JP2023536125A - 造血細胞を分化させるシステム及び方法 - Google Patents

Abstract

外因的に添加される特定の成長因子シグナル伝達のアゴニストの任意の組み合わせが除外されている条件下にて、初期中胚葉細胞の集団から造血始原細胞を分化させるための培地、方法、システム、及びキットが開示される。初期中胚葉細胞の集団は、多能性幹細胞から誘導することができ、開示する条件下で分化される造血始原細胞は多能性である。本明細書で開示する培養条件は、血清を含まないワークフロー及び／または間質及び／またはフィーダー細胞を含まないワークフローを形成することができる。
【選択図】図１Ｃ

Description

関連出願
本出願は、２０２０年７月２７日に出願の米国特許仮出願番号第６３／０５７，０３７号の利益を請求し、その全体が参照により本明細書に援用される。

本開示は、細胞培養応用に関し、より詳細には、造血細胞を用いた細胞培養応用に関する。具体的には、本開示は、造血細胞を分化させるための細胞培養応用に関する。

ＮＫ細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞は、病原体及び腫瘍に対する防御力を有するリンパ球である。ＮＫ細胞は、自然免疫において重要な役割を果たし、炎症誘発性サイトカインを分泌することに加えて、がん細胞またはウイルス感染細胞を殺傷する能力がある。Ｔ細胞は、適応免疫系の細胞である。それらは、それらの抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して広範囲の標的を認識し、かつサイトカイン分泌及び細胞傷害性細胞殺傷などのエフェクター機能を発揮する。Ｂ細胞は、適応免疫系の細胞である。それらの様々な機能の中で、特定のＢ細胞は、抗体を産生するか、または抗体を産生するように刺激される場合がある。

ヒトＮＫ細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞は、臍帯血（ＣＢ）、骨髄（ＢＭ）、または末梢血（ＰＢ）から精製したＣＤ３４^＋造血幹及び始原細胞（ＨＳＰＣ）を間質細胞及びサイトカインと共に培養することによって生成することができる。しかし、ＣＢ、ＢＭ、及びＰＢから誘導される細胞は、異種性のものであることが多く、ドナーごとに質が異なる可能性がある。加えて、ＣＢ、ＢＭ及びＰＢから誘導される細胞は、数に限りがある。

多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、臨床応用に適した同種のカスタマイズ可能な大規模集団を作成する機会をもたらす。ＰＳＣの使用により、疾患モデリングまたは細胞療法応用を促進する遺伝子工学法も可能になる。

ＰＳＣ細胞からＮＫ細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞への分化は、例えば、がん患者における養子免疫療法の開発、ならびに、これらの細胞の基礎生物学の研究にとって有用なツールをもたらすことになる。したがって、ＰＳＣから開始する、効率的なＮＫ細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞分化プロトコルが必要である。

本開示は、造血細胞を分化させる方法に関する。

本開示の一態様において、造血始原細胞を分化させる方法が提供され、該方法は、第１の培地中で初期中胚葉細胞の集団を培養することを含み、ここで、該第１の培地は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうち１つ以上が補充された基礎培地を含み、かつＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達のアゴニストからなるリストから選択される外因的に添加されるアゴニストの任意の組み合わせが除外されている。

一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、骨形成タンパク質である。一実施形態では、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ４である。

一実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達のアゴニストは、繊維芽細胞成長因子である。一実施形態では、繊維芽細胞成長因子は、ＦＧＦ２である。

一実施形態では、ＶＥＧＦシグナル伝達のアゴニストは、血管内皮成長因子である。

一実施形態では、第１の培地は、血清を含まない。

一実施形態では、方法は、外因的に添加される間質細胞及び／またはフィーダー細胞の不在下で初期中胚葉細胞の集団を培養することをさらに含む。一実施形態では、第１の培地における初期中胚葉細胞の集団の培養は、３～１５日間行われる。

一実施形態では、造血始原細胞は、ＣＤ３４^＋である。一実施形態では、造血始原細胞は、骨髄系、赤血球系、及びリンパ球系潜在能力を有する。

一実施形態では、初期中胚葉細胞の集団は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から誘導される。

一実施形態では、方法は、誘導培地中でＰＳＣを培養することをさらに含み、ここで、該誘導培地は、ＰＳＣ由来の初期中胚葉細胞の分化した集団を得るために、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト、ＦＧＦシグナル伝達のアゴニスト、及びＶＥＧＦシグナル伝達のアゴニストのうち１つ以上が補充された第２の基礎培地を含む。

一実施形態では、誘導培地中のＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、骨形成タンパク質である。一実施形態では、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ４である。

一実施形態では、誘導培地中のＦＧＦシグナル伝達のアゴニストは、繊維芽細胞成長因子である。一実施形態では、繊維芽細胞成長因子は、ＦＧＦ２である。

一実施形態では、誘導培地中のＶＥＧＦシグナル伝達のアゴニストは、血管内皮成長因子である。

一実施形態では、誘導培地は、血清を含まない。

一実施形態では、方法は、外因的に添加される間質細胞及び／またはフィーダー細胞の不在下でＰＳＣを培養することをさらに含む。一実施形態では、誘導培地におけるＰＳＣの培養は、１～７日間行われる。

一実施形態では、方法は、誘導培地におけるＰＳＣの培養の前に、ＰＳＣを凝集体に形成することをさらに含む。一実施形態では、方法は、誘導培地中でＰＳＣを凝集体に形成することをさらに含む。一実施形態では、凝集体は、マイクロウェルデバイス中で形成される。

一実施形態では、方法は、血清を含まない条件下で、及び／または外因的に添加される間質細胞及び／またはフィーダー細胞の不在下で、リンパ球系分化培地で分化した造血始原細胞を培養した後に、リンパ球系始原細胞を得ることをさらに含む。

一実施形態では、リンパ球系始原細胞は、多系統潜在能力を有する。

一実施形態では、リンパ球系始原細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞潜在能力を有する。

一実施形態では、Ｔ細胞及びＮＫ細胞は機能的である。

本開示の別の態様において、初期中胚葉細胞の集団から造血始原細胞を分化させるための培地が提供され、該培地は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうち１つ以上が補充された基礎培地を含み、かつＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達のアゴニストからなるリストから選択される外因的に添加されるアゴニストの任意の組み合わせが除外されている。

一実施形態では、初期中胚葉細胞の集団は、多能性幹細胞から誘導される。一実施形態では、多能性幹細胞は、哺乳動物のものである。

一実施形態では、培地は、血清を含まない。一実施形態では、培地は、間質細胞及び／またはフィーダー細胞ワークフローにおいて効果的である。

一実施形態では、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニストは、繊維芽細胞成長因子である。一実施形態では、繊維芽細胞成長因子は、ＦＧＦ２である。

一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、骨形成タンパク質である。一実施形態では、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ４である。

一実施形態では、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達のアゴニストは、ＶＥＧＦである。

一実施形態では、造血始原細胞は、リンパ球系、骨髄系、及び赤血球系潜在能力を有する。一実施形態では、造血始原細胞は、ＣＤ３４＋である。

本開示の別の態様では、初期中胚葉細胞の集団を介して多能性幹細胞から造血始原細胞を分化させるための構成要素（本明細書に記載されるような）を含むシステム及び／またはキットが提供される。システム及び／またはキットはまた、（本明細書にて開示する培地及びその他の培養物コーティングまたは培養器具を使用して）段階的に分化された任意の細胞の集団を濃縮するための構成要素を含む場合がある。システム及び／またはキットはまた、造血始原細胞を多能性リンパ球系始原細胞の集団に分化させるための構成要素を含む場合がある。

本明細書にて開示する主題のその他の特徴及び利点も、後述の発明を実施するための形態により明らかとなるであろう。しかし、発明を実施するための形態及び特定の実施例は、本開示の主題の好ましい実施形態を示しているが、この発明を実施するための形態により、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、当業者に明らかとなるため、例示のみを目的として示したものであることを理解するべきである。
本明細書に記載の種々の実施形態のより良い理解のため、またこれらの種々の実施形態を効果的に実行し得る方法をより明確に示すために、少なくとも１つの例示的実施形態を示す添付図面を参照として提示し、これより、添付図面について説明する。各図面は、本明細書に記載の技術の範囲を限定することを意図したものではない。

