JP2023534790A - オキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本発明は、ファインケミカルの生産のための発酵プロセスの分野にあり、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、およびオキシドレダクターゼを使用する発酵プロセスを包含する。【選択図】図１

Description

本発明は、ファインケミカルの生産のための発酵の分野にあり、オキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよびオキシドレダクターゼを使用する発酵プロセスを包含する。

パーキンソン病に罹患している患者は、振せん、硬直または運動緩徐のような症状を経験し、これらは、大脳基底核における細胞死に起因する低レベルのドーパミンによって引き起こされる。ドーパミンは血液脳関門を通過することができないので、その前駆体分子であるＬ－ＤＯＰＡ（Ｌ－ジヒドロキシフェニルアラニン）が、患者の症状を軽減するための薬剤として使用される。１９７７年に最初に発売されて以来、Ｌ－ＤＯＰＡ（レボドパ）は、６００ＭＴの世界的市場規模で、最も有望なパーキンソン治療へと進化した。

既存の生産プロセスは、化学合成、特に不斉水素化または水素化とキラル分割に基づく。これは確立された製造プロセスであるが、変換率および全体的な効率が低い。あるいは、Ｌ－ＤＯＰＡは、酵素的変換、すなわちピルビン酸とカテコールとの酵素的カップリングによって生成される。しかしながら、この酵素変換プロセスには、原料コストが高いという難点がある。

大腸菌（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼＨｐａＢおよび同族の４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼレダクターゼＨｐａＣを使用した発酵プロセスが文献に記載されており、変換率およびエナンチオ選択性がより高く、より経済的なプロセスであるため、有利であり得る。

経済的に魅力的なプロセスを達成するためには、一方でチロシン生産性を最適化し、他方でＨｐａＢ活性の増加によるＬ－チロシンのＬ－ＤＯＰＡへの変換を最適化することが重要である。

４－ヒドロキシフェニル酢酸－モノオキシゲナーゼ酵素の広い基質スペクトルはＰｒｉｅｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３に記載されており、非天然基質のＬ－チロシンを用いた酵素活性は、天然基質の４－ＨＰＡ（４－ヒドロキシフェニル酢酸）を用いた酵素活性のわずか５％であることが示された。したがって、酵素活性を高めるための有望な選択肢として酵素モデリングが考えられた。

Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１９）９：７０８７／ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１９－４３５７７－ｗ，ｐ．１－１１は、大腸菌由来のフラビン依存性ヒドロキシラーゼ（ＨｐａＢ）の触媒汎用性に関する構造的洞察を記載している。Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．は、大腸菌由来の４－ヒドロキシフェニル酢酸３－ヒドロキシラーゼ（ＥｃＨｐａＢ）が広範囲のフェノール化合物の効率的なオルトヒドロキシル化の能力を有し、広範な化学酵素用途の大きな可能性を示すことに言及している。その触媒汎用性の構造的および機構的基礎を理解するために、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．は、Ｘ線結晶構造解析によってＥｃＨｐａＢの結晶構造を解明し、活性部位を覆う独特のループ構造を明らかにした。Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．はさらに、基質特異性および触媒活性におけるその役割を調べるために、このループの突然変異誘発試験を実施した。その結果は、ループが大きな可塑性および広範な突然変異誘発に対する強い耐性を有することを示しただけでなく、活性部位への基質の進入および安定な結合を可能にする柔軟なループが酵素の触媒汎用性にとって重要な因子であり得ることも示唆した。様々なＥｃＨｐａＢ変異体のループ配列および構造が報告されている。しかしながら、Ｌ－ＤＯＰＡに対する選択性の増強は記載されていない。

Ｆｏｒｄｊｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ（２０１９）１８：７４／ｈｔｔｐｓ／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１２９３４－０１９－１１２２－０，ｐ．１－１０は、Ｄ－グルコースからのＬ－ＤＯＰＡのデノボ産生のための大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の代謝操作を記載する。ｇａｌＰおよびｇｌｋの過剰発現を通して炭素流を誘導しながら、ｔｙｒＲ、ｐｔｓＧ、ｃｒｒ、ｐｈｅＡおよびｐｙｋＦを欠失させることによって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を操作した。Ｅ４ＰおよびＰＥＰの蓄積を増強するために、ＴｋｔＡおよびｐｐｓＡも過剰発現させた。部位指定突然変異誘発をＨｐａＢに適用して、その活性を最適化した。３つの変異体、Ｇ８８３Ｒ、Ｇ８８３ＡおよびＬ１２３１Ｍは、野生型ｈｐａＢと比較して改善された活性を有すると同定され、それぞれＬ－ＤＯＰＡ産生の３．０３倍、２．９倍および２．５６倍の増加を示した。ＬＰ－８株の使用により、振とうフラスコおよび５Ｌバイオリアクタにおいてそれぞれ６９１．２４ｍｇ／Ｌおよび２５．５３ｇ／ＬのＬ－ＤＯＰＡの産生がもたらされた。

欧州特許出願公開第３１５０７１２Ａ１号（Ｓｙｍｒｉｓｅ）は、３，４－ジヒドロキシフェニル化合物およびそのメチル化変異体を提供するための生物工学的方法を記載する。欧州特許出願公開第３１５０７１２Ａ１号は、それにより、４－ヒドロキシフェニル化合物をヒドロキシル化して３，４－ジヒドロキシフェニル化合物を生成するためのプロトタイプ酵素４－ヒドロキシフェニル酢酸３－ヒドロキシラーゼ（４ＨＰＡ３Ｈ）の活性部位結合ポケットの合理的設計によって得られる遺伝子改変された酵素、ならびに前記酵素またはその触媒活性断片を使用するインビボおよびインビトロ方法を含む生物工学的方法に関する。

中国特許出願公開第１０７５４１４８３Ａ号（Ｔｉａｎｊｉｎ）は、レボドパの組換え産生のための大腸菌株、その構築方法および用途を記載する。中国特許出願公開第１０７５４１４８３Ａ号は、それにより、大腸菌組換え株Ｔ００２を用いてＬ－ＤＯＰＡを産生するための方法を提供しており、この方法では、Ｌ－ＤＯＰＡを産生することができる３－脱水素酵素、シキミ酸デヒドロゲナーゼの発現を増強するためにａｒｏＥ遺伝子の上方制御が実施される。

欧州特許出願公開第３１５０７１２Ａ１号明細書 中国特許出願公開第１０７５４１４８３Ａ号明細書

Ｐｒｉｅｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１９）９：７０８７／ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１９－４３５７７－ｗ，ｐ．１－１１ Ｆｏｒｄｊｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ（２０１９）１８：７４／ｈｔｔｐｓ／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１２９３４－０１９－１１２２－０，ｐ．１－１０

最適化されたチロシン産生およびＬ－チロシンのＬ－ＤＯＰＡへの高い変換率を有する、Ｌ－ＤＯＰＡの生産のための経済的に魅力的な発酵プロセスを提供することが本発明の目的であった。細胞内および／または媒質中での生成物の改善された収率またはより高い最終濃度を有するＬ－ＤＯＰＡの生産プロセスが必要とされている。このプロセスは、Ｌ－ＤＯＰＡの効率的な生産を確実にするために拡張可能である必要がある。
本発明のさらなる目的は、Ｌ－ＤＯＰＡを大量に産生することができるように改変された細胞を提供することである。

本発明の発明人は、驚くべきことに、オキシドレダクターゼＨｐａＢの突然変異がＬ－ＤＯＰＡの産生の増加およびＬ－チロシンのＬ－ＤＯＰＡへのより高い変換率をもたらすことを確証した。

