養物に与えられる。

「プロモーター」配列は、典型的には、プロモーターがコード配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結されていると理解される。プロモーター配列がコード配列と天然に会合していない場合、その転写は天然（野生型）の細胞においてプロモーターによって制御されないか、または配列が異なる連続的な配列と組み換えられる。

本明細書では、ＰＯＩコードＤＮＡなどのタンパク質コードポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を開始、調節、さもなければ媒介または制御するためのプロモーターが記載される。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子または異なる遺伝子に由来し得、同じまたは異なる生物に由来し得る。

プロモーターは、「誘導性プロモーター」または「構成的プロモーター」であり得る。「誘導性プロモーター」という用語は、特定の化合物または因子の存在または非存在によって誘導され得るプロモーターを指す。大腸菌などの細菌宿主細胞で使用するのに適したプロモーター配列には、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン／ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポタンパク質（ｌｐｐ）プロモーター、およびλファージＰＬプロモーター、プラスミドの糖誘導プロモーター（アラビノース、またはラムノース、またはマンノース、またはメリビオース、またはラクトース）が含まれる。

本明細書で使用される場合、「目的のタンパク質（ＰＯＩ）」という用語は、宿主細胞において組換え技術によって産生されるポリペプチドまたはタンパク質を指す。より具体的には、タンパク質は、宿主細胞に天然に存在しないポリペプチド、すなわち異種タンパク質であってもよいし、宿主細胞に天然であってもよい、すなわち宿主細胞に相同なタンパク質であってもよいが、例えば、ＰＯＩをコードする核酸配列を含む自己複製ベクターによる形質転換によって、または宿主細胞のゲノムへとＰＯＩをコードする核酸配列の１つまたは複数のコピーの組換え技術によって、またはＰＯＩをコードする遺伝子、例えばプロモーター配列の発現を制御する１つまたは複数の調節配列の組換え改変によって統合されると、産生される。場合によっては、本明細書で使用されるＰＯＩという用語は、組換え発現タンパク質によって媒介される宿主細胞による任意の代謝産物も指す。

ＰＯＩに関して制限はない。ＰＯＩは、真核生物または原核生物のポリペプチド、その変異体または誘導体であり得る。タンパク質は、天然に分泌されるタンパク質または細胞内タンパク質、すなわち天然に分泌されないタンパク質であり得る。

ＰＯＩは、治療用または診断用の産物であり得る。具体的には、ＰＯＩは、哺乳動物において機能する治療用タンパク質である。具体的には、ＰＯＩは、抗原結合タンパク質、治療用タンパク質、酵素、ペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物－タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン抗原、成長因子、ホルモン、サイトカイン、プロセス酵素、および代謝酵素からなる群から選択されるペプチドまたはタンパク質である。

具体的には、抗原結合タンパク質は、
ａ）キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、Ｆｖ四量体、ミニボディ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲ、またはＶ－ＮＡＲなどの単一ドメイン抗体のいずれかなどの抗体または抗体断片、
ｂ）抗体模倣物、例えばアドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎｓ）、アフィマー（Ａｆｆｉｍｅｒｓ）、アフィチン（Ａｆｆｉｔｉｎｓ）、アルファボディ、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒｓ）、ＤＡＲＰｉｎｓ、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒｓ）、クニッツドメインペプチド（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、モノボディ（Ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ）、またはナノＣＬＡＭＰＳ、または
ｃ）１つまたは複数の免疫グロブリン－フォールドドメイン、抗体ドメインまたは抗体模倣物を含む融合タンパク質からなる群から選択される。

ＰＯＩは、真核生物タンパク質、好ましくは、哺乳動物由来もしくは関連タンパク質、例えばヒトタンパク質もしくはヒトタンパク質配列を含むタンパク質、または細菌タンパク質もしくは細菌由来タンパク質であり得る。細菌宿主細胞に天然には存在しない任意のそのような哺乳動物、細菌または人工的なタンパク質は、宿主細胞に対して異種であると理解される。

本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、少なくとも５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の化合物（例えば、ＰＯＩ）を含む調製物を指すものとする。純度は、化合物に適した方法によって測定される（例えば、クロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）。単離・精製された化合物は、細胞の培養上清を精製して不純物を低減することによって得ることができる。