種々の成長因子の組み合わせの存在下または不在下にて分化させた産出造血始原細胞の棒グラフを示す。本開示の方法に従って、ＷＬＳ－１Ｃ、ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１、Ｈ１、及びＨ９のＰＳＣ株の全てにわたって、（ＢＭＰ４、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦアゴンシムの異なる組み合わせで）分化させた６ウェルＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレートのウェル当たりのＣＤ３４^＋造血始原細胞の存在比率を測定した。データは、ＰＳＣ細胞株に応じた２～５回の実験の平均を表している。 種々の成長因子の組み合わせの存在下または不在下にて分化させた産出造血始原細胞の棒グラフを示す。本開示の方法に従って、ＷＬＳ－１Ｃ、ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１、Ｈ１、及びＨ９のＰＳＣ株の全てにわたって、（ＢＭＰ４、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦアゴンシムの異なる組み合わせで）分化させた６ウェルＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレートのウェル当たりのＣＤ３４^＋造血始原細胞の収量を測定した。データは、ＰＳＣ細胞株に応じた２～５回の実験の平均を表している。 本開示の方法に従って、ＷＬＳ－１Ｃ、ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１、Ｈ１、及びＨ９のＰＳＣ株の全てにわたって、ＶＥＧＦのみが不在の状態で、分化させた６ウェルＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレートのウェル当たりのＣＤ３４^＋造血始原細胞の測定した存在比率及び収量を示す。データは、ＰＳＣ細胞株に応じた２～５回の実験の平均を表している。 ＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞の存在比率及び収量を照会した場合においても、ＣＤ３４^＋細胞分化の増加（ＶＥＧＦの不在下で分化させた場合）が見られることを示す。データは、ＰＳＣ細胞株に応じた２～５回の実験の平均を表している。 （Ａ）種々の凝集体解離試薬を使用して得られた造血始原細胞の数の棒グラフを示す。（Ｂ）種々の凝集体解離試薬を使用して得られた生造血始原細胞の割合の棒グラフを示す。１，０００個のＰＳＣの凝集体を、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）４００の各ウェル中で形成し、全凝集体をプールした後に、等しく６つの画分に分割した。この際、凝集体は、１－Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、２－ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ、３－Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＩ ＆ ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ、４－Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ ＆ ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ、５－Ｇｅｎｔｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＣＤＲ）または６－Ｔｒｙｐｓｉｎのいずれかを使用して解離した。データは、個別の点によって示されている２～３回の実験の平均を表している。 （Ａ）種々のＰＳＣ株から分化させた産出造血始原細胞の棒グラフを示す。本開示の方法に従って、Ｈ１、Ｈ９、ＷＬＳ－１Ｃ、ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１、及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６のＰＳＣ株の全てにわたって、分化させた６ウェルＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレートのウェル当たりのＣＤ３４^＋造血始原細胞の存在比率及び収量を測定した。データは、ＰＳＣ細胞株に応じた７～２２回の実験の平均±ＳＥＭを表している。（Ｂ）濃縮前の分化したＣＤ３４^＋造血始原細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示している。（Ｃ）濃縮後の分化したＣＤ３４^＋造血始原細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示している。 （Ａ）ＣＤ３４^＋造血始原細胞の多分化能の棒グラフを示す。ＶＥＧＦの不在下で分化させたＣＤ３４＋始原細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）中で培養し、骨髄系及び赤血球系系統に分化するそれらの能力を評価した。また、本開示のＣＤ３４＋細胞を、様々な細胞数でＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎシステム中でさらに培養し、限界希釈で始原細胞の存在比率を評価した。各細胞数を、１２個のレプリケートウェルにプレーティングし、細胞数ごとの陽性ウェル（リンパ球系始原細胞を含有するウェル）の数を使用して、存在比率を測定した。（Ｂ）各条件のデータを表にまとめた。 （Ａ）造血始原細胞から分化させた産出リンパ球系始原細胞の棒グラフを示す。本開示の方法に従って、Ｈ１、Ｈ９、ＷＬＳ－１Ｃ、ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１、及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６のＰＳＣ株の全てにわたって、ＰＳＣ由来の造血始原細胞から分化させたＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりの存在比率及び収量を測定した。データは、ＰＳＣ細胞株に応じた５～２０回の実験の平均±ＳＥＭを表している。（Ｂ）ＰＳＣ由来のＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞の代表的フローサイトメトリープロットである。 （Ａ）及び（Ｂ）分化プロトコルの初期段階の期間を変化させた場合の産出造血始原細胞及びリンパ球系始原細胞の棒グラフを示す。（Ａ）本開示の方法に従って、１Ｃ、Ｈ１、及びＨ９のＰＳＣ株の全てにわたって、１０日間または１２日間分化させたＣＤ３４^＋造血始原細胞の６ウェルＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレートのウェル当たりの存在比率及び収量を測定した。（Ｂ）本開示の方法に従って、１Ｃ、Ｈ１、及びＨ９のＰＳＣ株の全てにわたって、１０日間または１２日間分化させたＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりの存在比率及び収量を測定した。（Ａ）及び（Ｂ）のデータは、細胞株に応じた３～７回の実験の平均を表している。 （Ａ）及び（Ｂ）造血始原細胞から分化させた産出ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ダブルポジティブＴ細胞の棒グラフを示す。（Ａ）本開示の方法に従って、Ｈ１、Ｈ９、ＷＬＳ－１Ｃ、ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１、及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６のＰＳＣ株の全てにわたって、ＰＳＣ由来のリンパ球系始原細胞から分化させたＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ダブルポジティブＴ細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりの存在比率及び収量を測定した。（Ｂ）本開示の方法に従って、Ｈ１、Ｈ９、ＷＬＳ－１Ｃ、ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１、及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６のＰＳＣ株の全てにわたって、ＰＳＣ由来のリンパ球系始原細胞から分化させたＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ダブルポジティブＴ細胞に基づいてゲーティングした）の存在比率を測定した。（Ｃ）産出ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ダブルポジティブＴ細胞の代表的なフローサイトメトリープロットである。（Ｄ）ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋細胞に基づいてゲーティングしたＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋細胞の産出の代表的なフローサイトメトリープロットである。（Ａ）及び（Ｂ）のデータは、ＰＳＣ株に応じた３～１３回の実験の平均±ＳＥＭを表している。 （Ａ）及び（Ｂ）リンパ球系始原細胞から分化させた産出ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ダブルポジティブＴ細胞の棒グラフを示す。（Ａ）Ｈ１、ＷＬＳ－１Ｃ、及びＨ９のＰＳＣ株の全てにわたって、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ダブルポジティブＴ細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりの存在比率及び収量に基づいて、分化したリンパ球系始原細胞の中で選別した生細胞またはＣＤ７^＋細胞の播種の効果を測定した。（Ｂ）Ｈ１（ドット記号）及びＷＬＳ－１Ｃ（正方形記号）のＰＳＣ株で、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ダブルポジティブＴ細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりの存在比率及び収量に基づいて、播種するリンパ球系始原細胞の数を変化させることの効果を測定した。（Ａ）及び（Ｂ）のデータは、ＰＳＣ株に応じた１～４回の実験の平均を表している。 （Ａ）ＰＳＣ由来のＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ダブルポジティブＴ細胞から分化させた産出ＣＤ８^＋シングルポジティブ（ＳＰ）Ｔ細胞（ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＤ４^－ＣＤ８^＋）の棒グラフを示す。本開示の方法に従ってＨ１、Ｈ９及びＷＬＳ－１ＣのＰＳＣ株から分化させたＣＤ８^＋シングルポジティブＴ細胞の存在比率を示している。データは、ＰＳＣ細胞株に応じた３～４回の実験の平均±ＳＥＭを表している。（Ｂ）～（Ｅ）産出ＣＤ８^＋シングルポジティブＴ細胞による異なるＴ細胞マーカーの発現の代表的なフローサイトメトリープロットである。 （Ａ）リンパ球系始原細胞から分化させた産出ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の棒グラフを示す。本開示の方法に従って、Ｈ１、Ｈ９、ＷＬＳ－１Ｃ、ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１、及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６のＰＳＣ株の全てにわたって、リンパ球系始原細胞に分化させたＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりの存在比率及び収量を測定した。データは、ＰＳＣ細胞株に応じた４～１３回の実験の平均±ＳＥＭを表している。（Ｂ）～（Ｈ）ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１のＰＳＣから誘導させた産出ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞のＮＫ細胞マーカー共発現の代表的なフローサイトメトリープロットである。 （Ａ）～（Ｆ）ＰＳＣ由来のＮＫ細胞が機能的であることを実証する棒グラフ及びフローサイトメトリープロットを示す。（Ａ）複数のＰＳＣ株の全てにわたって、分化したＣＤ５６^＋ＮＫ細胞は、２．５：１のエフェクター（ＮＫ細胞）対標的（Ｋ５６２細胞）の比率で、末梢血（ＰＢ）ＮＫ細胞と同等の殺傷能力を示した。データは、ＰＳＣ細胞株に応じた３～７回の実験の平均±ＳＥＭを表している。（Ｂ）非活性のＨ１由来のＮＫ細胞によるＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ－γ発現の代表的なフローサイトメトリープロットである。（Ｃ）１：１のＮＫ細胞：Ｋ５６２細胞の比率で、Ｋ５６２細胞との共培養によって活性化されたＨ１由来のＮＫ細胞によるＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ－γ発現の代表的なフローサイトメトリープロットである。（Ｄ）（Ｂ）及び（Ｃ）との比較におけるＫ５６２細胞との共培養によって活性化された末梢血ＮＫ細胞の代表的なフローサイトメトリープロットである。（Ｅ）ＰＢ ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞と比較した、Ｋ５６２細胞との共培養によって活性化された種々のＰＳＣ株から分化したＣＤ５６^＋ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの発現を示す。（Ｆ）ＰＢ ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞と比較した、Ｋ５６２細胞との共培養によって活性化された種々のＰＳＣ株から分化したＣＤ５６＋ＮＫ細胞によるＣＤ１０７ａの発現を示す。データは、ＰＳＣ細胞株に応じた２～４回の実験の平均±ＳＥＭを表している。 （Ａ）～（Ｄ）出発ＰＳＣを異なる培地調合物中に維持した場合の産出造血始原細胞及びリンパ球系始原細胞の棒グラフを示す。（Ａ）Ｈ１、Ｈ９、ＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６及びＷＬＳ－１ＣのＰＳＣ株の全てにわたって、ｍＴｅＳＲ１またはＴｅＳＲ－Ｅ８中に維持した６ウェルＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレートのウェル当たりのＣＤ３４^＋造血始原細胞の収量を測定した。（Ｃ）Ｈ１、Ｈ９、ＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６及びＷＬＳ－１ＣのＰＳＣ株の全てにわたって、ｍＴｅＳＲ１またはｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ中に維持した６ウェルＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレートのウェル当たりのＣＤ３４^＋造血始原細胞の収量を測定した。（Ａ）及び（Ｃ）のデータは、ｍＴｅＳＲ１を使用した４回の実験及びＴｅＳＲ－Ｅ８を使用した２回の実験の平均を表している。（Ｂ）Ｈ１、Ｈ９、ＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６及びＷＬＳ－１ＣのＰＳＣ株で、ｍＴｅＳＲ１またはＴｅＳＲ－Ｅ８中に維持したＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりの存在比率及び収量を測定した。（Ｄ）Ｈ１、Ｈ９、ＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６及びＷＬＳ－１ＣのＰＳＣ株で、ｍＴｅＳＲ１またはｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ中に維持したＣＤ５＋ＣＤ７＋リンパ球系始原細胞の投入ＣＤ３４＋細胞当たりの存在比率及び収量を測定した。（Ｂ）及び（Ｄ）のデータは、ｍＴｅＳＲ１を使用した７回の実験及びｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓを使用した２回の実験の平均を表している。

以下の説明は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）または初期中胚葉細胞から造血系統の細胞を分化させるための培地、方法及びシステム（キット）に関する。

本明細書で使用される場合、用語「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」とは、３つの胚性胚葉のいずれか／全てのうちの任意の細胞型への自己複製及び／または分化が可能な細胞を指す。胚幹細胞などのＰＳＣは、胚盤胞から単離され、維持または分化細胞培養条件に供される場合がある。誘導多能性幹細胞などのＰＳＣは、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４などの特定の多能性遺伝子の強制発現によって任意の細胞型から誘導される場合がある。多能性遺伝子の強制発現は、それらのコード領域を安定的にもしくは一過性に宿主細胞へ導入することを介して、または宿主細胞内にこれらの遺伝子の内因性コピーの発現を活性化する因子を導入することによって実現され得る。

本明細書で使用される場合、用語「初期中胚葉細胞」または「中胚葉前駆細胞」とは、造血幹及び始原細胞の前駆細胞である。これらは、胚（例えば、大動脈－生殖腺－中腎）などの適切な組織から単離されるか、ＰＳＣから分化され得る。加えて、初期中胚葉細胞は、造血内皮として知られている血管内皮の分化した亜集団に相当する場合がある。初期中胚葉細胞の集団が、ＰＳＣ由来のものであるか、または初期段階の胚から単離されたものであるかに関わらず、それらは、ＫＤＲ、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）またはＢｒａｃｈｙｕｒｙのうち１つ以上を発現する場合があるが、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）などのマーカーを発現しない場合がある。

本明細書で使用される場合、用語「造血幹及び始原細胞」または「ＨＳＰＣ」とは、造血系統のより分化した細胞への自己複製及び／または分化が可能な造血系統の細胞を指す。ＨＳＰＣは、骨髄（ＢＭ）、臍帯血（ＣＢ）、胚から成体の末梢血（ＰＢ）、胸腺、末梢リンパ節、胃腸管、扁桃腺、妊娠子宮、肝臓、脾臓、またはＨＳＰＣの局部的集団を含む任意の他の組織から得ることができる。ＨＳＰＣはまた、誘導多能性幹細胞、胚幹細胞、ナイーブ幹細胞、伸長幹細胞などの多能性幹細胞から分化可能である。ＨＳＰＣの顕著な特徴は、膜貫通リン糖タンパク質ＣＤ３４を発現することであり、ゆえに、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４^＋細胞と呼ばれることもある。ヒトＨＳＰＣは、ＣＤ４５及びＣＤ３４の発現によってさらに定義されることがあり、かつ、ＨＳＰＣ亜集団を区別するために使用される場合があるＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１０、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ２０１、及びインテグリン－α３などのマーカーの組み合わせによってさらに定義される場合がある。ＨＳＰＣは、グリコフォリンＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ５６などのマーカーを発現しないか、またはそれらを少ししか発現しないことがあり、そのようなマーカーは、より成熟した血球の特徴を有する場合がある。用語「造血始原細胞」は、「造血幹及び始原細胞」または「ＨＳＰＣ」と同じ意味で用いられる場合がある。