本発明は、配列番号１（ジオバチルス属種（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＡ９）、配列番号３（サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、配列番号４（ストレプトミセス・グロビスポラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ））、配列番号５（クロストリジウム・アミノブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ））、配列ＩＤ：６（バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒａｉ ｃｅｐａｃｉａ））、配列番号８（オスキラトリア属種（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．）ＰＣＣ ６５０６）、配列番号９（パラバークホルデリア・フィマツム（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｈｙｍａｔｕｍ））のアミノ酸配列と少なくとも≧５０％同一であり、

配列番号１の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４位の１つ以上、または配列番号３、配列番号４、配列ＩＤ：５、配列番号６、配列番号８、配列番号９のアミノ酸配列の対応する位置におけるアミノ酸交換を特徴とし、アミノ酸交換がＡ２１０ＳまたはＳ２１２Ａではない、
オキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに関する。

本発明によれば、配列番号１の２１０位または配列番号３、配列番号４、配列ＩＤ：５、配列番号６、配列番号８、配列番号９のアミノ酸配列の対応する位置におけるアラニンからセリンへのアミノ交換、および配列番号１の２１２位または配列番号３、配列番号４、配列ＩＤ：５、配列番号６、配列番号８、配列番号９のアミノ酸配列の対応する位置におけるセリンからアラニンへのアミノ交換は除外され、本発明の一部ではない。

代替形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１１、２１３、２１４位の１つ以上、または配列番号３、配列番号４、配列ＩＤ：５、配列番号６、配列番号８、配列番号９のアミノ酸配列の対応する位置にアミノ酸交換を有する。
好ましい実施形態では、オキシドレダクターゼは、配列番号２の４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼではない。
好ましい実施形態では、アミノ酸交換は、Ｌ－ＤＯＰＡの産生の増加および／またはＬ－チロシンのＬ－ＤＯＰＡへのより高い変換率をもたらす。
好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列によってコードされるオキシドレダクターゼは、４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼである。

本発明によれば、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列ＩＤ：５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０によってコードされる酵素は、４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼである。

ジオバチルス属種ＰＡ－９由来のホモログを合理的酵素設計の出発点として選択し、一連の突然変異を標準化された全細胞スクリーニングシステムで試験した。スクリーニングシステムで得られた有望な結果を１Ｌ発酵スケールに移すことにより、これらの結果が確認され、大腸菌およびジオバチルス属種ＰＡ－９野生型遺伝子を発現する参照株と比較して、変異酵素の性能の有意な増加が示された。

「配列番号１の対応する位置」または「アミノ酸配列の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１３、２１４位に相当する位置」という表現は、コードされたポリペプチドのＮ末端領域（配列番号１の２０２～２１４位に基づく）のアミノ酸をコードするコドンの挿入または欠失によって、挿入の場合は位置の記述および長さの記述が形式的に１単位増加しているか、または欠失の場合は１単位減少しているという事実を意味すると解釈される。同様に、コードされたポリペプチドのＣ末端領域（２０２～２１４位に基づく）のアミノ酸をコードするコドンの挿入または欠失によって、長さの記述が、挿入の場合は形式的に１単位増加しているか、または欠失の場合は１単位減少している。そのような相当する位置は、例えばＣｌｕｓｔａｌ Ｗ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２，４６３７－４６８０（１９９４））またはＭＡＦＦＴ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ（Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ２００５；１６（１），２２－３３）を使用して、「アラインメント」の形態でのアミノ酸配列の比較によって容易に同定され得る。「配列番号１の対応する位置」という表現は、異なる種からの異なる配列番号（配列番号３～配列番号１０など）に言及する場合、比較する結晶構造内の相同な位置を指す。そのような相同な位置はまた、上記のような「アラインメント」の形態でのアミノ酸配列の比較によって、または構造予測に基づいて同定され得る。

この場合、配列番号１の位置２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４は、様々な配列における以下の位置に対応する：
配列番号３の１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２００位、２０１位、２０２位、２０３位、２０４位、２０５位；
配列番号４の２１２位、２１３位、２１４位、２１５位、２１６位、２１７位、２１８位、２１９位、２２０位、２２１位、２２２位；
配列番号５の２０２位、２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位；
配列番号６の２０２位、２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位；
配列番号７の２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、２１３位；
配列番号８の２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、２１３位、２１４位、２１５位、２１６位、２１７位；
配列番号９の１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２００位、２０１位；
配列番号１０の２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、２１３位、２１４位、２１５位、２１６位、２１７位。

本発明のオキシドレダクターゼに関して、ホモログＨｐａＢ酵素配列をＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａと整列させ、第２の工程で、ＨｐａＢ配列の二次構造を予測し、二次構造予測を使用して配列を再整列させた。

そのような挿入および欠失は、酵素活性に実質的に影響を及ぼさない。「実質的に影響を及ぼさない」とは、前記変異体の酵素活性が、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性と最大１０％、最大７．５％、最大５％、最大２．５％、または最大１％異なることを意味する。

好ましくは、配列番号１（ジオバチルス属種ＰＡ９）、配列番号３（サーマス・サーモフィルス）、配列番号４（ストレプトミセス・グロビスポラス）、配列番号５（クロストリジウム・アミノブチリカム）、配列ＩＤ：６（バークホルデリア・セパシア）、配列番号７（カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ））、配列番号８（オスキラトリア属種ＰＣＣ ６５０６）、配列番号９（パラバークホルデリア・フィマツム）のアミノ酸配列と少なくとも≧６５％同一であり、配列番号１の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４位の１つ以上、または配列番号３、配列番号４、配列ＩＤ：５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９のアミノ酸配列の対応する位置におけるアミノ酸交換を特徴とするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、オキシドレダクターゼをコードする。

より好ましくは、配列番号１（ジオバチルス属種ＰＡ９）、配列番号３（サーマス・サーモフィルス）、配列番号４（ストレプトミセス・グロビスポラス）、配列番号５（クロストリジウム・アミノブチリカム）、配列ＩＤ：６（バークホルデリア・セパシア）、配列番号７（カプリアビダス・ネカトール）、配列番号８（オスキラトリア属種ＰＣＣ ６５０６）、配列番号９（パラバークホルデリア・フィマツム）、配列番号１０（ラルストニア・ピッケティ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ））のアミノ酸配列と少なくとも≧９０％同一であり、
配列番号１の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４位の１つ以上、または配列番号３、配列番号４、配列ＩＤ：５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０のアミノ酸配列の対応する位置におけるアミノ酸交換を特徴とするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、オキシドレダクターゼをコードする。
・２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４位の１つまたは複数でアミノ酸交換を有する配列番号１（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＰＡ９）；
・１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５位の１つまたは複数でアミノ酸交換を有する配列番号３（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）； または配列番号21;
・２１２位、２１３位、２１４位、２１５位、２１６位、２１７位、２１８位、２１９位、２２０位、２２１位、２２２位のうちの１つ以上でアミノ酸交換を有する配列番号４（ストレプトミセス・グロビスポラス）； または配列番号22;
・２０２位、２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位の１つ以上でアミノ酸交換を有する配列番号５（クロストリジウム・アミノブチリカム）； または配列番号23;
・２０２位、２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位のうちの１つ以上でアミノ酸交換を有する配列番号６（バークホルデライ・セパシア）； または配列番号24;
・２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、２１３位のうちの１つ以上でアミノ酸交換を有する配列番号７（クプリアビダス・ネケーター）； または配列番号25;
・２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、２１３位、２１４位、２１５位、２１６位、２１７位のうちの１つ以上でアミノ酸交換を有する配列番号８（オシラトリア種ＰＣＣ ６５０６）； または配列番号26;
・１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２００位、２０１位のうちの１つ以上でアミノ酸交換を有する配列番号９（パラバークホルデリア・フィマタム）； または配列番号27;
・２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６位の１つまたは複数でアミノ酸交換を有する配列番号１０（ラルストニア・ピケッティ）、 ２１７または配列番号２８。
異なる配列におけるこれらの位置は、本発明による「アミノ酸配列の対応する位置」が意味するものである。