以下の標準的な方法が好ましい：精密濾過またはタンジェンシャルフローフィルター（ＴＦＦ）または遠心分離による細胞（残屑）の分離および洗浄、沈殿または熱処理によるＰＯＩの精製、酵素消化によるＰＯＩの活性化、クロマトグラフィー、例えばイオン交換（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除（ＳＥＣ）またはＨＰＬＣクロマトグラフィーによるＰＯＩの精製、濃縮のＰＯＩ沈殿および限外濾過ステップによる洗浄。

高度に精製された産物は、混入タンパク質を本質的に含まず、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９８％、最大１００％の純度を有する。精製された産物は、細胞の培養上清または細胞残屑の精製によって得ることができる。

組換えポリペプチドまたはタンパク質産物を得るための単離および精製方法としては、塩析、溶媒沈殿などの溶解度の違いを利用した方法、限外ろ過およびゲル電気泳動などの分子量の違いを利用した方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の違いを利用した方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用した方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の違いを利用した方法、ならびに等電点電気泳動などの等電点の違いを利用した方法などの方法を用いることができる。

単離および精製されたＰＯＩは、ウエスタンブロット、ＨＰＬＣ、活性アッセイまたはＥＬＩＳＡなどの従来の方法によって同定することができる。

本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、「遺伝子工学によって調製されるものまたは遺伝子工学の結果」を意味するものとする。「組換え細胞」または「組換え宿主細胞」は、本明細書では、当該細胞に天然ではない核酸配列を含むように遺伝子操作または改変された細胞または宿主細胞として理解される。組換え宿主は、１つまたは複数のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を欠失および／または不活性化するように操作され得、特に宿主にとって外来のヌクレオチド配列を使用して、組換え核酸配列を含有する発現ベクターまたはクローニングベクターを特に含み得る。組換えタンパク質は、それぞれの組換え核酸を宿主において発現させることによって産生される。本明細書で使用されるＰＯＩに関する「組換え」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作成または単離されたＰＯＩ、例えばＰＯＩを発現するように形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞から単離されたＰＯＩを含む。本発明によれば、当技術分野の技能の範囲にある従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を使用することができる。このような技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，‘‘Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，（１９８２）を参照されたい。特定の組換え宿主細胞は、遺伝子操作を使用して、すなわちヒトの介入によって操作された宿主細胞として理解される「操作された」宿主細胞である。宿主細胞が所与の遺伝子またはそれぞれのタンパク質を発現するように操作される場合、宿主細胞は、操作前の同じ条件下での宿主細胞と比較して、または当該遺伝子もしくはタンパク質が発現されるように操作されていない宿主細胞と比較して、宿主細胞がそのような遺伝子およびタンパク質をそれぞれより高い程度で発現する能力を有するように、操作される。

上記の説明は、以下の実施例を参照してより十分に理解されるであろう。しかし、そのような例は、本発明の１つ以上の実施形態を実施する方法の単なる代表例であり、本発明の範囲を限定するものとして読まれるべきではない。
実施例
実施例１：方法
培地の調製、ｐＨの設定および沈殿の観察

まず、培地を調製し、オートクレーブ処理した。沈殿事象は、培地の調製中、オートクレーブ処理の前後、およびｐＨを７．０に調整した後に、観察することができる。沈殿しなかった培地を、振盪フラスコにおける細胞の成長の試験に使用した。沈殿物の有無は、分光光度計（ＯＤ_６００）を用いた波長６００ｎｍでの光学密度測定により判定した。
振盪フラスコ培養

調製中に沈殿しなかった培地の成長能力を試験するために、大腸菌Ｗ３１１０（例えば、ＤＳＭ ５９１１から）を使用して振盪フラスコ培養を行った。振盪フラスコ培養物において細胞を成長させる培地を、バイオリアクタスケールでさらに試験した。
バイオリアクター培養

