JP2023532248A

JP2023532248A - 免疫関連疾患のためのｔｉｇｉｔに対するヒトモノクローナル抗体

Info

Publication number: JP2023532248A
Application number: JP2022579851A
Authority: JP
Inventors: スイ、ジャンフア; ヤン、フアン; ジャオ、リンリン; ウエイ、ジィゾン
Original assignee: Huahui Health Ltd
Current assignee: Huahui Health Ltd
Priority date: 2020-06-24
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2023-07-27
Also published as: WO2021258337A1; CN116670286A; US20230272067A1; WO2021259335A1; EP4172209A4; EP4172209A1

Abstract

本発明は、ヒトＴＩＧＩＴとマウスＴＩＧＩＴの両方に結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体およびその抗原結合断片に関する。本出願はまた、抗体またはその断片をコードするヌクレオチド、抗体またはその断片を含む組成物または組み合わせ、ならびにがんおよびウイルス感染などの免疫関連疾患の治療における抗体またはその断片の使用を提供する。

Description

本明細書には、ＴＩＧＩＴに結合し、ＴＩＧＩＴの機能をブロックする、具体的にはＴＩＧＩＴとそのリガンドＣＤ１５５との相互作用をブロックする、単離された抗体またはその抗原結合断片が記載される。本出願は、がんおよびウイルス感染などの免疫関連疾患の治療における上記抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の使用も提供する。

免疫療法は、種々のがんを治療するための極めて強力なモダリティとして台頭している。最も影響力のあるアプローチの１つは、免疫チェックポイント受容体またはリガンドの遮断に基づいている。

ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）／ネクチンファミリーのメンバーであるＴＩＧＩＴは、活性化Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のサブセットに主に発現する免疫受容体である（Johnston, R. J. et al., 2014. Cancer cell 26:923-937; Boles, K. S. et al., 2009. European journal of immunology39:695-703; Yu, X., K. et al., 2009. Nature immunology 10:48-57; およびLevin, S. D. et al., 2011. European journal of immunology 41:902-915）。研究によって、ＴＩＧＩＴ^-/-マウスが、免疫誘発性自己免疫に対してより感受性が高かったことが示されており（Levin S. D. et al., 2011，上記を参照；Joller, N. et al., 2011. J Immunol 186:1338-1342.）、ＴＩＧＩＴが免疫恒常性の維持において抑制性受容体として機能することを裏付けている。ＴＩＧＩＴは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に発現される高親和性同族リガンドＣＤ１５５（ＰＶＲとしても知られる）に結合し、この結合によって、Ｔ細胞およびＡＰＣを介して、ならびにＮＫ細胞により免疫応答を阻害する（Joller, N. et al., 2011, supra; Stanietsky, N. et al., 2009. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106:17858-17863）。ＴＩＧＩＴは、ＣＤ１５５への結合のためにＣＤ２２６と競争し（Yu, X. et al., 2009，上記を参照）、この結果、ＣＤ２２６介在共刺激Ｔ細胞シグナル伝達を相殺するが（Johnston, R. J. et al., 2014，上記を参照）、これは、ＣＤ２８の共刺激機能に対抗するＣＴＬＡ－４の機能によく似ている（Egen, J. G. et al., 2002. Nature immunology3:611-618.）ことも示されている。

がんに関連して、ＴＩＧＩＴは、腫瘍浸潤Ｔ細胞によって、およびＣＤ１５５がヒトとマウスの両方の腫瘍および腫瘍浸潤骨髄細胞によって高度に発現されることを考慮してアップレギュレートされることが知られている（Martinet, L., and M. J. Smyth. 2015. Nat Rev Immunol 15:243-254; Chan, C. J. et al., 2014. Nature immunology 15:431-438; Blake, S. J. et al., 2016. Clinical cancer research 22:5183-5188; Li, X. Y. et al., 2018. J Clin Invest 128:2613-2625; Kurtulus, S. et al., 2015. J Clin Invest 125:4053-4062）。ＴＩＧＩＴは、複数の連続した工程を介して抗腫瘍免疫応答を阻害し得ることが提案されており（Manieri, N. A. et al., 2017. Trends Immunol38:20-28）、まず、ＮＫ細胞媒介性の腫瘍細胞の死滅の他に腫瘍抗原の放出も阻害し、その後、免疫寛容原性樹状細胞を誘導して、ＴＩＧＩＴ⁺Ｔｒｅｇを介してＣＤ８⁺Ｔ細胞機能を抑制し、最後に、ＣＤ８⁺Ｔ細胞のエフェクター機能を直接阻害して、最終的にがん細胞の排除を妨げる。したがって、ＴＩＧＩＴはがん免疫における重要な阻害剤であると考えられ（Manieri, N. A. et al., 2017，上記参照；Dougall, W. C. et al., 2017. Immunol Rev 276:112-120）、ＴＩＧＩＴを標的とすることはがん免疫療法を開発するための有望なアプローチと見られている。

抗ＴＩＧＩＴ抗体は、いくつかのマウスがんモデルで治療効果を示しており、いくつかの抗体がヒト臨床試験において現在評価されている（Burugu, S. et al., 2018. Semin Cancer Biol 52:39-52.）。これらの有望な医学的結果にもかかわらず、これらの抗ＴＩＧＩＴ抗体が抗腫瘍作用を付与する（１つまたは複数の）機序の科学的理解は不明のままであり、このため、より有効な抗体または組み合わせを開発する試みのみならず、どの患者集団がそのような治療から恩恵を受ける可能性があるかを特定する臨床的試みも制限される。

したがって、治療用途に適した改良された抗ＴＩＧＩＴ抗体を開発するように抗ＴＩＧＩＴ抗体の機能の根底にある機序を探求する試みが依然として必要とされている。

科学出版物、特許出願公報、および特許公報を含むすべての参考文献は、あらゆる目的でそれらの実体が組み込まれている。

ヒトＴＩＧＩＴ（ｈＴＩＧＩＴ－ＥＣＤ；ＵｎｉｐｒｏｔＩＤＱ４９５Ａ１）とマウスＴＩＧＩＴ（ｍＴＩＧＩＴ－ＥＣＤ；ＵｎｉｐｒｏｔＩＤＰ８６１７６）の両方の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を標的として使用した大型ファージディスプレイ抗体ライブラリの交差選択（cross-selection）およびスクリーニングによって、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５の相互作用に対する阻害活性を有するヒトモノクローナル抗体のパネルが特定された。それらの中でも、Ｔ４Ａｂおよびｈｍ７Ａｂは、ｈＴＩＧＩＴとｍＴＩＧＩＴの両方に対してより高い結合親和性を示し、他のＡｂよりも良好な阻害活性を示した。チェーンシャッフリングのアプローチによるＴ４Ａｂとｈｍ７Ａｂの両方の最適化によって、さらに高い結合親和性を備えたより強力なＡｂが得られ、したがって本発明が完成した。さらに、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴのそのリガンドへの結合をブロックする機能に加えて、Ｆｃ介在エフェクター機能を保有することが分かった。また、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、交差保護的な耐久性のある免疫記憶効果を誘発することができ、治療用途に適したものになることも分かった。

第１の態様では、本開示は、ヒトＴＩＧＩＴ（ｈＴＩＧＩＴ）とマウスＴＩＧＩＴ（ｍＴＩＧＩＴ）の両方に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、
（１）配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１（重鎖相補性決定領域１）、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１（軽鎖相補性決定領域１）、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（２）配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号２０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号２３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（３）配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号２０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号３０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号３２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（４）配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または
（５）配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号２０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む。

より具体的な実施形態では、ヒトＴＩＧＩＴ（ｈＴＩＧＩＴ）とマウスＴＩＧＩＴ（ｍＴＩＧＩＴ）の両方に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片は、
（１）配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号１２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（２）配列番号２７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号２６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または
（３）配列番号３４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号３３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む。

一実施形態では、ヒトＴＩＧＩＴ（ｈＴＩＧＩＴ）とマウスＴＩＧＩＴ（ｍＴＩＧＩＴ）の両方に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。

より具体的な実施形態では、ヒトＴＩＧＩＴ（ｈＴＩＧＩＴ）とマウスＴＩＧＩＴ（ｍＴＩＧＩＴ）の両方に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片は、
（１）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（２）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（３）配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（４）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または
（５）配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む。

より具体的な実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、
（１）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、およびＩＧＫＶ１－３９、Ｔ４、１－４４、１－４８、１－６０、１－６６、１－９３、３－５、３－１２、３－１７、３－９６、およびＴ４Ｍからなる群から選択される抗体の図６に示されるような軽鎖可変ドメイン；
（２）図１０に示されるようなＩＧＨＶ３－２３、ＩＧＨＶ３－３０、ｈｍ７、ｈｍ７－３－２３、およびｈｍ７－３－３０からなる群から選択される重鎖可変ドメイン、およびＩＧＬＶ２－１１、ＩＧＬＶ２－１４、ｈｍ７、Ｔｍ１、Ｔｍ３、Ｔｍ４、Ｔｍ５、Ｔｍ６、Ｔｍ７、Ｔｍ８、Ｔｍ９、Ｔｍ１０、Ｔｍ１１、Ｔｍ１２、Ｔｍ１３、Ｔｍ１４、Ｔｍ１５、Ｔｍ１７、Ｔｍ１８、Ｔｍ１９、ＣＳ１９、ＣＳ１９ＭＥ、およびＣＳ１９ＭＥ－Ｎからなる群から選択される抗体の図９に示されるような軽鎖可変ドメイン
を含む。

一実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体はヒト抗体である。一実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体はヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。

一実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）であるか、または二重特異性または三重特異性抗体におけるドメインとして含まれる。

一実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはそれらの変異体のサブクラスの重鎖定常領域、およびカッパまたはラムダまたはそれらの変異体のタイプの軽鎖定常領域を含む。好ましい実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体はＩｇＧ１の重鎖定常領域を含む。

一実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は単離された抗体である。一実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は組換え抗体である。

一実施形態では、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｆｃ介在エフェクター機能を保有する。１つの好ましい実施形態では、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、増強したＦｃ介在エフェクター機能を保有する。

一実施形態では、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、修飾のない抗体と比較して、（１）ＡＤＣＣ機能を増強する、（２）ＡＤＣＰ機能を増強する、および／または（３）ＣＤＣ機能を低減または排除するように、Ｆｃ領域を変更することによってさらに修飾される。好ましくは、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体のＦｃ修飾された変異体は、修飾前の本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体と比較して、ＡＤＣＣ機能が増強される、ＡＤＣＰ機能が増強される、ＣＤＣ機能が低減されるか、またはＣＤＣ機能がない。

一実施形態では、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体は脱フコシル化抗体である。一実施形態では、脱フコシル化抗体は、そのフコシル化対応物と比較してエフェクター機能が増強されている。

一実施形態では、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体は免疫記憶効果を誘発する。より具体的な実施形態では、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体によって誘発された免疫記憶効果は、交差腫瘍免疫を生み出す。

第２の態様では、本開示は、本出願の第１の態様の抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物、たとえば、医薬組成物を提供する。好ましい実施形態では、医薬組成物は、治療上有効な量の抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片を含む。

第３の態様では、本開示は、本出願の第１の態様の抗ＴＩＧＩＴ抗体もしくは抗原結合断片、または本出願の第２の態様の組成物を含むキットを提供する。好ましい実施形態では、キットは、治療上有効な量の抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片を含む。

第４の態様では、本開示は、免疫関連の病状または疾患を予防または治療するための方法であって、本出願の第１の態様の治療上有効な量の抗ＴＩＧＩＴ抗体もしくは抗原結合断片、または本出願の第２の態様の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む方法を提供する。具体的な実施形態では、免疫関連の病状または疾患は、がんまたは慢性ウイルス感染症などのウイルス感染症である。

第５の態様では、本開示は、がんなどの免疫関連の病状または疾患の再発を予防するための方法であって、本出願の第１の態様の治療上有効な量の抗ＴＩＧＩＴ抗体もしくは抗原結合断片、または本出願の第２の態様の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む方法を提供する。具体的な実施形態では、疾患または障害はがんである。