本明細書で使用される場合、用語「リンパ球系始原細胞」とは、ＨＳＰＣよりもさらに分化され、かつＢ細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞などの１つ以上のリンパ球系細胞型にさらに分化することができる細胞型を指す。リンパ球系始原細胞は、ＨＳＰＣの直系子孫である場合があるか、またはＨＳＰＣからさらに取り出される場合がある。さらに、リンパ球系始原細胞は、下流のリンパ球系細胞型に直接分化するか、または分化の１つ以上のさらなる過程を経て、その後リンパ球系細胞型となる場合がある。リンパ球系始原細胞の一例には、表現型マーカーＣＤ７及びＣＤ５に対して陽性な細胞がある。別の例では、リンパ球系始原細胞は、ＣＤ７には陽性であるが、ＣＤ５には陰性である、またはその逆である場合がある。別の例では、リンパ球系始原細胞は、ＣＤ７及びＣＤ５の両方に対して陰性である場合がある。リンパ球系始原細胞で発現することがある他の表現型マーカーとしては、ＣＤ１０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１６１、ＣＤ１２２、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１ａ及び／またはインテグリンβ７が挙げられる。本明細書において、明言しない限り、リンパ球系始原細胞の集団は、１つ以上のリンパ球系細胞型に分化する能力のある同種の細胞の集団または異種の細胞の集団を指す場合がある。一実施形態では、リンパ球系始原細胞は、リンパ球系細胞の任意型に分化する能力がある場合がある。一実施形態では、リンパ球系始原細胞は、その分化能力がより限定される場合があり、かつリンパ球系細胞の１つ以上のみに分化できるが、全てには分化できない。

本明細書で使用される場合、用語「ナチュラルキラー細胞」または「ＮＫ細胞」とは、ＨＳＰＣから誘導される場合がある造血系統のリンパ球の型を指す。より具体的には、ＮＫ細胞は、多リンパ球系始原細胞（ＭＬＰ）またはリンパ球系共通始原細胞（ＣＬＰ）から誘導され得る。ＮＫ細胞は、典型的には、Ｔ及びＢ細胞特異的マーカーの不在、ＣＤ１６（ＮＫ細胞の亜集団で発現する低親和性Ｆｃガンマ受容体３Ａ）を伴うまたは伴わないＣＤ５６の発現、及びそれらのエフェクター機能を特徴とする。より具体的には、ＮＫ細胞のエフェクター機能としては、細胞毒性作用及び／またはＩＦＮγ及び／またはＴＮＦαなどの炎症性サイトカインの産生が挙げられる。ＮＫ細胞は、さらに、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）と呼ばれる活性化及び抑制性受容体の発現を特徴とする場合がある。ＮＫ細胞が発現することがあるその他の活性化受容体としては、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２ＣＮＫＧ２Ｅ及びＮＫＧ２Ｆを含むＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体、ならびにＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６を含む天然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）が挙げられる。その他の抑制性受容体としては、ＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｂを含むＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体が挙げられる。ＰＳＣまたはＨＳＰＣ（例えば、ＰＳＣ由来のＨＳＰＣ）からのＮＫ細胞の分化は、通常、ＰＳＣ由来の中胚葉前駆細胞及び／またはリンパ球系始原細胞（例えば、ＰＳＣ由来のリンパ球系始原細胞）などの１つ以上の始原細胞集団によって媒介される。

本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞」とは、ＨＳＰＣから誘導される場合がある造血系統のリンパ球の型を指す。より具体的には、Ｔ細胞は、多リンパ球系始原細胞（ＭＬＰ）またはリンパ球系共通始原細胞（ＣＬＰ）から誘導され得る。Ｔ細胞は、典型的には、ＮＫ特異的マーカー、Ｂ特異的マーカー、及び赤芽球特異的マーカーの不在、ＣＤ３、及びＴＣＲαβ（もしくはＴＣＲγσ）、及びＣＤ４もしくはＣＤ８の発現、ならびにそれらのエフェクター機能を特徴とする。Ｔ細胞の一部の亜集団が、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方の特性を発現する場合があるが、ＴＣＲαβまたはＴＣＲγσを発現する、または発現しない場合があり、かつＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１６、及びＮＫ１．１を発現する、または発現しない場合がある。より具体的には、Ｔ細胞のエフェクター機能としては、サイトカインの産生、感染もしくは腫瘍標的細胞の殺傷、または他の造血細胞型の刺激が挙げられる。Ｔ細胞は、さらに、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ２７の発現を特徴とする場合がある。ＰＳＣまたはＨＳＰＣ（例えば、ＰＳＣ由来のＨＳＰＣ）からのＴ細胞の分化は、通常、ＰＳＣ由来の中胚葉前駆細胞及び／またはリンパ球系始原細胞（例えば、ＰＳＣ由来のリンパ球系始原細胞）などの１つ以上の始原細胞集団によって媒介される。

方法
本開示の方法は、ＰＳＣまたは初期中胚葉細胞から、造血始原細胞及び他の下流造血細胞型を分化させるステップを含む。本開示の方法はまた、ＰＳＣを１つ以上の前駆細胞集団を介してＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＢ細胞に分化させるステップを含み得る。造血始原細胞及び他の下流造血細胞型を分化させるための本明細書で開示する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｅｘ ｖｉｖｏ方法であることが好ましい。

造血始原細胞を分化させる方法は、１つ以上のサイトカイン（複数可）または成長因子（複数可）を補充した第１の基礎培地を含む第１の培地中で初期中胚葉細胞（例えば、造血始原細胞の前駆細胞）の集団を培養することを含む。一実施形態では、１つ以上のサイトカイン（複数可）または成長因子（複数可）は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）である。一実施形態では、第１の培地は、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達のアゴニストからなるリストから選択される外因的に添加されるアゴニストの任意の組み合わせが除外されている。別の実施形態では、第１の培地は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうち１つ以上が補充された基礎培地からなる、またはそれから本質的になる。

一実施形態では、初期中胚葉細胞の集団は、造血幹及び始原細胞の前駆細胞であり、かつ、それらは、胚（例えば、大動脈－生殖腺－中腎）などの適切な組織から単離される。一実施形態では、中胚葉前駆細胞は、造血内皮として知られている血管内皮の分化した亜集団に相当する。いくつかの実施形態では、初期中胚葉細胞（例えば、中胚葉前駆細胞）の集団は、ＰＳＣから分化される。初期中胚葉細胞の集団が、ＰＳＣ由来のものであるか、または初期段階の胚から単離されたものであるかに関わらず、それらは、ＫＤＲ、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）またはＢｒａｃｈｙｕｒｙのうち１つ以上を発現する場合があるが、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）などのマーカーを発現しない場合がある。

本開示の第１の培地は、中胚葉細胞から造血始原細胞（または造血内皮、ＨＥ）を分化させるのに使用することができる任意の培地を含む。ＨＥ細胞は、胚内の大動脈－生殖腺－中腎（ＡＧＭ）領域に局在する内皮細胞であり、内皮から造血への（ＥＨＴ）移行と呼ばれるプロセスを通して造血始原細胞へ分化する能力がある。第１の培地における初期中胚葉細胞の集団の造血始原細胞への分化は、中間体（例えば、造血内皮）の１つ以上の集団を介して進行する場合がある。または、そのような第１の培地により、初期中胚葉細胞の集団を造血始原細胞に直接的または間接的に分化させることができる。

本開示の第１の培地は、血清を含む場合があるか、または血清を含まない場合がある。好ましくは、本開示の第１の培地は、血清を含まない。培地が血清を含まない場合、そのような培地に、ＢＩＴ ９５００ Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０９５００）、または他の市販の血清代替溶液などの血清代替サプリメントを含める必要がある場合がある。あるいは、本開示の任意の細胞を培養または分化するために必要な血清に通常存在する成分、例えば、アルブミン（組換えであるかどうかに関わらず）は、許容可能な濃度で培地に個別に添加されてよい。

本開示の第１の培地は、本開示の細胞（例えば、造血始原細胞、またはＨＳＰＣ、及び場合により下流リンパ球系始原細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞）を培養／分化させるように適切に調合された第１の基礎培地を含む。したがって、第１の基礎培地は、造血系統の細胞の培養／分化を支援する任意の基礎培地であってよい。非限定的例として、第１の基礎培地は、ＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１００－１７１）、ＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０５３１１）、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）ＡＰＥＬ（商標）２ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０５２７０）、または目的にかなった任意の市販の基礎培地であってよい。そのような第１の基礎培地を調合するのに使用される一般的な成分としては、塩、緩衝剤、脂質、アミノ酸、トレース成分、特定のタンパク質などが挙げられる。一実施形態では、第１の基礎培地は、初期中胚葉細胞の集団からの造血始原細胞（または造血内皮、ＨＥ）の分化を最適に支援するように調合される。

一実施形態では、本開示の第１の培地は、初期段階の造血分化に影響を与えることが知られている１つ以上のサイトカインまたは成長因子を含んでいてもよい。第１の基礎培地に添加されるサプリメント（複数可）は、培養される細胞の特定の型に応じて変更される場合がある。概して、可能性のあるサプリメントの非網羅的なリストには、１つ以上のサイトカイン、１つ以上の成長因子、または他のタンパク質のうち少なくとも１つが含まれる。

一実施形態では、１つ以上のサイトカインまたは成長因子は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－２であってよい。一実施形態では、第１の培地には、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－２のそれぞれが補充される。一実施形態では、第１の培地には、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－２のうち１つ以上が補充される。ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－２のうち１つ以上を含む第１の培地の実施形態において、かかるサイトカインは、約１～１０００ｎｇ／ｍＬ、または約１～１００ｎｇ／ｍＬ、または約５～５０ｎｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ存在し得る。前述のサイトカインのうち１つ以上の小分子類似体が、第１の培地に含まれる場合の実施形態では、それらは、典型的に低濃度で使用される。

いくつかの実施形態では、Ｌ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－２のうち任意の１つ以上は含まれていなくてもよいが、培地の効率が損なわれる可能性がある。一実施形態では、第１の培地中にＩＬ－１５を含めることは、必ずしも必要ではない。一実施形態では、第１の培地は、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、及びＴＰＯのうち１つ以上を含む。

一実施形態では、第１の培地は、造血始原細胞を含む造血細胞の培養または分化で一般的に使用される１つ以上の他の成長因子を含んでいてもよい。例えば、第１の培地は、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト、ＦＧＦシグナル伝達のアゴニスト、及びＶＥＧＦシグナル伝達のアゴニストのうち１つ以上を含んでいてもよい。一実施形態では、第１の培地は、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト、ＦＧＦシグナル伝達のアゴニスト、及びＶＥＧＦシグナル伝達のアゴニストのうち１つ、一部または全てを含んでいない。別の言い方をすれば、第１の培地は、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達のアゴニストからなるリストから選択される外因的に添加されるアゴニストの任意の組み合わせが除外されている場合がある。

一実施形態では、第１の培地は、外因的に添加されるＢＭＰシグナル伝達のアゴニストを含むか、または含んでいない。ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、含まれる場合、ＢＭＰシグナル伝達の既知の任意のアゴニストであってよい。ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、産生細胞で内因的に発現して、単離され得るか、またはＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、組換えられて、産生細胞で発現し、かつ単離され得る。あるいは、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、小分子であってよい。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、マウスまたはヒトＢＭＰ４などの任意の種の骨形成タンパク質である。

第１の培地におけるＢＭＰシグナル伝達のアゴニストの濃度は、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約５～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であってよい。

一実施形態では、第１の培地は、外因的に添加されるＦＧＦシグナル伝達のアゴニストを含むか、または含んでいない。ＦＧＦシグナル伝達のアゴニストは、含まれる場合、既知の任意の繊維芽細胞成長因子であってよい。繊維芽細胞成長因子は、産生細胞で内因的に発現して、単離され得るか、または繊維芽細胞成長因子は、組換えられて、産生細胞で発現し、かつ単離され得る。一実施形態では、繊維芽細胞成長因子は、ヒトまたはマウスＦＧＦ２（塩基性ＦＧＦ、ｂＦＧＦとしても知られている）である。

第１の培地における繊維芽細胞成長因子の濃度は、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約５～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であってよい。