大腸菌Ｗ３１１０およびＬＢ２．０（ＢＬ２１由来）細胞を、調製、オートクレーブおよびｐＨ調整の間に沈殿しなかった培地を含むバイオリアクターで培養し、同時に振盪フラスコの規模で細胞を成長させた。細胞の成長および産物の形成をバイオリアクター培養物を通して経時的にモニターした。フェドバッチ培養を、１５ｍＬ（ａｍｂｒ（登録商標）１５ｆ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、２５０ｍＬ（ａｍｂｒ（登録商標）２５０、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）から１Ｌ（ＤＡＳＧＩＰ（登録商標）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）までの範囲の異なる発酵システムおよび異なるスケールで行った。沈殿とは別に、細胞の成長、最大ＯＤ_６００／ＤＣＷおよび力価に対する異なるバッチ培地の効果を調べた。
実施例２：新規培地システム、ＮＰＭ

成長および産物形成に対する培地およびその変異体の影響を調べるために、いくつかの発酵を行った。驚くべきことに、バッチ培地のカルシウム塩およびマグネシウム塩を減少させ、フィード培地のカルシウム塩およびマグネシウム塩を増加させると、発酵プロセスの能力が大幅に改善され、望ましくない培地の沈殿が生じる傾向が減少することが判明した。さらに、バッチ培地のカルシウム塩およびマグネシウム塩の量を減少させたにもかかわらず、クエン酸などのキレート剤は、予想外にも、バッチ培地を改善し、ｐＨ７．３までの中性ｐＨ、さらにはより高いｐＨでそれを使用することが、オートクレーブ処理の前後、および発酵中でさえ、沈殿を示すことなく、可能であった。クエン酸ナトリウム、クエン酸およびＥＤＴＡの中から選択したキレート剤を使用した。クエン酸塩は追加の炭素供給源であるが、大腸菌はその分子を吸収または消費することができず、したがってＥＤＴＡと同程度に不活性であることが分かった。細胞の成長は、新規の培地から影響を受けないことが証明された。

新規培地システムは、ＮＰＭメディアシステムと呼ばれる。
ＮＰＭ培地システム（様々な変形例を含む）：
ＮＰＭバッチ培地の組成：
（ｉ）０～１ｍＭのＣａＣｌ_２；
（ｉｉ）１～３ｍＭのＭｇＳＯ_４，
（ｉｉｉ）１０～３０ｇ／Ｌのグリセロール；
（ｉｖ）５０～１２５ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４およびＮＨ_４Ｃｌ（合計）；
（ｖ）５～５０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４；
（ｖｉ）３０～１２０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４；
（ｖｉｉ）５～１００ｍＭのクエン酸塩および／またはクエン酸；
（ｖｉｉｉ）塩化銅、硫酸マンガン、モリブデン酸ナトリウム、ホウ酸、硫酸亜鉛、および硫酸鉄を含む微量元素；
（ｉｘ）および消泡剤；
ＮＰＭフィード培地の組成：
（ｉ）１～５ｍＭのＣａＣｌ_２；
（ｉｉ）３～１００ｍＭ、好ましくは３０～６０ｍＭのＭｇＳＯ_４；
（ｉｉｉ）５５０～７００ｇ／Ｌのグリセロール；
（ｉｖ）０～１０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４；
（ｖ）塩化銅、硫酸マンガン、モリブデン酸ナトリウム、ホウ酸、硫酸亜鉛、および硫酸鉄を含む微量元素；
（ｖｉ）ならびに場合によりキレート剤：最大２０ｍＭのクエン酸塩および／またはクエン酸。
実施例３：ＮＰＭ、能力

ＮＰＭ培地を、限定されない成長および高い生産性レベルをもたらすことが証明された沈殿培地と比較した。沈殿培地は、成長およびタンパク質産生のために細胞が必要とするすべての成分の存在を保証する複合供給源を含んでいた。したがって、沈殿を回避することを除いて同様の能力についてＮＰＭ培地を比較することは、良い参照となった。
ラムノース誘導プロモーター下で発現される３つの異なるレポーター分子を用いたバッチ培地とフィード培地とのＮＰＭの組み合わせの試験