第６の態様では、本開示は、本明細書に記載されるさまざまな病状もしくは疾患を治療するための、または本明細書に記載されるさまざまな病状または疾患の再発を予防するための、本出願の第１の態様の抗体もしくは抗原結合断片、または本出願の第２の態様の医薬組成物の使用を提供する。

第７の態様では、本開示は、本明細書に記載されるさまざまな病状もしくは疾患を治療するための、または本明細書に記載されるさまざまな病状または疾患の再発を予防するための、医薬品の製造における本出願の第１の態様の抗ＴＩＧＩＴ抗体もしくは抗原結合断片、または本出願の第２の態様の医薬組成物の使用を提供する。

第８の態様では、本開示は、第１の態様の抗ＴＩＧＩＴ抗体または結合断片をコードする単離された核酸を提供する。本態様のより具体的な実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその断片をコードする単離された核酸は、
（１）配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列、および／または配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；
（２）配列番号２９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列、および／または配列番号２８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；または
（３）配列番号３６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列、および／または配列番号３５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列
を含む。

第９の態様では、本開示は第８の態様の核酸を含む発現ベクターを提供する。

第１０の態様では、本開示は第８の態様の核酸または第９の態様の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

ｈＴＩＧＩＴ－ＥＣＤ（ヒトＴＩＧＩＴ細胞外ドメイン）およびｍＴＩＧＩＴ－ＥＣＤ（マウスＴＩＧＩＴ細胞外ドメイン）のアミノ酸配列を示し、ドットは同一のアミノ酸残基を有する位置を示す。ｈＴＩＧＩＴおよびｍＴＩＧＩＴへの抗ＴＩＧＩＴＡｂの結合を示す。Ａ）フローサイトメトリー解析。Ｂ）ＢｉａｃｏｒｅＴ２００を使用するシングルサイクルカイネティクス解析。ＥＬＩＳＡによって解析された抗ＴＩＧＩＴＡｂの結合およびリガンド競争活性を示す。Ａ）精製ＴＩＧＩＴ－ＥＣＤタンパク質へのＴ４およびｈｍ７Ａｂの結合。Ｂ）Ｔ４およびｈｍ７Ａｂのリガンド競争アッセイ。ＳＰＲによるｈＴＩＧＩＴまたはｍＴＩＧＩＴへの抗ＴＩＧＩＴＡｂの結合動態を示す。Ａ）ＢｉａｃｏｒｅＴ２００を使用する抗ＴＩＧＩＴＡｂ（Ｔ４およびｈｍ７）とｈＴＩＧＩＴまたはｍＴＩＧＩＴとの間の相互作用のマルチサイクルカイネティクス解析。Ｂ）ｋａ、ｋｄ、およびＫＤの値をリストした表。ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲを使用したｈＴＩＧＩＴおよびｍＴＩＧＩＴへのＴ４およびＴ４由来の抗ＴＩＧＩＴＡｂの結合解析を示す。Ａ）精製ＴＩＧＩＴ－ＥＣＤタンパク質（ビオチン化ｈＴＩＧＩＴ－ＥＣＤまたはｍＴＩＧＩＴ－ＥＣＤ）への抗ＴＩＧＩＴＡｂの結合解析。Ｂ）ＢｉａｃｏｒｅＴ２００を使用した抗ＴＩＧＩＴＡｂとｈＴＩＧＩＴまたはｍＴＩＧＩＴとの間の相互作用のシングルサイクルカイネティクス解析。Ｔ４由来の変異体ＡｂのＶＬのアミノ酸配列と生殖系列配列とのアラインメントを示す。ドットは同一のアミノ酸を有する位置を示す。アミノ酸の番号付けはコンセンサス配列に基づいている。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムに従って判定され、灰色の陰影が付けられている。ＳＰＲを使用したｈＴＩＧＩＴおよびｍＴＩＧＩＴへのＴ４およびＴ４ＭＡｂの結合動態を示す。Ａ）ＢｉａｃｏｒｅＴ２００を使用した抗ＴＩＧＩＴＡｂとｈＴＩＧＩＴまたはｍＴＩＧＩＴとの間の相互作用のマルチサイクルカイネティクス解析。Ｂ）ｋａ、ｋｄ、およびＫＤの値をリストした表。ＳＰＲを使用したｈＴＩＧＩＴ（Ａ）またはｍＴＩＧＩＴ（Ｂ）への抗ＴＩＧＩＴＡｂ（ｈｍ７由来のＡｂ、ｈｍ７、およびＴ４）の結合動態を示す。ｈｍ７Ａｂに由来する変異体のＶＬのアミノ酸配列アラインメントを示す。ドットは同一のアミノ酸を有する位置を示す。アミノ酸の番号付けはコンセンサス配列に基づいている。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムに従って判定され、灰色の陰影が付けられている。ｈｍ７Ａｂに由来する変異体のＶＨのアミノ酸配列アラインメントを示す。ドットは同一のアミノ酸を有する位置を示す。アミノ酸の番号付けはコンセンサス配列に基づいている。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムに従って判定され、灰色の陰影が付けられている。ＳＰＲを使用したｈＴＩＧＩＴまたはｍＴＩＧＩＴへの抗ＴＩＧＩＴＡｂの結合動態を示す。Ａ）Ｔ２００を使用した抗ＴＩＧＩＴＡｂとｈＴＩＧＩＴまたはｍＴＩＧＩＴとの間の相互作用のマルチサイクルカイネティクス解析。Ｂ）ｋａ、ｋｄ、およびＫＤの値をリストした表。抗ＴＩＧＩＴＡｂのエピトープマッピングを示す。Ａ）ｈＴＩＧＩＴ、ｍＴＩＧＩＴ、ｈＣＤ１５５、３つのｈＴＩＧＩＴ／ｈＣＤ１５５キメラ、および３つのｈＴＩＧＩＴ変異体のＮ末端ＩｇＶドメインのアミノ酸配列アラインメント。ドットは同一のアミノ酸を有する位置を示し、破線は間隙を示す。置換または変異した領域は灰色で陰影が付けられている。アミノ酸の番号付けはｈＴＩＧＩＴに基づいている。Ｂ）全長ｈＴＩＧＩＴ（野生型、ＷＴ）、またはそのキメラもしくは変異体を一時的に発現するＣＨＯ細胞に結合する種々のＡｂまたはｈＣＤ１５５－ｈＦｃリガンドのフローサイトメトリー解析。二次Ａｂ染色のみが陰性対照として使用された（Ｎｅｇ．Ｃｔｒｌ．）。ＷＴｈＴＩＧＩＴ、キメラ、および変異体の細胞表面発現レベルは、Ｎ末端タグを認識するｍＡｂ（ＧＣ３３）を使用することによって評価された。Ｃ）全長ｈＴＩＧＩＴ（野生型、ＷＴ）、またはその３つの変異体（Ｓ７８Ａ、Ｓ８０Ａ、Ｋ８２Ａ）を一時的に発現する２９３Ｔ細胞に結合する種々のＡｂまたはｈＣＤ１５５－ｈＦｃリガンドのフローサイトメトリー解析。二次Ａｂ染色のみが陰性対照として使用された（Ｎｅｇ．Ｃｔｒｌ．）。ＷＴｈＴＧＩＴおよび変異体の細胞表面発現レベルは、ｈＣＤ１５５－ｈＦｃを使用することによって評価された。ＥＬＩＳＡによって解析された抗ＴＩＧＩＴＡｂのリガンド競争活性を示す。ＥＬＩＳＡプレート上に固定化されたストレプトアビジンによって捕捉されたビオチン化ｈＴＩＧＩＴ、ｍＴＩＧＩＴ、またはｈＴＩＧＩＴへのｈＣＤ１５５－ｍＦｃ（Ａ）、ｍＣＤ１５５－ｍＦｃ（Ｂ）、またはｈＣＤ１１２（Ｃ）の結合の競争のために、段階希釈濃度のｈＩｇＧ１型のＣＳ１９ＭＥ３－３０－ＮＡｂが試験された。抗ＴＩＧＩＴＡｂが、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５相互作用によって抑制されたＮＫ細胞の細胞毒性を効果的に逆転させることを示す。（Ａ－Ｂ）ＹＴＳ－ｈＴＩＧＩＴ上のｈＴＩＧＩＴまたは７２１．２２１－ｈＣＤ１５５安定細胞株上のｈＣＤ１５５の発現は、フローサイトメトリーによって抗ＴＩＧＩＴＡｂ（１０Ａ７）またはｈＴＩＧＩＴ－Ｆｃ融合タンパク質を使用して評価された。Ｃ）ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５会合はＹＴＳ細胞の細胞毒性を破壊し（左）、Ｔ４、ＣＳ１９ＭＥ３－２３、およびＣＳ１９ＭＥ３－３０－ＮＡｂは、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５相互作用によって抑制されたＮＫ細胞の細胞毒性を効果的に逆転させた（中央および右）。ＮＫエフェクターＹＴＳ細胞による７２１．２２１標的細胞の死滅アッセイ、およびＹＴＳ－ｈＴＩＧＩＴ細胞による７２１．２２１－ｈＣＤ１５５細胞の死滅に関して、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比がｘ軸に示される。Ａｂの存在下での死滅アッセイに関して、Ｅ：Ｔ比は２：１であった。抗体１０Ａ７は抗ＴＩＧＩＴ参照Ａｂ対照として含まれた。Ａｂは全長ｈＩｇＧ１Ａｂであった。本出願の抗ＴＩＧＩＴＡｂによって誘発されたＡＤＣＣエフェクター機能を示す。Ａ）Ｒａｊｉ－ｈＴＩＧＩＴ細胞株が、インビトロでのＦｃ介在エフェクター機能解析のために生成された。ＲａｊｉＷＴおよびＲａｊｉ－ｈＴＩＧＩＴ細胞上のｈＴＩＧＩＴの発現はＦＡＣＳによって解析された。Ｂ）Ｔ４Ａｂによって誘発されたＡＤＣＣエフェクター機能。レポーターアッセイ系を使用してＡＤＣＣ活性が測定された。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２ｐ／ｍＦｃγＲＩＶ（Ｊｕｒｋａｔ－ｍＦｃγＲＩＶ）またはＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２ｐ／ｈＦｃγＲＩＩＩ（Ｊｕｒｋａｔ－ｈＦｃγＲＩＩＩ）がエフェクター細胞として、およびＲａｊｉ－ｈＴＩＧＩＴ細胞が標的細胞として、それぞれ使用された。Ａｂは、３つの複製を用いて指定された濃度で試験された。Ｅ：Ｔ比は６：１であった。（Ｃ－Ｄ）ｈＩｇＧまたはｍＩｇＧ形式のＣＳ１９ＭＥ３－２３（Ｃ）、またはＣＳ１９ＭＥ３－３０－Ｎ（Ｄ）によって誘発されたＡＤＣＣエフェクター機能。ＡＤＣＣ機能は、０．１μｇ／ｍｌのＡｂを含む培地中でパネルＢに記載された方法に従って検出された。Ｅ）ｈＩｇＧおよび脱フコシル化ｈＩｇＧ１変異体によって誘発されたＡＤＣＣエフェクター機能。検出方法は、パネルＢに記載される方法と同じであった。マクロファージを介して抗ＴＩＧＩＴＡｂによって誘発されたＡＤＣＰエフェクター機能を示す。Ｒａｊｉ－ｈＴＩＧＩＴ標的細胞は、Ｆ４／８０－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３Ａｂで染色されたマウス骨髄由来マクロファージと混合する前に、ＣＦＳＥ蛍光色素で標識された。Ｅ：Ｔ比は１：２であった。ＡＤＣＰ活性が蛍光顕微鏡を介してモニターされた。食作用指数は、マクロファージ１００個あたりのＣＦＳＥ陽性標的細胞の数として判定された。Ｔ４ｍＩｇＧＡｂ（Ａ）、ＣＳ１９ＭＥ３－３０－ＮｍＩｇＧＡｂ（Ｂ）、またはｈＩｇＧＡｂ（Ｃ）を介したＡＤＣＰ応答の検出が実施された（「ｎｓ」：有意性なし；^****Ｐ＜０．０００１）。抗ＴＩＧＩＴＡｂによって誘発されたＣＤＣエフェクター機能を示す。Ｒａｊｉ－ｈＴＩＧＩＴ標的細胞は、５％のウサギ補体血清の存在下で抗ＴＩＧＩＴＡｂとインキュベートされた。ＣＤＣ活性が、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を３回反復して測定された。Ａｂは１５～２０μｇ／ｍｌで試験された。Ｔ４ｍＩｇＧＡｂ（Ａ）、ＣＳ１９ＭＥ３－２３ｍＩｇＧＡｂ（Ｂ）、またはｈＩｇＧＡｂ（Ｃ－Ｄ）を介したＣＤＣ応答の検出が実施された（「ｎｓ」：有意性なし；^****Ｐ＜０．０００１）。マウスモデルにおけるＦｃ介在エフェクター機能に依存する抗ＴＩＧＩＴＡｂの強い抗腫瘍活性を示す。Ａ）ＣＴ２６、Ａ２０、または４Ｔ１細胞株上のｍＣＤ１５５の発現。抗体投与の時点は矢印でマークされている。腫瘍体積は平均±ＳＥＭとして示されている。Ｂ－Ｃ）ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＣＳ１９ＭＥ３－３０－Ｎ－ｍＩｇＧ２ａ、Ｔ４－ｈＩｇＧ１、またはＴ４－ｍＩｇＧ２ａの抗腫瘍活性。抗体投与の時点は矢印でマークされている。腫瘍体積は平均±ＳＥＭとして示されている。Ｄ）Ａ２０または４Ｔ１腫瘍モデルにおけるＴ４－ｍＩｇＧ２ａの抗腫瘍活性。抗体投与の時点は矢印でマークされている。腫瘍体積は平均±ＳＥＭとして示されている。Ｅ－Ｆ）ＣＴ２６およびＡ２０腫瘍モデルにおけるＴ４またはＣＳ１９ＭＥ３－２３ＡｂおよびそれらのＦｃ変異体の抗腫瘍活性。抗体投与の時点は矢印でマークされている。腫瘍体積は平均±ＳＥＭとして示されている。マウスにおける抗ＴＩＧＩＴＡｂの薬物動態プロファイルの結果を示す。Ａ－Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴ４（Ａ）またはＣＳ１９ＭＥ３－２３Ａｂ（Ｂ）（１０ｍｇ／ｋｇ）の単回投与の対数血清Ａｂ濃度対時間プロファイルが示されている。Ｃ－Ｄ）Ｃ５７ＷＴ（Ｃ）またはＣ５７－ｈＦｃＲｎ（Ｄ）マウスにおけるＣＳ１９ＭＥ３－３０－Ｎ－ｈＩｇＧ１Ａｂ（５ｍｇ／ｋｇ）の単回投与の血清Ａｂ濃度対時間プロファイルが示されている。データは平均値±ＳＥＭとして示されている。実施例９の枯渇研究の結果を示す。Ａ）Ｔ４Ａｂの最適な治療効果にはＴ細胞が必要とされる。ＣＴ２６腫瘍を治療するためのＴ４Ａｂの抗腫瘍効果は、ＢＡＬＢ／ｃ（ｎ＝５／群）およびヌードマウス（ｎ＝６／群）で比較された。Ｂ－Ｋ）ＣＴ２６またはＡ２０腫瘍の治療におけるＴ４Ａｂの治療効果に対する選択的免疫細胞不足の影響。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させるために、ＣＤ４枯渇抗体（クローンＧＫ１．５）またはＣＤ８枯渇抗体（クローン２．４３）が使用された。ＮＫ細胞、好中球、またはマクロファージの枯渇のために、それぞれ、抗アシアロＧＭ１ポリクローナル抗体（Ｐｏｌｙ２１４６０）、抗Ｌｙ６Ｇ抗体（１Ａ８クローン）、またはクロドロネートリポソーム（ＦｏｒｍｕＭａｘ）が使用された。黒い矢印は、枯渇抗体またはクロドロネートリポソームの投与を示す。Ｔ４Ａｂ治療（１０ｍｇ／ｋｇ）は灰色の矢印で示されている。経時的な腫瘍体積が示されている（ｎ＝４～６／群）。本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体での治療によって誘発された免疫記憶を示す。Ａ）Ｔ４Ａｂ治療により治癒したＣＴ２６腫瘍担持マウスに、ＣＴ２６、Ａ２０、または４Ｔ１がリチャレンジされた。矢印はリチャレンジの時点を示す。年齢が一致したナイーブマウスは対照として含まれた。ｎ＝３～５／群。Ｂ）Ｔ４Ａｂ治療により治癒したＡ２０腫瘍担持マウスに、Ａ２０、ＣＴ２６、または４Ｔ１がリチャレンジされた。研究はパネルＡと同様に実施された。異なる用量での抗ＴＩＧＩＴＡｂ（ＣＳ１９ＭＥ３－３０－Ｎ－ｈＩｇＧ１－ａｆｕｃｏ）の抗腫瘍効果を示す。投与の時点は矢印でマークされている。腫瘍体積は平均±ＳＥＭとして示されている。抗ＴＩＧＩＴＡｂおよび抗ＰＤ－１（または抗ＰＤ－Ｌ１）Ａｂの相乗的な抗腫瘍効果を示す。Ａ）無治療対照群、抗ＴＩＧＩＴＡｂ治療群（ＣＳ１９ＭＥ３－３０－Ｎ－ｍＩｇＧ２ａ、１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍＰＤ－１Ａｂ治療群（ＲＭＰ１－１４、３ｍｇ／ｋｇ）、および併用治療群により得られたＭＣ３８を有するＣ５７マウスにおける抗腫瘍効果の比較。Ｂ）およびＣ）同様の平均ＣＴ２６腫瘍体積（１２０～２７０ｍｍ³）に基づいて以下の群に無作為化されたＣＴ２６を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗腫瘍効果の比較：無治療対照群、抗ＴＩＧＩＴＡｂ治療群（ＣＳ１９ＭＥ３－３０－Ｎ－ｈＩｇＧ１－ａｆｕｃｏ、１ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍＰＤ－１Ａｂ治療群（ＲＭＰ１－１４、５ｍｇ／ｋｇ）または自作抗ｍＰＤ－Ｌ１Ａｂ治療群（ｍＰ４、１０ｍｇ）／ｋｇ）、および併用治療群。抗体治療の時点は矢印でマークされている。腫瘍体積は平均±ＳＥＭとして示されている。