一実施形態では、第１の培地は、外因的に添加されるＶＥＧＦシグナル伝達のアゴニストを含むか、または含んでいない。ＶＥＧＦシグナル伝達のアゴニストは、含まれる場合、既知の任意の血管内皮成長因子であってよい。血管内皮成長因子は、産生細胞で内因的に発現して、単離され得るか、または繊維芽細胞成長因子は、組換えられて、産生細胞で発現し、かつ単離され得る。一実施形態では、血管内皮成長因子は、ヒトまたはマウスＶＥＧＦである。

第１の培地における血管内皮成長因子の濃度は、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約５～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であってよい。

一実施形態では、第１の培地は、１つ以上の外因的に添加されるＢＭＰ４、ＦＧＦ２、及びＶＥＧＦが除外されている。

いくつかの実施形態では、第１の培地は、アクチビン（例えば、アクチビンＡ）、ＣＨＩＲ９９０２１などのＷｎｔシグナル伝達アゴニスト、及び／またはＳＢ４３１５４２などのアクチビン受容体様キナーゼの阻害剤を含んでいない。

さらに、本開示の第１の培地は、細胞の培養を支援する追加のサプリメントと相乗作用を示す場合がある。例えば、一方では、間質またはフィーダー細胞が、本開示の細胞培養培地と共に使用されてよい。そのような細胞の非網羅的な例としては、胚性肝臓細胞株ＥＬ０８．１Ｄ２、ＡＦＴ０２４細胞、ＯＰ９細胞、ＭＳ－５またはＭ２－１０Ｂ４細胞、胚性大動脈－生殖腺中腎（ＡＧＭ）由来のマウス胚性繊維芽または間質細胞が挙げられる。他方では、間質及び／またはフィーダーを含まない培養手法が、本開示の細胞培養培地と共に使用されてよい。かかる手法のいくつかの実施形態では、間質／フィーダー細胞の培養物によってコンディショニングした培地が使用されてよく、またはかかるシステムは、間質／フィーダー細胞代替物を利用してもよい。間質／フィーダー細胞代替物は、適切なシグナルまたは結合部位を培養中の細胞に提供する１つ以上の既定の成分を含む場合がある。このような成分は、第１の培地に、または培養容器の内部培養物表面へ、もしくは粒子、ビーズ、マイクロキャリアなどの細胞培養培地中に懸濁した固体表面に塗布されるコーティングに含まれてよい。このような成分の非網羅的な例としては、フィブロネクチンコーティング、ゼラチンコーティング、コラーゲンコーティング、またはＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０９９２５）またはＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）などのコーティングが挙げられる。あるいは、間質／フィーダー細胞代替物は、例えば、補給によって、または間質／フィーダー細胞によって事前にコンディショニングされた培地として、細胞培養培地内で可溶性形態のそのような成分を提供することができる。

一実施形態では、初期中胚葉細胞の集団から造血始原細胞を分化させる方法は、間質を含まない条件及び／またはフィーダーを含まない条件下で、初期中胚葉細胞（例えば、中胚葉前駆細胞）を培養することをさらに含む場合がある。一実施形態では、初期中胚葉細胞の集団から造血始原細胞を分化させる方法は、外因的に添加される間質及び／またはフィーダー細胞を含まない条件下で、中胚葉前駆細胞を培養することをさらに含む場合がある。

ＰＳＣ由来の中胚葉前駆細胞などの初期中胚葉細胞の集団を（前述のような第１の培地などの適切な培地中で）培養することは、それらの生存能力または下流系統へ分化する能力に影響を与えない任意の時間期間で行われる場合がある。一実施形態では、初期中胚葉細胞の集団から造血始原細胞を分化させる方法は、第１の培地中で約２日間～２１日間、または約４日間～１４日間細胞を培養することをさらに含む。一実施形態では、初期中胚葉細胞の集団から造血始原細胞を分化させる方法は、第１の培地中で約６日間～１０日間細胞を培養することをさらに含む。

驚くべきことに、初期中胚葉細胞の集団から造血始原細胞を分化させるための第１の培地（本明細書に別途記載）中に、外因的に添加されるＢＭＰシグナル伝達アゴニスト、ＦＧＦシグナル伝達アゴニスト及びＶＥＧＦシグナル伝達アゴニストのうちの１つ、一部または全てが存在しない場合であっても、分化の効率は著しく低下しないことが、本発明者らによって明らかとなった。場合によっては、前述のアゴニストのいずれか（または任意の組み合わせ）を除外することにより、初期中胚葉細胞の集団から造血始原細胞を分化させる効率に有益な影響を与えることができる。例えば、外因的に添加されるＶＥＧＦシグナル伝達アゴニストが存在しない場合、外因的なＶＥＧＦシグナル伝達アゴニストを含む第１の培地と比較して、分化した造血始原細胞の存在比率及び／または収量が増加し得る。さらに、外因的に添加されるＶＥＧＦシグナル伝達アゴニストを含んでいない第１の培地における造血始原細胞分化は、接着性が低い場合があり、それにより、外因的に添加されるＶＥＧＦシグナル伝達アゴニストを含む第１の培地と比較して、下流リンパ球系始原細胞（及びさらに生じるＴ細胞、Ｂ細胞、及び／またはＮＫ細胞）の存在比率及び収量が増加する。同様に、外因的に添加されるＦＧＦまたはＢＭＰシグナル伝達アゴニストが存在しない場合、外因的に添加されるＦＧＦまたはＢＭＰシグナル伝達アゴニストを含む第１の培地と比較して、分化した造血始原細胞の存在比率及び／または収量が増加し得る。ＦＧＦまたはＢＭＰシグナル伝達アゴニストのいずれかを第１の培地から除外すると、造血始原細胞が増加する可能性があるが、そのような細胞は、下流リンパ球系始原細胞へ分化する能力が損なわれている可能性がある。しかし、驚くべきことに、ＶＥＧＦシグナル伝達のアゴニスト、ＦＧＦシグナル伝達のアゴニスト、及びＢＭＰシグナル伝達のアゴニストのそれぞれが除外されている第１の培地で分化した造血始原細胞は、さらにリンパ球系始原細胞に分化する、向上した（または同等の）能力を有する可能性がある（３つのそれぞれを含む条件と比較した場合）。造血始原細胞（及び下流リンパ球系始原細胞）を分化させる最小限の培地条件を特定することによる他の利点は、製造コストが大幅に削減できることと、複雑度を軽減することと、その複雑度の軽減により、規制上のハードルを下げることができることである。

したがって、本開示はまた、造血始原細胞を分化させるための培地も包含する。一実施形態では、本開示は、ＰＳＣ由来の造血始原細胞を分化させるための培地を包含する。一実施形態では、ＰＳＣは哺乳動物のものであり、一実施形態では、ＰＳＣはヒトのものである。造血始原細胞を分化させるための培地は、第１の培地と呼ばれることもあり、そのような第１の培地は、上記詳述した調合物のいずれかを含む場合がある。一実施形態では、第１の培地は、血清を含まず、かつフィーダー／間質を含まないワークフローで使用される。一実施形態では、第１の培地は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうち１つ以上が補充された基礎培地を含み、かつＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達のアゴニストからなるリストから選択される外因的に添加されるアゴニストの任意の組み合わせが除外されている。

ＢＭＰ、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦアゴニストのうち１つ、一部または全てが第１の培地に存在しないということは、第１の培地で培養される細胞（及び間質細胞または間質を含まないワークフローにおけるコーティング材料と接触した細胞）が、例えば、間質細胞もしくは間質代替物、または細胞自体が成長因子を導入する場合、それでも低レベルまたは検出未満のレベルのそのようなアゴニストに曝されることを意味する。しかし、ＰＳＣまたは間質細胞（存在する場合）のどちらも、そのようなアゴニストを異所的に発現するか、または過剰発現するように操作されていない。したがって、本発明者らの知見の限りでは、これは、血清及び間質を含まない条件下で、ＢＭＰ、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦシグナル伝達アゴニストのうち１つ、一部、または全ての不在下で、ＰＳＣ由来の中胚葉前駆細胞から造血始原細胞が効率的に分化することを報告する第１の開示である。

一実施形態では、初期中胚葉細胞の集団からＰＳＣ由来の造血始原細胞を分化させる方法は、ＰＳＣ由来の初期中胚葉細胞の分化した集団を得るために、第２の基礎培地、ならびにＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト（前述の通り）、ＦＧＦシグナル伝達のアゴニスト（前述の通り）、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達のアゴニストのうち１つ以上を含む誘導培地中でＰＳＣを培養することをさらに含む場合がある。

本開示の誘導培地は、ＰＳＣから初期中胚葉細胞の集団を分化させるのに使用することができる任意の培地を含む。誘導培地中でＰＳＣから初期中胚葉細胞の集団を誘導することは、中間体の１つ以上の集団を介して行われる。または、誘導培地により、ＰＳＣの集団を初期中胚葉細胞の集団に直接的または間接的に分化させることができる。

本開示の誘導培地は、血清を含む場合があるか、または血清を含まない場合がある。好ましくは、本開示の誘導培地は、血清を含まない。培地が血清を含まない場合、そのような培地に、ＢＩＴ ９５００ Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０９５００）、または他の市販の血清代替溶液などの血清代替サプリメントを含める必要がある場合がある。あるいは、本開示の任意の細胞を培養または分化するために必要な血清に通常存在する成分、例えば、アルブミン（組換えであるかどうかに関わらず）は、許容可能な濃度で培地に個別に添加されてよい。

本開示の誘導培地は、本開示の細胞（例えば、ＰＳＣ、及び場合により、下流造血始原細胞、リンパ球系始原細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞）を分化させるように適切に調合された第２の基礎培地を含む。第２の基礎培地は、ＰＳＣ及び／またはその始原細胞（例えば、初期中胚葉細胞）を含む造血系統の細胞の培養を支援する任意の基礎培地であってよい。非限定的例として、第２の基礎培地は、ＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１００－１７１）、ＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０５３１１）、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）ＡＰＥＬ（商標）２ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０５２７０）、または目的にかなった任意の市販の基礎培地であってよい。そのような第１の基礎培地を調合するのに使用される一般的な成分としては、塩、緩衝剤、脂質、アミノ酸、トレース成分、特定のタンパク質などが挙げられる。

一実施形態では、第２の基礎培地は、第１の基礎培地と同じであるか、本質的に同じである。一実施形態では、第２の基礎培地は、第１の基礎培地とは異なる。

一実施形態では、誘導培地は、初期段階の造血分化に影響を与えることが知られている１つ以上の成長因子を含んでいてもよい。例えば、誘導培地は、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト、ＦＧＦシグナル伝達のアゴニスト、及びＶＥＧＦシグナル伝達のアゴニストのうち１つ以上を含んでいてもよい。

誘導培地の一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、ＢＭＰシグナル伝達の既知の任意のアゴニストであってよい。ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、産生細胞で内因的に発現して、単離され得るか、またはＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、組換えられて、産生細胞で発現し、かつ単離され得る。あるいは、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、小分子であってよい。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、骨形成タンパク質である。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、ＢＭＰ４である。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、ヒトまたはマウスＢＭＰ４である。

誘導培地におけるＢＭＰシグナル伝達のアゴニストの濃度は、含まれる場合、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約５～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であってよい。

誘導培地の一実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達のアゴニストは、既知の任意の繊維芽細胞成長因子であってよい。繊維芽細胞成長因子は、産生細胞で内因的に発現して、単離され得るか、または繊維芽細胞成長因子は、組換えられて、産生細胞で発現し、かつ単離され得る。一実施形態では、繊維芽細胞成長因子は、ヒトまたはマウスＦＧＦ２（塩基性ＦＧＦ、ｂＦＧＦとしても知られている）である。いくつかの実施形態では、繊維芽細胞成長因子は、単一のアイソフォームバリアントからなる。いくつかの実施形態では、繊維芽細胞成長因子は、２つ以上のアイソフォームバリアントを含む。