ラムノーズプロモーター下で３つの異なるレポーター分子を発現する大腸菌Ｗ３１１０株を、ＮＰＭ培地の能力に関する再現性を評価するために、バイオリアクター内で培養した（表１）。成長および生産性という観点から、複合沈殿培地（「沈殿」と表記）でＮＰＭ培地を基準にした。選択されたレポーター分子は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、抗体フラグメント（Ｆａｂ）およびｅＧＦＰであった。バッチとフィードの選択された組み合わせから得た新規ＮＰＭ培地も、バッチの複合化合物（酵母抽出物）で試験した。

生産性に関しては、複合化合物である、酵母抽出物（「ＮＰＭ」、「ＮＰＭ＋ＹＥ」）の添加の有無にかかわらず、ＮＰＭ培地システムが産物の収率に関して最良であり、ｐＨ７．０で沈殿しないという利点が得られた。

すべての場合において、ＮＰＭ培地を用いた細胞成長は制限を示さず、複合沈殿培地と同様に行った。

発酵におけるリン酸塩制限プロモーターによるＮＰＭ培地システムの使用

ラムノース誘導システムでもたらされる結果が、大腸菌における他のプロモーターシステムを使用した場合に類似するかどうかをさらに調べた。この場合、リン酸枯渇システムに対する効果を、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を産生するＷ３１１０株において調べた（表２）。結果として、成長のプロファイルおよび最終的なバイオマス含有量は、複合沈殿培地と同等であった。ＮＰＭ培地システムを使用するすべての培養物は、わずかにより高い単一ドメイン抗体価および同様の成長を示した。

発酵条件下で抗体断片を産生する大腸菌Ｂ株におけるＮＰＭ培地の使用

ＮＰＭ培地で培養した大腸菌Ｂ株のパフォーマンスを実行した。この場合、ラムノース誘導システムの下で抗体断片（Ｆａｂ）を産生するＬＢ２．０株を発酵条件で調査した。先の実施例と同様に、ＮＰＭ培地の能力を、成長および産物形成に関して複合沈殿培地と比較した（表３）。

実施例４：ＮＰＭ、供給原料中により高いリン酸塩濃度を含む培地との比較
同等：リン酸塩濃度が高いＮＰＭフィード培地は沈殿している

標準的な濃度を使用し、グリセロールをＣ供給源として使用して、ＮＰＭフィード培地を調製した。増加する濃度のリン酸塩を塩溶液に添加した。すべての塩を希釈したら、Ｃ供給源（例えばグリセロール）を添加し、溶液を１２１℃で３０分間オートクレーブ処理した。調製中およびオートクレーブ処理後に沈殿事象を監視した。

試験したリン酸塩の濃度は、０ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、７０ｍＭであった。ＫＨ_２ＰＯ_４をリン酸塩供給源として使用した（表４）。

中程度の範囲の濃度のカルシウム塩およびマグネシウム塩、ならびに１０ｍＭ未満のリン酸塩を含むこのようなＮＰＭフィード培地組成物が使用され得ると結論付けられる。

低めの濃度のカルシウム塩およびマグネシウム塩、例えば約１ｍＭのカルシウム塩および約３ｍＭのマグネシウム塩を含む同等のフィード培地では、より高いリン酸塩濃度、例えば最大１０８、または１０５、または最大１００ｍＭのリン酸塩を使用することができる。いずれの場合も、フィード培地は、バッチ培地での３０～１２０ｍＭと比較して、バッチ培地中に含まれる量の９０％未満、好ましくはフィード培地中２７～１０８ｍＭ未満を含み得る。
比較例：Ｈａｒｄｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７，１３２：３５９～３７４）および欧州特許第１５８４６８０号明細書の先行技術の培地は沈殿している

従来技術からのバッチ培地およびフィード培地を、Ｈａｒｄｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７、１３２：３５９－３７４）および欧州特許第１５８４６８０号明細書（実施例１に例示されている）に記載されているように調製した。バッチ培地を調製し、オートクレーブし、ｐＨを７．０に設定した。フィード培地を調製し、オートクレーブした。調製および完了の異なるステップ中に沈殿事象を監視した（表５）。

Claims (15)