定義
本文書の他の場所で特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての他の技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。

添付の特許請求の範囲を含め、本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの単語の単数形は、文脈が明確に別段指示しない限り、それらの対応する複数参照を含む。

「または」という用語は、文脈が明確に別段指示しない限り、「および／または」という用語を意味し、それと交換可能に使用される。

本開示に関連して、別段に指示がない限り、「含む（comprise）」という文言、および「含む（comprises）」および「含むこと（comprising）」などのその変形は、明記された要素、たとえば、アミノ酸配列、ヌクレオチド配列、特性、工程、またはそれらの群を含蓄することを暗示すように理解されるが、任意の他の要素、たとえば、アミノ酸配列、ヌクレオチド配列、特性、および工程を除外するものではない。本明細書で使用される場合、「含む（comprise）」という用語またはその変形は、「含有する（contain）」、「含む（include）」、または場合によっては「有する（having）」という用語、またはそれらの同等の変形で置き換えることができる。特定の実施形態では、「含む（comprise）」という文言は、「からなる（consisting of）」のシナリオも含む。

抗体およびその抗原結合断片
別段の指示がない限り、本明細書で使用されるような用語「抗体」または「Ａｂ」は、ヒトＴＩＧＩＴおよびマウスＴＩＧＩＴを認識してそれらに結合する限り、抗体の他に抗体断片も最も広い意味で包含する。本出願の抗体は、概して、単一特異性抗体を指す。しかし、本出願はまた、異種特異性（ヘテロ特異性）を有する抗体または多重特異性抗体も企図している。「抗体断片」および「抗原結合断片」は交換可能であり、通常、抗原のための結合領域または可変領域を含む全長抗体の一部を意味する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二特異性抗体；線形抗体；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多重特異性抗体を挙げることができる。

「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、抗体が他のタンパク質と比較して特定の標的に優先的に結合することを意味するが、この特異性は絶対的な結合特異性を必要としない。抗体は、その結合がサンプルにおける標的タンパク質の存在を決定する場合に、その意図した標的に対して「特異的」であると見なされ、たとえば、偽陽性などの望ましくない結果を生み出すことはない。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、非標的タンパク質との親和性よりも少なくとも２倍を超える、好ましくは少なくとも１０倍を超える、より好ましくは少なくとも２０倍を超える、最も好ましくは少なくとも１００倍を超える親和性で標的タンパク質に結合する。代替的にまたは付加的に、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、その標的タンパク質に対する、具体的には、１×１０^-7Ｍ未満、１×１０^-8Ｍ未満、１×１０^-9Ｍ（１ｎＭ）未満、１×１０^-10Ｍ未満、１×１０^-11Ｍ未満、またはさらには１×１０^-12Ｍ（１ｐＭ）未満のＫＤ値によって表されるようなｈＴＩＧＩＴとｍＴＩＧＩＴの両方に対する結合親和性を有する。

本明細書で使用されるような「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。ヒト抗体は、マウス、マウス細胞、またはマウス細胞由来のハイブリドーマで産生される場合、マウスの糖鎖を含み得る。同様に、「マウス抗体」は、それぞれ、マウスまたはラットの免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。

ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する本発明の抗体は、ヒトＴＩＧＩＴのマウスオルソログとも交差反応性を示す。本明細書で使用されるような「交差反応性」という用語は、他の種に由来する同種またはオルソロガスのタンパク質と反応する抗体の能力を指す。抗体の交差反応性は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して判定することができる。たとえば、これは、表面プラズモン共鳴（たとえば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技術（たとえば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）を介する結合親和性の測定によって判定することができる。

本出願の抗体は、不要な物質を取り除くための精製プロセスに付され、結果として精製された抗体を得ることができる。抗体を精製するための従来の方法には、限定されないが、当該技術分野で周知のカラムクロマトグラフィー法が含まれる。

本発明の抗体または抗原結合断片は単離された抗体であり得る。「単離された」という用語とは、抗体または抗原結合断片が、それらが産生される細胞、細胞培養物、増殖培地、発現系からの他の生物学的物質または非生物学的物質を少なくとも部分的に含まないことを意味する。上記物質には、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、緩衝液、塩、または細胞破片および増殖培地などの他の材料が含まれ得る。

本出願は、１つまたは複数の保存的置換を含む抗体またはその抗原結合断片も企図するが、これは、抗体または抗原結合断片が、ｈＴＩＧＩＴおよびｍＴＩＧＩＴに結合し、本明細書に記載されるような抗体の特性の少なくとも１つを保有することを前提とする。アミノ酸の「保存的置換」は、当該技術分野で周知であり、概して、１つのアミノ酸残基を構造または機能において類似した側鎖を有する別のアミノ酸残基に変更することを指す。

本出願では、たとえば可変領域またはＣＤＲのコンセンサスアミノ酸配列は、本出願の関連抗体の複数の配列を整列させ、各位置で最も頻繁に示される残基を特定することによって決定される。結果として、コンセンサス配列は、アラインメントを行うために使用される本出願の特異抗体に対する高い配列相同性を共有する。（配列全体のアミノ酸配列の３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、または１０％未満）の少数のアミノ酸にのみコンセンサス配列とは異なる可変領域またはＣＤＲを含む抗体が、特にアラインメントに示されるような可変位置で、アラインメントに関与する特異抗体に類似した特性を有し得、本出願によって包含されるべきであることが企図され得る。