誘導培地における繊維芽細胞成長因子アゴニストの濃度は、含まれる場合、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約５～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であってよい。

誘導培地の一実施形態では、ＶＥＧＦシグナル伝達のアゴニストは、既知の任意の血管内皮成長因子または任意のそれらのスプライシングアイソフォームであってよい。血管内皮成長因子またはスプライスバリアント（複数可）は、産生細胞で内因的に発現して、単離され得るか、または血管内皮成長因子またはスプライスバリアント（複数可）は、組換えられて、産生細胞で発現し、かつ単離され得る。一実施形態では、血管内皮成長因子の単一のアイソフォームが、誘導培地に含まれる。一実施形態では、血管内皮成長の複数のアイソフォームが、誘導培地に含まれる。ヒト血管内皮成長因子は、複数の方法でスプライシングされることが知られている。あるいは、例えば、血管内皮成長因子のスプライシングされたアイソフォームは、長さが１２１、１４５、１６５、１８３、１８９、及び２０６アミノ酸のアイソフォームを含む。最も効力があり、豊富なアイソフォームは、１２１、１６５、及び１８９アミノ酸長のバリアントを含む場合がある。

誘導培地における血管内皮成長因子アゴニストの濃度は、含まれる場合、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約５～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であってよい。

誘導培地は、初期段階の造血分化に影響を与えることが知られている他のサイトカインまたは成長因子、例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ）、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）、及び／またはＴＧＦβ経路阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）、及び／またはアクチビンをさらに含んでいてもよい。

さらに、本開示の誘導培地は、細胞の培養向けの追加のサプリメントと相乗作用を示す場合がある。例えば、一方では、間質及び／またはフィーダー細胞が、本開示の細胞培養培地と共に使用されてよい。そのような細胞の非網羅的な例としては、胚性肝臓細胞株ＥＬ０８．１Ｄ２、ＡＦＴ０２４細胞、ＯＰ９細胞、ＭＳ－５またはＭ２－１０Ｂ４細胞、胚性ＡＧＭ由来のマウス胚性繊維芽または間質細胞が挙げられる。他方では、間質及び／またはフィーダーを含まない培養手法が、本開示の細胞培養培地と共に使用されてよい。間質及び／またはフィーダーを含まない培養システムは、間質細胞によって事前にコンディショニングした培地を利用してもよく、またはそのようなシステムは間質細胞代替物を利用してもよい。そのようなシステムは、間質／フィーダー細胞細胞によって事前にコンディショニングした培地を利用してもよく、またはそのようなシステムは間質／フィーダー細胞代替物を利用してもよい。間質／フィーダー細胞代替物は、適切なシグナルまたは結合部位を培養中の細胞に提供する１つ以上の既定の成分を含む場合がある。このような成分は、誘導培地に、または培養容器の内部培養物表面へ、もしくは粒子、ビーズ、マイクロキャリアなどの細胞培養培地中に懸濁した固体表面に塗布されるコーティングに含まれてよい。このような成分の非網羅的な例としては、フィブロネクチンコーティング、ゼラチンコーティング、コラーゲンコーティング、固定化されたＮｏｔｃｈリガンド、またはＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０９９２５）またはＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）などのコーティングが挙げられる。あるいは、間質／フィーダー細胞代替物は、例えば、補給によって、または間質／フィーダー細胞によって事前にコンディショニングされた培地として、細胞培養培地内で可溶性形態のそのような成分を提供することができる。

一実施形態では、ＰＳＣから初期中胚葉細胞の集団を分化させる方法は、間質を含まない条件及び／またはフィーダーを含まない条件下で、ＰＳＣを培養することをさらに含む場合がある。一実施形態では、ＰＳＣから初期中胚葉細胞の集団を分化させる方法は、外因的に添加される間質及び／またはフィーダー細胞を含まない条件下で、ＰＳＣを培養することをさらに含む場合がある。

一実施形態では、ＰＳＣから初期中胚葉細胞の集団を分化させる方法は、ＰＳＣを凝集塊または単一の細胞に解離させることと、誘導培地中にそのような細胞をプレーティングすることとをさらに含む場合がある。

一実施形態では、ＰＳＣから初期中胚葉細胞の集団を分化させる方法は、誘導培地中でＰＳＣを培養する前に、ＰＳＣを凝集体に形成することをさらに含む場合がある。

一実施形態では、ＰＳＣから初期中胚葉細胞の集団を分化させる方法は、誘導培地中でＰＳＣを凝集体に形成することをさらに含む場合がある。

ＰＳＣは、任意の手法を使用して凝集体に形成されてよい。例えば、ＰＳＣの凝集体は、細胞培養プレートのチューブまたはウェルの底に所望の数のＰＳＣを堆積させることによって形成され得る。あるいは、凝集体は、確実にＰＳＣの均一なサイズの凝集体を効率的かつ再現可能に形成するために、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）マイクロウェルデバイスのウェル中に所望の数のＰＳＣを堆積させることによって形成され得る。

一実施形態では、凝集体を形成するために使用されるＰＳＣの数は、約１～１００，０００である。一実施形態では、凝集体を形成するために使用されるＰＳＣの数は、約１０～１０，０００である。一実施形態では、凝集体を形成するために使用されるＰＳＣの数は、約１００～１，０００である。

そのために、一実施形態では、ＰＳＣの凝集体は、マイクロウェルデバイス中で形成され得る。一実施形態では、ＰＳＣの凝集体は、約１０００個の細胞または約５００個の細胞から形成される。

ＰＳＣを（前述のような誘導培地などの適切な培地中で）培養して中胚葉前駆細胞を生成することは、それらの生存能力または下流系統へ分化する能力に影響を与えない任意の時間期間で行われる場合がある。一実施形態では、初期中胚葉細胞の集団から造血始原細胞を分化させる方法は、ＰＳＣ由来の中胚葉細胞の分化した集団を得るために、誘導培地中で約１日間～７日間ＰＳＣを培養することをさらに含む。一実施形態では、ＰＳＣから初期中胚葉細胞の集団を分化させる方法は、誘導培地中で約２日間～５日間ＰＳＣを培養することをさらに含む。

一実施形態では、ＰＳＣは、ＰＳＣ由来の中胚葉細胞の分化した集団を得るために、第２の基礎培地、ならびにＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト、ＦＧＦシグナル伝達のアゴニスト、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達のアゴニストのうち１つ以上を含む誘導培地中で初期中胚葉細胞の集団に分化され得る。一実施形態では、誘導培地は、第２の基礎培地ならびにＢＭＰ、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦシグナル伝達のアゴニストのそれぞれを含む。

したがって、上記に基づいて、本開示はまた、本明細書で前述したような誘導培地も包含する。さらに、誘導培地及び第１の培地は、ＰＳＣを初期中胚葉細胞の集団を介して造血始原細胞に分化させるためのキットまたはシステムに含まれる場合がある。

一実施形態では、ＰＳＣ由来の中胚葉前駆細胞から造血始原細胞を分化させる方法は、造血始原細胞を解離させた後に、リンパ球系始原細胞を得ることと、解離した造血始原細胞をリンパ球系分化培地中で血清を含まない及び／または間質を含まない条件下で培養することとをさらに含む。

ＰＳＣの凝集体が初期中胚葉前駆細胞の集団を分化するために使用され、そのようなＰＳＣ由来の中胚葉前駆細胞が造血始原細胞を分化するために使用される場合、造血始原細胞は、既知の任意のまたは開発された手段を使用して解離され得る。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｇｅｎｔｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、ＧＣＤＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはトリプシンなどの種々の解離試薬が市販されている。異なる解離試薬を組み合わせることが望ましい場合もある。例えば、本明細書に示されるように、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＩ ＆ ＴｒｙｐＬＥ（商標）またはＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ ＆ ＴｒｙｐＬＥ（商標）が、造血始原細胞を解離するために組み合わされてよい。

一実施形態では、造血始原細胞の解離後、サンプル内の造血始原細胞を濃縮することが望ましい場合がある。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む種々の市販の試薬が知られている。あるいは、造血始原細胞（または造血内皮細胞）は、ＦＡＣＳ選別によって濃縮され得る。

本開示のリンパ球系分化培地は、造血始原細胞または造血内皮細胞をリンパ球系始原細胞に分化させるのに使用することができる任意の培地を含む。そのようなリンパ球系分化培地とは、ＰＳＣ由来の造血始原細胞のリンパ球系始原細胞への分化を指し、それらの間の中間体の１つ以上の集団の誘導を含む場合がある。あるいは、そのようなリンパ球系分化培地により、ＰＳＣ由来の造血始原細胞の集団をリンパ球系始原細胞の１つ以上の亜集団に直接的または間接的に分化させることができる。

本開示のリンパ球系分化培地は、血清を含む場合があるか、または血清を含まない場合がある。好ましくは、本開示のリンパ球系分化培地は、血清を含まない。培地が血清を含まない場合、そのような培地に、ＢＩＴ ９５００ Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０９５００）、または他の市販の血清代替溶液などの血清代替サプリメントを含める必要がある場合がある。あるいは、本開示の任意の細胞を培養または分化するために必要な血清に通常存在する成分は、許容可能な濃度で培地に個別に添加されてよい。

本開示のリンパ球系分化培地は、本開示の細胞を分化させるように（例えば、造血始原細胞をリンパ球系始原細胞に）適切に調合された第３の基礎培地を含む。第３の基礎培地は、造血系統の細胞の培養を支援する任意の基礎培地であってよい。非限定的例として、第３の基礎培地は、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０９６５０）、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０９６５５）、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）－ＡＣＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０９８５５）、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｈ３０００（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０９８５０）または目的にかなった任意の市販の基礎培地であってよい。そのような第３の基礎培地を調合するのに使用される一般的な成分としては、塩、緩衝剤、脂質、アミノ酸、トレース成分、特定のタンパク質などが挙げられる。

一実施形態では、第３の基礎培地は、第２基礎培地もしくは第１の基礎培地、またはその両方と同じであるか、第２基礎培地もしくは第１の基礎培地、またはその両方と本質的に同じである。一実施形態では、第３の基礎培地は、第２の基礎培地もしくは第１の基礎培地、またはその両方とは異なる。

一実施形態では、リンパ球系分化培地は、造血始原細胞の分化を支援するためにさらに補充される必要がある場合がある。基礎培地に添加されるサプリメント（複数可）は、培養される細胞の特定の型に応じて変更される場合がある。概して、可能性のあるサプリメントの非網羅的なリストには、１つ以上のサイトカイン、１つ以上の成長因子、または他のタンパク質が含まれる。

具体的には、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－２が、本開示のリンパ球系分化培地に含まれてよい。一実施形態では、リンパ球系分化培地には、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－２のそれぞれが補充される。一実施形態では、リンパ球系分化培地には、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－２のうち１つ以上が補充される。ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－２のうち１つ以上を含むリンパ球系分化培地の実施形態において、かかるサイトカインは、約１～１０００ｎｇ／ｍＬ、または約１～１００ｎｇ／ｍＬ、または約５～５０ｎｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ存在し得る。小分子も含まれる場合、それらは通常低濃度で使用される。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストＣＨＩＲ９９０２１またはＴＧＦβ経路阻害剤ＳＢ４３１５４２などの小分子は、０．１ｎＭ～３０ｕＭの低濃度で使用されてよい。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－２のうち任意の１つ以上はリンパ球系分化培地に含まれていなくてもよいが、リンパ球系分化培地の効率が損なわれる可能性がある。

一実施形態では、中胚葉細胞から造血始原細胞を分化させる方法（造血始原細胞のリンパ球系始原細胞への次の分化を含む）は、Ｔ細胞成熟培地中でリンパ球系始原細胞を培養した後にＴ細胞を得ることをさらに含む場合がある。