1. 発酵産物を産生するための細菌発酵プロセスにおいて沈殿を減少させる方法であって、前記発酵プロセスは、
   ａ）バッチ培地を使用したバッチ相で細菌の成長のため宿主細胞を培養するステップ、および
   ｂ）フィード培地を使用してフェドバッチ相で前記発酵産物を産生するために前記宿主細胞を培養するステップ、を含み、
   フィード培地およびバッチ培地はそれぞれ非沈殿培地溶液であり、
   ここで、
   ｉ）前記バッチ培地は、ある量のカルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、ならびに、少なくとも５ｍＭのある量のクエン酸塩および／もしくはクエン酸ならびに／または少なくとも１ｍＭのある量のＥＤＴＡである少なくとも１つのキレート剤を含み、
   ｉｉ）前記フィード培地は、少なくとも１ｍＭであり、前記バッチ培地と比較して少なくとも５倍高いある量のカルシウム塩（Ｍ／Ｍ）を含み、
   ｉｉｉ）前記フィード培地は、少なくとも３ｍＭであり、前記バッチ培地と比較して少なくとも１０倍高いある量のマグネシウム塩（Ｍ／Ｍ）を含み、
   ｉｖ）前記フィード培地は、前記バッチ培地に含まれる量の９０％未満のある量のリン酸塩（Ｍ／Ｍ）を含む、方法。
2. ａ）カルシウム塩の前記量は前記バッチ培地で最大１ｍＭであり、前記フィード培地で最大５ｍＭ、または最大４ｍＭであり、かつ／または
   ｂ）マグネシウム塩の前記量は前記バッチ培地で１～３ｍＭであり、前記フィード培地で３～１００ｍＭ、または３０～６０ｍＭであり、かつ／または
   ｃ）リン酸塩の前記量は前記バッチ培地で３０～１２０ｍＭであり、前記フィード培地では前記バッチ培地（Ｍ／Ｍ）に含まれる前記量の９０％未満の前記フィード培地における、請求項１に記載の方法。
3. 前記バッチ培地およびフィード培地の両方が、有機炭素供給源および微量元素をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記バッチ培地がアンモニウム塩をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記発酵プロセスが、６．７～７．３の範囲のｐＨで行われる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記宿主細胞が、少なくとも１０ｇの細胞乾燥重量／リットルの密度まで前記バッチ相で成長させられ、前記宿主細胞が、成長制限条件下で前記フェドバッチ相で培養される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記細菌宿主細胞が、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される種の産生宿主細胞である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記発酵産物が、目的のタンパク質（ＰＯＩ）、代謝経路、ＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡもしくはプラスミドベクターなどの組換えＤＮＡ分子のいずれか１つである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記細菌宿主細胞が、誘導性プロモーターを含む前記発酵産物を産生および／または発現する遺伝子構築物を含み、前記遺伝子構築物の発現が、細胞の培養成分の制限または誘導物質の添加によって誘導される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 細菌細胞を培養するためバッチ培地とフィード培地とを含む、細菌発酵プロセスで使用するための培地システムであって、培地がそれぞれ非沈殿培地溶液であり、
    ｉ）前記バッチ培地は、ある量のカルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、ならびに、少なくとも５ｍＭのある量のクエン酸塩および／もしくはクエン酸ならびに／または少なくとも１ｍＭのある量のＥＤＴＡである少なくとも１つのキレート剤を含み、
    ｉｉ）前記フィード培地は、少なくとも１ｍＭであり、前記バッチ培地と比較して少なくとも５倍高いある量のカルシウム塩（Ｍ／Ｍ）を含み、
    ｉｉｉ）前記フィード培地は、少なくとも３ｍＭであり、前記バッチ培地と比較して少なくとも１０倍高いある量のマグネシウム塩（Ｍ／Ｍ）を含み、
    ｉｖ）前記フィード培地は、前記バッチ培地に含まれる量の９０％未満のある量のリン酸塩（Ｍ／Ｍ）を含む、培地システム。
11. 以下の特徴、すなわち、