本出願はまた、本出願の抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸配列を提供する。「単離された核酸」または「単離されたポリヌクレオチド」とは、単離されたポリヌクレオチドが自然界で見られるポリヌクレオチドの全部または一部から除去された、または自然界では結合されていないポリヌクレオチドに結合されたＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。特異的なヌクレオチド配列を「含む」単離された核酸分子は、特異的な配列に加えて、列挙された核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に結合された制御配列を含み得る。コドン縮重が要因で、当業者は、特定のアミノ酸配列が異なるヌクレオチド配列によってコードされ得ることを理解することができる。

「エフェクター機能」、具体的には「Ｆｃ介在エフェクター機能」とは、Ｆｃ受容体と抗体のＦｃ領域との相互作用または結合から結果として生じた効果を指し、たとえば、Ｃ１複合体上のＣｌｑへの結合、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃγＲ介在エフェクター機能を含む。本出願の抗体は、エフェクター機能を有していても有していなくてもよい。

当該技術分野で既知であるように、抗体のエフェクター機能は、抗体のＦｃおよび／または定常領域のアミノ酸配列または翻訳後修飾を変更することによって調節することができる。本出願の抗体のｍＩｇＧ２ａ－ＤＬＥ変異体（Ｔ４またはＣＳ１９ＭＥ３－２３）は、野生型ｍＩｇＧ２ａを有する抗体と比較して、抗腫瘍効果が向上していることが分かった。ｍＩｇＧ２ａ－ＤＬＥ変異体は、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ機能を示したが、ＣＤＣ機能は示さなかった。したがって、好ましい実施形態では、本出願は、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ機能を有するがＣＤＣ機能を有さない第１の態様の抗体に関するか；またはＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ機能が増強され、ＣＤＣ機能が低減されたかまたは存在しない第１の態様の抗体のＦｃ変異体に関する。

本出願に関連して、「免疫記憶」または「免疫学的記憶」とは、免疫系が、特定のチャレンジに対する免疫を確立し、それにより、その後のチャレンジが発生したときに効率的に応答することができることを意味する。本出願の具体的な実施形態では、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体によって作り出された免疫記憶は、抗体の投与が、腫瘍またはがんを減少させるだけでなく、被験体を二次または再発の腫瘍またはがんからも保護することを意味する。より好ましくは、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体によって誘発された免疫記憶は、種々のタイプのがんに対する交差保護を提供する。すなわち、抗体が１つの腫瘍を治療するために使用される場合、交差保護免疫記憶が確立され、本出願の抗体に応答する別の腫瘍を発症することからも被験体を保護する。

治療用途
本開示は、がんおよびウイルス感染、たとえば慢性ウイルス感染などの免疫関連疾患を予防する、治療する、または免疫関連疾患の再発を予防するための方法であって、本出願の第１の態様の治療上有効な量の抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片、または本出願の第２の態様の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。

本明細書で使用されるような「治療上有効な量」という用語は、疾患、または疾患もしくは障害の臨床症状の少なくとも１つを治療するために被験体に投与されるときに、疾患、障害、または症状のためのそのような治療を有効にするのに十分な抗体の量を指す。「治療上有効な量」は、抗体、疾患、障害、および／または疾患もしくは障害の症状、疾患、障害、および／または疾患もしくは障害の症状の重症度、治療される被験体の年齢、および／または治療される被験体の体重によって変化し得る。任意の所与の例における適切な量は、当業者に明らかであり得るか、または定期的な実験によって判定され得る。併用療法の場合、「治療上有効な量」は、疾患、障害、または病状の有効な治療のための組み合わせ対象の総量を指す。

本出願に関連して、「被験体」とは、動物、好ましくは哺乳動物、たとえば霊長類、好ましくは高等霊長類、たとえばヒトを指す。

本明細書における「がん」または「腫瘍」という用語は、典型的に調節されていない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物の生理学的状態を意味するか、または説明する。本出願の抗体によって治療することができるがんには、固形腫瘍および血液悪性腫瘍の両方、たとえば、乳がん、リンパ腫、および結腸直腸がんが含まれる。

本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、限定されないが、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＯＸ４０抗体、および抗ＣＴＬＡ４抗体を含む、追加の治療薬と組み合わせて使用することができる。

実施例１．抗ＴＩＧＩＴ抗体の産生
本実施例は、ライブラリスクリーニングからの本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体の産生を説明する。

抗原標的－ＴＩＧＩＴ－ＥＣＤおよびｍＴＩＧＩＴ－ＥＣＤ
ｈＴＩＧＩＴおよびｍＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、ライブラリスクリーニングの標的として使用した。両方のＥＣＤを、ビオチン化組換え融合タンパク質として発現した。ｈＴＩＧＩＴ－ＥＣＤおよびｍＴＩＧＩＴ－ＥＣＤの配列アラインメントを図１に示す。

ファージディスプレイ抗体ライブラリ
ヒト非免疫ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体ライブラリを、９３人の健常ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から構築した。ライブラリのサイズは合計１．１×１０¹⁰のメンバーであった（Li D, et al. A potent human neutralizing antibody Fc-dependently reduces established HBV infections. Elife 2017;6）。

ファージ抗体ライブラリの選択およびスクリーニング
表面にｓｃＦｖを発現するファージ粒子（ファージ－ｓｃＦｖ）をライブラリから調製し、精製抗原に対するファージ－ｓｃＦｖの選択に使用した。第１ラウンドの選択は、ビオチン化ｈＴＩＧＩＴ－ＥＣＤタンパク質を、ストレプトアビジン結合磁気Ｍ－２８０Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社（Life Technologies））上に捕捉し、その後、ライブラリから調製した１×１０¹³のファージ粒子とインキュベートした。第２ラウンドの選択は、ｈＴＩＧＩＴ－ＥＣＤ－ビオチンまたはｍＴＩＧＩＴ－ＥＣＤ－ビオチンタンパク質を、Ｍ－２８０Ｄｙｎａｂｅａｄｓ上に捕捉し、第１ラウンドの選択から調製したファージ粒子とインキュベートした。各ラウンドの選択は、高親和性Ａｂを得るために、磁気ビーズ上に捕捉された抗原の量を最適化し、広範な洗浄工程を適用した。ライブラリの選択は独立して２回繰り返した。

続いて、単一のクローンを選択し、レスキューして、細菌培養上清中にファージｓｃＦｖを生成し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってｈＴＩＧＩＴとｍＴＩＧＩＴの両方に結合特異性を有する抗体をスクリーニングした。ｈＴＩＧＩＴおよびｍＴＩＧＩＴと交差反応したクローンを、ＯＤ４５０（ｈＴＩＧＩＴおよびｍＴＩＧＩＴの両方に対して＞０．６）に基づいて選択した。クローンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域のヌクレオチド配列を配列決定した。それらの対応するアミノ酸配列を整列させて、さらなる特徴付けのために種々の配列を有する抗体を特定した。

２ラウンドの選択後、約３０００個のファージ－Ａｂクローンを、ＥＬＩＳＡを使用してｈＴＩＧＩＴ－ＥＣＤとｍＴＩＧＩＴ－ＥＣＤの両方に対する交差結合活性についてスクリーニングし、それにより、交差結合活性を有する約１００個のクローンを得た。続いて、これらをｈＩｇＧ１形式に変換し、ＦＡＣＳを使用してｈＴＩＧＩＴとｍＴＩＧＩＴの両方を発現するＣＨＯ細胞への結合を解析した。

最適な抗体候補を特定するための固有配列を有するＡｂのさらなる特徴付け
固有配列を有する抗体クローンを、精製ファージ－ｓｃＦｖ粒子または全長ヒトＩｇＧ１のいずれかとして生成し、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、またはＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によってＣＤ１５５へのそれらの結合活性およびＣＤ１５５への競争的結合を試験した。これらのアッセイの結果に基づいて、Ａｂを、それらの結合活性および競争活性に従ってランク付けした。さらなる開発のために上位ランクの抗体を選択した。

結合および競争活性の解析のための精製ファージ－ｓｃＦｖの調製
１０～３０ｍＬの細菌培養の上清中のファージ－ｓｃＦｖをＰＥＧ／ＮａＣｌによって沈殿させ、その後、分光計で定量化した。ファージ－ｓｃＦｖを、ファージ－Ａｂの段階希釈を行い、同じ濃度に正規化することによって、ＴＩＧＩＴ結合活性およびＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との間の相互作用をブロックする活性について評価した。

全長ＩｇＧ１抗体の調製
ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬのコード配列を、抗体重鎖（ＨＣ）発現ベクターおよび軽鎖（ＬＣ）発現ベクターに別々にクローニングした。ＩｇＧＡｂを産生するために、２９３Ｆ（ライフテクノロジー社）細胞を、１：１の比率で２つの発現プラスミド（ＨＣ＋ＬＣプラスミド）で共トランスフェクションした。トランスフェクションの３～５日後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡセファロースＣＬ－４Ｂ、ＧＥヘルスケア社（GE Healthcare）によるＩｇＧＡｂの精製のために細胞培養上清を回収した。

ＥＬＩＳＡに基づく結合および競争アッセイ
ＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイは、ビオチン化タンパク質抗原を、ストレプトアビジン（シグマ社（Sigma））で被覆した９６ウェルプレート（ヌンク社（Nunc）、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標））で捕捉した。ファージ－ｓｃＦｖベースのＥＬＩＳＡについては、段階希釈したファージ－ｓｃＦｖを加え、その後、マウス抗Ｍ１３－ＨＲＰ抗体（ＧＥヘルスケア）を加えることによって検出した。全長ヒトＩｇＧベースのＥＬＩＳＡアッセイについて同様のプロセスを実施した。結合したＡｂを、マウス抗ヒトＩｇＧＦｃ－ＨＲＰ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific））を使用して検出した。

ＥＬＩＳＡに基づく競争アッセイは、試験したＡｂを、競争リガンド、ヒトＣＤ１５５、およびマウスＣＤ１５５の存在下で捕捉された抗原とインキュベートしたことを除いて、ＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイと類似した方法で実施した。簡単に説明すると、段階希釈した濃度の種々のヒトＩｇＧ１抗体を、マウスＦｃタグと融合したｈＣＤ１５５またはｍＣＤ１５５（ｈＣＤ１５５－ｍＦｃまたはｍＣＤ１５５－ｍＦｃ）の細胞外ドメイン２μｇ／ｍＬと混合し、ＥＬＩＳＡプレートに加えて、ＴＩＧＩＴへの結合をＣＤ１５５と競争させた。シグナルを、ＨＲＰ－抗マウスＩｇＧ二次抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用したリガンド検出を介して測定した。

ＦＡＣＳに基づく結合および競争アッセイ
ｈ／ｍＴＩＧＩＴの全長を安定して発現するＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＴおよびＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＴ）をこのアッセイで使用した。細胞株の構築のために、全長（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤＱ４９５Ａ１）またはｍＴＩＧＩＴ（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤＰ８６１７６）をコードするＤＮＡ断片をベクターに挿入することによって、発現プラスミドを構築した。その後、発現プラスミドをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、続いて、これらの安定細胞株のために、１０Ａ７（Ｇｅｎｅｔｅｃｈによって産生された抗ＴＩＧＩＴＡｂ）染色陽性集団のＦＡＣＳソーティングを行った。