一実施形態では、Ｔ細胞成熟培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－２のうち任意の１つ以上を含む場合がある。一実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－２のうち１つ、一部または全てがＴ細胞成熟培地に含まれていなくてもよいが、そのような培地の効率が損なわれる可能性がある。例えば、ＩＬ－１５は、Ｔ細胞成熟培地の効率に著しい影響を与えることなくＴ細胞成熟培地から除外されてよい。

一実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ダブルポジティブＴ細胞であり、ＣＤ３及びＴＣＲαβを発現する場合がある。一実施形態では、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ダブルポジティブＴ細胞は、ＣＤ８^＋シングルポジティブＴ細胞にさらに成熟する場合がある。

一実施形態では、中胚葉細胞から造血始原細胞を分化させる方法（造血始原細胞のリンパ球系始原細胞への次の分化を含む）は、ＮＫ細胞生成培地中でリンパ球系始原細胞を培養した後にＮＫ細胞を得ることをさらに含む場合がある。

一実施形態では、ＮＫ細胞生成培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－２のうち任意の１つ以上を含む場合がある。一実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－２のうち１つ、一部または全てがＮＫ細胞生成培地に含まれていなくてもよいが、そのような培地の効率が損なわれる可能性がある。例えば、ＩＬ－１５は、いくつかの実施形態においてはＮＫ細胞生成培地の重要な成分である。

一実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞である。一実施形態では、ＮＫ細胞は機能的である。一実施形態では、ＮＫ細胞はＩＦＮ－γを産生する。同一のまたは異なる実施形態では、ＮＫ細胞は細胞傷害性である。同一のまたは異なる実施形態では、ＮＫ細胞はＣＤ１０７、より具体的にはＣＤ１０７ａを発現する。

開示する、ＰＳＣを初期中胚葉細胞（例えば、前駆細胞）の集団に分化させる方法、ＰＳＣ由来の中胚葉前駆細胞を造血始原細胞に分化させる方法、ＰＳＣ由来の造血始原細胞をリンパ球系始原細胞に分化させる方法、及びＰＳＣ由来のリンパ球系始原細胞を種々のリンパ球系系統に分化させる方法に加えて、本明細書にて開示する種々の培地は、独立型形態に包含され得るか、または血清及び／または間質を含まない条件下であるかどうかに関わらず、ＰＳＣのリンパ球系始原細胞への、及びそれを超えた段階的分化のシステムに含まれ得る。

いくつかの実施形態では、全システムは、血清及び／または間質を含まない条件下で行われる。いくつかの実施形態では、システムの特定の態様のみが、血清及び／または間質を含まない条件下で行われる。例えば、前述の概説を限定することなく、ＰＳＣの初期中胚葉細胞の集団への分化、ＰＳＣ由来の中胚葉前駆細胞の造血始原細胞への分化、及びＰＳＣ由来の造血始原細胞のリンパ球系始原細胞への分化は、血清及び／または間質を含まない条件下で行われるが、さらなる下流段階は、行われる場合もあるし、行わない場合もある。逆に、初期段階のシステムは、血清及び／または間質を含まない条件下で行われる場合もあるし、行われない場合もあるが、次の段階は、血清及び／または間質を含まない条件下で行われる。

一実施形態では、このようなシステム（複数可）またはキット（複数可）は、ＰＳＣを初期中胚葉細胞の集団に分化させるための第１の培養システム；ＰＳＣ由来の中胚葉細胞を造血始原細胞に分化させるための第２の培養システム；ＰＳＣ由来の造血始原細胞をリンパ球系始原細胞の１つ以上の亜集団に分化させるための第３の培養システム；ＰＳＣ由来のリンパ球系始原細胞をＢ細胞に分化させるための第４の培養システム；ＰＳＣ由来のリンパ球系始原細胞をＴ細胞に分化させるための第５の培養システム；ＰＳＣ由来のリンパ球系始原細胞をＮＫ細胞に分化させるための第６の培養システム；コーティング基質；初期中胚葉細胞（例えば、前駆細胞）の集団をポジティブにまたはネガティブに濃縮するための第１のキット；造血始原細胞の集団をポジティブにまたはネガティブに濃縮するための第２のキット；リンパ球系始原細胞の集団をポジティブにまたはネガティブに濃縮するための第３のキット；Ｂ細胞の集団をポジティブにまたはネガティブに濃縮するための第４のキット；Ｔ細胞の集団をポジティブにまたはネガティブに濃縮するための第５のキット；及びＮＫ細胞の集団をポジティブにまたはネガティブに濃縮するための第６のキットのうち１つ、３つ、４つ、または５つの構成要素を含む場合がある。

以下の非限定的実施例は、本開示を例示するものである。

実施例１：ＰＳＣの維持
ヒトＰＳＣ（ｈＰＳＣ）を、ｍＴｅＳＲ（商標）１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴｅＳＲ（商標）－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはｍＴｅＳＲ（商標）Ｐｌｕｓ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中で、製造業者の推奨に従って６～８日間、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングしたプレート上に維持した。完全培地交換を毎日実施した。ＰＳＣコロニーを、ＰＳＣ株の維持培養中に、新たにコーティングしたＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）プレート上で凝集塊にして継代した。ＰＳＣを下流分化アッセイに使用した場合、単一細胞懸濁液を得るために、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造業者の推奨プロトコルに従ってコロニーを解離した。

実施例２：凝集体の形成
実施例１に従って単一細胞懸濁液を得ることに先立って、２４ウェルまたは６ウェルＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）４００プレート（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、製造業者の推奨に従って準備し、その際、マイクロウェルデバイス（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）への細胞の粘着を低減させるために、抗粘着洗浄液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてマイクロウェルデバイスをコーティングした。推奨されるインキュベーションの後に、抗粘着洗浄液を破棄し、各ウェルを、１５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む等量のＤＭＥＭ－Ｆ１２で１回すすいだ。

マイクロウェルデバイスを準備した後、実施例１に従って解離したｈＰＳＣを、誘導培地（例えば、ＥＢ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び１０μＭのＹ－２７６３２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）中に、マイクロウェルデバイスの１つ以上のウェルの中へ播種した。６ウェル方式のマイクロウェルデバイスを使用する場合の実施形態では、２．５ｍＬのＥＢ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍをマイクロウェルデバイスのウェルに添加した。次に、さらに２．５ｍＬの細胞懸濁液（約１．４×１０^６細胞／ｍＬ）含有ＥＢ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍを、２．５ｍＬのＥＢ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍを含有するウェルに添加し、さらにマイクロウェルデバイスを短時間遠心分離し、３７℃でインキュベートした。２４ウェル方式のマイクロウェルデバイスを使用する場合、その分、ウェル当たりの容量を２ｍＬ／ウェルに縮小する必要がある。マイクロウェルデバイスの各ウェルの最終細胞濃度は、２４ウェルプレートの約３×１０^５細胞／ｍｌもしくは６×１０^５細胞／ウェル、または６ウェルプレートの７×１０^５細胞／ｍＬもしくは３．５×１０^６細胞／ウェルにする必要がある。

実施例３：細胞数及び収量のフローサイトメトリー及び測定
本開示で概説する分化プロトコルの任意の段階で、サンプルを回収して、その表現型をフローサイトメトリーによって評価する場合がある。以下の一般的なプロトコルを、ＣＤ３４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＮＫ系統マーカー、例えばＣＤ５６、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６もしくはＫＩＲ、及びＴ系統マーカー、例えばＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβもしくはＣＤ３の測定に等しく適用する。

簡単に述べると、細胞サンプルを遠心分離によって回収し、適切に洗浄した。続いて、選択した抗原に対抗する蛍光体結合抗体で細胞サンプルを染色した。調製した細胞サンプルをＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。死細胞を、光散乱プロファイル及びＤＲＡＱ７染色によって除外した。

ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ２５０（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して、製造業者の推奨に従って総生細胞数を得た。細胞を必要に応じて希釈した後に、アクリジンオレンジ及びＤＡＰＩ（ＡＯ／ＤＡＰＩ）の混合物によって染色した。本混合物では、ＡＯは、細胞膜を標識し、ＤＡＰＩは、死／死滅細胞の核酸を標識し、これらを一緒に用いることで、サンプル中の生細胞と死細胞との写真による識別が可能になる。次にＮＣ２５０ソフトウエアによって、得られた画像を分析し、生細胞濃度を含む細胞数を記録した。投入細胞当たりの特定の細胞の収量を計算するために、総生存可能数に所与の細胞型の存在比率％を乗じた。例えば、投入ＣＤ３４^＋細胞当たりのＮＫ細胞の収量を計算するために、まず生細胞数に、フローサイトメトリーによって取得したＣＤ５６^＋の％を乗ずる。次に、この数を、投入細胞の数で除算して（投入ＣＤ３４^＋細胞の場合）、最終の値を得る。投入ＣＤ３４^＋細胞数を、１つのウェルで培養された総細胞に細胞分離後のＣＤ３４^＋細胞の存在比率を乗ずることによって得た。ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）のウェル当たりのＣＤ３４^＋細胞の収量を計算するために、投入ｈＰＳＣ当たりのＣＤ３４^＋細胞（細胞分離前の）の収量に、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）の１つのウェルに播種したｈＰＳＣの数（６ｗｐ ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）４００の３．５×１０^６／ウェル）を乗じた。

実施例４：凝集体の造血始原細胞への分化
実施例２に従って凝集体を形成した２日後に、凝集体を崩すことなく、マイクロウェルデバイスの各ウェル中の２．５ｍＬの培地を慎重に取り出して、破棄した。２．５ｍＬ容量の新鮮な誘導培地（例えば、ＥＢ Ｍｅｄｉｕｍ Ａ）（ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を、各ウェルに添加し、かつマイクロウェルデバイスを３７℃で再びインキュベートした。

中胚葉中間体（例えば、初期中胚葉細胞の集団）を形成した３日後に、凝集体を崩すことなく、マイクロウェルデバイスの各ウェル中の２．５ｍＬの培地を慎重に取り出して、破棄した。２．５ｍＬ容量の新鮮な第１の培地（例えば、ＥＢ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂ）（ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｂ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を、各ウェルに添加し、かつ３７℃でインキュベートして、中胚葉細胞を造血始原細胞に分化させた。

５日目に、凝集体をマイクロウェルデバイスの各ウェルから回収し、３７μｍ可逆性フィルタ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に通過させて、その表面上で凝集体を単離した。新鮮なチューブの上方でフィルタを反転させることによって新鮮なチューブに凝集体の濾液を堆積させ、メッシュと対向している２．５ｍＬ／ウェル（２４ウェル方式のマイクロウェルデバイスを使用した場合１ｍＬ／ウェル）の新鮮な第１の培地（例えば、ＥＢ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂ）に誘導した。このようにして得た凝集体を緩やかに再懸濁させた後に、総容量を非組織培養処理プレートに添加し、その後、３７℃でインキュベートした。７日目に、６ウェルプレートの各ウェルに新鮮なＥＢ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂを２．５ｍＬ（または２４ウェルプレートの１ｍＬ／ウェル）ずつ添加し、次に、３７℃でインキュベートした。１０日目に、凝集体を崩さないように注意を払いながら新鮮なＥＢ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂで半分培地交換を行い、続いて３７℃でさらに２日間インキュベートした。

ＢＭＰ、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦシグナル伝達のうち１つ以上のアゴニストが、ＰＳＣの初期中胚葉を介した造血始原細胞への分化の際に必要であると一般的に考えられているため（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ，２０１２；Ｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１６）、分化プロトコル（例えば、第１の培地）から、これらのアゴニストを単独でまたは組み合わせて除去することが、産出造血始原細胞に悪影響を及ばさないことは驚くべきことであった。実際に、分化のこの段階からＢＭＰ、ＦＧＦ、及び／またはＶＥＧＦを除外することにより、産出造血始原細胞を増加させることが可能であり（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ）、同時に、リンパ球系始原細胞の下流分化（図１Ｄ）及びそれを超えた培養中に汚染する接着細胞の数の低減（データは示さず）などの利益がもたらされる。