配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％または１００％、好ましくは≧９７％、特に好ましくは≧９８％、非常に特に好ましくは≧９９％、極めて好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、オキシドレダクターゼをコードし、ここで、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４は、２０７位またはアミノ酸配列の対応する位置に、Ｌ－バリン以外のタンパク質構成アミノ酸を有する。

ポリヌクレオチドは、好ましくは、ジオバチルス属の微生物由来の酵素４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする複製可能なヌクレオチド配列である配列であり、それによってコードされるタンパク質配列は、配列番号１の２０７位に対応する位置にＬ－バリン以外のタンパク質構成アミノ酸を含む。

本発明の有利な形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、２０７位または対応する位置に、トレオニン、ロイシン、グルタミンおよびグリシンからなる群より選択されるアミノ酸を有する。
ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質配列が、
－２０６位もしくはアミノ酸配列の対応する位置にＬ－トレオニン以外のタンパク質構成アミノ酸、好ましくはＬ－メチオニンもしくはＬ－アラニンを含むか；または
－２０８位もしくはアミノ酸配列の対応する位置にＬ－リジン以外のタンパク質構成アミノ酸、好ましくはＬ－アルギニンを含む
場合が特に好ましい。

好ましい形態では、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％または１００％、好ましくは≧９７％、特に好ましくは≧９８％、非常に特に好ましくは≧９９％、極めて好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、オキシドレダクターゼをコードする。

それに対応して、本発明はまた、そのような配列を含み、１つ以上の挿入または欠失を含む配列番号１～２０および配列番号２９～３２のポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドおよび核酸分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、アミノ酸の最大５個、最大４個、最大３個または最大２個の挿入または欠失を含む。
本発明はさらに、本発明によるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。

本発明は、好ましくはさらに、本発明によるポリヌクレオチド、ベクターおよび／またはポリペプチドを含むエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）またはコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の微生物であって、４－ヒドロキシフェニル酢酸モノオキシゲナーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列が、好ましくは過剰発現された形態で存在する微生物に関する。

好ましくは、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、２０７位または対応する位置に、トレオニン、ロイシン、グルタミンおよびグリシンからなる群より選択されるアミノ酸を示し得る。

それによってコードされるタンパク質配列は、２０６位またはアミノ酸配列の対応する位置に、Ｌ－トレオニン以外のタンパク質構成アミノ酸、好ましくはＬ－メチオニンを含み得る。

それによってコードされるタンパク質配列は、２０８位またはアミノ酸配列の対応する位置に、Ｌ－リジン以外のタンパク質構成アミノ酸、好ましくはＬ－アルギニンをさらに含み得る。

本発明はさらに、本発明によるポリヌクレオチドを含み、任意でコリネバクテリウム属、シュードモナス属もしくはエシェリキア属の微生物において複製するか、またはそれに適したプラスミドおよびベクターに関する。

本発明はさらに、本発明によるポリヌクレオチド、ベクターおよびポリペプチドを含むコリネバクテリウム属、シュードモナス属またはエシェリキア属の微生物に関する。

本発明はさらに、本発明によるポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていることを特徴とする、本発明による微生物に関する。相同組換えは、本発明によるベクターを使用して、染色体上のＤＮＡ断片を、ベクターによって細胞内に輸送される本発明によるポリヌクレオチドと交換することを可能にする。ベクターの環状ＤＮＡ分子と染色体上の標的ＤＮＡとの間の効率的な組換えのために、本発明によるポリヌクレオチドを含む交換されるＤＮＡ領域は、標的部位に相同なヌクレオチド配列を有する末端に提供される；これらは、ベクターの組み込み部位およびＤＮＡの交換部位を決定する。
例えば、本発明によるポリヌクレオチドは、染色体中の天然遺伝子部位で天然ｈｐａＢ遺伝子と交換され得るか、またはさらなる遺伝子部位に組み込まれ得る。

本発明は、特許請求されるポリヌクレオチドのいずれか、または特許請求されるポリペプチドのいずれか、または特許請求されるベクターのいずれかを含む、大腸菌、シュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）種の微生物を提供する。
微生物は、ポリヌクレオチドが過剰発現された形態で存在する微生物であり得る。

微生物は、ファインケミカルを産生する能力を有することを特徴とし得る。ファインケミカルは、好ましくはＬ－ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ－ＤＯＰＡ）である。

過剰発現は、一般に、出発株（親株）または野生型株が出発株である場合は野生型株と比較して、リボ核酸、タンパク質（ポリペプチド）または酵素の細胞内濃度または活性の増加を意味すると解釈される。出発株（親株）は、過剰発現をもたらす手段が株を意味すると解釈される。

過剰発現では、組換え過剰発現の方法が好ましい。これらには、インビトロで提供されるＤＮＡ分子を使用して微生物を産生する全ての方法が含まれる。そのようなＤＮＡ分子は、例えば、プロモータ、発現カセット、遺伝子、対立遺伝子、コード領域などを含む。これらは、形質転換、コンジュゲーション、形質導入などの方法によって所望の微生物に変換される。

発現または過剰発現の程度は、遺伝子によって転写されたｍＲＮＡの量を測定する工程、ポリペプチドの量を決定する工程、および酵素活性を決定する工程によって確立することができる。
ファインケミカルを生産するための発酵プロセスであって、以下の工程：
ａ）培地中での、配列番号１または配列番号３～配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％または１００％、好ましくは≧９７％、特に好ましくは≧９８％、非常に特に好ましくは≧９９％、極めて好ましくは１００％同一である、オキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む微生物の発酵、
ｂ）発酵ブロスが得られる、培地中のファインケミカルの蓄積
を含むプロセスが開示される。

本発明によるそのようなプロセスの使用は、実施例３に示すように、それぞれの出発株と比較して、生成物濃度およびＬ－ＤＯＰＡ：Ｌ－チロシン比の驚くべき増加をもたらす。

使用される培養培地または発酵培地は、それぞれの株の要求を適切に満たさなければならない。様々な微生物の培養培地の説明は、ハンドブック「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）に含まれている。培養培地および発酵培地または培地という用語は、相互に交換可能である。

炭素源として、糖および炭水化物、例えばグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、甜菜糖またはサトウキビ加工からのスクロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物およびセルロース、油および脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびココナッツ脂肪など、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸など、アルコール、例えばグリセロール、メタノールおよびエタノールなど、ならびに有機酸、例えば酢酸または乳酸などを使用することができる。

窒素源としては、有機窒素化合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粕および尿素など、または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどを使用することができる。窒素源は、個別にまたは混合物として使用することができる。
リン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩を使用することができる。

培養培地はさらに、例えば、成長に必要な、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムおよび鉄などの金属の塩化物または硫酸塩の形態の塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含有しなければならない。最後に、上記の物質に加えて、アミノ酸、例えばホモセリンおよびビタミン、例えばチアミン、ビオチンまたはパントテン酸などの必須成長物質を使用することができる。
前記出発材料は、単一バッチの形態で培養物に添加することができ、または培養中に適切な方法で供給することができる。