ＦＡＣＳに基づく結合アッセイは、ＣＨＯ－ｈ／ｍＴＩＧＩＴ細胞株を、１時間４℃で１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中において５μｇ／ｍＬの種々のｈＩｇＧ１Ａｂとインキュベートした。その後、細胞を１％のＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ－ＦＩＴＣＡｂ（Ｐｉｅｒｃｅ－サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を加えることによって、細胞に結合するＡｂを検出した。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術による結合動態解析
ｈＴＩＧＩＴまたはｍＴＩＧＩＴの細胞外ドメインへのＴ４およびＴ４のＦｃ変異体の結合の動態解析を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥヘルスケア社）で実施した。アミンカップリングキット（ＧＥヘルスケア社）を使用して、抗ｈＦｃＡｂ（サーモフィッシャー社）をＣＭ５センサチップの表面に共有結合させた。最適濃度のＡｂをチップ上に捕捉し、その後、分析物（ｈＴＩＧＩＴまたはｍＴＩＧＩＴ）を、判定された濃度または２倍連続希釈濃度で注入した。結合動態を、１：１のラングミュア結合モデルを使用して評価した。会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、および親和定数（ＫＤ）を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウェアを使用して計算した。

ＦＡＣＳに基づく結合解析に従って、５つのクローン（Ｔ４、＃１８、＃４３、＃４５、およびｈｍ７）が、ＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＴおよびＣＨＯ－ｍＴＩＧＩＴ細胞の両方に対して高い交差結合親和性を示した（図２Ａ）。それらのｈＴＩＧＩＴとｍＴＩＧＩＴの両方に対する結合動態により、２つの上位ランクのＡｂ、Ｔ４およびｈｍ７Ａｂを主要な候補として選択した（図２Ｂ）。これらの２つのＡｂ、Ｔ４およびｈｍ７は、ｈＴＩＧＩＴとｍＴＩＧＩＴの両方との特異的結合を示し、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、またはＳＰＲアッセイにおいてＴＩＧＩＴに対してそのリガンドＣＤ１５５との競争活性を示した（図３～４）。

実施例２．ＶＬ鎖シャッフリングによるＴ４の結合親和性の向上
Ｔ４結合親和性をさらに向上させるために、本発明者らは、Ｔ４のＶＨが固定され、異なるＶｋ（カッパ可変軽鎖）鎖のライブラリと対になった、ＶＬ鎖をシャッフルしたファージディスプレイライブラリを作製した。構築した最終ライブラリ（Ｔ４ＶＨ／Ｖｋｌｉｂ）のサイズは約２．８×１０⁸であった。

ストレプトアビジン結合磁気Ｍ－２８０Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社）上に捕捉されたｈＴＩＧＩＴを標的として使用することによって、Ｔ４ＶＨ／Ｖｋｌｉｂを２ラウンドの間スクリーニングした。ｈＴＩＧＩＴとの結合に関してＥＬＩＳＡを使用して１９６個のクローンをスクリーニングした。ほとんどのクローンが陽性であり、それらを配列決定のために選択した。異なるＶｋ鎖配列を有する９個のクローン、１－４４、１－４８、１－６０、１－６６、１－９３、３－５、３－１２、３－１７、および３－９６を、ファージＥＬＩＳＡによって同定した。これらのＡｂを、全長ヒトＩｇＧ１に変換し、Ｂｉａｃｏｒｅを使用してｈＴＩＧＩＴまたはｍＴＩＧＩＴへの結合を試験した。図５に示すように、９個のクローンの中で、クローン１－４８は、他のＡｂよりもｈＴＩＧＩＴとｍＴＩＧＩＴの両方に対して最も強い結合活性を示した。これらのクローンのＶＨ配列は、配列番号８で同一であり、配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされる。これらのクローンのＶｋ配列は図６に示され、ここで、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）は、ＫａｂａｔシステムによるそれぞれのＶｋのアミノ酸配列において、それぞれ、アミノ酸２４～３４、アミノ酸５０～５６およびアミノ酸８９～９７である。

さらなる配列解析では、１－４８ＡｂのＶｋのＣＤＲ２におけるＳ５０およびＹ５２が、１－４８Ａｂの親和性の向上に寄与したことを示唆した（図６）。

この結果に基づいて、抗体Ｔ４Ｍを産生して、これらの２つのアミノ酸（Ｓ５０およびＹ５２）をＴ４の生殖系列Ｖｋ配列に組み込んだ。結合動態の解析では、変異体Ｔ４Ｍが、親Ｔ４Ａｂと比較して、特にｈＴＩＧＩＴに対する結合親和性を向上させたことを確認した（図７）。

実施例３．ＶＬ鎖シャッフリングによるｈｍ７の結合親和性の向上
ｈｍ７結合親和性をさらに向上させるために、本発明者らは、ｈｍ７のＶＨが固定され、異なるＶｌ（ラムダ可変軽鎖）鎖のライブラリと対になった、ＶＬ鎖をシャッフルしたファージディスプレイライブラリを作製した。構築されている最終ライブラリ（ｈｍ７ＶＨ／Ｖｌｌｉｂ）のサイズは約１×１０⁸であった。

ストレプトアビジン結合磁気Ｍ－２８０Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社）上に捕捉されたｈＴＩＧＩＴを標的として使用することによって、ｈｍ７ＶＨ／Ｖｌｌｉｂを２ラウンドの間スクリーニングした。ｈＴＩＧＩＴとの結合に関してＥＬＩＳＡによって５７６個のクローンをスクリーニングした。ほとんどのクローンが陽性であり、それらを配列決定のために選択した。４７のＡｂを、全長ｈＩｇＧ１に変換し、ＳＰＲを使用してｈＴＩＧＩＴまたはｍＴＩＧＩＴへの結合を試験した。異なるＶｌ鎖配列を有する１８個のクローン、Ｔｍ１、Ｔｍ３、Ｔｍ４、Ｔｍ５、Ｔｍ６、Ｔｍ７、Ｔｍ８、Ｔｍ９、Ｔｍ１０、Ｔｍ１１、Ｔｍ１２、Ｔｍ１３、Ｔｍ１４、Ｔｍ１５、Ｔｍ１７、Ｔｍ１８、Ｔｍ１９およびＣＳ１９は、ｈＴＩＧＩＴへの結合に関して親Ａｂｈｍ７よりも高い親和性を示した（図８）。中でも、ＣＳ１９は、他のＡｂよりもｈＴＩＧＩＴとｍＴＩＧＩＴの両方に対して最も強い結合活性を示した。

潜在的な望ましくない翻訳後修飾および免疫原性を最小限に抑えるため、ＣＳ１９をさらに変更した。ＣＳ１９Ａｂに由来する２つの新しいＶｌを生成し、それぞれ、ＣＳ１９ＭＥ－Ｖｌ（ＣＳ１９－Ｖｌ－Ｑ１０８Ｋ／Ｍ４９Ｌ／Ｎ９７Ｅ）およびＣＳ１９ＭＥ－Ｎ－Ｖｌ（ＣＳ１９－Ｖｌ－Ｑ１０８Ｋ／Ｍ４９Ｌ／Ｎ９７Ｅ／Ｋ５５Ｎ）と命名した（図９）。

ｈｍ７抗体のＶＨについては、２つの新しいＶＨを、生殖細胞系解析に基づいて構築し、それぞれ、ｈｍ７－３－２３－ＶＨ（ｈｍ７－ＶＨ－Ｖ１１Ｌ／Ｒ１６Ｇ）およびｈｍ７－３－３０－ＶＨ（ｈｍ７－ＶＨ－Ｅ１Ｑ／Ｌ５Ｖ）と命名した（図１０）。

上述のＶＨとＶＬを組み合わせて、２つの新しい抗体、ＣＳ１９ＭＥ３－２３Ａｂ（重鎖：ｈｍ７－３－２３－ＶＨ；軽鎖：ＣＳ１９ＭＥ－Ｖｌ）およびＣＳ１９ＭＥ３－３０－ＮＡｂ（重鎖：ｈｍ７－３－３０－ＶＨ；軽鎖：ＣＳ１９ＭＥ－Ｎ－Ｖｌ）を産生した。それらは両方とも、それらの親ｈｍ７Ａｂと比較して、増強された結合親和性を示した（図１１）。

ｈｍ７およびｈｍ７由来のクローンのＶＨおよびＶＬ配列を、それぞれ、図１０および図９に列挙する。図９に示されるように、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）は、ＫａｂａｔシステムによるそれぞれのＶＬのアミノ酸配列において、それぞれ、アミノ酸２３～３４、アミノ酸５２～５８およびアミノ酸９１～１０２である。図１０に示されるように、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）は、ＫａｂａｔシステムによるそれぞれのＶＬのアミノ酸配列において、それぞれ、アミノ酸３１～３５、アミノ酸５０～６６およびアミノ酸９９～１１３である。

実施例４．抗ＴＩＧＩＴ抗体のエピトープマッピング
エピトープマッピングのために、ｈＴＩＧＩＴの細胞外領域の残基をｈＣＤ１５５Ｄ１の対応する残基と置き換えることによって、ヒトＴＩＧＩＴＩｇＶドメインおよびｈＣＤ１５５のＮ末端ＩｇＶドメインＤ１のキメラを構築した。３つのｈＴＩＧＩＴ変異体および３つのキメラを、図１２Ａ～Ｃに示されるように作製した。これらのキメラおよび変異体を、ＣＨＯまたは２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、それらの細胞表面発現レベルを、キメラおよび変異体またはｈＣＤ１５５－ｈＦｃの各々に融合されたＮ末端タグを認識するｍＡｂＧＣ３３を使用することによって評価した（４）。ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用することによって、これらのトランスフェクタントへのヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）フォーマットまたはｈＣＤ１５５－ｈＦｃの試験Ａｂの結合を検出した。その後、細胞をＦＡＣＳ装置（ＢＤＡｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６）で解析した。

これらのｈＴＩＧＩＴ／ｈＣＤ１５５キメラまたはｈＴＩＧＩＴ変異体でＣＨＯ細胞をトランスフェクトし、続いて、ＦＡＣＳによりこれらのＣＨＯトランスフェクタント細胞に結合するＴ４Ａｂ、ＣＳ１９ＭＥ３－２３Ａｂ、およびＣＳ１９ＭＥ３－３０－ＮＡｂを解析することによって、ｈＴＩＧＩＴの細胞外ＩｇＶドメインのＦＧループが、これらのＡｂの結合に重要であることを特定した（図１２Ｂ）。ＦＧループがｈＣＤ１５５リガンドへの結合にも重要であり、これが以前の発見と一致していることが分かった（５）。したがって、ＦＧループに結合することによって、これらの３つのＡｂは、ＴＩＧＩＴのそのリガンドＣＤ１５５への結合をブロックする。ｈＴＩＧＩＴとｍＴＩＧＩＴとの間のこのループにおけるアミノ酸配列相同性が高いため、これらの３つのＡｂは、それらの両方と交差反応することができる。すなわち、Ｔ４Ａｂ、ＣＳ１９ＭＥ３－２３Ａｂ、およびＣＳ１９ＭＥ３－３０－ＮＡｂは、ヒトおよびマウスのＴＩＧＩＴに対して異種間反応性を保有している。

さらに、エピトープマッピングの結果に基づいて、Ｃ－Ｃ’ループは、ＴＩＧＩＴへのＣＳ１９ＭＥ３－２３およびＣＳ１９ＭＥ３－３０－Ｎの結合にも関与している。

米国特許出願公開第２０１８／０１８６８７５号明細書（ジェネンテック）は、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸残基Ｓ７８、Ｓ８０、およびＫ８２が抗ＴＩＧＩＴ抗体の重要なエピトープ残基であることを示した。ｈＴＩＧＩＴへの本開示の抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合におけるこれらの残基の役割を調査するために、Ｓ７８Ａ、Ｓ８０Ａ、およびＫ８２Ａから選択される単一の点突然変異を各々が有する３つのｈＴＩＧＩＴ変異体を作製した。これらのｈＴＩＧＩＴ変異体で２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、続いて、ＦＡＣＳによりこれらの２９３Ｔトランスフェクタント細胞に結合するＣＳ１９ＭＥ３－３０－ＮＡｂを解析することによって、ｈＴＩＧＩＴの細胞外ＩｇＶドメインにおける３つの残基がいずれも、これらのＡｂの結合に重要ではないことを特定した（図１２Ｃ）。