実施例５：造血始原細胞の濃縮
実施例４の凝集体を各ウェルから回収し、個々の１５ｍＬチューブへ移した。チューブを３００ｇで５～１０分間遠心分離した。上澄液を吸引し、１ｍＬのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ－２５００Ｕ／ｍＬ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（カタログ番号０７４１８）を、各チューブに添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。その後、３ｍＬのＴｒｙＰＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓを、各チューブに添加し、さらに２０分間インキュベートした。これらの解離条件により、他の従来の手法と比較して、ＣＤ３４^＋細胞の回収率が増加し、かつＣＤ３４^＋生細胞の収量が増加した（図２）。

インキュベーション後、各チューブにＤＭＥＭ／Ｆ１２を６ｍＬずつ添加し、３７μｍフィルタに通して濾過した。溶出液を、３００ｇ×で５～１０分間遠心分離し、上澄液を破棄した。ペレット化した細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＣＤ３４^＋濃縮プロトコルに供した。磁気分離の回数を４回から２回に減らした以外は、ＣＤ３４^＋濃縮に関する製造業者の推奨に従った。

Ｈ１、Ｈ９、ＷＬＳ－１Ｃ、ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６のＰＳＣ株は、ＣＤ３４^＋造血始原細胞に効率的に分化した。全てのＰＳＣ株にわたって、実施例３に従って計算したＣＤ３４^＋造血始原細胞の平均存在比率は、３１％～４２％の範囲であった（図３Ａ）。全てのＰＳＣ株にわたって、実施例３に従って計算したＣＤ３４^＋造血始原細胞の６ウェルＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレートのウェル当たりの平均収量は、３．３×１０^５～７．４×１０^５細胞の範囲であった（図３Ａ）。このようにして得られたＣＤ３４^＋造血始原細胞の濃縮前（図３Ｂ）及び濃縮後（図３Ｃ）の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。

実施例６：ＰＳＣ由来の造血始原細胞の多分化能の測定
３～１２日目まで、ＶＥＧＦを含有または非含有で、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ試薬を使用して（前述したように）、ｈＰＳＣを１２日間分化させた。産出細胞を回収し、解離し、かつＣＤ３４^＋細胞を（前述したように）磁気的に濃縮した。濃縮した細胞をウェル当たり１×１０^４細胞の密度で播種して、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）ＳＦ Ｈ４６３６（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で製造業者の指示に従って培養した。１２日後、ＳＴＥＭ（商標）視覚機器（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、画像及び数を製造業者の指示に従って取得した。図４Ａは、プレーティングした１×１０^４細胞当たりの総ＣＦＵ数を示しており、列挙する集団は、プールしたＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＧＥＭＭ及びＢＦＵ－Ｅを含む。Ｈ１細胞（ＥＳ）及びＷＬＳ－１Ｃ（ｉＰＳ）に関して、ＶＥＧＦを用いずに誘導されたＣＤ３４^＋造血始原細胞から得られたＣＦＵの数は、ＶＥＧＦを含有しているものと同等であった。

さらに、造血始原細胞のリンパ球系潜在能力（本明細書で前述したように分化する）を、限界希釈アッセイにて評価した。簡単に述べると、ＦＡＣＳにより選別したＣＤ３４^＋細胞（本明細書に記載されるよう分化させ、選別した細胞）を、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌ含有ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（どちらも、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってコーティングしたプレート上に、ウェル当たり１０、３０、１００、３００、１０００、３０００、及び５０００細胞と数を増加させて、播種した。各細胞数で１２個のレプリケートウェルを準備し、２００個以上のＣＤ７＋細胞を含有するウェルを陽性として記録した。Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｌｉｍｉｔｉｎｇ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙツールを使用して、これらの結果を用いて始原細胞存在比率を測定した。ＶＥＧＦの不在下で誘導したリンパ球系潜在能力を有する造血始原細胞の（造血分化段階中の）存在比率は、ＶＥＧＦを含む条件と比較して、Ｈ１（ＥＳ細胞）では、０．４％に対して２．０７％、１Ｃ（ｉＰＳ細胞）では、０．０４％に対して０．１１％と高かった（図４Ｂ）。

したがって、ＶＥＧＦの除去は、多分化能を有するＣＤ３４^＋細胞の生成に悪影響を及ぼすようには見えず、実際にはリンパ球系潜在能力を高める可能性がある。

実施例７：分化した造血始原細胞からのリンパ球系始原細胞の誘導
濃縮したＣＤ３４^＋細胞（実施例５に従って得られた）を使用した拡張した実験では、より多くのＰＳＣ細胞株で分化した細胞を、下流分化実験でテストした。濃縮したＣＤ３４^＋細胞を、ＳｔｅｍＳｐａｎ^（商標）Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ）を使用して、リンパ球系始原細胞に分化させた。細胞を播種する２時間前に、製造業者の推奨に従ってＰＢＳで１倍に希釈したＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、非組織培養処理培養器具をコーティングした。室温での２時間のインキュベーション後、コーティング材料を吸引し、ＰＢＳでウェルをすすいだ。一晩、２～８℃でプレートをインキュベートすることも可能である。

培養プレートの形式に応じて、実施例５の適切な数の濃縮したＣＤ３４^＋細胞を、適切な容量のＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の各ウェルに播種した（下記の表を参照されたい）。

３～４日の培養後、元の容量のＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに等しい追加容量を、各ウェルに添加した。さらに３～４日の培養後（及び必要に応じてその後の３～４日サイクル）、細胞を破壊しないように注意を払いながらＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍの半量培地交換を行った。

ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍへの濃縮したＣＤ３４^＋細胞の最初の播種から約１週間後、非組織培養処理培養器具を、前述したようにＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌでコーティングした。次に細胞を慎重に再懸濁し、プレートの底をこする、またはいずれの接着細胞も剥がすことがないように注意を払いながら新たにコーティングした培養器具に移した。次に、細胞を３７℃でさらに１週間インキュベートした。前述したように半分培地交換を３～４日ごとに行った。

Ｈ１、Ｈ９、ＷＬＳ－１Ｃ、ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６のＰＳＣ株は、ＣＤ３４^＋造血始原細胞中間体を介して、ＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞に効率的に分化した。全てのＰＳＣ株にわたって、実施例３に従って計算したＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞の平均存在比率は、３７％～５７％の範囲であった（図５Ａ）。全てのＰＳＣ株にわたって、実施例３に従って計算した投入ＣＤ３４^＋造血始原細胞当たりのＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞の平均収量は、１１～２２細胞の範囲であった（図５Ａ）。このようにして得られたＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを、図５Ｂに示す。

実施例８：造血始原細胞分化及び下流リンパ球系始原細胞に対する培養期間の変化の影響
実施例４の実験を、１０日間の分化期間で行った。これには、初期中胚葉細胞の集団を形成する最初の３日間の期間と、それに続く造血始原細胞を形成する後続の７日間の期間が含まれた。前述の１０日間のプロトコルを、後続の７日間を９日間に延長させたより長い１２日間のプロトコルと比較して一連の実験を行った。

テストした３つのＰＳＣ株中２つ（１Ｃ及びＨ１）で、期間が長いほど、ＣＤ３４^＋造血始原細胞の６ウェルＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）４００プレートのウェル当たりの存在比率及び収量（図６Ａ）だけではなく、実施例７に従って生成したＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞の存在比率及び収量により測定した際の下流リンパ球系潜在能力（図６Ｂ）も改善した。

実施例９：リンパ球系始原細胞からのＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の誘導
このＴ細胞分化プロトコルの開始の２時間前に、非組織培養処理培養器具を、実施例７に記載されているように１倍のＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌでコーティングした。

実施例７のＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞を、０．５～１×１０^６細胞／ｍＬで、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ）中の新たにコーティングした培養器具に播種し、３７℃で２週間培養した。最初の３～４日の期間後に、元の容量のＳｔｅｍＳｐａｎ（商標） Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに等しい追加容量を各ウェルに添加した。その後３～４日ごとに、細胞を破壊しないように注意を払いながら半量培地交換を行った。

２週間の培養期間後、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞を回収し、基本的に、実施例３に記載したようにフローサイトメトリーによって分析した。図７Ａは、実施例２～５、実施例７及び本実施例９に従って、Ｈ１、Ｈ９、ＷＬＳ－１Ｃ、ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６のＰＳＣ株から誘導させたＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりの存在比率及び収量を示している。テストした全てのＰＳＣ株にわたって、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の平均存在比率は、２４％～５８％の範囲であった。テストした全てのＰＳＣ株にわたって、投入ＣＤ３４^＋細胞当たりのＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の平均収量は、７～１２０の範囲であった。図７Ｂは、各ＰＳＣ株から誘導させたＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中で比較したＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋細胞の存在比率を示している。全てのＰＳＣ株にわたって、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋細胞の中で比較したＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋細胞の平均存在比率は、９％～３８％の範囲であった。Ｈ１由来のＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞（図７Ｃ）、及びＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞に基づいてゲーティングしたＨ１由来のＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋細胞（図７Ｄ）の、ＣＤ４及びＣＤ８の発現を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す。

ＦＡＣＳが利用可能な場合、ＦＳＣとＳＳＣとの組み合わせ、及びＤＲＡＱ７または７－ＡＡＤなどの生死判定用色素を使用した生細胞の選別後に、ＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞を播種することにより、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりの存在比率及び収量が増加した。図８Ａは、実施例２～５、実施例７、及び本実施例９に従って、Ｈ１、ＷＬＳ－１Ｃ及びＨ９のＰＳＣ株から誘導させたＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりの存在比率及び収量に基づく選別した生細胞またはＣＤ７^＋細胞の分化の効果を示している。実施例７の未選別の細胞の播種と比較して、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりのより高い存在比率及び収量が、播種した生細胞及びＣＤ７^＋細胞を使用したＨ１及びＷＬＳ－１Ｃで観察された。

新たにコーティングした培養器具に播種するＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞の数を変えることで、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりの存在比率及び収量が増加した。図８Ｂは、実施例２～５、及び実施例７に従って、Ｈ１、ＷＬＳ－１Ｃ及びＨ９のＰＳＣ株から誘導させたＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりの存在比率及び収量に基づいて、播種するＣＤ５^＋ＣＤ７^＋細胞の数を増加させた場合の効果を示している。ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりのより高い存在比率及び収量が、播種するＣＤ５^＋ＣＤ７^＋細胞の数を増やしたＨ１及びＷＬＳ－１Ｃで観察された。

実施例１０：ダブルポジティブＴ細胞からのＣＤ４^－ＣＤ８^＋ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋シングルポジティブＴ細胞の誘導
このＴ細胞分化プロトコルの開始の２時間前に、非組織培養処理培養器具を、実施例７に記載されているように１倍のＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌでコーティングした。

実施例９のＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、１×１０^６細胞／ｍＬで、推奨される濃度の０．５倍（すなわち、１２．５ｕｇ／ｍＬ）のＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む、ＣＤ８ ＳＰ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び約１０ｎｇ／ｍＬのＨｕｍａｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩＬ－１５（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ）中の新たにコーティングした培養器具に播種した。細胞を、３７℃及び５％ＣＯ_２で３～４日間培養した。３～４日後、ウェルに新鮮なＣＤ８ ＳＰ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍを添加したが、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞活性化剤は含めず、３７℃及び５％ＣＯ_２でさらに３～４日間再度インキュベートした。