    ａ）カルシウム塩の前記量は前記バッチ培地で最大１ｍＭであり、前記フィード培地で最大５ｍＭ、または最大４ｍＭであり、
    ｂ）マグネシウム塩の前記量は前記バッチ培地で１～３ｍＭであり、前記フィード培地で３～１００ｍＭ、または３０～６０ｍＭであり、
    ｃ）リン酸塩の前記量は前記バッチ培地で３０～１２０ｍＭであり、前記バッチ培地に含まれる前記量の９０％未満（Ｍ／Ｍ）であり、
    ｄ）バッチ培地の前記キレート剤の前記量は、最大１００ｍＭのクエン酸塩および／もしくはクエン酸、ならびに／または最大３０ｍＭのＥＤＴＡであり、
    ｅ）前記バッチ培地およびフィード培地は、有機炭素供給源および微量元素をさらに含み、
    ｆ）前記バッチ培地は、窒素供給源およびリン酸塩をさらに含む、
    のいずれか１つ以上により特徴づけられる、請求項１０に記載の培地システム。
12. ａ）前記バッチ培地は、
    （ｉ）好ましくはＣａＣｌ_２とする、０～１ｍＭのカルシウム塩、
    （ｉｉ）好ましくはＭｇＳＯ_４とする、１～３ｍＭのマグネシウム塩、
    （ｉｉｉ）１０～３０ｇ／Ｌのグルコースおよび／またはグリセロール、
    （ｉｖ）例えば約９０ｍＭ、好ましくは（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２－Ｈ－クエン酸塩またはＮＨ_３の１つまたは複数とする、５０～１２５ｍＭのアンモニウム、
    （ｖ）好ましくは（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、またはＫ_２ＳＯ_４の１つまたは複数とする、５～５０ｍＭ硫酸塩、
    （ｖｉ）好ましくはＫＨ_２ＰＯ_４、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、または（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４もしくはＨ_３ＰＯ_４、またはＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４もしくはＫ_２ＨＰＯ_４のうちの１つまたは複数とする、３０～１２０ｍＭのリン酸塩、
    （ｖｉｉ）５～１００ｍＭのクエン酸塩および／もしくはクエン酸、ならびに／または１～３０ｍＭのＥＤＴＡ、
    （ｖｉｉｉ）例えば、銅、マンガン、ナトリウム、ホウ素、亜鉛、および鉄塩の１つまたは複数を含むものなどの微量元素、
    （ｉｘ）ならびに場合により消泡剤、を含むかそれらからなり、
    また、
    ｂ）前記フィード培地は、
    （ｉ）好ましくはＣａＣｌ２とする、１～５ｍＭのカルシウム塩、
    （ｉｉ）好ましくはＭｇＳＯ_４とする、３～１００ｍＭまたは３０～６０ｍＭのマグネシウム塩、
    （ｉｉｉ）好ましくはＫＨ_２ＰＯ_４、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、または（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４もしくはＨ_３ＰＯ_４、またはＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４もしくはＫ_２ＨＰＯ_４のうちの１つまたは複数とする、バッチ培地中に含有される９０％未満（Ｍ／Ｍ）の量のリン酸塩、
    （ｉｖ）５００～８００ｇ／Ｌのグルコースおよび／またはグリセロール、
    （ｖ）例えば、銅、マンガン、ナトリウム、ホウ素、亜鉛、および鉄塩の１つまたは複数を含むものなどの微量元素、
    （ｖｉ）ならびに場合により好ましくは最大２０ｍＭのクエン酸塩および／またはクエン酸、または最大１０ｍＭのＥＤＴＡであるキレート剤、を含むかそれらからなる、請求項１０または１１に記載の培地システム。
13. フェドバッチ発酵プロセスにおいて細菌宿主細胞を培養する方法における、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の培地システムの使用。
14. 細菌発酵プロセスにおける発酵産物の製造方法であって、
    ａ）前記宿主細胞を成長させるためのバッチ相、それに続く、
    ｂ）前記宿主細胞から発酵産物を産生するためのフェドバッチ相、および
    ｃ）発酵産物の単離を含み、
    請求項１０から１２のいずれか一項に記載の培地システムを使用する、方法。
15. 前記発酵産物が、目的のタンパク質（ＰＯＩ）、ＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡもしくはプラスミドベクターなどの組換えＤＮＡ分子のいずれか１つである、請求項１４に記載の方法。