実施例５．抗ＴＩＧＩＴ抗体はＥＬＩＳＡにおいて有効なリガンドブロック機能を発揮する
ＥＬＩＳＡに基づく競争アッセイは、試験したＡｂを、競争リガンドの存在下で捕捉された抗原とインキュベートしたことを除いて、ＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイと類似した方法で実施した。簡単に説明すると、段階希釈した濃度の種々のヒトＩｇＧ１抗体を、マウスＦｃタグと融合したｈＣＤ１５５（ｈＣＤ１５５－ｍＦｃ）の細胞外ドメイン０．０５μｇ／ｍＬ、マウスＦｃタグと融合したｍＣＤ１５５（ｍＣＤ１５５－ｍＦｃ）のの細胞外ドメイン０．８μｇ／ｍＬ、またはマウスＦｃタグと融合したｈＣＤ１１２（ｈＣＤ１１２－ｍＦｃ）のの細胞外ドメイン５μｇ／ｍＬと混合し、ＥＬＩＳＡプレートに加えて、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との間の結合について競争させた。シグナルを、ＨＲＰ－抗マウスＩｇＧ二次抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用したリガンド検出を介して測定した。

ＣＤ１５５（ＰＶＲまたはＮｅｃｌ－５としても知られる）およびＣＤ１１２（Ｐｖｒｌ２またはＮｅｃｔｉｎ－２としても知られる）は、多くのがん細胞上で高発現される２つの主要なリガンドである（６）。それらは両方ともＴＩＧＩＴと相互作用して、Ｔ／ＮＫ細胞機能を阻害する（６）。ＴＩＧＩＴ結合に対する抗ｈＴＩＧＩＴＡｂの競争活性が確認された。結果は、抗ｈＴＩＧＩＴＡｂが、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＴＩＧＩＴに対するそのリガンドＣＤ１５５またはＣＤ１１２との競争活性を示したことを示した（図１３Ａ～Ｃ）。

実施例６．抗ＴＩＧＩＴ抗体は細胞に基づくアッセイにおいて有効なリガンドブロック機能を発揮する
本実施例では、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体のリガンドブロック機能を示すために、本発明者らによって実施されたＮＫ細胞の細胞毒性アッセイが説明される。

１）安定細胞株の確立
以前の研究では、ＹＴＳ細胞（ＮＫ細胞株）が、７２１．２２１標的細胞（ＭＨＣクラスＩ陰性のヒトＢ細胞株）の限定的な死滅を達成することが示され（６－８）、かつＹＴＳ細胞においてｈＴＩＧＩＴを発現させ、そして７２１．２２１細胞においてｈＣＤ１５５を発現させることによって、この死滅を効果的に阻害することができることが示された（６、７）。

本発明者らは、ｈＴＩＧＩＴを安定して発現するＹＴＳ細胞（ＹＴＳ－ｈＴＩＧＩＴ）およびｈＣＤ１５５を安定して発現する７２１．２２１細胞（７２１．２２１－ｈＣＤ１５５）を確立した（図１４Ａ～Ｂ）。安定細胞株の作製については、ｈＴＩＧＩＴまたはｈＣＤ１５５の全長ｃＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅し、哺乳動物細胞発現プラスミドへとクローニングした。ＹＴＳ細胞または７２１．２２１細胞を、それぞれ、製造元の指示に従って、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）またはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒトランスフェクションシステム（ロンザ社（Lonza）、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒｋｉｔＶ）を使用して、対応するプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、トランスフェクトした細胞を、それぞれ、ｈＣＤ１５５－ｈＦｃまたはｈＴＩＧＩＴ－ｈＦｃで免疫染色し、陽性細胞を選別した。選別によって同定された陽性細胞をＧ４１８の選択下で培養した。

２）細胞毒性アッセイ
７２１．２２１－ｈＣＤ１５５細胞（５０００細胞／ウェル）を、６時間、５μｇ／ウェルのＡｂの存在下で、種々のＥ：Ｔ（エフェクター対標的）でＹＴＳ－ｈＴＩＧＩＴとインキュベートした。その後、細胞による乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイキット（プロメガ社（Promega））の指示に従って検出した。細胞毒性のパーセンテージを製造元の指示に従って計算した。

結果として、ＹＴＳ上に発現したｈＴＩＧＩＴと７２１．２２１上に発現したｈＣＤ１５５との相互作用が、それらの親細胞（ＹＴＳから７２１．２２１へ）の死滅を効果的に阻害したことを確認した（図１４Ｃの左パネル）。

３）リガンドブロック機能アッセイ
本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体の効果を試験するために、上述のＮＫ細胞の細胞毒性アッセイを、抗体Ｔ４、ＣＳ１９ＭＥ３－２３、およびＣＳ１９ＭＥ３－３０－Ｎの存在下で実施した。Ｔ４、ＣＳ１９ＭＥ３－２３、およびＣＳ１９ＭＥ３－３０－ＮＡｂが、７２１．２２１－ｈＣＤ１５５細胞を死滅するＹＴＳ－ｈＴＩＧＩＴ細胞の能力を回復させたことが分かり（図１４Ｃの中央および右）、したがって、これらのＡｂが、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５相互作用媒介性の阻害機能を効率的にブロックすることが実証された。

実施例７．本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、インビトロでＦｃ介在エフェクター機能を誘発した
異なるＦｃに関連したキメラＡｂの構築
多様なキメラ抗体が、種々のヒトおよびマウスＩｇＧアイソタイプ（ｈＩｇＧ１、ｍＩｇＧ１、およびｍＩｇＧ２ａ）、およびｈＩｇＧ１とｍＩｇＧ２ａアイソタイプの３つのＦｃ変異体：消失したＦｃγＲ介在エフェクター機能を有するＦｃ－Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ（ＤＡＮＡ）またはＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ｇ（ＤＡＮＧ）の変異体（９～１３）；増強されたＦｃγＲ介在エフェクター機能を有するＦｃ－Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ＤＥ）変異体、Ｆｃ－Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ（ＤＬＥ）変異体、および脱フコシル化ｈＩｇＧ１（ＦＵＴ８ノックアウト２９３Ｆ細胞またはＣＨＯ細胞によって発現された）（１４～２２）に関連して構築された。

ＮＫ細胞株を使用したＡＤＣＣアッセイ
ＡＤＣＣアッセイに関して、全長ｈＴＩＧＩＴを安定して発現するＲａｊｉ細胞株（Ｒａｊｉ－ｈＴＩＧＩＴ）を確立し、本アッセイの標的細胞として使用した。ＦｃγＲ（ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）またはｍＦｃγＲＩＶ受容体）および活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）応答エレメント駆動ホタルルシフェラーゼレポーターを安定的に発現するＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２ｐ／ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）またはＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２ｐ／ｍＦｃγＲＩＶと命名された）を産生し、エフェクター細胞として使用した。

標的細胞（１５０００細胞／ウェル）を、Ｕ字形底の９６ウェル細胞培養プレートのウェルへと播種し、様々な濃度の異なるＡｂと短時間インキュベートした。その後、エフェクター細胞を、１％の熱不活性化ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中の様々な濃度の標的細胞およびＡｂを含有するウェルに加え（９００００細胞／ウェル）、３７℃で５時間インキュベートした。ＡＤＣＣ活性を、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ社）の説明書に従って、ルシフェラーゼ発現によって判定した。

マウスマクロファージを使用したＡＤＣＰアッセイ
ＡＤＣＰアッセイに関して、マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、本アッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。ＢＭＤＭを調製するために、マウス骨髄細胞を、Ｃ５７マウスの脛骨および大腿骨から収集し、３日間、Ｌ９２９上清中で顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）によって誘発した。Ｒａｊｉ－ｈＴＩＧＩＴ安定細胞株を、ＣＦＳＥで標識し、標的細胞として使用した。ＢＭＤＭを、標的細胞とのインキュベーション前に抗マウスＦ４／８０－ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ６４７（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で標識した。ＣＦＳＥ標識した標的細胞を、２×１０⁵細胞／ウェルの密度で蒔き、１５分間室温で本出願のさまざまな抗体（２０μｇ／ｍｌ）とインキュベートし、その後、ＤＭＥＭ＋１０％熱不活性化ＦＢＳ培地中で５％ＣＯ₂加湿インキュベーターにおいて２時間、３７℃で標識したＢＭＤＭ（１×１０⁵細胞／ウェル、結果として１：２のＥ：Ｔ比をもたらす）に加えた。ＮｉｋｏｎＡ１Ｒ共焦点顕微鏡を使用して、抗マウスＦ４／８０Ａｂ標識マクロファージによるＣＦＳＥ標識した標的細胞の食作用を記録した。

補体媒介性細胞毒性（ＣＤＣ）アッセイ
ＣＤＣアッセイに関して、Ｒａｊｉ－ｈＴＩＧＩＴ安定細胞を、標的細胞として使用し、４×１０⁵細胞／ウェルで９６ウェルのＵ字形底プレートに播種し、５％のウサギ血清（シグマ社）の存在下において示した濃度で本出願の１００ｎＭの抗ＴＩＧＩＴ抗体とインキュベートした。２時間のインキュベーション後、各ウェルにおける上清を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイキット（プロメガ社）を使用して、ＬＤＨ放出に関して解析した。

抗ＴＩＧＩＴＡｂが、腫瘍上のＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との間の相互作用とは無関係にそれらの抗腫瘍効果をどのように発揮するかを求めて、本発明者らはまず、抗ＴＩＧＩＴＡｂが、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣを含む、インビトロアッセイを使用してＦｃ介在エフェクター機能を保有するかどうかを調べた。

以前の研究では、マウスＦｃγＲＩＶが、マウスのＡＤＣＣに関与する主要な受容体であることが示され、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの「機能的」相同体となることを提案した（２３、２４）。ＡｂのＡＤＣＣを試験するために、本発明者らは、ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８対立遺伝子）またはｍＦｃγＲＩＶを発現するＪｕｒｋａｔＴリンパ球細胞（２３、２４）およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動させるＮＦＡＴ応答エレメントを、エフェクター細胞として使用し；ｈＴＩＧＩＴを安定して発現するＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ－ｈＴＩＧＩＴ）を標的細胞として使用したレポーター系を確立した。マウスＩｇＧＡｂのＡＤＣＣを試験するために、本発明者らは、マウスＦｃγＲＩＶおよびホタルルシフェラーゼの発現を駆動させるＮＦＡＴ応答エレメントを発現するＪｕｒｋａｔＴリンパ球細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２ｐ／ｍＦｃγＲＩＶ）を、エフェクター細胞として使用し、Ｒａｊｉ－ｈＴＩＧＩＴを標的細胞として使用した改変したシステム（２５）を使用した。一方、ｈＩｇＧＡｂのＡＤＣＣを試験するために、本発明者らは、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８対立遺伝子）およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動させるＮＦＡＴ応答エレメントを発現するヒトＪｕｒｋａｔＴリンパ球細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２ｐ／ｈＦｃγＲＩＩＩａ）を、エフェクター細胞として使用し、Ｒａｊｉ－ｈＴＩＧＩＴを標的細胞として使用した系（２５）を使用した（図１５Ａ）。このＡＤＣＣアッセイは、ｈＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ａアイソフォームのいずれかでのＴ４、ＣＳ１９ＭＥ３－２３、およびＣＳ１９ＭＥ３－３０－Ｎが、標的細胞に対してエフェクター細胞によって実行される細胞毒性効果を誘発したことを明らかにした。予想した通りに、ｈＩｇＧ１／ｍＩｇＧ２ａ－ＤＥ、ｈＩｇＧ１／ｍＩｇＧ２ａ－ＤＬＥ、およびｈＩｇＧ１脱フコシル化変異体が、野生型ｈＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ａよりも著しく高いＡＤＣＣ活性を示した；一方で、ｈＩｇＧ１／ｍＩｇＧ２ａ－ＤＡＮＡ／ＤＡＮＧおよびｍＩｇＧ１は、ＡＤＣＣ機能を誘発しなかった（図１５Ｂ～Ｅ）。