さらなる３～４日間のインキュベーション後、シングルポジティブＣＤ８^＋Ｔ細胞を回収し、基本的に、実施例３に記載したようにフローサイトメトリーによって分析した。図９Ａは、ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＤ４^－ＣＤ８^＋シングルポジティブＴ細胞が、Ｈ１由来、Ｈ９由来、及びＷＬＳ－１Ｃ由来のＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞（実施例９に従って生成される）から生成され得ることを示している。テストした全てのＰＳＣ株にわたって、ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＤ４^－ＣＤ８^＋シングルポジティブＴ細胞の平均存在比率は、４％～７％の範囲であった。図９Ｂ～Ｅは、さらに、ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＤ４^－ＣＤ８^＋シングルポジティブＴ細胞が、より未熟な細胞を示すＣＤ８ααではなくＣＤ８αβヘテロ二量体、ならびに成熟ナイーブ表現型を示す場合があるＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ２７マーカーを発現することを示している。

実施例１１：リンパ球系始原細胞からのＮＫ細胞の誘導
実施例７のＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞を、１×１０^５細胞／ｍＬで、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ）中のコーティングしていない培養器具に播種し、３７℃で２週間培養した。最初の３～４日の期間後に、元の容量のＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに等しい追加容量を各ウェルに添加した。その後３～４日ごとに、細胞を破壊しないように注意を払いながら半量培地交換を行った。

２週間の培養期間後、ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を回収し、基本的に、実施例３に記載したようにフローサイトメトリーによって分析した。図１０Ａは、実施例２～５、実施例７及び本実施例１１に従って、Ｈ１、Ｈ９、ＷＬＳ－１Ｃ、ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６のＰＳＣ株から誘導させたＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の投入ＣＤ３４^＋細胞当たりの存在比率及び収量を示している。テストした全てのＰＳＣ株にわたって、ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の平均存在比率は、８１％～９５％の範囲であった。テストした全てのＰＳＣ株にわたって、投入ＣＤ３４^＋細胞当たりのＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の平均収量は、１１２～３３２の範囲であった。ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１のＰＳＣについて、種々のＮＫ細胞マーカーの発現を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す（図１０Ｂ～Ｈ）。

ＰＳＣ由来のＮＫ細胞が機能的に活性であるかどうかを判断するために、それらを、Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（ＣＡＭ）標識Ｋ５６２細胞に対する細胞毒性作用アッセイでテストした。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した末梢血（ＰＢ）ＮＫ細胞、及びＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した単核細胞を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。テスト及び対照細胞を、Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（ＣＡＭ）標識Ｋ５６２細胞と共に、２．５：１のエフェクター（ＮＫ）対標的細胞（Ｋ５６２）の比率で４時間共培養した。共培養後、上澄溶液のサンプルを収集し、溶解した細胞から放出した蛍光を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（商標）マイクロプレートリーダーを使用して測定した。特異的溶解の％を、次式：（テスト放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）＊１００％を使用して計算した。図１１Ａは、実施例２～５、実施例７、及び本実施例１１に記載するような種々のＰＳＣ株から誘導させたＮＫ細胞が、ＰＢ ＮＫ細胞に匹敵するＫ５６２細胞殺傷能力を有することを示す。

図１１Ａに示すようなＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ細胞毒性作用アッセイの結果を確認するために、１：１のエフェクター：非標識Ｋ５６２標的細胞の標的の比率で、ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイを実施して、刺激（前述したような）により脱顆粒するＮＫ細胞の能力を実証した。ＣＤ１０７ａは、リソソーム関連膜タンパク質であり、ＮＫ細胞が刺激されて脱顆粒すると、細胞表面に露出する。陰性対照として、非活性のＨ１由来のＮＫ細胞を、モネンシン、ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）、及び抗ＣＤ１０７ａ蛍光性抗体に４時間曝した。ただし、Ｋ５６２細胞との共培養は行わなかった（図１１Ｂ）。モネンシン、ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）、及び抗ＣＤ１０７ａ蛍光性抗体の存在下で、１：１のエフェクター（ＮＫ細胞）対標的（Ｋ５６２）細胞の比率で、Ｋ５６２細胞と４時間共培養することによって、Ｈ１細胞から誘導させたＮＫ細胞、及びＰＢ ＮＫ細胞を活性させた（それぞれ、図１１Ｃ及び１１Ｄ）。４時間のインキュベーション後、細胞を単離し、固定し、浸透させ、生存能力、ＣＤ５６、ＣＤ１０７ａ、及びＩＦＮ－γについて染色した。これらのマーカーの発現を、基本的に、実施例３に記載したようにフローサイトメトリーを使用して評価した。非活性のＨ１由来のＣＤ５６^＋ＮＫ細胞とは対照的に、活性したＨ１由来のＣＤ５６^＋ＮＫ細胞は、活性したＰＢ ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞と同等の脱顆粒及び細胞溶解活性が可能である。これらの結果を、ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６のＰＳＣ株に対して拡張した（図１１Ｅ及び１１Ｆ）。

実施例１２：下流分化に悪影響を与えることなく種々の培養培地でＰＳＣを維持することができる
種々のＰＳＣ株を、実施例１に記載したような種々のＰＳＣ維持培地に維持した。実施例２～５、及び実施例７で概説したように、ＰＳＣを分化させて、分析した。図１２は、ｍＴｅＳＲ（商標）１、ＴｅＳＲ－Ｅ８及びｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓのそれぞれが、下流分化に適合性があることを示している。

図１２Ａは、誘導培地それに続く第１の培地でＨ１及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６のＰＳＣ株から誘導させたＣＤ３４^＋造血始原細胞の６ウェルＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）マイクロウェルデバイスのウェル当たりの収量を示している。ＴｅＳＲ－Ｅ８またはｍＴｅＳＲ１で維持したＰＳＣを使用した場合、Ｈ１由来及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６由来のＣＤ３４^＋造血始原細胞の平均収量は同等であった。図１２Ｂは、Ｈ１のＰＳＣ株から誘導させたＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞の投入ＣＤ３４^＋造血始原細胞当たりの存在比率及び収量を示している。ＴｅＳＲ－Ｅ８維持及びｍＴｅＳＲ１維持のＰＳＣの両方は、ＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞の同等の存在比率及び収量をもたらした。

図１２Ｃは、誘導培地それに続く第１の培地でＷＬＳ－１Ｃ及びＨ９のＰＳＣ株から誘導させたＣＤ３４^＋造血始原細胞の６ウェルＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）マイクロウェルデバイスのウェル当たりの収量を示している。ｍＴｅＳＲ ＰｌｕｓまたはｍＴｅＳＲ１で維持したＰＳＣを使用した場合、ＷＬＳ－１Ｃ由来及びＨ９由来のＣＤ３４^＋造血始原細胞の平均収量は同等であった。図１２Ｄは、ＷＬＳ－１Ｃ及びＨ９のＰＳＣ株から誘導させたＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞の投入ＣＤ３４^＋造血始原細胞当たりの存在比率及び収量を示している。ｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ維持及びｍＴｅＳＲ１維持のＰＳＣの両方は、ＣＤ５^＋ＣＤ７^＋リンパ球系始原細胞の同等の存在比率及び収量をもたらした。

本開示は、現在好ましい例であると考えられるものを参照して説明してきたが、本開示は開示する例に限定されないことを理解すべきである。それとは反対に、本開示は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれる種々の変更及び同等の構成を包括することを目的としている。

全ての出版物、特許、及び特許出願は、各個別出版物、特許、または特許出願が、その全体で参照することにより組み込まれるように明確にかつ個別に示された場合と同一の程度に、それらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。

Claims (33)

1. 造血始原細胞を分化させる方法であって、第１の培地中で初期中胚葉細胞の集団を培養することを含み、前記第１の培地は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうち１つ以上が補充された基礎培地を含み、かつＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達のアゴニストからなる群から選択される外因的に添加されるアゴニストの任意の組み合わせが除外されている、前記方法。
2. 前記ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、骨形成タンパク質であり、場合により、前記骨形成タンパク質は、ＢＭＰ４である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＦＧＦシグナル伝達のアゴニストは、繊維芽細胞成長因子であり、場合により、前記繊維芽細胞成長因子は、ＦＧＦ２である、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＶＥＧＦシグナル伝達のアゴニストは、血管内皮成長因子である、請求項１に記載の方法。
5. 前記第１の培地は、血清を含まない、請求項１に記載の方法。
6. 外因的に添加される間質細胞及び／またはフィーダー細胞の不在下で前記初期中胚葉細胞の集団を培養することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記第１の培地における前記初期中胚葉細胞の集団の培養は、３～１５日間行われる、請求項１に記載の方法。
8. 前記造血始原細胞は、ＣＤ３４^＋である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記造血始原細胞は、骨髄系、赤血球系、及びリンパ球系潜在能力を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 多能性幹細胞（ＰＳＣ）の集団から前記初期中胚葉細胞の集団を誘導することをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 誘導培地中で前記ＰＳＣの集団を培養することをさらに含み、前記誘導培地は、ＰＳＣ由来の初期中胚葉細胞の分化した集団を得るために、前記ＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト、前記ＦＧＦシグナル伝達のアゴニスト、及び前記ＶＥＧＦシグナル伝達のアゴニストのうち１つ以上が補充された第２の基礎培地を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、骨形成タンパク質であり、場合により、前記骨形成タンパク質は、ＢＭＰ４である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ＦＧＦシグナル伝達のアゴニストは、繊維芽細胞成長因子であり、場合により、前記繊維芽細胞成長因子は、ＦＧＦ２である、請求項１１に記載の方法。
14. 前記ＶＥＧＦシグナル伝達のアゴニストは、血管内皮成長因子である、請求項１１に記載の方法。
15. 前記誘導培地は、血清を含まない、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 外因的に添加される間質細胞及び／またはフィーダー細胞の不在下で前記ＰＳＣを培養することをさらに含む、請求項１１～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記誘導培地における前記ＰＳＣの培養は、１～７日間行われる、請求項１１～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記誘導培地における前記ＰＳＣの培養の前に、前記ＰＳＣを凝集体に形成することをさらに含む、請求項１１～１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記誘導培地中で前記ＰＳＣを凝集体に形成することをさらに含む、請求項１１～１７のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記凝集体は、マイクロウェルデバイス中で形成される、請求項１８または１９に記載の方法。
21. 血清を含まない条件下で、及び／または外因的に添加される間質細胞及び／またはフィーダー細胞の不在下で、リンパ球系分化培地で前記分化した造血始原細胞を培養した後に、リンパ球系始原細胞を得ることをさらに含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記リンパ球系始原細胞は、多系統潜在能力を有する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記リンパ球系始原細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞潜在能力を有する、請求項２２に記載の方法。
24. 前記Ｔ細胞及び前記ＮＫ細胞は、機能的である、請求項２３に記載の方法。
25. 初期中胚葉細胞の集団から造血始原細胞を分化させるための培地であって、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうち１つ以上が補充された基礎培地を含み、かつＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達のアゴニストからなるリストから選択される外因的に添加されるアゴニストの任意の組み合わせが除外されている、前記培地。
26. 前記初期中胚葉細胞の集団は、多能性幹細胞から誘導される、請求項２５に記載の培地。
27. 前記多能性幹細胞は、哺乳動物のものである、請求項２６に記載の培地。
28. 前記培地は、血清を含まない、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の培地。
29. 前記培地は、間質細胞及び／またはフィーダー細胞ワークフローにおいて効果的である、請求項２５～２８のいずれか１項に記載の培地。
30. 前記繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニストは、繊維芽細胞成長因子であり、場合によってＦＧＦ２である、請求項２５～２９のいずれか１項に記載の培地。
31. 前記ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストは、骨形成タンパク質であり、場合によってＢＭＰ４である、請求項２５～３０のいずれか１項に記載の培地。
32. 前記血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達のアゴニストは、ＶＥＧＦである、請求項２５～３１のいずれか１項に記載の培地。
33. 前記造血始原細胞は、リンパ球系、骨髄系、及び赤血球系潜在能力を有する、請求項２５～３２のいずれか１項に記載の培地。