水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水などの塩基性化合物、またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物は、培養物のｐＨ制御のために適切な方法で使用される。ｐＨは、通常６．０～８．５、好ましくは６．５～８に調整される。泡発生を制御するために、例えば脂肪酸のポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、例えば抗生物質などの適切な選択的に作用する物質を培地に添加することができる。発酵は、好ましくは好気的条件下で行われる。前記好気的条件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気が培養物に導入される。過酸化水素が濃縮された液体の使用も同様に可能である。任意で、発酵は、超大気圧、例えば０．０３～０．２ＭＰａの超大気圧で行われる。培養温度は、通常２０°Ｃ～４５°Ｃであり、好ましくは２５°Ｃ～４０°Ｃ、特に好ましくは３０°Ｃ～３７°Ｃである。バッチまたはフェドバッチプロセスの場合、培養は、好ましくは、所望の有機化合物を得るための手段に十分な量が形成されるまで継続される。この目標は、通常、１０時間～１６０時間以内に達成される。連続プロセスでは、より長い培養時間が可能である。微生物の活性により、発酵培地中および／または微生物の細胞中でファインケミカルの濃縮（蓄積）が起こる。

適切な発酵培地の例は、とりわけ、米国特許第５，７７０，４０９号、米国特許第５，９９０，３５０号、米国特許第５，２７５，９４０号、国際公開第２００７／０１２０７８号、米国特許第５，８２７，６９８号、国際公開第２００９／０４３８０３号、米国特許第５，７５６，３４５号または米国特許第７，１３８，２６６号に見出し得る；任意で、使用される株の要件に対して適切な改変を行い得る。

プロセスは、バッチプロセス、フェドバッチプロセス、反復フェドバッチプロセスおよび連続プロセスからなる群より選択されるプロセスであることを特徴とし得る。

プロセスは、ファインケミカルまたは液体もしくは固体のファインケミカル含有生成物がファインケミカル含有発酵ブロスから得られることをさらに特徴とし得る。
好ましい形態では、ファインケミカルはＬ－ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ－ＤＯＰＡ）である。

濃度（体積あたりに形成された化合物）、収率（消費された炭素源あたりに形成された化合物）、体積生産性（体積および時間あたりに形成された化合物）およびバイオマス特異的生産性（細胞乾燥質量もしくはバイオ乾燥質量および時間あたりに形成された化合物または細胞タンパク質および時間あたりに形成された化合物）または他のプロセスパラメータならびにそれらの組合せの群から選択されるパラメータの１つ以上に関する本発明によるプロセスまたは発酵プロセスの性能は、本発明によるプロモータ変異体が存在する微生物を用いたプロセスまたは発酵プロセスに基づいて、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％または少なくとも２％増加する。
発酵の手段により、所望のファインケミカル、好ましくはアミノ酸または有機酸を含有する発酵ブロスが得られる。
次いで、ファインケミカルを含有する液体または固体形態の生成物が提供されるかまたは生産されるかまたは得られる。

発酵ブロスは、好ましい実施形態では、微生物が一定時間および一定温度で培養された発酵培地または栄養培地を意味すると解釈される。発酵培地または発酵中に使用される培地は、所望の化合物の産生を確実にし、典型的には成長および／または生存性を確実にする全ての物質または成分を含有する。
したがって、発酵が完了すると、得られた発酵ブロスは以下を含む：
ａ）微生物の細胞の増殖から生じる微生物のバイオマス（細胞塊）、
ｂ）発酵の過程で形成された所望のファインケミカル、
ｃ）発酵の過程で形成される可能性のある有機副生成物、および
ｄ）使用される発酵培地の成分、または発酵によって消費されない出発物質の成分、例えばビオチンなどのビタミン、または硫酸マグネシウムなどの塩。
有機副生成物は、発酵に使用される微生物によってそれぞれの所望の化合物に加えて生成され、分泌される可能性がある物質を含む。

発酵ブロスは、培養容器または発酵容器から取り出され、任意で収集され、ファインケミカルを含有する液体または固体形態の生成物を提供するために使用される。「ファインケミカル含有生成物を得る工程」という表現も、そのために使用される。最も単純な場合には、発酵容器から取り出されたファインケミカル含有発酵ブロス自体が、得られた生成物である。
以下の群：

ａ）水の部分的（＞０％～＜８０％）除去から完全な（１００％）または実質的に完全な（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％）除去、
ｂ）除去前に不活性化されていてもよい、バイオマスの部分的（＞０％～＜８０％）除去から完全な（１００％）または実質的に完全な（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％）除去、
ｃ）発酵の過程で形成された有機副生成物の部分的（＞０％～＜８０％）除去から完全な（１００％）または実質的に完全な（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．３％、≧９９．７％）除去、および
ｄ）使用された発酵培地の成分または発酵によって消費されない出発物質の成分の部分的（＞０％）除去から完全な（１００％）または実質的に完全な（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．３％、≧９９．７％）除去
から選択される測定値の１つ以上によって、所望の有機化合物の濃縮または精製が発酵ブロスから達成される。このようにして、所望の含有量の化合物を有する生成物が単離される。
水（測定値ａ））の部分的（＞０％～＜８０％）除去から完全な（１００％）または実質的に完全な（≧８０％～＜１００％）除去は、乾燥とも呼ばれる。

プロセスの変形形態では、使用される発酵培地の水、バイオマス、有機副生成物および非消費成分の完全なまたは実質的に完全な除去によって、所望の有機化合物、好ましくはアミノ酸、より好ましくはＬ－ＤＯＰＡの純粋な（≧８０重量％、≧９０重量％）または高純度の（≧９５重量％、≧９７重量％、≧９９重量％）生成物形態が成功裏に達成される。ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）による手段については、多種多様な技術的指示書が従来技術において利用可能である。

Ｌ－ＤＯＰＡを生産するプロセスの場合、発酵ブロスの成分を含まない生成物が得られるプロセスが好ましい。これらの生成物は、特に、ヒト医学、医薬品産業、および食品産業において使用されている。
本発明によるプロセスは、Ｌ－ＤＯＰＡの発酵生産に役立つ。
最後に、本発明は、Ｌ－ＤＯＰＡの発酵生産のための本発明による微生物の使用に関する。

図１は、ＢｉｏＬｅｃｔｏｒスクリーニングを用いた単一変異体によるＬ－ＤＯＰＡおよびＬ－チロシンの産生を示す。 図２は、ＢｉｏＬｅｃｔｏｒスクリーニングを用いた単一および複数の変異体によるＬ－ＤＯＰＡおよびＬ－チロシンの産生を示す（プラスミドはプラスミド安定化エレメントを含有する）。 図３は、発酵プロセスを用いた大腸菌ＨｐａＢ（上）およびジオバチルス属種ＨｐａＢ（下）による４８時間にわたるＬ－ＤＯＰＡおよびＬ－チロシンの産生を示す。 図４は、発酵プロセスを用いたジオバチルス属種ＨｐａＢ Ｖ２０７Ｔ変異体（上）およびジオバチルス属種ＨｐａＢ Ｖ２０７Ｌ変異体（下）による４８時間にわたるＬ－ＤＯＰＡおよびＬ－チロシンの産生を示す。 図５は、ジオバチルス属種ＨｐａＢと２ｙｙｊ（サーマス・サーモフィルス由来のオキシドレダクターゼ）のアラインメントを示す。 図６は、ジオバチルス属種ＨｐａＢと４ｏｏ２（ストレプトミセス・グロビスポラス由来のオキシドレダクターゼ）のアラインメントを示す。 図７は、ジオバチルス属種ＨｐａＢと１ｕｖ８（クロストリジウム・アミノブチリカム由来のオキシドレダクターゼ）のアラインメントを示す。 図８は、ジオバチルス属種ＨｐａＢと３ｈｗｃ（バークホルデリア・セパシア由来のオキシドレダクターゼ）のアラインメントを示す。 図９は、ジオバチルス属種ＨｐａＢと４ｇ５ｅ（カプリアビダス・ネカトール由来のオキシドレダクターゼ）のアラインメントを示す。 図１０は、ジオバチルス属種ＨｐａＢと４ｉｒｎ（オスキラトリア属種ＰＣＣ ６５０６由来のオキシドレダクターゼ）のアラインメントを示す。 図１１は、ジオバチルス属種ＨｐａＢと５ｉｄｕ（パラバークホルデリア・フィマツム由来のオキシドレダクターゼ）のアラインメントを示す。 図１２は、ジオバチルス属種ＨｐａＢと６ｊｈｍ（ラルストニア・ピッケティ由来のオキシドレダクターゼ）のアラインメントを示す。