ＡｂのＡＤＣＰ活性を試験するために、ＢＭＤＭおよびＲａｊｉ－ｈＴＩＧＩＴを、それぞれ、エフェクター細胞および標的細胞として使用した。ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ、ｍＩｇＧ２ａ－ＤＥ変異体、ｍＩｇＧ２ａ－ＤＬＥ変異体、およびｈＩｇＧ１アイソタイプに関連したＴ４およびＣＳ１９ＭＥ３－３０－ＮＡｂが、類似したレベルのＡＤＣＰ活性を示した一方で、ｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ａ－ＤＡＮＡ／ＤＡＮＧはＡＤＣＰを誘発しなかった（図１６）。

ＡｂのＣＤＣ活性を試験するために、Ｒａｊｉ－ｈＴＩＧＩＴ細胞株を標的細胞として使用し、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を、補体を介する標的細胞溶解の読み出しとして使用した。ｍＩｇＧＡｂに関して、Ｔ４－ｍＩｇＧ２ａ、Ｔ４－ｍＩｇＧ２ａ－ＤＥ、およびＴ４－ｍＩｇＧ２ａ－ＤＡＮＡが類似したＣＤＣ活性を示した一方で、Ｔ４－ｍＩｇＧ１およびＴ４－ｍＩｇＧ２ａ－ＤＬＥはＣＤＣをまったく誘発しなかった（図１７Ａ）。ＣＳ１９ＭＥ３－２３－ｍＩｇＧ２ａがＣＳ１９ＭＥ３－２３－ｍＩｇＧ２ａ－ＤＡＮＧよりも強いＣＤＣを示し、ＣＳ１９ＭＥ３－２３－ｍＩｇＧ２ａ－ＤＡＮＧがＣＳ１９ＭＥ３－２３－ｍＩｇＧ２ａ－ＤＥよりも強いＣＤＣを示した一方で、ＣＳ１９ＭＥ－２３－ｍＩｇＧ１およびＣＳ１９ＭＥ３－２３－ｍＩｇＧ２ａ－ＤＬＥは、ＣＤＣをまったく誘発しなかった（図１７Ｂ）。ＣＳ１９ＭＥ３－２３およびＣＳ１９ＭＥ３－３０－ＮｈＩｇＧＡｂに関して、ｈＩｇＧ１のみが有効なＣＤＣ機能を示し、他の変異体は示さなかった（図１７Ｃ）。さらに、それらのｈＩｇＧ１脱フコシル化変異体は、ｈＩｇＧ１に類似したＣＤＣ活性を示した（図１７Ｄ）。

まとめると、これらの研究は、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体が、ＣＤ１５５へのＴＩＧＩＴの結合をブロックするその活性に加えて、インビトロでのＦｃ介在エフェクター機能を保有することを実証した。これらのＡｂＦｃ変異体は、マウスモデルを使用した続くインビボ研究のためのツールセットを提供した。

実施例８．本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、動物モデルにおいてＦｃ介在エフェクター機能に応じて強力な抗腫瘍活性を発揮した
本実施例では、抗ＴＩＧＩＴＡｂの抗腫瘍効果を、免疫適格性マウス同系腫瘍モデルを使用して評価した。抗ＴＩＧＩＴＡｂのエフェクター機能も、抗腫瘍効果へのそれらの寄与に関して調べた。

ＦＡＣＳを用いるマウス腫瘍細胞株上のｍＣＤ１５５発現の検出
マウス腫瘍細胞株、ＣＴ２６（結腸癌腫）、Ａ２０（Ｂ細胞リンパ腫）、および４Ｔ１（乳がん）を、マウスＣＤ１５５（ｍＣＤ１５５）の発現について調べた。腫瘍細胞表面上のｍＣＤ１５５発現を調べるために、ラット抗ｍＣＤ１５５Ａｂ４．２４．１（バイオレジェンド社（Biolegend））を使用した。ロバ抗ラットＩｇＧ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗体を二次抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）として使用した。Ａ２０細胞を染色するために、ｍＣＤ１５５染色の前に、細胞表面Ｆｃ受容体を、２．４Ｇ２（マウスＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩへのＦｃ結合をブロックする抗体）を使用して予めブロックした（図１８Ａ）。

動物試験
すべての動物実験を、中国のＮａｔｉｏｎａｌＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒＨｏｕｓｉｎｇａｎｄＣａｒｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓに従って行い、北京生命科学研究所（National Institute of Biological Sciences, Beijing）で承認されたＩＡＣＵＣプロトコルの下で実施した。

マウス腫瘍モデルを確立するために、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹部に１～３×１０⁵のＣＴ２６、Ａ２０、または４Ｔ１細胞を皮下接種した。類似した平均腫瘍体積（特に別段明記されている場合を除き、５０～１００ｍｍ³）に基づいて、マウスを無作為に群（ｎ＝３～６／群）に分け、週に２回、合計５回または６回、抗ＴＩＧＩＴＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）、その変異体、またはＰＢＳ緩衝液を腹腔内注射した。腫瘍体積を、電子キャリパーで測定し、修正楕円体式を使用して１／２×（長さ×幅²）として計算した。

ＣＴ２６およびＡ２０の腫瘍モデルの両方に関して、ＣＳ１９ＭＥ３－３０－Ｎ－ｍＩｇＧ２ａ、Ｔ４－ｈＩｇＧ１、Ｔ４－ｍＩｇＧ２ａ、またはＣＳ１９ＭＥ３－２３－ｍＩｇＧ２ａによる治療によって、対照群と比較して、腫瘍増殖を著しく阻害し、腫瘍退縮を誘発さえした（図１８Ｂ～Ｅ）。

これらの抗ＴＩＧＩＴＡｂのエフェクター機能がインビボでのそれらの抗腫瘍効果に寄与するかどうかを試験するために、本発明者らは、ＡｂのＦｃ変異体のセットの抗腫瘍活性を、増強または消失したエフェクター機能と比較した。ＣＴ２６またはＡ２０の腫瘍担持モデルのＢＡＬＢ／ｃマウスでは、抗ＴＩＧＩＴ（Ｔ４またはＣＳ１９ＭＥ３－２３）ＡｂのｍＩｇＧ２ａ－ＤＬＥまたはｍＩｇＧ２ａ－ＤＥ変異体による治療によって、野生型ｍＩｇＧ２ａと比較して抗腫瘍効果が改善され、特にＡ２０腫瘍に対する顕著な改善があり（図１８Ｅ～Ｆ）、これらは実施例７および図１５で事前に判定されたＡＤＣＣエフェクター機能の増強と一致することが分かった。インビトロでのＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ機能を欠くｍＩｇＧ２ａ－ＤＡＮＡ変異体は、ＣＴ２６およびＡ２０の腫瘍の両方に対して最小の抗腫瘍活性を示したか、または抗腫瘍活性を示さなかった（図１８Ｅ～Ｆ）。（上記の実施例７に記載されるように）ｍＩｇＧ２ａ－ＤＬＥがインビトロでＣＤＣ機能を発揮しなかったという発見を想起すると、これらの変異体の観察された抗腫瘍効果はＣＤＣ機能を必要としないと考えられる。

薬物動態解析
本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴ４ＡｂのＦｃ変異体のＰＫプロファイルを検査した。本実験では、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。試験Ａｂの単回腹腔内注射後、異なる時点で血液を採取した。血清中のＡｂ濃度をｍＴＩＧＩＴ結合ＥＬＩＳＡによって測定した。

Ｔ４Ａｂ、Ｔ４－ｍＩｇＧ２ａ、Ｔ４－ｍＩｇＧ２ａ－ＤＡＮＡの他に、Ｔ４－ｈＩｇＧ１のＦｃ変異体のＰＫプロファイルがすべて、同等のＰＫプロファイルを有していた一方で、Ｔ４－ｍＩｇＧ２ａ－ＤＥおよびＴ４－ｍＩｇＧ２ａ－ＤＬＥは、おそらくインビボでのこれらのＡｂの安定性がより低いことが原因で、著明にクリアランスがより速く、血清半減期がより短かった（図１９）。これらの明らかに劣ったＰＫプロファイルにもかかわらず、Ｔ４－ｍＩｇＧ２ａ－ＤＥおよびＴ４－ｍＩｇＧ２ａ－ＤＬＥがより強い抗腫瘍活性を示したことを想起すると（図１８Ｅ～Ｆ）、これらの２つのＡｂ変異体（Ｔ４－ｍＩｇＧ２ａ－ＤＥおよびＴ４－ｍＩｇＧ２ａ－ＤＬＥ）の改善された抗腫瘍活性が、それらの優れたエフェクター機能に起因し得ると結論付けられる。

まとめると、上記結果は、増強されたエフェクター機能を有するＦｃ変異体がインビボで改善された抗腫瘍効果を発揮したため、ＦｃγＲ関与介在エフェクター機能がインビボでの抗ＴＩＧＩＴＡｂの抗腫瘍活性にとって重要であることを実証した。したがって、本出願の一実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、増強されたエフェクター機能を有するＦｃ変異体である。

実施例９．抗ＴＩＧＩＴＡｂ介在腫瘍退縮におけるＣＤ８＋ＴおよびＮＫ細胞の関与
本実施例では、本発明者らは、インビボ免疫細胞枯渇試験を行うことによって、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体の抗腫瘍効果に寄与する免疫細胞型を特定しようとした。

インビボ免疫細胞枯渇
ＣＤ４またはＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇については、Ｔ４Ａｂ治療の２日前に、および週２回、腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２００μｇのＣＤ４枯渇Ａｂ（クローンＧＫ１．５、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）またはＣＤ８枯渇Ａｂ（クローン２．４３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）を注射した。

ＮＫ細胞の枯渇については、Ｔ４Ａｂ治療の１日前に、および５日に１回、マウスに５０μｇの抗アシアロ－ＧＭ１ポリクローナルＡｂ（Ｐｏｌｙ２１４６０、バイオレジェンド社）を注射した。

好中球の枯渇については、Ｔ４Ａｂ治療の２日前に、および週２回、マウスに４００μｇの抗Ｌｙ６ＧモノクローナルＡｂ（１Ａ８クローン、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）を注射した。

マクロファージの枯渇については、Ｔ４Ａｂ処理の１日前に、およびその後週１回、マウスに１００μＬのクロドロネートリポソーム（ＦｏｒｍｕＭａｘ社）を注射した。

免疫細胞枯渇実験のすべてについて、Ｔ４Ａｂ治療が終了するまで枯渇抗体または試薬を与えた。上記の免疫細胞枯渇法の効率を、腫瘍ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して確認した。

ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の関与
まず、前述のＣＴ２６腫瘍モデルを使用することによって、Ｔ細胞の寄与を評価した。Ｔ４Ａｂ治療が、ＷＴＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて効果的なＣＴ２６腫瘍退縮を誘発したが、Ｔ細胞欠損ヌードマウスにおいて誘発された抗腫瘍活性ははるかに少ないことが観察され（図２０Ａ）、これは、Ｔ４Ａｂの十分な治療効果にはＴ細胞が必要とされることを明確に示唆している。

どの（１つまたは複数の）Ｔ細胞サブセットがＴ４Ａｂ介在腫瘍退縮に関与しているかを特定するために、Ｔ４Ａｂ治療の２日前に、確立されたＣＴ２６腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、抗ＣＤ４または抗ＣＤ８抗体でマウスを処理することによって、それぞれ、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた。ＣＤ４＋細胞単独の枯渇は、Ｔ４Ａｂ治療の状況に関係なく腫瘍増殖を大幅に抑制し、これは、抗ＣＤ４抗体による治療の結果、免疫抑制性ＣＤ４＋細胞が除去され、ＣＤ４＋細胞がＴ４Ａｂの抗腫瘍活性に明らかに必要ではないことを示唆している（図２０Ｂ）。

対照的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｔ４Ａｂ治療の状況に関係なく、非枯渇マウスと比較して枯渇マウスでは腫瘍増殖がより速く、これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が天然の抗ＣＴ２６腫瘍免疫において重要なエフェクターとして機能することを示唆している。また、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇は、Ｔ４Ａｂの治療効果を完全に無効にし（図２０Ｃ）、これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＴ４Ａｂの観察された抗腫瘍効果に必須であることを裏付けている。

ＮＫ細胞の関与
次に、ＮＫ細胞枯渇によるＴ４Ａｂの抗腫瘍活性におけるＮＫ細胞の潜在的な役割を、抗アシアロ－ＧＭ１抗体を使用することによって評価した。ＮＫ細胞枯渇は、確立されたＣＴ２６腫瘍担持マウスでＴ４Ａｂ治療の１日前に始まり、Ｔ４Ａｂ治療の終了まで続いた。

ＣＤ８＋細胞での観察と同様に、ここでＮＫが重要な天然の抗腫瘍エフェクター細胞として機能することが分かった。具体的には、ＮＫ枯渇マウスは、非枯渇マウスよりも腫瘍増殖がはるかに速かった。さらに、ＮＫ細胞の枯渇によってＴ４Ａｂ治療の治療効果は大きく損なわれ（図２０Ｄ）、これは、Ｔ４Ａｂの抗腫瘍効果がＮＫ細胞を必要とすることを示唆している。

好中球およびマクロファージの関与
抗Ｌｙ６Ｇ抗体（１Ａ８クローン）を使用して好中球を枯渇させ、クロドロネートリポソームを使用してマクロファージを枯渇させることによる、これらの細胞種の枯渇により、Ｔ４Ａｂの治療効果における好中球およびマクロファージの役割も評価した。

好中球またはマクロファージの枯渇が、Ｔ４Ａｂの抗腫瘍活性に有意な効果がなかったことが見出され、これは、それらがＴ４Ａｂの抗腫瘍効果に関与する可能性が低いことを示唆している（図２０Ｅ～Ｆ）。

同系Ａ２０腫瘍モデルマウスにおける枯渇研究
Ａ２０腫瘍担持同系ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、同様の免疫細胞枯渇試験を実施した。ＣＴ２６腫瘍モデルと同様の結果が観察された。具体的には、ＣＤ８＋ＴまたはＮＫ細胞の枯渇は、それぞれ、Ｔ４Ａｂの抗腫瘍効果をブロックまたは大幅に低下させたが、ＣＤ４＋Ｔ、好中球、またはマクロファージの枯渇は、Ｔ４Ａｂ治療後の腫瘍転帰にほとんどまたはまったく効果がなかった（図２０Ｇ～Ｋ）。

まとめると、我々の結果は、ＣＤ８＋ＴおよびＮＫ免疫細胞が、ＣＴ２６およびＡ２０の腫瘍担持マウスモデルの両方でＴ４Ａｂの治療効果に寄与することを実証している。

実施例１０．抗ＴＩＧＩＴＡｂによる治療によって誘発された交差保護的かつ持続的な抗腫瘍免疫記憶
本実施例では、本発明者らによって発見された本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体での治療後の持続的な抗腫瘍免疫記憶および交差保護効果について説明する。

腫瘍リチャレンジ研究
抗ＴＩＧＩＴＡｂの治療後のＣＴ２６またはＡ２０の腫瘍が完全に退縮したマウスを、最初の腫瘍接種から８０～１００日後にＣＴ２６、Ａ２０、または４Ｔ１腫瘍でリチャレンジし、左側腹部に腫瘍細胞（１～３×１０⁵のＣＴ２６、Ａ２０、または４Ｔ１）を皮下（ｓ．ｃ．）に接種した。同齢のナイーブマウスを対照として使用し、リチャレンジ群と同じ腫瘍移植を受けさせた。毎週２回、腫瘍体積を測定することによって、腫瘍増殖を経時的にモニターした。マウス血清を、腫瘍細胞のリチャレンジの前に収集し、リチャレンジの前に検出可能な抗ＴＩＧＩＴＡｂがないことを確認した。

免疫記憶効果
同年齢のナイーブマウスとは対照的に、抗ＴＩＧＩＴＡｂで治癒したマウスは、同じ腫瘍によるリチャレンジに対して耐性があった。たとえば、ＣＴ２６の治癒したマウスはＣＴ２６によるリチャレンジに対して耐性があり、同じことがＡ２０腫瘍にも当てはまった（図２１ＡおよびＢ）。

また、ＣＴ２６またはＡ２０の腫瘍が完全に退縮したマウスは、両方の腫瘍タイプを拒絶する交差腫瘍免疫が発達したが、別の異なる４Ｔ１腫瘍に対しては発達しなかったことが観察された（図２１ＡおよびＢ）。

これらの結果は、抗ＴＩＧＩＴ抗体による治療の結果、保護的で持続的な抗腫瘍免疫記憶がもたらされ得、この記憶は、抗ＴＩＧＩＴＡｂ治療に応答性である異なるタイプの腫瘍を交差保護することができるが、抗ＴＩＧＩＴＡｂ治療に抵抗性である腫瘍を交差保護することはできないことを実証している。

実施例１１．抗ＴＩＧＩＴＡｂは低用量でも強力な抗腫瘍効果を示す
本実施例では、種々の用量での抗ＴＩＧＩＴＡｂの抗腫瘍効果を調べる動物試験について説明する。

すべての動物実験を、中国のＮａｔｉｏｎａｌＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒＨｏｕｓｉｎｇａｎｄＣａｒｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓに従って行い、北京生命科学研究所で承認されたＩＡＣＵＣプロトコルの下で実施した。

マウス腫瘍モデルに関して、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹部に２×１０⁵のＣＴ２６細胞を皮下接種した。類似した平均ＣＴ２６腫瘍体積（２０～８０ｍｍ³）に基づいて、マウスを無作為に５つの群（０．３ｍｇ／ｋｇ群、１ｍｇ／ｋｇ群、３ｍｇ／ｋｇ群、１０ｍｇ／ｋｇ群および対照として無治療群；ｎ＝５～６／群）に分け、それらに、週１回で４回、抗ＴＩＧＩＴ（ＣＳ１９ＭＥ３－３０－Ｎ－ｈＩｇＧ１－ａｆｕｃｏ）を腹腔内注射した。腫瘍体積を、電子キャリパーで測定し、修正楕円体式１／２×（長さ×幅²）を使用して計算した。

腫瘍担持マウスモデルにおける低用量および高用量の抗ＴＩＧＩＴＡｂの抗腫瘍活性を調べるために、異なる投与量でのＡｂの抗腫瘍活性を、免疫適格性腫瘍担持マウスモデルにおいて比較した。ＣＴ２６腫瘍モデルを有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、抗ＴＩＧＩＴＡｂ（ＣＳ１９ＭＥ３－３０－Ｎ－ｈＩｇＧ１－ａｆｕｃｏ）による治療は、０．３ｍｇ／ｋｇの最低用量でも強力な抗腫瘍活性を示した（図２２）。抗体の明らかな用量依存性は観察されなかった。

実施例１２．抗ＰＤ－１Ａｂまたは抗ＰＤ－Ｌ１Ａｂと組み合わせた抗ＴＩＧＩＴＡｂの使用
本実施例では、２つの異なる腫瘍を有するマウスモデルにおいて本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体とｍＰＤ－１またはｍＰＤ－Ｌ１に対する抗体との併用について調べる。抗ｍＰＤ－１Ａｂ（ＲＭＰ１－１４）はＢｉｏＸＣｅｌｌ社から入手し、抗ｍＰＤ－Ｌ１Ａｂは、マウスＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ｍＰＤ－Ｌ１－ＥＣＤ；ＵｎｉｐｒｏｔＩＤＱ９ＥＰ７３）を標的として使用してファージディスプレイ抗体ライブラリから選択した。この抗体を、抗ｍＰＤ－Ｌ１－ｍＩｇＧ２ａ（ｍＰ４）として発現し、本アッセイで使用した。

マウス腫瘍モデルに関して、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮまたはＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹部に１×１０⁵のＭＣ３８または２×１０⁵のＣＴ２６細胞を皮下接種した。

ＭＣ３８腫瘍担持マウスを、無作為に群（抗ＴＩＧＩＴＡｂ治療群（ＣＳ１９ＭＥ３－３０－Ｎ－ｍＩｇＧ２ａ、１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍＰＤ－１Ａｂ治療群（ＲＭＰ１－１４、３ｍｇ／ｋｇ）、併用治療群、および対照として無治療群（ＰＢＳ）；ｎ＝３～６／群）に分け、それらに、抗ＴＩＧＩＴＡｂおよび／または抗ｍＰＤ－１（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社、ＲＭＰ１－１４）またはＰＢＳを腹腔内注射した。

類似した平均ＣＴ２６腫瘍体積（１２０～２７０ｍｍ³）に基づいて、マウスを無作為に群（ｎ＝３～６／群）に分け、それらに、週２回で４～６回、抗ＴＩＧＩＴＡｂおよび／または抗ｍＰＤ－１（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社、ＲＭＰ１－１４）、または抗ＴＩＧＩＴＡｂおよび／または自作の抗ｍＰＤ－Ｌ１（ｍＰ４）を腹腔内注射した。

腫瘍体積を、電子キャリパーで測定し、修正楕円体式１／２×（長さ×幅²）を使用して計算した。

図２３に示されるように、抗ＴＩＧＩＴＡｂ（ＣＳ１９ＭＥ３－３０－Ｎ－ｍＩｇＧ２ａおよびＣＳ１９ＭＥ３－３０－ＮｈＩｇＧ１－ａｆｕｃｏ）は、ＭＣ３８およびＣＴ２６の腫瘍を有するマウスモデルの両方で抗ｍＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせると相乗的な抗腫瘍効果を示した。これらの観察は、本開示の抗ＴＩＧＩＴ抗体が、単独で、または、例えば抗ｍＰＤ－１剤または抗ｍＰＤ－Ｌ１剤などの抗腫瘍剤などの別の治療剤と組み合わせて、さまざまながんの治療などの多数の治療用途に使用され得ることを示唆している。

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Claims

ヒトＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびΠΙΜドメインを有するＴ細胞免疫受容体）およびマウスＴＩＧＩＴに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（１）配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１（重鎖相補性決定領域１）、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１（軽鎖相補性決定領域１）、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（２）配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号２０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号２３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（３）配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号２０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号３０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号３２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（４）配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または
（５）配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号２０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む単離された抗体またはその抗原結合断片。
（１）配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号１２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（２）配列番号２７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号２６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または
（３）配列番号３４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号３３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む請求項１記載の抗体またはその抗原結合断片。
（１）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（２）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または
（３）配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および／または配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む請求項１記載の抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体が、増強されたエフェクター機能を有するまたはエフェクター機能を有さないヒトＩｇＧ１抗体またはその変異体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
修飾のない抗体と比較して、（１）ＡＤＣＣ機能を増強する、（２）ＡＤＣＰ機能を増強する、および／または（３）ＣＤＣ機能を低減または排除するように、Ｆｃ領域を変更することによってさらに修飾される請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体が脱フコシル化抗体である請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
脱フコシル化抗体が、そのフコシル化対応物と比較してエフェクター機能が増加されている抗体またはその抗原結合断片。
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸。
（１）配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；および／または配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；
（２）配列番号２９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；および／または配列番号２８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；または
（３）配列番号３６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；および／または配列番号３５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列
を含む請求項８記載の核酸。
請求項８または９に記載の核酸を含むベクター。
請求項８または９に記載の核酸または請求項１０記載のベクターを含む細胞。
がんまたはウイルス感染の治療における請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
がんまたはウイルス感染の治療における追加の治療剤と組み合わせた請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
前記追加の治療剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、または抗ＴＩＭ３抗体の群から選択される請求項１３記載の使用。
治療上有効な量の請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む、それを必要とする被験体においてがんまたはウイルス感染を治療する方法。
抗体またはその抗原結合断片が、ＣＤ１５５へのＴＩＧＩＴの結合をブロックし、エフェクター機能を発揮する請求項１５記載の方法。