本発明のさらなる好ましい実施形態を以下に要約する：

本発明は、配列番号１（ジオバチルス属種ＰＡ９）、配列番号３（サーマス・サーモフィルス）、配列番号４（ストレプトミセス・グロビスポラス）、配列番号５（クロストリジウム・アミノブチリカム）、配列番号６（バークホルデリア・セパシア）、配列番号８（オスキラトリア属種ＰＣＣ ６５０６）、配列番号９（パラバークホルデリア・フィマツム）のアミノ酸配列と少なくとも≧５０％同一であり、
配列番号１の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４位の１つ以上、または配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９のアミノ酸配列の対応する位置におけるアミノ酸交換を特徴とし、アミノ酸交換がＡ２１０ＳまたはＳ２１２Ａではない、
オキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを対象とする。

好ましい実施形態では、配列番号１（ジオバチルス属種ＰＡ９）、配列番号３（サーマス・サーモフィルス）、配列番号４（ストレプトミセス・グロビスポラス）、配列番号５（クロストリジウム・アミノブチリカム）、配列番号６（バークホルデリア・セパシア）、配列番号８（オスキラトリア属種ＰＣＣ ６５０６）、配列番号９（パラバークホルデリア・フィマツム）のアミノ酸配列と少なくとも≧５０％同一であり、
配列番号１の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４位、または配列番号３の１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５位、または配列番号４の２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２位、または配列番号５の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０位、または配列番号６の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２位、または配列番号８の２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７位、または配列番号９の１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１位、の１つ以上のアミノ酸交換を特徴とし、アミノ酸交換がＡ２１０ＳまたはＳ２１２Ａではない、
オキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを対象とする。
さらなる好ましい実施形態では、配列番号１の２１０位および２１２位におけるアミノ交換は除外される。

好ましい実施形態では、配列番号１（ジオバチルス属種ＰＡ９）、配列番号３（サーマス・サーモフィルス）、配列番号４（ストレプトミセス・グロビスポラス）、配列番号５（クロストリジウム・アミノブチリカム）、配列番号６（バークホルデリア・セパシア）、配列番号７（Cupriavidus necator）、配列番号８（オスキラトリア属種ＰＣＣ ６５０６）、配列番号９（パラバークホルデリア・フィマツム）のアミノ酸配列と少なくとも≧６５％同一であり、
配列番号１の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４位、または配列番号３の１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５位、または配列番号４の２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２位、または配列番号５の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０位、または配列番号６の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２位、または配列番号７の２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３位、または配列番号８の２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７位、または配列番号９の１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１位、の１つ以上のアミノ酸交換を特徴とし、アミノ酸交換がＡ２１０ＳまたはＳ２１２Ａではない、
オキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを対象とする。
さらなる好ましい実施形態では、配列番号１の２１０位および２１２位におけるアミノ交換は除外される。

好ましい実施形態では、配列番号１（ジオバチルス属種ＰＡ９）、配列番号３（サーマス・サーモフィルス）、配列番号４（ストレプトミセス・グロビスポラス）、配列番号５（クロストリジウム・アミノブチリカム）、配列番号６（バークホルデリア・セパシア）、配列番号７（Cupriavidus necator）、配列番号８（オスキラトリア属種ＰＣＣ ６５０６）、配列番号９（パラバークホルデリア・フィマツム）、配列番号１０（ラルストニア・ピケッティ）のアミノ酸配列と少なくとも≧９０％同一であり、
配列番号１の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４位、または配列番号３の１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５位、または配列番号４の２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２位、または配列番号５の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０位、または配列番号６の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２位、または配列番号７の２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３位、または配列番号８の２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７位、または配列番号９の１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１位、または配列番号１０の２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７位、の１つ以上のアミノ酸交換を特徴とし、アミノ酸交換がＡ２１０ＳまたはＳ２１２Ａではない、
オキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを対象とする。

好ましい実施形態では、オキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを対象とし、以下のアミノ酸配列と少なくとも≧３０％同一である、
・２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４位の１つ以上のアミノ酸交換がされた配列番号１（ジオバチルス属種ＰＡ９）、
・１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５位の１つ以上のアミノ酸交換がされた配列番号３（サーマス・サーモフィルス）のまたは配列番号２１、
・２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２位の１つ以上のアミノ酸交換がされた配列番号４（ストレプトミセス・グロビスポラス）または配列番号２２、
・２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０位の１つ以上のアミノ酸交換がされた配列番号５（クロストリジウム・アミノブチリカム）または配列番号２３、
・２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２位の１つ以上のアミノ酸交換がされた配列番号６（バークホルデリア・セパシア）または配列番号２４、
・２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３位の１つ以上のアミノ酸交換がされた配列番号７（Cupriavidus necator）または配列番号２５、

・２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７位の１つ以上のアミノ酸交換がされた配列番号８（オスキラトリア属種ＰＣＣ ６５０６）または配列番号２６、
・１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１位の１つ以上のアミノ酸交換がされた配列番号９（パラバークホルデリア・フィマツム）または配列番号２７、
・２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７位の１つ以上のアミノ酸交換がされた配列番号１０（ラルストニア・ピケッティ）または配列番号２８、アミノ酸交換がＡ２１０ＳまたはＳ２１２Ａではない。

好ましい実施形態は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％同一である、オキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを対象とし、ここで、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４は、２０７位またはアミノ酸配列の対応する位置に、Ｌ－バリン以外のタンパク質構成アミノ酸を有する。

好ましい実施形態は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％または１００％、好ましくは≧９７％、特に好ましくは≧９８％、非常に特に好ましくは≧９９％、極めて好ましくは１００％同一である、オキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、ここで、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４は、２０７位またはアミノ酸配列の対応する位置に、Ｌ－バリン以外のタンパク質構成アミノ酸を有する。

好ましい実施形態では、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、オキシドレダクターゼをコードする。

好ましい実施形態では、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％または１００％、好ましくは≧９７％、特に好ましくは≧９８％、非常に特に好ましくは≧９９％、極めて好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、オキシドレダクターゼをコードする。

例示的な実施形態を参照して、本発明を以下でより詳細に説明する。
実施例１：異なるＨｐａＢ（ジオバチルス属）変異体を用いた大腸菌株の産生

プラスミドの完全な配列（シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）ＡＫ６１由来のシアニダーゼ遺伝子の配列を含む）が開示されているドイツ特許第１０２００４０４３７４８Ａ１号に以前に記載されているｐＯＭ１７ｃ－プラスミドを出発点として使用した。このプラスミド上の複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子の配列を維持し、野生型ジオバチルス属種ＰＡ－９ ｈｐａＢ遺伝子、野生型大腸菌ｈｐａＣ遺伝子、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）ＰａｌｋＢプロモータおよび大腸菌ｒｒｎＢターミネータ配列、ならびにａｌｋＳ転写調節遺伝子（Ｙｕｓｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９８ Ｏｃｔ；１８０（１９）：５２１８－２６）を付加した。このプラスミドを、ジオバチルス属種野生型シングルカッター制限酵素ＡｇｅＩおよびＰｍｌＩ［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＧｍｂＨ，Ｂｒｕｎｉｎｇｓｔｒａｓｓｅ ５０，Ｇｅｂ．Ｂ８５２，６５９２６ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａｍ Ｍａｉｎ］を用いて消化した。合成したＤＮＡ断片［Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｇｅｒｍａｎｙ ＧｍｂＨ Ａｎｚｉｎｇｅｒ Ｓｔｒ．７ａ ＤＥ－８５５６０ Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ］を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＧｍｂＨ Ｂｒｕｎｉｎｇｓｔｒａｓｓｅ ５０，Ｇｅｂ．Ｂ８５２ ６５９２６ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａｍ Ｍａｉｎ］を製造者の指示に従って使用して、プラスミド骨格でクローニングした。それにより、プラスミドは大腸菌ｈｐａＣおよび異なるｈｐａＢ変異体の両方を含有していた。ＮＥＢ（登録商標）５－αエレクトロコンピテント大腸菌［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＧｍｂＨ Ｂｒｕｎｉｎｇｓｔｒａｓｓｅ ５０，Ｇｅｂ．Ｂ８５２ ６５９２６ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａｍ Ｍａｉｎ］の形質転換後、細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天に播種した。正確にクローニングされたプラスミドを選択するために、制限分析および配列決定を行った。言及される場合は、プラスミド安定化毒素－抗毒素配列ｈｏｋ／ｓｏｋ（Ｔｈｉｓｔｅｄ，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９４ Ａｐｒ １５；１３（８）：１９５０－９）およびｃｅｒ決定基（Ｓｕｍｍｅｒｓ＆Ｓｈｅｒｒａｔｔ，１９８４，ＤＯＩ：１０．１０１６／００９２－８６７４（８４）９００６０－６）をプラスミドに付加して、プラスミドの安定性を高めた。

選択したプラスミドの形質転換のために、Ｌ－チロシン産生株ＤＰＤ６０２１－Ｓを使用した。ＤＰＤ６０２１－Ｓは、米国特許第７７００３２８Ｂ２号に記載されている、ｐＭＴ１００プラスミドがさらに排除されたＤＰＤ４１４５のＳ期変異体である。プラスミド形質転換のために、株をＬＢ一晩培養物から０，０５のＯＤ_６００まで接種し、０．７のＯＤ_６００まで増殖させた。氷上で３０分間インキュベートした後、細胞を回収し（１０分、５５００ｇ；４°Ｃ）、５０ｍｌの脱塩水で２回洗浄した。１ｍｌの予冷した１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを用いたさらなる洗浄工程の後、細胞を２００μｌの予冷した１０％（ｖ／ｖ）グリセロールに再懸濁し、４０μｌのアリコートを形質転換に使用した。したがって、１００ｎｇのプラスミドをエレクトロポレーションキュベットに移し、４０μｌの細胞溶液と混合し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌエレクトロポレーションシステム［Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｋａｐｅｌｌｅｎｓｔｒａｓｓｅ １２，Ｄ－８５６２２ Ｆｅｌｄｋｉｒｃｈｅｎ］において２５００Ｖ、２００Ωおよび２５μＦでパルスした。１ｍｌのＳＯＣ培地を添加し、３７°Ｃで４５分間再生した後、１００μｌの懸濁液を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天に播種した。プラスミドを耐性コロニーから単離し、プラスミドの真正性を制限分析によって確認した。

下記系統を生成した:
hpaBC_Ec: E. coli hpaB (wildtype;参照);
hpaB_Gs: Geobacillus sp. PA-9 hpaB (wildtype);
hpaB_V207L_Gs: Geobacillus sp. PA-9 hpaB (Mutation V207L);
hpaB_V207T_Gs: Geobacillus sp. PA-9 hpaB (Mutation V207T);
hpaB_V207Q_Gs: Geobacillus sp. PA-9 hpaB (Mutation V207Q);
hpaB_V207G_Gs: Geobacillus sp. PA-9 hpaB (Mutation V207G);
hpaB_V207T_K208R_Gs: Geobacillus sp. PA-9 hpaB (Mutation V207T_K208R);
hpaB_T206M_V207T_Gs: Geobacillus sp. PA-9 hpaB (Mutation T206M_V207T);
hpaB_T206A_V207T_Gs: Geobacillus sp. PA-9 hpaB (Mutation T206A_V207T).
hpaB_V207T_A210S_T211N_S212T: Geobacillus sp. PA-9 hpaB (Mutation V207T_A210S_T211N_S212T)
hpaB_V207T_A210V_T211M_S212N: Geobacillus sp. PA-9 hpaB (Mutation V207T_A210V_T211M_S212N)
hpaB_V207T_G213A_E214Q_D215N: Geobacillus sp. PA-9 hpaB (Mutation V207T_G213A_E214Q_D215N)
hpaB_I152L_V207T: Geobacillus sp. PA-9 hpaB (Mutation I152L_V207T)
実施例２：Ｌ－ＤＯＰＡおよびＬ－チロシンの産生（ＢｉｏＬｅｃｔｏｒスクリーニングを使用）

ジオバチルス属種ＰＡ－９遺伝子の野生型または突然変異型変異体を発現するプラスミドを有するＤＰＤ６０２１－Ｓ株、ならびに野生型大腸菌遺伝子を発現する参照株を、ＢｉｏＬｅｃｔｏｒ［ｍ２ｐ－ｌａｂｓ；Ａｒｎｏｌｄ－Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｄ－Ｒｉｎｇ ２，５２４９９ Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ］小規模試験系で試験した。

したがって、バッフル付き振とうフラスコ中１０ｍｌ ＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）において３７°Ｃ、２００ｒｐｍで１８時間、株を培養した。培養物を、１ｍｌのＬＢ培地、ｐＨ５．５（７．５ｍＭ Ｌ－チロシン；１００μｇ／ｍｌのアンピシリン；０．２５％（ｖ／ｖ）ＤＣＰＫを添加）を含有するＢｉｏＬｅｃｔｏｒ Ｆｌｏｗｅｒｐｌａｔｅに播種して、０．１の出発ＯＤ_６００を得た。培養を、プロセスが停止するまで、３７°Ｃ、１２００ｒｐｍおよび８５％の相対湿度で２４時間行い、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使用してＬ－ＤＯＰＡおよびＬ－チロシン濃度を測定した。

ＨＰＬＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）で実施した。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３、５μｍ、４．６×１５０ｍｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。使用した方法は、停止時間１８分で１．００ｍｌ／分のカラム流量を必要とした。移動相は、表１に記載されるような溶媒Ａ（２．７２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、２．５ｍｌ／Ｌ濃リン酸、４０ｍｌ／Ｌアセトニトリル）と溶媒Ｂ（アセトニトリル）との比率で構成された。

スペクトルを１００ｎｍから３８０ｎｍまで走査し、Ｌ－ＤＯＰＡについてのシグナルを２９０ｎｍ、２．８分の保持時間で記録し、Ｌ－チロシンについてのシグナルを２７８ｎｍ、３．９分の保持時間で記録した。

表３：ＢｉｏＬｅｃｔｏｒスクリーニングを用いた単一および複数の変異体によるＬ－ＤＯＰＡおよびＬ－チロシンの産生（プラスミド安定化エレメントを含有するプラスミド）

スクリーニングの結果を表２および表３に要約し、図１および図２に可視化する。図１は、ＢｉｏＬｅｃｔｏｒスクリーニングを用いた単一変異体によるＬ－ＤＯＰＡおよびＬ－チロシンの産生を示し、図２は、ＢｉｏＬｅｃｔｏｒスクリーニングを用いた単一および複数の変異体によるＬ－ＤＯＰＡおよびＬ－チロシンの産生を示す（プラスミドはプラスミド安定化エレメントを含有する）。
実施例３：Ｌ－ＤＯＰＡおよびＬ－チロシンの産生（発酵プロセス）

株ＤＰＤ４１４５について米国特許第７７００３２８Ｂ２号の実施例８に記載されているように発酵を行い、株をＬ－チロシンおよびＬ－ＤＯＰＡの産生について評価した。米国特許第７７００３２８Ｂ２号の実施例８とは異なり、ＩＰＴＧではなくジシクロプロピルケトン（ＤＣＰＫ）で発酵を誘導し、ｐＨ６．８でアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）の存在下に発酵を行った。試料を定期的に発酵槽から取り出し、Ｌ－チロシン、Ｌ－ＤＯＰＡおよびバイオマス濃度について分析した。結果を表４～６に要約しており、表４は４８時間にわたるＬ－ＤＯＰＡの産生を示し、表５は同じ発酵プロセスについて４８時間にわたるＬ－チロシンの産生を示し、表６はＬ－ＤＯＰＡ／Ｌ－チロシンの比率を示す。結果を対応する図３～図４に可視化する。

図３は、発酵プロセスを用いた大腸菌ＨｐａＢ（上）およびジオバチルス属種ＨｐａＢ（下）による４８時間にわたるＬ－ＤＯＰＡおよびＬ－チロシンの産生を示し、図４は、発酵プロセスを用いたジオバチルス属種ＨｐａＢ Ｖ２０７Ｔ変異体（上）およびジオバチルス属種ＨｐａＢ Ｖ２０７Ｌ変異体（下）による４８時間にわたるＬ－ＤＯＰＡおよびＬ－チロシンの産生を示す。

ジオバチルス属由来のＨｐａＢを野生型酵素として使用し、４８時間のＬ－ＤＯＰＡの発酵生産のために異なる突然変異を用いることにより、Ｌ－ＤＯＰＡ／Ｌ－チロシンの比率が大腸菌野生型酵素を使用した場合よりも高いことを明確に示すことができた（表６）。ジオバチルス属ＨｐａＢ酵素の変異体は、さらにＬ－ＤＯＰＡ／Ｌ－チロシンの比率についてより高い値を有する。

さらなる変異体Ｇｓ＿Ｖ２０７Ｔ－Ｔ２０６ＭおよびＧｓ＿Ｖ２０７Ｔ－Ｋ２０８Ｒも発酵プロセスで試験し、Ｌ－ＤＯＰＡ／Ｌ－チロシンの比率について高い値で同様の結果を得た。
実施例５：構造相同性の分析

本発明のオキシドレダクターゼに関して、ジオバチルス属種ＨｐａＢ配列を使用して、構造相同体について蛋白質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）（ＰＤＢ）を検索した。構造アラインメントは、ＭＡＴＴ（Ｍｅｎｋｅ，Ｍ．，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．＆Ｃｏｗｅｎ，Ｌ．Ｍａｔｔ：Ｌｏｃａｌ Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ Ａｉｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．４，ｅ１０（２００８））を用いて構築した。

本発明のオキシドレダクターゼについてのそのようなアラインメントを図５に示しており、これは、ジオバチルス属種ＨｐａＢと２ｙｙｊ（サーマス・サーモフィルス由来のオキシドレダクターゼ）のアラインメントを示す。

図６:Geobacillus sp. HpaB and 4oo2 (oxidoreductase from Streptomyces globisporus)のアラインメント。

図７:Geobacillus sp. HpaB and 1uv8 (oxidoreductase from Clostridium aminobutyricum)のアラインメント。

図８:Geobacillus sp. HpaB and 3hwc (oxidoreductase from Burkholderia cepacia)のアラインメント。

図９:Geobacillus sp. HpaB and 4g5e (oxidoreductase from Cupriavidus necator)のアラインメント。

図１０: Geobacillus sp. HpaB and 4irn (oxidoreductase from Oscillatoria sp. PCC 6506)のアラインメント。

図１１:Geobacillus sp. HpaB and 5idu (oxidoreductase from Paraburkholderia phymatum)のアラインメント。

図１２: Geobacillus sp. HpaB and 6jhm (oxidoreductase from Ralstonia pickettii)のアラインメント。
モデル化された HpaB 構造の重ね合わせは、タンパク質が適切に整列していることを示している。
実施例６：異なるオキシドレダクターゼ変異体を用いた大腸菌株の産生

酵素ＥａｒＩ［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＧｍｂＨ Ｂｒｕｎｉｎｇｓｔｒａｓｓｅ ５０，Ｇｅｂ．Ｂ８５２ ６５９２６ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａｍ Ｍａｉｎ］を用いて野生型ジオバチルス属種ＰＡ－９ ｈｐａＢ遺伝子および野生型大腸菌ｈｐａＣ遺伝子を担持する実施例１に記載のｐＯＭ１７ｃプラスミドの制限を行って、野生型ジオバチルス属種ＰＡ－９ ｈｐａＢ遺伝子、ならびにＰａｌｋＢ、ａｌｋＳ配列および大腸菌ｈｐａＣ配列の一部を除去する。得られたプラスミド骨格を、先に除去されたＰａｌｋＢおよびａｌｋＳ配列ならびに大腸菌ｈｐａＣ配列の一部、ならびに配列番号３（サーマス・サーモフィルス）、配列番号４（ストレプトミセス・グロビスポラス）、配列番号５（クロストリジウム・アミノブチリカム）、配列番号６（バークホルデリア・セパシア）、配列番号７（カプリアビダス・ネカトール）、配列番号８（オスキラトリア属種ＰＣＣ ６５０６）、配列番号９（パラバークホルデリア・フィマツム）、配列番号１０（ラルストニア・ピッケティ）のアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子の野生型配列を含む合成ＤＮＡ断片でクローニングする。

さらに、前述のプラスミド骨格を、先に除去されたＰａｌｋＢおよびａｌｋＳ配列ならびに大腸菌ｈｐａＣ配列の一部、ならびに配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８のアミノ酸配列を有する、活性が改善された酵素変異体をもたらす遺伝子の変異配列を含む合成ＤＮＡ断片でクローニングする。
得られたプラスミドを、実施例１に記載されるように、Ｌ－チロシン産生株ＤＰＤ６０２１－Ｓの形質転換に使用する。

得られた株を、実施例２に記載される小規模スクリーニング系または実施例３に記載される発酵で培養して、突然変異型酵素変異体を発現する株の変換率を評価する。Ｌ－ＤＯＰＡ形成を実施例１に記載されるように定量化する。全ての変異体についてＬ－ＤＯＰＡ産生が検出された。
タンパク質配列
SEQ ID NO:1 Geobacillus sp. PA9 HpaB

SEQ ID NO:2 E.coli (HpaB) 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase component
SEQ ID NO:3 Thermus thermophilus
SEQ ID NO:4 Streptomyces globisporus
SEQ ID NO:5 Clostridium aminobutyricum
SEQ ID NO:6 Burkholderia cepacia
SEQ ID NO:7 Cupriavidus necator
SEQ ID NO:8 Oscillatoria sp. PCC 6506
SEQ ID NO:9 Paraburkholderia phymatum
SEQ ID NO:10 Ralstonia pickettii
SEQ ID NO:11 Geobacillus sp. PA9 HpaB V207L
SEQ ID NO:12 Geobacillus sp. PA9 HpaB V207T
SEQ ID NO:13 Geobacillus sp. PA9 HpaB V207Q
SEQ ID NO:14 Geobacillus sp. PA9 HpaB V207G
SEQ ID NO:15 Geobacillus sp. PA9 HpaB T206M
SEQ ID NO:16 Geobacillus sp. PA9 HpaB T206A
SEQ ID NO:17 Geobacillus sp. PA9 HpaB K208R
SEQ ID NO:18 Geobacillus sp. PA9 HpaB V207T_K208R
SEQ ID NO:19 Geobacillus sp. PA9 HpaB T206M_V207T
SEQ ID NO:20 Geobacillus sp. PA9 HpaB T206A_V207T
SEQ ID NO:21 Thermus thermophilus (mutated)
SEQ ID NO:22 Streptomyces globisporus (mutated)
SEQ ID NO:23 Clostridium aminobutyricum (mutated)
SEQ ID NO:24 Burkholderia cepacia (mutated)
SEQ ID NO:25 Cupriavidus necator (mutated)
SEQ ID NO:26 Oscillatoria sp. PCC 6506 (mutated)
SEQ ID NO:27 Paraburkholderia phymatum (mutated)
SEQ ID NO:28 Ralstonia pickettii (mutated)
SEQ ID NO:29 Geobacillus sp. PA9 HpaB V207T_A210S_T211N_S212T
SEQ ID NO:30 Geobacillus sp. PA9 HpaB V207T_A210V_T211M_S212N
SEQ ID NO:31 Geobacillus sp. PA9 HpaB V207T_G213A_E214Q_D215N
SEQ ID NO:32 Geobacillus sp. PA9 HpaB I152L_V207T

Claims (18)

1. 配列番号１（ジオバチルス属種（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＡ９）、配列番号３（サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、配列番号４（ストレプトミセス・グロビスポラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ））、配列番号５（クロストリジウム・アミノブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ））、配列番号６（バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒａｉ ｃｅｐａｃｉａ））、配列番号８（オスキラトリア属種（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．）ＰＣＣ ６５０６）、配列番号９（パラバークホルデリア・フィマツム（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｈｙｍａｔｕｍ））のアミノ酸配列と少なくとも≧５０％同一であり、
   配列番号１の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４位の１つ以上、または配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９のアミノ酸配列の対応する位置におけるアミノ酸交換を特徴とし、
   前記アミノ酸交換が、Ａ２１０ＳまたはＳ２１２Ａではない、
   オキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
2. 配列番号１（ジオバチルス属種ＰＡ９）、配列番号３（サーマス・サーモフィルス）、配列番号４（ストレプトミセス・グロビスポラス）、配列番号５（クロストリジウム・アミノブチリカム）、配列番号６（バークホルデリア・セパシア）、配列番号７（カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ））、配列番号８（オスキラトリア属種ＰＣＣ ６５０６）、配列番号９（パラバークホルデリア・フィマツム）のアミノ酸配列と少なくとも≧６５％同一であり、
   配列番号１の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４位の１つ以上、または配列番号３、配列番号４、配列ＩＤ：５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９のアミノ酸配列の対応する位置におけるアミノ酸交換を特徴とする、
   請求項１に記載のオキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
3. 配列番号１（ジオバチルス属種ＰＡ９）、配列番号３（サーマス・サーモフィルス）、配列番号４（ストレプトミセス・グロビスポラス）、配列番号５（クロストリジウム・アミノブチリカム）、配列番号６（バークホルデリア・セパシア）、配列番号７（カプリアビダス・ネカトール）、配列番号８（オスキラトリア属種ＰＣＣ ６５０６）、配列番号９（パラバークホルデリア・フィマツム）、配列番号１０（ラルストニア・ピッケティ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ））のアミノ酸配列と少なくとも≧９０％同一であり、
   配列番号１の２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４位の１つ以上、または配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０のアミノ酸配列の対応する位置におけるアミノ酸交換を特徴とする、
   請求項１または２に記載のオキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
4. ・２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４位の１つ以上にアミノ酸交換を有する配列番号１（ジオバチルス属種ＰＡ９）；
   ・１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５位の１つ以上にアミノ酸交換を有する配列番号３（サーマス・サーモフィルス）；または配列番号２１；
   ・２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２位の１つ以上にアミノ酸交換を有する配列番号４（ストレプトミセス・グロビスポラス）；または配列番号２２；
   ・２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０位の１つ以上にアミノ酸交換を有する配列番号５（クロストリジウム・アミノブチリカム）；または配列番号２３；
   ・２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２位の１つ以上にアミノ酸交換を有する配列ＩＤ：６（バークホルデリア・セパシア）；または配列番号２４；
   ・２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３位の１つ以上にアミノ酸交換を有する配列番号７（カプリアビダス・ネカトール）；または配列番号２５；
   ・２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７位の１つ以上にアミノ酸交換を有する配列番号８（オスキラトリア属種ＰＣＣ ６５０６）；または配列番号２６；
   ・１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１位の１つ以上にアミノ酸交換を有する配列番号９（パラバークホルデリア・フィマツム）；または配列番号２７；
   ・２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７位の１つ以上にアミノ酸交換を有する配列番号１０（ラルストニア・ピッケティ）；または配列番号２８
   から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のオキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
5. 配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％または１００％、好ましくは≧９７％、特に好ましくは≧９８％、非常に特に好ましくは≧９９％、極めて好ましくは１００％同一である、請求項１～４のいずれか一項に記載のオキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４が、２０７位または前記アミノ酸配列の対応する位置にＬ－バリン以外のタンパク質構成アミノ酸を有する、ポリヌクレオチド。
6. ジオバチルス属の微生物由来の酵素４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする複製可能なヌクレオチド配列であり、それによってコードされるタンパク質配列が、配列番号１の２０７位に対応する位置にＬ－バリン以外のタンパク質構成アミノ酸を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のオキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載のオキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、それによってコードされるアミノ酸配列が、２０７位または対応する位置に、トレオニン、ロイシン、グルタミンおよびグリシンからなる群より選択されるアミノ酸を有する、ポリヌクレオチド。
8. 請求項１～７のいずれか一項に記載のオキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、それによってコードされるアミノ酸配列が、
   －２０６位もしくは前記アミノ酸配列の対応する位置に、Ｌ－トレオニン以外のタンパク質構成アミノ酸、好ましくはＬ－メチオニンもしくはＬ－アラニンを含むか；または
   －２０８位もしくは前記アミノ酸配列の対応する位置に、Ｌ－リジン以外のタンパク質構成アミノ酸、好ましくはＬ－アルギニンを含む、
   ポリヌクレオチド。
9. 配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％または１００％、好ましくは≧９７％、特に好ましくは≧９８％、非常に特に好ましくは≧９９％、極めて好ましくは１００％同一である、請求項１～８のいずれか一項に記載のオキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
10. 請求項１～９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
11. エシェリキア属、シュードモナス属またはコリネバクテリウム属の微生物における複製に適する、請求項１０に記載のベクター。
12. 請求項１～９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
13. 請求項１～９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項１０に記載のポリペプチド、または請求項１０もしくは１１に記載のベクターを含む、エシェリキア属、シュードモナス属またはコリネバクテリウム属の微生物。
14. 請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが過剰発現された形態で存在する、請求項１３に記載の微生物。
15. ファインケミカルを産生する能力を有し、好ましくは前記ファインケミカルがＬ－ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ－ＤＯＰＡ）であることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の微生物。
16. ファインケミカルを生産するための発酵プロセスであって、以下の工程：
    ａ）培地中での、配列番号１または配列番号３～配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％または１００％、好ましくは≧９７％、特に好ましくは≧９８％、非常に特に好ましくは≧９９％、極めて好ましくは１００％同一である、オキシドレダクターゼをコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む微生物の発酵、
    ｂ）発酵ブロスが得られる、前記培地中の前記ファインケミカルの蓄積
    を含む、発酵プロセス。
17. 前記ファインケミカルまたは液体もしくは固体のファインケミカル含有生成物が、前記ファインケミカル含有発酵ブロスから得られ、前記ファインケミカルがＬ－ＤＯＰＡであることを特徴とする、請求項１６に記載のプロセス。
18. Ｌ－ＤＯＰＡの発酵生産のための、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の微生物の使用。